BE1028712A1 - Composition para-pharmaceutique ou pharmaceutique administrable à un être vivant, de préférence un être humain comprenant au moins une enzyme pour le traitement et/ou la prévention d'infections bactériennes impliquant la formation de biofilm - Google Patents

Composition para-pharmaceutique ou pharmaceutique administrable à un être vivant, de préférence un être humain comprenant au moins une enzyme pour le traitement et/ou la prévention d'infections bactériennes impliquant la formation de biofilm Download PDF

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Abstract

Composition para-pharmaceutique ou pharmaceutique administrable à l’être vivant, en particulier à l’être humain comprenant au moins une enzyme endoribonucléase choisie parmi les classes EC 3.1.30 et EC 3.1.31, de préférence à une teneur de 10 à 1000U/ml, de préférence 50 à 500U/ml, de préférence de 100 à 500U/ml pour une utilisation dans un traitement curatif ou préventif des infections dermatologiques ou d’infections se développant sur des brûlures et des plaies superficielles ou profondes

Description

COMPOSITION PARA -PHARMACEUTIQUE OU PHARMACEUTIQUE ADMINISTRABLE A UN ETRE VIVANT, DE PREFERENCE UN ETRE HUMAIN COMPRENANT AU MOINS UNE ENZYME POUR LE TRAITEMENT ET/OU LA PREVENTION D'INFECTIONS
BACTERIENNES IMPLIQUANT LA FORMATION DE BIOFILM La présente invention se rapporte à une composition para- pharmaceutique ou pharmaceutique administrable à l'être vivant et en particulier humain comprenant au moins Une enzyme ainsi qu’à son utilisation en tant que potentialisateur dans le traitement et/ou la prévention d'infections bactériennes impliquant la formation de biofilm, comme par exemple les infections post-implantatoires, liées aux implants médicaux in situ, et donc implantés, et les infections diverses du corps comme les infections aigues ou chroniques des plaies, des brûlures, les infections de la cavité orale, du tractus digestif, du système urinaire, du système respiratoire.
Un biofilm est une pellicule visqueuse qui se développe sur toutes les surfaces, suite à l'adhésion de microorganismes sur ces surfaces et à la sécrétion par ceux-ci de polymères qui les recouvrent et facilitent leur adhésion. Les biofilms constituent ainsi une couche de protection autour des microorganismes et représentent une source récurrente de contamination du milieu environnant qui pose des problèmes majeurs en termes de santé, par exemple dans les milieux hospitaliers.
Plus spécifiquement, l'accumulation de polymères secrétés par les bactéries crée une matrice composée essentiellement de polysaccharides, d'ADN, de protéines ainsi que de lipides qui protège ces microorganismes des agressions extérieures et qui présente une très forte résistance aux procédures de nettoyage et de désinfection conventionnelles. Les microorganismes se développent donc aisément au sein de cette matrice protectrice et contaminent le milieu environnant en constituant un réservoir particulièrement critique et difficile à éliminer.
Il est reconnu que la problématique de la présence de biofilms est double. Premièrement, comme indiqué plus haut, ceux-ci représentent une source de contamination permanente et très difficile à éliminer par des moyens conventionnels, même les plus agressifs. En effet, les désinfectants classiques sont très souvent inefficaces car il est observé qu'ils ne parviennent pas à atteindre les microorganismes qui sont protégés par la matrice du biofilm composée de polysaccharides, d’ ADN, de protéines et de lipides.
Deuxièmement, un biofilm est mixte, en ce sens qu'il est initialement développé par certaines souches bactériennes mais qu'il peut en abrter d'autres, ces souches vivant et se développant en colonies. Or, ces colonies favorisent la communication entre bactéries et, entre-autre, l'échange et la propagation de gènes de résistance portés par certaines bactéries. Les biofilms résultant de ces échanges de gènes sont alors encore plus difficiles à éliminer et il faut recourir à des moyens de désinfection ou de traitement de plus en plus puissants qui se heurtent toutefois fréquemment à des problèmes de résistance et/ou de tolérance majeurs.
La matrice de protection des bactéries formant les biofilms est si résistante qu'elle constitue une véritable barrière protégeant les bactéries des agents microbicides (antibiotiques et/ou biocides) qui pourraient agir contre les microorganismes et donc contre les infections liées à la présence de biofilms, dont les infections du corps humain associées à la présence de biofilm. Actuellement, les traitements classiques à base de différents antibiotiques et/ou de différents biocides (désinfectants…), même lorsqu'ils sont, dans certains cas, en association avec d'autres composés (détergents formulés et/ou séquestrants et/ou dispersants et/ou tensioactifs), n'agissent pas de manière suffisamment efficace car ils ne pénètrent pas ou seulement de façon limitée le biofilm dans son épaisseur. Par ailleurs, les microbicides peuvent être inhibés par certaines molécules composant cette matrice. Par conséquent, les traitements actuels ne sont que partiellement efficaces, et agissent uniquement à la surface du biofilm, la matrice du biofilm protégeant efficacement les bactéries de phénomènes de déshydratation, de l'action des antibiotiques et des biocides (et plus généralement des molécules microbicides), de la phagocytose et des acides.
En ce sens, il est d'ailleurs généralement admis que les biofilms présentent une résistance jusqu'à 1000 fois supérieure aux microbicides par rapport à une bactére planctonique (non protégée par un biofilm).
On comprend donc que le traitement et/ou la prévention d'infections bactériennes impliquant la formation de biofilms est un véritable défi car les bactéries sont protégées des agents microbicides et des agressions extérieures.
En mileu hospitalier, dentaire ou vétérinaire, la situation est d'autant plus critique que de nombreux microorganismes responsables de la formation de biofilms sont détectés en de nombreux endroits, tant au niveau des individus patients/ animaux (plaies, blessures, brûlures, système respiratoire, …) qu'au niveau de l'environnement (salle d'opération, cabinet et matériel de dentisterie, matériel chirurgical, équipements de maintenance de ce matériel, endoscopes, sondes urinaires, cathéters, implants ou prothèses dentaires, équipement médical, appareil de dialyse ou de ventilation assistée des individus, …) et des surfaces (sols, murs, tables d'opération, …).
En parallèle, le traitement des plaies, domaine en pleine évolution est également largement concerné par les infections bactériennes impliquant la formation de biofilms. Présents dans plus de 90% des plaies chroniques, le biofilm est un obstacle majeur à la guérison, en augmentant la réponse inflammatoire et en retardant le processus de cicatrisation.
Les plaies/blessures aigues ou chroniques comprennent les plaies — chirurgicales, les brûlures, les ulcères veineux et artériels de la jambe, les ulcères diabétiques du pied, les ulcères de pression (escarres), les brûlures. Les ulcères chroniques sont extrêmement douloureux et difficilement traitables. Une plaie est dite chronique lorsqu’aucun signe de cicatrisation n’est apparent après 4 à 6 semaines.
Le traitement des plaies comprend deux segments : le segment traitement traditionnel des plaies et le traitement actif avancé des plaies. Le traitement traditionnel des plaies concerne tout ce qui est pansement dans un environnement sec pour couvrir les plaies et les protéger de l'environnement.
Le traîtement actif avancé des plaies/blessures concerne tous les traitements qui apportent Un vrai support à la cicatrisation, à la guérison des plaies en incluant parfois le débridement des tissus endommagés. Ce traitement va permettre une stimulation de la croissance des nouveaux tissus et permet de contrôler l'infection et la douleur. Le domaine des soins d'hygiène corporelle ou cosmétique est également concerné par les infections bactériennes liées à la formation de biofilms. On a cité précédemment les cabinets de dentisterie pour les infections post-implantatoires suite à la pose de prothèses dentaires (peri-implantites). Toutefois, il existe d’autres applications dans lesquelles les biofilms ont un impact négatif sur la santé. Par exemple, on sait que les dents, les gencives, et les prothèses dentaires sont des supports de choix pour les bactéries vu IO l'environnement buccal humide et riche en microorganismes dans lequel ils sont localisés. On rapporte que le biofilm qui compose la plaque dentaire est Un facteur de risque majeur de complications comme les carries, les maladies parodontales et gingivites et il est reconnu que lorsque le biofilm devient épais, il représente une résistance aux produits chimiques (antibiotiques, désinfectants).
En outre, les maladies respiratoires sont souvent liées aux maladies parodontales par transfert de microorganismes de la bouche vers les voies respiratoires. Pourtant, il est possible de réduire les risques de santé liés à la plaque dentaire en prévenant et/ou réduisant sa formation par une action mécanique.
A ce sujet, Kaplan et al. décrivent une dispersine B mutée qui est une P-N-acetylglucosaminidase {de la classe EC 3.2.1.52) dans des produits d'hygiène buccale comme des dentifrice ou des eaux buccales.
Un autre exemple réside dans le traîtement des onychomycoses (infection des ongles) ou des lentilles oculaires où des biofilms sont également impliqués voire même de l'acné.
De tout ceci, il ressort que les biofilms constituent Un réel enjeu, tout particulièrement dans le domaine des soins, en particulier des soins de santé (hôpitaux, cabinets dentaires, ...) et des soins vétérinaires voire des soins d'hygiène.
Cette problématique est d'autant plus critique que les biofilms impliquent des bactéries responsables d'infections potentiellement mortelles chez les individus, par exemple chez des individus développant une infection provoquée par les bactéries du genre Staphylocoques ou encore les Entérobactéres qui se révèlent être multi-résistantes à des antibiotiques de dernière génération. Il convient donc de prendre toutes les précautions possibles afin d'éviter la formation et le développement de biofilms.
5 Il est bien connu de l’état de la technique des compositions comprenant au moins une enzyme pour disperser un biofilm. Par exemple, les documents US2009/0130082 et WO2009/121183 portent sur des compositions comprenant une DNase | bovine (endodéoxyriponucléase | de la classe EC
3.1.21) pour disperser le biofilm et un antibiotique (agent microbicide) pour tuer les bactéries libérées. Selon ces documents antérieurs, ces compositions sont notamment utilisées lors de la fabrication/préparation de dispositifs médicaux pour traiter des plaies. A cette fin, les dispositifs médicaux sont revêtus (coatés) ou imprégnés avec une composition comprenant une DNase | et un antibiotique. Plus spécifiquement, ces documents antérieurs enseignent essentiellement que de telles compositions sont utilisées pour préparer les dispositifs médicaux et pour désinfecter la peau ou le milieu environnant avant insertion ou implantation d'un dispositif médical. En ce sens, les compositions divulguées dans ces documents antérieurs sont essentiellement utilisées comme revêtements (coatings) ou comme solutions de rinçage pré-procédures avant une chirurgie par exemple.
Dans cette optique, on connait la demande EP 3468583 qui décrit une composition comprenant au moins une enzyme comme par exemple une DNase | et au moins une molécule microbicide pour la prévention ou le traitement d'infections à biofilm post-implantatoires.
Par ailleurs la problématique des infections à biofilms n’est pas seulement limitée aux infections à biofilm post-implantatoires. En effet, les biofilms sont également impliqués dans des infections chroniques du corps animal. Comme expliqué plus haut, ces infections peuvent être présentes, par exemple, au niveau de plaies/blessures présentes à la surface du corps humain ou du corps de mammifères.
On connait aussi Ia demande de brevet WO2006/133523 qui décrit une composition comprenant au moins une enzyme utilisée dans le traitement des problèmes dermatologiques et des plaies. Cette composition comprend au moins une peroxydase dans le but de générer des radicaux hypothiocyanite antimicrobien à partir de H2O2 et de thiocyanate pour le traitement des infections.
Malheureusement, comme on peut le constater, l'état de la technique est riche d'enseignements vu la diversité des infections, comme par exemple celle dans lesquelles des biofilms sont impliqués. Dans certains cas, les IO auteurs de travaux de recherche ont cherché à identifier une enzyme qui aura une action spécifique et/ou ciblées vis-à-vis des biofilms alors que d'autres se sont focalisés sur une action antimicrobienne sans prendre en compte la matrice du biofilm.
Alternativement, on connait des solutions commerciales comme par exemple l'EnziQure® qui est un détergent multi-enzymatique permettant la dissolution curative du biofilm et le nettoyage en profondeur des instruments chirurgicaux et des endoscopes. EnziQure® est Un produit formulé qui contient une base tensioactive non-ionique, des agents dispersants et séquestrants et un cocktail enzymatique contenant 7 enzymes pour pouvoir dégrader la matrice du biofilm de nombreuses espèces bactériennes (son action anti-biofilm a été démontrée sur plus de 15 souches), les enzymes étant présentes dans des concentrations élevées pour assurer une efficacité maximale.
Bien que très efficace pour le nettoyage des instruments médicaux, cette solution est un dispositif médical de Classe | qui n'est pas administrable à l'être vivant, en particulier à l'être humain de par sa composition détergente et enzymatique qui n'a pas le grade pharmaceutique requis pour son utilisation comme substance active (médicament).
