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Nouveau procédé de production de '-carotène.
La présente invention concerne un nouveau procédé de production de ,-carotène par fermentation.
Il est connu d'obtenir du 9-carotène par fermentation submergée de micro-organismes du genre Choanephora ou Blakeslea. Diverses publications ont décrit les conditions tavorisant la production de ,-carotène. BARNETT et coll.
(Science, 123, 141 (1956))ont montré que la production du ,-carotène était améliorée par la culture simultanée des formes opposées d'une même espèce. Cette étude a ensuite été étendue à la culture de formes opposées d'espaces différentes (C.
HESSELTINE -Mycologia, 49, 449 (1957)). Les milieux de cultures
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ont également été examinés et il a été montré que l'addition de graines entières ou hydrolysées, d'huiles végétales, d'agents tensio-actifs, d'antioxydants et d'épaississants augmentait le
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rendement en 0-carotène. (R.ANDEISON et coll - J. Agr. Food.
Chem. ks 543 (1958 (A.CIEGLER et coll. - App. Miorob. 20 94 ' et 98 (1959)).
Enfin MACKINNEY et coll. (J[. Au. Chem. Soc, 7& , 3456 (1952) ) ont montré que l'addition de;rs-ion4ne à la culture statique d'un Phycomyces augmentait fortement la for- mation du ,-carotène, au détriment 'd'autres pigwènts caroténol-
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des* ANDERSON et coll. ont noté le même effet en culture agitée avec des Blalceslea et Choanephora (loc. cit.).
On a maintenant trouvé,, et c'est ce qui fait l'objet de la présente invention, qu'il est intéressant de remplacer, dans les milieux de culture , la p-ionone par la triméthyl-2,
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2, 6 cyelohexanone ou ses dérivés fonctionnels (produits chimiques moins évoluée donc plus accessibles que la '-ionone) et qu'on obtient ainsi une forte augmentation du taux de production de
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,-carotène par -rapport aux milleux')éroolms sans précurseur.
Par "dérivés fonctionnels" 'on entend les produits de condensation de la triméthyl-2, 2,6 cyclohexanone avec l'ammo-
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niao ou son dérivés monosubstituéa, tels que l'oxime, l'hydrazone, la '8!Aicarbazone, la thiose-vicarbazone ou les 1 mines. Parmi ces dérivés on donne la préférence à la semiearbazone.
La triméthyl-2, 2,6 cyclohqxanone (ou son dérivé) peut être ajoutée au milieu de culture, en quantités allant de 0,1 à 10 g/litre, au départ, ou en cours de fermentation, en une ou plusieurs fois. De préférence, on emploie une quantité com- prise entre 1 et 3 g/litre et on effectue l'addition après 1 à 3 jours de culture.
Quels que soient la quantité ajoutée et le moment d'addition de la triméthyl-2. 2, 6 cyclohexanone ou de son dérivé, il convint de poursuivre la culture pendant b à 10 jours après l'ensemencement pour obtenir la production
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maximal. de p-carotène. Le milieu de culture peut varier mais contient essentiellement une source de carbone et une source d'azote assimilables, des éléments minéraux et éventuellement des facteurs de croissance, des antioxydants, des agents tenslo- actifs et des épaississants.
Comme source de carbone assimilable, on peut utiliser des hydrates de carbone (tels que le glucose, les dextrines, l'amidon), des huiles animales ou végétales (comme l'huile de lard, l'huile de soja, l'huile de graine de coton) ou leurs mélanges. Les sources convenables d'azote assimilable sont extrêmement variées elles peuvent être des composés chimiques définis ou des substances complexes contenant principalement l'azote sous forme protidique telles que caséine, lactalbumine, gluten et leurs hydrolysats, farines de soja, d'arachide, ex- traits de levure ,"distillers solubles", "corn-steep".
Parmi les éléments minéraux ajoutés, certains peuvent avoir un effet tampon ou neutralisant comme les phosphates alcalins ou alcalino-terreux.
Parmi les facteurs de croissance, le plus fréquentent employa est la vitamine B1 ou thiamine. Parmi les anti-oxydants on peut citer la N, H'-diphényl paraphénylène - diamine, la triméthyl-2,2,4 éthoxy-6 dihydro-1,2 quinoléine, l'acide ascor- bique ou l'acide sorbique. Les agents tensio-actifs sont de préférence du genre non-ionique tels que des dérivés du sorbitol avec des acides gras, ou des produits à base de condensais d'oxyde d'éthylène. Parmi les épaississants, les plus habituel- lement employés sont l'amidon, la carboxyméthylcellulose, la gé- lose.
