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Die Erfindung bezieht sich auf das Kloneren von Pollenallergenen, im besonderen auf die Klonierung und Expression von DNA, die für das Hauptallergen von Erlenpollen, Aln g i, kodiert.
Es ist seit langem bekannt, dass eine Typ l-Allergie gegen Pollenproteine mit Beschwerden wie juckende und gerötete Augen, Schnupfen, Lidödeme, Husten und Asthmabeschwerden in Zusammenhang steht. In dieser Hinsicht nehmen die Pollen frühblühender Bäume (Birke, Hasel, Erle, Hainbuche) eine wichtige Stellung ein. Zahlreiche Studien wurden durchgeführt, die Allergene dieser Pollen genau zu identifizieren und zu charakterisieren (1-4). Fortschritte hinsichtlich der exakten Charakterisierung der Pollenallergene wurden durch die Heterogenität der in Verwendung befindlichen Pollenextrakte behindert.
Ungefähr 8 Allergene des Erlenpollen rufen beim Atopiker eine IgE-Antwort hervor und eines davon, Aln g t, ein 17 kD Protein, reagiert mit einem Grossteil der Allergikerseren als das Hauptallergen (5, 6).
Mindestens 10% der Bevölkerung leiden zu verschiedenen Zeiten und in verschiedenem Ausmass an
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Es besteht die Möglichkeit einer Therapie der Pollenallergien durch Hyposensibilisierung, d. h. durch die regelmässige und langsam ansteigende Gabe der die Allergie auslösenden Proteine.
Es Ist daher eines der Ziele der vorliegenden Erfindung, eine Methode für die Herstellung von
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den Nachweis der entsprechenden Allergie und auch für eine Therapie (Hyposensibilisierung) zur Verfügung zu haben.
Gemäss der vorliegenden Erfindung wird ein rekombinantes DNA-Molekül bereitgestellt, dessen Nukleotidsequenz als Polypeptid exprimiert werden kann, das die antigenen Eigenschaften des Hauptallergens der
Erle, AInus sp., besitzt, oder als Peptid, das mindestens ein Epitop davon umfasst, oder eine Nukleotidequenz, die mit solch einer Sequenz unter stringenten Bedingungen hybridisiert oder durch Degeneration aus dieser abgeleitet werden kann. In einer bestimmten Konstruktion kann diese Nukleotidsequenz als das Hauptallergen Aln g I der Erle exprimiert werden, oder als ein Peptid, das mindestens ein Epitop davon umfasst. Diese Nukleotidsequenz kann dadurch gekennzeichnet werden, dass sie die gesamte Sequenz oder Teile dieser Sequenz, wie in Figur 1 gezeigt, beinhaltet.
Pollen von Birke, Erle, Hasel und Hainbuche besitzen in bezug auf ihre gE-Bindung ähnliche Hauptallergene, die - soweit bekannt - auf Aminosäureebene ein hohes Ausmass an Homologie aufweisen.
Daher bezieht sich die gegenwärtige Erfindung nicht nur auf das Hauptallergen der Erle, sondern auch auf andere Pollenallergene, die durch DNA-Sequenzen kodiert werden, die mit der Nukleotidsequenz von Aln g I unter stringenten Bedingungen hybridisieren oder aus dieser durch Degeneration abgeleitet werden können.
Weiters stellt diese Erfindung ein Expressionsplasmid bereit, das eine wie oben beschriebene Nuleotidsequenz beinhaltet und eine Wirtszelle, die dieses Expressionsplasmid beherbergt.
Weiters stellt diese Erfindung synthetische Proteine oder Polypeptide bereit, die die Antigenität von Teilen oder der Gesamtheit von Ain g i besitzen oder von Allergenen anderer pflanzlicher Gewebe, die aufgrund eines hohen Ausmasses an Aminosäurehomologie (7) von wenigstens 50% zu Teilen oder der Gesamtheit von Aln g I antigene Kreuzreaktivität zeigen, d. h. dass Antikörper oder zelluläre Antigenbin- dungssteilen, die eigentlich gegen Ain g I gerichtet sind, an diese Moleküle ebenfalls binden können.
