BE1023622B1 - Composities voor gebakken producten bevattende lipolytische enzymes en het gebruik ervan - Google Patents

Abstract

De onderhavige uitvinding heeft betrekking op composities en werkwijzen voor het verbeteren van eigenschappen van gebakken producten die lipolytische enzymen met verschillende en synergistische eigenschappen combineren.

Description

COMPOSITIES VOOR GEBAKKEN PRODUCTEN BEVATTENDE LIPOLYTISCHE ENZYMEN EN HET GEBRUIK ERVAN

VAKGEBIED VAN DE UITVINDING

De onderhavige uitvinding heeft betrekking op nieuwe composities en werkwijzen voor de verbetering van bakkerijproducten die één of meer lypolytische enzymen omvatten.

ACHTERGROND VAN DE UITVINDING

Hoewel ze maar 2% van de massa van bloem vertegenwoordigen, spelen de lipiden in bloem bij het bakken een belangrijke technische rol omdat ze een interactie aangaan met eiwitten en zetmeel in een deeg of beslag, hierbij worden de Theologische eigenschappen van het deeg of beslag, evenals de kwaliteit van het gebakken product, beïnvloed. De lipiden kunnen worden onderverdeeld in vrije lipiden en gebonden lipiden, waarbij beide fracties polaire of niet-polaire lipiden bevatten. Ongeveer de helft van de lipiden is polair, en de verhouding van polaire tot niet-polaire lipiden is van groot belang bij het maken van brood vanwege de sterke correlatie met het volume van brood. De polaire lipidenfractie bestaat voornamelijk uit lysofosfolipiden, fosfolipiden en galactolipiden.

Het is belangrijk om op te merken dat de lipiden zich op verschillende locaties in een deeg of een beslag bevinden. De meeste polaire lipiden bevinden zich in de zetmeelkorrels. Sommige vrije lipiden verplaatsen zich spontaan naar grensvlakken tussen gas en water, sommige bevinden zich aan het oppervlak of in zetmeelkorrels, of zijn gekoppeld aan glutenmoleculen en sommige zijn pas na gelatinisering van het zetmeel beschikbaar.

In het algemeen is de belangrijkste functie van lipiden hun effect op de stabiliteit van de gascellen en het versterken van gluten. Ook hebben in het bijzonder de polaire lipiden het vermogen om de retrogradatie van zetmeel te verminderen. Het stabiliseren van gasbellen die ontstaan door gistfermentatie leidt tot een groter volume van het gebakken product. Het versterken van het glutennetwerk leidt tot een betere stabiliteit van het deeg en verbetert de zachtheid en de textuur van het kruim en verlengt hierbij de houdbaarheid. Vanwege de kleine hoeveelheid lipiden in bloem is de natieve fosfolipidenfractie van de bloem echter niet genoeg om uit zichzelf een significant effect op de eigenschappen van het deeg of beslag te hebben en om de kwaliteit van de gebakken producten voort te brengen. Bovendien hebben sommige van de aanwezige fosfolipidemoleculen geen effect of zelfs een negatief effect op de eigenschappen van deeg. Derhalve worden exogene fosfolipiden en/of emulgatoren gebruikt om een gelijkmatige kwaliteit en stabiliteit van de houdbaarheid van gebakken producten te garanderen.

Een andere manier om dit probleem aan te pakken is om lipolytische enzymen te gebruiken (zoals fosfolipasen en lipasen) en een in situ modificatie van triglyceriden, fosfolipiden en galactolipiden uit te voeren om de overeenkomstige lysolipiden vrij te geven. Lysolipiden hebben betere emulgerende eigenschappen ten opzichte van de oorspronkelijke moleculen en zijn functioneler als bevochtigingsmiddel in processen voor het maken van brood en cake. Voorts leidt het vrijgeven van meer lysolipiden met betere emulgerende eigenschappen tot verbeterde rheologische eigenschappen van het deeg of het beslag. Een dergelijke vrijgave verbetert in het bijzonder bij het maken van cake de opname van lucht in de waterige fase in een schuim- of sponscake en verbetert de verdeling van het bakkerijvet in het beslag van cakes opgebouwd in lagen.

Vanwege het feit dat de lipiden niet gelijkmatig zijn verdeeld in deeg- en beslagsystemen, zijn ze niet altijd toegankelijk voor hydrolyse door lipasen en fosfolipasen. Door de pH-omstandigheden, de ionensterkte en/of de suikerconcentratie bij verschillende temperaturen te wijzigen, wordt de beschikbaarheid van deze lipiden gewijzigd. In dergelijke gevallen heeft men enzymen nodig die bij deze verschillende temperaturen en omstandigheden actief zijn en de gewenste specificiteit bezitten. Anderzijds ontstaan er wanneer de substraten te ver worden gehydrolyseerd moleculen die een negatief effect hebben op de kwaliteitskenmerken van gebakken producten.

Hoewel bepaalde lipasen en/of fosfolipasen al zijn beschreven vanwege hun positieve eigenschappen bij de bereiding van gebakken producten, is het resultaat van het gebruik daarvan uiterst onvoorspelbaar, als gevolg van hun verschillende specificiteit, hun verschillende hydrolyseproducten, hun mogelijke synergieën, de procesomstandigheden of de substraten. Derhalve bestaat er momenteel nog steeds behoefte aan composities en werkwijzen om de eigenschappen van gebakken producten, zoals de tolerantie, het volume en/of de versheid van deeg of beslag, verder te verbeteren.

SAMENVATTING VAN DE UITVINDING

De uitvinders hebben ontdekt dat het gebruik van een combinatie van een lipolytisch enzym en een specifiek fosfolipase in bakkerijtoepassingen, en in het bijzonder bij het maken van brood, een synergistisch effect heeft op de deegtolerantie.

Dienovereenkomstig heeft de onderhavige uitvinding in een eerste aspect betrekking op een compositie die het volgende omvat: ten minste één eerste enzym met een verhouding van fosfolipase A1 -activiteit / fosfolipase A2-activiteit in het bereik tussen 0,01 en 100, bij voorkeur in het bereik tussen 0,01 en 80, met meer voorkeur in het bereik tussen 0,01 en 50, met zelfs nog meer voorkeur tussen 0,01 en 25; en; ten minste één tweede enzym met een verhouding van fosfolipase A1 -activiteit / fosfolipase A2-activiteit in het bereik tussen 5000 en 60000, bij voorkeur tussen 10000 en 50000, met meer voorkeur tussen 15000 en 50000, en een verhouding van fosfolipase A1-activiteit / lipaseactiviteit van 500 of meer.

In een bijzondere uitvoeringsvorm voorziet de compositie zoals in deze aanvraag beschreven erin dat genoemd eerste enzym wordt gekozen uit een lipolytisch enzym met fosfolipaseactiviteit van Chaetomium thermophilum, een · lipolytisch enzym met fosfolipaseactiviteit van Meiothermus ruber, een lipolytisch enzym met fosfolipaseactiviteit van Meiothermus silvanus, een lipolytisch enzym met fosfolipaseactiviteit van Streptomyces violaceoruber en/of een lipolytisch enzym met fosfolipaseactiviteit van Fusarium culmorum.

In een bijzondere uitvoeringsvorm voorziet de compositie zoals in deze aanvraag beschreven erin dat genoemd eerste enzym een sequentie heeft die voor ten minste 85% identiek is aan een van de sequenties SEQ ID NO 1, SEQ ID NO 2, SEQ ID NO 3, SEQ ID NO 4 en/of SEQ ID NO 5, en bij voorkeur een sequentie heeft die voor ten minste 85% identiek is aan een van de sequenties SEQ ID NO 1, SEQ ID NO 2 en/of SEQ ID NO 3.

In een bijzondere uitvoeringsvorm voorziet de compositie zoals in deze aanvraag beschreven erin dat genoemd eerste enzym wordt gekenmerkt door een optimale fosfolipaseactiviteit bij een temperatuur gelijk aan of hoger dan 45¾.

In een bijzondere uitvoeringsvorm voorziet de compositie zoals in deze aanvraag beschreven erin dat genoemd eerste enzym meer dan 50% van zijn fosfolipaseactiviteit behoudt na incubatie bij 50°C gedurende 30 minuten.

In een bijzondere uitvoeringsvorm voorziet de compositie zoals in deze aanvraag beschreven erin dat genoemd tweede enzym wordt gekozen uit een lipolytisch enzym met fosfolipase- en lipaseactiviteiten van Thermomyces lanuginosus of een lipolytisch enzym met fosfolipase- en lipaseactiviteiten van Fusarium solani.

In een bijzondere uitvoeringsvorm voorziet de compositie zoals in deze aanvraag beschreven erin dat genoemd tweede enzym een sequentie heeft die voor ten minste 85% identiek is aan een van de sequenties SEQ ID NO 6 en/of SEQ ID NO 7 of wordt gekozen uit Lipopan® Max van Novozymes of Veron® Hyperbake T van AB enzymes.

Voorts heeft de onderhavige uitvinding in een ander aspect betrekking op het gebruik van een compositie zoals in deze aanvraag beschreven in bakkerijtoepassingen.

In een bijzondere uitvoeringsvorm wordt het gebruik van de compositie zoals in deze aanvraag beschreven in broodverbetermiddelen.

In een bijzondere uitvoeringsvorm wordt het gebruik van de compositie zoals in deze aanvraag beschreven in brood of banketbakkersproducten, bij voorkeur cakes, brood, stokbroden of broodjes.