On a trouvé que dans ces milieux la triméthyl-2,2,6 cyclohexanone et ses dérivés sont compatibles avec les substances auxiliaires décrites dans la demande de brevet fran- gals déposée le 5 juin 1962 sous le titre "Procédé de production
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de 11-carotèneus c'est-à-dire avec les amides de formule générale
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RCONR1R2 (dans laquelle R représente un atome d'hydrogène, un radical alcoyle ayant au plus 6 atomes de carbone ou un radical aryle ou aralcoyle et %Il.,' identiques ou différents,
représentent chacun un atome d'hydrogène ou un radical alcoyle ayant au plus 4 atomes de carbone
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- ou les dialcoyleulfoxydes dont les radicaux alcoyles contiennent au maximum 4 atomes de carbone.
Le milieu de culture ainsi préparé est ensuite ensemencé par une culture des forces + et - de Blakeslea trispo- ra (NRRL 2456 et 2457).
Les exemples suivants, donnés à titre non limitatif, montrent comment l'invention peut être mise en pratique.
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EXEL'J1LE
Des fioles d'Erlenmeyer de 300 cm3 sont remplies de 50 cm3 d'un milieu de culture dont la composition est la suivan- te
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- hydrolysant de graine de mais...... 75 g - huile de soja .................... 20 cm3 - huile de graine de coton ......... 20 Cûl3 - Tween 80" 1,2 ca3
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<tb> - <SEP> phosphate <SEP> monopotassique <SEP> . <SEP> ......... <SEP> 0,5 <SEP> g
<tb> - <SEP> carboxyméthylcellulose <SEP> ........... <SEP> 20 <SEP> g
<tb>
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- chlorhydrate de tbiam1ne".""'" 0,01 g - eau distillée........comp3êment 1000 cm3 Le pH du milieu est ajusté à 6,2 avec de la soude concentrée.
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Les fioles sont stérilisées pendant 20 minutes à '120 . Après refroidissement on ajoute stérilement dans chaque fiole 0,5 cm3 d'une solution stérile de dihydro-1,2 trimétiyl-2,2,, éthoxy-6 quinoléine à 1% dans du pétrole.
Chaque fiole est ensuite ensemencée avec 5 cm3 d'une culture agitée contenant les deux formes + et - de la souche
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de BlaJceslea trispora (NBRL 2456 et NRRL 2457), et âgée de 24 h.
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Les fioles sont ensuite placées sur une table à agita-
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tion rotative tournant à 220 tr/min dans une enceinte à 278.
Après 2 jours d'incubation, les fioles sont partagées en deux lots équivalents.
A chaque fiole du premier lot sont ajoutés stérilement 0,5 cm3 de, pétrole.
Chaque fiole du second lot reçoit 0,5 cm3 d'une solu-
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tion à 10%' de trimtkïyl-2,,6 cyelohexenone dans du pétrole.
Les, cultures sont poursuivies dans les mêmes conditions de température et d'agitation, pendant 6 jours de plue.
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Au bout de ce temps, la production de p-carotene est maximale dans toutes les fioles.
Le, dosage du f3-carotène est effectué CO!!IIJe suit le mycélium est sépare par filtration, lavé par de l'eau,puis
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séché pendant une nuit sous vide à 350* Le mycélium sec est eri. suite extrait par de l'hexane. On sépare le P-eurotène des autres caroténotdes présents,par une chroaatographie de l'extrait sur alumine. Les fractions d'élution contenant le 11-carotène
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sont réunies et dosées spectrophotométriqueaent par rapport à un échantillon pur de ,-carotçne.
Les productions sontles suivantes:
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Triméttayl-2,2,6 cyclohexanone p-carotënt /1 de milieu initial :tJT!./1 :ot
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<tb> 0 <SEP> 105
<tb>
<tb> 1 <SEP> 170
<tb>
EXEMPLE 2 9
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500 cra3 d'eau contenant 75 g de wd1st111ers' lolubles. sont portés/à l ébullition durant 15 minutes.
