BE1024796B1 - Constructions antigeniques du virus zika - Google Patents

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BE1024796B1 BE2017/5392A BE201705392A BE1024796B1 BE 1024796 B1 BE1024796 B1 BE 1024796B1 BE 2017/5392 A BE2017/5392 A BE 2017/5392A BE 201705392 A BE201705392 A BE 201705392A BE 1024796 B1 BE1024796 B1 BE 1024796B1
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Abstract

Il est fourni ici des composés utiles en tant que composants de compositions immunogènes pour l'induction d'une réponse immunogène chez un sujet contre une infection virale, des procédés pour leur utilisation dans un traitement, et des procédés pour leur fabrication. Les composés comprennent une construction d'acide nucléique comprenant une séquence qui code pour un antigène du virus Zika.

Description

(73) Titulaire(s) :
GLAXOSMITHKLINE BIOLOGICALS SA
1330, RIXENSART
Belgique (72) Inventeur(s) :
SHARMA Mayuri 02139 CAMBRIDGE États-Unis
YU Dong
20850 ROCKVILLE États-Unis (54) CONSTRUCTIONS ANTIGENIQUES DU VIRUS ZIKA (57) Il est fourni ici des composés utiles en tant que composants de compositions immunogènes pour l'induction d'une réponse immunogène chez un sujet contre une infection virale, des procédés pour leur utilisation dans un traitement, et des procédés pour leur fabrication. Les composés comprennent une construction d'acide nucléique comprenant une séquence qui code pour un antigène du virus Zika.
Fr,Îy5«O»Î!Â? t x ••.wv.rx-x
BREVET D'INVENTION BELGE
SPF Economie, PME, Classes Moyennes & Energie
Numéro de publication : 1024796 Numéro de dépôt : BE2017/5392
Office de la Propriété intellectuelle Classification Internationale : A61K 39/12 A61K 39/39 C07K 14/18 C12N 15/86 A61K 39/00 Date de délivrance : 10/07/2018
Le Ministre de l'Economie,
Vu la Convention de Paris du 20 mars 1883 pour la Protection de la propriété industrielle ;
Vu la loi du 28 mars 1984 sur les brevets d'invention, l'article 22, pour les demandes de brevet introduites avant le 22 septembre 2014 ;
Vu le Titre 1er “Brevets d’invention” du Livre XI du Code de droit économique, l'article XI.24, pour les demandes de brevet introduites à partir du 22 septembre 2014 ;
Vu l'arrêté royal du 2 décembre 1986 relatif à la demande, à la délivrance et au maintien en vigueur des brevets d'invention, l'article 28 ;
Vu la demande de brevet d'invention reçue par l'Office de la Propriété intellectuelle en date du 01/06/2017.
Considérant que pour les demandes de brevet tombant dans le champ d'application du Titre 1er, du Livre XI du Code de Droit économique (ci-après CDE), conformément à l'article XI. 19, §4, alinéa 2, du CDE, si la demande de brevet a fait l'objet d'un rapport de recherche mentionnant un défaut d'unité d'invention au sens du §ler de l'article XI.19 précité et dans le cas où le demandeur n'effectue ni une limitation de sa demande ni un dépôt d'une demande divisionnaire conformément aux résultats du rapport de recherche, le brevet délivré sera limité aux revendications pour lesquelles le rapport de recherche a été établi.
Arrête :
Article premier. - Il est délivré à
GLAXOSMITHKLINE BIOLOGICALS SA, Rue de l'Institut 89, 1330 RIXENSART Belgique;
représenté par
PRONOVEM - Office Van Malderen, Avenue Josse Goffin 158, 1082, BRUXELLES;
un brevet d'invention belge d'une durée de 20 ans, sous réserve du paiement des taxes annuelles visées à l’article XI.48, §1 du Code de droit économique, pour : CONSTRUCTIONS ANTIGENIQUES DU VIRUS
ZIKA.
INVENTEUR(S) :
SHARMA Mayuri, 40 Landsdowne Street, 02139, CAMBRIDGE;
YU Dong, 14200 Shady Grove Road, 20850, ROCKVILLE;
PRIORITE(S) :
02/06/2016 US 62344417;
15/09/2016 US 62394769;
13/04/2017 US 62485081;
DIVISION :
divisé de la demande de base : date de dépôt de la demande de base :
Article 2. - Ce brevet est délivré sans examen préalable de la brevetabilité de l'invention, sans garantie du mérite de l'invention ou de l'exactitude de la description de celle-ci et aux risques et périls du (des) demandeur(s).
Bruxelles, le 10/07/2018, Par délégation spéciale :
BE2017/5392
CONSTRUCTIONS ANTIGENIQUES DU VIRUS ZIKA
DOMAINE DE L'INVENTION
Cette invention se situe dans le domaine du traitement et de la prévention d'infections virales. En particulier, la présente invention concerne des constructions vaccinales à base d'acides nucléiques codant pour des antigènes du virus Zika et l'utilisation des antigènes du virus Zika pour le traitement et la prévention des infections dues au virus Zika.
ARRIERE PLAN TECHNOLOGIQUE DE L'INVENTION
Le virus Zika a été identifié pour la première fois en Ouganda en 1947 chez des singes Rhésus au travers d'un réseau de surveillance de la fièvre jaune selvatique Il a été ensuite identifié chez des êtres humains en 1952 en Ouganda et en République unie de Tanzanie. Des épidémies de la maladie due au virus Zika ont été enregistrées en Afrique, dans les Amériques, en Asie et dans le Pacifique. Le virus Zika appartient au genre flavivirus. Son réservoir est inconnu.
Le virus Zika est un virus à ARN brin positif appartenant à la famille des Flaviviridés. La maladie
BE2017/5392 due au virus Zika est provoquée par un virus transmis principalement par les moustiques Aedes. Les personnes souffrant de la maladie due au virus Zika peuvent présenter des symptômes qui peuvent inclure une fièvre légère, une éruption cutanée, une conjonctivite, des douleurs musculaires et articulaires, une sensation de malaise ou une céphalée. Ces symptômes durent normalement pendant 2 à 7 jours.
Le virus Zika est connu pour circuler en Afrique, dans les Amériques, en Asie et dans le Pacifique. Transmis par les moustiques Aedes, le virus a été connu pour provoquer soit une infection asymptomatique (chez la majorité des personnes infectées) soit une maladie spontanément résolutive avec décroissance de l'éruption, de la conjonctivite et de la fièvre légère. Toutefois, durant l'épidémie actuelle due au virus Zika dans les Amériques, il a été rapporté une augmentation alarmante du nombre de bébés nés avec une microcéphalie, ainsi qu'une augmentation de l'incidence du syndrome de Guillain-Barré. En plus de la microcéphalie, d'autres malformations fœtales et des troubles neurologiques ont été décrits.
Dowd et al. (Science, Vol. 354 Issue 6309, pp. 23740 (2016) ont rapporté récemment que des vaccins à ADN exprimant les protéines prémembranaire et de l'enveloppe du virus Zika étaient immunogènes chez les souris et des primates non humains lorsqu'ils étaient administrés par électroporation ou injection sans aiguille ; et cette protection contre la virémie après une épreuve avec le virus Zika a corrélé avec l'activité neutralisante du sérum.
BE2017/5392
Chahal et al. (Scientific Reports, 7: 252, pp. 1-9 (2017)) décrivent un vecteur d'ARN d'alphavirus codant pour des antigènes structuraux du virus Zika. Lorsqu'il a été formulé avec un matériau de dendrimères modifiés et administré à des souris par voie intramusculaire, il a été trouvé que le vaccin est immunogène.
Richner et al. (Cell, 168, pp. 1-12, (2017)) décrivent un vaccin à ARNm modifié codant pour des protéines structurales de type sauvage ou mutantes du virus Zika. Lorsqu'il a été encapsulé dans des nanoparticules lipidiques et intramusculaire à des souris, le vaccin déclenché des titres élevés en anticorps neutralisants et une protection contre une épreuve virale.
Étant donné la charge préoccupante de la maladie et le potentiel de dissémination rapide, il existe un besoin urgent de développement de composants pour une utilisation dans une composition immunogène ou vaccinale contre le virus Zika.
administré par voie à ARNm a
RESUME DE L'INVENTION
Les présents inventeurs fournissent des constructions utiles en tant que composants de compositions immunogènes pour l'induction d'une réponse immunitaire chez un sujet contre une infection par le virus Zika, des procédés pour leur utilisation dans le traitement, et des procédés pour leur fabrication.
Dans certains modes de réalisation, il est fourni une construction vaccinale à base d'acide nucléique codant pour un polypeptide comprenant un antigène préBE2017/5392
M-E (prME) pleine longueur du virus Zika, ou l'un de ses fragments immunogènes.
Dans certains modes de réalisation, il est fourni un vecteur comprenant la construction telle que décrite.
Dans certains modes de réalisation, il est fourni une molécule d'ARN s'auto-répliquant (également appelée ici molécule d'ARNm s'auto-amplifrant, ou SAM) comprenant la construction telle que décrite.
Dans certains modes de réalisation, il est fourni une composition comprenant une quantité immunologiquement efficace d'un(e) ou de plusieurs des constructions, vecteurs, ou molécules d'ARN s'autorépliquant tels que décrits ci-dessus.
Dans certains modes de réalisation, il est fourni une composition telle que décrite ci-dessus dans laquelle la composition comprend un vaccin à base d'ARN.
Dans certains modes de réalisation, il est fourni une composition telle que décrite ci-dessus dans laquelle la composition comprend un(e) ou plusieurs constructions, vecteurs, ou molécules d'ARN s'autorépliquant tels que décrits ci-dessus complexés avec une particule d'une émulsion cationique huile dans l'eau.
Dans certains modes de réalisation, il est fourni une composition telle que décrite ci-dessus pour une utilisation dans l'induction d'une réponse immunitaire contre une infection par le virus Zika chez un sujet en ayant besoin.
Dans certains modes de réalisation, il est fourni une construction, un vecteur, et/ou une molécule d'ARN s ' auto-répliquant tel que décrit ici pour une utilisation en thérapie ou médecine. Dans certains modes
BE2017/5392 de réalisation, les compositions divulguées ici sont destinées à une utilisation en thérapie ou médecine. Dans un mode de réalisation préféré, la thérapie est une thérapie vaccinale. De préférence, la thérapie est un vaccin pour prévenir une infection par le virus Zika.
Dans certains modes de réalisation, il est fourni une construction, un vecteur, et/ou une molécule d'ARN s ' auto-répliquant tel que décrit ici pour une utilisation dans la prévention ou le traitement d'une infection par le virus Zika chez un sujet en ayant besoin. Dans certains modes réalisation, de d ' une des les compositions divulguées ici sont destinées à une utilisation dans la prévention ou le traitement d'une infection par le virus Zika chez un sujet en ayant besoin.
Dans certains modes de réalisation, il est fourni un procédé pour l'induction d'une réponse immunitaire contre une infection par le virus Zika chez un sujet en ayant besoin, qui comprend l'administration au dit sujet d'une quantité immunologiquement efficace composition comprenant un(e) ou plusieurs constructions, vecteurs, ou molécules d'ARN s'autorépliquant tels que décrits ci-dessus.
Dans certains modes de réalisation, il est fourni un procédé pour l'induction d'une réponse immunitaire suffisante pour prévenir ou traiter une infection par le virus Zika chez un sujet, qui comprend l'administration au dit sujet d'une composition comprenant un(e) ou plusieurs des constructions, vecteurs, ou molécule d'ARN s'auto-répliquant tels que décrits ci-dessus dans une quantité suffisante pour prévenir ou traiter une infection par le virus Zika.
BE2017/5392
Dans certains modes de réalisation, il est fourni un procédé tel que décrit ci-dessus dans lequel la composition comprend un(e) ou plusieurs constructions, vecteurs, ou molécules d'ARN s'auto-répliquant tels que décrits ci-dessus complexés avec une particule d'une émulsion cationique huile dans l'eau.
Dans certains modes de réalisation, il est fourni un procédé pour la production d'un vaccin à base d'ARN comprenant une étape de transcription d'un vecteur ou d'une molécule d'ADN codant pour une molécule d'ARN s'auto-répliquant telle que décrite ci-dessus pour produire un ARN comprenant une région codante pour 1'antigène.
Dans certains modes de réalisation, il est fourni un procédé de préparation d'une composition telle que décrite ci-dessus dans lequel le procédé comprend 1) la préparation d'une émulsion cationique huile dans l'eau ; 2) la préparation d'un(e) ou de plusieurs constructions, vecteurs, ou molécules d'ARN s'auto-répliquant tels que décrits ci-dessus ; et 3) l'addition des un(e) ou plusieurs constructions, vecteurs, ou molécules d'ARN s'auto-répliquant à l'émulsion cationique huile dans l'eau de telle façon que la construction, le vecteur, ou la molécule d'ARN s'auto-répliquant se complexe avec 1'émulsion.
Dans certains modes de réalisation, il est fourni une composition produite par le procédé décrit ci-dessus.
Dans certains modes de réalisation, il est fourni une utilisation de la construction, du vecteur, de la molécule d'ARN s'auto-répliquant, ou de la composition décrit ci-dessus pour l'induction d'une réponse
BE2017/5392 immunitaire contre une infection par le virus Zika chez un sujet.
Dans certains modes de réalisation, il est fourni une utilisation de la construction, du vecteur, de la molécule d'ARN s'auto-répliquant, ou de la composition décrits ci-dessus dans la fabrication d'un médicament qui induit une réponse immunitaire contre une infection par le virus Zika chez un sujet.
DESCRIPTION DES FIGURES
Figure 1 - Organisation du génome de Flavivirus, montrant que la polyprotéine est clivée en protéines structurales et non structurales par une combinaison de protéases virales et cellulaires.
Figure 2 - Formation des virions et des particules sous-virales de Flavivirus. (1) Dans les infections naturelles, les protéines de flavivirus sont produites par le traitement d'une polyprotéine traduite à partir de l'ARN génomique viral et insérées de façon cotraductionnelle dans la membrane du réticulum endoplasmique (RE) . Les flèches horizontales indiquent les clivages de la polyprotéine par le signal peptidase et les pointes de flèches indiquent le clivage par la protéase virale NS2B-3. La flèche vide indique un clivage par la signalase qui est inefficace à moins que le clivage de la capside cytoplasmique (C) se soit produit. (2) L'exigence minimale pour la production de particules sous-virales consiste en les protéines précurseurs de la membrane (prM) et de l'enveloppe (E). (3) Les particules de flavivirus sont formées par bourgeonnement sur la membrane du RE dirigé par les protéines prM et E
BE2017/5392 indépendantes de la protéine C ou des nucléocapsides préformées. L'infection virale se traduit principalement par la formation de virions. (4) Les particules pseudovirales dépourvues de nucléocapsides sont produites de façon efficace par expression recombinante des protéines prM et E et sont un sous-produit d'une infection par un flavivirus. (5) Les virions et les particules pseudovirales suivent la voie exocytaire pour la sécrétion à partir des cellules infectées/transfectées. « Cy » indique le côté cytoplasmique de la membrane du RE.
Figures 3A à D - Alignement de séquences multiples CLUSTAL 0(1.2.1) des protéines CprME du virus Zika. Voir les séquences ici et SEQ ID NO : 2 et SEQ ID NO : 15 à 23.
Tableau 1
Souche du virus Zika, année, et référence Genbank
SOUCHE ANNEE NUMERO GENBANK
Ouganda NC 012532
Micronésie 2007 EU545988.1
Natal (Brésil) 2016 KU527068
Salvador (Brésil) 2016 KU707826.1
Sao Paulo (Brésil) 2016 KU321639
Polynésie française 2013 KJ776791
Figures 4A à C - Alignement de séquences multiples CLUSTAL 0(1.2.1) des protéines CprME issues des souches brésiliennes du virus Zika : Natal (SEQ ID NO : 2) ;
Salvador (SEQ ID NO : 15) ; No. d'accession Genbank
KU365777 (SEQ ID NO : 20) ; No. d'accession Genbank
KU365778 (SEQ ID NO : 21) ; No. d'accession Genbank
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KU365779 (SEQ ID NO : 22) ; No. d'accession Genbank KU365780 (SEQ ID NO : 23) ; et Sao Paulo (« Sao ») (SEQ ID NO : 16). Voir le tableau 1 pour les souches du virus Zika, l'année, et la référence Genbank.
Figure 5 - Construction SAM-Zika. Le contexte de l'ARNm s'auto-amplifrant (SAM) est constitué du réplicon du VEE TC-83 codant pour les protéines non structurales virales 1 à 4 (nsPl à 4), suivies du promoteur sousgénomique, et de soit la prME du Zika soit la CprME du Zika. Le vecteur vide est représenté par SEQ ID NO : 24 ; 1'insert démarre immédiatement après le nucléotide 7561.
Figure 6 - Conception d'une construction Zika-SAM codant pour les protéines virales prME. Le schéma montre la région de la séquence signal de la prM du gène de la prM, qui contient des résidus basiques dans la région NH2-terminale (région n), un noyau hydrophobe ininterrompu par des résidus chargés ou polaires (région h), et un motif des acides aminés -3, -1 dans la région de clivage COOH-terminale (région c) approprié pour la reconnaissance de la signalase. La première construction est une prME qui a été optimisée pour les codons pour une expression dans des cellules de mammifères. Une caractéristique inhabituelle du peptide signal de la prM des flavivirus est le manque de résidu
polaire dans la région c. Auparavant, il a été montré
que le remplacement de Gly, Phe et Ala au niveau des
positions -5, -4 et -2 par Pro, Gin et Gin,
respectivement (mutation PQAQA), augmente
considérablement l'étendue du clivage par la signalase de la prM in vitro sans l'exigence d'un clivage antérieur de C. Stocks, et al. 1998. Signal peptidase cleavage at
BE2017/5392 the flavivirus C-prM junction: dependence on the viral NS2B-3 protease for efficient processing requires determinants in C, the signal peptide, and prM. J. Virol. 72: 2141-2149.
La deuxième construction - ESS.l, comporte la mutation PQAQA. La troisième construction - ESS.2, a la séquence signal native de la prM remplacée par le peptide signal de 1'IgG, qui a été utilisé auparavant pour l'expression et la sécrétion des protéines IgG et Fab à partir de cellules de mammifères. Ciferri et al. (2015) Antigenic Characterization of the HCMV gH/gL/gO and Pentamer Cell Entry Complexes Reveals Binding Sites for Potently Neutralizing Human Antibodies, PLoS Pathog. Oct 20; 11 (10) : el005230.
