CH373375A

CH373375A - Process for preparing tetracyclines

Info

Publication number: CH373375A
Application number: CH5800058A
Authority: CH
Inventors: Daniel Mc Cormick Jerry Robert; Oscar Sjolander Newell; Hirsch Ursula
Original assignee: American Cyanamid Co
Priority date: 1957-04-05
Filing date: 1958-04-03
Publication date: 1963-11-30
Also published as: NL111166C

Description

  

  Procédé de préparation des     tétracyclines       La .présente invention a pour objet     un        procédé     nouveau pour     préparer        les    composés de la série des  tétracyclines, à savoir, la tétracycline, la     chlorotétra-          cycline    et la     bromotétracycline    qui sont des antibioti  ques à large     spectre.     



  Ces tétracyclines répondent à la     formule     
EMI0001.0011     
    dans     laquelle    Z est un .atome d'hydrogène,     de    chlore  ou de brome.     Antérieurement,    on préparait     ces    tétra  cyclines par fermentation aérobie d'un     milieu        nutritif     aqueux à l'aide d'un micro-organisme de     l'espèce     <I>S.</I>     aureofaciens,

      en     travaillant    dans des     conditions     contrôlées en     ce    qui concerne la teneur du     milieu     en ions     chlorure    et/ou en ions bromure.  



  Suivant la présente invention, on prépare les       tétracyclines    de formule I en faisant     fermenter    dans  des     conditions    aérobies un     milieu    nutritif aqueux à  l'aide d'un     micro-organisme    de     l'espèce    S.     aureofa-          ciens,    en présence d'une     5a(11a)-déhydrotétracycline     correspondante, de     formule     
EMI0001.0035     
    Ces     5a(lla)-déhydrotétracyclines    de     formule    II  sont elles-mêmes.

   des antibiotiques nouveaux, obtenus  par un procédé de fermentation décrit dans le brevet  allemand No<B>1089511,</B> comme on     l'indique    plus en  détail dans ledit brevet, ces nouveaux     antibiotiques     sont la 7 -     chloro    -     5a(1    la) -     déhydrotétracycline,    la       5a(11a)-déhydrotétracycline    et la     7-bromo-5a(11a)-          déhydrotétracycline,    et     ils    sont     produits    dans des       conditions    de fermentation appropriées,

   par     certaines     souches mutantes de<I>S.</I>     aureo   <I>f</I>     aciens,    dont     certaines     ont été appelées S1308, S1308-29,     S1308-V146    et       S1308-V237,    dont les cultures ont été     déposées    à       l'American        Type        Culture        Collection,    à Washington,  où elles. ont reçu respectivement les numéros     d'ins-          cription        ATCC    12748, 12749, 12750, 12751.  



  L'activité biologique de ces     5a(lla)-déhydro-          tétracyclines    est assez faible. Cependant,     étant        donné     que les nouvelles souches mutantes de<I>S.</I>     aureofaciens     qui produisent     ces    nouveaux     antibiotiques    sont des  souches à     grand    rendement, produisant fréquem  ment jusqu'à 9000-10 000     gammas/ce    de     7-chloro-          5a(11a)-déhydrotétracycline    par exemple,

   on a fait  des efforts pour     convertir    ces antibiotiques en ceux  possédant     l'activité    antibactérienne typique à spectre  large que l'on     désire    obtenir.  



  La présente     invention    permet     d'obtenir    le résul  tat désiré moyennant une conversion     biologique    de  ces nouveaux antibiotiques en     antibiotiques    à large  spectre désirés. On     convertit    ainsi la     7-chloro-          5a(lla)-déhydro@tétracycline    en     chlorotétracycline,    la       Sa(lla)-déhydrotétracycline    en     tétracycline,    et la     7-          bro#mo-5a(lla)-déhydrotétracycline    en     bromotétra-          cycline.     