Il existe donc un besoin actuellement de mettre au point des formulations alternatives qui peuvent être appliquées au corps d'un être vivant, en particulier au corps humain ou animal, en particulier pour le traitement et/ou la prévention d'infections bactériennes impliquant la formation de biofilm et présentant une efficacité similaire à celle du produit EnzQure® de la demanderesse de la présente demande de brevet.
La présente invention a donc pour objet de procurer une composition enzymatique qui peut être administrée à l'être humain tant en usage externe qu'en usage interne et dont l'efficacité est similaire à celle du produit détergent EnziQure® vis-à-vis de la dissolution de la matrice des biofilms et présentant une polyvalence d'utilisation.
Par les termes «utilisation polyvalente» ou « polyvalence d'utilisation », on entend une utilisation sur un large panel de souches de bactéries et pour une diversité d'application, à savoir une utilisation qui présente un large spectre d'actions.
En effet, pour qu'il soit possible d'exploiter industrielement une formulation pour le traitement et/ou la prévention d'infections bactériennes impliquant la formation de biofilm, il est avantageux de disposer d'une formulation à large spectre d'action, c'est-à-dire capable de dissocier différents types de biofilm associés à différents types d'infection. En effet, Ia composition d'un biofilm varie en fonction des bactéries qui le composent, et donc de la localisation et du type d'infection. Une telle formulation serait donc adaptée à diverses applications, et éviterait Ia nécessité de créer différentes formulations en fonction du type d'infection ciblé, car cette démarche implique une complexité logistique pénalisant une exploitation industrielle d'une telle formulation. La possibilité d'obtenir une formulation qui est active dans le traitement et/ou la prévention d'infections bactériennes impliquant la formation de biofilms issus d'un large panel de souches bactérienne et à destination de différentes applications permet au moins la fabrication d’un concentré qui peut être ensuite diversifié pour certaines applications ou bien de formuler une composition polyvalente.
Pour résoudre ce problème, il est prévu suivant l'invention une Utilisation d'une composition para-pharmaceutique ou pharmaceutique administrable à l'être vivant, en particulier à l'être humain comprenant au moins une enzyme endorbonucléase choisie dans le groupe constitué des enzymes appartenant aux classes EC 3.1.30 et EC 3.1.31 et leur mélange, pour potentialiser un agent microbicide, en particulier un antibiotique, un phage, un antifongique, , ou un désinfectant, dans le traitement et/ou la prévention d'infections bactériennes impliquant la formation de biofilm.
A titre d'exemple, une telle enzyme est la denarase® ou la benzonase endonucléase®. Elles sont de préférence présente à raison de 10 à 1000U/ml, de préférence 50 à 500U/ml, de préférence de 100 à 500U/ml.
Des concentrations selon la présente invention de ladite au moins une enzyme endoribonucléase choisie dans le groupe constitué des enzymes IO appartenant aux classes EC 3.1.30 et EC 3.1.31 vaut par exemple de 200 U/ml à 650 U/ml, plus particulièrement de 250 U/ml à 550 U/ml, de manière préférée de 300 U/ml, voire de 350 U/ml à 500 U/ml. Lorsque plusieurs endoribonucléases sont utilisées ensemble, soit chacune présente à la concentration susdite, soit ensemble, elles présentent la concentration susdite.
La concentration est exprimée selon la présente invention en termes d'U/mI. Une unité (U) est égale à la quantité de protéine qui induit un changement d'absorbance à 260nm de 1.0 en 30 minutes à 37°C.
Comme on le constate, la composition utilisée selon la présente invention est une composition para-pharmaceutique ou pharmaceutique, qui est administrable à l'être vivant, en particulier à l'être humain. Lorsque la composition est pharmaceutique, elle est essentiellement exempte d'endotoxine.
Par les termes «composition essentiellement exempte d'endotoxine », on entend une composition qui ne contient pas ou très peu de substance lipopolysaccharidique thermostable toxique. Typiquement selon l'organisme dont provient l'enzyme, la solution enzymatique contient souvent des endotoxines, qui sont présentes dans la membrane externe de bactéries à Gram négatif. Les endotoxines sont libérées durant l'extraction de l'enzyme à partir de la cellule lors de la lyse cellulaire. De telles enzymes sont largement commercialisées, mais ne conviennent en aucun ca à UN Usage pharmaceutique, d'autant moins qu'elles ne sont généralement pas produites selon les normes de Good manufacturing Practice. On peut obtenir une enzyme sans endotoxine soit par une production en bactéries gram+, soit dans d'autres hôte ne contenant pas d'endotoxines dans leur membrane, soit encore par purification.
Ladite au moins une enzyme endoribonucléase de la composition utilisée selon la présente invention a une activité sur l'ARN et sur l'ADN. Son activité enzymatique hydrolyse les substrats ADN et l'ARN en produits 5’- phospho(mono/oligo)nucléotides (EC 3.1.30) OU 3'- phospho(mono/oligo)nucléotides (EC 3.1.31).
Comme on l'a indiqué précédemment, Les compositions connues et développées actuellement sont des compositions comprenant, pour la plupart, une endodésoxyrbonucléase (Dnase |) de la classe EC 3.1.21 pour hydrolyser l'ADN et/ou une hydrolase de polysaccharides (Dispersine B) pour hydrolyser les polysaccharides présents dans la matrice des biofilms.
La composition pharmaceutique enzymatique utilisée selon la présente invention répond à des conditions très strictes de fabrication. La composition selon la présente invention est fabriquée en respectant les good manufacturing practices (GMPc) qui sont des directives devenues obligatoires dans le monde pharmaceutique, que ce soit au niveau de la chaine de production d'un médicament ou au niveau de manipulations en laboratoire. Ces directives imposent Un traçage de la production et un contrôle qualité pour assurer l'efficacité, la pureté et l'innocuité reproductible d'un produit à usage pharmaceutique. En particulier, Ia composition enzymatique selon l'invention répond aux spécifications pharmaceutiques en matière d'innocuité, de quantités d'endotoxine et de microorganismes (virus, mycoplasme, bactéries) présents, de pureté et d'absence de produit d'origine animale ou d'antibiotique Utilisé pour sa fabrication. Ces spécifications sont les prérequis vers une Utilisation thérapeutique dans le corps humain, que ce soit en usage externe ou interne.
| a en effet été identifié selon la présente invention qu'il était possible de produire une telle enzyme en souche bactérienne Gram+, laquelle ne produit pas d'endotoxine et dont Ia production et la purification est conforme aux normes good manufacturing practices. Par exemple, la benzonase endonucléase est également conforme aux normes good manufacturing practices. La composition para-pharmaceutique comprenant [ endorbonucléase (RNase) choisie parmi les classes EC 3.1.30 ou EC 3.1.31 ne doit quant à elle pas spécifiquement être de grade pharmaceutique. Par extension, une telle composition para-pharmaceutique peut-être un dispositif médical comme un pansement ou un dentifrice, peut dont être un produit d'hygiène corporelle, comme une lotion ou un dentifrice.
De plus, et de manière surprenante, l'utilisation d'une permet une diminution de la biomasse des biofilms provenant de nombreuses souches bactériennes et permet ainsi à l'agent microbicide d'accéder aux microorganismes présents à l'intérieur du biofilm pour le traitement de l'infection à biofilm et potentialise ainsi son effet. L'utilisation de la composition selon la présente invention crée un effet synergique de la composition enzymatique et de l'agent microbicide utilisé.
En effet, alors que d'autres RNAses appartenant à la classification EC4.6.1, comme la RNase | et la RNase A (pourtant existante sur le marché au grade pharmaceutique et donc administrable au corps d'un être vivant, en — particulier d'un mammifère, plus particulièrement d'un être humain) n'ont aucun effet sur les infections à biofilms ou un effet limité sur certains types de biofilms seulement, il a été mis en évidence, de manière surprenante qu'une endoribonucléase choisie spécifiquement dans la classe EC 3.1.30 ou EC 3.1.31 permet de réduire drastiquement la biomasse des biofilms et ainsi de potentialiser l'agent microbien qui, sans cette composition n'est pas capable d'entrer dans le biofilm et de traiter l'infection, cela pour des biofilms de souches de bactéries variée et avec une utilisation non spécifique de l'infection à biofilm à traiter ou traitée.
L’ activité endoribonucléase aspécifique des enzymes appartenant auxclasses EC 3.1.30 ou EC 3.1.31 permet de digérerl'ADN et l'ARN. Contre toute attente, ces enzymes entraînent une réduction drastique de la biomasse des biofilms déjà lorsqu'ils sont utilisés seuls dans une formulation selon la présente invention, la réduction drastique de la biomasse des biofilms étant similaire à celle observée pour la formulation commerciale multi-enzymatique EnziQure®. De plus, on atteint selon la présente invention une efficacité vis-à-vis de plusieurs types de biofilms déjà avec une seule enzyme, ce qui est particulièrement avantageux dans une composition para-pharmaceutique ou pharmaceutique où l'on recherche le moins d'ingrédient possible pour faciliter les autorisations de mise sur le marché. Les revendications dépendantes se réfèrent à d'autres formes d'utilisation avantageuses. Selon une première utilisation d'une composition selon la présente invention, le traitement et/ou la prévention d'infections bactériennes impliquant la formation de biofilm est un traiîtement curatif ou préventif d'infections dermatologiques ou d'infections provoquées par des blessures superficielles ou profondes. Ces infections bactériennes dermatologiques ou provoquées par des blessures superficielles ou profondes sont par exemple les plaies ou les brûlures. Ces infections peuvent se développer sur des plaies chroniques ou aigues, des brûlures, au site d'insertion d'un dispositif médical. L'élimination ou la réduction du biofilm accélère le processus de cicatrisation et de guérison des plaies et des brûlures.
Selon une deuxième utilisation d'une composition selon Ia présente invention, le traitement et/ou la prévention d'infections bactériennes impliquant la formation de biofilm est un traitement curatif ou préventif des infections post- implantatoires associées à l'infection d'un dispositif médical implanté dans le corps ou de tissus autour d'un dispositif médical implanté dans le corps.
L'utilisation d'une composition selon la présente invention va permettre un traitement in situ du biofilm formé sur un dispositif médical implanté infecté ou sur les tissus autour dudit dispositif médical implanté. Par exemple, une prothèse implantée infectée ne devra pas être sortie du corps humain pour être nettoyée. Les tissus internes infectés et la prothèse peuvent être nettoyés par administration in situ.
Selon une troisième utilisation selon l'invention, la composition para- pharmaceutique ou pharmaceutique administrable à l'être vivant, en particulier à l'être humain dans le traitement et/ou la prévention d'infections bactériennes impliquant la formation de biofilm est utilisée pour la fabrication d’un soin ou dans un soin d'hygiène corporelle ou cosmétique, comme par exemple Un soin pour les ongles, une solution buccale, un bain de bouche, un dentifrice, un bain oculaire, une solution de nettoyage de lentilles oculaires, une solution de nettoyage d'appareils dentaires, de prothèses dentaires, de brosses à dent, un soin pour la peau anti-acné. Selon une autre utilisation selon l'invention, la composition para- pharmaceutique ou pharmaceutique est utilisée pour nettoyer les accessoires IO en contact avec le corps humain, par exemple les piercings. Avantageusement, la composition comprend, en outre, une série d'enzymes additionnelles, par exemple une, deux, trois, quatre, cinq, six, sept, huit enzyme(s). Plus particulièrement, une enzyme de ladite série d'enzymes additionnelles est choisie dans le groupe constitué des glycosidases (EC 3.2.1), des désoxyrbonucléases (EC 3.1.21), des oxydoréductases (EC 1.), des hydrolases d’ester carboxylique (EC 3.1.1), des protéases et des peptidases (EC
3.4.), et de leur mélange. La classe des glycosidases comprend des hydrolases de — polysacchardes comme les cellulase (EC 3.2.1 4) et les dispersine B (EC 3.2.1.52), les hexosaminidases (EC 3.2.1.52), les alpha-amylases (EC 3.2.1.1), les mannanase (EC 3.2.1.78 et EC 3.2.1.101), les hyaluronidases (EC 3.2.1.35), les glucosidase (EC 3.2.1.21 et EC 3.2.1.20), galactosidases (EC 3.2.1.22 et EC
3.21.23), chitinases (EC 3.2.1.14), chitosanases (EC 3.2.1.132), fructanases (EC
3.2.1.80), dextranases (EC 3.2.1.11), ysozyme (EC 3.2.1.17) et pectinase (EC
3.2.1.15). Cette classe comprend également les polysaccharides yase comme l'alginate lyase (EC 4.2.99.4 et EC 4.2.2.26) et l'hyaluronate lyase (EC 4.2.2.1). La classe des oxydoréductases comprend par exemple la laccase (EC 1.10.3.2), les peroxydases (EC 1.11.1) lactoperoxydase (EC 1.11.1.7), haloperoxydase (EC 1.11.2.1), myélopéroxydase (EC 1.11.2.2) et les glucose oxydase (EC 1.1.3.4).
