Procédé de préparation des tétracyclines La .présente invention a pour objet un procédé nouveau pour préparer les composés de la série des tétracyclines, à savoir, la tétracycline, la chlorotétra- cycline et la bromotétracycline qui sont des antibioti ques à large spectre.
Ces tétracyclines répondent à la formule
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dans laquelle Z est un .atome d'hydrogène, de chlore ou de brome. Antérieurement, on préparait ces tétra cyclines par fermentation aérobie d'un milieu nutritif aqueux à l'aide d'un micro-organisme de l'espèce <I>S.</I> aureofaciens,
en travaillant dans des conditions contrôlées en ce qui concerne la teneur du milieu en ions chlorure et/ou en ions bromure.
Suivant la présente invention, on prépare les tétracyclines de formule I en faisant fermenter dans des conditions aérobies un milieu nutritif aqueux à l'aide d'un micro-organisme de l'espèce S. aureofa- ciens, en présence d'une 5a(11a)-déhydrotétracycline correspondante, de formule
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Ces 5a(lla)-déhydrotétracyclines de formule II sont elles-mêmes.
des antibiotiques nouveaux, obtenus par un procédé de fermentation décrit dans le brevet allemand No<B>1089511,</B> comme on l'indique plus en détail dans ledit brevet, ces nouveaux antibiotiques sont la 7 - chloro - 5a(1 la) - déhydrotétracycline, la 5a(11a)-déhydrotétracycline et la 7-bromo-5a(11a)- déhydrotétracycline, et ils sont produits dans des conditions de fermentation appropriées,
par certaines souches mutantes de<I>S.</I> aureo <I>f</I> aciens, dont certaines ont été appelées S1308, S1308-29, S1308-V146 et S1308-V237, dont les cultures ont été déposées à l'American Type Culture Collection, à Washington, où elles. ont reçu respectivement les numéros d'ins- cription ATCC 12748, 12749, 12750, 12751.
L'activité biologique de ces 5a(lla)-déhydro- tétracyclines est assez faible. Cependant, étant donné que les nouvelles souches mutantes de<I>S.</I> aureofaciens qui produisent ces nouveaux antibiotiques sont des souches à grand rendement, produisant fréquem ment jusqu'à 9000-10 000 gammas/ce de 7-chloro- 5a(11a)-déhydrotétracycline par exemple,
on a fait des efforts pour convertir ces antibiotiques en ceux possédant l'activité antibactérienne typique à spectre large que l'on désire obtenir.
La présente invention permet d'obtenir le résul tat désiré moyennant une conversion biologique de ces nouveaux antibiotiques en antibiotiques à large spectre désirés. On convertit ainsi la 7-chloro- 5a(lla)-déhydro@tétracycline en chlorotétracycline, la Sa(lla)-déhydrotétracycline en tétracycline, et la 7- bro#mo-5a(lla)-déhydrotétracycline en bromotétra- cycline.
On peut réaliser simplement la présente invention en ajoutant les nouveaux antibiotiques à un système de fermentation utilisant des souches ordinaires de <I>S.</I> aureofaciens. Ainsi, quand on ajoute de la 7- chloro - 5a(1 <I>la)
</I> - déhydrotétracycline à un système ordinaire de fermentation utilisant des souches ordi naires de<I>S.</I> aureofaciens productrices de chloro- tétracycline, elle est convertie en chlorotétracycline. Jusqu'à présent, la conversion est incomplète, mais on a trouvé qu'elle varie de 18 à 48 % dans la plupart des cas.
Les conditions de la fermentation sont généra lement les mêmes que dans les méthodes actuellement connues de préparation de la chlorotétracycline et de la tétracycline par fermentation, si ce n'est, évi demment, que l'on ajoute le nouvel antibiotique, de préférence au début de la fermentation. Le milieu de fermentation contient les substances nutritives et minérales usuelles.
Des substances nutritives appro priées qui peuvent fournir les principes nécessaires sont notamment l'amidon, le dextrose, le sucre de canne, le glucose, la mélasse, la farine de soja, la farine d'arachide, la levure, les extraits de viande, la peptone, le sulfate d'ammonium, l'urée, la liqueur de macération de maïs, les produits solubles de dis tillerie, la farine de poisson, et d'autres substances ordinaires.
