MX2012014576A

MX2012014576A - Profarmacos de peptido de la superfamilia de glucagon basado en amida.

Info

Publication number: MX2012014576A
Application number: MX2012014576A
Authority: MX
Inventors: Richard D Dimarchi; Binbin Kou
Original assignee: Univ Indiana Res & Tech Corp
Priority date: 2010-06-24
Filing date: 2011-06-14
Publication date: 2013-02-21
Also published as: CN103179979A; RU2580317C2; JP2013540102A; RU2013103093A; US20130123462A1; WO2011163012A2; AR081471A1; KR20130102470A; EP2588126A4; TW201209062A; WO2011163012A3; US8778872B2; CA2796894A1; EP2588126A2

Abstract

Se proporcionan formulaciones de profármacos de péptidos de la superfamilia de glucagón en donde el péptido de la superfamilia de glucagón ha sido modificado por la unión de un dipéptido a la superfamilia de glucagón a través de una ligadura de unión amida. Los profármacos divulgados en el presente han prolongado las semividas y son convertidos a la forma activa en condiciones fisiológicas a través de una reacción no enzimática dirigida por inestabilidad química.

Description

PROFÁRMACOS DE PÉPTIDO DE LA SUPERFAMILIA DE GLUCAGÓN BASADO EN AMIDA Inclusión por referencia de material presentado por medios electrónicos Se incorpora por vía de referencia en su totalidad un listado de secuencias de nucléotidos/amino ácidos en soporte de lectura informática presentado junto con la presente y que se identifica de la siguiente manera: archivo Un 957 KB ACII (Texto) denominado ,,Listado_de_Secuencias_213134" creado el 21 de junio de 2010.

Referencia Cruzada a Solicitudes de Patente Relacionadas La presente solicitud de patente reivindica prioridad de la Solicitud de Patente Provisoria Estadounidense N° 61/358.188 presentada el 24 de junio de 2010, la cual se incluye expresamente por referencia en su totalidad.

Antecedentes Los fármacos basados en péptidos son medicamentos altamente eficaces con una duración de acción relativamente corta y un índice terapéutico variable. La presente invención se refiere a profármacos basados en péptidos en donde el derivado del profármaco está diseñado para retardar el inicio de la acción y prolongar la semivida del fármaco. El inicio de la acción retardado es ventajoso en cuanto permite la distribución sistémica del profármaco antes de su activación. Por consiguiente, la administración de profármacos elimina complicaciones provocadas por actividades pico luego de la administración y aumenta el índice terapéutico del fármaco parental .

El reconocimiento del receptor y el posterior procesamiento de agonistas de péptido y de proteína es la principal vía degradación de muchos fármacos basados en péptidos y en proteínas. Por lo tanto la unión del fármaco de péptido a su receptor deriva en la estimulación biológica, pero también inicia la desactivación posterior de la farmacología inducida por proteína/péptido a través de la degradación enzimática del péptido o la proteína. De acuerdo con la presente invención, los profármacos se pueden preparar para prolongar la semivida biológica del péptido o la proteína basada en una estrategia del reconocimiento de la inhibición del profármaco por el receptor correspondiente .

Los profármacos revelados en la presente finalmente se convertirán químicamente en estructuras que pueden ser reconocidas por el receptor, en donde la velocidad de esta conversión química determinará el tiempo de inicio y la duración de la acción biológica in vivo. El diseño molecular revelado en esta solicitud de patente se basa en la reacción química intramolecular que no depende de aditivos químicos adicionales o enzimas.

Pre-proglucagón es unpolipeptido de precursor de 158 aminoácidos que se procesa en diferentes tejidos para formar numerosos péptidos derivados de proglucagón diferentes, que incluyen glucagón ( (SEQ ID NO: 701), péptido 1 similar a glucagón (GLP-1; se proporcionan aminoácidos 7-36 como SEQ ID NO: 703 y SEQ ID NO: 704), péptido 2 similar a glucagón (GLP-2; SEQ ID NO: 708) y oxintomodulina (OXM; SEQ ID NO: 706) , que están involucrados en una amplia variedad de funciones fisiológicas, que incluyen homeostasis de glucosa, secreción de insulina, vaciado gástrico y crecimiento intestinal, así como la regulación de la ingesta de alimentos .

Glucagón es un péptido de 29 aminoácidos (que corresponde a los aminoácidos 33 a 61 de pre-proglucagón, mientras que GLP-1 se produce como un péptido de 37 aminoácidos que corresponde a los aminoácidos 72 a 108 de pre-proglucagón. GLP-1 (7-36) amida (SEQ ID NO: 704; el extremo de C es una arginina amida) o GLP-1 (7-37) ácido (SEQ ID NO: 703; el extremo de C es una glicina) son formas biológicamente potentes de GLP-1, que demuestran la actividad esencialmente equivalente en el receptor de GLP-1.

Glucagón es un medicamento que salva vidas que se utiliza en el tratamiento agudo de hipoglucemia grave . Se ha informado que oxintomodulina tiene capacidad farmacológica para suprimir el apetito y bajar el peso corporal. Los estudios clínicos con agonistas de receptor de GLP-1 o análogos de GLP-1 estabilizados han demostrado que esta familia de péptidos constituye un tratamiento eficaz para la diabetes de Tipo II. Además, sería intrínsecamente más seguro que la terapia de insulina, debido a su acción que depende de la glucosa, eliminando entonces las oportunidades de hipoglucemia. Los estudios de la relación de la estructura a la actividad han demostrado que la histidina del extremo de N para cada uno de estos tres péptidos (glucagón,- GLP-1 y oxintomodulina) es especialmente importante para la acción completa y que las formas prolongadas del extremo de N disminuyen gravemente la potencia biológica.

Se sabe que los péptidos adicionales se asemejan a glucagón y GLP-1 en la estructura y tienen actividades similares. Por ejemplo, Exendina-4 es un péptido presente en la saliva del monstruo de Gila que se asemeja a GLP-1 en estructura, y como glucagón y GLP-1, aumenta la liberación de insulina.

Además, el polipéptido inhibidor gástrico (GIP) también es conocido como un péptido insulinotrópico que depende de la glucosa y es un miembro de la familia de hormonas de secretina. GIP deriva de una proproteína de 153 aminoácidos codificada por el gen de GIP y circula como un péptido de 42 aminoácidos biológicamente activo (SEQ ID NO: 707) . El gen de GIP se expresa en el intestino delgado así como en las glándulas salivales y es un inhibidor débil de la secreción de ácidos gástricos. Además de sus efectos inhibidores en el estómago, en la presencia de glucosa, GIP aumenta la liberación de insulina por las células beta de los islotes pancreáticos cuando se administra en dosis fisiológicas. Se cree que GIP funciona como un factor entérico que estimula la liberación de insulina pancreática y que puede cumplir una función fisiológica para mantener la homeostasis de glucosa.

Osteocalcina (SEQ ID NO: 709) es una proteína que no es de colágeno que se encuentra en los huesos y en la dentina. Es segregada por osteoblastos y se piensa que cumple una función en la mineralización y la homeostasis de iones de calcio. También se ha informado que Osteocalcina funciona como una hormona en el cuerpo, provocando que las células beta del páncreas liberen más insulina, y al mismo tiempo conduciendo a las células grasas a liberar la hormona adiponectina, que aumenta la sensibilidad a la insulina .

Una de las desventajas asociadas con el uso terapéutico de péptidos bioactivos tales como osteocalcina, GIP, glucagón, GLP-1 y oxintomodulina es su semivida extremadamente corta (aproximadamente dos minutos para glucagón y GLP-1) en el plasma. Por consiguiente, para obtener el control glicémico razonable, se necesitaría administrar péptidos relacionados con glucagón nativo en forma continua durante un período de tiempo prolongado. La semivida breve de glucagón y péptidos relacionados con GLP-1 deriva de la degradación rápida por Dipeptidil Peptidasa IV (DPP-IV), que se descompone entre el segundo y el tercer aminoácidos. Esta descomposición no solamente inactiva los péptidos nativos sino que en el caso de glucagón y GLP-1 las formas acortadas pueden ser antagonistas funcionales en sus receptores respectivos. Por consiguiente, existe una necesidad de variantes de acción más prolongada de GIP, glucagón, GLP-1 y oxintomodulina, y péptidos relacionados, para alcanzar el potencial terapéutico completo de estos mecanismos de acción del fármaco .

Extracto De acuerdo con algunas realizaciones, se proporciona un derivado de profármaco de un polipéptido bioactivo seleccionado del grupo formado por glucagón, exendina 4, GLP-1, GLP-2, GIP, péptido intestinal vasoactivo (VIP) , polipéptido 27 que activa ciclasa de adenilato pituitario (PACAP-27) , péptido histidina metionina (PHM) , oxintomodulina, secretina, osteocalcina, hormona que libera la hormona de crecimiento, así como análogos, derivados y conjugados de los precedentes. El derivado de profármaco comprende un elemento profármaco de dipéptido unido en forma covalente a un sitio activo del polipéptido bioactivo a través de una ligadura de amida. En algunas realizaciones, el dipéptido está unido en forma covalente al polipéptido bioactivo en una posición que interfiere con la capacidad del polipéptido bioactivo de interactuar con su receptor o cofactor correspondiente. En algunas realizaciones, el elemento profármaco de dipéptido está unido al extremo de amino del péptido bioactivo. La eliminación posterior del dipéptido, en condiciones fisiológicas y en la ausencia de actividad enzimática, restablece la actividad completa al polipéptido.

En algunas realizaciones, se proporciona un profármaco que tiene la estructura general de A-B-Q. En esta realización Q es un péptido bioactivo, seleccionado del grupo de péptidos de la superfamilia de glucagón, que incluyen péptidos relacionados con glucagón, osteocalcina así como análogos, derivados y conjugados de los precedentes; y A-B representa un profármaco de dipeptido unido a un péptido bioactivo a través de un enlace de amida. Más específicamente, en algunas realizaciones, A es un aminoácido o un hidroxi ácido y B es un aminoácido N-alquilado unido a Q a través de la formación de un enlace de amida entre un carboxilo de B (en A-B) y una amina de Q. Además, en algunas realizaciones, A, B, o el aminoácido de Q al cual está unido A-B, es un aminoácido no codificado, y la descomposición química de. A-B desde Q se completa en por lo menos un 90% dentro de aproximadamente 1 a aproximadamente 720 horas en PBS bajo condiciones fisiológicas. En otra realización, la descomposición química de A-B desde Q se completa en por lo menos un 50% dentro de aproximadamente 1 hora a aproximadamente 1 semana en PBS bajo condiciones fisiológicas.

En algunas realizaciones, A y B se seleccionan para inhibir la descomposición enzimática del dipeptido de A-B desde Q por enzimas halladas en el suero de mamífero. En algunas realizaciones, A y/o B se seleccionan de manera tal que la semivida de descomposición de A-B desde Q en PBS en condiciones fisiológicas, es no más de dos veces la semivida de descomposición de A-B desde Q en una solución que comprende una DPP-IV proteasa (es decir, la descomposición de A-B desde Q no ocurre a una velocidad más de 2x más rápida en la presencia de DPP-IV proteasa y las condiciones fisiológicas en relación con condiciones idénticas en la ausencia de la enzima) . En algunas realizaciones, A y/o B es un amioácido en la configuración del estereoisomero de D. En algunos ejemplos de realizaciones, A es un aminoácido en la configuración del estereoisomero de D y B es un aminoácido en la configuración del estereoisomero de L. En algunas realizaciones A es es un aminoácido en la configuración del estereoisomero de L y B es un aminoácido en la configuración del estereoisomero de D. En algunos ejemplos de realizaciones, A es un aminoácido en la configuración del estereoisomero de D y B es un aminoácido en la configuración del estreoisomero de D.

En algunas realizaciones, el elemento profármaco de dipéptido (A-B) comprende un compuesto que tiene la estructura general de la Fórmula I : en donde Ri, R2, R4 y Re se seleccionan i¦ndependientemente del grupo formado por H, alquilo de Ci-Ci8, alquenilo de C2-Ci8, (alquilo de d-Ci8)0H, (alquilo de Ci-Ci8)SH, (alquilo de C2-C3)SCH3, (alquilo de Ci-C4)CONH2, (alquilo de Ci-C4)C00H, (alquilo de Ci-C4) H2, (alquilo de Ci-C4) NHC ( H +) NH2 , (alquilo de C0-C4) (cicloalquilo de C3-C6) , (alquilo de C0-C4) (heterocíclico de C2-C5) , (alquilo de C0-C4) (arilo de C6-Ci0)R7, (alquilo de Ci-C4) (heteroarilo de C3-C9) , y alquilo de Ci~Ci2 (??) alquilo de Ci-C12, en donde i es un heteroátomo seleccionado del grupo formado por N, S y 0, o Ri y R2 junto con los átomos a los cuales están unidos forman un cicloalquilo o arilo de C3-Ci2; o R4 y R8 junto con los átomos a los cuales están unidos forman un cicloalquilo de C3-C6; R3 se selecciona del grupo formado por alquilo de Ci-Cis, (alquilo de Ci-Ci8)0H, (alquilo de Ci-Ci8)NH2, (alquilo de Ci-Ci8)SH, (alquilo de C0-C4) (C3-C6) cicloalquilo, (alquilo de C0-C4) (heterocíclico de C2-C5) , (alquilo de C0-C4) (arilo de C6-Ci0) 7, y (alquilo de C1-C4) (heteroarilo de C3-C9) o R4 y R3 junto con los átomos a los cuales están unidos forman un anillo heterocíclico de 4 , 5, 0 6 miembros ,- R5 es NHR6 u OH; R6 es H, alquilo de Ci-C8 o R6 y R2 junto con los átomos a los cuales están unidos forman un anillo heterocíclico de 4 , 5, o 6 miembros; y R7 se selecciona del grupo formado por H y OH.

Es aparente para una persona versada en la materia que cuando Wi es N, el átomo de nitrógeno se une a H bajo condiciones fisiológicas .

En otra realización, el elemento de profármaco de dipéptido (A-B) comprende un compuesto que tiene la estructura general de la Fórmula I : en donde R, R2, R4 y R8 se seleccionan independientemente del grupo formado por H, alquilo de C!-Ci8/ alquenilo de C2-Ci8, (alquilo de d-Ci8)OH, (alquilo de Ci-Ci8)SH, (alquilo de C2-C3)SCH3, (alquilo de Ci-C )CONH2, (alquilo de Ci-C4)C0OH, (alquilo de Ci-C4)NH2, (alquilo de C1-C4) NHC (NH2+) NH2 , (alquilo de C0-C ) (cicloalquilo de C3-C6) , (alquilo de C0-C4) (heterocíclico de C2-C5) , (alquilo de C0-C4) (arilo de C6-Ci0)R7, (alquilo de Ci-C4) (heteroarilo de C3-C9) , y alquilo de Ci-C12 (Wx) alquilo de Ci-C12, en donde Wi es un heteroátomo seleccionado del grupo formado por N, S y O, o Ri y R2 junto con los átomos a los cuales están unidos forman un cicloalquilo de C3-Ci2; o R4 y R8 junto con los átomos a los cuales están unidos forman un cicloalquilo de C3-C6; R3 se selecciona del grupo formado por alquilo de Cx-Cíe, (alquilo de Ci-C18)OH, (alquilo de C1-C18)NH2, (alquilo de d-Ci8)SH, (alquilo de C0-C4) cicloalquilo (de C3-C3) , (alquilo de C0-C4) (heterocíclico de C2-C5) , (alquilo de C0-C4) (arilo de C6-Ci0)R7, y (alquilo de C1-C ) (heteroarilo de C3-C9) o R4 y R3 junto con los átomos a los cuales están unidos forman un anillo heterocíclico de 4 , 5 , ó 6 miembros ; R5 es NHR6 o OH; R6 es H, alquilo de Ci-C8 o R6 y i junto con los átomos a los cuales están unidos forman un anillo heterocíclico de 4 , 5 o 6 miembros ; y R7 se selecciona del grupo formado por hidrógeno, alquilo de Ci-Ci8, alquenilo de C2-Ci8, (alquilo de C0-C4)CONH2, (alquilo de C0-C4)COOH, (alquilo de C0-C4)NH2, (alquilo de C0-C4)OH, y halo.

Como se describió anteriormente, en algunos aspectos se proporciona un profármaco que tiene la estructura general de A-B-Q, en donde Q es un péptido de la superfamilia de glucagón (por ejemplo un péptido relacionado con glucagón, Hormona que Libera la Hormona de Crecimiento (GHRH; SEQ ID NO: 719) , péptido intestinal vasoactivo (VIP; SEQ ID NO: 720), polipéptido 27 que activa ciclasa de adenilato pituitario (PACAP-27; SEQ ID NO: 721) , péptido histidina metionina (PHM; SEQ ID NO: 722) , o Secretina (SEQ ID NO: 723) , y/o análogos, derivados y conjugados de ellos) . Los péptidos de la superfamilia de glucagón pueden tener características estructurales comunes, que incluyen en forma no taxativa, homología dentro de los aminoácidos del extremo de N y/o estructura alfa-helicoidal dentro de la parte del extremo de C. Se cree que el extremo de C generalmente funciona en la unión al receptor y que el extremo de N generalmente funciona en la señalización del receptor. Algunos aminoácidos de la parte del extremo de N y de la parte del extremo de C se conservan altamente entre los miembros de la superfamilia de glucagón, por ejemplo, Hisl, Gly4 , Phe6, Phe22, Val23, Trp25, y Leu26, con aminoácidos en estas posiciones que presentan identidad, sustituciones conservadoras o similitud en las cadenas laterales de aminoácidos. En algunas realizaciones Q es un péptido relacionado con glucagón (SEQ ID NO: 701) , oxintomodulina (SEQ ID NO: 706), exendina 4 (SEQ ID NO: 718), péptido 1 similar a glucagón (GLP-1) (aminoácidos 7-37 provistos como SEQ ID NOs : 703 y 707), péptido 2 similar a Glucagón (GLP-2) (SEQ ID NO: 708), GIP (SEQ ID NO: 707) o análogos, derivados y conjugados de los precedentes. En algunas realizaciones Q como péptido relacionado con glucagón comprende una secuencia de aminoácido que es por lo menos un 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, o 95% idéntica a la secuencia correspondiente de glucagón nativo, oxintomodulina nativa, exendina 4 nativa, (7-37) GLP-1 nativo, GLP-2 nativo, o GIP nativo sobre la longitud del péptido nativo (o sobre las posiciones que corresponden a glucagón, véase por ejemplo, la Figura 10) . En otras realizaciones, un péptido de la superfamilia de glucagón (Q) comprende una secuencia de aminoácido de glucagón nativo, exendina 4 nativa, (7-37)GLP-l nativo, GLP-2 nativo, GHRH nativo, VIP nativo, PACAP-27 nativo, PHM nativo, Oxintomodulina nativa, Secretina nativa, o GIP nativo con hasta 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 modificaciones de aminoácidos. En aún otras realizaciones, Q comprende una secuencia de aminoácido que es una quimera de dos o más secuencias de péptido relacionado con glucagón nativo. En algunas realizaciones, Q comprende una secuencia de aminoácido por lo menos idéntica en un 50% al glucagón nativo (SEQ ID NO: 701) que retiene la conformación de alfa-hélice de los aminoácidos que corresponden a los aminoácidos 12-29 de SEQ ID NO: 701.

Q puede ser cualquiera de los péptidos de la superfamilia de glucagón que son conocidos en el arte, que incluyen, por ejemplo, cualquier péptido relacionado con glucagón conocido en el arte, algunos de los cuales se revelan en la presente a modo de ejemplos no taxativos. Una variedad de análogos de GLP-1 son conocidos en el arte y son un péptido relacionado con glucagón de acuerdo con la presente invención, véase, por ejemplo WO 2008023050, WO 2007030519, WO 2005058954, WO 2003011892, WO 2007046834, WO 2006134340, WO 2006124529, WO 2007046834, WO 2006134340, WO 2006124529, WO 2004022004, WO 2003018516, WO 2007124461, cada una de las cuales se incluye en su totalidad en la presente por referencia para cada una de sus revelaciones de secuencias o fórmulas de análogos o derivados de GLP-1. En ciertas realizaciones, Q es un péptido relacionado con glucagón de la Clase 1, 2, 3, 4 o 5 como se detalla en la presente. En cualquiera de las realizaciones descritas en la presente Q es cualquiera de SEQ ID NOs : 1-684, 701-742, 801-919, 1001-1262, 1301-1371, 1401-1518, 1701-1776, y 1801-1921.

Si bien el profármaco de dipéptido, por ejemplo, A-B, se puede unir a Q en cualquier posición que interfiere con la actividad de Q, las realizaciones reveladas en la presente ilustran ejemplos de posiciones que son adecuadas para la ligadura de A-B. Cuando los números de posiciones se denominan en la presente refiriéndose a la posición en la secuencia de glucagón nativo (SEQ ID NO: 701) , la posición correspondiente en los análogos de glucagón o en otros péptidos de la superfamilia de glucagón se puede determinar mediante la alineación. Véase, por ejemplo, la Figura 10 que muestra una alineación de ciertos péptidos de la superfiamilia de glucagón. Por ejemplo, la posición 24 basada en glucagón nativo corresponde a la posición 24 de (7-37) GLP-1.

En ciertas realizaciones, un péptido de la superfamilia de glucgón puede comprender un extremo de C o una secuencia de aminoácido del extremo de C que incluye en forma no taxativa: COOH, C0NH2, GPSSGAPPPS (SEQ ID NO: 710) , GPSSGAPPPS-CONH2 (SEQ ID NO: 711) , una prolongación del extremo de carboxi de oxintomodulina, KRNRNNIA (SEQ ID NO: 714) o KGKKNDWKHNITQ (SEQ ID NO: 713) . Otras secuencias de aminoácido del extremo de C para péptidos de la superfamilia de glucagón se describen más detalladamente a continuación.

En otros aspectos, Q comprende osteocalcina (SEQ ID NO: 709), o una secuencia de aminoácido que es por lo menos aproximadamente un 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, o 95% idéntica a la osteocalcina nativa sobre la longitud del péptido nativo. Q puede comprender un análogo de osteocalcina con hasta 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 modificaciones de aminoácidos en relación con la osteocalcina nativa. En aún otro aspecto, Q comprende la hormona que libera la hormona de crecimiento (GHRH) (SEQ ID NO: 719), o una secuencia de aminoácido que es por lo menos aproximadamente un 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, o 95% idéntica a la GHRH nativa sobre la longitud del péptido nativo. Q puede comprender un análogo de GHRH con hasta 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 modificaciones de aminoácidos en relación con la GHRH nativa. En algunas realizaciones, Q puede ser cualquier análogo de osteocalcina o GHRH conocido en el arte .

En aún otras realizaciones, se proporciona un profármaco que tiene la estructura general de A-B-Q, en donde Q es un péptido de la superfamilia de glucagón, osteocalcina o un análogo, derivado o conjugado de ellos y A-B conprende la estructura general: en donde Ri y R8 se seleccionan independientemente del grupo formado por H y alquilo de Ci-C8; R2 y R4 se seleccionan independientemente de H, alquilo de Ci-C8, alquenilo de C2-C8, (alquilo de Ci-C4)OH, (alquilo de Ci-C4)SH, (alquilo de C2-C3)SCH3, (alquilo de d-C )CO H2, (alquilo de Ci-C4)COOH, (alquilo de Ci-C )NH2r (alquilo de d-C4) HC (NH2+) NH2 , (alquilo de C0-C4) (cicloalquilo de C3-C6) , (alquilo de C0-C ) (arilo de C6-Cio) 7, CH2 (heteroarilo de C5-C9) , o Ri y R2 junto con los átomos a los cuales están unidos forman un cicloalquilo de C3-C6; R3 se selecciona del grupo formado por alquilo de Ci-C8, (alquilo de Ci-C )OH, (alquilo de Ci-C4)NH2, (alquilo de Ci-C4)SH, (C3-C6) cicloalquilo o R4 y R3 junto con los átomos a los cuales están unidos forman un anillo heterocíclico de 5 o 6 miembros; R5 es NHR6 o OH; R6 es H, o R6 y R2 junto con los átomos a los cuales están unidos forman un anillo heterocíclico de 5 o 6 miembros; y R7 se selecciona del grupo formado por H y OH.

Siempre que cuando R4 y R3 junto con los átomos a los cuales están unidos forman un anillo heterocíclico de 5 o 6 miembros, tanto Ri como R2 son diferentes de H.

En otras realizaciones, se proporciona un profármaco que tiene la estructura general de A-B-Q, en donde Q es un péptido de la superfamilia de glucagón, osteocalcina o un análogo, derivado o conjugado de ellos y A-B comprende la estructura general: en donde Ri y R8 son independientemente H o alquilo de Ci-C8; R2 y R se seleccionan independientemente del grupo formado por H, alquilo de Ci-C8, alquenilo de C2-C8, (alquilo de Ci-C4)OH, (alquilo de Ci-C4)SH, (alquilo de C2-C3)SCH3, (alquilo de Ci-C4)CONH2/ (alquilo de Ci-C4)COOH, (alquilo de Ci-C4)NH2/ (alquilo de C1-C4) NHC (NH2+) NH2, (alquilo de C0-C4) (cicloalquilo de C3-C6) , (alquilo de C0-C4) (heterocíclico de C2-C5) , (alquilo de C0-C4) (arilo de C6-Ci0)R7, y CH2 (heteroarilo de C3-C9) , o Rx y R2 junto con los átomos a los cuales están unidos forman un cicloalquilo de C3-C12; R3 se selecciona del grupo formado por alquilo de Ci-C8, (alquilo de Ci-C4)OH, (alquilo de Ci-C4)NH2, (alquilo de Ci-C4) SH, (C3-C6) cicloalquilo o R4 y R3 junto con los átomos a los cuales están unidos forman un anillo heterocíclico de 5 o 6 miembros; R5 es NHR6 o OH; R6 es H, alquilo de Ci-C8, o R6 y R2 junto con los átomos a los cuales están unidos forman un anillo heterocíclico de 5 o 6 miembros; y R7 se selecciona del grupo formado por hidrógeno, alquilo de Ci-Ci8/ alquenilo de C2-Ci8, (alquilo de C0-C4)CO H2( (alquilo de C0-C4)COOH, (alquilo de C0-C4)NH2, (alquilo de C0-C4)OH, halo, siempre que cuando R4 y R3 junto con los átomos a los cuales están unidos forman un anillo heterocíclico de 5 o 6 miembros, tanto Ri como R2 no son H.

En algunas realizaciones Q es un péptido seleccionado del grupo formado por Hormona que Libera la Hormona de Crecimiento (GHRH; SEQ ID NO: 719), péptido intestinal vasoactivo (VIP, SEQ ID NO: 720) , polipéptido 27 que activa ciclasa de adenilato pituitario (PACAP 27; SEQ ID NO: 721), péptido histidina metionina (PHM; SEQ ID NO: 722), o Secretina (SEQ ID NO: 723), glucagon (SEQ ID NO: 700), exendina 4 (SEQ ID NO: 718 (, péptido 1 similar a glucagon (GLP-1) (aminoácidos 7-37 provistos como SEQ ID NO: 703 y 704) , péptido 2 similar a glucagon (GLP-2) (SEQ ID NO: 708) , GIP (SEQ ID NO: 707) , o análogos, derivados y conjugados de los precedentes. En algunas realizaciones, Q es un péptido relacionado con glucagon.

En otra realización, se proporciona un análogo de profármaco de un péptido de la superfamilia de glucagon, u osteocalcina, o un análogo, derivado o conjugado de ellos, en donde el grupo profármaco (A-B) está unido en forma covalente a Q en uno o más residuos de aminoácidos en la secuencia de Q, por ejemplo, en una posición de Q que corresponde a la posición 12, 16, 17, 18, 20, 28, o 29 de glucagon nativo (SEQ ID NO: 701) . Por ejemplo, en ciertas realizaciones el grupo profármaco (A-B) está unido, directamente o a través de un enlace, a un Lys sustituido en la posición 20 de Q. En tales realizaciones, Q puede comprender en la posición 20 (en relación con la secuencia de glucagon nativo) , una sustitución que comprende la estructura: En otras realizaciones, el grupo profármaco (A-B) está unido, directamente o a través de un enlace, a un amino-Phe sustituido en la posición 22. En tales realizaciones, Q puede comprender en la posición 22 (en relación con la secuencia de glucagón nativo) , una sustitución que comprende la estructura: Alternativamente o de manera adicional, el grupo profármaco (A-B) está unido, directamente o a través de un enlace, al extremo amino de Q, en donde A-B comprende la estructura: en donde Rx y R8 se seleccionan independientemente del grupo formado por H y alquilo de Ci-C8; R2 y R4 se seleccionan independientemente del grupo formado por H, alquilo de Ci-C8, alquenilo de C2-C8, (alquilo de Ci-C4)OH, (alquilo de Ci-C4)SH, (alquilo de C2-C3)SCH3í (alquilo de Ci-C4)CONH2, (alquilo de Ci-C4)COOH, (alquilo de Ci-C4)NH2, (alquilo de C1-C4) NHC (NH2+) NH2, (alquilo de C0-C4) (cicloalquilo de C3-C6) , (alquilo de C0-C4) (arilo de C6-Ci0)R7, CH2 (heteroarilo de C5-C9) , o Rx y R2 junto con los átomos a los cuales están unidos forman un cicloalquilo de a C3-C6; R3 se selecciona del grupo formado por alquilo de Ci-C8 (alquilo de d-C4)OH, (alquilo de Ci-C4)NH2, (alquilo de Ci-C4)SH, (C3-C6) cicloalquilo o R4 y R3 junto con los átomos a los cuales están unidos forman un anillo heterocíclico de 5 o 6 miembros; R5 es NHR6 o OH; R6 es H, o R6 y R2 junto con los átomos a los cuales están unidos forman un anillo heterocíclico de 5 o 6 miembros; y R7 se selecciona del grupo formado por H y OH, con la condición de que cuando Ri y R2 son cada uno diferente de H cuando R4 y R3 junto con los átomos a los cuales están unidos forman un anillo heterocíclico de 5 o 6 miembros.

En otras realizaciones, el grupo profármaco (A-B) está unido, directamente o a través de un enlace, al extremo de amino de Q, en donde A-B comprende la estructura: en donde Ri y R8 son independientemente H o alquilo de Ci-C8; R2 y R4 se seleccionan independientemente de H, alquilo de Ci-C8, alquenilo de C2-C8, (alquilo de d-C )OH, (alquilo de Ci-C4)SH, (alquilo de C2-C3)SCH3, (alquilo de Ci-C4)CONH2, (alquilo de Ci-C4)COOH, (alquilo de C1-C4)NH2, (alquilo de C1-C4) NHC (NH2+) NH2 , (alquilo de C0-C4) (cicloalquilo de C3-C6) , (alquilo de C0-C4) (heterocíclico de C2-C5) , (alquilo de C0-C4) (arilo de C6-Ci0)R7, y CH2 (heteroarilo de C3-C9) , o Rx y R2 junto con los átomos a los cuales están unidos forman un cicloalquilo de C3-Ci ; R3 se selecciona del grupo formado por alquilo de Ci-C8, (alquilo de Ci-C4)OH, (alquilo de Ci-C4)NH2, (alquilo de Ci-C4)SH, (C3-Ce) cicloalquilo o R4 y R3 junto con los átomos a los cuales están unidos forman un anillo heterocíclico de 5 o 6 miembros; R5 es NHR6 o OH; R6 es H, alquilo de Ci-C8, o R6 y R2 junto con los átomos a los cuales están unidos forman un anillo heterocíclico de 5 o 6 miembros; y R7 se selecciona del grupo formado por hidrógeno, alquilo de Ci-Ci8, alquenilo de C2-Ci8, (alquilo de C0-C4)CONH2, (alquilo de C0-C4)COOH, (alquilo de C0-C4) H2, (alquilo de C0-C4)OH, halo, con la condición de que Ri y R2 no sean H cuando R4 y R3 junto los átomos a los cuales están unidos formen un anillo heterocíclico de 5 o 6 miembros.

En algunas realizaciones, solamente un grupo profármaco está unido a Q. Por ejemplo, en dichas realizaciones, cuando el grupo profármaco (A-B) está unido a Q en el extremo de N, no hay ningún grupo profármaco (A-B) unido a un residuo de aminoácido interno en la secuencia de Q y viceversa. En algunas realizaciones, dos o tres grupos profármacos están unidos a Q, por ejemplo en el extremo de N y en uno o más sitios internos.

Breve Descripción de los Dibujos La Figura 1 es un gráfico que muestra el cambio en el peso corporal en ratones con obesidad inducida por una dieta (DIO) a los cuales se inyectó en forma intraperitoneal con una sola dosis semanal de 15 o 70 mmol/kg de un análogo de glucagón. Se pesó a los ratones diariamente (N=8) después de la inyección inicial con los siguientes: solamente vehículo ?, Péptido A de la Superfamilia de Glucagón ("Péptido A") a 15 nmol/kg (O) o 70 nmol/kg (?) , o un derivado de profármaco de Péptido A en donde el dipéptido está unido al extremo de N del Péptido A a través de un enlace de amida en donde el dipéptido es Aib"1 Pro0 (administrado a 15 nmol/kg (O) o 70 nmol/kg (·) ) , Aib"1 dPro0 (administrado a 70 nmol/kg (O)), Lys"1 Sar° (administrado a 70 nmol/kg (?) ) , dAla"1 Pro0 (administrado a 70 nmol/kg (-4) ) o Ac-Aib"1 Pro"1 (administrado a 70 nmol/kg (¦) ) .

La Figura 2 es un gráfico que muestra el cambio en el peso corporal en ratones con obesidad inducida por una dieta (DIO) a los cuales se inyectó en forma intraperitoneal con una sola dosis semanal de 0,5; 3; 15 o 70 nmol/kg de vehículo solamente (?) , Péptido A, (a 0, 5 A, 3 ?, 15 T o 70 - nmol/kg/día) o Lys"1 Sar°-Péptido A (a 0,5 ?, 3 t> , 15 V o 70 <1 nmol/kg/día) .

La Figura 3 es un gráfico de niveles de glucosa en sangre (mg/dL) en ratones DIO (N=8) a los cuales se inyectó primero con un péptido relacionado con glucagón y luego con una solución de glucosa. Se inyectó a los ratones en forma intraperitoneal en el punto de tiempo de -60 minutos con vehículo solamente (A) , o una dosis de 15 o 70 nmol/kg de uno de los siguientes: (A) Péptido A, (a 15 o 704 nmol/kg/día) , (B) Lys"1 Sar° Péptido A, (a 15 t> o 70 ? nmol/kg/día) , o (C) dLys"1 Sar° Péptido A, (a 15D, o 70 ¦ nmol/kg/día) .

Una solución salina que comprende 25% (v/v) de glucosa se inyectó a una dosis de 1,5 g/kg de peso corporal en el punto de tiempo de 0 minuto. Se midieron los niveles de glucosa en sangre en los puntos de tiempo de -60, 0, 15, 30, 60, y 120 minutos.

La figura 4 es un gráfico de los niveles de glucosa en sangre (mg/dL) en ratones DIO (N=8) a los cuales se inyectó primero con un péptido relacionado con glucosa y luego con una solución de glucosa. Se inyectó a los ratones en forma intraperitoneal en el punto de tiempo de -15 minutos con vehículo solamente (T) o una dosis de 2 nmol/kg de uno de los siguientes compuestos: (A) Lys"1 Sar° Péptido A (¦) , (B) Lys_1(X), Sar° Péptido A (A), (X representa una cadena de 1 K PEG unida a la cadena lateral de Lys) (C) Lys"1 (Y), Sar° Péptido A (?) , (Y representa una terc-butil glicina unida a la cadena lateral de Lys) (D) dLys"1 Sar° Péptido A, (?) .

Una solución salina que comprende un 25% (v/v) de glucosa se inyectó a una dosis de 1,5 g/kg de peso corporal en el punto de tiempo de 0 minuto. Se midieron los niveles de glucosa en sangre en los puntos de tiempo de -15, 0, 15, 30, 60, y 120 minutos.

La Figura 5 es un gráfico de niveles de glucosa en sangre (mg/dL) en ratones DIO (N=8) a los cuales se inyectó primero con un péptido relacionado con glucagón y luego con una solución de glucosa. Se inyectó a los ratones en forma intraperitoneal en el punto de tiempo de -15 minutos con vehículo (?) , una dosis de 20 nmol/kg para dLys"1 Sar° Péptido A (?) , o una dosis de 0,67 nmol/kg de uno de los siguientes compuestos: (A) Lys"1 Sar° Péptido A (¦) , (B) Lys"1(X), Sar° Péptido A (A), (X representa una cadena de 1 K PEG unida a la cadena lateral de Lys) (C) Lys"1 (Y), Sar° Péptido A (?) , (Y representa una terc-butil glicina unida a la cadena lateral de Lys) .

Una solución salina que comprende un 25% (v/v) de glucosa se inyectó a una dosis de 1,5 g/kg de peso corporal en el punto de tiempo de 0 minuto. Se midieron los niveles de glucosa en sangre en los puntos de tiempo de -15, 0, 15, 30, 60 y 120 minutos.

La Figura 6 es un gráfico de niveles de glucosa en sangre (mg/dL) en ratones DIO (N=8) a los cuales se inyectó primero con un péptido relacionado con glucagón y luego con una solución de glucosa. Se inyectó a los ratones en forma intraperitoneal en el punto de tiempo de -60 minutos con vehículo solamente (T) o una dosis de 15 o 70 nmol/kg de uno de los siguientes compuestos: (A) Péptido A, (a 15 ? o 70 ? nmol/kg/día) , (B) dLys"1 Sar° Péptido A, (a 15 ?, o 70 ¦ nmol/kg/día) , o (C) Lys"1 Sar° Péptido A, (a 15 > o 70 ? nmol/kg/día) .

Una solución salina que comprende un 25% (v/v) de glucosa se inyectó a una dosis de 1,5 g/kg de peso corporal en el punto de tiempo de 0 minuto y 24 horas después (véase Figura 7) . Se midieron los niveles de glucosa en sangre indicados en los puntos de tiempo de -60, 0, 15, 30, 60 y 120 minutos con respecto a la primera administración de la solución de glucosa (es decir, en el punto de tiempo 0 minutos) .

La Figura 7 es un gráfico de los niveles de glucosa en sangre (mg/dL) en ratones DIO (N=8) a los cuales se inyectó en forma intraperitoneal en el punto de tiempo de -60 minutos con vehículo solamente (T) o una dosis de 15 o 70 nmol/kg de uno de los siguientes compuestos : (A) Péptido A, (a 15 ? o 70 ? nmol/kg/d£a) , (B) dLys"1 Sar° Péptido A, (a 15 o 70 V nmol/kg/día) , o (C) Lys"1 Sar° Péptido A, (a 15 ?, o 70 ¦ nmol/kg/día) Una solución salina que comprende 25% (v/v) de glucosa se inyectó a una dosis de 1,5 g/kg de peso corporal en el punto de tiempo de 0 minuto y 24 horas después. Se midieron los niveles de glucosa en sangre indicados en los puntos de tiempo de 0 , 15, 30, 60 y 120 minutos en relación con la administración de la segunda solución de glucosa a las 24 horas.

La Figura 8 presenta datos que indican la pérdida de peso en ratones DIO (N=8) a los cuales se inyectó en forma intraperitoneal con los compuestos indicados a una dosis de 15 o 70 mmol/kg. Los pesos corporales indicados se determinaron 7 días después de la administración de los compuestos.

Las Figuras 9A-B presentan gráficos de niveles de glucosa en sangre (BG) (mg/dL) en ratones DIO (n=8) . Se inyectó a los ratones en forma intraperitoneal con vehículo solamente, o con péptido de profármaco a las 24, 8, 4 o 1 hora antes del desafío (como se indica en la figura) con una inyección del 25% de glucosa en solución salina a 1,5 g/kg de peso corporal. Los niveles de glucosa en sangre indicados se midieron en los puntos de tiempo de 0, 15, 30, 60 y 120 minutos en relación con el desafío con solución de glucosa. La Figura 9A muestra los niveles de glucosa en sangre después de la administración de Lys"1 Sar° Péptido A (es decir, que comprende un elemento de profármaco de Lys_1-Sar°) . La Figura 9B muestra los niveles de glucosa en sangre después de la administración de dLys"1 Sar° Péptido A (es decir, que comprende un elemento de profármaco de D-Lys^-Sar0) .

La Figura 10 presenta una alineación de las secuencias de aminoácidos de diferentes péptidos de la superfamilia de glucagón o fragmentos relevantes de ellos. La secuencias de aminoácidos presentadas son GHRH (SEQ ID NO: 719), PHI (SEQ ID NO: 722), VIP (SEQ ID NO: 720), PACAP-27 (SEQ ID NO: 721), Exendina 4 (SEQ ID NO: 718), GLP-1 (SEQ ID NO: 703), Glucagón (SEQ ID NO: 701), Oxintomodulina (SEQ ID NO: 706), GIP (SEQ ID NO: 707), GLP-2. (SEQ ID NO: 708) y Secretina (SEQ ID NO: 724) .

La Figura 11 presenta un gráfico de niveles de glucosa en sangre (mg/dL) en ratones DIO (nueve grupos de ocho ratones) a los cuales se inyectó en forma subcutánea con una sola dosis de vehículo solamente o 10 mmol/kg de uno de los siguientes: (A) Péptido C de la Superfamilia de Glucagón ("Péptido C" ) , (B) dK-Sar-Péptido C, (C) dK-Gly (N-Hexil) -Péptido B de la Superfamilia de Glucagón ("Péptido B" ) , o (D) dK-F (N-Me) -Péptido C.

Los ratones tenían 5 meses y medio y habían tenido una dieta con alto contenido graso durante aproximadamente 2 meses. Se tomaron los niveles de glucosa en sangre a las 0, 2, 4, 24 y 72 horas después de la inyección.

La Figura 12 presenta un gráfico del cambio en el peso corporal en ratones DIO (nueve grupos de ocho ratones) a los cuales se inyectó en forma subcutánea con una sola dosis de vehículo solamente o 10 mmol/kg de uno de los siguientes: (A) Péptido C, (B) dK-Sar-Péptido C, (C) dK-Gli (N-Hexil) -Péptido B, o (D) dK-F (N-Me) -Péptido C.

Los ratones tenían 5 meses y medio y habían tenido una dieta con alto contenido graso durante aproximadamente 2 meses. La ingesta de alimentos y de masa grasa se monitorearon durante el estudio de una semana de duración.

Las Figuras 13A y 13B representan la actividad de unión al receptor de dK-Gly (N-Hexil) -Péptido B (Figura 13A) y dK-Sar-Péptido C (Figura 13B) en 20% de plasma humano determinado mediante el ensayo de Luciferasa de receptor de GLP.

La Figura 14 presenta un gráfico del cambio en el peso corporal en ratones DIO (n = 8) a los cuales se inyectó en forma subcutánea con una sola dosis de 3, 10, o 30 mmol/kg de vehículo solamente o uno de los siguientes compuestos : (A) Péptido C, (B) dLys"1 Sar° Péptido C, o (C) dLys"1 Gly (N-Hexil) 0 Péptido B.

Se determinaron los pesos corporales en los días 1, 3, 5, y 7 del estudio. Los ratones tenían 5 meses de edad con un peso corporal promedio inicial de 31,2 g y habían tenido una dieta de alimento regular durante aproximadamente 5 meses.

Las Figuras 15A-C presentan gráficos de niveles de glucosa en sangre (BG) (mg/dL) de ratones DIO (n=8) a los cuales se inyectó en forma subcutánea una sola dosis de 3, 10, o 30 mmol/kg de vehículo solamente o uno de los siguientes compuestos: (A) Péptido C, (B) dLys"1 Sar° Péptido C, o (C) dLys"1 Gly (N-Hexil) 0 Péptido B.

Los niveles de glucosa en sangre indicados se tomaron en forma itraperitoneal en los días 1 (Figura 15A) , 3 (Figura 15B) , y 5 (Figura 15C) . Los ratones tenían 5 meses de edad y habían tenido una dieta de alimento regular durante aproximadamente 5 meses.

Las Figuras 16A-16C representan la actividad de unión con el receptor de dLys-Gly (N-Hexil ) -Péptido C (Figura 16A) , dLys-Sar-Péptido C (Figura 16B) y dLys-Fe (N-Metil ) -Péptido C (Figura 16C) en 20% de plasma humano según se determina a través del ensayo de Luciferasa de Receptor de GLP.

Las Figuras 17A-17D representan la actividad de unión con el receptor de Aib-Sar Péptido D (Figura 17A) , dLys-Sar-Péptido D (Figura 17B) , dk-Gly (N-Hexil ) -Péptido D (Figura 17C) y dLys-Fe(N-metil) -Péptido D (Figura 17E) en 20% de plasma humano según se determina a través del ensayo de Luciferasa de receptor de GLP.

La Figura 18 representa un gráfico del efecto de una única dosis subcutánea de Péptido D y Aib-Sar-Péptido D en los niveles indicados de glucosa en sangre en ratones a lo largo de un plazo de 72 horas.

Descripción Detallada Definiciones En la descripción y las reivindicaciones de la invención, la siguiente terminología se utilizará de acuerdo con las definiciones que se dan a continuación.

Como se utiliza en la presente, el término "profármaco" se define como todo compuesto que experimenta una modificación química antes de presentar sus efectos farmacológicos completos.

Como se utiliza en la presente, el término "aminoácido" comprende todas las moléculas que contienen grupos funcionales amino y carboxilo, en donde los grupos amino y carboxilato están unidos al mismo carbono (el carbono alfa) . El carbono alfa opcionalmente puede tener uno dos sustituyentes orgánicos adicionales. Un aminoácido se puede designar con su código de tres letras, un código de una letra, o en algunos casos con el nombre de su cadena lateral. Por ejemplo, un aminoácido no natural que comprende un grupo ciclohexano unido al carbono alfa se denomina "ciclohexano" o "ciclohexilo" . Para los propósitos de la presente invención se desea que la designación de un aminoácido sin especificar la estereoquímica comprenda la forma L o D del aminoácido, o una mezcla racémica. Sin embargo, en el caso de que un aminoácido se designe con su código de tres letras e incluya un número superíndice (es decir, Lys"1) , se desea que tal designación especifique la forma L nativa del aminoácido, mientras que la forma D se especifica mediante la inclusión de una letra minúscula d antes del código de tres letras y el número superíndice (es decir, dLys"1) .

Como se utiliza en la presente, el término "hidroxil ácido" se refiere a un aminoácido que se ha modificado para reemplazar el grupo amino del carbono alfa con un grupo hidroxilo.

Como se utiliza en la presente, el término "aminoácido no codificado" comprende todo aminoácido que no es un isómero L de ninguno de los siguientes 20 aminoácidos: Ala, Cys, Asp, Glu, Phe, Gly, His, lie, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp, Tyr.

Un "dipéptido" es el resultado de la unión de un -aminoácido o un a-hidroxil ácido a otro aminoácido, a través de un enlace de péptido.

Como se utiliza en la presente, el término "descomposición química" ausente en cualquier otra designación comprende una reacción no enzimática que deriva en la rotura de un enlace químico covalente.

Un "polipéptido bioactivo" se refiere a polipéptidos que son capaces de ejercer un efecto biológico in vitro y/o in vivo.

Como se utiliza en la presente, un aminoácido "acilado" es un aminoácido que comprende un grupo acilo que es no nativo al aminoácido que no se da en forma natural, independientemente del medio por el cual se produzca. Ejemplos de métodos para producir aminoácidos acilados y péptidos acilados son conocidos en el arte e incluyen la acilación de un aminoácido antes de la inclusión en el péptido o la síntesis de péptido seguida por la acilación química del péptido. En algunas realizaciones, el grupo acilo hace que el péptido tenga una o más de (i) una semivida prolongada en circulación, (ii) un inicio de acción retardado, (iii) una duración de acción prolongada, (iv) una resistencia mejorada a las proteasas, tal como DPP-IV, y (v) potencia aumentada en los receptores de péptido de la superfamilia de glucagón y/o de péptido de osteocalcina .

Como se utiliza en la presente, un aminoácido "alquilado" es un aminoácido que comprende un grupo alquilo que es no nativo a un aminoácido natural, independientemente del medio por el cual se produzca. Ejemplos de métodos para producir aminoácidos alquilados y péptidos alquilados son conocidos en el arte e incluyen la alquilacion de un aminoácido antes de la inclusión en el péptido o síntesis de péptido seguido por la alquilacion química del péptido. Sin atarnos a ninguna teoría particular, se cree que la alquilacion de péptidos logrará efectos similares, si no los mismos efectos que la acilación de los péptidos, por ejemplo, una semivida prolongada en circulación, un inicio de acción retardado, una duración de acción prolongada, resistencia mejorada a las proteasas, tales como DPP-IV, y potencia aumentada en los receptores de péptido de la superfamilia de glucagón y/o de péptido de osteocalcina.

Como se utiliza en la presente se desea que una referencia general a un péptido comprende péptidos que tienen extremo de amino y carboxi modificados. Por ejemplo, se desea que una secuencia de aminoácido que designa los aminoácidos estándar comprenda amonoácidos estándar en los extremos de N y de C así como que un hidroxil ácido correspondiente en el extremo de N y/o un aminoácido correspondiente al extremo de C modificado para que comprenda un grupo amida en lugar del ácido carboxílico de extremo.

Como se utiliza en la presente, el término "portador farmacéuticamente aceptable" incluye cualquiera de los portadores farmacéuticos estándar, tales como una solución salina con tampón de fosfato, agua, emulsiones tales como aceite/agua o agua/aceite, y diferentes tipos de agentes de humedecimiento . El término también comprende cualquiera de los agentes aprobados por una agencia de regulación del gobierno federal de Estados Unidos o enumerados en la Farmacopea de Estados Unidos para su uso en animales, que incluyen humanos.

Como se utiliza en la presente, el término "sal farmacéuticamente aceptable" se refiere a sales de compuestos que retienen la actividad biológica del compuesto parental, y que no son indeseables biológicamente o de otro modo. Muchos de los compuestos revelados en la presente son capaces de formar sales de ácido y/o de base en virtud de la presencia de grupos amino y/o carboxilo o grupos similares a ellos.

Las sales de adición básicas farmacéuticamente aceptables se pueden preparar a partir de bases inorgánicas y orgánicas. Las sales derivadas de bases inorgánicas, incluyen a modo de ejemplo solamente, sales de sodio, potasio, litio, amonio, calcio y magnesio. Las sales derivadas de bases orgánicas incluyen, en forma no taxativa, sales de aminas primarias, secundarias y terciarias.

Las sales de adición acidas farmacéuticamente aceptables se pueden preparar a partir de ácidos inorgánicos y orgánicos. Las sales derivadas de ácidos inorgánicos incluyen ácido clorhídrico, ácido bromhídrico, ácido sulfúrico, ácido nítrico, ácido fosfórico, y similares. Las sales derivadas de ácidos orgánicos incluyen ácido acético, ácido propiónico, ácido glicólico, ácido pirúvico, ácido oxálico, ácido málico, ácido malónico, ácido succínico, ácido maleico, ácido fumárico, ácido tartárico, ácido cítrico, ácido benzoico, ácido cinámico, ácido mandélico, ácido metanosulfónico, ácido etanosulfónico, ácido p-tolueno-sulfónico, ácido salicílico, y similares.

Como se utiliza en la presente, el término "tratar" incluye la profilaxis del trastorno o condición específica, el alivio de los síntomas asociados con un trastorno o condición específico y/o la prevención o eliminación de dichos síntomas. Por ejemplo, como se utiliza en la presente el término "tratar la diabetes" se refiere en general a mantener los niveles de glucosa en sangre cerca de los niveles normales y puede incluir aumentar o disminuir los niveles de glucosa en sangre según una situación dada.

Como se utiliza en la presente, una cantidad "eficaz" o una "cantidad terapéuticamente eficaz" de un profármaco se refiere a una cantidad no tóxica pero suficiente del profármaco para proporcionar el efecto deseado. Por ejemplo, un efecto deseado sería la prevención o el tratamiento de hipoglucemia . La cantidad que es "eficaz" varía de un sujeto a otro, según la edad y la condición general del individuo, la forma de administración y similares. Por lo tanto, no siempre es posible especificar una "cantidad eficaz" exacta. Sin embargo, una cantidad "eficaz" apropiada en cualquier caso individual puede ser determinada por un experto en el arte usando la experimentación de rutina.

El término "parenteral" significa no a través del canal alimentario sino por alguna otra vía tal como subcutánea, intramuscular, intraespinal o intravenosa.

El término "identidad" como se utiliza en la presente se relaciona con la similitud entre dos o más secuencias. La identidad se mide dividiendo la cantidad de residuos idénticos por la cantidad total de residuos y multiplicando el producto por 100 para obtener un porcentaje. Por lo tanto, dos copias de exactamente la misma secuencia tienen 100% de identidad, mientras que dos secuencias que tienen eliminaciones, agregados o sustituciones de aminoácidos en relación uno con otro tienen un menor nivel de identidad. Los expertos en el arte reconocerán que varios programas de computación, tales como aquellos que emplean algoritmos tales como BLAST (Herramienta de Búsqueda de Alineación Local Básica, Altschul et al. (1993) J. Mol. Biol . 215:403-410) están disponibles para determinar la identidad de secuencia .

El término "péptido relacionado con glucagón" se refiere a aquellos péptidos que tienen actividad biológica (como agonistas o antagonistas) en uno o más cualquiera de los receptores de glucagón, GLP-1, GLP-2 y GIP, y que comprenden una secuencia de aminoácido que comparte por lo menos un 40% de identidad de secuencia (por ejemplo, un 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%) con por lo menos uno del glucagón nativo, oxintomodulina nativa, exendina 4 nativa, GLP-1 nativo, GLP-2 nativo, o GIP nativo. A menos que se exprese de otro modo, cualquier referencia a una posición de aminoácido en un péptido relacionado con glucagón (por ejemplo, para la unión de un grupo profármaco, un grupo conjugado, un polímero hidrófilo, acilación o alquilación) se refiere a la posición en relación con la secuencia de aminoácido de glucagón nativo (SEQ ID NO: 701) .

El término "peptido de la superfamilia de glucagón" se refiere a un grupo de péptidos relacionados en su estructura en sus regiones del extremo de N y del extremo de C (véase, por ejemplo, Sherwood et al., Endocrine Reviews 21: 619-670 (2000)). Los miembros de este grupo incluyen todos los péptidos relacionados con glucagón, así como la hormona que libera la hormona de crecimiento (GHRH; SEQ ID NO: 719), peptido intestinal vasoactivo (VIP; SEQ ID: 720) , polipéptido 72 que activa ciclasa de adenilato pituitario (PACAP 27; SEQ ID NO: 721), peptido histidina isoleucina (PHI) , péptido histidina metionina (PHM; SEQ ID NO: 722) , Secretina (SEQ ID NO: 723) y análogos, derivados o conjugados con hasta 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 modificaciones de aminoácidos en relación con el péptido nativo. Dichos péptidos preferentemente retienen la capacidad de interactuar (agonista o antagonista) con receptores de la superfamilia de receptores de glucagón. A menos que se exprese de otro modo, todas las referencias a una posición de aminoácido en un péptido de la superfamilia de glucagón (por ejemplo, para la unión de un grupo profármaco, o un grupo conjugado, un polímero hidrófilo, acilación o alquilación) se refiere a la posición en relación con la secuencia de aminoácido de glucagón nativo (SEQ ID NO: 701) , véase la Figura 10 para una alineación de péptidos de la superfamilia de glucagon representativos.

El término "agonista de GLP-1" se refiere a un compuesto que estimula la actividad del receptor de GLP-1, medida mediante la producción de cAMP usando un ensayo de modelo in Vitro validado, tal como aquel descrito en el Ejemplo 13 de la Solicitud de Patente Internacional Publicada N° WO 2007/056362, publicada el 18 de mayo de 2007, cuya invención se incluye expresamente en la presente por referencia en la presente solicitud de patente.

Como se utiliza en la presente el término "GLP-1 nativo" es un término genérico que designa GLP-1 (7-36) amida (que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 704), GLP-1 (7-37) ácido (que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 703) o una mezcla de esos dos compuestos. Como se utiliza en la presente, una referencia general a "GLP-1" en la ausencia de toda nueva designación se desea que signifique GLP-1 nativo.

Como se utiliza en la presente, el término "péptido de glucagon" es un término genérico que designa el péptido de glucagon natural de SEQ ID NO: 701 así como derivados modificados que tienen una o más modificaciones de aminoácidos en relación con la secuencia de glucagon nativo, opcionalmente que incluyen en forma no taxativa sustituciones en las posiciones de aminoácidos 1, 2, 5, 7, 8, 10, 12, 13, 14, 16, 17, 18, 24, 28 y 29. Generalmente, todas las referencias a una posición de aminoácido específica por número (por ejemplo, la posición 28) se refieren al aminoácido en esa posición en el glucagón nativo (SEQ ID NO: 701) o la posición de aminoácido correspondiente en cualquier análogo de ella. Por ejemplo, una referencia a la "posición 28" significaría la posición 27 correspondiente para un análogo de glucagón en donde el primer aminoácido de SEQ ID NO: 701 se ha eliminado. En forma similar, una referencia a la "posición 28" significaría la posición 29 correspondiente para un análogo de glucagón en donde un aminoácido se ha agregado antes del extremo de N de SEQ ID NO: 701.

Como se utiliza en la presente el término "péptido de GLP-1" es un término genérico que designa GLP-1 nativo así como derivados modificados que tienen una o más modificaciones de aminoácidos en relación con la secuencia del GLP-1 nativo.

Como se utiliza en la presente, una "modificación" de aminoácido se refiere a una sustitución, agregado o eliminación de un aminoácido, e incluye la sustitución, o el agregado, de cualquiera de los 20 aminoácidos que se hallan comúnmente en las proteínas humanas, así como aminoácidos no habituales o no naturales. Las fuentes comerciales de aminoácidos no habituales incluyen Sigma-Aldrich (Milwaukee, WI), ChemPep Inc. ( iami, FL) , y Genzyme Pharmaceuticals (Cambridge, MA) . Los aminoácidos no habituales se pueden comprar a proveedores comerciales, sintetizar nuevamente, o modificar o derivar químicamente desde aminoácidos naturales. Las modificaciones de aminoácidos incluyen la unión de aminoácido a un grupo conjugado, tal como un polímero hidrófilo, acilación, alquilación y/u otra derivación química de un aminoácido.

Como se utiliza en la presente una "sustitución" de aminoácido se refiere al reemplazo de un residuo de aminoácido por un residuo de aminoácido diferente.

Como se utiliza en la presente, el término "sustitución de aminoácido conservador" se define en la presente como intercambios dentro uno de los siguientes cinco grupos : I. Residuos alifáticos no polares o ligeramente polares pequeños : Ala, Ser, Thr, Pro, Gly; II. Residuos polares, con carga negativa y sus amidas: Asp, Asn, Glu, Gln; III. Residuos polares, con carga positiva: His, Arg, Lys, Ornitina (Orn) IV. Residuos grandes, alifáticos, no polares: Met, Leu, lie, Val, Cys, Norleucina (Nle) , homocisteína V. Residuos grandes, aromáticos: Phe, Tyr, Trp, acetil fenilalanina Como se utiliza, el término "Quimera 2" se refiere a un péptido de glucagón en donde la secuencia de aminoácido de glucagón nativo (SEQ ID NO: 701) que comprende las siguientes modificaciones: Gln en la posición 17, Ala en la posición 18, Lys en la posición 20, Glu en la posición 21, lie en la posición 23 y Ala en la posición 24 y una amida del extremo de C.

Como se utiliza en la presente, el término general "cadena de polietilenglicol" o "cadena de PEG" , se refiere a mezclas de polímeros de condensación de óxido de etileno y agua, en una cadena ramificada o recta, representada por la fórmula general H (0CH2CH2) kOH, en donde k es por lo menos 9. A falta de toda caracterización, se desea que el término incluya polímeros de etilenglicol con un peso molecular total promedio seleccionado de la gama de 500 a 80.000 Dalton. "Cadena de polietilenglicol" o "cadena de PEG" se utiliza en combinación con un sufijo numérico para indicar el peso molecular promedio aproximado de ella. Por ejemplo, PEG 5.000 (PEG 5k) se refiere a la cadena de polietilenglicol que tiene un peso molecular total promedio de 5.000 Dalton.

Como se utiliza en la presente, el término "pegilado" y términos similares se refiere a un compuesto que se ha modificado desde su estado nativo uniendo una cadena de polietilenglicol al compuesto. Un "polipéptido pegilado" es un polipéptido que tiene una cadena de PEG unida en forma covalente al polipéptido.

Como se utiliza en la presente, un "conector" es un enlace, una molécula o un grupo de moléculas que une dos entidades separadas una a otra. Los conectores pueden proporcionar la separación óptima de las dos entidades o puede proveer además una ligadura lábil que permite que dos entidades se separen una de otra. Las ligaduras lábiles incluyen grupos fotorompibles , grupos lábiles al ácido, grupos lábiles a la base y grupos rompibles por enzimas .

Como se utiliza en la presente, un "dímero" es un complejo que comprende dos subunidades unidas en forma covalente una a otra a través de un conector. El término dímero, cuando se utiliza sin ninguna expresión calificativa, comprende tanto homodímeros como heterodímeros . Un homodímero comprende dos subunidades idénticas, mientras que un heterodímero comprende dos subunidades que difieren, aunque las dos subunidades son sustancialmente similares una a otra.

El término "alquilo de Ci-Cn" en donde n puede ser de 1 a 6, como se utiliza en la presente, representa un grupo alquilo ramificado o lineal que tiene desde uno hasta la cantidad especificada de átomos de carbono. Los grupos alquilo de Ci-C6 típicos incluyen, en forma no taxativa, metilo, etilo, n-propilo, iso-propilo, butilo, iso-butilo, sec-butilo, tere-butilo, pentilo, hexilo y similares .

Los términos "alquenilo de C2-Cn" en donde n puede ser de 2 a 6 , como se utiliza en la presente, representa un grupo ramificado o lineal insaturado en forma olefínica que tiene desde 2 hasta la cantidad especificada de átomos de carbono y por lo menos un enlace doble. Ejemplos de tales grupos incluyen, en forma no taxativa, 1-propenilo, 2-propenilo (-CH2-CH=CH2) , 1,3-butadienilo, ( -CH=CHCH=CH2) , 1-butenilo ( -CH=CHCH2CH3) , hexenilo, pentenilo y similares.

El término "alquinilo de C2-Cn" en donde n puede ser de 2 a 6 , se refiere a un grupo ramificado o lineal insaturado que tiene desde 2 hasta n átomos de carbono y por lo menos un enlace triple. Ejemplos de dichos grupos incluyen, en forma no taxativa, 1-propinilo, 2-propinilo, 1-butinilo, 2-butinilo, 1-pentinilo, y similares .

Como se utiliza en la presente el término "arilo" se refiere a un sistema de anillo carbocíclico monocíclico o bicíclico que tiene uno o dos anillos aromáticos que incluyen, en forma no taxativa, fenilo, naftilo, tetrahidronaftilo, indanilo, indenilo y similares. El tamaño del anillo de arilo y la presencia de sustituyentes o grupos de unión se indican designando la cantidad de carbonos presentes. Por ejemplo, el término "(alquilo de Ci-C3) (arilo de C6-Ci0) " se refiere a un arilo de 6 a 10 miembros que está unido a un grupo parental a través de una cadena de alquilo de uno a tres miembros .

El término "heteroarilo" como se utiliza en la presente se refiere a un sistema de anillo monocíclico o bicílico que contiene uno o dos anillos aromáticos y que contiene por lo menos un átomo de nitrógeno, oxígeno o azufre en un anillo aromático. El tamaño del anillo de heteroarilo y la presencia de sustituyentes o grupos de unión se indican designando la cantidad de carbonos presentes. Por ejemplo, el término "(alquilo dé Ci-Cn) (heteroarilo de C5-C6) " se refiere a heteroarilo de 5 a 6 miembros que está unido a un grupo parental a través de una cadena de alquilo de uno a "n" miembros.

Como se utiliza en la presente, el término "heteroalquilo" se refiere a un hidrocarburo lineal o ramificado que contiene la cantidad indicada de átomos de carbono y por lo menos un heteroátomo en la cadena principal de la estructura. Los heteroátomos adecuados con los fines de la presente incluyen en forma no taxativa N, S y O.

Como se utiliza en la presente, el término "halo" se refiere a uno o más miembros del grupo formado por flúor, cloro, bromo y yodo .

Como se utiliza en la presente, el término "aminoácido con carga" se refiere a un aminoácido que comprende una cadena lateral que tiene una carga negativa (es decir, desprotonada) o con una carga positiva (es decir, protonada) en una solución acuosa a pH fisiológico. Por ejemplo, los aminoácidos con una carga negativa incluyen ácido aspártico, ácido glutámico, ácido cisteico, ácido homocisteico, y ácido homoglutámico, mientras que los aminoácidos con una carga positiva incluyen arginina, lisina e histidina. Los aminoácidos con una carga incluyen los aminoácidos con una carga entre los 20 aminoácidos que estaban comúnmente en proteínas humanas, así como aminoácidos atípicos o no naturales.

Como se utiliza en la presente, el término "aminoácido ácido" se refiere a un aminoácido que comprende un segundo grupo ácido (es decir diferente del grupo a-carboxilo que poseen todos los aminoácidos) , que incluye por ejemplo, un grupo ácido carboxílico o ácido sulfónico.

Como se utiliza en la presente, el término "paciente" sin otra designación se desea que comprenda todos los animales domesticados vertebrados de sangre caliente (que incluyen por ejemplo en forma no taxativa, ganado vacuno, caballos, gatos, perros, y otras mascotas), mamíferos y humanos.

Realizaciones La presente invención describe la formulación de derivados de profármacos de polipéptidos bioactivos útiles para tratar una enfermedad, por ejemplo, diabetes, obesidad. Más específicamente, los profármacos revelados en la presente se formulan para aumentar la semi ida del péptido o proteína bioactiva parental, mientras que permite la activación posterior del profármaco a través de un mecanismo de degradación no enzimática. El profármaco ideal debe ser soluble en agua en condiciones fisiológicas (por ejemplo, un pH de 7,2 y a 37°C) y debe ser estable en la forma de polvo para el almacenamiento prolongado.

También debe ser inmunológicamente inactivo y presentar una baja actividad en relación con el fármaco parental. En algunas realizaciones, el profármaco presenta no más del 10% de la actividad del fármaco parental. En algunas realizaciones, el profármaco presenta menos del 10%, menos del 5%, el 1%, o menos del 1% de actividad en relación con el fármaco parental. Además, el profármaco, cuando se inyecta en el cuerpo, debe convertirse cuantitativamente en el fármaco activo dentro de un período de tiempo definido. Como se revela en la presente, los solicitantes han provisto una técnica general para producir profármacos de un polipéptido bioactivo conocido seleccionado del grupo formado por péptidos de la superfamilia de glucagón, que incluyen péptidos relacionados con glucagón, y osteocalcina y análogos, derivados y conjugados de dichos polipéptidos , que cumplen con cada uno de estos objetivos.

Más específicamente, se proporciona un profármaco químico reversible que comprende la secuencia de un péptido de la superfamilia de glucagón, que incluye por ejemplo un péptido relacionado con glucagón, u osteocalcina, o un análogo, derivado o conjugado de él, modificado para tener un elemento de profármaco de dipéptido unido en forma covalente al péptido a través de una ligadura de amida. La unión covalente del elemento de profármaco de dipéptido a un sitio activo del péptido de la superfamilia de glucagón inhibe la actividad del polipéptido hasta la descomposición del elemento de profármaco de dipéptido. En algunas realizaciones se proporciona un profármaco que tiene una "semivida de activación no enzimática" (ti/2) de entre 1 y 720 horas en condiciones fisiológicas. Se desea que las condiciones fisiológicas reveladas en la presente incluyan una temperatura de 35°C a 40°C y un pH de 7,0 a 7,4 y más generalmente incluyen un pH de 7,2 a 7,4 y una temperatura de 36°C a 38°C.

Ventajosamente, la velocidad de descomposición, y por lo tanto la activación del profármaco, depende de la estructura y la estereoquímica del elemento de profármaco de dipéptido. Los profármacos revelados en la presente finalmente se convierten químicamente en estructuras que son reconocidas por el receptor nativo del fármaco, en donde la velocidad de esta conversión determina el tiempo de inicio y la duración de la acción biológica in vivo. El diseño molecular revelado en esta solicitud de patente se basa en la reacción química intramolecular que no depende de aditivos químicos adicionales, o enzimas. La velocidad de conversión está controlada por el carácter químico del sustituyente de dipéptido y su descomposición en condiciones fisiológicas. Dado que el pH y la temperatura fisiológicos se regulan altamente dentro de una gama muy definida, la velocidad de conversión del profármaco al fármaco presenta alta reproducibilidad intrapaciente e interpaciente.

Como se revela en la presente se proporcionan fármacos que tienen semividas prolongadas en virtud de que están en una forma de profármaco durante por lo menos 1 hora, y en algunas realizaciones, por más de 20 horas. En algunas realizaciones, la semivida de los profármacos es de 1 , 6, 8, 12, 20, 24, 48 o 72 horas. En algunas realizaciones, la semivida de los profármacos es de 100 horas o más e incluye semividas de hasta 168, 336, 504, 672 o 720 horas y se convierten en la forma activa en condiciones fisiológicas a través de una reacción no enzimática impulsada por la inestabilidad química implícita. En algunas realizaciones el tiempo ti2 de activación no enzimática del profármaco es entre 1-100 horas, y más generalmente entre 12 y 72 horas, por ejemplo, entre 12 y 48 horas y entre 48 y 72 horas y en algunas realizaciones el ti2 es entre 24-48 horas medido incubando el profármaco en una solución de tampón de fosfato (por ejemplo, PBS) a 37°C y un pH de 7,2. En otra realización el tiempo tx/2 de activación no enzimática del profármaco es entre 1 y 6 horas, por ejemplo 1 hora, 2 horas, 3 horas, 4 horas, 5 horas o 6 horas. En otra realización el tiempo ti/2 de activación no enzimática del profármaco es entre 6 y 24 horas. Las semividas de los diferentes profármacos se calculan usando la fórmula ti/2=0 , 693/k, donde "k" es la constante de velocidad de primer orden para la degradación del profáramco. En algunas realizaciones, la activación del profármaco ocurre después de la descomposición de un dipéptido unido por un enlace de amida, y la formación de una dicetopiperazina o dicetomorfolina y la liberación del fármaco de polipéptido activo. Se han identificado dipéptidos específicos compuestos de aminoácidos naturales, no codificadores y/o sintéticos que facilitan la descomposición intramolecular en condiciones fisiológicas para liberar los polipéptidos activos.

De acuerdo con algunas realizaciones se proporciona un profármaco de un péptido de la superfamilia de glucagon, u osteocalcina, o un análogo, derivado o conjugado de ellos, que comprende la estructura A-B-Q. En esta realización, Q es el péptido, A es un aminoácido o hidroxi ácido y B es un aminoácido N-alquilado. En algunas realizaciones, el péptido de la superfamilia de glucagon es un péptido relacionado con glucagon. A y B juntos representan el elemento de profármaco de dipéptido que está unido a Q a través de la formación de un enlace de amida entre A-B y una amina de Q. En algunas realizaciones, por lo menos uno de A, B o el aminoácido de Q al cual está unido A-B, es un aminoácido no codificado. Además, en algunas realizaciones el elemento de profármaco de dipéptido se selecciona en donde la descomposición de A-B desde Q es por lo menos un 90% completa dentro de 1 a 720 horas en PBS en condiciones fisiológicas. En otra realización los aminoácidos del dipéptido se seleccionan en donde la semivida de descomposición de A-B desde Q en PBS en condiciones fisiológicas, es no más de dos a cinco veces la semivida de descomposición de A-B desde Q en una solución que comprende una DPP-IV proteasa (que incluye por ejemplo, suero humano) .

De acuerdo con algunas realizaciones un grupo amino alifático de Q (por ejemplo, una amina primaria) , que incluye por ejemplo la amina de extremo de N o el grupo amino de una cadena lateral de aminoácido, se modifica con la ligadura covalente del elemento de profármaco de dipéptido a través de un enlace de amida. En algunas realizaciones el elemento de profármaco de dipéptido se une a un grupo amino de cadena lateral de un aminoácido presente en Q, directamente o a través de un grupo de unión. En algunas realizaciones, el grupo de unión comprende un grupo acilo o grupo alquilo que transporta amina. En algunas realizaciones, se proporciona un péptido de la superfamilia de glucagón, por ejemplo, un péptido relacionado con glucagón, que comprende un grupo acilo o grupo alquilo unido en forma covalente al aminoácido en la posición 10 o 20 del péptido de la superfamilia de glucagón, en donde el grupo acilo o el grupo alquilo además comprende un elemento de profármaco de dipéptido unido al grupo acilo o al grupo alquilo a través de un enlace de amida. Por ejemplo, la realización contempla que el profármaco está unido a un grupo amino de Q directamente o a través de un grupo de unión y un grupo acilo o alquilo está unido al profármaco directamente o a través de un grupo de unión.

En algunas realizaciones, el elemento de profármaco de dipéptido se une directamente a la cadena lateral de aminoácido, en donde el aminoácido tiene la estructura general : en donde n es un número entero de 1-4.

Alternativamente, el elemento de profármaco de dipéptido puede unirse a un sustituyente de aminoácido presente sobre un anillo de arilo de un aminoácido aromático, que incluye por ejemplo un aminoácido aromático seleccionado del grupo formado por amino-Phe, amino-naftil alanina, amino triptófano, amino-fenil-glicina, amino-homo-Phe , y amino tirosina. En algunas realizaciones elemento de profármaco de dipéptido se une al grupo amino aromático de un aminoácido que tiene la estructura general : en donde m es un número entero de 0 a 3. En algunas realizaciones el elemento de profármaco de dipéptido está unido al grupo 4-amino de un aminoácido que tiene la estructura general : en donde m es un número entero de 0 a 3. En algunas realizaciones el elemento de profármaco de dipéptido está unido al grupo amino de cadena lateral de un aminoácido de lisina o el grupo amino aromático de una 4 -aminofenilalanina (sustituido por un residuo de fenilalanina o tirosina nativa del péptido bioactivo) . En algunas realizaciones el elemento de profármaco de dipéptido está unido a una amina primaria presente sobre un aminoácido interno de un péptido de la superfamilia de glucagón, que incluye un péptido relacionado con glucagón, u ostoecalcina, o un análogo, derivados o conjugado de ellos.

En algunas realizaciones el elemento de profármaco de dipéptido tiene la estructura general A-B, en donde A es un aminoácido o un hidroxil ácido y B es un aminoácido N-alquilado que se une a través de un enlace de amida a un grupo amino primario de dicho péptido para producir el profármaco correspondiente del péptido. En algunas realizaciones el péptido de la superfamilia de glucagón es un péptido relacionado con glucagón. En algunas realizaciones A y B se seleccionan de manera tal que cuando el dipéptido A-B se une a una amina primaria de dicho péptido a través de un enlace de amida, la descomposición química de A-B desde el péptido es por lo menos un 90% completa dentro de 1 a 720 horas en PBS en condiciones fisiológicas. En algunas realizaciones, A y/o B son aminoácidos en la configuración de estereoisómero D. En algunos ejemplos de realizaciones, A es un aminoácido en la configuración de etereoisómero D y B es un aminoácido en la configuración de estereoisómero L. En algunos ejemplos de realizaciones, A es un aminoácido en la configuración de de estereoisómero L y B es un aminoácido en la configuración de estereoisómero D. En algunos ejemplos de realizaciones, A es un aminoácido en la configuración de estereoisómero D y B es un aminoácido en la configuración de estereoisómero D.

De acuerdo con algunas realizaciones el elemento de profármaco de dipéptido puede modificarse además para comprender un grupo hidrófilo. En algunas realizaciones el grupo hidrófilo es una cadena de polietilenglicol . De acuerdo con algunas realizaciones una cadena de polietilenglicol de 40K o más está unida en forma covalente a la cadena lateral del aminoácido A o B del elemento de profármaco de dipéptido. En otra realización el elemento de profármaco de dipéptido se acila o se alquila adicionalmente o alternativamente con un ácido graso o ácido biliar, o una sal de ellos, por ejemplo, un ácido graso de C4 a C30, un ácido graso de C8 a C24, ácido cólico, un alquilo de C4 a C30, un alquilo de C8 a C24, o un alquilo que comprende un grupo esteroide de un ácido biliar. El amino ácido "A" del elemento de profármaco de dipéptido puede incluir, por ejemplo, d-lisina unida en forma covalente con un grupo acilo o alquilo a través de su grupo amino de cadena lateral, o d-ciste£na unida en forma covalente a una molécula PEG a través de su cadena lateral del grupo sulfhidrilo. El elemento de profármaco de dipéptido puede unirse directamente con el grupo hidrófilo, el grupo acilo, o grupo alquilo; o unirse al grupo hidrófilo, grupo acilo o grupo alquilo a través de un separador, tal como se describe en la presente. Alternativamente, el elemento de profármaco de dipéptido se puede unir a una proteína de depósito tal como dextrano o una molécula de PEG grande (mayor o igual a 80.000 dalton) que sirve para secuestrar el profármaco a un sitio de inyección hasta que la descomposición del dipéptido libere el péptido bioactivo activo. Otras modificaciones para profármacos de dipéptido se describen a continuación en la sección referida a péptidos relacionados con glucagón.

El elemento de profármaco de dipéptido está diseñado para descomponerse basado en una reacción química intramolecular que no depende de los aditivos químicos adicionales, o enzimas. Más específicamente, en algunas realizaciones la estructura de dipéptido se selecciona para resistir la descomposición por peptidasas presentes en sueros de mamíferos, que incluyen por e emplo dipeptidil peptidasa IV (DPP-IV) . Por consiguiente, en algunas realizaciones la velocidad de descomposición del elemento de profármaco de dipéptido desde el péptido bioactivo no se mejora sustancialmente (por ejemplo, mayor de 2X) cuando la reacción se realiza usando condiciones fisiológicas en la presencia de proteasas de suero en relación con la realización de la reacción en la ausencia de las proteasas. Por lo tanto la semivida de descomposición de A-B desde el péptido bioactivo en PBS en condiciones fisiológicas, es no más de dos, tres, cuatro o cinco veces la semivida de descomposición de A-B desde la proteína bioactiva en una solución que comprende una DPP-IV proteasa. En algunas realizaciones la solución que comprende una DPP-IV proteasa es suero, más específicamente suero de mamífero, que incluye suero humano.

De acuerdo con algunas realizaciones A o B del elemento de profármaco de dipéptido, o el aminoácido del péptido de la superfamilia de glucagón al cual se une A-B es un aminoácido no .codificado. En algunas realizaciones el aminoácido "B" está N-alquilado pero no es prolina. En algunas realizaciones el grupo N-alquilado del aminoácido B es un alquilo de Ci-Ci8 y en algunas realizaciones es alquilo de Ci-C6.

De acuerdo con algunas realizaciones un derivado de profármaco de un péptido de la superfamilia de glucagón, que comprende un elemento de profármaco de dipéptido revelado en la presente, se puede administrar conjuntamente con un inhibidor de proteasa, que incluye un inhibidor de DPP-IV específico (por ejemplo, Januvia®, Merck & Co, Inc) , como un medio para retardar la activación del profármaco. En esta realización los aminoácidos del elemento de profármaco se seleccionan de manera tal que el dipéptido sea un sustrato aceptable para la descomposición de DPP-IV. En algunas realizaciones el péptido de la superfamilia de glucagón es un péptido relacionado con glucagón. El inhibidor de proteasa se puede administrar en una composición por separado o el profármaco y el inhibidor de proteasa se pueden formular como una sola composición. Cuando se administra como composición por separado, el inhibidor de proteasa generalmente se administra dentro de 1-5 horas, 1-2 horas, 30 minutos o 10 minutos de la administración del profármaco. En algunas realizaciones las dos composiciones por separado se administran una inmediatamente después de la otra .