Voorts heeft de onderhavige uitvinding in een ander aspect betrekking op een broodverbetermiddel dat de compositie zoals in deze aanvraag beschreven omvat.

Voorts heeft de onderhavige uitvinding in een ander aspect betrekking op een werkwijze voor het bereiden van een gebakken product, en omvat tijdens het bakproces het toevoegen aan het deeg of beslag van: ten minste één eerste enzym met een verhouding van fosfolipase A1-activiteit / fosfolipase A2-activiteit in het bereik tussen 0,01 en 100, bij voorkeur in het bereik tussen 0,01 en 80, met meer voorkeur in het bereik tussen 0,01 en 50, mei.zelfs nog meer voorkeur tussen 0,01 en 25; en; ten minste één tweede enzym met een verhouding van fosfolipase A1-activiteit / fosfolipase A2-activiteit in het bereik tussen 5000 en 60000, bij voorkeur tussen 10000 en 50000, met meer voorkeur tussen 15000 en 50000, en een verhouding van fosfolipase A1-activiteit / lipaseactiviteit van 500 of meer.

In een bijzondere uitvoeringsvorm voorziet de werkwijze zoals in deze aanvraag beschreven erin dat genoemd deeg of beslag tussen 5000 en 100000 PmU / 100 kg bloem omvat, bij voorkeur tussen 7000 en 50000 PmU /100 kg bloem, met meer voorkeur tussen 10000 en 30000 PmU /100 kg bloem van genoemd eerste enzym en tussen 10000 en 100000 LmU / 100 kg bloem, bij voorkeur tussen 20000 en 70000 LmU / 100 kg bloem van genoemd tweede enzym.

In een bijzondere uitvoeringsvorm voorziet de werkwijze zoals in deze aanvraag beschreven erin dat genoemd deeg of beslag een verbeterde tolerantie vertoont.

In een bijzondere uitvoeringsvorm voorziet de werkwijze zoals in deze aanvraag beschreven erin dat genoemd gebakken product een verbeterde versheid vertoont.

Voorts heeft de onderhavige uitvinding in een ander aspect betrekking op een gebakken product bereid uit een deeg of beslag dat de compositie zoals in deze aanvraag beschreven omvat.

GEDETAILLEERDE BESCHRIJVING

Voordat de onderhavige producten, composities, toepassingen en werkwijzen van de uitvinding worden beschreven, dient duidelijk te zijn dat deze uitvinding niet beperkt is tot specifieke producten, composities, toepassingen en werkwijzen of combinaties die worden beschreven, aangezien dergelijke producten, composities, toepassingen en werkwijzen en combinaties uiteraard kunnen variëren. Het dient eveneens duidelijk te zijn dat de terminologie die in deze aanvraag wordt gebruikt niet bedoeld is als beperkend, aangezien de reikwijdte van de onderhavige uitvinding uitsluitend wordt beperkt door de aangehechte conclusies.

Zoals in deze aanvraag gebruikt, omvatten de enkelvoudige vormen “de”, “het” en “een” zowel de enkelvoudige als meervoudige verwijzingen, tenzij de context duidelijk anders aangeeft.

De termen “omvattende”, “omvat” en “samengesteld uit” zijn, zoals in deze aanvraag gebruikt, synoniem met “inclusief”, “met inbegrip van” of “bevattende”, “bevat” en zijn inclusief of met een open uiteinde en sluiten geen bijkomende, niet-vermelde leden, onderdelen of werkwijzestappen uit. Het zal duidelijk zijn dat de termen “omvattende”, “omvat” en “samengesteld uit” zoals in deze aanvraag gebruikt de termen “bestaand uit" en “bestaat uit” omvatten.

De vermelding van numerieke bereiken met eindpunten omvat alle getallen en fracties die binnen de bijbehorende bereiken vallen, evenals de vermelde eindpunten.

De term “ongeveer” of “bij benadering” is, zoals in deze aanvraag gebruikt wanneer wordt verwezen naar een meetbare waarde zoals een parameter, een hoeveelheid, een tijdsduur en dergelijke, bedoeld variaties van +/-10% of minder, bij voorkeur +/-5% of minder, met meer voorkeur +/-1% of minder en met nog meer voorkeur +/-0,1% of minder van de gespecifieerde waarde te omvatten, voor zover dergelijke variaties geschikt zijn om in de beschreven uitvinding te worden uitgevoerd. Het dient duidelijk te zijn dat de waarde waarnaar de modificator “ongeveer” of “bij benadering” verwijst zelf ook specifiek is, en bij voorkeur wordt beschreven.

Hoewel de termen “één of meer” of “ten minste één”, zoals één of meer leden of ten minste één lid van een groep leden op zich duidelijk zijn, omvatten de termen bij wijze van verdere toelichting onder andere een verwijzing naar één van de genoemde leden of naar elke willekeurige twee of meer van genoemde leden, zoals elke willekeurige > 3, > 4, ä 5, £ 6 of a 7 etc. van genoemde leden, en tot aan alle genoemde leden.

Alle verwijzingen die in de onderhavige beschrijving worden aangehaald, zijn hiermee door verwijzing in hun geheel opgenomen. In het bijzonder is de leer van alle verwijzingen waarnaar in deze aanvraag specifiek wordt verwezen door verwijzing opgenomen.

Tenzij anders gedefinieerd, hebben alle termen die bij het beschrijven van de uitvinding worden gebruikt, met inbegrip van technische en wetenschappelijke termen, dezelfde betekenis als wordt begrepen door iemand met gemiddelde kennis van het vakgebied waartoe deze uitvinding behoort. Bij wijze van verdere begeleiding worden de definities van de termen opgenomen om de uitleg van de onderhavige uitvinding beter te begrijpen.

In de volgende passages worden verschillende aspecten van de uitvinding meer in detail gedefinieerd. Elk aspect dat als zodanig wordt gedefinieerd, kan met elk willekeurig ander aspect of alle willekeurige andere aspecten worden gecombineerd, tenzij het tegendeel duidelijk wordt aangegeven. In het bijzonder kan elk kenmerk dat wordt aangeduid als de . voorkeur genietend of voordelig worden gecombineerd met elk willekeurig ander kenmerk of alle willekeurige andere kenmerken waarvan is aangegeven dat ze de voorkeur genieten of voordelig zijn.

Verwijzing in deze beschrijving naar “één uitvoeringsvorm” of “een uitvoeringsvorm” betekent dat een specifiek kenmerk, specifieke structuur of eigenschap die wordt beschreven in verband met de uitvoeringsvorm is opgenomen in ten minste één uitvoeringsvorm van de onderhavige uitvinding. Zodoende verwijzen verschijningen van de zinnen “in één uitvoeringsvorm” of “in een uitvoeringsvorm” op verschillende plaatsen in deze beschrijving niet noodzakelijk allemaal naar dezelfde uitvoeringsvorm, maar dat zou wel kunnen. Voorts kunnen de specifieke kenmerken, structuren of eigenschappen op elke geschikte wijze gecombineerd worden in één of meer uitvoeringsvormen, zoals uit deze beschrijving duidelijk zou zijn voor een deskundige op het vakgebied. Hoewel bepaalde uitvoeringsvormen die in deze aanvraag worden beschreven sommige kenmerken omvatten die in andere uitvoeringsvormen zijn opgenomen, maar andere niet, zijn combinaties van kenmerken van verschillende uitvoeringsvormen voorts bedoeld binnen de reikwijdte van de uitvinding te vallen, en afzonderlijke uitvoeringsvormen te vormen, zoals duidelijk zou zijn voor deskundigen op het vakgebied. In de aangehechte conclusies kan bijvoorbeeld elk van de geclaimde uitvoeringsvormen in elke willekeurige combinatie worden gebruikt.

In deze aanvraag worden composities beschreven die een eerste enzym omvatten met een lage verhouding van fosfolipase A1-activiteit / fosfolipase A2-activiteit in combinatie met een tweede enzym met een hoge verhouding van fosfolipase A1-activiteit / fosfolipase A2-activiteit die in het bijzonder geschikt is voor gebruik in bakkerijtoepassingen en in het bijzonder voor gebruik als of in een broodverbetermiddel.

De uitvinders hebben verrassend ontdekt dat het gebruik van composities die twee of meer lipasen en/of fosfolipasen omvatten met de specifieke eigenschappen zoals in deze aanvraag beschreven het verkrijgen van gebakken producten met verbeterde eigenschappen mogelijk maakt. In het bijzonder worden de eigenschappen (bijv. de tolerantie) van het beslag en/of deeg aanzienlijk verbeterd. Ook bleken de gebakken producten een verbeterd volume en/of verbeterde versheid te vertonen.

Zoals in deze aanvraag gebruikt, verwijst de term “lipase” in het algemeen naar triacylglycerollipasen of triacylglycerolacylhydrolase zoals gedefinieerd door enzymingang EC 3.1.1.3. Lipasen worden in deze aanvraag gedefinieerd als enzymen die de hydrolyse van triacylglycerolen katalyseren om vrije vetzuren, diacylglycerolen, monoacylglycerolen en glycerol op te leveren. De lipase die wordt gebruikt in de composities die in deze aanvraag worden gedefinieerd, kan enzymatische nevenactiviteiten omvatten, zoals fosfolipaseactiviteit.