Les sels inorganiques .comprennent notam ment le carbonate de calcium, le sulfate d'ammo nium, le chlorure .d'ammonium, le phosphate mono sodique, et les divers oligo-éléments tels que le man ganèse, le cobalt, le zinc, le cuivre, le fer, etc.
Les autres conditions générales de la fermenta tion, telles que le pH, la température, le temps, le taux d'aération, la préparation de l'inoculum, la sté rilisation, l'incubation, etc., peuvent être usuelles et sont généralement similaires. à celles de la prépara tion de la chlorotétracycline, indiquées dans le brevet américain No 2482055, et de la préparation de la tétracycline, indiquées dans le brevet américain Nù 2734018.
De même, la récupération de la chlorotétra- cycline et de la .tétracycline à partir de la liqueur de fermentation n'a pas besoin d'être décrite, car de nombreuses méthodes ont été publiées pour récupé rer ces antibiotiques à partir des liqueurs de fermen tation. On peut récupérer la bromotétracycline de façon similaire.
Dans les exemples qui suivent, on notera que certaines des opérations de fermentation sont con- duites en présence de certains inhibiteurs de chloru- ration, qui sont le 2,5-dimercapto-1,3,4-thiadiazole, et le 2-(2-fnryl)-5-mercapto-1,3,4-oxadiazole. Ces inhibiteurs ont pour effet de modifier la proportion entre chlorotétracycline et tétracycline dans la fer mentation normale de la chlorotétracycline,
de ma nière à donner une forte proportion de tétracycline. De cette façon, il est possible d'observer plus faci lement la formation de chlorotétracycline due à la conversion de la 7 - chloro - 5a(1 la) - déhydrotétra- cycline, car en l'absence de ces inhibiteurs des aug mentations de la quantité de chlorotétracycline dues à la conversion de la 7-chloro-5a(lla)-déhydro- tétracycline pourraient passer inaperçues.
<I>Exemple 1</I> On prépare un milieu de fermentation qui a la composition suivante
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Amidon <SEP> 55 <SEP> g/1
<tb> Liqueur <SEP> de <SEP> macération <SEP> de <SEP> maïs <SEP> 25 <SEP> g/1
<tb> CaCO;; <SEP> .. <SEP> 9 <SEP> g/1
<tb> (NH4)zSO.<B>l</B> <SEP> 5,6 <SEP> g/1
<tb> MnS04 <SEP> (70 <SEP> % <SEP> ) <SEP> 80 <SEP> mg/1
<tb> CoC1,,,6H,0 <SEP> . <SEP> . <SEP> 5 <SEP> mg/1
<tb> NH4CI <SEP> . <SEP> . <SEP> 1,7 <SEP> g/1
<tb> Huile <SEP> de <SEP> saindoux <SEP> .
<SEP> <B>3,2%</B> <SEP> en <SEP> volume Après stérilisation du milieu, on inocule 25 cm," du milieu dans un flacon Erlenmeyer de 250 cm3, avec un inoculum végétatif de<I>S.</I> aureofaciens (souche S77).
On ajoute 100 parties par million de 2,5- dimercapto-1,3,4-thiadiazole et 500 gammas/cm3 de 7-chloro-5a(11a)-déhydrotétracycline, et on conduit la fermentation pendant 120 heures à 250 C sur une secoueuse rotative.
On titre la chlorotétracycline de la liqueur par voie fluorométrique, et on trouve que l'augmentation du titre fluorométrique due à l'addi tion de 7-chloro-5a(lla)-déhydrotétracycline repré sente 248 gammas/cm3, ce qui représente 48 % de la conversion théorique possible de la 7-chloro- 5a(lla)
-déhydrotétracycline en chlorotétracycline. <I>Exemple 2</I> On suit la méthode de l'exemple précédent à cette seule exception près que l'on ajoute au milieu 10 parties par million de 2-(2-furyl)-5-mercapto- 1,3,4-oxadiazole comme inhibiteur de chloruration. L'accroissement du titre fluorométrique de chloro- tétracycline due à l'addition de 7-chloro-5a(lla)
- déhydrotétracycline est de<B>170</B> gamma-s/cm3, ce qui représente 34 % de la conversion théorique de la 7 - chloro- 5a(11a) - déhydrotétracycline ajoutée en chlorotétracycline. <I>Exemple 3</I> On suit la méthode de l'exemple 1, sauf que l'on ajoute de la 5a(lla)
-déhydrotétracycline au sys tème de fermentation et que l'on utilise pas d'inhi- biteur. On inocule alors le milieu avec un inoculum végétatif de S. aureofaciens (souche S77). La con version de la 5a(1 la)-déhydrotétracyaline ajoutée en tétracycline est d'environ 35 %. <I>Exemple 4</I> On suit le procédé de l'exemple 1, sauf que l'on ajoute de la 7-bromo-5a(lla)-déhydrotétracycline au système de fermentation.