En algunas realizaciones el elemento de profármaco de dipéptido tiene la estructura general de la Fórmula I : en donde Ri, R2, R4 y Re se seleccionan independientemente del grupo formado por H, alquilo de Ci-Ci8, alquenilo de C2-Ci8, (alquilo de Ci-Ci8)OH, (alquilo de d-Ci8)SH, (alquilo de C2-C3)SCH3, (alquilo de C1-C4) CONH2, (alquilo de Ci-C4)COOH, (alquilo de Ci-C4)NH2/ (alquilo de C1-C4) NHC (NH2+) NH2 , (alquilo de C0-C4) (cicloalquilo de C3-C6) , (alquilo de C0-C4) (heterocíclico de C2-C5) , (alquilo de C0-C4) (arilo de C6-Ci0)R7, (alquilo de Ci-C4) (heteroarilo de C3-C9) , y alquilo de Cx-C12 (A) ( x) alquilo de C1-C12, en donde Wi es un heteroátomo seleccionado del grupo formado por N, S y 0, o Ri y R2 junto con los átomos a los cuales están unidos forman un cicloalquilo de C3-C12 o arilo; o R4 y R8 junto con los átomos a los cuales están unidos a un cicloalquilo de C3-C6; R3 se selecciona del grupo formado por alquilo de Ci- Cíe, (alquilo de d-Ci8)OH, (alquilo de Ci-Ci8) H2, (alquilo de Cx-Ci8)SH, (alquilo de C0-C4) (C3-C6) cicloalquilo, (alquilo de C0-C4) (heterocíclico de C2-C5) , (alquilo de C0-C ) (arilo de C6-Ci0)R7, y (alquilo de C1-C4) (heteroarilo de C3-C9) o R4 y R3 junto con los átomos a los cuales están unidos forman un anillo heterocíclico de 4 , 5 o 6 miembros; R5 es NHR6 o OH; R6 es H, alquilo de Ci-C8 o R6 y R2 junto con átomos a los cuales están unidos forman un anillo heterocíclico de 4, 5 o 6 miembros; y R7 se selecciona del grupo formado por H y OH.

Es evidente para una persona versada en la materia que cuando Wi es N, bajo condiciones fisiológicas, el átomo de nitrógeno se enlaza con H.

En otra realización el elemento de profármaco de dipéptido tiene la estructura general de la Fórmula I : en donde Ri, R2, R4 y R8 se seleccionan independientemente de H, alquilo de Ci-Ci8, alquenilo de C2-Ci8, (alquilo de Ci-Ci8) OH, (alquilo de Ci-Ci8) SH, (alquilo de C2-C3) SCH3, (alquilo de Ci-C4) CONH2, (alquilo de Ci-C4)C00H, (alquilo de C1-C4) H2, (alquilo de Ci-C4)NHC(NH2+)NH2í (alquilo de C0-C4) (cicloalquilo de C3-C6) , (alquilo de C0-C4) (heterocíclico de C2-C5) , (alquilo de C0-C4) (arilo de C6-C10)R7, (alquilo de Ci-C4) (heteroarilo de C3-C9) , y alquilo de Ci-Ci2 (Wi) alquilo de Ci-Ci2 f en donde Wi es un heteroátomo seleccionado del grupo formado por N, S y O, o Ri y R2 junto con los átomos a los cuales están unidos forman un cicloalquilo de C3-Ci2; o R4 y R8 junto con los átomos a los cuales están unidos forman un cicloalquilo de C3-C6; R3 se selecciona del grupo formado por alquilo de Ci-Cie, (alquilo de Ci-Ci8) OH, (alquilo de Ci-Ci8)NH2, (alquilo de Ci-Ci8) SH, (alquilo de C0-C4) (C3-C6) cicloalquilo, (alquilo de C0-C4) (heterocíclico de C2-C5) , (alquilo de C0-C4) (arilo de C6-Ci0)R7, y (alquilo de Ci-C4) (heteroarilo de C3-C9) o R4 y R3 junto con los átomos a los cuales están unidos forman un anillo heterocíclico de 4 , 5 o 6 miembros; R5 es NHR6 o OH; R6 es H, alquilo de Ci-C8 o R6 y Ri junto con los átomos a los cuales están unidos forman un anillo heterocíclico de 4, 5 o 6 miembros; y R7 se selecciona del grupo formado por hidrógeno, alquilo de Ci-Cia, alquenilo de C2-Ci8, (alquilo de C0-C4) CO H2( (alquilo de C0-C )CO0H, (alquilo de Co-C4)NH2, (alquilo de C0-C4)OH, y halo.

En algunas realizaciones R8 es H y R5 es NHR6.

En algunas realizaciones el elemento de profármaco de dipeptido tiene la estructura de la Fórmula I, en donde Ri y R8 son independientemente H o alquilo de Ci-C8; R2 y 4 se seleccionan independientemente del grupo formado por H, alquilo de Ci-C8, alquenilo de C2-C8, (alquilo de C!-C4)OH, (alquilo de C1-C4) SH, (alquilo de C2-C3)SCH3, (alquilo de Ci-C4)CONH2, (alquilo de Ci-C4)COOH, (alquilo de Ci-C4)NH2, (alquilo de C1-C4) NHC (NH2+) NH2 , (alquilo de C0-C4) (cicloalquilo de C3-C6) , (alquilo de C0-C4) (heterocíclico de C2-C5) , (alquilo de C0-C4) (arilo de C6-Ci0)R7, y CH2 (heteroarilo de C3-C9) , o Rx y R2 junto con los átomos a los cuales están unidos forman un cicloalquilo o arilo de C3-Ci2; R5 es HR6; y R6 es H o alquilo de Ci-C8.

En otras realizaciones el elemento de profármaco de dipéptido tiene la estructura de la Fórmula I, en donde Rx y R8 son independientemente H o alquilo de Ci-C8; R2 y R se seleccionan independientemente del grupo formado por H, alquilo de Ci-C8, alquenilo de C2-C8, (alquilo de Ci-C4)OH, (alquilo de d-C4)SH, (alquilo de C2-C3)SCH3, (alquilo de Ci-C4)CO H2, (alquilo de Ci-C4)COOH, (alquilo de Ci-C4)NH2, (alquilo de Ci-C4) NHC (NH2+) NH2, (alquilo de C0-C ) (cicloalquilo de C3-C3) , (alquilo de C0-C4) (heterocíclico de C2-C5) , (alquilo de C0-C4) (arilo de C6-Ci0) 7, y CH2 (heteroarilo de C3-C9) , o Rx y R2 junto con los átomos a los cuales están unidos forman un cicloalquilo de C3-C12; R3 es alquilo de Ci-C18; R5 es NHR6; R6 es H o alquilo de Ci-C8; y R7 se selecciona del grupo formado por hidrógeno, alquilo de Ci-Ci8, alquenilo de C2-Ci8, (alquilo de C0-C )CONH2, (alquilo de C0-C4)COOH, (alquilo de C0-C4)NH2, (alquilo de C0-C4)OH, y halo.

La semivida del profármaco formado de acuerdo con la presente invención se determina con los sustituyentes del elemento de profármaco de dipéptido, su ubicación, y el aminoácido al cual están unidos. Por ejemplo, el profármaco puede comprender un péptido de la superfamilia de glucagón en donde el elemento de profármaco de dipéptido está unido a través del grupo alfa amino del aminoácido del extremo de N de la proteína de la superfamilia de glucagón. En esta realización se proporcionan profármacos que tienen un ti/2 de, por ejemplo, de 1 hora que comprenden un elemento de profármaco de dipéptido con la estructura : en donde Rx y R2 son independientemente alquilo o arilo de Ci-Ci8; o y R2 están unidos a través de -(CH2)P, en donde p es 2-9; R3 es alquilo de Ci-Ci8; R4 y R8 son cada uno hidrógeno; y R5 es una amina.

En otras realizaciones, los profármacos que tienen un 1 de, por ejemplo 1 hora, comprenden un elemento de profármaco dipéptido con la estructura: en donde Rx y R2 son independientemente alquilo de Ci-Ci8 o (alquilo de C4) (arilo de C6-Ci0)R7; o Ri y R2 están unidos a través de (CH2)P, en donde p es 2-9; R3 es alquilo de Ci-Ci8; R4 y R8 son cada uno hidrógeno; R5 es NH2; y R7 se selecciona del grupo formado por hidrógeno, alquilo de C1-C18, alquenilo de C2-Ci8, (alquilo de C0-C4)CONH2, (alquilo de C0-C4)C00H, (alquilo de Co-C)NH2, (alquilo de C0-C4)OH, y halo.

Además, los profármacos que tienen el elemento de profármaco de dipéptido unido al alfa aminoácido del extremo de N del péptido de la superfamilia de glucagón y que tiene un ti/2, por ejemplo, de 6 a 24 horas comprenden un elemento de profármaco de dipéptido con la estructura: en donde Ri y R2 se seleccionan independientemente del grupo formado por hidrógeno, alquilo y a ilo de Ci-Ci8, o Ri y R2 están unidos a través de (CH2)P, en donde p es 2-9; R3 es alquilo de Ci-Ci8 o R3 y R4 junto con los átomos a los cuales están unidos forman un anillo de 4-12 heterociclos ; R4 y Re se seleccionan independientemente del grupo formado por hidrógeno, alquilo y arilo de Ci-C8; y R5 es una amina; con la condición de que tanto Ri como R2 no sean hidrógeno y siempre que uno de R4 o R8 sea hidrógeno.

En algunas realizaciones, los profármacos que tienen el elemento de profármaco de dipéptido unido al alfa aminoácido de extremo de N del péptido de la superfamilia de glucagón y que tiene un ti/2, entre 12 y 72 horas, o en algunas realizaciones, entre 12 y 48 horas, comprenden un elemento de profármaco de dipéptido con la estructura: en donde Rx y R2 se seleccionan independientemente del grupo formado por hidrógeno, alquilo de Ci-Ci8, (alquilo de Ci-Ci8)OH, (alquilo de Ci-C4)NH2, y (alquilo de C0-C4) (arilo de C6-C10)R7, o Ri y R2 están unidos a través de (CH2)P, en donde p es 2-9; R3 es alquilo de Ci-Ci8 o R3 y R4 junto con los átomos a los cuales están unidos forman un anillo heterocíclico de 4-12 miembros ; R4 y Re se seleccionan independientemente del grupo formado por hidrógeno, alquilo de Ci-C8 y (alquilo de C0-C ) (arilo de C6-Cio)R7; R5 es NH2; y R7 se selecciona del grupo formado por H, alquilo de Ci-Cie, alquenilo de C2-Ci8, (alquilo de C0-C4)CONH2, (alquilo de C0-C4)COOH, (alquilo de C0-C4)NH2, (alquilo de C0-C4)OH, y halo; con la condición de ni ¾ ni R2 sea hidrógeno y siempre que por lo menos uno de R4 o R8 sea hidrógeno.

En algunas realizaciones, los profármacos que tienen el elemento de profármaco de dipéptido unido al aminoácido de extremo de N del péptido de la superfamilia de glucagón y que tiene un ti/2, por ejemplo, de entre 12 y 72 horas, o en algunas realizaciones de entre 12 y 48 horas, comprenden un elemento de profármaco de dipéptido con la estructura: en donde Ri y R2 se seleccionan independientemente del grupo formado por hidrógeno, alquilo de Ci-C8 y (alquilo de Ci-C )NH2, o Ri y R2 están unidos a través de (CH2)P, en donde p es 2-9; R3 es alquilo de Ci-C8 o R3 y R4 junto con los átomos a los cuales están unidos forman un anillo heterocíclico de 4-6 miembros ; R4 se selecciona del grupo formado por hidrógeno y alquilo de Ci-C8; y R5 es NH2; con la condición de que tanto Rx como R2 no sean hidrógeno .

En otras realizaciones, los profármacos que tienen el elemento de profármaco de dipéptido unido al aminoácido del extremo de N del péptido de la superfamilia de glucagón y que tienen un ti/2 de por ejemplo, entre alrededor 12 y 72 horas, o en algunas realizaciones entre alrededor de 12 y 48 horas, comprenden un elemento de profármaco de dipéptido con la estructura: wherein Ri y R2 se seleccionan independientemente del grupo formado por hidrógeno, alquilo de Ci-C8 y (alquilo de Ci-C)NH2; R3 es alquilo de Ci-C6; R4 es hidrógeno; y R5 es H2; con la condición de que tanto Ri como R2 no sean hidrógeno .

En algunas realizaciones, los profármacos que tienen el elemento de profármaco de dipéptido unido al aminoácido del extremo de N del péptido de la superfamilia de glucagón y que tienen un ti/2, por ejemplo de entre aproximadamente 12 a aproximadamente 72 horas, o en algunas realizaciones de entre aproximadamente 12 a aproximadamente 48 horas, comprenden un elemento de profármáco de dipéptido con la estructura: wherein Ri y R2 se seleccionan independientemente del grupo formado por hidrógeno y alquilo de Ci-C8, (alquilo de Ci-C4)NH2, o Ri y R2 están unidos a (CH2)P, en donde p es 2-9; R3 es alquilo de Ci-C8; R4 es (alquilo de C0-C4) (arilo de C6-Ci0)R7; R5 es NH2; y R7 se selecciona del grupo formado por hidrógeno, alquilo de Ci-C8 y (alquilo de C0-C4)OH; con la condición de que tanto Ri como R2 no sean hidrógeno .

En algunas realizaciones el péptido de la superfamilia de glucagón es un péptido relacionado con glucagón. En cualquiera de estas realizaciones, el péptido de la superfamilia de glucagón es cualquiera de SEQ ID NOs : 1-684, 701-731, 801-919, 1001-1262, 1301-1371, 1401-1518, 1701-1776, y 1801-1908.

Además se proporciona un profármaco que tiene el elemento de profármaco de dipéptido unido al alfa aminoácido del extremo de N del péptido de la superfamilia de glucagón y que tiene un ti 2 de por ejemplo entre aproximadamente 72 a aproximadamente 168 horas en donde el elemento de profármaco de dipéptido tiene la estructura : en donde Ri se selecciona del grupo formado por hidrógeno, alquilo y arilo de Ci-C8; R3 es alquilo de Ci-Ci8; R4 y R8 son cada uno hidrógeno; y R5 es una amina o amina N- sustituida o un hidroxilo; con la condición de que, si Ri es alquilo o arilo, entonces Ri y R5 junto con los átomos a los cuales están unidos forman un anillo heterocíclico de 4-11 miembros.

En algunas realizaciones, el elemento de profármaco de dipéptido tiene la estructura: en donde Rx se selecciona del grupo formado por hidrógeno, alquilo de Ci-C8 y (alquilo de C0-C ) (arilo de C6-Cío) R-7 ; R3 es alquilo de Ci-Ci8; R4 y R8 son cada uno hidrógeno; R5 es NHR6 O OH; Re es H, alquilo de Ci-C8, o R6 y Ri junto con los átomos a los cuales están unidos forman un anillo heterocíclico de 4 , 5, 0 6 miembros; y R7 se selecciona del grupo formado por hidrógeno, alquilo de Ci-Ci8, alquenilo de C2-Ci8, (alquilo de C0-C4)CONH2( (alquilo de C0-C4)COOH, (alquilo de C0-C4)NH2, (alquilo de C0-C4)OH, y halo; con la condición de que, si Ri es alquilo o (alquilo de C0-C4) (arilo de C6-Ci0)R7, entonces Rx y R5 junto con los átomos a los cuales están unidos forman un anillo heterocíclico de 4-11 miembros. En algunas realizaciones el péptido de la superfamilia de glucagón es un péptido relacionado con glucagón.

El algunas realizaciones el elemento de profármaco de dipeptido está unido a una amina de cadena lateral de un aminoácido interno del péptido de la superfamilia de glucagón. En esta realización los profármacos que tienen un ti/2, por ejemplo de aproximadamente 1 hora tienen la estructura: wherein Ri y R2 son independientemente alquilo o arilo de Ci-C8; o Ri y R2 están unidos a (CH2)P, en donde p es 2-9; R3 es alquilo de Ci-Ci8; R4 y R8 son cada uno hidrógeno; y R5 es una amina.

En algunas realizaciones, los profármacos que tienen un ti/2, por ejemplo de aproximadamente 1 hora tienen la estructura: en donde Ri y R2 son independientemente alquilo de x-Ce o (alquilo de C0-C4) (arilo de C6-Ci0)R7; o Rj. y R2 están unidos a través de -(CH2)P-, en donde p es 2-9; R3 es alquilo de Ci-Ci8; R4 y R8 son cada uno hidrógeno; R5 es NH2; y R7 se selecciona del grupo formado por hidrógeno, alquilo de Ci-Ci8, alquenilo de C2-Ci8, (alquilo de C0-C4)CONH2, (alquilo de C0-C4)COOH, (alquilo de Co-C4)NH27 (alquilo de C0-C4)OH, y halo.

Además, los profármacos que tienen un ti/2 de entre aproximadamente 6 y aproximadamente 24 horas y que tienen un elemento de profármaco de dipéptido unido a una cadena lateral de aminoácido interno comprenden un elemento de profármaco de dipéptido con la estructura: en donde Ri y R2 se seleccionan independientemente del grupo formado por hidrógeno, alquilo y arilo de Cx-Cs, o Ri y R2 están unidos a través de -(CH2)P, en donde p es 2-9; R3 es alquilo de Ci-Ci8 o R3 y R4 junto con los átomos a los cuales están unidos forman un anillo heterociclico de 4-12 miembros ; R4 y R8 son independientemente alquilo o arilo de Ci- Cie; y R5 es una amina o amina N-sustituida; con la condición de que tanto Ri como R2 no sean hidrógeno y siempre que uno de R o R8 sea hidrógeno.

En algunas realizaciones, los profármacos que tienen un t1/2 por ejemplo de entre aproximadamente 12 y 72 horas, o en algunas realizaciones entre aproximadamente 12 y 48 horas, y que tienen el elemento de profármaco de dipeptido unido a una cadena lateral de aminoácido interna comprenden un elemento de profármaco de dipéptido con la estructura: O R4 R8 en donde Ri y R2 se seleccionan independientemente del * grupo formado por hidrógeno, alquilo de Ci-C8, y (alquilo de C0-C4) (arilo de C6-Ci0)R7, o Ri y R2 están unidos a través de - (CH2)P-, en donde p es 2-9; R3 es alquilo de Ci-Ci8 o R3 y R4 junto con los átomos a los cuales están unidos forman un anillo heterocíclico de 4-12 miembros ; R4 y R8 son independientemente hidrógeno, alquilo de Ci-Cie o (alquilo de C0-C4) (arilo de C6-Ci0) 7; R5 es NHR6; R6 es H o alquilo de Ci-C8/ o R6 y R2 junto con los átomos a los cuales están unidos forman un anillo heterocíclico de 4, 5, 0 6 miembros; y R7 se selecciona del grupo formado por hidrógeno, alquilo de Ci-Ci8, alquenilo de C2-Ci8, (alquilo de C0-C4)CONH2, (alquilo de C0-C4)COOH, (alquilo de Co-C4)NH2, (alquilo de C0-C4)OH, y halo; con la condición de que tanto i como R2 no sean hidrógeno y siempre que por lo menos uno de R4 o R8 sea hidrógeno. En algunas realizaciones el péptido de la superfamilia de glucagón es un péptido relacionado con glucagón.

Además se provee un profármaco que tiene un ti/2 de por ejemplo aproximadamente 72 a 168 horas y que tiene el elemento de profármaco de dipéptido unido a una cadena lateral de aminoácido interno del péptido de la superfamilia de glucagón en donde el elemento de profármaco de dipéptido tiene la estructura: en donde Ri y R2 se seleccionan independientemente del grupo formado por hidrógeno, alquilo y arilo de x-C1B; R3 es alquilo de Ci-Ci8; R y R8 son cada uno hidrógeno; y R5 es una amina o una amina N-sustituida o un hidroxilo ; con la condición de que, si Rx y R2 son ambos independientemente un alquilo o arilo, Ri o R2 esté unido a través de (CH2)P a R5, en donde p es 2-9.

En algunas realizaciones, se proporciona un profármaco que tiene un ti 2 por ejemplo de aproximadamente 72 a 168 horas y que tiene el elemento de profármaco de dipéptido unido a una cadena lateral de aminoácido interno del péptido de la superfamilia de glucagón en donde el elemento de profármaco de dipéptido tiene la estructura : en donde Ri se selecciona del grupo formado por hidrógeno, alquilo de Ci-Ci8 y (alquilo de C0-C4) (arilo de C6-C10) R7 ; R3 es alquilo de Ci-Ci8; R4 y R8 son cada uno hidrógeno; R5 es NHR6 O OH; R6 es H o alquilo de i-Ce, o R6 y Ri junto con los átomos a los cuales están unidos forman un anillo heterocíclico de , 5 o 6 miembros; y R7 se selecciona del grupo formado por hidrógeno, alquilo de 1-C18, alquenilo de C2-Ci8, (alquilo de C0-C4) CO H2, (alquilo de C0-C4)COOH, (alquilo de C0-C4)NH2, (alquilo de C0-C4)OH, y halo; con la condición de que, si Ri y R2 son ambos independientemente un alquilo o (alquilo de C0-C4) (arilo de C6-Ci0)R7, i o R2 esté unido a través de (CH2)P a R5, en donde p es 2-9. En algunas realizaciones, el péptido de la superfamilia de glucagón es un péptido relacionado con glucagón. En cualquiera de estas realizaciones, el péptido de la superfamilia de glucagón es cualquiera de SEQ ID NOs : 1-684, 701-731, 801-919, 1001-1262, 1301-1371, 1401-1518, 1701-1776, y 1801-1908.

En algunas realizaciones el elemento de profármaco de dipéptido está unido a una amina de cadena lateral de un aminoácido interno del péptido de la superfamilia de glucagón en donde el aminoácido interno comprende la estructura de la Fórmula II: en donde : n es un número entero seleccionado de 1 a 4. En algunas realizaciones n es 3 o 4 y en algunas realizaciones el aminoácido interno es lisina. En algunas realizaciones el elemento de profármaco de dipéptido está unido a una amina primaria sobre una cadena lateral de un aminoácido ubicado en la posición 12, 16, 17, 18, 20, 28, o 29 del péptido de la superfamilia de glucagón. En algunas realizaciones el amnoácido de 12, 16, 17, 18, 20, 28 o 29 comprende la estructura de la Fórmula II: en donde n es un número entero seleccionado de 1 a 4 y el elemento de profármaco de dipéptido está unido a la cadena lateral de aminoácido a través de un enlace de amida. En algunas realizaciones n es 4 y el aminoácido está ubicado en la posición 20. En algunas realizaciones, el péptido de la superfamilia de glucagón es un péptido relacionado con glucagón.

En otra realización el elemento de profármaco de dipéptido está unido al péptido de la superfamilia de glucagón a través de una amina presente sobre un grupo arilo de un aminoácido aromático. En algunas realizaciones el aminoácido aromático es un aminoácido interno del péptido de la superfamilia de glucagón, sin embargo el aminoácido aromático también puede ser el aminoácido del extremo de N. En algunas realizaciones el péptido de la superfamilia de glucagón es un péptido relacionado con glucagón.

En algunas realizaciones el aminoácido aromático se selecciona del grupo formado por amino-Phe, amino-naftil alanina, amino triptófano, amino-fenil-glicina, amino-homo-Phe , y amino tirosina. En algunas realizaciones la amina primaria que forma un enlace de amida con el elemento de profármaco de glucagón está en la posición para sobre el grupo arilo. En algunas realizaciones la amina aromática comprende la estructura de la Fórmula III: en donde m es un número entero de 1 a 3.

Para estas realizaciones en donde el elemento de profármaco de dipéptido está unido al péptido de la superfamilia de glucagón a través de una amina presente sobre un grupo arilo de un aminoácido aromático, profármacos que tienen un ti/2, por ejemplo de aproximadamente 1 hora tienen una estructura de dipéptido de: en donde Ri y R2 son independientemente alquilo o arilo de Ci-Cie; R3 es alquilo de Ci-C1a o R3 y R4 junto con los átomos a los cuales están unidos forman un anillo heterocíclico de 4-12 miembros ; R4 y Rs se seleccionan independientemente del grupo formado por hidrógeno, alquilo y arilo de Ci-Ci8; y R5 es una amina o un hidroxilo, En algunas realizaciones, el elemento de profármaco de dipéptido está unido al péptido de la superfamilia de glucagón a través de una amina presente sobre un grupo arilo de un aminoácido aromático, profármacos que tienen un ti/2 de por ejemplo aproximadamente 1 hora tienen una estructura de dipéptido de: en donde Ri y R2 son independientemente alquilo de Ci-Ci8 o (alquilo de C0-C4) (arilo de C6-Ci0)R7; R3 es alquilo de Cx-C18 o R3 y R4 junto con los átomos a los cuales están unidos forman un anillo heterocíclico de 4-12 miembros ; R y R8 se seleccionan independientemente de hidrógeno, alquilo de Ci-Ci8 y (alquilo de C0-C4) (arilo de C6-Ci0)R7; R5 es NH2 o OH; y R7 se selecciona del grupo formado por hidrógeno, alquilo de Ci-Ci8, alquenilo de C2-Ci8, (alquilo de C0-C4)CONH2, (alquilo de C0-C4)COOH, (alquilo de C0-C4)NH2, (alquilo de C0-C4)0H, y halo. En algunas realizaciones el péptido de la superfamilia de glucagón es un péptido relacionado con glucagón. Además, se proporcionan profármacos que tienen el elemento de profármaco de dipéptido unido a través de un aminoácido aromático y que tiene un ti/2, por ejemplo de aproximadamente 6 a 24 horas en donde el dipéptido comprende una estructura de: en donde Ri se selecciona del grupo formado por hidrógeno, alquilo y arilo de Ci-Ci8, o Ri y R2 están unidos a través de - (CH2)P, en donde p es 2-9; R3 es alquilo de Ci-Ci8 o R3 y R4 junto con los átomos a los cuales están unidos forman un anillo heterocíclico de 4-6 miembros ; R4 y R8 se seleccionan independientemente del grupo formado por hidrógeno, alquilo y arilo de Ci-Ci8; y R5 es una amina o amina N- sustituida .

En algunas realizaciones, se proporcionan profármacos que tienen el elemento de profármaco de dipéptido unido a través de un aminoácido aromático y que tienen un ti2 por ejemplo de aproximadamente 6 a 24 horas en donde el dipéptido comprende una estructura de : O R4 R8 wherein Ri se selecciona del grupo formado por hidrógeno, alquilo de Ci-Ci8, (alquilo de Ci-Ci8) OH, (alquilo de Ci-C4)NH2, y (alquilo de C0-C4) (arilo de C6-Ci0 aryl)R7; R3 es alquilo de 0?-018 o R3 y R4 junto con los átomos a los cuales están unidos forman un anillo heterocíclico de 4-6 miembros ; R4 y R8 se seleccionan independientemente del grupo formado por hidrógeno, alquilo de Ci-Ci8 y (alquilo de C0-C4) (arilo de C6-Ci0)R7; R5 es NHRe; R6 es H, alquilo de Ci-C8, o R6 y Ri junto con los átomos a los cuales están unidos forman un anillo heterocíclico de 4, 5 o 6 miembros; y R7 se selecciona del grupo formado por hidrógeno, alquilo de Ci-Ci8/ alquenilo de C2-Ci8, (alquilo de C0-C )CONH2, (alquilo de C0-C4)COOH, (alquilo de Co-C4)NH2, (alquilo de C0-C4)OH, y halo.

Además, se proporcionan profármacos que tienen el elemento de profármaco de dipéptido unido a través de una aminoácido aromático y que tienen un ti 2 por ejemplo de aproximadamente 72 a 168 horas en donde el dipéptido comprende una estructura de: en donde Ri y R2 se seleccionan independientemente del grupo formado por hidrógeno, alquilo y arilo de Ci-CB; R3 es alquilo de Ci-Ci8 o R3 y R4 junto con los átomos a los cuales están unidos forman un anillo heterocíclico de 4-6 miembros ; R y R8 son cada uno hidrógeno; y R5 se selecciona del grupo formado por amina, amina N-sustituida e hidroxilo.

En algunas realizaciones se proporcionan profármacos que tienen el elemento de profármaco de dipéptido unido a través de un aminoácido aromático y que tienen un ti/2 por ejemplo de aproximadamente 72 a 168 horas en donde el dipéptido comprende la estructura de: en donde Ri y R2 se seleccionan independientemente de hidrógeno, alquilo de Ci-C8, (alquilo de Ci-C4)COOH, y (alquilo de C0-C4) (arilo de C6-Cio)R7, o Rx y R5 junto con los átomos a los cuales están unidos forman un anillo heterocíclico de 4-11 miembros ; R3 es alquilo de Ci-Ci8 o R3 y R4 junto con los átomos a los cuales están unidos forman un anillo heterocíclico de 4-6 miembros ; R4 es hidrógeno o forma un anillo heterocíclico de 4-6 miembros con R3; R8 es hidrógeno; R5 es NHR6 o OH; R6 es H o alquilo de Ci-C8, o Rs y Ri junto con los átomos a los cuales están unidos forman un anillo heterocíclico de 4 , 5 o 6 miembros; y R7 se selecciona del grupo formado por hidrógeno, alquilo de Ci-Ci8, alquenilo de C2-Ci8, (alquilo de Co-C4)CONH2, (alquilo de C0-C4)COOH, (alquilo de C0-C4)NH2, (alquilo de C0-C4)OH, y halo.

En algunas realizaciones el elemento de profármaco de dipéptido está unido a un aminoácido aromático a través de una amina primaria presente como un sustituyente de arilo del aminoácido aromático, en donde el aminoácido aromático está ubicado en la posición 10, 13, 22 o 25 del péptido de la superfamilia de glucagón (basado en la numeración para glucagón, véase por ejemplo la Figura 10) . En algunas realizaciones el elemento de profármaco de dipéptido unido al aminoácido aromático está ubicado en la posición 22 del péptido de la superfamilia de glucagón.

De acuerdo con algunas realizaciones el elemento de profármaco de dipéptido está unido en la amina de extremo de N de un péptido de la superfamilia de glucagón, que incluye por ejemplo un péptido relacionado de glucagón, u osteocalcina, así como análogos, derivados y conjugados de los precedentes, en donde el elemento de profármaco de dipéptido comprende la estructura: en donde Ri se selecciona del grupo formado por H y alquilo de R2 y R4 se seleccionan independientemente de H, alquilo de Ci-C8, alquenilo de C2-C8, (alquilo de d-C)OH, (alquilo de Ci-C4)SH, (alquilo de C2-C3)SCH3, (alquilo de Ci-C4)CONH2( (alquilo de Ci-C4)C00H, (alquilo de Ci-C4)NH2/ (alquilo de Ci-C4) HC (NH2+) H2/ (alquilo de C0-C4) (cicloalquilo dé C3-Ce) , (alquilo de C0-C4) (arilo de C6-Cio)R7, CH2 (heteroarilo de C5-C9) , o Ri y R2 junto con los átomos a los cuales están unidos forman un cicloalquilo de C3-C6; R3 se selecciona del grupo formado por alquilo de Ci-C8, (C3-C6) cicloalquilo o R4 y R3 junto con los átomos a los cuales están unidos forman un anillo heterocíclico de 5 o 6 miembros; R5 es NHR6 o OH; R6 es H, o R6 y R2 junto con los átomos a los cuales están unidos forman un anillo heterocíclico de 5 o 6 miembros; y R7 se selecciona del grupo formado por H y OH. En algunas realizaciones Rx es H o alquilo de Ci-C8, R2 se selecciona del grupo formado por H, alquilo de Ci-C6/ CH2OH, (alquilo de Ci-C4)NH2/ (cicloalquilo de C3-C6) y CH2 (arilo de C6)R7 o R6 y R2 junto con los átomos a los cuales están unidos forman un anillo heterocíclico de 5 miembros, R3 es alquilo de Ci-C6, y R4 se selecciona del grupo formado por H, alquilo de Ci-C4, (C3-C6) cicloalquilo, (alquilo de Ci-C4)OH, (alquilo de Ci-C4)SH y (alquilo de C0-C4) (arilo de C6)R7, o R3 y R4 junto con los átomos a los cuales están unidos forman un anillo heterocíclico de 5 miembros. En otra realización R3 es CH3/ R5 es NHR6, y en una realización alternativa R3 y R4 junto con los átomos a los cuales están unidos forman un anillo heterocíclico de 5 miembros y R5 es NHR6.

De acuerdo con otra realización el elemento de profármaco de dipéptido está unido en la amina del extremo de N de un péptido de la superfamilia de de glucagón, que incluye por ejemplo un péptido relacionado con glucagón, u osteocalcina, así como análogos, derivados y conjugados de los precedentes, en donde el elemento de profármaco de dipéptido comprende la estructura: en donde Ri se selecciona del grupo formado por H y alquilo de Ci-Ce ; R2 y R4 se seleccionan independientemente de H, alquilo de Ci-C8, alquenilo de C2-C8, (alquilo de Cx-C OH, (alquilo de C -C4)SH, (alquilo de C2-C3) SCH3, (alquilo de Ci-C4)CONH2, (alquilo de C!-C4)COOH, (alquilo de Ci-C4)NH2í (alquilo de Ci-C4) NHC (NH2+) NH2, (alquilo de C0-C4) (cicloalquilo de C3-C6) , (alquilo de C0-C4) (arilo de C6-Cio)R7, CH2 (heteroarilo de C5-C9) , o Ri y R2 junto con los átomos a los cuales están unidos forman un cicloalquilo de C3-C6; R3 se selecciona del grupo formado por alquilo de Ci-C8, (C3-C6) cicloalquilo o R4 y R3 junto con los átomos a los cuales están unidos forman un anillo heterocíclico de 5 o 6 miembros; R5 es NHR6 o OH; R6 es H, o R6 y R2 junto con los átomos a los cuales están unidos forman un anillo heterocíclico de 5 o 6 miembros; y R7 se selecciona del grupo formado por hidrógeno, alquilo de C^-Cie, alquenilo de C2-Ci8, (alquilo de C0-C4)CONH2, (alquilo de C0-C4)COOH, (alquilo de C0-C4)NH2, (alquilo de C0-C4)OH, y halo. En algunas realizaciones Rx es H o alquilo de Ci-C8, R2 se selecciona del grupo formado por H, alquilo de Ci-C6, CH2OH, (alquilo de Ci-C4)NH2, (cicloalquilo de C3-C6) y CH2 (arilo de Cg)R7 o R6 y R2 junto con los átomos a los cuales están unidos forman un anillo heterocíclico de 5 miembros, R3 es alquilo de Ci-C6, y R se selecciona del grupo formado por H, alquilo de Ci-C4, (C3-C6) cicloalquilo, (alquilo de Ci-C4)OH, (alquilo de Ci-C4) SH y (alquilo de C0-C4) (arilo de C6)R7, o R3 y R junto con los átomos a los cuales están unidos forman un anillo heterocíclico de 5 miembros. En otra realización R3 es CH3, R5 es NHR6, y en otra realización alternativa R3 y R4 junto con los átomos a los cuales están unidos forman un anillo heterocíclico de 5 miembros y R5 es NHR6.

En algunas realizaciones, Q es cualquiera de SEQ ID NOs: 1-684, 701-731, 801-919, 1001-1262, 1301-1371, 1401-1518, 1701-1776, y 1801-1908.

Peptidos Relacionados con Glucagón En ciertas realizaciones la presente invención se refiere a péptidos relacionados con glucagón (como parte del grupo designado MQ"). El término péptido relacionado con glucagón se refiere a aquellos péptidos que tienen actividad biológica (como agonistas o antagonistas) en uno o más de cualquiera de los receptores de glucagón, GLP-1, GLP-2 y GIP y comprenden una secuencia de aminoácido que comparte por lo menos un 40% de identidad de secuencia (por ejemplo, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%) con por lo menos uno del glucagón nativo, oxintomodulina nativa, exendina 4 nativa, GLP-1 nativa, GLP-2 nativa, o GIP nativo. Se entiende que todos los subgrupos de actividad posible de los péptidos relacionados con glucagón están contemplados, por ejemplo péptidos que tienen actividad biológica (como agonistas o antagonistas) en una ó más de cualquiera de los receptores de glucagón o GLP-1 o GIP, junto con todos los subgrupos posibles de identidad de secuencia con cada péptido nativo enumerado, por ejemplo, comprenden una secuencia de aminoácido que comparte por lo menos un 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, o 95% de identidad de secuencia con el glucagon nativo sobre la longitud de glucagon nativo. En algunas realizaciones de la invención, el péptido relacionado con glucagon es un péptido que tiene una actividad de agonista de receptor de glucagon, una actividad de agonista de receptor de GIP, actividad de coagonista de receptor de glucagón/receptor de GLP-1, actividad de antagonista de receptor de glucagon o actividad de antagonista de receptor de glucagon y agonista de receptor de GLP-1. En algunas realizaciones, el péptido retiene una conformación de alfa-hélice en la mitad de la molécula del extremo de C. En algunas realizaciones, el péptido retiene posiciones involucradas en la interacción o señalización del receptor, por ejemplo la posición 3 de glucag.ón, o la posición 7, 10, 12, 13, 15 o 17 de (1-37) GLP-1. Por consiguiente, el péptido relacionado con glucagon puede ser un péptido de la Clase 1, Clase 2, Clase 3, Clase 4 y/o Clase 5, cada una de las cuales también se describe en la presente.

De acuerdo con algunas realizaciones el elemento de profármaco de dipéptido se puede unir a través de una ligadura de amida a cualquiera de los compuestos bioactivos revelados previamente en las Solicitudes de Patente Internacionales N° PCT/US2008/08608 (presentada el 3 de enero de 2008) , PCT/US2008/053857 (presentada el 13 de febrero de 2008) , PCT/US2009/47437 (presentada el 16 de junio de 2009) , PCT/US2009/47438 (presentada el 16 de junio de 2009) , PCT/US2009/47447 (presentada el 16 de junio de 2009) , PCT/US2008/080973 (presentada el 23 de octubre de 2008), y PCT/US2008/081333 (presentada el 27 de octubre de 2008) , cuyas invenciones se incluyen expresamente por referencia en la presente solicitud de patente. El elemento de profáramco de dipéptido revelado en en la presente puede, en algunos ejemplos de realizaciones, unirse a los péptidos bioactivos revelados en PCT/US2008/08608, PCT/US2008/053857 , PCT/US2009/47437 , PCT/US2009/47438, PCT/US2009/47447 , PCT/US2008/08097 , y PCT/US2008/081333 a través de la amina del extremo de N o del grupo amino de cadena lateral de una lisina en la posición 20 o del grupo amino aromático de una 4-amino fenilalanina sustituida por el aminoácido en la posición 22 de cualquiera de los péptidos bioactivos revelados. En algunos ejemplos de realizaciones el elemento de profármaco de dipéptido de la presente está unido a través de un enlace de amida a la amina del extremo de N de un peptido bioactivo revelado en PCT/US2008/08608 , PCT/US2008/053857, PCT/US2009/47437 , PCT/US2009/47438 , y PCT/US2009/47447, PCT/US2008/08097 , y PCT/US2008/081333. En algunas realizaciones, el péptido de la superfamilia de glucagón es cualquiera de SEQ ID NOs : 1-684, 701-731, 801-919, 1001-1262, 1301-1371, 1401-1518, 1701-1776, y 1801-1908.

Modificaciones El péptido relacionado con glucagón puede comprender la secuencia de aminoácido de glucagón nativo (SEQ ID NO: 701) con modificaciones. En ejemplos de realizaciones, el péptido relacionado con glucagón puede comprender un total de 1, hasta 2, hasta 3, hasta 4, hasta 5, hasta 6, hasta 7, hasta 8, hasta 9, o hasta 10 modificaciones de aminoácidos en relación con la secuencia de glucagón nativo, por ejemplo, sustituciones conservadoras o no conservadoras. Las modificaciones y sustituciones descritas en la presente, en ciertos aspectos, se realizan en posiciones específicas dentro de un péptido relacionado con glucagón en donde la numeración de la posición corresponde a la numeración de glucagón (SEQ ID NO: 701) . En algunas realizaciones 1, 2, 3, 4 o 5 sustituciones no conservadoras se realizan en cualquiera de las posiciones 2, 5, 7, 10, 11, 12, 13, 14, 17, 18, 19, 20, 21, 24, 27, 28 o 29 y hasta 5 sustituciones conservadoras adicionales se realizan en cualquiera de estas posiciones. En algunas realizaciones, 1, 2, o 3 modificaciones de aminoácidos se realizan dentro de los aminoácidos en las posiciones 1-16, y 1, 2 o 3 modificaciones de aminoácidos se realizan dentro de los aminoácidos en las posiciones 17-26. En algunas realizaciones, dichos péptidos relacionados con glucagón retienen por lo menos 22, 23, 24, 25, 26, 27 o 28 de los aminoácidos naturales en las posiciones correspondientes en glucagón nativo (por ejemplo, tienen 1-7, 1-5 o 1-3 modificaciones en relación con el glucagón natural) .

Resistencia a DPP-IV En algunas realizaciones, el péptido relacionado con glucagón comprende una modificación en la posición 1 o 2 para reducir la susceptibilidad a la descomposición por dipeptidil peptidasa IV. Más específicamente, en algunas realizaciones, la posición- 1 de un péptido relacionado con glucagón (por ejemplo seleccionado de aquellos de la Figura 10) se sustituye con un aminoácido seleccionado del grupo formado por D-histidina, ácido alfa,alfa-dimetil imidazol acético (DMIA) , N-metil histidina, alfa-metil histidina, ácido imidazol acético, desaminohistidina, hidroxil-histidina, acetil-histidina y homo-histidina . Más específicamente, en algunas realizaciones, la posición 2 del péptido relacionado con glucagón se sustituye con un aminoácido seleccionado del grupo formado por D-serina, D-alanina, valina, glicina, N-metil serina, y ácido aminoisobutírico . En algunas realizaciones, la posición 2 del péptido relacionado con glucagón no es D-serina.

Grupos Hidrófilos El algunas realizaciones, el péptido relacionado con glucagón (por ejemplo, un péptido relacionado con glucagón de la Clase 1, péptido relacionado con glucagón de la Clase 2, péptido relacionado con glucagón de la Clase 3, péptidos relacionados con glucagón de la Clase 4 o péptido relacionado con glucagón de . la Clase 5) se une (en forma covalente) a un grupo hidrófilo. Los grupos hidrófilos se pueden unir al péptido relacionado con glucagón en cualquier condición aceptable usada para la reacción de una proteína con una molécula de polímero activado. Se puede utilizar cualquier medio conocido en el arte, que incluye a través de acilación, alquilacion reductiva, agregado de Michael, alquilación de tiol u otros métodos de unión/conjugación química selectiva a través de un grupo reactivo sobre el grupo PEG (por ejemplo, un grupo aldehido, amino, éster, tiol, -haloacetilo, maleimido o hidrazino) a un grupo reactivo sobre el compuesto blanco (por ejemplo, un grupo aldehido, amino, éster, tiol, a-haloacetilo, maleimido o hidrazino) . Los grupos activadores que se pueden utilizar para unir el polímero soluble en agua a una o más proteínas incluyen en forma no taxativa sulfona, maleimida, sulfhidrilo, tiol, triflato, tresilato, aziridina, oxirano y 5-piridilo. Si se une al péptido mediante alquilación reductiva, el polímero seleccionado debe tener un solo aldehido reactivo de manera tal que se controle el nivel de polimerización. Véase, por ejemplo, Kinstler et al., Adv. Drug. Delivery Rev. 54: 477-485 (2002); Roberts et al., Adv. Drug Delivery Rev. 54: 459-476 (2002); y Zalipsky et al., Adv. Drug Delivery Rev. 16: 157-182 (1995) .

Con respecto a los péptidos relacionados con glucagón de las Clases 1 a 3, otros grupos activadores que se pueden utilizar para unir el polímero soluble en agua a una o más proteínas incluyen un grupo acilo alfa-halogenado (por ejemplo, ácido alfa-yodo acético, ácido alfa-bromoacético, ácido alfa-cloroacético) . En algunas realizaciones, en donde el péptido relacionado con glucagón es un péptido relacionado con glucagón de la Clase 1, Clase 2 o Clase 3, un aminoácido que comprende un tiol se modifica con PEG activado por meleimida en una reacción de agregado de Michael que deriva en un péptido PEGilado que comprende la ligadura de tioéter que se muestra a continuación: En otras realizaciones, el tiol de un aminoácido de un péptido relacionado con glucagón de la Clase 1, Clase 2 o Clase 3 se moifica con un PEG activado por haloacetilo en una reacción de sustitución de nucleófilo que deriva en un péptido PEGilado que comprende la ligadura de tioéter que se muestra a continuación: Péptido Los grupos hidrófilos adecuados incluyen polietilenglicol (PEG) , polipropilenglicol , polioles polioxietilados (por ejemplo, POG) , sorbitol polioxietilado, glucosa polioxietilada, glicerol polioxietilado (POG), polioxialquilenos , polietilenglicol propionaldehído, copolímeros de etilenglicol/propilenglicol , monometoxi -polietilenglicol, mono- (C1-C10) alcoxi- O ariloxi-polietilenglicol , carboximetilcelulosa, poliacetales , alcohol polivinílico (PVA) , polivinil pirrolidona, poli-1, 3-dioxolano, poli-1 , 3 , ß-trioxano, copolímero de etileno/anhídrido maleico, poli ( .beta . -aminoácidos) (homopolímeros o copolímeros aleatorios), poli(n-vinil pirrolidona) polietilenglicol , homopolímeros de propropilenglicol (PPG) y otros óxidos de polialquileno, copolímeros de óxido de polipropileno/óxido de etileno, ácidos colónicos u otros polímeros de polisacárido, Ficoll o dextrano y mezclas de ellos. Los dextranos son polímeros de polisacárido de subunidades de glucosa, predominantemente unidos por ligaduras de al-6. El dextrano está disponible en muchas gamas de peso molecular, por ejemplo de aproximadamente 1 kD a 100 kD, o de aproximadamente 5, 10, 15 o 20 kD a aproximadamente 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80 o 90 kD.

En algunas realizaciones el grupo hidrófilo es una cadena de polietilenglicol (PEG) u otro polímero soluble en agua que está unido en forma covalente a la cadena lateral de un residuo de aminoácido en una o más de las posiciones 16, 17, 21, 24, 29, 40 de dicho péptido relacionado con glucagón, dentro de una prolongación del extremo de C, o en el aminoácido del extremo de C. En algunas realizaciones, el aminoácido nativo en esa posición se sustituye con un aminoácido que tiene una cadena lateral adecuada para el entrecruzamiento con grupos hidrófilos, para facilitar la unión del grupo hidrófilo al péptido. Ejemplos de aminoácidos incluyen Cys, Lys, Orn, homo-Cys, o acetil fenilalanina (Ac-Phe) . En otras realizaciones, un aminoácido modificado para comprender un grupo hidrófilo se agrega al péptido en el extremo de C.

El grupo hidrófilo, por ejemplo, una cadena de polietilenglicol, de acuerdo con algunas realizaciones tiene un peso molecular seleccionado de la gama de 500 a 40.000 Dalton. En algunas realizaciones la cadena de polietilenglicol tiene un peso molecular seleccionado de la gama de 500 a 5.000 Dalton, o de 1.000 a 5.000 Dalton. En otra realización el grupo hidrófilo, por ejemplo, una cadena de polietilenglicol , tiene un peso molecular de 10.000 a 20.000 Dalton. En aún otro ejemplo de realizaciones el grupo hidrófilo, por ejemplo, una cadena de polietilenglicol, tiene un peso molecular de aproximadamente 20.000 a aproximadamente 40.000 Dalton.

Están contemplados polímeros hidrófilos lineales o ramificados. Las preparaciones de conjugados resultantes pueden ser esencialmente monodispersos o polidispersos , y pueden tener 0,5; 0,7; 1; 1,2; 1,5 o 2 grupos polimericos por cada péptido.

Acilación En algunas realizaciones, el péptido relacionado con glucagón (por ejemplo, un péptido relacionado con glucagón de la Clase 1, un péptido relacionado con glucagón de la Clase 2, un péptido relacionado con glucagón de la Clase 3, un péptido relacionado con glucagón de la Clase 4, o un péptido relacionado con glucagón de la Clase 5), se modifica para comprender un grupo acilo. Por ejemplo, el péptido relacionado con glucagón puede ser uno de la Clase 1, Clase 2, o Clase 3 y puede comprender un grupo acilo que es un aminoácido nativo a no natural. La acilación se puede realizar en cualquier posición dentro del péptido relacionado con glucagón, que incluye cualquiera de las posiciones 1-29, una posición dentro de una prolongación del extremo de C, o el aminoácido del extremo de C, siempre que la actividad presentada por el péptido relacionado con glucagón no acilado sea retenido al ocurrir la acilación. Por ejemplo, si el péptido no acilado tiene actividad de agonista de glucagón, entonces el péptido acilado retiene la actividad de agonista de glucagón. También por ejemplo, si el péptido no acilado tiene actividad de antagonista de glucagón, entonces el péptido acilado retiene la actividad de antagonista de glucagón. Por ejemplo, el péptido no acilado tiene actividad de agonista de GLP-1, entonces el péptido acilado retiene la actividad de agonista de GLP-1. Ejemplos no taxativos incluyen acilación en las posiciones 5, 7, 10, 11, 12, 13, 14, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 24, 27, 28, o 29 (de acuerdo con la numeración de aminoácidos del glucagón de tipo silvestre) . Con respecto a los péptidos relacionados con glucagón de la Clase 1, Clase 2 y Clase 3, la acilación puede ocurrir en cualquiera de las posiciones 5, 7, 10, 11, 12, 13, 14, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 24, 27, 28, 29, 30, 37, 38, 39, 40, 41, 42, o 43 (de acuerdo con la numeración de aminoácido del gluagón de tipo silvestre) . El grupo acilo se puede unir en forma covalente directamente a un aminoácido del péptido relacionado con glucagón, o indirectamente a un aminoácido del péptido relacionado con glucagón a través de un separador, en donde el separador está posicionado entre el aminoácido del péptido relacionado con glucagón y el grupo acilo.

Los péptidos relacionados con glucagón se pueden acilar en la misma posición de aminoácido donde se une un grupo hidrófilo, o en una posición de aminoácido diferente. Ejemplos no taxativos incluyen la acilación en la posición 10 (de acuerdo con la numeración de aminoácido del glucagón de tipo silvestre) y pegilación en una o más posiciones en la posición del extremo de C del péptido de glucagón, por ejemplo, la posición 24, 28 o .29 (de acuerdo con la numeración del aminoácido de glucagón de tipo silvestre) , dentro de una prolongación del extremo de C, o en el extremo de C (por ejemplo, a través del agregado de un Cys del extremo de C) .

En un aspecto específico de la invención, el péptido relacionado con glucagón se modifica para comprender un grupo acilo mediante la acilación directa de una amina, hidroxilo, o tiol de una cadena lateral de un aminoácido del péptido relacionado con glucagón. En algunas realizaciones, el péptido relacionado con glucagón se acila directamente a través de la amina de cadena lateral, hidroxilo, o tiol de un aminoácido. En algunas realizaciones, la acilación es en la posición 10, 20, 24 o 29 (de acuerdo con la numeración de aminoácido de glucagón de tipo silvestre) . Al respecto, el péptido relcionado con glucagón acilado puede comprender la secuencia de aminoácido de SEQ ID NO: 701, o una secuencia de aminoácido modificada de él que comprende una o más de las modificaciones de aminoácidos descritas en la presente, con por lo menos uno de los aminoácidos en las posiciones 10, 20, 24 y 29 (de acuerdo con la numeración de aminoácido de glucagón de tipo silvestre) modificado a cualquier aminoácido que comprende una amina de cadena lateral, hidroxilo o tiol. En algunas realizaciones especificas de la invención, la acilación directa del péptido relacionado con glucagón ocurre a través de la amina de cadena lateral, hidroxilo, o tiol del aminoácido en la posición 10 (de acuerdo con la numeración de aminoácido del glucagón de tipo silvestre) .

En algunas realÍ2aciones, el aminoácido que comprende una amina de cadena lateral es un aminoácido de la Fórmula I : en donde n = 1 a 4 [Fórmula I] En algunos ejemplos de realizaciones, el aminoácido de la Fórmula I es el aminoácido en donde n es 4 (Lys) o n es 3 (Orn) .

En otras realizaciones, el aminoácido que comprende un hidroxilo de cadena lateral es un aminoácido de la Fórmula II: en donde n = 1 a 4 [Fórmula II] En algunos ejemplos de realizaciones, el aminoácido de la Fórmula II es el aminoácido en donde n es 1 (Ser) .

En aún otras realizaciones, el aminoácido que comprende un tiol de cadena lateral es un aminoácido de la Fórmula III: en donde n = 1 a 4 [Fórmula III] En algunos ejemplos de realizaciones, el aminoácido de la Fórmula III es el aminoácido en donde n es 1 (Cys) .

En aún otras realizaciones, en donde el péptido relacionado con glucagón es un péptido relacionado con glucagón de la Clase 1, Clase 2, o Clase 3, el aminoácido que comprende una amina de cadena lateral, hidroxilo o tiol es un aminoácido disustituido que comprende la misma estructura de la Fórmula I, Fórmula II o Fórmula III, excepto en cuanto a que el hidrógeno unido al carbono alfa del aminoácido de la Fórmula I, la Fórmula II o la Fórmula III se reemplaza con una segunda cadena lateral.

En algunas realizaciones de la invención, el péptido relacionado con glucagon acilado comprende un separador entre el péptido y el grupo acilo. En algunas realizaciones, el péptido relacionado con glucagon está unido en forma covalente al separador, que está unido en forma covalente al grupo acilo. En. algunos ejemplos de realizaciones, el péptido relacionado con glucagon se modifica para comprender un grupo acilo mediante la acilación de una amina, hidroxilo, o tiol de un separador, dicho separador está unido a una cadena lateral de un aminoácido en la posición 10, 20, 24 o 29 (de acuerdo con la numeración de aminoácido del glucagon de tipo silvestre) , o en el aminoácido del extremo de C del péptido relacionado con glucagon. El aminoácido al cual está unido el separador puede ser cualquier aminoácido que comprende un grupo que permite la unión al separador. Por ejemplo, un aminoácido que comprende una cadena lateral -NH2, -OH, o -C00H (por ejemplo, Lys, Orn, Ser, Asp, o Glu) es adecuado. Además, con respecto a los péptidos relacionados con glucagon de la Clase 1, Clase 2 y Clase 3, un aminoácido (por ejemplo un aminoácido -sustituido simple o doble) que comprende una cadena lateral -NH2, -OH, o -COOH (por ejemplo, Lys, Orn, Ser, Asp, o Glu) es adecuado. Al respecto, el péptido relacionado con glucagón acilado puede comprender la secuencia de aminoácido de SEQ ID NO: 701, o una secuencia de aminoácido de él que comprende una o más de las modificaciones de aminoácido descritas en la presente, con por lo menos uno de los aminoácidos en las posiciones 10, 20, 24 y 29 (de acuerdo con la numeración de aminoácido del glucagón de tipo silvestre) modificados en cualquier aminoácido que comprende una amina de cadena lateral, hidroxilo, o carboxilato.

En algunas realizaciones, el separador es un aminoácido que comprende una amina de cadena lateral, hidroxilo o tiol, o un dipéptido o tripéptido que comprende un aminoácido que comprende una amina de cadena lateral, hidroxilo o tiol. En algunas realizaciones, el separador de aminoácido no es ?-Glu. En algunas realizaciones, el separador de dipéptido no es ?-Glu- ?-Glu.

Cuando la acilación ocurre a través de un grupo amina del aminoácido del separador, la acilación puede ocurrir a través de la alfa amina del aminoácido o una amina de cadena lateral. En el caso de que la alfa amina se acile, el aminoácido de separaror puede ser cualquier aminoácido. Por ejemplo, el aminoácido de separador puede ser un aminoácido hidrófobo, por ejemplo, Gly, Ala, Val, Leu, lie, Trp, Met, Phe, Tyr. En algunas realizaciones en donde el péptido relacionado con glucagón es un péptido relacionado con glucagón de la Clase 1, Clase 2 o Clase 3, el aminoácido de separador puede ser, por ejemplo, un aminoácido hidrófobo, por ejemplo, Gly, Ala, Val, Leu, lie, Trp, Met, Phe, Tyr, ácido 6-hexanoico, ácido 5-aminovalérico, ácido 7-aminoheptanoico, ácido 8-aminooctanoico . Alternativamente, el aminoácido de separador puede ser un residuo ácido, por ejemplo, Asp y Glu. En el caso de que la amina de cadena lateral del aminoácido de separador se acile, el aminoácido de separador es un aminoácido que comprende una amina de cadena lateral, por ejemplo, un aminoácido de la Fórmula I (por ejemplo, Lys u Orn) . En este ejemplo, es posible que tanto la alfa amina como la amina de cadena lateral del aminoácido de separador se acile, de manera tal que el péptido de glucagón se diacile. Las realizaciones de la invención incluyen dichas moléculas diaciladas.

Cuando la acilación ocurre a través de un grupo hidroxilo del aminoácido del separador, el aminoácido o uno de los aminoácidos del dipéptido o tripéptido puede ser un aminoácido de la Fórmula II. En un ejemplo específico de realización, el aminoácido es Ser.

Cuando la acilación ocurre a través de un grupo tiol del aminoácido del separador, el aminoácido o uno de los aminoácidos del dipeptido o tripéptido puede ser un aminoácido de la Fórmula III. En un ejemplo específico de realización, el aminoácido es Cys .

En algunas realizaciones, el separador comprende un separador bifuncional hidrófilo. En una realización específica, el separador comprende un amino poli (alquiloxi) carboxilato . Al respecto, el separador puede comprender, por ejemplo, NH2 (CH2CH20) n (CH2) mCOOH, en donde m es cualquier número entero de 1 a 6 y n es cualquier número entero de 2 a 12, tal como, por ejemplo, ácido 8-amino-3 , 6-dioxooctanoico, que está comercialmente disponible en Peptides International, Inc. (Louisville, Kentucky) .

En algunas realizaciones, los péptidos relacionados con glucagón que pertenecen solamente a la Clase 1, Clase 2 y Clase 3, el separador comprende un separador bifuncional hidrófilo. En ciertas realizaciones, el separador bifuncional hidrófilo unido al péptido relacionado con glucagón de la Clase 1, Clase 2 o Clase 3 comprende dos o más grupos reactivos, por ejemplo, una amina, un hidroxilo, un tiol y un grupo carboxilo o cualquier combinación de ellos. En ciertas realizaciones, el separador bifuncional hidrófilo unido al péptido relacionado con glucagón de la Clase 1, Clase 2 o Clase 3 comprende un grupo hidroxilo y un carboxilato. En otras realizaciones, el separador bifuncional hidrófilo unido al péptido relacionado con glucagón de la Clase 1, Clase 2 o Clase 3 comprende un grupo amino y un carboxilato. En otras realizaciones, el separador bifuncional hidrófilo unido al péptido relacionado con glucagón de la Clase 1, Clase 2 o Clase 3 comprende un grupo tiol y un carboxilato.

En algunas realizaciones en donde el péptido relacionado con glucagón es un péptido relacionado con glucagón de la Clase 1, Clase 2 o Clase 3, el separador es un separador bifuncional hidrófobo. Los separadores bifuncionales hidrófobos son conocidos en el arte. Véase, por ejemplo, Bioconjugate Techniques, G. T. Hermanson (Academic Press, San Diego, CA, 1996), que se incluye por referencia en su totalidad. En ciertas realizaciones, el separador bifuncional hidrófobo unido al péptido relacionado con glucagón de la Clase 1, Clase 2 o Clase 3 comprende dos o más grupos reactivos, por ejemplo, una amina, un hidroxilo, un tiol, y un grupo carboxilo o cualquier combinación de ellos. En ciertas realizaciones, el separador bifuncional hidrófobo unido al péptido relacionado con glucagón de la Clase 1, Clase 2 o Clase 3 comprende un grupo hidroxilo y un carboxilato. En otras realizaciones, el separador bifuncional hidrófobo unido al péptido relacionado con glucagón de la Clase 1, Clase 2 o Clase 3 comprende un grupo amina y un carboxilato. En otras realizaciones, el separador bifuncional hidrófobo unido al péptido relacionado con glucagon de la Clase 1, Clase 2 o Clase 3 comprende un grupo tiol y un carboxilato. Los separadores bifuncionales hidrófobos adecuados que comprenden un carboxilato y un grupo hidroxilo o un grupo tiol son conocidos en el arte e incluyen, por ejemplo, ácido 8 -hidroxioctanoico y ácido 8-mercaptooctanoico .

En algunas realizaciones, el separador bifuncional unido al péptido relacionado con glucagon de la Clase 1, Clase 2 o Clase 3 no es un ácido dicarboxílico que comprende un metileno no ramificado de 1 a 7 átomos de carbono entre los grupos carboxilato. En algunas realizaciones, el separador bifuncional unido al péptido relacionado con glucagon de la Clase 1, Clase 2 o Clase 3 es un ácido dicarboxílico que comprende un metileno no ramificado de 1-7 átomos de carbono entre los grupos carboxilato.

El separador (por ejemplo, aminoácido, dipéptido, tripéptido, separador bifuncional hidrófilo, o separador bifuncional hidrófobo) en realizaciones especificas, en donde el péptido relacionado con glucagon es un péptido relacionado con glucagon de la Clase 1, Clase 2 o Clase 3, tiene de 3 a 10 átomos (por ejemplo, de 6 a 10 átomos, (por ejemplo, 6, 7, 8, 9, o 10 átomos) de longitud) . En realizaciones más específicas en donde el péptido relacionado con glucagon es un péptido relacionado con glucagon de una Clase 1, Clase 2 o Clase 3, el separador tiene alrededor de 3 a 10 átomos (por ejemplo, de 6 a 10 átomos) de longitud y el grupo acilo es un grupo acilo graso de C12 a C18, por ejemplo, un grupo acilo de C14, un grupo acilo graso de C16, de manera tal que la longitud total del separador y el grupo acilo sea de 14 a 28 átomos, por ejemplo, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, o 28 átomos. En algunas realizaciones, en donde el péptido relacionado con glucagon es un péptido relacionado con glucagon de una Clase 1, Clase 2 o Clase 3 la longitud del separador y el grupo acilo es de 17 a 28 (por ejemplo, de 19 a 26, de 19 a 21) átomos.

De acuerdo con ciertas realizaciones en donde el péptido relacionado con glucagon es un péptido relacionado con glucagon de una Clase 1, Clase 2 o Clase 3, el separador bifuncional puede ser un aminoácido sintético o natural (que incluye, en forma no taxativa, cualquiera de aquellos descritos en la presente) que comprende una cadena principal de aminoácido que tiene de 3 a 10 átomos de longitud (por ejemplo, ácido 6-aminohexanoico, ácido 5-aminovalérico, ácido 7-aminoheptanoico y ácido 8-aminooctanoico) . Alternativamente, el separador unido al péptido relacionado con glucagon de la Clase 1, Clase 2 o Clase 3 puede ser un separador de dipéptido o tripéptido que tiene una cadena principal de péptido que tiene de 3 a 10 átomos (por ejemplo, de 6 a 10 átomos) de longitud. Cada aminoácido del separador de dipéptido o tripeptido unido al peptido relacionado con glucagón de la Clase 1, Clase 2 o Clase 3 puede ser igual o diferente del otro aminoácido (s) del dipéptido o tripéptido y se puede seleccionar independientemente del grupo formado por: aminoácidos naturales y/o no naturales que incluyen, por ejemplo, cualquiera de los isómeros D o L de los aminoácidos naturales (Ala, Cys, Asp, Glu, Phe, Gly, His, lie, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Arg, Ser, Thr, Val, Trp, Tyr) , o cualquier isómero D o L de los aminoácidos no naturales seleccionados del grupo formado por ß-alanina (ß-Ala) , ?-a-metil -alanina (Me-Ala) , ácido aminobutírico (Abu) , ácido ?-aminobutírico (?-Abu) , ácido aminohexanoico (e-Ahx) , ácido aminoisobutirico (Aib) , ácido aminometilpirrol carboxílico, ácido aminopiperidinacarboxílico, aminoserina (Ams) , ácido aminotetrahidropiran-4-carbox£lico, arginina N-metoxi-N-metil amida, ácido ß-aspártico (ß-Asp) , ácido azetidina carboxílico, 3- (2-benzotiazolil) alanina, a-terc-butilglicina, ácido 2-amino-5-ureido-n-valérico (citrulina, Cit) , ß-Ciclohexilalanina (Cha) , acetamidometil-cisteína, ácido diaminobutanoico (Dab) , ácido diaminopropiónico (Dpr) , dihidroxifenilalanina (DOPA) , dimetiltiazolidina (DMTA) , ácido ?-Glutámico (?-Glu) , homoserina (Hse) , hidroxiprolina (Hyp) , isoleucina N-metoxi-N-metil amida, metil-isoleucina (Melle) , ácido isonipecótico (Isn) , metil-leucina (MeLeu) , metil-lisina, dimetil-lisina, trimetil-lisina, metanoprolina, metionina-sulfóxido (Me (0) ) , metionina-sulfona (Met (02) ) , norleucina (Nle) , metil-norleucina (Me-Nle) , norvalina (Nva) , ornitina (Orn) , ácido para-aminobenzoico (PABA) , penicilamina (Pen) , metilfenilalanina (MePhe) , 4 -Clorofenilalanina (Phe(4-Cl)), 4-fluorofenilalanina (Phe(4-F)), 4 -nitrofenilalanina (Phe (4 -N02) ) , 4 -cianofenilalanina ( (Phe (4 -CN) ) , fenilglicina (Phg) , piperidinilalanina, piperidinilglicina, 3 , 4-deshidroprolina, pirrolidinilalanina, sarcosina (Sar) , selenocisteína (Sec) , 0-Bencil-fosfoserina, ácido 4-amino-3-hidroxi-6-metilheptanoico (Sta) , ácido 4-amino-5-ciclohexil-3-hidroxipentanoico (ACHPA) , ácido 4-amino-3-hidroxi-5-fenilpentanoico (AHPPA) , ácido 1,2,3,4, -tetrahidro-isoquinolina-3 -carboxílico (Tic) , tetrahidropiranglicina, tienilalanina (Thi) , 0-bencil-fosfotirosina, 0-fosfotirosina, metoxitirosina, etoxitirosina, 0- (bis-dimetilamino-fosfono) -tirosina, tirosina sulfato tetrabutilamina, metil-valina (MeVal) , ácido alquilado 3-mercaptopropiónico .

En algunas realizaciones en donde el péptido relacionado con glucagón es un péptido relacionado con glucagón de una Clase 1, Clase 2 o Clase 3, el separador comprende una carga negativa general, por ejemplo, comprende uno o dos aminoácidos con carga negativa. En algunas realizaciones en donde el péptido relacionado con glucagón es un péptido relacionado con glucagón de una Clase 1, Clase 2 o Clase 3, el dipéptido no es ninguno de los dipéptidos de la estructura general A-B, en donde A se selecciona del grupo formado por Gly, Gln, Ala, Arg, Asp, Asn, lie, Leu, Val, Phe, y Pro, en donde B se selecciona del grupo formado por Lys, His y Trp. En algunas realizaciones en donde el péptido relacionado con glucagón es un péptido relacionado con glucagón de una Clase 1, Clase 2 o Clase 3, el separador de dipéptido se selecciona del grupo formado por: Ala-Ala, ß-Ala- ß-Ala, Leu-Leu, Pro-Pro, ácido ?-aminobutírico- ácido ?-aminobutírico, y ?-Glu- ?-Glu.

En algunas realizaciones de la invención en donde el péptido relacionado con glucagón es un péptido relacionado con glucagón de una Clase 1, Clase 2 o Clase 3, el péptido relacionado con glucagón se modifica para comprender un grupo acilo mediante la acilación de un alcano de cadena larga por el péptido relacionado con glucagón. En aspectos específicos en donde el péptido relacionado con glucagón es un péptido relacionado con glucagón de una Clase 1, Clase 2, o Clase 3, el alcano de cadena larga comprende un grupo amina, hidroxilo o tiol (por ejemplo, octadecilamina, tetradecanol , y hexadecanotiol) que reacciona con un grupo carboxilo, o una forma activada de él, del péptido relacionado con glucagon. El grupo carboxilo o la forma activada de él, del péptido relacionado con glucagon de la Clase 1, Clase 2 o Clase 3 puede formar parte de una cadena lateral de un aminoácido (por ejemplo, ácido glutámico, ácido aspártico) del péptido relacionado con glucagon o puede formar parte de la cadena principal de péptido.

En ciertas realizaciones, el péptido relacionado con glucagon de la Clase 1, Clase 2 o Clase 3 se modifica para comprender un grupo acilo mediante la acilación de un alcano de cadena larga por un separador que está unido al péptido de glucagon. En aspectos específicos, el alcano de cadena larga comprende un grupo amina, hidroxilo, o tiol que reacciona con un grupo carboxilo, o una forma activada de él, del separador. Los separadores adecuados que comprenden un grupo carboxilo, o una forma activada de él, se describen en la presente e incluyen, por ejemplo, separadores bifuncionales, por ejemplo, aminoácidos, dipéptidos, tripéptidos, separadores bifuncionales hidrófilos y separadores bifuncionales hidrófobos.

Como se utiliza en la presente, el término "forma activada de un grupo carboxilo" se refiere a un grupo carboxilo con la fórmula general R(C=0)X, en donde X es un grupo saliente y R es un péptido relacionado con glucagon o el separador. Por ejemplo, las formas activadas de grupos carboxilo pueden incluir, en forma no taxativa, cloruros de acilo, anhídridos, y ésteres. En algunas realizaciones, el grupo carboxilo activado es un éster con un grupo saliente N-hidroxisuccinimida (NHS) .

Con respecto a estos aspectos de la invención, en donde un alcano de cadena larga se acila con un péptido relacionado con glucagon de la Clase 1, Clase 2, o Clase 3, el alcano de cadena larga puede ser de cualquier tamaño y puede comprender cualquier longitud de cadena de carbono. El alcano de cadena larga puede ser lineal o ramificado. En ciertos aspectos en donde el péptido relacionado con glucagon es un péptido relacionado con glucagon de una Clase 1, Clase 2 o Clase 3, el alcano de cadena larga es un alcano de C4 a C30. Por ejemplo, el alcano de cadena larga puede ser cualquiera de un alcano de C4, alcano de C8 , alcano de CIO, alcano de C12, alcano de C14, alcano de C16, alcano de C18, alcano de C20, alcano de C22, alcano de C24, alcano de C26, alcano de C28 o alcano de C30. En algunas realizaciones en donde el péptido relacionado con glucagon es un péptido relacionado con glucagon de una Clase 1, Clase 2 o Clase 3, el alcano de cadena larga comprende un alcano de C8 a C20, por ejemplo, un alcano de C14, alcano de C16 o un alcano de C18.

Además, en algunas realizaciones en donde el péptido relacionado con glucagon es un péptido relacionado con glucagon de una Clase 1, Clase 2 o Clase 3, un grupo amina, hidroxilo, o tiol del péptido relacionado con glucagon se acila con un ácido de colesterol. En una realización específica, el péptido relacionado con glucagon de la Clase 1, Clase 2 o Clase 3 está unido al ácido de colesterol a través de un separador de des-amino Cys alquilado, es decir un separador de ácido 3 -mercaptoproiónico alquilado .

Los métodos adecuados de acilación de péptidos a través de aminas, hidroxilos, y tioles son conocidos en el arte. Véase, por ejemplo, Miller, Biochem Biophys Res Commun 218: 377-382 (1996); Shimohigashi y Stammer, Int J Pept Protein Res 19: 54-62 (1982); y Previero et al., Biochim Biophys Acta 263: 7-13 (1972) (para métodos de acilación a través de hidroxilo) ; y San y Silvius, J Pept Res 66: 169-180 (2005) (para métodos de acilación a través de tiol); Bioconjugate Chem. "Chemical Modifications of Proteins: History and Applications" páginas 1, 2-12 (1990) ; Hashimoto et al., Pharmacuetical Res. "Synthesis of Palmitoyl Derivatives of Insulin and their Biological Activity" Vol . 6, No: 2 pp.171-176 (1989) El grupo acilo del péptido relacionado con glucagón acilado puede ser de cualquier tamaño, por ejemplo, una cadena de carbono de cualquier longitud y puede ser lineal o ramificado. En algunas realizaciones específicas de la invención, el grupo acilo es un ácido graso de C4 a C30. Por ejemplo, el grupo acilo puede ser cualquiera de un ácido graso de C4 , ácido graso de C6 , ácido graso de C8, ácido graso de CIO, ácido graso de C12, ácido graso de C1 , ácido graso de C16, ácido graso de C18, ácido graso de C20, ácido graso de C22, ácido graso de C24, ácido graso de C26, ácido graso de C28, o un ácido graso de C30. En algunas realizaciones, el grupo acilo es un ácido cjraso de C8 a C20, por ejemplo, un ácido graso de C14 o un ácido graso de C16.

En una realización alternativa, el grupo acilo es un ácido biliar. El ácido biliar puede ser cualquier ácido biliar adecuado, que incluye, en forma no taxativa, ácido cólico, ácido quenodesoxicólico, ácido desoxicólico, ácido litocólico, ácido taurocólico, ácido glicocolico y ácido de colesterol.

Los péptidos relacionados con glucagón acilados descritos en la presente se pueden modificar adicionalmente para comprender un grupo hidrófilo. En algunas realizaciones específicas el grupo hidrófilo puede comprender una cadena de polietilenglicol (PEG) . La incorporación de un grupo hidrófilo puede realizarse a través de cualquier medio adecuado, tal como cualquiera de los métodos descritos en la presente. Al respecto, el péptido relacionado con el glucagon acilado puede comprender SEQ ID NO: 701, que incluye cualquiera de las modificaciones descritas en la presente, en donde por lo menos uno de los aminoácidos en la posición 10, 20, 24 y 29 (de acuerdo con la numeración de aminoácido del glucagon de tipo silvestre) comprenden un grupo acilo y por lo menos uno de los aminoácidos en la posición 16, 17, 21, 24 o 29 (de acuerdo con la numeración de aminoácido del glucagon de tipo silvestre) , una posición dentro de una prolongación del extremo de C, el aminoácido del extremo de C se modifican a Cys, Lys, Orn, homo-Cys, o Ac-Phe y la cadena lateral del aminoácido está unida en forma covalente a un grupo hidrófilo (por ejemplo, PEG) . En algunas realizaciones, el grupo acilo se une a la posición 10 (de acuerdo con la numeración de aminoácido del glucagon de tipo silvetre) , opcionalmente a través de un separador que comprende Cys, Lys, Orn, homo-Cys, o Ac-Phe, y el grupo hidrófilo se incorpora en un residuo de Cys en la posición 24.

Alternativamente, el péptido relacionado con glucagon acilado puede comprender un separador, en donde el separador se acila y se modifica para comprender el grupo hidrófilo. Ejemplos no taxativos de los separadores adecuados incluyen un separador que comprende uno o más aminoácidos seleccionados del grupo formado por Cys, Lys, Orn, homo-Cys y Ac-Phe.

Alquilación De acuerdo con algunas realizaciones, el péptido relacionado con glucagón, por ejemplo, un péptido relacionado con glucagón de la Clase 1, péptido relacionado con glucagón de la Clase 2, péptido relacionado con glucagón de la Clase 3, péptido relacionado con glucagón de la Clase 4 o péptido relacionado con glucagón de la Clase 5, se modifica para comprender un grupo alquilo que se une al péptido relacionado con glucagón a través de una ligadura de éter, tioéter o amino con los fines de prolongar la semivida en la circulación y/o retardar el inicio y/o prolongar la duración de acción y/o mejorar la resistencia a las proteasas tales como DPP-IV. En ejemplos de realizaciones en donde el péptido relacionado con glucagón es un péptido relacionado con glucagón de una Clase 1, Clase 2, o Clase 3, el péptido relacionado con glucagón comprende un grupo alquilo que es un aminoácido no nativo a natural.

La alquilación se puede realizar en cualquier posición dentro del péptido relacionado con glucagón, que incluye cualquiera de las posiciones 1-29, una posición dentro de una prolongación del extremo de C, o el aminoácido del extremo de C, siempre que se retenga una actividad de agonista o antagonista del péptido relacionado con glucagon con respecto a GLP-1 u otro receptor de péptido relacionado con glucagon. En algunas realizaciones, si el péptido no alquilado tiene actividad de agonista de glucagon, entonces se retiene el péptido alquilado retiene la actividad de agonista de glucagon. En otras realizaciones, si el péptido no alquilado tiene actividad de antagonista de glucagon, entonces el péptido alquilado retiene actividad de antagonista. En algunas realizaciones, si el péptido no alquilado tiene actividad de agonista de GLP-1, entonces el péptido alquilado retiene actividad de agonista de GLP-1. Ejemplos no taxativos incluyen la alquilación en las posiciones 5, 7, 10, 11, 12, 13, 14, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 24, 27, 28 o 29 (de acuerdo con la numeración de aminoácido del glucagon de tipo silvestre) . Con respecto al péptido relacionado con glucagon de la Clase 1, Clase 2 y Clase 3, la alquilación puede ocurrir en las posiciones 5, 7, 10, 11, 12, 13, 14, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 24, 27, 28, 29, 30, 37, 38, 39, 40, 41, 42, o 43 (de acuerdo con la numeración de aminoácido del glucagon de tipo silvestre) . El grupo alquilo se puede unir en forma covalente directamente a un aminoácido del péptido relacionado con glucagon, o indirectamente a un aminoácido del péptido relacionado con glucagon a través de un separador, en donde el separador está posicionado entre el aminoácido del péptido relacionado con glucagon y el grupo alquilo. Los péptidos relacionados con glucagón se pueden alquilar en la misma posición de aminoácido donde está unido un grupo hidrófilo, o en una posición de aminoácido diferente. Ejemplos no taxativos incluyen la alquilacion en la posición 10 (de acuerdo con la numeración de aminoácido del glucagón de tipo silvestre) y la pegilación en una o más posiciones en la parte del extremo de C del péptido relacionado con glucagón, por ejemplo la posición 24, 28 o 29 (de acuerdo con la numeración de aminoácido del glucagón de tipo silvestre) , dentro de una prolongación del extremo de C, o en el extremo de C (por ejemplo, a través del agregado de Cys del extremo de C) .

En un aspecto específico de la invención, el péptido relacionado con glucagón se modifica para comprender un grupo alquilo mediante la alquilacion directa de una amina, hidroxilo o tiol de una cadena lateral de un aminoácido del péptido relacionado con glucagón. En algunas realizaciones, el péptido relacionado con glucagón se alquila directamente a través de la amina de cadena lateral, hidroxilo o tiol de un aminoácido. En algunas realizaciones, la alquilacion está en una posición 10, 20, 24, o 29 (de acuerdo con la numeración de aminoácido del glucagón de tipo silvestre) . Al respecto, el péptido relacionado con glucagón alquilado puede comprender la secuencia de aminoácido de SEQ ID NO: 701, o una secuencia de aminoácido de él que comprende una o más de las modificaciones de aminoácido descritas en la presente, con por lo menos uno de los aminoácidos en las posiciones 10, 20, 24 y 29 (de acuerdo con la numeración de aminoácido del glucagón de tipo silvestre) modificado en cualquier aminoácido que comprende una amina de cadena lateral, hidroxilo o tiol . En algunas realizaciones específicas de la invención, la alquilación directa del péptido relacionado con glucagón ocurre a través de la amina de cadena lateral, hidroxilo o tiol del aminoácido en la posición 10 (de acuerdo con la numeración de aminoácido del glucagón de tipo silvestre) .