Binnen de context van de onderhavige uitvinding wordt de lipaseactiviteit gemeten met gebruik van p-nitrofenylpalmitaat (pNPP) als substraat en volgens de in deze aanvraag beschreven werkwijze. De enzymactiviteit kan ook met andere analysemethoden voor lipaseactiviteit worden gemeten die bekend zijn voor deskundigen op het vakgebied (zie voor een bespreking bijvoorbeeld Stoytcheva M. & al, 2012, Current Analytical Chemistry, vol 8, p. 400).

In het bijzonder wordt de lipaseactiviteit gemeten met gebruik van p-nitrofenylpalmitaat (pNPP) als substraat. Het vrijkomen van gele p-nitrofenol als gevolg van de hydrolyse van p-nitrofenylpalmitaat door lipase wordt gemeten door middel van spectrofotometrie bij 414 nm. Eén lipase milliunit (LmU) wordt gedefinieerd als de hoeveelheid enzym die nodig is om één nanomol (nmol) p-nitrofenol per minuut vrij te maken uit p-nitrofenylpalmitaat bij 40 *€ en pH 7,5. In de voorbeelden worden meer details over het meten van de lipaseactiviteit gegeven.

Zoals in deze aanvraag gebruikt, verwijst de term “fosfolipase” in het algemeen naar enzymen die fosfolipiden hydrolyseren tot vetzuren en andere lipofiele stoffen, zoals lysofosfolipiden, diacylglycerolen, cholinefosfaat en fosfatidaten, afhankelijk van de plaats van hydrolyse. Afhankelijk van de specifieke binding in de fosfolipidemolecule waarop ze zich richten, worden fosfolipasen ingedeeld in verschillende typen, zoals A, B, C en D.

Binnen de context van de onderhavige uitvinding wordt de fosfolipaseactiviteit gemeten met gebruik van p-nitrofenylfosforylcholine als substraat, terwijl de fosfolipaseactiviteit wordt uitgedrukt als milliunits (PmU) die gedefinieerd worden als de hoeveelheid enzym die nodig is om één nanomol (nmol) p-nitrofenol vrij te maken uit p-nitrofenylfosforylcholine per minuut bij 50 °C en pH 7,5. De fosfolipaseactiviteit kan ook worden gemeten met andere analysemethoden voor fosfolipaseactiviteit zoals bekend voor deskundigen op het vakgebied, zoals de hydrolyse van fosfatidylcholine.

In het bijzonder wordt de fosfolipaseactiviteit gemeten met gebruik van p-nitrofenylfosforylcholine (pNPPC) als substraat. Het vrijkomen van gele p-nitrofenol als gevolg van de hydrolyse van p-nitrofenylfosforylcholine door fosfolipase wordt gemeten door middel van spectrofotometrie bij 414 nm. Eén fosfolipase milliunit (PmU) wordt gedefinieerd als da hoeveelheid enzym die nodig is om 1 nmol p-nitrofenol per minuut vrij te maken bij 50°C en pH 7,5. In de voorbeelden worden meer details over het meten van de fosfolipaseactiviteit gegeven.

Zoals in deze aanvraag gebruikt, verwijst de term “fosfolipase A” naar lipolytische enzymen die de hydrolyse van één of meer bindingen in fosfolipiden katalyseren. Er kunnen twee verschillende typen fosfolipase A-activiteit worden onderscheiden die één of meer esterbindingen hydrolyseren die de vetacylgroepen koppelen aan de glycerolhoofdketen. Fosfolipase A1, zoals gedefinieerd door enzym onderverdeling EC 3.1.1.32, en Fosfolipase A2, zoals gedefinieerd door enzym onderverdeling EC 3.1.1.4, katalyseren de deacylering van één vetacylgroep op respectievelijk de sn-1- en sn-2-positie van een diacylglycerofosfolipide om lysofosfolipide te produceren.

Binnen de context van de onderhavige uitvinding worden de fosfolipaseactiviteiten gemeten met gebruik van respectievelijk een lipidenmengsel van dioleoylfosfatidylcholine, dioleoylfosfatidylglycerol en met kleurstof gelabelde N-((6-(2,4-DNP)Amino)Hexanoyl)-1-(BODIPY® FL C5)-2-Hexyl-Sn-Glycero-3-Fosfo-ethanolamine (voor fosfolipase A1) of een lipidenmengsel van dioleoylfosfatidylcholine, dioleoylfosfatidylglycerol en met kleurstof gelabelde 1-0-(6-B0DIPY® 558/568-Aminohexyl)-2-BODIPY® FL C5-Sn-Glycero-3-

Fosfocholine (voor fosfolipase A2) als substraten en volgens de in deze aanvraag beschreven werkwijzen. De fosfolipaseactiviteiten kunnen ook worden gemeten met andere analysemethoden voor lipaseactiviteit zoals bekend aan deskundigen op het vakgebied, zoals met gebruik van rac-1,2-S,0-didecanoyl-3-fosfocholine-1-mercapto-2,3-propaandiol als substraat voor het analyseren van fosfolipase A1-activiteit en 2-hexadecanoylthio-1-ethyl-fosfocholine als substraat voor het analyseren van fosfolipase A2-activiteit.

In het bijzonder wordt de fosfolipase A1 -activiteit (PLA1) gemeten met gebruik van een lipidenmengsel van dioleoylfosfatidylcholine, dioleoylfosfatidylglycerol en met kleurstof gelabelde N-((6-(2,4-DNP)Amino)Hexanoyl)-1-(BODIPY® FL C5)-2-Hexyl-Sn-Glycero-3-Fosfo-ethanolamine (PED-A1) als substraat (dat bijvoorbeeld gevonden kan worden in de EnzChek Fosfolipase A1-analysekit - ThermoFisher Scientific). De PED-A1 is specifiek voor PLA1 en is een met kleurstof gelabelde glycerofosfo-ethanolamine met een met BODIPY® FL-kleurstof gelabelde acylketen op de sn-1 -positie en een met dinitrofenylquencher gemodificeerde hoofdgroep. Eén fosfolipase A1 milliunit (PA1mU) is gedefinieerd als de hoeveelheid enzym die nodig is om één nanomol (nmol) per minuut vrij te maken van fluorescerend vetzuur dat op de sn-1-positie van PED-A1 is gesubstitueerd, bij 40°C en pH 7,4. In de voorbeelden worden meer details over het meten van de fosfolipase A1-activiteit gegeven.

In het bijzonder wordt de fosfolipase A2-activiteit (PLA2) gemeten met gebruik van een lipidenmengsel van dioleoylfosfatidylcholine, dioleoylfosfatidylglycerol en met kleurstof gelabelde 1-0-(6-BODIPY® 558/568-Aminohexyl)-2-BODIPY® FL C5-Sn-Glycero-3-Fosfocholine (Rood/Groen BODIPY® PC-A2) als substraat (dat bijvoorbeeld gevonden kan worden in de EnzChek Fosfolipase A2-analysekit - ThermoFisher Scientific). Het Rood/Groen BODIPY® PC-A2-substraat is selectief voor PLA2 en voorziet in gevoelig en continu snel real-time volgen van PLA2-enzymactiviteiten. Eén fosfolipase A2 milliunit (PA2mU) is gedefinieerd als de hoeveelheid enzym die nodig is om één nanomol (nmol) per minuut vrij te maken van fluorescerend vetzuur dat is gesubstitueerd op de sn-2-postitie van Rood/Groen BODIPY® PC-A2 bij 40 Ό en pH 8,9. In de voorbeelden worden meer details over het meten van de fosfolipase A2-activiteit gegeven.

Dienovereenkomstig heeft de onderhavige uitvinding in een eerste aspect betrekking op een compositie die het volgende omvat: ten minste één eerste enzym met een verhouding van fosfolipase A1-activiteit / fosfolipase A2-activiteit in het bereik tussen 0,01 en 100, bij voorkeur in het bereik tussen 0,01 en 80, met meer voorkeur in het bereik tussen 0,01 en 50, en met zelfs nog meer voorkeur tussen 0,01 en 25; en; ten minste één tweede enzym met een verhouding van fosfolipase A1-activiteit / fosfolipase A2-activiteit in het bereik tussen 5000 en 60000, bij voorkeur tussen 10000 en 50000, met meer voorkeur tussen 15000 en 50000, en een verhouding van fosfolipase A1-activiteit / lipaseactiviteit van 500 of meer.

In het bijzonder wordt de lipaseactiviteit uitgedrukt in milliunits (LmU) die zijn gedefinieerd als de hoeveelheid enzym die nodig is om één nanomol (nmol) per minuut van p-nitrofenol vrij te maken uit p-nitrofenylpalmitaat bij 40°C en pH 7,5, wordt de fosfolipase A1-activiteit uitgedrukt in milliunits (PA1mU) die zijn gedefinieerd als de hoeveelheid enzym die één nanomol (nmol) per minuut hydrolyseert van fluorescerend vetzuur gesubstitueerd op de sn-1 -positie van N-((6-(2,4-DNP)Amino)Hexanoyl)-1 -(BODIPY® FL C5)-2-Hexyl-Sn-Glycero-3-Fosfo-ethanolamine bij 40°C en pH 7,4 en wordt de fosfolipase A2-activiteit uitgedrukt in milliunits (PA2mU) die zijn gedefinieerd als de hoeveelheid enzym die één nanomol (nmol) per minuut hydrolyseert van fluorescerend vetzuur gesubstitueerd op de sn-2-positie van 1-: 0-(6-BODIPY® 558/568-Aminohexyl)-2-BODIPY® FL C5-Sn-Glycero-3-Fosfocholine bij 40*0 en pH 8,9.