La classe des hydrolases d'’ester carboxylique (EC 3.1.1) comprend par exemple la lipase (EC 3.1.1.3).
La classe des protéases et peptidases (EC 3.4.) comprend par exemple la flavourzyme ou des protéases comme la Blaze@Pro, la subtilisine (EC
34.21.62), la bromélaïne (EC 34.22.33), la collagénase (EC 3.4.24.3), la papaîne (EC 3.4.22.2), la trypsine (EC 3.4.21.4) et la protéinase K (EC 3.4.21 .64).
Dans un mode de réalisation préféré de l'utilisation d'une composition selon la présente invention, Ia composition comprend, au moins une deuxième enzyme choisie dans le groupe des glycosidases (EC 3.2.1).
Dans un autre mode de réalisation préféré de l'utilisation d'une composition selon la présente invention, Ia composition comprend au moins une troisième enzyme choisie dans le groupe constitué des glycosidases (EC 3.2.1), désoxyriponucléases (EC 3.1.21), oxydoréductases (EC 1), des hydrolases d'ester carboxylique (EC 3.1.1), des peptidases et des protéases (EC 3.4), et de leur mélange, en particulier choisie dans le groupe constitué des glycosidases (EC
3.2.1) et des peptidases (EC 3.4).
Dans un autre mode de réalisation préféré de l'utilisation d'une composition selon la présente invention, la composition comprend au moins une quatrième enzyme choisie dans le groupe comprenant des glycosidases(EC
3.2.1), des désoxyribonucléases(EC 3.1.21), des oxydoréductases (EC 1), des hydrolases d'ester carboxylique(EC 3.1.1), des protéases et des peptidases (EC
3.4) pour la fabrication d’un médicament pour le traitement et/ou la prévention de maladies post-implantatoires associées à l'infection d'un dispositif médical implanté dans le corps.
Dans un mode de réalisation de l'utilisation d'une composition selon la présente invention, le dispositif médical est Un implant orthopédique.
Dans une utilisation particulière de la composition selon la présente invention, le traitement et/ou la prévention d'infections bactériennes impliquant la formation de biofilm est un traitement curatif ou préventif d'une infection bactérienne de tissus entourant un implant orthopédique implanté ou de l’'implant orthopédique implanté.
Dans une autre utilisation particulière de la composition selon la présente invention le traitement et/ou la prévention d'infections bactériennes impliquant la formation de biofilm est un traitement curatif ou préventif d'une infection bactérienne de tissus entourant un implant dentaire implanté ou de l'implant dentaire implanté.
Dans encore une autre utilisation particulière de la composition selon la présente invention, le traitement et/ou la prévention d'infections bactériennes impliquant la formation de biofilm est un traitement curatif ou préventif d'une infection bactérienne de tissus entourant un cathéter, une IO canule, une sonde, une prothèse, un implant endo-osseux, un implant zygomatique, un implant orthodontique, une prothèse dentaire, une plaque de contention, un valve, un drain, un stent, un tube pour respiration artificielle ou une vis implanté ou d' un cathéter, une canule, une sonde, une prothèse, un implant endo-osseux, un implant zygomatique, un implant orthodontique, une prothèse dentaire, une plaque de contention, un valve, un drain, un stent, un tube pour respiration artificielle ou une vis implanté.
Dans une utilisation avantageuse de la composition selon la présente invention, le traitement et/ou la prévention d'infections bactériennes impliquant la formation de biofilm comprend une application de ladite composition sur une plaie, une infection, des tissus ou un dispositif médical, de préférence une application d'un support tissé ou non tissé imprégné de ladite composition para-pharmaceutique ou pharmaceutique.
Le support peut être une mousse, une éponge, Un film, pansement hydrocolloïde, un pansement à base d'alginate, de polyuréthane, un hydrogel, Une compresse de gaze, un bandage, une lingette, un pansement , … Dans une autre utilisation avantageuse de la composition selon la présente invention, le traitement et/ou la prévention d'infections bactériennes impliquant la formation de biofilm comprend une application de ladite composition sur une plaie, une infection, des tissus, de préférence une application d'un pansement sous forme de gel comprenant ladite composition para-pharmaceutique ou pharmaceutique.
Dans une autre utilisation avantageuse de la composition selon la présente invention, le traitement et/ou la prévention d'infections bactériennes impliquant la formation de biofilm comprend une application de ladite composition sur une plaie, une infection, des tissus ou Un dispositif médical, de préférence une application d'une solution aqueuse, de préférence tamponnée de ladite composition para-pharmaceutique ou pharmaceutique, par infiltration, par irrigation, par injection, par application percutanée, par inhalation, par bain de bouche ou bain oculaire, par tamponnage.
La solution aqueuse de ladite composition para-pharmaceutique IO ou pharmaceutique selon la présente invention est par exemple sous concentrée ou sous forme diluée et/ou prête à l'emploi.
Dans encore une autre Utilisation avantageuse de la composition selon la présente invention, le traîtement et/ou la prévention d'infections bactériennes impliquant la formation de biofilm comprend une application de ladite composition sur une plaie, une infection, des tissus OU Un dispositif médical, de préférence une application d'une pâte ou d'une solution visqueuse comprenant ladite composition para-pharmaceutique ou pharmaceutique, comme par exemple d'un dentifrice.
Avantageusement, selon la présente invention, ledit agent microbicide, en particulier ledit antibiotique, phage, antifongique ou ledit désinfectant et ladite composition forment un produit de combinaison pour un emploi simultané, séparé ou échelonné dans le temps.
D'autres formes de réalisation de l'utilisation d'une composition para-pharmaceutique ou pharmaceutique administrable à l'être vivant, en particulier à l'être humain suivant Ia présente l'invention sont indiquées dans les revendications annexées.
La présente invention se rapporte également à une composition para-pharmaceutique ou pharmaceutique administrable à l'être vivant, en particulier à l'être humain comprenant au moins une enzyme endoribonucléase choisie parmi les classes EC 3.1.30, plus particulièrement de la classe EC 3.1.30.2, et EC 3.1.31, de préférence à une teneur de 10 à 1000U/ml, de préférence 50 à
500U/ml, de préférence de 100 à 500U/ml, comme par exemple de 200 U/ml à 650 U/ml, plus particulièrement de 250 U/ml à 550 U/ml, de manière préférée de 300 U/ml, voire de 350 U/ml à 500 U/ml et éventuellement un ou plusieurs excipients pharmaceutiquement acceptables.
Cela présente l'avantage que l'enzyme endoribonucléase a une activité sur l'ARN et sur l'ADN et permet une digestion de la matrice du biofilm, ce qui peut ainsi potentialiser l'effet d'un agent microbicide tout en permettant une utilisation d'un nombre restreint d'enzyme.
Avantageusement, ladite au moins une enzyme endoribonucléase IO dela composition para-pharmaceutique ou pharmaceutique selon la présente invention, est d'origine bactérienne.
De manière particulièrement avantageuse, l'enzyme endoribonucléase provient de Serratia marcescens.
Dans une forme de réalisation préférée, la composition selon la présente invention, comprend, en outre, une série d'enzymes additionnelles, par exemple une, deux, trois, quatre, cinq, six, sept, huit enzyme(s). Avantageusement, la composition selon la présente invention, comprend une enzyme de ladite série d'enzymes additionnelles de ladite composition est choisie dans le groupe constitué des glycosidases (EC 3.2.1), des désoxyriponucléases (EC 3.1.21), des oxydoréductases (EC 1), des hydrolases d'ester carboxylique (EC 3.1.1) et des peptidases (EC 3.4), et de leur mélange Plus particulièrement, selon la présente invention, Ia composition comprend au moins une deuxième enzyme choisie dans le groupe des glycosidases (EC 3.2.1). Dans une forme de réalisation préférée, la composition selon la présente invention, comprend en outre, au moins Une troisième enzyme choisie dans le groupe comprenant des glycosidases (EC 3.2.1), des désoxyriponucléases (EC 3.1.21), des oxydoréductases (EC 1), des hydrolases d'ester carboxylique (EC 3.1.1), des peptidases et des protéases (EC 3.4). Dans une forme de réalisation préférée, la composition selon la présente invention, comprend au moins une quatrième enzyme choisie dans le groupe comprenant des glycosidases (EC 3.2.1), des désoxyribonucléases (EC
3.1.21), des oxydoréductases (EC 1), des hydrolases d'ester carboxylique (EC
3.1.1) ; des peptidases et des protéases (EC 3.4). Dans une forme de réalisation préférée, la composition selon la présente invention, comprend au moins une cinquième enzyme choisie dans le groupe comprenant des glycosidases (EC 3.2.1), des désoxyribonucléases (EC
3.1.21), des oxydoréductases (EC 1), des hydrolases d'ester carboxylique (EC
3.1.1), des peptidases et des protéases (EC 3.4). Dans une forme de réalisation préférée, la composition selon la présente invention, comprend au moins une sixième enzyme choisie dans le IO groupe comprenant des glycosidases (EC 3.2.1), des désoxyribonucléases (EC
3.1.21), des oxydoréductases (EC 1), des hydrolases d'ester carboxylique (EC
3.1.1), des peptidases et des protéases (EC 3.4). Dans une forme de réalisation préférée, la composition selon la présente invention, comprend au moins une septième enzyme choisie dans le groupe comprenant des glycosidases (EC 3.2.1), des désoxyribonucléases (EC
3.1.21), des oxydoréductases (EC 1), des hydrolases d'ester carboxylique (EC
3.1.1), des peptidases et des protéases (EC 3.4). Dans une forme de réalisation préférée, la composition selon la présente invention, comprend au moins une huitième enzyme choisie dans le groupe comprenant des glycosidases (EC 3.2.1), des désoxyribonucléases (EC3.1.21), des oxydoréductases (ECI), des hydrolases d'ester carboxylique (EC3.1.1), des peptidases et des protéases (EC 3.4). Dans une forme de réalisation préférée, la composition selon la présente invention, comprend en outre au moins un agent microbicide comme un antibiotique, un antifongique, un antiseptique, un ou plusieurs peptides microbicides ou des phages, conditionné séparément ou avec ladite endoribonucléase. De manière préférée, la molécule microbicide est choisie dans le groupe constitué des fluoroquinolones, des glucopeptides, des —lipoglucopeptides, de l'acide fusidique, des pénicilines, des céphalosporines, des carbapénèmes, des monobactames, des polymixines, des béta-lactames,
des macrolides, des lincosamides, des oxazolidinones, des phénicoles, des tétracyclines, des aminoglycosides, des rifamycines, des nitrofuranes, des sulfamides, des nitroimidazoles des antifongiques (échinocandines, fluorocytosines, azoles, griseofulvines, amphotérécine), des enzymes lytiques (par exemple les endolysines ou le l\ysozyme), de N-acétylcystéine, des ammonia quaternaires, des biguanides, des aminés, des amidines, des dérivés halogénés (dont notamment la chlorhexidine), des peptides microbicides, des dérivés de l'argent (Ag), de H 202, des peracides, des dérivés phénoliques, des aldéhydes, des alcools, des phages et de leurs mélanges. Dans une autre forme de réalisation préférée, Ia composition selon la présente invention, comprend, en outre une inhibiteur de quorum sensing.
On peut encore prévoir comme composés additionnels, une ou plusieurs enzymes qui inhibent le «quorum sensing» au sein des biofilms. Le quorum sensing est un moyen de communication entre les cellules bactériennes qui leur permet de coordonner une action dans toute la population. Le quorum sensing régule entre-autre la formation de biofilms (étapes précoces en général), sur base de la sécrétion et la diffusion d'acyl homosérine lactone (chez les Gram-) ou des peptides (chez les Gram+), lesquels sont reconnus spécifiquement par les cellules de la même population. En particulier, on peut citer l'acylase | et le 2(5H)-furanone .
Dans une forme de réalisation préférée, la composition selon la présente invention, comprend, en outre, un tampon enzymatique choisi dans le groupe constitué du Tris-HCI, TGN, TBS, PBS, HEPES, MES, PIPES, MOPS, BES, TES, tampon phosphate et tampon citrate, contenant ou non de 0 à 2 mM de MgCl2, contenant de 0 à 2MM CaCl2, et de 0 à 500 MM de NaCl.
Dans une autre forme de réalisation préférée, la composition selon la présente invention, comprend, en outre, un tampon enzymatique comprenant O à 50% d'agent de stabilisation (polyol, arginine, formiate de calcium, glucose).
