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Dépolymérisation de macromolécules naturelles
La présente invention concerne un nouveau procédé pour la depolymerisation chimique contrôlée de polyanions naturels et plus spécifiquement d'acides nucléiques et de glycosaminoglycanes. Plus particulièrement, le procédé est utile pour la dépolymérisaton contrôlée de l'héparine et du dermatanesulfate (DS), qui sont difficiles à dépolymériser. La presen- te invention a pour objet les produits de la depolyme- risation de polyanions naturels et les compositions pharmaceutiques contenant ces produits, lorsqu'ils sont obtenus par le procédé de l'invention.
Les observations expérimentales suivant lesquelles la biodisponibilité et les effets biologiques de certains polyanions, lorsqu'ils sont administres par voie orale ou parentérale dans des modèles expé- rimentaux ou chez l'être humain, sont sous la dépendance du poids moléculaire moyen < PM suscitent de l'intérêt. Par exemple, l'héparine commercialisée est un agent anticoagulant bien connu en raison des propriétés activatrices qu'elle exerce, comme cofacteur, sur un puissant inhibiteur de protéase, l'anti-
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thrombine III (AT-III).
L'héparine est un glycosamino- glycane sulfaté de ## = 12.000 d (daltons). correspondant à environ 20 unités de disaccharide et dans la coagulation du sang, elle inhibe 5 facteurs, à savoir le facteur XII, le facteur XI, le facteur IX, le facteur X et le facteur 11. Par des procédés de dépolymérisation, il est possible d'obtenir des fragments ayant des poids moléculaires inférieurs à celui de l'héparine de départ. Récemment, il a été découvert que les fractions d'héparine ayant des ## de 4000 à 6000 d (héparines de bas poids moleculaire) exercent une inhibition sur certains facteurs, mais non sur d'autres et en particulier pas sur certains
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facteurs des du début de la thrombose veineuse, comme le facteur X.
Par conséquent, les héparines de bas PM'pourraient etre considerees commc etant des agents antithrombotiques efficaces exposant moins au risque d'hémorragie que l'heparine cotnmercialisee.
11 a été observe aussi que la demi-vie des héparines de bas PM dans la circulation sanguine est plus longue que la demi-vie de l'héparine commercialisée. Par conséquent, il est possible d'instaurer un traitement à long terme en évitant la perfusion goutte à goutte et les phénomènes de, rebond.
Un autre avantage des héparines de bas PH est l'absence de perturbation dans l'agrégation des plaquettes, qui est un effet indésirable qui a provoqué antérieurement de graves thrombocytopénies chez des patients au cours d'une administration d'héparine.
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Le comportement de l'acide deaoxyribonuclei- que (ADN) pour ce qui est de la depolymerisation peut être décrit comme autre exemple des propriétés des polyanions qui dépendent du poids moléculaire : l'ADN ne peut etre administré par voie parentérale en raison
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ym-6 de son PM (plus de 106 daltons), mais il manifeste des propriétés fort intéressantes lorsqu'il est depolymérisé. En fait, les oligodésoxyribonucléotides d'un PM de 25. 000 à 70. 000 d (défibrotide) exercent des effets anti-hyperfibrinolytiques et immuno-stimulants, de même que des activités dans la prophylaxie de l'infarctus.
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11 est difficile d'exécuter la depolymerisa- tion controlee des polyanions naturels et, par conséquent, de nombreuses tentatives ont été faites pour mettre au point des conditions opératoires convenant pour ces procédés.
En pratique, la dépolymérisation contrôlée des polyanions est une opération fort difficile pour
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de nombreuses raisons : a) les agents chimiques, tels qu'ils sont mis en oeuvre actuellement (acide nitreux, élimination en bêta, oxydation, hydrolyse acide ou alcaline) modifient la structure moleculaire au voisinage des liaisons affectées ou dans d'autres regions qui sont essen- tielles pour l'activité et donnent par conséquent de nouvelles substances qui pourraient être consi- dérées comme de nouveaux composés plutôt que comme des oligomeres b) les enzymes sont difficiles à manipuler lorsque la depolymerisation doit etre interrompue 4 un degré choisi au préalable et en outre certains polyanions,
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comme l'héparine, le dermatanesulfate (DS) et l'ADN,
ne sont pas facilement attaqués par les enzymes cou- rantes; c) les procédés physiques ou physico-chimiques de frac- tionnement, par exemple par passage sur tamis mole- culaire, ultrafiltration ou precipitation sélective, ne se prêtent pas à une fabrication économique a grande echelle.