In een bijzondere uitvoeringsvorm omvat de compositie zoals in deze aanvraag beschreven: ten minste één eerste enzym met een verhouding van fosfolipase A1-activiteit / fosfolipase A2-activiteit in het bereik tussen 0,01 en 50; en; ten minste één tweede enzym met een verhouding van fosfolipase A1-activiteit / fosfolipase A2-activiteit in het bereik tussen 15000 en 50000; en een verhouding van fosfolipase A1 -activiteit / lipaseactiviteit van 500 of meer.

In een bijzondere uitvoeringsvorm omvat de compositie zoals in deze aanvraag beschreven: ten minste één eerste enzym met een verhouding van fosfolipase A1-activiteit / fosfolipase A2-activiteit in het bereik tussen 0,01 en 25; en; ten minste één tweede enzym met een verhouding van fosfolipase A1-activiteit / fosfolipase A2-activiteit in het bereik tussen 15000 en 50000; en een verhouding van fosfolipase A1-activiteit / lipaseactiviteit van 500 of meer.

De uitvinders hebben ontdekt dat de enzymen van de composities zoals in deze aanvraag beschreven synergistisch werken bij het verbeteren van de eigenschappen van gebakken producten.

In een bijzondere uitvoeringsvorm voorziet de compositie zoals in deze aanvraag beschreven erin dat genoemd eerste enzym wordt gekenmerkt door een optimale fosfolipaseactiviteit bij een temperatuur gelijk aan of hoger dan 45¾.

In een bijzondere uitvoeringsvorm voorziet de compositie zoals in deze aanvraag beschreven erin dat genoemd eerste enzym wordt gekozen uit een lipolytisch enzym met fosfolipaseactiviteit van Chaetomium thermophilum, een lipolytisch enzym met fosfolipaseactiviteit van Meiothermus ruber, een lipolytisch enzym met fosfolipaseactiviteit van Meiothermus silvanus, een lipolytisch enzym met fosfolipaseactiviteit van Streptomyces violaceoruber en/of een lipolytisch enzym met fosfolipaseactiviteit van Fusarium culmorum.

In een bijzondere uitvoeringsvorm voorziet de compositie zoals in deze aanvraag beschreven erin dat genoemd eerste enzym een sequentie heeft die voor ten minste 85% identiek is aan een sequentie van SEQ ID NO 1, SEQ ID NO 2, SEQ ID NO 3, SEQ ID NO 4 en/of SEQ ID NO 5 (zie tabel A), en bij voorkeur een sequentie heeft die voor ten minste 85% identiek is aan een sequentie.van SEQ ID NO 1, SEQ ID NO 2 en/of SEQ ID NO 3.

Meer in het bijzonder is genoemd eerste enzym een lipolytisch enzym dat een sequentie heeft die voor ten minste 85%, bij voorkeur ten minste 90%, met meer voorkeur ten minste 95% identiek is aan SEQ ID NO 1, SEQ ID NO 2, SEQ ID NO 3, SEQ ID NO 4 en/of SEQ ID NO 5, en bij voorkeur een sequentie heeft die voor ten minste 85%, bij voorkeur ten minste 90%, met meer voorkeur ten minste 95% identiek is aan een sequentie van SEQ ID NO 1, SEQ ID NO 2 en/of SEQ ID NO 3 (zie tabel A).

Tabel A

Meer in het bijzonder is genoemd eerste enzym een lipolytisch enzym dat een sequentie heeft die voor 100% identiek is aan SEQ ID NO 1, SEQ ID NO 2, SEQ ID NO 3, SEQ ID NO 4 en/of SEQ ID NO 5, en bij voorkeur een sequentie heeft die voor 100% identiek is aan een sequentie van SEQ ID NO 1, SEQ ID NO 2 en/of SEQ ID NO 3.

In een bijzondere uitvoeringsvorm voorziet de compositie zoals in deze aanvraag beschreven erin dat genoemd eerste enzym een lipolytisch enzym met fosfolipaseactiviteit is van Chaetomium thermophilum, en op voordelige wijze een enzym is met SEQ ID NO 1, of een zeer goed daarop lijkende variant daarvan. In een bijzondere uitvoeringsvorm voorziet de compositie zoals in deze aanvraag beschreven erin dat genoemd eerste enzym een lipolytisch enzym met fosfolipaseactiviteit is van Meiothermus ruber, en op voordelige wijze een enzym is met SEQ ID NO 2, of een zeer goed daarop lijkende variant. In een bijzondere uitvoeringsvorm voorziet de compositie zoals in deze aanvraag beschreven erin dat genoemd eerste enzym een lipolytisch enzym met fosfolipaseactiviteit is van Meiothermus silvanus, en op voordelige wijze een enzym is met SEQ ID NO 3, of een zeer goed daarop lijkende variant. In een bijzondere uitvoeringsvorm voorziet de compositie zoals in deze aanvraag beschreven erin dat genoemd eerste enzym een lipolytisch enzym met fosfolipaseactiviteit is van Streptomyces violaceoruber, en op voordelige wijze een enzym is met SEQ ID NO 4, of een zeer goed daarop lijkende variant, met meer voorkeur Nagase 10P van Nagase. In een bijzondere uitvoeringsvorm voorziet de compositie zoals in deze aanvraag beschreven erin dat genoemd eerste enzym een lipolytisch enzym met fosfolipaseactiviteit is van Fusarium culmorum, en op voordelige wijze een enzym is met SEQ ID NO 5, of een zeer goed daarop lijkende variant daarvan, met meer voorkeur Panamore® Golden van DSM.

Binnen de context van de onderhavige uitvinding is een “zeer goed daarop lijkende variant”, zoals in deze aanvraag gebruikt, een enzym dat (de kwaliteit van) gebakken producten zoals hierboven beschreven verbetert en dat voor een significant deel identiek is aan SEQ ID NO 1 tot 5. “Significant identiek” verwijst binnen de context van de onderhavige uitvinding naar voor ten minste 85% identiek, bij voorkeur voor ten minste 90% identiek, bij voorkeur voor ten minste 91%, met meer voorkeur voor ten minste 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% of zelfs voor ten minste 99% identiek aan SEQ ID NO 1 tot 5.

De verwantschap tussen twee aminozuursequenties of tussen twee nucleotidensequenlies wordt beschreven door de parameter “identiek”. Voor de onderhavige doeleinden wordt de mate van overeenkomst tussen twee aminozuursequenties bepaald zoals in WO 2010/0142 697 met gebruik van het Needleman-Wunsch-algoritme zoals geïmplementeerd in het Needle-programma van het EMBOSS-pakket, bij voorkeur versie 3.0.0 of nieuwer. De optionele parameters die zijn gebruikt, zijn een gap open penalty van 10, een gap extension penalty van 0,5 en de EBLOSUM62 (EMBOSS-versie van BLOSUM62) substitutiematrix. De uitvoer van Needle gelabeld als “langste overeenkomst” (verkregen met gebruik van de -nobrief-optie) wordt gebruikt als het percentage overeenkomst en wordt als volgt berekend: (identieke residuen x 100)/(lengte van uitlijning - totaal aantal gaten in uitlijning).

In een bijzondere uitvoeringsvorm wordt het eerste enzym gekenmerkt door een optimale fosfolipaseactiviteit bij een temperatuur gelijk aan of hoger dan 45“O.

In een bijzondere uitvoeringsvorm voorziet de compositie zoals in deze aanvraag beschreven erin dat genoemd eerste enzym meer dan 50% van zijn fosfolipaseactiviteit behoudt na incubatie bij 50°C gedurende 30 minuten.

De activiteit wordt gemeten door het bepalen van de fosfolipaseactiviteit zoals in deze aanvraag aangegeven (met gebruik van p-nitrofenylfosforylcholine als substraat).

In een bijzondere uitvoeringsvorm voorziet de compositie zoals in deze aanvraag beschreven erin dat genoemd tweede enzym wordt gekozen uit een lipolytisch enzym met fosfolipase- en lipaseactiviteiten van Thermomyces lanuginosus of een lipolytisch enzym met fosfolipase- en lipaseactiviteiten van Fusarium solani.

In een bijzondere uitvoeringsvorm voorziet de compositie zoals in deze aanvraag beschreven erin dat genoemd tweede enzym een sequentie heeft die voor ten minste 85% identiek is aan een sequentievan SEQ ID NO 6 en/of SEQ ID NO 7 (zie tabel A) of wordt gekozen uit Lipopan® Max van Novozymes of Veron® Hyperbake T van AB enzymes.

Meer in het bijzonder is genoemd tweede enzym een lipolytisch enzym waarvan de sequentie voor ten minste 85%, bij voorkeur ten minste 90%, met meer voorkeur ten minste 95% identiek is aan SEQ ID NO 6 en/of SEQ ID NO 7 (zie tabel A).

Meer in het bijzonder is genoemd tweede enzym een lipolytisch enzym waarvan de sequentie voor 100% identiek is aan SEQ ID NO 6 en/of SEQ ID NO 7.

In een bijzondere uitvoeringsvorm voorziet de compositie zoals in deze aanvraag beschreven erin dat genoemd tweede enzym een lipolytisch enzym met fosfolipaseactiviteit is van Thermomyces lanuginosus, en op voordelige wijze een enzym is met SEQ ID NO 6, of een zeer goed daarop lijkende variant. In een bijzondere uitvoeringsvorm voorziet de compositie zoals in deze aanvraag beschreven erin dat genoemd eerste enzym een lipolytisch enzym met fosfolipaseactiviteit is van Fusarium solani, en op voordelige wijze een enzym is met SEQ ID NO 7, of een zeer goed daarop lijkende variant.