Figure 7 - Conception de construction Zika-SAM codant pour les protéines virales de la capside et prME. La protéine de la capside (C) du virus Zika est incorporée dans des constructions pour tester si la présence d'une protéine de la capside clivable augmente l'efficacité de la production des PSV. CprME.1 est une séquence d'acide nucléique optimisée pour les codons codant pour les protéines natives de la capside, prM et E du virus Zika, avec les sites de clivage natifs pour la NS2B-3 et la signalase. CprME.2 est identique à CprME.1, mais contient la mutation -PQ-Q dans la région du peptide signal de C. Finalement, CprME.3 est identique à CprME.1, sauf qu'une séquence P2A est insérée au niveau du site de clivage pour la NS2B-3.
Figure 8 - Analyse de l'expression et de la sécrétion de la protéine E à partir de constructions Zika-SAM. L'expression de la protéine E a été détectée
BE2017/5392 par immunoblot dans des lysats cellulaires pour toutes les constructions Zika-SAM testées (voir le tableau 2 : prME de type sauvage (« WT » ; construction No. 1), prME optimisée pour les codons (« CO », construction No. 2), séquence signal -PQ-Q amplifiée (« ESS.l », construction No. 3), séquence signal de 1 ' IgG (« ESS.2 », construction No. 4), et les trois constructions de la capside : CprME.1 (construction No. 5), CprME.2 (construction No. 6) et CprME.3 (construction No. 7). En tant que témoin positif, une construction SAM qui exprime la protéine E d'un autre flavivirus, le virus de la fièvre jaune, a été incluse (« SAM-YFV »). Les témoins négatifs comprenaient une construction SAM-virus respiratoire syncytial (« SAM-RSV ») et une pseudotransfection (« Pseudo »).
La sécrétion de la protéine E dans les surnageants cellulaires a été également détectée par immunoblot pour au moins la construction No. 1 (« WT »), la construction No. 2 (« CO ») , la construction No. 4 (ESS.2), et la construction No. 7 (CprME.3).
Figure 9 - Les immunoblots des surnageants de culture cellulaire de type sauvage (« WT ») et optimisée pour les codons (« CO ») après concentration avec un seuil de coupure de 100 kDa montrent que la protéine E du virus Zika est présente dans une masse moléculaire élevée qui est retenue dans la colonne mais pas dans la fraction non retenue. Ce résultat suggère que la protéine E sécrétée forme des complexes d'un ordre supérieur aux monomères ou aux dimères, ce qui est cohérent avec l'hypothèse des PSV.
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Figure 10 - Réponses en anticorps neutralisants. Il a été découvert que les souris ont des anticorps neutralisants significatifs contre le virus Zika deux semaines après une seule vaccination avec les constructions Zika-SAM No. 1 ou No. 2 (CO.prM-E et WT.prM-E, respectivement), ou avec la construction d'ADN de virus Zika témoin positif No. 5283, comme il est mesuré par l'analyse de la neutralisation des particules virales rapporteurs (PVR). Les titres en anticorps neutralisants ont encore augmenté deux semaines après une seconde vaccination avec la même construction ZikaSAM ou le témoin positif. Un effet dose-réponse a été observé pour les constructions de SAM No. 1 et No. 2, avec 15 pg d'ARN déclenchant plus d'anticorps neutralisants que 1,5 pg d'ARN.
Figure 11 - Protection contre une épreuve avec le virus Zika. Des souris vaccinées aux jours 0 et 21 ont été soumises à une épreuve avec le virus Zika vivant au jour 49. La charge virale a été mesurée 3 jours après l'épreuve. Les vaccinations avec les constructions de SAM No. 1 et No. 2 (à des doses de 1,5 pg et 15 pg) , ainsi que le témoin positif (ADN de virus Zika No. 5283) ont été protectrices contre la virémie du virus Zika, comparativement à des souris non vaccinées. La ligne en pointillés indique la limite de quantification (LOQ) de 1'analyse.
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DESCRIPTION DETAILLEE DE L'INVENTION
Antigènes ; variants ; fragments ; et constructions
Les présents inventeurs fournissent des constructions utiles en tant que composants de compositions immunogènes pour l'induction d'une réponse immunitaire chez un sujet contre une infection par le virus Zika, des constructions utiles pour l'expression d'antigènes, des procédés pour leur utilisation dans un traitement, et des procédés pour leur fabrication. Par « construction », il est signifié un acide nucléique qui code pour des séquences polypeptidiques décrites ici, et peut comprendre de l'ADN, de l'ARN, ou des monomères d'acide nucléique n'existant pas à l'état naturel. Les composants d'acide nucléique des constructions sont décrits plus pleinement dans la section Acides nucléiques ici.
Dans certains modes de réalisation, les constructions divulguées ici codent pour des séquences polypeptidiques de type sauvage d'un virus Zika, ou l'un de leurs variants, ou fragments. Les constructions peuvent coder en outre pour une séquence polypeptidique hétérologue aux séquences polypeptidiques d'un virus Zika. Dans certains modes de réalisation, les constructions codent pour des séquences polypeptidiques de type sauvage d'un virus Zika de souche brésilienne, ou l'un de leurs variants, ou fragments. Par « virus Zika de souche brésilienne », il est signifié toute souche de virus Zika indiquée comme « brésilienne » dans le tableau 1. Sauf indication contraire, les descriptions de l'antigène prME de type sauvage sont faites en référence à la souche de Natal (Brésil), numéro
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GenBank KU527068.1, telle que représentée par SEQ ID NO : 1 (acide nucléique) et SEQ ID NO : 2 (polypeptide), et telle qu'illustrée sur les figures 3A à D, et les figures 4A à C.
Un « variant » d'une séquence polypeptidique comprend des séquences d'acides aminés comportant une ou plusieurs substitutions, insertions et/ou délétions d'acides aminés comparativement à la séquence de référence. Le variant peut comprendre une séquence d'acides aminés qui est identique à au moins 70 %, au moins 75 %, au moins 80 %, au moins 85 %, au moins 90 %, au moins 95 %, au moins 96 %, au moins 97 %, au moins 98 %, ou au moins 99 % à un polypeptide de type sauvage pleine longueur, par exemple, à un polypeptide selon SEQ ID NO : 2. En variante, ou en outre, un fragment d'un polypeptide peut comprendre un fragment immunogène (c'est-à-dire, un fragment contenant un épitope) du polypeptide pleine longueur qui peut comprendre une séquence d'acides aminés contigus d'au moins 8, d'au moins 9, d'au moins 10, d'au moins 11, d'au moins 12, au moins 13, d'au moins 14, d'au moins 15, d'au moins 16, d'au moins 17, d'au moins 18, d'au moins 19 acides aminés ou plus qui est identique à une séquence d'acides aminés contigus du polypeptide pleine longueur.
Un fragment d'un polypeptide peut comprendre des délétions N- et/ou C-terminales comparativement à un polypeptide pleine longueur, par exemple SEQ ID NO : 2, dans lequel le fragment comprend une délétion de jusqu'à 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15 ou 20 acides aminés à partir de l'extrémité N-terminale, de l'extrémité Cterminale, ou à la fois de l'extrémité N-terminale et de
BE2017/5392 l'extrémité C-terminale de la séquence pleine longueur. Il peut être spécifié que les délétions sont d'acides aminés consécutifs.
Tel qu'utilisé ici, le terme « antigène » se rapporte à une molécule contenant un ou plusieurs épitopes (par exemple, linéaires, conformationnels ou les deux) qui stimuleront le système immunitaire d'un hôte pour fabriquer une réponse immunologique spécifique de l'antigène humorale et/ou cellulaire (c'est-à-dire, une réponse immunitaire qui reconnaît spécifiquement un polypeptide antigénique). Un « épitope » est cette partie d'un antigène qui détermine sa spécificité immunologique.
Les épitopes des lymphocytes T et B peuvent être identifiés de façon empirique (par exemple, en utilisant PEPSCAN ou des procédés similaires). Voir les références suivantes : Geysen et al. (1984) PNAS USA 81: 3998-4002 ; Carter (1994) Methods Mol Biol 36: 207-23. Ils peuvent être prédits (par exemple, en utilisant l'indice antigénique de Jameson-Wolf (voir Jameson et al. (1988) CABIOS 4(1): 181-186), des approches à base de matrices (voir Raddrizzani & Hammer (2000) Brief Bioinform 1(2): 179-89), TEPITOPE (voir De Lalla et al. (1999) J. Immunol. 163: 172529), des réseaux neuraux (voir Brusic et al.
(1998) Bioinformatics 14(2): 121-30), OptiMer et EpiMer (voir Meister et al. (1995) Vaccine 13(6): 581-91 ; voir Roberts et al. (1996) AIDS Res Hum Retroviruses 12(7): 593-610), ADEPT (voir Maksyutov & Zagrebelnaya (1993) Comput Appl Biosci 9(3): 291-7), Tsites (voir Feller & de la Cruz (1991) Nature 349(6311): 720-1),
1'hydrophilicité (voir Hopp (1993) Peptide Research 6:
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183-190), l'indice antigénique (voir Welling et al. (1985) FEBS Lett. 188: 215-218) ou les procédés divulgués dans la référence Davenport et al. (1995) Immunogenetics 42: 392-297, etc.).
Dans certains modes de réalisation, les constructions ici codent pour un antigène prME du virus Zika. Par « antigène prME du virus Zika », il est signifié la séquence d'acides aminés, ou une séquence nucléotidique codant pour la séquence d'acides aminés, d'une protéine structurale prME de type sauvage du virus Zika, de l'un de ses variants, ou fragments. La figure 3 et la figure 4 identifient la séquence d'acides aminés de plusieurs variants de la protéine structurale prME de type sauvage du virus Zika. Les numéros d'identification des séquences pour chacune sont présentés dans la section Séquences et la Liste des séquences ici. Voir SEQ ID NO : 2 et 15 à 23.
Ainsi, lorsqu'un antigène prME du virus Zika est un variant d'un polypeptide prME de type sauvage, le variant peut comprendre une séquence d'acides aminés qui est identique à au moins 70 %, au moins 75 %, au moins 80 %, au moins 85 %, au moins 90 %, au moins 95 %, au moins 96 %, au moins 97 %, au moins 98 %, ou au moins 99 % à un polypeptide de type sauvage pleine longueur, par exemple, à un polypeptide selon SEQ ID NO : 2 et 15 à 23. En variante, ou en outre, un fragment d'un polypeptide peut comprendre un fragment immunogène (c'est-à-dire, un fragment contenant un épitope) du polypeptide pleine longueur qui peut comprendre une séquence d'acides aminés contigus d'au moins 8, d'au moins 9, d'au moins 10, d'au moins 11, d'au moins 12,
BE2017/5392 d'au moins 13, d'au moins 14, d'au moins 15, d'au moins 16, d'au moins 17, d'au moins 18, d'au moins 19 acides aminés ou plus qui est identique à une séquence d'acides aminés contigus du polypeptide pleine longueur.
Un fragment d'un polypeptide prME du virus Zika peut comprendre des délétions N- et/ou C-terminales comparativement à un polypeptide pleine longueur, par exemple SEQ ID NO : 2 et 15 à 23, dans lequel le fragment comprend une délétion de jusqu'à 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15 ou 20 acides aminés à partir de l'extrémité Nterminale, de l'extrémité C-terminale, ou à la fois de l'extrémité N-terminale et de l'extrémité C-terminale de la séquence pleine longueur. Il peut être spécifié que les délétions sont d'acides aminés consécutifs. Dans certains modes de réalisation, le polypeptide prME du virus Zika comprend un fragment choisi dans le groupe constitué des acides aminés 1 à 692 de SEQ ID NO : 2 et des acides aminés 21 à 692 de SEQ ID NO : 2.
Dans certains modes de réalisation, un fragment immunogène d'un antigène prME comprend la pleine longueur de l'antigène M du virus Zika. Par « antigène M du virus Zika », il est signifié la séquence d'acides aminés, ou une séquence nucléotidique codant pour la séquence d'acides aminés, de SEQ ID NO : 28. Lorsqu'un antigène M du virus Zika est un variant d'un polypeptide M de type sauvage, le variant peut comprendre une séquence d'acides aminés qui est identique à au moins 70 %, au moins 75 %, au moins 80 %, au moins 85 %, au moins 90 %, au moins 95 %, au moins 96 %, au moins 97 %, au moins 98 %, ou au moins 99 % à un polypeptide de type
BE2017/5392 sauvage pleine longueur, par exemple, à un polypeptide selon SEQ ID NO : 28.
Un fragment d'un antigène M du virus Zika peut comprendre des délétions N- et/ou C-terminales comparativement à un polypeptide pleine longueur, par exemple SEQ ID NO : 28, dans lequel le fragment comprend une délétion de jusqu'à 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15 ou 20 acides aminés à partir de l'extrémité Nterminale, de l'extrémité C-terminale, ou à la fois de l'extrémité N-terminale et de l'extrémité C-terminale de la séquence pleine longueur. Il peut être spécifié que les délétions sont d'acides aminés consécutifs.
Dans certains modes de réalisation, un fragment immunogène d'un antigène prME comprend la pleine longueur de l'antigène E du virus Zika. Par « antigène E du virus Zika », il est signifié la séquence d'acides aminés, ou une séquence nucléotidique codant pour la séquence d'acides aminés, de SEQ ID NO : 29. Lorsqu'un antigène E du virus Zika est un variant d'un polypeptide E de type sauvage, le variant peut comprendre une séquence d'acides aminés qui est identique à au moins 70 %, au moins 75 %, au moins 80 %, au moins 85 %, au moins 90 %, au moins 95 %, au moins 96 %, au moins 97 %, au moins 98 %, ou au moins 99 % à un polypeptide de type sauvage pleine longueur, par exemple, à un polypeptide selon SEQ ID NO : 29.
Un fragment d'un antigène E du virus Zika peut comprendre des délétions N- et/ou C-terminales comparativement à un polypeptide pleine longueur, par exemple SEQ ID NO : 29, dans lequel le fragment comprend une délétion de jusqu'à 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10,
BE2017/5392 ou 20 acides aminés à partir de l'extrémité Nterminale, de l'extrémité C-terminale, ou à la fois de l'extrémité N-terminale et de l'extrémité C-terminale de la séquence pleine longueur. Dans un mode de réalisation, un antigène E du virus Zika comprend les acides aminés 1 à 520 de SEQ ID NO : 29. Il peut être spécifié que les délétions sont d'acides aminés consécutifs.
Comme il est noté ailleurs dans ce document, l'ARN du virus Zika est traduit sous la forme d'une polyprotéine comprenant une séquence signal de la prM. La séquence signal de la prM est localisée en position N-terminale par rapport à la séquence de l'antigène prM. Le clivage se déroule dans la lumière du RE par un signal peptidase cellulaire et produit l'extrémité N-terminale de la prM. Lorsque la polyprotéine comprend une séquence d'acides aminés de type sauvage, la polyprotéine comprend une séquence signal native de la prM, SEQ ID NO : 5. Par « séquence signal native de la prM », il est signifié la séquence d'acides aminés, ou une séquence nucléotidique codant pour la séquence d'acides aminés, d'une séquence signal d'une prME virale de type sauvage, SEQ ID NO : 5. Les figures 3A et B et la figure 4A identifient la séquence d'acides aminés de plusieurs variants de la séquence signal native de la prM pleine longueur provenant de diverses souches de virus Zika.
Dans certains modes de réalisation, les constructions codent pour une séquence signal native de la prM. Lorsque la séquence signal de la prM est un variant d'une séquence signal native de la prM, le variant peut comprendre une séquence d'acides aminés qui
BE2017/5392 est identique à au moins 70 %, au moins 75 %, au moins 80 %, au moins 85 %, au moins 90 %, au moins 95 %, au moins 96 %, au moins 97 %, au moins 98 %, ou au moins 99 % au polypeptide pleine longueur selon SEQ ID NO : 5. En variante, ou en outre, un fragment d'un polypeptide peut comprendre un fragment fonctionnel (c'est-à-dire, contenant la séquence reconnue et clivée par la protéase) du polypeptide pleine longueur qui peut comprendre une séquence d'acides aminés contigus d'au moins 9, d'au moins 10, d'au moins 11, d'au moins 12, d'au moins 13, d'au moins 14, d'au moins 15, d'au moins 16, d'au moins 17 acides aminés de SEQ ID NO : 5 qui est identique à une séquence d'acides aminés contigus de polypeptide pleine longueur.
Dans certains modes de réalisation, la construction code pour une séquence signal mutée de la prM pour un clivage amplifié de la prM. Par « séquence signal mutée de la prM pour un clivage amplifié de la prM », il est signifié une séquence signal de la prM dans laquelle la séquence d'acides aminés native est modifiée de telle façon que des résidus sont ajoutés, remplacés ou délétés pour augmenter l'étendue du clivage par la signalase. Dans un mode de réalisation, la séquence d'acides aminés de la séquence signal native de la prM est modifiée par le remplacement de Gly, Phe, et Ala au niveau des positions -5, -4, et -2 à partir du site de clivage par la signalase par Pro, Gin, et Gin, respectivement. Voir la figure 6. Le site de clivage par la signalase est localisé à la jonction de la séquence signal de la prM et de l'antigène prME. Ceci est illustré sur la figure 3A et la figure 4A pour plusieurs souches de virus Zika.
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Dans certains modes de réalisation, la séquence signal mutée de la prM pour un clivage amplifié de la prM a la séquence d'acides aminés représentée sur la figure 6 (ESS.l) (SEQ ID NO : 8) ou peut être l'un de ses variants ou fragments. Un variant peut comprendre une séquence d'acides aminés qui est identique à au moins 70 %, au moins 75 %, au moins 80 %, au moins 85 %, au moins 90 %, au moins 95 %, au moins 96 %, au moins 97 %, au moins 98 %, ou au moins 99 % à un polypeptide de type sauvage pleine longueur, par exemple, à un polypeptide selon SEQ ID NO : 8. En variante, ou en addition, un fragment d'un polypeptide peut comprendre un fragment fonctionnel (c'est-à-dire, contenant la séquence reconnue et clivée par la protéase) du polypeptide pleine longueur qui peut comprendre une séquence d'acides aminés contigus d'au moins 9, d'au moins 10, d'au moins 11, d'au moins 12, d'au moins 13, d'au moins 14, d'au moins 15, d'au moins 16, d'au moins 17 acides aminés, qui est identique à une séquence d'acides aminés contigus du polypeptide pleine longueur.