En algunas realizaciones, el aminoácido que comprende una amina de cadena lateral es un aminoácido de la Fórmula I . En algunos ejemplos de realizaciones, el aminoácido de la Fórmula I, es el aminoácido en donde n es 4 (Lys) o n es 3 (Orn) .

En otras realizaciones, el aminoácido que comprende un hidroxilo de cadena lateral es un aminoácido de la Fórmula II. En algunos ejemplos de realizaciones, el aminoácido de la Fórmula II es un aminoácido en donde n es 1 (Ser) .

En aún otras realizaciones, el aminoácido que comprende un tiol de cadena lateral es un aminoácido de la Fórmula III. En algunos ejemplos de realizaciones, el aminoácido de la Fórmula II es el aminoácido en donde n es 1 (Cys) En aún otras realizaciones, en donde el péptido relacionado con glucagón es un péptido relacionado con glucagón de la Clase 1, Clase 2 o Clase 3, el aminoácido que comprende una amina de cadena lateral, hidroxilo o tiol es un aminoácido disustituido que comprende la misma estructura de la Fórmula I, la Fórmula II o la Fórmula III, excepto que el hidrógeno unido al carbono alfa del aminoácido de la Fórmula I, la Fórmula II o la Fórmula III se reemplaza con una segunda cadena lateral .

En algunas realizaciones de la invención, el péptido relacionado con glucagón alquilado comprende un separador entre el péptido y el grupo alquilo. En algunas realizaciones, el péptido relacionado con glucagón está unido en forma covalente al separador, que está unido en forma covalente al grupo alquilo. En algunos ejemplos de realizaciones, el péptido relacionado con glucagón se modifica para comprender un grupo alquilo mediante la alquilación de una amina, hidroxilo o tiol de un separador, cuyo separador está unido a una cadena lateral de un aminoácido en la posición 10, 20, 24 o 29 (de acuerdo con la numeración de aminoácido del glucagón de tipo silvestre) del péptido relacionado con glucagón. El aminoácido al cual se une el separador puede ser cualquier aminoácido que comprende un grupo que permite la unión al separador. Con respecto a los péptidos relacionados con glucagón de la Clase 1, Clase 2 o Clase 3, el aminoácido al cual se une el separador puede ser cualquier aminoácido (por ejemplo, un aminoácido a-sustituido simple o un aminoácido a, a-disustituido) que comprende un grupo que permite la unión al separador. Por ejemplo, un aminoácido que comprende una cadena lateral -NH2, -OH, o -COOH (por ejemplo, Lys, Orn, Ser, Asp, o Glu) es adecuado. Al respecto, el péptido relacionado con glucagón alquilado puede comprender la secuencia de aminoácido de SEQ ID NO: 701, o una secuencia de aminoácido modificada de él que comprende una o más modificaciones de aminoácido descritas en la presente, con por lo menos uno de los aminoácidos en las posiciones 10, 20, 24 y 29 (de acuerdo con la numeración de aminoácido del glucagón de tipo silvestre) modificado en cualquier aminoácido que comprende una amina de cadena lateral, hidroxilo o carboxilato.

En algunas realizaciones, el separador es un aminoácido que comprende una amina de cadena lateral, hidroxilo o tiol o un dipéptido o tripéptido que comprende un aminoácido que comprende una amina de cadena lateral, hidroxilo o tiol. En algunas realizaciones, el separador de aminoácido no es ?-Glu. En algunas realizaciones, el separador de dipéptido no es ?-Glu- ?-Glu.

Cuando la alquilacion ocurre a través de un grupo amina del aminoácido del separador la alquilacion puede ocurrir a través de la alfa amina del aminoácido o una amina de cadena lateral. En el caso de que la alfa amina se alquile, el aminoácido de separador puede ser cualquier aminoácido. Por ejemplo, el aminoácido de separador puede ser un aminoácido hidrófobo, por ejemplo, Gly, Ala, Val, Leu, lie, Trp, Met, Phe, Tyr. Alternativamente, el aminoácido de separador puede ser un residuo ácido, por ejemplo, Asp y Glu. En ejemplos de realizaciones en donde el péptido relacionado con glucagón es un péptido relacionado con glucagón de una Clase 1, Clase 2 o Clase 3, el aminoácido de separador puede ser un aminoácido hidrófobo, por ejemplo, Gly, Ala, Val, Leu, lie, Trp, Met, Phe, Tyr, ácido 6-amino hexanoico, ácido 5-aminovalérico, ácido 7-aminoheptanoico, ácido 8-aminooctanoico . Alternativamente, el aminoácido de separador unido al péptido relacionado con glucagón de la Clase 1, Clase 2 o Clase 3 puede ser un residuo ácido, por ejemplo, Asp o Glu, siempre que la alquilacion ocurra sobre la alfa amina del residuo ácido. En el caso de que la amina de cadena lateral del aminoácido de separador se alquile, el aminoácido de separador es un aminoácido que comprende una amina de cadena lateral, por ejemplo, un aminoácido de la Fórmula I (por ejemplo, Lys u Orn) . En este caso, es posible que tanto la alfa amina como la amina de cadena lateral del aminoácido de separador se alquilen, de manera tal que el péptido de glucagón se dialquile. Las realizaciones de la invención incluyen dichas moléculas dialquiladas.

Cuando la alquilación ocurre a través de un grupo hidroxilo del aminoácido del separador, el aminoácido o uno de los aminoácidos del separador puede ser un aminoácido de la Fórmula II. En un ejemplo de realización específico, el aminoácido es Ser.

Cuando la alquilación ocurre a través de un grupo tiol del aminoácido del separador, el aminoácido o uno de los aminoácidos del separador puede ser un aminoácido de la Fórmula III. En un ejemplo de realización específico, el aminoácido es Cys .

En algunas realizaciones, el separador comprende un separador bidireccional hidrófilo. En una realización específica, el separador comprende un amino poli (alquiloxi) carboxilato . Al respecto, el separador puede comprender, por ejemplo, NH2 (CH2CH20) n (CH2) mCOOH, en donde m es cualquier número entero de 1 a 6 y n es cualquier número entero de 2 a 12, tal como, por ejemplo, ácido 8-amino-3 , 6-dioxaoctanoico, que está comercialmente disponible de Peptides International, Inc. (Louisville, Kentucky) .

En algunas realizaciones en donde el péptido relacionado con glucagón es un péptido relacionado con glucagón de una Clase 1, Clase 2 o Clase 3, el separador es un separador bifuncional hidrófilo. En ciertas realizaciones, el separador bifuncional hidrófilo unido al péptido relacionado con glucagón de la Clase 1, Clase 2 o Clase 3 comprende dos o más grupos reactivos, por ejemplo, un grupo amina, un hidroxilo, un tiol y un carboxilo o cualquier combinación de ellos. En ciertas realizaciones, el separador bifuncional hidrófilo unido al péptido relacionado con glucagón de la Clase 1, Clase 2 o Clase 3 comprende un grupo hidroxilo y un carboxilato. En otras realizaciones, el separador bifuncional hidrófilo unido al péptido relacionado con glucagón de la Clase 1, Clase 2 o Clase 3 comprende un grupo amina y un carboxilato. En otras realizaciones, el separador bifuncional hidrófilo unido al péptido relacionado con glucagón de la Clase 1, Clase 2 o Clase 3 comprende un grupo tiol y un carboxilato.

En algunas realizaciones, el separador unido al péptido relacionado con glucagón de la Clase 1, Clase 2 o Clase 3 es un separador bifuncional hidrófobo. En ciertas realizaciones, el separador bifuncional hidrófobo unido al péptido relacionado con glucagón de la Clase 1, Clase 2 o Clase 3, comprende dos o más grupos reactivos, por ejemplo, un grupo amina, un hidroxilo, un tiol y carboxilo o cualquier combinación de ellos. En ciertas realizaciones, el separador bifuncional hidrófobo unido al peptido relacionado con glucagón de la Clase 1, Clase 2 o Clase 3 comprende un grupo hidroxilo y un carboxilato. En otras realizaciones, el separador bifuncional hidrófilo unido al péptido relacionado con glucagón de la Clase 1, Clase 2 o Clase 3 comprende un grupo amina y un carboxilato. En otras realizaciones, el separador bifuncional hidrófilo unido al péptido relacionado con glucagón de la Clase 1, Clase 2 o Clase 3 comprende un grupo tiol y un carboxilato. Los separadores bifuncionales hidrófilos adecuados que comprenden un grupo carboxilato y un grupo hidroxilo o un grupo tiol son conocidos en el arte e incluyen, por ejemplo, ácido 8-hidroxioctanoico y'ácido 8 -mercatpooctanoico .

El separador (por ejemplo, aminoácido, dipéptido, tripéptido, separador bifuncional hidrófilo, o separador bifuncional hidrófobo) en realizaciones específicas en las cuales el péptido relacionado con glucagón es un péptido relacionado con glucagón de la Clase 1, Clase 2 o Clase 3 que tiene de 3 a 10 átomos (por ejemplo de 6 a 10 átomos (por ejemplo, 6, 7, 8, 9 o 10 átomos) de longitud) . En realizaciones más específicas, el separador unido al péptido relacionado con glucagón de la Clase 1, de la Clase 2 o de la Clase 3 tiene de 3 a 10 átomos (por ejemplo, de 6 a 10 átomos) de longitud y el alquilo es un grupo alquilo de C12 a C18, por ejemplo grupo alquilo de C14, grupo alquilo de C16, de manera tal que la longitud total del separador y el grupo alquilo sea de 14 a 28 átomos, por ejemplo, de aproximadamente 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26 27 O 28 átomos. En _ algunas realizaciones en donde el péptido relacionado con 5 glucagón es un péptido relacionado con glucagón de la Clase 1, Clase 2 o Clase 3, la longitud del separador y el alquilo es de 17 a 28 (por ejemplo, de 19 a 26, de 19 a 21)) átomos.

De acuerdo con ciertas realizaciones precedentes en donde el péptido relacionado con glucagón es un péptido relacionado con glucagón de una Clase 1, Clase 2 o Clase 3, el separador bifuncional puede ser un aminoácido sintético o no natural que comprende una cadena principal de aminoácido que tiene de 3 a 10 ?5 átomos de longitud (por ejemplo, ácido 6-amino hexanoico, ácido 5-aminovalérico, ácido 7-aminoheptanoico, y ácido 8- aminooctanoico) . Alternativamente, el separador unido al péptido relacionado con glucagón de la Clase 1, Clase 2 o Clase 3 puede ser un separador de dipéptido o tripéptido que tiene una cadena 20 principal de péptido que tiene de 3 a 10 átomos (por ejemplo, de 6 a 10 átomos) de longitud. El separador de dipéptido o tripéptido unido al péptido relacionado con glucagón de la Clase 1, Clase 2 o Clase 3 puede estar comp!iesto por aminoácidos naturales y/o no naturales, que incluyen, por ejemplo, cualquiera de los aminoácidos enseñados en la presente. En algunas realizaciones en donde el péptido relacionado con glucagón es un péptido relacionado con glucagón de la Clase 1, Clase 2 o Clase 3, el separador comprende una carga negativa general, por ejemplo comprende uno o dos aminoácidos con carga negativa. En algunas realizaciones en donde el péptido relacionado con glucagón es un péptido relacionado con glucagón de la Clase 1, Clase 2 o~ Clase 3, el separador de dipéptido se selecciona del grupo formado por Ala-Ala, ß-Ala- ß-Ala, Leu-Leu, Pro-Pro, ácido ?-aminobutírico-ácido ?-aminobutírico, y ?-Glu- ?-Glu. En algunas realizaciones, el separador de dipéptido no es ?-Glu- ?-Glu.

Los métodos adecuados de alquilación de péptidos a través de aminas, hidroxilos y tioles son conocidos en el arte. Por ejemplo, una síntesis de éter de Williamson se puede usar para formar una ligadura de éter entre el péptido relacionado con glucagón y el grupo alquilo. Además, una reacción de sustitución nucleofila del péptido con un haluro de alquilo puede derivar en cualquiera de una ligadura de éter, tioéter o amino.

El grupo alquilo del péptido relacionado con glucagón alquilado puede ser de cualquier tamaño, por ejemplo, cualquier longitud de cadena de carbono, y puede ser lineal o ramificado. En algunas realizaciones de la invención, el grupo alquilo es un alquilo de C4 a C30. Por ejemplo, el grupo alquilo puede ser cualquiera de un alquilo de C4, alquilo de C6, alquilo de C8, alquilo de CIO, alquilo de C12, alquilo de C14, alquilo de C16, alquilo de C18, alquilo de C20, alquilo de C22, alquilo de C24, alquilo de C26, alquilo de C28, o alquilo de C30. En algunas realizaciones, el grupo alquilo es un alquilo de C8 a C20, por ejemplo un alquilo de C14 o un alquilo de C16.

En algunas realizaciones específicas, el grupo alquilo comprende un grupo esteroide de un ácido biliar, por ejemplo ácido cólico, ácido quenodesoxicólico, ácido desoxicólico, ácido litocólico, ácido taurocólico, ácido glicocolico y ácido de colesterol.

En algunas realizaciones de la invención en donde el péptido relacionado con glucagón es un péptido relacionado con glucagón de la Clase 1, Clase 2 o Clase 3, el péptido relacionado con glucagón se modifica para comprender un grupo alquilo mediante la reacción de un alcano nucleófilo, de cadena larga con el péptido relacionado con glucagón, en donde el péptido relacionado con glucagón comprende un grupo saliente adecuado para la sustitución nucleófila. En aspectos específicos en donde el péptido relacionado con glucagón es un péptido relacionado con glucagón de la Clase 1, Clase 2 o Clase 3, el grupo nucleófilo del alcano de cadena larga comprende un grupo amina, hidroxilo, o tiol (por ejemplo, octadecilamina, tetradecanol , y hexadecanotiol) . El grupo saliente del péptido relacionado con glucagón de la clase 1, clase 2, o clase 3 puede ser parte de una cadena lateral de un aminoácido o puede ser parte de la cadena principal de péptido. Los grupos salientes adecuados incluyen por ejemplo, N-hidroxisuccinimida, halógenos y esteres de sulfonato.

En ciertas realizaciones, el péptido relacionado con glucagón de la clase 1, clase 2 o clase 3 se modifica para comprender un grupo alquilo mediante la reacción del alcano nucleófilo de cadena larga con un separador que se une al péptido relacionado con glucagón, en donde el separador comprende el grupo saliente. En aspectos específicos en donde el péptido relacionado con glucagón es un péptido relacionado con glucagón de clase 1, clase 2 o clase 3, el alcano de cadena larga comprende un grupo amina, hidroxilo o tiol. En ciertas realizaciones, en donde el péptido relacionado con glucagón es un péptido relacionado con glucagón de una clase 1, clase 2 o clase 3, el separador que comprende el grupo saliente puede ser cualquier separador descrito en la presente, por ejemplo, aminoácidos, dipéptidos, tripéptidos, separadores bifuncionales hidrófilos, y separadores bifuncionales hidrófobos que también comprenden un grupo saliente adecuado .

Con respecto a aquellos aspectos de la invención en donde el péptido relacionado con glucagón es un péptido relacionado con glucagón de la clase 1, clase 2 o clase 3 y en donde el alcano de cadena larga se alquila con el péptido relacionado con glucagón o el separador, el alcano de cadena larga puede ser de cualquier tamaño y puede comprender cualquier longitud de la cadena de carbono. El alcano de cadena larga puede ser lineal o ramificado. En ciertos aspectos, el alcano de cadena larga es un alcano de C4 a C30. Por ejemplo, el alcano de cadena larga puede ser cualquiera de un alcano de C4 , alcano de C6, alcano de C8, alcano de 10, alcano de C12, alcano de C14, alcano de C16, alcano de C18, alcano de C20, alcano de C22, alcano de C24, alcano de C26, alcano de C28 , o un alcano de C30. En algunas realizaciones en donde el péptido relacionado con glucagón es un péptido relacionado con glucagón de la clase 1, clase 2 o clase 3, el alcano de cadena larga comprende un alcano de C8 a C20, por ejemplo, un alcano de C14, alcano de C16 o un alcano de C18.

Además, en algunas realizaciones en donde el péptido relacionado con glucagón es un péptido relacionado con glucagón de la clase 1, clase 2 o clase 3, la alquilación puede ocurrir entre el péptido relacionado con glucagón y un grupo colesterol . Por ejemplo, el grupo hidroxilo del colesterol puede desplazar un grupo saliente sobre el alcano de cadena larga para formar un producto péptido de glucagon de colesterol.

Los péptidos relacionados con glucagon alquilados descritos en la presente pueden modificarse adicionalmente para comprender un grupo hidrófilo. En algunas realizaciones específicas el grupo hidrófilo puede comprender una cadena de polietilenglicol (PEG) . La incorporación de un grupo hidrófilo se puede realizar a través de cualquier medio adecuado, tal como cualquiera de los métodos descritos en la presente. Al respecto, el péptido relacionado con glucagon alquilado puede comprender SEQ ID NO: 701, o una secuencia modificada de ella que comprende una o más modificaciones de aminoácido descritas en la presente, en donde por lo menos uno de los aminoácidos en la posición 10, 20, 24 y 29 (de acuerdo con la numeración de aminoácido del glucagon de tipo silvestre) comprenden un grupo alquilo y por lo menos uno de los aminoácidos en la posición 16, 17, 21, 24 y 29, una posición dentro de la prolongación del extremo de C o el aminoácido del extremo de C se modifican a una Cys, Lys, Orn, homo-Cys, o Ac-Phe, y la cadena lateral del aminoácido se une en forma covalente a un grupo hidrófilo (por ejemplo, PEG) . En algunas realizaciones, el grupo alquilo se une a la posición 10 (de acuerdo con la numeración de aminoácido de glucagon de tipo silvestre) , opcionalmente a través de un separador que comprende Cys, Lys, homo-Cys, o Ac-Phe, y el grupo hidrófilo se incorpora en un residuo de Cys en la posición 24.

Alternativamente, el péptido relacionado con glucagón alquilado puede comprender un separador, en donde el separador se alquila y se modifica para comprender el grupo hidrófilo. Ejemplos no taxativos de separadores adecuados incluyen un separador que comprende uno o más aminoácidos seleccionados del grupo formado por Cys, Lys, Orn, homo-Cys y Ac-Phe.

Estabilización de la Estructura de Alfa-Hélice En algunas realizaciones, se forma un puente intramolecular entre dos cadenas laterales de aminoácidos para estabilizar la estructura tridimensional de la parte del extremo de carboxi (por ejemplo, los aminoácidos 12-29 (de acuerdo con la numeración de aminoácido del glucagón de tipo silvestre) ) del péptido relacionado con glucagón. Las dos cadenas laterales de aminoácido se pueden unir una a otra a través de enlace de hidrógeno, interacciones iónicas, tales como la formación de puentes de sal, o con enlaces covalentes .

En algunas realizaciones, el puente intramolecular se forma entre dos aminoácidos que están separados por 3 aminoácidos, por ejemplo, los aminoácidos en las posiciones i e i+4, en donde i es cualquier número entero entre 12 y 25 (por ejemplo, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, y 25) de acuerdo con la numeración de aminoácido del glucagón de tipo silvestre. Más específicamente, las cadenas laterales de los pares de aminoácidos 12 y 16, 16 y 20, 20 y 24, o 24 y 28 (pares de aminoácidos en donde i = 12, 16, 20 o 24) de acuerdo con la numeración de aminoácido del glucagón de tipo silvestre se unen uno a otro y por lo tanto estabilizan la alfa hélice de glucagón. Alternativamente, i puede ser 17.

En algunas realizaciones específicas, en donde los aminoácidos en las posiciones i e i+4 están unidos por un puente intramolecular, el tamaño del puente del conector es de alrededor de 8 átomos, o de aproximadamente 7-9 átomos.

En otras realizaciones, el puente intramolecular se forma entre dos aminoácidos que están separados por dos aminoácidos, por ejemplo los aminoácidos en las posiciones j y j +3 , en donde j es cualquier número entero entre 12 y 26 (por ejemplo, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, y 26) de acuerdo con la numeración de aminoácido del glucagón de tipo silvestre. En algunas realizaciones específicas, j es 17.

En algunas realizaciones específicas, en donde los aminoácidos en las posiciones j y j+3 están unidos por un puente intramolecular, el tamaño del conector es de alrededor de 6 átomos, o de aproximadamente 5 a 7 átomos .

En aún otras realizaciones, el puente intramolecular se forma entre dos aminoácidos que están separados a 6 aminoácidos, por ejemplo, aminoácidos en las posiciones k y k+7, en donde k es cualquier número entero entre 12 y 22 (por ejemplo, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, y 22) de acuerdo con la numeración de aminoácido del glucagón de tipo silvestre. En algunas realizaciones específicas, k es 12 , 13 o 17. En un ejemplo de realización k es 17.

Ejemplos de pares de aminoácidos que son capaces del enlace covalente para formar un puente de unión de 6 átomos incluyen Orn y Asp, Glu y un aminoácido de la Fórmula I, en donde n es 2 y ácido homoglutámico y un aminoácido de la Fórmula I, en donde, n es 1, en donde la Fórmula I es: en donde n = 1 a 4 [Fórmula I] Ejemplos de pares de aminoácidos que son capaces de enlace covalente para formar un puente de unión de siete átomos incluyen Orn-Glu (anillo de lactama) , Lys-Asp (lactama) ; u Homoser-Homoglu (lactona) . Ejemplos de aminoácidos que pueden formar un conector de ocho átomos incluyen Lys-Glu (lactama) ; Homolys-Asp (lactama) ; Orn-Homoglu (lactama) ; 4-aminoPhe-Asp (lactama) ; o Tyr-Asp (lactona) . Ejemplos de pares de aminoácidos que pueden formar un conector de nueve átomos incluyen Homolys-Glu (lactama) ; Lys- Homoglu (lactama) ; 4 -aminoPhe-Glu (lactama) ,- o Tyr-Glu (lactona) . Cualquiera de las cadenas laterales sobre estos aminoácidos puede sustituirse adicionalmente con grupos químicos adicionales, siempre que la estructura tridimensional de la alfa-hélice no se interrumpa. Un experto en el arte puede imaginar pares alternativos o análogos de aminoácidos alternativos, que incluyen derivados modificados químicamente, que crearían una estructura estabilizadora de un tamaño similar y con un efecto deseado. Por ejemplo, un puente de homocisteína-disulfuro de homocisteína tiene 6 átomos de longitud y puede modificarse adicionalmente para proporcionar el efecto deseado. Aún sin la ligadura covalente, los pares de aminoácidos descritos anteriormente o pares similares que un experto en el arte puede imaginar también pueden proporcionar estabilidad agregada a la alfa-hélice a través de enlaces no covalentes, a través de la formación de puentes de sal o interacciones de enlace de hidrógeno.

El tamaño de un anillo de lactama puede variar según la longitud de las cadenas laterales de aminoácido y en algunas realizaciones la lactama se forma uniendo las cadenas laterales de un aminoácido de lisina a una cadena de ácido glutámico. Otros ejemplos de realizaciones (de acuerdo con la numeración de aminoácido del glucagón de tipo silvestre) incluyen los siguientes pares, opcionalmente con un puente de lactama: Glu en la posición 12 con Lys en la posición 16, Lys nativa en la posición 12 con Glu en la posición 16; Glu en la posición 16 con Lys en la posición 20; Lys en la posición 16 con Glu en la posición 20; Glu en la posición 20 con Lys en la posición 24; Lys en la posición 20 con Glu en la posición 24; Glu en la posición 24 con Lys en la posición 28; Lys en la posición 24 con Glu en la posición 28. Alternativamente, el orden del enlace de amida en el anillo de lactama se puede invertir (por ejemplo, se puede formar un anillo de lactama entre las cadenas laterales de un Lysl2 y un Glul6 o alternativamente entre un Glu 12 y un Lysl6) .

Los puentes intramoleculares diferentes de un puente de lactama se pueden usar para estabilizar la alfa hélice de los péptidos relacionados con glucagón. En algunas realizaciones, el puente intramolecular es un puente hidrófobo. En este caso, el puente intramolecular opcionalmente es entre las cadenas laterales de los dos aminoácidos que forman parte de la superficie hidrófoba de la alfa hélice del péptido relacionado con glucagón. Por ejemplo, uno de los aminoácidos unidos por el puente hidrófobo pueden ser el aminoácido en la posición 10, 14 y 18 (de acuerdo con la numeración de aminoácido del glucagón de tipo silvestre) .

En un aspecto específico, la metátesis de olefina se usa para entrecruzar uno o dos giros de la alfa hélice del péptido relacionado con glucagón usando un sistema de entrecruzamiento de todos hidrocarburos. El péptido relacionado con glucagón en este caso puede comprender aminoácidos a-metilados que transportan cadenas laterales de olefina de longitud variable y configurados con la estereoquímica de R o S en las posiciones i e i+4 o i+7. Por ejemplo, la cadena lateral de olefina puede comprender (CH2)n, en donde n es cualquier número entero de 1 a 6. En algunas realizaciones, n es 3 para una longitud entrecruzada de 8 átomos. Los métodos adecuados para formar dichos puentes intramoleculares se describen en el arte. Véase, por ejemplo, Schafmeister et al., J. Am. Chem. Soc. 122: 5891-5892 (2000) y alensky et al., Science 305: 1466-1470 (2004) . Alternativamente, el péptido de glucagón puede comprender residuos de 0-alil Ser ubicados sobre giros de hélice adyacentes, que forman puentes juntos a través de la metátesis de cierre del anillo catalizado por rutenio. Dichos procedimientos de entrecruzamiento se describen, por ejemplo, en Blackwell et al., Angew, Chem., Int. Ed. 37: 3281-3284 (1998) .

En otro aspecto específico, el uso del aminoácido de tio-dialanina no natural, lantionina, que se ha adoptado ampliamente como peptidomimético de cistina, se usa para entrecruzar un giro de la alfa hélice. Los métodos adecuados de la ciclación basada en lantionina son conocidos en el arte. Véase, por ejemplo, Matteucci et al., Tetrahedron Letters 45: 1399-1401 (2004); Mayer et al., J. Peptide Res. 51: 432-436 (1998) ; Polinsky et al., J. Med. Chem. 35: 4185-4194 (1992) ; Osapay et al., J. Med. Chem. 40: 2241-2251 (1997) ; Fukase et al., Bull. Chem. Soc. Jpn. 65: 2227-2240 (1992) ; Harpp et al., J. Org. Chem. 36: 73-80 (1971) ; Goodman y Shao, Puré Appl . Chem. 68: 1303-1308 (1996) ; y Osapay y Goodman, J. Chem. Soc. Chem. Commun . 1599-1600 (1993) .

En algunas realizaciones, téteres de , ?-diaminoalcano, por ejemplo, ácido 1 , 4 -diaminopropano y 1 , 5-diaminopentano entre dos residuos de Glu en las posiciones i e i+7 se usan para estabilizar la alfa hélice del péptido de glucagón. Dichos téteres derivan en la formación de un puente de 9 átomos o más de longitud, según la longitud del téter de diamioalcano . Los métodos adecuados para producir péptidos entrecruzados con dichos téteres se describen en el arte. Véase, por ejemplo, Phelan et al., J. Am. Chem. Soc. 119: 455-460 (1997).

En aún otra realización de la invención, se utiliza un puente de disulfuro para entrecruzar uno o dos giros de la alfa hélice del péptido relacionado con glucagón. Alternativamente, se utiliza un puente de disulfuro modificado en donde uno o ambos átomos de azufre se reemplazan por un grupo metileno que deriva en la macrociclación isoestérica para estabilizar la alfa hélice del péptido relacionado con glucagón. Los métodos adecuados para modificar péptidos con puentes de disulfuro o ciclación basada en azufre se describen, por ejemplo, en Jackson et al . , J. Am. Chem. Soc. 113: 9391-9392 (1991) y Rudinger y Jost, Experientia 20: 570-571 (1964) .

En aún otra realización, la alfa hélice del péptido relacionado con glucagón se estabiliza a través de la unión del átomo de metal con dos residuos His o un par de His y Cys posicionado en i e i+4. El átomo de metal puede ser, por ejemplo, Ru(III), Cu(II), Zn(II), o Cd(II) . Dichos métodos de estabilización de alfa hélice basada en la unión de metal son conocidos en el arte. Véase, por ejemplo, Andrews y Tabor, Tetrahedron 55: 11711-11743 (1999); Ghadiri et al., J. Am. Chem. Soc. 112: 1630-1632 (1990); y Ghadiri et al., J. Am. Chem. Soc. 119: 9063-9064 (1997).

La alfa hélice del péptido relacionado con glucagón puede estabilizarse a través de otros medios de ciclación de péptidos, los cuales se analizan en Davies, J. Peptide. Sci. 9: 471-501 (2003) . La alfa hélice se puede estabilizar a través de la formación de un puente de amida, un puente de tioéter, un puente de tioéster, un puente de urea, un puente de carbamato, un puente de sulfonamida y similares. Por ejemplo, un puente de tioéster se puede formar entre el extremo de C y la cadena lateral de un residuo de Cys. Alternativamente, se puede formar un tioéster a través de las cadenas laterales de aminoácidos que tienen un tiol (Cys) y un ácido carboxílico (por ejemplo, Asp, Glu) . En otro método, un agente de entrecruzamiento, tal como un ácido dicarboxílico, por ejemplo, ácido subérico (ácido octanodioico) , etc., puede introducir una unión entre dos grupos funcionales de una cadena lateral de aminoácido, tal como un grupo amino libre, hidroxilo, tiol y combinaciones de ellos.

De acuerdo con algunas realizaciones, la alfa hélice del péptido relacionado con glucagon se estabiliza a través de la incorporación de aminoácidos hidrófobos en las posiciones i e i+4. Por ejemplo, i puede ser Tyr e i+4 puede ser Val o Leu; i puede ser Phe e i+4 puede ser Cys o Met; I puede ser Cys e i+4 puede ser Met; o i puede ser Phe e i+4 puede ser lie. Se deberá entender que, para los fines de la presente, los pares de aminoácidos precedentes se pueden invertir, de manera tal que el aminoácido indicado en la posición i pueda estar ubicado alternativamente en i+4, mientras que el aminoácido de i+4 puede estar ubicado en la posición i.

De acuerdo con otras realizaciones de la invención, en donde el péptido relacionado con glucagon es un péptido que tiene actividad de agonista de glucagon, acividad de agonista de GIP, actividad de antagonista de glucagon y de GLP-1, la alfa hélice se estabiliza a través de la incorporación (mediante la sustitución o inserción de aminoácido) de uno o más aminoácidos que estabilizan la alfa hélice en la parte del extremo de C del péptido relacionado con glucagon (alrededor de los aminoácidos 12-29 de acuerdo con la renumeración de aminoácido del glucagon de tipo silvestre) . En una realización específica el aminoácido de estabilización de alfa hélice es un aminoácido , -disustituido que incluye, en forma no taxativa, cualquiera del ácido amino iso-butírico (AIB) , un aminoácido disustituido con el mismo grupo o con un grupo diferente seleccionado de metilo, etilo, propilo y n-butilo, o con un ciclooctano o cicloheptano (por ejemplo, ácido 1-aminociclooctano-l-carboxílico) . En algunas realizaciones, una, dos, tres, cuatro o más de las posiciones 16, 17, 18, 19, 20, 21, 24 o 29 del péptido relacionado con glucagón se sustituyen con un aminoácido a, a-disustituido. En una realización específica, una, dos, tres o la totalidad de las posiciones 16, 20, 21 y 24 se sustituyen con AIB.

Conjugados La presente invención también comprende conjugados en los cuales un péptido relacionado con glucagón (por ejemplo, un péptido relacionado con glucagón de la Clase 1, péptido relacionado con glucagón de la Clase 2, péptido relacionado con glucagón de la Clase 3, péptido relacionado con glucagón de la Clase 4, o péptido relacionado con glucagón de la Clase 5) , se une, opcionalmente a través de enlace covalente y opcionalmente a través de un conector, a un grupo conjugado. La unión se puede realizar mediante enlaces químicos covalentes, fuerzas físicas tales como electrostática, hidrógeno, iónica, van der Waals, o interacciones hidrófobas o hidrófilas. Se puede utilizar una variedad de sistemas de unión no covalente, que incluyen biotina-avidina, ligando/receptor, enzima/sustrato, ácido nucleico/proteína de unión a ácido nucleico, lípido/proteína de unión a lípido, moléculas compañeras de adhesión celular; o cualquier compañero de unión o fragmentos de ellos que tenga afinidad uno con otro.

El péptido relacionado con glucagón se puede unir a grupos conjugados a través de la unión covalente directa mediante la reacción de residuos de aminoácidos blanco del péptido con un agente de derivación orgánico que es capaz de reaccionar con cadenas laterales seleccionadas o los residuos de extremos de N o de C de estos aminoácidos blanco. Los grupos reactivos sobre el péptido o el grupo conjugado incluyen, por ejemplo, un grupo aldehido, amino, éster, tiol, a-haloacetilo, maleimido o hidrazino. Los agentes de derivación incluyen, por ejemplo éster de maleimidobenzoil sulfosuccinimida (conjugación a través de residuos de cisteína) , N-hidroxisuccinimida (a través de residuos de lisina) , glutaraldehído, anhídrido succínico u otros agentes conocidos en el arte. Alternativamente, los grupos conjugados se pueden unir al péptido indirectamente a través de portadores intermedios, tales como portadores de polisacárido o de polipéptido. Ejemplos de portadores de polisacárido incluyen aminodextrano . Ejemplos de portadores de polipéptido adecuados incluyen polilisina, ácido poliglutámico, ácido poliaspártico , copolímeros de ellos, y polímeros mezclados de estos aminoácidos y otros, por ejemplo, serinas, para conferir propiedades de solubilidad deseables al portador cargado resultante.

Los residuos de cisteinilo deben reaccionar comúnmente con a-haloacetatos (y aminas correspondientes) , tales como ácido cloroacético o cloroacetamida, para dar derivados de carboximetilo o carboxiamidometilo . Los residuos de cisteinilo también derivan mediante la reacción con bromotrifluoroacetona, ácido alfa-bromo-ß- (5-imidozoil) propiónico, fosfato de cloroacetilo, N-alquilmaleimidas, disulfuro de 3-nitro-2-pirido, disulfuro de metil 2-piridilo, p-cloromercuribenzoato, 2-cloromercuri-4-nitrofenol, o cloro-7-nitrobenzo-2-oxa-l, 3-diazol .

Los residuos de histidilo derivan mediante la reacción con pirocarbonato de dietilo a pH 5,5-7,0 porque este agente es relativamente específico para la cadena lateral de histidilo. El bromuro de para-bromofenacilo también es útil; la reacción preferentemente se realiza en 0,1 M cacodilato de sodio con un pH de 6,0.

Los residuos de lisinilo y de extremo de amino reaccionan con anhídridos de ácido succínico o con otros anhídridos de ácido carboxílico. La derivación con estos agentes tiene el efecto de invertir la carga de los residuos de lisinilo. Otros agentes adecuados para derivar residuos que contienen alfa-amino incluyen imidoésteres tales como picolinimidato de metilo, fosfato de piridoxal, piridoxal, cloroborohidruro, ácido trinitrobencenosulfónico, O-metilisourea, 2 , 4-pentanodiona, y reacción catalizada por transaminasa con glioxilato.

Los residuos de arginilo se modifican mediante la reacción con uno o más reactivos convencionales, entre ellos fenilglioxal , 2 , 3-butanodiona, 1 , 2-ciclohexanodiona, y ninhidrina. La derivación de residuos de arginina requiere que la reacción se realice en condiciones alcalinas debido al alto pKa del grupo funcional guanidina. Además, estos reactivos pueden reaccionar con los grupos de lisina así como el grupo arginina épsilon-amino .

La modificación específica de los residuos de tirosilo se puede realizar, con particular interés en introducir marcadores espectrales en los residuos de tirosilo mediante la reacción con compuestos diazonio aromático o tetranitrometano. Más comúnmente, se utilizan N-acetilimidazol y tetranitrometano para formar especies O-acetil tirosilo y derivados de 3-nitro, respectivamente .

Los grupos laterales carboxilo (aspartilo o glutamilo) se modifican selectivamente mediante la reacción con carbodiimidas (R-N=C=N-R' ) , donde R y R" son grupos alquilo diferentes, tales como l-ciclohexil-3 - (2-morfolinil-4-etil) carbodiimida o 1-etil-3 - (4 -azonia-4 , 4-dimetilpentil) carbodiimida. Además, los residuos de aspartilo y glutamilo se convierten en residuos de asparaginilo y glutaminilo mediante la reacción con iones de amonio .

Otras modificaciones incluyen la hidroxilación de prolina y lisina, la fosforilación de grupos hidroxilo de residuos de serilo y treonilo, metilación de los grupos alfa-amino de las cadenas laterales de lisina, arginina e histidina (T. E. Creighton, Proteins: Structure and Molecular Properties, W.H. Freeman & Co., San Francisco, pp. 79-86 (1983)), desamidación de asparagina o glutamina, acetilación de la amina del extremo de N, y/o amidación o esterificación del grupo ácido carboxílico del extremo de C.

Otro tipo de modificación covalente consiste en acoplar química o enzimáticamente glicósidos al péptido. Se pueden unir azúcares a (a) arginina e histidina, (b) grupos carboxilo libre, (c) grupos sulfhidrilo libre tales como aquellos de cisteína, (d) grupos hidroxilo libre, tales como aquellos de serina, treonina, o hidroxiprolina, (e) residuos aromáticos tales como aquellos de tirosina, o triptófano, o (f) el grupo amida de glutamina. Estos métodos se describen en WO87/05330 publicada el 11 de septiembre de 1987, y en Aplin y Wriston, CRC Crit. Rev. Biochem. , pp. 259-306 (1981) .

Ejemplos de grupos conjugados que se pueden unir a cualquiera de los péptidos relacionados con glucagón descritos en la presente incluyen en forma no taxativa un péptido o polipéptido heterólogo (que incluye por ejemplo, una proteína de plasma) , un agente de orientación, una inmunoglobulina o una parte de ella (por ejemplo, una región variable, CDR, o región de Fe) , un marcador de diagnóstico tal como un radioisótopo, fluoróforo o marcador enzimático, un polímero que incluye polímeros solubles en agua, u otros agentes terapéuticos o de diagnóstico. En algunas realizaciones se proporciona un conjugado que comprende un péptido relacionado con glucagón de la presente invención y una proteína de plasma, en donde la proteína de plasma se selecciona del grupo formado por albúmina, transferrina, fibrinógeno y globulinas. En algunas realizaciones, el grupo proteína de plasma del conjugado es albúmina o transferrina . En algunas realizaciones, el conector comprende una cadena de átomos de aproximadamente l a 60, o de l a 30 átomos o más larga, de 2 a 5 átomos, de 2 a 10 átomos, de 5 a 10 átomos, o de 10 a 20 átomos de largo. En algunas realizaciones, los átomos de la cadena son todos átomos de carbono. En algunas realizaciones los átomos de la cadena de la cadena principal del conector se seleccionan del grupo formado por C, O, N y S. Los átomos de la cadena y los conectores se pueden seleccionar de acuerdo con su solubilidad esperada (hidrofilicidad) de manera tal que proporcionen un conjugado más soluble. En algunas realizaciones, el conector proporciona un grupo funcional que está sujeto a descomposición por una enzima u otro catalizador o condiciones hidrolíticas halladas en el tejido u órgano o célula blanco. En algunas realizaciones, la longitud del conector es suficiente para reducir el potencial de impedimento estérico. Si el conector es un enlace covalente o un enlace de peptidilo y el conjugado es un polipéptido, el conjugado completo puede ser una proteína de fusión. Dichos conectores de peptidilo pueden tener cualquier longitud. Ejemplos de conectores tienen de 1 a 50 aminoácidos de longitud, de 5 a 50, de 3 a 5, de 5 a 10, de 5 a 15, o de 10 a 30 aminoácidos de longitud. Dichas proteínas de fusión pueden alternativamente producirse mediante métodos de ingeniería genética recombinante conocidos para un experto en el arte.

Como se indicó anteriormente, en algunas realizaciones, los péptidos relacionados con glucagón se conjugan, por ejemplo, se fusionan a una inmunoglobulina o una parte de ella (por ejemplo, región variable, CDR, o región de Fe) . Los tipos conocidos de inmunoglobulinas (Ig) incluyen IgG, IgA, IgE, IgD o Ig . La región de Fe es una región del extremo de C de una cadena pesada de Ig, que es responsable de la unión a receptores de Fe que realizan actividades tales como reciclado (que deriva en una semivida prolongada) , citotoxicidad mediadas por células que depende del anticuerpo (ADCC) , y citotoxicidad que depende del complemento (CDC) .

Por ejemplo, de acuerdo con algunas definiciones, la región de Fe de cadena pesada de Ig humana se extiende desde Cys226 hasta el extremo de C de la cadena pesada. La "región de bisagra" generalmente se extiende desde Glu216 a Pro230 de IgGl humana (regiones bisagra de otros isotipos de IgG se pueden alinear con la secuencia de IgGl alineando las cisteínas involucradas en el enlace de cisteína) . La región de Fe de una IgG incluye dos dominios constantes, CH2 y CH3. El dominio de CH2 de una región de Fe de IgG humana habitualmente se extiende desde los aminoácidos 231 al aminoácido 341. El dominio de CH3 de una región de Fe de IgG humana habitualmente se extiende desde los aminoácidos 342 a 447. Las referencias a la numeración de aminoácidos de inmunoglobulinas o fragmentos o regiones de inmunoglobulinas, están todas basadas en Kabat et al. 1991, Sequences of Proteins of Immunological Interest, U.S. Department of Public Health, Bethesda, Md. En una realización relacionada, la región de Fe puede comprender una o más regiones constantes nativas o modificadas desde una cadena pesada de inmunoglobulina, diferente de CH1, por ejemplo, las regiones de CH2 y CH3 de IgG e IgA, o las regiones CH3 y CH4 de IgE.

Los grupos conjugados adecuados incluyen partes de secuencia de inmunoglobulina que incluyen el sitio de unión de FcRn. FcRn, un receptor de salvamento, es responsable de reciclar inmunoglobulinas y retenerlas para la circulación en sangre. La región de la parte de Fe de IgG que se une al receptor de FcRn se ha descrito en base a la cristalografía de rayos X (Burmeister et al. 1994, Nature 372:379). La principal área de contacto de la Fe con la FcRn está cerca de la unión de los dominios de CH2 y CH3. Los contactos de Fc-FcRn están todos dentro de una sola cadena pesada de Ig. Los principales sitios de contacto incluyen los residuos de aminoácido 248, 250-257, 272, 285, 288, 290-291, 308-311, y 314 del dominio de CH2 y los residuos de aminoácido 385-387, 428, y 433-436 del dominio de CH3.

Algunos grupos conjugados puede o no incluir el/los sitio (s) de unión de FcyR. FcyR son responsables de ADCC y CDC. Ejemplos de posiciones dentro de la región de Fe que establecen un contacto directo con FcyR son los aminoácidos 234-239 (región bisagra inferior) , los aminoácidos 265-269 (bucle de B/C) , los aminoácidos 297-299 (bucle C/E) y los aminoácidos 327-332 (bucle F/G) (Sondermann et al., Nature 406: 267-273, 2000). La región bisagra inferior de IgE también se ha implementado en la unión de FcRI (Henry, et al., Biochemistry 36, 15568-15578, 1997). Los residuos involucrados en la unión del receptor de IgA se describen en Lewis et al., (J Immunol . 175:6694-701, 2005). Los residuos de aminoácido involucrados en la unión de receptor de IgE se describen en Sayers et al. (J Biol Chem. 279 (34 ): 35320-5 , 2004) .

Se pueden hacer modificaciones de aminoácidos en la región de Fe de una inmunoglobulina . Dichas variantes de regiones de Fe comprenden por lo menos una modificación de aminoácido en el dominio de CH3 de la región de Fe (residuos 342-447) y/o por lo menos una modificación de aminoácido en el dominio de CH2 de la región de Fe (residuos 231-341) . Las mutaciones que se cree que imparten afinidad aumentada para FcRn incluyen T256A, T307A, E380A, and N434A (Shields et al. 2001, J. Biol. Chem. 276:6591) . Otras mutaciones pueden reducir la unión de la región de Fe a FcyRI, FCYRIIA, FcyRIIB, y/o FcyRIIIA sin reducir significativamente la afinidad para FcRn. Por ejemplo, la sustitución de Asn en la posición 297 de la región de Fe con Ala u otro aminoácido elimina un sitio de N-glicosilación altamente conservado y puede derivar en inmunogenicidad reducida con semivida prolongada concomitante de la región de Fe, así como unión reducida a FcyRs (Routledge et al. 1995, Transplantation 60:847; Friend et al. 1999, Transplantation 68:1532; Shields et al. 1995, J. Biol . Chem. 276:6591). Se han hecho modificaciones de aminoácidos en las posiciones 233-236 de IgGl que reducen la unión a FcyRs (Ward and Ghetie 1995, Therapeutic Immunology 2:77 y Armour et al. 1999, Eur. J. Immunol . 29:2613) . Algunos ejemplos de sustituciones de aminoácidos se describen en las Patentes Estadounidenses 7.355.008 y 7.381.408, cada una de las cuales se incluye en la presente por referencia. rPEG En algunas realizaciones, el conjugado de la invención comprende un péptido de la superfamilia de glucagón, que incluye péptidos relacionados con glucagón, osteocalcina, así como análogos, derivados y conjugados de los precedentes, fusionados a un péptido accesorio que es capaz de formar una conformación extendida similar al compuesto químico PEG (por ejemplo, una molécula de PEG recombinante (rPEG) ) , tal como aquellas descritas en la Publicación de Solicitud de Patente Internacional N° WO2009/023270 y en la Publicación de Solicitud de Patente Estadounidense N° US2008/0286808. La molécula de rPEG no es polietilenglicol . La molécula de rPEG en algunos aspectos es un polipéptido que comprende uno o más de glicina, serina, ácido glutámico, ácido aspártico, alanina o prolina. En algunos aspectos, el rPEG es un homopolímero, por ejemplo, poli-glicina, poli-serina, ácido poli-glutámico, ácido poli-aspártico, poli-alanina, o poli-prolina. En otras realizaciones, el rPEG comprende dos tipos de aminoácidos repetidos, por ejemplo poli (Gly-Ser) , poli (Gly-Glu) , poli (Gly-Ala) , poli (Gly-Asp) , poli (Gly-Pro) , poli (Ser-Glu) , etc. En algunos aspectos, el rPEG comprende tres tipos diferentes de aminoácidos, por ejemplo, poli (Gly-Ser-Glu) . En aspectos específicos, el rPEG aumenta la semivida del péptido de la superfamilia de glucagón, u osteocalcina . En algunos aspectos, el rPEG comprende una carga positiva neta o una carga negativa neta. El rPEG en algunos aspectos carece de una estructura secundaria. En algunas realizaciones, el rPEG es mayor o igual a 10 aminoácidos de longitud y en algunas realizaciones tiene de 40 a 50 aminoácidos de longitud. El péptido secundario en algunos aspectos está fusionado a los extremos de N o de C del péptido de la invención a través de un enlace de péptido o un sitio de descomposición de proteinasa, o se inserta en los bucles del péptido de la invención. El rPEG en algunos aspectos comprende un marcador de afinidad o está unido a un PEG que tiene más de 5 kDa. En algunas realizaciones, el rPEG confiere al péptido de la invención un mayor radio hidrodinámico, semivida en suero, resistencia a la proteasa, o solubilidad y en algunos aspectos le confiere al péptido inmunogenicidad reducida.

Prolongación del extremo de C del Péptido de Fusión En ciertas realizaciones un péptido relacionado con glucagón puede comprender un extremo de C o una secuencia de aminoácido del extremo de C que incluye en forma no taxativa: COOH, CONH2/ GPSSGAPPPS (SEQ ID NO: 710), GPSSGAPPPS-CONH2 (SEQ ID NO: 711), una prolongación del extremo de carboxi de oxintomodulina, KRNRNNIA (SEQ ID NO: 714) o KGKKNDWKHNITQ (SEQ ID NO: 713) . Por ejemplo, los diez aminoácidos del extremo de Exendina 4 (es decir la secuencia de SEQ ID NO: 710 (GPSSGAPPPS)) se unen al extremo de carboxi del péptido relacionado con glucagón de la Clase 1, del péptido relacionado con glucagón de la Clase 2, del péptido relacionado con glucagón de la Clase 3, del péptido relacionado con glucagón de la Clase 4 o del péptido relacionado con glucagón de la Clase 5 de la presente invención.

Otro compuesto que induce la pérdida de peso es oxintomodulina, una hormona digestiva natural hallada en el intestino delgado (véase Diabetes 2005; 54:2390-2395). Oxintomodulina es un péptido de 37 aminoácidos (SEQ ID NO: 706) que contiene la secuencia de 29 aminoácidos de glucagón seguida por una prolongación del extremo de carboxi de 8 aminoácidos de SEQ ID NO: 714 (KRNRNNIA) . Por consiguiente, en algunas realizaciones se proporcionan derivados de profármaco de péptidos relacionados con glucagón que además comprenden la prolongación del extremo de carboxi de la secuencia de SEQ ID NO: 714 o una prolongación de cuatro amino ácidos que tienen la secuencia KRNR.

Modificación de glucagón en la posición 3 Los péptidos relacionados con gluacagón de las Clases 1 a 3 descritos en la presente se pueden modificar en la posición 3 (de acuerdo con la numeración de aminoácido del glucagón de tipo silvestre) para mantener o aumentar la actividad en el receptor de glucagón.

En algunas realizaciones en las cuales el péptido relacionado con glucagón es un péptido relacionado con glucagón de la Clase 1, Clase 2 o Clase 3, se puede lograr la actividad mantenida o mejorada en el receptor de glucagón modificando la Gln en la posición 3 con un análogo de glutamina. Por ejemplo, un péptido relacionado con glucagón de la Clase 1, Clase 2 o Clase 3 que comprende un análogo de glutamina en la posición 3 puede presentar un 5%, un 10%, un 20%, un 50% o un 85% o más de la actividad de glucagón nativo (SEQ ID NO: 701) en el receptor de glucagón. En algunas realizaciones un péptido relacionado con glucagón de la clase 1, clase 2 o clase 3 que comprende un análogo de glutamina en la posición 3 puede presentar un 20%, un 50%, un 75%, un 100%, un 200% o un 500% o más de la actividad de un péptido relacionado con glucagón que tiene la misma secuencia de aminoácido que el péptido que comprende el análogo de glutamina, excepto por el aminoácido modificado en la posición 3 en el receptor de glucagón. En algunas realizaciones, un péptido relacionado con glucagón de la Clase 1, de la Clase 2, o de la Clase 3 que comprende un análogo de glutamina en la posición 3 presenta actividad mejorada en el receptor de glucagón, pero la actividad mejorada es no más del 1000%, 10.000%, 100.000% o 1.000.000% de la actividad del glucagón nativo o de un péptido relacionado con glucagón correspondiente que tiene la misma secuencia de aminoácido que el péptido que comprende el análogo de glutamina, excepto por el aminoácido modificado en la posición En algunas realizaciones, el análogo de glutamina es un aminoácido natural o no natural que comprende una cadena lateral de la Estructura I, II o III: O •^-R1-CH2-X-U-R2 Estructura I O •^-R1-CH2-U-Y Estructura II O • -R1-CH2-S-CH2-R4 Estructura III en donde R1 es alquilo de C0 -3 o heteroalquilo de C0-3; R2 es NHR4 o alquilo de Ci-3; R3 es alquilo de Ci-3; R4 es H o alquilo de Ci-3 X es NH, 0, o S; e Y es NHR4, SR3, o OR3. En algunas realizaciones, X es NH o Y es NHR4. En algunas realizaciones, R1 es alquilo de C0 -2 o heteroalquilo de Ci. En algunas realizaciones, R2 es NHR4 o alquilo de Ci. En algunas realizaciones, R4 es H o alquilo de C1. En ejemplos de realizaciones en donde el péptido relacionado con glucagon es un péptido relacionado con glucagon de la Clase 1, Clase 2 o Clase 3, se proporciona un aminoácido que comprende una cadena lateral de la Estructura I en donde R1 es CH2-S, X es NH, y R2 es CH3 (acetamidometil-cisteína, C (Acm) ) ; R1 es CH2, X es NH, y R2 es CH3 (ácido acetildiaminobutanoico, Dab(Ac)); R1 es alquilo de C0, X es NH, R2 es NHR4, y R4 es H (ácido carbatnoildiaminopropanoico, Dap(urea)); o R1 es CH2-CH2, X es NH, y R2 es CH3 (acetilornitina, Orn(Ac)). En ejemplos de realizaciones se proporciona un aminoácido que comprende una cadena lateral de la Estructura II donde R1 es CH2, Y es NHR4, y R4 es CH3 (metilglutamina, Q (Me) ) ; En ejemplos de realizaciones se proporciona un aminoácido que comprende una cadena lateral de la Estructura IIII donde R1 es CH2 y R4 es H (sulfóxido de metionina, M(0)); En realizaciones específicas, el aminoácido en la posición 3 se sustituye con Dab(Ac) .

Dímeros Con respecto a los péptidos relacionados con glucagón de la Clase 1, Clase 2 y Clase 3, el péptido relacionado con glucagón puede formar parte de un dímero, trímero o multímero de orden más alto que comprende por lo menos dos, tres o más péptidos unidos a través de un conector, en donde por lo menos uno o ambos péptidos son un péptido relacionado con glucagón. El dímero puede ser un homodímero o heterodímero . En algunas realizaciones, el conector se selecciona del grupo formado por un entrecruzamiento de tiol bifuncional y un entrecruzamiento de amina bifuncional . En ciertas realizaciones, el conector es PEG, por ejemplo, un PEG de 5 kDa, PEG de 20 JDa. En algunas realizaciones, el conector es un enlace de disulfuro. Por ejemplo, cada monómero del dímero puede comprender un residuo de Cys (por ejemplo, un extremo o un Cys posicionado internamente) y el átomo de azufre de cada residuo de Cys participa en la formación del enlace de disulfuro. En algunos aspectos de la invención, los monómeros se conectan a través de aminoácidos de extremo (por ejemplo, un extremo de N o extremo de C) , a través de aminoácidos internos, o a través de un aminoácido de extremo de por lo menos un monómero y un aminoácido interno de por lo menos otro monómero. En aspectos específicos, los monómeros no están conectados a través de un aminoácido del extremo de N. En algunos aspectos, los monómeros del multímero están unidos juntos en una orientación de "cola a cola" en donde los aminoácidos del extremo de C de cada monómero se unen juntos. Un grupo conjugado puede unirse en forma covalente a cualquiera de los péptidos relacionados con glucagón descritos en la presente, que incluye un dímero, trímero o multímero de más alto orden .

Métodos para elaborar péptidos relacionados con glucagón Los péptidos relacionados con glucagón (y profármacos) revelados en la presente se pueden preparar mediante métodos sintéticos estándar, técnicas de ADN recombinante o cualquier otro método para preparar péptidos y proteínas de fusión. Aunque ciertos aminoácidos no naturales no se pueden expresar mediante técnicas de ADN recombinante estándar, las técnicas para su preparación son conocidas en el arte. Los compuestos de esta invención que comprende partes que no son peptidos se pueden sintetizar mediante reacciones químicas orgánicas estándar, además de reacciones químicas de peptido estándar cuando son aplicables.

Las clases de péptidos relacionados con glucagón se describen detalladamente a continuación. Con respecto a cada una de las secciones de la invención referidas a las modificaciones de péptidos relacionados con glucagón de las clases 1, 2, 3, 4 y 5 se describen con respecto a la parte de peptido relacionado con glucagón (Q) de un compuesto profármaco detallado anteriormente. Por lo tanto, los elementos estructurales descritos con respecto a una clase de péptidos relacionados con glucagón son elementos estructurales de Q que luego se modifican adicionalmente para generar un compuesto de profármaco como se describió anteriormente .

Péptidos Relacionados con Glucagón de Clase 1 En ciertas realizaciones, el peptido relacionado con glucagón es un péptido relacionado con glucagón de una Clase 1, que se describe en la presente y en la Solicitud de Patente Internacional N° PCT US2009/47437 (presentada el 16 de junio de 2009) , la Publicación de la Solicitud de Patente Internacional N° WO 2008/086086, publicada el 17 de julio de 2008 y la Solicitud Provisoria de Patente Estadounidense N° 61/090.415, cuyo contenido se incluye en la presente por referencia en su totalidad .

Las secuencias biológicas citadas en la siguiente sección (SEQ ID NO: 801-915) en relación con los péptidos relacionados- con glucagón de la Clase 1 corresponden a las SEQ ID NO: 1-115 e la Solicitud de Patente Internacional N° PCT US2009/47437.

Actividad Los péptidos de glucagón de Clase 1 retienen la actividad de receptor de glucagón en relación con el péptido de glucagón nativo (SEQ ID NO: 801) . Por ejemplo, el péptido de glucagón puede retener por lo menos un 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 75% de actividad, 80% de actividad, 85% de actividad, o 90% o de la actividad del glucagón nativo (calculada como la proporción inversa de las EC50 para el péptido de glucagón contra glucagón, por ejemplo, medida mediante la producción de cAMP usando el ensayo descrito en general en el Ejemplo 5) . En algunas realizaciones, los péptidos relacionados con glucagón de Clase 1 tienen la misma o mayor actividad (palabra utilizada como sinónimo del término "potencia" en la presente) que glucagon. En algunas realizaciones, los péptidos de glucagon descritos en la presente presentan no más de alrededor del 100%, 1.000%, 10.000%, 100.000%, o 1.000.000% de la actividad del péptido de glucagon nativo .

Cualquiera de los péptidos relacionados con glucagon de Clase 1 descritos en la presente pueden presentar una EC50 en el receptor de glucagon humano de 100 nM, 75 nM, 50 nM, 40 nM, 30 nM, 20 nM, 10 nM, 5 nM, 1 nM o menos cuando se ensaya para la inducción de cAMP en células HEK293 que sobreexpresan el receptor de glucagon, por ejemplo, usando el ensayo del Ejemplo 5. Generalmente, los péptidos pegilados presentan una EC50 mayor comparada con el péptido no pegilado. Por ejemplo, los péptidos relacionados con glucagon de la Clase 1 descritos en la presente, cuando no se pegilan, pueden presentar actividad en el receptor de glucagon que es por lo menos un 20& (por ejemplo, por lo menos un 30%, por lo menos un 40%, por lo menos un 50%, por lo menos un 60&, por lo menos un 75%, por lo menos un 80%, por lo menos un 90%, por lo menos un 95%, por lo menos un 98%, por lo menos un 99%, 100%, 150%, 200%, 400%, 500% o más) de la actividad de glucagon nativo (SEQ ID NO: 801) en el receptor de glucagon. En ciertas realizaciones, los péptidos relacionados con glucagon de la Clase 1 descritos en la presente presentan el porcentaje de actividad indicado del glucagón nativo en el receptor de glucagón, cuando carece de un grupo hidrófilo, pero presentan un porcentaje de actividad reducido del glucagón nativo en el receptor de glucagón, cuando comprende un grupo hidrófilo. Por ejemplo, los péptidos relacionados con glucagón de la Clase 1 descritos en la presente, cuando son pegilados, pueden presentar actividad en el receptor de glucagón que es por lo menos un 2% (por e emplo, por lo menos un 3%, por lo menos un 4%, por lo menos un 5%, por lo menos un 6%, por lo menos un 7%, por lo menos un 8%, por lo menos un 9%, o por lo menos un 10% de la actividad del glucagón nativo) . En algunas realizaciones, los péptidos relacionados con glucagón de la Clase 1 descritos en la presente pueden presentar cualquiera de las actividades indicadas anteriormente pero no más del 1.000%, 10.000%, 100.000%, o 1.000.000% de la actividad del glucagón nativo en el receptor de glucagón.

En algunas realizaciones, los péptidos relacionados con glucagón de la Clase 1 presentan menos de alrededor del 5%, 4%, 3%, 2% o 1% de la actividad de GLP-1 nativo en el receptor de GLP-1 y/o más de alrededor de 5 veces, 10 veces o 15 veces la selectividad para el receptor de glucagón comparado con el receptor de G1P-1. Por ejemplo, en algunas realizaciones, los péptidos relacionados con glucagón de la Clase 1 presentan menos del 5% de la actividad de GLP-1 nativo en el receptor de GLP-1 y presentan más de 5 veces la selectividad del receptor de glucagón comparado con el receptor de GLP-1.

Solubilidad mejorada El glucagón nativo presenta baja solubilidad en soluciones acuosas, específicamente a pH fisiológico, con una tendencia a agregarse y a precipitar en el tiempo. En cambio, los péptidos relacionados con glucagón de la Clase 1 en algunas realizaciones presentan por lo menos 2 veces, 5 veces, o aún más alta solubilidad comparados con el glucagón nativo a un pH de entre 6 y 8, o entre 6 y 9, por ejemplo, a pH 7, después de 24 horas a 25°C.

Por consiguiente, en algunas realizaciones, un péptido relacionado con glucagón de la Clase 1 se ha modificado en relación con el péptido de tipo silvestre de His-Ser-Gln-Gly-Thr-Phe- Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Lys-Tyr-Leu-Asp-Ser- Arg-Arg-Ala-Gln-Asp-Phe-Val-Gln-Trp-Leu-Met-Asn-Thr (SEQ ID NO: 801) para mejorar la solubilidad del péptido en soluciones acuosas, específicamente a un pH en la gama de aproximadamente 5,5 a 8,0, mientras que retiene la actividad biológica del péptido nativo.

Por ejemplo, la solubilidad de cualquiera de los péptidos relacionados con glucagón de la Clase 1 descritos en la presente puede mejorarse adicionalmente uniendo un grupo hidrófilo al péptido. La introducción de dichos grupos también aumenta la duración de la acción, por ejemplo medida por una semivida prolongada en circulación. Los grupos hidrófilos se describen adicionalmente en la presente.

Modificación con Residuos con una carga En algunas realizaciones, la solubilidad se mejora agregando una carga el péptido relacionado con glugacón de la Clase 1 mediante la sustitución de aminoácidos sin carga nativos con aminoácidos con carga seleccionados del grupo formado por lisina, arginina, histidina, ácido aspártico y ácido glutámico, o mediante el agregado de aminoácidos con carga al extremo de amino o de carboxi del péptido.

De acuerdo con algunas realizaciones, el péptido relacionado con glucagón de la Clase 1 tiene solubilidad mejorada debido al hecho de que el péptido se modifica mediante sustituciones y/o agregados de aminoácidos que introducen un aminoácido con carga en la parte del extremo de C del péptido y en algunas realizaciones en una posición del extremo de C a la posición 27 de SEQ ID NO: 801. Opcionalmente, se pueden introducir uno, dos o tres aminoácidos con carga dentro de la parte del extremo de C y, en algunas realizaciones, el extremo de C a la posición 27. De acuerdo con algunas realizaciones, el/los aminoácido/s nativo/s en la posición 28 y/o 29 se sustituyen con un aminoácido con carga y/o uno a tres aminoácidos con carga se agregan al extremo de C del péptido, por ejemplo, después de la posición 27, 28 o 29. En ejemplos de realizaciones, uno, dos, tres o la totalidad de los aminoácidos con carga tienen carga negativa. En otras realizaciones, uno, dos, tres o la totalidad de los aminoácidos con carga tienen carga positiva.

En ejemplos específicos de realizaciones, el péptido relacionado con glucagón de la Clase 1 puede comprender una o dos de cualquiera de las siguientes modificaciones: sustitución de N28 con E; sustitución de N28 con D; sustitución de T29 con D; sustitución de T29 con E; inserción de E después de la posición 27, 28 o 29; inserción de D después de la posición 27, 28 o 29. Por ejemplo, D28E29, E28E29, E29E30, E28E30, D28E30.

De acuerdo con un ejemplo de realización, el péptido relacionado con glcuagón de la Clase 1 comprende una secuencia de aminoácido de SEQ ID NO: 811, o un análogo de él que contiene 1 a 3 modificaciones de aminoácido adicionales (descritas en la presente con referencia a los agonistas de glucagón) en relación con el glucagón nativo, o un análogo de agonista de glucagón de él. SEQ ID NO 811 representa un péptido relacionado con glucagón de la clase 1 modificado, en donde el residuo de asparagina en la posición 28 de la proteína nativa se ha sustituido con un ácido aspártico. En otro ejemplo de realización el péptido relacionado con glucagón de la Clase 1 comprende una secuencia de aminoácido de SEQ ID NO 838, en donde el residuo de asparagina en la posición 28 de la proteína nativa se ha sustituido con ácido glutámico. Otros ejemplos de realizaciones incluyen péptidos relacionados con glucagón de la Clase 1 de SEQ ID NO 824, 825, 826, 833, 835, 836 y 837.

La sustitución del aminoácido normal en la posición 28 y/o 29 con aminoácidos con carga, y/o el agregado de uno a dos aminoácidos con carga en el extremo de carboxi del péptido relacionado con glucagón de la Clase 1, mejora la solubilidad y la estabilidad de los péptidos de glucagón en soluciones acuosas a pHs fisiológicamente relevantes (es decir, un pH de alrededor de 6,5 a 7,5) por lo menos 5 y tanto como 30 veces. Por consiguiente, los péptidos relacionados con glucagón de la Clase 1 de algunas realizaciones retienen la actividad de glucagón y presentan por lo menos 2 veces, 5 veces, 10 veces, 15 veces, 25 veces, 30 veces o más solubilidad en relación con el glucagón nativo a un pH dado entre aproximadamente 5,5 y 8, por ejemplo a pH 7, medido después de 24 horas a 25 °C.

Otras modificaciones, por ejemplo, sustituciones conservadoras, las cuales se describen adicionalmente en la presente, se pueden hacer en los péptidos relacionados con glucagon de la Clase 1 que aún permiten retener la actividad de glucagon.

Estabilidad mejorada Cualquiera de los péptidos de glucagon de la Clase 1 puede presentar además estabilidad mejorada y/o degradación reducida, por ejemplo, reteniendo por lo menos un 95% del péptido original después de 24 horas a 25°C. Cualquiera de los péptidos relacionados con glucagon de la Clase 1 revelados en la presente puede presentar además estabilidad mejorada a un pH dentro de la gama de 5,5 a 8, por ejemplo, reteniendo por lo menos un 75%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% del péptido original después de 24 horas a 25 °C. En algunas realizaciones, los péptidos relacionados con glucagon de la Clase 1 de la invención presentan estabilidad mejorada, de manera tal que por lo menos un 75% (por ejemplo, por lo menos un 80%, por lo menos un 85%, por lo menos un 90%, por lo menos un 95%, más del 95%, hasta un 100%) de una concentración del péptido o menos del 25% (por ejemplo, menos del 20%, menos del 15%, menos del 10%, menos del 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, hasta el 0%) del péptido degradado es detectable a 280 nm por un detector de radiación ultravioleta después de 1 o más semanas (por ejemplo, aproximadamente 2 semanas, 4 semanas, 1 mes, dos meses, cuatro meses, seis meses, ocho meses, diez meses, doce meses) en solución a una temperatura de por lo menos 20°C (por ejemplo, 21°C, 22°C, 23°C, 24°C, 25°C, 26°C, por lo menos 27,5°C, por lo menos 30°C, por lo menos 35°C, por lo menos 40°C, por lo menos 50°C) y menos de 100°C, menos de 85°C, menos de 75°C, o menos de 70 °C. Los péptidos relacionados con glucagón de la clase 1 pueden incluir modificaciones adicionales que alteran sus propiedades farmacéuticas, por ejemplo potencia aumentada, semivida prolongada en circulación, vida útil aumentada, precipitación o agregado reducido, y/o degradación reducida, por ejemplo, ocurrencia reducida de descomposición o modificación química después del almacenamiento.

En aún otros ejemplos de realizaciones, cualquiera de los péptidos relacionados con glucagón de la clase 1 precedentes se pueden modificar adicionalmente para mejorar la estabilidad modificando el aminoácido en la posición 15 de SEQ ID NO 801 para reducir la degradación del péptido en el tiempo, especialmente en tampones ácidos o alcalinos. En ejemplos de realizaciones, ASp en la posición 15 se sustituye con un Glu, homo-Glu, ácido cisteico o ácido homo-cisteico .

Alternativamente, cualquiera de los péptidos relacionados con glucagón de la Clase 1 descritos en la presente se pueden modificar adicionalmente para mejorar la estabilidad modificando el aminoácido en la posición 16 de SEQ ID NO 801. En ejemplos de realizaciones, Ser en la posición 16 se sustituye con Thr o AIB, o cualquiera de las sustituciones de aminoácidos descritas en la presente con respecto a los péptidos relacionados con glucagón de la Clase 1 que mejoran la potencia en el receptor de glucagón. Dichas modificaciones reducen la descomposición del péptido unido entre Aspl5-Serl6.

En algunas realizaciones, cualquiera de los péptidos relacionados con glucagón de la clase 1 descritos en la presente se pueden modificar adicionalmente para reducir la degradación en diferentes posiciones de aminoácidos modificando una, dos, tres cualquiera o las cuatro posiciones 20, 21, 24 o 27. Ejemplos de realizaciones incluyen la sustitución de Gln en la posición 20 con Ser, Thr, Ala o AIB, la sustitución de Asp en la posición 21 con Glu, la sustitución de Gln en la posición 24 con Ala o AIB, la sustitución de et en la posición 27 con Leu o Nle . La remoción o sustitución de metionina reduce la degradación debido a la oxidación de la metionina. La remoción o la sustitución de Gln o Asn reduce la degradación debido a la desaminación de Gln o Asn. La remoción o sustitución de Asp reduce la degradación que ocurre a través de la deshidratación de Asp para formar un compuesto intermedio de succinimida cíclica seguida por .la isomerización a iso-aspartato .

Potencia mejorada De acuerdo con otra realización, se proporcionan péptidos relacionados con glucagón de la clase 1 que tienen potencia mejorada en el receptor de glucagón, en donde los péptidos comprenden modificación de aminoácido en la posición 16 del glucagón nativo (SEQ ID NO: 801) . A modo de ejemplo no taxativo, dicha potencia mejorada se puede proporcionar sustituyendo la serina natural en la posición 16 con ácido glutámico o con otro aminoácido con carga negativa que tiene una cadena lateral con una longitud de 4 átomos, o alternativamente con uno cualquiera de glutamina, ácido homoglut mico, o ácido homocisteico, o un aminoácido con una carga que tiene una cadena lateral que contiene por lo menos un heteroátomo (por ejemplo, N, O, S, P) y con una longitud de la cadena lateral de aproximadamente 4 (o 3-5) átomos. La sustitución de serina en la posición 16 con ácido glutámico mejora la actividad de glucagón por lo menos 2 veces, 4 veces, 5 veces y hasta 10 veces más en el receptor de glucagón.

En algunas realizaciones, el péptido relacionado con glucagón de la clase 1 retiene la selectividad para el receptor de glucagón en relación con los receptores de GLP-1, por ejemplo por lo menos 5 veces, 10 veces o 15 veces la selectividad.

Resistencia a DPP-IV En algunas realizaciones, los péptidos de glucagón de la Clase 1 revelados en la presente también se modifican en la posición 1 o 2 para reducir la susceptibilidad a la descomposición por dipeptidil peptidasa IV. Más específicamente, en algunas realizaciones, la posición 1 y/o la posición 2 del péptido relacionado con glucagón de la Clase 1 se sustituye con el aminoácido (s) resistente a DPP-IV descrito en la presente. En algunas realizaciones, la posición 2 del análogo de péptido se sustituye con un ácido amino isobutírico. En algunas realizaciones, la posición 2 del péptido análogo se sustituye con un aminoácido seleccionado del grupo formado por D-serina, D-alanina, glicina, N-metil serina, y un ácido e-amino butírico. En otra realización, la posición 2 del péptido relacionado con glucagón de la Clase 1 se sustituye con un aminoácido seleccionado del grupo formado por D-serina, glicina, y ácido aminoisobutírico . En algunas realizaciones, el aminoácido en la posición 2 no es D-serina.

La reducción en la actividad de glucagón sobre la modificación de los aminoácidos en la posición 1 y/o en la posición 2 del péptido de glucagón se puede restaurar mediante la estabilización de la estructura de alfa-hélice de la parte del extremo de C del péptido de glucagón (alrededor de los aminoácidos 12-29) . La estructura de alfa hélice se puede estabilizar por ejemplo mediante la formación de un puente intramolecular covalente o no covalente (por ejemplo, un puente de lactama entre cadenas laterales de aminoácidos en las posiciones "i" e "i+4", en donde i es un número entero de 12 a 25) , la sustitución y/o inserción de aminoácidos alrededor de las posiciones 12-29 con un aminoácido que estabiliza la alfa hélice (por ejemplo, un aminoácido , a-disustituido) , como se describe adicionalmente en la presente .

Modificaciones en la posición 3 La actividad de receptor de glucagón se puede reducir mediante modificaciones de aminoácido en la posición 3 (de acuerdo con la numeración de aminoácido del glucagón de tipo silvestre) , por ejemplo, la sustitución de la glutamina natural en la posición 3, con un aminoácido ácido, básico o hidrófobo. Por ejemplo las sustituciones en la posición 3 con ácido glutámico, ornitina, o norleucina reducen sustancialmente o destruyen la actividad del receptor de glucagón.

La actividad mantenida o mejorada en el receptor de glucagón se puede lograr modificando la Gln en la posición 3 con un análogo de glutamina descrito en la presente. Por ejemplo, los agonistas de glucagón pueden comprender la secuencia de aminoácido SEQ ID NO: 863, SEQ ID NO: 869, SEQ ID NO: 870, SEQ ID NO: 871, SEQ ID NO: 872, SEQ ID NO: 873, y SEQ ID NO: 874.

Mejora de actividad de GLP-1 con amidas y ásteres del extremo de C La actividad mejorada en el receptor de GLP-1 se proporciona reemplazando el ácido carboxílico del aminoácido del extremo de C con un grupo de carga neutra, tal como una amida o éster. A la inversa, la retención del ácido carboxílico nativo en el extremo de C del péptido mantiene la selectividad relativamente mayor del péptido relacionado con glucagón de la clase 1 para el receptor de glucagón contra el receptor de GLP-1 (por ejemplo, más de aproximadamente 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, o 20 veces) .

Otras modificaciones y combinaciones Se pueden hacer modificaciones adicionales al péptido relacionado con glucagón de la clase 1 que pueden aumentar adicionalmente la solubilidad y/o estabilidad y/o actividad de glucagón. El péptido relacionado con glucagón de la clase 1 puede comprender alternativamente otras modificaciones que no afectan sustancialmente la solubilidad o estabilidad y que no reducen sustancialmente la actividad de glucagón. En ejemplos de realizaciones, el péptido relacionado con glucagón de la clase 1 puede comprender un total de hasta 11, hasta 12, o hasta 13 o hasta 14 modificaciones de aminoácido en relación con la secuencia de glucagón nativo. Por ejemplo, se pueden hacer sustituciones conservadoras y no conservadoras, agregados o eliminaciones en cualquiera de las posiciones 2, 5, 7, 10, 11, 12, 13, 14, 17, 18, 19, 20, 21, 24, 27, 28 o 29.

Ejemplos de modificaciones del péptido relacionado con glucagón de la clase 1 incluyen en forma no taxativa: (a) sustituciones no conservadoras, sustituciones conservadoras, agregados o eliminaciones mientras retienen una actividad de agonista de glucagón por lo menos parcial, por ejemplo, sustituciones conservadoras en una o más de las posiciones 2, 5, 7, 10, 11, 12, 13, 14, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 24, 27, 28 o 29, sustituciones de Tyr en la posición 10 con Val o Phe, sustitución de Lys en la posición 12 con Arg, sustitución en una o más de estas posiciones con Ala; eliminación de aminoácidos en las posiciones 29 y/o 28, y opcionalmente en la posición 27, mientras retiene actividad agonista de glucagón por lo menos parcial; modificación del ácido aspártico en la posición 15, por ejemplo, mediante sustitución con ácido glutámico, ácido homoglutámico, ácido cisteico o ácido homocisteico, que puede reducir la degradación, o modificación de la serina en la posición 16, por ejemplo, mediante sustitución de treonina, AIB, ácido glutámico, o con otro aminoácido con carga negativa que tiene una cadena lateral con una longitud de 4 átomos, o alternativamente, con una de glutamina, ácido homoglutámico, o ácido homocisteico, que en forma similar puede reducir la degradación debido a la descomposición del enlace de Aspl5-Serl6; agregado de un grupo hidrófilo tal como el polímero soluble en agua polietilenglicol , como se describe en la presente, por ejemplo en la posición 16, 17, 20, 21, 24, 29, 40 o el aminoácido del extremo de C, que puede aumentar la solubilidad y/o la semivida; modificación de la metionina en la posición 27, por ejemplo, mediante la sustitución con leucina o norleucina, para reducir la degradación oxidativa; modificación de la Gln en la posición 20 o 24 mediante sustitución con Ser, Thr, Ala o AIB, para reducir la degradación que ocurre a través de la desaminación de Gln, modificación de Asp en la posición 21, por ejemplo, mediante sustitución con Glu, para reducir la degradación que ocurre a través de la deshidratación de ASp para formar un compuesto intermedio de succinimida cíclica seguido por la isomerización hacia iso-aspartato; modificaciones en la posición 1 o 2 como se describe en la presente que mejoran la resistencia a la descomposición de DPP-IV, opcionalmente en combinación con un puente intramolecular tal como un puente de lactama entre las posiciones "i" e "i+4" en donde i es un número entero de 12 a 25, por ejemplo 12, 16, 20, 24.

Acilación o alquilación del péptido de glucagón descrito en la presente, que puede aumentar la actividad en el receptor de glucagón y/o en el receptor de GLP-1, aumentar la semivida en circulación' y/o prolongar la duración de la acción y/o retardar el inicio de acción, opcionalmente combinada con agregado de un grupo hidrófilo, además o alternativamente, combinado opcionalmente con una modificación que reduce selectivamente la actividad en el péptido de GLP-1, por ejemplo una modificación de la Thr en la posición 7, tal como una sustitución de la Thr en la posición 7 con un aminoácido que carece de un grupo hidroxilo, por ejemplo, Abu o lie; eliminación del extremo de C de aminoácidos a un aminoácido en la posición 27 (por ejemplo, eliminación de uno o ambos de los aminoácidos en las posiciones 28 y 29, que da un péptido de 27 o 28 aminoácidos de longitud) ; (j) Prolongaciones de extremo de C descritas en la presente ; (k) Homodimerización o heterodimerización descritas en la presente; y combinaciones de (a) a (k) .

En algunas realizaciones, ejemplos de modificaciones del péptido relacionado con glucagón de la clase 1 incluyen por lo menos una modificación de aminoácido seleccionado del Grupo A y una o más modificaciones de aminoácido seleccionadas del Grupo B y/o del Grupo C, en donde el Grupo A es: sustitución de Asn en la posición 28 con un aminoácido con carga; sustitución de Asn en la posición 28 con un aminoácido con una carga seleccionado del grupo formado por Lys, Arg, His, Asp, Glu, ácido cisteico y ácido homocisteico, sustitución en la posición 28 con Asn, Asp o Glu; sustitución en la posición 28 con Asp; sustitución en la posición 28 con Glu; sustitución de Thr en la posición 29 con un aminoácido con carga; sustitución de Thr en la posición 29 con un aminoácido con carga seleccionado grupo formado por Lys, Arg, His, Asp, Glu, ácido cisteico, y ácido homocisteico; sustitución en la posición 29 con Asp, Glu o Lys; sustitución en la posición 29 con Glu; inserción de 1-3 aminoácidos con carga después de la posición 29; inserción después de la posición 29 de Glu o Lys, inserción después de la posición 29 de Gly-Lys o Lys-Lys ; o combinaciones de ellas, en donde el grupo B es: sustitución de Asp en la posición 15 con Glu; sustitución de Ser en la posición 16 con Thr o AIB; y en donde el grupo C es: sustitución de His en la posición 1 con un aminoácido no nativo que reduce la susceptibilidad del péptido de glucagón a la descomposición por dipeptidil peptidasa IV (DPP-IV) , sustitución de Ser en la posición 2 con un aminoácido no nativo que reduce la susceptibilidad del péptido de glucagón a la descomposición por dipeptidil peptidasa IV (DPP-IV) , sustitución de Lys en la posición 12 con Arg; sustitución de Gln en la posición 20 con Ser, Thr, Ala o AIB; sustitución de Asp en la posición 21 con Glu; sustitución de Gln en la posición 24 con Ser, Thr, Ala o AIB; sustitución de Met en la posición 27 con Leu o Nle; eliminación de aminoácidos en las posiciones 27-29; eliminación de aminoácidos en las posiciones 28-29; eliminación del aminoácido en la posición 29; o combinaciones de ellas.

