<Desc/Clms Page number 1>
EMI1.1
EMI1.2
<Desc/Clms Page number 2>
EMI2.1
<Desc/Clms Page number 3>
abgetöteten, getrockneten M. butyricum mit 2 Teilen einer physiologischen Kochsalzlösung emulgiert werden) emulgiert und ergaben Konzentrationen von 1 gm/ml. Gruppen von Meerschweinchen wurden subkutan mit 0,5 ml der einen oder der andern Emulsion geimpft. Nach 22 Tagen wurden den Tieren die Weichen geschoren und eine Reihe von intradermalen Injektionen (0, 1 ml) mit dem in einer Verdünnungsreihe verdünnten gereinigten Hahnenfusspollenextrakt auf diese geschorenen Zonen durchgeführt. 0, 4 ml einer Saigon Lösung von Pontamine Sky Blue (Azofarbstoff der Fa. Du Pont) wurden sofort intravenös injiziert. Nach 20 min wurden die Durchmesser der gereizten Zonen gemessen und diese sind in Tabelle 2 angegeben.
Es ist ersichtlich, dass das mit Glutaraldehyd behandelte Material nicht nur Antikörper produziert, welche mit dem Ausgangsmaterial reagieren, sondern dass es auch ein wirksameres immunisierendes Material ist als das Ausgangsmaterial.
Tabelle 1
EMI3.1
<tb>
<tb> Patient <SEP> Unlöslich <SEP> gemachter <SEP> Gereinigter <SEP> Phenol-Salzlösung
<tb> Nr. <SEP> Hahnenfusspollenextrakt <SEP> Hahnenfussextrakt
<tb> 10 <SEP> mg/ml <SEP> 50 <SEP> Ilg/ml
<tb> 1 <SEP> 21 <SEP> 84 <SEP> 12
<tb> 2 <SEP> 16 <SEP> 32 <SEP> 9
<tb> 3 <SEP> 13 <SEP> 57 <SEP> 23
<tb> 4 <SEP> 15 <SEP> 51 <SEP> 4
<tb> Gesamt <SEP> 65 <SEP> 224 <SEP> 48
<tb> Gesamt
<tb> minus
<tb> die <SEP> für
<tb> Phenolsalzlösung <SEP> 17 <SEP> 176
<tb>
Tabelle 2
EMI3.2
<tb>
<tb> Meerschweinchen <SEP> Immunisierendes <SEP> Durchmesser <SEP> der <SEP> Reizzone <SEP> (mm) <SEP> für <SEP> die <SEP> Menge
<tb> Nr.
<SEP> Material <SEP> Hahnenfusspollenextrakt, <SEP> die <SEP> intradermal <SEP> injiziert <SEP> wurde
<tb> (0, <SEP> 5 <SEP> mg) <SEP> 100 <SEP> jlg <SEP> 10jUg <SEP> 1 <SEP> pg <SEP> 0, <SEP> 1 <SEP> jlg <SEP> 0, <SEP> 0l <SEP> g <SEP> 0, <SEP> 00l <SEP> g
<tb> 1 <SEP> gereinigter <SEP> 15 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0
<tb> Hahnenfuss-
<tb> 2 <SEP> @ <SEP> 16 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0
<tb> pollenextrakt
<tb> 3 <SEP> 17 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0
<tb> 4 <SEP> 16 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0
<tb> 5 <SEP> mit <SEP> Glutaral- <SEP> 14 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0
<tb> 6 <SEP> dehyd <SEP> behan-
<tb> 7 <SEP> delter <SEP> Hahnen <SEP> 12 <SEP> 10 <SEP> 9 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0
<tb> 8 <SEP> fusspollen- <SEP> 14 <SEP> 13 <SEP> 12 <SEP> 12 <SEP> 10 <SEP> 8
<tb> extrakt <SEP> 16 <SEP> 14 <SEP> 12 <SEP> 11 <SEP> 10 <SEP> 8
<tb> 9
<SEP> 12 <SEP> 10 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0
<tb> 10 <SEP> 12 <SEP> 9 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0
<tb>
<Desc/Clms Page number 4>
EMI4.1
rigem Phenol und anschliessende Ausfällung des Proteins aus der Phenolphase, um auf diese Weise den Grossteil der Kohlehydrate und der Materialien mit niederem Molgewicht zu entfernen, gereinigt worden war, wurden in 5 ml 0,5 m Boratpuffer, PH-Wert 8, 85, gelöst. 5 ml einer 2%gen Lösung von 1-Cyc1ohexyl-3- (2-morpho- linäthyl)-carbodiimidmetho-p-toluolsulfonat wurden langsam zugefügt und die Lösung bei Zimmertemperatur über Nacht gerührt. Der gebildete Niederschlag wurde hierauf abzentrifugiert, dreimal mit Boratpuffer gewaschen und in Phenol-Salzlösung suspendiert.
Test auf Allergenität
Eine Suspension des Testmaterials und eine Lösung des Ausgangsmaterials, beide in Phenol-Salzlösung, und das Medium selbst wurden jeweils in die Haut von grasempfindlichen allergischen Patienten injiziert.
Reizzonen wurden nach 10 min gemessen.
Die Ergebnisse des Allergenitättests sind in Tabelle 3 gezeigt.
Tabelle 3
EMI4.2
<tb>
<tb> Patient <SEP> Gemischter <SEP> Mit <SEP> Carbodiimid <SEP> Phenol-Salzlösung
<tb> Nr. <SEP> Graspollenextrakt <SEP> behandelter
<tb> .., <SEP> gemischter
<tb> Graspollenextrakt
<tb> 1 <SEP> 12 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP>
<tb> 2 <SEP> 3 <SEP> 2 <SEP> 0 <SEP>
<tb> 3 <SEP> 8 <SEP> 0 <SEP> 0
<tb> 4 <SEP> 12 <SEP> 0 <SEP> 0
<tb> 5 <SEP> 15 <SEP> 0 <SEP> 0
<tb> 6 <SEP> 62 <SEP> 3 <SEP> 0
<tb> Total <SEP> 112 <SEP> 5 <SEP> 0
<tb>
Die Zahlen bedeuten Reizzonen in mm2.
Test für die Immunogenität
Wiederholt behandelte Meerschweinchen wurden durch subkutane Injektion einer Emulsion, die das Testmaterial in einem Freund's-Adjuvans enthielt, immunisiert. Eine ähnliche Gruppe von Meerschweinchen wurde mit nicht modifiziertem Ausgangsmaterial, welches auf die gleiche Weise in einem Hilfsstoff gelöst war, immunisiert. Nach 21 bis 8 Tagen wurden die Weichen der Tiere geschoren und eine Reihe von intradremalen Injektionen (0, 1 ml) mit einer Verdünnungsreihe endend mit der normalen Salzlösung des Ausgangsmaterials in diese geschorenen Stellen gemacht.
0, 4 ml einer 5%igen Lösung von Pontamine Sky Blue wurde sofort intravenös injiziert. Nach 20 min bildeten sich an manchen Stellen der intradermalen Injektion blaugefärbte Reizzonen, die die Anwesenheit von Antikörper mit der Spezifität auf das Ausgangsmaterial anzeigen. Die Durchmesser der gereizten Zonen wurden gemessen und aufgezeichnet.
Die Ergebnisse der Immunitätstests sind in Tabelle 4 gezeigt.
<Desc/Clms Page number 5>
Tabelle 4
EMI5.1
<tb>
<tb> Meerscheinchen <SEP> Immunisierendes <SEP> Durchmesser <SEP> der <SEP> Reizzone <SEP> (mm) <SEP> auf <SEP> die <SEP> Menge <SEP> des
<tb> Nr. <SEP> Material <SEP> gemischten <SEP> Graspollenextraktes, <SEP> die <SEP> intradermal
<tb> injiziert <SEP> wurde
<tb> 100 <SEP> j <SEP> g <SEP> 1Ojug <SEP> 1jLtg <SEP> 0, <SEP> 1 <SEP> jug <SEP> 0, <SEP> 01 <SEP> lig <SEP> 0,
<SEP> 001 <SEP> lig <SEP>
<tb> 1 <SEP> gemischter <SEP> 14 <SEP> 12 <SEP> 10 <SEP> 9 <SEP> 8 <SEP> 8
<tb> 2 <SEP> Graspollen- <SEP> 14 <SEP> 13 <SEP> 10 <SEP> 9 <SEP> 8 <SEP>
<tb> extrakt
<tb> 3 <SEP> 16 <SEP> 14 <SEP> 12 <SEP> 10 <SEP> 9 <SEP> 9
<tb> 4 <SEP> 14 <SEP> 13 <SEP> M
<tb> 5 <SEP> Mit <SEP> Carbodiimid <SEP> 14 <SEP> 12 <SEP> 10 <SEP> 10 <SEP> 19
<tb> 6 <SEP> behandelter <SEP> 12 <SEP> 10
<tb> gemischter
<tb> 7 <SEP> Graspollen- <SEP> 12 <SEP> 10 <SEP> 9 <SEP> 9 <SEP> 9
<tb> 8 <SEP> extrakt <SEP>
<tb>
Aus den Ergebnissen, die in den Tabellen 3 und 4 gezeigt sind, kann man ersehen, dass höhere Mengen Antikörper durch die Immunisierung mit mit Carbodiimid modifiziertem Allergen gebildet werden, dass aber die Allergenität des Materials vernachlässigbar war.
Verfahrensweise 3 :
50 mg Material, welches aus gemischten Graspollen extrahiert und teilweise gereinigt worden war, um den Grossteil an Kohlehydraten und niedermolekularem Material zu entfernen, wurden in 5 ml 0, 01 m-Phosphatpuffer, pH-Wert 8,0, gelöst 1 ml 1-Chlor-2,3-epoxypropan wurde langsam zugegeben und die Mischung über Nacht bei Zimmertemperatur gerührt. Der gebildete Niederschlag wurde abzentrifugiert, mit Phosphatpuffer gewaschen und in Phenol-Salzlösung suspendiert.
