AT504942A1

AT504942A1 - Verfahren zur bestimmung von probnp

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Publication number: AT504942A1
Application number: AT0036507A
Authority: AT
Original assignee: Biomedica Medizinprodukte Gmbh
Priority date: 2007-03-07
Filing date: 2007-03-07
Publication date: 2008-09-15
Also published as: EP2118668B1; US9103839B2; AT504942B1; CA2678465A1; ATE511657T1; EP2118668A1; WO2008106707A1; AU2008222578A1; CN101627310A; US20100136590A1; AU2008222578B2; ES2364942T3

Description

1

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Bestimmung von proBNP oder Fragmenten davon in Säugetieren.

Das Atriale Natriuretische Peptid (ANP), Brain Natriuretisches Peptid (BNP) und C-type natriuretisches Peptid (CNP) gehören zu einer Familie von Hormonen, die aus dem Herz-Vorhof, dem Ventrikel des Herzens und den vaskulären Endothelzellen sezer-niert werden.

Alle natriuretischen Peptide besitzen C-terminal die gleiche 17-Aminosäureringstruktur, die mit einer Disulfidbrücke verbunden ist. Dieser Teil ist für die biologische Wirkung verantwortlich. Zur Zeit sind 3 Rezeptoren, der ANP-A-Rezeptor (spezifisch für ANP und BNP), der ANP-B-Rezeptor (spezifisch für CNP und ANP) und der Clearance Rezeptor charakterisiert. BNP wurde erstmals aus dem Schweinehirn isoliert und später auch im Schweineherzen gefunden. Es wurde bereits in der Literatur beschrieben, daß die natriuretischen Peptide den Organismus gegen Flüssig-keitsüberschuß und hohen Blutdruck schützen. Die biologische, biochemische und pathophysiologische Rolle der natriuretischen Peptide ist in Übersichtsarbeiten bereits ausführlich beschrieben worden. Die "Wertigkeit der natriuretischen Peptide als Serummarker für die Diagnostik und Therapiekontrolle von Herzerkankungen beim Menschen ist heute gut dokumentiert.

Beim Menschen entsteht die reife Form des BNP, die hauptsächlich aus dem Ventrikel sezerniert wird, aus einer hochmolekularen Vorstufe, dem proBNP (1-108). Das physiologisch aktive C-terminale Peptid, proBNP (77-108), auch BNP-32 genannt, besteht aus 32 Aminosäuren, die N-terminale, im Plasma zirkulierende Form aus 76 Aminosäuren (NT-proBNP(1-76)). Weiters wurden auch die Fragmente 8-29 und 31-57 des pre-proBNP beschrieben , wobei insbesondere die Bestimmung des Fragmentes 8-29 zur Messung des NT-proBNP 1-76 analoge klinische Daten liefert.

Herzerkrankungen spielen nicht nur beim Menschen eine bedeutende Rolle, auch Tiere, im Speziellen Haustiere, wie Hunde und Katzen, oder Nutztiere, wie Pferde, sind von diesen Erkrankungen betroffen. Pferde, die an Herzkrankheiten leiden haben allgemein eine schwache Kondition, sie schwitzen schnell, der Puls ist erhöht, sie leiden unter Atemnot oder Fieber. Ca. 0,3% aller Pferde haben einen angeborenen Herzfehler, die Arterien können weniger Sauerstoff transportieren als im gesunden Zustand. Meistens entwickeln sich die Herzprobleme erst im Laufe des Lebens, 2

Herzrhythmusstörungen kommen häufig vor, sind im Ruhezustand aber meist normal. Krankhafte Herzrhythmusstörungen sind ein Zeichen für Herzmuskelschäden, die durch Sauerstoffmangel oder Infektionen entstehen können. Entzündungen am Herzmuskel bezeichnet man als Myokarditis. Bei Veränderungen der chemischen Struktur der Herzmuskelfasern kann das Herz nicht mehr richtig Blut pumpen, man spricht von Myokardosen. Herzinnenhautentzündungen, werden von Bakterien ausgelöst, die durch z.B. entzündete Hufe oder Gelenke übers Blut ins Herz gelangen. Bei der Herzbeutelwassersucht gelangt Wasser durch die Blutgefäßwände in den Herzbeutel. Eine Nichtbehandlung von Herzproblemen führt in der Regel zu einer Herzinsuffizienz. In leichten Fällen kann der Kreislauf ausgleichen, in schweren Fällen ist mit Herzversagen zu rechnen. Bei Pferden, die einen Klappenfehler der rechten Herzhälfte aufweisen, führt aufgestautes Blut in Organen zu einer Leberzirrhose. Herzkrankheiten werden von Tierärzten durch Abhören, Ultraschall oder EKG festgestellt. Das Pferd sollte zunächst keiner Belastung ausgesetzt werden und im Idealfall in 1 Offenstall oder Außenbox untergebracht werden, damit das Herz mit reichlich Sauerstoff versorgt wird. Heilung bzw. Behandlung von Herzerkrankungen können sehr lange dauern, eine Therapie dauert in jedem Fall 4-6 Wochen. Manche Pferde können dauerhaft geheilt werden, andere wiederum werden rückfällig wenn die Medikamente abgesetzt werden. Jedoch können auch im Falle einer Heilung keine Höchstleistungen mehr vom Pferd gefordert werden. Da das Herz in der Lage ist Funktionsstörungen zunächst durch Mehrarbeit auszugleichen, bleibt eine solche Erkrankung zumeist verborgen, was zur Folge hat, dass sich durch die vermehrte Herzbelastung der Zustand des Herzens verschlechtert. Die aus Herzkrankheiten resultierenden Symptome, wie Müdigkeit, Kreislaufschwäche, Abgeschlagenheit, sind meist dann erkennbar, wenn das Herz des Tieres die Schwäche nicht mehr kompensieren kann.

In einem solchen Fall ist die Herzerkrankung bereits so weit fortgeschritten, dass eine vollständige Heilung kaum mehr möglich ist. Eine möglichst frühe Diagnostik von Herzerkrankungen beim Pferd wäre daher von großer Bedeutung und könnte irreparable Schäden Vorbeugen oder sogar verhindern, dass Sportpferde endgültig vom Renn- oder Turniersport zurückgezogen werden müssen.