Dieses synthetische Produkt kann Fusions- und Nichtfusionsproteine umfassen, die einen Polypeptidanteil enthalten, der die Antigenität eines Teiles oder der Gesamtheit von Aln g I besitzt.
Die Methode zur Herstellung eines synthetischen Proteins oder Polypeptides umfasst die Schntte der Kultur von prokaryotischen oder eukaryotischen Wirtszelle, die das beschriebene Expressionsplasmid beinhalten und die Reinigung des synthetischen Proteins oder der Polypeptide aus der Kultur.
Der Begriff "synthetisch" bezieht sich hier aber auch auf Proteine oder Polypeptide, die durch Klonierung und Expression der hier beschriebenen Nukleotidsequenz oder durch chemische Synthese nach dieser Nukleotidsequenz hergestellt werden.
Die synthetischen Proteine oder Polypeptide oder synthetischen Allergene, die gemäss dieser Erfindung erzeugt werden, besitzen die Antigenität des nativen Allergens. Wie gezeigt werden konnte, produziert ein cDNA-Klon, der für Aln g I kodiert, ein Nichtfusionsprotein, das mit IgE aus Allergikerseren reagiert. Daher wäre es möglich, dieses Protein als Antigen bei diagnostischen Tests und als Bestandteil von Therapeutika bei der Hyposensibilisierung zu verwenden.
Im besonderen können die synthetischen Allergene als diagnostische Reagentien in vitro und in vivo verwendet werden, da ihre Antigenität der des nativen Erlenpollenallergens entspricht, und sie daher IgE aus Seren von Erlenpollenallergikern binden können.
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MATERIAL UND METHODEN 1.Poly A + RNA-Isolation aus Pollen und Synthese des 1. cDNA-Stranges
Polyadenylierte mRNA wurde aus reifem Erlenpollen (Allergon AB, Engelsholm, Schweden) isoliert (1).
An dieser wurde wie folgt der
1. Strang der cDNA synthetisiert :
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2 ul 10mM Dithiothreit (DTT) 1 l Primer BP-A (100 ng/ul, Nukleotidsequenz siehe Figur 2) 2 l 25mM Desoxinukleosidtriphosphate (dNTPs), d.h. je 25mM von dATP, dCTP, dGTP, dTTP (Pharmacia, Uppsala, Schweden) 11 Ul H20
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1 l AMV Reverse Transkriptase (United States Biochemical Corporation (USB), Cleveland, Ohio, USA)
32 Units Diese Reaktion mit einem Summenvolumen von 20 ut wurde für 2 Stunden bei 42 C inkubiert, dann mit
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aufbewahrt.
2. "Polymerase chain reaction" (PCR)
Die PCR wurde an den in Schritt 1 hergestellten RNA-DNA-Hybridmolekülen durchgeführt. Als Primer für das 5'-Ende der Moleküle wurde ein Gemisch folgender zwei Oligodesoxinukleotide verwendet : Nr. 2482 5'- GTT TTC AAT TAC GAA GCG GAA AC -3' Nr. 2490 5'- GTT TTC AAT TAC GAA GCG GAG AC -3' Die Nukleotidsequenz dieser Oligodesoxinukleotide wurde von der durch Edman-Abbau teilweise bestimmten N-terminalen Aminosäuresequenz von Aln g I abgeleitet.
Als Primer für das 3'-Ende der Moleküle wurde der T 7 Primer (Pharmacia) verwendet, der auch Bestandteil des BP-A Primers ist.
Folgender Ansatz wurde für die Reaktion verwendet : 2. 5 u. t des Reaktionsgemisches aus Punkt 1
5.0 l 10x PCR Puffer (400 mM KCI, 10 mM MgCI2, 10% Gelatine, 100 mM Tris, pH 8, 3) 2.0 ui T7 Primer (Pharmacia) # 20 pmol. Nukleotidsequenz siehe Figur 2 4. 0 I. J. I Primermix zu gleichen Teilen Nr. 2482 und 2490 100 pmol
2.5 l 2mM dNTPs (Pharmacia)
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5 ul32. 5 u. ! H20 (ad 50 ul) Zugabe von 1 Unit Taq DNA Polymerase (USB). Das Reaktionsgemisch wurde 30 Sekunden bei 93 C 30 Sekunden bei 55 C und 1 Minute bei 72 - C inkubiert. Dieser Zyklus wurde insgesamt 30x durchlaufen.