Test auf Allergenität
Eine Suspension des Testmaterials und eine Lösung des Ausgangsmaterials, beide in Phenol-Salzlösung, und das Medium selbst, wurden jeweils in die Haut von grasempfindlichen, allergischen Patienten injiziert.
Reizzonen wurden nach 10 min gemessen. Die Ergebnisse des Tests auf Allergenität sind in Tabelle 5 gezeigt.
Tabelle 5
EMI5.2
<tb>
<tb> Patient <SEP> Gemischter <SEP> Mit <SEP> Epichlorhydrin <SEP> behandelter <SEP> Phenol-Salzlösung
<tb> Nr. <SEP> Graspollenextrakt <SEP> gemischter <SEP> Graspollenextrakt
<tb> (50 <SEP> g/ml) <SEP> (1mg/ml)
<tb> 1 <SEP> 62 <SEP> 0 <SEP> 0
<tb> 2 <SEP> 15 <SEP> 1 <SEP> 0
<tb> 3 <SEP> 12 <SEP> 0 <SEP> 0
<tb> 4 <SEP> 8 <SEP> 2 <SEP> 0
<tb> 5 <SEP> 3 <SEP> 0 <SEP> 0
<tb> 6 <SEP> 12 <SEP> 0 <SEP> 0
<tb> Total <SEP> 112 <SEP> 3 <SEP> 0
<tb>
Die Zahlen bedeuten Reizzonen in mm2.
<Desc/Clms Page number 6>
Test auf Immunogenität
Wiederholt behandelte Meerschweinchen wurden durch subkutane Injektion einer Emulsion, die das Testmaterial in Freund's-Adjuvans enthielt, immunisiert. Eine ähnliche Reihe von Meerschweinchen wurde mit nicht modifiziertem Ausgangsmaterial in der gleichen Hilfslösung immunisiert. Nach 21 bis 8 Tagen wurden die Weichen der Tiere geschoren und in diese geschorenen Flächen eine Reihe von intradermalen Injektionen (0, 1 ml) mit einer Verdünnungsreihe des Ausgangsmaterials, endend mit der normalen Salzlösung, gemacht.
0, 4 ml einer Saigon Lösung von Pontamine Sky Blue wurden sofort intravenös injiziert. Nach 20 min bildeten sich an manchen Stellen der intradermalen Injektion blaugefärbte Reizzonen, die die Anwesenheit von Antikörper mit der Spezifität auf das Ausgangsmaterial anzeigen. Die Durchmesser dieser Zonen wurden gemessen und aufgezeichnet. Die Ergebnisse des Tests auf die Immunogenität sind in Tabelle 6 gezeigt.
Tabelle 6
EMI6.1
<tb>
<tb> Meerschweinchen <SEP> Immunisierendes <SEP> Durchmesser <SEP> der <SEP> gereizten <SEP> Zone <SEP> (mm) <SEP> auf <SEP> die <SEP> Menge
<tb> Nr. <SEP> Material <SEP> des <SEP> gemischten <SEP> Graspollenextraktes, <SEP> welche
<tb> intradermal <SEP> injiziert <SEP> wurde
<tb> 100 <SEP> p.
<SEP> g <SEP> 10 <SEP> g <SEP> 1 g <SEP> 0, <SEP> 1 <SEP> lig <SEP> 0, <SEP> 01 <SEP> big <SEP> 0, <SEP> 001 <SEP> big <SEP>
<tb> 1 <SEP> gemischter <SEP> 14 <SEP> 13 <SEP> 10--
<tb> 2 <SEP> Graspollen- <SEP> 16 <SEP> 14 <SEP> 12 <SEP> 10 <SEP> 9 <SEP> 9
<tb> extrakt
<tb> 3 <SEP> (8 <SEP> mg) <SEP> 14 <SEP> 13 <SEP> 10 <SEP> 9 <SEP> 8
<tb> 4 <SEP> 14 <SEP> 12 <SEP> 10 <SEP> 9 <SEP> 8 <SEP> 8
<tb> 5 <SEP> Mit <SEP> Epichlor-12 <SEP> 10--- <SEP>
<tb> 6 <SEP> hydrin <SEP> be-10---- <SEP>
<tb> Handelter
<tb> 7 <SEP> gemischter-
<tb> 8 <SEP> Graspollen-10extrakt
<tb> (5 <SEP> mg)
<tb> 9 <SEP> gemischter <SEP> 12 <SEP> 9 <SEP> - <SEP> - <SEP> -
<tb> 10 <SEP> Graspollen-14 <SEP> 12 <SEP> 9 <SEP> - <SEP> extrakt
<tb> 11 <SEP> (0,5 <SEP> mg)
<SEP> 12 <SEP> 11 <SEP> 9 <SEP> - <SEP> -
<tb> 12 <SEP> 14 <SEP> 12 <SEP> 9 <SEP> - <SEP> - <SEP> -
<tb> 13 <SEP> Mit <SEP> Epichlor-10 <SEP> 8--- <SEP>
<tb> hydrin <SEP> be- <SEP>
<tb> 14 <SEP> handelter
<tb> 15 <SEP> Graspollen-10 <SEP> 8 <SEP>
<tb> extrakt
<tb> (0,5 <SEP> mg)
<tb>
Aus den obigen Ergebnissen ist ersichtlich, dass nachweisbare Mengen von Antikörper durch Immunisierung mit mit Epichlorhydrin behandeltem Allergen gebildet werden, während die Allergenität auf ein vernachlässigbares Mass herabgesetzt wurde.
Verfahrensweise 4 :
50 mg Material, welches aus Hahnenfussgraspollen extrahiert worden war, wurden in 10 ml 0, 01 m-Puffer, pH-Wert 8, gelöst. 1 ml l-Brom-2, 3-epoxypropan wurde langsam hinzugefügt und die Mischung über Nacht bei Zimmertemperatur gerührt. Der gebildete Niederschlag wurde abzentrifugiert, mit Phosphatpuffer gewaschen und in Phenol-Salzlösung suspendiert.
<Desc/Clms Page number 7>
Die Ergebnisse der biologischen Tests sind in den Tabellen 7 und 8 gezeigt. Die Testmethoden waren die gleichen wie in Beispiel 3. Nachweisbare Mengen von Antikörper wurden durch die Immunisierung gebildet, während die Allergenität auf ein vernachlässigbares Mass herabgesetzt wurde.
Tabelle 7
EMI7.1
<tb>
<tb> Immunogenität <SEP> von <SEP> mit <SEP> Epibromhydrin <SEP> behandeltem <SEP> Allergen
<tb> Meerschweinchen <SEP> Immunisierendes <SEP> Zonendurchmesser <SEP> (mm) <SEP> auf <SEP> die <SEP> Menge <SEP> HahnenfussNr. <SEP> Material <SEP> pollenextrakt, <SEP> die <SEP> intradermal <SEP> injiziert <SEP> wurde
<tb> 100 <SEP> jag <SEP> 10 <SEP> mg <SEP> 1 <SEP> jug <SEP> 0, <SEP> 1 <SEP> flg <SEP> 0, <SEP> 01 <SEP> jlg <SEP> 0, <SEP> 001 <SEP> g
<tb> 1 <SEP> Hahnenfuss-16 <SEP> 10-- <SEP>
<tb> pollenextrakt
<tb> ponenextrakt <SEP> 16 <SEP> 10 <SEP> - <SEP> -
<tb> 3 <SEP> 16 <SEP> 10----
<tb> 4 <SEP> Mit <SEP> Epibrom-14 <SEP> 10-- <SEP>
<tb> hydrin <SEP> behandelter
<tb> 6 <SEP> Hahnenfuss-15 <SEP> 10- <SEP>
<tb> extrakt
<tb> (0,5 <SEP> mg)
<tb>
Tabelle 8
EMI7.2
<tb>
<tb> Allergenität <SEP> von <SEP> mit <SEP> Epibromhydrin <SEP> behandeltem <SEP> Allergen
<tb> Patient <SEP> Hahnenfuss- <SEP> Mit <SEP> Epibromhydrin <SEP> behandelter <SEP> Phenol-Salzlösung
<tb> Nr. <SEP> extrakt <SEP> Hahnenfusspollenextrakt
<tb> 100 <SEP> Jlg/ml <SEP> 100 <SEP> g/ml
<tb> 1 <SEP> 9 <SEP> 0 <SEP> 0
<tb> 2 <SEP> 18 <SEP> 0 <SEP> 0
<tb> 3 <SEP> 22 <SEP> 0 <SEP> 0
<tb> 4 <SEP> 21 <SEP> 0 <SEP> 0
<tb> Total <SEP> 70 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP>
<tb>
Verfahrensweise 5 :
Herstellung von cyanat-modifiziertem Allergen
Ein wässeriger Extrakt von gemischten Graspollen (Straussgras, Ginster, Hahnenfuss, Hundeschwanzgras, Falscher Hafer, Schwingelgras, Fuchsschwanzgras, Wiesenroggen, Frühlings-Wiesen-Lieschgras und Yorkshire Nachmahd) wurde durch Behandeln mit wässerigem Phenol und darauffolgendes Ausfällen des Proteins aus der Phenolphase, um den Grossteil des Kohlehydrats und der niedermolekularen Materialien zu entfernen, teilweise gereinigt. 50 mg des erhaltenen teilweise gereinigten allergenen Proteins wurden in 5 ml Wasser gelöst und der pH-Wert durch Zugabe von Natriumhydroxydlösung auf 6 eingestellt. Der pH-Wert wurde hierauf mit Essigsäure auf 5,0 eingestellt. 0, 2 g Kaliumcyanat wurden zugegeben und die Mischung über Nacht bei Zimmertemperatur gerührt.
Der gebildete Niederschlag wurde wiederholt mit Phosphatpuffer von pH-Wert 8 gewaschen und hierauf in Phenol-Salzlösung suspendiert.
