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PROCEDE DE RECUPERATION DE TRYPSINE A PARTIR DE GLANDES DE PANCREAS.
La présente invention concerne un procédé de récupération de trypsine cristalline à partir de mélanges de tissus contenant des enzymes et de sol- vants organiques, puis elle a plus particulièrement trait à la préparation de trypsine sous une forme cristalline appropriée à l'usage médical.
On sait que les glandes de pancréas de mammifères contiennent à la fois de l'insuline et des enzymes protéolytiques comprenant la trypsine.
Les préparations d'enzymes, telles que la pancréatine, qui est constituée par un mélange d'enzymes amorphes et qui est largement utilisée dans l'indus- trie des textiles et dans l'industrie du tannage, ont été obtenues à partir de glandes fraîches de pancréas depuis de nombreuses années. Les enzymes cristallines pures ont également été préparées à l'échelle du laboratoire à partir de glandesfraîches de pancréas
L'extraction des pro-enzymes à partir des glandes de pancréas peut être éxécutée d'un certain nombre de manières différentes. Suivant, dans une certaine mesure, la nature des tissus particuliers de pancréas, la mesure de l'agitation et d'autres facteurs, il n'a été possible, jusqu'à présent, que d'extraire de 60 à 80% des enzymes en une période de 48 heures.
Dans l'extraction à l'échelle industrielle, des périodes de 48 heures sont indésirables, parce que l'utilisation de l'appareillage d'extrac- tion est sérieusement limitée. En conséquence, on désire créer un procédé d'exécution de l'extraction des enzymes d'une manière sensiblement complète dans un laps de temps très réduit.
En pratique, les glandes de pancréas, qui sont soumises selon l'invention au procédé d'extraction d'enzymes, contiennent des particules grasses. Spécialement, lorsqu'on utilise des glandes de pancréas de porc , qui contiennent environ 30 à 40% dë graisse, on a trouvé que l'extraction est très difficile. Mais, même avec de moindres quantités de graisse, on a constaté qu'elles n'influencent pas seulement 1(.opération d'extraction, mais
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également la cristallisation subséquente.
En conséquence, selon l'un de ses aspects, la,présente invention est basée sur la constatation qu'afin d'exécuter un procédé donnant dans sa dernière opération une trypsine cristalline appropriée à l'usage médical, il est important d'éliminer les particules de graisse de la matière glandu- laire. Un problème particulier relatif à la séparation des particules gras- ses des glandes est dû au fait que les graisses se trouvant fréquemment ré- parties dans tout le tissu et qu'elles empêchent; en conséquence, un contact efficace entre le liquide aqueux utilisé pour l'extraction et le tissu por- tant les enzymes dans une mesure telle qu'il est difficile d'exécuter le pro- cédé avec un rendement satisfaisant dans un temps raisonnable.
Le facteur temps présente aussi un problème en ce que les enzymes sont des substances très sensibles qui sont sujettes à perte d'activité si le traitement est exagérément prolongé.
Confornément à cette constatation, le procédé'de la présente invention pour récupérer de la trypsine cristalline à partis de mélanges de glandes de pancréas réduites contenant des enzymes et de solvants organiques est caractérisé en ce que les glandes sont soumises, en présence d'un agert extracteur, à un traitement mécanique, tel qu'une distorsion, après quoi la trypsine extraite est soumise à cristallisation.
Ainsi, une importante caractéristique de l'invention réside dans la distorsion des glandes au cours de l'extraction, cette distorsion soumet- tant ces glandes à une flexion produisant un pressurage analogue au pressa- ge d'une éponge, ce qui a pour résultat partiellement que les solvants peu- vent pénétrer dans les tissus d'une manière complète pour effectuer la récu- pération des enzymes, afin d'accélérer leur extraction et partiellement pour produire un relâchement ou un dégagement des substances grasses de l'intérieur des glandes, en permettant aux particules grasses dégagées d'être retirées du tissu.
Comme on peut facilement le comprendre, on obtient de ce fait à la fois une augmentation du rendement et une réduction de la durée de l'ex- traction.