On inocule le milieu avec un inoculum végétatif de<I>S.</I> aureofaciens (sou che S77). La conversion de la 7-bromo-5a(lla)- déhydrotétracycline ajoutée en bromotétracycline est d'environ 30 %.
Process for preparing tetracyclines The present invention relates to a novel process for preparing compounds of the tetracycline series, namely tetracycline, chlorotetracycline and bromotetracycline which are broad spectrum antibiotics.
These tetracyclines meet the formula
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wherein Z is a hydrogen, chlorine or bromine atom. Previously, these tetra cyclins were prepared by aerobic fermentation of an aqueous nutrient medium using a microorganism of the species <I> S. </I> aureofaciens,
by working under controlled conditions with regard to the content of the medium in chloride ions and / or bromide ions.
According to the present invention, the tetracyclines of formula I are prepared by aerobically fermenting an aqueous nutrient medium with the aid of a microorganism of the species S. aureofaciens, in the presence of a 5a ( 11a) -dehydrotetracycline corresponding, of formula
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These 5a (11a) -dehydrotetracyclines of formula II are themselves.
new antibiotics, obtained by a fermentation process described in German patent No. <B> 1089511, </B> as is indicated in more detail in said patent, these new antibiotics are 7 - chloro - 5a (1 la ) - dehydrotetracycline, 5a (11a) -dehydrotetracycline and 7-bromo-5a (11a) - dehydrotetracycline, and they are produced under suitable fermentation conditions,
by certain mutant strains of <I> S. </I> aureo <I> f </I> aciens, some of which have been designated S1308, S1308-29, S1308-V146 and S1308-V237, whose cultures have been deposited at the American Type Culture Collection, Washington, where they. have received ATCC registration numbers 12748, 12749, 12750, 12751 respectively.
The biological activity of these 5a (11a) -dehydro-tetracyclines is quite low. However, since the new mutant strains of <I> S. </I> aureofaciens that produce these new antibiotics are high yielding strains, frequently producing up to 9000-10000 gammas / cc of 7-chloro- 5a (11a) -dehydrotetracycline for example,
Efforts have been made to convert these antibiotics to those possessing the typical broad spectrum antibacterial activity which is desired.
The present invention achieves the desired result through biological conversion of these novel antibiotics into the desired broad spectrum antibiotics. 7-Chloro-5a (11a) -dehydro @ tetracycline is thus converted to chlorotetracycline, Sa (11a) -dehydrotetracycline to tetracycline, and 7-bro # mo-5a (11a) -dehydrotetracycline to bromotetracycline.
The present invention can be accomplished simply by adding the novel antibiotics to a fermentation system using ordinary strains of <I> S. </I> aureofaciens. So when we add 7- chloro - 5a (1 <I> la)
</I> - dehydrotetracycline to an ordinary fermentation system using ordinary strains of <I> S. </I> aureofaciens producing chlorotetracycline, it is converted into chlorotetracycline. So far, the conversion is incomplete, but it has been found to vary from 18 to 48% in most cases.
The fermentation conditions are generally the same as in the currently known methods of preparing chlorotetracycline and tetracycline by fermentation, except, of course, that the new antibiotic is added, preferably at the start. of fermentation. The fermentation medium contains the usual nutrients and minerals.
Suitable nutrients which can provide the necessary principles include starch, dextrose, cane sugar, glucose, molasses, soybean meal, peanut meal, yeast, meat extracts, peptone, ammonium sulfate, urea, corn maceration liquor, soluble products from the distillery, fishmeal, and other common substances.
Inorganic salts include in particular calcium carbonate, ammonium sulphate, ammonium chloride, monosodium phosphate, and various trace elements such as man ganese, cobalt, zinc, copper, iron, etc.