Met zelfs nog meer voorkeur is het tweede enzym Lipopan® Max van Novozymes of Veron® Hyperbake T van AB enzymes.

In uitvoeringsvormen die nog meer voorkeur genieten omvat de compositie zoals in deze aanvraag beschreven een eerste enzym met de aminozuursequentie van SEQ ID NO 1, of SEQ ID NO 2, of SEQ ID NO 3 of sterk daarop lijkende varianten daarvan en een tweede enzym met een verhouding van fosfoiipase A1-activiteit / fosfolipase A2-activiteit tussen 5000 en 60000, bij voorkeur tussen 10000 en 50000, met meer voorkeur tussen 15000 en 50000, en een verhouding van fosfolipase A1-activiteit /1ipaseactiviteit gelijk aan of groter dan 500.

In uitvoeringsvormen die nog meer voorkeur genieten, omvat de compositie zoals in deze aanvraag beschreven een eerste enzym met de aminozuursequentie van SEQ ID NO 1, of SEQ ID NO 2, of SEQ ID NO 3 of sterk daarop lijkende varianten, en een tweede enzym met de aminozuursequentie van SEQ ID NO 6, of SEQ ID NO 7 of een sterk daarop lijkende variant daarvan, bij voorkeur een tweede enzym met de sequentie van SEQ ID NO 6 of een sterk daarop lijkende variant.

In voorkeursuitvoeringsvormen die nog meer voorkeur genieten, omvat de compositie zoals in deze aanvraag beschreven een eerste enzym met de aminozuursequentie van SEQ ID NO 1 of een sterk daarop lijkende variant daarvan, en een tweede enzym met een verhouding van fosfolipase A1-activiteit / fosfolipase A2-activiteit tussen 5000 en 60000, bij voorkeur tussen 10000 en 50000, met meer voorkeur tussen 15000 en 50000; en een verhouding van fosfolipase A1-activiteit / lipaseactiviteit gelijk aan of groter dan 500, bij voorkeur een tweede enzym met de aminozuursequentie van SEQ ID NO 6 of SEQ ID NO 7 of een sterk daarop lijkende variant daarvan, met meer voorkeur een tweede enzym met de sequentie van SEQ ID NO 6 of een sterk daarop lijkende variant.

In voorkeursuitvoeringsvormen die nog meer voorkeur genieten, omvat de compositie zoals in deze aanvraag beschreven een eerste enzym met de aminozuursequentie van SEQ ID NO 2 of een sterk daarop lijkende variant daarvan, en een tweede enzym met een verhouding van fosfolipase A1-activiteit / fosfolipase A2-activiteit tussen 5000 en 60000, bij voorkeur tussen 10000 en 50000, met meer voorkeur tussen 15000 en 50000; en een verhouding van fosfolipase A1 -activiteit / lipaseactiviteit gelijk aan of groter dan 500, bij voorkeur een tweede enzym met de aminozuursequentie van SEQ ID NO 6 of SEQ ID NO 7 of een sterk daarop lijkende variant daarvan, met meer voorkeur een tweede enzym met de sequentie van SEQ ID NO 6 of een sterk daarop lijkende variant.

In voorkeursuitvoeringsvormen die nog meer voorkeur genieten, omvat de compositie zoals in deze aanvraag beschreven een eerste enzym met de aminozuursequentie van SEQ ID NO 3 of een sterk daarop lijkende variant daarvan, en een tweede enzym met een verhouding van fosfolipase A1-activiteit / fosfolipase A2-activiteit tussen 5000 en 60000, bij voorkeur tussen 10000 en 50000, met meer voorkeur tussen 15000 en 50000; en een verhouding van fosfolipase A1-activiteit / lipaseactiviteit gelijk aan of groter dan 500, bij voorkeur een tweede enzym met de aminozuursequentie van SEQ ID NO 6 of SEQ ID NO 7 of een sterk daarop lijkende variant daarvan, met meer voorkeur een tweede enzym met de sequentie van SEQ ID NO 6 of een sterk daarop lijkende variant.

Voorts heeft de onderhavige uitvinding in een ander aspect betrekking op een broodverbetermiddel dat de compositie zoals in deze aanvraag beschreven omvat.

De compositie van de onderhavige uitvinding kan op voordelige wijze deel uitmaken van een broodverbetermiddel of een banketbakkersmix of een premix. “Broodverbetermiddelen” (ook “deegconditioneermiddelen” of “deegverbetermiddelen” of “verbetermiddel” of “bloembehandelmiddel” genoemd) worden doorgaans aan het deeg toegevoegd om de textuur, het volume, de smaak en de versheid van het gebakken product te verbeteren, evenals om de verwerkbaarheid en stabiliteit van het deeg te verbeteren. Een broodverbetermiddel omvat doorgaans of bestaat doorgaans uit: één of meer enzymen (zoals amylasen (alfa-amylasen, bèta-amylasen, glucoamylasen, ruw zetmeel afbrekende amylasen), xylanasen (hemicellulasen), cellulasen, pectinasen, proteasen, pectaatlyasen, oxidasen (peroxidasen, glucoseoxidase, pyranoseoxidasen, hexoseoxidasen, L- aminozuuroxidasen, koolhydraatoxidasen, sulfhydryloxidasen), lipoxygenasen, dehydrogenasen, laccasen, transglutaminasen, acyltransferasen, eiwitdisulfide-isomerasen), één of meer oxiderende of reducerende middelen (zoals ascorbinezuur, glutathion, cysteïne), één of meer emulgatoren (zoals diacetylwijnsteenzuuresters van monoglyceriden (DATEM), natriumstearoyllactylaat (SSL), calciumstearoyllactylaat (CSL), glycerolmonostearaat (GMS), rhamnolipiden, lecithinen, sucro-esters, galzouten), één of meer lipidematerialen (zoals margarine, boter, olie, bakvet), één of meer vitaminen (zoals pantotheenzuur en vitamine E), één of meer gommen, en/of één of meer vezelbronnen (zoals havervezel). Cakemixen (banketbakkersmixen) omvatten doorgaans allé ingrediënten van een cakerecept, met uitzondering van water, vet (olie, boter, margarine) en eieren. Cakepremixen zijn doorgaans cakemixen waarbij een deel van of alle bloem en suiker is verwijderd.

In bijzondere uitvoeringsvormen omvat de compositie een eerste enzym met een lage verhouding van fosfolipase A1 -activiteit / fosfolipase A2-activiteit en een tweede enzym met een hoge verhouding van fosfolipase A1-activiteit / fosfolipase A2-activiteit zoals hierboven beschreven; en ten minste één, bij voorkeur twee bijkomende bestanddelen gekozen uit de lijst van enzym(en), oxiderend(e) middel(en), reducerend(e) middel(en), emulgator(s), lipide(n), vitamine(n), vezel(s). De uitvinders hebben ontdekt dat het bijzonder voordelig was om in de compositie één of meer enzymen op te nemen gekozen uit de groep van amylasen (alfa-amylasen, bèta-amylasen, glucoamylasen, ruw zetmeel afbrekende amylasen), xylanasen (hemicellulasen), cellulasen, pectinasen, proteasen, pectaatlyasen, oxidasen (peroxidasen, glucoseoxidase, pyranoseoxidase, hexoseoxidasen, L-aminozuuroxidasen, koolhydraatoxidasen, sulfhydryloxidasen), lipoxygenasen, dehydrogenasen, laccasen, transglutaminasen, acyltransferasen, eiwitdisulfide-isomerasen.

Voorts heeft de onderhavige uitvinding in een ander aspect betrekking op het gebruik van een compositie zoals in deze aanvraag beschreven in bakkerijtoepassingen. Binnen de context van de onderhavige uitvinding verwijzen bakkerijtoepassingen naar toepassingen die betrekking hebben op zowel brood- als banketbakkersproducten.

Er is ontdekt dat het gebruik van de composities zoals in deze aanvraag beschreven de vermindering of zelfs de onderdrukking van het gebruik van ongewenste deeg- of beslagbestanddelen, zoals emulgatoren, mogelijk maakt.

In een bijzondere uitvoeringsvorm wordt het gebruik van de compositie zoals in deze aanvraag beschreven in broodverbetermiddelen verschaft.

In een bijzondere uitvoeringsvorm wordt het gebruik van de compositie zoals in deze aanvraag beschreven in brood- of banketbakkersproducten, bij voorkeur cakes, brood, stokbroden of broodjes verschaft.

In deze aanvraag zijn ook werkwijzen beschreven voor het bereiden van gebakken producten waarbij een eerste enzym met een lage verhouding van fosfolipase A1-activiteit/ fosfolipase A2-activiteit en een tweede enzym met een hoge verhouding van fosfolipase A1-activiteit/ fosfolipase A2-activiteit worden gebruikt bij de bereidingswijze.

Voorts heeft de onderhavige uitvinding in een ander aspect betrekking op een werkwijze voor het bereiden van een gebakken product, die tijdens de stappen van het bakproces het toevoegen aan het deeg of beslag van: ten minste één eerste enzym met een verhouding van fosfolipase A1-activiteit / fosfolipase A2-activiteit in het bereik tussen 0,01 en 100, bij voorkeur in het bereik tussen 0,01 en 80, met meer voorkeur in het bereik tussen 0,01 en 50, met zelfs nog meer voorkeur tussen 0,01 en 25; en; ten minste één tweede enzym met een verhouding van fosfolipase A1-activiteit / fosfolipase A2-activiteit in het bereik tussen 5000 en 60000, bij voorkeur tussen 10000 en 50000, met meer voorkeur tussen 15000 en 50000, en een verhouding van fosfolipase A1-activiteit / lipaseactiviteit van 500 of meer.