Dans une forme de réalisation préférée, la composition selon la présente invention, comprend, en outre, au moins Un tensio-actif.
Dans une forme de réalisation préférée, la composition selon la présente invention, comprend, en outre, au moins un conservateur et/ou un séquestrant et/ou un dispersant.
Dans une forme de réalisation préférée, la composition para- pharmaceutique ou pharmaceutique selon la présente invention, est sous forme de solution, par exemple un bain de bouche, un bain oculaire, une lotion, une solution d'irigation, une solution de nettoyage des prothèses dentaires, des brosses à dents.
Dans une autre forme de réalisation préférée, la composition est un pansement hydrophile, par exemple un hydrogel.
Dans une variante selon la présente invention, la composition est sous forme immobilisée sur un support tissé ou non tissé, sec ou sur Un dispositif médical ou sous forme imprégnée sur un support tissé ou non tissé.
Dans une autre variante avantageuse de la présente invention, la composition est sous forme d'une composition topique.
Dans encore une autre variante avantageuse de la présente invention, Ia composition est sous forme d'une solution stérile administrable par infiltration par irrigation, par injection, par application percutanée et par inhalation.
La présente invention se rapporte aussi à une composition para- pharmaceutique ou pharmaceutique, pour utilisation en tant que potentialisateur d'un agent microbicide, en particulier un antibiotique, un antifongique, ou un désinfectant, dans le traitement et/ou la prévention d'infections bactériennes impliquant la formation de biofilm.
Dans une forme de réalisation particulière selon la présente invention, la composition para-pharmaceutique ou pharmaceutique est prévue pour une utilisation dans le traitement et/ou la prévention d'infections bactériennes impliquant la formation de biofilm est un traitement et/ ou une prévention des infections dermatologiques aigues ou chroniques ou d'infections provoquées par des blessures (brûlures et/ou plaies) superficielles ou profondes.
Dans une forme de réalisation particulière selon la présente invention, Ia composition para-pharmaceutique ou pharmaceutique est prévue pour une utilisation dans traitement curatif et/ou préventif des infections post- implantatoires associées à l'infection de tissus autour d'un dispositif médical implanté dans le corps ou d'un dispositif médical implanté dans le corps.
Dans une forme de réalisation avantageuse selon la présente invention, Ia composition para-pharmaceutique ou pharmaceutique est prévue pour une utilisation dans Un soin d'hygiène corporelle ou cosmétique, comme par exemple un soin pour les ongles, une solution buccale, un bain de bouche, un dentifrice, un bain oculaire, une solution de nettoyage de lentilles oculaires, un soin pour la peau anti-acné.
Dans une autre forme de réalisation avantageuse selon la présente invention, la composition para-pharmaceutique ou pharmaceutique est prévue pour une utilisation dans un traîtement curatif ou préventif d'une infection bactérienne de tissus entourant un implant orthopédique implanté ou de l'implant orthopédique implanté.
Dans une autre forme de réalisation avantageuse selon la présente invention, Ia composition para-pharmaceutique ou pharmaceutique est prévue pour traitement curatif ou préventif d'une infection bactérienne de tissus entourant un implant dentaire implanté ou de l'implant dentaire implanté.
Dans une autre forme de réalisation avantageuse selon la présente invention, la composition para-pharmaceutique ou pharmaceutique est prévue pour une utilisation dans un traitement curatif ou préventif d'une infection bactérienne de tissus entourant un cathéter, une canule, une sonde, une prothèse, un implant endo-osseux, un implant zygomatique, un implant orthodontique, une prothèse dentaire, une plaque de contention, un valve, un drain, un stent, un tube pour respiration artificielle ou une vis implanté ou bien d'un cathéter, une canule, une sonde, une prothèse, Un implant endo-osseux, un implant zygomatique, un implant orthodontique, une prothèse dentaire, une plaque de contention, un valve, Un drain, un stent, un tube pour respiration artificielle ou une vis implanté.
Dans encore une autre forme de réalisation avantageuse selon la présente invention, la composition para-pharmaceutique ou pharmaceutique est prévue pour une utilisation dans le traitement et/ou la prévention d'infections bactériennes impliquant la formation de biofilm qui comprend une application de ladite composition sur une plaie, une infection, des tissus OU un dispositif médical, de préférence une application d'un support tissé ou non tissé imprégné de ladite composition para-pharmaceutique ou pharmaceutique ou sur lequel ladite composition para-pharmaceutique ou pharmaceutique est immobilisée, à sec.
Dans encore une autre forme de réalisation avantageuse selon la présente invention, la composition para-pharmaceutique ou pharmaceutique est prévue pour une utilisation dans le traitement et/ou la prévention d'infections bactériennes impliquant la formation de biofilm qui comprend une application de ladite composition sur une plaie, une infection, des tissus, de préférence une application d'un pansement sous forme de gel, plus particulièrement un hydrogel comprenant ladite composition para-pharmaceutique ou pharmaceutique.
Dans une variante selon la présente invention, la composition para- pharmaceutique ou pharmaceutique est prévue pour une Utilisation dans le — traitement et/ou la prévention d'infections bactériennes impliquant la formation de biofilm qui comprend une application de ladite composition sur une plaie, une infection, des tissus, de préférence une application d'un pansement sous forme de gel, plus particulièrement un hydrogel comprenant ladite composition para-pharmaceutique ou pharmaceutique.
Dans une variante selon la présente invention, Ia composition para- pharmaceutique ou pharmaceutique est prévue pour une Utilisation dans le traitement et/ou la prévention d'infections bactériennes impliquant la formation de biofilm qui comprend une application de ladite composition sur une plaie, une infection, des tissus ou un dispositif médical, de préférence une application d'une solution aqueuse, de préférence tamponnée de ladite composition para- pharmaceutique ou pharmaceutique, par infiltration, par irrigation, par injection,
par application percutanée, par inhalation, par bain de bouche ou bain oculaire, par tamponnage, par bain de trempage.
Dans une autre variante selon la présente invention, Ia composition para-pharmaceutique ou pharmaceutique est prévue pour une utilisation dans le traitement et/ou la prévention d'infections bactériennes impliquant la formation de biofilm qui comprend une application de ladite composition sur une plaie, une infection, des tissus ou un dispositif médical, de préférence une application d'une pâte ou d'une solution visqueuse comprenant ladite composition para-pharmaceutique ou pharmaceutique, comme par exemple IO d'undentifrice.
Dans encore une autre variante selon la présente invention, la composition para-pharmaceutique ou pharmaceutique est prévue pour une Utilisation comme produit de combinaison pour un emploi simultané, séparé ou échelonné dans le temps.
Enfin, Ia composition selon la présente invention est prévue pour une utilisation chirurgicale.
D'autres formes de réalisation de la composition para- pharmaceutique ou pharmaceutique suivant l'invention sont indiquées dans les revendications annexées.
D'autres caractéristiques, détails et avantages de l'invention ressortiront de la description donnée ci-après, à titre non limitatif et en faisant référence aux dessins et aux exemples.
La figure 1 est un graphique qui illustre la diminution du pourcentage de biomasse du biofilm de plusieurs souches de Staphylococcus aureus, suite à une mise en contact avec une composition selon l'invention avec une concentration de 500 U/MI pour la denarase.
La figure 2 est un graphique qui illustre la diminution du pourcentage de biomasse du biofilm formés par différentes souches de S. aureus et Staphylococcus epidermidis, suite à une mise en contact avec une composition selon l'invention avec une concentration de 100 U/ml pour la denarase en comparaison avec une composition comprenant 100 U/ml de RNase |, , avec une composition comprenant 100 U/ml pour chaque enzyme d'un mélange de RNase 1, RNase A et DNase 1. La figure 3 est une série de quatre graphiques qui illustre la diminution du pourcentage de biomasse du biofilm de différentes souches de S. aureus et S. epidermidis, suite à une mise en contact avec une composition selon l'invention ave une concentration de 500 U/ml pour la denarase en comparaison avec une composition comprenant Un cocktail enzymatique CDD comprenant 500 U/ml de denarase, 0.06 U/ml de dispersine B et 7 U/ml de IO cellulase, en comparaison avec une composition comprenant 0.06 U/ml de dispersine B, en comparaison avec une composition comprenant 7 U/ml de cellulase.
La figure 4 est une série de trois graphiques qui illustre la diminution du pourcentage de biomasse du biofilm de multiples souches de S. aureus et S.
epidermidis, suite à une mise en contact avec une composition comprenant seulement 500 U/ml de denarase, en comparaison avec une composition comprenant un cocktail enzymatique comprenant 500 U/ml de denarase et 0.06 U/ml de dispersine B, en comparaison avec une composition comprenant un cocktail enzymatique comprenant 500 U/ml de denarase et 7 U/ml de cellulase.
La figure 5 est une série de deux graphiques qui illustre la diminution du pourcentage de biomasse du biofilm de différentes souches de p. aeruginosa, suite à une mise en contact avec une composition comprenant 500 U/ml de denarase, en comparaison avec une composition comprenant Un cocktail enzymatique CDD comprenant 500 U/ml de denarase, 0.06 U/ml de dispersine B et 7 U/ml de cellulase .
La figure 6 est une série de 4 graphiques qui illustre la diminution de la viabilité (exprimée log10(CFU/MmI) du biofilm de S. aureus ATCC33591 après un traitement curatif du biofilm avec une composition selon l'invention comprenant de la denarase à 500 U/ml suivi de 24h d'incubation avec différentes concentrations en vancomycine de 0, 10, et 20 mg/L, ainsi que la diminution de la biomasse (exprimée en absorbance à 570nm) du biofilm de S. aureus
ATCC33591 après un traitement curatif du biofilm avec une composition selon l'invention comprenant de la denarase à 500 U/MI suivi de 24h d'incubation avec différentes concentrations en vancomycine de 0, 10, et 20 mg/L.
La figure 7 est une série de 3 graphiques qui illustre la viabilité dans le biofilm de S. aureus ATCC33591 exprimée en logi (CFU/MI) après un traitement curatif du biofilm avec une composition comprenant un cocktail enzymatique CDD comprenant 500 U/ml de denarase, 7 U/ml de cellulase et
0.06 U/ml de dispersine B suivi de 24h d'incubation avec 0 mg/L ou 20mg/L de vancomycine, en comparaison avec une composition comprenant un cocktail enzymatique BDD comprenant 500 U/ml de denarase, 1% v/v de BlazePro et 0.06 U/ml de Dispersine B suivi de 24h d'incubation avec 0 mg/L ou 20mg/L de vancomycine, en comparaison avec une composition comprenant un cocktail enzymatique FDD comprenant 500 U/ml de denarase, 1% v/v de Flavourzyme et
0.06 U/ml de Dispersine B suivi de 24h d'incubation avec 0 mg/L ou 20mg/L de vancomycine.
La figure 8 représente l'effet de différentes concentrations en vancomycine (0 et 20mg/L) sur la viabilité exprimée en logio(CFU/mI) sur le biofilm de différentes souches de S. aureus et S. epidermidis après un traitement curatif avec différentes compositions ti-enzymatiques. La composition tri- enzymatique CDD comprend un cocktail enzymatique composé de 7 U/ml de cellulase, 0.06 U/ml de dispersine B et de 500 U/ml de denarase, en comparaison avec une composition enzymatique CDD2 comprenant un cocktail tri- enzymatique composé de 70 U/ml de cellulase, de 0.32 U/ml de dispersine B et de 500 U/ml de denarase , en comparaison avec une composition enzymatique ADD comprenant un cocktail tri-enzymatigue composé de 70 U/ml de cellulase, 2000 U/ml d'alpha-amylase et de 500 U/ml de denarase.
La figure 9 représente l'effet de 20 mg/L de vancomycine sur la biomasse exprimée en % et la viabilité exprimée en log10(CFU/ml) du biofilm de différentes souches de S. aureus et S. epidermidis formé en présence de compositions selon l'invention. La composition tri-enzymatique CDD2 comprend un cocktail tr-enzymatique composé de 70 u/ml de cellulase, 0.32 U/MI de dispersine B et 500 U/ml de denarase ; en comparaison avec une composition enzymatique ADD comprenant un cocktail tr-enzymatique composé de 70 U/ml de cellulase, de 2000 U/ml d'alpha-amylase et de 700 U/ml de denarase.
La Figure 10 représente l'effet de différentes concentrations en vancomycine (0 et 20mg/L) sur la viabilité exprimée en log1o(CFU/MmI) du biofilm des. aureus ATCC33591 et S. epidermidis ATCC35984_formé en présence de compositions selon l'invention.