Dans certains modes de réalisation, la construction code pour une séquence signal hétérologue non-Zika. Dans certains modes de réalisation, la construction code pour une séquence signal d'IgG, l'un de ses variants ou fragments, à la place de la séquence signal de la prM du virus Zika. Par « séquence signal d'IgG », il est signifié la séquence d'acides aminés telle que représentée sur la figure 6 (ESS.2) (SEQ ID NO : 10) . Un variant peut comprendre une séquence d'acides aminés qui est identique à au moins 70 %, au moins 75 %, au moins 80 %, au moins 85 %, au moins 90 %, au moins 95 %, au
BE2017/5392 moins 96 %, au moins 97 %, au moins 98 %, ou au moins 99 % à un polypeptide de type sauvage pleine longueur, par exemple, à un polypeptide selon SEQ ID NO : 10. En variante, ou en outre, un fragment d'un polypeptide peut comprendre un fragment fonctionnel (c'est-à-dire, contenant la séquence reconnue et clivée par la protéase) du polypeptide pleine longueur qui peut comprendre une séquence d'acides aminés contigus d'au moins 9, d'au moins 10, d'au moins 11, d'au moins 12, d'au moins 13, d'au moins 14, d'au moins 15, d'au moins 16, d'au moins 17 acides aminés, qui est identique à une séquence d'acides aminés contigus du polypeptide pleine longueur.
Dans certains modes de réalisation, la construction code pour un polypeptide comprenant une protéine de la capside clivable. Par « séquence de la capside », il est signifié l'une quelconque des séquences d'acides aminés désignées par « capside (C) » telles que représentées sur la figure 3 (par exemple, les acides aminés 1 à 104 de SEQ ID NO : 12) . Une séquence de la capside peut comprendre en outre les sites de clivage des protéines natives C et prM (correspondant aux sites de clivage par la NS2B-3 et la signalase illustrés sur la figure 7) . Lorsque la séquence de la capside est un variant d'une séquence de la capside de type sauvage, le variant peut comprendre une séquence d'acides aminés qui est identique à au moins 70 %, au moins 75 %, au moins 80 %, au moins 85 %, au moins 90 %, au moins 95 %, au moins 96 %, au moins 97 %, au moins 98 %, ou au moins 99 % à un polypeptide de la capside de type sauvage pleine longueur, par exemple, aux acides aminés 1 à 104 de SEQ ID NO : 12. En variante, ou en outre, un fragment
BE2017/5392 d'un polypeptide peut comprendre un fragment fonctionnel (c'est-à-dire, contenant la séquence reconnue et clivée par la protéase) du polypeptide pleine longueur qui peut comprendre une séquence d'acides aminés contigus d'au moins 8, d'au moins 9, d'au moins 10, d'au moins 11, d'au moins 12, d'au moins 13, d'au moins 14, d'au moins 15, d'au moins 16, d'au moins 17, d'au moins 18, d'au moins 19, d'au moins 25, d'au moins 50 et d'au moins 75 acides aminés, qui est identique à une séquence d'acides aminés contigus du polypeptide de la capside pleine longueur.
Un fragment d'une protéine de la capside du virus Zika peut comprendre des délétions N- et/ou C-terminales comparativement à un polypeptide pleine longueur, par exemple les acides aminés 1 à 104 de SEQ ID NO : 12, dans lequel le fragment comprend une délétion de jusqu'à 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15 ou 20 acides aminés à partir de l'extrémité N-terminale, de l'extrémité Cterminale, ou à la fois de l'extrémité N-terminale et de l'extrémité C-terminale de la séquence pleine longueur.
Dans certains modes de réalisation, la construction code pour un polypeptide comprenant une séquence de clivage de la protéine 2A du teschovirus-1 porcin. Par « séquence de clivage de la protéine 2A du teschovirus1 porcin », il est signifié la séquence d'acides aminés telle que représentée sur la figure 7 (séquence P2A) (SEQ ID NO : 14).
Dans certains modes de réalisation, la construction code pour un polypeptide comprenant de la partie Cterminale à la partie N-terminale : un antigène prME, l'un de ses variants ou fragments immunogènes ; un ou
BE2017/5392 plusieurs composants choisis dans le groupe constitué d'une séquence signal de la prM, l'un de leurs variants ou fragments ; une séquence signal mutée de la prM pour un clivage amplifié de la prM, l'un de ses variants ou fragments ; une séquence signal d'IgG, l'un de ses variants ou fragments ; un variant de la séquence de clivage de la protéine 2A du teschovirus-1 porcin, l'un de ses variants ou fragments ; et une séquence de la capside, l'un de ses variants ou fragments.
Dans certains modes de réalisation, une construction code pour chaque composant du polypeptide, si présent, juxtaposé immédiatement à côté du composant adjacent, c'est-à-dire, sans aucun acide aminé intervenant. Dans certains modes de réalisation, un groupe lieur de 1, 2, 3, 4, ou 5 acides aminés est présent entre un ou plusieurs des composants.
Dans certains modes de réalisation, la construction code pour un polypeptide ayant une séquence choisie dans le groupe constitué de SEQ ID NO : 26, SEQ ID NO : 31, SEQ ID NO : 36, SEQ ID NO : 41, SEQ ID NO : 46,
SEQ ID NO : 52, et SEQ ID NO : 58. Dans certains modes de réalisation, la construction code pour un polypeptide qui est identique à au moins 70 %, au moins 75 %, au moins 80 %, au moins 85 %, au moins 90 %, au moins 95 %, au moins 96 %, au moins 97 %, au moins 98 %, ou au moins 99 % à une séquence choisie dans le groupe constitué de 26, SEQ ID NO : 31, SEQ ID NO : 36,
41, SEQ ID NO : 46, SEQ ID NO : 52, et 58. Dans certains modes de réalisation, la construction code pour un polypeptide qui comprend un fragment d'une séquence pleine longueur choisie dans le
SEQ ID NO SEQ ID NO SEQ ID NO
BE2017/5392 groupe constitué de SEQ ID NO : 26, SEQ ID NO : 31, SEQ ID NO : 36, SEQ ID NO : 41, SEQ ID NO : 46,
SEQ ID NO : 52, et SEQ ID NO : 58, dans laquelle le fragment comprend une suite contiguë de la séquence d'acides aminés de la séquence pleine longueur de jusqu'à 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, ou 10 acides aminés plus courte que la séquence pleine longueur.
Dans certains modes de réalisation, la construction comprend une séquence d'ADN choisie dans le groupe
constitué de SEQ ID NO : 25, SEQ ID NO : 30,
SEQ ID NO : 35, SEQ ID NO : 40, SEQ ID NO : 45,
SEQ ID NO : 51, et SEQ ID NO : 57. Dans certains modes
de réalisation, la construction comprend une séquence
d'ADN qui est identique à au moins 70 %, au moins 75 %,
au moins 80 O O r au moins 85 %, au moins 90 O θ r au moins
95 %, au moins 96 % , au moins 97 %, au moins 98 ο θ r ou au
moins 99 O O à une séquence choisie dans le groupe
constitué de SEQ ID NO : 25, SEQ ID NO : 30,
SEQ ID NO : 35, SEQ ID NO : 40, SEQ ID NO : 45,
SEQ ID NO : 51, et SEQ ID NO : 57. Dans certains modes
constitué SEQ ID NO :
de
35, et de réalisation, la construction comprend une séquence d'ADN qui comprend un fragment d'une séquence pleine longueur choisie dans le groupe
SEQ ID NO : 25, SEQ ID NO : 30,
SEQ ID NO : 40, SEQ ID NO : 45, SEQ ID NO : 51,
SEQ ID NO : 57, dans laquelle le fragment comprend une suite contiguë de la séquence d'ADN de la séquence pleine longueur de jusqu'à 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, ou 30 acides nucléiques plus courte que la séquence pleine longueur.
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Dans comprend longueur de réalisation, d'une séquence le groupe la construction d'ADN pleine constitué de certains modes un fragment choisie dans
SEQ ID NO : 25, SEQ ID NO : 30, SEQ ID NO : 35, SEQ ID NO : 40, SEQ ID NO : 45, SEQ ID NO : 51, et SEQ ID NO : 57, dans laquelle le fragment comprend une délétion de jusqu'à 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, ou 30 acides nucléiques à partir de l'extrémité en 5', de l'extrémité en 3', ou à la fois des extrémités en 5 ' et en 3 ' de la séquence pleine longueur. Dans certains modes de réalisation, la construction comprend les acides nucléiques 1 à 2076 d'une séquence choisie
dans le groupe constitué de SEQ ID NO : 25,
SEQ ID NO : 30, SEQ ID NO : 35, SEQ ID NO : 40,
SEQ ID NO : 45, SEQ ID NO : 51, et SEQ ID NO : 57 •
Dans certains modes de réalisation, la construction
comprend une séquence d'ARN choisie dans le groupe
constitué de SEQ ID NO : 77, SEQ ID NO : 78,
SEQ ID NO : 79, SEQ ID NO : 80, SEQ ID NO : 81,
SEQ ID NO : 82, et SEQ ID NO : 83. Dans certains modes
de réalisation, la construction comprend une séquence
d'ARN qu i est identique à au moins 70 %, au moins 75 %,
au moins 80 %, au moins 85 %, au moins 90 %, au moins
95 %, au moins 96 %, au moins 97 %, au moins 98 %, ou au
moins 99 % à une séquence choisie dans le groupe
constitué de SEQ ID NO : 77, SEQ ID NO : 78,
SEQ ID NO : 79, SEQ ID NO : 80, SEQ ID NO : 81,
SEQ ID NO : 82, et SEQ ID NO : 83. Dans certains modes
de réalisation, la construction comprend une séquence d'ARN qui comprend un fragment d'une séquence pleine longueur choisie dans le groupe constitué de
BE2017/5392
SEQ ID NO : 77, SEQ ID NO : 78, SEQ ID NO : 79, SEQ ID NO : 80, SEQ ID NO : 81, SEQ ID NO : 82, et SEQ ID NO : 83, dans laquelle le fragment comprend une suite contiguë de la séquence d'ARN de la séquence pleine longueur de jusqu'à 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, ou 30 acides nucléiques plus courte que la séquence pleine longueur.
Dans certains modes de réalisation, la construction comprend un fragment d'une séquence d'ARN pleine longueur choisie dans le groupe constitué de SEQ ID NO : 77, SEQ ID NO : 78, SEQ ID NO : 79, SEQ ID NO : 80, SEQ ID NO : 81, SEQ ID NO : 82, et SEQ ID NO : 83, dans laquelle le fragment comprend une délétion de jusqu'à 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, ou 30 acides nucléiques à partir de l'extrémité en 5', de l'extrémité en 3', ou à la fois des extrémités en 5 ' et en 3 ' de la séquence pleine longueur. Dans certains modes de réalisation, la construction comprend
les acides nucléiques 1 à 2076 d ' une séquence choisie
dans le groupe constitué de SEQ ID NO : 77,
SEQ ID NO : 78, SEQ ID NO : 79, SEQ ID NO : 80,
SEQ ID NO : 81, SEQ ID NO : 82, et SEQ ID NO : 83.
Polypeptides
Dans certains modes de réalisation, un polypeptide ici est une forme n'existant pas à l'état naturel (par exemple, une forme recombinante ou modifiée).
Par exemple, les polypeptides (par exemple, des antigènes) divulgués ici peuvent être préparés par synthèse chimique (en totalité ou en partie), par digestion de polypeptides plus longs en utilisant des
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Synthesis protéases, par traduction à partir d'ARN, par purification à partir d'une culture cellulaire (par exemple, à partir d'une expression recombinante), à partir de l'organisme lui-même, etc. Un exemple de procédé pour la production de peptides d'une longueur < 40 acides aminés implique une synthèse chimique in vitro, voir les références suivantes : Bodanszky (1993) Principles of Peptide Synthesis (ISBN: 0387564314) ; et Fields et al. (1997) Meth Enzymol 289:
Solid-Phase Peptide Synthesis. ISBN: 0121821900. Des techniques de synthèse de peptides sur phase solide, telles que les procédés basés sur la chimie tBoc ou Fmoc sont connues dans l'art, voir la référence suivante : Chan & White (2000) Fmoc Solid Phase Peptide Synthesis. ISBN: 0199637245. Une synthèse enzymatique peut être également utilisée en partie ou en totalité, voir la référence suivante : Kullmann (1987) Enzymatic Peptide ISBN: 0849368413. Comme variante de la synthèse chimique, la synthèse biologique peut être utilisée, par exemple, les polypeptides peuvent être produits par traduction. Ceci peut être réalisé in vitro ou in vivo. Les procédés biologiques sont en général restreints à la production de polypeptides d'acides L-aminés, mais une manipulation machinerie de traduction (par exemple, des molécules d ' aminoacyl-ARNt) peut être utilisée pour permettre l'introduction d'acides D-aminés (ou d'autres acides aminés non naturels, tels que 1'iodotyrosine ou la méthylphénylalanine, 1'azidohomoalanine, etc.), voir la référence suivante : Kullmann (1987) Enzymatic Peptide Synthesis. ISBN: 0849368413. Toutefois, lorsque des à base de la
BE2017/5392 acides D-aminés sont inclus, il est préféré d'utiliser la synthèse chimique. Les polypeptides de la divulgation peuvent comporter des modifications covalentes à l'extrémité C-terminale et/ou N-terminale. Ils peuvent également prendre diverses formes (par exemple, native, fusions, glycosylée, non glycosylée, lipidée, non lipidée, phosphorylée, non phosphorylée, myristoylée, non myristoylée, monomère, multimère, particulaire, dénaturée, etc.). Les polypeptides peuvent être glycosylés de façon naturelle ou non naturelle (c'està-dire que le polypeptide peut présenter un profil de glycosylation qui diffère du profil de glycosylation trouvé dans le polypeptide existant à l'état naturel correspondant).
Les formes n'existant pas à l'état naturel des polypeptides ici peuvent comprendre une ou plusieurs séquences d'acides aminés hétérologues (par exemple, une autre séquence d'antigène, une autre séquence signal, un marqueur détectable, ou analogues) en plus d'une séquence de l'antigène prME du virus Zika. Par exemple, un polypeptide ici peut être une protéine de fusion. En variante, ou en outre, la séquence d'acides aminés ou la structure chimique du polypeptide peut être modifiée (par exemple, par un ou plusieurs acides aminés non naturels, par modification covalente, et/ou en ayant un profil de glycosylation différent, par exemple, par l'élimination ou l'addition d'un ou de plusieurs groupes glycosylé) comparativement à une séquence polypeptidique existant à l'état naturel.
Les polypeptides (par exemple, des antigènes) divulgués ici sont fournis de préférence sous une forme
BE2017/5392 purifiée ou sensiblement purifiée, c'est-à-dire, sensiblement dépourvue d'autres polypeptides (par exemple, dépourvue de polypeptides existant à l'état naturel), particulièrement d'autres polypeptides du virus Zika ou de la cellule hôte ; par exemple, au moins purs à environ 50 % (en poids), au moins purs à environ 60 % (en poids), au moins purs à environ 70 % (en poids), au moins purs à environ 80 % (en poids) , ou au moins purs à environ 90 % (en poids), etc. En variante, moins d'environ 50 %, moins d'environ 40 %, moins d'environ 30 %, moins d'environ 20 %, moins d'environ 10 %, ou moins d'environ 5 % d'une composition est constituée d'autres polypeptides exprimés.
Acides nucléiques
Les présents inventeurs divulguent ici des molécules d'acide nucléique comprenant une séquence qui code pour un antigène prME du virus Zika. Les acides nucléiques tels que divulgués ici peuvent prendre diverses formes (par exemple, simple brin, double brin, vecteurs, etc.). Les acides nucléiques peuvent être circulaires ou ramifiés, mais ils seront généralement linéaires.
Les acides nucléiques utilisés ici sont fournis de préférence sous une forme purifiée ou sensiblement purifiée, c'est-à-dire, sensiblement dépourvue d'autres acides nucléiques (par exemple, dépourvue d'acides nucléiques existant à l'état naturel), particulièrement d'autres acides nucléiques du virus Zika ou de la cellule hôte, étant généralement au moins purs à environ 50 % (en poids), au moins purs à environ 60 % (en poids), au
BE2017/5392 moins purs à environ 70 % (en poids), au moins purs à environ 80 % (en poids), et habituellement au moins purs à environ 90 %.
Les acides nucléiques peuvent être préparés de nombreuses façons, par exemple, par synthèse chimique (par exemple, la synthèse d'ADN par les phosphoramidites) en totalité ou en partie, par digestion d'acides nucléiques plus longs en utilisant des nucléases (par exemple, des enzymes de restriction), par jonction d'acides nucléiques plus courts ou de nucléotides (par exemple, en utilisant des ligases ou des polymérases), à partir de banques génomiques ou d'ADNc, etc.
Le terme « acide nucléique » signifie en général une forme polymère de nucléotides d'une longueur quelconque, qui contiennent des désoxyribonucléotides, des ribonucléotides, et/ou leurs analogues. Il comprend l'ADN, l'ARN, des hybrides ADN/ARN. Il comprend également des analogues d'ADN ou d'ARN, tels que ceux contenant des squelettes modifiés (par exemple, acides nucléiques peptidiques phosphorothioates ) ou des bases l'acide nucléique de la divulgation comprend l'ARNm, ADN, l'ADNc, des acides nucléiques recombinants, des acides nucléiques ramifiés, des plasmides, des vecteurs, etc. Lorsque l'acide nucléique prend la forme d'ARN, il peut ou pas avoir une coiffe en 5'.
Les acides nucléiques ici comprennent une séquence qui code pour au moins un antigène prME du virus Zika. Généralement, les acides nucléiques de l'invention seront sous forme recombinante, c'est-à-dire, une forme qui n'existe pas dans la nature. Par exemple, l'acide des (PNA) ou des modifiées. Ainsi,
BE2017/5392 nucléique peut comprendre une ou plusieurs séquences d'acide nucléique hétérologues (par exemple, une séquence codant pour un autre antigène et/ou une séquence de contrôle tel qu'un promoteur ou un site d'entrée interne des ribosomes) en plus de la séquence codant pour au moins un antigène prME du virus Zika. L'acide nucléique peut faire partie d'un vecteur, c'est-à-dire, une partie d'une construction d'acide nucléique conçue pour la traduction/transfection d'un ou de plusieurs types cellulaires. Les vecteurs peuvent être, par exemple, des « vecteurs d'expression » qui sont conçus pour l'expression d'une séquence nucléotidique dans une cellule hôte, ou des « vecteurs viraux » qui sont conçus pour entraîner la production d'un virus recombinant ou d'une particule pseudovirale.
En variante, ou en outre, la séquence ou la structure chimique de l'acide nucléique peut être modifiée comparativement à une séquence existant à l'état naturel qui code pour un antigène prME du virus Zika. La séquence de la molécule d'acide nucléique peut être modifiée, par exemple, pour augmenter l'efficacité de l'expression ou de la réplication de l'acide nucléique, ou pour fournir une stabilité ou une résistance supplémentaire à la dégradation.