En ejemplos de realizaciones, Lys en la posición 12 se sustituye con Arg. En otros ejemplos de realizaciones los aminoácidos en las posiciones 29 y/o 28 y opcionalmente en la posición 27 se eliminan .

En algunas realizaciones específicas, el péptido de glucagón comprende (a) una modificación de aminoácido en la posición 1 y/o 2, que confiere resistencia a DPP-IV, por ejemplo, sustitución con DMIA en la posición 1, o AIB en la posición 2, (b) un puente intramolecular dentro de las posiciones 12-29, por ejemplo en las posiciones 16 y 20, o una o más sustituciones de aminoácidos en las posiciones 16, 20, 21 y 24 con un aminoácido a,a disustituido, opcionalmente (c) unido a un grupo hidrófilo tal como PEG, por ejemplo, a través de Cys en la posición 24, 29 o en el aminoácido del extremo de C, opcionalmente (d) una modificación de aminoácido en la posición 27 que sustituye Met con por ejemplo, Nle, opcionalmente (e) modificaciones de aminoácidos en las posiciones 20, 21 y 24 que reducen la degradación y opcionalmente (f) unido a SEQ ID NO 820. Cuando el péptido de glucagón está unido a SEQ ID NO 820, el aminoácido en la posición 29 en ciertas realizaciones es Thr o Gly. En otras realizaciones específicas, el péptido de glucagón comprende: (a) Asp28Glu29, o Glu28Glu29, o Glu29Glu30, o Glu28Glu30 o Asp28Glu30, y opcionalmente (b) una modificación de aminoácido en la posición 16 que sustituye Ser con, por ejemplo, Thr o AIB, y opcionalmente (c) una modificación de aminoácido en la posición 27 que sustituye Met con, por ejemplo, Nle, y opcionalmente (d) modificaciones de aminoácidos en las posiciones 20, 21 y 24 que reducen la degradación. En una realización específica, el péptido de glucagón es T16, A20, E21, A24, Nle27, D28, E29.

En algunas realizaciones el péptido relacionado con glucagón de la clase 1 comprende la secuencia de aminoácido: Xl-X2-Gln-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Lys-Tyr-Leu-Asp-Ser-Arg-Arg-Ala-Gln-Asp-Phe-Val-Gln-Trp-Leu-Met-Z (SEQ ID NO: 839) con 1 a 3 modificaciones de aminoácido de ella, en donde XI y/o X2 es un aminoácido no reactivo que reduce la susceptibilidad (o aumenta la resistencia) del péptido de glucagón a la descomposición por dipeptidil peptidasa IV (DPP-IV), en donde Z se selectciona del grupo formado por -COOH (el carboxilato del extremo de C natural) , -Asn-COOH, Asn-Thr-COOH, y Y-COOH, en donde Y tiene de 1 a 2 aminoácidos, y en donde un puente intramolecular, específicamente un enlace covalente, conecta las cadenas laterales de un aminoácido en la posición i y un aminoácido en la posición i+4, en donde i es 12, 16, 20 o 24.

En algunas realizaciones, el puente intramolecular es un puente de lactama. En algunas realizaciones, los aminoácidos en las posiciones i e i+4 de SEQ ID NO 839 son Lys y Glu, por ejemplo, Glul6 y Lys20. En algunas realizaciones, XI se selecciona del grupo formado por D-His, N-metil-His, alfa-metil-His, ácido imidazol acético, des-amino-His , hidroxil -His , acetil-His, homo-His, y ácido alfa, ácido alfa-dimetil imidazol acético (DMIA) . En otras realizaciones, X2 se selecciona del grupo formado por: D-Ser, D-Ala, Gly, N-metil-Ser, Val, y ácido alfa, amino isobutírico (AIB) . En algunas realizaciones, el péptido de glucagón está unido en forma covalente a un grupo hidrófilo en cualquiera de las posiciones de aminoácido 16, 17, 20, 21, 24, 29, 40, dentro de una prolongación del extremo de C, o en el aminoácido del extremo de C. En ejemplos de realizaciones, este grupo hidrófilo está unido en forma covalente a un residuo de Lys, Cys, Orn, homocisteína, o acetil-fenilalanina en cualquiera de estas posiciones. Ejemplos de gruops hidrófilos incluyen polietilenglicol (PEG) , por ejemplo, de un peso molecular de alrededor de 1.000 Dalton a 40.000 Dalton, o de alrededor de 20.000 Dalton a 40.000 Dalton.

En otras realizaciones, el péptido relacionado con glucagón de la clase 1 comprende la secuencia de aminoácido: Xl-X2-Gln-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Lys-Tyr-Leu-Asp-Ser-Arg-Arg-Ala-Gln-Asp-Phe-Val-Gln-Trp-Leu-Met-Z (SEQ ID NO: 839) , en donde XI y/o X2 es un aminoácido no nativo que reduce la susceptibilidad (o aumenta la resistencia) del péptido de glucagón a la descomposición por dipeptidil peptidasa IV (DPP-IV) , en donde una, dos, tres, cuatro o más de las posiciones 16, 20, 21, y 24 del péptido de glucagón se sustituye con un aminoácido , a-disustituido, y en donde Z se selecciona del grupo formado por -COOH (el carboxilato del extremo de C natural) , -Asn-COOH, Asn-Thr-COOH, y Y-COOH, en donde Y tiene de 1 a 2 aminoácidos.

Ejemplos de otras modificaciones de aminoácidos de los péptidos relacionados con glucagón de la Clase 1 o análogos de ellos incluyen sustituciones de Thr en la posición 7 con un aminoácido que carece de un grupo hidroxilo, por ejemplo, ácido aminobutírico (Abu) , lie, opcionalmente , en combinación con la sustitución o agregado de un aminoácido que comprende una cadena lateral unida en forma covalente (opcionalmente, a través de un separador) a un grupo acilo o alquilo, cuyo grupo acilo o alquilo es no nativo a un aminoácido natural; sustitución de Lys en la posición 12 con Arg; sustitución de Asp en la posición 15 con Glu; sustitución de Ser en la posición 16 con Thr o AIB; sustitución de Gln en la posición 20 con Ser, Thr, Ala o AIB; sustitución de Asp en la posición 21 con Glu; sustitución de Gln en la posición 24 con Ser, Thr, Ala o AIB; sustitución de et en la posición 27 con Leu o Nle; sustitución de Asn en la posición 28 con un aminoácido con carga; sustitución de Asn en la posición 28 con un aminoácido con carga seleccionado del grupo formado por Lys, Arg, His, Asp, Glu, ácido cisteico, y ácido homocisteico; sustitución en la posición 28 con Asn, Asp, o Glu; sustitución en la posición 28 con Asp; sustitución en la posición 28 con Glu; sustitución de Thr en la posición 29 con un aminoácido con carga; sustitución de Thr en la posición 29 con un aminoácido con carga seleccionado del grupo formado por Lys, Arg, His, Asp, Glu, ácido cisteico, y ácido homocisteico; sustitución en la posición 29 con Asp, Glu, o Lys; sustitución en la posición 29 con Glu; inserción de 1-3 aminoácidos con carga en la posición 29; inserción en la posición 30 (es decir, después de la posición 29) de Glu o Lys; opcionalmente con inserción en la posición 31 de Lys; agregado de SEQ ID NO: 820 al extremo de C, opcionalmente en donde el aminoácido en la posición 29 es Thr o Gly; sustitución o agregado de un aminoácido unido en forma covalente a un grupo hidrófilo; o combinación de ellos.

Cualquiera de las modificaciones descritas en la presente con referencia a los agonistas de glucagon de la clase 1 que aumenta la actividad de receptor de glucagon, retiene la actividad de receptor de glucagon parcial, mejora la solubilidad, aumenta la estabilidad, o reduce la degradación se puede aplicar a los péptidos de glucagon de la Clase 1 individualmente o combinados. Por lo tanto, se pueden preparar péptidos relacionados con glucagon de la clase 1 que retienen por lo menos el 20% de la actividad del glucagón nativo en el receptor de glucagón, y que son solubles a una concentración de por lo menos 1 mg/ml, a un pH de entre 6 y 8 o entre 6 y 9 (por ejemplo pH 7) , y opcionalmente retienen por lo menos un 95% del péptido original (por ejemplo, un 5% o menos del péptido original se degrada o se descompone) después de 24 hora a 25 °C. Alternativamente, se pueden preparar péptidos de glucagón de la clase 1 de alta potencia que presentan por lo menos alrededor de un 100%, 125%, 150%, 175%, 200%, 250%, 300%, 350%, 400%, 450%, 500%, 600%, 700%, 800%, 900% o 10 veces o más de la actividad de glucagón nativo en el receptor de glucagón, y opcionalmente son solubles a una concentración de por lo menos 1 mg/ml, a un pH de entre 6 y 8 o entre 6 y 9 (por ejemplo, pH 7) y opcionalmente retiene por lo menos un 95% del péptido original (por ejemplo un 5% o menos del péptido original se degrada o se descompone) después de 24 horas a 25°C. En algunas realizaciones, los péptidos de glucagón de la Clase 1 descritos en la presente pueden presentar por lo menos cualquiera de los niveles relativos indicados anteriormente de actividad en el receptor de glucagón pero no más del 10.000%, 100.000% o 1.000.000% de la actividad del glucagón nativo en el receptor de glucagón .

Ejemplos de realizaciones de péptidos relacionados con glucagón de la Clase 1 De acuerdo con algunas realizaciones, el péptido de glucagón nativo de SEQ ID NO 801 se modifica mediante la sustitución del aminoácido nativo en la posición 28 y/o 29 con un aminoácido de carga negativa (por ejemplo, ácido aspártico, o ácido glutámico) y opcionalmente el agregado de un aminoácido de carga negativa (por ejemplo, ácido aspártico o ácido glutámico) al extremo de carboxi del péptido. En una realización alternativa el péptido de glucagón nativo de SEQ ID NO 801 se modifica mediante la sustitución del aminoácido nativo en la posición 29 con un aminoácido con carga positiva (por ejemplo, lisina, arginina, o histidina) y opcionalmente el agregado de uno o dos aminoácidos de carga positiva, (por ejemplo, lisina, arginina o histidina) sobre el extremo de carboxi del péptido. De acuerdo con algunas realizaciones se proporciona un análogo de glucagón que tiene solubilidad y estabilidad mejorada en donde el análogo comprende la secuencia de aminoácido de SEQ ID NO 834 con la condición de que por lo menos un aminoácido en la posición 28 o 29 se sustituya con un aminoácido y/o un aminoácido ácido adicional se agregue en el extremo de carboxi de SEQ ID NO 834. En algunas realizaciones, los aminoácidos ácidos se seleccionan independientemente del grupo formado por Asp, Glu, ácido cisteico y ácido homocisteico .

De acuerdo con algunas realizaciones, se proporciona un agonista de glucagón que tiene solubilidad y estabilidad mejorada en donde el agonista comprende la secuencia de aminoácido de SEQ ID NO 833, en donde por lo menos uno de los aminoácidos en las posiciones 27, 28 o 29 se sustituye con un residuo de aminoácido no nativo (es decir, por lo menos un aminoácido presente en la posición 27, 28 o 29 del análogo es un aminoácido diferente del aminoácido presente en la posición correspondiente de SEQ ID NO 801) . De acuerdo con algunas realizaciones se proporciona un agonista de glucagón que comprende la secuencia de SEQ ID NO 833 con la condición de que cuando el aminoácido en la posición 28 es asparagina y el aminoácido en la posición 29 es treonina, el péptido además comprende uno a dos aminoácidos, independientemente seleccionados del grupo formado por Lys, Arg, His, Asp o Glu, agregado al extremo de carboxi del péptido de glucagón .

Se ha descubierto que ciertas posiciones del péptido de glucagón nativo se pueden modificar mientras retienen por lo menos algo de la actividad del péptido parental . Por consiguiente, los solicitantes anticipan que uno o más de los aminoácidos ubicados en las posiciones 2, 5, 7, 10, 11, 12, 13, 14, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 24, 27, 28 o 29 del péptido de SEQ ID NO: 811 se puede sustituir con un aminoácido diferente de aquel presente en el péptido de glucagon nativo, y aún retener la potencia mejorada, estabilidad de pH fisiológico y actividad biológica del péptido de glucagon parental. Por ejemplo, de acuerdo con algunas realizaciones, el residuo de metionina presente en la posición 27 del péptido nativo se convierte en leucina o norleucina para impedir la degradación oxidativa del péptido.

En algunas realizaciones se proporciona un análogo de glucagon de SEQ ID NO 822 en donde 1 a 6 aminoácidos seleccionados de las posiciones 1, 2, 5, 7, 10, 11, 12, 13, 14, 16, 17, 18, 19, 20, 21 o 24 del análogo difieren del aminoácido correspondiente de SEQ ID NO 801. De acuerdo con otra realización se proporciona un análogo de glucagon de SEQ ID NO 833 en donde de 1 a 3 aminoácidos seleccionados de las posiciones 1, 2, 5, 7, 10, 11, 12, 13, 14, 16, 17, 18, 19, 20, 21 o 24 del análogo difieren del aminoácido correspondiente de SEQ ID NO 801. En otra realización, se proporciona un análogo de glucagon de SEQ ID NO 807, SEQ ID NO 808 o SEQ ID NO 834 en donde 1 a 2 aminoácidos seleccionados de las posiciones 1, 2, 5, 7, 10, 11, 12, 13, 14, 16, 17, 18, 19, 20, 21 o 24 del análogo difieren del aminoácido correspondiente de SEQ ID NO 801, y en otra realización uno a dos aminoácidos diferentes representan sustituciones de aminoácidos conservadoras en relación con el aminoácido presente en la secuencia nativa (SEQ ID NO 801) . De acuerdo con algunas realizaciones, se proporciona un péptido de glucagón de SEQ ID NO 811 o SEQ ID NO 813 en donde el péptido de glucagón además comprende una, dos o tres sustituciones de aminoácido en las posiciones seleccionadas de las posiciones 2, 5, 7, 10, 11, 12, 13, 14, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 24, 27 o 29. En algunas realizaciones, las sustituciones en las posiciones 2, 5, 7, 10, 11, 12, 13, 14, 16, 17, 18, 19, 20, 27 o 29 son sustituciones de aminoácido conservadoras.

En algunas realizaciones, se proporciona un agonista de glucagón que comprende un péptido análogo de SEQ ID NO 801 en donde el análogo difiere de SEQ ID NO 801 en que tiene un aminoácido diferente de serina en la posición 2 y en que tiene un aminoácido sustituido por el aminoácido nativo en la posición 28 o 29 o un aminoácido acídico agregado al extremo de carboxi del péptido de SEQ ID NO 801. En algunas realizaciones el aminoácido ácido es ácido aspártico o ácido glutámico. En algunas realizaciones se proporciona un análogo de glucagón de SEQ ID NO 809, SEQ ID NO 812, SEQ ID NO: 813 o SEQ ID NO: 832 en donde el análogo difiere de la molécula parental por una sustitución en la posición 2. Más específicamente, la posición 2 del péptido análogo se sustituye con un aminoácido seleccionado del grupo formado por D-serina, alanina, D-alanina, glicina, n-metil serina y ácido amino isobutírico .

En otra realización, se proporciona un agonista de glucagón que comprende un peptido análogo de SEQ ID NO 801 en donde el análogo difiere de SEQ ID NO 801 en que tiene un aminoácido diferente de histidina en la posición 1 y en que tiene un aminoácido acídico que sustituye al aminoácido nativo en la posición 28 o 29 o un aminoácido acídico agregado al extremo de carboxi del péptido de SEQ ID NO 801. En algunas realizaciones, el aminoácido ácido es ácido aspártico o ácido glutámico. En algunas realizaciones, se proporciona un análogo de glucagón de SEQ ID NO: 809, SEQ ID NO: 812, SEQ ID NO: 813 o SEQ ID NO: 832 en donde el análogo difiere del aminoácido parental por una sustitución en la posición 1. Más específicamente, la posición 1 del péptido análogo se sustituye con un aminoácido seleccionado del grupo formado por DMIA, D-histidina, desaminohistidina, hidroxil-histidina, acetil-histidina y homo-histidina .

De acuerdo con algunas realizaciones, el péptido de glucagón modificado comprende una secuencia seleccionada del grupo formado por SEQ ID NO: 809, SEQ ID NO: 812, SEQ ID NO: 813 y SEQ ID NO: 832. En otra realización se proporciona un péptido de glucagón que comprende una secuencia de SEQ ID NO: 809, SEQ ID NO: 812, SEQ ID NO: 813 o SEQ ID NO: 832 que además comprende uno a dos aminoácidos, agregados el extremo de C de SEQ ID NO: 809, SEQ ID NO: 812, SEQ ID NO: 813 o SEQ ID NO: 832, en donde los aminoácidos adicionales se seleccionan independientemente del grupo formado por Lys, Arg, His, Asp Glu, ácido cisteico o ácido homocisteico . En algunas realizaciones, los aminoácidos adicionales agregados al extremo de carboxi se seleccionan del grupo formado por Lys, Arg, His, Asp o Glu o en una realización adicional los aminoácidos adicionales son Asp o Glu.

En otra realización, el péptido de glucagon comprende la secuencia de SEQ ID NO 7 o un agonista de glucagon de él . En algunas realizaciones el péptido comprende una secuencia del grupo formado por SEQ ID NO: 808, SEQ ID NO: 810, SEQ ID NO: 811, SEQ ID NO: 812 y SEQ ID NO: 813. En otra realización el péptido comprende una secuencia seleccionada del grupo formado por SEQ ID NO: 808, SEQ ID NO: 810 y SEQ ID NO: 811. En algunas realizaciones el péptido de glucagon comprende la secuencia de SEQ ID NO: 808, SEQ ID NO: 810 y SEQ ID NO: 811 que además comprende un aminoácido adicional, seleccionado del grupo formado por Asp y Glu, agregado al extremo de C del péptido de glucagon. En algunas realizaciones el péptido de glucagon comprende la secuencia de SEQ ID NO 811 o SEQ ID NO 813, y en otra realización el péptido de glucagon comprende la secuencia de SEQ ID NO 811.

De acuerdo con algunas realizaciones se proporciona un agonista de glucagón que comprende un péptido de glucagón modificado seleccionado del grupo formado por: NH2-His-Ser-Gln-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Lys-Tyr-Leu-Xaa-Ser-Arg-Arg-Ala-Gln-Asp-Phe-Val-Gln-Trp-Leu-Xaa-Xaa-Xaa-R (SEQ ID NO: 834) , NH2-His-Ser-Gln-Gly-Thr-Phe- Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Lys-Tyr-Leu-Asp-Ser- Arg-Arg-Ala-Gln-Asp-Phe-Val -Gln-Trp-Leu- Met-Asp-Thr-R (SEQ ID NO: 811) y NH2-His-Ser-Gln-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Xaa-Tyr-Leu-Glu-Ser-Arg-Arg-Ala-Gln-Asp-Phe-Val-Gln-Trp-Leu-Met-Asp-Thr-R (SEQ ID NO: 813) en donde Xaa en la posición 15 es Asp, Glu, ácido cisteico, ácido homoglutámico o ácido homocisteico, Xaa en la posición 28 es Asn o un aminoácido ácido y Xaa en la posición 29 es Thr o un aminoácido ácido y R es un aminoácido ácido, COOH o CONH2, con la condición de que un residuo de ácido ácido esté presente en una de las posiciones 28, 29 o 30. En algunas realizaciones, R es COOH y en otra realización R es C0NH2.

La presente invención también comprende péptidos de fusión de glucagón en donde un segundo péptido se ha fusionado al extremo de C del péptido de glucagón para mejorar la estabilidad y solubilidad del péptido de glucagón. Más específicamente, el péptido de glucagón de fusión puede comprender un análogo de agonista de glucagón que comprende un péptido de glucagón NH2-His-Ser-Gln-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Lys-Tyr-Leu-Xaa-Ser-Arg-Arg-Ala-Gln-Asp-Phe-Val-Gln-Trp-Leu-Xaa-Xaa-Xaa-R (SEQ ID NO: 834) , en donde R es un aminoácido ácido o un enlace y una secuencia de aminoácido de SEQ ID NO: 820 (GPSSGAPPPS) , SEQ ID NO: 821 (KRNRNNIA) o SEQ ID NO: 822 (KRNR) unida al aminoácido del extremo de carboxi del péptido de glucagón. En algunas realizaciones el péptido de glucagón se selecciona del grupo formado por SEQ ID NO: 833, SEQ ID NO: 807 o SEQ ID NO: 808 que además comprende una secuencia de aminoácido de SEQ ID NO: 820 (GPSSGAPPPS), SEQ ID NO: 821 (KRNRNNIA) o SEQ ID NO: 822 (KRNR) unida al aminoácido del extremo de carboxi del péptido de glucagón. En algunas realizaciones el péptido de fusión de glucagón comprende SEQ ID NO: 802, SEQ ID NO: 803, SEQ ID NO: 804, SEQ ID NO: 805 y SEQ ID NO: 806 o un análogo de agonista de glucagón de él, que además comprende una secuencia de aminoácido de SEQ ID NO: 820 (GPSSGAPPPS), SEQ ID NO: 821 (KRNRNNIA) o SEQ ID NO: 822 (KRNR) unida al aminoácido 29 del péptido de glucagón. De acuerdo con algunas de las realizaciones el péptido de fusión además comprende una cadena de PEG unida a un aminoácido en la posición 16, 17, 21, 24, 29, dentro de la prolongación del extremo de C, o en el aminoácido del extremo de C, en donde la cadena de PEG se selecciona de la gama de 500 a 40.000 Dalton. En algunas realizaciones la secuencia de aminoácido de SEQ ID NO: 820 (GPSSGAPPPS) , SEQ ID NO: 821 (KRNRNNIA) o SEQ ID NO: 822 (KRNR) está unida al aminoácido 29 del p>éptido de glucagón a través de un enlace de péptido. En algunas realizaciones, la parte de péptido de glucagón del péptido de fusión de glucagón comprende una secuencia seleccionada del grupo que comprende SEQ ID NO: 810, SEQ ID NO: 811 y SEQ ID NO: 813. En algunas realizaciones la parte de péptido de glucagón del péptido de fusión de glucagón comprende la secuencia de SEQ ID NO 811 o SEQ ID NO 813, en donde una cadena de PEG está unida en la posición 21, 24, 29 dentro de una prolongación del extremo de C o en el aminoácido del extremo de C, respectivamente.

En otra realización la secuencia de péptido de glucagón del péptido de fusión comprende la secuencia de SEQ ID NO 811, que además comprende una secuencia de aminoácido de SEQ ID NO: 820 (GPSSGAPPPS), SEQ ID NO: 821 (KRNRNNIA) o SEQ ID NO: 822 (KRNR) unida al aminoácido 29 del péptido de glucagón. En algunas realizaciones el péptido de fusión de glucagón comprende una secuencia seleccionada del grupo formado por SEQ ID NO: 824, SEQ ID NO: 825 y SEQ ID NO: 826. Generalmente, los péptidos de fusión de la presente invención tienen un aminoácido del extremo de C con el grupo ácido carboxílico estándar. Sin embargo, los análogos de estas secuencias en donde el aminoácido del extremo de C tiene una amida que sustituye al ácido carboxílico también están contemplados como realizaciones. De acuerdo con algunas realizaciones, el péptido de glucagón de fusión comprende un análogo de agonista de glucagón seleccionado del grupo formado por SEQ ID NO: 810, SEQ ID NO: 811 y SEQ ID NO: 813, que además comprende una secuencia de aminoácido de SEQ ID NO: 823 (GPSSGAPPPS-CONH2) unida al aminoácido 29 del péptido de glucagón.

Los agonistas de glucagón de la presente invención también se pueden modificar para mejorar la solubilidad y estabilidad del péptido en soluciones acuosas mientras retienen la actividad biológica del péptido de glucagón. De acuerdo con algunas realizaciones, la introducción de grupos hidrófilos en una o más posiciones seleccionadas de las posiciones 16, 17, 20, 21, 24 y 29 del péptido de SEQ ID NO: 811, o un análogo de agonista de glucagón de él, se anticipan para mejorar la solubilidad y estabilidad del pH del análogo de glucagón. Más específicamente, en algunas realizaciones el péptido de glucagón de SEQ ID NO: 810, SEQ ID NO: 811, SEQ ID NO: 813, o SEQ ID NO: 832 se modifica para comprender uno o más grupos hidrófilos unidos en forma covalente a las cadenas laterales de los aminoácidos presentes en las posiciones 21 y 24 del péptido de glucagón.

De acuerdo con algunas realizaciones, el péptido de glucagon de SEQ ID NO 811 se modifica para contener una o más sustituciones de aminoácidos en las posiciones 16, 17, 20, 21, 24 y/o 29, en donde el aminoácido nativo se sustituye con un aminoácido que tiene una cadena lateral adecuada para el entrecruzamient.o con grupos hidrófilos, que incluyen por ejemplo, PEG. El péptido nativo se puede sustituir con un aminoácido natural o un aminoácido sintético (no natural) . Los aminoácidos sintéticos o no naturales se refieren a aminoácidos que no ocurren naturalmente in vivo pero que, de todos modos, se pueden incorporar en las estructuras de péptidos descritas en la presente .

En algunas realizaciones, se proporciona un agonista de glucagon de SEQ ID NO: 810, SEQ ID NO: 811 o SEQ ID NO: 813 en donde la secuencia del péptido de glucagon nativo se ha modificado para contener un aminoácido natural o sintético en por lo menos una de las posiciones 16, 17, 21, 24, 29, dentro de una prolongación de extremo de C o en el aminoácido del extremo de C de la secuencia nativa, en donde el sustituto de aminoácido además comprende un grupo hidrófilo. En algunas realizaciones la sustitución es- en la posición 21 o 24, y en otra realización el grupo hidrófilo es una cadena de PEG. En algunas realizaciones el péptido de glucagon de SEQ ID NO 811 se sustituye con por lo menos un residuo de cisteína, en donde la cadena lateral del residuo de cisteína se modifica adicionalmente con un reactivo de tiol, que incluye por ejemplo, maleimido, vinil sulfona, 2-piridiltio, haloalquilo, y haloacilo. Estos reactivos de tiol pueden contener grupos carboxi, ceto, hidroxilo y éter así como otros grupos hidrófilos tales como unidades de polietilenglicol . En una realización alternativa, el péptido de glucagon nativo se sutituye con lisina, y la cadena lateral del residuo de lisina susituyente se modifica adicionalmente usando reactivos de amina tales como esteres activos (succinimido, anhídrido, etc.) de ácidos carboxílicos o aldehidos de grupos hidrófilos tales como polietilenglicol. En algunas realizaciones el péptido de glucagon se selecciona del grupo formado por SEQ ID NO: 814, SEQ ID NO: 815, SEQ ID NO: 816, SEQ ID NO: 817, SEQ ID NO: 818 y SEQ ID NO: 819.

De acuerdo con algunas realizaciones el péptido de glucagon pegilado comprende dos o más cadenas de polietilenglicol unidas en forma covalente al péptido de glucagon en donde el peso molecular total de las cadenas de glucagon es de aproximadamente 1.000 a 5.000 Dalton. En algunas realizaciones el agonista de glcuagón pegilado comprende un péptido de SEQ ID NO 806, en donde una cadena de PEG está unida en forma covalente al residuo de aminoácido en la posición 21 y en la posición 24, y en donde el peso molecular combinado de las dos cadenas de PEG es de 1.000 a 5.000 Dalton. En otra realización el agonista de glucagón pegilado comprende un péptido de SEQ ID NO 806, en donde la cadena de PEG se une en forma covalente al residuo de aminoácido en la posición 21 y en la posición 24, y en donde el peso molecular combinado de las dos cadenas de PEG es de aproximadamente 5.000 a 20.000 Dalton.

La cadena de polietilenglicol puede estar en la forma de una cadena recta o puede ser ramificada. De acuerdo con algunas realizaciones la cadena de polietilenglicol tiene un peso molecular promedio seleccionado de la gama de alrededor de 500 a 40.000 Dalton. En algunas realizaciones la cadena de polietilenglicol tiene un peso molecular seleccionado de la gama de aproximadamente 500 a 5.000 Dalton. En otra realización la cadena de polietilenglicol tiene un peso molecular de aproximadamente 20.000 a 40.000 Dalton.

Cualquiera de los péptidos de glucagón descritos anteriormente puede modificarse adicionalmente para incluir un puente intramolecular covalente o no covalente o un aminoácido que estabiliza la alfa hélice dentro de la parte del extremo de C del péptido de glucagón (posiciones de aminoácido 12-29) . De acuerdo con algunas realizaciones, el péptido de glucagón comprende una o más de cualquiera de las modificaciones discutidas en la presente además de una sustitución de aminoácido en las posiciones 16, 20, 21, o 24 (o una combinación de ellos) con un aminoácido a,a-disustituido , por ejemplo AIB. De acuerdo con otra realización, el péptido de glucagón comprende una o más de cualquiera de las modificaciones discutidas anteriormente además de un puente intramolecular, por ejemplo, una lactama, entre las cadenas laterales de los aminoácidos en las posiciones 16 y 20 del péptido de glucagón.

De acuerdo con algunas realizaciones el péptido de glucagón comprende la secuencia de aminoácido de SEQ ID NO 877, en donde Xaa en la posición 3 es un aminoácido que comprende una cadena lateral de la Estructura I, II o III: O •^-R1-CH2-X-W-R2 Estructura I O •|-R1-CH2--Y Estructura II O |-R1-CH2-S-CH2-R4 Estructura III en donde R1 es alquilo de C0-3 o heteroalquilo de C0-3 ; R2 es NHR4 o alquilo de Ci-3; R3 es alquilo de Ci-3; R4 es H o alquilo de Ci_3; X es H, O, o S; e Y es NHR4, SR3, o OR3. En algunas realizaciones, X es NH o Y es NHR4. En algunas realizaciones, R1 es alquilo de C0-2 o heteroalquilo de Ci. En algunas realizaciones, R2 es NHR4 o alquilo de Ci. En algunas realizaciones, R4 es H o alquilo de C1. En ejemplos de realizaciones se proporciona un aminoácido que comprende una cadena lateral de la Estructura I en donde R1 es CH2-S, X es NH, y R2 es CH3 (acetamidometil-cisteína, C (Acm) ) ; R1 es CH2, X es NH, y R2 es CH3 (ácido acetildiaminobutanoico, Dab(Ac)); R1 es alquilo de C0, X es NH, R2 es NHR4, y R4 es H (ácido carbamoildiaminopropanoico, Dap(urea)); o R1 es CH2-CH2, X es NH, y R2 es CH3 (acetilornitina, Orn(Ac)). En ejemplos de realizaciones se proporciona un aminoácido que comprende una cadena lateral de la Estructura II, en donde R1 es CH2, Y es NHR4, y R4 es CH3 (metilglutamina, Q(Me)); En ejemplos de realizaciones se proporciona un aminoácido que comprende una cadena lateral de la Estructura III en donde R1 es CH2 y R4 es H (sulfóxido de metionina, M(O)); En realizaciones específicas, el aminoácido en la posición 3 se sustituye con Dab(Ac). Por ejemplo, los agonistas de glucagón pueden comprender la secuencia de aminoácido de SEQ ID NO: 863, SEQ ID NO: 869, SEQ ID NO : 871, SEQ ID NO: 872, SEQ ID NO: 873, y SEQ ID NO: 874.

En ciertas realizaciones, el péptido de glucagón es un análogo del péptido de glucagón de SEQ ID NO 877. En aspectos específicos, el análogo comprende cualquiera de las modificaciones de aminoácidos descritas en la presente, que incluyen, en forma no taxativa, una sustitución de Asn en la posición 28 con un aminoácido con una carga, una sustitución de Asn en la posición 28 con un aminoácido con una carga seleccionado del grupo formado por Lys, Arg, His, Asp, Glu, ácido cisteico, y ácido homocisteico, una sustitución en la posición 28 con Asn, Asp, o Glu, una sustitución en la posición 28 con Asp, una sustitución en la posición 28 con Glu, una sustitución de Thr en la posición 29 con un aminoácido con una carga, una sustitución de Thr en la posición 29 con un aminoácido con una carga seleccionado del grupo formado por Lys, Asp, His, Glu, ácido cisteico y ácido homocisteico, una sustitución en la posición 29 con Asp, Glu, o Lys, una sustitución en la posición 24 con Glu, una inserción de 1-3 aminoácidos con una carga después de la posición 29, una inserción después de la posición 29 de Glu o Lys, una inserción después de la posición 29 de Gly-Lys or Lys-Lys y una combinación de ellas.

En ciertas realizaciones, el análogo del péptido de glucagón de SEQ ID NO 877 comprende un aminoácido a, a-disustituido, tal como AIB en una, dos, tres o todas las posiciones 16, 20, 21 y 24.

En ciertas realizaciones el análogo del péptido de glucagón de SEQ ID NO 877 comprende una o más de las siguientes: sustitución de His en la posición 1 con un aminoácido no nativo que reduce la susceptibilidad del péptido de glucagón a la descomposición por dipeptidil peptidasa IV (DPP-IV) , sustitución de Ser en la posición 2 con un aminoácido no nativo que reduce la susceptibilidad del péptido de glucagón a la descomposición por dipeptidil peptidasa IV (DPP-IV) , sustitución de Thr en la posición 7 con un aminoácido que carece de un grupo hidroxilo, por ejemplo, sustitución de Abu o lie, sustitución de Tyr en la posición 10 con Phe o Val, sustitución de Lys en la posición 12 con Arg, sustitución de Asp en la posición 15 con Glu, sustitución de Ser en la posición 16 con Thr o AIB, sustitución de Gln en la posición 20 Ala o AIB, sustitución de Asp en la posición 21 con Glu, sustitución de Gln en la posición 24 con Ala o AIB, sustitución de Met en la posición 27 con Leu o Nle, eliminación de aminoácidos en las posiciones 27-29, eliminación de aminoácidos en las posiciones 28-29, eliminación del aminoácido en la posición 29, agregado de la secuencia de aminoácido de SEQ ID NO 820 del extremo de C, en donde el aminoácido en la posición 29 es Thr o Gly o una combinación de De acuerdo con realizaciones especificas, el péptido de glucagón comprende la secuencia de aminoácido de cualquiera de SEQ ID NO 862-867 y 869-874.

En ciertas realizaciones, el análogo del péptido de glcuagón que comprende SEQ ID NO 877 comprende un grupo hidrófilo, por ejemplo, PEG, unido en forma covalente al aminoácido en cualquiera de las posiciones 16, 17, 20, 21, 24 y 29 o en el aminoácido del extremo de C.

En ciertas realizaciones el análogo del péptido de glucagón que comprende SEQ ID NO 877 comprende un aminoácido que comprende una cadena lateral unida en forma covalente, opcionalmente , a través de un separador, a un grupo acilo o un grupo alquilo, cuyo grupo acilo o grupo alquilo es no nativo al aminoácido natural. El grupo acilo en algunas realizaciones es un grupo acilo graso de C4 a C30. En otras realizaciones, el grupo alquilo es un alquilo de C4 a C30. En aspectos específicos, el grupo acilo o el grupo alquilo se une en forma covalente a la cadena lateral del aminoácido en la posición 10. En algunas realizaciones, el aminoácido en la posición 7 e lie o Abu.

El agonista de glucagón puede ser un péptido que comprende la secuencia de aminoácido de cualquiera de las SEQ ID NO 801-919, opcionalmente con hasta 1, 2, 3, 4 o 5 modificaciones diferentes que retienen la actividad de agonista de glucagon. En ciertas realizaciones, el agonista de glucagon comprende el aminoácido de cualquiera de SEQ ID NO 859-919.

Péptidos relacionados con glucagon de la Clase 2 En ciertas realizaciones, el péptido relacionado con glucagon es un péptido relacionado con glucagon de la clase 2, que se describe en la presente y en la Solicitud de Patente internacional N° PCT US2009/47447 (presentada el 16 de junio de 2009) , la solicitud de patente provisoria Estadounidense N° 61/090.448 y la solicitud de patente estadounidense N° 61/151.349, cuyo contenido se incluye en la presente por referencia en su totalidad.

Las secuencias biológicas citadas en la siguiente sección (SEQ ID NO 1001-1262) relacionadas con los péptidos relacionados con glucagon de la Clase 2 corresponden a SEQ ID NO 1-262 en la solicitud de patente internacional N° PCT US2009/47447.

Actividad El glucagon nativo no activa el receptor de GIP y normalmente tiene un 1% de la actividad de GLP-1 nativo en el receptor de GLP-1. Las modificaciones en la secuencia de glucagon nativo descritas en la presente producen péptidos relacionados con glucagon de la clase 2 que pueden presentar actividad de glucagon potente equivalente o mejor que la actividad del glucagon nativo (SEQ ID NO 1001) , actividad de GIP potente equivalente o mejor que la actividad de GIP nativo (SEQ ID NO 1004) y/o actividad de GLP-1 potente equivalente o mejor que la actividad de GLP-1 nativo. Al respecto, el péptido relacionado con glucagon de la clase 2 puede ser uno de un coagonista de glucagón/GIP, triagonista de glucagón/GIP/GLP-1, coagonista de GIP/GLP-1 o péptido de glucagon agonista de GIP, como se describen adicionalmente en la presente.

En algunas realizaciones, los péptidos relacionados con glucagon de la clase 2 descritos en la presente presentan una EC50 para la actividad de activación de receptor de GIP de aproximadamente 100 nM o menos, o 75, 50, 25, 10, 8, 6, 5, 4, 3, 2 o 1 nM o menos. En algunas realizaciones, los péptidos relacionados con glucagon de la clase 2 presentan una EC50 para la activación del receptor de glucagon de 100 nM o menos, o de 75, 50, 25, 10, 8, 6, 5, 4, 3, 2 o 1 nM o menos. En algunas realizaciones, los péptidos relacionados con glucagon de la clase 2 presentan una EC50 para la activación del receptor de GLP-1 de 100 nM o menos, o de alrededor de 75, 50, 25, 10, 8, 6, 5, 4, 3, 2 o 1 nM o menos. La activación del receptor se puede medir mediante ensayos in vitro que miden la inducción de cAMP en células HEK293 que sobreexpresan el receptor, por ejemplo, ensayando células HEK293 cotransfectadas con ADN que codifica el receptor y un gen de luciferasa unido al elemento sensible a cAMP como se describe en el Ejemplo 5.

En algunas realizaciones los péptidos relacionados con glucagon de la clase 2 presentan por lo menos alrededor de un 0,1%, 0,2%, 0,3%, 0,4%, 0,5%, 0,6%, 0,7%, 0,8%, 0,9%, 1%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 75%, 100%, 125%, 150%, 175% o 200% o mayor actividad del receptor de GIP en relación con GIP nativo (potencia de GIP) . En algunas realizaciones, los péptidos de glucagon descritos en la presente presentan no más del 1.000%, 10.000%, 100.000%, o 1.000.000% de actividad en el receptor de GIP en relación con GIP nativo. En algunas realizaciones, los péptidos relacionados con glucagon de la clase 2 presentan por lo menos un 1%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 75%, 100%, 125%, 150%, 175%, 200%, 250%, 300%, 350%, 400%, 450%, o 500% o mayor actividad en el receptor de glucagon en relación con el glucagon nativo (potencia de glucagon) . En algunas realizaciones, los péptidos de glcuagón descritos en la presente presentan no más del 1.000%, 10.000%, 100.000%, o 1.000.000% de actividad en el receptor de glucagon en relación con el glucagon nativo. En algunas realizaciones los péptidos relacionados con glucagon de la clase 2 presentan por lo menos alrededor de un 0,1%, 0,2%, 0,3%, 0,4%, 0,5%, 0,6%, 0,7%, 0,8%, 0,9%, 1%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 75%, 100%, 125%, 150%, 175% o 200% o mayor actividad en el receptor de GLP-1 en relación con GLP-1 nativo (potencia de GLP-1). En algunas realizaciones, los péptidos de glucagon descritos en la presente presentan no más del 1.000%, 10.000%, 100.000%, o 1.000.000% de actividad en el receptor de GLP-1 en relación con GLP-1 nativo. La actividad del péptido relacionado con glucagon de la clase 2 en el receptor en relación con un ligando nativo del receptor se calcula sobre la proporción inversa de las EC50 para el péptido relacionado con glucagon de la clase 2 contra el ligando nativo.

En algunas realizaciones, los péptidos relacionados con glucagon de la clase 2 presentan actividad tanto en el receptor de glucagon como en el receptor de GIP ("coagonistas de glucagón/GIP" ) . Estos péptidos relacionados con glucagon de la clase 2 han perdido la selectividad del glucagon nativo para el receptor de glucagon comparados con el receptor de GIP. En algunas realizaciones, la EC50 de los péptidos relacionados con glucagon de la clase 2 en el receptor de GIP es menos de 50 veces, 40 veces, 30 veces o 20 veces diferente (mayor o menor) que la EC50 del receptor de glucagon. En algunas realizaciones, la potencia de GIP del péptido relacionado con glucagon de la clase 2 es menos de aproximadamente 500, 450, 400, 350, 300, 250, 200, 150, 100, 75, 50, 25, 20, 15, 10, o 5 veces diferente (mayor o menor) de la potencia de glucagon. En algunas realizaciones, la relación de la EC50 del péptido relacionado con glucagon en el receptor de GIP dividido por la EC50 del péptido relacionado con glucagon de la Clase 2 en el receptor de glucagon es menos de 100, 75, 60, 50, 40, 30, 20, 15, 10, o 5. En algunas realizaciones la relación de EC50 en el receptor de GIP dividido por la EC50 en el receptor de glucagon es 1 o menos de 1 (por ejemplo, 0,01; 0,013; 0,0167; 0,02; 0,025; 0,03; 0,05; 0,067; 0,1; 0,2) . En algunas realizaciones, la relación de la potencia de GIP del péptido relacionado con glucagon de la clase 2 comparada con la potencia del péptido relacionado con glucagon de la clase 2 es menor que aproximadamente 500, 450, 400, 350, 300, 250, 200, 150, 100, 75, 60, 50, 40, 30, 20, 15, 10, o 5. En algunas realizaciones, la relación de la potencia del receptor de GIP dividido por la potencia en el receptor de glucagon es aproximadamente 1 o menos de 1 (por ejemplo, 0,01; 0,013; 0,0167; 0,02; 0,025; 0,03; 0,05; 0,067; 0,1; 0,2). En algunas realizaciones, la actividad de GLP-1 se ha reducido significati amente o destruido, por ejemplo, mediante la modificación en la posición 7, una eliminación del aminoácido del extremo de C al aminoácido en la posición 27 o 28, que da un péptido de 27 o 28 aminoácidos, o una combinación de ellos.

En otra realización, los péptidos relacionados con glucagón de la clase 2 presentan actividad en los receptores de glucagón, GIP y GLP-1 ( "triagonistas de glucagón/GIP/GLP- 1" ) . Estos péptidos relacionados con glucagón de la clase 2 han perdido la selectividad del glucagón nativo para el receptor de glucagón comparada con los receptores de GLP-1 y GIP. En algunas realizaciones, la EC50 del péptido relacionado con glucagón de la clase 2 en el receptor de GIP es menos de aproximadamente 50 veces, 40 veces, 30 veces o 20 veces diferente (mayor o menor) que su respectiva EC50 en los receptores de glucagón y de GLP-1. En algunas realizaciones, la potencia de GIP del péptido relacionado con glucagón de la clase 2 es menos de aproximadamente 500-, 450-, 400-, 350-, 300-, 250-, 200-, 150-, 100-, 75-, 50-, 25-, 20-, 15-, 10-, o 5- veces diferente (mayor o menor) que sus potencias de glucagón y de GLP-1. En algunas realizaciones, la relación de EC50 del triagonista en el receptor de GIP dividido por la EC50 del triagonista en el receptor de GLP-1 es menos de alrededor de 100, 75, 60, 50, 40, 30, 20, 15, 10, o 5. En algunas realizaciones, la relación de la EC50 en el receptor de GIP dividido por la EC50 en el receptor de GLP-1 es aproximadamente 1 o menos de 1 (por ejemplo, alrededor de 0,01; 0,013; 0,0167; 0,02; 0,025; 0,03; 0,05; 0,067; 0,1; 0,2) . En algunas realizaciones, la relación de la potencia de GIP del triagonista comparada con la potencia de GLP-1 del triagonista es menos de alrededor de 100, 75, 60, 50, 40, 30, 20, 15, 10, o 5. En algunas realizaciones, la relación de la potencia en el receptor de GIP dividido por la potencia en el receptor de GLP-1 es 1 o menos de 1 (por ejemplo, 0,01; 0,013; 0,0167; 0,02; 0,025; 0,03; 0,05; 0,067; 0,1; 0,2). En realizaciones relacionadas, la relación de la EC50 del triagonista en el receptor de GIP dividido por la EC50 del triagonista en el receptor de glucagón es menos de 100, 75, 60, 50, 40, 30, 20, 15, 10, o 5. En algunas realizaciones, la relación de la EC50 en el receptor de. GIP dividido por la EC50 en el receptor de glucagón es 1 o menos de 1 (por ejemplo, alrededor de 0,01; 0,013; 0,0167; 0,02; 0,025; 0,03; 0,05; 0,067; 0,1; 0,2). En algunas realizaciones, la relación de la potencia de GIP del triagonista comparada con la potencia de glucagón del triagonista es menos de aproximadamente 500, 450, 400, 350, 300, 250, 200, 150, 100, 75, 60, 50, 40, 30, 20, 15, 10, o 5. En algunas realizaciones, la relación de la potencia en el receptor de GIP dividido por la potencia en el receptor de glucagón es 1 o menos de aproximadamente 1 (por ejemplo, 0,01; 0,013; 0,0167; 0,02; 0,025; 0,03; 0,05; 0,067; 0,1; 0,2). En algunas realizaciones la relación de EC50 del triagonista en el receptor de GLP-1 dividido por la EC50 del triagonista en el receptor de glucagón es menor de 100, 75, 60, 50, 40, 30, 20, 15, 10, o 5. En algunas realizaciones la relación de EC50 en el receptor de GLP-1 dividido por EC50 en el receptor de glucagón es de alrededor de 1 o menos de 1 (por ejemplo, 0,01; 0,013; 0,0167; 0,02; 0,025; 0,03; 0,05; 0,067; 0,1; 0,2). En algunas realizaciones la relación de la potencia de GLP-.l del triagonista comparada con la potencia de glucagón del triagonista es menos de aproximadamente 100, 75, 60, 50, 40, 30, 20, 15, 10, o 5. En algunas realizaciones la relación de la potencia en el receptor de GLP-1 dividida por la potencia en el receptor de glucagón es alrededor de 1 o menos de 1 (por ejemplo, 0,01; 0,013; 0,0167; 0,02; 0,025; 0,03; 0,05; 0,067; 0,1; 0,2).

En aún otro aspecto, los péptidos relacionados con glucagón de la clase 2 presentan actividad en los receptores de GLP-1 y GIP, pero en donde la actividad de glucagón se ha reducido significativamente o se ha destruido ("coagonistas de GIP/GLP-1"), por ejemplo, mediante modificaciones de aminoácido en la posición 3. Por ejemplo, la sustitución en esta posición con un aminoácido ácido, básico o hidrófobo (ácido glutámico, ornitina, norleucina) reduce la actividad de glucagón. En algunas realizaciones, la EC50 del péptido de glucagón en el receptor de GIP es menos de 50 veces, 40 veces, 30 veces o 20 veces diferente (mayor o menor) que su EC50 en el receptor de GLP-1. En algunas realizaciones, la potencia de GIP del péptido relacionado con glucagón de la clase 2 es menos de aproximadamente 25-, 20-, 15-, 10-, o 5- veces diferente (mayor o menor) que su potencia de GLP-1. En algunas realizaciones, estos péptidos relacionados con glucagón de la clase 2 tienen alrededor de un 10% o menos de la actividad del glucagón nativo en el receptor de glucagón, por ejemplo alrededor del 1-10%, o del 0,1-10% o más de alrededor del 0,1% pero menos del 10%. En algunas realizaciones, la relación de la EC50 del péptido relacionado con glucagón de la clase 2 en el receptor de GIP dividido por la EC50 del péptido relacionado con glucagón de la clase 2 en el receptor de GLP-1 es menos de aproximadamente 100, 75, 60, 50, 40, 30, 20, 15, 10, o 5 y no menos de 1. En algunas realizaciones, la relación de la potencia de GIP del péptido relacionado con glucagón de la clase 2 comparada con la potencia de GLP-1 del péptido relacionado con glucagón de la clase 2 es menos de aproximadamente 100, 75-, 60, 50, 40, 30, 20, 15, 10, o 5 y no menos de 1.

En otro aspecto, los péptidos relacionados con glucagón de la clase 2 presentan actividad en el receptor de GIP, en donde la actividad de glucagón y de GLP-1 se ha reducido significativamente o se ha destruido ("péptidos de glucagón de agonista de GIP"), por ejemplo, mediante modificaciones de aminoácidos en las posiciones 3 con Glu y 7 con lie. En algunas realizaciones, estos péptidos relacionados con glucagón de la clase 2 tienen alrededor de un 10% o menos de la actividad de glucagón nativo en el receptor de glucagón, por ejemplo alrededor del 1-10%, o del 0,1-10% o más de alrededor del 0,1%; 0,5% o 1% pero menos del 1%, 5% o 10%. En algunas realizaciones, los péptidos relacionados con glucagón de la clase 2 también tienen un 10% o menos de la actividad de GLP-1 nativo en el receptor de GLP-1, por ejemplo aproximadamente 1-10%, o 0,1%-10% o más del 0,1%; 0,5% o 1% pero menos del 1%; 5% o 10%.

En algunas realizaciones, cuando el péptido relacionado con glucagón de la clase 2 no está pegilado, la EC50 del péptido relacionado con glucagón de la clase 2 para la activación del el receptor de GIP es 4 , 2, 1 nM o menos, o el análogo tiene por lo menos alrededor de un 1%, 2%, 3%, 4% o 5% de la actividad de GIP nativo en el receptor de GIP. En realizaciones relacionadas, la EC50 del péptido relacionado con glucagón de la clase 2 no pegilado para la activación del receptor de GLP-1 es 4, 2, 1- nM o menos pero por lo menos alrededor de 1%, 2%, 3%, 4% o 5% de la actividad de GLP-1 nativo en el receptor de GLP-1. En aún otras realizaciones, la EC50 del péptido relacionado con glucagón de la clase 2 no pegilado para la activación del receptor de glucagon es aproximadamente 4, 2, 1 nM o menos, pero por lo menos alrededor de 5%, 10%, 15% o 20% de la actividad de glucagon nativo en el receptor de glucagon. En algunas realizaciones, el péptido relacionado con glucagon de la clase 2 no pegilado tiene menos de alrededor del 1% de la actividad de glucagon nativo en el receptor de glucagon. En otras realizaciones, el péptido relacionado con glucagon de la clase 2 no pegilado tiene menos de alrededor del 10%, 5% o 1% de la actividad de GLP-1 nativo en el receptor de GLP-1.

En las realizaciones donde los péptidos relacionados con glucagon de la clase 2 están unidos a grupos hidrófilos tales como PEG, la EC50 relativa en uno o más receptores puede ser más alta, por ejemplo 10 veces más alta. Por ejemplo la EC50 de un análogo pegilado para la activación del receptor de GIP es 10 nM o menos, o el péptido relacionado con glucagon de la clase 2 tiene por lo menos aproximadamente un 0,1%; 0,2%; 0,3%; 0,4% o 0,5% de la actividad de GIP nativo en el receptor de GIP. En realizaciones relacionadas, la EC50 de un péptido relacionado con glucagon de la clase 2 pegilado para la activación del receptor de GLP-1 es 10 nM o menos o tiene por lo menos un 0,1%; 0,2%; 0,3%; 0,4% o 0,5% de la actividad de GLP-1 nativo en el receptor de GLP-1. En aún otras realizaciones, la EC50 de un péptido relacionado con glucagon de la clase 2 pegilado para la activación del receptor de glucagon es 10 nM o menos, o por lo menos un 0,5%; 1%; 1,5% o 2% de la actividad de glucagon nativo en el receptor de glucagon. En algunas realizaciones, el péptido relacionado con glucagon de la clase 2 tiene menos del 1% de la actividad de glucagon nativo en el receptor de glucagon. En otras realizaciones, el péptido relacionado con glucagon de la clase 2 tiene menos de alrededor del 10%, 5%, o 1% de la actividad de GLP-1 nativo en el receptor de GLP-1.

Modificaciones Las modificaciones reveladas en la presente con referencia a un péptido relacionado con glucagon de la clase 2 permiten la manipulación de glucagon (SEQ ID NO 1001) para crear péptidos de glucagon que presentan actividad de GIP aumentada, actividad de glucagon y/o actividad de GLP-1. Otras modificaciones reveladas en la presente con referencia a un péptido relacionado con glucagon de la clase 2 prolongan la semivida, aumentan la solubilidad, o aumentan la estabilidad del péptido resultante. Aún otras modificaciones reveladas en la presente con referencia a un péptido relacionado con glucagón de la clase 2 no tienen ningún efecto sobre la actividad, o pueden realizarse sin destruir la actividad o actividades deseadas. Cualquiera de las combinaciones con referencia a un péptido relacionado con glucagón de la clase 2 que cumplen la misma función (por ejemplo, aumentar la actividad de GIP) se puede aplicar individualmente o en combinación. Cualquiera de las únicas o grupos de combinaciones con referencia a un péptido relacionado con glucagón de la clase 2 que confiera propiedades mejoradas se puede aplicar individualmente o en combinación, por ejemplo actividad de GIP y/o GLP-1 aumentada se puede combinar con semivida aumentada. En realizaciones relacionadas, 1, 2, 3, 4, 5, 6 o más de las modificaciones de aminoácidos pueden' ser sustituciones no conservadoras, agregados o eliminaciones. En algunas realizaciones, 1, 2, 3, 4, 5, 6 o más de las modificaciones de aminoácidos pueden ser sustituciones conservadoras .

Modificaciones que afectan la actividad de GIP La actividad mejorada en el receptor de GIP se proporciona con una modificación de un aminoácido en la posición 1. Por ejemplo, His en la posición 1 se sustituye con un aminoácido aromático, grande, opcionalmente Tyr, Phe, Trp, amino-Phe, cloro-Phe, sulfo-Phe, 4-piridil-Ala, metil-Tyr o 3-amino Tyr. La combinación de Tyr en la posición 1 con estabilización de la alfa hélice dentro de la región correspondiente a los aminoácidos 12-29 proporcionó un péptido relacionado con glucagón de la clase 2 que activa el receptor de GIP así como el receptor de GLP-1 y el receptor de glucagón. La estructura de la alfa hélice se puede estabilizar, por ejemplo, mediante la formación de un puente intramolecular covalente o no covalente, o la sustitución y/o inserción de aminoácidos alrededor de las posiciones 12-29 con un aminoácido que estabiliza la alfa hélice (por ejemplo, un aminoácido OÍ, OÍ-disustituido) .

La actividad mejorada en el receptor de GIP también se proporciona mediante modificaciones de aminoácidos en las posiciones 27 y/o 28 y opcionalmente en la posición 29. Por ejemplo, la Met en la posición 27 se sustituye con un aminoácido alifático grande, opcionalmente Leu, la Asn en la posición 28 se sustituye con un aminoácido alifático pequeño, opcionalmente Ala y la Thr en la posición 29 se sustituye con un aminoácido alifático pequeño, opcionalmente Gly. La sustitución con LAG en las posiciones 27-29 proporciona actividad de GIP aumentada en relación con la secuencia MNT nativa en esas posiciones.

La actividad mejorada en el receptor de GIP también se proporciona mediante una modificación de aminoácido en la posición 12. Por ejemplo, la posición 12 se sustituye con un aminoácido no polar, alifático, grande, opcionalmente lie.

La actividad mejorada en el receptor de GIP también se proporciona mediante una modificación de aminoácido en las posiciones 17 y/o 18. Por ejemplo, la posición 17 se sustituye con un residuo polar, opcionalmente Gln, y la posición 18 se sustituye con un aminoácido alifático pequeño, opcionalmente Ala. Una sustitución con QA en la posición 17 y 18 proporciona actividad de GIP aumentada en relación con la secuencia RR en esas posiciones.

La actividad aumentada en el receptor de GIP se proporciona mediante modificaciones que permiten la formación de un puente intramolecular entre las cadenas de aminoácidos en las posiciones de 12 a 29. Por ejemplo, se puede formar un puente intramolecular mediante una ligadura covalente entre las cadenas laterales de dos aminoácidos en las posiciones i e i+4 o entre las posiciones j y j+3, o entre las posiciones k y k+7. En ejemplos de realizaciones, el puente es entre la posición 12 y 16, 16 y 20, 20 y 24, 24 y 28 o 17 y 20. En otras realizaciones, se pueden formar interacciones no covalentes tales como puentes de sales entre aminoácidos con carga positiva y negativa en estas posiciones .

Cualquiera de las modificaciones descritas anteriormente que aumentan la actividad de receptor de GIP se puede aplicar individualmente o combinadas. Las combinaciones de modificaciones que aumentan la actividad de receptor de GIP generalmente proporcionan actividad de GIP más alta que cualquiera de dichas modificaciones tomadas solas.

Modificaciones que afectan la actividad de qlucagón En algunas realizaciones, la potencia de glucagon mejorada se proporciona mediante modificaciones de aminoácidos en la posición 16 de glucagon nativo (SEQ ID NO 1001) . A modo de ejemplo no taxativo, dicha potencia mejorada se puede proporcionar sustituyendo la serina natural en la posición 16 con ácido glutámico o con otro aminoácido con carga negativa que tiene una cadena lateral con una longitud de 4 átomos, o alternativamente con una cualquiera de glutamina, ácido homnoglutámico, o ácido homocisteico, o un aminoácido con carga que tiene una cadena lateral que contiene por lo menos un heteroátomo (por ejemplo, N, O, S, P) y con una longitud de la cadena lateral de 4 (o 3-5) átomos. En algunas realizaciones el péptido de glucagon retiene su selectividad original para el receptor de glucagon en relación con los receptores de GLP-1.

La actividad del receptor de glucagón se puede reducir mediante modificaciones de aminoácidos en la posición 3, por ejemplo, la sustitución de la glutamina natural en la posición 3, con un aminoácido ácido, básico o hidrófobo. Por ejemplo, la sustitución en la posición 3 con ácido glutámico, ornitina, o norleucina reduce sustancialmente o destruye la actividad de receptor de glucagón.

La actividad mantenida o mejorada en el receptor de glucagón se puede lograr modificando la Gln en la posición 3 con un análogo de glutamina, como se describe en la presente. Por ejemplo"/ los agonistas de glucagón pueden comprender la secuencia de aminoácido de cualquiera de SEQ ID NO 1243-1248, 1250, 1251, y 1253-1256.

La restauración de la actividad de glucagón que se ha reducido mediante modificaciones de aminoácidos en las posiciones 1 y 2 se produce mediante modificaciones que estabilizan la estructura de alfa hélice de la parte del extremo de C (aminoácidos 12-29) del péptido de glucagón o un análogo de él. Por ejemplo, se puede formar un puente intramolecular mediante un enlace covalente entre las cadenas laterales de dos aminoácidos en las posiciones i e i+4 o entre las posiciones j y j+3, o entre las posiciones k y k+7. En otras realizaciones, se pueden formar interacciones no covalentes tales como puentes de sal entre aminoácidos con carga positiva o negativa en estas posiciones. En aún otras realizaciones, uno o más aminoácidos , a-disustituidos se insertan o sustituyen en esta parte del extremo de C (aminoácidos 12-29) en las posiciones que retienen la actividad deseada. Por ejemplo, una, dos, tres o la totalidad de las posiciones 16, 20, 21 o 24 se sustituyen con un aminoácido a, a-disustituido, por ejemplo AIB.

Modificaciones que afectan la actividad de GLP-1 La actividad mejorada en el receptor de GLP-1 se proporciona reemplazando el ácido carboxílico del aminoácido del extremo de C con un grupo de carga neutra, tal como una amida o éster.

La actividad mejorada en el receptor de GLP-1 también se proporciona estabilizando la estructura de alfa-hélice en parte del extremo de C del glucagón (alrededor de los aminoácidos 12-29), por ejemplo, a través de la formación de un puente intramolecular entre las cadenas laterales de dos aminoácidos, o la sustitución y/o inserción de aminoácidos alrededor de las posiciones 12-29 con un aminoácido que estabiliza la alfa-hélice (por ejemplo, un aminoácido a, a-disustituido) , como también se describe en la presente. En ejemplos de realizaciones, las cadenas laterales de los pares de aminoácidos 12 y 16, 13 y 17, 16 y 20, 17 y 21, 21 y 24 o 24 y 28 (pares de aminoácidos en donde i = 12, 16, 20 o 24) se unen uno a otro y por lo tanto estabilizan la alfa hélice de glucagón. En algunas realizaciones, el puente o conector tiene aproximadamente 8 (o alrededor de 7-9) átomos de longitud, particularmente cuando el puente es entre las posiciones i e i+4. En algunas realizaciones, el puente o conector tiene entre aproximadamente 6 (o alrededor de 5-7) átomos de longitud, particularmente cuando el puente está entre las posiciones j y j+3.

En algunas realizaciones, se forman puentes intramoleculares (a) sustituyendo la serina natural en la posición 16 con ácido glutámico o con otro aminoácido con carga negativa que tiene una cadena lateral con una longitud de 4 átomos, o alternativamente, con uno de glutamina, ácido homoglutámico , o ácido homocisteico, o un aminoácido con una carga que tiene una cadena lateral que contiene por lo menos un heteroátomo (por ejemplo, N, O, S, P) y con una longitud de cadena lateral de aproximadamente 4 (o 3-5) átomos y (b) sustituyendo la glutamina natural en la posición 20 con otro aminoácido hidrófilo que tiene una cadena lateral que tiene una carga o tiene una capacidad de enlace de hidrógeno, y tiene por lo menos aproximadamente 5 (o 4-6) átomos de longitud, por ejemplo, lisina, citrulina, arginina u ornitina. Las cadenas laterales de dichos aminoácidos en las posiciones 16 y 20 pueden formar un puente de sal o pueden unirse en forma covalente. En algunas realizaciones, los dos aminoácidos se unen uno a otro para formar un anillo de lactama.

En algunas realizaciones, la estabilización de la estructura de alfa hélice en la parte del extremo de C del péptido de glucagón se logra a través de la formación de un puente intramolecular diferente de un puente de lactama. Por ejemplo, los métodos de enlace covalente adecuados incluyen uno o más cualquiera de metátesis de olefina, ciclación basada en lantionina, formación de puente de disulfuro o puente que contiene azufre modificado, el uso de téteres de a, ?-diaminoalcano, la formación de puentes de átomo de metal, y otros medios de ciclación de péptido se usan para estabilizar la alfa hélice.

En aún otras realizaciones, se insertan uno o más de los aminoácidos , a-disustituidos en la parte del extremo de C (aminoácidos 12-29) en las posiciones que retienen la actividad deseada. Por ejemplo, una, dos, tres o la totalidad de las posiciones 16, 20, 21 o 24 se sustituyen con un aminoácido a, -disustituido, por ejemplo AIB.

Se proporciona actividad aumentada en el receptor de GLP-1 con una modificación de aminoácido en la posición 20 como se describe en la presente.

Se proporciona actividad aumentada en el receptor de GLP-1 agregando GPSSGAPPPS (SEQ ID NO: 1095) o XGPSSGAPPPS (SEQ ID NO: 1096) al extremo de C. La actividad de GLP-1 en dichos análogos se puede aumentar adicionalmente modificando el aminoácido en la posición 18, 28 o 29, o en la posición 28 y 29, como se describe en la presente.

Otro aumento modesto en la potencia de GLP-1 se proporciona modificando el aminoácido en la posición 10 con un residuo de aminoácido aromático, grande, opcionalmente Trp.

Se proporciona actividad reducida en el receptor de GLP-1, por ejemplo, mediante una modificación de aminoácido en la posición 7 como se describe en la presente .

Se puede mejorar adicionalmente la potencia en el receptor de GLP-1 mediante una sustitución de alanina por arginina nativa en la posición 18.

Cualquiera de las modificaciones descritas anteriormente con referencia a un péptido relacionado con glucagón de la clase 2 que aumenta la actividad de receptor de GLP-1 se puede aplicar individualmente o en combinación. Las combinaciones de las modificaciones que aumentan la actividad de receptor de GLP-1 generalmente proporcionan actividad de GLP-1 más alta que cualquiera de dichas modificaciones tomadas por separado. Por ejemplo, la invención proporciona péptidos de glucagón que comprenden modificaciones en la posición 16, en la posición 20 y en el grupo ácido carboxilico del extremo de C, opcionalmente con un enlace covalente entre los aminoácidos en las posiciones 16 y 20, péptidos de glucagón que comprenden modificaciones en la posición 16 y el grupo ácido carboxilico del extremo de C, péptidos de glucagón que comprenden modificaciones en las posiciones 16 y 20, opcionalmente con un enlace covalente entre los aminoácidos en las posiciones 16 y 20 y péptidos de glucagón que comprenden modificaciones en la posición 20 y en el grupo ácido carboxilico del extremo de C.

Modificaciones que mejoran la resistencia a DPP-IV Las modificaciones en la posición 1 y/o 2 pueden aumentar la resistencia del péptido a la descomposición de dipeptidil peptidasa IV (DPP-IV) . Por ejemplo, la posición 1 y/o la posición 2 se puede sustituir con un aminoácido resistente a DPP-IV como se describe en la presente. En algunas realizaciones, el aminoácido en la posición 2 se sustituye con N-metil alanina.

Se observó que las modificaciones en la posición 2 (por ejemplo, AIB en la posición 2) y en algunos casos modificaciones en la posición 1 (por ejemplo, DMIA en la posición 1) pueden reducir la actividad de glucagón, algunas veces significativamente; sorpresivamente, esta reducción en la actividad de glucagón se puede restaurar estabilizando la estructura de alfa-hélice en la parte del extremo de C (alrededor de los amioácidos 12-29) , por ejemplo, a través de la formación de un enlace covalente entre las cadenas laterales de dos aminoácidos, como se describe en la presente. En algunas realizaciones, el enlace covalente es entre los aminoácidos en las posiciones "i" e "i+4", o las posiciones "j" Y "j+3", por ejemplo, entre las posiciones 12 y 16, 16 y 20, 20 y 24, 24 y 28 o 17 y 20. En ejemplos de realizaciones, este enlace covalente es un puente de lactama entre un ácido glutámico en la posición 16 y una lisina en la posición 20. En algunas realizaciones, este enlace covalente es un puente intramolecular diferente de un puente de lactama, como se describe en la presente .

Modificaciones que reducen la degradación En aún otros ejemplos de realizaciones, cualquiera de los péptidos relacionados con glucagón de la clase 2 se puede modificar adicionalmente para mejorar la estabilidad modificando el aminoácido en la posición 15 y/o 16 de SEQ ID NO 1001 para reducir la degradación del péptido en el tiempo, especialmente en tampones ácidos o alcalinos. Dichas modificaciones reducen la descomposición del enlace de péptido de Aspl5-Serl6. En ejemplos de realizaciones, la modificación de aminoácido en la posición 16 es una eliminación o sustitución de Asp con ácido glutámico, con Thr o AIB. En otros ejemplos de realizaciones, la modificación de aminoácido en la posición 16 con ácido glutámico o con otro aminoácido con carga negativa es una eliminación o sustitución de Ser con Thr o AIB. En otros ejemplos de realizaciones, Ser en la posición 16 se sustituye con ácido glutámico o con otro aminoácido con carga negativa que tiene una cadena lateral con una longitud de 4 átomos, o alternativamente con uno cualquiera de glutamina, ácido homoglutámico, o ácido homocisteico .

En algunas realizaciones, el residuo de metionina presente en la posición 27 del péptido nativo se modifica, por ejemplo mediante eliminación o sustitución. Dichas modificaciones pueden impedir la degradación oxidativa del péptido. En algunas realizaciones, la Met en la posición 27 se sustituye con leucina, isoleucina o norleucina. En algunas realizaciones específicas, Met en la posición 27 se sustituye con leucina o norleucina.

En algunas realizaciones, la Gln en la posición 20 y/o 24 se modifica, por ejemplo, mediante eliminación o sustitución. Dichas modificaciones pueden reducir la degradación que ocurre a través de la desaminación de Gln. En algunas realizaciones, la Gln en la posición 20 y/o 24 se sustituye con Ser, Thr, Ala o AIB. En algunas realizaciones, la Gln en la posición 20 y/o 24 se sustituye con Lys, Arg, Orn o Citrulina.

En algunas realizaciones, la Asp en la posición 21 se modifica, por ejemplo mediante eliminación o sustitución. Dichas modificaciones pueden reducir la degradación que ocurre a través de la deshidratación de Asp para formar un compuesto intermedio succinimida cíclica seguida por la isomerizacion a iso-aspartato. En algunas realizaciones, la posición 21 se sustituye con Glu, ácido homoglutámico o ácido homocisteico . En algunas realizaciones específicas, la posición 21 se sustituye co Glu.

Estabilización de la estructura de alfa hélice La estabilización de la estructura de alfa-hélice en la parte del extremo de C del péptido relacionado con glucagón de la clase 2 (alrededor de los aminoácidos 12-29) proporciona actividad de GLP-1 y/o GIP mejorada y restaura la actividad de gluagón que se ha reducido por las modificaciones de aminoácido en la posición 1 y/o 2. La estructura de alfa hélice se puede estabilizar por ejemplo, mediante formación de un puente intramolecular covalente o no covalente, o sustitución y/o inserción de aminoácidos alrededor de las posiciones 12-29 con un aminoácido que estabiliza la alfa hélice (por ejemplo, un amioácido ,a-disustituido) . La estabilización de la estructura de alfa-hélice de un agonista de GIP se puede realizar como se describe en la presente .

Acilación y Alquilación De acuerdo con algunas realizaciones, los péptidos de glucagón descritos en la presente se modifican para comprender un grupo acilo o un grupo alquilo, por ejemplo un grupo acilo o alquilo que es un aminoácido no nativo a no natural como se describe en la presente. La acilación o alquilación puede aumentar la semivida de los péptidos de glucagón en circulación. La acilación o alquilación puede retardar ventajosamente el inicio de acción y/o prolongar la duración de acción en los receptores de glucagón y/o GLP-1 y/o mejorar resistencia a proteasas tales como DPP-IV y/o mejorar la solubilidad. La actividad en los receptores de glucagón y/o GLP-1 y/o GIP del péptido de glucagón se puede mantener después de la acilación. En algunas realizaciones, la potencia de los péptidos de glucagón acilados es comparable con las versiones no aciladas de los péptidos de glucagón. Los péptidos relacionados con glucagón de la clase 2 se pueden acilar o alquilar en la misma posición de aminoácido donde se une un grupo hidrófilo, o en una posición de aminoácido diferente, como se describe en la presente.

En algunas realizaciones, la invención proporciona un péptido de glucagón modificado para comprender un grupo acilo o grupo alquilo unido en forma covalente al aminoácido en la posición 10 del péptido de glucagón. El péptido de glucagón puede comprender además un separador entre el aminoácido en la posición 10 del péptido de glucagón y el grupo acilo o el grupo alquilo. En algunas realizaciones, el grupo acilo es un ácido graso o ácido biliar, o una sal de ellos, por ejemplo un ácido graso de C4 a C30, un ácido graso de C8 a C24, ácido cólico, un alquilo de C4 a C30, un alquilo de C8 a C24 o un alquilo que comprende un grupo esteroide de un ácido biliar. El separador es cualquier grupo con grupos reactivos adecuados para unir grupos acilo o alquilo. En ejemplos de realizaciones, el separador comprende un aminoácido, un dipéptido, un tripéptido, un separador bifuncional hidrófilo o un separador bifuncional hidrófobo. En algunas realizaciones, el separador se selecciona del grupo formado por: Trp, Glu, Asp, Cys y un separador que comprende NH2 (CH2CH20) n (CH2) mCOOH, en donde m es cualquier número entero de 1 a 6 y n es cualquier número entero de 2 a 12. Dichos péptidos de glucagón acilado o alquilado también pueden comprender además un grupo hidrófilo, opcionalmente un polietilenglicol . Cualquiera de los péptidos de glucagón precedentes puede comprender dos grupos acilo o dos grupos alquilo, o una combinación de ellos.

Conjugados y fusiones El agonista de GIP se puede unir, opcionalmente a través de enlace covalente y opcionalmente a través de un conector, a un grupo conjugado como se describe en la presente.

En otras realizaciones, el segundo péptido es XGPSSGAPPPS (SEQ ID NO: 1096) , en donde X se selecciona de uno de los 20 aminoácidos comunes, por ejemplo ácido glutámico, ácido aspártico o glicina. En algunas realizaciones, X representa un aminoácido, por ejemplo, Cys, que además comprende un grupo hidrófilo unido en forma covalente a las cadenas laterales de ese aminoácido. Dichas prolongaciones del extremo de C mejoran la solubilidad y también pueden mejorar la actividad de GIP o GLP-1. En algunas realizaciones en donde el péptido de glucagón además comprende una prolongación del extremo de carboxi, el aminoácido del extremo de carboxi de la prolongación termina en un grupo amida o un grupo éster en lugar de un ácido carboxílico.

En algunas realizaciones, por ejemplo en péptidos de glucagón que comprenden la prolongación del extremo de C, la treonina en la posición 29 del péptido de glucagón nativo se reemplaza con una glicina. Por ejemplo, un péptido de glucagón que tiene una sustitución de glicina por treonina en la posición 29 y que comprende la prolongación del extremo de C de GPSSGAPPPS (SEQ ID NO: 1095) es cuatro veces la potencia en el receptor de GLP-1 como glucagón nativo modificado para comprender la misma prolongación del extremo de C. La sustitución T29C se puede usar en conjunto con otras modificaciones reveladas en la presente para mejorar la afinidad de los péptidos de glucagón para el receptor de GLP-1. Por ejemplo, la sustitución T29C se puede combinar con sustituciones de aminoácido S16E y N20K, opcionalmente con un puente de lactama entre los aminoácidos 16 y 20, y opcionalmente con el agregado de una cadena de PEG como se describe en la presente.

En algunas realizaciones se agrega un aminoácido al extremo de C, y el aminoácido adicional se selecciona del grupo formado por ácido glutámico, ácido aspártico y glicina.

Modificaciones que mejoran la solubilidad En otra realización, la solubilidad de cualquiera de los péptidos de glucagón se puede mejorar mediante sustituciones y/o agregados de aminoácidos que introducen un aminoácido con carga en la parte del extremo de C del péptido, preferentemente en una posición del extremo de C a la posición 27 de SEQ ID NO: 1001. Opcionalmente , uno, dos, o tres aminoácidos con una carga se pueden introducir dentro de la parte del extremo de C, preferentemente el extremo de C a la posición 27. En algunas realizaciones los aminoácidos nativos en las posiciones 28 y/o 29 se sustituyen con uno o dos aminoácidos con carga, y/o en otra realización de uno a tres aminoácidos con carga también se agregan al extremo de C del péptido. En ejemplos de realizaciones, uno, dos o la totalidad de los aminoácidos con carga tienen una carga negativa. En algunas realizaciones, el aminoácido con carga negativa (aminoácido ácido) es ácido aspártico o ácido glutámico.

Se pueden hacer modificaciones adicionales, por ejemplo, sustituciones conservadoras, en el péptido de glucagón que aún permiten que retenga la actividad de GIP (y opcionalmente la actividad de GLP-1 y/o la actividad de glucagón) .

Otras modificaciones Cualquiera de las modificaciones descritas anteriormente con referencia a un péptido de la clase 2 que aumenta o disminuye la actividad de GIP, que aumenta o disminuye la actividad de receptor de glucagón, y que aumenta la actividad de receptor de GLP-1 se puede aplicar individualmente o en combinación. Cualquiera de las modificaciones descritas con referencia al péptido relacionado con glucagón de la clase 2 también puede combinarse con otras modificaciones que confieren otras propiedades deseables, tales como una solubilidad y/o estabilidad y/o duración de acción aumentada, como se describe en la presente con respecto a péptidos relacionados con glucagón de la clase 2. Alternativamente, cualquiera de las mdoficaciones descritas anteriormente con referencia a péptidos relacionados con glucagón de la clase 2 se puede combinar con otras modificaciones descritas en la presente con referencia a péptidos relacionados con glucagón de la clase 2 que no afectan sustancialmente la solubilidad o estabilidad o actividad. Ejemplos de modificaciones incluyen en forma no taxativa: (A) mejorar la solubilidad, por ejemplo introduciendo uno, dos, tres o más aminoácidos con carga en la parte del extremo de C del glucagón nativo, preferentemente en una posición del extremo de C a la posición 27. Dichos aminoácidos con carga se pueden introducir sustituyendo un aminoácido nativo con un aminoácido con carga, por ejemplo, en las posiciones 28 o 29, o alternativamente agregando un aminoácido con carga, por ejemplo, después de la posición 27, 28 o 29. En ejemplos de realizaciones, uno, dos, tres o la totalidad de los aminoácidos con carga tienen carga negativa. En otras realizaciones, uno, dos, tres o la totalidad de los aminoácidos con carga tienen carga positiva. Dichas modificaciones aumentan la solubilidad, por ejemplo, proporcionan por lo menos 2 veces, 5 veces, 10 veces, 15 veces, 25 veces, 30 veces o más solubilidad en relación con el glucagón nativo a un pH dado de entre aproximadamente 5,5 y 8, por ejemplo, pH 7, cuando se mide después de 24 horas a 25 °C.

(B) aumentar la solubilidad y la duración de acción o semivida en circulación agregando un grupo hidrófilo tal como una cadena de polietilenglicol , como se describe en la presente, por ejemplo en la posición 16, 17, 20, 21, 24 o 29, dentro de una prolongación del extremo de C, o en el aminoácido del extremo de C del péptido.

(C) Aumentar la solubilidad y/o duración de acción o semivida en circulación y/o retardar el inicio de acción mediante acilación o alquilacion del péptido de glucagón, como se describe en la presente. _ (D) Aumentar la duración de acción o la semivida en b circulación a través de la introducción de resistencia a la descomposición por dipeptidil peptidasa IV (DPP-IV) mediante la modificación del aminoácido en la posición 1 o 2 como se describe en la presente.

(E) Aumentar la estabilidad mediante la modificación de Asp en la posición 15, por ejemplo, mediante eliminación o sustitución con ácido glutámico, ácido homoglutámico, ácido cisteico o ácido homocisteico . Dichas modificaciones pueden reducir la degradación o ^ descomposición a un pH dentro de la gama de 5,5 a 8, por ejemplo, reteniendo por lo menos un 75%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99%, hasta 100% del péptido original después de 24 horas a 25°C. Dichas modificaciones reducen la descomposición del enlace de péptido entre Aspl5- 20 Serl6.

(F) Aumentar la estabilidad mediante modificaciones de la Ser en la posición 16, por ejemplo, mediante sustitución con Thr o AIB. Dichas modificaciones también reducen la descomposición del enlace de péptido entre Aspl5-Serl6.

