BE1026767B1 - La méthode de la construction et l'utilité du Streptomyces diastatochromogènes de recombinaison de renforcer l'expression toyB - Google Patents

La méthode de la construction et l'utilité du Streptomyces diastatochromogènes de recombinaison de renforcer l'expression toyB Download PDF

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Abstract

La présente invention révèle un genre Streptomyces diastatochromogènes de recombinaison de renforcer l’expression toyB et la méthode de sa construction et son utilité. Le genre Streptomyces diastatochromogènes de recombinaison est capable d’exprimer excessivement les gènes toyB codant l’enzyme de synthèse de 6-pyruvoyl-tetahydroptérine, soit l’enzyme clé pour la synthèse biologique de toyocamycine et possède la capacité de la synthèse de toyocamycine plus puissante que Streptomyces diastatochromogènes 1628. Le procédé de construction est comme suit : 1) construire le vecteur de traduction plB139-toyB; 2) profiter de la méthode de soudage et de transfert et insérer le vecteur de traduction dans le chromosome de Streptomyces diastatochromogènes, puis obtenir la bactérie d’ingénierie. Profiter du promoteur permE* du vecteur plB139 pour démarrer la traduction des gènes toyB et de la méthode de sondage et de transfert pour introduire la particularité du vecteur plB139-toyB au chromosome de Streptomyces diastatochromogènes 1628 et obtenir la bactérie d’ingénierie avec une stable hérédité. Par rapport à la souche d’origine, l’activité de l’enzyme de synthèse de 6-pyruvoyl-tetahydroptérine de la bactérie de recombinaison s’élève au moins de 1,3 fois et la production de toyocamycine s’élève au moins de 23,4%.

Description

La méthode de la construction et l’utilité du Streptomyces diastatochromogènes de recombinaison de renforcer l’expression toyB
DOMAINE TECHNIQUE
La présente invention concerne l'augmentation de la production de toyocamycine par renforcer l'expression des gènes toyB dans Streptomyces diastatochromogènes et appartient au domaine de la technologie de génie génétique.
CONTEXTE TECHNIQUE
[0002] La toyocamycine est un nouveau antibiotique de nucléoside, la formule moléculaire étant C12H13N5O4, le ribose Ci connectant l'anneau de désazotation purine similaire à la guanine, la structure clé étant la Pyrryl-pyrimidine, un analogue nucléoside. Son mécanisme de fonctionnement réside principalement en l'influence sur la croissance des bactéries par inhiber la transcription du microbe et les rapportages de recherche au sujet de sa bioactivité se concentrent considérablement sur le domaine de la médecine clinique. Recherches les plus récentes démontrent que la toyocamycine peut apporter un bon effet sur la prévention et guérison des maladies épidémiques de plusieurs plantes. En plus, son utilisation de longtemps ne cause pas la pollution environnementale et dans un certain degré joue un rôle d'ajuster la croissance végétale. En conséquence, la toyocamycine possède la potentialité d'utilité sur le plan de la prévention et guérison des maladie végétales d'agriculture. En comparaison avec la méthode de synthèse
- 2 BE2019/5493 chimique, la synthèse biologique de la toyocamycine use des ressources renouvelables comme matière première et en plus elle présente les avantages de réaction de condition douce, de faible pollution et de bas coût,etc.. Donc, la méthode de synthèse biologique est une méthode économique et efficace de la production industrielle de toyocamycine pour le moment.
La toyocamycine appartient au métabolite secondaire et sa voie de synthèse est complexe à cause de la restriction et la contrôle de plusieurs facteurs, tout ça suscitant une niveau bas de synthèse et la difficulté de production industrielle. Le moyen du présent de résoudre ce problème réside en la sélection des bactéries productives avec une qualité supérieure et un rendement élevé, l'obtention de semences par mutagenèse à la façon traditionnelle étant considérée comme le moyen important de sélection. Mais nombreux facteurs incertains et la période trop longue accompagnent toujours la sélection des bonne bactéries productive.