L'acide nucléique codant pour les polypeptides décrits ci-dessus peut être optimisé pour les codons. Par « optimisé pour les codons », il est signifié une modification par rapport à l'usage des codons qui peut augmenter l'efficacité de la traduction et/ou la demivie de l'acide nucléique. Une queue poly A (par exemple, d'environ 30 résidus d'adénosine ou plus) peut être
BE2017/5392 fixée à l'extrémité 3' de 1'ARN pour augmenter sa demivie. L'extrémité 5' de l'ARN peut être coiffée par un ribonucléotide modifié avec la structure m7G (5') ppp (5') N (structure de coiffe 0) ou l'un de ses dérivés, qui peut être incorporée durant la synthèse de l'ARN ou peut être créée par des enzymes après la transcription de l'ARN (par exemple, en utilisant l'enzyme de coiffage du virus de la vaccine (VCE) constituée d'ARNm triphosphatase, guanylyl-transférase et guanine-7méthyltransférase, qui catalyse la construction de structures de coiffe 0 N7-monométhylée). La structure de coiffe 0 joue un rôle important dans le maintien de la stabilité et de l'efficacité de la traduction de la molécule d'ARN. La coiffe en 5 ' de la molécule d'ARN peut être en outre modifiée par une 2'-0méthyltransférase qui entraîne la production d'une structure de coiffe 1 (m7Gppp [m2'-O] N), qui peut en outre augmenter l'efficacité de la traduction.
Les acides nucléiques peuvent comprendre un ou plusieurs analogues nucléotidiques ou nucléotides modifiés. Tel qu'utilisé ici, « analogue nucléotidique » ou « nucléotide modifié » se rapporte à un nucléotide qui contient une ou plusieurs modifications chimiques (par exemple, des substitutions) dans ou sur la base azotée du nucléoside (par exemple, cytosine (C), thymidine (T) (ou uracile (U)), adénine (A) ou guanine (G)). Un analogue nucléotidique peut contenir d'autres modifications chimiques dans ou sur la fraction sucre du nucléoside (par exemple, ribose, désoxyribose, ribose modifié, désoxyribose modifié, analogue de sucre à six chaînons, ou analogue de sucre à chaîne ouverte), ou
BE2017/5392 du phosphate. La préparation des nucléotides et des nucléotides et des nucléosides modifiés est bien connue dans l'art, voir les références suivantes : brevets U.S. numéros 4 373 071, 4 458 066, 4 500 707, 4 668 777,
973 679, 5 047 524, 5 132 418, 5 153 319, 5 262 530,
700 642. De nombreux nucléosides modifiés et nucléotides modifiés sont disponibles dans le commerce.
Les nucléobases modifiées qui peuvent être incorporées dans des nucléosides et des nucléotides modifiés et être présentes dans les molécules d'ARN comprennent : m5C (5-méthylcytidine), m5U (5-méthyluridine), m6A (N6-méthyladénosine), s2U (2-thiouridine), Um (2'-O-méthyluridine), mlA (1-méthyladénosine) ; m2A (2-méthyladénosine) ; Am (2-1-O-méthyladénosine) ; ms2m6A (2-méthylthio-N6-méthyladénosine) ; i6A (N6isopentényladénosine) ; ms2i6A (2-méthylthio-N6isopentényladénosine) ; io6A (N6-(cis-hydroxyisopentényl)adénosine) ; ms2io6A (2-méthylthio-N6-(cishydroxyisopentényl)adénosine) ; g6A (N6-glycinylcarbamoyladénosine) ; t6A (N6-thréonylcarbamoyladénosine) ; ms2t6A (2-méthylthio-N6-thréonylcarbamoyladénosine) ; m6t6A (N6-méthyl-N6-thréonylcarbamoyl(N6-hydroxynorvalylcarbamoylhn6A adénosine) adénosine) ms2hn6A (2-méthylthio-N6-hydroxynorvalylcarbamoyladénosine) ; Ar(p) (2'-O-ribosyladénosine (phosphate)) ; I (inosine) ; mil (1-méthylinosine) ; m'im (1,2'-O-diméthylinosine) ; m3C (3-méthylcytidine) ;
Cm (2T-O-méthylcytidine) ; (N4-acétylcytidine) ; 5FC (5,2-O-diméthylcytidine) ;
s2C (2-thiocytidine) ; ac4C (5-formylcytidine) ; m5Cm ac4Cm (N4-acétyl-2T-Ométhylcytidine) k2C (lysidine) mlG (1-méthylBE2017/5392 guanosine) ; m2G (N2-méthylguanosine) ; m7G (7-méthylguanosine) ; Gm (2'-O-méthylguanosine) ; m22G (N2,N2diméthylguanosine) ; m2Gm (N2,2'-O-diméthylguanosine) ; m22Gm (N2,N2,2'-O-triméthylguanosine) ; Gr(p) (2'-Oribosylguanosine (phosphate)) ; yW (wybutosine) ; o2yW (peroxywybutosine) ; OHyW (hydroxywybutosine) ; OHyW* (hydroxywybutosine sous-modifiée) ; imG (wyosine) ; mimG (méthylguanosine) ; Q (queuosine) ; oQ (époxyqueuosine) ; galQ (galactosyl-queuosine) ; manQ (mannosyl-queuosine) ; preQo (7-cyano-7-déazaguanosine) ; preQi (7-aminométhyl-7-déazaguanosine) ; G* (archaéosine) ; D (dihydrouridine) ; m5Um (5,2'-Οdiméthyluridine) ; s4U (4-thiouridine) ; m5s2U (5méthyl-2-thiouridine) ; s2Um (2-thio-2'-O-méthyluridine) ; acp3U (3-(3-amino-3-carboxypropyl)uridine) ; ho5U (5-hydroxyuridine) ; mo5U (5-méthoxyuridine) ; cmo5U (acide uridine-5-oxyacétique) ; mcmo5U (ester méthylique de l'acide uridine-5-oxyacétique) ; chm5U (5(carboxyhydroxyméthyl)uridine)) ; mchm5U (ester méthylique de la 5-(carboxyhydroxyméthyl)uridine) ; mcm5U (5-méthoxycarbonyl-méthyluridine) ; mcm5Um (5méthoxycarbonylméthyl-2-O-méthyluridine) ; mcm5s2U (5méthoxycarbonylméthyl-2-thiouridine) ; nm5s2U (5-aminométhyl-2-thiouridine) ; mnm5U (5-méthylaminométhyluridine) ; mnm5s2U (5-méthylaminométhyl-2-thiouridine) ; mnm5se2U (5-méthylaminométhyl-2-séléno-uridine) ; ncm5U (5-carbamoylméthyl-uridine) ; ncm5Um (5-carbamoylméthyl-2'-O-méthyluridine) ; cmnm5U (5-carboxyméthylaminométhyluridine) ; cnmm5Um (5-carboxyméthylaminométhyl-2-L-O-méthyluridine) ; cmnm5s2U (5-carboxyméthylaminométhyl-2-thiouridine) ; m62A (N6,N6BE2017/5392 diméthyladénosine) ; Tm (2'-O-méthylinosine) ; m4C (N4méthylcytidine) ; m4Cm (N4,2-O-diméthylcytidine) ; hm5C (5-hydroxyméthylcytidine) ; m3U (3-méthyluridine) ; cm5U (5-carboxyméthyluridine) ; m6Am (N6,T-O-diméthyladénosine) ; m62Am (N6,N6,O-2-triméthyladénosine) ; m2'7G (N2,7-diméthylguanosine) ; m2'2'7G (N2,N2,7triméthylguanosine) ; m3Um (3,2T-O-diméthyluridine) ; m5D (5-méthyldihydrouridine) ; £5Cm (5-formyl-2'-0méthylcytidine) ; mlGm (1,2'-O-diméthylguanosine) ; m'Am (1,2-O-diméthyladénosine) irinométhyluridine) ; tm5s2U (S-taurinométhyl-2-thiouridine) ; iniG-14 (4déméthyl-guanosine) ; imG2 (isoguanosine) ; ac6A (N6acétyladénosine), hypoxanthine, inosine, 8-oxo-adénine, ses dérivés 7-substitués, dihydrouracile, pseudouracile, 2-thiouracile, 4-thiouracile, 5-aminouracile, 5-(alkyl en Ci à Ce)-uracile, 5-méthyluracile, 5-(alcényl en C2 à Ce) -uracile, 5-(alcynyl en C2 à Ce) -uracile, 5-(hydroxyméthyl)uracile, 5-chlorouracile, 5-fluorouracile, 5bromouracile, 5-hydroxycytosine, 5- (alkyl en Ci à Ce) ~ cytosine, 5-méthylcytosine, 5-(alcényl en C2 à Ce) ~ cytosine, 5-(alcynyl en C2 à Ce)-cytosine, 5-chlorocytosine, 5-fluorocytosine, 5-bromocytosine, N2diméthylguanine, 7-déazaguanine, 8-azaguanine, 7-déazaguanine 7-substituée, 7-déaza-7-(alcynyl en C2 à Ce)~ guanine, 7-déaza-guanine 8-substituée, 8-hydroxyguanine, 6-thioguanine, 8-oxoguanine, 2-aminopurine, 2-amino-6chloropurine, 2,4-diaminopurine, 2,6-diaminopurine, 8azapurine, 7-déazapurine substituée, 7-déaza-purine 7substituée, 7-déaza-purine 8-substituée, hydrogène (résidu abasique) , m5C, m5U, m6A, s2U, W, ou 2'-O-méthylU. Un grand nombre de ces nucléobases modifiées et de
BE2017/5392 leurs ribonucléosides correspondants sont disponibles auprès de fournisseurs commerciaux.
Vaccins à base d'acide nucléique
Les présents inventeurs divulguent des compositions comprenant une séquence d'acide nucléique qui code pour un polypeptide comprenant un antigène du virus Zika, l'un de ses variants ou fragments. De telles compositions peuvent être un vaccin à base d'acide nucléique. Une autre composition comprenant une séquence d'acide nucléique qui code pour un ou plusieurs (par exemple, un deuxième, troisième, quatrième, cinquième ou sixième) antigènes supplémentaires de virus Zika peut être également fournie sous la forme d'un vaccin à base d'acide nucléique. Dans certains modes de réalisation, une composition comprend une séquence d'acide nucléique codant pour un antigène prME du virus Zika provenant d'une première souche de virus Zika et une séquence d'acide nucléique supplémentaire codant pour un antigène prME supplémentaire de virus Zika provenant d'une ou de plusieurs autres souches de virus Zika. Dans certains modes de réalisation, une composition comprend une séquence d'acide nucléique codant pour un antigène prME de virus Zika et un ou plusieurs (par exemple, un deuxième, troisième, quatrième, cinquième ou sixième) antigènes supplémentaires de virus Zika. En variante, un ou plusieurs antigènes supplémentaires de virus non-Zika peuvent être codés.
L'acide nucléique peut être, par exemple, de l'ARN (c'est-à-dire, un vaccin à base d'ARN) ou de l'ADN (c'est-à-dire, un vaccin à base d'ADN, tel qu'un vaccin
BE2017/5392 à base d'ADN plasmidique). Dans certains modes de réalisation, le vaccin à base d'acide nucléique est un vaccin à base d'ARN. Dans certains modes de réalisation, le vaccin à base d'ARN comprend une molécule d'ARN s'auto-répliquant, également appelée ici molécule d'ARNm s'auto-amplifrant (SAM). La molécule d'ARN s'autorépliquant peut être un réplicon d'ARN dérivé d'alphavirus.
Les molécules d'ARN s'auto-répliquant sont bien connues dans l'art et peuvent être produites en utilisant des éléments de réplication dérivés, par exemple, d'alphavirus, et en substituant les protéines structurales virales par une séquence nucléotidique codant pour une protéine d'intérêt. Une molécule d'ARN s ' auto-répliquant est généralement une molécule brin + qui peut être traduite directement après l'administration à une cellule, et cette traduction fournit une ARN polymérase ARN-dépendante qui ensuite produit des transcrits à la fois antisens et sens à partir de l'ARN administré. Ainsi, l'ARN administré mène à la production de multiples molécules d'ARN filles. Ces molécules d'ARN filles, ainsi que les transcrits subgénomiques colinéaires, peuvent être traduites ellesmêmes pour fournir l'expression in situ d'un antigène codé (c'est-à-dire, un antigène prM-F de virus Zika), ou peuvent être transcrites pour fournir d'autres transcrits avec le même sens que l'ARN administré qui sont traduits pour fournir l'expression in situ de l'antigène. Le résultat global de cette séquence de transcriptions est une énorme amplification du nombre
BE2017/5392 des ARN de réplicons introduits et ainsi l'antigène codé devient un produit polypeptidique majeur des cellules.
Un système approprié pour obtenir une autoréplication de cette façon est d'utiliser un réplicon à base d ' alphavirus. Ces réplicons sont des ARN brin + (brin de sens positif) qui mènent à la traduction d'une réplicase (ou d'une réplicase-transcriptase) après l'administration à une cellule. La réplicase est traduite sous la forme d'une polyprotéine qui s'autoclive pour fournir un complexe de réplication qui crée des copies de brins génomiques de l'ARN brin + administré Ces transcrits brin négatif (brin -) peuvent même être transcrits pour donner d'autres copies de l'ARN brin + parent et également pour donner un transcrit subgénomique qui code pour l'antigène. La traduction du transcrit subgénomique mène ainsi à l'expression in situ de l'antigène par la cellule infectée. Les réplicons d'alphavirus appropriés peuvent utiliser une réplicase provenant d'un virus Sindbis, d'un virus de la forêt de Semliki, d'un virus de l'encéphalite équine de l'Est, d'un virus de l'encéphalite équine du Venezuela, etc. Les séquences virales mutantes ou de type sauvage peuvent être utilisées, par exemple, le mutant TC83 atténué du VEEV a été utilisé dans des réplicons, voir la référence suivante : WO 2005/113782, dont le contexte est incorporé en référence.
Dans certains modes de réalisation, la molécule d'ARN s ' auto-répliquant décrite ici code pour (i) une ARN polymérase ARN-dépendante qui peut transcrire l'ARN à partir de la molécule d'ARN s'auto-répliquant et (ii) un antigène prME de virus Zika. La polymérase peut
BE2017/5392 être une réplicase d'alphavirus, par exemple, comprenant une ou plusieurs protéines nsPl, nsP2, NsP3 et nsP4 d'alphavirus.
Tandis que les génomes naturels d'alphavirus codent pour des protéines structurales de virions en plus de la polyprotéine non structurale de la réplicase, dans certains modes de réalisation, les molécules d'ARN s'auto-répliquant ne codent pas pour des protéines structurales d'alphavirus. Ainsi, l'ARN s'autorépliquant peut mener à la production de copies d'ARN génomique de lui-même dans une cellule, mais pas à la production de virions contenant l'ARN. L'incapacité de produire ces virions signifie que, à la différence d'un alphavirus de type sauvage, la molécule d'ARN s'autorépliquant ne peut pas se perpétuer sous forme infectieuse. Les protéines structurales d'alphavirus qui sont nécessaires à la perpétuation dans les virus de type sauvage sont absentes des ARN s'auto-répliquant de la présente divulgation et leur place est prise par un ou plusieurs gènes codant pour l'immunogène d'intérêt, de telle façon que le transcrit subgénomique code pour 1'immunogène plutôt que pour les protéines structurales de virions d'alphavirus.
Ainsi, une molécule d'ARN s'auto-répliquant utile avec 1'invention peut comporter deux cadres de lecture ouverts. Le premier cadre de lecture ouvert (5') code pour une réplicase ; le second cadre de lecture ouvert (3') code pour un antigène. Dans certains modes de réalisation, l'ARN peut comporter des cadres de lecture ouverts supplémentaires (par exemple, en aval), par
BE2017/5392 exemple, pour coder pour d'autres antigènes ou pour coder pour des polypeptides accessoires.
Dans certains modes de réalisation, la molécule d'ARN s'auto-répliquant divulguée ici comporte une coiffe en 5' (par exemple, une 7-méthylguanosine) . Cette coiffe peut amplifier la traduction in vivo de l'ARN. Dans certains modes de réalisation, la séquence en 5' de la molécule d'ARN s'auto-répliquant doit être choisie pour assurer la compatibilité avec la réplicase codée.
Une molécule d'ARN s'auto-répliquant peut comporter une queue poly-A en 3'. Elle peut également comprendre une séquence de reconnaissance de la poly-A polymérase (par exemple, AAUAAA) près de son extrémité 3'.
Les molécules d'ARN s'auto-répliquant peuvent avoir diverses longueurs mais elles ont généralement une longueur de 5000 à 25 000 nucléotides. Les molécules d'ARN s'auto-répliquant seront généralement simple brin. Les ARN simple brin peuvent généralement initier un effet adjuvant par liaison au TLR7, au TLR8, aux ARN hélicases et/ou à la PKR. L'ARN administré sous forme double brin (ARNdb) peut se lier au TLR3, et ce récepteur peut être également déclenché par des ARNdb qui se sont formés soit durant la réplication d'un ARN simple brin soit au sein de la structure secondaire d'un ARN simple brin.
L'ARN s'auto-répliquant peut être préparé de façon pratique par une transcription in vitro (TIV) . La TIV peut utiliser une matrice (ADNc) créée et propagée sous forme plasmidique dans des bactéries, ou créée par synthèse (par exemple, par la synthèse de gènes et/ou des procédés de création par réaction en chaîne de la polymérase (PCR)). Par exemple, une ARN polymérase ADNBE2017/5392 dépendante (telle que les ARN polymérases des bactériophages T7, T3 ou SP6) peut être utilisée pour transcrire l'ARN s ' auto-répliquant à partir d'une matrice d'ADN. Des réactions appropriées de coiffage et d'addition de poly-A peuvent être utilisées comme il est nécessaire (bien que la poly-A du réplicon soit habituellement codée au sein de 1'ADN matrice). Ces ARN polymérases peuvent avoir des exigences stringentes pour le ou les nucléotides transcrits en 5' et dans certains modes de réalisation, ces exigences doivent correspondre aux exigences de la réplicase codée, afin de garantir que l'ARN transcrit par TIV puisse fonctionner efficacement en tant que substrat pour sa réplicase autocodée.
Un ARN s'auto-répliquant peut comprendre (en plus de toute structure de coiffe en 5 ' ) un ou plusieurs nucléotides comportant une nucléobase modifiée. Un ARN utilisé avec l'invention comprend de façon idéale uniquement des liaisons phosphodiester entre les nucléosides, mais dans certains modes de réalisation, il peut contenir des liaisons phosphoramidate, phosphorothioate, et/ou méthylphosphonate.