In genoemde werkwijze wordt de lipaseactiviteit uitgedrukt in milliunits (LmU) die zijn gedefinieerd als de hoeveelheid enzym die nodig is om één nanomol (nmol) per minuut van p-nitrofenol vrij te maken uit p-nitrofenylpalmitaat bij 40°C en pH 7,5, wordt de fosfolipase A1-activiteit uitgedrukt in milliunits (PA1mU) die zijn gedefinieerd als de hoeveelheid enzym die één nanomol (nmol) per minuut hydrolyseert van fluorescerend vetzuur gesubstitueerd op de sn-1-positie van N-((6-(2,4-DNP)Amino)Hexanoyl)-1-(BODIPY® FL C5)-2-Hexyl-Sn-Glycero-3-Fosfo-ethanolamine bij 40“G en pH 7,4 en wordt de fosfolipase A2-activiteit uitgedrukt in milliunits (PA2mU) per minuut die zijn gedefinieerd als de hoeveelheid enzym die één nanomol (nmol) per minuut hydrolyseert van fluorescerend vetzuur gesubstitueerd op de sn-2-positie van 1-0-(6-B0DIPY® 558/568-Aminohexyl)-2-BODIPY® FL C5-Sn-Glycero-3-Fosfocholine bij 40°C en pH 8,9, en de fosfolipaseactiviteit wordt uitgedrukt in milliunits (PmU) die zijn gedefinieerd als de hoeveelheid enzym die nodig is om één nanomol (nmol) per minuut vrij te maken van p-nitrofenol uit p-nitrofenylfosforylcholine per minuut bij 50¾ en pH 7,5.

In een bijzondere uitvoeringsvorm van de werkwijze van de onderhavige uitvinding wordt het eerste enzym gekenmerkt door een optimale fosfolipaseactiviteit bij een temperatuur gelijk aan of hoger dan 45 °C.

Er is ontdekt dat de composities zoals in deze aanvraag beschreven in het bijzonder geschikt zijn voor gebruik in de in deze aanvraag beschreven werkwijzen.

In een bijzondere uitvoeringsvorm voorziet de werkwijze zoals in deze aanvraag beschreven erin dat genoemd deeg of beslag tussen 5000 en 100000 PmU / 100 kg bloem omvat, bij voorkeur tussen 7000 en 50000 PmU /100 kg bloem, met meer voorkeur tussen 10000 en 30000 PmU /100 kg bloem van genoemd eerste enzym en tussen 10000 en 100000 LmU / 100 kg bloem, bij voorkeur tussen 20000 en 70000 LmU / 100 kg bloem van genoemd tweede enzym.

De werkwijze zoals in deze aanvraag beschreven maakt het op voordelige wijze mogelijk om de tolerantie van het beslag of het deeg te verbeteren en/of om de eigenschappen van de gebakken producten, zoals het volume of de versheid, te verbeteren.

In een bijzondere uitvoeringsvorm voorziet de werkwijze zoals in deze aanvraag beschreven erin dat genoemd deeg of beslag een verbeterde tolerantie vertoont.

De uitvinders hebben ontdekt dat het gebruik van een combinatie van een lipolytisch enzym en een specifiek fosfolipase in bakkerijtoepassingen, en in het bijzonder bij de bereiding van broodproducten, een synergistisch effect heeft op de deegtolerantie.

Binnen de onderhavige context verwijst de deegtolerantie naar het vermogen van een deeg of beslag, bij voorkeur een bakkerijdeeg, om zijn vorm te behouden onder stressomstandigheden, zoals een langere rijstijd of mechanische schokken tijdens of na het rijzen en om na het bakken een gebakken product te verschaffen met eigenschappen (bijv. volume) die vergelijkbaar zijn met een gebakken product dat verkregen is met een deeg of beslag dat zonder stressomstandigheden is verkregen.

In een bijzondere uitvoeringsvorm voorziet de werkwijze zoals in deze aanvraag beschreven erin dat genoemd gebakken product een verbeterde versheid vertoont.

Binnen de onderhavige context verwijst versheid naar een combinatie van textuurparameters zoals zachtheid, vochtigheid, samenhang, elasticiteit en veerkrachtigheid. Verlies van versheid wordt doorgaans in verband gebracht met oudbakken worden. Meer in het bijzonder correspondeert een verbeterde versheid van een gebakken product met een verbeterde zachtheid en/of een verbeterde vochtigheid en/of een verbeterde krokante beet ten opzichte van een referentie. Deze parameters kunnen op voordelige wijze worden gemeten door middel van fysische werkwijzen, zoals met een textuurmeter, of door middel van sensorische analyse uitgevoerd met een panel van ervaren juryleden.

In deze aanvraag worden ook gebakken producten beschreven die een eerste enzym met een lage verhouding van fosfolipase A1-activiteit / fosfolipase A2-activiteit en een tweede enzym met een hoge verhouding van fosfolipase A1-activiteit / fosfolipase A2-activiteit omvatten.

Voorts heeft de onderhavige uitvinding in een ander aspect betrekking op een gebakken product bereid uit een deeg of beslag dat de compositie zoals in deze aanvraag beschreven omvat.

Binnen de context van de onderhavige uitvinding is een gebakken product een bakkerij product of banketbakkersproduct dat bekend is in het vakgebied, zoals de gebakken producten gekozen uit de groep omvattende: brood, zachte broodjes, bagels, donuts, bladerdeeggebak, hamburgerbroodjes, pizza, pitabrood, ciabatta, sponscakes, roomcakes, pondcakes, muffins, cupcakes, gestoomde cakes, wafels, brownies, cakedonuts, met gist gerezen donuts, stokbroden, broodjes, crackers, biscuits, koekjes, taartkorsten, beschuit en andere gebakken producten. Met meer voorkeur heeft de onderhavige uitvinding betrekking op brood, stokbroden en broodjes.

Een ander doel van de onderhavige uitvinding heeft betrekking op het gebruik van composities, broodverbetermiddelen, banketbakkersmixen en/of banketbakkerspremixen om gebakken producten mee te bereiden.

VOORBEELDEN

Voorbeeld 1: bepaling van de enzymatische activiteiten Lipase:

De lipaseactiviteit wordt gemeten met gebruik van p-nitrofenylpalmitaat (pNPP) als substraat. Het vrijkomen van gele p-nitrofenol als gevolg van de hydrolyse van p-nitrofenylpalmitaat door lipase wordt gemeten door middel van spectrofotometrie bij 414 nm. Eén lipase milliunit (LmU) wordt gedefinieerd als de hoeveelheid enzym die nodig is om één nanomol (nmol) p-nitrofenol per minuut vrij te maken uit p-nitrofenylpalmitaat bij 40°C en pH 7,5. Voor uitvoering van de test wordt 120 μΙ van 1 mM pNPP-oplossing (opgelost in 0,05 M Na-fosfaatbuffer bij pH 7,5 die 0,69 M aceton en 0,0049 M Triton X-100 bevat) gemengd met 60 μΙ enzymmonster en gedurende 30 minuten bij 45°C geïncubeerd. De extinctie wordt gemeten bij 414 nm tegen een substraatblanco in microtiterplaten met 96 cups.

De activiteit wordt uitgedrukt als:

LmU/ml = (((Abs enzym - Abs blanco) / 30) x 0,18)) / (13380 x 0,06)) x monsterverdunning x 1000000 [ 30 = reactietijd in minuten; 0,18 = reactievolume in ml; 13380 = molaire extinctiecoëfficiënt bij 414 nm (M'1 cm'1); 0,06 = volume enzymmonster in ml; 1000000 om te converteren naar LmU/ml ]

Fosfolioase:

De fosfolipaseactiviteit wordt gemeten met gebruik van p-nitrofenylfosforylcholine (pNPPC) als substraat. Het vrijkomen van gele p-nitrofenol als gevolg van de hydrolyse van p-nitrofenylfosforylcholine door fosfolipase wordt gemeten door middel van spectrofotometrie bij 414 nm. Eén fosfolipase milliunit (Pmll) wordt gedefinieerd als de hoeveelheid enzym die nodig is om 1 nmol p-nitrofenol per minuut vrij te maken bij 50*0 en pH 7,5. Voor uitvoering van de test wordt 120 μΙ van 0,02 mM pNPPC-oplossing (opgelost in 0,05 M Na-fosfaatbuffer bij pH 7,5 die 0,69 M aceton en 0,0049 M Triton X-100 bevat) gemengd met 60 μΙ enzymmonster en gedurende 30 minuten bij 50 geïncubeerd. Na afloop wordt 720 μΙ 1 M Na2C03 toegevoegd om de reactie te stoppen. De extinctie wordt gemeten bij 414 nm tegen een substraatblanco in microtiterplaten met 96 cups.