Test auf Allergenität
Eine Suspension des cyanatmodifizierten Allergens, welches wie oben beschrieben hergestellt wurde, eine Suspension des unmodifizierten, teilweise gereinigten Allergenextrakts (beide in Phenol-Salzlösung) und das
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Phenol-Salzmedium selbst wurden jeweils in die Haut von grasempfindlichen allergischen Patienten injiziert. Die gereizten Zonen wurden nach 10 min gemessen und sind in Tabelle 9 in mm2 ausgedrückt. Es ist ersichtlich, dass das cyanatmodifizierte Allergen eine gegenüber dem unmodifizierten Material vernachlässigbare Allergenität zeigt.
Tabelle 9
EMI8.1
<tb>
<tb> Patient <SEP> Gemischter <SEP> cyanat-behandelter <SEP> gemischter <SEP> Phenol-Salzlösung
<tb> Nr. <SEP> Graspollenextrakt <SEP> Graspollenextrakt
<tb> 50 <SEP> mglml <SEP> 1 <SEP> mg/ml
<tb> 1 <SEP> 12 <SEP> 4 <SEP> 0
<tb> 2 <SEP> 3 <SEP> 2 <SEP> 0
<tb> 3 <SEP> 8 <SEP> 6 <SEP> 0
<tb> 4 <SEP> 12 <SEP> 3 <SEP> 0
<tb> 5 <SEP> 15 <SEP> 5 <SEP> 0
<tb> 6 <SEP> 62 <SEP> 24 <SEP> 0
<tb> Total <SEP> 112 <SEP> 44 <SEP> 0
<tb>
Test für Immunogenität
Wiederholt behandelte Meerschweinchen wurden durch subkutane Injektion einer Emulsion, die das cyanat-modifizierte Allergen in Freund's-Adjuvans enthielt, immunisiert. Eine ähnliche Reihe von Meerschweinchen wurde durch unmodifiziertes Ausgangsmaterial im gleichen Hilfsstoff immunisiert.
Nach 21 bis 28 Tagen wurden die Weichen beider Tierreihen geschoren und eine Reihe von intradermalen Injektionen (0, 1 ml) mit einer Verdünnungsreihe des Ausgangsmaterials endend mit normaler Salzlösung in die geschorenen Flächen durchgeführt.
0, 4 ml einer Neigen Lösung von Pontamine Sky Blue wurden sofort intravenös injiziert. Nach 20 min bildeten sich blaugefärbte Reizzonen an manchen Stellen der intradermalen Injektion, welche die Anwesenheit von Antikörper mit der Spezifität für das Ausgangsmaterial anzeigten. Wieder wurden die Durchmesser der gereizten Zonen gemessen und in Tabelle 10 aufgezeichnet. Es ist ersichtlich, dass das cyanat-modifizierte Allergen die immunisierende Spezifität des Ausgangsmaterials beibehält.
<Desc/Clms Page number 9>
Tabelle 10
EMI9.1
<tb>
<tb> Meerschweinchen <SEP> Immunisierendes <SEP> Durchmesser <SEP> der <SEP> Reizzonen <SEP> (mm) <SEP> auf <SEP> die <SEP> Menge <SEP> des
<tb> Nr. <SEP> Material <SEP> gemischten <SEP> Graspollenextraktes, <SEP> die <SEP> intradermal
<tb> injiziert <SEP> wurde
<tb> 100 <SEP> g <SEP> 10 <SEP> g <SEP> 1 <SEP> g <SEP> 0,1 <SEP> g <SEP> 0,01 <SEP> g <SEP> 0,001 <SEP> g
<tb> 1 <SEP> Gemischter <SEP> 14 <SEP> 12 <SEP> 10 <SEP> 9 <SEP> 8 <SEP> 8
<tb> 2 <SEP> Graspollen- <SEP> 14 <SEP> 13 <SEP> 10 <SEP> 9 <SEP> 8 <SEP> - <SEP>
<tb> extrakt
<tb> 3 <SEP> (5 <SEP> mg) <SEP> 16 <SEP> 14 <SEP> 12 <SEP> 10 <SEP> 9 <SEP> 9
<tb> 4 <SEP> 14 <SEP> 13 <SEP> 10
<tb> 5 <SEP> MitCyanat <SEP> 12 <SEP> 9 <SEP> 7
<tb> 6 <SEP> behandelter <SEP> 12 <SEP> 9 <SEP>
<tb> gemischter
<tb> 7 <SEP> Graspollen <SEP> 10
<tb> 8 <SEP> extrakt
<tb> mg)
<tb> (5 <SEP> mg)
<tb> 9 <SEP> Gemischter <SEP> 14 <SEP> 12 <SEP> 9
<tb> 10 <SEP> Graspollen- <SEP> 11 <SEP> 9
<tb> extrakt
<tb> 11 <SEP> (0,5 <SEP> mg) <SEP> 14 <SEP> 12 <SEP> 9
<tb> 12 <SEP> 12 <SEP> 9
<tb>
Verfahrensweise 6 :
Um eine Bestätigung für die biologischen Testergebnisse zu erhalten, wurde das Verfahren nach Verfahrensweise 5 wiederholt. Die Ergebnisse des Allergenitätstests von modifiziertem Allergen sind in Tabelle 11 und die Ergebnisse des Immunogenitätstests des cyanat-modifizierten Allergens in Tabelle 12 angegeben.
Tabelle 11
EMI9.2
<tb>
<tb> Patient <SEP> Gemischter <SEP> Mit <SEP> Cyanat <SEP> behandelter
<tb> Nr. <SEP> Graspollenextrakt <SEP> gemischter <SEP> Graspollenextrakt <SEP> Phenol-Salzlösung
<tb> 100 <SEP> g/ml <SEP> 2 <SEP> mg/ml
<tb> 1 <SEP> 23 <SEP> 1 <SEP> 1 <SEP>
<tb> 2 <SEP> 6 <SEP> 0 <SEP> 0
<tb> 3 <SEP> 2 <SEP> 0 <SEP> 0
<tb> 4 <SEP> 19 <SEP> 0 <SEP> 0
<tb> Total <SEP> 50 <SEP> 1 <SEP> 1 <SEP>
<tb>
Die Zahlen bedeuten die Reizzonen in mm2.
<Desc/Clms Page number 10>
Tabelle 12
EMI10.1
<tb>
<tb> Meerschweinchen <SEP> Immunisierendes <SEP> Reizzonendurchmesser <SEP> (mm) <SEP> auf <SEP> die <SEP> Menge <SEP> des
<tb> Nr. <SEP> Material <SEP> injizierten <SEP> Graspollenextrakts
<tb> 100 <SEP> mg <SEP> 10 <SEP> g <SEP> 1 <SEP> g <SEP> 0,1 <SEP> g <SEP> 0,01 <SEP> g <SEP> 0,001 <SEP> g
<tb> 1 <SEP> Gemischter <SEP> 12 <SEP> 10 <SEP> 9 <SEP> 8
<tb> 2 <SEP> Graspollen- <SEP> 12 <SEP> 10 <SEP> 7 <SEP> extrakt
<tb> 3 <SEP> (5 <SEP> mg) <SEP> 12 <SEP> 10 <SEP> 8 <SEP> -
<tb> 4 <SEP> 12 <SEP> 10 <SEP> 9 <SEP> - <SEP> - <SEP> -
<tb> 5 <SEP> Mit <SEP> Cyanat <SEP> 12 <SEP> 10 <SEP> - <SEP> -
<tb> 6 <SEP> behandelter <SEP> 12 <SEP> 9
<tb> gemischter
<tb> 7 <SEP> Graspollen- <SEP> 14 <SEP> 12 <SEP> 9 <SEP> - <SEP> - <SEP> -
<tb> 8 <SEP> extrakt <SEP> 14 <SEP> 10 <SEP> - <SEP> - <SEP> - <SEP> -
<tb> (5 <SEP> mg)
<tb> 9 <SEP> gemischter <SEP> 14 <SEP> 10 <SEP> - <SEP> -
<tb> 10 <SEP> Graspollen- <SEP> 12 <SEP> 11 <SEP> 9 <SEP> extrakt
<tb> 11 <SEP> (0, <SEP> 5 <SEP> mg) <SEP> 10 <SEP> 9 <SEP> - <SEP> - <SEP> - <SEP> - <SEP>
<tb> 12 <SEP> - <SEP> - <SEP> - <SEP> - <SEP> - <SEP> - <SEP>
<tb> 13 <SEP> Mit <SEP> Cyanat <SEP> 12 <SEP> 11 <SEP> 8 <SEP> -
<tb> 14 <SEP> behandelter <SEP> 12
<tb> gemischter
<tb> 15 <SEP> Graspollen-10--extrakt
<tb> (0, <SEP> 5 <SEP> mg) <SEP>
<tb>
Verfahrensweise 7 : Behandlung von Pollenextrakt mit Phenylglyoxal
Verfahren :
Eine tige Lösung von Phenylglyoxalhydrat, gelöst in 0, 01 m-Phosphatpuffer, PH-Wert 8, wurde zu einem gleichen Volumen von 50 mg Material zugegeben, welches aus Hahnenfusspollen extrahiert und nach Reinigung durch Behandlung mit Phenol im gleichen Puffer gelöst worden war.
Die Reaktion wurde bei Zimmertemperatur 24 h lang durchgeführt. Der gebildete Niederschlag wurde wiederholt mit Phosphatpuffer, pH-Wert 8, gewaschen und dann in Phenol-Salzlösung suspendiert.
Allergenitätstest
Eine Suspension des mit Phenylglyoxal modifizierten Materials, hergestellt wie oben beschrieben, eine Suspension des nicht modifizierten, mit Phenol behandelten Hahnenfussextrakts (beide in Phenol-Salzlösung) und das Phenol-Salzmedium selbst wurden jeweils in die Haut von grasempfindlichen allergischen Patienten injiziert. Die gereizten Zonen wurden nach 10 min ausgemessen und sind in Tabelle 13 in mm2 ausgedrückt.