La molécule d'ARN s'auto-répliquant peut coder pour un seul antigène polypeptidique hétérologue (c'est-àdire, un antigène prME de virus Zika) ou, éventuellement, deux antigènes polypeptidiques hétérologues ou plus liés ensemble de telle façon que chacune des séquences conserve son identité (par exemple, liées en série) lorsqu'elles sont exprimées sous la forme d'une séquence d'acides aminés. Les polypeptides hétérologues produits à partir de l'ARN s'auto-répliquant peuvent être ensuite
BE2017/5392 produits sous la forme d'un polypeptide de fusion ou modifiés de façon à produire des séquences polypeptidiques ou peptidiques distinctes.
Les molécules d'ARN s'auto-répliquant décrites ici peuvent être modifiées pour exprimer de multiples séquences nucléotidiques, à partir de deux cadres de lecture ouverts ou plus, permettant de cette façon la coexpression de protéines, comme un, deux antigènes ou plus de virus Zika (par exemple, un, deux antigènes prME ou plus de virus Zika) conjointement avec des cytokines ou d'autres immunomodulateurs, qui peuvent amplifier la production d'une réponse immunitaire. Une telle molécule d'ARN s'auto-répliquant pourra être particulièrement utile, par exemple, dans la production de divers produits géniques (par exemple, des protéines) en même temps, par exemple, sous la forme d'un vaccin bivalent ou multivalent.
Si c'est souhaité, les molécules d'ARN s'autorépliquant peuvent être criblées ou analysées pour confirmer leurs propriétés thérapeutiques et prophylactiques en utilisant divers procédés d'analyse in vitro ou in vivo qui sont connus de l'homme du métier. Par exemple, des vaccins comprenant une molécule d'ARN s'auto-répliquant peuvent être testés pour leur effet sur l'induction de la prolifération ou de la fonction effectrice du type de lymphocyte particulier d'intérêt, par exemple, les lymphocytes B, les lymphocytes T, les lignées de lymphocytes T, et les clones de lymphocytes T. Par exemple, des cellules spléniques provenant de souris immunisées peuvent être isolées et la capacité des lymphocytes T cytotoxiques à lyser des cellules
BE2017/5392 cibles autologues qui contiennent une molécule d'ARN s ' auto-répliquant qui code pour un antigène prME de virus Zika. En outre, la différenciation des lymphocytes T auxiliaires peut être analysée en mesurant la prolifération ou la production de cytokines TH1 (IL-2 et IFN-γ) et/ou TH2 (IL-4 et IL-5) par une technique ELISA ou directement dans des lymphocytes T CD4+ par coloration cytoplasmique des cytokines et cytométrie en flux.
Les molécules d'ARN s'auto-répliquant qui codent pour un antigène prME de virus Zika peuvent être également testées pour leur capacité à induire des réponses immunitaires humorales, comme il est mis en évidence, par exemple, par l'induction par les lymphocytes B d'anticorps spécifiques d'un antigène prME de virus Zika d'intérêt. Ces analyses peuvent être conduites en utilisant, par exemple, des lymphocytes B périphériques provenant d'individus immunisés. De tels procédés d'analyse sont connus de l'homme du métier. D'autres analyses qui peuvent être utilisées pour caractériser les molécules d'ARN s'auto-répliquant peuvent impliquer la détection de l'expression de l'antigène prME de virus Zika codé par les cellules cibles. Par exemple, la technique FACS peut être utilisée pour détecter l'expression d'antigènes sur la surface cellulaire ou au niveau intracellulaire. Un autre avantage de la sélection par la technique FACS est qu'on peut trier différents niveaux d'expression ; parfois une expression inférieure peut être souhaitée. Un autre procédé approprié pour identifier des cellules qui expriment un antigène particulier implique une immunoadhérence en utilisant des anticorps monoclonaux
BE2017/5392 sur une plaque ou une capture en utilisant des billes magnétiques revêtues d'anticorps monoclonaux.
Dans certains modes de réalisation, les molécules d'ARN s'auto-répliquant comprennent une séquence choisie
dans le groupe constitué de SEQ ID NO : 70,
SEQ ID NO : 71, SEQ ID NO : 72 r SEQ ID NO : 73,
SEQ ID NO : 74, SEQ ID NO : 75, et SEQ ID NO : 76. Dans
certains modes de réalisation, les molécules d'ARN
s'auto-répliquant comprennent une séquence qui est identique à au moins 70 %, au moins 75 %, au moins 80 %,
au moins 85 O θ r au moins 90 %, au moins 95 %, au moins
96 %, au moins 97 %, au moins 98 %, ou au moins 99 o d.
une séquence choisie dans le groupe constitué de
SEQ ID NO : 70, SEQ ID NO : 71, SEQ ID NO : 72,
SEQ ID NO : 73, SEQ ID NO : 74, SEQ ID NO : 75, et
SEQ ID NO : 76. Dans certains modes de réalisation, la
SEQ ID NO : 71, SEQ ID NO : 74, 76 dans laquelle le
SEQ ID NO : 65, molécule d'ARN s'auto-répliquant comprend un fragment d'une séquence pleine longueur choisie dans le groupe constitué de SEQ ID NO : 70,
SEQ ID NO : 72, SEQ ID NO : 73,
SEQ ID NO : 75, et SEQ ID NO fragment comprend une suite contiguë de la séquence d'acide nucléique de la séquence pleine longueur de jusqu'à 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, ou acides nucléiques plus courte que la séquence pleine longueur.
Dans certains modes de réalisation, il est fourni une séquence d'ADN codant pour une molécule d'ARN s'autorépliquant, ladite séquence d'ADN étant choisie dans le groupe constitué de SEQ ID NO : 63,
SEQ ID NO : 66,
SEQ ID NO : 64, SEQ ID NO : 67,
BE2017/5392
SEQ ID NO : 68, et SEQ ID NO : 69. Dans certains modes de réalisation, la séquence d'ADN codant pour une molécule d'ARN s ' auto-répliquant comprend une séquence qui est identique à au moins 70 %, au moins 75 %, au moins 80 %, au moins 85 %, au moins 90 %, au moins 95 %, au moins 96 %, au moins 97 %, au moins 98 %, ou au moins 99 % à une séquence choisie dans le groupe constitué de
ID NO : 63, SEQ ID NO : 64, SEQ ID NO : 65,
ID NO : 66, SEQ ID NO : 67, SEQ ID NO : 68, et
ID NO : 69. Dans certains modes de réalisation, la
séquence d'ADN codant pour une molécule d'ARN s'autorépliquant comprend un fragment d'une séquence pleine longueur choisie dans le groupe constitué de
SEQ ID NO : 63, SEQ ID NO : 64, SEQ ID NO : 65, SEQ ID NO : 66, SEQ ID NO : 67, SEQ ID NO : 68, et SEQ ID NO : 69 dans laquelle le fragment comprend une suite contiguë de la séquence d'acide nucléique de la séquence pleine longueur de jusqu'à 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, ou 30 acides nucléiques plus courte que la séquence pleine longueur.
Le vaccin à base d'acide nucléique peut comprendre un système d'administration viral ou non viral. Le système d'administration (également appelé ici véhicule d'administration) peut avoir des effets adjuvants qui amplifient l'immunogénicité de l'antigène prME de virus Zika codé. Par exemple, la molécule d'acide nucléique peut être encapsulée dans des liposomes, des microparticules polymères biodégradables non toxiques ou des particules de réplicons de type viral (PRV) , ou complexée avec des particules d'une émulsion cationique huile dans l'eau. Dans certains modes de réalisation, le
BE2017/5392 vaccin à base d'acide nucléique comprend un système d'administration de nanoémulsion cationique (NEC) ou un système d'administration de nanoparticules lipidiques (NPL) . Dans certains modes de réalisation, le vaccin à base d'acide nucléique comprend un système d'administration non viral, c'est-à-dire que le vaccin à base d'acide nucléique est sensiblement dépourvu de capside virale. En variante, le vaccin à base d'acide nucléique peut comprendre des particules de virions de type viral. Dans d'autres modes de réalisation, le vaccin à base d'acide nucléique peut comprendre un acide nucléique nu, tel qu'un ARN nu (par exemple, ARNm), mais l'administration par l'intermédiaire de NEC ou de NPL est préférée.
Dans certains modes de réalisation, le vaccin à base d'acide nucléique comprend un système d'administration de nanoémulsion cationique (NEC). Les systèmes d'administration de NEC et les procédés pour leur préparation sont décrits dans la référence suivante : WO 2012/006380. Dans un système d'administration de NEC, la molécule d'acide nucléique (par exemple, ARN) qui code pour l'antigène est complexée avec une particule d'une émulsion cationique huile dans l'eau. Les émulsions cationiques huile dans l'eau peuvent être utilisées pour administrer des molécules chargées négativement, telles qu'une molécule d'ARN aux cellules. Les particules de l'émulsion comprennent un noyau d'huile et un lipide cationique. Le lipide cationique peut interagir avec la molécule chargée négativement, ancrant de cette façon la molécule aux particules de l'émulsion. D'autres détails de NEC utiles peuvent se
BE2017/5392 trouver dans les références suivantes : WO 2012/006380 ; WO 2013/006834 ; et WO 2013/006837 (dont le contenu est incorporé ici dans son intégralité) .
Ainsi, dans un vaccin à base d'acide nucléique de l'invention, une molécule d'ARN codant pour un antigène prME de virus Zika peut être complexée avec une particule d'une émulsion cationique huile dans l'eau. Les particules comprennent généralement un noyau d'huile (par exemple, une huile végétale ou un squalène) qui est en phase liquide à 25 °C, un lipide cationique (par exemple, un phospholipide) et, éventuellement, un tensioactif (par exemple, le trioléate de sorbitane, le polysorbate 80) ; du polyéthylène glycol peut être également inclus. Dans certains modes de réalisation, la NEC comprend du squalène et un lipide cationique, tel que le 1,2-dioléoyloxy-3-(triméthylammonio)propane (DOTAP). Dans certains modes de réalisation préférés, le système d'administration est un système d'administration non viral, tel qu'une NEC, et le vaccin à base d'acide nucléique comprend un ARN s'auto-répliquant (ARNm). Ceci peut être particulièrement efficace dans le déclenchement de réponses immunitaires humorales et cellulaires. Les avantages comprennent également l'absence de réponse immunitaire anti-vecteur limitante et le manque de risque d'intégration génomique.
Dans certains modes de réalisation, une molécule d'ARN codant pour un antigène prME de virus Zika peut être complexée avec une émulsion cationique huile dans l'eau submicronique. Dans certains modes de réalisation, l'émulsion cationique huile dans l'eau est caractérisée par une taille de particule moyenne d'environ 80 nm à
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180 nm de diamètre (ou en variante d'environ 80 à environ 150 nm ; d'environ 80 à 130 nm ; ou d'environ 100 nm). Dans certains modes de réalisation, la concentration de DOTAP dans ladite émulsion, avant la complexation de l'ARN, est d'au moins environ 2,5 mM, ou d'environ 2,5 mM à environ 8 mM. Dans un mode de réalisation particulier, la concentration de DOTAP dans ladite émulsion est d'environ 4 mg/ml (5,73 mM) . L'huile peut être le squalène ou le squalane.
Dans certains modes de réalisation, une molécule d'ARN codant pour un antigène prME de virus Zika est complexée à une émulsion cationique huile dans l'eau comprenant du DOTAP, du squalène, du trioléate de sorbitane et du polysorbate 80 dans du tampon citrate. Les émulsions cationiques huile dans l'eau appropriées pour l'administration d'une molécule d'ARN codant pour un antigène prME de virus Zika peuvent contenir environ 2 mg/ml à 7 mg/ml de DOTAP, environ 3 mg/ml à 6 mg/ml de Span 85 ; environ 3 mg/ml à 6 mg/ml de Tween 80 ; et environ 30 mg/ml à 50 mg/ml de squalène. Dans certains modes de réalisation, l'émulsion cationique huile dans l'eau, avant la complexation avec l'ARN, contient environ 4,3 % de squalène p/v, 0,5 % de Tween 80, 0,5 % de SPAN 85, et 4 mg/ml de DOTAP.
Il est également fourni un procédé de préparation d'une composition comprenant une molécule d'ARN codant pour un antigène prME de virus Zika complexée à une émulsion cationique huile dans l'eau, le procédé comprenant : (i) la fourniture d'une émulsion huile dans l'eau telle que décrite ici ; (ii) la fourniture d'une solution aqueuse comprenant la molécule d'ARN ; et
BE2017/5392 (iii) la combinaison de la solution aqueuse de (ii) et de l'émulsion huile dans l'eau de (i) , préparant de cette façon la composition. Si c'est souhaité, la solution aqueuse comprenant la molécule d'ARN peut être un tampon. Le tampon peut comprendre un ou plusieurs sels, tampons, saccharides, ou polymères. Dans un mode de réalisation préféré, le tampon comprend 560 mM de saccharose, 20 mM de NaCl, et 10 mM de citrate, qui peuvent être mélangés avec une émulsion cationique huile dans l'eau décrite ici pour produire une phase aqueuse finale qui comprend 280 mM de saccharose, 10 mM de NaCl et 10 mM de citrate.
Les systèmes d'administration de NPL et les microparticules polymères biodégradables non toxiques, et des procédés pour leur préparation sont décrits dans les références suivantes : WO 2012/006376 (systèmes d'administration de NPL et de microparticules) ; Geall et al. (2012) PNAS USA. Sep 4; 109(36): 14604-9 (système d'administration de NPL) ; et WO 2012/006359 (système d'administration de microparticules). Les NPL sont des particules liposomiques non-virions dans lesquelles une molécule d'acide nucléique (par exemple, ARN) peut être encapsulée. Les particules peuvent comprendre un peu d'ARN externe (par exemple, sur la surface des particules), mais au moins la moitié de l'ARN (et de façon idéale sa totalité) est encapsulée. Les particules liposomiques peuvent être formées, par exemple, d'un mélange de lipides zwittérioniques, cationiques et anioniques qui peuvent être saturés ou insaturés, par exemple : DSPC (zwittérionique, saturé), DlinDMA (cationique, insaturé), et/ou DMG (anionique, saturé) . Les NPL préférées pour une utilisation avec l'invention
BE2017/5392 comprennent un lipide amphiphile qui peut former des liposomes, éventuellement en combinaison avec au moins un lipide cationique (tel que DOTAP, DSDMA, DODMA, DLinDMA, DLenDMA, etc.). Un mélange de DSPC, DlinDMA, PEG-DMG et cholestérol est particulièrement efficace. D'autres NPL utiles sont décrites dans les références suivantes : WO 2012/006376 ; WO 2012/030901 ;
WO 2012/031046 ; WO 2012/031043 ; WO 2012/006378 ; WO 2013/033563 ;
WO 2015/095340 ;
WO 2016/037053. Dans certains modes de réalisation, les NPL sont des liposomes RV01, voir les références WO 2012/006376 et Geall ei al
WO 2011/076807 WO 2014/136086
WO 2013/006825 WO 2015/095346 survantes (2012) PNAS
USA. Sep 4; 109(36): 14604-9.
Compositions pharmaceutiques ; compositions immunogènes
La divulgation fournit des compositions comprenant un acide nucléique comprenant une séquence qui code pour un polypeptide du virus Zika, par exemple, un antigène prME du virus Zika. La composition peut être une composition pharmaceutique, par exemple, une composition immunogène ou une composition vaccinale. Par conséquent, la composition peut également comprendre un support pharmaceutiquement acceptable. Dans certains modes de réalisation, le virus Zika est un virus Zika de souche brésilienne.
Un « support pharmaceutiquement acceptable » comprend tout support qui n'induit pas lui-même la production d'anticorps nocifs pour l'individu recevant la composition. Les supports appropriés sont généralement des grosses macromolécules métabolisées
BE2017/5392 lentement telles que des protéines, des polysaccharides, des polyacides lactiques, des polyacides glycoliques, des acides aminés polymères, des copolymères d'acides aminés, le saccharose, le tréhalose, le lactose, et des agrégats lipidiques (tels que des gouttelettes d'huile ou des liposomes) . De tels supports sont bien connus d'une personne ayant des compétences moyennes dans le domaine. Les compositions peuvent également contenir un diluant pharmaceutiquement acceptable, tel que l'eau, le sérum physiologique, le glycérol, etc. En outre, des substances auxiliaires, telles que des agents de mouillage ou d'émulsification, des substances tampons du pH, et analogues, peuvent être présentes. Le sérum physiologique apyrogène stérile tamponné par du phosphate est un support type.
Les compositions pharmaceutiques peuvent comprendre les constructions, les séquences d'acides aminés, et/ou les séquences polypeptidiques décrites ailleurs dans ce document dans de l'eau simple (par exemple, « e.p.p.i. ») ou dans un tampon, par exemple, un tampon phosphate, un tampon Tris, un tampon borate, un tampon succinate, un tampon histidine, ou un tampon citrate. Les sels tampons seront généralement inclus dans la plage de 5 à 20 mM. Les compositions pharmaceutiques peuvent avoir un pH situé entre 5,0 et 9,5, par exemple, entre 6,0 et 8,0. Les compositions peuvent comprendre des sels de sodium (par exemple, le chlorure de sodium) pour donner la tonicité. Une concentration de 10 ± 2 mg/ml de NaCl est typique, par exemple, environ 9 mg/ml. Les compositions peuvent comprendre des chélateurs d'ions métalliques. Ceux-ci peuvent prolonger la stabilité de l'ARN en
BE2017/5392 éliminant les ions qui peuvent accélérer l'hydrolyse des phosphodiesters. Ainsi, une composition peut comprendre un ou plusieurs parmi l'EDTA, l'EGTA, le BAPTA, l'acide pentétique, etc. De tels chélateurs sont généralement présents à une concentration située entre 10 et 500 μΜ, par exemple, 0,1 mM. Un sel citrate, tel que le citrate de sodium, peut également agir comme chélateur, tout en fournissant également de façon avantageuse une activité tampon. Les compositions pharmaceutiques peuvent avoir une osmolalité située entre 200 mOsm/kg et 400 mOsm/kg, par exemple, entre 240 et 360 mOsm/kg, ou entre 290 et 310 mOsm/kg. Les compositions pharmaceutiques peuvent comprendre un ou plusieurs conservateurs, tels que le thiomersal ou le 2-phénoxyéthanol. Des compositions dépourvues de mercure sont préférées, et des vaccins dépourvus de conservateur peuvent être préparés. Les compositions pharmaceutiques peuvent être aseptiques ou stériles. Les compositions pharmaceutiques peuvent être non pyrogènes, par exemple, contenant < 1 UE (unité d'endotoxine, une mesure classique) par dose, et de préférence < 0,1 UE par dose. Les compositions pharmaceutiques peuvent être dépourvues de gluten. Les compositions pharmaceutiques peuvent être préparées sous forme de doses unitaires. Dans certains modes de réalisation, une dose unitaire peut avoir un volume situé entre 0,1 et 1,0 ml, par exemple, environ 0,5 ml.