  On peut réaliser simplement la présente     invention     en ajoutant les nouveaux antibiotiques à un système  de fermentation     utilisant    des souches     ordinaires    de  <I>S.</I>     aureofaciens.    Ainsi, quand on     ajoute        de    la     7-          chloro    -     5a(1   <I>la)

  </I> -     déhydrotétracycline    à un système           ordinaire    de fermentation     utilisant    des souches ordi  naires de<I>S.</I>     aureofaciens        productrices    de     chloro-          tétracycline,    elle est convertie en     chlorotétracycline.     Jusqu'à présent, la conversion est incomplète,     mais     on a trouvé qu'elle varie de 18 à 48 % dans la  plupart des cas.

      Les conditions de la fermentation sont généra  lement les mêmes que dans les méthodes actuellement  connues de     préparation    de la     chlorotétracycline    et  de la tétracycline par fermentation,     si    ce n'est, évi  demment, que l'on ajoute le nouvel antibiotique, de  préférence au début de la     fermentation.    Le     milieu     de fermentation contient les     substances    nutritives et  minérales usuelles.

   Des substances nutritives appro  priées qui peuvent fournir les principes     nécessaires     sont     notamment        l'amidon,    le dextrose, le sucre de  canne, le glucose, la mélasse, la     farine    de soja, la  farine d'arachide, la levure, les extraits de viande,  la peptone, le     sulfate    d'ammonium, l'urée, la liqueur  de macération de maïs, les produits     solubles    de dis  tillerie, la     farine    de poisson, et d'autres     substances     ordinaires.

   Les sels inorganiques .comprennent notam  ment le carbonate de calcium, le     sulfate    d'ammo  nium, le     chlorure    .d'ammonium, le phosphate mono  sodique, et les divers oligo-éléments tels que le man  ganèse, le cobalt, le zinc, le cuivre, le fer, etc.  



  Les     autres    conditions générales de la fermenta  tion, telles que le pH, la     température,    le temps, le  taux d'aération, la préparation de     l'inoculum,    la sté  rilisation, l'incubation, etc., peuvent être     usuelles    et  sont généralement     similaires.    à     celles    de la prépara  tion de la     chlorotétracycline,        indiquées    dans le brevet  américain No 2482055, et de la préparation de la       tétracycline,    indiquées dans le brevet     américain          Nù    2734018.  



  De même, la     récupération    de la     chlorotétra-          cycline    et de la     .tétracycline    à partir de la     liqueur     de fermentation n'a pas besoin d'être décrite, car de       nombreuses    méthodes ont été     publiées    pour récupé  rer     ces    antibiotiques à partir des liqueurs de fermen  tation. On peut récupérer la     bromotétracycline    de  façon     similaire.     



  Dans les exemples qui suivent, on notera que       certaines    des     opérations    de fermentation sont     con-          duites    en     présence    de certains inhibiteurs de     chloru-          ration,    qui sont le     2,5-dimercapto-1,3,4-thiadiazole,     et le     2-(2-fnryl)-5-mercapto-1,3,4-oxadiazole.    Ces  inhibiteurs ont pour effet de     modifier    la proportion  entre     chlorotétracycline    et     tétracycline    dans la fer  mentation normale de la     chlorotétracycline,

      de ma  nière à donner une     forte    proportion de     tétracycline.     De     cette    façon, il est possible d'observer plus faci  lement la formation de     chlorotétracycline    due à la  conversion de la 7 -     chloro    - 5a(1 la) -     déhydrotétra-          cycline,    car en     l'absence    de ces inhibiteurs des aug  mentations de la quantité de     chlorotétracycline    dues  à la conversion de la     7-chloro-5a(lla)-déhydro-          tétracycline    pourraient passer inaperçues.