Un autre avantage important de l'exécution du procédé de la ma- nière décrite consiste en ce que les forces de distorsion ont pour effet de retirer les particules grasses de l'intérieur du tissu glandulaire et égale - ment de favoriser la formation de masses agglutinées de particules grasses qui tendent à s'élever à la surface de la solution d'extraction et qui peu- vent ensuite être retirées par écumage ou centrifugeage. La production d'une solution d'enzymes sensiblement exempte de graisse par le procédé de la pré- sente invention a rendu possible d'obtenir des enzymes cristallines à partir de glandes contenant des quantités importantes de particules grasses. En reconnaissant cette nécessité d'une solution d'enzymes essentiellement exemp- te de graisse, on empêche la formation de trypsine cristalline à partir de glandes contenant des graisses.
On pense que cet effet résulte des influen- ces défavorables des particules grasses suf la formation d'enzymes cristal- lines au cours de l'opération de cristallisation subséquente.
Dans la mise en oeuvre du procédé, ceci peut être effectué rapi- dement selon l'invention en faisant passer les glandes sous la forme d'une bouillie à travers une zone de @istorsion, par exemple, dans une pompe à turbine sans soumettre la matière glandulaire à une autre subdivision notable quelconque. Ceci est nettement différent du' procédé antérieur@@@t connu d'extraction d'insuline dans lequel on a proposé d'améliorer l'extraction d'enzymes protéolytiques en élevant le degré de subdivision des glandes, par exemple en les faisant passer à travers un broyeur à grande vitesse. Mais ceci n'a pas été démontré satisfaisant en raison des difficultés accrues qui en résultent dans la séparation des extraits à partir du tissu finement di- visé.
La matière de départ servant à effectuer l'opération d'extraction selon le procédé de l'invention peut être constituée par les résidus prove-
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vebant de l'extraction d'insuline à partir de glandes de pancréas réduites en faisant venir ces glandes en contact avec un solvant organique miscible à l'eau pour l'insuline. En partant de ces résidus, la première opération du procédé de l'invention consiste à former une bouillie contenant les pro- duits solides des résidus et un solvant d'extraction liquide contenant au moins 80% d'eau en volume.
Etant donné que la partie liquide des résidus peut comporter immédiatement après l'extraction de l'insuline une concentra- tion supérieure à 50% de solvant organique, il sera généralement nécessaire de réduire la concentration du soldant organique contenu dans les résidus, de préférence pour qu'elle contienne au moins 3 parties en poids d'un solvant d'extraction aqueux (contenant au moins 80% d'eau) pour chaque partie de produit solide et on peut utiliser jusqu'à environ 30 parties de solvant par partie de solides. On utilise de préférence entre environ 6 et 12 parties de solvant d'extraction pour chaque partie de solides et il semble que les résultats optima sont obtenus lorsqu'on emploie environ 9 parties de solvant d'extraction pour chaque partie de solides.
Si on le désire, on peut utili- ser pour former la bouillie le procédé ordinairement appliqué qui consiste à diluer les résidus en y ajoutant de l'eau jusqu'à ce que la concentration" de solvant organique soit réduite à la valeur désirée. Après la formation de la bouillie, on effectue l'extraction de trypsine. On préfère'amener le tissu et le solvant d'extraction en contact à un pH inférieur à 6,5, de pré- férence au-dessous de 4, et utiliser une température comprise entre 0 et 5 C lorsqu'on traite des glandes de porc, puis une température allant jusqu'à 15 C lorsqu'on traite des matières premières ayant une teneur quelque peu inférieure en matière lipoidale.
Afin que l'extraction des enzymes soit effectuée aussi complète- ment que possible, on préfère faire passer la bouillie plusieurs fois à tra- vers la zone dans laquelle les morceaux glandulaires sont distordus et, afin de faciliter la séparation entre la matière lipoidale et l'extrait, la bouil- lie est soumise à une douce agitation entre les passes, de manière que les particules de graisses tendent à se coaguler pour former de plus gros agglo- mérés ayant tendance à s'élever à la surface de la bouillie en raison de leur poids spécifique quelque peu inférieur. Les plus gros agrégats des particu- les de graisse peuvent ensuite être retirés par écumage.
L'invention est expliquée ci-après à l'aide du dessin schémati- que annexé.
La figure 1 est un schéma de courant simplifié du procédé d'ex- traction de trypsine à partir de glandes de pancréas.
La figure 2 est une vue en perspective des éléments explosés de la pompe utilisée dans le circuit de la figure 1.