La composition enzymatique CDD comprenant un cocktail tr-enzymatique composé de 7 U/ml de cellulase, 0.06 U/ml de dispersine B et 500 U/ml de denarase; La composition enzymatique CDD2 comprenant un cocktail tri--enzymatique composé de 70 U/ml de cellulase, 0.32 IO U/ml de dispersine B et de 500 U/MI de denarase; en comparaison avec une composition enzymatique ADD comprenant un cocktail tri-enzymatique composé de 70 U/ml de cellulase, de 2000 U/MI d'alpha-amylase et de 500 U/ml de denarase.
Sur les figures, les éléments identiques ou analogues portent les mêmes références D'autres caractéristiques et avantages de la présente invention seront tirés de la description non limitative qui suit, et en faisant référence aux dessins et aux exemples.
Efficacité d'une composition selon l'invention pour réduire la — biomasse des biofilms impliqués dans des infections du corps humain Afin de tester l'efficacité d'une composition selon l'invention, comprenant au moins une enzyme endoribonucléase, plusieurs expériences ont été menées sur différentes souches bactériennes (isolats cliniques et souches de collection ATCC) (Tableau 1).
Tableau 1.- CS [eni Jafae Te aes Plele Tan [aes Pe Lo L'effet d'un traitement avec la composition selon l'invention sur la biomasse des biofilms a été étudié dans un modèle statique en plaques 96 puits.
Le traitement enzymatique curatif est réalisé sur un biofilm préformé de 24h. Pour tester son efficacité à réduire la biomasse des biofilms, la composition selon l'invention est mise en contact avec le biofilm pendant 1h à 37°C. La solution enzymatique est ensuite retirée, et la biomasse détachée est éliminée par des étapes de lavage. Le colorant cristal violet (CV) est ensuite utilisé pour quantifier IO la biomasse résiduelle. Ce dernier interagit avec les cellules mortes et vivantes, et les macromolécules de la matrice extracellulaire du biofilm (comme l'ADN et les exopolysaccharides). Le marquage au CV est gquantifié par spectrophotométrie en mesurant l'absorbance à 570 nm.
1.1] méthode de culture, de traitement enzymatique, de quantification de la biomassse et d'analyse des résultats Les différentes souches de S. aureus et P. aeruginosa (Table 1) ont été ensemencées dans 5ml de milieu de culture TGN (Tryptic Soy Broth VWR + 1% glucose + 2% NaCl) à partir de 20 u d'un stock glycérolé conservé à -80°C. Les souches ont ensuite été incubées à 130 rpm en aérobie à 37°C. Après 18h de croissance, les précultures ont été diluées dans du TGN pour atteindre une densité optique à 620 nm (DOs20) de 0,05, ce qui correspond à +/- 5*106 CFU/ml. Deux cents microlitres de chaque culture (n = 4 pour chaque condition testée) IO ont été placés dans les puits d'une plaque 96 puits et incubés à 37°C sans agitation pendant 24h pour permettre la formation du biofilm. Les biofilms sont ensuite lavés 2X avec 200ul PBS pH 7,5 (Sigma) afin d'éliminer les cellules planctoniques (i.e. non-adhérentes au biofilm). La composition selon l'invention ou les compositions contrôles CT- (contrôle négatif) et CT+ (contrôle positif) (200 ui) sont ajoutées sur le biofilm lavé et le biofilm est incubé pendant Ih à 37°C (n=4 pour chaque condition). Les plaques sont ensuite vidées, le biofilm est lavés 2X avec 200ul PBS pH 7,5 (Sigma) et séché à 60°C pendant 18h avant d'analyser la biomasse.
Pour quantifier la biomasse résiduelle, une solution de CV 1% (Sigma) est ajoutée sur les biofilms à température ambiante pendant 15’. Le colorant non fixé est ensuite lavé à l'eau distillée. Le colorant fixé au biofilm est ensuite détaché et dissous avec de l'acide peracétique 66% et l’absorbance à 570 NM (As70) est mesurée dans un lecteur multimode SpectraMax M3. Cette valeur d'absorbance correspond à la biomasse du biofilm.
Pour analyser l'effet des compositions selon l'invention, un test statistique (one-way ANOVA et test post-hoc de Tukey) est réalisé en comparant les valeurs d'absorbance des biofilms non traités (contrôle négatif, CT- = traitement avec du tampon sans enzyme) et des biofilms traités avec les compositions enzymatiques dont un contrôle positif, CT+. Ce contrôle positif comprend un colorant, deux tensioactifs non-anioniques, un séquestrant, un conservateur, un stabilisant enzymatique, un solvant, sept enzymes dont deux protéases (EC 3.4), une laccase (EC 1.10.3.2), une mannanase (EC 3.2.1.78 et EC
3.2.1.101), une amylase (EC 3.2.1.1) et une lipase (EC 3.1.1.3). La différence est significative lorsque la pvaleur du test statistique est inférieure ou égale à 0.05 (caractère * représenté sur les graphes). Lorsque cela est précisé dans les exemples comparatifs, l'activité. des compositions enzymatiques sont comparées entre elles (one-way ANOVA et test post-hoc Tukey).
1.2 Résultats Exemple 1.- composition selon l'invention contenant de la denarase dans du TGN.
Premièrement, une composition comprenant de la denarase (c- Lecta), qui est une endoribonucléase de S. marcescens appartenant à la classe IO enzymatique EC 3.1.30, a été testée à une concentration de 500 U/ml dans du TGN . Le contrôle négatif (CT-) est composé de TGN uniquement. L'absorbance As70 du CV mesurée sur le CT- correspond à 100% de biomasse. Comme illustré à la figure 1, le pourcentage de biomasse d'un biofilm de S. aureus ATCC 29213, ATCC 33591, 7832, 7841, 1142-004 et 1144-20 diminue respectivement de 75%, 76%, 72%, 71%, 47% et 52%. L'analyse statistique (ANOVA et test post-hoc de tukey indique que dans tous les cas, cette différence est significative (pvalue < 0,05) par rapport au CT- Cette diminution suggère que l'effet d'un agent microbicide sera potentialisé après traitement du biofilm avec la denarase.
comparaison de l'efficacité de la composition de l'exemple 1 avec d'autres endoribonucléase.
L’ effet sur la biomasse de la denarase a été comparé à ceux d'un contrôle négatif (TGN), d’un contrôle positif (EnziQure* 1% dans du TGN ; Onelife sa), et de compositions contenant de la RNase | uniquement (endoribonuclease Escherichia coli; classe EC4.6.1; ThermoFisher Scientific), et un mélange de RNase |, RNase A (endoribonucléase bovine de la classe EC 4.6.1 ; ThermoFisher Scientific) et DNase | (endodeoxyribonucléase bovine de la classe EC 3.1.21; ThermoFisher Scientific).
Les compositions sont reprises au tableau 2.
Tableau 2.- Exemple comparatif 1 | RNase | 100 U/ml TGN en Exemple comparatif 2 | RNase |, | 100U/ml de TGN (EC. 2) RNase A et | chaque DNase | enzyme Ces tests ont été effectués dans le but de comparer l'effet disruptif de biofilms des différentes nucléases à 100 U/MI dans du TGN. Ces compositions ont été testées sur Un biofilm de 24h de S. aureus ATCC33591 et 7832, et S.epidermidis ATCC35984 (n = 4) en suivant le protocole décrit au point 1.1.1.
La figure 2 montre que la RNase | (endoribonucléase) selon l'exemple comparatif ECI a peu ou pas d'effet significatif sur la diminution du pourcentage de biomasse des biofilms (1 biofilm/3 est réduit significativement IO par rapport à CT-). L'ajout de RNase A (endoribonucléase) et de DNase | (endodeoxyribonucléase) en plus de la RNase | selon l'exemple comparatif EC2 améliore légèrement l'activité disruptive de la composition de l'exemple comparatif ECIA (2 biofilms/3 sont significativement réduits). De manière intéressante, la denarase (exemple 1) (endorbonucléase) réduit significativement la biomasse de 2 biofilms/3, comme le mélange de nucléase EC2, mais de manière plus efficace : 46% vs. 30% pour la souche ATCC33591 et 37% vs 13% pour la souche ATCC35984. Etant donné que l'activité endoribonucléase aspécifique de la denarase permet de digérer à la fois l'ADN et l'ARN, il est inattendu de constater qu'une endoribonucléase choisie spécifiquement dans la classe EC 3.1.30 ou EC 3.1.31 permet une réduction plus efficace de la biomasse des biofilms qu'un mélange DNase | - Rnase | - RNase A. Les raisons scientifiques de cette observation ne sont à ce jour pas connues.
1.2.3 comparaison de l'efficacité de la denarase en traitement curatif avec d'autres composition enzymatiques L'activité antibiomasse en traitement curatif de la denarase (SOOU/mI) a ensuite été comparée à celle de la cellulase (Sigma ; 7U/mI) et de la dispersine B (GIGA ; 0,06 U/MI), et à celle d'un cocktail tri-enzymatique composé de denarase, cellulase et dispersine B aux mêmes concentrations.
Ces 4 compositions (Ex1, EC3, EC4 et Ex 2) ont été testées sur les biofilms de S. aureus ATCC33591, ATCC29213 et S. epidermidis ATCC35984 en suivant le protocole détaillé au point 1.1.1, excepté que les mélanges ont été réalisés dans un IO tampon Tris-HCI 20mM pH 7. Dans cette expérience, le CT- est le Tris-HCI 20mM pH 7 sans enzyme et sa biomasse correspond à 100%. Le CT+ est composé de 1% d'EnziQure® dans ce même tampon.
Les compositions sont reprises au tableau 3. Tableau 3.- Exemple comparatif 3 | Cellulase 7U/ml Tris-HCI 20MM ea Exemple comparatif 4 | Dispersine B 0,06U/ml Tris-HCI 20MM ee Exemple 3 (Ex. 3) Denarase, 500 U/ml Tris-HCI 20MM cellulase et | 7 U/ml dispersine B 0,06 U/ml On peut constater sur la Figure 3 que la composition comprenant la denarase (Ex.2) est la composition (Figure 3A) permettant la plus grande diminution de la biomasse de chacun des biofilms avec une diminution significative et supérieure à 80 % de la biomasse des 3 biofilms testés (Figure 3A). La cellulase (EC. 3) (Figure 3B) n'a en effet aucun effet significatif et la dispersine B (EC. 4) (Figure 3C) diminue le biofilm de 70% (ATCC29213) à 27% (ATCC33591).
Le mélange des 3 enzymes (Ex. 3) (Figure 3D) est aussi efficace que la denarase seule (Ex.2) sur 2 biofilms/3. Cependant, la composition de l'exemple 3 est moins efficace que la denarase de l'exemple 2 sur le biofilm de la souche ATCC29213. Ces résultats suggèrent que, dans les conditions expérimentales testées, il n'existe pas d'effet synergique entre la denarase, la cellulase et la dispersine B.
1.2.4 comparaison de l'activité disruptive de la biomasse Pour confirmer l'absence de synergie entre la denarase, la cellulase et la dispersine B, l'activité disruptive de la biomasse de la denarase ([Exemple 2 (Ex.2}] - (Figure 4A) a été comparée à celle de duos enzymatiques denarase + dispersine B ([Exemple 4 (Ex.4)] - (Figure 4B) et denarase + cellulase — ([Exemple 5 (Ex.5)] (Figure 4C). Les souches, conditions expérimentales et concentrations enzymatiques utilisées sont les mêmes que dans l'expérience décrite plus haut. Dans cette expérience, le CT- est le Tris-HCI 20MM pH 7 sans enzyme et sa biomasse correspond à 100%. Le CT+ est composé de 1% d'EnziQure® dans ce même tampon. Les compositions testées sont reprises au tableau 4. Tableau 4.- Exemple 4 (Ex. 4) Denarase et | 500U/ml et Tris-HCI 20MM ee 800m Exemple 5 (Ex. 5) Denarase et | 500U/ml et Tris-HCI 20MM MN ram EE De manière similaire à ce qui a été observé précédemment, les résultats obtenus indiquent que l'ajout de dispersine B (Exemple 4 - Figure 4B) ou de cellulose (exemple 3 - Figure 4C) n'augmente pas l'activité de la denarase de l'exemple 2 de manière significative sur les souches de staphylocoques testées (Figure 4A). Nous n'oloservons donc pas d'effet synergique associé au cumul de la denarase avec la cellulase ou la dispersine B.