Chronische Herzklappen- und Herzmuskelveränderungen sind in .......... • ·· · · · · ·· ·· · • · · · · ·· · ·· ···· · · ··· ····· ··· ·· - 3 - der Regel nicht heilbar, wobei aber durch medikamentösen Einsatz das weitere Fortschreiten der Herzerkrankung verlangsamt werden kann. Auch aus diesem Grund ist es wichtig, eine Frühdiagnose für auftretende Herzerkrankungen zu stellen. Routinemäßig werden hierfür vor allem physikalische Methoden, wie das Abhören der Herztöne, die Aufnahme eines Elektrokardiogramms, Röntgen- und Ultraschalluntersuchungen, eingesetzt. Diese Untersuchungsmethoden weisen vor allem den Nachteil auf, dass sie erst dann durchgeführt werden können, wenn bereits sichtbare bzw. hörbare Schäden am Herzen direkt erkennbar werden. Des Weiteren benötigen physikalische Untersuchungsmethoden geeignete und in der Regel teure Vorrichtungen, um eine entsprechende Diagnose durchzuführen.

Insgesamt sind die Herzerkrankungen des Pferdes den analogen Erkrankungen beim Menschen sehr ähnlich.

Bei vielen Herzerkrankungen, wie z.B. Herzinsuffizienz, di-latativer Kardiomyopathie, hypertropher Kardiomyopathie, linksventrikulärer Hypertrophie und Dysfunktion, wird BNP ausgeschüttet. Dieses Hormon bewirkt die Ausscheidung von Flüssigkeit über die Niere und reguliert somit das Herz-Kreislauf-System. Da dieses Peptid im Herzen produziert wird und bei Überlastung und Überfüllung des Herzens vermehrt produziert wird, ist die Bestimmung des BNP-Spiegels im Blut ein geeignetes Mittel zur Beurteilung von Herzschwäche. BNP wie auch andere natriuretische Peptide spielen bei der Regulierung des Wasserhaushaltes und des Blutdrucks eine bedeutende Rolle. Wenn die Herzwand gedehnt wird, schüttet diese vermehrt BNP aus, was zu einer Ausscheidung von Natrium und Flüssigkeit über die Niere und zu einer Erweiterung der Blutgefäße führt, welche in Summe den Blutdruck und die Füllung des Herzens zu senken vermögen. BNP wird von den Herzmuskelzellen als proBNP synthetisiert, welches schließlich in n-terminales proBNP und BNP gespalten wird. Beide Teile des BNPs werden an das Blut abgegeben und können darin bestimmt werden.

Mit Herzerkrankungen bei Tieren beschäftigen sich unter anderem folgende einschlägigen Veröffentlichungen: Bright JM and Cali JV, J Am Vet Med Assoc 2000, 216:1110-4; Guglielmini C, Vet Res Commun 2003, 27 Suppl 1:555; Boswood A et al., J Small Anim Pract 2003, 44:104-8; Takemura N et al., J Vet Med Sei 2003, 4 65:1265-7; MacDonald KA et al., J Vet Intern Med 2003, 17:172-7; Greco DS et al., Can Vet J 2003, 44:293-7; Monnet E et al., J Am Vet Med Assoc 1997, 211:569-72; Hamlin RL et al., J Vet Intern Med 1996, 10:85-7; Gaschen L et al., J Vet Intern Med 1999, 13:346-56.

Im Stand der Technik ist bereits eine Vielzahl an Verfahren bekannt, mit deren Hilfe humanes proBNP bzw. deren Fragmente im Serum eines Individuums detektiert werden kann. Beispielhaft seien hierin die EP 0 648 228 Bl, WO 03/87819 und FR 2 843 396 erwähnt.

In der US 2004/0018577 ist ein Immunoassay der mindestens drei Antikörper umfasst, welche alle an unterschiedlichen Epito-pen eines Analyten zu binden vermögen offenbart. Die dabei zu detektierenden Analyten betreffen insbesondere die Detektion von Markern betreffend Herzerkrankungen, wobei unter anderem auch BNP und proBNP detektiert werden können.

Biondo A.W. et al. (Vet.Pathol. 2003, 40(5):501-506) beschreiben ein Verfahren zum Nachweis von ANP und BNP in Katzen; mittels polyklonaler Antikörper, die gegen ein Peptid des ANP, welches die Aminosäuren 1 bis 28 umfasst, bzw. gegen ein Peptid, welches die Aminosäuren 43 bis 56 von proBNP umfasst, gerichtet sind.

In der EP 1 016 867 Al wird ein Immunoassay für den Nachweis von preproBNP in Säugetieren beschrieben. Dabei werden Antikörper verwendet, die gegen Peptide, umfassend die Aminosäuren 27 bis 102, 73 bis 102 und 27 bis 64 von humanem BNP, gerichtet sind.

Jortani S.A. et al. (Clin.Chem.2003, 50(2):265-278) beschreiben die Verwendung von BNP und dessen prepro- und pro-Formen als mögliche Marker für Herzerkrankungen. In diesem Artikel werden keine bevorzugten Peptidregionen von BNP erwähnt, die sich eignen würden, Herzerkrankungen bei Pferden nachzuweisen.

In der WO 2000/35951 werden mehrere Peptide geoffenbart, gegen welche Antikörper hergestellt werden können, die sich in einem Verfahren zur Diagnose von Herzerkrankungen eignen. Dabei werden drei Peptide, umfassend die Aminosäuren 1 bis 13, 37 bis 49 und 65 bis 76 des humanen Nt-pro-BNP-Proteins geoffenbart, welche auch zur Herstellung von Antikörpern, die gegen diese Peptide gerichtet sind, herangezogen werden können.

In der WO 2006/027374 A sind spezifische BNP-Tests für Hunde 5 und Katzen geoffenbart. Es zeigte sich, dass mit den dort geof-fenbarten Antikörpern zwar auch BNP in manchen anderen Tieren nachgewiesen werden konnte, eine spezifische Detektion von Pfer-de-BNP konnte aber bislang nicht zur Verfügung gestellt werden.

Des Weiteren gibt es am Markt mehrere Testkits zur Detektion von humanem proBNP bzw. deren Fragmente (z.B. von Roche und Bio-medica). Nichtsdestotrotz gibt es kein bekanntes Verfahren, mit dessen Hilfe spezifisch proBNP in equinen Proben bestimmt werden kann. Daher und aufgrund der kostenintensiven und aufwendigen physikalischen Untersuchungen von Pferden ist es Aufgabe der vorliegenden Erfindung, geeignete Mittel zur Bestimmung von proBNP bzw. dessen Fragmenten in Proben aus Pferden zur Verfügung zu stellen. Insbesondere soll damit eine rechtzeitige Diagnose einer beginnenden Herzerkrankung ermöglicht werden.

Demgemäß betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Bestimmung von equinem proBNP oder Fragmenten davon umfassend die Schritte:

Bereitstellen einer equinen Probe,

Inkontaktbringen der Probe mit mindestens einem Antikörper, der spezifisch an equines proBNP bindet, und

Bestimmen der Anwesenheit und/oder Konzentration des in der Probe vorhandenen equinen proBNP oder Fragmenten davon.