Zum Abschluss wurde das Reaktionsgemisch noch weitere 10 Minuten bei 72. C gehalten.
3. Klonierung des PCR-Fragmentes und Sequenzierung
Das in der Reaktion aus Punkt 2 synthetisierte DNA-Fragment wurde aus einem 1, 5% Agarosegel mittels DEAE-Papier isoliert (8). Anschliessend wurde dieses Fragment an den 5'-Enden kinasiert. a) Kinasierung
10 ul DNA ("Q. 500 ng Ain g l DNA) 2, 5 1. 1 10x T4 Polynukleotidkinase-Puffer (Boehringer, Mannheim, Deutschland) 7, 0 u. y-32P-ATP, 10 mCl/ml (Amersham, Little Chalfont, England) 4,5 ul H20
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Danach erfolgte eine weitere Zugabe von 1 ul Polynukleotidkinase und eine Inkubation für 60 Minuten bei 37 C
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b) Klenowauffüllungsreaktion
Zur obigen Reaktion erfolgte eine Zugabe von :
1 u. i 2mM dNTPS (Pharmacia) 1 l Klenowfragment (# 2 Units) Die Reinigung des kinasierten und aufgefüllten DNA-Fragmentes erfolgte über eine"Nick Column" (Pharmacia) und wurde anschliessend mit Äthanol und Natriumacetat gefällt (9). c) Bglil Verdau des Fragmentes
An die Aln g l Sequenz wurde durch die Verwendung des BP-A-oligodesoxinukleotides (Figur 2) in der PCR eine Polyklonierungssequenz am 3'-Ende angefügt. Aus dieser Sequenz wurde die Bglll Schnittstelle zur Spaltung mit dem Restriktionsenzym BgIII ausgewählt, um das Fragment in die entsprechende Bglil Stelle des pBluescriptR Plasmides (Stratagene, La Jolla, California, USA) zu iigieren. Durch die Klenowreaktion wurden am 5'-Ende der Sequenz bereits glatte Enden erzeugt.
Die gesamte gefällte DNA aus 2b)
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(11 Units). Das Reaktionsgemisch wurde für 1, 5 Stunden bei 37'C inkubiert. Das so geschnittene Fragment wurde aus einem 1, 5% Agarosegel mittels DEAE-Papier eluiert (8). d) Ligation des DNA Fragmentes in das pBluescriptR KS + Plasmid
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Phosphatase entfernt (10), um unspezifische Religation des Vektors zu vermeiden.
Ligation des Ain g I Fragmentes in das pBluescriptR KS + Plasmid :
20 ng DNA aus 2c) in 10 gl H20 gelöst
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pH 7, 6) 1, 0 ul 10 mM ATP
3, 0 ul pBluescriptR KS + geschnitten mit EcoRV und BamHI (oA, 50 ng)
4,0 lH2O
1,0 l T4 DNA Ligase Boehringer (# 3 Units) Die Inkubation dieser Reaktion erfolgte für 4 Stunden bei Raumtemperatur. e) Transformation kompetenter Ecoli Wirtszellen
Die Transformation wurde in E. coli XL1-Blue Zellen (Stratagene) durchgeführt (11).
Die Selektion positiver Klone wurde auf ampicillinhaltigen (100 ug/ml) Kulturplatten mittels des Blau-Weiss-lndikationssy- stemes durchgeführt (12). f) Sequenzierung der Ain g I DNA
Die Sequenzierung der Aln g l DNA wurde mittels eines T7 Sequenzterungskits (Pharmacia) nach den Angaben des Herstellers durchgeführt.