1.2.5 comparaison de l'activité disruptive sur P. aeruginosa L'activité disruptive du biofilm de la denarase selon l'exemple 1 (500U/ml) et d'un mélange tr-enzymatique selon l'exemple 6 composé de dénarase (500U/MI), cellulase (/U/mI) et dispersine B (0,06U/MmI) a été testée sur 3 souches de P. aeruginosa (PAOI, ATCC27853 et 618) en traitement curatif (tampon TGN). Dans cette expérience, le CT- est le TGN sans enzyme et sa biomasse correspond à 100%. Le CT+ est composé de 1% d'EnziQure dans ce IO même tampon. Les compositions testées sont reprises au tableau 5. Tableau 5.- Exemple 6 (Ex. 6) Denarase et | 500U/ml et TGN Dispersine B | 0,06U/ml et cellulose 7 U/ml Les résultats présentés à la Figure 5 montrent que la denarase (Ex.! ; Fig. 5B) et la composition tri-enzymatique de l'exemple 6 (Ex. 6 ; Fig. 5A) sont aussi efficaces pour réduire la biomasse des 3 biofilms testés avec des réductions de 94%, 85% et 44% de la biomasse des biofilms de P. aeruginosa PAOI, ATCC27853 et 618, respectivement, en présence de denarase. On n'observe pas de différence significative entre les 2 compositions. Ces résultats indiquent qu'il n’y a pas de synergie entre la denarase, la cellulase et la dispersine B pour réduire la biomasse des biofilms de P. aeruginosa . En outre, de manière intéressante, la denarase et la composition de l'exemple 6 est plus efficace que le détergent multi-enzymatique enziQure (CT+; contient 7 enzymes) pour diminuer la biomasse du biofilm de P. deruginosa 618.
Efficacité d'une composition selon l'invention en combinaison avec un microbicide pour réduire la biomasse et la viabilité des biofilmsimpliqués dans des infections du corps humain Pour les essais présentés ci-dessous, la vancomycine a été utilisée comme molécule antibiotique. L'antibiotique est ajouté à différentes concentrations dans du TGN pendant 24h à 37°C sur les biofilms prétraités avec la composition enzymatique selon l'invention (voir les sections suivantes). Le biofilm est ensuite lavé avant d'effectuer les mesures de biomasse et de viabilité. Deux modèles de biofilms différents ont été utilisés : biofilm statique en plaque 96 puits (tel que décrit précédemment) et le biofilm sur coupons de Titane. Le titane a été choisi car c'est un matériel largement utilisé dans la fabrication des implants (ex. prothèses orthopédiques, implants dentaires, valves cardiaques, pacemaker…). Les techniques utilisées pour mesurer la viabilité diffèrent entre les 2 modèles et sont détaillées plus bas.
2.1 biofilm en plaques 96 puits Dans ce modèle, la viabilité cellulaire a été mesurée de manière indirecte, en mesurant le métabolisme des cellules du biofilm. En effet, la viabilité a été quantifiée en suivant l'évolution de la couleur de la resazurine (7-Hydroxy- 3H-phenoxazin-3-one 10 oxide) (prestoBlue, ThermoFisher). Ce composé de couleur bleu devient rose lorsqu'il est réduit en resorufin par l'activité redox du biofilm, activité qui est directement proportionnelle aux nombre de cellules métaboliquement actives dans le biofilm. La quantification de la resorufin est réalisée par mesure de la fluorescence. Pour corréler le nombre de cellules présentes dans le biofilm au signal fluorescent, une courbe de calibration est réalisée dans chaque expérience en mesurant le signal fluorescent émis par des différentes concentrations cellulaires connues.
2.1.1 méthode de culture, de traîtement enzymatique, de quantification de la biomasse et de la viabilité et d'analyse des résultats La méthode expérimentale pour cultiver les souches et former le biofilm est décrite au point 1.1 de ce document. Après 24h de formation du biofilm à 37°C dans les puits de la plaque 96 puits, le biofilm a été lavé 2X avec du PBS (200 Jet traité pendant Ih à 37°C avec la composition selon l'invention ou les compositions contrôles (CT- et CT+) {n= 4 pour chaque condition testée). Le biofilm est ensuite lavé 2X avec du PBS (200, ). Deux cents microlitres de différentes concentrations en vancomycine préparée dans du TGN sont ensuite ajoutées sur le biofilm et la plaque est incubée 24h à 37°C. Les biofilms qui ne sont pas traités à Ia vancomycine sont incubés en présence de TGN uniquement. Les biofilms sont ensuite lavés 2X avec du PBS (200ul) avant d'analyser la biomasse et la viabilité. La biomasse est quantifié par la technique de coloration au CV en suivant la procédure décrite au point 1.1. Pour l'analyse de la biomasse, le réactif prestoBlue (ThermoFisher) est dilué 10X dans du milieu de culture CA-MHB (VWR) et 200ul sont ajoutés dans les puits. Pour effectuer la droite de calibration, le biofilm de deux échantillons CT- non traités aux enzymes, ni à la vancomycine est détaché et homogénéisé dans 10Oul de CA-MHB et différentes dilutions de cet échantillon sont réalisées dans du CA-MHB (de 10 en 10). Dix microlitres de chaque dilution sont ensuite étalés sur boîte TSA pour effectuer un comptage bactérien. Cents microlitres d'un mélange prestoBlue dilué 5X-CaMHB sont ensuite ajoutés dans les 90 ul des différentes dilutions. La plaque contenant tous les échantillons est ensuite incubée pendant 24h à 37°C dans le lecteur de plaque spectraMax M3. La fluorescence est mesurée toutes les 10 minutes pendant 18h (excitation 560nm, émission 590nm).
Pour analyser l'effet des compositions selon l'invention, un test statistique (one-way ANOVA et test post-hoc de Tukey) est réalisé. Ce tesi compare les valeurs de fluorescence (viabilité) ou d'absorbance à 570 nm (biomasse) du contrôle négatif CT- (= traîtement avec du tampon sans enzyme) et des biofilms traités avec les compositions enzymatiques, et ce à chaque concentration en vancomycine. La différence est significative lorsque la pvaleur du test statistique est inférieure ou égale à 0.05 (caractère * représenté sur les graphes). Lorsque cela est précisé dans les exemples comparatifs, l'activité des compositions enzymatiques sont comparées entre elles (one-way ANOVA et test post-hoc Tukey).
2.1.2 Résultats La figure 6 illustre l'effet potentialisé d'un agent microbicide (la vancomycine) par la composition de l'exemple | ou de l'exemple 2 comprenant de la denarase sur le biofim de S. aureus ATCC33591. La composition a été testée dans du TGN (Ex. 1 - Fig. 6A et 6C) et dans du TrisHCl 20mM pH7 (Ex. 2 - Fig. 6B et 6D). Les contrôles CT- et CT+ sont composés de tampon sans enzymes. Les contrôles CT+ sont composés d'1% d'enziQure® (v/v) dans du tampon (TGN ou TrisHC|20MM). Après un traitements enzymatique d'Ih à 37°C, les biofilms ont été incubés 24h à 37°C en présence des concentrations suivantes en vancomycine : 0 mg/L, 10 et 20 mg/L.
Les résultats de viabilité obtenus (Fig. 6A et 6B) montrent qu'en l'absence de tratement enzymatique, la vancomycine (10 mg et 20mg/L) ne diminue pas (Fig. 5A) ou très peu (Fig. 5B) la viabilité du biofilm de S. aureus ATCC33591. Par contre, lorsque le biofilm est prétraité avec la denarase de l'exemple 1 (dans du TGN) et de l'exemple 2 (dans du TrisHCI 20MM pH7), une réduction significative par rapport au CT- de 1.35 logs et de 0.5 logs, respectivement, est observée après traitement à 20mg/L de vancomycine. Ces diminutions correspondent à une diminution de la viabilité de 96.5 et 80%, respectivement, par rapport aux contrôles CT- respectifs sans enzymes à 20mg/L de vancomycine. L'effet potentialisateur de la denarase sur Ia vancomycine 20mg/L est également observée sur la biomasse avec une réduction de la biomasse de 84% et 70% en TGN et Tris, respectivement (Fig. 6C et 6D). Un effet similaire mais plus léger sur la viabilité et la biomasse est mesuré en présence de 10mg/L de vancomycine : réduction de 50% de la viabilité et 80% de la biomasse dans du TGN, par rapport à CT-.
2.2 biofilm sur coupons de Titane Dans ce modèle, la viabilité est quantifiée après détachement et homogénéisation du biofilm par la technique d'étalement et de comptage des cellules sur boîte de culture TSA (VWR).
2.2.1 méthode de culture, de traitement enzymatique, de quantification de la biomasse et de la viabilité et d'analyse des résultats
Les coupons de Titane (n = 3 pour chaque condition) sont placés dans les puits d’une plaque 12 puits et sont incubés à 37°C sous agitation (50 rom) pendant 24h dans 3ml d’inoculum bactérien à une DO de 0,005 (106 CFU/ml) afin de permettre Ia formation de biofilm. Les coupons sont ensuite lavés 2X au PBS (2m!) et traités pendant Ih à 37°C avec la composition selon l'invention ou la solution sans enzymes (CT- = TrisHCI 20mM pH7). Les coupons sont ensuite lavés 2X au PBS (2ml) et réincubés dans 750 ul de TGN contenant 0 ou 20mg/L de vancomycine pendant 24h à 37°C sous agitation (50 rom). Après 2 lavages au PBS (2m), le biofilm est décroché et homogénéisé dans 2ml de PBS. Différentes dilutions sont réalisés (de 10 en 10) et 10 ul de chaque dilution est étalé sur boite TSA. Les colonies (CFU) sont comptés après 18h d'incubation à 37°C. Pour analyser l'effet des compositions selon l'invention, un test statistique (one-way ANOVA et test post-hoc de Tukey) est réalisé. Ce test compare les valeurs de fluorescence (viabilité) ou d’absorbance (biomasse) du contrôle négatif CT- (= traitement avec du tampon sans enzyme) et des biofilms traités avec les compositions enzymatiques, et ce à chaque concentration en vancomycine. La différence est significative lorsque la pvaleur du test statistique est inférieure ou égale à 0.05 (caractère * représenté sur les graphes). Lorsque cela est précisé dans les exemples comparatifs, l'activité des compositions enzymatiques sont comparées entre elles (one-way ANOVA et test post-hoc Tukey).
2.1.2 Résultats Effet potentialisateur de 3 compositions tri-enzymatiques sur l'efficacité de la vancomycine La figure 7 illustre l'effet potentialsateur de trois compositions tri- enzymatique contenant de la denarase sur l'effet microbicide de la vancomycine à 20mg/L: (i) Exemple 8 (Ex. 8): cellulase (7U/ml}, denarase (500U/ml) et la dispersine B (0,06U/mI), (ii) Exemple 9 (Ex. 9) : flavourzyme (1% v/v), denarase (500U/mI) et dispersine B (0,06 U/ml) et (iii) BDD : Blaze® Pro (1% v/v),
denarase (500U/ml) et dispersine B (0,06U/MI) sur S. aureus ATCC33591. Le tampon utilisé est du Tris-HCI 20mM pH7. Les compositions sont reprises au tableau 6. Tableau 6.- Exemple 3 (Ex. 3) Denarase et | 500U/ml et Tris-HCI 20MM Dispersine B et | 0,06U/ml ee Exemple 8 (Ex. 8) Denarase et 500U/ml Tris-HC 1 20MM Flavourzyme 1% V/V Le Exemple 9 (Ex. 9) Denarase et 500U/ml Tris-HCI 20MM Blaze® Pro 1% V/V |
Les résultats montrent qu'en absence de traitement enzymatique (CT-) la vancomycine 20mg/L ne diminue pas la viabilité dans le biofilm.
Par contre, le prétraitement des biofilms aux 3 compositions potentialisent de manière significative l'effet de la vancomycine.
En effet, avec les 3 cocktails une réduction similaire de 2,5 logs est observée en présence de 20mg/L de vancomycine (= réduction de 99,8% de la viabilité). Effet potentialisateur de 3 compositions tri-enzymatiques sur la vancomycine La figure 8 illustre l'effet potentialsateur de trois compositions tri- enzymatique contenant de la denarase sur l'effet microbicide de la vancomycine à 20mg/L: (i) Exemple 6 : cellulase (7U/ml), denarase (500U/ml|) et la dispersine B (0,06U/mI), (ii) Exemple 10 : cellulase (70U/ml), denarase (SOOU/mI) et la dispersine B (0,32 U/mI) et (iii) Exemple 11 : alpha-amylase (2000 U/mI) ; cellulase (70U/MI), denarase (500U/ml) et la dispersine B (0,32 U/MI). Ces cocktails ont été testés en traitement curatif sur les biofilms de S. aureus ATCC33591 (Fig. 8A), S. epidermidis ATCC35984 (Fig. 8B) et S. aureus 144-20 (Fig. 8C). Le tampon Utilisé est du TGN.
Les compositions sont reprises au tableau 7. Tableau 7.- Exemple 6 (Ex. 6) Denarase et | 500U/ml et TGN Dispersine B et | 0,06U/ml cellulose 7 U/ml Exemple 10 (Ex. 10) Denarase et | 500U/ml TGN Dispersine B et | 0,32 U/ml cellulose 70 U/ml Exemple 11 (Ex. 11) Denarase et 500U/ml TGN alpha-amylase | 2000 U/ml Et Dispersine B | 0,32U/ml Les résultats montrent qu'en absence de traitement enzymatique (CT-) la vancomycine 20mg/L ne diminue pas la viabilité dans le biofilm de manière significative.