Mit der vorliegenden Erfindung wird die Bestimmung von equinem proBNP zur Verfügung gestellt, indem spezifische Antikörper gegen diese Spezies offenbart werden. Damit kann eine effiziente und frühzeitige Diagnose von Herzerkrankungen im Pferd erreicht werden, welche von hoher Relevanz ist.

Vorzugsweise bindet bei der Bestimmung von equinem proBNP oder Fragmenten davon der mindestens eine Antikörper an ein (selbstverständlich Pferde-spezifisches) NT-proBNP-Epitop aus Seq.ID.No.l, insbesondere an ein Epitop, ausgewählt aus den Epi-topen mit den Sequenzen PLGGLGPASEQS, PASEQSGIQELL, LLDRLGDSV-LEP, SVLEPQAERMTL, PQAERMTLEPLQ, EPLQQDRGPAEA, LQQDRGPAEASE, DRGPAEASETRG, PAEASETRGAAP, RGAAPTGVLGPR, LGPRTKVLQALR, PRTKVL-QALRGL oder LQALRGLRSPKM.

Vorzugsweise wird bei der Bestimmung von equinem proBNP oder Fragmenten davon zusätzlich mindestens ein proBNP-Antikörper verwendet, der nicht spezifisch für equines proBNP ist.

Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens wird zusätzlich mindestens ein Antikörper verwen- 6 det, der spezifisch für equines pre-proBNP ist, insbesondere ein Antikörper, der spezifisch an mindestens ein Epitop aus Seq.I-D.No.l, ausgewählt aus den Epitopen mit den Sequenzen SPKMMRNSG-CFG oder DRIGSFSGLGCN, bindet.

Es wird darauf hingewiesen, dass die hierin offenbarten equinen proBNP-Sequenzen beispielhaft für die gesamte Pferde-Fa-milie der herangezogen wurden, womit einzelne von diesen hierin offenbarten Sequenzen abweichende Aminosäuren in den proBNP Sequenzen von Tieren anderer Gattungen dieser Familie ebenfalls unter die hierin offenbarten Sequenzen fallen, sofern diese abweichenden Aminosäuren nicht die Epitope der hierin offenbarten Antikörper in der Weise betreffen, dass eine spezifische Bindung nicht mehr ermöglicht wird. Die Aminosäuresequenzen, die hierin für die anderen Spezies offenbart sind, sind in öffentlichen Datenbanken publiziert.

Die im erfindungsgemäßen Verfahren verwendeten Proben umfassen flüssige Proben, wie beispielsweise Blut, Urin, aber auch Gewebeproben, wie beispielsweise Gewebeschnitte der Herzmuskula-tur oder des Gehirns. Je nach Bedarf können die Proben entsprechend aufbereitet werden, um beispielsweise das spätere in Kontakt Bringen der Probe mit den erfindungsgemäßen Antikörpern zu erleichtern bzw. zu ermöglichen. So können aus Blutproben Fraktionen enthaltend proBNP bzw. Fragmente davon, bereitgestellt werden oder aber auch Gewebeproben können beispielsweise homogenisiert und ebenfalls von nicht-proteinhaltigen Fraktionen abgetrennt werden.

Die Bindung von mindestens einem Antikörper an ein Epitop des equinen proBNP in der Probe bedeutet, dass der Antikörper in der Lage ist, ein Epitop in einem definierten Sequenzbereich eines spezifischen Proteins zu binden, wobei dieser Antikörper nicht in der Lage ist, Epitope des Proteins außerhalb des definierten Bereiches spezifisch zu binden.

Erfindungsgemäß kann ein Antikörper, der ein Pferde-spezifi-sches Epitop zu binden vermag, eingesetzt werden um proBNP oder Fragmente davon zu bestimmen. Dennoch kann es von Vorteil sein, mehrere (z.B. zwei, drei, vier oder fünf) Antikörper, welche verschiedene Epitope des proBNP zu binden vermögen, einzusetzen.

Die Anwesenheit bzw. die Konzentration des in der Probe befindlichen equinem proBNP oder Fragements davon kann durch an sich im Stand der Technik bekannte Methoden festgestellt werden. 7

Beispielhaft sei hierbei die Durchführung von Enzym-Immunoassays (z.B. ELISA) bei flüssigen Proben bzw. immunhistochemischen Verfahren bei Gewebeproben erwähnt. „Antikörper" gemäß der vorliegenden Erfindung umfassen auch Fragmente von Antikörpern, die in der Lage sind ein erfindungsgemäßes Epitop zu erkennen. So kann ein Antikörper beispielsweise lediglich aus dem F(ab)-Teil bestehen, der die antigenbindende Seite aufweist. Diese Antikörperfragmente können des Weiteren Teil eines bispezifischen Antikörpers oder eines „Heterominibodies" (siehe z.B. EP 1 100 830 Bl) sein. „proBNP oder deren Fragmente" umfassen erfindungsgemäß alle proBNP Bruchstücke, die in vivo entstehen (z.B. insbesondere Nt-proBNP) oder in vitro erzeugt werden (z.B. durch Versetzen einer Probe mit Protease oder chemischen Substanzen wie CNBr), und die erfindungsgemäßen Epitope aufweisen.

In einem Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung können mehrere Antikörper, die mehrere unterschiedliche Epitope an equinem proBNP spezifisch zu binden vermögen, eingesetzt werden. Aus diesem Grund kann mindestens ein Antikörper, der an mindestens ein Epitop zu binden vermag, erfindungsgemäß eingesetzt werden. Weiters sei hierbei angemerkt, dass die hier angegebenen Aminosäurebereiche nicht nur ein Epitop, sondern je nach Größe mehrere Epitope umfassen können. Somit umfasst das erfindungsgemäße Verfahren die Verwendung einer Kombination mehrerer Antikörper, die an mindestens ein Epitop spezifisch binden können.

Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform ist der mindestens eine Antikörper polyklonal und/oder monoklonal. Selbstverständlich werden erfindungsgemäß auch funktionelle Abwandlungen vollständiger Antikörper, deren Fragmente oder Derivate unter dem Begriff „Antikörper" vom Fachmann subsumiert oder als äquivalente Mittel zu den Antikörpern verstanden.