Un réservoir 10 est représenté dans l'angle gauche supérieur de la figure 1, ce réservoir contient les glandes de pancréas et la quantité nécessaire d'eau acidifiée. Ce mélahge est pompé du réservoir 10 dans l'ap- pareil de distillation à vapeur d'eau 11, dans lequel le(-solvant organique est retiré par distillation sous pression réduite. L'appareil de distilla- tion est alimenté en vapeur d'eau par une canalisation 11b. Le solvant or- ganique, qui sera généralement de l'alcool éthylique, quitte à son sommet lla l'appareil de distillation à vapeur d'eau 11 et passe à travers un con- denseur 12, dans lequel il est condensé en un liquide qui est amené à un réservoir 13. d'alcool récupéré.
La bouillie restant dans l'appareil de distillation à vapeur d'eau 11 peut être amenée à passer à un extracteur 14. Suivant l'exemple représen- té, cet extracteur est,muni d'une chemise 14a à travers laquelle on fait cir- culer de la saumure réfrigérante entrant par le tuyau 14c et sortant par-le tuyau 14d, pour refroidir la bouillie. L'extracteur 14 est également muni d'un agitateur 15. On préfère maintenir la bouillie dans l'extracteur 14 pendant un temps assez long pour permettre son refroidissement au moins à 15 C pendant ce temps, on peut faire fonctionner l'agitateur 15 pour mainte- nir les morceaux solides de la bouillie en suspension.
Après le refroidisse-
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ment de la bouillie à la température désirée, on.la fait passer au moyen de la canalisation de sortie 16 prévue au fond de l'extracteur par la pompe 17' et elle est ramenée à la partie supérieure de l'extracteur au moyen de la canalisation 18.
A l'intérieur de la pompe 17, la bouillie est maintenue à un état de violente agitation, les morceaux de matière glandulaire se trouvant en même temps distordus en leur faisant prendre une succession de formes irré- gulièresa On a trouvé qu'une pompe à turbine est l'appareillage convenant le mieux pour obtenir ce résultat. La figure 2.montre une vue en perspecti- ve de la pompe 17, dont les pièces sont séparées.' Dans l'exemple représenté, la pompe 17 est constituée par une enveloppe cylindrique 17a destinée à ren- fermer une turbine 17b à fortes aubes, qui est montée sur l'arbre d'un moteur et maintenue dans l'enveloppe 17a par une plaque de fermeture 17c. Lorsque on fait fonctionner la pompe, la bouillie entre par l'admission 17d et sort par la sortie 17e.
Pendant qu'elle se trouve dans l'enveloppe 17a la bouillie est maintenue à un état de violente agitation, en raison de la rotation rapi- de de la turbine 17b et les morceaux de matière glandulaire sont ainsi dis- tordus en leur faisant prendre une succession de formes irrégulières par l'ac- tion combinée des aubes de-la turbine 17b et des parois de l'enveloppe 17a.
Le mouvement rotatif de brassage imprimé à la bouillie favorise la séparation et l'agglomération des particules de graisse. Il est évident qu'il est dési- rable de faire tourner la turbine 17b à grande vitesse. Par exemple, on peut faire tourner la turbine entre 450 et 1750 tours à la minute.
Au cours des expériences, une pompe du type décrit ayant une ca- pacité d'environ 10 litres à la minute a été utilisée pour faire circuler la bouillie de la base d'une cuve d'extracteur d'une capacité de 20 litres environ en la renvoyant dans la partie supérieure de cette cuve d'extracteur.
Bien que l'on puisse faire varier considérablement la durée du cycle de pom- page suivant la grandeur ou la capacité particulière de la pompe, il est dé- sirable de faire passer la bouillie à travers la pompe à turbine plusieurs fois au cours du cycle de pompage. Par exemple, lorsqu'on utilise la pompe ayant'aune capacité de 10 litres mentionnée ci-dessus, on a trouvé désirable de faire passer la bouillie à travers la pompe quinze fois pendant un cycle de pompage de 30 minutes. Ensuite, la bouillie est maintenue dans l'extrac- teur pendant un certain laps de temps et, de préférence avec une légère agi- tation, pour produire une nouvelle agglutination des particules de graisse.