Par contre, le prétraitement des biofilms aux 3 compositions potentialisent de manière significative l'effet de Ia vancomycine sur la viabilité des 3 souches testées.
Dans ces conditions, une réduction de la viabilité de 2,5 à 3 logs est observée en présence de vancomycine 20mg/L par rapport aux CT- non traités avec les cocktails.
Efficacité d'une composition selon _l'invention_en combinaison avec un microbicide pour prévenir la formation de biofilm impliqués dans des infections du corps humain
3.1 modèle de biofilm en plaques 96 puits La capacité de la composition selon l'invention à prévenir la formation de biofilm a été testée sur un Modèle de biofilm en plaque 96 puits.
Dans ce set-up expérimental, les compostions enzymatiques sont ajoutées dans l'inoculum bactérien de départ (milieu TGN contenant 5*106 CFU/mI), c'est-à- dire avant la formation du biofilm.
Après 24h de croissance à 37°C, les biofilms sont lavés et incubés en présence de vancomycine (20mg/L) pendant 24h à 37°C, comme décrit au point 2.1.1. La quantité de biomasse (coloration CV) et la viabilité (mesure du métabolisme) des biofilms sont ensuite mesurés et IO comparés à la condition CT- où l'inoculum de départ ne contenait pas d'enzymes (n=4 dans chaque condition). Les compositions testées sont reprises au tableau 8. Tableau 8.- Exemple 10 (Ex. 10) Denarase et | 500U/ml TGN Dispersine B et | 0,32 U/ml ee Exemple 11 (Ex. 11) Denarase et 500U/ml TGN alpha-amylase | 2000 U/ml En La Figure 9 montre l'effet préventif de 2 compositions selon l'invention contenant de la denarase (exemples 10 & 11), sur différentes souches de S. aureus et S. epidermidis.
En présence de vancomycine 20 mg/L, les 2 cocktails réduisent de manière significative la quantité de biomasse formée (Fig. 9A) et la viabilité du biofilm (Fig. 9B), avec des amplitudes variables entre les souches.
3.2 modèle de biofilm en coupons de fitane L'effet préventif de la formation de biofilm des compositions selon l'invention ont été testées sur un modèle coupons en titane. Dans cette expérience, les coupons sont incubés pendant 24h à 37°C avec un inoculum bactérien (106 CFU/MI) dans du TGN contenant différentes compositions enzymatiques, ou non (=CT-). Après formation du biofilm, les coupons sont incubés en présence (Van Omg/L) ou présence de 20 mg/L de vancomycine pendant 24h avant analyse de la viabilité par Ia technique d'étalement sur TSA et de comptage. Les compositions testées sont reprises au tableau 7. Tableau 7.- Exemple 6 (Ex. 6) Denarase et | 500U/ml et TGN Dispersine B et | 0,06U/ml cellulose 7 U/ml Exemple 10 (Ex. 10) Denarase et | 500U/ml TGN Dispersine B et | 0,32 U/ml
EE Exemple 11 (Ex. 11) Denarase et 500U/ml TGN alpha-amylase | 2000 U/ml EE | La figure 10 illustre l'effet préventif de trois compositions tri- enzymatique contenant de la denarase sur l'effet microbicide de la vancomycine à 20mg/L: (i) Exemple 6 : cellulase (7U/ml), denarase (500U/ml|) et la dispersine B (0,06U/mI), (ii) Exemple 10 : cellulase (70U/ml), denarase (SOOU/mI) et la dispersine B (0,32 U/ml) et (iii) Exemple 11 : alpha-amylase (2000 U/mI) ; cellulase (70U/ml|}, denarase (500U/ml) et la dispersine B (0,32 U/MI). Ces cocktails ont été testés en traitement préventif sur le biofilm de S. aureus ATCC33591 (Fig.
IOA) et S. epidermidis ATCC35984 (Fig. 10B). Les résultats indiquent qu'en présence de vancomycine 20 mg/L, les 3 cocktails réduisent de manière significative la viabilité dans le biofilm formé pars. aureus ATCC33591 (diminution de 2,5 à 3 logs) (Fig.
IOA) et S. epidermidis ATCC35984 (diminution de 2 à 3 logs) (Fig. 10B) après 24h d'incubation.
Ces observations montrent que les compositions selon l'invention contenant de la denarase préviennent la formation de biofilm, et par conséquent potentialisent l'effet d'un antibiotique sur sa capacité à réduire la viabilité au sein du biofilm.
Il est bien entendu que la présente invention n'est en aucune façon limitée aux formes de réalisations décrites ci-dessus et que bien des modifications peuvent y être apportées sans sortir du cadre des revendications annexées.
Par exemple, la dénarase a été utilisée dans les exemples, il va de sol que les exemples auraient pu illustrer l'activité de la benzonase endonucléase® disponible auprès de la société Millipore Sigma

Claims (1)

  1. REVENDICATIONS BE2020/5726
    1. Utilisation d'une composition para-pharmaceutiaue OU pharmaceutique administrable à l'être vivant, en particulier à l'être humain comprenant au moins une enzyme endorbonucléase choisie dans le groupe constitué des enzymes appartenant aux classes enzymatiques EC 3.1.30 et EC
    3.1.31 et leurmélange, pour potentialiser un agent microbicide, en particulier un antibiotique, un antifongique, ou un désinfectant, dans le traitement et/ou la prévention d'infections bactériennes impliquant la formation de biofilm.
    2. Utilisation d'une composition para-pharmaceutique ou pharmaceutique administrable à l'être vivant, en particulier à l'être humain IO selon la revendication 1, dans laquelle le traitement et/ou la prévention d'infections bactériennes impliquant la formation de biofilm est un traitement curatif ou préventif des infections dermatologiques ou d'infections se développant sur des brûlures et des plaies superficielles ou profondes.
    3. Utilisation d'une composition para-pharmaceutique OU pharmaceutique administrable à l'être vivant, en particulier à l'être humain selon la revendication 1, dans laquelle le traitement et/ou la prévention d'infections bactériennes impliquant la formation de biofilm est Un traitement curatif et/ou préventif des infections post-implantatoires associées à l'infection de tissus autour d'un dispositif médical implanté dans le corps ou d'un dispositif médical implanté dans le corps.
    4. Utilisation d'une composition para-pharmaceutique OU pharmaceutique administrable à l'être vivant, en particulier à l'être humain dans le traitement et/ou la prévention d'infections bactériennes impliquant la formation de biofilm selon la revendication 1, dans un soin d'hygiène corporelle ou cosmétique, comme par exemple un soin pour les ongles, une solution buccale, un bain de bouche, un dentifrice, un bain oculaire, une solution de nettoyage de lentiles oculaires, une solution de nettoyage d'appareils/prothèses dentaires, de brosses à dents, un soin pour la peau anti- acné.
    5. Utilisation d'une composition para-pharmaceutique OU pharmaceutique administrable à l'être vivant, en particulier à l'être humain selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, dans laquelle ladite composition comprend, en outre, une série d'enzymes additionnelles, par exemple une, deux, trois, quatre, cinq, six, sept, huit enzyme(s).
    6. Utilisation d'une composition para-pharmaceutique OU pharmaceutique administrable à l'être vivant, en particulier à l'être humain selon la revendication 5, dans laquelle une enzyme de ladite série d'enzymes additionnelles de ladite composition est choisie dans le groupe constitué des glycosidases (EC 3.2.1), des désoxyribonucléases (EC 3.1.21), des oxydoréductases (EC 1.), des hydrolases d'ester carboxylique (EC 3.1.1), des protéases et des peptidases (EC 3.4.), et de leur mélange.
    7. Utilisation d'une composition para-pharmaceutique OU pharmaceutique administrable à l'être vivant, en particulier à l'être humain selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, dans laquelle ladite composition comprend au moins une deuxième enzyme choisie dans le groupe des glycosidases (EC 3.2.1).
    8. Utilisation d'une composition para-pharmaceutique OU pharmaceutique administrable à l'être vivant, en particulier à l'être humain selon la revendication 7, dans laquelle ladite composition comprend au moins une troisème enzyme choisie dans le groupe constitué des glycosidases (EC
    3.2.1), désoxyribonucléases (EC 3.1.21), oxydoréductases (EC 1), des hydrolases d'ester carboxylique (EC 3.1.1), des peptidases et des protéases (EC 3.4), et de leur mélange, en particulier choisie dans le groupe constitué des glycosidases (EC 3.2.1) et des peptidases (EC 3.4).
    9. Utilisation d'une composition para-pharmaceutique OU pharmaceutique administrable à l'être vivant, en particulier à l'être humain selon l'une quelconque des revendications 1, 3, 5 à8, dans laquelle le traitement et/ou la prévention d'infections bactériennes impliquant la formation de biofilm est un traitement curatif ou préventif d'une infection bactérienne de tissus entourant un implant orthopédique implanté ou de l'implant orthopédique implanté.
    10. Utilisation d'une composition para-pharmaceutique OU pharmaceutique administrable à l'être vivant, en particulier à l'être humain selon l'une quelconque des revendications 1, 3, 5 à8, dans laquelle le traitement et/ou la prévention d'infections bactériennes impliquant la formation de biofilm est un traitement curatif ou préventif d'une infection bactérienne de tissus entourant un implant dentaire implanté ou de l'implant dentaire implanté.
    11. Utilisation d'une composition para-pharmaceutique OU pharmaceutique administrable à l'être vivant, en particulier à l'être humain selon l'une quelconque des revendications 1, 3,5 à 8, dans laquelle le traitement et/ou la prévention d'infections bactériennes impliquant la formation de biofilm est un traitement curatif ou préventif d'une infection bactérienne de tissus entourant un cathéter, une canule, une sonde, une prothèse, un implant endo- osseux, un implant zygomatique, un implant orthodontigue, une prothèse dentaire, une plaque de contention, un valve, Un drain, un stent, un tube pour respiration artificielle ou une vis implanté ou d' un cathéter, une canule, une sonde, une prothèse, un implant endo-osseux, un implant zygomatique, un implant orthodontique, une prothèse dentaire, une plaque de contention, un valve, un drain, un stent, un tube pour respiration artificielle ou une vis implanté.
    12. Utilisation d'une composition para-pharmaceutique OU pharmaceutique administrable à l'être vivant, en particulier à l'être humain selon l'une quelconque des revendications 1, 2, 4 à8, dans laquelle le traitement et/ou la prévention d'infections bactériennes impliquant la formation de biofilm comprend une application de ladite composition sur une plaie, une infection, des tissus ou un dispositif médical, de préférence une application d'un support tissé OU non tissé imprégné de ladite composition para-pharmaceutique ou pharmaceutique.
    13. Utilisation d'une composition para-pharmaceutique OU pharmaceutique administrable à l'être vivant, en particulier à l'être humain selon l'une quelconque des revendications 1, 2, 5 à8, dans laquelle le traitement et/ou la prévention d'infections bactériennes impliquant la formation de biofilm comprend une application de ladite composition sur une plaie, une infection, des tissus, de préférence une application d'un pansement sous forme de gel comprenant ladite composition para-pharmaceutique ou pharmaceutique.
    14. Utilisation d'une composition para-pharmaceutique OU pharmaceutique administrable à l'être vivant, en particulier à l'être humain, selon l'une quelconque des revendications 1 à 11, dans laquelle le traitement et/ou la prévention d'infections bactériennes impliquant la formation de biofilm comprend une application de ladite composition sur une plaie, une infection, des tissus ou Un dispositif médical, de préférence une application d'une solution aqueuse, de préférence tamponnée de ladte composition para- pharmaceutique ou pharmaceutique, par infiltration, par irrigation, par injection, par application percutanée, par inhalation, par bain de bouche ou bain oculaire, par tamponnage.
    15. Utilisation d'une composition para-pharmaceutique OU pharmaceutique administrable à l'être vivant, en particulier à l'être humain, selon l'une quelconque des revendications 1, 2, 4 à8, dans laquelle le traitement et/oula prévention d'infections bactériennes impliquant la formation de biofilm comprend une application de ladite composition sur une plaie, une infection, des tissus ou un dispositif médical, de préférence une application d'une pâte, d'une crème, d'une pommade, ou d'une solution visqueuse comprenant ledite composition para-pharmaceutique ou pharmaceutique, comme par exemple d'un dentifrice.
    16. Utilisation d'une composition para-pharmaceutique OU pharmaceutique administrable à l'être vivant, en particulier à l'être humain, dans laquelle ledit agent microbicide, en particulier ledit antibiotique, phage, antifongique, ou ledit désinfectant et ladite composition forment un produit de combinaison pour un emploi simultané, séparé ou échelonné dans le temps.