Other general fermentation conditions, such as pH, temperature, time, rate of aeration, preparation of inoculum, sterilization, incubation, etc., may be customary and are generally similar. to those of the preparation of chlorotetracycline, shown in US Patent No. 2,482055, and of the preparation of tetracycline, shown in US Patent No. 2734018.
Likewise, the recovery of chlorotetracycline and tetracycline from fermentation liquor need not be described, since many methods have been published to recover these antibiotics from fermen's liquors. tation. Bromotetracycline can be recovered in a similar fashion.
In the examples which follow it will be appreciated that some of the fermentation operations are carried out in the presence of certain chlorination inhibitors, which are 2,5-dimercapto-1,3,4-thiadiazole, and 2- ( 2-acryl) -5-mercapto-1,3,4-oxadiazole. These inhibitors have the effect of modifying the proportion between chlorotetracycline and tetracycline in the normal fermentation of chlorotetracycline,
so as to give a high proportion of tetracycline. In this way, it is possible to observe more easily the formation of chlorotetracycline due to the conversion of 7 - chloro - 5a (1 la) - dehydrotetracycline, because in the absence of these inhibitors increases in amount of chlorotetracycline due to the conversion of 7-chloro-5a (11a) -dehydro-tetracycline could go unnoticed.
<I> Example 1 </I> A fermentation medium is prepared which has the following composition
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Starch <SEP> 55 <SEP> g / 1
<tb> Liqueur <SEP> of <SEP> maceration <SEP> of <SEP> corn <SEP> 25 <SEP> g / 1
<tb> CaCO ;; <SEP> .. <SEP> 9 <SEP> g / 1
<tb> (NH4) zSO. <B> l </B> <SEP> 5,6 <SEP> g / 1
<tb> MnS04 <SEP> (70 <SEP>% <SEP>) <SEP> 80 <SEP> mg / 1
<tb> CoC1 ,,, 6H, 0 <SEP>. <SEP>. <SEP> 5 <SEP> mg / 1
<tb> NH4CI <SEP>. <SEP>. <SEP> 1.7 <SEP> g / 1
<tb> Lard <SEP> oil <SEP> <SEP>.
<SEP> <B> 3.2% </B> <SEP> by <SEP> volume After sterilization of the medium, 25 cm, "of the medium are inoculated into a 250 cm3 Erlenmeyer flask, with a vegetative inoculum of <I > S. </I> aureofaciens (strain S77).
100 parts per million of 2,5-dimercapto-1,3,4-thiadiazole and 500 gammas / cm3 of 7-chloro-5a (11a) -dehydrotetracycline are added, and the fermentation is carried out for 120 hours at 250 C on a rotary shaker.
The chlorotetracycline of the liquor is titrated fluorometrically, and it is found that the increase in the fluorometric titre due to the addition of 7-chloro-5a (11a) -dehydrotetracycline represents 248 gammas / cm3, which represents 48%. of the possible theoretical conversion of 7-chloro-5a (lla)
-dehydrotetracycline to chlorotetracycline. <I> Example 2 </I> We follow the method of the previous example with this one exception that we add to the medium 10 parts per million of 2- (2-furyl) -5-mercapto- 1,3 , 4-oxadiazole as a chlorination inhibitor. The increase in the fluorometric titre of chlorotetracycline due to the addition of 7-chloro-5a (lla)
- dehydrotetracycline is <B> 170 </B> gamma-s / cm3, which represents 34% of the theoretical conversion of 7 - chloro-5a (11a) - dehydrotetracycline added to chlorotetracycline. <I> Example 3 </I> We follow the method of example 1, except that we add 5a (lla)
-dehydrotetracycline in the fermentation sys tem and that no inhibitor is used. The medium is then inoculated with a vegetative inoculum of S. aureofaciens (strain S77). The conversion of 5α (1 la) -dehydrotetracyaline added to tetracycline is about 35%. <I> Example 4 </I> The procedure of Example 1 is followed except that 7-bromo-5a (11a) -dehydro-tetracycline is added to the fermentation system.
The medium is inoculated with a vegetative inoculum of <I> S. </I> aureofaciens (strain S77). The conversion of the added 7-bromo-5a (11a) - dehydrotetracycline to bromotetracycline is about 30%.