Par exemple , la bouillie peut être maintenue dans l'extracteur 14 et agitée douvement par l'agitateur 15 pendant 15 minutes. Au cours de ce laps de temps, les particules de graisse tendent à s'élever à la surface et à s'agglutiner en agglomérés dont au moins les plus gros peuvent être retirés par écumage et évacués par le tuyau 14b. Après la période de repos, on a trouvé désira- ble de soumettre la bouillie à un autre cycle de pompage, qui peut avoir environ la même durée que le premier cycle de pompage. Par exemple, on peut faire passer la bouillie de nouveau par la pompe 17 pendant un laps de temps de 30 minutes.
On a constaté que par cette succession d'opérations, l'extrac- tion des enzymes peut être effectuée à peu près complètement en une à deux heures, alors qu'il fallait antérieurement 48 heures pour obtenir les mêmes résultats,bien que 60à 80% des enzymes aient été extraites dans l'appareil de distillation à vapeur d'eau 11.
On fait ensuite passer la bouillie de l'extracteur 14 à une cen- trifugeuse 19, dans laquelle le résidu usé est séparé de la partie liquide, La partie liquide contient les particules de graisse qui s'agglutinent enco- re sous l'action centrifuge. Le produit centrifugé ou partie liquide est amené à passer dans un écumeur de graisse 20 pouvant affecter la forme d'une petite cuve présentant une lèvre 20a à sa partie supérieure. L'extrait est maintenu dans l'écumeur 20 suffisamment longtemps pour permettre aux parti- cules de graisse de s'élever à la surface et d'être retirées par écumage de la surface en passant sur la lèvre 20a et par le tuyau 20b. L'extrait exempt de graisse est ensuite amené à passer dans une cuve 21, dans;laquelle on peut ajouter du sulfate d'ammonium ou un autre réactif pour assurer la sépa- ration et l'activation de trypsine.
Le résidu usé est évacué par le tuyau 19a.
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Comme on l'a précédemment indiqué, la matière de départ pour exé- cuter le nouveau procédé d'extraction de cette invention est de préférence constituée par les résidus provenant de l'extraction d'insuline à partir de glandes de pancréas réduites en faisant venir ces glandes en contact avec un solvant organique miscible à l'eau pour l'insuline. Cependant, il est évident que le procédé de l'invention est également applicable à l'extraction de trypsine à partir de glandes fraîches de pancréas.
Pour illustrer plus complètement les détails de cette invention, on donne ci-après des exemples.
EXEMPLE 1.
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De la trypsine fut récupérée à partir de résidus de pancréas de boeuf exempts d'insuline par:le mode opératoire suivant : les résidus conte- naient environ 70% de liquide et 30% de solides en poids, puis la partie li- quide était constituée par 65% d'éthanol en volume acidifié au pH 2,85. 450kg de ces résidus furent mis en suspension dans 1500 litres d'eau de conduite qui contenait 2200 cm3 de H2SO$ concentré. Après que la suspension eut été préparée, en utilisant un agitateur du type à turbine, la bouillie fut pompée dans l'appareil de distillation.
La distillation fut effectuée dans un ap- pareil du type à pot sous vide à une température moyenne de 16 à 21 C et 30 C au maximum. 650 litres de liquide, soit environ 30% d'éthanol; furent reti- rés au cours de cette opération. La concentration d'alcool du concentré se trouvant dans l'appareil de distillation était d'environ 1 %. Le concentré fut ensuite dilue'avec 250 litres d'eau de conduite afin d'obtenir une con- sistance permettant de la faire circuler.
Le liquide dilué fut ensuite ramené à son réservoir de départ et refroidi à 4 C. L'extraction fut effectuée avec deux circulations de 30 minutes à travers une pompe à turbine à trois aubes. La suspension fut agi- tée lentement avec un agitateur à turbine pendant 15 minutes entre et après les cycles de circulation. Cette action permit aux particules de graisse de s'agglutiner avant nouvelle extraction et nouveau traitement. Les parti- cules de graisses agglutinées furent retirées pendant ces opérations par écu- mage.
La séparation fut effectuée dans une centrifugeuse Bird du type cylindrique. Le tissu provenant de la première centrifugation fut mis en suspension dans 850 litres d'eau de conduite contenant 340 cm3 de H2SO4.