      <I>Exemple 1</I>  On prépare un milieu de fermentation qui a la  composition     suivante     
EMI0002.0071     
  
    Amidon <SEP> 55 <SEP> g/1
<tb>  Liqueur <SEP> de <SEP> macération <SEP> de <SEP> maïs <SEP> 25 <SEP> g/1
<tb>  CaCO;; <SEP> .. <SEP> 9 <SEP> g/1
<tb>  (NH4)zSO.<B>l</B> <SEP> 5,6 <SEP> g/1
<tb>  MnS04 <SEP> (70 <SEP> % <SEP> ) <SEP> 80 <SEP> mg/1
<tb>  CoC1,,,6H,0 <SEP> . <SEP> . <SEP> 5 <SEP> mg/1
<tb>  NH4CI <SEP> . <SEP> . <SEP> 1,7 <SEP> g/1
<tb>  Huile <SEP> de <SEP> saindoux <SEP> .

   <SEP> <B>3,2%</B> <SEP> en <SEP> volume       Après     stérilisation    du milieu, on inocule 25     cm,"    du       milieu    dans un     flacon        Erlenmeyer    de 250     cm3,    avec  un     inoculum    végétatif de<I>S.</I>     aureofaciens    (souche  S77).

   On ajoute 100 parties par     million    de     2,5-          dimercapto-1,3,4-thiadiazole    et 500     gammas/cm3    de       7-chloro-5a(11a)-déhydrotétracycline,    et on conduit  la fermentation pendant 120 heures à 250 C sur une       secoueuse    rotative.

   On titre la     chlorotétracycline    de  la     liqueur    par voie     fluorométrique,    et on trouve que  l'augmentation du titre     fluorométrique    due à l'addi  tion de     7-chloro-5a(lla)-déhydrotétracycline    repré  sente 248     gammas/cm3,        ce    qui représente 48 % de  la     conversion        théorique    possible de la     7-chloro-          5a(lla)

  -déhydrotétracycline    en     chlorotétracycline.       <I>Exemple 2</I>    On suit la méthode de l'exemple     précédent    à  cette seule     exception    près que l'on ajoute au     milieu     10 parties par     million    de     2-(2-furyl)-5-mercapto-          1,3,4-oxadiazole    comme     inhibiteur    de     chloruration.     L'accroissement du titre     fluorométrique    de     chloro-          tétracycline    due à l'addition de     7-chloro-5a(lla)

  -          déhydrotétracycline    est de<B>170</B>     gamma-s/cm3,    ce qui       représente    34 % de la conversion théorique de la  7 -     chloro-        5a(11a)    -     déhydrotétracycline    ajoutée en       chlorotétracycline.       <I>Exemple 3</I>    On suit la méthode de l'exemple 1, sauf que  l'on ajoute de la     5a(lla)

  -déhydrotétracycline    au sys  tème de fermentation et que l'on utilise pas     d'inhi-          biteur.    On inocule alors le     milieu    avec un     inoculum          végétatif    de S.     aureofaciens    (souche S77). La con  version de la     5a(1        la)-déhydrotétracyaline    ajoutée en       tétracycline    est d'environ 35 %.    <I>Exemple 4</I>    On suit le     procédé    de l'exemple 1, sauf que l'on  ajoute de la     7-bromo-5a(lla)-déhydrotétracycline     au système de fermentation.

   On     inocule    le     milieu     avec un     inoculum        végétatif    de<I>S.</I>     aureofaciens    (sou  che S77). La conversion de la     7-bromo-5a(lla)-          déhydrotétracycline    ajoutée en     bromotétracycline    est  d'environ 30 %.



  Process for preparing tetracyclines The present invention relates to a novel process for preparing compounds of the tetracycline series, namely tetracycline, chlorotetracycline and bromotetracycline which are broad spectrum antibiotics.



  These tetracyclines meet the formula
EMI0001.0011
    wherein Z is a hydrogen, chlorine or bromine atom. Previously, these tetra cyclins were prepared by aerobic fermentation of an aqueous nutrient medium using a microorganism of the species <I> S. </I> aureofaciens,

      by working under controlled conditions with regard to the content of the medium in chloride ions and / or bromide ions.