Die in einem erfindungsgemäßen Verfahren eingesetzten Antikörper können sowohl polyklonal als auch monoklonal sein. Zur Herstellung dieser Antikörper werden Peptidfragmente, umfassend die hierin offenbarten Aminosäurebereiche des equinen proBNP, verwendet. Diese Peptidfragmente können entweder synthetisch (Merrifield R.P., 1963, J Am Chem Soc 85, 2000, 149), rekombi-nant oder durch chemischen oder enzymatischen Abbau von proBNP rekombinanten oder nativen Ursprungs hergestellt werden. Die daraus gewonnenen Peptide werden abhängig von ihrer Größe an - 8 - • ·· einen immunogenen Träger (z.B. KLH) gebunden oder direkt zur Herstellung von polyklonalen oder von monoklonalen Antikörpern (z.B. Köhler G. and Milstein C., 1975, Nature 256:495; Galfre et al., 1977, Nature 266:550) eingesetzt. Erfindungsgemäß können die Antikörper auch rekombinant hergestellt werden. Verfahren zur Herstellung von rekombinanten Antikörpern sind dem Fachmann hinreichend bekannt (siehe z.B. Sambrook et al., Molecular Clo-ning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, Laboratory Press, 2001).

Gemäß einer weiteren bevorzugten Ausführungsform bindet an den mindestens einen Antikörper oder an das mindestens eine Epitop mindestens ein weiterer Antikörper, wodurch beispielsweise die Ausführung des erfindungsgemäßen Tests als Sandwich-Assay ermöglicht wird.

Die Bindung eines weiteren Antikörpers an den mindestens einen Antikörper ermöglicht es, diesen und indirekt das an den mindestens einen Antikörper gebundene Epitop qualitativ bzw. quantitativ zu bestimmen. Bindet der mindestens eine weitere Antikörper an das mindestens eine Epitop, ist es möglich, die Bindung des mindestens einen Antikörpers an das mindestens eine Epitop, wenn beispielsweise der mindestens eine Antikörper an eine Festphase immobilisiert ist, qualitativ bzw. quantitativ über ein Enzymimmunoassay zu bestimmen.

Vorzugsweise ist der mindestens eine Antikörper und/oder der mindestens eine weitere Antikörper markiert.

Der mindestens eine Antikörper und/oder der mindestens eine weitere Antikörper ist dabei mit Enzym, wie Peroxidase, insbesondere Meerrettich-Peroxidase, Biotin, Fluoreszenz-Farbstoff, insbesondere Fluoreszein (FITC, DFTF), R-Phycoerythrin (PE), Pe-ridiniumchlorophyll-Protein (PerCP) und Tandemkonjugate wie PE-Cy5 oder PE-Texas-Rot, Goldkolloid oder Radionuklide markiert.

Durch die Markierung eines der beiden Antikörper ist es möglich, durch eine Sekundärreaktion oder aber auch direkt die Anwesenheit bzw. Konzentration des markierten Antikörpers gebunden an das mindestens eine Epitop zu bestimmen. Die Antikörper selbst könnten wiederum durch Protein A Konjugate (z.B. Protein A Gold Konjugat) detektiert werden.

Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform ist der mindestens eine Antikörper oder der mindestens eine weitere Antikörper an eine Festphase gebunden. 9

Durch die Bindung des mindestens einen Antikörpers oder des mindestens einen weiteren Antikörpers können beispielsweise Antikörperchips, beschichtete Mikrotiterplatten oder Lateral Flow Devices hergestellt werden, die in einer Vielzahl von Verfahren eingesetzt werden können.

Vorzugsweise erfolgt die Bestimmung von equinem proBNP oder Fragmenten davon durch ein Verfahren ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Radioimmunassay, Immunbindungsassay, Westernblot, Immunhistochemie, Enzymimmunoassay, Lateral Flow Device (LFD, Teststreifen) und Kombinationen davon.

Die oben erwähnten Verfahren sind dem Fachmann hinreichend bekannt. Ein Überblick über diese Verfahren kann beispielsweise in „Bioanalytik" (Lottspeich und Zorbas, Spektrum Verlag 1998) gefunden werden. Lateral Flow Devices (LFD, Teststreifen) sind beispielsweise in der WO 02/059567 offenbart.

Gemäß einem weiteren Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung auch Antikörper oder Antikörpermischung, welche spezifisch an equines BNP, NT-proBNP oder proBNP binden. Unter „spezifisch binden" wird erfindungsgemäß verstanden, dass mit diesen Antikörpern spezifisch die equine From des Proteins erkannt wird und diese Antikörper nicht an proBNP anderer Spezies binden. Dabei ist ausreichend, wenn die Antikörper diese Spezifität bei bestimmten, vom Fachmann leicht zu ermittlnden Bedingungen zeigen, selbst wenn bei weniger stringenten Bedingungen (im Antigen/Ant-körper-Bindungsassay) diese Spezifität nicht vorliegt. Insbesondere wird unter „spezifisch" gemäß der vorliegenden Erfindung verstanden, dass der erfindungsgemäße Antikörper bzw. die Antikörpermischung (zB die polyklonale Antikörperpräparation oder die Mischung aus monoklonalen Antikörpern, die verschiedene Epi-tope erkennen) equines proBNP von humanem, murinem, Ratten-, porcinem, bovinem, caninem, felinem oder Schaf-proBNP in einem Bindungsassay unterscheiden kann (d.h. eine unterschiedliche Bindung eingehen bzw. ausschließlich equines preBNP binden).

Bevorzugter Weise binden die erfindungsgemäßen Antikörper oder Antikörpermischung spezifisch an mindestens ein Epitop aus Seq.ID.No.l, ausgewählt aus den Epitopen mit den Sequenzen PLG-GLGPASEQS, PASEQSGIQELL, LLDRLGDSVLEP, SVLEPQAERMTL, PQAERMTLE-PLQ, EPLQQDRGPAEA, LQQDRGPAEASE, DRGPAEASETRG, PAEASETRGAAP, RGAAPTGVLGPR, LGPRTKVLQALR, PRTKVLQALRGL, LQALRGLRS PKM, SPKMMRNSGCFG oder DRIGSFSGLGCN. Die spezifische Bindung an die 10 hierin erwähnten Pferde-spezifischen Epitope wird von den erfindungsgemäßen Antikörpern vorzugsweise in größeren Polypeptiden erzielt, vor allem in equinen pre-proBNP, proBNP, NT-proBNP oder BNP. Die erfindungsgemäßen Antikörper gehen dabei keine signifikanten Bindungen mit entsprechenden homologen Polypeptiden anderer Spezies ein, zumindest nicht unter ausreichend stringenten Bedingungen (dh solchen Bedingungen, wie sie üblicher Weise bei klinischen Immunodiagnoseverfahren von BNP eingesetzt werden.

Die erfindungsgemäßen Antikörper werden vorzugsweise durch epitopspezifische Affinitätschromatographie hergestellt oder als epitopspezifische monoklonale Antikörper (jeweils unter Verwendung von „Epitope-Mapping").