    17. Composition para-pharmaceutique ou pharmaceutique administrable à l'être vivant, en particulier à l'être humain comprenant au moins une enzyme endoribonucléase choisie parmi les classes EC 3.1.30 et EC 3.1.31, de préférence à une teneur de 10 à 1000U/ml, de préférence 50 à 500U/ml, de préférence de 100 à 500U/ml, comme par exemple à Une teneur de 200 U/ml à 650 U/ml, plus particulièrement de 250 U/ml à 550 U/ml, de manière préférée de 300 U/ml, voire de 350 U/ml à 500 U/ml.
    18. Composition para-pharmaceutique ou pharmaceutique administrable à l'être humain selon la revendication 17, dans laquelle ladite au moins une enzyme endoribonucléase est d'origine bactérienne.
    19. Composition para-pharmaceutique ou pharmaceutique administrable à l'être vivant, en particulier à l'être humain selon la revendication 17 ou la revendication 18, comprenant, en outre, une série d'enzymes additionnelles, par exemple une, deux, trois, quatre, cinq, six, sept, huit enzymel(s).
    20. Composition para-pharmaceutique ou pharmaceutique administrable à l'être vivant, en particulier à l'être humain selon la revendication 19, dans laquelle une enzyme de ladite série d'enzymes additionnelles de ladite composition est choisie dans le groupe constitué des glycosidases (EC 3.2.1), des désoxyriponucléases (EC 3.1.21), des oxydoréductases (EC 1), des hydrolases d'ester carboxylique (EC3.1.1) et des peptidases (EC 3.4), et de leur mélange
    21. Composition para-pharmaceutique ou pharmaceutique IO administrable à l'être vivant, en particulier à l'être humain selon l'une quelconque des revendications 17 à 20, comprenant, en outre, au moins une deuxième enzyme choisie dans le groupe des glycosidases (EC 3.2.1).
    22. Composition para-pharmaceutique ou pharmaceutique administrable à l'être vivant, en particulier à l'être humain selon la revendication 21, comprenant en outre, au moins une troisième enzyme choisie dans le groupe comprenant des glycosidases (EC 3.2.1), des désoxyriponucléases (EC 3.1.21), des oxydoréductases (EC 1), des hydrolases d'ester carboxylique (EC 3.1.1), des protéases et des peptidases (EC 3.4).
    23. Composition para-pharmaceutique ou pharmaceutique administrable à l'être vivant, en particulier à l'être humain selon Ia revendication 22, comprenant au moins une quatrième enzyme choisie dans le groupe comprenant des glycosidases EC 3.2.1), des désoxyribonucléases (EC 3.1.21), des oxydoréductases (EC 1), des hydrolases d'ester carboxylique (EC 3.1.1), des protéases et des peptidases (EC 3.4).
    24. Composition para-pharmaceutique ou pharmaceutique administrable à l'être vivant, en particulier à l'être humain selon la revendication 23, comprenant au moins une cinquième enzyme choisie dans le groupe comprenant des glycosidases (EC 3.2.1), des désoxyribonucléases (EC 3.1.21), des oxydoréductases (EC 1), des hydrolases d'ester carboxylique (EC 3.1.1), des protéases et des peptidases (EC 3.4).
    25. Composition para-pharmaceutique ou pharmaceutique administrable à l'être vivant, en particulier à l'être humain selon la revendication 24, comprenant au moins une sixème enzyme choisie dans le groupe comprenant des glycosidases (EC 3.2.1), des désoxyribonucléases (EC 3.1.21), des oxydoréductases (EC 1), des hydrolases d'ester carboxylique (EC 3.1.1), des protéases et des peptidases (EC 3.4).
    26. Composition para-pharmaceutique ou pharmaceutique administrable à l'être vivant, en particulier à l'être humain selon la revendication 25, comprenant au moins une septième enzyme choisie dans le groupe comprenant des glycosidases (EC 3.2.1), des désoxyriponucléases (EC 3.1.21), des oxydoréductases (EC 1), des hydrolases d'ester carboxylique (EC 3.1.1), des protéases et des peptidases (EC 3.4).
    27. Composition para-pharmaceutique ou pharmaceutique administrable à l'être vivant, en particulier à l'être humain selon la revendication 26, comprenant au moins une huitième enzyme choisie dans le groupe comprenant des glycosidases (classe EC 3.2.1), des désoxyribonucléases (classe EC 3.1.21), des oxydoréductases (classe EC 1.), des hydrolases d'ester carboxylique (classe EC 3.1.1), des protéases et des peptidases (classe EC 3.4.), et de leur mélange.
    28. Composition para-pharmaceutique ou pharmaceutique administrable à l'être vivant, en particulier à l'être humain selon l'une quelconque des revendications 17 à 27, comprenant en outre au moins une molécule microbicide comme un antibiotique, un antiseptique, antifongique, un phage, ou un ou plusieurs peptides microbicides conditionné séparément ou avec ladite endoribonucléase.
    29. Composition para-pharmaceutgive ou pharmaceutique administrable à l'être vivant, en particulier à l'être humain selon l'une quelconque des revendications 17 à 28, comprenant, en outre une inhibiteur de quorum sensing
    30. Composition para-pharmaceutique ou pharmaceutique administrable à l'être vivant, en particulier à l'être humain selon l'une quelconque des revendications 17 à 29, sous forme d'une solution, comprenant, en outre, un tampon enzymatique choisi dans le groupe constitué du Tris-HCI, TGN, TBS, PBS, HEPES, MES, PIPES, MOPS, BES, TES, tampon phosphate et tampon citrate, contenant de 0 à 2 MM de MgCl2, contenant de 0 à 2MM CaCl2, et de 0 à 500 MM de NaCl.
    31. Composition parapharmaceutique ou pharmaceutique administrable à l'être vivant, en particulier à l'être humain selon l’une quelconque des revendications 17 à 29 , sous forme d'une solution, comprenant en outre, un tampon enzymatique comprenant 0 à 50% d’agent de stabilisation (polyol, arginine, formiate de calcium, glucose).
    32. Composition para-pharmaceutique ou pharmaceutique administrable à l'être vivant, en particulier à l'être humain selon l'une quelconque des revendications 17 à 31, comprenant, en outre, au moins un tensio-actif.
    33. Composition para-pharmaceutique ou pharmaceutique administrable à l'être vivant, en particulier à l'être humain selon l'une quelconque des revendications 17 à 32, comprenant, en outre, au moins un conservateur.
    34. Composition para-pharmaceutique ou pharmaceutique administrable à l'être vivant, en particulier à l'être humain selon l'une quelconque des revendications 17 à 33, comprenant, en outre, au moins un séquestrant.
    35. Composition pharmaceutique administrable à l'être vivant, en particulier à l'être humain selon l'une quelconque des revendications 17 à 34, sous forme de solution, par exemple un bain de bouche, un bain oculaire, une lotion, une solution d'irrigation, une solution injectable.
    36. Composition para-pharmaceutique ou pharmaceutique selon l'une quelconque des revendications 17 à 34, sous forme d'un pansement hydrophile, par exemple Un hydrogel.
    37. Composition para-pharmaceutique ou pharmaceutique selon l'une quelconque des revendications 17 à 34, sous forme immobilisée sur un support tissé OU non tissé, sec ou sur un dispositif médical ou sous forme imprégnée sur un support tissé ou non tissé.
    38. Composition para-pharmaceutique ou pharmaceutique selon l'une quelconque des revendications 17 à 34, sous forme d'une composition topique.
    39. Composition para-pharmaceutique ou pharmaceutique selon l'une quelconque des revendications 17 à 34, sous forme d'une solution stérile administrable par infiltration, par irigation, par injection, par application percutanée et par inhalation.
    40. Composition para-pharmaceutique ou pharmaceutique selon l'une quelconque des revendications 17 à 37 pour une utilisation en tant due potentialisateur d'un agent microbicide, en particulier un antibiotique, un phage, un antifongique, ou un désinfectant, dans le traitement et/ou la prévention d'infections bactériennes impliquant la formation de biofilm.
    41. Composition para-pharmaceutique ou pharmaceutique selon l’une quelconque des revendications 17 à 38 pour une utilisation dans un traîtement curatif ou préventif des infections dermatologiques ou d'infections se développant sur des brûlures et des plaies superficielles ou profondes.
    42. Composition para-pharmaceutique ou pharmaceutique selon l'une quelconque des revendications 17 à 38, pour une utilisation dans traitement curatif et/ou préventif des infections post-implantatoires associées à l'infection de tissus autour d'un dispositif médical implanté dans le corps ou d'un dispositif médical implanté dans le corps.
    43. Composition para-pharmaceutique ou pharmaceutique selon l'une quelconque des revendications 17 à 38, pour une utilisation dans un soin d'hygiène corporelle ou cosmétique, comme par exemple Un soin pour les — ongles, une solution buccale, un bain de bouche, un dentifrice, un bain oculaire, une solution de nettoyage de lentilles oculaires, une solution de nettoyage d'appareils dentaires, de brosses à dents, un soin pour la peau anti-acné.
    44. Composition para-pharmaceutique ou pharmaceutique selon l'une quelconque des revendications 17 à 38, pour une utilisation dans un traitement curatif ou préventif d’une infection bactérienne de tissus entourant un implant orthopédique implanté ou de l'implant orthopédique implanté.
    45. Composition para-pharmaceutique ou pharmaceutique selon l'une quelconque des revendications 17 à 38, pour une utilisation dans un traitement curatif ou préventif d'une infection bactérienne de tissus entourant un implant dentaire implanté ou de l'implant dentaire implanté.
    46. Composition para-pharmaceutique ou pharmaceutique selon l'une quelconque des revendications 17 à 38, pour une utilisation dans un traitement curatif ou préventif d'une infection bactérienne de tissus entourant un catheter, une canule, une sonde, une prothese, un implant endo-osseux, un implant zygomatique, un implant orthodontique, une prothèse dentaire, une plaque de contention, un valve, un drain, un stent, un tube pour respiration artificielle ou une vis implanté ou bien d'un cathéter, une canule, une sonde, une prothèse, un implant endo-osseux, un implant zygomatique, un implant orthodontique, une prothèse dentaire, une plaque de contention, un valve, un drain, un stent, un tube pour respiration artificielle ou une vis implanté.
    47. Composition para-pharmaceutique ou pharmaceutique selon l'une quelconque des revendications 17 à 38 et 41, 42, pour une utilisation dans le traitement et/ou la prévention d'infections bactériennes impliquant la formation de biofilm qui comprend une application de ladite composition sur une plaie, une infection, des tissus ou un dispositif médical, de préférence une application d'un support tissé ou non tissé imprégné de ladite composition para- pharmaceutique ou pharmaceutique ou sur lequel ladite composition para- pharmaceutique ou pharmaceutique est immobilisée, par exemple à sec.
    48. Composition para-pharmaceutique ou pharmaceutique selon l'une quelconque des revendications 17 à 38 et 41, pour une utilisation dans le traitement et/ou la prévention d'infections bactériennes impliquant la formation de biofilm qui comprend une application de ladite composition sur une plaie, une infection, des tissus, de préférence une application d'un pansement sous forme de gel, plus particulièrement un hydrogel comprenant ladite composition para-pharmaceutique ou pharmaceutique.
    49. Composition para-pharmaceutique ou pharmaceutique selon l'une quelconque des revendications 17 à 38 et 41 à 46, pour une utilisation dans le traitement et/ou la prévention d'infections bactériennes impliquant la formation de biofilm qui comprend une application de ladite composition sur une plaie, une infection, des tissus ou un dispositif médical, de préférence une application d'une solution aqueuse, de préférence tamponnée de ladite composition para-pharmaceutique ou pharmaceutique, par infiltration, par irigation, par injection, par application percutanée, par inhalation, par bain de bouche ou bain oculaire, par tamponnage, par trempage.
    50. Composition para-pharmaceutique ou pharmaceutique selon l'une quelconque des revendications 17 à 38 et 41, pour une utilisation dans le traitement et/ou la prévention d'infections bactériennes impliquant la formation de biofilm qui comprend une application de ladite composition sur une plaie, une infection, des tissus ou un dispositif médical, de préférence une application d'une pâte ou d'une solution visqueuse comprenant ladite composition para-pharmaceutique ou pharmaceutique, comme par exemple d'un dentifrice.
    51. Composition para-pharmaceutique ou pharmaceutique selon l'une quelconque des revendications 28 à 50, pour une utilisation comme produit de combinaison pour un emploi simultané, séparé ou échelonné dans le IO temps.
    52. Composition para-pharmaceutique ou pharmaceutique selon l'une quelconque des revendications 17 à 38 et 41 à 45, pour une utilisation chirurgicale.
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