<Desc/Clms Page number 11>
Tabelle 13
EMI11.1
<tb>
<tb> Patient <SEP> Hahnenfusspollenextrakt <SEP> Mit <SEP> Phenylglyoxal <SEP> Phenol-Salzlösung
<tb> Nr. <SEP> 50/lg/mI <SEP> behandelter <SEP> Extrakt
<tb> 1 <SEP> mg/ml
<tb> 1 <SEP> 35 <SEP> 0 <SEP> 0
<tb> 2 <SEP> 27 <SEP> 4 <SEP> 0
<tb> 3 <SEP> 19 <SEP> 2 <SEP> 1 <SEP>
<tb> Total <SEP> 91 <SEP> 6 <SEP> 1
<tb>
Test auf Immunogenität
Meerschweinchen, die wiederholt behandelt worden waren, wurden durch subkutane Injektion einer Emulsion, die das phenylglyoxalbehandelte Material in Freund's-Adjuvans enthielt, immunisiert. Eine ähnliche Reihe von Meerschweinchen wurde mit dem nicht modifizierten Ausgangsmaterial in der gleichen Hilfslösung immunisiert.
Nach 28 Tagen wurden den Meerschweinchen beider Versuchsreihen die Weichengeschoren und in diese geschorenen Flächen eine Reihe von intradermalen Injektionen (0, 1 ml) mit Verdünnungsreihen des Ausgangsmaterials endend mit normaler Salzlösung durchgeführt. 0, 4 ml einer 5% gen Lösung von Pontamine Sky Blue wurden sofort intravenös injiziert. Nach 20 min bildeten sich an manchen Stellen der intradermalen Injektion blaugefärbte Reizzonen, die die Anwesenheit von Antikörper mit der Spezifität des Ausgangsmaterials anzeigten. Die Reizzonen wurden gemessen und sind in Tabelle 14 angegeben.
Tabelle 14
EMI11.2
<tb>
<tb> Meerschweinchen <SEP> Immunisierendes <SEP> Reizzonendurchmesser <SEP> (mm) <SEP> auf <SEP> die <SEP> Menge
<tb> Nr. <SEP> Material <SEP> Hahnenfusspollenextrakt, <SEP> die <SEP> intradermal
<tb> injiziert <SEP> wurde
<tb> 100 <SEP> g <SEP> 10 <SEP> g <SEP> 1 <SEP> g <SEP> 0,1 <SEP> g <SEP> 0,01 <SEP> g <SEP> 0,001 <SEP> g
<tb> 1 <SEP> Hahnenfuss- <SEP> 14 <SEP> 14 <SEP> 10 <SEP> 10 <SEP> 9 <SEP> 7
<tb> 2 <SEP> pollenextrakt <SEP> 14 <SEP> 12 <SEP> 8 <SEP> 7 <SEP> 6
<tb> (5 <SEP> mg)
<tb> 3 <SEP> 12 <SEP> 11 <SEP> 10 <SEP> 9 <SEP> 7
<tb> 4 <SEP> 12 <SEP> 11 <SEP> 9 <SEP> 9 <SEP> 8
<tb> 1 <SEP> Mit <SEP> Phenyl-12 <SEP> 11 <SEP>
<tb> glyoxal <SEP> behandelte
<tb> 3 <SEP> Hahnenfuss--12
<tb> pollenextrakt
<tb> (0,5 <SEP> mg)
<tb>
Verfahrensweise 8 :
Behandlung von Pollenextrakt mit Nitroindandion
Verfahren :
1 ml eines 0, 9%igen 2-Nitro-indan-l, 3-dions in Wasser wurde zu 9 ml Hahnenfussextrakt, welcher durch Phenolbehandlung gesäubert und in 0, 01 m-Phosphatpuffer, PH-Wert 8, gelöst war, zugegeben. Die Mischung wurde bei Zimmertemperatur über Nacht gerührt. Der gebildete Niederschlag wurde wiederholt mit Phosphatpuffer von pH-Wert 8 gewaschen und dann in Phenol-Salzlösung suspendiert.
Test auf Allergenität
Eine Suspension des nach obigem Verfahren hergestellten nitroindandion-modifizierten Materials, eine Suspension des unmodifizierten Extrakts (beide in Phenol-Salzlösung) und die Phenol-Salzlösung selbst wurden
<Desc/Clms Page number 12>
jeweils in die Haut von grasempfindlichen, allergischen Patienten injiziert. Die Reizzonen wurden nach 10 min gemessen und sind in Tabelle 15 in mm2 angegeben.
Tabelle 15
EMI12.1
<tb>
<tb> Patient <SEP> Hahnenfusspollen- <SEP> nitroindandion-behandelter <SEP> Phenol-Salzlösung
<tb> Nr. <SEP> extrakt <SEP> Extrakt
<tb> 50 <SEP> g/ml <SEP> 1 <SEP> mg/ml
<tb> 1 <SEP> 3 <SEP> 0 <SEP> 0
<tb> 2 <SEP> 11 <SEP> 2 <SEP> 1
<tb> 3 <SEP> 8 <SEP> 2 <SEP> 0
<tb> 4 <SEP> 5 <SEP> 1 <SEP> 0
<tb> Total <SEP> 27 <SEP> 5 <SEP> 1
<tb>
Test auf Immunogenität
Meerschweinchen, die wiederholt behandelt worden waren, wurden durch subkutane Injektion einer Emulsion, die das nitroindandion-modifizierte Material in Freund's-Adjuvans enthielt, immunisiert. Eine ähnliche Serie von Meerschweinchen wurde mit nicht modifiziertem Ausgangsmaterial in der gleichen Hilfslösung immunisiert.
Nach 28 Tagen wurden den Meerschweinchen beider Serien die Weichen geschoren und eine Reihe von intradermalen Injektionen (0, 1 ml) von Verdünnungsreihen des Ausgangsmaterials endend mit normaler Salzlösung in diese geschorenen Flächen gemacht. 0,4 ml einer 3% gen Lösung von Pontamine Sky Blue wurden sofort intravenös injiziert. Nach 20 min wurden die Reizzonen gemessen, die Ergebnisse sind in Tabelle 16 aufgezeigt.
Tabelle 16
EMI12.2
<tb>
<tb> Meerschweinchen <SEP> Immunisierendes <SEP> Reizzonendurchmesser <SEP> (mm) <SEP> auf <SEP> die <SEP> Menge
<tb> Nr. <SEP> Material <SEP> des <SEP> intradermal <SEP> injizierten <SEP> Hahnenfussextrakts
<tb> 100 <SEP> 10/lg <SEP> 10 <SEP> mg <SEP> 1 <SEP> g <SEP> 0, <SEP> 1 <SEP> g <SEP> 0,01 <SEP> g <SEP> 0,001 <SEP> g
<tb> 1 <SEP> Hahnenfuss- <SEP> 13 <SEP> 13 <SEP> 9 <SEP> 9
<tb> 2 <SEP> pollenextrakt <SEP> 13 <SEP> 13 <SEP> 5 <SEP> 4 <SEP> 3
<tb> (0,5 <SEP> mg)
<tb> 3 <SEP> 12 <SEP> 11 <SEP> 10 <SEP> 9 <SEP> 7
<tb> 4 <SEP> 12 <SEP> 11 <SEP> 9 <SEP> 9 <SEP> 8
<tb> 1 <SEP> Mit <SEP> Nitroin- <SEP> 10 <SEP> - <SEP> - <SEP> - <SEP> - <SEP> - <SEP>
<tb> 2 <SEP> dandion <SEP> be <SEP> - <SEP> 14 <SEP> 11 <SEP>
<tb> handelter
<tb> 3 <SEP> Hahnenfuss- <SEP> 14 <SEP> 11 <SEP> 9 <SEP> pollenextrakt
<tb> (0, <SEP> 5 <SEP> mg)
<tb>
Das folgende Beispiel soll die Erfindung näher erläutern, ohne dass diese jedoch hierauf beschränkt sein soll.
Beispiel : Behandlung von Pollenextrakt mit Glutaraldehyd und anschliessende
Absorption in Aluminiumhydroxyd
Verfahren :
1 ml einer Soigen Glutaraldehydlösung wurde zu 9 ml eines wässerigen Extraktes von Wiesenlieschgraspollen
<Desc/Clms Page number 13>
(1 mg/ml) bei einem pH-Wert von 5, 3 zugegeben. Die Mischung wurde bei Zimrrss rtemperatur 3 Tage lang gerührt. 6 ml Zeiger Aluminiumhydroxydlösung wurden zugefügt und die Mischung 1 h gerührt. Nach Zentrifugieren des Niederschlages wurde dieser zweimal mit 0, 01 m-Phosphatpuffer, pH-Wert 8, und dreimal mit destilliertem Wasser gewaschen und schliesslich wieder suspendiert, u. zw. mit einer Konzentration von 1 mg/ml in der Phenol-Salzlösung.
Der Vorgang wurde wiederholt ohne die Zugabe des Glutaraldehyds, wobei diese Suspension als Kontrolle beim Immunisierungs-Spezifitätstest verwendet wurde.
Allergenitätstest :
Eine Suspension des obigen Materials, eine Lösung des nicht modifizierten Pollenextraktes (beide in Phenol-Salzlösung) und die Phenol-Salzlösung selbst wurden jeweils in die Haut von grasempfindlichen, allergischen Patienten injiziert. Die Reizzonen wurden nach 10 min gemessen ; die Resultate sind in Tabelle 17 in mm2 angegeben.
Tabelle 17
EMI13.1
<tb>
<tb> Patient <SEP> wässeriger <SEP> An <SEP> Aluminiumoxyd <SEP> An <SEP> Aluminiumoxyd <SEP> Phenol-Salzlösung
<tb> Nr. <SEP> Wiesen- <SEP> adsorbierter <SEP> mit <SEP> adsorbierter <SEP> unbeliesch- <SEP> Glutaraldehyd <SEP> be- <SEP> handelter <SEP> Wiesengraspollen- <SEP> handelter <SEP> Wiesen- <SEP> lieschgraspollen- <SEP>
<tb> extrakt <SEP> lieschgraspollen-extrakt
<tb> 50 <SEP> g/ml <SEP> extrakt <SEP> 1 <SEP> mg/ml
<tb> 1 <SEP> mg/ml
<tb> 1 <SEP> 17 <SEP> 2 <SEP> 6 <SEP> 0
<tb> 2 <SEP> 2 <SEP> 0 <SEP> 3 <SEP> 0 <SEP>
<tb> 3 <SEP> 6 <SEP> 0 <SEP> 3 <SEP> 0 <SEP>
<tb> Total <SEP> 25 <SEP> 2 <SEP> 12 <SEP> 0
<tb>
Test auf Immunisierungsspezifität
Meerschweinchen, die schon wiederholt behandelt worden waren, wurden durch subkutane Injektion des an Aluminiumoxyd adsorbierten, mit Glutaraldehyd modifizierten Materials immunisiert.