Aumentar la estabilidad mediante modificaciones de la metionina en la posición 27, por ejemplo, mediante la sustitución con leucina o norleucina. Dichas modificaciones pueden reducir la degradación oxidativa. La estabilidad también se puede aumentar mediante la modificación de la Gln en la posición 20 o 24, por ejemplo, mediante sustitución con Ser, Thr, Ala o AIB. Dichas modificaciones pueden reducir la degradación que ocurre a través de la desaminacion de Gln. La estabilidad se puede aumentar mediante la modificación de Asp en la posición 21, por ejemplo mediante la sustitución con Glu. Dichas modificaciones pueden reducir la degradación que ocurre a través de la deshidratación de Asp para formar un compuesto intermedio de succinimida cíclica seguida por la isomerizacion a iso-aspartato.

Sustituciones no conservadoras o conservadoras, agregados o eliminaciones que no afectan sustancialmente la actividad, por ejemplo, sustituciones conservadoras en una o más de las posiciones 2, 5, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 24, 27, 28 o 29; sustitución de una o más de las posiciones con Ala, eliminación de aminoácidos en una o más de las posiciones 27, 28 o 29, o eliminación del aminoácido 29 opcionalmente en combinación con una amida o éster del extremo de C en lugar del grupo ácido carboxílico del extremo de C, sustitución de Lys en la posición 12 con Arg, sustitución de Tyr en la posición 10 con Val o Phe.

La preservación de la actividad después de la pegilación se proporciona mediante el agregado de GPSSGAPPPS (SEQ ID NO: 1095) al extremo de C.

Algunas posiciones del péptido de glucagón nativo se pueden modificar mientras retienen por lo menos algunas de las actividades del péptido parental. Por consiguiente, los solicitantes anticipan que uno o más de los aminoácidos ubicados en las posiciones 2, 5, 10, 11, 12, 13, 14, 17, 18, 19, 20, 21, 24, 27, 28 o 29 se pueden sustituir con un aminoácido diferente de aquel presente en el péptido de glucagón nativo, y aún retener la actividad en el receptor de glucagón.

En algunas realizaciones, la posición 18 se sustituye con un aminoácido seleccionado del grupo formado por Ala, Ser o Thr. En algunas realizaciones el aminoácido en la posición 20 se sustituye con Ser, Thr, Lys, Arg, Orn, Citrulina o AIB. En algunas realizaciones, la posición 21 se sustituye con Glu, ácido homoglutámico o ácido homocisteico . En algunas realizaciones, el péptido de glucagón comprende de 1 a 10 modificaciones de aminoácidos seleccionadas de las posiciones 16, 17, 18, 20, 21, 23, 24, 27, 28 y 29. En ejemplos de realizaciones, las modificaciones son una o más sustituciones de aminoácidos seleccionadas del grupo formado por Glnl7, Alal8, Glu21, Ile23, Ala24, Val27 y Gly29. En algunas realizaciones, 1 a 2 aminoácidos seleccionados de las posiciones 17-26 difieren del péptido parental . En otras realizaciones, 1 a 2 aminoácidos seleccionados de las posiciones 17-22 difieren del péptido parental. En aún otras realizaciones, las modificaciones son Glnl7, Alal8, Glu21, Ile23 y Ala24.

En algunas realizaciones, se agrega uno o más aminoácidos al extremo de carboxi del péptido de glucagón. El aminoácido generalmente se selecciona de uno de los 20 aminoácidos comunes y en algunas realizaciones el aminoácido tiene un grupo amida del ácido carboxílico del aminoácido nativo. En ejemplos de realizaciones, el aminoácido agregado se selecciona del grupo formado por ácido glutámico y ácido aspártico y glicina.

Otras modificaciones que no destruyen la actividad incluyen 10 y R20.

En algunas realizaciones, los péptidos relacionados con glucagón de la clase 2 revelados en la presente se modifican truncando el extremo de C con uno o dos residuos de aminoácidos aún retienen una actividad y potencia similar en los receptores de glucagón, GLP-1 y/o GIP. Al respecto, el aminoácido en la posición 29 y/o 28 se puede eliminar.

Ejemplos de Realizaciones De acuerdo con algunas realizaciones de la invención, el análogo de glucagón (SEQ ID NO: 1001) que tiene actividad de agonista de GIP comprende SEQ ID NO: 1001 con (a) una modificación de aminoácido en la posición 1 que confiere actividad de agonista de GIP, (b) una modificación que estabiliza la estructura de alfa hélice de la parte del extremo de C (aminoácidos 12-29) del análogo y (c) opcionalmente , 1 a 10 (por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10) modificaciones adicionales de aminoácidos. En algunas realizaciones, el análogo presenta por lo menos un 1% de actividad de GIP nativo en el receptor de GIP o cualquier otro nivel de actividad en el receptor de GIP descrito en la presente.

En ciertas realizaciones, la modificación que estabiliza la estructura de alfa hélice es una que proporciona o introduce un puente intramolecular, que incluye, por ejemplo, un puente intramolecular covalente, tal como cualquiera de aquellos descritos en la presente. El puente intramolecular covalente en algunas realizaciones es un puente de lactama. El puente de lactama del análogo de estas realizaciones puede ser un puente de lactama como se describe en la presente. Véase, por ejemplo, las enseñanzas de puentes de lactama en la sección "Estabilización de la Estructura de Alfa Hélice". Por ejemplo, el puente de lactama puede ser uno entre las cadenas laterales de aminoácidos en las posiciones i e i+4 o entre las cadenas laterales de aminoácidos en las posiciones j y j+3, en donde i es 12, 13, 16, 17, 20 o 24 y en donde j es 17. En ciertas realizaciones, el puente de lactama puede ser entre los aminoácidos en las posiciones 16 y 20, en donde uno de los aminoácidos en las posiciones 16 y 20 se sustituye con Glu y el otro de los aminoácidos en las posiciones 16 y 20 se sustituye con Lys .

En realizaciones alternativas, la modificación que estabiliza al estructura de alfa hélice es la introducción de uno, dos, tres o cuatro aminoácidos a, -disustituidos en la posición 16, 20, 21, y 24 del análogo. En algunas realizaciones, el aminoácido OÍ, OÍ-disustituido es AIB. En ciertos aspectos, el aminoácido a,a-disustituido (por ejemplo, AIB) está en la posición 20 "y el aminoácido en la posición 16 con un aminoácido con carga positiva, tal como, por ejemplo, un aminoácido de la Fórmula IV, que se describe en la presente. El aminoácido de la Fórmula IV puede ser homoLys, Lys, Orn, o ácido 2 , 4 -diaminobutírico (Dab) .

En aspectos específicos de la invención, la modificación de aminoácidos en la posición 1 es una sustitución de His con un aminoácido que carece de una cadena lateral de imidazol, por ejemplo, un aminoácido aromático grande (por ejemplo, Tyr) .

En ciertos aspectos, el análogo de glucagón comprende modificaciones de aminoácidos en una, dos o la totalidad de las posiciones 27, 28 y 29. Por ejemplo, la Met en la posición 27 se puede sustituir con un aminoácido alifático grande, opcionalmente Leu, la Asn en la posición 28 se puede sustituir con un aminoácido alifático pequeño, opcionalmente Ala, la Thr en la posición 29 se puede sustituir con un aminoácido alifático pequeño, opcionalmente Gly, o una combinación de dos o tres de los precedentes. En realizaciones específicas, el análogo de glucagón comprende Leu en la posición 27, Ala en la posición 28, y Gly o Thr en la posición 29.

En ciertas realizaciones de la invención, el análogo de glucagón comprende una prolongación de 1 a 21 aminoácidos del extremo de C al aminoácido en la posición 29. La prolongación puede comprender la secuencia de aminoácido de SEQ ID NO 1095 o 1096, por ejemplo. Además, o alternativamente, el análogo de glucagón puede comprender una prolongación en la cual 1-6 aminoácidos de la prolongación son aminoácidos con carga positiva. Los aminoácidos con carga positiva pueden ser aminoácidos de la Fórmula IV, que incluyen, en forma no taxativa, Lys, homoLys, Orn y Dab.

El análogo de glucagón en algunas realizaciones se acila o alquila como se describe en la presente. Por ejemplo, el grupo acilo o alquilo se puede unir al análogo de glucagón, con o sin un separador, en la posición 10 o 40 del análogo, como se describe en la presente. El análogo puede además o alternativamente modificarse para comprender un grupo hidrófilo como se describe en la presente. Además, en algunas realizaciones, el análogo comprende una cualquiera, o una combinación de las siguientes modificaciones: (a) Ser en la posición 2 sustituido con D- Ser, Ala, D-Ala, Gly, N-metil-Ser, AIB, Val, o ácido a-amino-N-butírico; (b) Tyr en la posición 10 sustituido con Trpy Lys, Orn, Glu, Phe, o Val: (c) Unión de un grupo acilo a un Lys en la posición 10; (d) Lys en la posición 12 sustituido con Arg o lie; (e) Ser en la posición 16 sustituido con Glu, Gln, ácido homoglutámico, ácido homocisteico, Thr, Gly, o AIB; (f) Arg en la posición 17 sustituido con Gln; (g) Arg en la posición 18 sustituido con Ala, Ser, Thr, o Gly; (h) Gln en la posición 20 sustituido con Ser, Thr, Ala, Lys, Citrulina, Arg, Orn, o AIB; (i) Asp en la posición 21 sustituido con Glu, ácido homoglutámico , ácido homocisteico; (j) Val en la posición 23 sustituido con lie; (k) Gln en la posición 24 sustituido con Asn, Ser, Thr, Ala, o AIB; (1) y una sustitución conservadora en cualquiera de las posiciones 2, 5, 9, 10, 11, 12. 13, 14, 15, 16, 8 19 20, 21. 24, 27, 28, y 29.

En ejemplos de realizaciones, el análogo de glucagón (SEQ ID NO 1001) que tiene actividad de agonista de GIP comprende las siguientes modificaciones: (a) una modificación de aminoácido en la posición 1 que confiere actividad de agonista de GIP, (b) un puente de lactama entre las cadenas laterales de aminoácidos en las posiciones i e i+4 o entre las cadenas laterales de aminoácidos en las posiciones j y j+3, en donde i es 12, 13, 16, 17, 20 o 24, y en donde j es 17, (c) modificaciones de aminoácidos en una, dos, o la totalidad de las posiciones 27, 28 y 29, por ejemplo, modificaciones de aminoácidos en las posiciones 27 y/o 28, y (d) 1-9 o 1-6 otras modificaciones de aminoácidos, por ejemplo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 o 9 modificaciones de aminoácidos y la EC50 del análogo para la activación del receptor de GIP es de aproximadamente 10 nM o menos.

El puente de lactama del análogo de estas realizaciones puede ser un puente de lactama como se describe en la presente. Véase, por ejemplo, las enseñanzas de puentes de lactama en la sección "Estabilización de la Estructura de Alfa Hélice". Por ejemplo, el puente de lactama puede ser entre los aminoácidos en las posiciones 16 y 20, en donde uno de los aminoácidos en las posiciones 16 y 20 se sustituye con Glu y el otro de los aminoácidos en las posiciones 16 y 20 se sustituye con Lys .

De acuerdo con estas realizaciones, el análogo puede comprender, por ejemplo, la secuencia de aminoácido de cualquiera de SEQ ID NO 1005-1094.

En otros ejemplos de realizaciones, el análogo de glucagón (SEQ ID NO 1001) que tiene actividad de agonista de GIP comprende las siguientes modificaciones: (a) una modificación de aminoácido en la posición 1 que confiere actividad de agonista de GIP, (b) uno, dos, tres o la totalidad de los aminoácidos en las posiciones 16, 20, 21, y 24 del análogo se sustituye con un aminoácido , a-disustituido, (c) modificaciones de aminoácidos en una, o la totalidad de las posiciones 27, 28 y 29, por ejemplo, modificaciones de aminoácidos en la posición 27 y/o 28, y (d) 1-9 o 1-6 otras modificaciones de aminoácidos, por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 o 9 otras modificaciones de aminoácidos y la EC50 del análogo para la activación del receptor de GIP es 10 nM o menos.

El aminoácido , a-disustituido del análogo de estas realizaciones puede ser cualquier aminoácido OÍ, a-disustituido, que incluye, en forma no taxativa, ácido amino iso-butírico (AIB) , un aminoácido disustituido con el mismo o un grupo diferente, seleccionado de metilo, etilo, propilo y n-butilo, o con un ciclooctano o cicloheptano (por ejemplo ácido 1-aminociclooctano-l-carboxílico) . En ciertas realizaciones, el aminoácido a,a-disustituido es AIB. En ciertas realizaciones, el aminoácido en la posición 20 se sustituye con un aminoácido , -disustituido, por ejemplo AIB.

De acuerdo con estas realizaciones, el análogo puede ocmprender, por ejemplo, la secuencia de aminoácido de cualquiera de SEQ ID NO 1099-1141, 1144-1164, 1166-1169 y 1173-1178.

En aún otros ejemplos de realizaciones, el análogo de glucagón (SEQ ID NO: 1001) que tiene actividad de agonista de GIP, comprende las siguientes modificaciones: (a) una modificación de aminoácido en la posición 1 que confiere actividad de agonista de GIP, (b) una sustitución de aminoácido de Ser en la posición 16 con un aminoácido de la Fórmula IV: [Fórmula IV] , en donde n es l a 16, o l a 10, o l a 7, o 1 a 6, o 2 a 6, cada uno de i y R2 se selecciona independientemente del grupo formado por H, alquilo de Ci-Ci8, (alquilo de Ci-Ci8)OH, (alquilo de Ci-Ci8)NH2, (alquilo de Ci-C18)SH, (alquilo de C0- C4) (C3-C6) cicloalquilo, (alquilo de C0- C4) (heterocíclico de C2-C5) , (alquilo de C0- C4) (arilo de C6-Cio) 7, Y (alquilo de Ci- C ) (heteroarilo de C3-C9) , en donde R7 es H o OH, y la cadena lateral del aminoácido de la Fórmula IV comprende un grupo amino libre, (c) una sustitución de aminoácido de la Gln en la posición 20 con un aminoácido alfa, alfa- disustituido, (d) modificaciones de aminoácidos en una, dos o la totalidad de las posiciones 27, 28 y 29, por ejemplo modificaciones de aminoácidos en la posición 27 y/o 28, y (e) 1-9 o 1-6 otras modificaciones de aminoácidos, por ejemplo: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 o 9 otras modificaciones de aminoácidos, y EC50 del análogo para la activación del receptor de GIP es aproximadamente 10 n o menos.

El aminoácido de la Fórmula IV del análogo de estas realizaciones puede ser cualquier aminoácido, tal como, por ejemplo, el aminoácido de la Fórmula IV, en donde n es 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, o 16. En ciertas realizaciones, n es 2, 3, 4, o 5, en donde el aminoácido es Dab, Orn, Lys, u homoLys respectivamente.

El aminoácido alfa, alfa-disustituido del análogo de estas realizaciones puede ser cualquier aminoácido alfa, alfa-disustituido, que incluye, en forma no taxativa, ácido amino iso-butírico (AIB) , un aminoácido disustituido con el mismo o un grupo diferente seleccionado de metilo, etilo, propilo y n-butilo o con un ciclooctano o cicloheptano (por ejemplo, 1-aminociclooctano-l-carbox£lico) . En ciertas realizaciones, el aminoácido alfa, alfa-disustituido es AIB.

De acuerdo con estas realizaciones, el análogo puede comprender, por ejemplo, la secuencia de aminoácido de cualquiera de SEQ ID NO 1099-1165.

En aún otros ejemplos de realizaciones, el análogo de glucagón (SEQ ID NO 1001) que tiene la actividad de agonista de GIP comprende : (a) una modificación de aminoácido en la posición 1 que confiere actividad de agonista de GIP y (b) una prolongación de aproximadamente 1 a 21 aminoácidos del extremo de C al aminoácido en la posición 29, en donde por lo menos uno de los aminoácidos de la prolongación está acilado o alquilado, en donde la EC50 del análogo para la activación del receptor de GIP es aproximadamente 10 nM o menos.

En algunas realizaciones, el aminoácido acilado o alquilado es un aminoácido de la Fórmula I, II o III. En realizaciones más específicas, el aminoácido de la Fórmula I es Dab, Orn, Lys o homoLys . Además, en algunas realizaciones, la prolongación de 1 a 21 aminoácidos comprende la secuencia de aminoácido de GPSSGAPPPS (SEQ ID NO: 1095) o XGPSSGAPPPS (SEQ ID NO: 1096), en donde X es cualquier aminoácido, o GPSSGAPPPK (SEQ ID NO: 1170) o XGPSSGAPPPK (SEQ ID NO: 1171) o XGPSSGAPPPSK (SEQ ID NO: 1172), en donde X es Gly o aminoácido pequeño, alifático o no polar o ligeramente polar. En algunas realizaciones de 1 a 21 aminoácidos pueden comprender secuencias que comprenden una o más sustituciones conservadoras en relación con SEQ ID NO: 1095, 1096, 1170, 1171 o 1172. En algunas realizaciones, el aminoácido acilado o alquilado está ubicado en la posición 37, 38, 39, 40, 41, 42, o 43 del análogo prolongado del extremo de C . En ciertas realizaciones, el aminoácido acilado o alquilado está ubicado en la posición 40 del análogo prolongado del extremo de C.

En algunas realizaciones, el análogo que tiene actividad de agonista de GIP además comprende modificaciones de aminoácido en una, dos o la totalidad de las posiciones 27, 28 y 29, por ejemplo, modificaciones de aminoácidos en las posiciones 27 y/o 28.

En cualquiera de los ejemplos de realizaciones precedentes, la modificación de aminoácido en la posición 1 que confiere actividad de agonista de GIP puede ser una sustitución de His con un aminoácido que carece de una cadena lateral de imidazol . La modificación de aminoácido en la posición 1 puede ser por ejemplo, una sustitución de His con un aminoácido grande, aromático. En algunas realizaciones, el aminoácido grande, aromático es cualquiera de aquellos descritos en la presente, que incluyen, por ejemplo, Tyr.

Además, con respecto a los ejemplos de realizaciones precedentes, las modificaciones de aminoácidos en una, dos o la totalidad de las posiciones 27, 28 y 29, pueden ser cualquiera de las modificaciones en estas posiciones descritas anteriormente. Por ejemplo, la Met en la posición 27 se puede sustituir con un aminoácido grande, alifático, opcionalmente Leu, la Asn en la posición 28 se puede sustituir con un aminoácido pequeño alifático, opcionalmente Ala, y/o la Thr en la posición 29 se puede sustituir con un aminoácido pequeño alifático, opcionalmente Gly. Alternativamente, el análogo puede comprender tales modificaciones de aminoácidos en la posición 27 y/o 28.

El análogo de los ejemplos de realizaciones precedentes puede comprender además 1-9 o 1-6 otras modificaciones de aminoácido, tales como, por ejemplo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 o 9 otras modificaciones de aminoácido, tales como, por ejemplo cualquiera de las modificaciones descritas en la presente que aumentan o disminuyen la actividad en cualquiera de los receptores de GIP, GLP-1 y glucagón, mejoran la solubilidad, mejoran la duración de acción o la semivida en circulación, retardan el inicio de la acción o aumentan la estabilidad. El análogo puede comprender además, por ejemplo, una modificación de aminoácido en la posición 12, opcionalmente una sustitución con lie, y/o modificaciones de aminoácido en las posiciones 17 y 18, opcionalmente sustitución con Q en la posición 17 y A en la posición 18, y/o agregado de GPSSGAPPPS (SEQ ID NO: 1095) o XGPSSGAPPPS (SEQ ID NO: 1096), o secuencias que contienen una o más sustituciones conservadoras en relación con SEQ ID NO 1095 o 1096, en el extremo de C. El análogo puede comprender una o más de las siguientes modificaciones: (i) Ser en la posición 2 sustituido con D-Ser, Ala, D- Ala, Gly, N-metil-Ser, AIB, Val, o ácido a-amino- N-but£rico; (ii) Tyr en la posición 10 sustituido con Trp, Lys, Orn, Glu, Phe, o Val; (iii) Unión de un grupo acilo a Lys en la posición 10; (iv) Lys en la posición 12 sustituido con Arg; (v) Ser en la posición 16 sustituido con Glu, Gln, ácido homoglutámico, ácido homocisteico, Thr, Gly, O AIB; (vi) Arg en la posición 17 sustituido con Gln; (vii) Arg en la posición 18 sustituido con Ala, Ser, Thr, o Gly; (viii) Gln en la posición 20 sustituido con Ala, Ser, Thr, Lys, Citrulina, Arg, Orn, o AIB; (ix) Asp en la posición 21 sustituido con Glu, ácido homoglutámico, ácido homocisteico; (x) Val en la posición 23 sustituido con lie; (xi) Gln en la posición 24 sustituido con Asn, Ala, Ser, Thr, o AIB; y (xii) una sustitución conservadora en cualquiera de las posiciones 2, 5, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 24, 27, 28, y 29 El análogo en algunas realizaciones comprende una combinación de las modificaciones (i) a (xii) . Alternativamente o además, el análogo puede comprender una modificación de aminoácido en la posición 3 (por ejemplo, una sustitución de aminoácido de Gln con Glu) , en donde el análogo tiene menos del 1% de la actividad de glucagón en el receptor de glucagón. Alternativamente o además, el análogo puede comprender una modificación de aminoácido en la posición 7 (por ejemplo, una sustitución de aminoácido de Thr con un aminoácido que carece de un grupo hidroxilo, por ejemplo Abu o lie) , en donde el análogo tiene menos del 10% de la actividad de GLP-1 en el receptor de GLP-1.

Con respecto a los ejemplos de realizaciones, el análogo se puede unir en forma covalente a un grupo hidrófilo. En algunas realizaciones el análogo está unido en forma covalente al grupo hidrófilo en cualquiera de las posiciones de aminoácido 16, 17, 20, 21, 24, 29, 40, o el extremo de C. En ciertas realizaciones, el análogo comprende una prolongación del extremo de C (por ejemplo, una secuencia de aminoácido de SEQ ID NO 1095) y un agregado de un aminoácido que comprende el grupo hidrófilo, de manera tal que el grupo hidrófilo se una en forma covalente al análogo en la posición 40.

En algunas realizaciones el grupo hidrófilo está unido en forma covalente a Lys, Cys, Orn, homocisteína, o acetil-fenilalanina del análogo. La Lys, Cys, Orn, homocisteína, o acetil-fenilalanina pueden ser un aminoácido que es nativo a la secuencia de glucagón (SEQ ID NO 1001) o puede ser un aminoácido que está reemplazando a un amioácido nativo de SEQ ID NO 1001. En algunas realizaciones en donde el grupo hidrófilo se une a un Cys, la ligadura al grupo hidrófilo puede comprender la estructura : Con respecto a los análogos que comprenden un grupo hidrófilo, el grupo hidrófilo puede ser cualquiera de aquellos descritos en la presente. Véase, por ejemplo, las enseñanzas en la sección "Unión de grupos hidrófilos" . En algunas realizaciones el grupo hidrófilo es un polietilenglicol (PEG) . El PEG en ciertas realizaciones tiene un peso molecular de 1.000 Dalton a 40.000 Dalton, por ejemplo de 20.000 Dalton a 40.000 Dalton.

Con respecto a los ejemplos de realizaciones, el análogo puede comprender un aminoácido modificado en donde la cadena lateral se une en forma covalente a un grupo acilo o alquilo (por ejemplo, un grupo acilo o alquilo que es no nativo a un aminoácido natural) . El análogo acilado o alquilado puede estar de acuerdo con los péptidos acilados o alquilados descritos en la sección "Acilación y Alquilación" . En algunas realizaciones, el grupo acilo es un grupo acilo graso de C4 a C30, tal como por ejemplo, un grupo acilo graso o alquilo de CIO, un grupo acilo graso o alquilo de C12, un grupo acilo graso o alquilo de C14, un grupo acilo graso o alquilo de C16, un grupo acilo graso o alquilo de C18, un grupo acilo o alquilo de C20, o un grupo acilo o alquilo de C22. El grupo acilo o alquilo puede estar unido en forma covalente a cualquier aminoácido del análogo, que incluye, en forma no taxativa, el aminoácido en la posición 10 o 40, o el aminoácido del extremo de C. En ciertas realizaciones, el análogo comprende una prolongación del extremo de C (por ejemplo, una secuencia de aminoácido de SEQ ID NO 1095) y un agregado de un aminoácido que comprende el grupo acilo o alquilo, de manera tal que el grupo acilo o alquilo esté unido en forma covalente al análogo en la posición 40. En algunas realizaciones, el grupo acilo o alquilo está unido en forma covalente a la cadena lateral de un aminoácido de la Fórmula I, II o III, por ejemplo, un residuo de Lys . El grupo acilo o alquilo puede estar unido en forma covalente a un aminoácido que es nativo a la secuencia de glucagón (SEQ ID NO 1001) o puede estar unido a un aminoácido que se agrega a la secuencia de SEQ ID NO 1001 o a la secuencia de SEQ ID NO 1001 seguida por SEQ ID NO 1095 (en el extremo de N o C) o puede estar unido a un aminoácido que reemplaza a un aminoácido nativo, por ejemplo la Tyr en la posición 10 de SEQ ID NO 1001.

En los ejemplos de realizaciones precedentes, en donde el análogo comprende un grupo acilo o alquilo, el análogo puede unirse al grupo acilo o alquilo a través de un separador, como se describe en la presente. El separador, por ejemplo, puede tener de 3 a 10 átomos de longitud y puede ser, por ejemplo, un aminoácido (por ejemplo, ácido 6-amino hexanoico, cualquier aminoácido descrito en la presente) , un dipéptido (por ejemplo, Ala-Ala, pAla^Ala, Leu-Leu, Pro-Pro, YGlu-yGlu) , un tripéptido o un separador bifuncional hidrófilo o hidrófobo. En ciertos aspectos, la longitud total del separador y al grupo acilo o alquilo tiene de 14 a 28 átomos. En algunas realizaciones, el separador de aminoácido no es ?-Glu. En algunas realizaciones, el separador de dipéptido no es ?-Glu- ?-Glu.

En aún otros ejemplos de realizaciones, el análogo de glucagón que tiene actividad de receptor de GIP comprende la secuencia de aminoácido de acuerdo con cualquiera de SEQ ID NO 1227, 1228, 1229, o 1230 que además comprende las siguientes modificaciones: (a) opcionalmente, una modificación de aminoácido en la posición 1 que confiere actividad de agonista de GIP, (b) una prolongación de 1 a 21 aminoácidos del extremo de C al aminoácido en la posición 29, en donde por lo menos uno de los aminoácidos de la prolongación está acilado o alquilado y (c) hasta 6 otras modificaciones de aminoácido, en donde la EC50 del análogo para la activación del receptor de GIP es 10 nM o menos.

En algunos aspectos, el aminoácido acilado o alquilado es un aminoácido de la Fórmula I, II o III. En realizaciones más específicas, el aminoácido de la Fórmula I es Dab, Orn, Lys o homoLys. Además, en algunas realizaciones, de 1 a 21 aminoácidos comprende al secuencia de GPSSGAPPPS (SEQ ID NO: 1095) o XGPSSGAPPPS (SEQ ID NO: 1096), en donde X es cualquier aminoácido, o GPSSGAPPPK (SEQ ID NO: 1170) o XGPSSGAPPPK (SEQ ID NO: 1171) o XGPSSGAPPPSK (SEQ ID NO: 1172), en donde X es Gly o un aminoácido pequeño, alifático o no polar o ligeramente polar. En algunas realizaciones de 1 a 21 aminoácidos pueden comprender secuencias que contienen una o más sustituciones conservadoras en relación con SEQ ID NO 1095, 1096, 1170, 1171 o 1172. En algunas realizaciones, el aminoácido acilado o alquilado está ubicado en la posición 37, 38, 39, 40, 41, 42, o 43 del análogo prolongado del extremo de C. En ciertas realizaciones, el aminoácido acilado o alquilado está ubicado en la posición 40 del análogo prolongado del extremo de C.

En cualquiera de los ejemplos de realizaciones precedentes, el aminoácido en la posición 1 que confiere actividad de agonista de GIP puede ser un aminoácido que carece de una cadena lateral de imidazol . El aminoácido en la posición 1 puede, por ejemplo, ser un aminoácido grande, aromático. En algunas realizaciones, el aminoácido grande, aromático es cualquiera de aquellos descritos en la presente, que incluyen, por ejemplo, Tyr.

El análogo de los ejemplos precedentes de realizaciones puede comprender además 1-6 otras modificaciones de aminoácidos, tales como, por ejemplo, cualquiera de las modificaciones descritas en la presente que aumentan o disminuyen la actividad en cualquiera de los receptores de GIP, GLP-1 y glucagón, mejoran la solubilidad, mejoran la duración de acción o semivida en circulación, retardan el inicio de acción o aumentan la estabilidad.

En ciertos aspectos, los análogos de glucagón descritos en los ejemplos precedentes de realizaciones, comprenden otras modificaciones de aminoácidos en una, dos o la totalidad de las posiciones 27, 28 y 29. Las modificaciones en estas posiciones pueden ser cualquiera de las modificaciones descritas en la presente en relación con estas posiciones. Por ejemplo, en relación con SEQ ID NO: 1227, 1228, 1229 o 1230, la posición 27 se puede sustituir con un aminoácido grande alifático (por ejemplo, Leu, lie o norleucina) o Met, la posición 28 puede sustituirse con otro aminoácido pequeño alifático (por ejemplo, Gly o Ala) o Asn, y/o la posición 29 se puede sustituir con otro aminoácido alifático pequeño (por ejemplo, Ala o Gly) o Thr. Alternativamente, el análogo puede comprender dichas modificaciones de aminoácido en la posición 27 y/o 28.

El análogo puede comprender además una o más de las siguientes modificaciones adicionales: (i) el aminoácido en la posición 2 es uno cualquiera de D-Ser, Ala, D-Ala, Gly, N-metil-Ser, AIB, Val, o ácido a-amino-N-but£rico; (ii) el aminoácido en la posición 10 es Tyr, Trp, Lys, Orn, Glu, Phe, o Val; (iii) la unión de un grupo acilo a una Lys en la posición 10; (iv) el aminoácido en la posición 12 es lie, Lys o Arg; (v) el aminoácido en la posición 16 es cualquiera de Ser, Glu, Gln, ácido homoglutámico, ácido homocisteico, Thr, Gly, o AIB; (vi) el aminoácido en la posición 17 es Gln o Arg; . (vii) el aminoácido en la posición 18 es cualquiera de Ala, Arg, Ser, Thr, o Gly; (viii) el aminoácido en la posición 20 es cualquiera de Ala, Ser, Thr, Lys, Citrulina, Arg, Orn, o AIB u otro ácido alfa, alfa-disustituido; (ix) el aminoácido en la posición 21 es cualquiera de Glu, Asp, ácido homoglutámico, ácido homocisteico; (x) el aminoácido en la posición 23 es Val o lie; (xi) el aminoácido en la posición 24 es uno cualquiera de Gln, Asn, Ala, Ser, Thr, o AIB; y (xii) una o más sustituciones conservadoras en cualquiera de las posiciones 2, 5, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 24, 27, 28, y 29 El análogo en algunas realizaciones comprende una combinación de las modificaciones (i) a (xii) . Alternativamente o además, el análogo puede comprender una modificación de aminoácido en la posición 3 (por ejemplo una sustitución de aminoácido de Gln con Glu) , en donde el análogo tiene menos del 1% de la actividad de glucagón en el receptor de glucagón. Alternativamente o además, el análogo puede comprender una modificación de aminoácido en la posición 7 (por ejemplo, una sustitución de aminoácido de Thr con un aminoácido que carece de un grupo hidroxilo, por ejemplo, Abu o lie) , en donde el análogo tiene menos del 10% de la actividad de GLP-1 en el receptor de GLP-1.

Con respecto a los ejemplos de realizaciones, el análogo se puede unir en forma covalente a un grupo hidrófilo. En algunas realizaciones, el análogo está unido en forma covalente al grupo hidrófilo en cualquiera de las posiciones de aminoácido 16, 17, 20, 21, 24, 29, 40, o el extremo de C. En ciertas realizaciones, el análogo comprende un grupo hidrófilo unido en forma covalente al análogo en la posición 24.

En algunas realizaciones, el grupo hidrófilo está unido en forma covalente a una Lys, Cys, Orn, homocisteína, o acetil-fenilalanina del análogo. La Lys, Cys, Orn, homocisteína, o acetil-fenilalanina pueden ser un aminoácido que es nativo en SEQ ID NO: 1001, 1227, 1228, 1229 o 1230 o puede ser un aminoácido sustituido. En algunas realizaciones, en donde el grupo hidrófilo está unido a una Cys, la unión puede comprender la estructura Con respecto a los análogos que comprenden un grupo hidrófilo, el grupo hidrófilo puede ser cualquiera de aquellos descritos en la presente. Véase, por ejemplo, las enseñanzas en la sección "Unión de grupos hidró ilos algunas realizaciones el grupo hidrófilo es un polietilenglicol (PEG) . El PEG en ciertas realizaciones tiene un peso molecular de 1.000 Dalton a 40.000 Dalton, por ejemplo de 20.000 Dalton a 40.000 Dalton.

Con respecto a los ejemplos de realizaciones, el análogo puede comprender un aminoácido modificado dentro de la prolongación del extremo de C en donde la cadena lateral se une en forma covalente a un grupo acilo o alquilo. El análogo acilado o alquilado puede estar de acuerdo con los péptidos acilados o alquilados descritos en la sección "Acilación y Alquilación" . En algunas realizaciones, el grupo acilo es un grupo acilo graso de C4 a C30, tal como por ejemplo, un grupo acilo graso o alquilo de CIO, un grupo acilo graso o alquilo de C12, un grupo acilo graso o alquilo de C14, un grupo acilo graso o alquilo de C16, un grupo acilo graso o alquilo de C18, un grupo acilo o alquilo de C20, o un grupo acilo o alquilo de C22. El grupo acilo o alquilo puede estar unido en forma covalente a cualquier aminoácido del análogo, que incluye, en forma no taxativa, el aminoácido en la posición 10 o 40, o el aminoácido del extremo de C. En algunas realizaciones, el grupo acilo o alquilo está unido en forma covalente a la cadena lateral de un aminoácido de la Fórmula I, II o III, por ejemplo, un residuo de Lys . El grupo acilo o alquilo puede estar unido en forma covalente a un aminoácido que es nativo a SEQ ID NO 1001, 1227, 1228, 1229 o 1230 o puede estar unido a un aminoácido sustituido. El grupo acilo o alquilo está unido en forma covalente a un aminoácido que es nativo a SEQ ID NO 1001, 1227, 1228, 1229 o 1230 o puede estar unido a un aminoácido sustituido. El grupo acilo o alquilo está unido en forma covalente a un aminoácido que es nativo a SEQ ID NO 1095, 1096, 1171 o 1172, o puede estar unido a un aminoácido sustituido .

En los ejemplos de realizaciones precedentes, en donde él análogo comprende un grupo acilo o alquilo, el análogo puede unirse al grupo acilo o alquilo a través de un separador, como se describe en la presente. El separador, por ejemplo, puede tener de 3 a 10 átomos de longitud y puede ser, por ejemplo, un aminoácido (por ejemplo, ácido 6-amino hexanoico, cualquier aminoácido descrito en la presente) , un dipéptido (por ejemplo, Ala-Ala, ß??ß-ß??ß, Leu-Leu, Pro-Pro, yGlu-YGlu) , un tripéptido o un separador bifuncional hidrófilo o hidrófobo. En ciertos aspectos, la longitud total del separador y del grupo acilo o alquilo tiene de 14 a 28 átomos. En algunas realizaciones el separador de aminoácido no es ?-Glu. En algunas realizaciones, el separador de dipéptido no es ?-Glu- ?-Glu.

En algunas realizaciones muy específicas, un análogo de la invención comprende una secuencia de aminoácido seleccionada del grupo formado por SEQ ID NOs : 1099-1141, 1144-1164, 1166, 1192-1207, 1209-1221 y 1223 o se selecciona del grupo formado por SEQ ID NOS : 1167-1169, 1173-1178 y 1225.

En algunas realizaciones, los ejemplos específicos de análogos de la invención incluyen en forma no taxativa, cualquiera de aquellos citados en las Tablas 1-3.

En aún otros ejemplos de realizaciones, el análogo de glucagón que tiene actividad de agonista de GIP comprende un grupo acilo o alquilo (por ejemplo, un grupo acilo o alquilo que es no nativo a un aminoácido natural) , en donde el grupo acilo o alquilo se une a un separador, en donde (i) el separador está unido a la cadena lateral del aminoácido en la posición 10 del análogo, o (ii) el análogo comprende una prolongación de 1 a 21 aminoácidos del extremo de C al aminoácido en la posición 29 y el separador se une a la cadena lateral de un aminoácido que corresponde a una de las posiciones 37-43 en relación con SEQ ID NO 1001, en donde la EC50 del análogo para la activación del receptor de GIP es de 10 nM o menos .

En dichas realizaciones, el análogo puede comprender una secuencia de aminoácido de SEQ ID NO 1001 con (i) una modificación de aminoácido en la posición 1 que confiere actividad de agonista de GIP, (ii) modificaciones de amioácido en una, dos o la totalidad de las posiciones 27, 28 y 29, (iii) por lo menos uno de : (A) el análogo comprende un puente de lactama entre las cadenas laterales de aminoácidos en las posiciones i e i+4 o entre las cadenas laterales de aminoácidos en las posiciones j y j+3, en donde i es 12 , 13, 16, 17, 20 o 24, y en donde j es 17; (B) uno, dos, tres o la totalidad de los aminoácidos en la posición 16, 20, 21 y 24 del análogo se sustituye con un aminoácido alfa, alfa-disustituido, o (C) el análogo comprende (i) una sustitución de aminoácido de Ser en la posición 16 con un aminoácido de la Fórmula IV [Fórmula IV] , en donde n es 1 a 7, en donde cada uno de Rl y R2 se selecciona independientemente del grupo foramodo por H, alquilo de Ci-Ci8/ (alquilo de Ci-Ci8)OH, (alquilo de Ci- Ci8)NH2, (alquilo de Ci-C18)SH, (alquilo de C0-C4) (C3- C6) cicloalquilo, (alquilo de C0-C4) (heterocíclico de C2-C5) , (alquilo de C0-C4) (arilo de C6-Ci0)R7, y (alquilo de Ci- C4) (heteroarilo de C3-C9) , en donde R7 es H o OH, y la cadena lateral del aminoácido de la Fórmula IV comprende un aminoácido libre; y (ii) una sustitución de aminoácido de la Gln en la posición 20 con un aminoácido alfa, alfa- disustituido y (iv) hasta 6 otras sustituciones de aminoácidos.

El aminoácido alfa, alfa-disustituido del análogo de estas realizaciones puede ser cualquier aminoácido alfa, alfa-disustituido que incluye, en forma no taxativa, ácido amino isobutírico (AIB) , un aminoácido disustituido con el mismo o un grupo diferente seleccionado de metilo, etilo, propilo, y n-butilo, o con un ciclooctano o cicloheptano (por ejemplo, ácido l-aminociclooctano-l-carbox£lico) . En algunas realizaciones el aminoácido alfa, alfa-disustitudo es AIB.

El aminoácido de la Fórmula IV del análogo de estas realizaciones puede ser cualquier aminoácido, tal como, por ejemplo, el aminoácido de la Fórmula IV, en donde n es 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, o 16. En ciertas realizaciones, n es 2, 3, 4, o 5, en cuyo caso el aminoácido es Dab, Orn, Lys, o homoLys respectivamente.

En cualquiera de los ejemplos de realizaciones precedentes, la modificación de aminoácido en la posición 1 que confiere actividad de agonista de GIP puede ser una sustitución de His con un aminoácido que carece de una cadena lateral de imidazol. La modificación de aminoácido en la posición 1 puede ser, por ejemplo, una sustitución de His con un aminoácido grande, aromático. En algunas realizaciones, el aminoácido grande, aromático es cualquiera de aquellos descritos en la presente, que incluye, por ejemplo, Tyr.

Además, con respecto a los ejemplos de realizaciones precedentes, las modificaciones de aminoácidos en una, dos, o la totalidad de las posiciones 27, 28 y 29 pueden ser cualquiera de las modificaciones de estas posiciones descritas en la presente. Por ejemplo, la et en la posición 27 se puede sustituir con un aminoácido grande alifátco, opcionalmente Leu, la Asn en la posición 28 se puede sustituir con un aminoácido pequeño alifático, opcionalmente Ala, y/o la Thr en la posición 29 se puede sustituir con un aminoácido pequeño alifático, opcionalmente Gly. Alternativamente, el análogo puede comprender dichas modificaciones de aminoácido en la posición 27 y/o 28.

El análogo de los ejemplos de realizaciones precedentes puede comprender además 1-9 o 1-6 otras modificaciones de aminoácidos adicionales, por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 o 9 otras modificaciones de aminoácido, tales como, por ejemplo, cualquiera de las modificaciones descritas en la presente que aumentan o disminuyen la actividad de cualquiera de los receptores de GIP, GLP-1 y glucagón, mejoran la solubilidad, mejoran la duración de acción o semivida en circulación, retardan el inicio de acción, o aumentan la estabilidad. El análogo puede comprender además, por ejemplo, una modificación de aminoácido en la posición 12, opcionalmente, una sustitución con lie, y/o modificaciones de aminoácido en las posiciones 17 y 18, opcionalmente la sustitución con Q en la posición 17 y A en la posición 18 y/o un agregado de GPSSGAPPPS (SEQ ID NO: 1095) o XGPSSGAPPPS (SEQ ID NO: 1096) , o secuencias que contienen una o más sustituciones conservadoras en relación con SEQ ID NO 1095 o 1096, al extremo de C. El análogo puede comprender una o más de las siguientes modificaciones : (i) Ser en la posición 2 sustituido con D-Ser, Ala, D- Ala, Gly, N-metil-Ser, AIB, Val, o ácido -amino- N-butírico; (ii) Tyr en la posición 10 sustituido con Trp, Lys, Orn, Glu, Phe, o Val; (iii) Unión del grupo acilo a Lys en la posición 10; (iv) Lys en la posición 12 sustituido con Arg; (v) Ser en la posición 16 sustituido con Glu, Gln, ácido homoglutámico, ácido homocisteico, Thr, Gly, Lys, o AIB; (vi) Arg en la posición 17 sustituido con Gln; (vii) Arg en la posición 18 sustituido con Ala, Ser, Thr, o Gly; (viii) Gln en la posición 20 sustituido con Ala, Ser, Thr, Lys, Citrulina, Arg, Orn, o AIB; (ix) Asp en la posición 21 sustituido con Glu, ácido homoglutámico, ácido homocisteico; (x) Val en la posición 23 sustituido con lie; (xi) Gln en la posición 24 sustituido con Asn, Ala, Ser, Thr, o AIB; y (xii)una sustitución conservadora en cualquiera de las posiciones 2, 5, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 24, 27, 28, y 29.

El análogo en algunas realizaciones comprende una combinación de las modificaciones (i) a (xii) . Alternativamente o además, el análogo puede comprender una modificación de aminoácido en la posición 3 (por ejemplo una sustitución de aminoácido de Gln con Glu) , en donde el análogo tiene menos del 1% de la actividad de glucagón en el receptor de glucagón. Alternativamente o además, el análogo puede comprender una modificación de aminoácido en la posición 7 (por ejemplo una sustitución de aminoácido de Thr con un aminoácido que carece de un grupo hidroxilo, por ejemplo, Abu o lie) , una eliminación del aminoácido del extremo de C al aminoácido en la posición 27 o 28, que da un péptido de 27 o 28 aminoácidos, o una combinación de ellos, en donde el análogo tiene menos del 10% de la actividad de GLP-1 en el receptor de GLP-l .

Con respecto a los ejemplos de realizaciones, el análogo se puede unir en forma covalente a un grupo hidrófilo. En algunas realizaciones, el análogo está unido en forma covalente al grupo hidrófilo en cualquiera de las posiciones de aminoácido 16, 17, 20, 21, 24, 29, 40, o el extremo de C. En ciertas realizaciones, el análogo comprende una prolongación del extremo de C (por ejemplo una secuencia de aminoácido de SEQ ID NO 1095) y un agregado de un aminoácido que comprende el grupo hidrófilo, de manera tal que el grupo hidrófilo está unido en forma covalente al análogo en la posición 40.

En algunas realizaciones el grupo hidrófilo está unido en forma covalente a una Lys, Cys, Orn, homocisteína, o acetil-fenilalanina del análogo. La Lys, Cys, Orn, homocisteína, o acetil-fenilalanina pueden ser un aminoácido que es nativo a la secuencia de glucagón (SEQ ID NO: 1001) o puede ser un aminoácido que reemplaza al aminoácido nativo de SEQ ID NO: 1001. En algunas realizaciones, en donde el grupo hidrófilo está unido a una Cys, la unión al grupo hidrófilo puede comprender la estructura Con respecto a los análogos que comprenden un grupo hidrófilo, el grupo hidrófilo puede ser cualquiera de aquellos descritos en la presente. Véase, por ejemplo, las enseñanzas en la sección "Unión de grupos hidrófilos" . En algunas realizaciones el grupo hidrófilo es un polietilenglicol (PEG) . El PEG en ciertas realizaciones tiene un peso molecular de 1.000 Dalton a 40.000 Dalton, por ejemplo de 20.000 Dalton a 40.000 Dalton.

En ejemplos de realizaciones, en donde el análogo comprende un grupo acilo o alquilo, que está unido al análogo a través de un separador, el separador puede ser cualquier separador que se describe en la presente. El separador, por ejemplo, puede tener de 3 a 10 átomos de longitud y puede ser, por ejemplo, un aminoácido (por ejemplo, ácido 6-amino hexanoico, cualquier aminoácido descrito en la presente) , un dipéptido (por ejemplo, Ala-Ala, ß??3- ??3, Leu-Leu, Pro-Pro, YGIU-YGIU) , un tripéptido o un separador bifuncional hidrófilo o hidrófobo. En ciertos aspectos, la longitud total entre el separador y el grupo acilo o alquilo es de 14 a 28 átomos. En algunas realizaciones el separador de aminoácido no es ?-Glu. En algunas realizaciones, el separador de dipéptido no es ?-Glu- ?-Glu.

El grupo acilo es cualquier grupo acilo o alquilo descrito en la presente, tal como un grupo acilo o alquilo que es no nativo a un aminoácido natural. El grupo acilo o alquilo en algunas realizaciones es un grupo acilo graso de C4 a C30, tal como por ejemplo, un grupo acilo graso o alquilo de CIO, un grupo acilo graso o alquilo de C12, un grupo acilo graso o alquilo de C14 , un grupo acilo graso o alquilo de C16, un grupo acilo graso o alquilo de C18, un grupo acilo o alquilo de C20, o un grupo acilo o alquilo de C22, o un grupo alquilo de C4 a C30. En realizaciones específicas el grupo acilo es un grupo acilo graso de C12 a C18, por ejemplo un grupo acilo graso de C14 a C16) .

En algunas realizaciones, la extensión de 1 a 21 aminoácidos del extremo de C al aminoácido en la posición 29 del profármaco comprende la secuencia de aminoácido de GPSSGAPPPS (SEQ ID NO: 1095) o XGPSSGAPPPS (SEQ ID NO: 1096), en donde X es cualquier aminoácido, o GPSSGAPPPK (SEQ ID NO: 1170) o XGPSSGAPPPK (SEQ ID NO: 1171) o XGPSSGAPPPSK (SEQ ID NO: 1172), en donde X es Gly o un aminoácido pequeño, alifático o no polar o ligeramente polar. En algunas realizaciones, de 1 a 21 aminoácidos pueden comprender secuencias que contienen una o más sustituciones conservadoras en relación con SEQ ID NO: 1095, 1096, 1170, 1171 o 1172. En algunas realizaciones, el aminoácido acilado o alquilado está ubicado en la posición 37, 38, 39, 40, 41, 42, o 43 del análogo prolongado del extremo de C. En ciertas realizaciones, el aminoácido acilado o alquilado está ubicado en la posición 40 del análogo prolongado del extremo de C.

El agonista de GIP puede ser un péptido que comprende la secuencia de aminoácido de cualquiera de las secuencias de aminoácidos, por ejemplo, SEQ ID NO 1005-1094, con hasta 1, 2, 3, 4 o 5 otras modificaciones que retienen la actividad de agonista de GIP. En ciertas realizaciones, el agonista de GIP comprende los aminoácidos de cualquiera de SEQ ID NO 1099-1262.

Péptidos Relacionados con Glucagón de la Clase 3 En ciertas realizaciones, el péptido relacionado con glucagón es un péptido relacionado con glucagón de la Clase 3, que se describe en la presente y en la Solicitud Internacional de Patente N° PCT US2009/47438 (presentada el 16 de junio de 2009) , la Publicación de la Solicitud de Internacional Patente N° WO 2008/101017, publicada el 21 de agosto de 2008 y la Solicitud Provisoria de Patente Estadounidense N° 61/090.412 y en la Solicitud de Patente Estadounidense N° 61/177.476, cuyo contenido se incluye en la presente por referencia en su totalidad.

Algunas de las secuencias biológicas citadas en la siguiente sección (SEQ ID NO: 1-656) en relación con los péptidos relacionados con glucagón de la Clase 3 corresponden a las SEQ ID NO: 1-656 en la Solicitud Internacional de Patente N° PCT US2009/47438.

Actividad El péptido relacionado con glucagon de la clase 3 puede ser un péptido que presenta una actividad aumentada en el receptor de glucagon, y en otras realizaciones presenta estabilidad biofísica y/o solubilidad acuosa mejorada. Además, en algunas realizaciones, el péptido relacionado con glucagon de la clase 3 ha perdido la selectividad de glucagon nativo para el receptor de glucagon contra el receptor de GLP-1 y por lo tanto representa coagonistas de esos dos receptores. Las modificaciones de aminoácidos seleccionadas dentro del péptido relacionado con glucagon de la clase 3 pueden controlar la actividad relativa del péptido en el receptor de GLP-1 contra el receptor de glucagon. Por lo tanto, el péptido relacionado con glucagon de la clase 3 puede ser un coagonista de glucagón/GLP- 1 que tiene más alta actividad en el receptor de glucagon contra el receptor de GLP-1, un coagonista de glucagón/GLP-1 que tiene actividad aproximadamente equivalente en ambos receptores, o un coagonista de glucagón/GLP- 1 que tiene más alta actividad en el receptor de GLP-1 contra el receptor de glucagon. La última categoría de coagonista se puede diseñar para presentar escasa o ninguna actividad en el receptor de glucagon y aún retener la capacidad de activar el receptor de GLP-1 con la misma o mejor potencia que GLP-1 nativo. Cualquiera de estos coagonistas también puede incluir modificaciones que confieren estabilidad biofísica y/o solubilidad acuosa mejorada.

Se pueden hacer modificaciones del péptido relacionado con glucagon de la clase 3 para producir un péptido de glucagon que tiene cualquiera de por lo menos 1% (que incluye por lo menos 1,5%, 2%, 5%, 7%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 75%, 100%, 125%, 150%, 175%) hasta 200% o más alta actividad en el receptor de GLP-1 en relación con GLP-1 nativo, y cualquiera desde por lo menos un 1% (que incluye un 1,5%, 2%, 5%, 7%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 75%, 100%, 125%, 150%, 175%, 200%, 250%, 300%, 350%, 400%, 450%) hasta 500% o más alta actividad en el receptor de glucagon en relación con el glucagon nativo. La secuencia de aminoácido de glucagon nativo es SEQ ID NO 1, la secuencia de aminoácido de GLP-1 (7-36) amida es SEQ ID NO 52 y la secuencia de aminoácido de GLP-1 (7-37 ( ácido es SEQ ID NO 50. En ejemplos de realizaciones, un péptido relacionado con glucagon de la clase 3 puede presentar por lo menos un 10% de la actividad de glucagon nativo en el receptor de glucagon y por lo menos un 50% de actividad de GLP-1 nativo en el receptor de GLP-1, o por lo menos 40% de la actividad de glucagon nativo en el receptor de glucagon y por lo menos un 40% de la actividad de GLP-1 nativo en el receptor de GLP-1, o por lo menos 60% de la actividad de glucagon nativo en el receptor de glucagon y por lo menos 60% de la actividad de GLP-1 nativo en el receptor de GLP-1.

La selectividad de un péptido relacionado con glucagón de la clase 3 para el receptor de glucagón contra el receptor de GLP-1 se puede describir como la relación relativa de la actividad de glucagón/GLP-l (la actividad del péptido en el receptor de glucagón en relación con el glucagón nativo, dividido por la actividad del péptido en el receptor de GLP-1 en relación con GLP-1 nativo) . Por ejemplo, un péptido relacionado con glucagón de la clase 3 que presenta un 60% de la actividad del glucagón nativo en el receptor de glucagón y un 60% de la actividad del GLP-1 nativo en el receptor de GLP-1 nativo tiene una relación 1:1 de la actividad de glucagón/GLP-l. Ejemplos de relaciones de la actividad de glucagón/GLP-l incluyen 1:1, 1.5:1, 2:1, 3:1, 4:1, 5:1, 6:1, 7:1, 8:1, 9:1 O 10:1, o 1:10, 1:9, 1:8, 1:7, 1:6, 1:5, 1:4, 1:3, 1:2, o 1:1,5. Como un ejemplo, una relación de actividad de glucagón/GLP-l de 10:1 indica una selectividad de 10 veces para el receptor de glucagón contra el receptor de GLP-1. En forma similar, la relación de la actividad de GLP-1/glucagón de 10:1 indica una selectividad de 10 veces para el receptor de GLP-1 contra el receptor de glucagón.

En algunas realizaciones, los péptidos relacionados con glucagón de la clase 3 tienen un 10% o menos de la actividad de glucagón nativo en el receptor de glucagón, por ejemplo 1-10%, 0,1-10% o más del 0,1% pero menos del 10%, mientras que presentan por lo menos un 20% de la actividad de GLP-1 en el receptor de GLP-1. Por ejemplo, ejemplos de péptidos relacionados con glucagón de la clase 3 descritos en la presente tienen un 0,5%, un 1% o un 7% de la actividad del glucagón nativo, mientras que presentan por lo menos un 20% de la actividad de GLP-1 en el receptor de GLP-1.

El péptido relacionado con glucagón de la clase 3 con actividad aumentada o disminuida en el receptor de glucagón o el receptor de GLP-1 o ambos. El péptido relacionado con glucagón de la clase 3 puede ser un péptido de glucagón con selectividad alterada para el receptor de glucagón contra el receptor de GLP-1.

Por lo tanto, como se revela en la presente, se proporcionan péptidos relacionados con glucagón de la clase 2 de alta potencia que también presentan solubilidad y/o estabilidad mejorada. Un ejemplo de péptido relacionado con glucagón de la clase 3 de alta potencia presenta por lo menos alrededor de un 200% de la actividad del glucagón nativo en el receptor de glucagón y opcionalmente es soluble en una concentración de por lo menos 1 mg/ml a un pH entre 6 y 8, o entre 6 y 9 o entre 7 y 9 (por ejemplo pH 7) y opcionalmente retiene por lo menos un 95% del péptido original (por ejemplo, un 5% o menos del péptido original se degrada o se descompone) después de 24 horas a 25 °C. Como otro ejemplo, un ejemplo de péptido relacionado con glucagón de la clase 3 presenta más de alrededor del 40% o más de alrededor del 60% de actividad en los receptores de glucagón y de GLP-1 (a una relación de entre aproximadamente 1:3 y 3:1, o entre aproximadamente 1:2 y 2:1), es opcionalmente soluble a una concentración de por lo menos 1 mg/ml a un pH de entre 6 y 8, o entre 6 y 9, o entre 7 y 9 (por ejemplo pH 7) y opcionalmente retiene por lo menos un 95% del péptido original después de 24 horas a 25 °C. Otro ejemplo de péptido relacionado con glucagón de la clase 3 presenta aproximadamente un 175% o más de la actividad de glucagón nativo en el receptor de glucagón y aproximadamente un 20% o menos de la actividad de GLP-1 nativo en el receptor de GLP-1, es opcionalmente soluble en una concentración de por lo menos 1 mg/ml a un pH de entre 6 y 8, o entre 6 y 9, o entre 7 y 9 (por ejemplo, pH 7) , y opcionalmente retiene por lo menos un 95% del péptido original después de 24 horas a 25°C. Aún otro ejemplo de péptido relacionado con glucagón de la clase 3 presenta aproximadamente un 10% o menos de la actividad de glucagón nativo en el receptor de glucagón y por lo menos aproximadamente un 20% de la actividad de GLP-1 nativo en el receptor de GLP-1, es opcionalmente soluble en una concentración de por lo menos 1 mg/ml a un pH de entre 6 y 8 o entre 6 y 9 o entre 7 y 9 (por ejemplo, pH 7) , y opcionalmente retiene por lo menos un 95% del péptido original después de 24 horas a 25 °C. Aún otro ejemplo de péptido relacionado con glucagón de la clase 3 presenta alrededor de un 10% o menos pero más del 0,1%; 0,5% o 1% de la actividad del glucagón nativo en el receptor de glucagón y por lo menos aproximadamente un 50%, 60%, 70%, 80%, 90% o 100% o más de la actividad de GLP-1 nativo en el receptor de GLP-1, es opcionalmente soluble en una concentración de por lo menos 1 mg/ml a un pH de entre 6 y 8 o entre 6 y 9 o entre 7 y 9 (por ejemplo, pH 7) y opcionalmente retiene por lo menos un 95% del péptido original después de 24 horas a 25°C. En algunas realizaciones, dichos péptidos relacionados con glucagón de la clase 3 retienen por lo menos 22, 23, 24, 25, 26, 27 o 28 de los aminoácidos naturales en las posiciones correspondientes en el glucagón nativo (por ejemplo, tienen 1-7, 1-5 o 1-3 modificaciones en relación con el glucagón natural) .

Modificaciones que afectan la actividad de glucagón La actividad aumentada en el receptor de glucagón se proporciona mediante una modificación de aminoácido en la posición 16 de glucagón nativo (SEQ ID NO 1) . En algunas realizaciones, el péptido relacionado con glucagón de la clase 3 es un agonista de glucagón que se ha modificado en relación con el péptido de tipo silvestre de His-Ser-Gln-Gly-Thr-Phe- Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Lys-Tyr-Leu-Asp-Ser- Arg-Arg-Ala-Gln-Asp-Phe-Val-Gln-Trp-Leu- Met-Asn-Thr (SEQ ID NO: 1) para mejorar la potencia del péptido en el receptor de glucagón. La serina natural en la posición 16 del glucagón nativo (SEQ ID NO 1) se puede sustituir con aminoácidos ácidos selectos para mejorar la potencia de glucagón, en términos de su capacidad de estimular la síntesis de Camp en un ensayo de modelo in Vitro validado (véase el Ejemplo 5) . Más específicamente, esta sustitución mejora la potencia del análogo por lo menos 2 veces, 4 veces, 5 veces, y hasta 10 veces más en el receptor de glucagón. Esta sustitución también mejora la actividad del análogo en el receptor de GLP-1 por lo menos 5 veces, 10 veces, o 15 veces en relación con el glucagón nativo, pero la selectividad se mantiene para el receptor de glucagón sobre el receptor de GLP-1.

A modo de ejemplo no taxativo, dicha potencia mejorada se puede proporcionar sustituyendo la serina natural en la posición 16 con ácido glutámico o con otro aminoácido con carga negativa que tiene una cadena lateral con una longitud de 4 átomos, o alternativamente con una cualquiera de glutamina, ácido homoglutámico, o ácido homocisteico, o un aminoácido con una carga que tiene una cadena lateral que contiene por lo menos un heteroátomo, (por ejemplo, N, O, S, P) y con una longitud de cadena lateral de aproximadamente 4 (o 3-5) átomos. De acuerdo con algunas realizaciones, el residuo de serina en la posición 16 de glucagón nativo se sustituye con una secuencia de aminoácido seleccionada del grupo formado por ácido glutámico, glutamina, ácido homoglutámico, ácido homocisteico, treonina, o glicina. De acuerdo con algunas realizaciones, el residuo de serina en la posición 16 de glucagón nativo se sustituye con un aminoácido seleccionado del grupo formado por ácido glutámico, glutamina, ácido homoglutámico y ácido homocisteico y en algunas realizaciones el residuo de serina se sustituye con ácido glutámico .

En algunas realizaciones, la potencia mejorada del péptido relacionado con glucagón de la clase 3 comprende un péptido de SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO : 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7 o un análogo de agonista de glucagón de SEQ ID NO: 5. De acuerdo con algunas realizaciones, se proporciona un péptido relacionado con glucagón de la clase 3 que tiene potencia mejorada en el receptor de glucagón en relación con el glucagón de tipo silvestre en donde el péptido comprende la secuencia de SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO : 8, SEQ ID NO : 9 o SEQ ID NO: 10, en donde el péptido de glucagón retiene su selectividad para el receptor de glucagón en relación con los receptores de GLP-1. En algunas realizaciones el péptido relacionado con glucagón de la clase 3 que tiene especificidad mejorada para el receptor de glucagón comprende el péptido de SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10 o un análogo de agonista de glucagón de él, en donde el aminoácido del extremo de carboxi retiene su grupo ácido carboxílico nativo. De acuerdo con algunas realizaciones, un péptido relacionado con glucagón de la clase 3 comprende la secuencia de NH2-His-Ser-Gln-Gly-Thr-Phe- Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Lys-Tyr-Leu-Asp-Glu-Arg-Arg-Ala-Gln-Asp-Phe-Val-Gln-Trp-Leu-Met-Asn-Thr-COOH (SEQ ID NO: 10), en donde el péptido presenta una potencia mejorada de aproximadamente cinco veces en el receptor de glucagón, en relación con el glucagón nativo medida por el ensayo de cAMP in vitro del Ejemplo 5.

La actividad del receptor de glucagón se puede reducir, mantener o mejorar mediante una modificación de aminoácido en la posición 3, por ejemplo, sustitución de la glutamina natural en la posición 3. En algunas realizaciones, la sustitución del aminoácido en la posición 3 con un aminoácido ácido, básico o hidrófobo (ácido glutámico, ornitina, norleucina) se ha mostrado que reduce sustancialmente o destruye la actividad de receptor de glucagón. Los análogos que se sustituyen por ejemplo con ácido glutámico, ornitina, o norleucina tienen aproximadamente un 10% o menos de la actividad de glucagón nativo en el receptor de glucagón, por ejemplo, aproximadamente 1-10%, o 0,1-10%, o más de alrededor del 0,1% pero menos de alrededor del 10%, mientras que presentan por lo menos un 20% de la actividad de GLP-1 en el receptor de GLP-1. Por ejemplo, ejemplos de análogos descritos en la presente tienen aproximadamente un 0,5%, un 1% o 7% de la actividad de glucagon nativo, mientras que presentan por lo menos un 20% de la actividad de GLP-1 en el receptor de GLP-1. En particular, cualquiera de los péptidos relacionados con glucagon de la clase 3, que incluyen análogos de glucagon, análogos de agonista de glucagon, coagonistas de glucagon, y moléculas de coagonistas de glucagón/GLP-1 , descritos en la presente, se pueden modificar para contener una modificación en la posición 3, por ejemplo Gln sustituido con Glu, para producir un péptido con alta selectividad, por ejemplo, selectividad de diez veces, para el receptor de GLP-1 comparada con la selectividad para el receptor de glucagon.

En otra realización, la glutamina natural en la posición 3 de cualquiera de los péptidos de glucagon de la clase 3 se puede sustituir con un análogo de glutamina sin una pérdida sustancial de actividad en el receptor de glucagon, y en algunos casos, con un aumento de actividad de receptor de glucagon, como se describe en la presente. En realizaciones específicas, el aminoácido en la posición 3 se sustituye con Dab(Ac) . Por ejemplo, los agonistas de glucagon pueden comprender la secuencia de aminoácido SEQ ID NO: 595, SEQ ID NO: 601 SEQ ID NO: 603, SEQ ID NO: 604, SEQ ID NO: 605, y SEQ ID NO: 606.

Se observó que las modificaciones en la posición 2 (por ejemplo AIB en la posición 2) y, en algunos casos, modificaciones en la posición 1, puede reducir la actividad de glucagón. Esta reducción en la actividad de glucagón se puede restaurar estabilizando la alfa-hélice en la parte del extremo de C de glucagón, por ejemplo, a través de medios descritos en la presente, por ejemplo, a través de un enlace covalente entre las cadenas laterales de aminoácidos en la posición "i" e wi+4", por ejemplo 12 y 16, 16 y 20, o 20 y 24. En algunas realizaciones, este enlace covalente es un puente de lactama entre ácido glutámico en la posición 16 y una lisina en la posición 20. En algunas realizaciones, este enlace covalente es un puente intramolecular diferente de un puente de lactama. Por ejemplo, los métodos de enlace covalente adecuados incluyen uno o más de cualquiera de la metátesis de olefina, ciclación basada en lantionina, puente de disulfuro o formación de puente que contiene azufre modificado, el uso de téteres de a, ?-diaminoalcano, la formación de puentes de átomo de metal, y otros medios de ciclación de péptido.

Modificaciones que afectan la actividad de GLP-1 La actividad mejorada en el receptor de GLP-1 se proporciona reemplazando el ácido carboxilico del aminoácido del extremo de C con un grupo de carga neutra, tal como una amida o éster. En algunas realizaciones, estos péptidos relacionados con glucagon de la clase 3 comprenden una secuencia de SEQ ID NO 20, en donde el aminoácido del extremo de carboxi tiene un grupo amida en lugar del grupo ácido carboxilico hallado en el aminoácido nativo. Estos péptidos relacionados con glucagon de la clase 3 tienen fuerte actividad en los receptores de glucagon y GLP-1 y por lo tanto actúan como coagonistas en ambos receptores. De acuerdo con algunas realizaciones, el péptido relacionado con glucagon de la clase 3 es un coagonista de receptor de glucagon y GLP-1, en donde el péptido comprende la secuencia de SEQ ID NO 20, en donde el aminoácido en la posición 28 es Asn o Lys y el aminoácido en la posición 29 es Thr-amida.

La actividad aumentada en el receptor de GLP-1 se proporciona mediante modificaciones que estabilizan la alfa hélice en la parte del extremo de C de glucagon (por ejemplo, alrededor de los residuos 12-29) .

En algunas realizaciones, dichas modificaciones permiten la formación de un puente intramolecular entre las cadenas laterales de dos aminoácidos que están separados por tres aminoácidos intervinientes (es decir, un aminoácido en la posición "i" y un aminoácido en la posición "i+4", en donde i en cualquier número entero entre 12 y 25) , por dos aminoácidos intervinientes, es decir un aminoácido en la posición "j" y un aminoácido en la posición "j+3" en donde j es cualquier número entero entre 12 y 27, o por seis aminoácidos intervinientes, es decir, un aminoácido en la posición xxk" y un aminoácido en la posición "k+7" , en donde k es cualquier número entero entre 12 y 22. En ejemplos de realizaciones, el puente o conector es aproximadamente de 8 (o de aproximadamente 7-9) átomos de longitud y se forma entre cadenas laterales de aminoácidos en las posiciones 12 y 16, o en las posiciones 16 y 20, o en las posiciones 20 y 24 o en las posiciones 24 y 28. Las dos cadenas laterales de aminoácido se pueden unir una a otra a través de enlaces no covalentes, por ejemplo, enlace de hidrógeno, interacciones iónicas, tales como la formación de puentes de sal, o mediante enlaces covalentes.

De acuerdo con algunas realizaciones, el péptido relacionado con glucagón de la clase 3 presenta actividad de coagonista de receptor de glucagón/GLP- 1 y comprende una secuencia de aminoácido seleccionada del grupo formado por SEQ ID NO 11, 47, 48 y 49. En algunas realizaciones, las cadenas laterales se unen en forma covalente una a otra y en algunas realizaciones, los dos aminoácidos se unen uno a otro para formar un anillo de lactama.

De acuerdo con algunas realizaciones, el péptido relacionado con glucagón de la clase 3 comprende SEQ ID NO 45, en donde por lo menos un anillo de lactama se forma entre las cadenas laterales de un par de aminoácidos seleccionado del grupo formado por los pares de aminoácido 12 y 16, 16 y 20, 20 y 24, o 24 y 28. En algunas realizaciones, el péptido relacionado con glucagón de la clase 3 comprende un análogo de péptido de glucagón de SEQ ID NO 20, en donde el péptido comprende un puente de lactama intramolecular formado entre las posiciones de aminoácido 12 y 16 o entre las posiciones de aminoácido 16 y 20. En algunas realizaciones, el péptido relacionado con glucagón de la clase 3 comprende la secuencia de SEQ ID NO 20, en donde un puente de lactama intramolecular se forma entre las posiciones de aminoácido 12 y 16, entre las posiciones de aminoácido 16 y 20 o entre las posiciones de aminoácido 20 y 24 y el aminoácido en la posición 29 es glicina, en donde la secuencia de SEQ ID NO 29 está unida al aminoácido del extremo de C de SEQ ID NO 20. En otra realización, el aminoácido en la posición 20 es ácido aspártico .

En algunas realizaciones específicas, la estabilización de la estructura de alfa hélice en la parte del extremo de C del péptido relacionado con glucagón de la clase 3 se realiza a través de la formación de un puente intramolecular diferente de un puente de lactama. Por ejemplo, los métodos de enlace covalente adecuados incluyen una o más cualquiera de metátesis de olefina, ciclación basada en lantionina, puente de disulfuro o formación de puente que contiene azufre modificado, el uso de téteres de , ?-diaminoalcano, la formación de puentes de átomo de metal, y otros medios de ciclación de péptido se usan para estabilizar la alfa hélice.

Además, la actividad mejorada en el receptor de GLP-1 puede realizarse estabilizando la estructura de alfa-hélice en la parte del extremo de C del péptido de glucagón (alrededor de los aminoácidos 12-29) a través la introducción con un propósito de uno o más aminoácidos alfa, alfa-disustituido en las posiciones que retienen la actividad deseada. Dichos péptidos se pueden considerar en la presente como un péptido que carece de un puente intramolecular. En algunos aspectos, la estabilización de la alfa-hélice se realiza de esta manera sin introducción de un puente intramolecular tal como un puente de sal o un enlace covalente. En algunas realizaciones, una, dos, tres, cuatro o más de las posiciones 16, 17, 18, 19, 20, 21, 24 o 29 de un péptido de glucagón se sustituye con un aminoácido alfa, alfa-disustituido. Por ejemplo, la sustitución de la posición 16 del péptido relacionado con glucagón de la Clase 3 con ácido amino iso-butírico (AIB) mejora la actividad de GLP-1, en la ausencia de un puente de de sal o lactama. En algunas realizaciones, una, dos, tres o más de las posiciones 16, 20, 21 o 24 se sustituyen con AIB.

La actividad mejorada en el receptor de GLP-1 se puede lograr mediante una modificación de aminoácido en la posición 20. En algunas realizaciones, la glutamina en la posición 20 se reemplaza con otro aminoácido hidrófilo que tiene una cadena lateral que tiene una carga o tiene capacidad para el enlace de hidrógeno, o tiene por lo menos alrededor de 5 (o alrededor de 4-6) átomos de longitud, por ejemplo, lisina, citrulina, arginina u ornitina .

La actividad aumentada en el receptor de GLP-1 se demuestra en los péptidos relacionados con glucagón de la clase 3 que comprenden la extensión del extremo de C de SEQ ID NO 26. La actividad de GLP-1 en dichos péptidos relacionados con glucagón de la clase 3 que comprenden SEQ ID NO 26 se puede aumentar adicionaímente modificando el aminoácido en la posición 18, 28 o 29, o en la posición 18 y 29 como se describe en la presente.

Otro aumento modesto en la potencia de GLP-1 se puede realizar modificando el aminoácido en la posición 10 para que sea Trp.

Las combinaciones de las modificaciones que aumentan la actividad de receptor de GLP-1 pueden proporcionar actividad de GLP-1 más alta que cualquiera de dichas modificaciones tomadas en forma aislada. Por ejemplo, los péptidos relacionados con glucagón de la clase 3 pueden comprender modificaciones en la posición 16, en la posición 20 y en el grupo ácido carboxílico del extremo de C, opcionalmente con un enlace covalente entre los aminoácidos en las posiciones 16 y 20, pueden comprender modificaciones en la posición 16 y en el grupo ácido carboxílico del extremo de C pueden comprender modificaciones en las posiciones 16 y 20, opcionalmente con un enlace covalente entre los aminoácidos en las posiciones 16 y 20, o pueden comprender modificaciones én la posición 20 y en el grupo ácido carboxílico del extremo de C, opcionalmente con la condición de que el aminoácido en la posición 12 no sea Arg, u opcionalmente con la condición de que el aminoácido en la posición 9 no sea Glu.

Modificaciones que afectan la solubilidad Agregado de grupos hidrófilos Los péptidos relacionados con glucagon de la clase 3 pueden modificarse además para mejorar la solubilidad y estabilidad del péptido en soluciones acuosas a pH fisiológico, mientras que mantiene la actividad biológica alta en relación con un glucagon nativo. Se pueden unir grupos hidrófilos como se discute en la presente al péptido relacionado con glucagon de la clase 3 como se discute en la presente.

De acuerdo con algunas realizaciones, la introducción de grupos hidrófilos en la posiciones 17, 21 y 24 del péptido relacionado con glucagon de la clase 3 que comprende SEQ ID NO 9 o SEQ ID NO 10 se anticipan para mejorar la solubilidad y estabilidad del análogo de glucagon de alta potencia en soluciones que tienen un pH fisiológico. La introducción de dichos grupos también aumenta la duración de acción, por ejemplo medido por una semivida prolongada en circulación.

En algunas realizaciones, el péptido relacionado con glucagon de la clase 3 comprende una secuencia seleccionada del grupo formado por SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18 y SEQ ID NO: 19, en donde la cadena lateral de un residuo de aminoácido en una de las posiciones 16, 17, 21 o 24 de dicho péptido relacionado con glucagón de la Clase 3 además comprende una cadena de polietilenglicol , que tiene un peso molecular seleccionado de la gama de 500 a 40.000 Dalton. En algunas realizaciones, la cadena de polietilenglicol tiene un peso molecular seleccionado de la gama de 500 a 5.000 Dalton. En otra realización, la cadena de polietilenglicol tiene un peso molecular de 10.000 a 20.000 Dalton. En aún otros ejemplos de realizaciones, la cadena de polietilenglicol tiene un peso molecular de 20.000 a 40.000 Dalton.

Los grupos hidrófilos adecuados incluyen cualquier polímero soluble en agua conocido en el arte, que incluye los grupos hidrófilos descritos en la presente, homopolímeros o copolímeros de PEG, y un polímero sustituido con monometilo de PEG (mPEG) . De acuerdo con algunas realizaciones el grupo hidrófilo comprende una cadena de polietileno (PEG) . Más específicamente, en algunas realizaciones, el péptido relacionado con glucagón de la clase 3 comprende la secuencia de SEQ ID NO 6 o SEQ ID NO 7 en donde una cadena de PEG está unida en forma covalente a las cadenas laterales de aminoácidos presentes en las posiciones 21 y 24 del péptido relacionado con glucagón de la clase 3 y el aminoácido del extremo de carboxi del peptido relacionado con glucagón de la clase 3 tiene el grupo ácido carboxílico. De acuerdo con algunas realizaciones la cadena de polietilenglicol tiene un peso molecular promedio seleccionado de la gama de 500 a 10.000 ^ Dalton.

De acuerdo con algunas realizaciones, el peptido relacionado con glucagón de la clase 3 pegilado comprende dos o más cadenas de polietilenglicol unidas en forma covalente al péptido relacionado con glucagón de la clase 3 en donde el peso molecular total de L0 las cadenas de glucagón es de aproximadamente 1.000 a 5.000 Dalton. En algunas realizaciones, el agonista de glucagón pegilado comprende un péptido que comprende SEQ ID NO 5 o un análogo de agonista de glucagón de SEQ ID NO 5, en donde una cadena de PEG está unida en forma covalente al residuo de aminoácido en la posición 21 y en la posición 24, y en donde el peso molecular combinado de las dos cadenas de PEG es de alrededor de 1.000 a 5.000 Dalton.

Extremo de C con Carga 20 La solubilidad del péptido relacionado con glucagón de la clase 3 que comprende SEQ ID NO 20 se puede mejorar, por ejemplo, introduciendo uno, dos, tres o más aminoácidos con carga en la parte del extremo de C del péptido de glucagón de SEQ ID NO 20, preferentemente en una posición del extremo de C a la posición 27. Dicho aminoácido con carga se puede introducir sustituyendo un aminoácido nativo con un aminoácido con carga, por ejemplo, en las posiciones 28 o 29, o alternativamente agregando un aminoácido con carga, por ejemplo después de la posición 27, 28 o 29. En ejemplos de realizaciones, uno, dos, tres o la totalidad de los aminoácidos con carga tienen una carga negativa. Se pueden hacer modificaciones adicionales, por ejemplo, sustituciones conservadoras, al péptido relacionado con glucagón de la clase 3 que aún le permite retener la actividad de glucagón. En algunas realizaciones, se proporciona un análogo del péptido relacionado con glucagón de la clase 3 de SEQ ID NO 20 en donde el análogo, difiere de SEQ ID NO 20 en 1 a 2 sustituciones de aminoácido en las posiciones 17—20, en algunas realizaciones, el análogo difiere del péptido de SEQ ID NO 20 en una sustitución de aminoácido en la posición 20.

Aciclación/Alquilación De acuerdo con algunas realizaciones, el péptido de glucagón se modifica para comprender un grupo acilo o alquilo, por ejemplo un grupo acilo o alquilo de C4 a C30. En algunos aspectos, el grupo acilo o el grupo alquilo no es natural sobre un aminoácido. En aspectos específicos, el grupo acilo o alquilo es no nativo a cualquier aminoácido natural. La acilación o alquilación puede aumentar la semivida en circulación y/o retardar el inicio y/o prolongar la duración de acción y/o mejorar la resistencia a proteasas tales como DPP-IV. La actividad en el receptor de glucagón y el receptor de GLP-1 de los péptidos relacionados con glucagón de la clase 3 se mantiene, si no se mejora sustancialmente después de la acilación. Además, la potencia de los análogos acilados fue comparable con las versiones no aciladas de los péptidos relacionados con glucagón de la clase 3, si no mejoró sustancialmente.

En algunas realizaciones, la invención proporciona un péptido relacionado con glucagón de la clase 3 modificado para comprender un grupo acilo o grupo alquilo unido en forma covalente al aminoácido en la posición 10 del péptido de glucagón. El péptido de glucagón puede comprender además un separador entre el aminoácido en la posición 10 del péptido relacionado con glucagón de la clase 3 y el grupo acilo o grupo alquilo. Cualquiera de los péptidos relacionados con glucagón de la clase 3 puede comprender dos grupos acilo o dos grupos alquilo, o una combinación de ellos .

En un aspecto específico de la invención, el péptido relacionado con glucagón de la clase 3 acilado comprende la secuencia de aminoácido de cualquiera de SEQ ID NOs : 534-544 y 546-549.

Truncado del extremo de C En algunas realizaciones, los péptidos relacionados con glucagón de la clase 3 descritos en la presente se modifican adicionalmente truncando o eliminando uno o más aminoácidos del extremo de C del péptido de glucagón (es decir, la posición 29 y/o 28) sin afectar la actividad y/o la potencia en los receptores de glucagón y/o GLP-1. Al respecto, el péptido relacionado con glucagón de la clase 3 puede comprender los aminoácidos 1-27 o 1-28 del péptido de glucagón nativo (SEQ ID NO 1) , opcionalmente con una o más modificaciones descritas en la presente .