Comment profiter de la biologie moléculaire et des autres moyens techniques avancés améliorant le microbe et augmentant de plus la production de toyocamycine se fait une voie praticable. Le groupe de McCarty considère une souche de Streptomyces rimosus (ATCC14673) qui peut synthétiser la toyocamycine comme objet d'origine de recherche, clone le cluster génétique de toyocamycine synthétique biologique, élucide le procédé de la syntèse de toyocamycine et le mécanisme de l'ajustement et le contrôle. En outre, les études découvre que c'est le prosome de GTP qui subit plusieurs réactions et synthétise la toyocamycine et l'enzyme de synthèse de 6-pyruvoyl-tetahydroptérine codé par les gènes toyB est un des enzymes clé de voie métabolique. Parce que profiter de la technologie de l'ingénierie métabolique, élever davantage la production de toyocamycine par l'augmentation du flux métabolique de toyocamycine touche la difficulté de l'établissement du
- 3 BE2019/5493 système de traduction et des autres problèmes compliqués, on n'a pas encore vu le rapportage connexe.
CONTENU DE L’INVENTION
Afin de surmonter les inconvénients de la technologie du moment, la présente invention fournit la méthode de constuction et l'utilité d'une bactérie d'ingénierie du Streptomyces diastatochromogènes produisant la toyocamycine.
Streptomyces diastatochromogènes 1628 est un actinomycète antagoniste, et sa boisson fermentée possède un fort effet d'inhibition sur plusieurs fungus pathogéniques végétaux. Après la séparation et l'extraction, il est prouvé que le composant actif principal de la boisson fermentée est la toyocamycine. Et on n'a pas encore vu le rapportage d'études en matière de la modification moléculaire de l'ingénierie métabolique de Streptomyces diastatochromogènes.
Tout d'abord, cette invention clone les gènes toyB codant l'enzyme de synthèse de 6-pyruvoyl-tetahydroptérine à la première fois en utilisant Streptomyces diastatochromogènes 1628 (le numéro souchothèque est CGMCC NO. 2060), connecte les gènes et le plasmide intégré de type expressif pIB139 du Streptomyces, puis réussit à construire le vecteur de recombinaison pIB139-toyB transportant les gènes toyB, et enfin introduit la particularité du vecteur pIB139-toyB dans le chromosome de Streptomyces diastatochromogènes 1628 en profitant de la méthode de sondage et de transfert.
Pour les gènes toyB d'un genre Streptomyces diastatochromogènes, sa séquence est comme le montre SEQ ID NO:1
Pour un genre Streptomyces diastatochromogènes de recombinaison de renforcer l'expression toyB, il traduit les gènes toyB de codage de l'enzyme de synthèse de 6-pyruvoyl-tetahydroptérine, soit l'enzyme clé de la synthèse biologique de toyocamycine et en plus possède la
- 4 BE2019/5493 capacité plus puissante de traduire la toyocamycine que Streptomyces diastatochromogènes 1628
La bactérie d'origine est Streptomyces diastatochromogènes 1628.
Les gènes toyB codant l'enzyme de synthèse de 6-pyruvoyltetahydroptérine provient de la bactérie d'origine de Streptomyces diastatochromogènes 1628 prête à recombiner.
Les gènes toyB codant l'enzyme de synthèse de 6-pyruvoyltetahydroptérine sont insérés dans le chromosome de la bactérie originale de Streptomyces diastatochromogènes.
La méthode de construction de Streptomyces diastatochromogènes de recombinaison de renforcer l'expression toyB est caractérisée par le fait que le procédé est comme suit :
1) Construire le vecteur de traduction pIB139-toyB; .
2) Profiter de la méthode de soudage et de transfert et insérer le vecteur de traduction dans le chromosome de Streptomyces diastatochromogènes, puis obtenir la bactérie d'ingénierie.
Profiter du promoteur permE* du vecteur pIB139 pour démarrer la traduction des gènes toyB et profiter de la méthode de sondage et de transfert pour introduire la particularité du vecteur pIB139-toyB au chromosome de Streptomyces diastatochromogènes 1628 et obtenir la bactérie d'ingénierie avec une stable hérédité.