4) Expression der Aln g I DNA und Nachweis der gE Bindung des daraus resultierenden Proteins a) Das DNA-Insert aus dem pBluescriptR KS + Vektor, das die für Aln g I kodierende Sequenz beinhaltet, wurde einer Mutagenese nach Kunkel (13) unterzogen. Um die Ain g I Sequenz am 5'-Ende zu vervollständigen und sie mit dem ATG Kodon und einer zusätzlichen EcoRI Schnittstelle zu versehen, wurde folgendes Oligodesoxinukleotid synthetisiert : 5'- CTT CGT AAT TGA AAA CAC CCA TGA ATT CCG ATA CCG TCG A-3' und für die Mutagenese verwendet.
Dadurch konnte die Aln g l Sequenz in der richtigen Orientierung mittels der EcoRI Schnittstelle am 5'-Ende und mittels der HindIII Schnittstelle am 3'-Ende des Gens In das Expressionsplasmid pKK 223-3 (Pharmacia) ligiert werden. E. coli K12 JM105 Zellen (thi, rpsL, endA, sbcB15, hsdR4, delta (lacpro AB)/F', thraD36, proAB, laclqz delta M15) wurden mit diesem Plasmid
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transformiert. Nach erfolgter Proteinsynthese wurden die Baktenenzellen geerntet und mit flüssigem
Stickstoff aufgebrochen. Das Lysat wurde auf einem SDS-Polyacrylamid aufgetrennt. Der Nachweis von rekombinantem Aln g l Nichtfusionsprotein wurde mittels Immunoblot erbracht. gE aus Allergikerseren konnte von dem rekombinanten Aln g I gebunden werden.
Der Nachweis des gebundenen gE erfolgt mit 125 J-markiertem anti-Human 1gE (Pharmacia). b) Das DNA-insert aus dem pBluescriptR KS+ Plasmid, das die für Aln g l kodierende Sequenz beinhaltet, wurde mittels EcoRI Linkern (Boehringer) in die Expressionsplasmide pEX A, pEX B und pEX
C (14), die den Leserahmen des Insertes jeweils um ein Nukleotid verschieben, ligiert. Dadurch konnt in einem Fall der für/t/n ss) korrekte Leserahmen erreicht und die Produktion eines rekombinanten Atn g I - Fusionsproteins induziert werden. Die Fähigkeit dieses rekombinanten Ain g I - Fusionsproteins IgE aus
Erlenpollen-Allergikerseren zu binden wurde mittels Immunoblot erbracht. Der Nachweis des gebunde- nen gE erfolgte mit 1251-markiertem anti-Human IgE (Pharmacia).
Fig. 1 zeigt die vollständige Nukleotidsequenz von Aln g i mit einer Länge von 665 Nukleotiden. Die Sequenz besteht aus einer kodierenden Region von 483 Nukleotiden, einer nichtkodierenden Region von 162 Nukleotiden und einem poly-A-Schwanz von 20 Nukleotiden. Die von den Basentripletts abgeleitete Aminosäuresequenz von Aln g) ist unter dem jeweiligen Kodon angegeben. Daraus ergibt sich für das vollständige Protein eine Länge von 159 Aminosäuren.
Fig. 2 veranschaulicht die Nukleotidsequenz des BP-A-Primers, der für die Synthese des 1. cDNA Stranges eingesetzt wurde. Die Erkennungssequenzen der Restriktionsenzyme Bglll (Nukleotide 19-24) und H) nd ! t) (Nuk ! eotide 31-36) sind unterstrichen. Die Sequenz des T7 Primers (Nukleotide 4-17), der als Primer für die PCR-Amplifikation von Aln g verwendet wurde und der Bestandteil von BP-A ist, ist ebenfalls vermerkt.
Referenzen
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9. Zitat wie 8. Unit 2. 1.
10. Zitat wie 8. Unit 3. 10.
11. Zitat wie 8. Unit 1. 8.
12. Zitat wie 8. Unit 1.
13. Kunkel, T.A., Roberts,J.D., Zakour,R.A. (1987) Rapid and efficlent site-specific mutagenesis without phenotypic selection. In : Methods in Enzymology Vol. 154. Wu, R. and Grossman, L. (eds) Academic Press, Inc., pp367-382.
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