Eine ähnliche Reihe von Meerschweinchen wurde mit nicht modifiziertem, an Aluminiumoxyd adsorbiertem Wiesenlieschgraspollenextrakt mit einer Pollenkonzentration von 1 mg/ml immunisiert. 21 Tage später wurde nochmals eine Injektion gegeben und die Tiere 10 Tage später zur Ader gelassen.
Passive Hautanaphylaxie wurde an der Versuchsserie durch intradermale Injektion der Verdünnungsreihenlösungen in die geschorenen Weichen einer Reihe von Meerschweinchen durchgeführt. Die Tiere wurden dann intravenös mit dem nicht modifizierten wässerigen Wiesenlieschgrasextrakt, der 0, 4 ml Pontamine Sky Blue- - Lösung enthielt, gereizt. Die Ergebnisse, die mit verschiedenen Konzentrationen an reizende Antigen erzielt wurden, sind in Tabelle 18 für das modifizierte Material und in Tabelle 19 für die Kontrollsuspension ohne Glutaraldehyd angeführt.
<Desc/Clms Page number 14>
Tabelle 18
EMI14.1
<tb>
<tb> Meerschweinchen <SEP> Reizmittel <SEP> Reizzonendurchmesser <SEP> in <SEP> mm <SEP> bei <SEP> einer
<tb> Nr. <SEP> gefrierge <SEP> Serumverdünnung <SEP> von
<tb> trockneter
<tb> wässeriger <SEP> # <SEP> ## <SEP> ### <SEP> ### <SEP> #### <SEP> Salzlösung
<tb> Wiesenlieschgraspollenextrakt
<tb> 1 <SEP> 1 <SEP> mg/ml <SEP> 22 <SEP> 20 <SEP> 16 <SEP> M
<tb> 2 <SEP> 100 <SEP> Jl <SEP> g/ml <SEP> 20 <SEP> 17 <SEP> 13
<tb> 3 <SEP> lOg/ml <SEP> 20 <SEP> 18
<tb> 4 <SEP> 5 <SEP> bi <SEP> g/ml <SEP> 14- <SEP>
<tb>
Tabelle 19
EMI14.2
<tb>
<tb> Meerschweinchen <SEP> Reizmittel <SEP> Reizzonendurchmesser <SEP> in <SEP> mm <SEP> bei <SEP> einer
<tb> Nr.
<SEP> gefrierge <SEP> - <SEP> Serumverdünnung <SEP> von
<tb> trockneter
<tb> wässeriger <SEP> 1 <SEP> 1 <SEP> 1 <SEP> 1 <SEP> 1 <SEP> Salzlösung
<tb> Wiesenliesch <SEP> 5 <SEP> 25 <SEP> 125 <SEP> 625 <SEP> 3125
<tb> graspollenextrakt
<tb> 5 <SEP> 1 <SEP> mg/ml <SEP> 25 <SEP> 16 <SEP> - <SEP> - <SEP> -
<tb> 6 <SEP> 100 <SEP> g/ml <SEP> 20 <SEP> 18 <SEP> 16 <SEP> - <SEP> -
<tb> 7 <SEP> 10 <SEP> g/ml-----
<tb> 8 <SEP> 5 <SEP> g/ml-----
<tb>
Es ist ersichtlich, dass die Behandlung mit Glutaraldehyd zu einer gesteigerten Antikörperbildung führt, wenn man sie mit dem unbehandeltem Material vergleicht, obwohl die allergene Wirksamkeit reduziert ist.
<Desc / Clms Page number 1>
EMI1.1
EMI1.2
<Desc / Clms Page number 2>
EMI2.1
<Desc / Clms Page number 3>
killed, dried M. butyricum are emulsified with 2 parts of a physiological saline solution) and gave concentrations of 1 gm / ml. Groups of guinea pigs were inoculated subcutaneously with 0.5 ml of one or the other emulsion. After 22 days, the animals were shaved off and a series of intradermal injections (0.1 ml) with the purified buttercup pollen extract diluted in a dilution series was carried out on these shaved areas. 0.4 ml of a Saigon solution from Pontamine Sky Blue (azo dye from Du Pont) were immediately injected intravenously. After 20 minutes the diameters of the irritated zones were measured and these are given in Table 2.
It can be seen that the glutaraldehyde treated material not only produces antibodies which react with the starting material, but that it is also a more effective immunizing material than the starting material.
Table 1
EMI3.1
<tb>
<tb> patient <SEP> insoluble <SEP> made <SEP> purified <SEP> phenol saline solution
<tb> No. <SEP> buttercup pollen extract <SEP> buttercup extract
<tb> 10 <SEP> mg / ml <SEP> 50 <SEP> Ilg / ml
<tb> 1 <SEP> 21 <SEP> 84 <SEP> 12
<tb> 2 <SEP> 16 <SEP> 32 <SEP> 9
<tb> 3 <SEP> 13 <SEP> 57 <SEP> 23
<tb> 4 <SEP> 15 <SEP> 51 <SEP> 4
<tb> Total <SEP> 65 <SEP> 224 <SEP> 48
<tb> total
<tb> minus
<tb> the <SEP> for
<tb> Phenolic salt solution <SEP> 17 <SEP> 176
<tb>
Table 2
EMI3.2
<tb>
<tb> guinea pig <SEP> immunizing <SEP> diameter <SEP> of the <SEP> irritation zone <SEP> (mm) <SEP> for <SEP> the <SEP> amount
<tb> No.
<SEP> material <SEP> buttercup pollen extract, <SEP> which was <SEP> injected intradermally <SEP> <SEP>
<tb> (0, <SEP> 5 <SEP> mg) <SEP> 100 <SEP> jlg <SEP> 10jUg <SEP> 1 <SEP> pg <SEP> 0, <SEP> 1 <SEP> jlg <SEP > 0, <SEP> 0l <SEP> g <SEP> 0, <SEP> 00l <SEP> g
<tb> 1 <SEP> cleaned <SEP> 15 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0
<tb> buttercup
<tb> 2 <SEP> @ <SEP> 16 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0
<tb> pollen extract
<tb> 3 <SEP> 17 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0
<tb> 4 <SEP> 16 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0
<tb> 5 <SEP> with <SEP> Glutaral- <SEP> 14 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0
<tb> 6 <SEP> dehyd <SEP> treated
<tb> 7 <SEP> delter <SEP> tap <SEP> 12 <SEP> 10 <SEP> 9 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0
<tb> 8 <SEP> foot pollen- <SEP> 14 <SEP> 13 <SEP> 12 <SEP> 12 <SEP> 10 <SEP> 8
<tb> extract <SEP> 16 <SEP> 14 <SEP> 12 <SEP> 11 <SEP> 10 <SEP> 8
<tb> 9
<SEP> 12 <SEP> 10 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0
<tb> 10 <SEP> 12 <SEP> 9 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0
<tb>
<Desc / Clms Page number 4>
EMI4.1
Rigem phenol and subsequent precipitation of the protein from the phenol phase, in order to remove the majority of the carbohydrates and the materials with low molecular weight, were dissolved in 5 ml of 0.5 M borate buffer, pH 8.8 . 5 ml of a 2% solution of 1-cyclohexyl-3- (2-morpholine ethyl) -carbodiimidmetho-p-toluenesulfonate were slowly added and the solution was stirred at room temperature overnight. The precipitate formed was then centrifuged off, washed three times with borate buffer and suspended in phenol saline.
Test for allergenicity
A suspension of the test material and a solution of the starting material, both in phenol saline, and the medium itself were each injected into the skin of weed-sensitive allergic patients.
Zones of irritation were measured after 10 minutes.
The results of the allergenicity test are shown in Table 3.
Table 3
EMI4.2
<tb>
<tb> Patient <SEP> Mixed <SEP> with <SEP> carbodiimide <SEP> phenol saline solution
<tb> No. <SEP> grass pollen extract <SEP> treated
<tb> .., <SEP> mixed
<tb> grass pollen extract
<tb> 1 <SEP> 12 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP>
<tb> 2 <SEP> 3 <SEP> 2 <SEP> 0 <SEP>
<tb> 3 <SEP> 8 <SEP> 0 <SEP> 0
<tb> 4 <SEP> 12 <SEP> 0 <SEP> 0
<tb> 5 <SEP> 15 <SEP> 0 <SEP> 0
<tb> 6 <SEP> 62 <SEP> 3 <SEP> 0
<tb> Total <SEP> 112 <SEP> 5 <SEP> 0
<tb>
The numbers mean irritation zones in mm2.
Test for immunogenicity
Repeatedly treated guinea pigs were immunized by subcutaneous injection of an emulsion containing the test material in a Freund's adjuvant. A similar group of guinea pigs were immunized with unmodified starting material dissolved in an adjuvant in the same way. After 21 to 8 days, the animals were sheared and a series of intradremal injections (0.1 ml) with a dilution series ending with the normal saline solution of the starting material were made into these shaved areas.
0.4 ml of a 5% solution of Pontamine Sky Blue was immediately injected intravenously. After 20 minutes, blue-colored zones of irritation formed at some points of the intradermal injection, which indicate the presence of antibodies specific to the starting material. The diameters of the irritated zones were measured and recorded.
The results of the immunity tests are shown in Table 4.
