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R-Mutantenstämme enthalten defekte Lipopolysaccharide. Die 0-spezifischen Ketten sind nicht vorhanden und das Kernpolysaccharid ist, abhängig von den Stellen der Mutation, in mehr oder weniger vollständiger Form vorhanden.
Die Immunisierung von Tieren mit Bakterien oder isolierten Lipopolysacchariden führt zur Bildung spezifischer Antilipopolysaccharidantikörper. Sie betreffen hauptsächlich Determinanten im Zuckerteil des Moleküls. Zirkulierende Antikörper mit Antilipoid A-Spezifität wurden noch nicht festgestellt.
Wie bereits erwähnt, ist das Lipoid A Hauptbaustein aller Lipopolysaccharide und strukturell identisch oder ähnlich bei allen Enterobacteriaceae. Die Bildung von Antikörpern gegen die allgemeine Lipoid A-Struktur der Lipopolysaccharide wurde bisher nicht beschrieben und es wurde auch bislang kein Versuch unternommen, durch Immunisierung mit Lipoid A zirkulierende Antikörper mit Lipoid A-Spezifität zu erzeugen.
Überraschenderweise wurde gefunden, dass Lipoid A in Säugetieren als Immunogen wirkt und dass dadurch Antikörper gebildet werden, die spezifisch mit Lipoid A reagieren. Diese Tatsache kann man sich zunutze machen, um erfindungsgemäss Sera, die Antilipoid A-Antikörper enthalten, herzustellen. Dadurch wird es ermöglicht, eine grosse Reihe von Infektionskrankheiten wirksam zu bekämpfen.
Zur Gewinnung von Lipoid A für die erfindungsgemässe Infektionsbehandlung von Säugetieren werden Bakterien auf an sich bekannte Weise gezüchtet und dann die Kulturen abgetötet. Die Bakterien können auf bekannte Weise isoliert werden. Aus diesen Bakterien gewinnt man die Lipopolysaccharide, die man dann hydrolysiert, wobei man Lipoid A erhält.
Für die im Rahmen des erfindungsgemässen Verfahrens vorgesehene Injektionsbehandlung von Säugetieren kann man Zusammensetzungen verwenden, die das Lipoid A und an sich bekannte Trägerstoffe enthalten. Man kann weiterhin hydrolysierte und nicht-hydrolysierte Bakterien mit Lipoid A oder alkalibehandeltem Lipoid A überziehen und alle diese Präparationen Säugetieren injizieren, um erfindungsgemäss antikörperhältige Sera herzustellen. Die von den Serumspendern gewonnenen Rohsera können zur Prophylaxe und Therapie für Infektionskrankheiten verwendet werden.
Die beim erfindungsgemässen Verfahren verwendeten Lipoid A enthaltenden Injektionspräparate können wie folgt erhalten werden :
1. Bakterien :
Die für die Gewinnung von Lipoid A benötigten Bakterien können in üblicher Weise gezüchtet werden.
2. Lipopolysaccharide :
Lipopolysaccharide können aus Glattformbakterien nach dem Phenol/Wasser-Verfahren oder aus
Rauhformbakterien nach dem Phenol/Chloroform/Petroläther-Verfahren extrahiert werden.
3. Lipoid A :
Freies Lipoid A wird durch Hydrolyse des entsprechenden Lipopolysaccharids in verdünnter Säure, z. B. in l% iger-Essigsäure bei 1000C während 2 h hergestellt. Das wasserunlösliche freie Lipoid A wird mehrere Male mit destilliertem Wasser gewaschen und im Vakuum getrocknet. In solchen
Präparationen kann kein 2-Keto-3-desoxycotonat (KDO) festgestellt werden. Lipoid A kann durch
Zugabe von Triäthylamin (l jul) zu einer Suspension von Lipoid A in Wasser (2 mg/2 ml) solubilisiert werden. Zur Solubilisierung von Lipoid A kann man auch andere Amine und andere basisch reagierende Stoffe verwenden.
4. Alkalibehandeltes Lipoid At
Modifizierte Lipoid A-Präparate werden durch Behandlung von Lipoid A mit alkalischen Mitteln erhalten. So wird z. B. freies Lipoid A in 0, 25 n-Natriumhydroxyd 1 h bei 560C erwärmt. Das unlösliche Material wird entfernt und die überstehende Flüssigkeit wird mit Essigsäure neutralisiert, wobei sich ein Niederschlag bildet. Der Niederschlag wird entfernt und die überstehende Lösung gegen destilliertes Wasser dialysiert. Ausgefallenes Material wird erneut durch Zentrifugieren entfernt und die überstehende Flüssigkeit, die lösliches, alkalibehandeltes Lipoid A enthält, gefriergetrocknet.