Gemäß einem weiteren Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung ein Polypeptid mit einer Aminosäuresequenz gemäß Seq.I-D.No.l, oder spezifischen Fragmenten davon, insbesondere Aminosäuren 8 bis 113, 8 bis 81 und 82 bis 113 von Seq.ID.No.l. Die Animosäuren 1 bis 7 sind im pre-proBNP nicht mehr vorhanden (Signalsequenz), ab Aminosäure 82 (S) beginnt das reife equine BNP-Hormon. Ein „spezifisches" Fragment von Seq.ID.No.l ist ein Fragment, dass sich um zumindest einen Aminosäurenrest von bekannten pre-pro-BNP-Sequenzen unterscheidet und zumindest 7, vorzugsweise zumindest 8, insbesondere zumindest 10 Aminosäuren umfasst. Besonders bevorzugte erfindungsgemäße Fragmente umfassen vorzugsweise ein oder mehrere Epitope, ausgewählt aus der Gruppe PLGGLGPASEQS, PASEQSGIQELL, LLDRLGDSVLEP, SVLEPQAERMTL, PQAERMTLEPLQ, EPLQQDRGPAEA, LQQDRGPAEASE, DRGPAEASETRG, PAEASE-TRGAAP, RGAAPTGVLGPR, LGPRTKVLQALR, PRTKVLQALRGL, LQALRGLRS PKM, SPKMMRNSGCFG oder DRIGSFSGLGCN.

Die vorliegende Erfindung betrifft daher auch ein Polypeptid mit einer Aminosäuresequenz, ausgewählt aus den Sequenzen PLGGLGPASEQS, PASEQSGIQELL, LLDRLGDSVLEP, SVLEPQAERMTL, PQAERMTLEPLQ, EPLQQDRGPAEA, LQQDRGPAEASE, DRGPAEASETRG, PAEASETRGAAP, RGAAPTGVLGPR, LGPRTKVLQALR, PRTKVLQALRGL, LQALRGLRSPKM, SPKMMRNSGCFG oder DRIGSFSGLGCN.

Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform wird das erfindungsgemäße Polypeptid chemisch synthetisiert oder von einer Probe isoliert bzw. rekombinant hergestellt.

Um das Epitop aus einem Peptid, welches aus einer Probe isoliert bzw. rekombinant hergestellt wurde, entsprechend herzustellen, kann dieses mit an sich bekannten enzymatischen bzw. 11 chemischen Methoden weiterverarbeitet werden. Die erfindungsgemäßen Polypeptide können auch als Konjugate mit weiteren Molekülen zur Verfügung gestellt werden, vorzugsweise mit weiteren Molekülen an N- oder C-Terminus der Peptide, insbesondere mit weiteren Polypeptiden, die nicht natürlicher Weise mit den erfindungsgemäßen Polypeptiden verbunden sind.

Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft die Verwendung eines erfindungsgemäßen Antikörpers oder einer Antikörpermischung zur Bestimmung von equinem proBNP oder Fragmenten davon in dem erfindungsgemäßen Verfahren.

Die erfindungsgemäßen Peptide können in kompetitiven Immuno-assays in markierter Form eingesetzt werden.

Vorzugsweise werden die Peptide gemäß der vorliegenden Erfindung zur Herstellung eines Antikörpers oder einer Antikörpermischung verwendet werden.

Des Weiteren werden die Peptide gemäß der vorliegenden Erfindung als Positivkontrolle bzw. als Standard für Konzentrationsbestimmungen in einem erfindungsgemäßen Verfahren angewendet.

Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft einen Kit zur Bestimmung von equinem proBNP oder Fragmenten davon, umfassend mindestens einen erfindungsgemäßen Antikörper oder mindestens eine erfindungsgemäße Antikörpermischung, Mittel zur qualitativen und/oder quantitativen Detektion einer Bindung des mindestens einen Antikörpers oder der mindestens einen Antikörpermischung an equinem proBNP oder Fragmenten davon und gegebenenfalls erfindungsgemäße Peptide (i.e. equines proBNP oder Fragmente davon) als Positiv-Kontrolle oder Standard für eine Konzentrationsbestimmung.

Erfindungsgemäß kann der Kit mindestens einen weiteren Antikörper umfassen.

Dieser zusätzliche Antikörper weist eine Avidität zum mindestens einen Antikörper oder aber auch zum mindestens einen Epitop auf.

Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform ist der mindestens eine Antikörper und/oder der mindestens eine weitere Antikörper markiert.

Vorzugsweise umfasst die Markierung Enyzme, wie Peroxidasen, insbesondere Meerrettich-Peroxidase, Biotin, Fluoreszenz-Farbstoffe, insbesondere Fluoreszein (FITC, DFTF), R-Phycoerythrin (PE), Peridiniumchlorophyll-Protein (PerCP) und Tandemkonjugate 12 wie PE-Cy5 oder PE-Texas-Rot, Goldkolloid oder Radionuklide.

Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft die Verwendung eines erfindungsgemäßen Kits in einem Verfahren zur Bestimmung von equinem proBNP.

Gemäß einem weiteren Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur rekombinanten Herstellung der erfindungsgemäßen Polypeptide, wobei eine Nukleinsäure, kodierend für diese Polypeptide, in einen geeigneten Wirtsorganismus eingebracht wird, die Polypeptide in an sich bekannter Weise vom Wirt exprimiert werden und die exprimierten Polypeptide gewonnen werden. Diese Methoden, inklusive geeigneter Wirte, Expressionssysteme und Verfahren zur Gewinnung der Polypeptide sind an sich dem Fachmann bekannt.

Auf der anderen Seite können die erfindungsgemäßen Polypeptide auch chemisch synthetisiert werden, vorzugsweise über die Festphasen-Methode (Merryfield). Auch hierfür steht dem Fachmann ein an sich bekannter Methodenschatz zur Verfügung.

Die vorliegende Erfindung betrifft auch die Verwendung der erfindungsgemäßen Antikörper zur Diagnose von Herzerkrankungen beim Pferd. Die Antikörper können dabei in den an sich beim Menschen bekannten Set-ups eingesetzt werden. Die erfindungsgemäßen Polypeptide können dabei ebenfalls verwendet werden zB als Standard, Vergleichsprobe oder zum Austitrieren von noch nicht ausreagierten Antikörpern.

Die Erfindung wird durch die folgenden Beispiele und Figuren näher veranschaulicht, ohne jedoch auf diese beschränkt zu sein.