De activiteit wordt uitgedrukt als:

PmU /ml = (((Abs enzym - Abs blanco) / 30) x 0,9)) / (13380 x 0,06)) x monsterverdunning x 1000000 [ 30 = reactietijd in minuten; 0,9 = reactievolume in ml; 13380 = molaire extinctiecoëfficiënt bij 414 nm (M'1 cm"1); 0,06 = volume enzymmonster in ml; 1000000 om te converteren naar PmU/ml ]

Fosfolioase A1 :

De fosfolipase A1-activiteit (PLA1) wordt gemeten met gebruik van een lipidenmengsel van 16.5 μΜ dioleoylfosfatidylcholine, 16,5 μΜ dioleoylfosfatidylglycerol en 3,3 μΜ met kleurstof gelabelde N-((6-(2,4-DNP)Amino)Hexanoyl)-1-(BODIPY® FL C5)-2-Hexyl-Sn-Glycero-3-Fosfo-ethanolamine (PED-A1) als substraat (verkregen uit de EnzChek Fosfolipase A1-analysekit - ThermoFisher Scientific). De PED-A1 is specifiek voor PLA1 en is een met kleurstof gelabelde glycerofosfo-ethanolamine met een met BODIPY® FL-kleurstof gelabelde acylketen op de sn-1-positie en een met dinitrofenylquencher gemodificeerde hoofdgroep. Eén fosfolipase A1 milliunit (PA1 mU) is gedefinieerd als de hoeveelheid enzym die nodig is om één nanomol (nmol) per minuut vrij te maken van fluorescerend vetzuur gesubstitueerd op de sn-1-positie van PED-A1 bij 40^0 en pH 7,4. De test wordt uitgevoerd in microtiterplaten met 96 cups met gebruik van een totaal volume van 100 μΙ per cup. Er werden verschillende lipidenoplossingen bereid in reactiebuffer die 250 mM Tris-HCI, 0,7 M NaCI en 10 mM CaCI2 bij pH 7,4 bevatte. Monsters en controles worden gemengd met de lipidenmix in een verhouding van 1:1 (50 μΙ monster/controle en 50 μΙ lipidenmix). De enzymatische reactie wordt uitgevoerd bij 40*C gedurende 30 minuten. Er wordt een ijkkromme geconstrueerd met gebruik van verschillende concentraties fosfolipase A1 die in de kit zijn verschaft (Lecitase ultra). De fluorescentiemeting wordt uitgevoerd met excitatie bij 480 nm en met emissie bij 515 nm.

De activiteit wordt uitgedrukt als: PA1mU /ml = (((fluorescentie-intensiteit enzym - fluorescentie-intensiteit blanco) -interceptwaarde) / hellingwaarde van ijkkromme) x monsterverdunning x 1000 [1000 om te converteren naar PA1mU/ml]

Fosfolipase A2:

De fosfolipase A2-activiteit (PLA2) wordt gemeten met gebruik van een lipidenmengsel van 16.5 μΜ dioleoylfosfatidylcholine, 16,5 μΜ dioleoylfosfatidylglycerol en 1,7 μΜ met kleurstof gelabelde 1-0-(6-BODIPY® 558/568-Aminohexyl)-2-BODIPY® FL C5-Sn-Glycero-3-

Fosfocholine (Rood/Groen BODIPY® PC-A2) als substraat (verkregen uit de EnzChek Fosfolipase A2-analysekit - ThermoFisher Scientific). Het Rood/Groen BODIPY® PC-A2-substraat is selectief voor PLA2 en verschaft de mogelijkheid om gevoelig, continu, snel en in real-time PI_A2-enzymactiviteiten op te volgen. Eén fosfolipase A2 milliunit (PA2mU) is gedefinieerd als de hoeveelheid enzym die nodig is om één nanomol (nmol) per minuut vrij te maken van fluorescerend vetzuur dat is gesubstitueerd op de sn-2-positie van Rood/Groen BODIPY® PC-A2 bij 40°C eh pH 8,9. De test wordt uitgevoerd in microtiterplaten met 96 cups met gebruik van een totaal volume van 100 μΙ per cup. Er werden verschillende lipidenoplossingen bereid in een reactiebuffer die 250 mM Tris-HCI, 500 M NaCI en 5 mM CaCI2 bij pH 8,9 bevatte. Monsters en controles worden gemengd met lipidenmix in een verhouding van 1:1 (50 μΙ monster/controle en 50 μΙ lipidenmix). De enzymatische reactie wordt uitgevoerd bij 40Ό gedurende 10 minuten. Er wordt een ijkkromme geconstrueerd met gebruik van verschillende concentraties fosfolipase A2 uit gif van de honingbij, verschaft in de kit. De fluorescentiemeting wordt uitgevoerd met excitatie bij 480 nm en met emissie bij 515 nm.

De activiteit wordt uitgedrukt als: PA2mU /ml = (((fluorescentie-intensiteit enzym - fluorescentie-intensiteit blanco) -interceptwaarde) / hellingwaarde van ijkkromme) x monsterverdunning x 1000 [1000 = PA2mU/ml]

Voorbeeld 2: enzymen

De volgende enzymen werden in de onderstaande voorbeelden gebruikt. - Lipolytisch enzym met fosfolipaseactiviteit van Chaetomium thermophilum (PH2) met de aminozuursequentie van SEQ ID NO 1. - Lipolytisch enzym met fosfolipaseactiviteit van Meiothermus ruber (PH3) met de aminozuursequentie van SEQ ID NO 2. - Lipolytisch enzym met fosfolipaseactiviteit van Meiothermus silvanus (PH4) met de aminozuursequentie van SEQ ID NO 3. - Lipopan® Max (lipase van Thermomyces lanuginosus; Novozymes) (LIM) - Nagase 10P (fosfolipase A2 van; Streptomyces violaceoruber, Nagase) (NAG) - Panamore® Golden (lipase van Fusarium culmorum; DSM) (PAN)

Lecitase Ultra (eiwitgemodificeerde carboxylzuuresterhydrolase van Thermomyces lanuginosus; Novozymes) (LEC) - Bakezyme® PH 800 BG (lipase van Fusarium oxysporum; DSM) (BAK) - Veron® Hyperbake-T (lipase van Fusarium solanl·, AB enzymes) (HYP)

De PH2-, PH3- en PH4-enzymen zijn verkregen via klonering en het tot expressie brengen van de corresponderende genen, zoals hierna beschreven. De overige enzymen werden verkregen via de respectievelijke leveranciers.

Kloneren van de PH2-. PH3- en PH4-aenen

Gebaseerd op de geïdentificeerde sequenties van de vermoedelijke genen van lipolytische enzymen zijn de DNA-sequenties die coderen voor de enzymen gesynthetiseerd om tot expressie te worden gebracht in de pET22b-plasmide met gebruik van de pelB-leadersequentie en volgens standaardprotocollen.

De DNA-sequenties die corresponderen met PH2, PH3 en PH4 worden getoond in figuur 1 en zijn respectievelijk SEQ ID NO 8, SEQ ID NO 9 en SEQ ID NO 10 (zie tabel A).

De volledig gesynthetiseerde DNA-fragmenten werden gesubkloneerd in een plasmide afgeleid van pl_IC19. Deze plasmiden werden gebruikt om ultracompetente E. coli DH5a®-cellen te transformeren. Gezuiverde plasmidepreparaten gemaakt met het Pure Yield Midiprep System (Promega) werden geknipt met gebruik van geschikte restrictie-enzymen om het DNA-fragment dat de voor lipolytische enzymen coderende sequenties bevat te isoleren. Deze fragmenten werden gesubkloneerd in de pET 22b(+) kloneervector (Novagen) en de resulterende recombinante plasmiden werden getransformeerd in E. coli BL21 (DE3)-cellen (Agilent Technologies). Van de gezuiverde plasmidepreparaten gemaakt met het Pure Yield Midiprep System (Promega) werd de sequentie bepaald met gebruik van een ABI3700 DNA-sequencer (Applied Biosystems). Het bepalen van de sequentie van de geïnserteerde fragmenten werd uitgevoerd met gebruik van de universele primers T7-promotor en T7-terminator, evenals primers die corresponderen met interne DNA-sequenties. De verkregen sequenties waren identiek aan de verwachte sequenties.

Culturen van de recombinante stammen en productie van PH2. PH3 en PH4 15 ml van een precultuur van 5 uur (37Ό) van de E. coli BL21 (DE3)-cellen die de lipolytische enzymgenen dragen, werd gedurende 1 minuut bij 10000 g gecentrifugeerd en de pellet werd geresuspendeerd in 500 ml Terrifie broth (12 g/l Bacto trypton (Difco), 24 g/l gistextract (Difco), 4 ml/l glycerol, 12,54 g/l K2HP04, 2,31 g/l KH2P04) dat 200 pg/ml ampicilline bevatte in een erlenmeyer van 2 liter. De culturen werden geïncubeerd bij 37*€ en 250 rpm tot een extinctie tussen 3 en 4 bij 550 nm bekomen werd, op welk moment de expressie van het enzym werd geïnduceerd met 1mM isopropyl-1-thio-ß-galactopyranoside.

Terugwinnen van PH2. PH3 en PH4

Na 15 uur incubatie bij 37°C werden de cellen geoogst door middel van centrifatie bij 18000 g gedurende 30 minuten bij 4°C, geresuspendeerd in 50 mM BICINE dat 10 mM NaCI bevatte, gelyseerd in een voorgekoelde celdisruptie-mrichting (Panda 2K, Niro Soavi, GEA Process Engineering Division) bij 1500 bar en gedurende 30 minuten bij 40000 g gecentrifugeerd. Chromosomaal DNA werd uit de ruwe cellysaten verwijderd door behandeling met 0,2% protaminesulfaat (Calbiochem) en centrifugatie gedurende 30 minuten bij 40000 g. Vervolgens werden 25 units benzonase (Merck, Darmstadt, Duitsland) aan de oplossing toegevoegd.