L'utilité de Streptomyces diastatochromogènes de recombinaison de renforcer l'expression toyB montre que après la fermentation de la bactérie de recombinaison 1628-TOYB, l'activité enzymatique de l'enzyme de synthèse de 6-pyruvoyl-tetahydroptérine de la bactérie de recombinaison s'élève au moins de 1,3 fois et la production de toyocamycine s'élève au moins de 23,4%, par rapport à la souche originale.
Le bon effet de la présente invention :
La présente invention renforce la traduction excessive des gènes toyB de l'enzyme clé de la voie synthétique biologique de toyocamycine dans
- 5 BE2019/5493
Streptomyces diastatochromogènes et l'activité enzymatique de l'enzyme de synthèse de 6-pyruvoyl-tetahydroptérine de la bactérie de recombinaison s'élève au moins de 1,3 fois et la production de toyocamycine s'élève au moins de 23,4%, par rapport à la souche originale. Et ça jette les bases de l'augmentation davantage de la production de toyocamycine et de la réalisation de la production industrielle dans les plus bref délai.
DESSINS ANNEXES :
Dessin 1 est le schéma de la construction du plasmide de recombinaison pIB139- toyB.
Dessin 2 est la démonstration de la coupe enzymique de plasmide de recombinaison pMD18-T-toyB.
1.pMD18-T-toyB/Nde I+Not I ; 2. AND Marqueur DL2000 ;
Dessin 3 est le diagramme de SDS-PAGE des gènes toyB dans E.coli BL21.
1. pET28a-toyB / E.coli BL21 provocation ; 2. Protéine Marqueur ; 3. pET28a-toyB /E.coli BL21 sans provocation.
Dessin 4 est la démonstration d'électrophorèse de la coupe enzymique de plasmide d'expression de navette et de recombinaison pIB139- toyB. ÀAND /Hin dIII Marqueur; 2. pIB139-toyB/Nde I+Not I; 3. toyB gène; 4. DL2000 Marqueur.
Dessin 5 est la démonstration d'électrophorèse PCR de la bactérie de recombinaison 1628-TOYB.
1-3 la souche du génie génétique; 4 la souche d'origine; 5 DL2000 marqueur .
METHODE CONCRETE D’EXECUTION
Nous vous présentons une description plus minutieuse combinant les dessins annexes et des méthodes concrètes d'exécution.
- 6 BE2019/5493
Exemple pratique 1 : l’amplification de gène de but et la construction de Streptomyces diastatochromogènes de recombinaison
Génomes du chromosome de S. diastatochromogènes 1628 comme modèle, PtoyB F Nde I et PtoyB R Not I comme amorce génétique, obtenir les gènes toyB contenant Nde I et Not I, deux sites d’enzyme par l’amplification de la technologie PCR, conjuguer vecteur pMD18-T, construire le vecteur de clonage pMD18-T-toyB (Nde I + Not I) et puis transformer le vecteur pMD18-T-toyB (Nde I + Not I) dans le récepteur Escherichia coli (abrégé E.coli ), enduire les E.coli sur le plateau d’agar LB contenant l’ampicilline résistante, les cultiver une nuit à température de 37 T, choisir aléatoirement des transformants positifs, les identifier par coupe enzymique et puis les apporter dans la Société limitée de génie biologique de Shanghai pour tester la séquence et puis analyser la séquence, utiliser Nde I et Not I deux enzymes à couper transformants positifs, acquérir les gènes toyB contenant Nde I et Not I, deux sites d’enzyme, connecter vecteur d’expression intégré de navette pIB139 de Streptomyces coupé par les deux même enzymes, acquérir vecteur d’expression de navette et de recombinaison pIB139-toyB, après la démonstration de coupe enzymique les transformer dans E.coli ET12567(pUZ8002), sélectionner le transformant positif E.coli ET12567(pUZ8002, pIB139-toyB) sur le plateau LB contenant kanamycine résistante et apramycine résistante, et enfin E.coli ET12567(pUZ8002, pIB139-toyB) comme donateur, S. diastatochromogènes comme récepteur, introduire la particularité du vecteur pIB139-toyB au chromosome de S. diastatochromogènes 1628 par la méthode de sondage et de transfert, sélectionner les transformants positifs sur plateau MS contenant apramycine résistante, et ainsi acquérir Streptomyces. diastatochromogènes de recombinaison 1628-TOYB.