<Desc / Clms Page number 5>
Table 4
EMI5.1
<tb>
<tb> Guinea pigs <SEP> immunizing <SEP> diameter <SEP> of the <SEP> irritation zone <SEP> (mm) <SEP> on <SEP> the <SEP> amount <SEP> des
<tb> No. <SEP> material <SEP> mixed <SEP> grass pollen extract, <SEP> the <SEP> intradermal
<tb> was injected <SEP>
<tb> 100 <SEP> j <SEP> g <SEP> 1Ojug <SEP> 1jLtg <SEP> 0, <SEP> 1 <SEP> jug <SEP> 0, <SEP> 01 <SEP> lig <SEP> 0 ,
<SEP> 001 <SEP> lig <SEP>
<tb> 1 <SEP> mixed <SEP> 14 <SEP> 12 <SEP> 10 <SEP> 9 <SEP> 8 <SEP> 8
<tb> 2 <SEP> grass pollen- <SEP> 14 <SEP> 13 <SEP> 10 <SEP> 9 <SEP> 8 <SEP>
<tb> extract
<tb> 3 <SEP> 16 <SEP> 14 <SEP> 12 <SEP> 10 <SEP> 9 <SEP> 9
<tb> 4 <SEP> 14 <SEP> 13 <SEP> M
<tb> 5 <SEP> With <SEP> Carbodiimide <SEP> 14 <SEP> 12 <SEP> 10 <SEP> 10 <SEP> 19
<tb> 6 <SEP> treated <SEP> 12 <SEP> 10
<tb> mixed
<tb> 7 <SEP> grass pollen- <SEP> 12 <SEP> 10 <SEP> 9 <SEP> 9 <SEP> 9
<tb> 8 <SEP> extract <SEP>
<tb>
From the results shown in Tables 3 and 4 it can be seen that higher levels of antibody are produced by immunization with carbodiimide modified allergen, but that the allergenicity of the material was negligible.
Procedure 3:
50 mg of material, which had been extracted from mixed grass pollen and partially purified in order to remove most of the carbohydrates and low molecular weight material, was dissolved in 5 ml of 0.01 m-phosphate buffer, pH 8.0, 1 ml of 1-chlorine -2,3-epoxypropane was slowly added and the mixture was stirred overnight at room temperature. The precipitate formed was centrifuged off, washed with phosphate buffer and suspended in phenol saline.
Test for allergenicity
A suspension of the test material and a solution of the starting material, both in phenol saline and the medium itself, were each injected into the skin of weed-sensitive, allergic patients.
Zones of irritation were measured after 10 minutes. The results of the allergenicity test are shown in Table 5.
Table 5
EMI5.2
<tb>
<tb> Patient <SEP> Mixed <SEP> <SEP> phenol saline solution treated with <SEP> epichlorohydrin <SEP>
<tb> No. <SEP> grass pollen extract <SEP> mixed <SEP> grass pollen extract
<tb> (50 <SEP> g / ml) <SEP> (1mg / ml)
<tb> 1 <SEP> 62 <SEP> 0 <SEP> 0
<tb> 2 <SEP> 15 <SEP> 1 <SEP> 0
<tb> 3 <SEP> 12 <SEP> 0 <SEP> 0
<tb> 4 <SEP> 8 <SEP> 2 <SEP> 0
<tb> 5 <SEP> 3 <SEP> 0 <SEP> 0
<tb> 6 <SEP> 12 <SEP> 0 <SEP> 0
<tb> Total <SEP> 112 <SEP> 3 <SEP> 0
<tb>
The numbers mean irritation zones in mm2.
<Desc / Clms Page number 6>
Immunogenicity test
Repeatedly treated guinea pigs were immunized by subcutaneous injection of an emulsion containing the test material in Freund's adjuvant. A similar set of guinea pigs were immunized with unmodified starting material in the same auxiliary solution. After 21 to 8 days, the animals' limbs were sheared and a series of intradermal injections (0.1 ml) with a dilution series of the starting material, ending with normal saline, were made into these shaved areas.
0.4 ml of a Saigon solution from Pontamine Sky Blue were immediately injected intravenously. After 20 minutes, blue-colored zones of irritation formed at some points of the intradermal injection, which indicate the presence of antibodies specific to the starting material. The diameters of these zones were measured and recorded. The results of the immunogenicity test are shown in Table 6.
Table 6
EMI6.1
<tb>
<tb> guinea pig <SEP> immunizing <SEP> diameter <SEP> of the <SEP> irritated <SEP> zone <SEP> (mm) <SEP> to <SEP> the <SEP> amount
<tb> No. <SEP> Material <SEP> of the <SEP> mixed <SEP> grass pollen extract, <SEP> which
<tb> was injected intradermally <SEP> <SEP>
<tb> 100 <SEP> p.
<SEP> g <SEP> 10 <SEP> g <SEP> 1 g <SEP> 0, <SEP> 1 <SEP> lig <SEP> 0, <SEP> 01 <SEP> big <SEP> 0, <SEP > 001 <SEP> big <SEP>
<tb> 1 <SEP> mixed <SEP> 14 <SEP> 13 <SEP> 10--
<tb> 2 <SEP> grass pollen- <SEP> 16 <SEP> 14 <SEP> 12 <SEP> 10 <SEP> 9 <SEP> 9
<tb> extract
<tb> 3 <SEP> (8 <SEP> mg) <SEP> 14 <SEP> 13 <SEP> 10 <SEP> 9 <SEP> 8
<tb> 4 <SEP> 14 <SEP> 12 <SEP> 10 <SEP> 9 <SEP> 8 <SEP> 8
<tb> 5 <SEP> With <SEP> Epichlor-12 <SEP> 10 --- <SEP>
<tb> 6 <SEP> hydrin <SEP> be-10 ---- <SEP>
<tb> trader
<tb> 7 <SEP> mixed-
<tb> 8 <SEP> grass pollen extract
<tb> (5 <SEP> mg)
<tb> 9 <SEP> mixed <SEP> 12 <SEP> 9 <SEP> - <SEP> - <SEP> -
<tb> 10 <SEP> grass pollen-14 <SEP> 12 <SEP> 9 <SEP> - <SEP> extract
<tb> 11 <SEP> (0.5 <SEP> mg)
<SEP> 12 <SEP> 11 <SEP> 9 <SEP> - <SEP> -
<tb> 12 <SEP> 14 <SEP> 12 <SEP> 9 <SEP> - <SEP> - <SEP> -
<tb> 13 <SEP> With <SEP> Epichlor-10 <SEP> 8 --- <SEP>
<tb> hydrin <SEP> be <SEP>
<tb> 14 <SEP> traded
<tb> 15 <SEP> grass pollen-10 <SEP> 8 <SEP>
<tb> extract
<tb> (0.5 <SEP> mg)
<tb>
From the above results it can be seen that detectable levels of antibody are produced by immunization with allergen treated with epichlorohydrin, while the allergenicity is reduced to a negligible level.
Procedure 4:
50 mg of material, which had been extracted from buttercup grass pollen, were dissolved in 10 ml of 0.01 M buffer, pH 8. 1 ml of 1-bromo-2,3-epoxypropane was slowly added and the mixture was stirred at room temperature overnight. The precipitate formed was centrifuged off, washed with phosphate buffer and suspended in phenol saline.
<Desc / Clms Page number 7>
The results of the biological tests are shown in Tables 7 and 8. The test methods were the same as in Example 3. Detectable amounts of antibody were generated by the immunization, while the allergenicity was reduced to a negligible level.
Table 7
EMI7.1
<tb>
<tb> Immunogenicity <SEP> of <SEP> <SEP> allergen treated with <SEP> epibromohydrin <SEP>
<tb> guinea pigs <SEP> immunizing <SEP> zone diameter <SEP> (mm) <SEP> on <SEP> the <SEP> amount <SEP> buttercup no. <SEP> material <SEP> pollen extract, <SEP> which <SEP> was injected intradermally <SEP> <SEP>
<tb> 100 <SEP> jag <SEP> 10 <SEP> mg <SEP> 1 <SEP> jug <SEP> 0, <SEP> 1 <SEP> flg <SEP> 0, <SEP> 01 <SEP> jlg <SEP> 0, <SEP> 001 <SEP> g
<tb> 1 <SEP> Hahnenfuss-16 <SEP> 10-- <SEP>
<tb> pollen extract
<tb> ponenextrakt <SEP> 16 <SEP> 10 <SEP> - <SEP> -
<tb> 3 <SEP> 16 <SEP> 10 ----
<tb> 4 <SEP> With <SEP> Epibrom-14 <SEP> 10-- <SEP>
<tb> hydrin <SEP> treated
<tb> 6 <SEP> Hahnenfuss-15 <SEP> 10- <SEP>
<tb> extract
<tb> (0.5 <SEP> mg)
<tb>
Table 8
EMI7.2
<tb>
<tb> Allergenicity <SEP> of <SEP> <SEP> allergen treated with <SEP> epibromohydrin <SEP>
<tb> Patient <SEP> Buttercup <SEP> <SEP> phenol saline solution treated with <SEP> epibromohydrin <SEP>
<tb> No. <SEP> extract <SEP> buttercup pollen extract
<tb> 100 <SEP> Jlg / ml <SEP> 100 <SEP> g / ml
<tb> 1 <SEP> 9 <SEP> 0 <SEP> 0
<tb> 2 <SEP> 18 <SEP> 0 <SEP> 0
<tb> 3 <SEP> 22 <SEP> 0 <SEP> 0
<tb> 4 <SEP> 21 <SEP> 0 <SEP> 0
<tb> Total <SEP> 70 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP>
<tb>
Procedure 5:
Production of cyanate-modified allergen
An aqueous extract of mixed grass pollen (ostrich, gorse, buttercup, dogtail grass, false oats, fescue grass, foxtail grass, meadow rye, spring timothy and Yorkshire aftermath) was obtained by treating with aqueous phenol and then precipitating the protein from the phenol Remove most of the carbohydrate and low molecular weight materials, partially purified. 50 mg of the partially purified allergenic protein obtained were dissolved in 5 ml of water and the pH was adjusted to 6 by adding sodium hydroxide solution. The pH was then adjusted to 5.0 with acetic acid. 0.2 g of potassium cyanate were added and the mixture was stirred at room temperature overnight.
The precipitate formed was repeatedly washed with phosphate buffer of pH 8 and then suspended in phenol saline.