Fig.l zeigt eine Anordnung bereits bekannter BNP-Sequenzen verschiedener Spezies im Vergleich mit der erfindungsgemäßen Sequenz;

Fig.2 zeigt das Design von equinen pre-proBNP-Varianten;

Fig.3 zeigt eine vergleichende Strukturanalyse der pre-proB-NPs verschiedener Spezies;

Fig.4 zeigt eine Strukturanalyse der wahrscheinlichsten Variante des Pferde-pre-proBNPs (eqpreproBNP);

Fig.5 zeigt die Isolierung von eq-pre-proBNP;

Fig.6 zeigt die Analyse der Gesamt-RNA auf einem 1,2%-igen Agarosegel: M) GeneRuler DNA Ladder Mix (Fermentas), 150 ng, 1) Gesamt-RNA rechte Herzhälfte, 1 pg, 2) Gesamt-RNA linke Herzhälfte, 1 pg;

Fig.7 zeigt die Analyse der ds cDNA auf einem 1,2%-igen Aga- 13 rosegel: M) GeneRuler DNA Ladder Mix (Fermentes), 150 ng, 1) ds cDNA aus Pferde-herzgewebe, 120 ng;

Fig.8 zeigt eine Teilsequenz der cDNA des preproBNP vom Pferd;

Fig.9 zeigt den phylogenetischer Baum aus Sequenzen verschiedener natriuretischer Peptide; die einzelnen Aminosäuresequenzen der verglichenen natriuretischen Peptide sind den einschlägigen Sequenz-Datenbanken entnommen.

Beispiele: 1. Design von Pferde- preproBNP Sequenzen:

Obwohl die Aminosäuresequenzen der zum humanen pre-proBNP analogen Moleküle einiger Spezies (Hund, Katze, Rind ...) bereits aufgeklärt worden sind^ist es bisher niemandem gelungen, das pre-proBNP des Pferdes zu isolieren und zu charakterisieren.

Dies dürfte vermutlich an der geringen Sequenzhomologie der preproBNP Moleküle verschiedener Tierarten liegen (Fig.l). Daher wurden Sequenzen entwickelt, die den Aminosäureabschnitten des pre-proBNPs des Pferdes entsprechen könnten. Diese Sequenzen sind durch die bereits publizierten Sequenzen der pre-proBNP Moleküle anderer Spezies nicht nahegelegt, da wie bereits erwähnt, nur eine geringe Übereinstimmung dieser Sequenzen vorliegt. Die Auswahl der vielversprechendsten der hypothetischen Sequenzvarianten (Fig.2) erfolgte durch einen neuartigen Ansatz, bei dem L<v die Sequenzen» einer molekularen Analyse mittels proteomischepar — 4/u

Inputs unterzogen w^den. Überraschenderweise zeigten dabei einige Varianten der erstellten Sequenzen in bestimmten Bereichen eine signifikante Übereinstimmung der sogenannten Recognition Factors, was auf eine hohe strukturelle bzw. funktionelle Konserviertheit dieser Strukturen und damit eine hohe Wahrscheinlichkeit für die Richtigkeit der Sequenzvariante schließen ließ. Fig.3 gibt einen Überblick über die durchgeführten molekularen Analysen. Fig.4 zeigt die analoge Strukturanalyse für die wahrscheinlichste Sequenzvariante.

Da die Peaks in den Recognition Factor Diagrammen Bereichen mit hoher Antigenizität bzw. Epitopverfügbarkeit entsprechen, wurde abgeleitet, dass Antikörper gegen die Bereiche 1-20 und 45-55 sich zur Darstellung des eqpreprj^feNPs eignen müssten. Sol- o 14 che Antikörper wurden hergestellt und damit die unten beschriebene Isolierung des Moleküls durchgeführt. 2. Präparation von Pferde-BNP aus Serum:

Das Pferde-pre-proBNP wird mittels einer Immunoaffinitäts-chromatographie aufgereinigt und in einem kompetitiven ELISA nachgewiesen.

Pferdeserum wurde 10 min bei 2000rpm zentrifugiert und nach Zugabe von lml/L Proclin300 bei -20°C gelagert.

Streptavidin-Sepharose (AMERSHAM) wurde mit gereinigtem, biotinyliertem S2190 Antikörper AA 45-55 beladen.(Säulenparameter 100pg Antikörper/ml Streptavidin-Sepharose). Laufparameter: Bindungspuffer 0,05M Borat pH 8.0, Elutionspuffer 0,1M Glycin-Buffer pH 2,0, 0.5ml/min 3. Nachweis von eq-pre-proBNP mittels eines kompetitiven ELISA:

Das gewonnene eq-pre-proBNP wurde in einem ELISA unter Verwendung eines Antikörpers gegen die Sequenz 1-20 nachgewiesen. Als Tracermolekül wurde ein Peroxidase markiertes Peptid entsprechender Sequenz verwendet. Fig.5 zeigt die Korrelation der Immunreaktivität mit den Elutionsprofil der Affinitätschromatographie .

Aufgrund der guten messbaren Immunreaktivität wurde davon ausgegangen, dass tatsächlich eq-pre-proBNP isoliert worden war und basierend auf den ermittelten Teilsequenzen eine molekularbiologische Amplifikation des eq-pre-proBNP in Angriff genommen (4.) . 4. Amplifikation des eq-pre-proBNP aus Gesamt-RNA aus Pferde-herzgewebe:

Ausgangsmaterial:

Zwei Röhrchen mit Pferdeherzgewebe in RNALater, die mit rechts bzw. links bezeichnet waren.

Isolierung von Gesamt-RNA:

Die Isolierung der Gesamt-RNA erfolgte mit dem RNeasy Fi-brous Tissue Midi Kit der Firma Qiagen nach Herstellerangaben. Jeweils 200 mg Gewebe aus der linken bzw. rechten Herzhälfte wurde für die Isolierung verwendet. 15

Die Qualität der Gesamt-RNA wurde auf einem 1,2%-igen Agaro-segel analysiert (Fig.6)). CDNA-Synthese:

Die Erststrang cDNA-Synthese erfolgte mit dem Library Con-struction Kit der Firma BD Biosciences nach Herstellerangaben.

Als Template wurde 1 pg Gesamt-RNA verwendet. Doppelsträngige cDNA (ds cDNA) wurde durch PCR-Amplifikation (15 Zyklen) mit dem 5' PCR Primer und dem CDS 111/3' PCR Primer dargestellt.

Die Qualität der ds cDNA wurde auf einem 1,2%-igen Agarose-gel analysiert (Fig.7). PCR-Amplifikation:

Anhand der vorgegebenen Referenzsequenzen wurden mehrere PCR-Primer abgeleitet. Zur Amplifikation des 3'-Endes des proB-NP-Gens wurden genspezifische Forward Primer und der 3' cDNA-Synthese Primer verwendet. Zur Amplifikation des 5'-Endes wurden genspezifische Reverse Primer und ein Primer, der den 3'-Bereich des SMARTIV Oligo abdeckt, verwendet.