5. Mit Lipoid A überzogene Bakterien :
Zur Herstellung von mit Lipoid A überzogenen Bakterien wird Lipoid A in destilliertem Wasser (1 mg/ml) suspendiert und durch Zugabe von Triäthylamin (1jul/2 ml) solubilisiert. Aliquote Teile dieser Lösungen werden mit 2 ml einer Suspension der Bakterien in destilliertem Wasser (1 mg/2 ml) vermischt, und dann wurde die Mischung getrocknet. Auf diese Weise erhält man Bakterien, die mit
10,100 oder 500 jug Lipoid A pro 1 mg Trockengewicht überzogen sind.
Auf ähnliche Weise werden hydrolysierte Bakterien mit Lipoid A überzogen. Zur Hydrolyse werden die
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Vakuum getrocknet und wie oben beschrieben mit Lipoid A überzogen.
Das so erhaltene Lipoid A und die Lipoid A-Präparationen wurden beim folgenden Beispiel verwendet.
Selbstverständlich ist es möglich, Lipoid A auch noch auf andere Weise zu modifizieren.
Bei den vorliegenden Versuchen wurden unbehandelte, wie auch mit Lipoid A überzogene Bakterien als Antigene verwendet.
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Weiterhin setzte man in Kontrollversuchen als Antigene frische, in der Wärme abgetötete Bakterien ein und verwendete ausserdem noch unvollständiges Freund's Adjuvans allein. Es wurden antibakterielle Sera gegen Sund R-Formbakterien hergestellt.
Beispiel : Herstellung von Antilipoid A-Antikörper.
Weissen Kaninchen aus Neuseeland mit einem Körpergewicht von 2 bis 2, 5 kg wurden 4 intravenöse Injektionen des Antigens mit unterschiedlichen Mengen verabreicht :
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<tb>
<tb> 1. <SEP> Tag <SEP> 100 <SEP> jug <SEP>
<tb> 3. <SEP> Tag <SEP> 200 <SEP>
<tb> 7. <SEP> Tag <SEP> 300 <SEP> jug <SEP>
<tb> 1l. <SEP> Tag <SEP> 500 <SEP> jug. <SEP>
<tb>
Am 16. Tag wurde den Tieren durch Herzpunktur Blut entnommen, das dann näher untersucht wurde. Das
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von 7 Wochen durchgeführt. 10 Tage danach wurde aus der Ohrvene Blut entnommen. Das Verhältnis von Bakterien zu Lipoid A betrug 2 : 1 (Gew. /Gew.).
Zum Nachweis der Wirksamkeit wurden weisse Mäuse mit 0, 2 ml Serum (Titer 1 : 30. 000) intravenös behandelt.
Absorption und Desorption von Antilipoid A-Antikörper.
Erythrozyten, die entweder mit Lipoid A oder mit alkalibehandeltem Lipoid A sensibilisiert sind, ergeben im wesentlichen die gleichen Ergebnisse. Der Einfachheit halber wird im allgemeinen alkalibehandeltes Lipoid A verwendet, um die Erythrozyten zu überziehen.
Antilipoid A-Serum (1 ml) wird mit gepackten, mit Formalin behandelten roten Zellen (0, 1 ml), die mit alkalibehandeltem Lipoid A (100 f. lg) sensibilisiert sind, vermischt. Die Mischung wird bei Zimmertemperatur 15 min gerührt und dann werden die Zellen durch Zentrifugieren abgetrennt.
Zur Desorption der Antilipoid A-Antikörper werden die Zellen nach der Absorption in einen 0, 1 m-Glycin-HCI-puffer (pffWert : 2, 2 ; 2 ml) bei Zimmertemperatur 1 h gerührt. Nach dem Zentrifugieren wird die überstehende Flüssigkeit mit Natriumhydroxyd neutralisiert und durch Ultrafiltration auf das ursprüngliche Volumen (1 ml) eingeengt.
Antilipoid A-Aktivität verschiedener Immunsera.
Um die Antilipoid A-Aktivität in dem entsprechenden Serum zu bestimmen, wird der passive Hämolyseversuch durchgeführt, wobei man rote Blutzellen verwendet, die mit alkalibehandeltem Lipoid A aus S. minnesota R345 überzogen sind. Im allgemeinen führt die subkutane Immunisierung in unvollständigem Freund's Adjuvans zu einem geringfügig höheren Antilipoid A-Titer, verglichen mit dem intravenösen Immunisierungsschema. Mit beiden Methoden erhält man die besten Ergebnisse, wenn man hydrolysierte Aalmonella minnesotaR595-Bakterien, die mit Lipoid A überzogen sind, als Antigen verwendet. Man erhält ebenfalls gute Ergebnisse, wenn man mit hydrolysierten Bakterien oder mit nicht-hydrolisierten Bakterien, die mit Lipoid A überzogen sind, immunisiert.