Le chromosome de S. diastatochromogènes 1628 comme modèle, concevoir deux amorces, amplifier toyB avec technologie PCR, et la conception des amorces est comme suivante :
- 7 BE2019/5493 toyB F Nde I : 5' -CGCCATATGTTGTTCAGCATCACCGTC -3'; toyB R Not I : 5' -CGCGCGGCCGCTCACAGCGCACGCTCGTAG -3' La démonstration de coupe enzymique des deux enzymes de restriction Nde I et Not I pour le plasmide de recombinaison pMD18-T-toyB est comme le montre dessin 2. Après la coupe enzymique de deux enzymes du plasmide de recombinaison pMD18-T-toyB, on obtient environ 0,4kb et 2,7kb de fragment ADN. Si les longueurs étaitent respectivement identiques au fragment des gènes toyB et à plasmide pMD18-T, il sera prouvé que la conjugaison de vecteur de clonage recombiné est correcte. Le test de la séquence de plasmide pMD18-T-toyB et l'analyse de séquence indique le fragment d'insertion est la séquence de 399 bp qui code 132 acides aminés avec une masse moléculaire relative d'environ 14 kDa et possède une grande homologie à l'enzyme de synthèse de 6pyruvoyl-tetahydroptérine de nombreux Streptomyces rapporté, la plus grande homologie atteignant 90%. La séquence de l'acide nucléique toyB est comme le montre SEQ ID NO:1. Insérer les gènes toyB au vecteur pET28a, construire le vecteur de recombinaison pET28a-toyB, puis introduire le vecteur de recombinaison dans Escherichia coli BL21, sélectionner les transformants positifs et les mettre dans 10 ml du milieu de culture LB, les cultiver par oscillation à température 37°C une nuit et le lendemain provoquer l'expression à l'aide d'IPTG. Comme le montre dessin 3, la bactérie de recombinaison présente la bande de spécificité évidente après la provocation. L'activité de l'enzyme de synthèse de 6pyruvoyl-tetahydroptérine du test est 39 U/mg protéine totale et ça démontre la traduction des gènes toyB avec réussite dans Escherichia coli.
Le résultat de la démonstration de coupe enzymique du plasmide d'expression de navette et de recombinaison de type ingéré pIB139-toyB est comme le montre dessin 4 : le plasmide de recombinaison pIB139toyB coupé par deux enzymes Nde I et Not I délivre 0,4 kb de fragment avec une longueur identique aux gènes toyaB, ça démontre la réussite
- 8 BE2019/5493 de construction de plasmide pIB139-toyB. Introduire le plasmide pIB139toyB au chromosome de S. diastatochromogènes 1628 par la méthode de sondage et de transfert, choisir au hasard quelques colonies microbiennes uniques sur plateau d'apramycine résistante et les poser dans le milieu de culture CP, les cultiver à plusieurs reprises, extraire le chromosome. Si dans toutes les amplification des chromosomes par l'essai PCR apparaissaient les gènes d'apramycine résistante apr (dessicateur 5), il sera prouvé qu'on a construit avec rréussite le Streptomyces diastatochromogènes de recombinaison 1628-TOYB avec une stable hérédité.