Test for allergenicity
A suspension of the cyanate-modified allergen prepared as described above, a suspension of the unmodified, partially purified allergen extract (both in phenol saline) and the
<Desc / Clms Page number 8>
Phenol salt medium itself was injected into the skin of weed-sensitive allergic patients. The irritated zones were measured after 10 minutes and are expressed in Table 9 in mm2. It can be seen that the cyanate-modified allergen shows a negligible allergenicity compared to the unmodified material.
Table 9
EMI8.1
<tb>
<tb> Patient <SEP> Mixed <SEP> cyanate-treated <SEP> mixed <SEP> phenol-saline solution
<tb> No. <SEP> grass pollen extract <SEP> grass pollen extract
<tb> 50 <SEP> mglml <SEP> 1 <SEP> mg / ml
<tb> 1 <SEP> 12 <SEP> 4 <SEP> 0
<tb> 2 <SEP> 3 <SEP> 2 <SEP> 0
<tb> 3 <SEP> 8 <SEP> 6 <SEP> 0
<tb> 4 <SEP> 12 <SEP> 3 <SEP> 0
<tb> 5 <SEP> 15 <SEP> 5 <SEP> 0
<tb> 6 <SEP> 62 <SEP> 24 <SEP> 0
<tb> Total <SEP> 112 <SEP> 44 <SEP> 0
<tb>
Test for immunogenicity
Repeatedly treated guinea pigs were immunized by subcutaneous injection of an emulsion containing the cyanate-modified allergen in Freund's adjuvant. A similar set of guinea pigs was immunized by unmodified starting material in the same adjuvant.
After 21 to 28 days, the switches of both rows of animals were sheared and a series of intradermal injections (0.1 ml) with a dilution series of the starting material ending with normal saline solution were carried out into the shaved areas.
0.4 ml of a Neigen solution from Pontamine Sky Blue was immediately injected intravenously. After 20 minutes, blue-colored zones of irritation formed at some points of the intradermal injection, which indicated the presence of antibodies with the specificity for the starting material. Again, the diameters of the irritated zones were measured and recorded in Table 10. It can be seen that the cyanate-modified allergen retains the immunizing specificity of the starting material.
<Desc / Clms Page number 9>
Table 10
EMI9.1
<tb>
<tb> guinea pigs <SEP> immunizing <SEP> diameter <SEP> of the <SEP> stimulation zones <SEP> (mm) <SEP> on <SEP> the <SEP> amount <SEP> des
<tb> No. <SEP> material <SEP> mixed <SEP> grass pollen extract, <SEP> the <SEP> intradermal
<tb> was injected <SEP>
<tb> 100 <SEP> g <SEP> 10 <SEP> g <SEP> 1 <SEP> g <SEP> 0.1 <SEP> g <SEP> 0.01 <SEP> g <SEP> 0.001 <SEP > g
<tb> 1 <SEP> Mixed <SEP> 14 <SEP> 12 <SEP> 10 <SEP> 9 <SEP> 8 <SEP> 8
<tb> 2 <SEP> grass pollen- <SEP> 14 <SEP> 13 <SEP> 10 <SEP> 9 <SEP> 8 <SEP> - <SEP>
<tb> extract
<tb> 3 <SEP> (5 <SEP> mg) <SEP> 16 <SEP> 14 <SEP> 12 <SEP> 10 <SEP> 9 <SEP> 9
<tb> 4 <SEP> 14 <SEP> 13 <SEP> 10
<tb> 5 <SEP> with cyanate <SEP> 12 <SEP> 9 <SEP> 7
<tb> 6 <SEP> treated <SEP> 12 <SEP> 9 <SEP>
<tb> mixed
<tb> 7 <SEP> grass pollen <SEP> 10
<tb> 8 <SEP> extract
<tb> mg)
<tb> (5 <SEP> mg)
<tb> 9 <SEP> Mixed <SEP> 14 <SEP> 12 <SEP> 9
<tb> 10 <SEP> grass pollen- <SEP> 11 <SEP> 9
<tb> extract
<tb> 11 <SEP> (0.5 <SEP> mg) <SEP> 14 <SEP> 12 <SEP> 9
<tb> 12 <SEP> 12 <SEP> 9
<tb>
Procedure 6:
The procedure of Procedure 5 was repeated to confirm the biological test results. The results of the allergenicity test of the modified allergen are shown in Table 11 and the results of the immunogenicity test of the cyanate-modified allergen are shown in Table 12.
Table 11
EMI9.2
<tb>
<tb> Patient <SEP> Mixed <SEP> Treated with <SEP> cyanate <SEP>
<tb> No. <SEP> grass pollen extract <SEP> mixed <SEP> grass pollen extract <SEP> phenol-salt solution
<tb> 100 <SEP> g / ml <SEP> 2 <SEP> mg / ml
<tb> 1 <SEP> 23 <SEP> 1 <SEP> 1 <SEP>
<tb> 2 <SEP> 6 <SEP> 0 <SEP> 0
<tb> 3 <SEP> 2 <SEP> 0 <SEP> 0
<tb> 4 <SEP> 19 <SEP> 0 <SEP> 0
<tb> Total <SEP> 50 <SEP> 1 <SEP> 1 <SEP>
<tb>
The numbers mean the stimulus zones in mm2.
<Desc / Clms Page number 10>
Table 12
EMI10.1
<tb>
<tb> guinea pig <SEP> immunizing <SEP> stimulus zone diameter <SEP> (mm) <SEP> on <SEP> the <SEP> amount <SEP> des
<tb> No. <SEP> material <SEP> injected <SEP> grass pollen extract
<tb> 100 <SEP> mg <SEP> 10 <SEP> g <SEP> 1 <SEP> g <SEP> 0.1 <SEP> g <SEP> 0.01 <SEP> g <SEP> 0.001 <SEP > g
<tb> 1 <SEP> Mixed <SEP> 12 <SEP> 10 <SEP> 9 <SEP> 8
<tb> 2 <SEP> grass pollen <SEP> 12 <SEP> 10 <SEP> 7 <SEP> extract
<tb> 3 <SEP> (5 <SEP> mg) <SEP> 12 <SEP> 10 <SEP> 8 <SEP> -
<tb> 4 <SEP> 12 <SEP> 10 <SEP> 9 <SEP> - <SEP> - <SEP> -
<tb> 5 <SEP> With <SEP> cyanate <SEP> 12 <SEP> 10 <SEP> - <SEP> -
<tb> 6 <SEP> treated <SEP> 12 <SEP> 9
<tb> mixed
<tb> 7 <SEP> grass pollen- <SEP> 14 <SEP> 12 <SEP> 9 <SEP> - <SEP> - <SEP> -
<tb> 8 <SEP> extract <SEP> 14 <SEP> 10 <SEP> - <SEP> - <SEP> - <SEP> -
<tb> (5 <SEP> mg)
<tb> 9 <SEP> mixed <SEP> 14 <SEP> 10 <SEP> - <SEP> -
<tb> 10 <SEP> grass pollen <SEP> 12 <SEP> 11 <SEP> 9 <SEP> extract
<tb> 11 <SEP> (0, <SEP> 5 <SEP> mg) <SEP> 10 <SEP> 9 <SEP> - <SEP> - <SEP> - <SEP> - <SEP>
<tb> 12 <SEP> - <SEP> - <SEP> - <SEP> - <SEP> - <SEP> - <SEP>
<tb> 13 <SEP> With <SEP> cyanate <SEP> 12 <SEP> 11 <SEP> 8 <SEP> -
<tb> 14 <SEP> treated <SEP> 12
<tb> mixed
<tb> 15 <SEP> grass pollen-10 extract
<tb> (0, <SEP> 5 <SEP> mg) <SEP>
<tb>
Procedure 7: Treatment of pollen extract with phenylglyoxal
Procedure:
A term solution of phenylglyoxal hydrate, dissolved in 0.01m-phosphate buffer, pH 8, was added to an equal volume of 50 mg of material which had been extracted from buttercup pollen and, after purification by treatment with phenol, had been dissolved in the same buffer.
The reaction was carried out at room temperature for 24 hours. The formed precipitate was repeatedly washed with phosphate buffer, pH 8, and then suspended in phenol saline.
Allergenicity test
A suspension of the phenylglyoxal modified material prepared as described above, a suspension of the unmodified phenolic treated buttercup extract (both in phenolic saline) and the phenolic salt medium itself were each injected into the skin of weed-sensitive allergic patients. The irritated zones were measured after 10 minutes and are expressed in Table 13 in mm2.
<Desc / Clms Page number 11>
Table 13
EMI11.1
<tb>
<tb> Patient <SEP> Buttercup pollen extract <SEP> With <SEP> phenylglyoxal <SEP> phenol salt solution
<tb> No. <SEP> 50 / lg / mI <SEP> treated <SEP> extract
<tb> 1 <SEP> mg / ml
<tb> 1 <SEP> 35 <SEP> 0 <SEP> 0
<tb> 2 <SEP> 27 <SEP> 4 <SEP> 0
<tb> 3 <SEP> 19 <SEP> 2 <SEP> 1 <SEP>
<tb> Total <SEP> 91 <SEP> 6 <SEP> 1
<tb>
Immunogenicity test
Guinea pigs that had been repeatedly treated were immunized by subcutaneous injection of an emulsion containing the phenylglyoxal-treated material in Freund's adjuvant. A similar set of guinea pigs were immunized with the unmodified starting material in the same auxiliary solution.
After 28 days, the guinea pigs in both test series were shaved and a series of intradermal injections (0.1 ml) with dilution series of the starting material ending with normal saline were carried out in these shaved areas. 0.4 ml of a 5% solution of Pontamine Sky Blue was immediately injected intravenously. After 20 min, blue-colored zones of irritation formed at some points of the intradermal injection, which indicated the presence of antibodies with the specificity of the starting material. The zones of irritation were measured and are given in Table 14.