En algunas realizaciones, el péptido relacionado con glucagón de la clase 3 truncado comprende SEQ ID NO 550 o SEQ ID NO 551. En otra realización, el péptido de agonista de glucagón truncado comprende SEQ ID NO 552 o SEQ ID NO 553.

Prolongación del extremo de C De acuerdo con algunas realizaciones, los péptidos relacionados con glucagón de la clase 3 revelados en la presente se modifican agregando un segundo péptido al extremo de carboxi del péptido de glucagón, por ejemplo, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27 o SEQ ID NO: 28. En algunas realizaciones, un péptido relacionado con glucagón de la clase 3 que tiene una secuencia seleccionada del grupo formado por SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 66, SEQ ID NO: 67, SEQ ID NO : 68, y SEQ ID NO: 69 se une en forma covalente a través de un enlace de péptido a un segundo péptido, en donde el segundo péptido comprende una secuencia seleccionada del grupo formado por SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27 y SEQ ID NO: 28. En otra realización, en los péptidos relacionados con glucagón de la clase 3 que comprenden la prolongación del extremo de C, la treonina en la posición 29 del péptido de glucagón nativo se reemplaza con una glicina. Un péptido relacionado con glucagón de la clase 3 que tiene una sustitución de glicina por treonina en la posición 29 y que comprende la prolongación del extremo de carboxi de SEQ ID NO 26 es cuatro veces la potencia en el receptor de GLP-1 como glucagón nativo modificado para comprender la prolongación del extremo de carboxi de SEQ ID NO 26. La potencia en el receptor de GLP-1 se puede mejorar adicionalmente con una sustitución de alanina por arginina nativa en la posición 18.

Por consiguiente, el péptido relacionado con glucagón de la clase 3 puede tener una prolongación del extremo de carboxi de SEQ ID NO: 27 (KRNRN IA) o SEQ ID NO: 28. De acuerdo con alguna realizaciones, el péptido relacionado con glucagón de la clase 3 que comprende SEQ ID NO 33 o SEQ ID NO 20, además comprende la secuencia de aminoácido de SEQ ID NO: 27 (KRNRNNIA) o SEQ ID NO: 28, unida al aminoácido 29 del péptido de glucagón. Más específicamente, el péptido relacionado con glucagón de la clase 3 comprende una secuencia seleccionada del grupo formado por SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13 SEQ ID NO: 14 y SEQ ID NO: 15, que además comprende la secuencia de aminoácido SEQ ID NO: 27 (KRNRNNIA) o SEQ ID NO: 28 unida al aminoácido 29 del péptido de glucagón. Más específicamente, el péptido de glucagón comprende una secuencia seleccionada del grupo formado por SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13 SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 66, SEQ ID NO: 67, SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 69, SEQ ID NO: 55 y SEQ ID NO: 56 que además comprende la secuencia de aminácido de SEQ ID NO: 26 (GPSSGAPPPS) o SEQ ID NO: 29 unida al aminoácido 29 del péptido relacionado con glucagón de la clase 3. En algunas realizaciones, el péptido relacionado con glucagón de la clase 3 comprende la secuencia de SEQ ID NO: 64.

Otras Modificaciones Cualquiera de las modificaciones descritas anteriormente con respecto a los péptidos relacionados con glucagón de la clase 3 que aumenta o disminuye la actividad del receptor de glucagón y que aumenta la actividad de receptor de GLP-1 se puede aplicar individualmente o en combinación. Las combinaciones de las modificaciones que aumentan la actividad de receptor de GLP-1 generalmente proporcionan una actividad de GLP-1 más alta que cualquiera de dichas modificaciones tomadas por separado. Cualquiera de las modificaciones descritas anteriormente puede combinarse también con otras modificaciones descritas en la presente con referencia a los péptidos relacionados con glucagón de la clase 3 que confieren otras propiedades deseables, tales como solubilidad y/o estabilidad y/o duración de acción aumentada. Alternativamente, cualquiera de las modificaciones descritas anteriormente se puede combinar con otras modificaciones descritas en la presente con referencia a péptidos relacionados con glucagón de la clase 3 que no afectan sustancialmente la solubilidad o estabilidad o actividad. Ejemplos de modificaciones incluyen en forma no taxativa: (A) Mejorar la solubilidad, por ejemplo, introduciendo uno, dos, tres o más aminácidos con carga en la parte del extremo de C de glucagón nativo, preferentemente en una posición del extremo de C a la posición 27. Dicho aminoácido con carga se puede introducir sustituyendo un aminoácido nativo con un aminácido con carga, por ejemplo, en las posiciones 28 o 29, o alternativamente agregando un aminoácido con carga, por ejemplo, después de la posición 27, 28 o 29. En ejemplos de realizaciones, uno, dos, tres o la totalidad de los aminoácidos con carga tienen carga negativa. En otras realizaciones, uno, dos, tres o la totalidad de los aminoácidos con carga tienen una carga positiva. Dichas modificaciones aumentan la solubilidad, por ejemplo, proporcionan por lo menos 2 veces, 5 veces, 10 veces, 15 veces, 25 veces, 30 veces o más solubilidad en relación con el glucagón nativo a un pH dado entre aproximadamente 5,5 y 8, por ejemplo pH 7, cuando se mide después de 24 horas a 25 °C.

Aumentar la solubilidad y duración de acción o semivida en circulación agregando un grupo hidrófilo tal como una cadena de polietilenglicol , descrito en la presente, por ejemplo en la posición 16, 17, 20, 21, 24 o 29, o en el aminoácido del extremo de C del péptido.

Aumentar la estabilidad mediante la modificación del ácido aspártico en la posición 15, por ejemplo, mediante eliminación o sustitución con ácido glutámico, ácido homoglutámico, ácido cisteico, o ácido homocisteico .

Dichas modificaciones pueden reducir la degradación o descomposición a un pH dentro de la gama de 5,5 a 8, especialmente en tampones ácidos o alcalinos, por ejemplo, reteniendo por lo menos 75%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% del péptido original después de 24 horas a 25°C Aumentar la estabilidad mediante la modificación de la metionina en la posición 27, por ejemplo, mediante la sustitución con leucina o norleucina. Dichas modificaciones pueden reducir la degradación oxidativa. La estabilidad también se puede aumentar mediante modificaciones de la Gln en la posición 20 o 24, por ejemplo mediante la sustitución con Ser, Thr, Ala o AIB. Dichas modificaciones pueden reducir la degradación que ocurre a través de la desaminación de Gln. La estabilidad se puede aumentar mediante la modificación de Asp en la posición 21, por ejemplo mediante la sustitución con Glu. Dichas modificaciones pueden reducir la degradación que ocurre a través de la deshidratación de Asp para formar un compuesto intermedio succinimida cíclica seguida por la isomerizacion a iso-aspartato.

Aumentar la resistencia a la descomposición por dipeptidil peptidasa IV (DPP-IV) mediante la modificación del aminoácido en la posición 1 o 2 con aminoácidos resistentes a DPP-IV descrita en la presente y que incluye la modificación del aminoácido en la posición 2 con N-metil -alanina .

(F) Sustituciones conservadoras y no conservadoras, agregados o eliminaciones que no afectan la actividad, por ejemplo, sustituciones conservadoras en una o más de las posiciones 2, 5, 7, 10, 11, 12, 13, 14, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 24, 27, 28 o 29; eliminaciones en una o más de las posiciones 27, 28 o 29 o una eliminación del aminoácido 29 opcionalmente combinada con una amida o éster del extremo de C en lugar del grupo ácido carboxílico del extremo de C.

(G) Agregar prolongaciones del extremo de C como se describe en la presente (H) Aumentar la semivida en circulación y/o prolongar la duración de acción y/o retardar el inicio de acción, por ejemplo, a través de la acilación o alquilación del péptido de glucagón, como se describe en la presente.

(I) Homodimerización o heterodimerización descrita en la presente .

Otras modificaciones incluyen la sustitución de His en la posición 1 con un aminoácido grande, aromático (por ejemplo, Tyr, Phe, Trp o amino-Phe) ; Ser en la posición 2 con Ala,- sustitución de Tyr en la posición 10 con Val o Phe; sustitución de Lys en la posición 12 con Arg; sustitución de Asp en la posición 15 con Glu; sustitución de Ser en la posición 16 con Thr o AIB.

Los péptidos relacionados con glucagón de la clase 3 con actividad de GLP-1 que contienen una sustitución no conservadora de His en la posición 1 con un aminoácido grande, aromático (por ejemplo, Tyr) puede retener la actividad de GLP-1 siempre que la alfa-hélice se estabilice a través de un puente intramolecular, por ejemplo, tal como cualquiera de aquellos descritos en la presente .

Conjugación y fusiones El péptido relacionado con glucagón de la clase 3 se puede unir, opcionalmente a través de enlace covalente y opcionalmente a través de un conector a un grupo conjugado.

El péptido relacionado con glucagón de la clase 3 puede también formar parte de un péptido o proteína de fusión en donde un segundo péptido o polipéptido se ha fusionado a un extremo, por ejemplo, el extremo de carboxi del péptido relacionado con glucagón de la clase 3.

Más específicamente, el péptido relacionado con glucagón de la clase 3 puede comprender un agonista de glucagón de SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 9 o SEQ ID NO: 10 además de comprender una secuencia de aminoácido de SEQ ID NO: 26 (GPSSGAPPPS) , SEQ ID NO: 27 (KRNRNNIA) o SEQ ID NO : 28 (KRNR) unido al aminoácido 29 del péptido de glucagón. En algunas realizaciones, la secuencia de aminoácido de SEQ ID NO: 26 (GPSSGAPPPS), SEQ ID NO: 27 (KRNRNNIA) o SEQ ID NO: 28 (KRNR) está unida al aminoácido 29 del péptido relacionado con glucagón de la clase 3 a través de un enlace de péptido. Los solicitantes han descubierto que, en el péptido relacionado con glucagón de la clase 3, péptidos de fusión que comprenden el péptido de prolongación del extremo de C de Exendina 4 (por ejemplo, SEQ ID NO: 26 o SEQ ID NO: 29) , sustitución del residuo de treonina nativa en la posición 29 con glicina aumenta dramáticamente la actividad del receptor de GLP-1. Esta sustitución de aminoácido se puede usar en conjunto con otras modificaciones reveladas en la presente con respecto a los péptidos relacionados con glucagón de la clase 3 para aumentar la afinidad de los análogos de glucagón para el receptor de GLP-1. Por ejemplo, la sustitución T29G se puede combinar con las sustituciones de aminoácido S16E y N20K, opcionalmente con un puente de lactama entre los aminoácidos 16 y 20, y opcionalmente con el agregado de una cadena de PEG como se describe en la presente. En algunas realizaciones, un péptido relacionado con glucagón de la clase 3 comprende la secuencia de SEQ ID NO: 64. En algunas realizaciones, la parte del péptido relacionado con glucagón de la clase 3 del péptido de fusión de glucagón se selecciona del grupo formado por SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, y SEQ ID NO: 5 en donde una cadena de PEG, cuando está presente en las posiciones 17, 21, 24, o el aminoácido de extremo de C, o tanto en 21 como en 24, se selecciona de la gama de 500 a 40.000 Dalton. Más específicamente, en algunas realizaciones, el segmento de péptido relacionado con glucagón de la clase 3 se selecciona del grupo formado por SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, y SEQ ID NO: 63, en donde la cadena de PEG se selecciona de la gama de 500 a 5.000. En algunas realizaciones, el péptido relacionado con glucagón de la clase 3 es un péptido de fusión que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 55 y SEQ ID NO: 65 en donde el péptido de SEQ ID NO: 65 está unido al extremo de carboxi de SEQ ID NO: 55.

De acuerdo con algunas realizaciones, otra modificación química del péptido relacionado con glucagón de la clase 3 de SEQ ID NO 10 confiere potencia de receptor de GLP-1 aumentada a un punto en el cual la actividad relativa en los receptores de glucagón y GLP-1 es virtualmente equivalente. Por consiguiente, en algunas realizaciones, un péptido relacionado con glucagón de la clase 3 comprende un aminoácido de extremo que comprende un grupo amida en lugar del grupo ácido carboxílico que está presente sobre el aminoácido nativo. La actividad relativa del péptido relacionado con glucagón de la clase 3 en los receptores de glucagón y GLP-1 respectivos se puede ajustar mediante otras modificaciones al péptido relacionado con glucagón de la clase 3 para producir análogos que demuestran aproximadamente un 40% a 500% o más de la actividad de glucagón nativo en el receptor de glucagón y aproximadamente un 20% a 200% o más de la actividad de GLP-1 nativo en el receptor de GLP-1, por ejemplo 50 veces, 100 veces o más aumento en relación con la actividad normal de glucagón en el receptor de GLP-1. En algunas realizaciones, los péptidos de glucagón revelados en la presente presentan hasta alrededor de 100%, 1.000%, 10.000%, 100.000% o 1.000.000% de la actividad de glucagón nativo en el receptor de glucagón. En algunas realizaciones, los péptidos de glucagón descritos en la presente presentan hasta aproximadamente 100%, 1.000%, 10.000%, 100.000% o 1.000.000% de la actividad de GLP-1 nativo en el receptor de GLP-í .

Ejemplos de realizaciones De acuerdo con algunas realizaciones, se proporciona un análogo de glucagón que comprende la secuencia de SEQ ID NO 55, en donde dicho análogo difiere de SEQ ID NO 55 en 1 a 3 aminoácidos, seleccionados de las posiciones 1, 2, 3, 5, 7, 10, 11, 13, 14, 17, 18, 19, 21, 24, 27, 28, y 29, en donde dicho péptido de glucagón presenta por lo menos 20% de la actividad de GLP-1 nativo en el receptor de GLP-1.

De acuerdo con algunas realizaciones, se proporciona un coagonista de receptor de glucagón/GLP-1 que comprende la secuencia : NH2-His-Ser-Gln-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Lys-Tyr-Leu-Xaa-Xaa-Arg-Arg-Ala-Xaa-Asp-Phe-Val-Xaa-Trp-Leu-Met-Xaa-Xaa-R (SEQ ID NO: 33) en donde Xaa en la posición 15 se selecciona del grupo formado por Asp, Glu, ácido cisteico, ácido homoglutámico y ácido homocisteico, Xaa en la posición 16 se selecciona del grupo formado por Ser, Glu, Gln, ácido homoglutámico y ácido homocisteico, Xaa en la posición 20 es Gln o Lys, Xaa en la posición 24 es Gln o Glu, Xaa en la posición 28 es Asn, Lys o un aminoácido ácido, Xaa en la posición 29 es Thr, Gly o un aminoácido ácido, y R es COOH o CONH2, con la condición de que cuando la posición 16 es serina, la posición 20 es Lys, o alternativamente cuando la posición 16 es serina la posición 24 es Glu y la posición 20 o la posición 28 es Lys. En algunas realizaciones, el coagonista de receptor de glucagón/GLP-1 comprende la secuencia de SEQ ID NO: 33 en donde el aminoácido en la posición 28 es ácido aspártico y el aminoácido en la posición 29 es ácido glutámico. En otra realización, el aminoácido en la posición 28 es la asparagina nativa, el aminoácido en la posición 29 es glicina y la secuencia de aminoácido de SEQ ID NO: 29 o SEQ ID NO: 65 está unida en forma covalente al extremo de carboxi de SEQ ID NO: 33.

En algunas realizaciones se proporciona un coagonista que comprende la secuencia de SEQ ID NO 33 en donde se agrega un aminoácido ácido adicional al extremo de carboxi del péptido. En otra realización, el aminoácido del extremo de carboxi del análogo de glucagón tiene una amida en lugar del grupo ácido carboxilico del aminoácido natural. En algunas realizaciones, el análogo de glucagón comprende una secuencia seleccionada del grupo formado por SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 43 y SEQ ID NO: 44.

De acuerdo con algunas realizaciones se proporciona un análogo de péptido de glucagón de SEQ ID NO: 33, en donde dicho análogo difiere de SEQ ID NO: 33 en 1 a 3 aminoácidos, seleccionados de las posiciones 1, 2, 3, 5, 7, 10, 11, 13, 14, 17, 18, 19, 21 y 27, con la condición de que cuando el aminoácido en la posición 16 es serina, la posición 20 es lisina, o se forma un puente de lactama entre un aminoácido en la posición 24 y el aminoácido en la posición 20 o la posición 28. De acuerdo con algunas realizaciones el análogo difiere de SEQ ID NO: 33 en 1 a 3 aminoácidos seleccionados de las posiciones 1, 2, 3, 21 y 27. En algunas realizaciones el análogo de péptido de glucagón de SEQ ID NO: 33 difiere de esa secuencia en 1 a 2 aminoácidos, o en algunas realizaciones en un solo aminoácido, seleccionado de las posiciones 1, 2, 3, 5, 7, 10, 11, 13, 14, 17, 18, 19, 21 y 27, con la condición de que cuando el aminoácido en la posición 16 es serina, la posición 20 es lisina, o se forma un puente de lactama entre el aminoácido en la posición 24 y el aminoácido en la posición 20 o la posición 28.

De acuerdo con otra realización se proporciona un agonista de receptor de GLP-1 relativamente selectivo que comprende la secuencia NH2 -His-Ser-Xaa-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Lys-Tyr-Leu-Xaa-Xaa-Arg-Arg-Ala-Xaa-Asp-Phe-Val-Xaa-Trp-Leu-Met-Xaa-Xaa-R (SEQ ID NO: 53) en donde Xaa en la posición 3 se selecciona del grupo de aminoácidos formado por Glu, Orn o Nle, el Xaa en la posición 15 se selecciona del grupo de aminoácidos formado por Asp, Glu, ácido cisteico, ácido homoglutámico y ácido homocisteico, Xaa en la posición 16 se selecciona del grupo de aminoácidos formado por Ser, Glu, Gln, ácido homoglutámico y ácido homocisteico, el Xaa en la posición 20 es Gln o Lys, el Xaa en la posición 24 es Gln o Glu, el Xaa en la posición 28 es Asn, Lys o un aminoácido ácido, el Xaa en la posición 29 es Thr, Gly o un aminoácido ácido, y R es COOH, CONH2, SEQ ID NO: 26 o SEQ ID NO: 29, con la condición de que cuando la posición 16 es serina, la posición 20 es Lys, o alternativamente cuando la posición 16 es serina la posición 24 es Glu y la posición 20 o la posición 28 es Lys. En algunas realizaciones el aminoácido en la posición 3 es ácido glutámico. En algunas realizaciones el aminoácido ácido sustituido en la posición 28 y/o 29 es ácido aspártico o ácido glutámico. En algunas realizaciones el péptido de glucagón, que incluye un péptido coagonista, comprende la secuencia de SEQ ID NO: 33 que además comprende un aminoácido ácido adicional agregado al extremo de carboxi del péptido. En otra realización el aminoácido del extremo de carboxi del análogo de glucagón tiene una amida en lugar del grupo ácido carboxílico del aminoácido natural .

De acuerdo con algunas realizaciones se proporciona un coagonista de receptor de glucagón/GLP-1 que comprende un péptido de glucagón modificado seleccionado del grupo formado por: NH2-His-Ser-Gln-Gly-Thr-Phe- Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Lys-Tyr-Leu-Xaa-Xaa-Arg-Arg-Ala-Xaa-Asp-Phe-Val-Xaa-Trp-Leu-Met-Xaa-Xaa-R (SEQ ID NO: 34) , en donde Xaa en la posición 15 se selecciona del grupo de aminoácidos formado por Asp, Glu, ácido cisteico, ácido homoglutámico y ácido homocisteico, Xaa en la posición 16 se selecciona del grupo de aminoácidos formado por Ser, Glu, Gln, ácido homoglutámico y ácido homocisteico, Xaa en la posición 20 es Gln o Lys, Xaa en la posición 24 es Gln o Glu y Xaa en la posición 28 es Asn, Asp o Lys, R es COOH o C0NH2, Xaa en la posición 29 es Thr o Gly, y R es COOH, CONH2, SEQ ID NO: 26 o SEQ ID NO: 29, con la condición de que cuando la posición 16 es serina, la posición 20 es Lys, o alternativamente cuando la posición 16 es serina la posición 24 es Glu y la posición 20 o la posición 28 es Lys. En algunas realizaciones R es CONH2/ Xaa en la posición 15 es Asp, Xaa en la posición 16 se selecciona del grupo de aminoácidos formado por Glu, Gln, ácido homoglutámico o ácido homocisteico, Xaas en las posiciones 20 y 24 son cada uno Gln, Xaa en la posición 28 es Asn o Asp y Xaa en la posición 29 es Thr. En algunas realizaciones Xaas en las posiciones 15 y 16 son cada uno Glu, Xaas en las posiciones 20 y 24 son cada uno Gln, Xaa en la posición 28 es Asn o Asp, Xaa en la posición 29 es Thr y R es CONH2.

Se ha informado que ciertas posiciones del péptido de glucagón nativo se pueden modificar mientras retienen por lo menos algo de la actividad del péptido parental . Por consiguiente, los solicitantes anticipan que uno o más de los aminoácidos ubicados en las posiciones 2, 5, 7, 10, 11, 12, 13, 14, 17, 18, 19, 20, 21, 24, 27, 28 o 29 del péptido de SEQ ID NO: 11 se pueden sustituir con un aminoácido diferente de aquel presente en el péptido de glucagón nativo y aún retienen la actividad en el receptor de glucagón. En algunas realizaciones, el residuo de metionina presente en la posición 27 del péptido nativo se cambia a leucina o norleucina para prevenir la degradación oxidativa del péptido. En otras realizaciones, el aminoácido en la posición 20 se sustituye con Lys, Arg, Orn o Citrulina y/o la posición 21 se sustituye con Glu, ácido homoglutámico o ácido homocisteico .

En algunas realizaciones, se proporciona un análogo de glucagón de SEQ ID NO: 20 en donde 1 a 6 aminoácidos, seleccionados de las posiciones 1, 2, 5, 7, 10, 11, 13, 14, 17, 18, 19, 21, 27, 28 o 29 del análogo difieren del aminoácido correspondiente de SEQ ID NO 1, con la condición de que cuando el aminoácido en la posición 16 es serina, la posición 20 es Lys, o alternativamente, cuando la posición 16 es serina la posición 24 es Glu y la posición 20 o la posición 28 es Lys. De acuerdo con otra realización, se proporciona un análogo de glucagón de SEQ ID NO 20 en donde de 1 a 3 aminoácidos seleccionados de las posiciones 1, 2, 5, , 10, 11, 13, 14, 17, 18, 19, 20, 21, 27, 28 o 29 del análogo difieren del aminoácido correspondiente de SEQ ID NO 1. En otra realización se proporciona un análogo de glucagón de SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9 o SEQ ID NO: 11 en donde 1 a 2 aminoácidos seleccionados de las posiciones 1, 2, 5, 7, 10, 11, 13, 14, 17, 18, 19, 20 o 21 del análogo difieren del aminoácido correspondiente de SEQ ID NO 1 y en otra realización uno o dos aminoácidos diferentes representan sustituciones de aminoácido conservadoras en relación con el aminoácido presente en la secuencia de glucagón nativo (SEQ ID NO 1) . En algunas realizaciones se proporciona un péptido de glucagón de SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14 o SEQ ID NO: 15 en donde el péptido de glucagón además comprende una, dos o tres sustituciones de aminoácidos en las posiciones seleccionadas de las posiciones 2, 5, 7, 10, 11, 13, 14, 17, 18, 19, 20, 21, 27 o 29. En algunas realizaciones, las sustituciones en las posiciones 2, 5, 7, 10, 11, 13, 14, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 27 o 29 son sustituciones de aminoácidos conservadoras.

De acuerdo con algunas realizaciones, se proporciona un coagonista de receptor de glucagón/GLP-1 que comprende una variante de la secuencia de SEQ ID NO 33, en donde 1 a 10 aminoácidos seleccionados de las posiciones 16, 17, 18, 20, 21, 23, 24, 27, 28 y 29, respectivamente, de la variante difieren del aminoácido correspondiente de SEQ ID NO: 1. De acuerdo con algunas realizaciones, se proporciona una variante de la secuencia de SEQ ID NO 33 en donde la variante difiere de SEQ ID NO: 33 en una o más sustituciones de aminoácidos seleccionadas del grupo formado por Glnl7, Alal8, Glu21, Ile23, Ala24, Val27 y Gly29. De acuerdo con algunas realizaciones, se proporciona un coagonista de receptor de glucagón/GLP-1 que comprende variantes de la secuencia de SEQ ID NO 33, en donde 1 a 2 aminoácidos seleccionados de las posiciones 17-26 de la variante difieren del aminoácido correspondiente de SEQ ID NO: 1. De acuerdo con algunas realizaciones, se proporciona una variante de la secuencia de SEQ ID NO 33 en donde la variante difiere de SEQ ID NO: 33 en una sustitución de aminoácido seleccionada del grupo formado por Glnl7, Alal8, Glu21, Ile23 y Ala24. De acuerdo con algunas realizaciones se proporciona una variante de la secuencia SEQ ID NO 33, en donde la variante difiere de SEQ ID NO: 33 en una sustitución de aminoácido en la posición 18 en donde el aminoácido sustituido se selecciona del grupo formado por Ala, Ser, Thr, y Gly. De acuerdo con algunas realizaciones, se proporciona una variante de SEQ ID NO 33 en donde la variante difiere de SEQ ID NO: 33 en una sustitución de aminoácido de Ala en la posición 18. Dichas variaciones están comprendidas por SEQ ID NO: 55. En otra realización, se proporciona un coagonista de receptor de glucagón/GLP-1 que comprende variantes de la secuencia de SEQ ID NO 33, en donde 1 a 2 aminoácidos seleccionados de las posiciones 17-22 de la variante difieren del aminoácido correspondiente de SEQ ID NO: 1, y en otra realización se proporciona una variante de SEQ ID NO 33 en donde la variante difiere de SEQ ID NO: 33 en 1 o 2 sustituciones de aminoácidos en las posiciones 20 y 21. De acuerdo con algunas realizaciones se proporciona un coagonista de receptor de glucagón/GLP-1 que comprende la secuencia: NH2-His-Ser-Gln-Gly-Thr-Phe- Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Lys-Tyr-Leu-Xaa-Xaa-Arg-Arg-Ala-Xaa-Xaa-Phe-Val-Xaa-Trp-Leu-Met-Xaa-Xaa-R (SEQ ID NO: 51) , en donde Xaa en la posición 15 es Asp, Glu, ácido cisteico, ácido homoglutámico o ácido homocisteico, Xaa en la posición 16 es Ser, Glu, Gln, ácido homoglutámico o ácido homocisteico, Xaa en la posición 20 es Gln, Lys, Arg, Orn o citrulina, Xaa en la posición 21 es Asp, Glu, ácido homoglutámico o ácido homocisteico, Xaa en la posición 24 es Gln o Glu, Xaa en la posición 28 es Asn, Lys o un aminoácido ácido, Xaa en la posición 29 es Thr o un aminoácido ácido y R es COOH o CONH2. En algunas realizaciones, R es C0NH2. De acuerdo con algunas realizaciones se proporciona un coagonista de receptor de glucagón/GLP-1 que comprende una variante de SEQ ID NO : 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 48 o SEQ ID NO: 49, en donde la variante difiere de dicha secuencia en una sustitución de aminoácido en la posición 20. En algunas realizaciones, la sustitución de aminoácido se selecciona del grupo formado por Lys, Arg, Orn o citrulina por la posición 20.

En algunas realizaciones, se proporciona un agonista de glucagón que comprende un péptido de análogo de SEQ ID NO 34 en donde el análogo difiere de SEQ ID NO 34 en que tiene un aminoácido diferente de serina en la posición 2. En algunas realizaciones el residuo de serina se sustituye con ácido aminoisobutírico, D-alanina, y en algunas realizaciones el residuo de serina se sustituye con ácido aminoisobutírico. Dichas modificaciones suprimen la descomposición por dipeptidil peptidasa IV mientras que retienen la potencia implícita del compuesto parental (por ejemplo, por lo menos 75, 80, 85, 90, 95% o más de la potencia del compuesto parental) . En algunas realizaciones la solubilidad del análogo aumenta, por ejemplo, introduciendo uno, dos, tres o más aminoácidos con carga a la parte del extremo de C del glucagón nativo, preferentemente en una posición de extremo de C a la posición 27. En ejemplos de realizaciones, uno, dos, tres o la totalidad de los aminoácidos con carga tienen carga negativa. En otra realización, el análogo además comprende un aminoácido sustituido por el aminoácido nativo en la posición 28 o 29, o en el - aminoácido ácido agregado al extremo de carboxi del péptido de SEQ ID NO 34.

En algunas realizaciones los análogos de glucagón revelados en la presente se modifican también en las posiciones 1 o 2 para reducir la susceptibilidad a la descomposición por dipeptidil peptidasa IV. En algunas realizaciones, se proporciona un análogo de glucagón de SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14 o SEQ ID NO: 15 en donde el análogo difiere de la molécula parental en una sustitución en la posición 2 y presenta susceptibilidad reducida (es decir, resistencia) a la descomposición por dipeptidil peptidasa IV. Más específicamente, en algunas realizaciones la posición 2 del péptido de análogo se sustituye con un aminoácido seleccionado del grupo formado por D-serina, D-alanina, valina, ácido amino n-butírico, glicina, N-metil serina y ácido aminoisobutírico . En algunas realizaciones, la posición 2 del péptido de análogo se sustituye con un aminoácido seleccionado del grupo formado por D-serina, D-alanina, glicina, N-metil serina y ácido aminoisobutírico. En otra realización la posición 2 del péptido de análogo se sustituye con un aminoácido seleccionado del grupo formado por D-serina, glicina, N-metil serina y ácido aminoisobutírico. En algunas realizaciones el aminoácido en la posición 2 no es D-serina . En algunas realizaciones el péptido de glucagón comprende la secuencia de SEQ ID NO: 21 o SEQ ID NO: 22.

En algunas realizaciones se proporciona un análogo de glucagón de SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14 o SEQ ID NO: 15 en donde el análogo difiere de la molécula parental en una sustitución en la posición 1 presenta una susceptibilidad reducida (es decir, resistencia) a la descomposición por dipeptidil peptidasa IV. Más específicamente, la posición 1 del péptido de análogo se sustituye con un aminoácido sustituido del grupo formado por D-histidina, ácido alfa, alfa-dimetil imidiazol acético (DMIA) , N-metil histidina, alfa-metil histidina, ácido imidazol acético, desaminohistidina, hidroxil-histidina, acetil -histidina y homo-histidina . En otra realización, se proporciona un agonista de glucagón que comprende un péptido de análogo de SEQ ID NO: 34 en donde el análogo difiere de SEQ ID NO: 34 en que tiene un aminoácido diferente de histidina en la posición 1. En algunas realizaciones, la solubilidad del análogo se aumenta, por ejemplo, introduciendo uno, dos, tres o más aminoácidos de la parte del extremo de C del glucagón nativo, preferentemente en la posición en un extremo de C a la posición 27. En ejemplos de realizaciones, uno, dos, tres o la totalidad de los aminoácidos con carga tienen una carga negativa. En otra realización el análogo además comprende un aminoácido ácido sustituido por un aminoácido nativo en la posición 28 o 29 o un aminoácido ácido agregado al extremo de carboxi del péptido de SEQ ID NO 34. En algunas realizaciones el aminoácido ácido es ácido aspártico o ácido glutámico.

En algunas realizaciones el coagonista de receptor de glucagón/GLP-1 comprende una secuencia de SEQ ID NO 20 que además comprende una prolongación del extremo de carboxi adicional de un aminoácido o un péptido seleccionado del grupo formado por SEQ ID NO 26, SEQ ID NO 27 y SEQ ID NO 28. En la realización en donde un solo aminoácido se agrega al extremo de carboxi de SEQ ID NO 20, el aminoácido se selecciona generalmente de uno de los 20 aminoácidos comunes y en algunas realizaciones el aminoácido del extremo de carboxi adicional tiene un grupo amida en lugar del ácido carboxílico del aminoácido nativo. En algunas realizaciones el aminoácido adicional se selecciona del grupo formado por ácido glutámico, ácido aspártico, y glicina.

En una realización alternativa se proporciona un coagonista de receptor de glucagón/GLP-1 en donde el péptido comprende por lo menos un anillo de lactama formado entre la cadena lateral del residuo de ácido glutámico y un residuo de lisina, en donde el residuo de ácido glutámico y un residuo de lisina están separados por tres aminoácidos. En algunas realizaciones, el aminoácido de extremo de carboxi del péptido de glucagón que lleva lactama tiene un grupo amida en lugar del ácido carboxílico del aminoácido nativo. Más específicamente, en algunas realizaciones se proporciona un coagonista de glucagón y GLP-1 que comprende un péptido de glucagón modificado del grupo formado por: NH2-His-Ser-Gln-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Lys-Tyr-Leu-Asp-Glu-Arg-Arg-Ala-Gln-Asp-Phe-Val-Gln-Trp-Leu-Met-Xaa-Xaa-R (SEQ ID NO: 66) NH2-His-Ser-Gln-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Lys- Tyr-Leu-Asp-Glu-Arg-Arg-Ala-Lys-Asp-Phe-Val-Gln-Trp-Leu-Met-Xaa- Xaa-R (SEQ ID NO : 67) NH2-His-Ser-Gln-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Lys- Tyr-Leu-Asp-Ser-Arg-Arg-Ala-Lys-Asp-Phe-Val-Glu-Trp-Leu-Met-Xaa- Xaa-R (SEQ ID NO : 68) b NH2-His-Ser-Gln-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Lys- Tyr-Leu-Asp-Ser-Arg-Arg-Ala-Gln-Asp-Phe-Val-Glu-Trp-Leu-Met-Lys- Xaa-R (SEQ ID NO : 69) NH2-His-Ser-Gln-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Lys-L0 Tyr-Leu-Asp-Glu-Arg-Arg-Ala-Lys-Asp-Phe-Val-Glu-Trp-Leu-Met-Asn- Thr-R (SEQ ID NO: 16) NH2-His-Ser-Gln-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Lys- Tyr-Leu-Asp-Glu-Arg-Arg-Ala-Gln-Asp-Phe-Val-Glu-Trp-Leu-Met-Lys- Thr-R (SEQ ID NO: 17) L5 NH2-His-Ser-Gln-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Lys- Tyr-Leu-Asp-Glu-Arg-Arg-Ala-Lys-Asp-Phe-Val-Glu-Trp-Leu-Met-Lys- Thr-R (SEQ ID NO: 18) en donde Xaa en la posición 28 = Asp, o Asn, Xaa en la posición 29 es Thr o Gly, R se selecciona del grupo formado por COOH, 20 CONH2, ácido glutámico, ácido aspártico, glicina, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27 y SEQ ID NO: 28, y un puente de lactama se forma entre Lys en la posición 12 y Glu en la posición 16 para SEQ ID NO: 66, entre Glu en la posición 16 y Lys en la posición 20 para SEQ ID NO: 67, entre Lys en la posición 20 y Glu en la posición 24 para SEQ ID NO: 68, entre Glu en la posición 24 y Lys en la posición 28 para SEQ ID NO: 69, entre Lys en la posición 12 y Glu en la posición 16 y entre Lys en la posición 20 y Glu en la posición 24 para SEQ ID NO: 16, entre Lys en la posición 12 y Glu en la posición 16 y entre Glu en la posición 24 y Lys en la posición 28 para SEQ ID NO: 17 y entre Glu en la posición 16 y Lys en la posición 20 y entre Glu en la posición 24 y Lys en la posición 28 para SEQ ID NO: 18. En algunas realizaciones R se selecciona del grupo formado por COOH, CONH2, ácido glutámico, ácido aspártico, glicina, el aminoácido en la posición 28 es Asn, y el aminoácido en la posición 29 es treonina. En algunas realizaciones, R es CONH2, el aminoácido en la posición 28 es Asn y el aminoácido en la posición 29 es treonina. En otra realización, R se selecciona del grupo formado por SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 29 y SEQ ID NO: 65 y el aminoácido en la posición 29 es glicina.

En otra realización el coagonista de receptor de glucagón/GLP-1 se selecciona del grupo formado por SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17 y SEQ ID NO: 18, en donde el péptido además comprende una prolongación de extremo de carboxi adicional de un aminoácido o un péptido seleccionado del grupo formado por SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27 y SEQ ID NO: 28. En algunas realizaciones, la prolongación del extremo comprende la secuencia de SEQ ID NO.: 26, SEQ ID NO: 29 o SEQ ID NO: 65 y el péptido de glucagón comprende la secuencia de SEQ ID NO: 55. En algunas realizaciones, el coagonista de receptor de glucagón/GLP-1 comprende la secuencia de SEQ ID NO: 33 en donde el aminoácido en la posición 16 es ácido glutámico, el aminoácido en la posición 20 es lisina, el aminoácido en la posición 28 es asparagina y la secuencia de aminoácido de SEQ ID No: 26 o SEQ ID NO: 29 se une al extremo de carboxi de SEQ ID NO: 33.

En la realización en donde se agrega un solo aminoácido al extremo de carboxi de SEQ ID NO 20, el aminoácido normalmente se selecciona de uno de los 20 aminoácidos comunes y en algunas realizaciones el aminoácido tiene un grupo amida en lugar del ácido carboxilico del aminoácido nativo. En algunas realizaciones el aminoácido adicional se selecciona del grupo formado por ácido glutámico y ácido aspártico y glicina. En las realizaciones en donde el análogo de agonista de glucagón también comprende una prolongación de extremo de carboxi, el aminoácido de extremo de carboxi de la prolongación, en algunas realizaciones, termina en un grupo amida o un grupo éster en lugar de un ácido carboxilico.

En otra realización el coagonista de receptor de glucagón/GLP-1 comprende la secuencia H2-His-Ser-Gln-Gly-Thr-Phe- Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Lys-Tyr-Leu-Asp-Glu-Arg-Arg-Ala-Gln-Asp-Phe-Val-Gln-Trp-Leu- et-Asn-Thr-Xaa-CONH2 (SEQ ID NO: 19), en donde Xaa en la posición 30 representa cualquier aminoácido. En algunas realizaciones Xaa se selecciona del grupo formado por 20 aminoácidos comunes, y en algunas realizaciones el aminoácido es ácido glutámico, ácido aspártico o glicina. La solubilidad de este péptido se puede mejorar más uniendo en forma covalente una cadena de PEG a la cadena lateral de aminoácido en las posiciones 17, 21, 24 o 30 de SEQ ID NO: 19. En otra realización el péptido comprende una prolongación del extremo de carboxi adicional de un péptido seleccionado del grupo formado por SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27 y SEQ ID NO: 28. De acuerdo con algunas realizaciones el coagonista de receptor de glucagón/GLP-1 comprende la secuencia de SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 31 y SEQ ID NO: 32.

Se pueden hacer modificaciones específicas del sitio internas a la secuencia de glucagón de SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19 y SEQ ID NO: 64 para dar un grupo de agonistas de glucagón que posee niveles variables de agonismo de GLP-1. Por consiguiente, se han preparado y caracterizado péptidos que poseen potencia in vitro idéntica en cada receptor. En forma similar, se han identificado y caracterizado péptidos con diez veces la potencia mejorada selectivamente en cada uno de los dos receptores. Como se indicó anteriormente, la sustitución del residuo de serina en la posición 16 con ácido glutátnico mejora la potencia del glucagón nativo en los receptores de glucagón y de GLP-1, pero mantiene aproximadamente una selectividad de diez veces para el receptor de glucagón. Además, mediante la sustitución de la glutamina nativa en la posición 3 con ácido glutámico (SEQ ID NO 22) se genera un análogo de glucagón que presenta aproximadamente una selectividad de diez veces para el receptor de GLP-1.

La solubilidad de los péptidos de coagonista de glucagón/GLP-1 se puede mejorar adicionalmente en soluciones acuosas a pH fisiológico, mientras retiene la actividad biológica alta en relación con el glucagón nativo mediante la introducción de grupos hidrófilos en las posiciones 16, 17, 21 y 24 del péptido o mediante el agregado de un solo aminoácido modificado (es decir un aminoácido modificado para comprender un grupo hidrófilo) en el extremo de carboxi del péptido coagonista de glucagón/GLP-l. De acuerdo con algunas realizaciones el grupo hidrófilo comprende una cadena de polietilenglicol (PEG) . Más específicamente, en algunas realizaciones el péptido de glucagón comprende la secuencia de SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17 o SEQ ID NO: 18 en donde una cadena de PEG está unida en forma covalente a la cadena lateral de un aminoácido en la posición 16, 17, 21, 24, 29 o el aminoácido de extremo del péptido de glucagón, con la condición de que cuando el péptido comprenda SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12 o SEQ ID NO: 13 la cadena de polietilenglicol está unida en forma covalente a un residuo de aminoácido en la posición 17, 21 o 24, cuando el péptido comprende SEQ ID NO: 14 o SEQ ID NO: 15 la cadena de polietilenglicol está unida en forma covalente a un residuo de aminoácido en la posición 16, 17 o 21, y cuando el péptido comprende SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17 o SEQ ID NO: 18. la cadena de polietilenglicol está unida en forma covalente a un residuo de aminoácido en la posición 17 o 21.

En algunas realizaciones el péptido de glucagón comprende la secuencia de SEQ ID NO 11, SEQ ID NO 12 o SEQ ID NO 13, en donde una cadena de PEG está unida en forma covalente a la cadena lateral de un aminoácido en la posición 17, 21, 24, o el aminoácido del extremo de C del péptido de glucagón . y el aminoácido del extremo de carboxi del péptido tiene un grupo amida en lugar del grupo ácido carboxílico del aminoácido nativo. En algunas realizaciones el péptido de coagonista de receptor de glucagón/GLP- 1 comprende una secuencia seleccionada del grupo formado por SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18 y SEQ ID NO: 19, en donde una cadena de PEG está unida en forma covalente a la cadena lateral de un aminoácido en la posición 17, 21 o 24 de SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13 y SEQ ID NO: 19, o en la posición 16, 17 o 21 de SEQ ID NO: 14 y SEQ ID NO: 15 o en la posición 17 o 21 SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17 y SEQ ID NO: 18 del péptido de glucagón. En otra realización el péptido de coagonista de receptor de glucagón/GLP-1 comprende la secuencia de SEQ ID NO: 11 o SEQ ID NO: 19, en donde una cadena de PEG está unida en forma covalente a la cadena lateral de un aminoácido en la posición 17, 21 o 24 o el aminoácido de extremo de C del péptido de glucagón.

De acuerdo con algunas realizaciones, y con las limitaciones de condiciones descritas en los párrafos precedentes, el péptido de coagonista de glucagón se modifica para contener una o más sustituciones de aminoácidos en las posiciones 16, 17, 21, 24, o 29 o el aminoácido de extremo de C, en donde el aminoácido se sustituye con un aminoácido que tiene una cadena lateral adecuada para el entrecruzamiento con grupos hidrófilos, que incluyen por ejemplo, PEG. El péptido nativo se puede sustituir con un aminoácido natural o un aminoácido sintético (no natural) . Los aminoácidos sintéticos o no naturales se refieren a aminoácidos que no son naturales in vivo pero que, de todos modos, se pueden incorporar en las estructuras de péptidos descritas en la presente. Alternativamente, el aminoácido que tiene una cadena lateral adecuada para entrecruzar con grupos hidrófilos, que incluyen, por ejemplo, PEG, se puede agregar al extremo de carboxi de cualquiera de los análogos de glucagón revelados en la presente. De acuerdo con algunas realizaciones se hace una sustitución de aminoácido en el coagonista de receptor de glucagón/GLP-1 en una posición seleccionada del grupo formado por 16, 17, 21, 24 o 29 reemplazando el aminoácido nativo con un aminoácido seleccionado del grupo formado por lisina, cisteína, ornitina, homocisteína y acetil fenilalanina, en donde el aminoácido sustituyente además comprende una cadena de PEG unida en forma covalente a la cadena lateral del aminoácido. En algunas realizaciones un péptido de glucagón seleccionado del grupo formado por SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, y SEQ ID NO: 19 se modifica adicionalmente para comprender una cadena de PEG que está unida en forma covalente a la cadena lateral de un aminoácido en la posición 17 o 21 del péptido de glucagón. En algunas realizaciones el coagonista de receptor de glucagón/GLP-1 pegilado además comprende la secuencia de SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27 o SEQ ID NO: 29.

En otras realizaciones el péptido de glucagón comprende la secuencia de SEQ ID NO: 55 o SEQ ID NO: 56, que además comprende una prolongación del extremo de C de SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 29 o SEQ ID NO: 65 unida al aminoácido de extremo de C de SEQ ID NO: 55 o SEQ ID NO: 56, y opcionalmente además comprende una cadena de PEG unida en forma covalente a la cadena lateral de un aminoácido en la posición 17, 18, 21, 24 o 29 o el aminoácido de extremo de C del péptido. En otra realización el péptido de glucagón comprende la secuencia de SEQ ID NO: 55 o SEQ ID NO: 56, en donde la cadena de PEG está unida en forma covalente a la cadena lateral de un aminoácido en la posición 21 o 24 del péptido de glucagón y el péptido además comprende una prolongación de extremo de C de SEQ ID NO: 26, o SEQ ID NO: 29.

En otra realización el péptido de glucagón comprende la secuencia de SEQ ID NO: 55, o SEQ ID NO: 33 o SEQ ID NO: 34, en donde un aminoácido adicional se agrega al extremo de carboxi de SEQ ID NO: 33 o SEQ ID NO : 34, y una cadena de PEG está unida en forma covalente a la cadena lateral del aminoácido agregado. En otra realización el análogo de glucagón pegilado además comprende una prolongación del extremo de C de SEQ ID NO 26 o SEQ ID NO 29 unida al aminoácido de extremo de C de SEQ ID NO 33 o SEQ ID NO 34. En otra realización el péptido de glucagón comprende la secuencia de SEQ ID NO 19, en donde una cadena de PEG está unida en forma covalente a la cadena lateral del aminoácido en la posición 30 del péptido de glucagón y el péptido además comprende una prolongación del extremo de C de SEQ ID NO 26 o SEQ ID NO 29 unida al aminoácido del extremo de C de SEQ ID NO 19.

La cadena de polietilenglicol puede estar en la forma de una cadena recta o puede ser ramificada. De acuerdo con algunas realizaciones la cadena de polietilenglicol tiene un peso molecular seleccionado de la gama de 500 a 10.000 Dalton. En algunas realizaciones la cadena de polietilenglicol tiene un peso molecular promedio seleccionado de la gama de 1.000 a 5.000 Dalton. En una realización alternativa la cadena de polietilenglicol tiene un peso molecular promedio seleccionado de la gama de 10.000 a 20.000 Dalton. De acuerdo con algunas realizaciones el péptido de glucagón pegilado comprende dos o más cadenas de polietilenglicol unidas al péptido de glucagón en donde el peso molecular total de las cadenas de glucagón es de 1.000 a 5.000 Dalton. En algunas realizaciones el agonista de glucagón pegilado comprende un péptido que comprende una SEQ ID no 5 o un análogo de agonista de glucagón de SEQ ID NO 5, en donde la cadena de PEG está unida en forma covalente al residuo de aminoácido en la posición 21 y/o en la posición 24 y en donde el peso molecular combinado de las dos cadenas de PEG es de 1.000 a 5.000 Dalton.

En ciertos ejemplos de realizaciones el péptido de glucagón comprende la secuencia de aminoácido de SEQ ID NO 1 con hasta diez modificaciones de aminoácido y comprende un aminoácido en la posición 10 que está acilado o alquilado. En algunas realizaciones el aminoácido en la posición 10 está acilado o alquilado con un ácido graso de C4 a C30. En ciertos aspectos, el aminoácido en la posición 10 comprende un grupo acilo o un grupo alquilo que es no nativo a un aminoácido natural.

En ciertas realizaciones, el péptido de glucagón que comprende un aminoácido en la posición 10 que está acilado o alquilado comprende una alfa hélice estabilizada. Por consiguiente, en ciertos aspectos, el péptido de glucagón comprende un grupo acilo o alquilo como se describe en la presente y un puente intramolecular, por ejemplo, un puente intramolecular covalente (por ejemplo un puente de lactama) entre las cadenas laterales de un aminoácido en la posición i y un aminoácido en la posición i+4, en donde i es 12, 16, 20 o 24. Alternativamente o además, el péptido de glucagón comprende un grupo acilo o alquilo como se describe en la presente y una, dos, tres o más de las posiciones 16, 20, 21 y/o 24 del péptido de glucagón se sustituyen con un aminoácido OÍ, a-disustituido, por ejemplo AIB. En algunas realizaciones el péptido de glucagón no nativo comprende Glu en la posición 16 y Lys en la posición 20, en donde opcionalmente un puente de lactama une la Glu y la Lys, y opcionalmente, el péptido de glucagón además comprende una o más modificaciones seleccionadas del grupo formado por Gln en la posición 17, Ala en la posición 18, Glu en la posición 21, lie en la posición 23 y Ala en la posición 24.

Además, en cualquiera de las realizaciones, en donde el péptido de glucagón comprende un aminoácido en la posición 10 que está acilado o alquilado, el péptido de glucagón además puede comprender una amida de extremo de C en lugar del alfa carboxilato del extremo de C.

En algunas realizaciones, el péptido de glucagón que comprende un grupo acilo o alquilo como se describe en la presente además comprende una sustitución de aminoácido en la posición 1, en la posición 2, o en las posiciones 1 y 2, en donde la sustitución de aminoácido logra resistencia a la DPP-IV proteasa. Por ejemplo, la His en la posición 1 puede sustituirse con un aminoácido seleccionado del grupo formado por D-histidina, alfa, ácido alfa-dimetil imidiazol acético (DMIA) , N-metil histidina, alfa-metil histidina, ácido imidazol acético, desaminohistidina, hidroxil-histidina, acetil -histidina y homo-histidina . Alternativamente o además, la Ser en la posición 2 se puede sustituir con un aminoácido seleccionado del grupo formado por D-serina, alanina, D-alanina, valina, glicina, N-metil serina, N-metil alanina, y ácido amino isobutírico. En algunas realizaciones el aminoácido en la posición 2 no es D-serina.

El péptido de glucagón que comprende el aminoácido en la posición 10 que se acila o alquila como se describe en la presente puede comprender cualquier secuencia de aminoácido que está sustancialmente relacionada con SEQ ID NO 1. Por ejemplo, el péptido de glucagón comprende SEQ ID NO 1 con hasta 10 modificaciones de aminoácidos (por ejemplo, 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 modificaciones). En ciertas realizaciones, la secuencia de aminoácido del péptido de glucagón acilado o alquilado es más del 25% idéntica a SEQ ID NO 1 (por ejemplo, más del 30%, 35%, 40%, 50%, 60%, 70% 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, o casi 100% idéntica a SEQ ID NO: 1) . En ciertas realizaciones específicas, el péptido de glucagón es uno que comprende SEQ ID NOs: 55 con un aminoácido en la posición 10 acilado o alquilado como se describe en la presente. El péptido de glucagón puede ser cualquiera de SEQ ID NOs: 55, 55 con 1 o 2 modificaciones de aminoácidos, 2-4, 9-18, 20, 23-25, 33, 40-44, 53, 56, 61, 62, 64, 66-514, y 534.

El grupo acilo o alquilo de estas realizaciones puede ser cualquier grupo acilo o alquilo descrito en la presente. Por ejemplo, el grupo acilo puede ser un grupo acilo graso de C4 a C30 (por ejemplo, de C8 a C24) y el grupo alquilo puede ser un grupo alquilo de C4 a C30 (por ejemplo de C8 a C24) .

El aminoácido al cual se une el grupo acilo o alquilo puede ser cualquiera de los aminoácidos descritos en la presente, por ejemplo, un aminoácido de cualquiera de la Fórmula I (por ejemplo, Lys) , Fórmula II y Fórmula III.

En algunas realizaciones el grupo acilo o grupo alquilo se une directamente al aminoácido en la posición 10. En algunas realizaciones, el grupo acilo o alquilo se une al aminoácido en la posición 10 a través de un separador, tal como por ejemplo un separador que tiene de 3 a 10 átomos de longitud, por ejemplo, un aminoácido o dipéptido. Los separadores adecuados con los fines de unir un grupo acilo o alquilo se describen en la presente .

De acuerdo con algunas realizaciones, el péptido relacionado con glucagón de la clase 3 puede ser un análogo de cualquiera de los péptidos relacionados con glucagón de la Clase 3 precedentes descritos en la presente, cuyo análogo presenta actividad de agonista en el receptor de GIP. El nivel de actividad del análogo en el receptor de glucagón, el receptor de GLP-1 y el receptor de GIP, la potencia en cada uno de estos receptores y la selectividad de cada uno de estos receptores puede estar de acuerdo con la enseñanzas de los péptidos relacionados con glucagón de la clase 2 descritos en la presente. Véase por ejemplo, las enseñanzas en el subtítulo de la sección de péptidos relacionados con glucagón de la clase 2 titulada "Actividad" .

En algunas realizaciones de la invención, se proporciona un análogo de un péptido de glucagón, el cual presenta actividad de agonista en el receptor de GIP. El análogo en ciertas realizaciones comprende la secuencia de aminoácido de SEQ ID NO 1 con por lo menos una modificación de aminoácido (opcionalmente, hasta 15 modificaciones de aminoácido) y una prolongación de 1 a 21 aminoácidos del extremo de C al aminoácido en la posición 29 del análogo.

En ciertos aspectos, los análogos comprenden por lo menos una modificación de aminoácido y hasta 15 modificaciones de aminoácidos (por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 modificaciones de aminoácidos, hasta 10 modificaciones de aminoácidos) . En ciertas realizaciones, los análogos comprenden por lo menos una modificación de aminoácido hasta 10 modificaciones de aminoácidos y modificaciones de aminoácidos conservadoras adicionales. Las modificaciones de aminoácidos conservadoras se describen en la presente .

En algunos aspectos, por lo menos una de las modificaciones de aminoácidos confiere una estructura de alfa hélice estabilizada en la parte de extremo de C del análogo. Las modificaciones que logran una estructura de alfa hélice estabilizada se describen en la presente. Véanse, por ejemplo, las enseñanzas en la sección titulada Estabilización de alfa hélices / Puentes intramoleculares. En algunos aspectos, el análogo comprende un puente intramolecular (por ejemplo un puente intramolecular covalente, un puente intramolecular no covalente) entre las cadenas laterales de dos aminoácidos del análogo. En ciertos aspectos, un puente intramolecular une las cadenas laterales de los aminoácidos en las posiciones i e i+4, en donde i es 12, 13, 16, 17, 20 o 24. En otros aspectos, un puente intramolecular conecta las cadenas laterales de los aminoácidos en las posiciones j y j+3, en donde j es 17, o en las posiciones k y k+7 en donde k es cualquier número entero entre 12 y 22. En ciertas realizaciones, el puente intramolecular es un puente intramolecular covalente, por ejemplo, un puente de lactama. En aspectos específicos, el puente de lactama conecta las cadenas laterales de los aminoácidos en las posiciones 16 y 20. En aspectos específicos, uno de los aminoácidos en las posiciones 16 y 20 es un aminoácido con carga positiva y el otro es un aminoácido con carga negativa. Por ejemplo, el análogo puede comprender un puente de lactama que conecta las cadenas laterales de una Glu en la posición 16 y una Lys en la posición 20. En otros aspectos, el aminoácido con carga negativa y el aminoácido con carga positiva forman un puente de sal. En este caso, el puente intramolecular es un puente intramolecular no covalente.

En aspectos particulares, la modificación de aminoácido que confiere una alfa hélice estabilizada es una inserción o sustitución de un aminoácido de SEQ ID NO 1, con un aminoácido alfa, alfa-disustituido . Los aminoácidos alfa, alfa-disustituidos adecuados para los fines de estabilizar la alfa hélice se describen en la presente e incluyen, por ejemplo, AIB. En algunos aspectos, uno, dos, tres o más de los aminoácidos en las posiciones 16, 20, 21 y 24 de SEQ ID NO 1 se sustituyen con un aminoácido alfa, alfa-disustituido, por ejemplo, AIB. En realizaciones particulares, el aminoácido en la posición 16 es AIB.

El análogo que presenta actividad de agonista en el receptor de GIP puede comprender modificaciones adicionales, tales como cualquiera de aquellas descritas en la presente. Por ejemplo, las modificaciones de aminoácidos pueden aumentar o disminuir la actividad en uno ambos receptores de GLP-1 y de glucagón. Las modificaciones de aminoácidos pueden aumentar la estabilidad del péptido, por ejemplo aumentar la resistencia a la degradación por DPP-IV proteasa, estabilizar el enlace entre los aminoácidos 15 y 16. Las modificaciones de aminoácidos pueden aumentar la solubilidad del péptido y/o alterar el tiempo de acción del análogo en cualquiera de los receptores de GIP, glucaón y GLP-1. Una combinación de cualquiera de estos tipos de modificaciones puede estar presente en los análogos que presentan actividad de agonista en el receptor de GIP.

Por consiguiente, en algunos aspectos, el análogo comprende la secuencia de aminoácido de SEQ ID NO 1 con una o más de Gln en la posición 17, Ala en la posición 18, Glu en la posición 21, lie en la posición 24 y Ala y Cys en la posición 24, o sustituciones de aminoácidos conservadoras de ellas. En algunos aspectos, el análogo comprende una amida de extremo de C en lugar del alfa carboxilato de extremo de C. En ciertas realizaciones, el análogo comprende una sustitución de aminoácido en la posición 1, posición 2 o posiciones 1 y 2, cuyas sustituciones logran resistencia a DPP-IV proteasa. Las sustituciones de aminoácidos adecuadas se describen en la presente. Por ejemplo, D IA en la posición 1 y/o d-Sér o AIB en la posición 2. En algunas realizaciones el aminoácido en la posición 2 no es D-serina.

Además o alternativamente, el análogo puede comprender una o una combinación de (a) Ser en la posición 2 sustituido con Ala, (b) Gln en la posición 3 sustituido con Glu o un análogo de glutamina, (c) Thr en la posición 7 sustituido con lie, (d) Tyr en la posición 10 sustituido con Trp o un aminoácido que comprende un grupo acilo o alquilo que es no nativo al aminoácido natural, (e) Lys en la posición 12 sustituido con lie, (f) Asp en la posición 15 sustituido con Glu, (g) Ser en la posición 16 sustituido con Glu, (h) Gln en la posición 20 sustituido con Ser, Thr, Ala, AIB, (i) Gln en la posición 24 sustituido con Ser, Thr, Ala, AIB (j) Met en la posición 27 sustituido con Leu o Nle, (k) Asn en la posición 29 sustituido con un aminoácido con carga, opcionalmente , Asp o Glu y (1) Thr en la posición 29 sustituido con Gly o un aminoácido con carga, opcionalmente Asp o Glu.

En ciertos aspectos, el análogo no comprende una modificación de aminoácido en la posición 1 cuya modificación confiere actividad de agonista de GIP. En algunos aspectos, el aminoácido en la posición 1 no es un aminoácido grande, aromático, por ejemplo Tyr. En algunas realizaciones, el aminoácido en la posición 1 es un aminoácido que comprende un anillo de imidazol, por ejemplo His, análogos de His. En ciertas realizaciones, el análogo no es ninguno de los compuestos revelados en la Solicitud de Patente Estadounidense N° 61/151.349. En ciertos aspectos, el análogo comprende la secuencia de aminoácido de cualquiera de SEQ ID NO 657-669.

Con respecto a los análogos que presentan actividad de agonista en los receptores de GIP, el análogo comprende una prolongación de 1-21 aminoácidos (por ejemplo, 5-19, 7-15, 9-12 aminoácidos). La prolongación del análogo puede comprender cualquier secuencia de aminoácido, siempre que la prolongación sea de 1 a 21 aminoácidos. En algunos aspectos, la prolongación es de 7 a 15 aminoácidos y en otros aspectos, la prolongación es de 9 a 12 aminoácidos. En algunas realizaciones la prolongación comprende (i) la secuencia de aminoácido SEQ ID NO 26 o 674, (ii) una secuencia de aminoácido que tiene alta identidad de secuencia (por ejemplo, por lo menos 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99%) con la secuencia de aminoácido de SEQ ID NO 26 o 674, o (iii) la secuencia de aminoácido de (i) o (ii) con una o más modificaciones de aminoácido conservadoras.

En algunas realizaciones, por lo menos uno de los aminoácidos de la prolongación se acila o se alquila. El aminoácido que comprende el grupo acilo o alquilo puede estar ubicado en cualquier posición de la prolongación del análogo. En ciertas realizaciones el aminoácido acilado o alquilado de la prolongación está ubicado en una de las posiciones 37, 38, 39, 40, 41, o 42 (de acuerdo con la numeración de SEQ ID NO 1) del análogo. En ciertas realizaciones, el aminoácido acilado o alquilado está ubicado en la posición 40 del análogo.

En ejemplos de realizaciones, el grupo acilo o alquilo es un grupo acilo o alquilo que es no nativo al aminoácido natural. Por ejemplo, el grupo acilo o alquilo puede ser un grupo acilo graso de C4 a C30 (por ejemplo, de C12 a C18) o alquilo de C4 a C30 (por ejemplo de C12 a C18) . El grupo acilo o alquilo puede ser cualquiera de aquellos descritos en la presente.

En algunas realizaciones, el grupo acilo o alquilo se une directamente al aminoácido, por ejemplo a través de la cadena lateral del aminoácido. En otras realizaciones, el grupo acilo o alquilo se une al aminoácido a través de un separador (por ejemplo, un aminoácido, un dipéptido, un tripéptido, un separador bifuncional hidrófilo, un separador bifuncional hidrófobo) . En ciertos aspectos, el separador tiene de 3 a 10 átomos de longitud. En algunas realizaciones, el separador de aminoácido no es ?-Glu. En algunas realizaciones, el separador de dipéptido no es ?-Glu- ?-Glu.

Además, en ejemplos de realizaciones, el aminoácido al cual está unido el grupo acilo o alquilo puede ser cualquiera de aquellos descritos en la presente, que incluyen, por ejemplo, un aminoácido de la fórmula I, II o III. El aminoácido que se acila o se alquila puede ser una Lys, por ejemplo. Los aminoácidos adecuados que comprenden un grupo acilo o alquilo, así como grupos acilo y grupos alquilo adecuados, se describen en la presente. Véase, por ejemplo, las enseñanzas en las secciones tituladas Acilación y Alquilacion .

En otras realizaciones, 1-4 aminoácidos (por ejemplo, 1-2, 1-3, 1-4, 1-5 aminoácidos de la prolongación son aminoácidos con carga positiva, por ejemplo aminoácidos de la Fórmula IV, tales como, por ejemplo, Lys. Como se usa en la presente, el término "aminoácido con carga positiva" se refiere a cualquier aminoácido, naturales o no naturales, que comprenden una carga positiva o un átomo de su cadena lateral a un pH fisiológico. En ciertos aspectos, los aminoácidos con carga positiva están ubicados en cualquiera de las posiciones 37, 38, 39, 40, 41, 42, y 43. En realizaciones específicas, un aminoácido con carga positiva está ubicado en la posición 40.

En otros casos, la prolongación se acila o alquila como se describe en la presente y comprende 1-6 aminoácidos con carga positiva descritos en la presente.

En aún otras realizaciones, los análogos que presentan actividad de agonista en el receptor de GIP comprende (i) SEQ ID NO 1 con por lo menos una modificación de aminoácido, (ii) una prolongación de 1 a 21 aminoácidos (por ejemplo, de 5 a 18, de 7 a 15, de 9 a 12 aminoádidos) del extremo de C al aminoácido en la posición 29 del análogo, y (iii) un aminoácido que comprende un grupo acilo o alquilo que es no nativo al aminoácido natural que está ubicado fuera de la prolongación del extremo de C (por ejemplo, en cualquiera de las posiciones 1-29) . En algunas realizaciones, el análogo comprende un aminoácido acilado o alquilado en la posición 10. En aspectos particulares, el grupo acilo o alquilo es un grupo acilo graso de C5 a C30 o el grupo alquilo de C4 a C30. En algunas realizaciones, el grupo acilo o alquilo se une a través de un separador, . por ejemplo un aminoácido, dipéptido, tripéptido, separador bifuncional hidrófilo, separador bifuncional hidrófobo) . En ciertos aspectos, el análogo comprende una modificación de aminoácido que estabiliza la alfa hélice, tal como un puente de sal entre una Glu en la posición 16 y una Lys en la posición 20, un aminoácido alfa, alfa-disustituido en una, dos, tres o mas cualquiera de las posiciones 16, 20, 21 y 24. En aspectos específicos, el análogo además comprende modificaciones de aminoácidos que confieren resistencia a DPP-IV proteasas, por ejemplo D IA en la posición 1, AIB en la posición 2. Los análogos que comprenden otras modificaciones de aminoácidos están contemplados en la presente.

En ciertas realizaciones, los análogos que tienen actividad de receptor de GIP presentan por lo menos un 0,1% (por ejemplo, por lo menos un 0.5%, 1%, 2%, 5%, 10%, 15%, o 20%) de actividad de GIP nativo en el receptor de GIP. En algunas realizaciones, los análogos presentan más del 20% (por ejemplo, más del 50%, más del 75%, más del 100%, más del 200%, más del 300%, más del 500%) de actividad de GIP nativo en el receptor de GIP. En algunas realizaciones, el análogo presenta actividad de agonista apreciable en uno o ambos de los receptores de GLP-1 y glucagón. En algunos aspectos, la selectividad para estos receptores (receptor de GIP y receptor de GLP-1 y/o receptor de glucagón) está dentro de las 100 veces. Por ejemplo, la selectividad para el receptor de GLP-1 de los análogos que tienen actividad de receptor de GIP puede ser menos de 500 veces, 100 veces, dentro de 50 veces, dentro de 25 veces, dentro de 15 veces, dentro de 10 veces) la selectividad para el receptor de GIP y/o para el receptor de glucagón.

En aspectos particulares, el análogo comprende las estructuras de cualquiera de SEQ ID NO 657-669.

De acuerdo con algunas realizaciones, el péptido relacionado con glucagón de la clase 3 comprende la secuencia de aminoácido de glucagón nativo (SEQ ID NO 1) que comprende las siguientes modificaciones: AIB en la posición 2, Glu en la posición 3, Lys en la posición 10, Glu en la posición 16, Glu en la posición 17, Ala en la posición 18, Lys en la posición 20, Glu en la posición 21, lie en la posición 23, Ala en la posición 24, en donde Lys en la posición 10 se acila con un ácido graso de C14 a C16 y en donde el carboxilato de extremo de C se reemplaza con una amida. En una realización específica, este péptido relacionado con glucagón se une a través de su aminoácido de extremo de N al dipéptido D-Lys-Sarcosina .

De acuerdo con algunas realizaciones, el péptido relacionado con glucagón de la clase 3 comprende, consiste esencialmente en, o consiste en una secuencia de aminoácido de cualquiera de SEQ ID NO 70-514, 517-534, o 554, opcionalmente con hasta 1,2, 3, 4, o 5 otras modificaciones que retienen la actividad de agonista de GLP-1 y/o de agonista de glucagón. En ciertas realizaciones, el péptido relacionado con glucagón de la clase 3 comprende los aminoácidos de cualquiera de SEQ ID NO 562-684 y 1701-1776. En algunas realizaciones, el péptido relacionado con glucagón de la clase 3 comprende la secuencia de aminoácido de cualquiera de SEQ ID NO 1801-1908.

Péptidos relacionados con glucagón de la Clase 4 En ciertas realizaciones, el péptido relacionado con glucagón es un péptido relacionado con glucagón de la Clase 4 (véase, por ejemplo, la Solicitud de Patente Internacional (PCT) N° US2008/080873 , que se incorpora en la presente como referencia en su totalidad) .

Todas las secuencias biológicas citadas en la siguiente sección (SEQ ID NO: 1301-1371) corresponden a las SEQ ID NO: 1-71 de la Solicitud de Patente Internacional N° PCT US2008/080973.

Actividad De acuerdo con algunas realizaciones, se proporcionan péptidos relacionados con glucagón de la Clase 4 (en adelante denominados "péptidos de la Clase 4") . En ciertos aspectos, se proporciona un péptido de la clase 4 que tiene actividad antagonista de glucagón. Los antagonistas de glucagón se usan en cualquier escenario donde se desea la supresión del agonismo de glucagón. El uso más inmediato y obvio sería en el tratamiento de la diabetes donde se ha demostrado que el antagonismo de glucagón en los modelos preclínicos de hiperglicemia producen una disminución de la glucosa en sangre. Los antagonistas de glucagón pueden modificarse además para mejorar la estabilidad biofísica y/o la solubilidad acuosa de los compuestos mientras mantienen la actividad antagonista del compuesto parental. En ciertos aspectos se define un péptido de la clase 4 como un antagonista de glucagón puro.

El término "antagonista de glucagón" se refiere a un compuesto que contrarresta la actividad de glucagón o previene la función de glucagón. Por ejemplo, un antagonista de glucagón presenta por lo menos un 60% de inhibición (por ejemplo, por lo menos un 70% de inhibición) y preferentemente por lo menos un 80% de inhibición de la respuesta máxima lograda por glucagón en el receptor de glucagón. En algunas realizaciones, el antagonista de glucagón presenta por lo menos un 90% de inhibición de la respuesta máxima alcanzada por glucagón en el receptor de glucagón. En una realización específica el antagonista de glucagón presenta un 100% de inhibición de la respuesta máxima lograda por glucagón en el receptor de glucagón. Además, un antagonista de glucagón a una concentración de 1 µ? presenta menos del 20% de la actividad de agonista máxima lograda por glucagón en el receptor de glucagón. En algunas realizaciones, el antagonista de glucagón presenta menos del 105 de la actividad de agonista máxima lograda por glucagón en el receptor de glucagón. En una realización específica, el antagonista de glucagón presenta menos del 5% de la actividad de agonista máxima lograda por glucagón en el receptor de glucagón. En aún otra realización específica, el antagonista de glucagón presenta 0% de la actividad de agonista máxima lograda por glucagón en el receptor de glucagón.

Un "antagonista de glucagón puro" es un antagonista de glucagón que no produce ninguna estimulación deseada de actividad de receptor de glucagón o GLP-1, medida mediante la producción de cA P usando un ensayo de modelo in Vitro validado (véase, por ejemplo, PCT/US2008/080973 ) . Por ejemplo, un , antagonista de glucagón puro presenta menos del 5% (por ejemplo, menos del 4%, menos del 3%, menos del 2%, menos del 1%, un 0%) de la actividad de agonista máxima lograda por glucagón en el receptor de glucagón y presenta menos del 5% (por ejemplo, Menos del 4%, menos del 3%, menos del 2%, menos del 1%, un 0%) de la actividad de agonista máxima lograda por GLP-1 en el receptor de GLP-1.

Por consiguiente, en algunos aspectos se proporcionan péptidos de la clase 4 que presentan actividad de antagonista de glucagón puro. De acuerdo con algunas realizaciones el antagonista de glucagón presenta actividad que reduce la producción de cAMP inducida por glucagón de receptor de glucagón en un máximo de por lo menos 50% cuando el receptor de glucagón se pone en contacto simultáneamente con 0,8nM de glucagón y el antagonista de glucagón, medido por la producción de cAMP en un ensayo in Vitro. En algunas realizaciones, el antagonista de glucagón reduce la producción de cAMP inducida por glucagón de receptor de glucagón en una magnitud máxima de por lo menos el 80%.

Se cree que los péptidos de la clase 4 son adecuados para cualquier uso que se ha descrito previamente para antagonistas de glucagón. Por consiguiente, los péptidos de la clase 4 descritos en la presente se pueden usar para tratar hiperglicemia o para tratar otras enfermedades metabólicas que derivan de los altos niveles en sangre de glucagón o altos niveles de glucosa en sangre. De acuerdo con algunas realizaciones el paciente a quien se debe tratar usando péptidos de la clase 4 revelados en la presente es un animal domesticado, y en otra realización el paciente a quien se debe tratar es un humano. Los estudios sugieren que la falta de supresión de glucagón en los pacientes diabéticos contribuye a la hiperglicemia postprandial en parte a través de la glicogenólisis acelerada. El análisis de la glucosa en sangre durante el Ensayo de Tolerancia de Glucosa Oral (OGTT) y en la presencia o ausencia de supresión de glucagón inducida por somatostatina, ha demostrado un aumento significativo en la glucosa en sujetos con niveles de glucagón más altos. Por consiguiente, los peptidos de la clase 4 de la presente invención se pueden usar para tratar hiperglicemia, y se espera que sean útiles para tratar una variedad de tipos de diabetes que incluyen diabetes mellitas tipo I, diabetes mellitas tipo II o diabetes gestacional, insulinodependiente o no insulinodependiente , y reducir complicaciones de la diabetes que incluyen nefropatía, retinopatía y enfermedad vascular.

En algunas realizaciones los diez aminoácidos de extremo de Exendina 4 (es decir la secuencia de SEQ ID NO 1319 (GPSSGAPPPS) ) están unidos al extremo de carboxi de un péptido de la clase 4. Se anticipa que estas proteínas de fusión tienen actividad farmacológica para suprimir el apetito e inducir la pérdida de peso/mantenimiento de peso. De acuerdo con algunas realizaciones los peptidos de la clase 4 revelados en la presente pueden modificarse adicionalmente para incluir la secuencia de aminoácido de SEQ ID NO: 1319 (GPSSGAPPPS) unida al aminoácido 24 del péptido de la clase 4 de SEQ ID NO: 1342 y administrarse a individuos para inducir la pérdida de peso o contribuir al mantenimiento del peso. Más específicamente, el péptido de la clase 4 comprende una secuencia seleccionada del grupo formado por SEQ ID NO: 1302, SEQ ID NO: 1303, SEQ ID NO: 1304 SEQ ID NO: 1305, SEQ ID NO: 1306, SEQ ID NO: 1307, SEQ ID NO: 1308, SEQ ID NO: 1336, SEQ ID NO: 1339, SEQ ID NO: 1340 SEQ ID NO: 1341, SEQ ID NO: 1342, SEQ ID NO: 1343 y SEQ ID NO: 1344 y además comprende la secuencia de aminoácido de SEQ ID NO: 1319 (GPSSGAPPPS) unida al aminoácido 24 del péptido de la clase 4 se usa para suprimir el apetito e inducir la pérdida de peso/mantenimiento de peso. En algunas realizaciones, el péptido de la clase 4 administrado comprende la secuencia de SEQ ID NO: 1346 o SEQ ID NO: 1347.

Se espera que dichos métodos para reducir el apetito o promover la pérdida de peso sean útiles en la reducción del peso corporal, la prevención del aumento de peso, o el tratamiento de la obesidad por diferentes causas, que incluyen obesidad inducida por fármacos, y la reducción de complicaciones asociadas con la obesidad que incluyen enfermedad vascular (enfermedad de las arterias coronarias, ataque, enfermedad vascular periférica, reperfusión de isquemia, etc.), hipertensión, inicio de diabetes tipo II, hiperlipidemias, y enfermedades musculoesqueléticas .

Los péptidos de la clase 4 de la invención se pueden administrar solos o en combinación con otros agentes antidiabéticos o antiobesidad. Los agentes antidiabéticos conocidos en el arte o que se están investigando incluyen insulina, sulfonilureas , tales como tolbutamida (Orinase) , acetohexamida (Dymelor) , tolazamida (Tolinase) , clorpropamida (Diabinese) , glipizida (Glucotrol) , gliburida (Diabeta, Micronase, Glynase) , glimepirida (Amaryl) , o gliclazida (Diamicron) ; meglitinidas , tales como repaglinida (Prandin) o nateglinida (Starlix) ; biguanidas tales como metformina (Glucophage) o fenformina; tiazolidinadionas tales como rosiglitazona (Avandia) , pioglitazona (Actos) , o troglitazona (Rezulin) , u otros inhibidores de PPARy; inhibidores de alfa glucosidasa que inhiben la digestión de carbohidratos, tales como miglitol (Glyset) , acarbosa (Precose/Glucobay) ; exenatida (Byetta) o pramlintida; inhibidores de Dipeptidil peptidasa-4 (DPP-4) tales como vildagliptina o sitagliptina; inhibidores de SGLT (transportador 1 de glucosa dependiente de sodio); o inhibidores de FBPasa (fructosa 1 , 6-bisfosfatasa) .

Los agentes antiobesidad conocidos en el arte o que se están investigando incluyen supresores del apetito, que incluyen estimulantes de tipo de fenetilamina, fentermina (opcionalmente con fenfluramina o dexfenfluramina) , dietilpropion (Temíate®) , fendimetrazina (Prelu-2®, Bontril®) , benzfetamina (Didrex®) , sibutramina ( eridia®, Reductil®) , rimonabant (Acomplia®) , otros antagonistas de receptor canabinoide; oxintomodulina, clorhidrato de fluoxetina (Prozac) ; Qnexa (topiramato y fentermina) , Excalia (bupropión y zonisamida) o Contrave (bupropión y naltrexona) o inhibidores de lipasa, similares a Xenical (Orlistat) o Cetilistat (también denominada ATL-962 ) , o GT 389-255.

Los péptidos de la clase 4 de la presente invención también se' pueden administrar a pacientes que sufren pérdida catabólica. Se estima que más de la mitad de los pacientes con cáncer experimentan pérdida catabólica que se caracteriza por pérdida de peso no intencional progresiva, debilidad, y baja grasa y músculo corporal. El síndrome es igualmente común en pacientes con SIDA y también puede estar presente en enfermedades bacterianas y parásitas, artritis reumatoide, y enfermedades crónicas del intestino, hígado, pulmones y corazón. También se la asocia habitualmente con la anorexia y puede manifestarse como una condición en el envejecimiento o como resultado de un trauma físico. La pérdida catabólica es un síntoma que disminuye la calidad de vida, empeora la condición subyacente, y es la principal causa de muerte. Los solicitantes anticipan que los péptidos de la clase 4 revelados en la presente se pueden administrar a pacientes para tratar la pérdida catabólica.

Las composiciones farmacéuticas que comprenden los péptidos de la clase 4 revelados en la presente se pueden formular y administrar a pacientes usando portadores farmacéuticamente aceptables estándar y vías de administración conocidas para los expertos en el arte. Por consiguiente, la presente invención también comprende composiciones farmacéuticas que comprenden uno o más de los péptidos de la clase 4 revelados en la presente en combinación con un portador farmacéuticamente aceptable. Las composiciones farmacéuticas pueden comprender péptidos de la clase 4 como el componente farmacéuticamente activo, o los péptidos de la clase 4 se pueden combinar con uno o más agentes activos adicionales. De acuerdo con algunas realizaciones se proporciona una composición que comprende un péptido de la clase 4 de la presente invención y un compuesto que activa el receptor de GLP-1 (tal como GLP-1, análogo de GLP-1, un análogo de exendina 4, o derivados de ellos) . De acuerdo con algunas realizaciones se proporciona una composición que comprende un péptido de la clase 4 de la presente invención e insulina o un análogo de insulina. Alternativamente, se puede proporcionar una composición para inducir la pérdida de peso o prevenir el aumento de peso que comprende la secuencia de SEQ ID NO 1342 que además comprende la secuencia de aminoácido de SEQ ID NO: 1319 (GPSSGAPPPS) unida al aminoácido 24 de SEQ ID NO: 1342, y un péptido antiobesidad. Los péptidos antiobesidad adecuados incluyen aquellos revelados en las patentes estadounidenses 5.691.309, 6.436.435 o en la solicitud de patente estadounidense 20050176643, e incluyen en forma no taxativa GLP-1, GIP (Polipéptido Inhibidor Gástrico), P1, PYY, MC-4, Leptina.