Par conséquent, le but de la présente invention est de reproduire par réaction chimique certaines conditions observées et etudiees dans les tissus animaux (spécifiquement dans l'humeur vitreuse et en particulier dans le cartilage) qui conduisent à la dépolymérisation de l'acide hyaluronique (AH). In vivo, l'AH. qui est un polyanion qu'on trouve dans les tissus conjonctifs, est dépolymérisé par une réaction d'oxydo-réduction induite par radicaux libres. Des radicaux libres (superoxyde et hydroxyle) sont engendrés par des systèmes biochimiques, par exemple xanthine/xanthine oxydase en présence d'oxygene et de porteurs auto-oxydants comme la cystéine, le glutathion ou l'acide ascorbique.
La scission induite par radicaux libres des macromolé-
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cules naturelles est, croit-on, d'une importance décisive pour le début et le developpement d'etats pathologiques comme l'inflammation locale, la cataracte, l'ar- throse et sans doute aussi l'athérosclérose. Cette scission est une véritable peroxydolyse n'induisant dans la molécule pas de modifications autres que l'hydrolyse de liaisons carbone-oxygène menant à 1a dépolymé- risation de l'AH.
L'importance de reproduire la dépolymérisation
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oxydo-réductrice au laboratoire. de chimie est evidente et il en va de même de l'arrêt rapide et total de la réaction à tout degré choisi au préalable en utilisant des capteurs de radicaux.
L.'invention a pour objet un procédé caractérisé par l'utilisation d'un exces de peroxyde d'hydrogène dans des conditions d'aeration en presence de quantités catalytiques de sels ferreux comme système générateur de radicaux libres et d'ethanol comme capteur de radicaux, de meme que les produits des polyanions naturels dépolymérisés obtenus par ce procédé. Le pH de travail est neutre ou faiblement acide et de pre-
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ference le pH est de 4, 0-7, 0. L'intervalle des tem- pératures de travail (températures jusqu'à 100 C et de préférence de 20 à 80*C) permet de ralentir la réaction pour verifier les paramètres operatoires, principalement le Mf par viscositnetrie.
Le procédé de l'invention peut être appliqué de façon générale à la dépolymérisation chimique contolée des polyanions naturels. Plus spécifiquement, le procédé de l'invention permet la dépolymérisation contrôlée des acides nucléiques et des glycosaminoglycanes, comme l'héparine et le DS, qui sont difficiles
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a depolymeriser au moyen d'enzymes.
Les exemples suivants, qui ne sont pas limitatifs des applications, décrivent le procédé.
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EXEMPLE 1
On dissout 20 9 d'heparine sodique pharmacopée EUA dans 100 ml d'eau et on y ajoute sous agitation 4 g de résine cationique (Amberlite I R-120), forme H+.
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Des que le pH est descendu à 4, 0-4, 5, on sépare la ré- sine par filtration et on recueille le filtrat dans un ballon à fond rond. On le chauffe au reflux à 80 C au bain-marie et on y ajoute alors sous agitation 4, 2ml d'un reactant prepare en mélangeant 4, 0 ml de H202 à 30% et 0, 2 ml de solution de Fe II (solution A ou 1, 5 g
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FeSO.4 7H20 dans 100 ml d'eau).
On maintient le système à 80 C et on note le pH.
A intervalles déterminés au préalable, on prélève des échantillons de 20 m1 dans le ballon. A chaque echantillon, on ajoute rapidement sous agitation quelques
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gouttes de NaOH 0, 1 M pour élever le pH jusqu'à 7, 0, 0, 5 ml de solution de NaCl, 25 ml d'ethanol goutte à goutte et 3,3 ml de solution de NaCl à 20%. On procède à la collecte du précipité qu'on lave a l'éthanol, puis à l'acetone. On le sèche jusqu'au lendemain à l'étuve à vide à 50-60 C, puis on détermine le PM par viscosimetrie et l'activiste des échantillons, Les résultats sont résumés au tableau suivant.
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<tb>
<tb>
Temps <SEP> pH <SEP> ## <SEP> Activité <SEP> UI/mg <SEP> H2O2 <SEP> résiduel, <SEP> %
<tb> - <SEP> 4, <SEP> 6 <SEP> 12. <SEP> 000 <SEP> 135 <SEP> 100
<tb> 30 <SEP> 4, <SEP> 3 <SEP> 6000 <SEP> 82 <SEP> 64
<tb> 60 <SEP> 4, <SEP> 0 <SEP> 4000 <SEP> 48 <SEP> 58
<tb> 120 <SEP> 3,6 <SEP> < 2500 <SEP> 20 <SEP> 54
<tb> 180. <SEP> 3, <SEP> 5 <SEP> < 2500 <SEP> < 20 <SEP> 47
<tb> 300 <SEP> 3, <SEP> 0 <SEP> < 2500 <SEP> < 20 <SEP> 44
<tb>
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EXEMPLE 2 On dissout 20 g d'héparine sodique dans 100 ml d'eau au pH naturel de 5, 6. On chauffe la solution à
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50*C au reflux au bain-marie, puis on y ajoute 4, 6 ml d'un reactant préparé en mélangeant 4, 0 ml de H202 à 30% et 0, 6 ml de solution A (voir exemple 1). On maintient le mélange de réaction il 50 C et on note son pH.