Na een dergelijke behandeling worden de lipolytische enzympreparaten gezuiverd door een eindfiltratie op een Millipore POD-systeem met een cut-off bereik van 0,05 tot 1 pm, vervolgens geconcentreerd door middel van ultrafiltratie op een cross-flowfiltratiesysteem (Satocon-Sartorius) met een cut-off van 5 kDa. De geconcentreerde enzymoplossingen werden gefiltreerd op een steriel filtratiesysteem, met inbegrip van een eindfiltratie van 0,8 en 0,22 pm (absoluut filter).

De lipase- en fosfolipaseactiviteiten van de enzymen worden bepaald met gebruik van de protocollen van voorbeeld 1. De resultaten worden in tabel 1 getoond.

Tabel 1

De activiteiten van de enzymen als functie van de temperatuur worden bepaald met gebruik van de fosfolipaseanalysemethode van voorbeeld 1, met uitzondering van de temperatuur van de test. De resultaten worden weergegeven in tabel 2.

Tabel 2

De stabiliteit van de enzymen is bepaa d door een monster van het enzym voor te incuberen bij 50°C gedurende 30, 60 en 240 minuten voorafgaande aan het uitvoeren van de fosfolipaseanalysemethode zoals in voorbeeld 1. De resultaten worden weergegeven in tabel 3.

Tabel 3

Voorbeeld 3: krokante broodjes.

Het effect van het combineren van lipolytische enzymen werd getest bij het maken van krokante broodjes. Krokante broodjes werden bereid met gebruik van de deegcomposities van tabel 4.

Tabel 4

* bevat ascorbinezuur en enzymen (alfa-amylase, xylanase)

De ingrediënten werden gedurende 2 min bij lage snelheid en 5 min bij hoge snelheid gemengd in een Eberhardt N24 mixer. De uiteindelijke deegtemperatuur en de rust- en rijstemperaturen waren 25°C. Na het rusten gedurende 15 minuten bij 25°C werd het deeg opnieuw met de hand gekneed en liet men het nogmaals 10 min rusten. Daarna werden stukken deeg van 2 kg gemaakt en liet men deze 10 min rijzen. De stukken deeg van 2 kg werden verdeeld en met gebruik van de Rotamat werden ronde stukken deeg van 50 gram verkregen. Na nog een rusttijd van 5 minuten werden de stukken deeg ingesneden tijdens het drukken op de deegstukjes en werd 50% van de deegstukken onderworpen aan een laatste rijsfase bij 35 *O gedurende 120 min en werd 50% van de deegstukken onderworpen aan een schoktest (men liet de plaat met de degen op de plank vallen vanaf een hoogte van 10 cm) en onderworpen aan een laatste rijsfase gedurende 120 minuten bij 35*0. De deegstukken werden gebakken bij 230°C in een MIWE Roll-ln-oven met stoom (Michael Wenz-Arnstein-Duitsland). Het volume van 6 broodjes werd gemeten met gebruik van de algemeen gebruikte raapzaadvervangingsmethode.

De resultaten worden in tabel 5 getoond.

Tabel 5

De resultaten laten zien dat het gebruik van een enzym 1 dat correspondeert met het eerste enzym van een compositie volgens de uitvinding en een enzym 2 dat correspondeert met het tweede enzym van een compositie volgens de uitvinding een betere verbetering van het volume en een betere deegtolerantie oplevert dan de referentie of wanneer de enzymen alleen worden gebruikt. Voorts is dit effect synergistisch aangezien de enzymcombinaties resultaten opieveren die hoger zijn dan de som van de resultaten die voor de afzonderlijk gebruikte enzymen zijn verkregen.

Voorbeeld 4: krokante broodjes.

Het effect van het combineren van lipolytische enzymen werd getest bij het maken van krokante broodjes.

Krokante broodjes werden bereid en geëvalueerd als in voorbeeld 3. Enzymen werden aan het deeg toegevoegd volgens het schema van tabel 6. De enzymdoseringen waren de volgende: PH3 315 PmU / deeg; LIM 690 LmU / deeg; HYP 1200 LmU / deeg; LEC 1400 LmU/deeg.

Tabel 6

De resultaten laten zien dat het gebruik van een enzym 1 (PH3) dat correspondeert met het eerste enzym van een compositie volgens de uitvinding en een enzym 2 (LIM of HYP) dat correspondeert met het tweede enzym van een compositie volgens de uitvinding een betere verbetering van het volume en een betere deegtolerantie oplevert dan de referentie of wanneer de enzymen alleen worden gebruikt.

Claims (15)

1. CONCLUSIES

   1. Compositie omvattende: ten minste één eerste enzym met een verhouding van fosfolipase A1-activiteit / fosfolipase A2-activiteit in het bereik tussen 0,01 en 100, bij voorkeur in het bereik tussen 0,01 en 80, met meer voorkeur in het bereik tussen 0,01 en 50, met zelfs nog meer voorkeur tussen 0,01 en 25; en; ten minste één tweede enzym met een verhouding van fosfolipase A1-activiteit / fosfolipase A2-activiteit in het bereik tussen 5000 en 60000, bij voorkeur tussen 10000 en 50000, met meer voorkeur tussen 15000 en 50000, en een verhouding van fosfolipase A1-activiteit / lipaseactiviteit van 500 of meer.
2. 2. Compositie volgens conclusie 1, waarbij genoemd eerste enzym wordt gekozen uit een lipolytisch enzym met fosfolipaseactiviteit van Chaetomium thermophilum, een lipolytisch enzym met fosfolipaseactiviteit van Meiothermus ruber, een lipolytisch enzym met fosfolipaseactiviteit van Meiothermus silvanus, een lipolytisch enzym met fosfolipaseactiviteit van Streptomyces violaceoruber en/of een lipolytisch enzym met fosfolipaseactiviteit van Fusarium culmorum.
3. 3. Compositie volgens conclusie 1 of 2, waarbij genoemd eerste enzym een sequentie heeft die voor ten minste 85% identiek is aan een sequentie van SEQ ID NO 1, SEQ ID NO 2, SEQ ID NO 3, SEQ ID NO 4 en/of SEQ ID NO 5, en bij voorkeur een sequentie heeft die voor ten minste 85% identiek is aan een sequentie van SEQ ID NO 1, SEQ ID NO 2 en/of SEQ ID NO 3.
4. 4. Compositie volgens een van de voorgaande conclusies, waarbij genoemd eerste enzym wordt gekenmerkt door een optimale fosfolipaseactiviteit bij een temperatuur gelijk aan of hoger dan 45 °C.
5. 5. Compositie volgens een der voorgaande conclusies, waarbij genoemd tweede enzym wordt gekozen uit een lipolytisch enzym met fosfolipase- en lipaseactiviteiten van Thermomyces lanuginosus of een lipolytisch enzym met fosfolipase- en lipaseactiviteiten van Fusarium solani.
6. 6. Compositie volgens een der voorgaande conclusies, waarbij genoemd tweede enzym een sequentie heeft die voor ten minste 85% identiek is aan een van SEQ ID NO 6 en/of SEQ ID NO 7 of wordt gekozen uit Lipopan® Max van Novozymes of Veron® Hyperbake T van AB enzymes.
7. 7. Gebruik van een compositie volgens conclusies 1 tot 6 in bakkerijtoepassingen.
8. 8. Gebruik volgens conclusie 7 in broodverbetermiddelen.
9. 9. Gebruik volgens conclusie 7 of 8 in brood of banketbakkersproducten, bij voorkeur cakes, brood, stokbroden of broodjes.
10. 10. Broodverbetermiddel omvattende de compositie volgens een van de conclusies 1 tot 6.
11. 11. Werkwijze voor het bereiden van een gebakken product, waar tijdens de stappen van het bakproces het volgende wordt toegevoegd aan het deeg of beslag: ten minste één eerste enzym met een verhouding van fosfolipase A1-activiteit / fosfolipase A2-activiteit in het bereik tussen 0,01 en 100, bij voorkeur in het bereik tussen 0,01 en 80, met meer voorkeur in het bereik tussen 0,01 en 50, met zelfs nog meer voorkeur tussen 0,01 en 25; en; ten minste één tweede enzym met een verhouding van fosfolipase A1-activiteit / fosfolipase A2-activiteit in het bereik tussen 5000 en 60000, bij voorkeur tussen 10000 en 50000, met meer voorkeur tussen 15000 en 50000, en een verhouding van fosfolipase A1-activiteit / lipaseactiviteit van 500 of meer.
12. 12. Werkwijze volgens conclusie 11, waarbij genoemd deeg of beslag tussen 5000 en 100000 PmU /100 kg bloem, bij voorkeur tussen 7000 en 50000 PmU /100 kg bloem, met meer voorkeur tussen 10000 en 30000 PmU /100 kg bloem van genoemd eerste enzym en tussen 10000 en 100000 LmU /100 kg bloem, bij voorkeur tussen 20000 en 70000 LmU / 100 kg bloem van genoemd tweede enzym omvat.
13. 13. Werkwijze volgens conclusie 11 of 12, waarbij genoemd deeg of beslag verbeterde tolerantie laat zien.
14. 14. Werkwijze volgens conclusie 11 of 12, waarbij genoemd gebakken product verbeterde versheid laat zien.
15. 15. Gebakken product bereid uit een deeg of beslag omvattende de compositie volgens een der conclusies 1 tot 6.