Estructura del péptido de la clase 4 En algunas realizaciones se proporcionan péptidos relacionados con glucagón de la clase 4 en donde el ácido aspártico que normalmente aparece en la posición nueve (de glucagón, EQ ID NO 1301) se ha sustituido con ácido glutámico o un derivado basado en ácido cisteico. Más específicamente, la eliminación del primer aminoácido (des-His) y la sustitución del ácido aspártico en la posición 9 con ácido glutámico, en algunos aspectos, produce un péptido de la clase . Los péptidos relacionados con glucagón de la clase 4 que tiene n sustituyentes de ácido sulfónico sustituidos en la posición 9 del aminoácido de glucagón se comportan en forma similar a los aminoácidos basados en ácido carboxílico pero con pocas diferencias críticas en relación con las propiedades físicas tales como solubilidad. El ácido homocisteico (hCysS03) cuando se sustituye por ácido glutámico isoestérico en la posición nueve en la des-His convencional, el peptido de la clase 4 Glu9 retiene un antagonista parcial y un agonista débil .

En algunas realizaciones se proporciona un peptido de la clase 4 en donde los primeros dos a cinco aminoácidos están removidos, y la posición 9 (de acuerdo con la numeración de SEQ ID NO 1301) está reemplazada con hCys(S03), ácido homoglutámico, ácido ß-homoglutámico, o un derivado de alquildicarboxilato de cisteína que tiene la estructura de En donde X5 es alquilo de Ci-C4, alquenilo de C2-C4, o alquinilo de C2-C4, proporciona un compuesto que se comporta como un antagonista hormonal que es altamente específico, potente y sin propiedades de agonista contaminante.

De acuerdo con algunas realizaciones se proporciona un péptido de la clase 4 que comprende un péptido de glucagón modificado, en relación con la secuencia de tipo silvestre de SEQ ID NO 1301, mediante la eliminación de dos a cinco residuos de aminoácidos del extremo de N y la sustitución del residuo de ácido aspártico en la posición nueve de la proteína nativa con un ácido glutámico, ácido homoglutámico, ácido ß-homoglutámico, un derivado sulfónico de cisteína, o un derivado de alquilcarboxilato de cisteína que tiene la estructura de: En donde X5 es alquilo de Ci-C4, alquenilo de C2-C4, o alquinilo de C2-C4.

En algunas realizaciones específicas, el péptido de la clase 4 que comprende la eliminación de dos a cinco residuos de aminoácidos del extremo de N y la sustitución de la Asp en la posición 9 del glucagón nativo se modifica adicionalmente en hasta tres modificaciones de aminoácido. Por ejemplo, el péptido de la clase 4 puede comprender una, dos, o tres modificaciones de aminoácidos conservadoras. Alternativamente o además, el péptido de la clase 4 puede comprender una o más modificaciones de aminoácidos seleccionadas del grupo formado por: A. sustitución de uno o más aminoácidos en las posiciones 10, 20 y 24 (de acuerdo con la numeración de aminoácido de SEQ ID NO 1301) o el aminoácido de extremo de N o de C del péptido de la clase 4 con un aminoácido unido en forma covalente a un grupo acilo o grupo alquilo a través de una unión de éster, éter, tioéter, amida o alquil amina; B. sustitución de uno o dos aminoácidos en las posiciones 16, 17, 20, 21 y 24 (de acuerdo con la numeración de aminoácido de SEQ ID NO 1301) , en el aminoácido del extremo de N o C del péptido de la clase 4 con un aminoácido seleccionado del grupo formado por Cys, Lys, ornitina, homocisteína, y acetil-fenilalanina (Ac-Phe) , en donde el aminoácido del grupo está unido en forma covalente a un grupo hidrófilo; C. agregado de un aminoácido unido en forma covalente a un grupo hidrófilo al extremo de N o de C del péptido de la clase 4 ; D. sustitución de Asp en la posición 15 (de acuerdo con la numeración de SEQ ID NO 1301) con ácido cisteico, ácido glutámico, ácido homoglutámico y ácido homocisteico; E. sustitución de Ser en la posición 16 (de cuerdo con la numeración de EQ ID NO 1301) con ácido cisteico, ácido glutámico, ácido homoglutámico y ácido homocisteico; F. sustitución con AIB en una o más de las posiciones 17, 20, 21 y 24 de acuerdo con la numeración de aminoácido de SEQ ID NO 1301; G. eliminación del aminoácido en la posición 29 sobre los aminoácidos en las posiciones 28 y 29, de acuerdo con la numeración de SEQ ID NO 1301; H. sustitución de cada uno o ambos de la Asn en la posición 28 y la Thr en la posición 29 (de acuerdo con la numeración de aminoácido de SEQ ID NO 1301) con aminoácidos con carga y/o agregado de uno a dos aminoácidos con carga en el extremo de C de SEQ ID NO 1301; I. sustitución de la Met en la posición 27 (de acuerdo con la numeración de SEQ ID NO 1301) con Leu o norleucina; J. agregado de un péptido que tiene la secuencia de aminoácido de cualquiera de las SEQ ID NOs : 19-21 y 53 al extremo de C de SEQ ID NO: 1301; en donde Thr en la posición 29 (de acuerdo con la numeración de SEQ ID NO: 1301) es Thr o Gly; y K. reemplazo del carboxilato del extremo de C con una amida o éster .

En una realización específica, el péptido de la clase 4 comprende una modificación de aminoácido de A, B o C, descritas anteriormente, o una combinación de ellas. En aún otra realización específica, el péptido de la clase 4 además comprende una modificación de aminoácido de cualquiera de D a K, descritas anteriormente, o una combinación de ellas, además de la modificación (es) de aminoácido de A, B y/o C.

En algunas realizaciones el péptido de la clase 4 comprende un péptido de glucagón, en donde los primeros 5 aminoácidos se han eliminado del extremo de C, y el grupo amino del extremo de C restante se ha reemplazado con un grupo hidroxilo (el "análogo de PLA6") , que produce el péptido de SEQ ID NO 1339. Los solicitantes han descubierto que esa sustitución de ácido fenil-láctico por fenilalanina en análogos del péptido de la clase 4 que tienen los primeros cinco aminoácidos eliminados y sustitución de un ácido glutámico en la posición 9 (en relación con el glucagón nativo) además mejora la potencia de estos análogos de péptido de la clase 4.

En algunas realizaciones el péptido de la clase 4 de SEQ ID NO 1339 se modifica adicionalmente sustituyendo el residuo de ácido aspártico en la posición cuatro (posición 9 del glucagón nativo) con un aminoácido de la estructura general : En donde X6 es alquilo de C1-C3, alqueno de C2-C3 o alquinilo de C2-C3, y en algunas realizaciones X6 es alquilo de Ci-C3/ y en otra realización X6 es alquilo de C2. En algunas realizaciones, el péptido de la clase 4 comprende un peptido de glucagón, en donde los primeros 5 aminoácidos se han eliminado del extremo de N, y el residuo de ácido aspártico en la posición cuatro (posición 9 de glucagón nativo) se ha sustituido con ácido cisteico o ácido homoscisteico . En algunas realizaciones el péptido de la clase 4 comprende un péptido de glucagón que comprende una secuencia de aminoácido del grupo formado por SEQ ID NO: 1339, SEQ ID NO: 1307 y SEQ ID NO: 1308. En algunas realizaciones el péptido de la clase 4 comprende una secuencia de aminoácido seleccionada del grupo formado por SEQ ID NO: 1308, en donde el aminoácido en la posición cuatro es ácido homocisteico .

En otra realización, el péptido de la clase 4 de SEQ ID NO 1339 se modifica adicionalmente sustituyendo el residuo de ácido aspártico en la posición cuatro (posición 9 del glucagón nativo) con ácido glutámico, ácido homoglutámico, ácido beta-homoglutámico, o un derivado de alquildicarboxilato de cisteína que tiene la estructura de: En donde X5 es alquilo de C1-C4, alquenilo de C2-C4, o alquini de C2-C4. En una realización específica, X5 es alquilo de Ci o C2 Sin embargo, los solicitantes han descubierto que con la sustitución de la fenilalanina del extremo de N con PLA en un análogo de desl-5 glucagón (es decir un análogo de glucagón que tiene los primeros cinco aminoácidos eliminados) no se necesita otra sustitución del residuo de ácido aspártico nativo en la posición cuatro (posición 9 del glucagón nativo) para producir un análogo que presenta antagonismo puro. Este resultado es sorprendente a la luz de las enseñanzas del arte previo que el residuo de ácido aspártico nativo en la posición cuatro debe ser sustituido para producir antagonistas de alta afinidad y potentes de análogos de glucagón (2-29) . El uso de la sustitución de PLA mejora la potencia relativa del análogo de Asp9 a un punto comparable a aquel de los análogos de Glu9 y hCys(S03H)9.

La sustitución del residuo de fenilalanina con otros análogos de fenilalanina, que incluyen 3 , 4-2F-fenilalanina (3 , 4 -2F-Phe) , 2-naftialanina (2-Nal) , N-acil -fenilalanina (Ac-Phe) , ácido alfa-metulhidrocinámico (MCA) y ácido bencilmalónico (BMA) no se comportó en forma tan potente como la sustitución de PLA.

La sustitución de PLA en sitios diferentes de la posición sies (de acuerdo con la numeración de aminoácido de glucagón nativo) , que incluye en la posición 4 y 5 revela que el análogo de PLA6 es un antagonista apreciablemente más potente que los análogos de glucagón que tienen un extremo de N ligeramente prolongado. La presente invención también incluye análogos en donde el grupo amino del extremo de N se sustituye con un péptido de "extremo de 0" acilado y alquilado.

Además, la sustitución de PLA6 no solamente aumenta la potencia del antagonista sino que también cumple una función crítica én la pegilación. Los análogos de PLA6 se puede pegilar selectivamente sin restauración del agonismo de glucagón. En la ausencia de la sustitución de PLA, la pegilación del análogo sorpresivamente induce el agonismo de glucagón. Este agonismo de glucagón no se observa en los análogos de PLA6 pegilados. Se investigaron varios sitios para pegilación que incluyen las posiciones 3, 6 y 19 (posiciones 8, 11 y 19 de glucagón nativo) y en el residuo de aminoácido de extremo de N. En algunas realizaciones la pegilación está en la posición 19 (posición 24 de glucagón nativo) ya que ese sitio presenta el antagonismo de glucagón más potente y selectivo.

En algunas realizaciones, el péptido de la clase 4 coprende la estructura general de A-B-C, en donde A se selecciona del grupo formado por : (i) ácido fenil láctico (PLA) , (ii) un derivado de oxi de PLA, (iii) un péptido de 2 a 6 aminoácidos en donde dos aminoácidos consecutivos del péptido se unen a través de un enlace de éster o éter, B representa amioácidos i a 26 de SEQ ID NO 1301, en donde i es 3, 4, 5, 6 o 7, que opcionalmente comprende una o más modificaciones de aminoácido seleccionadas del grupo formado por: (iv) Asp en la posición 9 (de acuerdo con la numeración de aminoácido de SEQ ID NO 1301) se sustituye con una Glu, un derivado de ácido sulfonico de Cys, ácido homoglutámico, ácido ß-homoglutámico o un derivado de alquilcarboxilato de cisteína que tiene la estructura de: donde X5 es alquilo de Ci-C4> alquenilo de C2-C4, o alquinilo C2-C4 (v) sustitución de uno o dos aminoácidos en las posiciones 10, 20 y 24 (de acuerdo con la numeración de aminoácido de SEQ ID NO 1301) con un aminoácido unido en forma covalente a un grupo acilo o alquilo a través de una unión de éster, éter, tioéter, amida, o alquilamina, (vi) sustitución de uno o dos aminoácidos en las posiciones 16, 17, 20, 21 y 24 (de acuerdo con la numeración de aminoácido de SEQ ID NO 1301) con un aminoácido seleccionado del grupo formado por Cys, Lys, ornitina, homocisteína, y acetil-fenilalanina (Ac-Phe) , en donde el aminoácido del grupo está unido en forma covalente a un grupo hidrófilo; (vii) Asp en la posición 15 (de acuerdo con la numeración de SEQ ID NO 1301) se sustituye con ácido cisteico, ácido glutámico, ácido homoglutámico y ácido homocisteico; (viii) Ser en la posición 16 (de acuerdo con la numeración de SEQ ID NO 1301) se sustituye con ácido cisteico, ácido glutámico, ácido homoglutámico y ácido homocisteico (ix) Sustitución con AIB en una o más de las posiciones 16, 20, 21 y 24 de acuerdo con la numeración de aminoácido de SEQ ID NO 1301) , y C se selecciona del grupo formado por: (?) X (xi) X-Y (xii) X-Y-Z, y (xiii) X-Y-Z-R10, En donde X es Met, Leu, o Nle; Y es Asn o un aminoácido con carga; Z es Thr, Gly, Cys, Lys, ornitina (Orn) , homocisteína, acetil fenilalanina (Ac-Phe) , o un aminoácido con carga; en donde RIO se selecciona del grupo formado por SEQ ID NOs : 1319-1321 y 1353; (xiv) Cualquiera de (x) a (xiii) en donde el carboxilato de extremo de c se reemplaza con una amida.

En un aspecto específico, el péptido de la clase 4 coprende un derivado de oxi de PLA. Como se usa en la presente "derivado de oxi de PLA" se refiere a un compuesto que comprende una estructura modificada de PLA en donde el grupo hidroxilo se ha reemplazado con O-Rn, en donde Rn es un grupo químico. Al respecto, el derivado de oxi de PLA puede ser, por ejemplo, un éster de PLA o un éter de PLA.

Los métodos para elaborar derivados de oxi de PLA son conocidos en el arte. Por ejemplo, cuando el derivado de oxi es uñ éster de PLA, el éster se puede formar cuando reacciona el hidroxilo de PLA con un carbonilo que lleva un nucleofilo. El nucleofilo puede ser cualquier nucleofilo adecuado, que incluye en forma no taxativa una amina o hidroxilo. Por consiguiente, el éster de PLA puede comprender la estructura de la Fórmula IV: Fórmula IV En donde R7 es un éster formado al reaccionar el hidroxilo de PLA con un carbonilo que lleva un nucleófilo.

El carbonilo que lleva un nucleófilo (que reacciona con el hidroxilo de PLA para formar un éster) puede ser, por ejemplo, un ácido carboxílico, un derivado de ácido carboxílico, o un éster activado de un ácido carboxílico. El derivado de ácido carboxílico puede ser, en forma no taxativa, un cloruro de acilo, un anhídrido de ácido, una amina, un éster o un nitrilo. El éster activado de un ácido carboxílico puede ser, por ejemplo, N-hidroxisuccinimida (NHS) , tosilato (OT) , una carbodiimida, o un hexafluorofosfato . En algunas realizaciones, la carbodiimida es 1,3-diciclohexilcarbodiimida (DCC) , 1, 1 ' -carbonildiimidazol (CDI) , clorhidrato de l-etil-3 - (3 -dimetilaminopropil) carbodiimida (EDC) , o 1,3-diisopropilcarbodiimida (DICD) . En algunas realizaciones, el hexafluorofosfato se selecciona de un grupo formado por benzotriazol hexafluorofosfato benzotriazol-l-il-oxi-tris (dimetilamino) fosfonio hexafluorofosfato (BOP) , benzotriazol-l-il-oxutripurrolidinofosfonio hexafluorofosfato (PyBOP) , 2-(lH-7-azabenzotriazol-l-il) -1, 1, 3 , 3 -tetrametil uronio hexafluorofosfato (Hatu) , y o-benzotriazol-N, N, N ' , ' -tetrametil-uronio-hexafluoro-fosfato (hbtu) .

Los métodos para preparar éteres a partir de la reacción con un grupo hidroxilo (por ejemplo, el hidroxilo de PLA) también son conocidos en el arte. Por ejemplo, el grupo hidroxilo de PLA puede reaccionar con un alcohol de alquilo halogenado o alquilo tosilado para formar un enlace de éter.

Generalmente, el grupo químico de Rn es aquel que no reduce la actividad del péptido de la clase 4. En algunas realizaciones, el grupo químico mejora la actividad, estabilidad, y/o solubilidad del péptido de la clase 4.

En una realización, el grupo químico unido a PLA a través de un enlace que contiene oxígeno (por ejemplo a través de un enlace de éster o éter) es un polímero (por ejemplo, un polialquilenglicol) , un carbohidrato, un aminoácido, un péptido, o un lípido, por ejemplo, un ácido graso o un esteroide .

En una realización específica, el grupo químico es un aminoácido, que, opcionalmente , es una parte de un péptido, de manera tal que la Fórmula IV sea un depsipéptido . Al respecto, PLA puede ser una posición diferente del residuo de aminoácido del extremo de N del péptido de la clase 4, de manera tal que el péptido de la clase 4 comprende uno o más (por ejemplo 1, 2, 3, 4, 5, 6, O más) aminoácidos del extremo de N al residuo de PLA. Por ejemplo, el péptido de la clase 4 puede comprender PLA en una posición n, en donde n es 2, 3, 4, 5, o 6 del péptido de la clase 4.

Los aminoácidos del extremo de N al residuo de PLA pueden ser sintéticos o naturales. En una realización específica, los aminoácidos que son PLA de extremo de N son aminoácidos naturales. En algunas realizaciones, los aminoácidos que son de extremo de N a PLA son los aminoácidos de extremo de N de glucagon nativo. Por ejemplo, el péptido de la clase 4 puede comprender en el extremo de N de la secuencia de aminoácido de cualquiera de SEQ ID NO 1354-1358, en donde PLA está unido a treonina a través de un enlace de éter: SEQ ID NO: 1354His-Ser-Gln-Gly-Thr-PLA SEQ ID NO: 1355 Ser-Gln-Gly-Thr-PLA SEQ ID NO: 1356 Gln-Gly-Thr-PLA SEQ ID NO: 1357 Gly-Thr-PLA SEQ ID NO: 1358 Thr-PLA En una realización alternativa, uno o más de los aminoácidos del extremóte N se puede sustituir con un aminoácido diferente del aminoácido de glucagon antivo. Por ejemplo, cuando el péptido de la clase 4 comprende PLA en el aminoácido en la posición 5 o 6, el aminoácido en la posición 1 y/o posición 2 puede ser un aminoácido que reduce la susceptibilidad de descomposición por dipeptidil peptidasa IV. Más específicamente, en algunas realizaciones, la posición 1 en el péptido de la clase 4 es un aminoácido seleccionado del grupo formado por D-histidina, ácido alfa, alfa-dimetil imidiazol acético (DMIA) , N-metil histidina, alfa-metil histidina, ácido imidazol acético, desaminohistidina, hudroxul-histidina, acetil -histidina y homo-histidina . Más específicamente, en algunas realizaciones, la posición 2 del péptido de antagonista es un aminoácido seleccionado del grupo formado por D-serina, D-alanina, valina, glicina, N-metil serina, N-metil alanina, y ácido aminoisobutírico (AIB) . Además, por ejemplo, cuando el péptido de la clase 4 coprende PLA como el aminoácido en la posición 4, 5, o 6, el aminoácido en la posición 3 del péptido de la clase 4 puede ser ácido glutámico por oposición al residuo de glutamina nativo de glucagón nativo. En un ejemplo de la realización de la invención, el péptido de la clase 4 en el extremo de M de la secuencia de aminoácido de cualquiera de SEQ ID NOs: 1359-1361.

Con respecto a los péptidos de la clase 4 que comprenden un compuesto de la Fórmula IV, el polímero puede ser cualquier polímero, siempre que pueda reaccionar con el grupo hidroxilo de PLA. El polímero puede ser uno que naturalmente o normalmente comprende un carbonilo que lleva un nucleofilo. Alternativamente, el polímero puede ser uno que se obtuvo para comprender el carbonilo que lleva el carbonilo. El polímero puede ser un polímero derivado de cualquiera de: poliamidas, policarbonatos , polialquilenos y derivados de ellos que incluyen polialquilenglicoles , óxidos de polialquileno, tereftalatos de polialquileno, polímeros de esteres acrílicos y metacrílicos, que incluyen poli (metil metacrilato) , poli (etil metacrilato) , poli (butilmetacrilato) , poli (isobutil metacrilato), poli (hexilmetacrilato) , poli (isodecil metacrilato), poli (lauril metacrilato), poli(fenil metacrilato), poli (metil acrilato) , poli (isopropil acrilato) , poli (isobutil acrilato) , y poli (octadecil acrilato) , polímeros de polivinilol que incluyen alcoholes polivinílicos , éteres de polivinilo, ésteres de polivinilo, haluros de polivinilo, poli(vinil acetato), y polivinilpirrolidona, poliglicolidos , polisiloxanos , poliuretanos y copolímeros de ellos, celulosas que incluyen alquil celulosa, hidroxialauil celulosas, éteres de celulosa, ésteres de celulosa, nitro celulosas, metil celulosa, etil celulosa, hidroxipropil celulosa, hidroxi-propil metil celulosa, hidroxibutil metil celulosa, acetato de celulosa, propionato de celulosa, butirato de acetato de celulosa, ftalato de acetato de celulosa, carboxiletil celulosa, triacetato de celulosa, y sal de sodio de sulfato de celulosa, polipropileno, polietilenos que incluyen poli (etilenglicol) , poli (etilenóxido) , y poli (etilen tereftalato) , y poliestireno .

El polímero puede ser un polímero biodegradable, que incluye un polímero biodegradable sintético (por ejemplo polímeros de ácido láctico y ácido glicólico, polianhídridos , poli (orto) ésteres , poliuretanos , poli (ácido bútico) , poli (ácido valérico) , y poli (lactida-cocaprolactona) ) , y un polímero biodegradable natural (por ejemplo, alginato y otros polisacáridos que incluyen dextrano y celulosa, colágeno, derivados químicos de ellos (sustituciones, agregados de grupos químicos, por ejemplo, alquilo, alquileno, hidroxilaciones , oxidaciones, y otras modificaciones realizadas en forma rutinaria por los expertos en el arte) , albúmina y otra proteínas hidrófilas (por ejemplo, zeina y y otras prolaminas y proteínas hidrófilas) ) , así como cualquier copolímero o mezcla de ellos. En general, estos materiales se degradan con la hidrólisis o exposición enzimática a agua in vivo, con la erosión superficial o global.

El polímero puede ser un polímero bioadhesivo tal como un hidromel biodegradable descrito por H. S. Sawhney, C. P. Pathak and J. A. Hubbell in Macromolecules , 1993, 26, 581-587, cuyas enseñanzas se incorporan en la presente como referencia, ácidos polihialurónicos , caseína, gelatina, glutina, polianhídridos , ácido poliacrílico, alginato, quitosano, poli(metil metacrilatos) , poli(etil metacrilatos) , poli (butilmetacrilato) , poli (isobutil metacrilato) , poli (hexilmetacrilato) , poli (isodecil metacrilato) , polidauril metacrilato), poli(fenil metacrilato), poli (metil acrilato) , poli (isopropil acrilato) , poli (isobutil acrilato) , y poli (octadecil acrilato).

En algunas realizaciones, el polímero es un polímero soluble en agua. Los polímeros solubles en agua adecuados son conocidos en el arte e incluyen, por ejemplo, polivinilpirrolidona, hidroxipropil celulosa (HPC; Klucel) , hidroxipropil metilcelulosa (HPMC; Methocel) , nitrocelulosa, hidroxipropil etilcelulosa, hidroxipropil butilcelulosa, hidroxipropil pentilcelulosa, metil celulosa, etilcelulosa (Ethocel), hidroxietil celulosa, diferentes alquil celulosas e hidroxialquil celulosas, diferentes éteres de celulosa, acetato de celulosa, carboximetil celulosa, sodio carboximetil celulosa, calcio carboximetil celulosa, copolímeros de acetato de vinilo/ácido crotónico, poli-hidroxialquil metacrilato, hidroximetil metacrilato, copolímeros de ácido metacrílico, ácido polimetacrílico, polimetilmetacrilato, copolímeros de anhídrido maleico/éter de metil vinilo, alcohol polivinílico, ácido poliacrílico de sodio y calcio, ácido poliacrílico, polímeros de carboxi ácido, carboxipolimetileno, polímeros de carboxivinilo, copolímero de polioxietileno polioxipropileno, polimetilviniléter con anhídrido maleico, carboximetilamida, copolímero de metacrilato potasio divinilbenceno, polioxietilenglicoles , óxido de polietileno, y derivados, sales y combinaciones de ellos.

En una realización específica, el polímero es un polialquilenglicol que incluye por ejemplo polietilenglicol (PEG) El carbohidrato puede ser cualquier carbohidrato siempre que comprenda o esté elaborado de manera que comprenda un carbonilo con un grupo saliente alfa. El carbohidrato, por ejemplo, puede ser uno que se ha derivado para comprender un carbonilo con un grupo saliente alfa. Al respecto, el carbohidrato puede ser una forma derivada de un monosacárido (por ejemplo, glucosa, galactosa, fructosa) , un disacárido (por ejemplo, sacarosa, lactosa, maltosa), un oligosacáridos (por ejemplo, rafinosa, estaquiosa) , un polisacárido (un almidón, amilasa, amilopectina, celulosa, quitina, calosa, laminarían, xilano, mañano, fucoidan, galactomanano) .

Con respecto a los péptidos de la clase 4 que comprenden un compuesto de la Fórmula IV el lípido puede ser cualquier lípido que comprende un carbonilo con un grupo saliente alfa. El lípido, por ejemplo, puede ser uno que deriva para comprender el carbonilo. Al respecto, el lípido puede ser un derivado de un ácido graso (por ejemplo, un ácido graso de C4-C30, eicosanoide, prostaglandina, leucotrieno, tromboxano, N-acil etanolamina) , glicerolípido (por ejemplo, gliceroles mono-, di-, tri-substituidos) , glicerofosfolípido (por ejemplo, fosfatidilcolina, fosfatidilinositol , fosfatidiletanolamina, fosfatidilserina) , esfingolípido (por ejemplo, esfingosina, ceramida) , lípido de esterol (por ejemplo, esteroide, colesterol) , lípido de prenol, sacarolípido, o una policetida, aceite, cera, colesterol, esterol, vitamina soluble en grasa, monoglicérido, diglicérido, triglicérido, un fosfolípido.

En algunas realizaciones, R7 tiene un peso molecular de 100 kDa o menos, por ejemplo de 90 kDa o menos, 80 kDa o menos, 70 kDa o menos, 60 kDa o menos, 50 kDa o menos, 40 kDa o menos. Por consiguiente, R7 puede tener un peso molecular de 35 kDa o menos, 30 kDa o menos, 25 kDa o menos, 20 kDa o menos, 15 kDa o menos, 10 kDa o menos, 5 kDa o menos, o 1 kDa.

En una realización alternativa, el péptido de la clase 4 comprende como A, un péptido de 2 a 6 aminoácidos en donde dos aminoácidos consecutivos del péptido están unidos a través de un enlace de éster o éter. El enlace de éster o éter puede estar, por ejemplo, entre los aminoácidos 2 y 3, 3 y 4, 4 y 5 o 5 y 6. Opcionalmente, el péptido puede modificarse adicionalmente mediante la unión covalente a otro grupo químico que incluye la unió a un polímero (por ejemplo, un polímero hidrófilo) , alquilación, o acilación.

Con respecto al péptido de la clase 4 que comprende la estructura general A-B-C, B representa aminoácidos de glucagón nativo, por ejemplo, i a 26 de SEQ ID NO 1301, en donde i es 3, 4, 5, 6, o 7, que opcionalmente comprende una o más modificaciones de aminoácido. En una realización específica, B representa aminoácidos 7 a 26 de SEQ ID NO 1201, opcionalmente también modificados .

En algunas realizaciones, B se modifica con hasta tres modificaciones de aminoácido. Por ejemplo B que representa la secuencia de aminoácido nativo de SEQ ID NO 1301 se modifica con una o más modificaciones de aminoácido conservadoras.

En otra realización, B comprende una o más modificaciones de aminoácido conservadoras seleccionadas del grupo formado por (iv) a (ix) , descritas anteriormente. En una realización específica, B comprende una o ambas modificaciones de aminoácido (v) y (vi) . En otra realización específica, B comprende una o una combinación de modificaciones de aminoácido seleccionadas del grupo formado por (iv) , (vii) , (viii) , y (ix) además de (v) y (vi) .

En otra realización específica, el péptido de la clase 4 comprende uno o más aminoácidos con carga en el extremo de C. Por ejemplo, Y y/o Z pueden ser un aminoácido con carga, por ejemplo, Lys, Arg, His, Asp y Glu. En aún otra realización el péptido de la clase 4 comprende un a dos aminoácidos con carga (por ejemplo, Lys, Arg, His, Asp, y Glu) del extremo de C a Z . En una realización específica Z seguido por uno a dos aminoácidos con carga no comprende RIO.

El péptido de la clase 4 en algunas realizaciones comprende un grupo hidrófilo unido en forma covalente a un residuo de aminoácido del péptido de la clase 4, descrito en la presente. Por ejemplo, el péptido de la clase 4 puede comprender un grupo hidrófilo unido en forma covalente a un aminoácido en la posición 1, 16, 20, 21 o 24 de acuerdo con la numeración de SEQ ID NO 1301. En otra realización, el grupo hidrófiloestá unido a un aminoácido del extremo de C del péptido de la clase 4, que en algunos casos, es 1 u 11 aminoácidos del extremo de C a Z. en aún otra realización el grupo hidrófilo está unido a PLA, cuando A es PLA, PLA-Phe, o PLA-Thr-Phe , en donde PLA está modificado para comprender el grupo hidrófilo. En otra realización, no se agrega ningún aminoácido que comprende un grupo hidrófilo al extremóte N o de C del péptido de la clase 4. En otra realización, el péptido de la clase 4 comprende un grupo acilo o un grupo alquilo como se describe en la presente. Por ejemplo, la acilación o alquilación puede ocurrir fuera de la cadena lateral del aminoácido en la posición 10, 20, o 24, de acuerdo con la numeración de SEQ ID NO 1301. En una realización alternativa, la acilación o alquilación ocurre fuera de la cadena lateral del aminoácido del extremo de C del péptido de la clase 4, que en algunos casos es el extremo de C de 1 u 11 aminoácidos a Z. En aún otra realización, cuando A es PLA, PLA-Phe, 0 PLA-Thr-Phe, PLA se modifica para comprender un grupo acilo o alquilo.

Ejemplos de realizaciones El péptido de la clase 4 puede comprender cualquier aminoácido, sintético o natural, siempre que por lo menos dos aminoácidos consecutivos del péptido estén unidos a través de un enlace de éster o éter. En una realización específica, el péptido comprende aminoácidos de glucagón nativo. Por ejemplo, el péptido puede comprender j a 6 de glucagón nativo (SEQ ID NO 1301) , en donde j es l, 2, 3, 4, o 5. Alternativamente, el péptido puede comprender una secuencia de aminoácido basada en el extremo de N de SEQ ID NO 1301, con una o más modificaciones de aminoácido. El aminoácido en la posición 1 y/o posición 2 puede ser un aminoácido que reduce la susceptibilidad de descomposición por dipeptidil peptidasa IV. Por ejemplo, el péptido puede comprender en la posición 1 del péptido de la clase 4 un aminoácido seleccionado del grupo formado por D-histidina, ácido alfa, alfa-dimetil imidazol acético (DMIA) , N-metil histidina, alfa-metil histidina, ácido imidazol acético, desaminohistidina, hidroxil-histidina, acetil-histidina y homo-histidina . Más específicamente, en algunas realizaciones, la posición 2 del péptido de antagonista es un aminoácido seleccionado del grupo formado por D-serina, D-alanina, valina, glicina, N-metil serina, N-metil alanina, y ácido aminoisobutírico (AIB) . Además, por ejemplo, el aminoácido en la posición 3 del péptido de la clase 4 puede ser ácido glutámico en el residuo de glutamina nativa de glucagón nativo. Por consiguiente, el péptido de la clase 4 puede comprender una secuencia de aminoácido de: Xaa!-Xaaz-Xaas-Thr-Gly-Phe (SEQ ID NO: 1368); Xaa2-Xaa3-Thr-Gly-Phe (SEQ ID NO: 1369) ; o Xaa3-Thr-Gly-Phe (SEQ ID NO: 1370); En donde Xaax se selecciona del grupo formado por: His, D-histidina, ácido alfa, alfa-dimetil imidazol acético (DMIA) , N-metil histidina, alfa-metil histidina, ácido imidazol acético, desaminohistidina, hidroxil-histidina, acetil-histidina y homo-histidina; Xaa2 se selecciona del grupo formado por: Ser, D-serina, D-alanina, valina, glicina, N-metil serina, N-metil alanina, y ácido aminoisobutírico (AIB) ,· y Xaa3 es Gln o Glu.

La presente invención también comprende realizaciones en donde el aminoácido de extremo de C de los péptidos de la clase 4 tiene un grupo amida que sustituye al grupo ácido carboxílico que está presente en el aminoácido nativo.

En algunas realizaciones en donde el péptido de la clase 4 está PEGilado el péptido de la clase 4 comprende los péptidos de glucagón acortados, específicamente 6-29 en donde el aminoácido de "extremo de N" es PLA (ácido fenil- láctico) . Dichos derivados de glucagón presentan virtudes únicas. Son péptidos más potentes que aquellos con la fenilalanina del extremo de N nativo y suprimen todos los agonistas de glucagón que derivan de la pegilación, algo que no se observa con la fenilalanina nativa. Finalmente si bien la bibliografía actual establece que se necesita una sustitución del ácido aspártico nativo en la posición 9 para la actividad de antagonista, los solicitantes han descubierto el sorprendente resultado de que dicha sustitución ya no es necesaria en los análogos de glucagón de PLA6- (6-29) .

En algunas realizaciones un aminoácido del péptido de la clase 4 se sustituye con por lo menos un residuo de cisteína, en donde la cadena lateral del residuo de cisteína se modifica adicionalmente con un reactivo de tiol, que incluye por ejemplo, maleimido, vinil sulfone, 2-piridiltio, haloalquilo, y haloacilo. Estos reactivos pueden contener carboxi, ceto, hidroxilo y otros grupos así como otros grupos hidrófilos tales como unidades de polietilenglicol . En una realización alternativa, un aminoácido del péptido de la clase 4 se sustituye con lisina y la cadena lateral del residuo de lisina sustituyente se modifica adicionalmente usando reactivos de amina tales como ésteres (succinimido, anhídrido, etc) de ácidos carboxílicos o aldehidos de grupos hidrófilos tales como polietilengicol . De acuerdo con algunas realizaciones el residuo de lisina que corresponde a la posición 12 del péptido nativo se sustituye con arginina y una sola sustitución de lisina se inserta por uno de los aminoácidos que corresponden a la posición 1, 16, 17, 20, 21, 24 o 29 del péptido nativo, o se agrega una lisina al extremo de N o C del péptido de la clase 4.

En otra realización el residuo de metionina que corresponde a la posición 27 del péptido nativo se cambia por leucina o norleucina para prevenir la degradación oxidativa del péptido.

En algunas realizaciones los péptidos de la clase 4 descritos en la presente se modifican adicionalmente truncando o eliminando uno o dos aminoácidos del extremo de C del péptido de glucagón (es decir, truncado del aminoácido en la posición 29 o en la posición 28 y 29 del glucagón nativo) sin afectar la actividad y/o la potencia en el receptor de glucagón. Al respecto, el péptido de glucagón de la clase 4 descrito en la presente puede, por ejemplo, comprender esencialmente o comprender los aminoácidos 1-27, 1-28, 2-27, 2-28, 3-27, 3-28, 4-27, 4-28, 5-27, 5-28, 6-27, o 6-28 del péptido de glucagón nativo (SEQ ID NO 1301) con una o más modificaciones que derivan en la actividad de péptido de la clase 4 descrita en la presente.

El péptido de la clase 4 revelado en la presente también comprende sustituciones de aminoácidos en las posiciones que se sabe que no son críticas para la función del péptido de glucagón. En algunas realizaciones las sustituciones son sustituciones de aminoácido conservadoras en una, dos o tres posiciones seleccionadas del grupo formado por 2, 5, 6, 7, 8, 9, 12, 13, 14, 15, 16, 19, 22, 23 O 24 de SEQ ID NO: 1339. En algunas realizaciones el péptido de la clase 4 comprende un péptido derivado de SEQ ID NO 1342 en donde el péptido de glucagón comprende otra sustitución de amioácido en realción con SEQ ID NO 1342 en una a tres posiciones de aminoácido seleccionadas de las posiciones 2, 5, 6, 8, 9, 12, 13 y 14. En algunas realizaciones las sustituciones en las posiciones 2, 5, 6, 8, 9, 12, 13 y 14 de SEQ ID NO: 1342 son sustituciones de aminoácido conservadoras. En algunas realizaciones, los aminoácidos correspondientes a las posiciones 16, 17, 20, 21, 24 o 29 del péptido nativo, y más particularmente en la posición 21 y/o 24 se sustituyen con cisteína o lisina, en donde una cadena de PEG está unida en forma covalente al residuo de cisteína o lisina sustituido.

De acuerdo con algunas realizaciones el péptido de la clase 4 modificado comprende dos o más cadenas de polietilenglicol unidos en forma covalente al péptido en donde el peso molecular total de las cadenas de glucagón es de 1.000 a 5.000 Dalton. En algunas realizaciones el péptido de la clase 4 pegilado comprende un péptido seleccionado del grupo formado por SEQ ID NO: 1312, y SEQ ID NO: 1322 en donde dicho péptido comprende una cadena de polietilenglicol unida al aminoácido en la posición 11 y 19 y el peso molecular combinado de las dos cadenas de PEG es de 1.000 a 5.000 Dalton.

De acuerdo con algunas realizaciones se proporciona un péptido de la clase 4 que comprende un péptido de glucagón modificado seleccionado del grupo formado por: Ri-Phe-Thr-Ser-Xaa-Tyr-Ser-Xaa-Tyr-Leu-Xaa-Xaa-Arg-Arg-Ala-Gln-Asp-Phe-Val-Gln-Trp-Leu- Xaa-Asn-Thr-R2 (SEQ ID NO: 1309) , Rx-Phe-Thr-Ser-Xaa-Tyr-Ser-Xaa-Tyr-Leu-Asp-Ser-Arg-Arg-Ala-Gln-Xaa-Phe-Val-Gln-Trp-Leu- Xaa-Asn-Thr-R2 (SEQ ID NO: 1310) , Ri-Phe-Thr-Ser-Xaa-Tyr-Ser-Xaa-Tyr-Leu-Asp-Ser-Arg-Arg-Ala-Gln-Asp-Phe-Val-Xaa-Trp-Leu-Xaa-Asn-Thr-R2 (SEQ ID NO: 1311) y Ri-Phe- Thr-Ser-Xaa-Tyr-Ser-Xaa-Tyr-Leu-Asp-Ser- Arg-Arg-Ala-Gln-Xaa-Phe-Val-Xaa-Trp-Leu- Xaa-Asn-Thr-R2 (SEQ ID NO: 1312) , En donde Xaa en la posición 4 = ácido aspártico, ácido glutámico, ácido cisteico o ácido homocisteico, Xaa en la posición 7 = Lys o Arg, Xaa en la posición 10 es ácido aspártico, ácido cisteico, ácido glutámico, ácido homogluámico y ácido homocisteico; Xaa en la posición 11 is Ser, Lys, Cys, Orn, homocisteín o acetil fenilalanina, Xaa en la posición 16 es Asp, Lys, Cys, Orn, homocisteína o acetil fenilalanina y Xaa en la posición 19 es Gln, Lys, Cys, Orn, homocisteína y acetil fenilalanina, Xaa en la posición 22 = Met, Leu o Nle, Ri es OH o NH2, y R2 es COOH o CONH2, en donde el péptido está pegilado en la posición 11 para SEQ ID NO: 1309, en la posición 16 para SEQ ID NO: 1310, posición 19 para SEQ ID NO: 1311 y en las posiciones 16 y 19 de SEQ ID NO: 1312, con la condición de que cuando Xaa en la posición 4 = ácido aspártico entonces Ri es OH. De acuerdo con algunas realizaciones el péptido comprende la secuencia de SEQ ID NO: 1309, SEQ ID NO: 1310 o SEQ ID NO: 1311, en donde Ri es OH y R2 es C0NH2. De acuerdo con algunas realizaciones el péptido comprende la escuencia de SEQ ID NO: 1309, SEQ ID NO: 1310 o SEQ ID NO: 1311, en donde Ri es OH, R2 es CONH2 y el aminoácido en la posición 4 es ácido aspártico, y en otra realización dicho péptido comprende una prolongación del extremo de carboxi que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 1319.

De acuerdo con algunas realizaciones el péptido comprende una secuencia seleccionada del grupo formado por SEQ ID NO: 1309, SEQ ID NO: 1310, SEQ ID NO: 1313, SEQ ID NO: 1314, y SEQ ID NO: 1316, en donde el péptido está pegilado en la posición 11 para SEQ ID NO: 1309 y SEQ ID NO: 1313, pegilado en la posición 16 para SEQ ID NO: 1310, y pegilado en la posición 19 para SEQ ID NO: 1310 y SEQ ID NO: 1314. En algunas realizaciones el agonista de glucagón comprende el péptido de SEQ ID NO: 1313 o SEQ ID NO: 1314. En algunas realizaciones el aminoácido del extremo de C de los péptidos de la clase 4 revelados en la presente tienen un grupo amida en lugar del grupo ácido carboxílico que está presente en el aminoácido nativo. De acuerdo con algunas realizaciones el péptido de la clase 4 comprende la secuencia de SEQ ID NO: 1318.

De acuerdo con algunas realizaciones se proporciona un péptido de la clase 4 en donde una proteína de plasma se ha unido en forma covalente a una cadena lateral de aminoácido del péptido para mejorar la solubilidad, estabilidad y/o farmcocinética del péptido de glucagón. Por ejemplo, albúmina de suero puede estar unida en forma covalente a los péptidos de la clase 4 presentados en la presente. En algunas realizaciones la proteína de plasma está unida en forma covalente a un aminoácido que corresponde a la posición 16, 17, 20, 21, 24 o 29 del péptido de glucagón nativo. Más específicamente en algunas realizaciones la proteína de plasma está unida a un aminoácido que corresponde a la posición 16 o 24 del péptido de glucagón nativo, en donde el péptido de la clase 4 comprende la secuencia de SEQ ID NO: 1303, SEQ ID NO: 1304, SEQ ID NO: 1305, SEQ ID NO: 1306, SEQ ID NO: 1307, SEQ ID NO: 1308, SEQ ID NO: 1309, SEQ ID NO: 1311, SEQ ID NO: 1312, SEQ ID NO: 1322, SEQ ID NO: 1323, SEQ ID NO: 1324, SEQ ID NO: 1325, SEQ ID NO: 1326, SEQ ID NO: 1327, SEQ ID NO: 1328, SEQ ID NO: 1336 y SEQ ID NO: 1339. En algunas realizaciones el péptido de la clase 4 comprende un péptido seleccionado del grupo formado por SEQ ID NO: 1309, SEQ ID NO: 1310, SEQ ID NO: 1311 y SEQ ID NO: 1312.

De acuerdo con algunas realizaciones se proporciona un péptido de la clase 4 en donde una secuencia de aminoácido lineal que corresponde a la parte de Fe de una molécula de inmunoglobulina se ah unido en forma covalente a una cadena lateral de aminoácido del péptido de la clase 4 revelado en la presente para mejorar la solubilidad, estabilidad y/o farmacocinética del péptido de glucagón. Por ejemplo, la secuencia de aminoácido que representa la parte de Fe de una molécula de inmunoglobulina se puede unir en forma covalente a la posición 11, 12, 15, 16, 19, 21 o 24 del péptido de glucagón de SEQ ID NO: 1307, SEQ ID NO: 1339, o un análogo de él. En algunas realizaciones el péptido de Fe está unido en forma covalente a la posición 11 o 19 del péptido de la Clase 4 de SEQ ID NO: 1306, SEQ ID NO: 1307, SEQ ID NO: 1308 O SEQ ID NO: 1336. La parte de Fe generalmente se aisla de IgG pero el fragmento de péptido de Fe de cualquier inmunoglobulina debe funcionar en forma equivalente. En algunas realizaciones el péptido de glucagón se selecciona del grupo formado por SEQ ID NO: 1303, SEQ ID NO: 1304, SEQ ID NO: 1305, SEQ ID NO: 1307 SEQ ID NO: 1308, y SEQ ID NO: 1339, en donde la parte de Fe está unida a la posición correspondiente de 16, 17, 20, 21, 24 o 29 del péptido de glucagón nativo. En algunas realizaciones el péptido de la clase 4 comprende un péptido de glucagón seleccionado del grupo formado por SEQ ID NO: 1309, SEQ ID NO: 1310, SEQ ID NO: 1311 y SEQ ID NO: 1312, en donde el péptido de Fe está unido a la cadena lateral del aminoácido ubicado en la posición 11, 16 o 19 de SEQ ID NO: 1309, SEQ ID NO: 1310, SEQ ID NO: 1311, respectivamente, y en ambas posiciones 11 y 19 para SEQ ID NO: 1312.

En algunas realizaciones de la invención el péptido de la clase 4 comprende la secuencia de aminoácido de cualquiera de SEQ ID NOs : 1362, 1364-1367, y 1371.

Modificaciones para mejorar la solubilidad Los péptidos de la clase 3 se pueden modificar adicionalmente para mejorar la solubilidad del péptido en soluciones acuosas a pH fisiológico, mientras que en algunos aspectos retiene la actividad de un antagonista de glucagón. La introducción de grupos hidrófilos en posiciones que corresponden a las posiciones 1, 16, 17, 20, 21, 24 y 29 del péptido nativo, o en el extremo de C, pueden mejorar la solubilidad del péptido de la clase 4 resultante en soluciones que tienen un pH fisiológico, mientras mantiene el porcentaje de actividad de los compuestos antagonistas. En consecuencia, en algunas realizaciones los péptidos de la clase 4 revelados en la presente se modifican adicionalmente para comprender uno o más grupos hidrófilos unidos en forma covalente a cadenas laterales de aminoácidos correspondientes a posiciones de aminoácidos 1, 16, 17, 20, 21, 24 y 29 del péptido de glucagón nativo o del aminoácido del extremo de N o C . En otra realización las cadenas laterales de aminoácidos correspondientes a las posiciones de aminoácidos 16 y 24 del péptido de glucagón nativo están unidas en forma covalente a grupos hidrófilos y en algunas realizaciones el grupo hidrófilo es polietilenglicol (PEG) .

Los solicitantes también han descubierto que el glucagón nativo se puede modificar introduciendo una carga en su extremo de carboxi para mejorar la solubilidad del péptido mientras retiene las propiedades de agonistas del péptido. La solubilidad mejorada permite la preparación y el almacenamiento de soluciones de glucagón cerca del pH neutro. La formulación de soluciones de glucagón a pH relativamente neutros (por ejemplo el pH de 6,0 a 8,0) mejora la estabilidad prolongada de los péptidos de la clase 4.

Nuevamente, los solicitantes anticipan que los péptidos de la clase 4 revelados en la presente se pueden modificar en forma similar para mejorar su solubilidad en soluciones acuosas a pH relativamente neutro (por ejemplo, pH de 6,0 a 8,0) mientras retiene las propiedades de antagonistas de la proteína parental . Por consiguiente, algunas realizaciones de la presente invención se refiere a un péptido de la clase 4 de SEQ ID NO 1339 que se ha modificado también en relación con los aminoácidos nativos presentes en las posiciones 29 del glucagón de tipo silvestre (SEQ ID NO 1301) para agregar la carga al péptido mediante la sustitución de aminoácidos nativos sin carga con aminoácidos con carga, o el agregado con carga al extremo de carboxi . De acuerdo con algunas realizaciones, uno a tres de los aminoácidos nativos sin carga del péptido de la clase 4 de SEQ ID NO 1339 se reemplazan con un aminoácido con carga. En algunas realizaciones el aminoácido con carga se selecciona del grupo formado por lisina, arginina, histidina, ácido aspártico y ácido glutámico.

Más específicamente, los solicitantes han descubierto que la sustitución de aminoácidos normales en la posición 28 y/o 29 correspondiente en relación con glucagón nativo con aminoácidos con carga, y/o el agregado de uno o dos aminoácidos con carga en el extremo de carboxi del péptido de la clase 4, mejora la solubilidad y la estabilidad de péptidos de la clase 4 en soluciones acuosas pH fisiológicamente relevantes (es decir, a pH de 6,5 a 7,5) . Por consiguiente, se anticipa que dichas modificaciones del péptido de la clase 4 revelado en la présente tienen un efecto similar sobre la solubilidad en soluciones acuosas, específicamente a pH en la gama de 5,5 a 8,0 mientras que retiene la actividad biológica del péptido parental .

De acuerdo con algunas realizaciones el péptido de la clase 4 de SEQ ID NO 1339 se modifica mediante la sustitución del aminoácido nativo en la posición 28 y/o 29 correspondientes en relación con el glucagón nativo con un aminoácido con carga negativa ' (por ejemplo, ácido aspártico o ácido glutámico) y opcionalmente el agregado de un aminoácido con carga negativa (por ejemplo, ácido aspártico o ácido glutámico) al extremo de carboxi del péptido. En una realización alternativa el péptido de la clase 4 de SEQ ID NO 1339 se modifica mediante la sustitución del aminoácido nativo en la posición 29 correspondiente en relación con el glucagón nativo con un amioácido con carga positiva (por ejemplo, lisina, arginina o histidina) y opcionalmente el agregado de uno o dos aminoácidos con carga positiva (por ejemplo, lisina, arginina, o histidina) o el extremo de carboxi del péptido. De acuerdo con algunas realizaciones se proporciona un péptido de la clase 4 que tiene solubilidad y estabilidad mejorada en donde el péptido comprende la secuencia de aminoácido de SEQ ID NO 1341 con la condición de que por lo menos un aminoácido en la posición 23, o 24 de SEQ ID NO 1341 se sustituye con un aminoácido ácido y/o un aminoácido ácido adicional se agrega en el extremo de carboxi de SEQ ID NO 1341. En algunas realizaciones los aminoácidos ácidos se seleccionan independientemente del grupo formado por Asp, Glu, ácido cisteico y ácido homocisteico .

De acuerdo con algunas realizaciones se proporciona un péptido de la clase 4 que mejora la solubilidad y estabilidad en donde el antagonista comprende la secuencia de aminoácido de SEQ ID NO SEQ ID NO: 1341, SEQ ID NO: 1342, SEQ ID NO: 1343 o SEQ ID NO: 1344, en donde por lo menos uno de los aminoácidos en las posiciones 23 o 24 se sustituye con un residuo de aminoácido no nativo (es decir por lo menos un aminoácido presente en la posición 23 o 24 del análogo es un aminoácido ácido diferente del aminoácido presente en la posición correspondiente en SEQ ID NO 1307) . De acuerdo con algunas realizaciones se proporciona un agonista de glucagón que comprende la secuencia de SEQ ID NO 1341 o 1342 con la condición de que cuando el aminoácido en la posición 23 es asparagina y el aminoácido en la posición 24 es treonina, el péptido también comprende uno o dos aminoácidos, seleccionado independientemente del grupo formado por Lys, Arg, His, Asp o Glu, agregado al extremo de carboxi del péptido de la clase 4.

En otras realizaciones la solubilidad del péptido de la clase 4 de SEQ ID NO 1342 se puede mejorar uniendo en forma covalente un grupo hidrófilo a un residuo de aminoácido en la posición 11, 12, 15, 16, 19, o 24, y en algunas realizaciones el grupo hidrófilo está unido a un aminoácido en la posición 11, 16 o 19, y en otra realización el grupo hidrófilo está unido al aminoácido 19. En algunas realizaciones el grupo hidrófilo es una proteína de plasma o la parte de Fe de una inmunoglobulina, y en una realización alternativa el grupo hidrófilo es una cadena de hidrocarburo. En algunas realizaciones, el grupo hidrófilo es polietilenglicol , que tiene un peso molecular seleccionado de la gama de 1.000 a 5.000 Dalton. En otra realización el grupo hidrófilo es polietilenglicol, que tiene un peso molecular de por lo menos 20.000 Dalton. En algunas realizaciones, el péptido de la clase 4 modificado de polietileno comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1309, SEQ ID NO: 1310, SEQ ID NO: 1311, SEQ ID NO: 1312, SEQ ID NO: 1343, SEQ ID NO: 1344 O SEQ ID NO: Modificaciones para mejorar la solubilidad La secuencia de Asp-Ser en la posición 15-16 de glucagón nativo se ha identificado como un dipéptido inestable únicamente que deriva en la descomposición química prematura de la hormona nativa en tampones acuosos. Por ejemplo, cuando se mantiene a 0,01 M HCl a 37°C durante 2 semanas, más del 50% del glucagón nativo se puede descomponer en fragmentos. Los dos péptidos de descomposición liberados 1-15 y 16-29 están desprovistos de actividad biológica similar a glucagón y por lo tanto representan una limitación sobre la preformulación acuosa de glucagón y sus análogos relacionados. Se ha observado que la sustitución química selectiva del Asp en la posición 15 del péptido de glucagón nativo con Glu elimina virtualmente la descomposición química del enlace de péptidos 15-16.

Por consiguiente, se espera que los péptidos de la clase 4 de la presente invención se pueden modificar en forma similar para reducir su susceptibilidad a la descomposición química prematura en tampones acuosos. De acuerdo con algunas realizaciones los péptidos de la clase 4 descritos en la presente se pueden modificar adicionalmente para mejorar la estabilidad en soluciones acuosas reemplazando el aminoácido aspártico nativo, ubicado en la posición 15 del péptido de glucagón nativo, con un aminoácido seleccionado del grupo formado por ácido cisteico, ácido glutámico, ácido homoglutámico y ácido homocisteico . De acuerdo con algunas realizaciones el residuo de ácido aspártico en la posición 10 del péptido de la clase 4 de SEQ ID NO 1339 se puede sustituir con un aminoácido seleccionado del grupo formado por ácido cisteico, ácido glutámico, ácido homoglutámico, ácido homocisteico, y en algunas realizaciones el ácido aspártico nativo en la posición 10 de SEQ ID NO 1339 se reemplaza con ácido glutámico. De acuerdo con algunas realizaciones se proporciona un péptido de la clase 4 que tiene estabilidad mejorada en soluciones acuosas en donde el antagonista comprende una secuencia seleccionada del grupo formado por SEQ ID NO: 1335, SEQ ID NO: 1340 y SEQ ID NO: 1342. En otra realización el péptido de la Clase 4 está amidado.

De acuerdo con algunas realizaciones, también se puede lograr una estabilidad aumentada mediante la degradación reducida'- del péptido de la clase 4 descrito en la presente, mediante la sustitución de serina en la posición 16 (de acuerdo con la numeración de glucagón nativo) con ácido glutámico, ácido cisteico, ácido homoglutámico, o ácido homocisteico. En una realización específica, la serina en la posición 16 (de acuerdo con la numeración de aminoácido de glucagón nativo) se reemplaza con ácido glutámico. En un aspecto más específico, el péptido de la clase 4 que comprende dicha modificación comprende un carboxilato de extremo de C y no está amidado.

De acuerdo con algunas realizaciones se proporciona un péptido de la clase 4 que comprende un péptido de glucagón seleccionado del grupo formado por SEQ ID NO: 1307, SEQ ID NO: 1336, SEQ ID NO: 1339, SEQ ID NO: 1340, SEQ ID NO: 1341, SEQ ID NO: 1342, SEQ ID NO: 1343 y SEQ ID NO: 1344, también modificado con una o más sustituciones de aminoácido adicionales en posiciones correspondientes a 11, 12, 15, 16, 19 y/o 24 del péptido de glucagón, en donde las sustituciones de aminoácidos comprenden una sustitución con un aminoácido que tiene una cadena lateral adecuada para entrecruzar con grupos hidrófilos, que incluyen por ejemplo PEG. El péptido se puede sustituir con un aminoácido natural sobre un aminoácido sintético (no natural) . Los aminoácidos sintéticos o no naturales se refieren a aminoácidos que no son naturales in Vitro pero que, de todos modos, se pueden incorporar en la estructuras de péptido descritas en la presente. En algunas realizaciones se proporciona un péptido de la clase 4 en donde el péptido comprende la secuencia de SEQ ID NO: 1307, SEQ ID NO: 1336, SEQ ID NO: 1339, SEQ ID NO: 1340, SEQ ID NO: 1341, SEQ ID NO: 1342, SEQ ID NO: 1343 y SEQ ID NO: 1344, y que también comprende una cadena de polietilenglicol unida a la posición 21 o 24 correspondiente del péptido de glucagón nativo.

En otra realización el extremo de C del péptido de la clase 4 se modifica para reemplazar el grupo ácido carboxílico con un grupo amida .

Péptídos de fusión y conjugados La presente invención también comprende péptidos de fusión de péptido de la clase 4 en donde el segundo péptido se ha fusionado en el extremo de C del péptido de la clase 4. Más específicamente, el péptido de fusión puede comprender un péptido de la clase 4 de SEQ ID NO 1344 que además comprende una secuencia de amioácido de SEQ ID NO: 1319 (GPSSGAPPPS) , SEQ ID NO: 1320 (Lys Arg Asn Arg Asn Asn lie Ala ) o SEQ ID NO: 1321 (Lys Arg Asn Arg) unido al aminoácido de extremo de C del péptido de clase 4. En algunas realizaciones la secuencia de aminoácido de SEQ ID NO: 1319 (GPSSGAPPPS) está unido al al aminoácido 24 del péptido de la clase 4 de SEQ ID NO: 1342 a través de un enlace de péptido. En otra realización el péptido de fusión comprende un péptido de la clase 4 de SEQ ID NO: 1307, SEQ ID NO: 1336, SEQ ID NO: 1339, SEQ ID NO: 1340, SEQ ID NO: 1341 o SEQ ID NO: 1343 que además comprende una secuencia de aminoácido de SEQ ID NO: 1319 (GPSSGAPPPS) unido al aminoácido 24 del péptido de la clase 4. En otra realización el péptido de fusión comprende un péptido de la clase 4 de SEQ ID NO: 1307, SEQ ID NO: 1336, SEQ ID 4 4 NO: 1337, SEQ ID NO: 1338, SEQ ID NO: 1339, SEQ ID NO: 1341 o SEQ ID NO: 1343 que además comprende una secuencia de aminoácido de SEQ ID NO: 1320, SEQ ID NO: 1321 o SEQ ID NO: 1353 unido al aminoácido 24 del péptido de la clase 4. En algunas realizaciones el péptido de fusión comprende una secuencia seleccionada del grupo formado por SEQ ID NO: 1346 y SEQ ID NO 1347. En otra realización el extremo de C del péptido de fusión se modifica para reemplazar el grupo ácido carboxílico con un grupo amida.

En algunas realizaciones se proporciona un péptido de fusión de péptido de la clase 4 en donde la parte del péptido de la clase 4 se selecciona del grupo formado por SEQ ID NO: 1303, SEQ ID NO: 1304, SEQ ID NO: 1305, SEQ ID NO: 1306, SEQ ID NO: 1307, SEQ ID NO: 1308, SEQ ID NO: 1309, SEQ ID NO: 1311, SEQ ID NO: 1312, SEQ ID NO: 1313, SEQ ID NO: 1314, SEQ ID NO: 1315, SEQ ID NO: 1310, SEQ ID NO: 1316, SEQ ID NO: 1317, SEQ ID NO: 1318 y SEQ ID NO: 1339 y la secuencia de SEQ ID NO: 1319 se fusiona en el extremo de carboxi de la parte de péptido de la clase 4 y en donde la cadena de PEG, cuando está presente, se selecciona de la gama de 500 a 40.000 Dalton. Más específicamente, en algunas realizacoines el segmento de péptido de la clase 4 se selecciona del grupo formado por SEQ ID NO: 1313, SEQ ID NO: 1314, SEQ ID NO: 1315, SEQ ID NO: 1316, SEQ ID NO: 1346 y SEQ ID NO: 1347 en donde la cadena de PEG se selecciona de la gama de 500 a 5.000 Dalton, y más específicamente en algunas realizaciones la cadena de PEG es de 1.000 Dalton. En otra realización el extremo de C se modifica para reemplazar el grupo ácido carboxilico con un grupo amida .

El péptido de la clase 4 puede comprender además uno o dos aminoácidos con carga agregados al extremo de carboxi . En algunas realizaciones en donde uno o dos aminoácidos con carga se agregan al extremo de carboxi de SEQ ID NO 1344, los aminoácidos son aminoácidos con carga negativa, que incluyen por ejemplo ácido glutámico y ácido aspártico. En algunas realizaciones el péptido de la clase 4 comprende la secuencia de SEQ ID NO 1342 en donde por lo menos uno de la posición 27 y 28 correspondiente en relación con el péptido de glucagón nativo comprende un aminoácido seleccionado del grupo formado por ácido aspártico y ácido glutámico y en donde SEQ ID NO 1342 opcionalmente se modifica para incluir un agregado a dos aminoácidos con carga negativa agregados al extremo de carboxi. En algunas realizaciones los aminoácidos con carga negativa son ácido glutáimico o ácido aspártico.

Los péptidos de la clase 4 revelados en la presente se pueden combinar con otros agentes activos, que incluyen por ejemplo insulina para tratar enfermedades o condiciones que se 4 caracterizan por la actividad excesiva de glucagón. En algunas realizaciones, los peptidos de la clase 4 que se han modificado para unirse en forma covalente a una cadena de PEG que tiene un peso molecular mayor de 10.000 Dalton se pueden administrar en conjunto con insulina para contribuir a mantener niveles de glucosa estables en la diabetes. Los peptidos de la clase 4 de la presente invención se pueden administrar en forma conjunta con insulina como una sola composición, administrarse simultáneamente como soluciones por separado, o alternativamente, la insulina y el péptido de la clase 4 se pueden administrar en momentos diferentes en relación uno con otro. En algunas realizaciones, la composición que comprende insulina y la composición que comprende el péptido de la clase 4 se administran dentro de 12 horas uno de otro. La relación precisa del péptido de la clase 4 en relación con la insulina administrada depende en parte de la determinación de los niveles de glucagón del paciente, y se puede determinar a través de experimentación de rutina.

Dímeros de Péptidos La presente invención también comprende multímeros de los péptidos de la clase 4 modificados revelados en la presente. Dos o más de los péptidos de la clase 4 modificados se pueden unir juntos usando agentes y procedimientos de unión estándar conocidos para los expertos en el arte. Por ejemplo, se pueden formar dímeros entre dos péptidos de la clase 4 modificados a través del uso de entrecruzamientos de tiol bifuncional y entrecruzamientos de amina bifuncionales , particularmente para péptidos de la clase 4 que se han sustituido en las posiciones 11, 16 o 19, por ejemplo) con residuos de cisteína, lisina ornitina, homocisteína o acetil fenilalanina (por ejemplo SEQ ID NO: 1309, SEQ ID NO: 1310, SEQ ID NO: 1311 y SEQ ID NO: 1312) . El dímero puede ser un homodímero o alternativamente puede ser un heterodímero . En algunas realizaciones el dímero se forma entre dos péptidos de la clase 4 seleccionados independientemente del grupo formado por SEQ ID NO: 1308, SEQ ID NO: 1309, SEQ ID NO: 1310, SEQ ID NO: 1311, SEQ ID NO: 1312, SEQ ID NO: 1345, SEQ ID NO: 1346, o SEQ ID NO: 1347, en donde los dos péptidos están unidos uno a otro a través de un conector unido a la posición 11 de cada p ptido, 16 de cada péptido o posición 19 de cada péptido o cualquier combinación de ellos. En algunas realizaciones la unión es una unión de disulfuro entre un residuo de Cysll y Cysll o Cysl9 y Cysl9 o Cysll y Cysl9 de los respectivos péptidos de la clase 4.

En forma similar, se puede formar un dímero entre dos péptidos de la clase 4 seleccionados independientemente del grupo formado por SEQ ID NO: 1303, SEQ ID NO: 1304, SEQ ID NO: 1305, SEQ ID NO: 1306, SEQ ID NO: 1307, SEQ ID NO: 1308, SEQ ID NO: 1309, SEQ ID NO: 1310, SEQ ID NO: 1311, SEQ ID NO: 1312, SEQ ID NO: 1336, SEQ ID NO: 1337, SEQ ID NO: 1338, SEQ ID NO: 1339 y SEQ ID NO: 1342 en donde la unión se forma entre la posición de aminoácido seleccionada independientemente de las posiciones 16, 21, y 24 con respecto al péptido de glucagón nativo.

De acuerdo con algunas realizaciones se proporciona un dimero de péptido de la clase 4 que comprende dos péptidos de la clase 4, cada uno de los cuales comprende la secuencia de SEQ ID NO 1346, en donde los dos antagonistas están unidos uno a otro por un enlace de disulfuro a través de la posición de aminoácido. En otra realización, se proporciona un dimero de péptido de la clase 4 que comprende dos péptidos de la clase 4, cada uno de los cuales comprende la secuencia de SEQ ID NO 1347, en donde los dos antagonistas están unidos uno a otro por un enlace de disulfuro a través de la posición de aminoácido 35. En algunas realizaciones el dimero se forma desde péptidos de la clase 4 de SEQ ID NO: 1346 y SEQ ID NO: 1347 en donde el aminoácido en la posición 10 es ácido glutámico.

En algunas realizaciones el dimero comprende un homodímero de un péptido de fusión de péptido de la clase 4 seleccionado del grupo formado por SEQ ID NO: 1307, SEQ ID NO: 1308, SEQ ID NO: 1336, SEQ ID NO: 1337, SEQ ID NO: 1340, SEQ ID NO: 1339, NO: 1340, SEQ ID NO: 1341, SEQ ID NO: 1342 y sales farmacéuticamente aceptables de dicho péptidos de la clase 4. De acuerdo con algunas realizaciones se proporciona un dimero que comprende un péptido de la clase 4 unido a un segundo péptido de la clase 4 a través de un conector en donde el primer y segundo péptidos del dímero se seleccionan independientemente del grupo formado por SEQ ID NO: 1307, SEQ ID NO: 1308, SEQ ID NO: 1336, SEQ ID NO: 1337, SEQ ID NO: 1339, SEQ ID NO: 1340, SEQ ID NO: 1341, y SEQ ID NO: 1342 y las sales farmacéuticamente aceptables de dicho polipéptido de glucagón. En otra realización el primer y segundo péptidos de la clase 4 del dímero se seleccionan independientemente del grupo formado por SEQ ID NO: 1307, SEQ ID NO: 1308, SEQ ID NO: 1336 y SEQ ID NO: 1339.

En otra realización el dímero comprende un homodímero de un péptido de la clase 4 seleccionado del grupo formado por SEQ ID NO: 1323, SEQ ID NO: 1324, SEQ ID NO: 1325, SEQ ID NO: 1326, SEQ ID NO: 1327, SEQ ID NO: 1328, SEQ ID NO: 1329, SEQ ID NO: 1330, SEQ ID NO: 1331. En otra realización se proporciona un dímero de péptido de la clase 4 en donde el primer y segundo péptidos del dímero comprenden una secuencia de aminoácido seleccionada independientemente del grupo formado por SEQ ID NO: 1323, SEQ ID NO: 1324, SEQ ID NO: 1325, SEQ ID NO: 1326, SEQ ID NO: 1327 y SEQ ID NO: 1328. En otra realización el dímero comprende un homodímero de un péptido de la clase 4 seleccionado del grupo formado por SEQ ID NO: 1309, SEQ ID NO: 1311 y SEQ ID NO: 1312 en donde el péptido además comprende una cadena de polietilenglicol unida en forma covalente a la posición 11 o 19 del péptido de glucagón .

El péptido relacionado con glucagón de la clase 4 puede comprender la secuencia de aminoácido de cualquiera de SEQ ID NOs : 1301-1371, opcionalmente con hasta 1, 2, 3, 4, o 5 otras modificaciones que retienen la actividad de antagonista de glucagón .

Péptidos relacionados con glucagón de la clase 5 En ciertas realizaciones, el péptido relacionado con glucagón es un péptido relacionado con glucagón de la Clase 5 (véase, por ejemplo, la Solicitud de Patente Internacional (PCT) N° US2008/081333 , que se incorpora en la presente como referencia en su totalidad) .

Todas las secuencias biológicas citadas en la siguiente sección (SEQ ID NO: 1-119) corresponden a las SEQ ID NO: 1-118 de la Solicitud de Patente Internacional N° PCT US2008/081333.

Actividad En ciertos aspectos un péptido relacionado con glucagón de la clase 5 (en adelante denominado "péptido de la clase 5") "puede ser un antagonista de glucagón/aongista de GLP-1. los antagonistas de glucagón/agonistas de GLP-1 se utilizan en cualquier escenario donde se desea la supresión del agonismo de glucagón mientras también se desea la estimulación simultánea de la actividad de GLP-1. Por ejemplo, la actividad de antagonista de glucagón en conjunto con la estimulación de GLP-1 se puede usar en el tratamiento de la diabetes cuando se ha demostrado que el antagonismo de glucagón en modelos preclíonicos produce una disminución de la glucosa en sangre y que la actividad de GLP-1 está asociada con la producción de insulina. También se sabe que los compuestos que demuestran actividad de GLP-1 son útiles para el tratamiento de la obesidad y la prevención del aumento de peso .

En ciertos aspectos se cree que los péptidos de la clase 5 son útiles para cualquier uso que se ha descrito previamente para otros antagonistas de glucagón/agonistas de GLP-1. Se ha demostrado por separado que estas dos actividades son altamente deseables para el tratamiento de síndrome metabólico, específicamente diabetes y obesidad. La actividad de antagonista de glucagón es útil en cualquier escenario donde se desea la supresión del agonismo de glucagón. La presencia de agonismo de GLP-1 también suprime la secreción endógena de glucagón desde el páncreas mientras que estimula la síntesis y secreción de insulina. Las dos acciones farmacológicas sirven en una forma sinérgica para normalizar las anormalidades metabólicas. Por consiguiente, los péptidos de la clase 5 se pueden usar para tratar hiperglicemia, para tratar otras enfermedades metabólicas que derivan de los niveles altos de glucagón en sangre o los niveles altos de glucosa en sangre. De acuerdo con algunas realizaciones el paciente a quien se debe tratar usando el antagonista de glucagón/agonista de GLP-1 tal como los péptidos de la clase 5 revelados en la presente es un animal domesticado, y en otra realización el paciente a quien se debe tratar es un humano. Los estudios sugieren que la falta de supresión de glucagón en los pacientes diabéticos contribuye a la hiperglicemia postprandial en parte a través de la glicogenólisis acelerada. El análisis de glucosa en sangre durante un Ensayo de Tolerancia de Glucosa Oral (OGTT) y en la presencia o ausencia de supresión de glucagón inducida por somatostatina ha mostrado un aumento significativo en la glucosa en sujetos con niveles de glucagón más altos. Por consiguiente, un antagonista de glucagón/agonista de GLP-1 o péptidos de la clase 5 descritos en la presente se pueden usar para tratar la hiperglicemia y se espera que sean útiles para tratar una variedad de tipos de diabetes que incluyen diabetes mellitas de tipo I, diabetes mellitas de tipo II, o diabetes gestacional, insulinodependiente o no insulinodependiente, y reducir complicaciones de la diabetes que incluyen nefropatía, retinopatía y enfermedad vascular.

Se espera que dichos métodos para reducir el apetito o promover la pérdida de peso corporal sean útiles en la reducción del peso corporal, la prevención del aumento de peso, o el tratamiento de la obesidad con diferentes causas, que incluyen obesidad inducida por fármacos, y la reducción de complicaciones asociadas con la obesidad que incluyen enfermedad vascular (enfermedad de arterias coronarias, ataque, enfermedad vascular periférica, reperfusión de isquemia, etc.), inicio de diabetes tipo II, hiperlipidemias y enfermedades musculoesqueléticas .

Las composiciones farmacéuticas que comprenden péptidos de la clase 5 se pueden formular y administrar a pacientes usando portadores farmacéuticamente aceptables estándar y vías de administración conocidas para los expertos en el arte. Por consiguiente, la presente invención también comprende composiciones farmacéuticas que comprenden uno o más péptidos de la clase 5 reveladas en la presente en combinación con un 4 portador farmacéuticamente aceptable. Las composiciones farmacéuticas pueden comprender los péptidos de la clase 5 como el único componente farmacéuticamente activo, o los péptidos de la clase 5 se pueden combinar con uno o más agentes activos adicionales. De acuerdo con algunas realizaciones se proporciona una composición que comprende un péptido de la clase 5 e insulina o un análogo de insulina. Alternativamente, se proporciona una composición para inducir la pérdida de peso o prevenir el aumento de peso que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 1415 o SEQ ID NO: 1451 que además comprende la secuencia de SEQ ID NO: 1421 (GPSSGAPPPS) o SEQ ID NO: 1450 unido al aminoácido 24 de SEQ ID NO: 1415 o SEQ ID NO: 1451, y un péptido antiobesidad. Los péptidos antiobesidad adecuados incluyen aquellos revelados en las patentes estadounidenses 5.691.309, 6.436.435 o la solicitud de patente estadounidense 20050176643.

Estructura de péptido de la clase 5 De acuerdo con algunas realizaciones se proporciona un péptido de la clase 5 que comprende un péptido de glucagón que se ha modificado mediante la eliminación de los primeros 1 a 5 residuos de aminoácidos (por ejemplo primer aminoácido, primeros dos aminoácidos, primeros tres aminoácidos, primeros cuatro aminoácidos, primeros cinco aminoácidos) del extremo de N, y estabilización de la estructura de alfa-hélice en la parte de extremo de C del compuesto (alrededor las posiciones de aminoácidos 12-29 de acuerdo con la numeración de aminoácido de glucagon de tipo silvestre, SEQ ID NO 1401) , por ejemplo mediante la unión de las cadenas laterales de pares de aminoácidos, seleccionados de las posiciones 12 y 16, 16 y 20, 20 y 24, y 24 y 28 (en relación con la secuencia de péptido de glucagon nativo) , uno con otro a través del enlace de hidrógeno o interacciones iónicas, tales como la formación de puentes de sal, o mediante enlaces covalentes. Alternativamente, la estabilización de la alfa-hélice alrededor de los residuos 12-29 se logra a través de la introducción de uno o más aminoácidos alfa , alf -disustituidos en las posiciones que retienen la actividad deseada. En algunas realizaciones, una, dos, tres, cuatro o más de las posiciones 16, 17, 18, 19, 20, 21, 24 o 29 (de acuerdo con la numeración de aminoácido del glucagon de tipo silvestre) del péptido de la clase 5 o un análogo de él se sustituye con un aminoácido alfa, alfa-disustituido. Por ejemplo, la sustitución de la posición 16 (de acuerdo con la numeración de aminoácido del glucagon de tipo silvestre) de un péptido de la clase 5 o un análogo de él con ácido amino iso-butírico (AIB) proporciona una alfa-hélice estabilizada en la ausencia de un puente de sal o lactama. En algunas realizaciones, una, dos, tres o más de las posiciones 16, 20, 21 o 24 (de acuerdo con la numeración de aminoácido de glucagón de tipo silvestre) y se sustituyen con AIB.

De acuerdo con algunas realizaciones, se proporciona un péptido de la clase 5 en donde el péptido presenta por lo menos un 80% del agonismo máximo logrado por GLP-1 nativo en el receptor de GLP-1, y presenta la actividad de antagonismo de glucagón que reduce la producción de cAMP inducida por glucagón máxima en el receptor de glucagón en por lo menos el 50%, medido mediante producción de cAMP en un ensayo in Vitro. En algunas realizaciones el péptido de la clase 5 presenta por lo menos un 90% de la actividad del GLP-1 nativo en el receptor de GLP-1 y presenta actividad de antagonista de glucagón, que reduce la producción máxima de cAMP inducida por glucagón en el receptor de glcuagón en más del 80%.

De acuerdo con algunas realizaciones el péptido de la clae 5 comprende un péptido derivado de SEQ ID NO 1402, en donde el péptido comprende otras sustituciones de aminoácido en relación con SEQ ID NO: 1402 en una a tres posiciones de aminoácidos seleccionadas de las posiciones 1, 2, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 19, 22 y 24, y presenta por lo menos 90% de la actividad de GLP-1 nativo en el receptor de GLP-1, y presenta la actividad de antagonista de glucagón, que reduce la producción máxima de cAMP inducida por glucagón en el receptor de glucagón en al menos el 80%.

En algunas realizaciones la estructura de alfa-hélice en la parte de extremo de C del péptido de la clase 5 (alrededor de los aminoácidos 12-29 de acuerdo con la numeración de aminoácido de glucagón de tipo silvestre) se estabiliza mediante por ejemplo la formación de un puente intramolecular covalente o no covalente, la sustitución y/o inserción de aminoácidos alrededor de la posición 12-29 con un aminoácido que estabiliza la alfa-hélice (por ejemplo un aminoácido alfa, alfa-disustituido) . En algunas realizaciones, una, dos, tres, cuatro o más de las posiciones 16, 17, 18, 19, 20, 21, 24 o 29 (de acuerdo con la numeración de aminoácido de glucagón de tipo silvestre) del péptido de la clase 5 o un análogo de él se sustituye con un aminoácido alfa, alfa-disustituido, por ejemplo ácido amino isobutírico (AIB) . Por ejemplo, la sustitución de la posición 16 (de acuerdo con la numeración de aminoácido de glucagón de tipo silvestre) de un péptido de la clase 5 o un análogo de él con ácido amino isobutírico (AIB) proporciona una alfa hélice estabilizada en la ausencia de un puente de sal o lactama.

En algunas realizaciones el péptido de la clase 5 comprende SEQ ID NO: 1415 o SEQ ID NO: 1451, y más específicamente, una secuencia seleccionada del grupo formado por SEQ ID NO: 1405, SEQ ID NO: 1406, SEQ ID NO: 1407, SEQ ID NO: 1408, SEQ ID NO: 1409, SEQ ID NO: 1416, SEQ ID NO: 1417, SEQ ID NO: 1418, SEQ ID NO: 1419, SEQ ID NO: 1422, SEQ ID NO: 1423, SEQ ID NO: 1424 y SEQ ID NO: 1425. En otras realizaciones el péptido de la clase 5 comprende un péptido derivado de SEQ ID NO: 1415 o SEQ ID NO: 1451 en donde el péptido además comprende otra sustitución de aminoácido en relación con SEQ ID NO: 1415 o SEQ ID NO: 1451 en una a tres posiciones de aminoácido seleccionadas de las posiciones 1, 2, 5, 6, 8, 9, 12, 13 y 14. En algunas realizaciones las sustituciones en las posiciones 1, 2, 5, 6, 8, 9, 12, 13 y 14 son sustituciones de aminoácidos conservadoras. En algunas realizaciones la treonina en la posición 24 de SEQ ID NO 1405 o SEQ ID NO 1406 se sustituye con glicina.

De acuerdo con algunas realizaciones el péptido de la clase 5 representa otra modificación del péptido en donde además de la eliminación del extremo de N, la fenilalanina en la posición 6 del péptido de glucagón nativo se modifica, por ejemplo, para comprender un grupo hidroxilo en lugar del grupo amino del extremo de N. En otra realización el ácido carboxílico natural del aminoácido del extremo de C se reemplaza con un grupo de carga neutra, tal como una amida o éster.

De acuerdo con algunas realizaciones, se han preparado peptidos de la clase 5 en donde se han eliminado los primeros tres a cinco aminoácidos de glucagón nativo, el aminoácido en la posición 9, en relación con el peptido de glucagón nativo, se ha sustituido con un aminoácido seleccionado del grupo formado por ácido glutámico, ácido homoglutámico, ácido ß-homoglutámico, un derivado de ácido sulfónico, o un derivado de alquilcarboxilato de cisteína que tiene la estructura de: En donde X5 es alquilo de Ci-C4, alquenilo de C2-C4, o alquinilo de C2-C4, y la estructura de alfa-hélice en la parte del extremo de C de glucagón (alrededor de los aminoácidos 12-29 de acuerdo con la numeración de aminoácidos de glucagón de tipo silvestre, por ejemplo, a través de un puente de lactama que se forma entre las cadenas laterales de los aminoácidos 12 y 16 o entre los aminoácidos 16 y 20, en relación con el péptido de glucagón nativo. Ejemplos de pares de aminoácidos que son capaces del enlace covalente para formar un puente de unión de siete átomos se detallan en toda esta memoria descriptiva. En algunas realizaciones, el derivado de ácido sulfónico de cisteína es ácido cisteico o ácido homocisteico.