Après refroidisse- ment, on ajoute:
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. # Amidon de malt ............................ 50 le #Huile de soja ............................ 30 cm3 - Nulle de co ton ............................ 30 cm3 #"Tween 80............................... 1,2 cm3 - Extrait de levure ........................ 1 g - Phosphate mono potassique ........ w..... 0,5 9 - N,N' diph&vyl paraphnylène diamine ...... 0,1 g - Chlorhydrate de t.ila-ine ................. 0,01 g
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On complète le volume à 1,000 cw3 par de l'eau distillée.
Le mélange est ajusté â ,pH.6,0 avec de la sjude, répar- ti en .rlenwers de 300 cl) à raison de 50 cm3 par fiole,puis Stérilisé pendant 20 minutes à Z2Q . Après refroidissement, on ajoute stérilement dans chaque erlenmeyer 0,5 cm3 de pétrole.
L'ensemencement avec une culture mixte des formes + et - de Blakeslea trispora et le développement des cultures
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ensemencées s'effectuent dans les.conditions décrites dans l' exem- ple 1.
Après 48 heures de développement, les cultures sont ré- parties en 4 séries et chaque erleru..eyer reçoit stérilement les additions suivantes:
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1ère série : pétrole 0,5 CZ130 2eae lu s 50 mg de triméthyl-2,2,6 cyclohexenone
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<tb> en <SEP> solution <SEP> dans <SEP> 0,5 <SEP> cm3 <SEP> de <SEP> pétrole.
<tb>
<tb> 3eme <SEP> * <SEP> : <SEP> 100 <SEP> mg <SEP> de <SEP> triuéthyl-2,2,6 <SEP> cyclohexanone
<tb>
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en solution dans u,5 cn3 de pétrole. 4eme. " t 150 mg de trl:aétiyl-2,Z,6 cyclohexanone
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<tb> en <SEP> solution <SEP> dans <SEP> 0,5 <SEP> ém3 <SEP> de <SEP> pétrole.
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
Les cultures sont encore poursuivies pendant 3 jour - comme dans l'exemple 1.
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Les productions en p-caro.tene déterminées conte dans l'exemple 1 sont les suivantes :
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Tr1mthyl-2,2,6 cyclohexanone p-carotcne
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<tb> 9/litre <SEP> de <SEP> milieu <SEP> mg/litre <SEP> de <SEP> moût
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 0 <SEP> 470
<tb>
<tb>
<tb> 1 <SEP> 690
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 2695
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 3 <SEP> 740
<tb>
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mmÊmmmî,m\\\t i i i j n i . m . m i # i im n i i ###....1 m # m
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ffl#.'iPLK 3- 500 ca3 d'eau contenant 7S g de "distillera' solubles. sont portés à l'ébullition durant 15 minutes.
Après refroidisse- ment on ajoute :
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- Amidon de mais ............a.......... 50 g - Huile de soja ........................ 30 c3 - Huile de coton ........................ 30 c3 - wtween 80" ........................ 5 cm3 - Extrait de levure ...................... 1 g - Phosphate mono potassique ............... ove 9 - DimûthylformroJ1de ........:............. 2 em3 - Sulfate de tianganèse monohydraté ...... 0,1 g - Chlorhydrate de thia.'111ne ............... O,t71 g
On co..plète le volume à 1.000 cm3 par de l'eau distillée.
Le mélange est ajusté à pH 6,0 avec de la -soude et réparti en
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fioles d'Erleneyer de 300 cia3 à raison de 50 c.3 par fiole. Après stérilisation pondant 20 minutes à 1200 et refroidissement @ on ajoute stérilement dans chaque fiole 0,5 cm3 d'une solution
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de triméthyl-2j4- thoxy..6 dihydro-l,2 quinoléine à 1; dans du pétrole.
L'ense1aencel1lent avec une culture mixte des formes + et - de Blakeslea trispora et le développement des culutres en- semencées s'effectuent dans les conditions indiquées dans l'exem- ple 1.
Apres 48 heures de développement les cultures sont ré-
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parties en 3 séries et chaque erlennieyer reçoit stérilement les additions suivantes !
1ère série : 0,5 cm3 de pétrole.
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2ème série : 50 mg do trimthyl-2,, cyclchexafione en solution dans 0, 5 cm3 de pétrole.
3émue série 60 g decse lcarbaone de la triméthy.-2,?!pb' cyclohexanone sous forme d'une suspension à 7% dans l'eau addi- tionnée de 1%de "Tween 80" et 0,5 cm3 de pétrole.