Exemple pratique 2 : la démonstration de performance de fermentation de la souche d'origine et de la souche de recombinaison pour Streptomyces diastatochromogènes
En comparaison avec la souche d'origine, l'activité de l'enzyme de synthèse de 6-pyruvoyl-tetahydroptérine de la souche de recombinaison s'élève de 1,3 fois; on fait les essais de fermentation dans 250 ml de fiole d'oscillation pour la souche de recombinaison 1628-TOYB et la souche d'origine S. diastatochromogenes 1628 afin de démontrer que l'accroissement de l'activité de l'enzyme de synthèse de 6-pyruvoyltetahydroptérine de S. diastatochromogènes suscite l'augmentation de la production de toyocamycine du point de vue de la fermentation. Avec une vitesse de révolution de 200 r/min pour oscillateur alternatif, à température de 28°C. fermenter 96 heures et le groupe contrôle est la souche de départ de Streptomyces diastatochromogènes. Comme tableau 1 le présente: la production finale de toyocamycine de la souche de recombinaison est supérieure à celle de la souche d'origine et atteint 166,55 mg/L, augmentant d'environ 23,4% par rapport à la souche d'origine, avec une bonne répétabilité. De ce fait, il est attesté que renforcer l'expression toyB codant l'enzyme de synthèse de 6-pyruvoyltetahydroptérine, soit l'enzyme clé de la voie de synthèse biologique dans la souche de production de toyocamycine S. diastatochromogenes
- 9 BE2019/5493
1628 favorise l'augmentation de la production de toyocamycine pendant la fermentation.
Tableau 1 est la comparaison de la production finale de toyocamycine entre la souche de recombinaison et la souche d'origine.
Tableau 1
La souche La production de toyocamycine
1628 134,97
1628-TOYB 166,55

Claims (2)

  1. REVENDICATIONS
    1. Les gènes toyB d'un genre Streptomyces diastatochromogènes sont caractérisés par le fait que sa séquence est comme le montre SEQ ID NO:1.
    2. Un genre Streptomyces diastatochromogènes de recombinaison de renforcer l'expression toyB est caractérisé par le fait que Streptomyces diastatochromogènes 1628 dont le numéro souchothèque est CGMCC NO. 2060 est recombiné et puis traduit les gènes toyB codant l'enzyme de synthèse de 6-pyruvoyl-tetahydroptérine, soit l'enzyme clé de la synthèse biologique de toyocamycine et la séquence des gènes toyB est comme le montre SEQ ID NO:1 ainsi que possède la capacité plus puissante de traduire toyocamycine que Streptomyces diastatochromogènes 1628 avec le numéro souchothèque de CGMCC NO. 2060;
    Les gènes toyB codant l'enzyme de synthèse de 6-pyruvoyltetahydroptérine sont introduits dans le chromosome de Streptomyces diastatochromogènes 1628 décrit plus haut.
    3. La méthode de construction d'un genre Streptomyces diastatochromogènes de recombinaison de renforcer l'expression toyB selon la revendication 2 est caractérisée par le fait que le procédé est comme suit :
    1 ) Construire le vecteur de traduction pIB139-toyB;
  2. 2) Profiter de la méthode de soudage et de transfert et insérer le vecteur de traduction ci-dessus dans le chromosome de Streptomyces diastatochromogènes et obtenir la bactérie d'ingénierie. Le vecteur de traduction pIB139-toyB profite du promoteur permE* du vecteur pIB139 pour démarrer la traduction des gènes toyB et la démarche 2) décrite plus haut profite de la méthode
    - 11 BE2019/5493 de sondage et de transfert pour introduire la particularité du vecteur pIB139-toyB au chromosome de Streptomyces diastatochromogènes 1628 et obtenir la bactérie d'ingénierie avec une stable hérédité.
    5 4. L'utilité d'un genre Streptomyces diastatochromogènes de recombinaison de renforcer l'expression toyB selon la revendication 2 est caractérisée par le fait que après la fermentation de Streptomyces diastatochromogènes de recombinaison, l'activité l'enzyme de synthèse de 6-pyruvoyl-tetahydroptérine de la bactérie de recombinaison s'élève 10 au moins de 1,3 fois et la production de toyocamycine s'élève au moins de 23,4% par rapport à la souche originale.
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CN103290043B (zh) * 2013-05-08 2014-09-24 中国计量学院 加强了toyB表达的重组淀粉酶产色链霉菌及构建方法与用途

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