Immunisierung mit entweder mit Phenol getöteten oder mit wärmegetöteten Bakterien führt zu niedrigen Werten der Antilipoid A-Aktivität. Im Präblutserum oder nach der Injektion mit unvollständigem Feund's Adjuvans kann man keine Antikörper feststellen.
Spezifische Absorption und Desorption von Lipoid A-Antikörper.
Die Spezifität eines Antilipoid A-Serums wird durch Absorption mit formalinbehandelten Erythrozyten, die mit Lipoid A sensibilisiert sind (aus S. minnesota R345) untersucht.
Das absorbierte Serum enthält keine Antilipoid A-Aktivität, während man bei Vergleichsprobe (Behandlung mit nicht-sensibilisierten Erythrozyten) keinen Titerabfall beobachtet.
Die absorbierten Antilipoid A-Antikörper können dissoziiert werden, indem man die mit Lipoid A überzogenen Zellen mit Glycin-HCl-Puffer mit PH 2, 2 inkubiert. Es wird eine beträchtliche Menge der Antilipoid A-Aktivität wiedergewonnen.
Serologische Kreuzreaktionen zwischen Lipoid A und verschiedenen Lipopolysacchariden der S- und R-Formen.
Die Fähigkeit von Antilipoid A-Serum, mit S- und R-Lipopolysacchariden von Salmonella- und E. coli-Stämmen zu reagieren, wird im passiven Hämolysetest mit rosten Zellen, die mit diesen Präparationen sensibilisiert sind, untersucht. Alle S- und R-Formen der Lipopolysaccharide reagieren mit dem Antilipoid A-Serum. Um die Spezifität dieser Kreuzreaktionen zu beweisen, werden die Lipopolysaccharide verschiedener Bakterien mit dem gleichen Serum nach Absorption mit Lipoid A geprüft. Dabei tritt in keinem Fall eine Kreuzreaktion auf.
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R mutant strains contain defective lipopolysaccharides. The O-specific chains are not present and the core polysaccharide is present in a more or less complete form, depending on the sites of the mutation.
The immunization of animals with bacteria or isolated lipopolysaccharides leads to the formation of specific anti-lipopolysaccharide antibodies. They mainly affect determinants in the sugar part of the molecule. Circulating antibodies with antilipoid A specificity have not yet been detected.
As already mentioned, lipoid A is the main building block of all lipopolysaccharides and structurally identical or similar in all Enterobacteriaceae. The formation of antibodies against the general lipoid A structure of the lipopolysaccharides has not yet been described and no attempt has been made to produce circulating antibodies with lipoid A specificity by immunization with lipoid A.
Surprisingly, it has been found that lipoid A acts as an immunogen in mammals and that antibodies which react specifically with lipoid A are thereby formed. This fact can be used to produce sera which contain antilipoid A antibodies according to the invention. This makes it possible to fight a wide range of infectious diseases effectively.
To obtain lipoid A for the treatment of infection of mammals according to the invention, bacteria are grown in a manner known per se and the cultures are then killed. The bacteria can be isolated in a known manner. The lipopolysaccharides are obtained from these bacteria, which are then hydrolyzed to obtain lipoid A.
For the injection treatment of mammals provided in the context of the method according to the invention, compositions can be used which contain lipoid A and carrier substances known per se. Hydrolyzed and non-hydrolyzed bacteria can also be coated with lipoid A or alkali-treated lipoid A and all of these preparations can be injected into mammals in order to produce antibody-containing sera according to the invention. The raw sera obtained from the serum donors can be used for prophylaxis and therapy for infectious diseases.
The injection preparations containing lipoid A used in the process according to the invention can be obtained as follows:
1. Bacteria:
The bacteria required for obtaining lipoid A can be grown in the usual way.
2. Lipopolysaccharides:
Lipopolysaccharides can be obtained from smooth-form bacteria using the phenol / water method or from
Rough-form bacteria can be extracted using the phenol / chloroform / petroleum ether method.
3. Lipoid A:
Free lipoid A is obtained by hydrolysis of the corresponding lipopolysaccharide in dilute acid, e.g. B. in 1% acetic acid at 1000C for 2 h. The water-insoluble free lipoid A is washed several times with distilled water and dried in vacuo. In such
Preparations, no 2-keto-3-deoxycotonate (KDO) can be detected. Lipoid A can go through
Addition of triethylamine (l jul) to a suspension of lipoid A in water (2 mg / 2 ml) to be solubilized. Other amines and other basic reacting substances can also be used to solubilize lipoid A.
4. Alkali Treated Lipoid At
Modified Lipoid A preparations are obtained by treating Lipoid A with alkaline agents. So z. B. heated free lipoid A in 0.25 n sodium hydroxide for 1 h at 560C. The insoluble material is removed and the supernatant liquid is neutralized with acetic acid, whereby a precipitate is formed. The precipitate is removed and the supernatant solution is dialyzed against distilled water. Precipitated material is again removed by centrifugation and the supernatant liquid, which contains soluble, alkali-treated lipoid A, is freeze-dried.