  According to the present invention, the tetracyclines of formula I are prepared by aerobically fermenting an aqueous nutrient medium with the aid of a microorganism of the species S. aureofaciens, in the presence of a 5a ( 11a) -dehydrotetracycline corresponding, of formula
EMI0001.0035
    These 5a (11a) -dehydrotetracyclines of formula II are themselves.

   new antibiotics, obtained by a fermentation process described in German patent No. <B> 1089511, </B> as is indicated in more detail in said patent, these new antibiotics are 7 - chloro - 5a (1 la ) - dehydrotetracycline, 5a (11a) -dehydrotetracycline and 7-bromo-5a (11a) - dehydrotetracycline, and they are produced under suitable fermentation conditions,

   by certain mutant strains of <I> S. </I> aureo <I> f </I> aciens, some of which have been designated S1308, S1308-29, S1308-V146 and S1308-V237, whose cultures have been deposited at the American Type Culture Collection, Washington, where they. have received ATCC registration numbers 12748, 12749, 12750, 12751 respectively.



  The biological activity of these 5a (11a) -dehydro-tetracyclines is quite low. However, since the new mutant strains of <I> S. </I> aureofaciens that produce these new antibiotics are high yielding strains, frequently producing up to 9000-10000 gammas / cc of 7-chloro- 5a (11a) -dehydrotetracycline for example,

   Efforts have been made to convert these antibiotics to those possessing the typical broad spectrum antibacterial activity which is desired.



  The present invention achieves the desired result through biological conversion of these novel antibiotics into the desired broad spectrum antibiotics. 7-Chloro-5a (11a) -dehydro @ tetracycline is thus converted to chlorotetracycline, Sa (11a) -dehydrotetracycline to tetracycline, and 7-bro # mo-5a (11a) -dehydrotetracycline to bromotetracycline.



  The present invention can be accomplished simply by adding the novel antibiotics to a fermentation system using ordinary strains of <I> S. </I> aureofaciens. So when we add 7- chloro - 5a (1 <I> la)

  </I> - dehydrotetracycline to an ordinary fermentation system using ordinary strains of <I> S. </I> aureofaciens producing chlorotetracycline, it is converted into chlorotetracycline. So far, the conversion is incomplete, but it has been found to vary from 18 to 48% in most cases.

      The fermentation conditions are generally the same as in the currently known methods of preparing chlorotetracycline and tetracycline by fermentation, except, of course, that the new antibiotic is added, preferably at the start. of fermentation. The fermentation medium contains the usual nutrients and minerals.

   Suitable nutrients which can provide the necessary principles include starch, dextrose, cane sugar, glucose, molasses, soybean meal, peanut meal, yeast, meat extracts, peptone, ammonium sulfate, urea, corn maceration liquor, soluble products from the distillery, fishmeal, and other common substances.

   Inorganic salts include in particular calcium carbonate, ammonium sulphate, ammonium chloride, monosodium phosphate, and various trace elements such as man ganese, cobalt, zinc, copper, iron, etc.



  Other general fermentation conditions, such as pH, temperature, time, rate of aeration, preparation of inoculum, sterilization, incubation, etc., may be customary and are generally similar. to those of the preparation of chlorotetracycline, shown in US Patent No. 2,482055, and of the preparation of tetracycline, shown in US Patent No. 2734018.



  Likewise, the recovery of chlorotetracycline and tetracycline from fermentation liquor need not be described, since many methods have been published to recover these antibiotics from fermen's liquors. tation. Bromotetracycline can be recovered in a similar fashion.