Dans certains modes de réalisation, les compositions divulguées ici sont des compositions immunogènes qui, lorsqu'elles sont administrées à un sujet, induisent une réponse immunitaire humorale et/ou cellulaire spécifique de l'antigène (c'est-à-dire, une
BE2017/5392 réponse immunitaire qui reconnaît spécifiquement un polypeptide du virus Zika existant à l'état naturel) . Par exemple, une composition immunogène peut induire une population de lymphocytes T et/ou B à mémoire par rapport à un sujet non traité à la suite d'une infection par le virus Zika, particulièrement dans ces modes de réalisation où la composition comprend un acide nucléique comprenant une séquence qui code pour un antigène prME de virus Zika ou comprend un antigène de virus Zika. Dans certains modes de réalisation, le sujet est un vertébré, tel qu'un mammifère, par exemple, un être humain ou un mammifère vétérinaire.
Les compositions de l'invention peuvent être formulées sous la forme de compositions vaccinales. Le vaccin comprendra une quantité immunologiquement efficace d'antigène. Par « une quantité immunologiquement efficace », il est signifié que l'administration de cette quantité à un sujet, soit dans une dose unique soit faisant partie d'une série, est efficace pour induire une réponse immunitaire mesurable contre le virus Zika chez le sujet. Cette quantité varie selon l'état de santé et la condition physique de l'individu à traiter, l'âge, le groupe taxonomique de l'individu à traiter (par exemple, humain, primate non humain, etc.), la capacité du système immunitaire de l'individu à synthétiser des anticorps, le degré de protection souhaité, la formulation de la composition ou du vaccin, l'évaluation du médecin traitant de la situation médicale, la gravité de la maladie, la puissance du composé administré, le mode d'administration, et d'autres facteurs pertinents. On
BE2017/5392 s'attend à ce que la quantité se situe au sein d'une plage relativement large qui peut être déterminée à l'aide d'essais de routine. Dans un mode de réalisation, une quantité immunologiquement efficace d'un antigène du virus Zika est une quantité suffisante pour prévenir ou traiter une infection par le virus Zika. Les vaccins tels que divulgués ici peuvent être soit prophylactiques (c'est-à-dire, pour prévenir une infection) soit thérapeutiques (c'est-à-dire, pour traiter une infection), mais ils seront généralement prophylactiques Dans certains modes de réalisation, les compositions vaccinales divulguées ici peuvent induire une réponse immunitaire efficace contre une infection par le virus Zika, c'est-à-dire, une réponse suffisante pour le traitement ou la prévention d'une infection par le virus Zika.
Dans certains modes de réalisation, la composition comprend en outre un antigène supplémentaire. Dans certains modes de réalisation, la composition est administrée à un sujet en combinaison avec une autre composition qui comprend un antigène supplémentaire.
Une composition de la présente divulgation peut également comprendre, ou être administrée conjointement avec, un ou plusieurs adjuvants (par exemple, des adjuvants vaccinaux), en particulier où la composition comprend une quantité immunologiquement efficace d'un acide nucléique codant pour un antigène prME de virus Zika ou un antigène prME de virus Zika. Par « adjuvant », il est signifié qu'il est capable d'augmenter une réponse immunitaire contre un antigène comparativement à l'administration dudit antigène seul. Dans certains
BE2017/5392 aspects, les compositions d'adjuvants telles que décrites ici comprennent en outre un ou plusieurs immunostimulants, par exemple, une saponine telle que le QS21.
Les adjuvants qui peuvent être utilisés dans des compositions de l'invention comprennent, mais n'y sont pas limités : (A) des compositions contenant des minéraux, par exemple, des sels d'aluminium et de calcium, tels que des phosphates d'aluminium. (B) Des émulsions huileuses, par exemple, des émulsions squalène dans l'eau, telles que MF59 ou AS03. L'adjuvant complet de Freund (CFA) et l'adjuvant incomplet de Freund (IFA) peuvent être également utilisés. (C) Des formulations de saponines. (D) Des virosomes et des particules pseudovirales (PPV). (E) Des dérivés bactériens ou microbiens tels que des dérivés non toxiques du lipopolysaccharide (LPS) entérobactérien, des dérivés du lipide A, des oligonucléotides immunostimulants et des toxines ADP-ribosylantes et leurs dérivés détoxifiés. (F) Des immunomodulateurs humains, par exemple, des cytokines, tels que des interleukines, des interférons, le facteur de stimulation des colonies de macrophages, et le facteur de nécrose tumorale. (G) Des bioadhésifs et des mucoadhésifs, tels que des microsphères d'acide hyaluronique estérifié, des dérivés réticulés de poly(acide acrylique), polyalcool vinylique, polyvinylpyrrolidone, polysaccharides et carboxyméthylcellulose. (H) Des microparticules, par exemple, des particules de ~ 100 nm à ~ 150 pm de diamètre, de préférence ~ 200 nm à ~ 30 pm de diamètre, et de façon préférée entre toutes ~ 500 nm à ~ 10 pm de
BE2017/5392 diamètre, formées à partir de matériaux qui sont biodégradables et non toxiques (par exemple, un poly(acide α-hydroxylé), un polyacide hydroxybutyrique, un polyorthoester, un polyanhydride, une polycaprolactone, etc.), avec un poly(lactide-coglycolide) sont préférés, éventuellement traités pour avoir une surface chargée négativement (par exemple, avec du SDS) ou une surface chargée positivement (par exemple, avec un détergent cationique, tel que le CTAB). (I) Des liposomes. (J) Des formulations d'éthers de polyoxyéthylène et d'esters de polyoxyéthylène. (K) Un polyphosphazène (PCPP). (L) Des muramyl-peptides. (M) Des composés d'imidazoquinolone, par exemple, 1'Imiquimod et ses homologues.
Des combinaisons d'un ou de plusieurs des adjuvants identifiés ci-dessus peuvent être également utilisées avec l'invention.
Procédés d'utilisation/utilisations
Dans certains modes de réalisation, il est fourni des procédés pour induire une réponse immunitaire contre une infection par le virus Zika chez un sujet en ayant besoin comprenant une étape d'administration d'une quantité immunologiquement efficace d'une construction ou d'une composition telle que divulguée ici. Dans certains modes de réalisation, il est fourni l'utilisation des constructions ou des compositions divulguées ici pour induire une réponse immunitaire contre un antigène prME de virus Zika chez un sujet en ayant besoin. Dans certains modes de réalisation, il est fourni l'utilisation des constructions ou des
BE2017/5392 compositions divulguées ici pour induire une réponse immunitaire contre une infection par le virus Zika chez un sujet. Dans certains modes de réalisation, il est fourni l'utilisation de la construction ou de la composition telle que divulguée ici dans la fabrication d'un médicament qui induit une réponse immunitaire contre une infection par le virus Zika chez un sujet. Par « sujet », il est signifié un vertébré, tel qu'un mammifère, par exemple, un être humain ou un mammifère vétérinaire. Dans certains modes de réalisation, le sujet est humain. Par « réponse immunitaire », il est signifié une réponse immunologique humorale et/ou cellulaire spécifique de l'antigène (c'est-à-dire, une réponse immunitaire qui reconnaît spécifiquement un polypeptide antigénique) qui peut être démontrée comme neutralisant le virus Zika in vitro ou contrôlant/réduisant/éliminant une infection par le virus Zika in vivo.
Dans certains modes de réalisation, la réponse immunitaire est caractérisée par une mémoire immunologique contre le virus Zika et/ou une population efficace de lymphocytes T à mémoire sensible au virus Zika.
Dans certains modes de réalisation, la composition comprend une molécule d'ARN codant pour un polypeptide choisi dans le groupe constitué de SEQ ID NO : 26, SEQ ID NO : 31, SEQ ID NO : 36, SEQ ID NO : 41, SEQ ID NO : 46, SEQ ID NO : 52, SEQ ID NO : 58. Dans certains modes de réalisation, la composition comprend une molécule d'ARN codant pour un polypeptide qui est identique à au moins 70 %, au moins 75 %, au moins 80 %,
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au moi ns 85 o θ r au moins 90 %, au moins 95 %, au mo ins
96 O 0 f au moins 97 %, au moins 98 %, ou au moins 99 S- à •s a
une séquence choisie dans le groupe ; constitué de
SEQ ID NO : 23, SEQ ID NO : 31, SEQ ID NO : 36,
SEQ ID NO : 41, SEQ ID NO : 46, SEQ ID NO : 52,
SEQ ID NO : 58 . Dans certains modes de réalisation, la
composition comprend une molécule d'ARN codant pour un
polypeptide qui comprend un fragment d'une séquence
pleine longueur choisie dans le groupe constitué de
SEQ ID NO : 26, SEQ ID NO : 31, SEQ ID NO : 36,
SEQ ID NO : 41, SEQ ID NO : 46, SEQ ID NO : 52,
SEQ ID NO : 58, dans laquelle le fragment comprend une
suite contiguë de la séquence d'acides aminés de la
séquence pleine longueur de jusqu'à 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, ou 10 acides aminées plus courte que la séquence pleine longueur.
Dans certains modes de réalisation, il est fourni une construction, un vecteur, un ARN s'auto-répliquant et/ou une molécule tels que décrits ici pour une utilisation en thérapie ou médecine. Dans certains modes de réalisation, les compositions divulguées ici sont destinées à une utilisation en thérapie ou médecine. Dans un mode de réalisation préféré, la thérapie est une thérapie vaccinale. De préférence, la thérapie est un vaccin pour prévenir une infection par le virus Zika.
Dans certains modes de réalisation, il est fourni une construction, un vecteur, un ARN s'auto-répliquant et/ou une molécule tels que décrits ici pour une utilisation dans la prévention ou le traitement d'une infection par le virus Zika chez un sujet en ayant besoin
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Dans certains
Dans certains modes modes
de réalisation, les
sont destinées à une
ou le traitement d ' une
un sujet en ayant besoin
de réalisation, les
sont destinées à une
une réponse immunitaire
contre une infection par le virus Zika chez un sujet en ayant besoin.
Dans certains modes de réalisation, il est fourni une construction, un vecteur, un ARN s'auto-répliquant et/ou une molécule, et/ou une composition tels que décrits ici pour une utilisation dans un procédé d'induction d'une réponse immunitaire contre une infection par le virus Zika chez un sujet en ayant besoin.
Dans certains modes de réalisation, il est fourni des procédés pour la prévention ou le raccourcissement d'une infection par le virus Zika et/ou la réduction ou la prévention des symptômes cliniques lors d'une infection par le virus Zika chez un sujet en ayant besoin, qui comprend l'administration au dit sujet d'une quantité immunologiquement efficace d'une composition immunogène telle que fournie ici.
Dans certains modes de réalisation, il est fourni l'utilisation d'une construction ou d'une composition divulguée ici dans la fabrication d'une composition immunogène pour la prévention ou le raccourcissement d'une infection par le virus Zika chez un sujet et/ou la réduction ou la prévention des symptômes cliniques lors d'une infection par le virus Zika chez un sujet.
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Dans certains modes d'administration, il est fourni des procédés pour la prévention ou la réduction de la transmission d'une infection par le virus Zika d'un sujet à un autre. Dans des modes de réalisation spécifiques, il est fourni des procédés pour la prévention ou la réduction de la transmission d'une infection par le virus Zika à un fœtus au travers de la barrière placentaire. Dans certains modes de réalisation, une composition telle que décrite ici est administrée à une femme dans une quantité efficace pour prévenir la transmission d'une infection par le virus Zika au travers de la barrière placentaire.
Dans certains modes de réalisation, il est fourni des procédés pour l'induction d'une réponse immunitaire suffisante pour prévenir ou traiter une infection par le virus Zika chez un sujet, qui comprend l'administration au dit sujet d'une composition comprenant un(e) ou plusieurs des constructions, des vecteurs, ou des molécules d'ARN s'auto-répliquant tels que décrits cidessus dans une quantité suffisante pour prévenir ou traiter une infection par le virus Zika. Dans certains modes de réalisation, il est fourni l'utilisation d'une construction ou d'une composition divulguée ici dans la fabrication d'une composition immunogène pour la prévention ou la réduction de la transmission d'une infection par le virus Zika à un fœtus au travers de la barrière placentaire.
Dans certains modes de réalisation, il est fourni une construction, un vecteur, une molécule d'ARN s'autorépliquant, et/ou une composition tels que décrits ici pour une utilisation dans un procédé de prévention ou de
BE2017/5392 réduction de la transmission d'une infection par le virus Zika à un fœtus au travers de la barrière placentaire.
Dans certains modes de réalisation, le sujet est un sujet humain. Dans des modes de réalisation spécifiques, le sujet humain a été exposé, ou est à risque d'être exposé, à une infection par le virus Zika.
Voies d'administration/dosages
Les compositions divulguées ici seront généralement administrées directement à un sujet. L'administration directe peut être accomplie par une injection parentérale (par exemple, par voie sous-cutanée, intrapéritonéale, intraveineuse, intramusculaire, intradermique, ou dans l'espace interstitiel d'un tissu) Les variantes des voies d'administration comprennent l'administration rectale, orale (par exemple, comprimé, pulvérisation), buccale, sublinguale, vaginale, topique, transdermique ou transcutanée, intranasale, oculaire, auriculaire, pulmonaire ou autre mucosale. L'administration intradermique et intramusculaire représente les voies d'administration préférées. L'injection peut être réalisée à l'aide d'une aiguille (par exemple, une aiguille hypodermique), mais une injection sans aiguille peut être utilisée en variante. Un volume de dose intramusculaire humaine type est de 0,5 ml.
Une dose d'un acide nucléique (par exemple, un vaccin à base d'acide nucléique, tel qu'un vaccin à base de SAM contre le virus Zika) peut comporter environ 50 pg à environ 100 pg d'acide nucléique. Dans un mode de réalisation, une dose de vaccin à base de SAM contre le
BE2017/5392 virus Zika contient 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 ou 100 pg d'ARN. Dans d'autres modes de réalisation, une dose d'un vaccin à base de SAM contre le virus Zika peut comporter < 10 pg d'acide nucléique, par exemple, de 1 à 10 pg, comme environ 1 pg, 2,5 pg, 5 pg, 7,5 pg ou 10 pg, mais une expression peut être observée à des taux bien plus bas ; par exemple, en utilisant < 1 pg/dose, < 100 ng/dose, < 10 ng/dose, < 1 ng/dose, etc. De façon similaire, une dose d'un antigène protéinique peut comporter < 10 pg de protéine ; par exemple, de 1 à 10 pg, comme environ 1 pg, 2,5 pg, 5 pg,
7,5 pg ou 10 pg.
Dans des modes de réalisation préférés, un vaccin ou une composition vaccinale à base de SAM contre le virus Zika est administré à un sujet à une dose efficace, ce qui signifie une dose suffisante pour obtenir une réponse immunitaire souhaitée, comme l'induction d'anticorps neutralisants dirigés contre le virus Zika et/ou une protection contre une infection par le virus Zika.
Dans certains modes de réalisation, un vaccin à base de SAM contre le virus Zika décrit ici a une dose efficace qui est inférieure ou égale à 50 %, 40 %, 30 %, 20 % ou 10 % de la dose efficace d'un vaccin ou d'une composition vaccinale à base d'ADN codant pour le même antigène. Dans certains modes de réalisation, un vaccin à base de SAM contre le virus Zika décrit ici a une dose efficace qui est d'un tiers ou moins de la dose efficace d'un vaccin ou d'une composition vaccinale à base d'ADN codant pour le même antigène.
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Procédés de fabrication/formulation
Des procédés de fabrication d'ARN s'auto-répliquant sont fournis ici. Dans certains modes de réalisation, le procédé de fabrication d'un ARN s'auto-répliquant comprend une étape de transcription in vitro (TIV) telle que décrite ailleurs dans ce document. Dans certains modes de réalisation, le procédé de fabrication d'un ARN s'auto-répliquant comprend une étape de TIV pour produire un ARN, et comprend en outre une étape de combinaison de l'ARN avec un système d'administration non viral tel que décrit ailleurs dans ce document. Dans certains modes de réalisation, le procédé de fabrication d'un ARN s'auto-répliquant comprend une étape de TIV pour produire un ARN, et comprend en outre une étape de combinaison de l'ARN avec un système d'administration de NEC tel que décrit ailleurs dans ce document.
Identité des séquences
L'identité ou l'homologie par rapport à une séquence d'acides aminés est définie ici comme le pourcentage de résidus d'acides aminés dans la séquence candidate qui sont identiques à la séquence d'acides aminés de référence après l'alignement des séquences et l'introduction de brèches, si nécessaire, pour obtenir le pourcentage d'identité de séquence maximal, et en ne considérant aucune des substitutions conservatives quelconques comme faisant partie de l'identité de la séquence. L'identité ou l'homologie par rapport à une séquence d'acide nucléique est définie ici comme le pourcentage de nucléotides dans la séquence candidate qui sont identiques à la séquence d'acide nucléique de
BE2017/5392 référence après l'alignement des séquences et l'introduction de brèches, si nécessaire, pour obtenir le pourcentage d'identité de séquence maximal.
L'identité de séquence peut être déterminée par des procédés classiques qui sont couramment utilisés pour comparer la similarité en position des acides aminés de deux polypeptides. En utilisant un programme informatique tel que BLAST, deux polypeptides sont alignés pour une correspondance optimale de leurs acides aminés respectifs (soit tout le long de la pleine longueur de l'une ou des deux séquences soit tout le long d'une partie prédéterminée de l'une ou des deux séquences) . Les programmes fournissent une pénalité d'ouverture par défaut et une pénalité de brèche par défaut, et une matrice de score telle que PAM 250 [une matrice de score classique ; voir Dayhoff ei al., dans Atlas of Protein Sequence and Structure, vol. 5, supp. 3 (1978)] peut être utilisée conjointement avec le programme informatique. Par exemple, le pourcentage d'identité peut être ensuite calculé comme : le nombre total de correspondances identiques multiplié par 100 et ensuite divisé par la somme de la longueur de la séquence la plus longue au sein de la plage de correspondance et le nombre de brèches introduites dans les séquences plus courtes enfin d'aligner les deux séquences. Les mêmes procédés utilisés pour comparer des polypeptides peuvent être également utilisés pour calculer le pourcentage d'identité de deux séquences polynucléotidiques.