A des intervalles déterminés au préalable, on prélève des echantillons de 20 ml dans le ballon. On traite ensuite les échantillons comme dans l'exemple 1. Les résultats sont résumés au tableau suivant.
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<tb>
<tb>
Temps <SEP> pH <SEP> ## <SEP> Activité <SEP> UI/mg <SEP> H2O2 <SEP> résiduel, <SEP> %
<tb> - <SEP> 5, <SEP> 6 <SEP> 12. <SEP> 0DO <SEP> 135 <SEP> 100
<tb> 30 <SEP> 5,3 <SEP> 10. <SEP> 000 <SEP> 114 <SEP> 96
<tb> 60 <SEP> 4, <SEP> 9 <SEP> 8000 <SEP> 109 <SEP> 90
<tb> 120 <SEP> 4, <SEP> 8 <SEP> 7000 <SEP> 75 <SEP> 83
<tb> 180 <SEP> 4,4 <SEP> 5000 <SEP> 56 <SEP> 71
<tb> - <SEP> - <SEP> - <SEP> - <SEP> -
<tb> 480 <SEP> 3,4 <SEP> < 2500 <SEP> < 10 <SEP> 3
<tb>
EXEMPLE 3
On soumet au traitement décrit dans l'exemple 1 20 g d'un mélange de sulfomucopolysaccharides naturels ayant la composition suivante : 20% de chondroltinesul-
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fate (CHS). 50% de dermatanesulfate (DS) et 30% d'hépa- ranesulfate (HS), (pH = 4,0 à 80 C, 30 ppm Fe II).
On prélève les échantillons et on en determine le pH et la viscosité intrinsèque, ainsi que les résultats d'e- lectrophorèse. Les résultats sont résumés au tableau suivant.
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<tb>
Temps <SEP> pH <SEP> Viscosité <SEP> E <SEP> L <SEP> e <SEP> c <SEP> t <SEP> r <SEP> o <SEP> p <SEP> h <SEP> o <SEP> r <SEP> è <SEP> s <SEP> e
<tb> (min) <SEP> intrinsèque
<tb> (dl/g) <SEP> CHS <SEP> DS <SEP> HS
<tb> - <SEP> 4, <SEP> 7 <SEP> 0, <SEP> 459 <SEP> 20 <SEP> 50 <SEP> 30/100
<tb> 30 <SEP> 4, <SEP> 9 <SEP> 0, <SEP> 365 <SEP> 15 <SEP> 40 <SEP> 30/85
<tb> 60 <SEP> 4, <SEP> 7
<tb> 120 <SEP> 4, <SEP> 5
<tb> 180 <SEP> 4, <SEP> 4 <SEP> - <SEP> 15 <SEP> 30 <SEP> 30/75
<tb> 300 <SEP> 3, <SEP> 8 <SEP> 0, <SEP> 225 <SEP> 5 <SEP> 15 <SEP> 15/35
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EXEMPLE 4
On dissout 20 g de désoxyribonucléate sodique de mammifère dans 100 ml d'eau au pH naturel de 6, 3.
On chauffe la solution au reflux et on suit le mode operatoire de l'exemple 1. A intervalles déterminés au préalable, on prélève des échantillons dans le ballon.
Pour chaque échantillon, on détermine le pH, le H202 résiduel et le point d'opalescence (nombre de ml d'etha- nol ajoutés goutte à goutte nécessaires pour l'opalescence permanente de la solution). On ajoute ensuite 2 volumes d'ethanol pour faire précipiter les sels d'acide nucléique depolymerise. Les résultats sont résumés au tableau suivant.
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<tb>
Temps <SEP> pH <SEP> H2O2 <SEP> résiduel <SEP> Point <SEP> d'opalescence
<tb> (min) <SEP> vol/vol
<tb> 0 <SEP> 5, <SEP> 9 <SEP> 100 <SEP> 0, <SEP> 500
<tb> 1 <SEP> 6, <SEP> 5 <SEP> 65 <SEP> 0, <SEP> 550
<tb> 2 <SEP> 6, <SEP> 5 <SEP> 59 <SEP> 0, <SEP> 630
<tb> 3 <SEP> 6, <SEP> 5 <SEP> 50 <SEP> 0,680
<tb> 4 <SEP> 6, <SEP> 5 <SEP> 42 <SEP> 0, <SEP> 680
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