Le lavage fut effectué par une circulation de 30 minutes à travers la pompe à turbine. La suspension obtenue fut ensuite centrifugée et le liquide sor- tant fut ajouté à celui obtenu de la première séparation. La trypsine cris- talline fut ensuite récupérée de la solution par précipitation fractionnée.
EXEMPLE 2.
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Le mode opératoire de l'exemple 1 fut suivi essentiellement, sauf que l'on remplaça les résidus de pancréas de boeuf par des résidus de pancréas de porc. En raison de la plus forte teneur en graisse ou matière lipoïdale contenue dans les glandes de pancréas de porc (en moyenne 30 à 40% comparativement à 5 à 10% pour les glandes de pancréas de boeuf), la bouillie fut réfrigérée après l'opération de distillation à environ 0 C ou légèrement au-dessous, puis maintenue à cette température pendant l'extraction à la pom- pe et le centrifugeage, afin de favoriser l'agglutination et la séparation des particules de graisse et d'empêcher la graisse de gêner@la récupération de trypsine cristalline.
Une autre modification du mode opératoire consiste à faire passer le produit centrifugé dans une petite cuve immédiatement après la séparation des résidus usés. Le produit centrifugé fut maintenu dans cette cave d'écu- mage assez longtemps pour permettre aux particules de graisse qui avaient été de nouveau agglutinées par la centrifugation de s'élever à la surface et d'ê- tre retirées par écumage. De cette manière, on obtintt un extrait sensible-
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ment exempt de graisse.
EXEMPLE 3.
La trypsine cristalline peut être récupérée à partir de glandes fraîches de pancréas par le mode opératoire suivant : des glandes de pancréas broyées sont mises en suspension dans 2 parties en poids d'eau acidifiée à l'acide sulfurique à 0,25 N. La bouillie obtenue contient généralement en- viron 11 parties en poids de liquide pour chaque partie en poids de solides.
On fait ensuite passer la bouillie à une cuve munie d'une chemise dans laquel- le elle est refroidie à environ 4 C pour les glandes de pancréas de boeuf et à environ - 1 C pour les glandes de pancréas de porc. On fait ensuite circuler la bouillie du réservoir à travers une pompe à turbine et on la ra- mène au réservoir pendant 15 minutes. La pompe est arrêtée et la bouillie est agitée doucement pendant 15 minutes, puis les plus gros agglomérés de graisse sont retirés en même temps par écumage. La pompe est de nouveau mi- se en marche et on fait passer la bouillie pendant un nouveau cycle de cir- culation de 15 minutes.
La matière glandulaire solide est ensuite séparée par centrifu- geage et maintenue pour l'extraction de l'insuline à partir de cette matière.
L'opération de centrifugeage fait de nouveau agglutiner les particules de graisse séparées et elles peuvent être retirées par le mode opératoire décrit à l'exemple 2. L'élimination du reste de la graisse à partir de l'extrait à ce point est particulièrement importante lorsque la matière de départ est constituée par des glandes de pancréas de porc.
Du sulfate d'ammonium est ajouté au produit centrifugé jusqu'à ce qu'on obtienne une concentration de 0,4 de saturation. La suspension ré- sultante est laissée reposer à 5 C pendant 48 heures.
La suspension est ensuite filtrée et le précipité contenant la fraction de protéines animales est évacué. Du sulfate d'ammonium est ajou- té à la couche surnageante jusqu'à 0,7 de saturation et on laisse reposer la suspension obtenue pendant 48 heures à 5 C. Le précipité d'enzymes brut est séparé et la couche surnageante est évacuée.
Le gâteau à 0,7 de saturation est retravaillé en le dissolvant dans 10 volumes d'eau distillée et en le refractionnant par des opérations de traitement au sulfate d'ammonium à 0,4 et 0,7 de saturation à 5 C. Le gateau saturé à 0,7 obtenu par ces opérations peut être retravaillé de nouveau en le dissolvant dans 3 volumes d'eau distillée et en le refraction- nant par des opérations de saturation au sulfate d'ammonium à 0,4 et 0,7 à 25 Co
Le gâteau saturé à 0,7 ainsi obtenu est dissous dans 1,5 volume d'eau distillée à 25 Ca La solution de sulfate d'ammonium saturée est ajou- tée à 0,25 de saturation. Le pH est réglé à 5 avec 5 N NaOH.