Lorsque la présente divulgation se rapporte à une séquence par référence à un code d'accession UniProt ou Genbank, la séquence à laquelle il est fait référence
BE2017/5392 est la version en cours à la date de dépôt de la présente demande.
Généralités
Sauf explication contraire, tous les termes techniques et scientifiques utilisés ici ont la même signification que celle couramment comprise par une personne de compétence moyenne dans le domaine auquel cette divulgation appartient. Les termes au singulier « un », « une », « le » et « la » comprennent les articles au pluriel sauf si le contexte indique clairement le contraire. De façon similaire, le mot « ou » est censé comprendre « et » sauf si le contexte indique clairement le contraire. Le terme « pluralité » se rapporte à deux ou plus. En outre, les limitations numériques données par rapport à des concentrations ou des taux d'une substance, comme des concentrations ou des rapports de composants de solution de celle-ci, et les conditions de réaction telles que les températures, les pressions et les temps des cycles sont censés être approximatifs. Le terme « environ » utilisé ici est censé signifier la quantité ± 10 %.
Le terme « comprend » signifie « inclut ». Ainsi, sauf si le contexte dicte le contraire, le mot « comprend », et des variations telles que « comprendre » et « comprenant » seront compris comme impliquant l'inclusion d'un composé ou d'une composition indiqué (par exemple, un acide nucléique, un polypeptide, un antigène) ou d'une étape, ou d'un groupe de composés ou d'étapes, mais pas l'exclusion de tout autre composé, composition, étape ou groupe de ceux-ci. Les modes de
BE2017/5392 réalisation décrits comme comprenant certains composants sont censés inclure des modes de réalisation constitués des composants indiqués.
L'abréviation « e.g. » est dérivée du latin exempli gratia, et est utilisée ici pour indiquer un exemple non limitant. Ainsi, l'abréviation « e.g. » est synonyme du terme « par exemple ».
L'invention sera en outre décrite en référence aux figures et aux exemples non limitants suivants.
EXEMPLES
Exemple 1 - Résumé du projet
Les présents inventeurs ont entreprise des travaux sur un vaccin contre le virus Zika en utilisant la plateforme SAM - ARNm s'auto-amplifrant (SAM) synthétique dérivé du génome d'alphavirus, exprimant des antigènes d'intérêt. Les constructions de SAM sont évaluées pour une production rigoureuse et une antigénicité des antigènes et en outre testées pour leur immunogénicité et efficacité en utilisant des modèles in vivo.
Procédés
Le vecteur de SAM VEE TC-83 a été utilisé comme construction contextuelle pour le clonage dans les exemples. Voir SEQ ID NO : 24.
Exemple 2 - Sélection de l'antigène
Le génome de Flavivirus est constitué d'ARN simple brin coiffé de polarité positive d'une longueur d' approximativement 11,3 kb (figure 1) . Le quart
BE2017/5392 proximal en 5' du génome code pour les protéines structurales de la capside (c), prémembranaire (prM), et de l'enveloppe (E) . Les protéines non structurales NSI, NS2A, NS2B, NS3, NS4A, NS4B, et NS5 sont impliquées dans la réplication de l'ARN viral. La région codante est flanquée de régions non traduites en 5' et 3' (UTR en 5' et 3') d'une longueur d'approximativement 100 et 600 nucléotides, respectivement. La traduction du génome viral produit un polypeptide unique qui est traité en protéines individuelles par une combinaison de protéases cellulaires et d'une protéase virale constituée d'une sous-unité catalytique, NS3, et de son cofacteur, NS2B.
Les protéines structurales prM et E sont insérées de façon cotraductionnelle dans la membrane du réticulum endoplasmique (RE) et traitées par des signaux peptidases, produisant des protéines qui encapsident la protéine C conjointement avec l'ARN viral, par bourgeonnement dans la lumière du RE (figure 2) . A une étape ultérieure dans la maturation virale, la protéine prM sur ces particules est clivée en protéine M mature par une protéase furine cellulaire avant la libération depuis la cellule. Ce clivage de la protéine prM est nécessaire pour l'infectivité des virions libérés. En plus des virions infectieux, les cellules infectées par le fiavivirus libèrent des particules sous-virales (PSV) (figure 2) . Ces particules sont plus petites que les virions, mais contiennent la protéine E et la protéine prM/Μ importantes d'un point de vue antigénique, ce qui est essentiel pour un repliement correct et 1 ' incorporation de la protéine E dans les PSV et les particules virales. Toutefois, à la différence des
BE2017/5392 virions, les PSV ne contiennent ni la protéine C ni le génome viral, et sont ainsi non infectieuses. Les PSV peuvent être produites dans divers systèmes par la coexpression des protéines prM et E, et les PSV partagent des propriétés avec les virus de type sauvage, telles que l'activité fusogène et l'induction d'une réponse immunitaire neutralisante et il a été démontré de façon répétée qu'elles stimulent les réponses immunitaires protectrices contre un certain nombre de maladies dues aux flavivirus. Les présents inventeurs ont choisi les protéines structurales du virus Zika, à savoir, prM et E, et dans certains cas, C, pour une autre expérimentation.
Exemple 3 - Sélection de la souche
Les séquences d'acides aminés des protéines C-prME provenant des souches de virus Zika (disponibles auprès du NCBI/Genbank) issues d'épidémies de Zika dans le monde entier depuis 2007 ont été alignées pour chercher les similarités et les différences (figure 3). Celles-ci comprenaient la souche de la lignée africaine d'origine d'Ouganda, de Micronésie (2007), de Polynésie française (2013), les souches brésiliennes depuis 2016 (figure 3). En outre, sept souches de virus Zika provenant de diverses régions du Brésil, ont été également comparées pour des différences d'acides aminés dans la région CprME (figure 4). Une conservation élevée a été observée parmi les souches issues de différentes épidémies, avec les souches brésiliennes presque identiques dans la région CprME. La souche de Natal, Bahia (KU527068) a été choisie comme la souche représentative. KU527068 a été
BE2017/5392 l'une des premières souches à être isolée du cerveau d'un fœtus présentant une microcéphalie.
Exemple 4 - Conception des constructions
La conception des constructions Zika-SAM de la figure 5 comprend le clonage de la séquence codant pour les protéines structurales prémembranaire (prM) et de l'enveloppe (E) du virus Zika (souche de Natal, Brésil) [avec ou sans la capside (C)], sous le promoteur subgénomique dans un vecteur de SAM. Une série de modifications a été effectuée sur les constructions SAMprME (tableau 1, figure 6 et figure 7) . Celles-ci comprennent :
i. L'optimisation des codons de la séquence codante pour l'antigène (CO-prME ou CO-CprME).
ii. Modifications génétiques dans le peptide signal natif de la prM (figure 6). En plus du traitement protéolytique par les signaux peptidases, la protéase virale NS3/NS2B est également impliquée dans la maturation des protéines structurales. La jonction de la région C et prM subit deux événements de clivage protéolytique durant la maturation. Un clivage libère la protéine C de sa séquence d'ancrage transmembranaire et est dépendant de l'activité NS2B/NS3. Un second clivage se produit à l'extrémité de la séquence d'ancrage de la protéine C dans la lumière du RE par un signal peptidase cellulaire et produit l'extrémité N-terminale de la prM. Des études antérieures concluent que le traitement par la protéase virale, sans tenir compte de la présence du site de clivage du signal peptidase, est nécessaire pour une sécrétion efficace des particules virales. Toutefois,
BE2017/5392 dans certains flavivirus, lorsque cette séquence obligatoire de clivages a été découplée dans un virus mutant, il y a eu une incorporation grandement réduite des virions dans les membranes bourgeonnantes et une augmentation de la libération des particules sousvirales (Lobigs et al (2004) Inefficient signalase cleavage promotes efficient nucleocapsid incorporation into budding flavivirus membranes, J Virol. 2004 Jan; 78(1) : 178-86) .
iii. Remplacement du peptide signal natif de la prM par un peptide signal hétérogène pour amplifier la production de PSV. Les présents inventeurs ont utilisé le peptide signal de 1'IgGl utilisé auparavant pour le clivage et la sécrétion des protéines IgG ou Fab (Ciferri et al. (2015) Antigenic Characterization of the HCMV gH/gL/gO and Pentamer Cell Entry Complexes Reveals Binding Sites for Potently Neutralizing Human Antibodies, PLoS Pathog. Oct 20; 11(10): el005230).
iv. La protéine de la capside (C) du virus Zika est incorporée dans d'autres constructions pour tester si la présence d'une protéine de la capside clivable augmente l'efficacité de la production des PSV (figure 7) . Ceci comprend le clivage médié par la protéine 2A (P2A) du teschovirus-1 porcin de la protéine C en l'absence de la protéase virale.
Tableau 2
Constructions SAM-Zika.
No . Insert SAM Description
1 WT-prME Séquences de prM et E de type sauvage
2 CO-prME Séquences de prM et E optimisées pour les codons
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3 CO-prME- ESS . 1 Identique à CO-prME mais avec une séquence signal amplifiée (ESS) - mutation PQAQA dans la région C du peptide signal de la prM pour favoriser les PPV
4 CO-prME- ESS . 2 Identique à CO-prME mais avec une ESS - la séquence du peptide signal de la prM est remplacée par la séquence du peptide signal d'IgG pour favoriser les PPV
5 CO-CprME.1 Identique à CO-prME mais exprimant également la protéine de la capside du virus Zika avec les sites de clivage natifs des protéines C et prM
6 CO-CprME.2 Identique à CO-prME mais exprimant également la protéine de la capside du virus Zika avec la mutation PQAQA dans la région C du peptide signal
7 CO-CprME.3 Identique à CO-prME mais exprimant également la protéine de la capside du virus Zika avec un site de la P2A inséré après le site de clivage natif de la NS2B-3
Légende : WT - type sauvage ; CO - optimisée pour les codons. Les constructions sont dans le vecteur de SAM décrit ailleurs. Les séquences Zika sont dérivées de la souche de Natal (Brésil) - KU527068.1, sauf indication contraire.
Evaluation/conception de l'étude
Les constructions sont évaluées dans des cellules de mammifères à la suite d'une électroporation de l'ARN 5 de Zika-SAM dans des cellules BHK en utilisant les procédés suivants :
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a. La réplication-puissance de l'ARN de SAM des constructions SAM-Zika est testée en utilisant des anticorps dirigés contre l'ARNdb et par FACS.
b. L'expression des antigènes est déterminée par des immunoblots et des tests d'immunofluorescence, pour étudier la protéine prM et E clivée dans les lysats cellulaires et le surnageant cellulaire.
c. La production des PSV est testée dans des cellules de mammifères en utilisant des procédures établies pour l'isolement de PSV à partir d'un surnageant cellulaire.
A la suite de l'identification des constructions candidates les plus efficaces, la formulation dans des systèmes d'administration à base de NPL/NEC est réalisée et l'analyse pour l'antigénicité et l'immunogénicité est réalisée in vivo.
Exemple 5 - Expression et sécrétion des constructions Zika-SAM
La capacité des cellules à exprimer et sécréter la protéine E du virus Zika à partir des constructions ZikaSAM décrites ci-dessus a été évaluée selon les procédés suivants.
Au jour 0, des cellules BHK ont été plaquées à 8 x 106 dans des flacons T225 dans du milieu de croissance. Pour la trypsination, le milieu a été prélevé et les cellules ont été lavées avec 5 ml de PBS. Le liquide de lavage de PBS a été prélevé, et 5 ml de trypsine pré-chauffée ont été ajoutés et répartis soigneusement sur toute la plaque. La trypsine a été prélevée et les plaques ont été maintenues à 37 degrés C
BE2017/5392 pendant 1 à 2 min. Les cellules ont été ensuite remises en suspension dans 10 ml de milieu de croissance (5 % de FBS) . Les cellules ont été dénombrées et plaquées à la concentration requise dans un nouveau flacon. Les cellules ont été incubées à 37 degrés C, 5 % de CCg pendant environ 20 heures.
Au jour 1, les plaques ont été préparées en ajoutant 2 ml de DMEM + 1 % de FBS + P/S (milieu d'excroissance) dans chaque puits d'une plaque de 6 puits (un puits par électroporation). Les plaques ont été maintenues au chaud dans un incubateur à 37 degrés C. L ' électroporateur a été préparé pour administrer 120 V, impulsion de 25 ms, intervalle de 0,0 impulsion, 1 impulsion pour une cuvette de 2 mm. Les cuvettes ont été marquées et maintenues sur de la glace. Les cellules en phase de croissance ont été récoltées comme la normale dans du milieu BHK (croissance) et dénombrées en utilisant un hémocytomètre. Les cellules ont été trypsinées en suivant le même protocole de trypsination que ci-dessus. Les électroporations des étalons et du témoin négatif ont été également préparées.
Les cellules ont été centrifugées à 1500 tr/min (462 x g) pendant 5 min. Le milieu a été aspiré, et les cellules ont été lavées une fois avec 20 ml de milieu Opti-MEM froid. Les cellules ont été à nouveau centrifugées à 1500 tr/min (462 x g) pendant 5 min. Le milieu a été aspiré, et les cellules ont été remises en suspension dans du milieu Opti-MEM jusqu'à 0,25 ml par électroporation.
Pour chaque échantillon, 4000 ng d'ARN ont été mélangés avec 250 μΐ de cellules, et le mélange a été
BE2017/5392 pipeté doucement 4 à 5 fois. Les cellules et le mélange d'ARN ont été transférés dans des cuvettes de 2 mm et soumis à une impulsion d'électroporation en utilisant les paramètres décrits ci-dessus. Les cellules ont été laissées reposer à température ambiante pendant 10 min. Les cellules provenant d'une cuvette ont été ajoutées à un puits d'une plaque de 6 puits préchauffée, et la plaque a été inclinée d'avant en arrière et ensuite d'un côté à l'autre selon un angle de 45° pour répartir les cellules uniformément.
Au jour 2 (30 h post-électroporation) , le surnageant a été recueilli. Une aliquote de 75 μΐ a été prélevée pour l'analyse Western blot, 25 μΐ de tampon NuPAGE 4X ont été ajoutés à 1'aliquote (aucun agent réducteur), et 1'aliquote a été stockée à -20 degrés C. Le reste du surnageant a été stocké à -80 degrés C.
Les cellules ont été lavées une fois avec du PBS glacé, et ensuite grattées dans 200 μΐ de tampon RIPA contenant un cocktail d'inhibiteurs des protéases (1 comprimé dans 10 ml) tout en maintenant la plaque sur de la glace. Le tampon contenant les cellules a été recueilli dans des tubes de microcentrifugeuse, et soumis à deux cycles de congélation décongélation sur de la glace sèche. Les échantillons ont été brièvement passés au vortex, et centrifugés à 8000 tr/min pendant 5 min. Les culots ont été jetés et les surnageants ont été retenus. 25 μΐ de tampon NuPAGE 4X ont été ajoutés à une aliquote de 75 μΐ des lysats pour l'analyse Western blot. Les aliquotes ont été stockées à -20 degrés C. Le reste des lysats a été stocké à -80 degrés C.
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Concentration et filtration de l'espèce protéine E du virus Zika à partir du surnageant cellulaire
Les surnageants cellulaires provenant des transfections simples (1 million de cellules, 4000 ng d'ARN, 30 h post-électroporation) ont été chargés, 500 μΐ chacun, dans la chambre supérieure de dispositifs de filtres à centrifuger Amicon Ultra-0.5, 100 K (LMMN de 100 000) . Les dispositifs des filtres à centrifuger ont été centrifugés à 14 000 x g pendant 10 minutes chacun. Après chaque centrifugation, la fraction non retenue a été recueillie dans un tube séparé. Après centrifugation, les échantillons demeurant dans la chambre supérieure ont été en outre lavés par mélange avec 500 μΐ de tampon HEPES 20 mM, pH = 7,4, et centrifugation à nouveau à 14 000 x g pendant 10 minutes chacun.
Les échantillons finals demeurant dans la chambre supérieure, environ 35 à 40 μΐ, ont été centrifugés dans un tube Eppendorf frais selon les instructions du fabricant. Cinq μΐ de cet échantillon ont été mélangés avec 5 μΐ de tampon NuPAGE 4X pour 1'immunoblot, et les échantillons restants ont été stockés à -80 degrés C. En outre, 75 μΐ de la fraction non retenue ont été mélangés avec 25 μΐ du tampon NuPAGE 4X pour 1'immunoblot, et la fraction non retenue restante a été sauvegardée à 80 degrés C.
Immunoblot μΐ des surnageants des cultures cellulaires et 15 μΐ des lysats cellulaires (ou 10 μΐ des surnageants concentrés et 15 μΐ de la fraction non retenue) ont été
BE2017/5392 passés sur un gel de SDS-PAGE à 4 à 12 % (Bis-Tris) dans le tampon de migration MOPS IX. Les échantillons séparés ont été transférés sur des membranes de nitrocellulose. Les membranes ont été bloquées pendant 2 à 3 heures dans du PBS-Tween 20 + 5 % de lait. L'anticorps primaire 4G2 de flavivirus a été ajouté à une dilution au 1/120 dans du PBS-T-lait et les membranes ont été incubées pendant une nuit à 4 degrés C. Les membranes ont été ensuite lavées 3 fois pendant 10 minutes à chaque fois dans du PBS-T. Un anticorps secondaire anti-souris (Odyssey® anti-Mouse 800CW-green (LI-COR, Inc., Lincoln, NE) à 1/5000) dans du tampon de blocage LI-COR a été ensuite ajouté, et les membranes ont été incubées pendant 1 heure Les membranes ont été lavées trois fois pendant 2 minutes à chaque fois, et ensuite lues sur un imageur LI-COR Odyssey® (LI-COR, Inc., Lincoln, NE) au canal 800, intensité moyenne.
Résultats
L'expression de la protéine E du virus Zika a été détectable par immunoblot dans tous les lysats provenant des cellules électroporées avec les constructions ZikaSAM ou avec le témoin positif SAM-YFV (figure 8) . L'expression de la protéine E du virus Zika n'a pas été détectée dans la construction SAM-RSV ou les témoins négatifs pseudo-infectés. Toutefois, la sécrétion de la protéine E du virus Zika a été détectable par immunoblot uniquement dans les surnageants de la construction No. 1 (type sauvage, WT), de la construction No. 2 (optimisée pour les codons, CO), de la construction No. 4 (optimisée pour les codons avec peptide signal d'IgG, CO-prMEBE2017/5392
ESS.2), et de la construction No. 7 (optimisée pour les codons avec la protéine de la capside du virus Zika et le site de la P2A, CO-CprME.3).