Spezifische PCR-Produkte wurden über präparative Agarosegele aufgetrennt und die Fragmente aus dem Gel ausgeschnitten. Die Isolierung der DNA erfolgte mit dem NucleoSpin Extract II Kit der Firma Macherey-Nagel nach Herstellerangaben.

Die PCR-Fragmente wurden jeweils mit den genspezifischen Primern sequenziert. Die Sequenzdaten wurden mit dem Programm SeqMan (DNAStar Lasergene Software) getrimmt und die erzielten Sequenzen mit Nukleotid- und Protein-Sequenzen aus der Genbank Datenbank verglichen.

Klonierung:

Das PCR-Fragment, das sehr gute Homologien zu proBNP-Sequen-zen aufwies wurde in das Plasmid pAllilO kloniert. Die PlasmidDNA mehrerer Klone wurde isoliert und sequenziert. Die Sequenzdaten wurden mit dem Programm SeqMan getrimmt, die Vektorsequenz entfernt und die erhaltenen Sequenzen assembliert. Es wurden Transkripte unterschiedlicher Länge identifiziert. Dies ist darauf zurückzuführen, dass die Transkripte jeweils an unterschiedlichen Positionen polyadenyliert sind. Die resultierende Consensus-Sequenz entspricht dem kürzesten Transkript und ist in Fig.6 dargestellt. 16

Zur Amplifikation des proBNP spezifischen PCR-Fragments wurde ein 27-mer (5'-CTCCTGCTCCTCCTSTTCTTGCACCTG-3') verwendet. Der Buchstabe S steht für die Nukleotide C oder G. Beide Varianten wurden in den Klonen gefunden. Daher sind die ersten 27 Nukleotide (neun Aminosäuren) der erhaltenen Seguenz nicht als gesichert zu betrachten, denn sie sind durch den Primer vorgegeben. Die abgeleitete Aminosäuresequenz des pre-proBNP vom Pferd kann daher wie folgt angegeben werden: SPLGGRSYPL GGLGPASEQS GIQELLDRLG DSVLEPQAER MTLEPLQQDR GPAEASETRG AAPTGVLGPR TKVLQALRGL RSPKMMRNSG CFGRRLDRIG SFSGLGCNVL RRY (Seq.ID.No.1)

Die equine proBNP-Sequenz lautet (das aktive BNP-Hormon ist unterstrichen); die NT-proBNP-Sequenz besteht daher aus dem nicht-unterstrichenen Teil von Seq ID No.2: YPLGGLGPAS EQSGIQELLD RLGDSVLEPQ AERMTLEPLQ QDRGPAEASE TRGAAPTGVL GPRTKVLQAL RGLRSPKMMR NSGCFGRRLD RIGSFSGLGC NVLRRY (Seq.ID.No.2) Für die Amplifikation des vollständigen 5'-Endes des Propeptids wurden 22 sequenz-spezifische Reverse Primer synthetisiert und PCR-Amplifikationen unter verschiedenen Bedingungen durchgeführt. Es wurden spezifische PCR-Fragmente erhalten und sequenziert, jedoch konnte die 5'-Sequenz des Propeptids nicht ermittelt werden. Unter Umständen konnte das 5'-Ende nicht am-plifiziert werden, da die Gesamt-RNA Anzeichen von Degradierung aufgewiesen hat. Vielleicht ist das 5'-Ende des proBNP degradiert . -

Die Aminosäuresequenz gemäß Seq.ID.No.1 wurde in dem Programm MegAlign (DNAStar Lasergene Software) mit verschiedenen Sequenzen natriuretischer Peptide des Typ A, B und C anhand der ClustalW Methode verglichen. Die ermittelte phylogenetische Verwandtschaft der Sequenzen wurde in einem phylogenetischen Stammbaum dargestellt (siehe Fig.9). Fig.9 zeigt, dass das proBNP vom Pferd im Cluster der natriuretischen Peptide des Typ B lokalisiert ist und die größte Homologie zu der Peptidsequenz aus Schwein aufweist. 5. Spezifität der erfindungsgemäßen Antikörper:

Die Spezifität der erfindungsgemäßen Antikörper ist vor allem dadurch charakterisiert, dass sie in der Lage sind, über die ^ua£iaan^ Epitope im equinen pre-proBNP das equine Molekül von dejrt Homologen anderer bekannter Spezies (Mensch, Maus, Ratte, Schwein, Rind, Hund, Katze und Schaf) zu unterscheiden.

Die Spezifität in Bezug auf das Epitop PLGGLGPASEQS bedeutet zB, dass der erfindungsgemäße Antikörper an dieses Epitop bindet, jedoch nicht oder mit bedeutend (= z.B. im ELISA unterscheidbar) geringerer Affinität an PLGSPGSASDLE (Mensch), PLGSPSQSPEQF (Maus), PLGSPSQSPEQS (Ratte), PLGGAGLASELP (Schwein), PLGGPG-PVSELP (Rind), PLGGRSPASEAS (Hund), PLGGPGPASEAS (Katze) und PLGGPGSASELP (Schaf). Dies gilt entsprechend für die weiteren bevorzugten Epitope PASEQSGIQELL, LLDRLGDSVLEP, SVLEPQAERMTL, PQAERMTLEPLQ, EPLQQDRGPAEA, LQQDRGPAEASE, DRGPAEASETRG, PAEASE-TRGAAP, RGAAPTGVLGPR, LGPRTKVLQALR, PRTKVLQALRGL, LQALRGLRSPKM, SPKMMRNSGCFG oder DRIGSFSGLGCN (jeweils im Vergleich mit den Sequenzen gemäß Fig.l). Die spezifische Bindung an die hierin erwähnten Pferde-spezifischen Epitope wird von den erfindungsgemäßen Antikörpern vorzugsweise im Rahmen der Bindung zu größeren Polypeptiden erzielt, vor allem zu equinen pre-proB-NP, proBNP, NT-proBNP oder BNP.

Claims

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Patentansprüche: 1. Verfahren zur Bestimmung von equinem proBNP oder Fragmenten davon umfassend die Schritte: Bereitstellen einer equinen Probe, Inkontaktbringen der Probe mit mindestens einem Antikörper, der spezifisch an equines proBNP bindet, und Bestimmen der Anwesenheit und/oder Konzentration des in der Probe vorhandenen equinen proBNP oder Fragmenten davon.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass bei der Bestimmung von equinem proBNP oder Fragmenten davon der mindestens eine Antikörper spezifisch an mindestens ein spezifisches NT-proBNP-Epitop aus Seq.ID.No.l bindet, insbesondere an ein Epitop, ausgewählt aus den Epitopen mit den Sequenzen PLG-GLGPASEQS, PASEQSGIQELL, LLDRLGDSVLEP, SVLEPQAERMTL, PQAERMTLE-PLQ, EPLQQDRGPAEA, LQQDRGPAEASE, DRGPAEASETRG, PAEASETRGAAP, RGAAPTGVLGPR, LGPRTKVLQALR, PRTKVLQALRGL oder LQALRGLRSPKM.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass bei der Bestimmung von equinem proBNP oder Fragmenten davon zusätzlich mindestens ein proBNP-Antikörper verwendet wird, der nicht spezifisch für equines proBNP ist.