Table 14
EMI11.2
<tb>
<tb> guinea pigs <SEP> immunizing <SEP> stimulus zone diameter <SEP> (mm) <SEP> to <SEP> the <SEP> amount
<tb> No. <SEP> material <SEP> buttercup pollen extract, <SEP> the <SEP> intradermal
<tb> was injected <SEP>
<tb> 100 <SEP> g <SEP> 10 <SEP> g <SEP> 1 <SEP> g <SEP> 0.1 <SEP> g <SEP> 0.01 <SEP> g <SEP> 0.001 <SEP > g
<tb> 1 <SEP> Buttercup- <SEP> 14 <SEP> 14 <SEP> 10 <SEP> 10 <SEP> 9 <SEP> 7
<tb> 2 <SEP> pollen extract <SEP> 14 <SEP> 12 <SEP> 8 <SEP> 7 <SEP> 6
<tb> (5 <SEP> mg)
<tb> 3 <SEP> 12 <SEP> 11 <SEP> 10 <SEP> 9 <SEP> 7
<tb> 4 <SEP> 12 <SEP> 11 <SEP> 9 <SEP> 9 <SEP> 8
<tb> 1 <SEP> With <SEP> Phenyl-12 <SEP> 11 <SEP>
<tb> glyoxal <SEP> treated
<tb> 3 <SEP> Buttercup - 12
<tb> pollen extract
<tb> (0.5 <SEP> mg)
<tb>
Procedure 8:
Treatment of pollen extract with nitroindandione
Procedure:
1 ml of a 0.9% strength 2-nitro-indane-1,3-dione in water was added to 9 ml of buttercup extract, which had been cleaned by phenol treatment and dissolved in 0.01m-phosphate buffer, pH 8. The mixture was stirred at room temperature overnight. The formed precipitate was repeatedly washed with phosphate buffer of pH 8 and then suspended in phenol saline.
Test for allergenicity
A suspension of the nitroindandione-modified material prepared by the above procedure, a suspension of the unmodified extract (both in phenolic salt solution) and the phenolic salt solution itself were used
<Desc / Clms Page number 12>
each injected into the skin of grass-sensitive, allergic patients. The irritation zones were measured after 10 minutes and are given in Table 15 in mm2.
Table 15
EMI12.1
<tb>
<tb> Patient <SEP> Buttercup pollen- <SEP> nitroindandione-treated <SEP> phenol salt solution
<tb> No. <SEP> extract <SEP> extract
<tb> 50 <SEP> g / ml <SEP> 1 <SEP> mg / ml
<tb> 1 <SEP> 3 <SEP> 0 <SEP> 0
<tb> 2 <SEP> 11 <SEP> 2 <SEP> 1
<tb> 3 <SEP> 8 <SEP> 2 <SEP> 0
<tb> 4 <SEP> 5 <SEP> 1 <SEP> 0
<tb> Total <SEP> 27 <SEP> 5 <SEP> 1
<tb>
Immunogenicity test
Guinea pigs that had been repeatedly treated were immunized by subcutaneous injection of an emulsion containing the nitroindandione-modified material in Freund's adjuvant. A similar series of guinea pigs were immunized with unmodified starting material in the same auxiliary solution.
After 28 days, the guinea pigs of both series were shaved and a series of intradermal injections (0.1 ml) of dilution series of the starting material ending with normal saline were made into these shaved areas. 0.4 ml of a 3% solution of Pontamine Sky Blue was immediately injected intravenously. The irritation zones were measured after 20 minutes; the results are shown in Table 16.
Table 16
EMI12.2
<tb>
<tb> guinea pigs <SEP> immunizing <SEP> stimulus zone diameter <SEP> (mm) <SEP> to <SEP> the <SEP> amount
<tb> No. <SEP> Material <SEP> of the <SEP> intradermally <SEP> injected <SEP> buttercup extract
<tb> 100 <SEP> 10 / lg <SEP> 10 <SEP> mg <SEP> 1 <SEP> g <SEP> 0, <SEP> 1 <SEP> g <SEP> 0.01 <SEP> g < SEP> 0.001 <SEP> g
<tb> 1 <SEP> Buttercup- <SEP> 13 <SEP> 13 <SEP> 9 <SEP> 9
<tb> 2 <SEP> pollen extract <SEP> 13 <SEP> 13 <SEP> 5 <SEP> 4 <SEP> 3
<tb> (0.5 <SEP> mg)
<tb> 3 <SEP> 12 <SEP> 11 <SEP> 10 <SEP> 9 <SEP> 7
<tb> 4 <SEP> 12 <SEP> 11 <SEP> 9 <SEP> 9 <SEP> 8
<tb> 1 <SEP> With <SEP> Nitroin- <SEP> 10 <SEP> - <SEP> - <SEP> - <SEP> - <SEP> - <SEP>
<tb> 2 <SEP> dandion <SEP> be <SEP> - <SEP> 14 <SEP> 11 <SEP>
<tb> traded
<tb> 3 <SEP> Buttercup <SEP> 14 <SEP> 11 <SEP> 9 <SEP> pollen extract
<tb> (0, <SEP> 5 <SEP> mg)
<tb>
The following example is intended to explain the invention in more detail without, however, being restricted thereto.
Example: Treatment of pollen extract with glutaraldehyde and subsequent
Absorption in aluminum hydroxide
Procedure:
1 ml of such a glutaraldehyde solution became 9 ml of an aqueous extract of timothy grass pollen
<Desc / Clms Page number 13>
(1 mg / ml) at pH 5.3 was added. The mixture was stirred at room temperature for 3 days. 6 ml Zeiger aluminum hydroxide solution was added and the mixture stirred for 1 hour. After centrifuging the precipitate, it was washed twice with 0.01 m phosphate buffer, pH 8, and three times with distilled water and finally resuspended, u. with a concentration of 1 mg / ml in the phenol salt solution.
The process was repeated without the addition of the glutaraldehyde, this suspension being used as a control in the immunization specificity test.
Allergenicity test:
A suspension of the above material, a solution of the unmodified pollen extract (both in phenol salt solution) and the phenol salt solution itself were each injected into the skin of weed-sensitive, allergic patients. The irritation zones were measured after 10 minutes; the results are given in Table 17 in mm2.
Table 17
EMI13.1
<tb>
<tb> patient <SEP> aqueous <SEP> an <SEP> aluminum oxide <SEP> an <SEP> aluminum oxide <SEP> phenol saline solution
<tb> No. <SEP> meadow- <SEP> adsorbed <SEP> with <SEP> adsorbed <SEP> unbeliesch- <SEP> glutaraldehyde <SEP> treated <SEP> traded <SEP> meadow grass pollen- <SEP> traded < SEP> Meadows- <SEP> Lachgrass pollen- <SEP>
<tb> extract <SEP> Lachgrass pollen extract
<tb> 50 <SEP> g / ml <SEP> extract <SEP> 1 <SEP> mg / ml
<tb> 1 <SEP> mg / ml
<tb> 1 <SEP> 17 <SEP> 2 <SEP> 6 <SEP> 0
<tb> 2 <SEP> 2 <SEP> 0 <SEP> 3 <SEP> 0 <SEP>
<tb> 3 <SEP> 6 <SEP> 0 <SEP> 3 <SEP> 0 <SEP>
<tb> Total <SEP> 25 <SEP> 2 <SEP> 12 <SEP> 0
<tb>
Immunization Specificity Test
Guinea pigs that had been treated repeatedly were immunized by subcutaneous injection of the alumina-adsorbed, glutaraldehyde-modified material.
A similar set of guinea pigs were immunized with unmodified timothy grass pollen extract adsorbed on aluminum oxide at a pollen concentration of 1 mg / ml. Another injection was given 21 days later and the animals were veined 10 days later.
Passive skin anaphylaxis was performed on the series of experiments by intradermal injection of the serial dilution solutions into the sheared switches of a number of guinea pigs. The animals were then challenged intravenously with the unmodified, aqueous timothy grass extract containing 0.4 ml of Pontamine Sky Blue solution. The results obtained with various concentrations of irritating antigen are given in Table 18 for the modified material and in Table 19 for the control suspension without glutaraldehyde.
<Desc / Clms Page number 14>
Table 18
EMI14.1
<tb>
<tb> guinea pigs <SEP> stimulant <SEP> stimulation zone diameter <SEP> in <SEP> mm <SEP> with <SEP> one
<tb> No. <SEP> frozen <SEP> serum dilution <SEP> of
<tb> drier
<tb> aqueous <SEP> # <SEP> ## <SEP> ### <SEP> ### <SEP> #### <SEP> saline solution
<tb> Timothy grass pollen extract
<tb> 1 <SEP> 1 <SEP> mg / ml <SEP> 22 <SEP> 20 <SEP> 16 <SEP> M
<tb> 2 <SEP> 100 <SEP> Jl <SEP> g / ml <SEP> 20 <SEP> 17 <SEP> 13
<tb> 3 <SEP> 10g / ml <SEP> 20 <SEP> 18
<tb> 4 <SEP> 5 <SEP> to <SEP> g / ml <SEP> 14- <SEP>
<tb>
Table 19
EMI14.2
<tb>
<tb> guinea pigs <SEP> stimulant <SEP> stimulation zone diameter <SEP> in <SEP> mm <SEP> with <SEP> one
<tb> No.
<SEP> frozen <SEP> - <SEP> serum dilution <SEP> of
<tb> drier
<tb> aqueous <SEP> 1 <SEP> 1 <SEP> 1 <SEP> 1 <SEP> 1 <SEP> saline solution
<tb> Wiesenliesch <SEP> 5 <SEP> 25 <SEP> 125 <SEP> 625 <SEP> 3125
<tb> grass pollen extract
<tb> 5 <SEP> 1 <SEP> mg / ml <SEP> 25 <SEP> 16 <SEP> - <SEP> - <SEP> -
<tb> 6 <SEP> 100 <SEP> g / ml <SEP> 20 <SEP> 18 <SEP> 16 <SEP> - <SEP> -
<tb> 7 <SEP> 10 <SEP> g / ml -----
<tb> 8 <SEP> 5 <SEP> g / ml -----
<tb>
It can be seen that the treatment with glutaraldehyde leads to increased antibody formation when compared with the untreated material, although the allergenic effectiveness is reduced.