@ Les cultures sont poursuivies âpres ces additions peh-
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dant,6 jours de plus dans les ra:aes conditions de tempéra turc
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et d'agitation. Au bout de ce temps la production de ss-carotène est maximale dans toutes les fioles.
Les productions en 0-carotène, déterminées comme dans l'exemple 1, sont les suivantes :
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<tb> Addition <SEP> à <SEP> 48 <SEP> h <SEP> Production <SEP> de
<tb>
<tb> 9-carotène <SEP> en
<tb>
<tb> mg/litre <SEP> de <SEP> moût
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Pétrole <SEP> 820
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
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Trlmdthyl-2,2,6
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<tb> cyclohexanone
<tb> + <SEP> pétrole <SEP> 940
<tb>
<tb> Semicarbazone <SEP> de <SEP> la
<tb> trim3thyl-2,2,6
<tb> cyclohexanone
<tb> + <SEP> pétrole <SEP> 1110
<tb>
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EXH.MhLE L m Dans un fermenteur de 30 litrea on charge : . n1.ttll.r.- solubles ..... 1500 a - Eau 11 litres
Le mélange est agité et chauffé à 95 pendant 10 minutes.
Après refroidissement on ajuste à pH 6,4 avec 70 cm3 de soude
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10 Ii et on complète le milieu avec les matières prenieros suivan- tes :
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<tb> Amidon <SEP> 750 <SEP> g
<tb>
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- Huile de soja ................ 450 em3 - auile de coton ....* 450 cm3
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<tb> -'Tween <SEP> 80" <SEP> ............. <SEP> 75 <SEP> cm3
<tb>
<tb> - <SEP> Extrait <SEP> de <SEP> levure <SEP> 15 <SEP> g
<tb>
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- Phosphate monopotassiquë ..... bzz - Suif s te de manganèse monohy- draté ........ 1,5 . g - TrILmét;âyl-2s2#4 ét:.oxy-6
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<tb> dihydro-1,2 <SEP> quinoléine <SEP> 1,5 <SEP> cm3
<tb>
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Solution de chlornydrbte
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<tb> de <SEP> thiamine <SEP> à <SEP> 0,3 <SEP> g/litre. <SEP> 250 <SEP> cm3.
<tb>
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Le volume est hj'tBté à 15 litres avec de l'eau, ;.
- pu du aélango est à 6,40. Le milieu est stérilisé pendant ] 50
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minutes à 122 avec injection de vcpeur. Après refroidissement le pH est à' 5,85 et le volume est de 14,2 litres,
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On a joute alors stérilement 30 c3 de diL1tJttylfor:r.8.I:!ide et 150 or3.do pétrole. Le fermenteur est ensuite ensemencé* avec deux cultures inoculum en fer.r.enteur8 figées de ad heures ' de la couche BlaKe81ea trispora raison de 750 c. 3 de culture de la forme + (NRRL 2456) et de 750 c¯'.3 do culture de la for;:.è ...
(NRRL 2457). La culture est développée à 26-27 avec agitation
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par turbine- à k0U y tr/rain et aération avec un débit de i.,2 m3/h.
Après 48 heures de développement on ajoute stérilement 15 cm3 de xriméttlrl.-z,z,6 cyclohexanone en solution dans 150 cr3 de pétrole. Après cette addition la culture est poursuivie dans les mêmes conditions d'aération, d'agitation et de température pendant 5 Jours de plus.
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La production en 0-cerot,net dosé aoc..e indiqué dans l'exemple 1, atteint alors 580 mg/1.
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Dans un autre fer.J4èn teur de 30 litres on prépare de la même façon le milieu décrit ci-dessus. Apres stérilisation et refroidissement on ajoute également 30 ca3 de discthylfortsarti- de et 150 cn3 de pétrole. Le milieu est ensuite eL3eencé dans les conditions décrites ci-dessus avec les i2^.es e cultures 1noQulu.,.s. ",,' Après 48 heures de développement on ajoute stérile-' :.lent 150 e.:13 de pétrole et 21 g de seaiearbazone de la tr1éthyl-
2,2,6 cyclohexanone sous forue d'une suspension à 7% dans l'eau , additionnée de 1% de "Tween" 80". Après ces additions la cul- ture est poursuivie dans les mêmes conditions d'aération, d'agita tion et de température pendant 5 jours de plus.
@
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La production en p-carotène est alors de 765 .11g/1.