4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass bei der Bestimmung von equinem proBNP oder Fragmenten davon zusätzlich mindestens ein Antikörper verwendet wird, der spezifisch für equines pre-proBNP ist, insbesondere ein Antikörper, der spezifisch an mindestens ein Epitop aus Se-q.ID.No.l, ausgewählt aus den Epitopen mit den Sequenzen SPKMMRNSGCFG oder DRIGSFSGLGCN, bindet.

5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass der mindestens eine Antikörper polyklonal und/oder monoklonal ist.

6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass der mindestens eine Antikörper und/oder der mindestens eine weitere Antikörper markiert ist. - 19 - - 19 - • · · • ·· • ·· « · · ♦ · · • · ♦ · ·

7. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass der mindestens eine Antikörper und/oder der mindestens eine weitere Antikörper mit Peroxidase, insbesondere Meerrettich-Peroxidase, Biotin, Fluoreszenzfarbstoff, Goldkolloid oder Radionuklide markiert ist.

8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass der mindestens eine Antikörper oder der mindestens eine weitere Antikörper an eine Festphase gebunden ist.

9. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, dass die Bestimmung von equinem proBNP oder Fragmenten davon durch ein Verfahren ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Radioimmunassay, Immunbindungsassay, Westernblot, Immunhi-stochemie, Enzymimmunoassay, Lateral Flow Device (LFD, Teststreifen) und Kombinationen davon, erfolgt.

10. Antikörper oder Antikörpermischung, dadurch gekennzeichnet, dass er (sie) spezifisch an equines BNP, NT-proBNP oder proBNP binden.

11. Antikörper oder Antikörpermischung nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, dass dieser/diese an mindestens ein Epitop aus Seq.ID.No.l, ausgewählt aus den Epitopen mit den Sequenzen PLG-GLGPASEQS, PASEQSGIQELL, LLDRLGDSVLEP, SVLEPQAERMTL, PQAERMTLE-PLQ, EPLQQDRGPAEA, LQQDRGPAEASE, DRGPAEASETRG, PAEASETRGAAP, RGAAPTGVLGPR, LGPRTKVLQALR, PRTKVLQALRGL, LQALRGLRSPKM, SPKMMRNSGCFG oder DRIGSFSGLGCN bindet.

12. Polypeptid mit einer Aminosäuresequenz gemäß Seq.ID.No.l, oder spezifische Fragmente davon, insbesondere Fragmente mit den Aminosäuren 8 bis 113, 8 bis 81 und 82 bis 113 von Seq.ID.No.l.

13. Polypeptid, umfassend eine Aminosäuresequenz, ausgewählt aus den Sequenzen PLGGLGPASEQS, PASEQSGIQELL, LLDRLGDSVLEP, SVLEPQAERMTL, PQAERMTLEPLQ, EPLQQDRGPAEA, LQQDRGPAEASE, DRGPAEASETRG, PAEASETRGAAP, RGAAPTGVLGPR, LGPRTKVLQALR, PRTKVLQALRGL, LQALRGLRS PKM, SPKMMRNSGCFG oder DRIGSFSGLGCN.

14. Polyeptid nach Anspruch 12 oder 13, dadurch gekennzeichnet, 20 dass dps es ein chemisch synthetisiertes, von einer Probe isoliertes oder rekombinant hergestelltes Polypeptid ist.

15. Verwendung eines Antikörpers oder einer Antikörpermischung nach einem der Ansprüche 10 oder 11 zur Bestimmung von equinem proBNP oder Fragmenten davon in einem Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9.

16. Verwendung eines Peptids nach einem der Ansprüche 12 bis 14 zur Herstellung eines Antikörpers oder einer Antikörpermischung nach einem der Ansprüche 10 oder 11.

17. Verwendung eines Peptids nach einem der Ansprüche 12 bis 14 als Positiv-Kontrolle oder als Standard für eine Konzentrationsbestimmung in einem Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9.

18. Kit zur Bestimmung von equinem proBNP oder Fragmenten davon umfassend mindestens einen Antikörper oder mindestens eine Antikörpermischung nach Anspruch 10 oder 11, Mittel zur qualitativen und/oder quantitativen Detektion einer Bindung des mindestens einen Antikörpers oder der mindestens einen Antikörpermischung an equinem proBNP oder Fragmenten davon und gegebenenfalls Peptide nach einem der Ansprüche 12 bis 14 als Positiv-Kontrolle oder Standard für eine Konzentrationsbestimmung.

19. Kit nach Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet, dass die Mittel zur qualitativen und/oder quantitativen Detektion einer Bindung des mindestens einen Antikörpers oder der mindestens einen Antikörpermischung an equinem proBNP oder Fragmenten davon mindestens einen weiteren Antikörper umfassen.

20. Kit nach Anspruch 18 oder 19, dadurch gekennzeichnet, dass der mindestens eine Antikörper und/oder der mindestens eine weitere Antikörper markiert ist.

21. Kit nach einem der Ansprüche 18 bis 20, dadurch gekennzeichnet, dass der mindestens eine Antikörper und/oder der mindestens eine weitere Antikörper mit Peroxidase, insbesondere Meerrettich-Peroxidase, Biotin, Fluoreszenzfarbstoff, Goldkolloid oder Radionuklide markiert ist. 21

22. Verwendung eines Kits nach einem der Ansprüche 18 bis 21 in einem Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9.

23. Verfahren zur Herstellung von Polypeptiden nach einem der Ansprüche 12 bis 14, dadurch gekennzeichnet, dass eine Nukleinsäure, kodierend für die Polypeptide, in einen geeigneten Wirtsorganismus eingebracht wird, die Polypeptide in an sich bekannter Weise vom Wirt exprimiert werden und die exprimierten Polypeptide gewonnen werden.

24. Verfahren zur Herstellung von Polypeptiden nach einem der Ansprüche 12 bis 14, dadurch gekennzeichnet, dass die Polypeptide chemisch synthetisiert werden.

25. Verwendung eines Antikörpers nach Anspruch 10 oder 11 zur Diagnose von Herzerkrankungen beim Pferd.

26. Verwendung eines Polypeptids nach einem der Ansprüche 12 bis 14 zur Diagnose von Herzerkrankungen beim Pferd.