On inocule dans la solution une petite quantité de cristaux de chymotrypsinogène et la solution est laissée reposer à 25 C jusqu'à ce que la cristallisation du cbhymotrypsinogène soit complète; il faut usuellement de 48 à 72 heures.
La suspension est ensuite filtrée.
Le pH du produit filtré après la séparation du chymotrypsino gè- ne brut est réglé à 3 avec 5 N H2SO4. Du sulfate d'ammonium est ajouté à cette solution à 0,7 de saturation. La suspension est filtrée et le pro- duit filtré est évacué. Le précipité obtenu est dissous dans 3 volumes d'eau distillée et retravaillé par une saturation au sulfate d'ammonium de 0,4 et 0,7 à 25 C. Le précipité saturé à 0,7 est dissous dans 1,5 volume de tampon au borate d'un pH 9 à 10 C. Le pH de la solution est réglé à 7 avec du 5 N NaOH. Le sulfate de magnésium saturé est ajouté à une saturation de 0,5.
La solution est maintenue à 5 C jusqu'à ce que la cristallisation de la tryp- sine soit complète; il faut ordinairement de 7 à 9 jours. La suspension de cristallisation est séparée par filtrage et le produit filtré est évacué, Le gâteau de trypsine cristalline peut ensuite être maintenu à - 5 C ou mis en suspension dans 10 volumes d'eau et lyophilisé.
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EXEMPLE 4.
De la trypsine cristalline peut être préparée par le mode opéra- toire suivant 7 parties d'eau sont ajoutées à chaque partie de résidus de glandes de pancréas après l'extraction de l'insuline pour former une bouillie contenant au moins 21 parties de liquide pour chaque partie de solides. La bouillie est ensuite conduite dans une cuve dans laquelle elle est refroidie à au moins 4 C. Après 'avoir atteint la température désirée, on fait circu- ler la bouillie à travers une pompe à turbine à trois aubes pendant 15 mi- nutes, on la laisse reposer avec une légère agitation dans la cuve pendant 15 minutes et on la fait circuler de nouveau à travers la pompe pendant 15 minutes.
Une partie de la graisse séparée peut être retirée par écumage pen- dant que la bouillie est au repos dans la cuve entre les cylles de circula- tiona
L'extrait est séparé des résidus usés par centrifugeage, clarifié, puis on obtient un précipité de trypsinogène brut à 0,8 de saturation avec du sulfate d'ammoniumo Ce précipité est séparé par filtrage et le gâteau de filtrage est dissous dans 6 volumes d'eau, puis l'épuration est effectuée en ajoutant un sulfate d'ammonium saturé à une concentration entre 0,35 et 0,55. La trypsine est ensuite cristallisée au pH 7,1 à 7,5 dans une solution de tampon au borate à 0,3 de saturation avec du sulfate de magnésium. Le sel de borate est retiré de la trypsine cristalline par dialyse et, après clarification, la matière dialysée est placée dans des flacons.
EXEMPLE 5.
Pour traiter rapidement les résidus afin d'obtenir la trypsine cristalline, on peut procéder de la faon suivante : on met 450 kg de rési- dus en suspension dans 1500 litres d'eau contenant 2200 cm3 d'acide sulfuri- que. On retire 650 litres de liquide par distillation sous pression réduite.
On refroidit le concentré à 0 C. On fait circuler à travers une pompe à tur- bine pendant 15 minutes. On centrifuge et on écume la graisse du liquide sortant dans une cuve d'écumage. On met le résidu en suspension dans 750 litres d'eau contenant 300 cm3 d'acide sulfurique. On fait circuler à tra- vers une pompe à turbine pendant 15 minutes. On centrifuge et on écume le liquide sortant, comme précédemment. On combine l'extrait et on précipite le trypsinogène avec saturation entre 0,4 et 0,7 de sulfate d'ammonium, après avoir précipité tout d'abord et séparé les contaminants inertes à une satura- tion de 0,4 de sulfate d'ammonium. Le gâteau d'enzymes brut ainsi obtenu peut être retravaillé pour obtenir le chymotrypsinogène et la trypsine sous la forme cristalline par le mode opératoire de l'exemple 3.
Bien que dans ce qui précède l'intention ait été décrite avec beaucoup de détails pour illustrer certains modes de réalisation, il est évi- dent que l'on peut faire varier ces détails dans une large mesure sans sor- tir de son cadre.