La filtration du surnageant à travers des filtres avec un seuil de coupure de 100 kD et 1 ' immunoblot a montré que presque la totalité de la protéine E a été retenue dans le filtre et qu'il n'y a pas eu de protéine E détectable dans la fraction non retenue (figure 9) . Ceci a indiqué que la protéine E détectée dans le surnageant peut faire partie d'une structure moléculaire de masse moléculaire supérieure, vraisemblablement des PSV.
Exemple 6 - Emulsions cationiques huile dans l'eau
Des nanoémulsions cationiques (NEC) ont été préparées essentiellement selon les procédés décrits dans Brito et al., Molecular Therapy, Vol. 22, No. 12, pp. 2118-29 (2014) et la publication de brevet international WO 2013006834.
En bref, du squalène (Sigma, St. Louis, MO) a été chauffé à 37 °C, et du DOTAP (Lipoïde, Ludwigshafen Allemagne) a été dissous directement dans le squalène en présence de trioléate de sorbitane (SPAN 85 ; Sigma, St. Louis, MO) . La phase huileuse résultante a été ensuite combinée avec la phase aqueuse (Tween 80 ; Sigma, St. Louis, MO, dans du tampon citrate) et homogénéisée immédiatement pendant 2 min en utilisant un homogénéiseur T25 (IKA, Wilmington, NC) à 24K tr/min pour produire une émulsion primaire. Les émulsions primaires ont été passées trois à cinq fois à travers un microfluidiseur M-110S ou un microfluidiseur M-110P
BE2017/5392 (Microfluidics, Newton, MA) avec un serpentin de refroidissement dans un bain de glace à une pression d'homogénéisation d'approximativement 15K à 20K PSI (1000 à 1400 bars) . Les échantillons des lots ont été prélevés de l'unité et stockés à 4 °C. La formulation de NEC utilisée dans les présents exemples contient 4 mg/ml de DOTAP ; 4,7 mg/ml de Span 85 ; 4,7 mg/ml de Tween 80 ; et 39 mg/ml de squalène.
Exemple 7 - Préparation des complexes ARN-NEC
1. Synthèse de l'ARN
Les constructions Zika-SAM contiennent un promoteur du bactériophage T7 localisé en amont de l'ADNc d'alphavirus pour faciliter la synthèse de l'ARN du réplicon in vitro. L'ARN de SAM-Zika pour la construction No. 1 (codant pour les séquences des protéines prM et E de type sauvage du virus Zika (WTprME) ) et la construction No. 2 (codant pour les séquences des protéines prM et E optimisées pour les codons (CO-prME)), a été synthétisé en utilisant des techniques de biologie moléculaire classiques. En bref, les ADN plasmidiques codant pour les constructions ZikaSAM ont été linéarisés par digestion avec des endonucléases au niveau d'un site unique localisé à l'extrémité 3' de la séquence du réplicon. L'ADN linéarisé a été ensuite transcrit en ARN par synthèse in vitro en utilisant une T7 ARN polymérase en présence de l'ADN matrice et des nucléosides triphosphates (ATP, CTP, GTP et UTP). A la suite de la transcription, l'ADN matrice a été digéré avec de la DNase, et les transcrits d'ARN ont été purifiés par précipitation au LiCl et
BE2017/5392 reconstitués dans de l'eau dépourvue de nucléase. L'ARN a été ensuite coiffé en utilisant le système de coiffage de la vaccine (New England BioLabs, Ipswich, MA) et purifié par précipitation au LiCl. La concentration de l'ARN dans chaque réaction a été déterminée par spectrophotométrie. Avant la complexation de l'ARN, l'ARN a été dilué à une concentration de 300 pg/ml dans du tampon citrate (10 mM de citrate pH 6,2, 20 mM de NaCl, 560 mM de saccharose).
2. Complexation de l'ARN
L'ARN de Zika-SAM a été complexé avec des particules de nanoémulsion cationique (NEC) essentiellement comme il est décrit dans Brito et al., Molecular Therapy, Vol. 22, No. 12, pp. 2118-29 (2014). En bref, l'ARN de Zika-SAM (300 pg/ml dans du tampon citrate) a été ajouté un volume égal de la NEC produite dans l'exemple 6, mélangé, et laissé se complexer sur de la glace pendant 30 minutes à 2 heures. La concentration finale de l'ARN complexé à la NEC était de 150 pg/ml.
Le rapport de l'ARN sur le lipide cationique peut être exprimé en rapport N/P, défini comme la quantité (moles) de phosphates (P) sur l'ARN. Le DOTAP, par exemple, a un azote qui peut être protoné par molécule. La concentration de l'ARN a été utilisée pour calculer la quantité de phosphate en solution en utilisant une estimation de 3 nmol de phosphate par microgramme d'ARN. Les formulations de NEC décrites ci-dessus ont un rapport N/P de 6,3/1.
Exemple 8 - Immunogénicité et protection in vivo des formulations de NEC de Zika-SAM
BE2017/5392
Des souris BALB/c femelles (âgées de 6 à 12 semaines ; The Jackson Laboratory), ont été logées et nourries à l'animalerie du Vaccine Research Center, NIAID, NIH, Bethesda, MD. Toutes les expériences animales ont été décrites et approuvées par l'Animal Care and Use Committee du VRC, NIAID, NIH. Tous les animaux ont été logés et soignés conformément aux règles locales, de l'Etat, fédérales, et constitutionnelles dans un établissement accrédité par 1'American Association for Accreditation of Laboratory Animal Care au NIH.
Les souris ont été immunisées deux fois selon la conception de l'étude présentée dans le tableau 2. En bref, il a été administré à des groupes de 10 souris chacun des formulations de NEC contenant les constructions d'ARN de Zika-SAM No. 1 ou No. 2. En tant que témoin positif, un autre groupe de souris a reçu 50 pg d'un vaccin à base d'ADN contre le virus Zika (construction No. 5283, telle que décrite dans Dowd et al., Science, Vol. 354 Issue 6309, pp. 237-40 (2016)) par électroporation intramusculaire. Toutes les souris ont été soumises à une épreuve par injection intrapéritonéale (i.p.) de virus Zika vivant au jour 49.
Tableau 2
Conception de l'étude sur les souris
Groupe n Admi nistration Construction Immunisation Jour 0 Immunisation jour 21 Epreuve Jour 49
1 10 CNE56 / ARN CO.prME 15 pg 15 pg 100 PFU, IP
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2 10 CNE56 / ARN CO.prME 1,5 pg 1,5 pg 100 IP PFU,
3 10 CNE56 / ARN WT.prME 15 pg 15 pg 100 IP PFU,
4 10 CNE56 / ARN WT.prME 1,5 pg 1,5 pg 100 IP PFU,
5 10 Electroporation/ ADN 5283 50 pg 50 pg 100 IP PFU,
Les sérums sanguins ont été prélevés au jour 0, ainsi que 2 semaines après la première immunisation, 2 semaines après la seconde immunisation, et trois jours après l'épreuve avec le virus Zika.
Les titres en anticorps neutralisants pour le virus Zika ont été mesurés par le test de neutralisation des particules virales rapporteurs (PVR) selon des procédés décrits dans Dowd, KA et al. Cell Rep. 16(6) : 1485-9 (2016). Les résultats sont présentés sur la figure 10. Deux semaines après la première immunisation avec les constructions Zika-SAM No. 1 ou No. 2 ou la construction d'ADN de virus Zika témoin positif, il y avait des taux significatifs d'anticorps neutralisants pour le virus Zika détectés dans les sérums des souris immunisées. Les taux d'anticorps neutralisants pour le virus Zika ont été supérieurs deux semaines après la seconde immunisation avec la même construction Zika-SAM ou le témoin positif.
Un effet dépendant de la dose a été observé, avec la dose de 15 pg des constructions Zika-SAM No. 1 et No. 2 produisant des taux supérieurs d'anticorps neutralisants par rapport à la dose de 1,5 pg. Notamment, la dose de 15 pg des constructions Zika-SAM No. 1 et
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No. 2 a produit une réponse en anticorps neutralisants qui a été comparable à la dose de 50 pg de la construction du vaccin à base d'ADN du virus Zika (ADN No. 5283) . Ces résultats indiquent que les constructions Zika-SAM No. 1 et No. 2 sont capables d'induire une réponse significative en anticorps neutralisants contre le virus Zika.
Au jour 49 de l'étude, les souris ont été soumises à une épreuve avec des injections intrapéritonéales de virus Zika vivant (souche PRVABC57) à une dose de 100 unités formant une plaque (PFU). Les échantillons de sérum ont été prélevés trois jours après l'épreuve, et les charges virales ont été déterminées par PCR quantitative en temps réel (qPCR) du gène de la capside du virus Zika.
Comme il est représenté sur la figure 11, les souris vaccinées avec les constructions Zika-SAM No. 1 ou No. 2 (doses de 1,5 ou 15 pg) ou la construction témoin positif (ADN No. 5283) ont montré de façon marquée une réduction du virus Zika détecté dans le sérum comparativement aux animaux non vaccinés. Ces résultats indiquent que les constructions Zika-SAM No. 1 et No. 2 sont capables de produire une réponse immunitaire protectrice contre une infection par le virus Zika.
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Claims (39)

  1. REVENDICATIONS
    1. Construction de vaccin à base d'acide nucléique codant pour un polypeptide comprenant un antigène prME pleine longueur du virus Zika, ou l'un de ses fragments immunogènes ou variants.
  2. 2. Construction selon la revendication 1, dans laquelle ledit acide nucléique est un ARN comprenant la région codante pour l'antigène.
  3. 3. Construction selon l'une quelconque des revendications 1 ou 2, dans laquelle la construction est optimisée pour les codons.
  4. 4. Construction selon l'une quelconque des revendications 1 à 3 comprenant une séquence signal de la prM.
  5. 5. Construction selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, comprenant en outre une séquence signal mutée de la prM pour un clivage amplifié de la prM.
  6. 6. Construction selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, comprenant en outre une séquence signal d'IgG.
  7. 7. Construction selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, comprenant en outre une séquence de la capside optimisée pour les codons.
  8. 8. Construction selon l'une quelconque des revendications 1 à 7, comprenant en outre une séquence de clivage de la protéine 2A du teschovirus-1 porcin.
  9. 9. Construction selon l'une quelconque des revendications 1 à 8, dans laquelle ladite construction
    BE2017/5392 comprend une séquence d'acide nucléique choisie dans le groupe constitué de :
    (a) une séquence d'acide nucléique codant pour un polypeptide comprenant la séquence d'acides aminés de SEQ ID NO : 26 ; SEQ ID NO : 31 ; SEQ ID NO : 36 ; SEQ ID NO : 41 ; SEQ ID NO : 46 ; SEQ ID NO : 52 ; et SEQ ID NO : 58 ;
    (b) une séquence d'acide nucléique comprenant la séquence d'ADN de SEQ ID NO : 25 ; SEQ ID NO : 30 ;
    SEQ ID NO : 35 ; SEQ ID NO : 40 ; SEQ ID NO : 45 ;
    SEQ ID NO : 51 ; et SEQ ID NO : 57 ;
    (c) une séquence d'acide nucléique comprenant la séquence d'ARN correspondant à la séquence d'ADN de SEQ ID NO : 77 ; SEQ ID NO : 78 ; SEQ ID NO : 79 ; SEQ ID NO : 80 ; SEQ ID NO : 81 ; SEQ ID NO : 82 ; et SEQ ID NO : 83 ; et (d) un variant ou un fragment de (a) à (c).
  10. 10. Vecteur comprenant la construction selon l'une quelconque des revendications 1 à 9.
  11. 11. Molécule d'ARN s'auto-répliquant comprenant la construction selon l'une quelconque des revendications 1 à 9.
  12. 12. Molécule d'ARN s'auto-répliquant codant pour un antigène comprenant une séquence d'acide nucléique choisie dans le groupe constitué de SEQ ID NO : 70, SEQ ID NO : 71, SEQ ID NO : 72, SEQ ID NO : 73, SEQ ID NO : 74, SEQ ID NO : 75, et SEQ ID NO : 76.
  13. 13. Molécule d'ADN codant pour la molécule d'ARN s'auto-répliquant selon les revendications 11 ou 12 comprenant une séquence d'acide nucléique choisie dans le groupe constitué de SEQ ID NO : 63, SEQ ID NO : 64,
    BE2017/5392
    SEQ ID NO : 65, SEQ ID NO : 66,
    SEQ ID NO : 68, et SEQ ID NO : 69.
  14. 14. Composition comprenant
    SEQ ID NO : 67, une quantité immunologiquement efficace d'un(e) ou de plusieurs des constructions revendications 1 revendication 10 selon l'une quelconque des à 9 ; du vecteur selon la ; ou de la molécule d'ARN s'autorépliquant selon les revendications 11 ou 12.
  15. 15. Composition selon la comprenant un vaccin à base d'ARN.
  16. 16. Composition revendication 14 revendication 15 selon la comprenant une molécule d'ARN s'auto-répliquant.
  17. 17. Composition selon la revendication 16, dans laquelle la molécule d'ARN s'auto-répliquant comprend une séquence choisie dans le groupe constitué de SEQ ID NO : 71, SEQ ID NO : 72,
    SEQ ID NO : 74, SEQ ID NO : 75, et
    ID NO : 70, ID NO : 73, ID NO : 76.
  18. 18. Composition selon l'une quelconque des revendications 14 à 17, dans laquelle la composition comprend un matériau d'administration non viral, tel qu'une émulsion cationique huile dans l'eau submicronique ; un liposome ; ou un système d'administration de microparticules polymères biodégradables.
  19. 19. Composition selon la revendication 18, dans laquelle l'émulsion cationique huile dans l'eau submicronique comprend un noyau huileux, un lipide cationique, et un tensioactif.
  20. 20. Composition selon l'une quelconque des revendications 14 à 19 dans laquelle la composition
    BE2017/5392 comprend en outre une ou plusieurs séquences d'acide nucléique qui codent pour un ou plusieurs antigènes supplémentaires et/ou la composition comprend en outre un ou plusieurs antigènes supplémentaires.
  21. 21. Composition selon l'une quelconque des revendications 14 à 20 dans laquelle la composition est pharmaceutiquement acceptable pour une administration à un sujet en combinaison avec une autre composition qui comprend un acide nucléique comprenant une séquence qui code pour un antigène supplémentaire ; et/ou la composition est pharmaceutiquement acceptable pour une administration au sujet en combinaison avec une autre composition qui comprend un antigène supplémentaire.
  22. 22. Composition selon l'une quelconque des revendications 14 à 21 dans laquelle la composition comprend un ou plusieurs adjuvants.
  23. 23. Procédé d'induction d'une réponse immunitaire contre une infection par le virus Zika chez un sujet en ayant besoin, qui comprend l'administration au dit sujet d'une quantité immunologiquement efficace d'une composition comprenant un(e) ou plusieurs d'une construction selon les revendications 1 à 9 ; du vecteur selon la revendication 10 ; de la molécule d'ARN s'autorépliquant selon les revendications 11 ou 12 ; ou d'une composition selon l'une quelconque des revendications 14 à 22 .
  24. 24. Procédé selon la revendication 23 dans lequel la réponse immunitaire est caractérisée par une mémoire immunologique contre le virus Zika et/ou une population efficace de lymphocytes T à mémoire sensible au virus Zika.
    BE2017/5392
  25. 25. Procédé selon l'une quelconque des revendications 23 ou 24 dans lequel le sujet est humain.
  26. 26. Procédé de production d'un vaccin à base d'ARN comprenant une étape de transcription du vecteur selon la revendication 10 ou de l'ADN selon la revendication 13 pour produire un ARN comprenant une région codante pour l'antigène.
  27. 27. Procédé selon la revendication 26, dans lequel ladite transcription est in vitro.
  28. 28. Procédé selon la revendication 26, dans lequel ladite transcription est in vivo.
  29. 29. Procédé selon l'une quelconque des revendications 26 à 28, comprenant en outre une étape de formulation de l'ARN comprenant la région codante pour l'antigène avec un système d'administration.
  30. 30. Procédé selon la revendication 29, dans lequel le système d'administration est un matériau d'administration non viral.
  31. 31. Procédé selon la revendication 30, dans lequel le système d'administration est choisi dans le groupe constitué de : une émulsion cationique huile dans l'eau submicronique ; un liposome ; et un système d'administration de microparticules polymères biodégradables.
  32. 32. Procédé selon l'une quelconque des revendications 26 à 31, comprenant en outre une étape de combinaison de l'ARN comprenant la région codante pour l'antigène avec une composition supplémentaire comprenant un adjuvant.
  33. 33. Procédé selon la revendication 32, dans lequel ledit adjuvant comprend un immunostimulant.
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  34. 34. Composition produite par le procédé selon l'une quelconque des revendications 26 à 33.
  35. 35. Utilisation de la construction selon les revendications 1 à 9 ; du vecteur selon la revendication 10 ; de la molécule d'ARN s'autorépliquant selon les revendications 11 ou 12 ; ou d'une composition selon l'une quelconque des revendications 14 à 22 pour l'induction d'une réponse immunitaire contre une infection par le virus Zika chez un sujet.
  36. 36. Utilisation de la construction selon les revendications 1 à 9 ; du vecteur selon la revendication 10 ; de la molécule d'ARN s'autorépliquant selon les revendications 11 ou 12 ; ou d'une composition selon l'une quelconque des revendications 14 à 22 dans la fabrication d'un médicament induisant une réponse immunitaire contre une infection par le virus Zika chez un sujet.
  37. 37. Construction selon les revendications 1 à 9 ; vecteur selon la revendication 10 ; molécule d'ARN s'auto-répliquant selon les revendications 11 ou 12 ; ou composition selon l'une quelconque des revendications 14 à 22 ou 34 pour une utilisation en thérapie ou en médecine.
  38. 38. Construction selon les revendications 1 à 9 ; vecteur selon la revendication 10 ; molécule d'ARN s'auto-répliquant selon les revendications 11 ou 12 ; ou composition selon l'une quelconque des revendications 14 à 22 ou 34 pour une utilisation en thérapie vaccinale.
  39. 39. Construction selon les revendications 1 à 9 ; vecteur selon la revendication 10 ; molécule d'ARN s'auto-répliquant selon les revendications 11 ou 12 ; ou
    BE2017/5392 composition selon l'une quelconque des revendications à 22 ou 34 pour une utilisation dans la prévention ou traitement d'une infection par le virus Zika chez sujet en ayant besoin.
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