  In the examples which follow it will be appreciated that some of the fermentation operations are carried out in the presence of certain chlorination inhibitors, which are 2,5-dimercapto-1,3,4-thiadiazole, and 2- ( 2-acryl) -5-mercapto-1,3,4-oxadiazole. These inhibitors have the effect of modifying the proportion between chlorotetracycline and tetracycline in the normal fermentation of chlorotetracycline,

      so as to give a high proportion of tetracycline. In this way, it is possible to observe more easily the formation of chlorotetracycline due to the conversion of 7 - chloro - 5a (1 la) - dehydrotetracycline, because in the absence of these inhibitors increases in amount of chlorotetracycline due to the conversion of 7-chloro-5a (11a) -dehydro-tetracycline could go unnoticed.

      <I> Example 1 </I> A fermentation medium is prepared which has the following composition
EMI0002.0071
  
    Starch <SEP> 55 <SEP> g / 1
<tb> Liqueur <SEP> of <SEP> maceration <SEP> of <SEP> corn <SEP> 25 <SEP> g / 1
<tb> CaCO ;; <SEP> .. <SEP> 9 <SEP> g / 1
<tb> (NH4) zSO. <B> l </B> <SEP> 5,6 <SEP> g / 1
<tb> MnS04 <SEP> (70 <SEP>% <SEP>) <SEP> 80 <SEP> mg / 1
<tb> CoC1 ,,, 6H, 0 <SEP>. <SEP>. <SEP> 5 <SEP> mg / 1
<tb> NH4CI <SEP>. <SEP>. <SEP> 1.7 <SEP> g / 1
<tb> Lard <SEP> oil <SEP> <SEP>.

   <SEP> <B> 3.2% </B> <SEP> by <SEP> volume After sterilization of the medium, 25 cm, "of the medium are inoculated into a 250 cm3 Erlenmeyer flask, with a vegetative inoculum of <I > S. </I> aureofaciens (strain S77).

   100 parts per million of 2,5-dimercapto-1,3,4-thiadiazole and 500 gammas / cm3 of 7-chloro-5a (11a) -dehydrotetracycline are added, and the fermentation is carried out for 120 hours at 250 C on a rotary shaker.

   The chlorotetracycline of the liquor is titrated fluorometrically, and it is found that the increase in the fluorometric titre due to the addition of 7-chloro-5a (11a) -dehydrotetracycline represents 248 gammas / cm3, which represents 48%. of the possible theoretical conversion of 7-chloro-5a (lla)

  -dehydrotetracycline to chlorotetracycline. <I> Example 2 </I> We follow the method of the previous example with this one exception that we add to the medium 10 parts per million of 2- (2-furyl) -5-mercapto- 1,3 , 4-oxadiazole as a chlorination inhibitor. The increase in the fluorometric titre of chlorotetracycline due to the addition of 7-chloro-5a (lla)

  - dehydrotetracycline is <B> 170 </B> gamma-s / cm3, which represents 34% of the theoretical conversion of 7 - chloro-5a (11a) - dehydrotetracycline added to chlorotetracycline. <I> Example 3 </I> We follow the method of example 1, except that we add 5a (lla)

  -dehydrotetracycline in the fermentation sys tem and that no inhibitor is used. The medium is then inoculated with a vegetative inoculum of S. aureofaciens (strain S77). The conversion of 5α (1 la) -dehydrotetracyaline added to tetracycline is about 35%. <I> Example 4 </I> The procedure of Example 1 is followed except that 7-bromo-5a (11a) -dehydro-tetracycline is added to the fermentation system.

   The medium is inoculated with a vegetative inoculum of <I> S. </I> aureofaciens (strain S77). The conversion of the added 7-bromo-5a (11a) - dehydrotetracycline to bromotetracycline is about 30%.

Claims

CLAIM Process for preparing tetracyclines of the formula EMI0003.0002 wherein Z is a hydrogen, chlorine or bromine atom, characterized in that an aqueous nutrient medium is aerobically fermented with the aid of a microorganism of the species <I> S. </I> aureofaciens, in the presence of a corresponding 5a (lla) -dehydro-tetracycline,

formula EMI0003.0016