5. Bacteria coated with Lipoid A:
To produce bacteria coated with lipoid A, lipoid A is suspended in distilled water (1 mg / ml) and solubilized by adding triethylamine (1 μl / 2 ml). Aliquots of these solutions are mixed with 2 ml of a suspension of the bacteria in distilled water (1 mg / 2 ml) and then the mixture is dried. This way you get bacteria that are with
10,100 or 500 jug of lipoid A per 1 mg dry weight are coated.
In a similar manner, hydrolyzed bacteria are coated with lipoid A. For hydrolysis, the
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Vacuum dried and coated with lipoid A as described above.
The thus obtained Lipoid A and the Lipoid A preparations were used in the following example.
Of course, it is also possible to modify lipoid A in other ways.
In the present experiments, untreated bacteria as well as bacteria coated with lipoid A were used as antigens.
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Furthermore, fresh bacteria killed in the heat were used as antigens in control experiments and, in addition, only incomplete Freund's adjuvant was used. Antibacterial sera against Sund R-form bacteria were prepared.
Example: production of antilipoid A antibodies.
White rabbits from New Zealand with a body weight of 2 to 2.5 kg were given 4 intravenous injections of the antigen in different amounts:
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<tb>
<tb> 1st <SEP> tag <SEP> 100 <SEP> jug <SEP>
<tb> 3rd <SEP> Tag <SEP> 200 <SEP>
<tb> 7. <SEP> Tag <SEP> 300 <SEP> jug <SEP>
<tb> 1l. <SEP> tag <SEP> 500 <SEP> jug. <SEP>
<tb>
On the 16th day, blood was drawn from the animals by cardiac puncture, which was then examined more closely. The
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carried out for 7 weeks. Blood was drawn from the ear vein 10 days later. The ratio of bacteria to lipoid A was 2: 1 (w / w).
To demonstrate the effectiveness, white mice were treated intravenously with 0.2 ml of serum (titer 1: 30,000).
Absorption and desorption of antilipoid A antibodies.
Red blood cells sensitized with either lipoid A or alkali-treated lipoid A give essentially the same results. For convenience, alkali treated lipoid A is generally used to coat the erythrocytes.
Antilipoid A serum (1 ml) is mixed with packed, formalin-treated red cells (0.1 ml) sensitized with alkali-treated lipoid A (100 f. Lg). The mixture is stirred at room temperature for 15 minutes and then the cells are separated by centrifugation.
For the desorption of the antilipoid A antibodies, the cells are stirred after absorption in a 0.1 m-glycine-HCl buffer (pff value: 2.2; 2 ml) at room temperature for 1 hour. After centrifugation, the supernatant liquid is neutralized with sodium hydroxide and concentrated to the original volume (1 ml) by ultrafiltration.
Antilipoid A activity of various immune sera.
In order to determine the antilipoid A activity in the corresponding serum, the passive hemolysis test is carried out using red blood cells which are coated with alkali-treated lipoid A from S. minnesota R345. In general, subcutaneous immunization in incomplete Freund's adjuvant results in a slightly higher antilipoid A titer compared to the intravenous immunization regimen. Both methods give the best results when using hydrolyzed Aalmonella minnesotaR595 bacteria coated with lipoid A as the antigen. Good results are also obtained when immunizing with hydrolyzed bacteria or with non-hydrolyzed bacteria coated with lipoid A.
Immunization with either phenol-killed or heat-killed bacteria results in low levels of antilipoid A activity. Antibodies cannot be detected in the pre-blood serum or after the injection with incomplete Feund's adjuvant.
Specific absorption and desorption of lipoid A antibodies.
The specificity of an antilipoid A serum is examined by absorption with formalin-treated erythrocytes which are sensitized with lipoid A (from S. minnesota R345).
The absorbed serum does not contain any antilipoid A activity, while no decrease in titre is observed in the comparison sample (treatment with non-sensitized erythrocytes).
The absorbed antilipoid A antibodies can be dissociated by incubating the cells coated with lipoid A with glycine-HCl buffer with pH 2, 2. A significant amount of the antilipoid A activity is recovered.
Serological cross-reactions between lipoid A and various lipopolysaccharides of the S and R forms.
The ability of antilipoid A serum to react with S- and R-lipopolysaccharides from Salmonella and E. coli strains is examined in a passive hemolysis test with rusted cells that are sensitized with these preparations. All S and R forms of lipopolysaccharides react with the antilipoid A serum. In order to prove the specificity of these cross-reactions, the lipopolysaccharides of different bacteria are tested with the same serum after absorption with lipoid A. In no case does a cross reaction occur.