En algunas realizaciones se proporciona una clase 5 que comprende una secuencia de aminoácido seleccionada del grupo formado por SEQ ID NO: 1405, SEQ ID NO: 1406, SEQ ID NO: 1407, o SEQ ID NO: 1408, en donde dicho péptido comprende un anillo de lactama formado entre las cadenas laterales de los aminoácidos 7 y 11 para SEQ ID NO: 1405, entre 11 y 15 para SEQ ID NO: 1406, entre las posiciones 15 y 19 para SEQ ID NO: 1407 y entre las posiciones 19 y 24 para SEQ ID NO: 1408, cada una de dichas secuencias se modifica también para comprender un grupo hidrófilo unido en forma covalente al péptido. Más específicamente, en algunas realizaciones cada una de las lactamas que lleva el péptido de la clase 5 se modifican mediante la unión covalente de una cadena de polietilenglicol . Por ejemplo, para un péptido de la clase que comprende SEQ ID NO: 1405, el péptido se pegila en una posición seleccionada del grupo formado por 12, 15, 16, 19 y 24; para un péptido de la clase 5 que comprende SEQ ID NO: 1406, el péptido se pegila en una posición seleccionada del grupo formado por 12, 16, 19 y 24; para un péptido de la clase 5 que comprende SEQ ID NO: 1407, el péptido se pegila en una posición seleccionada del grupo formado por 11, 12, 16 y 24; para el péptido de la clase 5 que comprende SEQ ID NO: 1408, el péptido se pegila en una posición seleccionada del grupo formado por 11, 12, 15 y 16. De acuerdo con algunas realizaciones se proporciona un péptido de la clase 5 que comprende SEQ ID NO: 1447 o SEQ ID NO: 1448 en donde el péptido se pegila en una posición seleccionada del grupo formado por 12, 16, 19 y 24, en relación con la secuencia de SEQ ID NO: 1447 o SEQ ID NO: 1448. En otra realización el péptido de SEQ ID NO: 1447 o SEQ ID NO: 1448 se modifica también agregando la secuencia de SEQ ID NO: 1421 al extremo de carboxi del péptido.

Como se detalló anteriormente en ciertos aspectos se proporcionan péptidos de la clase 5 en donde los primeros cinco aminoácidos de glucagón nativo se han eliminado, el grupo amino del aminoácido de extremo de N (fenilalanina) se ha reemplazado con un grupo hidroxilo (es decir, el primer aminoácido es ácido fenil-láctico) y las cadenas laterales de uno o más pares de aminoácidos seleccionados de las posiciones 12 y 16, 16 y 20, 20 y 24 y 24 y 26 están unidas una a otra, estabilizando así la alfa hélice de péptido de la clase 5.

De acuerdo con algunas realizaciones se proporciona un péptido de la clase 5 que comprende la secuencia de SEQ ID NO 1402 que está modificado mediante una sustitución del residuo de serina en la posición 11 de SEQ ID NO 1402 (posición 16 de acuerdo con la numeración de aminoácido de glucagón nativo) con un aminoácido seleccionado del grupo formado por ácido glutámico, glutamina, ácido homoglutámico, treonina o glicina. De acuerdo con algunas realizaciones el residuo de serina en la posición 11 de SEQ ID NO 1302 se sustituye con un aminoácido seleccionado del grupo formado por ácido glutámico, glutamina, ácido homoglutámico y ácido homocisteico y en algunas realizaciones el residuo de serina se sustituye con ácido glutámico. De acuerdo con algunas realizaciones el péptido de la clase 5 comprende la secuencia de SEQ ID NO 1438.

En algunas realizaciones se proporciona un péptido de la clase 5 en donde se forma un puente intramolecular entre dos cadenas laterales de aminoácido para estabilizar la estructura tridimensional del extremo de carboxi del péptido de SEQ ID NO 1402. Más específicamente, las cadenas laterales de uno o más aminoácidos seleccionados de los pares de aminoácidos 7 y 11, 11 y 15, 15 y 19 o 19 y 23 de SEQ ID NO 1402 están unidos uno a otro, estabilizando por lo tanto la alfa hélice en la parte del extremo de C. Las dos cadenas laterales se pueden unir una a otra a través de un enlace de hidrógeno, interacciones iónicas (tales como la formación de puentes de sal) o mediante enlaces covalentes. De acuerdo con algunas realizaciones el tamaño del conector es de 7-9 átomos y en algunas realizaciones el tamaño del conector es de 8 átomos. En algunas realizaciones el péptido de la clase 5 se selecciona del grupo formado por SEQ ID NO: 1405, SEQ ID NO: 1406, SEQ ID NO: 1407 y SEQ ID NO: 1408. En algunas realizaciones el aminoácido de extremo de C del peptido de la clase 5 tiene un grupo amida que sustituye al grupo ácido carboxílico que está presente en el aminoácido nativo.

De acuerdo con algunas realizaciones se proporciona el péptido de la clase 5 en donde el análogo comprende una secuencia de aminoácido de SEQ ID NO 1409. En algunas realizaciones la estructura tridimensional del extremo de carboxi del péptido de SEQ ID NO 1409 se estabiliza mediante la formación de enlaces covalentes entre las cadenas laterales del péptido. En algunas realizaciones dos cadenas laterales de aminoácido están unidas una a otra para formar un anillo de lactama. El tamaño del anillo de lactama puede variar según la longitud de las cadenas laterales de aminoácido y en algunas realizaciones la lactama se forma uniendo las cadenas laterales de un aminoácido de lisina a una cadena lateral de ácido glutámico. En algunas realizaciones el aminoácido del extremo de C de los péptidos de la clase 5 tienen un grupo amida que sustituye al grupo ácido carboxílico que está presente en el aminoácido nativo.

El orden del enlace de amida en el anillo de lactama se puede invertir (por ejemplo se puede formar un amillo de lactama entre las cadenas laterales de un Lysl2 y un Glul6 o alternativamente entre un Glu 12 y un Lys 16) . De acuerdo con algunas realizaciones se proporciona un análogo de glucagón de SEQ ID NO 1409 en donde por lo menos se forma un anillo de lactama entre las cadenas laterales de un par de aminoácido seleccionado del grupo los pares de aminoácidos 7 y 11, 11 y 15, 15 y 19 o 19 y 23 de SEQ ID NO 1409. En algunas realizaciones se proporciona un péptido de la clase 6 en donde el péptido comprende la secuencia de SEQ ID NO 1410, dicha secuencia también comprende un puente de lactama intramolecular formado entre las posiciones de aminoácido 7 y 11, o entre las posiciones de aminoácido 11 y 15, o entre las posiciones de aminoácido 15 y 16 de SEQ ID NO 1410. En algunas realizaciones se proporciona un péptido de la clase 5 en donde el péptido comprende la secuencia de SEQ ID NO 1411, dicha secuencia además comprende un puente de lactama intramolecular formado entre las posiciones de aminoácido 7 y 11, o entre las posiciones de aminoácidos 11 y 15 de SEQ ID NO 1411. En algunas realizaciones el péptido de la clase 5 comprende la secuencia de SEQ ID NO 1417.

Se proporciona otro péptido de la clase 5 que comprende derivados de SEQ ID NO 1405, en donde el ácido aspártico en la posición 10 de SEQ ID NO 1405 (posición 15 de glucagón nativo) se ha sustituido con ácido glutámico, un aminoácido de la estructura general : En donde X6 es alquilo de C1-C3, alqueno de C2-C3 o alquinilo de C2-C3, y en algunas realizaciones X6 es alquilo de C1-C3, y en otra realización X6 es alquilo de C2. En algunas realizaciones se proporcoina un péptido de la clase 5 de SEQ ID NO: 1409 en- donde la posición 10 de SEQ ID NO: 1409 (posición 15 de glucagón nativo) se sustituye con un aminoácido seleccionado del grupo formado por ácido glutámico, ácido cisteico, ácido homocisteico y ácido homoglutámico . En otra realización la posición 10 de SEQ ID NO: 1409 se sustituye con un aminoácido seleccionado del grupo formado por ácido cisteico o ácido homocisteico. En algunas realizaciones se proporciona un derivado de péptido de la clase 5 de SEQ ID NO: 1406, SEQ ID NO: 1407 o SEQ ID NO: 1408 en donde la posición 10 de SEQ ID NO: 1406, SEQ ID NO: 1407 o SEQ ID NO: 1408 se sustituye con un aminoácido seleccionado del grupo formado por ácido glutámico, ácido cisteico, ácido homocisteico y ácido homoglutámico. En algunas realizaciones el aminoácido del extremo de C de un péptido de la clase 5 tiene un grupo amida que sustituye al grupo ácido carboxilico que está presente en el aminoácido nativo. algunas realizaciones un péptido de la clase 5 se sustituye con por lo menos un residuo de cisteína, en donde la cadena lateral del residuo de cisteína se modifica también con un reactivo de tiol, que incluye por ejemplo maleimido, vinil sulfona, 2 -piridiltio, haloalquilo, y haloacilo. Estos reactivos de tiol pueden contener carboxi , ceto, hidroxilo y otros grupos éter así como otros grupos hidrófilos tales como unidades de polietilenglicol . En una realización alternativa, un aminoácido de un peptido de la clase 5 se sustituye con lisina, y la cadena lateral del residuo de lisina sustituyente se modifica además usando reactivos de amina tales como esteres activos (succinimido, anhídrido, etc) de ácidos carboxílicos o aldehidos de grupos hidrófilos tales como polietilenglicol. De acuerdo con algunas realizaciones el residuo de lisina que corresponde a la posición 7 del péptido de SEQ ID NO: 1405 se sustituye con arginina y una sola sustitución de lisia se inserta por uno de los aminoácidos correspondientes a la posición 12, 15, 16, 19 y 24 de SEQ ID NO: 1405.

En otra realización el residuo de metionina que corresponde a la posición 22 de los péptidos de la clase 5 revelados en la presente se cambia por leucina o norleucina para prevenir la degradación oxidativa del péptido.

Además los péptidos de la clase 5, en algunos aspectos, también comprenden sustituciones de aminoácido en las posiciones que se sabe que no son críticas para la función del análogo de glucagón. En algunas realizaciones las sustituciones son sustituciones de aminoácido conservadoras en una, dos o tres posiciones seleccionadas del grupo formado por 2, 5, 6, 7, 8, 9, 12, 13, 14, 15, 16, 19, 22, 23 o 24. En algunas realizaciones los aminoácidos que corresponden a las posiciones 16, 17, 20, 21, 24 o 29 del péptido de glucagón nativo y más específicamente en la posición 21 y/o 24 en relación con glucagón nativo se sustituyen con cisteína o lisina, en donde una cadena de PEG está unida en forma covalente al residuo de cisteína o lisina.

De acuerdo con algunas realizaciones, se proporciona un péptido de la clase 5 que comprende una secuencia que comprende SEQ ID NO 1409, también modificado por una o más sustituciones de aminoácido adicionales en las posiciones que corresponden a las posiciones 11, 12, 15, 16, 19 y/o 24 del péptido (que incluye por ejemplo la sustitución con cisteína), en donde la sustitución de aminoácido comprende un aminoácido que tiene una cadena lateral adecuada para entrecruzar con grupos hidrófilos, que incluyen por ejemplo, PEG. El glucagón nativo se puede sustituir con un aminoácido natural o un aminoácido sintético (no natural) . Los aminoácidos sintéticos o no naturales se refieren a aminoácidos que no son naturales in vivo pero que, de todos modos, se pueden incorporar en las estructuras de péptido descritas en la presente. En algunas realizaciones se proporciona un péptido de la clase 5 en donde el péptido comprende la secuencia de SEQ ID NO 1409 y que además comprende la cadena de polietilenglicol unida a la posición 16 o 19 del péptido. En otra realización el extremo de C del análogo de glucagón se modifica para reemplazar el grupo ácido carboxílico con un grupo amida.

De acuerdo con algunas realizaciones se proporciona un péptido de la clase 5 que comprende un análogo de glucagón seleccionado del grupo formado por: Ri-Phe- Thr-Ser-Xaa-Tyr-Ser-Lys-Tyr-Leu-Xaa-Glu-Arg-Arg-Ala-Gln-Asp-Phe-Val-Gln-Trp-Leu-Xaa-Asn- Thr-R2 (SEQ ID NO: 1439) Ri-Phe-Thr-Ser-Xaa-Tyr-Ser-Lys-Tyr-Leu-Asp-Glu-Arg-Arg-Ala-Gln-Xaa-Phe-Val-Gln-Trp-Leu- Xaa-Asn-Thr-R2 (SEQ ID NO: 1413) , Ri-Phe-Thr-Ser-Xaa-Tyr-Ser-Lys-Tyr-Leu-Asp-Glu-Arg-Arg-Ala-Gln-Asp-Phe-Val-Xaa-Trp-Leu-Xaa-Asn- Thr -R2 (SEQ ID NO: 1414) y Ri-Phe- Thr-Ser-Xaa-Tyr-Ser-Lys-Tyr-Leu-Asp-Glu-Arg-Arg-Ala-Gln-Xaa-Phe-Val-Xaa-Trp-Leu- Xaa-Asn- Thr -R2 (SEQ ID NO: 1412) , En donde Xaa en la posición 4 = ácido aspártico, ácido glutámico, ácido cisteico o ácido homocisteico, Xaa en la posición 10 = Asp, Glu, ácido cisteico, ácido homoglutámico y ácido homocisteico, Xaa en la posición 16 is Asp, Cys, Orn, homocisteína o acetil fenilalanina y Xaa en la posición 19 es Gln, Cys, Orn, homocisteína y acetil fenilalanina, Xaa en la posición 22 = Met , Leu o Nle, Ri es OH o NH2, y R2 es Gly Pro Ser Ser Gly Ala Pro Pro Pro Ser (SEQ ID NO: 1421) , Gly Pro Ser Ser Gly Ala Pro Pro Pro Ser Xaa (SEQ ID NO: 1450; en donde Xaa es Cys, Orn, homocisteína o acetil fenilalanina) , COOH o CONH2, en donde el péptido opcionalmente se pegila en la posición 16 de SEQ ID NO: 1413, en la posición 19 de SEQ ID NO: 1414 y en las posiciones 16 y 19 de SEQ ID NO: 1412. En algunas realizaciones la Thr en la posición 24 de SEQ ID NOs : 1412-1414 y 1439 se sustituye con Gly. De acuerdo con algunas realizaciones el péptido comprende la secuencia de SEQ ID NO: 13 o SEQ ID NO: 1414, en donde Ri es OH. De acuerdo con algunas realizaciones el péptido comprende la secuencia de SEQ ID NO: 1413 o SEQ ID NO: 1414, en donde i es OH y R2 es CONH2. De acuerdo algunas realizaciones el péptido comprende la secuencia SEQ ID NO: 1413 o SEQ ID NO: 1414, en donde Ri es OH, R2 es CONH2 y la treonina en la posición 24 se sustituye con glicina.

En algunas realizaciones, un péptido de la clase 5 se modifica también para comprender uno o más aminoácidos de GLP-1 nativo mediante la sustitución del residuo (s) de glucagón nativo en 4 0 posiciones dé aminoácido correspondientes. Por ejemplo, el péptido de la clase 5 puede comprender una o más sustituciones de aminoácido en cualquiera de las posiciones 2, 3, 17, 18, 21, 23, y 24 (de acuerdo con la numeración de aminoácido de glucagón nativo) . En una realización específica, el péptido de la clase 5 se modifica mediante una o más de las siguientes sustituciones de aminoácido: Ser2 se reemplaza con Ala, Gln3 se reemplaza con Glu, Argl7 se reemplaza con Gln, Arg en la posición 18 se reemplaza con Ala, Asp en la posición 21 se reemplaza con Glu, Val en la posición 23 se reemplaza con lie, y Gln en la posición 24 se reemplaza con Ala (las posiciones de aminoácido están de acuerdo con la secuencia de glucagón nativo) . En una realización específica, el péptido de la clase 5 se modifica reemplazando Ser2 con Ala y Gln3 con Glu (de acuerdo con la numeración de aminoácido de glucagón nativo) . En otra realización específica, el péptido de la clase 5 se modifica con la totalidad de las siguientes sustituciones de aminoácido: Argl7 se reemplaza con Gln, Arg en la posición 18 se reemplaza con Ala, Asp en la posición 21 se reemplaza con Glu, Val en la posición 23 se reemplaza con lie, y Gln en la posición 24 se reemplaza con Ala (numeración de aminoácido de acuerdo con el glucagón nativo) . En aún otra realización específica el péptido de la clase 5 se modifica para comprender solamente Glu en la posición 21 (de acuerdo con la numeración de SEQ ID NO: 1401) . Por consiguiente, el péptido de la clase 5 puede comprender la secuencias de aminoácido de cualquiera de SEQ ID NOs : 1460-1470, 1473-1478, 1480-1488, 1490-1496, 1503, 1504, 1506, y 1514-1518.

También se proporciona un péptido de la clase 5 o un conjugado de él que comprende (1) una alfa hélice estabilizada a través de medios descritos en la presente (por ejemplo a través de un puente intramolecular, o incorporación de uno o más aminoácidos alfa, alfa-disustituidos, o un aminoácido en la posición 16 (de acuerdo con la numeración de SEQ ID NO 1401) , o una combinación de ellos; (2) una amida del extremo de C o éster en lugar de un carboxilato del extremo de C y (3) una estructura general A-B-C, en donde A se selecciona del grupo por: (i) ácido fenil láctico (PLA) , (ii) cualquier derivado de oxi de PLA, y (iii) un péptido de 2 a 6 aminoácidos en donde dos aminoácidos consecutivos del péptido están unidos a través de un enlace de éster o éter, en donde B representa aminoácidos p a 26 de SEQ ID NO 1401, en donde p es 3, 4, 5, 6, o 7, que opcionalmente comprende una o más modificaciones de aminoácido, como se describe en la presente, que incluye, por ejemplo, cualquiera de las modificaciones descritas para los péptidos de la clase 5. Por ejemplo una o más modificaciones se puede seleccionar del grupo formado por: (iv) Asp en la posición 9 (de acuerdo con la numeración de aminoácido de SEQ ID NO 1401) se sustituye con una Glu, derivado de ácido sulfónico de Cys, ácido homoglutámico, ácido ß-homoglutámico, o un derivado de alquilcarboxilato de cisteína que tiene la estructura de: en donde X5 es alquilo de C1-C4, alquenilo de C2-C4, o alquinilo de C2-C4; (v) sustitución de uno o más aminoácidos en las posiciones 10, 20 y 24 (de acuerdo con la numeración de aminoácido d SEQ ID NO 1401) con un aminoácido unido en forma covalente con un grupo acilo o alquilo a través de una unión de éster, éter, tioéter, amida y alquilamina; (vi) sustitución de uno dos aminoácidos en las posiciones 16, 17, 20, 21 y 24 (de acuerdo con la numeración de aminoácido de SEQ ID NO 1401) con un aminoácido seleccionado del grupo formado por Cys, Lys, ornitina, homocisteína, y acetil-fenilalanina (Ac-Phe) , en donde el aminoácido del grupo está unido en forma covalente a un grupo hidrófilo; (vi) Asp en la posición 15 (de acuerdo con la numeración de SEQ ID NO 1401) se sustituye con ácido cisteico, ácido glutámico, ácido homoglutámico, y ácido homocisteico; (vii) Ser en la posición 16 (de acuerdo con la numeración de SEQ ID NO 1401) se sustituye con ácido cisteico, ácido glutámico, ácido homoglutámico y ácido homocisteico, (ix) Arg en la posición 17 se reemplaza con Gln, Arg en la posición 18 se reemplaza con Ala, Asp en la posición 21 se reemplaza con Glu, Val en la posición 23 es reemplaza con lie, y Gln en la posición 24 se reemplaza con Ala (de acuerdo con la numeración de aminoácido de SEQ ID NO 1401) ; (x) Ser en la posición 16 se reemplaza con Glu, Gln en la posición 20 se reemplaza con Glu, o Gln en la posición 24 se reemplaza con Glu de acuerdo con la numeración de aminoácido de SEQ ID NO 1401) ; en donde C (de la estructura general de A-B-C) se selecciona del grupo formado por : (vii) X, (viii) X-Y, (ix) X-Y-Z, (x) X-Y-Z-R10, En donde X es Met, Leu o Nle; Y es Asn o un aminoácido con carga, Z es Thr, Gly, Cys, Lys, ornitina (Orn) , homocisteína, acetil fenilalanina (Ac-Phe) , o un aminoácido con carga, en donde RIO se selecciona del grupo formado por SEQ ID NOs : 1421, 1426, 1427, y 1450.

En un aspecto específico, el péptido comprende un derivado de oxi de PLA. Como se usa en la presente "derivado de oxi de PLA" se refiere a un compuesto que comprende una estructura modificada de PLA en donde el grupo hidroxilo se ha reemplazado con O-Rn , en donde Rn es un grupo químico. Al respecto, el derivado de oxi de PLA puede ser, por ejemplo, un éster de PLA o un éter de PLA.

Los métodos para elaborar derivados de oxi de PLA son conocidos en el arte. Por ejemplo, cuando el derivado de oxi es un éster de PLA, el éster se puede formar cuando reacciona el hidroxilo de PLA con un carbonilo que lleva un nucleofilo. El nucleofilo puede ser cualquier nucleofilo, que incluye en forma no taxativa una amina o hidroxilo. Por consiguiente, el éster de PLA puede comprender la estructura de la Fórmula IV: Formula IV en donde R7 es un éster formado cuando reacciona el hidroxilo de PLA con un carbonilo que lleva un nucleofilo.

El carbonilo que lleva un nucleófilo (que reacciona con el hidroxilo de PLA para formar un éster) puede ser, por ejemplo, un ácido carboxílico, un derivado de ácido carboxílico, o un éster activado de un ácido carboxílico. El derivado de ácido carboxílico puede ser, en forma no taxativa, un cloruro de acilo, un anhídrido de ácido, una amida, un éster, o un nitrilo. El éster activado de un ácido carboxílico puede ser, por ejemplo, N-hidroxisuccinimida (NHS) , tosilato (Tos) , unaa carbodiimida, o un hexafluorofosfato . En algunas realizaciones, la carbodiimida es 1 , 3-diciclohexilcarbodiimida (DCC) , 1 , 11 -carbonildiimidazol (CDI) , clorhidrato de l-etil-3- (3-dimetilaminopropil) carbodiimida (EDC) , o 1 , 3 -diisopropilcarbodiimida (DICD) . En algunas realizaciones, el hexafluorofosfato se selecciona del grupo formado por hexafluorofosfato benzotriazol-l-il-oxi-tris (dimetilamino) fosfonio hexafluorofosfato (BOP) , benzotriazol -1-il-oxitripirrolidinofosfonio hexafluorofosfato (PyBOP) , 2-(lH-7-azabenzotriazol-l-il) -1,1,3, 3-tetrametil uronio hexafluorofosfato (HATU) , y o-benzotriazol -N, N, ' , ' -tetramétil -uronio-hexafluoro-fosfato (HBTU) .

Los métodos para elaborar éteres a partir de la reacción con un grupo hidroxilo (por ejemplo, el hidroxilo de PLA) también son conocidos en el arte. Por ejemplo, el grupo hidroxilo de PLA puede reaccionar con un alcohol de alquilo halogenado o de alquilo tosigado para formar un enlace de éter.

En una realización específica, el grupo químico unido a PLA a través de un enlace que contiene oxígeno (por ejemplo, a través de un enlace de éster o éter) es un polímero (por ejemplo, un polietilenglicol) , un carboxilato, un aminoácido, un péptido, o un lípido, por ejemplo un ácido graso o un esteroide.

En una realización específica, el grupo químico es un aminoácido, que, opcionalmente , es una parte de un péptido, de manera tal que la Fórmula IV sea un depsipéptido . Al respecto, PLA puede estar en una posición diferente del residuo de aminoácido del extremo de N del péptido, de manera tal que el péptido comprende uno o más (por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, o más) aminoácidos de extremo de N al residuo de PLA. Por ejemplo, el péptido puede comprender PLA en la posición n, en donde n es 2, 3, 4, 5 o 6 del péptido.

Los aminoácidos del extremo de N al residuo de PLA pueden ser sintéticos o naturales. En una realización específica, los aminoácidos que son PLA del extremo de N son aminoácidos naturales. En algunas realizaciones, los aminoácidos que son el extremo de N a PLA son aminoácidos del extremo de N de glucagón nativo. Por ejemplo, el péptido puede comprender en el extremo de N la secuencia de aminoácido de cualquiera de SEQ ID NO 1452-1456, en donde PLA se une a treonina a través de un enlace de éster; SEQ ID NO: 1452His-Ser-Gln-Gly-Thr-PLA SEQ ID NO: 1453 Ser-Gln-Gly-Thr-PLA SEQ ID NO: 1454 Gln-Gly-Thr-PLA SEQ ID NO: 1455 Gly-Thr-PLA SEQ ID NO: 1456 Thr-PLA En una realización alternativa, uno o más de los aminoácidos del extremo de N se pueden sustituir con un aminoácido diferente del aminoácido de glucagón nativo. Por ejemplo, cuando el péptido comprende PLA como el aminoácido en la posición 5 o 6, el aminoácido en la posición 1 y/o la posición 2 puede ser un aminoácido que reduce la susceptibilidad de descomposición por dipeptidil peptidasa IV. Más específicamente, en algunas realizaciones, la posición 1 del péptido es un aminoácido seleccionado del grupo formado por D-histidina, ácido alfa, alfa-dimetil imidiazol acético (DMIA) , N-metil histidina, alpha-metil histidina, ácido imidazol acético, desaminohistidina, hidroxil-histidina, acetil-histidina y homo-histidina . Más específicamente, en algunas realizaciones, la posición 2 del péptido antagonista/agonista es un aminoácido seleccionado del grupo de D-serina, D-alanina, valina, glicina, N-metil serina, N-metil alanina, y ácido aminoisobutírico (AIB) . Además por ejemplo, cuando el péptido comprende PLA como el aminoácido en la posición 4, 5, o 6, el aminoácido en la posición 3 del péptido puede ser ácido glutámico, a diferencia del residuo de glutamina nativo de glucagón nativo. En un ejemplo de realización de la invención, el péptido comprende en el extremo de N la secuencia de aminoácido de cualquiera de SEQ ID NOs : 1457-1459.

Con respecto a los péptidos que comprenden un compuesto de la Fórmula IV, el polímero puede ser cualquier polímero, siempre que pueda reaccionar con el grupo hidroxilo de PIA. El polímero puede uno que natural o normalmente comprende un carbonilo que lleva un nucleófilo. Al erna ivamente, el polímero puede ser uno que derivó para comprender el carbonilo que lleva el carbonilo. El polímero puede ser un polímero derivado de cualquiera de poliamidas, policarbonatos , polialquileno y derivados de ellos que incluyen polialquilenglicoles , óxidos de polialquileno, tereftalatos de polialquileno, polímeros de ésteres acrílico y metacrílico, que incluyen poli (metacrilato de metilo) , poli (metacrilato de etilo) , poli (methacrilato de butilo) , poli (metacrilato de isobutilo) , poli (metacrilato de hexilo) , poli (metacrilato de isodecilo) , poli (metacrilato de laurilo) , poli (metacrilato de fenilo) , poli (acrilato de metilo) , poli (acrilato de isopropilo) , poli (acrilato de isobutilo) , y poli (acrilato de octadecilo) , polímeros de polivinilo que incluyen alcoholes polivinílieos , éteres de polivinilo, esteres de polivinilo, haluros de polivinilo, poli (acetato de vinilo) , y polivinilpirrolidona, poliglicólidos , polisiloxanos , poliuretanos y copolímeros de ellos, celulosa, que incluye alquil celulosa, hidroxialquil celulosas, éteres de celulosa, ésteres de celulosa, nitro celulosas, metil celulosa, etil celulosa, hidroxipropil celulosa, hidroxi-propil metil celulosa, hidroxibutil metil celulosa, acetato de celulosa, propionato de celulosa, acetato de celulosa, ftalato de acetato de celulosa, carboxiletil celulosa, triacetato de celulosa y sal de sodio de sulfato de celulosa, polipropileno, polietilenos que incluyen poli (etilenglicol ) , poli (óxido de etileno) y poli (tereftalato de etileno) , y poliestireno .

El polímero puede ser un polímero biodegradable, que incluye un polímero biodegradable sintético (por ejemplo, polímeros de ácido láctico y ácido glicólico, polianhídridos , poli (orto) ésteres, poliuretanos, poli (ácido bútico) , poli (ácido valérico) , y poli (láctido-cocaprolactona) ) , y un polímero biodegradable natural (por ejemplo, alginato y otros polisacáridos que incluye dextrano y celulosa, colágeno, derivados químicos de ellos (sustituciones, agregados de grupos químicos, por ejemplo, alquilo, alquileno, hidroxilaciones, oxidaciones, y otras modificaciones realizadas de forma rutinaria por los expertos en el arte) , albúmina y otras proteínas hidrófilas (por ejemplo, Zein y otras prolaminas y proteínas hidrófobas) ) , así como cualquier copolímero o mezcla de ellos. En general, estos materiales se degradan o bien por hidrólisis enzimática o la exposición al agua in vivo, por la superficie o la erosión global.

El polímero puede ser un polímero bioadhesivo, tal como un hidromel descrito por H. S. Sawhney, C. P. Pathak and J. A. Hubbell in Macromolecules , 1993, 26, 581-587, cuyas enseñanzas se incorporan en la presente, ácidos polihialurónicos , caseína, gelatina, glutina, polianhídridos , ácido poliacrílico, alginato, quitosano, poli (metacrilato de metilo) , poli (metacrilato de etilo) , poli (metacrilato de butilo) , poli (metacrilato de isobutilo) , poli (metacrilato de hexilo) , poli (metacrilato de isodecilo) , poli (metacrilato de laurilo) , poli (metacrilato de fenilo) , poli (acrilato de metilo) , poli (acrilato de isopropilo) , poli (acrilato de isobutilo) , y poli (acrilato de octadecilo) .

En algunas realizaciones el polímero es un polímero soluble en agua. Los polímeros solubles en agua adecuados son conocidos en el arte e incluyen, por ejemplo, polivinilpirrolidona, hidroxipropil celulosa (HPC; KLUCEL) , hidroxipropilmetilcelulosa (HPMC; Methocel) , nitrocelulosa, hidroxipropil etilcelulosa, hidroxipropil butilcelulosa, hidroxipropil pentilcelulosa, metilcelulosa, etilcelulosa (Ethocel) , hidroxietil celulosa, diferentes alquil celulosas e hidroxialquil celulosas, diferentes éteres de celulosa, acetato de celulosa, carboximetilcelulosa, carboximetilcelulosa de sodio, carboximetilcelulosa de calcio, copolímeros de acetato de vinilo / ácido protónico, poli-hidroxialquil metacrilato, hidroximetil metacrilato, copolímeros de ácido metacrílico, ácido polimetacrílico, polimetilmetacrilato, copolímeros de anhídrido maleico / metil vinil éter, alcohol de polivinílico, ácido poliacrílico de sodio y calcio, ácido poliacrílico, polímeros de carboxi ácido, carboxipolimetileno, polímeros de carboxivinilo, copolímero de polioxietileno polioxipropileno, polimetilviniléter con anhídrido maleico, carboximetilamida, copolímero de metacrilato de potasio divinilbenceno, polioxietilenglicoles , óxido de polietileno, y derivados, sales y combinaciones de ellos.

En una realización específica, el polímero es un polialquilenglicol , que incluye, por ejemplo, polietilenglicol (PEG) .

El carbohidrato puede ser un carbohidrato siempre que comprenda o esté hecho para comprender un carbonilo con un grupo saliente alfa. El carbohidrato, por ejemplo, puede ser uno que se ha derivado para comprender un carbonilo con un grupo saliente alfa. Al respecto, el carbohidrato puede ser una forma derivada de un monosacárido (por ejemplo, glucosa, galactosa, fructosa), un disacárido (por ejemplo, sacarosa, lactosa, maltosa) , un oligosacáridos (por ejemplo, rafinosa, estaquiosa) , un polisacárido (un almidón, amilasa, amilopectina, celulosa, quitina, calosa, laminarían, xilano, mañano, fucoidan, galactomanano .

El lipido puede ser cualquier lipido que comprende un carbonilo con un grupo saliente alfa. El lipido, por ejemplo, puede ser uno derivado para comprender el carbonilo. Al respecto, el lipido puede ser un derivado de un ácido graso (por ejemplo, un ácido graso de C4-C30, eicosanoide, prostaglandina, leucotrienos, tromboxano, N-acil etanolamina) , glicerolípido (por ejemplo, gliceroles mono-, di-, tri-sustituidos) , glicerofosfolípido (por ejemplo, fosfatidilcolina, fosfatidilinositol , fosfatidiletnaolamina, fosfatidilserina) , esfingolípido (por ejemplo, esfingosina, ceramida) , lipido de esterol (por ejemplo, esteroide, colesterol) , lipido de prenol , sacarolípido, o un policetida, aceite, cera, colesterol, esterol, vitamina soluble en grasa, monoglicérido, diglicérido, triglicérido, un fosfolípido.

En algunas realizaciones, R7 tiene un peso molecular de 100 kDa o menos, por ejemplo de 90 kDa o menos, 80 kDa o menos, 70 kDa o menos, 60 kDa o menos, 50 kDa o menos, 40 kDa o menos. En consecuencia, R7 puede tener un peso molecular de 35 kDa o menos, 30 kDa o menos, 25 kDa o menos, 20 kDa o menos, 15 kDa o menos, 10 kDa o menos, 5 kDa o menos, o de 1 kDa.

En una realización alternativa, el péptido que comprende la estructura general de A-B-C comprende, como A, un péptido de 2 a 6 aminoácidos en donde dos aminoácidos consecutivos del péptido de A están unidos a través de un enlace de éster o éter. El enlace de éster o éter puede estar, por ejemplo, entre los aminoácidos 2 y 3, 3 y 4, 4 y 5, o 5 y 6. Opcionalmente , el péptido de A puede modificarse adicionalmente mediante la unión covalente a otro grupo químico que incluye la unión a un polímero (por ejemplo, un polímero hidrófilo) , alquilación o acilación.

En una realización específica, el péptido de la clase 5 descrito anteriormente que comprende PLA se modifica para comprender un derivado de oxi de PLA, tal como, por ejemplo, un éster de PLA o un éter de PLA. Por ejemplo, el péptido de la clase 5 puede comprender la secuencia de aminoácido de cualquiera de SEQ ID NO 1402, 1405-1420, 1422-1425, 1432-1436, 1438, 1439, 1445, 1446, y 1451, en donde PLA está unido a través de un enlace de éster o éter a un aminoácido, péptido, polímero, grupo acilo, o grupo alquilo. El aminoácido, péptido, polímero, grupo acilo, o grupo alquilo puede ser cualquiera de aquellos descritos en la presente. En el caso de que PLA esté unido a través de un enlace de éster a un aminoácido o péptido, el péptido de la clase 5 se puede considerar como un depsipeptido.

Además, en otra realización específica, el péptido de la clase 5 descrito anteriormente que carece de PLA se modifica para comprender por lo menos un enlace de éster o un enlace de éter entre dos aminoácidos consecutivos que son el extremo de N al aminoácido en la posición 7 (de acuerdo con la numeración de glucagón nativo) . En una realización específica, el péptido de la clase 5 comprende por lo menos un enlace de éster o éter entre los dos aminoácidos consecutivos. En una realización más específica, el péptido de la clase 5 comprende 6 aminoácidos del extremo de N de SEQ ID NO 1401 y dos aminoácidos consecutivos de los 6 aminoácidos de extremo de N están unidos por un enlace de éster o éter.

El péptido de A puede comprender cualquier aminoácido, sintético o natural, siempre que por lo menos dos aminoácidos consecutivos estén unidos a través de un enlace de éster o éter. En una realización específica, el péptido de A comprende ainoácidos de glucagón nativo. El aminoácido en la posición 1 y/o posición 2 puede ser un aminoácido que reduce la susceptibilidad a la descomposición por dipeptidil peptidasa IV. Por ejemplo, el péptido de A puede comprender en la posición 1 un aminoácido seleccionado del grupo formado por D-histidina, ácido alfa, alfa-dimetil imidiazol acético (DMIA) , M-metil histidina, alfa-metil histidina, ácido imidazol acético, desaminohistidina, hidroxil-histidina, acetil -histidina y homo-histidina . Más específicamente, en algunas realizaciones, la posición 2 del péptido de A es un aminoácido seleccionado de D-serina, D-alanina, valina, glicina, N-metil serina, N-metil alanina, y ácido aminoisobutírico (AIB) . Además, por ejemplo, el aminoácido en la posición 3 del péptido de A puede ser ácido glutámico, por oposición al residuo de glutamina nativo del glucagón nativo. Por consiguiente, el péptido de la estructura general de A-B-C puede comprender una secuencia de aminoácido de: Xaai-Xaa2-Xaa3-Thr-Gly-Phe (SEQ ID NO: 1507); Xaa2-Xaa3-Thr-Gly-Phe (SEQ ID NO: 1508) ; o Xaa3-Thr-Gly-Phe (SEQ ID NO: 1509) ; en donde Xaai se selecciona del grupo formado por: His, D-histidina, ácido alfa, alfa-dimetil imidiazol acético (DMIA) , N-metil histidina, alfa-metil histidina, ácido imidazol acético, desaminohistidina, hidroxil-histidina, acetil-histidina y homo-histidina; Xaa2 se selecciona del gruop formado por: Ser, D-serina, D-alanina, valina, glicina, N-metil serina, N-metil alanina, y ácido aminoisobutírico (AIB) ; y Xaa3 es Gln o Glu.

En algunas realizaciones B se modifica con hasta tres modificaciones de aminoácido. Por ejemplo, B, que representa la secuencia de aminoácido nativo de SEQ ID NO 1401 se modifica con una o más modificaciones de aminoácido conservadoras.

En otra realización, B comprende una o más modificaciones de aminoácido seleccionadas del grupo formado por (iv) a (x) , descritas en la presente. En una realización específica, B comprende una o ambas modificaciones de aminoácido (v) y (vi) . En otra realización específica, B comprende una o más combinaciones de modificaciones de aminoácidos seleccionadas del grupo formado por (iv) , (vii) , (viii) , (ix) , y (x) , además de (v) y (vi) .

Como se describe en la presente, el péptido que comprende la estructura general A-B-C puede comprender uno o más aminoácidos cargados en el extremo de C, por ejemplo, Y y/o Z, como se describe en la presente. Alternativamente o además, el péptido que comprende la estructura general A-B-C puede comprender además uno a dos aminoácidos con carga de extremo de C a Z, cuando C comprende X-Y-Z. Los aminoácidos con carga pueden ser, por ejemplo, uno de Lys, Arg, His, Asp, y Glu. En una realización específica, Y es Asp.

En algunas realizaciones, el péptido que comprende la estructura general A-B-C comprende un grupo hidrófilo unido en forma covalente a un residuo de aminoácido en la posición 1, 16, 20, 21 o 24 (de acuerdo con la numeración de aminoácido de SEQ ID NO 1401) , o en el residuo del extremo de N o C del péptido que comprende la estructura general A-B-C. En una realización específica, el grupo hidrófilo está unido a un residuo de Cys del péptido que comprende la estructura general A-B-C. Al respecto, el aminoácido en la posición 16, 21, 24 o 29 de glucagón nativo (SEQ ID NO 1401) se puede sustituir con un residuo de Cys. Alternativamente, un residuo de Cys que comprende un grupo hidrófilo se puede agregar al extremo de C del péptido que comprende la estructura general A-B-C como la posición 30 o como la posición 40, por ejemplo, cuando el péptido que comprende la estructura general A-B-C comprende una prolongación de extremo de C (posiciones de acuerdo con la numeración de aminoácido de SEQ ID NO 1401) Alternativamente, el grupo hidrófilo puede estar unido a PLA del péptido que comprende la estructura general A-B-C a través del grupo hidroxilo de PLA. El grupo hidrófilo puede ser cualquiera de los descritos en la presente, que incluyen por ejemplo, polietilenglicol .

En un aspecto específico, el péptido que comprende la estructura general A-B-C comprende una alfa-hélice estabilizada en virtud de la incorporación de un puente intramolecular. En algunas realizaciones el puente intramolecular es un puente de lactama. El puente de lactama puede estar entre los aminoácidos en las posiciones 9 y 12 , los aminoácidos en las posiciones 12 y 16, los aminoácidos entre las posiciones 16 y 20, los aminoácidos en las posiciones 20 y 24, o los aminoácidos en las posiciones 24 y 28 (de acuerdo con la numeración de aminoácido de SEQ ID NO 1401) . En una realización específica los aminoácidos en las posiciones 12 y 16 o en las posiciones 16 y 20 (de acuerdo con la numeración de aminoácido de SEQ ID NO 1401) están unidos a través un puente de lactama. Están contempladas otras posiciones del puente de lactama .

Además o alternativamente, el péptido que comprende la estructura general A-B-C puede comprender un aminoácido alfa, alfa-disustituido en, por ejemplo, cualquiera de las posiciones 16, 20, 21 o 24 (de acuerdo con la numeración de aminoácido de SEQ ID NO 1401) . En algunas realizaciones, el aminoácido alfa, alfa-disustituido es AIB. En un aspecto específico, el AIB está ubicado en la posición 16 (de acuerdo con la numeración de SEQ ID NO 1401) .

Alternativamente, el péptido que comprende la estructura general A-B-C se puede modificar para comprender un aminoácido en la posición 16 (de acuerdo con la numeración de aminoácido de SEQ ID NO 1401) , cuya modificación mejora la estabilidad de la alfa hélice. El aminoácido, en algunas realizaciones, es un aminoácido que comprende un ácido sulfónico de cadena lateral o un ácido carboxílico de cadena lateral. En una realización más específica, el aminoácido ácido se selecciona del grupo formado por Glu, Asp, ácido homoglutámico, un derivado de ácido sulfónico de Cys, ácido cisteico, ácido homocisteico, Asp y un derivado alquilado de Cys que tiene la estructura de: en donde X5 es alquilo de C1-C4, alquenilo de C2-C4, o alquinilo de C2-C4.

En una realización específica, el péptido de la clase 5 puede comprender la secuencia de aminoácido de cualquiera de SEQ ID NOS: 1460-1470, 1473-1478, 1480-1488, 1490-1496, 1503, 1504, 1506, y 1514-1518, o comprender la secuencia de aminoácido de cualquiera de los Péptidos 2-6 de la Tabla 13, los Péptidos 1-8 de la Tabla 14, y los Péptidos 2-6, 8, y 9 de la Tabla 15.

Tabla 13: Péptidos de Lactama, Cex glucagon (6-39) peptides y actividad de antagonista de glucagon y gonista de GLP-1 GLP-1 ECeo Glu IC, (nM) (nM) 1E9, K12,E16 FTSEYSKYLDE RAQDFVQWLMNTGPSSGAPPPS 1451 762 2E9, K12E16 (lactama) FTSEYSKYLDERRAQDFVQWLMNTGPSSGAPPPS 63 2008 3E9, E16K20 (lactama) FTSEYSKYLDERRAKDFVQWLMNTGPSSGAPPPS 36 42 D9, K12E16 (Lactama) FTSDYSKYLDERRAQDFVQWLMNTGPSSGAPPPS 118, 7 828 5 [PLA6, E9, 12E16 (Lactama) PLA- TSEYSKYLDERRAQDFVQWLMNTGPSSGAPPPS 6 72 6 [PLA6, E9, E16K20 (Lactama) ] PLA-TSEYSKYLDERRAKDFVQWLMNTGPSSGAPPPS 20 20 Tabla 14: Péptidos de Lactama glucagon (1-29 , 2-29, 4-29 and 6-29) y su actividad de antagonista de glucagon y agonista de GLP-1 (PA = antagonista parcial) * EC50 en receptor de glucagón Tabla 15 : Perfil Agonista / Antagonista Mezclado Análogos de Glucagón D9(6-29) En algunas realizaciones, el péptido que comprende la estructura general A-B-C es un péptido de la clase 5. En una realización específica, el péptido presenta por lo menos un 50% del agonismo máximo logrado por GLP-1 nativo en el receptor de GLP-1 nativo y por lo menos un 50% de inhibición de la respuesta máxima lograda por el glucagón nativo en el receptor de glucagón. En otra realización específica el péptido presenta por lo menos un 55%, por lo menos un 60% por lo menos un 70%, por lo menos un 80%, por lo menos un 90%, por lo menos un 95% o por lo menos un 100% del agonismo máximo logrado por GLP-1 nativo en el receptor de GLP-1. Alternativamente o además, el péptido puede presentar pór lo menos un 55%, por lo menos un 60%, por lo menos un 70$, por lo menos un 80%, por lo menos un 90%, por lo menos un 95% o por lo menos un 100% de inhibición de la respuesta máxima lograda por glucagón nativo en el receptor de glucagón.

En algunas realizaciones se proporciona un péptido con un péptido de la clase 5 o un conjugado de él, que comprende: (1) modificaciones que confieren actividad de antagonista de glucagón, que incluyen en forma no taxativa: (a) sustitución de Phe en la posición 6 con PLA (de acuerdo con la numeración de aminoácido de glucagón de tipo silvestre) , opcionalmente con eliminación de 1 a 5 amioácidos del extremo de N de glucagón de tipo silvestre, o (b) eliminación de 2 a 5 aminoácidos del extremo de N de glucagón de tipo silvestre, opcionalmente con ^ sustitución de Asp en la posición 9 de glucagón de tipo silvestre con ácido glutámico, ácido homoglutámico o un derivado de ácido sulfónico de cisteína (de acuerdo con la numeración de aminoácido de glucagón de tipo silvestre) ; L0 (2) modificaciones que confieren actividad de agonista de GLP-1, que incluyen en forma no taxativa: (a) inserción o susitución de aminoácido alfa, alfa- disustituido dentro de los aminoácidos 12-29 de glucagón de tipo silvestre, por ejemplo, en una, L5 dos, tres, cuatro o más de las posiciones 16, 17, 18, 19, 20, 21, 24 o 29 (de acuerdo con la numeración de aminoácido de glucagón nativo) ; (b) introducción de un puente intramolecular dentro de los aminoácidos 12-29 de glucagón de tipo silvestre, 20 por ejemplo un puente de sal o un puente de lactama u otro tipo de enlace covalente, o (c) sustitución del aminoácido en una o más de las posiciones 2, 3, 17, 18, 21, 23 o 24 (de acuerdo con la numeración de aminoácido de glucagón nativo) con el aminoácido correspondiente de GLP-1, por ejemplo Ser2 se reemplaza con Ala, Gln4 se reemplaza con Glu, Argl7 se reemplaza con Gln, Arg en la posición 18 se reemplaza co Ala, Asp en la posición 21 se reemplaza con Glu, Val en la posición 23 se reemplaza con lie y/o Gln en la posición 24 se reemplaza con Ala; o (d) otras modificaciones que estabilizan la estructura de alfa-hélice alrededor de las posiciones de L0 aminoácido 12-29 de acuerdo con la numeración de aminoácido de glucagón de tipo silvestre; (3) otras modificaciones que mejoran la actividad de agonista de GLP-1, por ejemplo (a) amida de extremo de C o éster en lugar de un L5 carboxilato de extremo de C; y opcionalmente (4) una o más de las siguientes modificaciones: (a) unión covalente a un grupo hidrófilo, tal como polietilenglicol , por ejemplo en el extremo de N, o 20 en la posición 6, 16, 17, 20, 21, 24, 29, 40 o en el aminoácido de extremo de C, y/o (b) acilación o alquilación; y opcionalmente (5) una o más de las siguientes modificaciones adicionales: unión covalente de aminoácidos, al extremo de N, por ejemplo 1-5 aminoácidos al extremo de N, opcionalmente a través de un enlace de éster a PLA e la posición 6 (de acuerdo con la numeración de glucagón de tipo silvestre) , opcionalmente junto con la modificación en la posición 1 o 2, por ejemplo, como se describe en la presente, que mejoran la resistencia a la descomposición por DPP-IV; eliminación de aminoácidos en las posiciones 29 y/o 28, y opcionalmente la posición 27 a la numeración de glucagón de tipo silvestre; enlace covalente de aminoácidos en el extremo de C; sustituciones no conservadoras, sustituciones conservadoras, agregados o eliminaciones mientras retienen la actividad deseada, por ejemplo, sustituciones conservadoras en una o más de las posiciones 2, 5, 7, 10, 11, 12, 13, 14, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 24, 27, 28 o 29, sustitución de Tyr en la posición 10 con Val o Phe, sustitución de Lys en la posición 12 con Arg, sustitución de una o más de estas posiciones con Ala; modificación del ácido aspártico en la posición 15, por ejemplo, mediante sustitución con ácido glutámico, ácido homoglutámico, ácido cisteico, ácido homocisteico, que puede reducir la degradación, o modificación de la serina en la posición 16, por ejemplo, mediante sustitución de treonina, AIB, ácido glutámico, o con otro aminoácido con carga negativa que tiene una cadena lateral con una longitud de 4 átomos, o alternativamente con cualquiera de glutamina, ácido homoglutámico o ácido homocisteico, que en forma similar puede reducir la degradación debido a la L0 descomposición del enlace de Aspl5-Serl6 ; (f) modificación de la metionina en la posición 27, por ejemplo, mediante sustitución con leucina o norleucina, para reducir la degradación oxidativa; (g) modificación de la Gln en la posición 20 o 24, por L c¡ ejemplo mediante la sustitución con Ala o AIB, para reducir la degradación que ocurre a través de la desaminacion de Gln (h) modificación de Asp en la posición 21, por ejemplo mediante la sustitución con Glu, para reducir la 20 degradación que ocurre a través de la deshidratación de Asp para formar un compuesto intermedio de succinimida seguido por la isomerización hacia iso- aspartato; (i) homodimerización o heterodimerización como se describe en la presente; y (j) combinación de las precedentes.

Se entiende que cualquiera de las modificaciones dentro la misma clase se pueden combinar juntas y/o se combinan modificaciones de diferentes clases. Por ejemplo, las modificaciones de (1) (a) se pueden combinar con (2) (a) y (3) ; (1) (a) se puede combinar con (2) (c) y (3); (1) (b) se puede combinar con (2) (a) y (3); (1) (b) se puede combinar con (2) (b) , por ejemplo puente de lactama o puente de sal, y (3) ; (1) (b) se puede combinar con (2) (c) y (3) ; cualquiera de las precedentes se puede combinar con (4) (a) y/o (4) (b) ; y cualquiera de las precedentes se puede combinar con (5) (a) a (5) (k) .

En ejemplos de realizaciones, el aminoácido alfa, alfa-disustituido AIB se sustituye en una, dos, tres, o la totalidad de las posiciones 16, 20, 21, o 24 (de acuerdo con la numeración de aminoácido de glucagón de tipo silvestre) .

En ejemplos de realizaciones, el puente intramolecular es un puente de sal .

En otros ejemplos de realizaciones, el puente intramolecular es un enlace covalente, por ejemplo un puente de lactama. En algunas realizaciones, el puente de lactama está entre los aminoácidos en las posiciones 9 y 12 , los aminoácidos en las posiciones 12 y 16, los aminoácidos en las posiciones 16 y 20, los aminoácidos en las posiciones 20 y 24, o los aminoácidos en las posiciones 24 y 28 (de acuerdo con la numeración de aminoácido de SEQ ID NO 1401) .

En ejemplos de realizaciones, la acilación o alquilación está en la posición 6, 10, 20 o 24 o el extremo de N o el extremo de C (de acuerdo con la numeración de aminoácido de glucagón de tipo silvestre) (SEQ ID NO 1401) .

En ejemplos de realizaciones, las modificaciones incluyen: (i) sustitución de Asp en la posición 15 (de acuerdo con la numeración de SEQ ID NO 1401) con ácido cisteico, ácido glutámico, ácido homoglutámico y ácido homocisteico; (ii) sustitución de Ser en la posición 16 (de acuerdo con la numeración de SEQ ID NO 1401) con ácido cisteico, ácido glutámico, ácido homoglutámico, y ácido homocisteico; (iii) sustitución de Asn en la posición 28 con un aminoácido con una carga, (iv) sustitución de Asp en la posición 28 con un aminoácido con carga seleccionado del grupo formado por Lys, Arg, His, Asp, Glu, ácido cisteico, y ácido homocisteico, (v) sustitución en la posición 28 con Asn, Asp o Glu; (vi) sustitución en la posición 28 con Asp; (vii) sustitución en la posición 28 con Glu; (viii) sustitución de Thr en la posición 29 con un aminoácido con carga; (ix) sustitución de Thr en la posición 29 con un aminoácido con carga del grupo formado por Lys, Arg, His, Asp, Glu, ácido cisteico y ácido homocisteico; (x) sustitución en la posición 29 con Asp, Glu o Lys; (xi) sustitución en la posición 29 con Glu; (xii) inserción de 1-3 aminoácidos con carga después de la posición 29; (xiii) inserción después de la posición 29 de Glu o Lys; (xiv) inserción después de la posición 29 de Gly-Lys o Lys-Lys; o combinaciones de ellas.

Cualquiera las modificaciones descritas anteriormente que aumentan la actividad de agonista de receptor de GLP-1, la actividad de antagonista de receptor de glucagón, solubilidad de péptido, y/o estabilidad de péptido se pueden aplicar individualmente o en combinación.

Modificación para mejorar la estabilidad De acuerdo con algunas realizaciones los péptidos de la clase 5 revelados en la presente se pueden modificar para incluir la secuencia de aminoácido de SEQ ID NO: 1421 (GPSSGAPPPS) , o SEQ ID NO: 1450, unidas al aminoácido de extremo de carboxi (posición 24) del péptido de la clase 5 y administrar a individuos para inducir la pérdida de peso o contribuir al mantenimiento del peso. Más específicamente, el péptido de la clase 5 comprende una secuencia esleccionada del grupo formado por SEQ ID NO: 1405, SEQ ID NO: 1406, SEQ ID NO: 1407, SEQ ID NO: 1408, SEQ ID NO: 1409, SEQ ID NO: 1412, SEQ ID NO: 1413, SEQ ID NO: 1414, SEQ ID NO: 1416, SEQ ID NO: 1417, SEQ ID NO: 1418, SEQ ID NO: 1419, SEQ ID NO: 1422, SEQ ID NO: 1423, SEQ ID NO: 1424 y SEQ ID NO: 1425 y que comprende además la secuencia de aminoácido de SEQ ID NO: 1421 (GPSSGAPPPS), o SEQ ID NO: 1450, unida al aminoácido del extremo de carboxi (posición 24) del péptido o el péptido de la clase 5, se usa para suprimir el apetito e inducir la pérdida de peso/mantenimiento de peso. En algunas realizaciones el péptido o el péptido de la clase 5 administrados comprende una secuencia seleccionada del grupo formado por SEQ ID NO: 1416, SEQ ID NO: 1417, SEQ ID NO: 1418y SEQ ID NO: 1419, que además comprende la secuencia de aminoácido de SEQ ID NO: 1421 (GPSSGAPPPS) unida al aminoácido de extremo de carboxi (posición 24) del péptido de la clase 5. En algunas realizaciones el método comprende administrar un péptido o péptido de la clase 5 que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 1445 O SEQ ID NO: 1446.

Por consiguiente, se espera que los péptidos de la clase 5 revelados en la presente se puedan modificar en forma similar para reducir su susceptibilidad a la descomposición química prematura en tampones acuosos. De acuerdo con algunas realizaciones los péptidos de la clase 5 descritos en la presente se pueden modificar también para mejorar su estabilidad en soluciones acuosas reemplazando el aminoácido aspártico nativo, ubicado en la posición correspondiente 15 de glucagón nativo, con un aminoácido seleccionado del grupo formado por ácido cisteico, ácido glutámico, ácido homoglutámico y ácido homocisteico . De acuerdo con algunas realizaciones el residuo de ácido aspártico en la posición 10 del péptido de la clase 5 de SEQ ID NO: 1405, SEQ ID NO: 1406, SEQ ID NO: 1407 o SEQ ID NO: 1408 se puede sustituir con un aminoácido seleccionado del grupo formado por ácido cisteico, ácido glutámico, ácido homoglutámico y ácido homocisteico y en algunas realizaciones el ácido aspártico nativo en la posición 10 de SEQ ID NO: 1405, SEQ ID NO: 1406, SEQ ID NO: 1407 o SEQ ID NO: 1408 se reemplaza con ácido glutámico. De acuerdo con algunas realizaciones se proporciona un péptido de la clase 5 que tiene estabilidad mejorada en soluciones acuosas en donde el antagonista comprende una secuencia modificada de SEQ ID NO 1409, en donde la modificación comprende la sustitución de la Asp en la posición 10 de SEQ ID NO 1409 con Glu. En algunas realizaciones se proporciona un péptido de la clase 5 que comprende una secuencia seleccionada¦ del grupo formado por SEQ ID NO: 1422, SEQ ID NO: 1423, SEQ ID NO: 1424 y SEQ ID NO: 1425. En algunas realizaciones el péptido de la clase 5 está amidado.

La secuencia de Asp-Ser en la posición 15-16 de glucagón nativo se ha identificado como un dipéptido exclusivamente inestable que deriva en la descomposición química prematura de la hormona nativa en tampones acuosos. Por ejemplo, cuando se mantiene a ?,??? HCl a 37°C durante 2 semanas, más del 50% del glucagón nativo se puede descomponer en fragmentos. Los dos péptidos de descomposición liberados 1-15 y 16-29 están desprovistos de actividad similar a glucagón y por lo tanto representan una limitación sobre la preformulación acuosa de glucagón y sus análogos relacionados. Se ha observado que la sustitución química selectiva de la Asp en la posición 15 de glucagón nativo con Glu virtualmente elimina la descomposición química del énla'ce de péptidos 15-16.

En aún otros ejemplos de realizaciones cualquiera de los compuestos precedentes se puede modificar adicionalmente para mejorar la estabilidad modificando el aminoácido correspondiente a la posición 15 o 16 de glucagón nativo, para reducir la degradación del péptido en el tiempo, especialmente en tampones ácidos o alcalinos.

Modificación para mejorar la solubilidad El péptido de la clase 5 se puede modificar adicionalmente para mejorar la solubilidad del péptido en solución acuosa a pH fisiológico, en ciertos aspectos, mientras retiene la actividad de antagonista de glucagón y de agonista de GLP-1. La introducción de grupos hidrófilos en las posiciones correspondientes a las posiciones 12, 15, 16, 19 y 24 del péptido de SEQ ID NO 1405 o en las posiciones 12, 16, 19 o 24 del péptido de SEQ ID NO 1406 puede mejorar la solubilidad de los péptidos resultantes en solución que tienen un pH fisiológico, mientras que retiene la actividad de antagonista de glucagón y agonista de GLP de los compuestos parentales. En consecuencia, en algunas realizaciones, el péptido de la clase 5 revelado en la presente que también se modifica para comprender uno o más grupos hidrófilos unidos en forma covalente a las cadenas laterales de aminoácidos que corresponden a las posiciones de aminoácido 12, 15, 16, 19 y 24 del péptido de SEQ ID NO 1405 o SEQ ID NO 1406.

En otra realización las cadenas laterales de aminoácidos que corresponden a las posiciones de aminoácido 16 y 19 de SEQ ID NO 1405 o SEQ ID NO 1406 están unidas en forma covalente a grupos hidrófilos, y en algunas realizaciones el grupo hidrófilo es polietilenglicol (PEG) .

Los péptidos de glucag n de la clase 5 se pueden modificar introduciendo una carga en su extremo de carboxi para mejorar la solubilidad del péptido mientras retiene las propiedades de agonista del péptido. La solubilidad mejorada permite las preparaciones y el almacenamiento de soluciones de glucagón cerca de pH neutro. La formulación de soluciones de glucagón a pH relativamente neutros (por ejemplo pH de 6,0 a 8,0) mejora la solubilidad prolongada de los péptidos de la clase 5.

Los solicitantes anticipan que los péptidos de la clase 5 revelados en la presente se pueden modificar en forma similar para mejorar su solubilidad en soluciones acuosas a pH relativamente neutro (por ejemplo pH de 6,0 a 8,0), en algunos casos, mientras retienen la actividad de antagonista de glucagón y de GLP-1. Por consiguiente, algunas realizaciones se refieren a un antagonista de glucagón / GLP-1 de SEQ ID NO: 1405, SEQ ID NO: 1406, SEQ ID NO: 1407 o SEQ ID NO: 1408 que se ha modificado adicionalmente en relación con los aminoácidos nativos presentes en la posición 6-29 del glucagón de tipo silvestre (SEQ ID NO: 1401) para agregar una carga al péptido mediante la sustitución de aminoácidos sin carga nativos con aminoácidos con carga, o el agregado de aminoácidos con carga al extremo de carboxi . De acuerdo con algunas realizaciones, uno a tres aminoácidos nativos sin carga de los péptidos de la clase 5 revelados en la presente se reemplazan con un aminoácido con carga. En algunas realizaciones el aminoácido con carga se selecciona del grupo formado por lisina, arginina, hitidina, ácido aspártico y ácido glutámico. Más específicamente, los solicitantes han descubierto que la sustitución del aminoácido normal que corresponde a la posición 28 y/o 29 (en relación con glucagón nativo) con aminoácidos con carga, y/o el agregado de uno a dos aminoácidos con carga en el extremo de carboxi del péptido, mejora la solubilidad y estabilidad del péptido de la clase 5 en soluciones acuosas a pH fisiológicamente relevantes (por ejemplo un pH de 6,5 a 7,5). Por consiguiente, se anticipa que dichas modificaciones de péptidos de la clase 5 tienen un efecto similar sobre la solubilidad en soluciones acuosas, específicamente a un pH en la gama de 5,5 a 8,0, mientras que retiene la actividad biológica del péptido parental .

De acuerdo con algunas realizaciones el péptido de la clase 5 de SEQ ID NO: 1405, SEQ ID NO: 1406, SEQ ID NO: 1407 o SEQ ID NO: 1408 se modifica mediante la sustitución del aminoácido nativo en la posición 23 y/o 24 de esas secuencias con un aminoácido con carga negativa (por ejemplo, ácido aspártico o ácido glutámico) y opcionalmente el agregado de un aminoácido con carga negativa (por ejemplo, ácido aspártico o ácido glutámico) al extremo de carboxi del péptido. En una realización alternativa un péptido de la clase 5 que comprende SEQ ID NO: 1405, SEQ ID NO: 1406, SEQ ID NO: 1407 o SEQ ID NO: 1408 se modifica mediante la sustitución del aminoácido nativo en la posición 24 de SEQ ID NO: 1405, SEQ ID NO: 1406, SEQ ID NO: 1407 o SEQ ID NO: 1408 con un aminoácido con carga positiva (por ejemplo, lisina, arginina, o histidina) y opcionalmente el agregado de uno o dos aminoácidos con carga positiva (por ejemplo, lisina, arginina, o histidina) en el extremo de carboxi del péptido. De acuerdo con algunas realizaciones se proporciona un péptido de la clase 5 que tiene solubilidad y estabilidad mejorada en donde el análogo comprende la secuencia de aminoácido de SEQ ID NO 1415 o SEQ ID NO 1451 con la condición de que por lo menos un aminoácido en la posición 23 o 24 de SEQ ID NO 1415 o SEQ ID NO 1451 se sustituya con un aminoácido ácido y/o se agregue un aminoácido ácido adicional en el extremo de carboxi de SEQ ID NO 1415 o SEQ ID NO 1451. En algunas realizaciones los aminoácidos ácidos se seleccionan del grupo formado por Asp, Glu, ácido cisteico y ácido homocisteico .

De acuerdo con algunas realizaciones se proporciona un péptido de la clase 5 que tiene solubilidad y estabilidad mejorada en donde el antagonista comprende la secuencia de aminoácido de SEQ ID NO: 1416, SEQ ID NO: 1417, SEQ ID NO: 1418 O SEQ ID NO: 1419. De acuerdo con algunas realizaciones se proporciona un agonista de glucagón que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 1416 o SEQ ID NO: 1417. En algunas realizaciones el péptido de la clase 5 comprende la secuencia de SEQ ID NO: 1420.

De acuerdo con algunas realizaciones se proporciona un péptido de la clase 5 que comprende la secuencia de SEQ ID NO 1415 o SEQ ID NO 1451. En algunas realizaciones, la posición 4 de SEQ ID NO 1415 o SEQ ID NO 1451 es ácido aspártico, ácido glutámico, ácido homoglutámico, ácido cisteico o ácido homocisteico, y en algunas realizaciones la posición 4 es ácido aspártico, ácido glutámico, ácido cisteico, o ácido homocisteico, y en otra realización la posición 4 de SEQ ID NO 1415 o SEQ ID NO 1451 es ácido aspártico o ácido glutámico y en algunas realizaciones la posición 4 de SEQ ID NO 1415 o SEQ ID NO 1451 es ácido aspártico. En algunas realizaciones se proporciona un péptido de la clase 5 que comprende la secuencia de SEQ ID NO 1415 o SEQ ID NO 1451 en donde la posición 4 de SEQ ID NO 1415 es ácido aspártico y la posición 10 de SEQ ID NO 1415 es ácido glutámico. En otra realización el aminoácido del extremo de C de SEQ ID NO 1415 o SEQ ID NO 1451 se modifica para reemplazar el grupo ácido carboxílico nativo con un grupo de carga neutra tal como una amida o un éster.

Fusiones de péptidos de la clase 5 En otra realización, el aminoácido de extremo de carboxi del péptido de la clase 5 descrito en la presente está unido en forma covalente a un segundo péptido que comprende una secuencia seleccionada del grupo formado por SEQ ID NOs : 1421, 1426, 1427, y 1450. Por ejemplo, en algunas realizaciones, el péptido de la clase 5 SEQ ID NO: 1415, SEQ ID NO: 1451, SEQ ID NO: 1405, SEQ ID NO: 1406, SEQ ID NO: 1407, SEQ ID NO: 1408, SEQ ID NO: 1412, SEQ ID NO: 1413, SEQ ID NO: 1414, SEQ ID NO: 1416, SEQ ID NO: 1417, SEQ ID NO: 1418, SEQ ID NO: 1419, SEQ ID NO: 1422, SEQ ID NO: 1423, SEQ ID NO: 1424 y SEQ ID NO: 1425 se une en forma covalente a un segundo péptido que comprende una secuencia seleccionada del grupo formado por SEQ ID NO: 1421 (GPSSGAPPPS) , SEQ ID NO: 1426 ( RNRNNIA), SEQ ID NO: 1427 (KRNR) y SEQ ID NO: 1450 (GPSSGAPPPSX) .

En algunas realizaciones se proporciona un dímero de péptido de la clase 5 que comprende dos secuencias seleccionadas independientemente del grupo formado por SEQ ID NO: 1405, SEQ ID NO: 1406, SEQ ID NO: 1407, SEQ ID NO: 1408, SEQ ID NO: 1409, SEQ ID NO: 1422, SEQ ID NO: 1423, SEQ ID NO: 1424 y SEQ ID NO: 1425 que también comprende una secuencia de aminoácido de SEQ ID NO: 1421 (GPSSGAPPPS) unida al aminoácido de extremo de carboxi del péptido de la clase 5.

En algunas realizaciones el péptido de la clase 5 se modifica adicionalmente truncando o eliminando uno o dos aminoácidos del extremo de C del péptido (es decir truncando el aminoácido en la posición 29 o en la posición 28 y 29 de glucagón nativo) . Preferentemente el truncado no afecta la actividad (por ejemplo antagonismo de glucagón/agonismo de GLP-1) de un péptido de la clase 5.

Conjugados de péptidos de la clase 5 También se proporcionan conjugados de péptidos de la clase 5 en donde el péptido de glucagón está unido, opcionalmente a través de un enlace covalente y opcionalmente a través de un conector, a un grupo conjugado.

En aquellas realizaciones en donde el péptido de la clase 5 comprende una cadena de polietilenglicol , la cadena de polietilenglicol puede estar en forma de una cadena recta o puede ser ramificada. De acuerdo con algunas realizaciones la cadena de polietilenglicol tiene un peso molecular promedio de la gama de 500 a 10.000 Dalton. En algunas realizaciones la cadena de polietilenglicol tiene un peso molecular promedio seleccionado de la gama de 1.000 a 5.000 Dalton. En algunas realizaciones la cadena de polietilenglicol tiene un peso molecular promedio seleccionado de la gama de 1.000 a 5.000 Dalton. En algunas realizaciones, la cadena de polietilenglicol tiene un peso molecular promedio seleccionado de 1.000 a 2.000 Dalton. En algunas realizaciones la cadena de polietilenglicol tiene un peso molecular promedio de 1.000 Dalton.

En algunas realizaciones el peptido de la clase 5 pegilado comprende un peptido que comprende la secuencia de SEQ ID NO 1415 o SEQ ID NO 1451 en donde la cadena de polietilenglicol está unida a un aminoácido seleccionado de las posiciones 11, 12, 15, 16, 19 y 24 de SEQ ID NO 1415 o SEQ ID NO 1451 y el peso molecular de la cadena de PEG es de 1.000 a 5.000 Dalton. En algunas realizaciones el péptido de la clase 5 pegilado comprende un péptido que comprende la secuencia de SEQ ID NO 1415 o ESQ ID NO 1451, en donde la cadena de polietilenglicol está unida al aminoácido en la posición 16 o 19 de SEQ ID NO 1415 o SEQ ID NO 1451 y el peso molecular de la cadena de PEG es de 1.000 a 5.000 Dalton. En otra realización el péptido de la clase 5 modificado comprende dos o más cadenas de polietilenglicol unidas en forma covalente al péptido en donde el peso molecular total de las cadenas de glucagón es de 1.000 a 5.000 Dalton. En algunas realizaciones el péptido de la clase 5 comprende la secuencia de SEQ ID NO 1415 o SEQ ID NO 1451 en donde la cadena de polietilenglicol está unida al aminoácido en las posiciones 16 y 19 de SEQ ID NO 1415 o SEQ ID NO 1451 y el peso molecular combinado de las dos cadenas de PEG es de 1.000 a 5.000 Dalton.

El péptido relacionado con glucagón de la clase 5 puede comprender la secuencia de aminoácido de cualquiera de SEQ ID NO 1401-1518, opcionalmente con hasta 1, 2, 3, 4, o 5 otras modificaciones que retienen la actividad de antagonista de glucagón y agonista de GLP-1.

Efecto de la estructura del elemento profármaco de dipéptido sobre la proporción de descomposición.

Según lo descripto anteriormente, la proporción de descomposición del elemento profármaco de dipéptido A-B del péptido de la superfamilia de glucagón y, por lo tanto, la activación del profármaco, dependen de la estructura (incluidos la N-alquilación, número de sustituyentes , longitud o volumen) y de la estereoquímica de los aminoácidos del elemento profármaco del dipéptido. La proporción de descomposición del elemento profármaco del dipéptido A-B del péptido de la superfamilia de glucagón también depende del impedimento estérico, la nucleofilicidad, la estabilidad del grupo que se despide de Q durante la formación de dicetopiperazina . Algunas de estas características estructurales son descriptas en las Categorías I, II y III mencionadas a continuación, que también forman parte de esta invención. Se encuentran explícitamente excluidos de estas categorías las secuencias de péptidos divulgadas en la solicitud internacional PCT/US2009/68745 , presentada el 18 de diciembre de 2009 o en su listado de secuencias y las subcategorías de (1) elementos profármacos de dipéptido, (2) aminoácidos A y/o (3) aminoácidos B divulgados en la solicitud internacional PCT/US2009/68745 , presentada el 18 de diciembre de 2009, en la medida en que se encuentren completamente o se superpongan parcialmente con cualquiera de las subcategorías descriptas en la presente descripción y sólo en la medida en que otorguen novedad al objeto reivindicado.

Categoría I : Composición de aminoácido B del elemento profármaco del dipéptido En algunas realizaciones, la semivida del profármaco, por ejemplo, la semivida de la descomposición química (ti/2) de A-B a partir de Q de por lo menos 1 hora a, aproximadamente, 1 semana en PBS, bajo condiciones psicológicas, depende de la presencia y longitud del sustituyente N-alquilo en el aminoácido B. Por ejemplo, un profármaco que tiene un sustituyente N-alquilo más carto en el aminoácido B (por ejemplo, Gly (N-metilo) experimentará una proporción de descomposición A-B más lenta y tiene una semivida más larga que un profármaco que tiene un sustituyente N-alquilo más largo en el aminoácido B (por ejemplo, Gl (N-hexilo) ) .

En algunas realizaciones, la semivida del profármaco depende del grado de sustitución de la posición beta del aminoácido B del elemento profármaco de dipéptido. Por ejemplo, un profármaco que tiene un aminoácido B que es disustituido de la posición beta (por ejemplo, isoleucina N-alquilada) experimentará una descomposición A-B más lenta y tiene una semivida más larga que un profármaco que tiene un aminoácido B monosustituido en la posición beta (por ejemplo, leucina N-alquilada) . Además, un profármaco que tiene un aminoácido B monosustituido en la posición beta (por ejemplo, leucina N-alquilada) experimentará una descomposición de A-B más lenta y tienen una semivida más larga que un profármaco que tiene un aminoácido que es sustituido en la posición beta (por ejemplo, alanine N-alquilada. Además, un profármaco que tiene un aminoácido B que tiene un carbono en la posición beta (por ejemplo, alanina N-alquilada) experimentará una descomposición A-B más lenta y tiene una semivida más larga que un profármaco que tiene una glicina como aminoácido B.

En algunas realizaciones, la semivida del profármaco depende del volumen de la cadena lateral del aminoácido B. Por ejemplo, un profármaco que tiene una cadena lateral más voluminosa en el aminoácido B (por ejemplo, fenilamina N-alquilada) experimentará una descomposición de A-B más lenta y tiene una semivida más larga que un profármaco que tiene una cadena lateral menos voluminosa en el aminoácido B (por ejemplo, alanina N-alquilada) .

La composición del aminoácido B del elemento profármaco del dipéptido puede clasificarse en las sub-categorías IA, IB y IC. Generalmente, el elemento profármaco del dipéptido en la sub-categoría IA experimenta la descomposición más rápida y los elementos profármacos del dipéptido en sub-categoría IC experiementan la descomposición más lenta.

Sub-categoría IA: el aminoácido B del elemento de profármaco del dipéptido es glicina N-alquilada.

En algunas realizaciones, el profármaco comprende la estructura: A-B-Q en donde Q es un péptido de la superfamilia de glucagón; en donde A-B comprende la estructura: O 4 R8 j en donde Ri y R2 son independientemente seleccionados de un grupo que consiste en H, Ci-Ci8 alquilo, C2-Ci8 alquenilo, (Ci-C18 alquilo) OH, (Ci-Ci8 alquilo) SH, (C2-C3 alquilo) SCH3 , (C1-C4 alquilo) CONH2 , (Ci-C4 alquilo) COOH, (C1-C4 alquilo) NH2, (C;L-C4 alquilo) NHC (NH2+) H2 , (C0-C4 alquilo) (C3-C6 cicloalquilo) , (C0-C4 alquilo) (C2-C5 heterocíclico) , (C0-C alquilo) (C6-Ci0 arilo) 7, (C1-C4 alquilo) (C3-C9 heteroarilo) y C1-C12 alquilo (Wi) Ci-C12 alquilo, en donde Wj. es un heteroátomo seleccionado del grupo que consiste en N, S y O, o Ri y R-2 junto con los átomos a los cuales están unidos forman un C3-C12 cicloalquilo; R3 es Ci-Ci8 alquilo; R y R8 son, cada uno, H; R5 es NHR6; R6 es H o Ci-C4 alquilo, o R5 y R2 junto con los átomos a los cuales están unidos forman un anillo heterocíclico de 4, 5 o 6 miembros y R7 es seleccionado del grupo que consiste en H, OH, halo, (C1-C7 alquilo), (C2-C7 alquenilo), OCF3, N02, CN, NC, 0(Ci-C7 alquilo), C02H, C02(Ci-C7 alquilo), NHR6, arilo y heteroarilo.

En algunas realizaciones, el aminoácido B es seleccionado del grupo que consiste en glicina (N-metilo) , glicina (N-etilo) , glicina (N-propilo) , glicina (N-butilo) , glicina (N-pentilo) , glicina (N-hexilo) , glicina (N-heptilo) , and glicina (N-octilo) . Por ejemplo, el aminoácido B puede ser glicina (N-metilo) o glicina (N-hexilo) .

En algunas realizaciones, cuando Ri y R2 son ambos hidrógeno, R3 es Cj.-C4 alquilo, por ejemplo, cuando A-B es conjugado a una amina alifática. En algunas realizaciones, cuando Ri y R2 son ambos hidrógeno, R3 es C5-C8 alquilo, por ejemplo, cuando A-B es conjugado con una amina alifática. En algunas realizaciones cuando al menos uno de Ri o R2 no es hidrógeno, R3 es C1-C4 alquilo, por ejemplo, cuando A-B es conjugado con una amina alifática. En algunas realizaciones cuando al menos uno de Rx o R2 no es hidrógeno, R3 es C5-C8 alquilo, por ejemplo, cuando A-B es conjugado con una amina alifática.

En algunas realizaciones, cuando Ri y R2 son ambos hidrógeno y R3 es metilo, A-B no es conjugado con el grupo amino alfa de F7GLP-1 (8-37) .

Sub-Categoría IB: el aminoácido B del element profármaco dipéptido no es sustituido o en monosustituido en la posición beta .

En algunas realizaciones, el profármaco comprende la estructura: A-B-Q; en donde Q es un peptide de la superfamilia de glucagón; en donde A-B comprende la estructura: O R4 R8 t en donde Ri y 2 son independientemente seleccionados de un grupo que consiste en H, Cx-Cis alquilo, C2-Ci8 alquenilo, (Ci-Ci8 alquilo) OH, (C1-C18 alquilo) SH, (C2-C3 alquilo) SCH3 , (C1-C4 alquilo) CONH2 , (C3.-C4 alquilo) COOH, (C!-C4 alquilo) NH2, (C3.-C4 alquilo) NHC (MH2+) NH2 , (C0-C4 alquilo) (C3-C6 cicloalquilo) , (C0-C4 alquilo) (C2-C5 heterocyclic) , (C0-C4 alquilo) (C6-C10 arilo)R7, (C1-C4 alquilo) (C3-C9 heteroarilo) , and Ci-Ci2 alquilo (Wi) Ci-Ci2 alquilo, en donde Wi es un heteroátomo seleccionado de un grupo que consiste en N, S y O, o Ri y R2 junto con los átomos a los cuales están unidos forman un C3-Ci2 cicloalquilo; R3 es Ci-Cis alquilo; R4 es seleccionado de un grupo que consiste en CH3, CH2(Ci-Ci0 alquilo), CH2(C2-Ci0 alquenilo) , CH2(C0-Ci0 alquilo) OH, CH2 (C0-Ci0 alquilo) SH, CH2(C0-C3 alquilo) SCH3 , CH2 (C0-C3 alquilo) CONH2 , CH2 (C0-C3 alquilo) COOH, CH2(C0-C3 alquilo) NH2, CH2(C0-C3 alquilo) NHC (NH2+) NH2 , CH2(C0-C3 alquilo) (C3-C6 cicloalquilo) , CH2(C0-C3 alquilo) (C2-C5 heterocíclico) , CH2 (C0-C3 alquilo) (C6-Ci0 arilo)R7, CH2(Ci-C3 alquilo) (C3-C9 heteroarilo) y CH2(C0-C12 alquilo) (Wi)Ci-Ci2 alquilo, en donde Wi es un heteroátomo seleccionado de un grupo que consiste en N, S y O; o R4 y R3 junto con los átomos a los cuales están unidos forman un anillo heterocíclico de 4 , 5 o 6 miembros; R8 es H, R5 es NHR6 o R5 y R2 junto con los átomos a los cuales están unidos forman un anillo heterocíclico de 4 , 5 o 6 miembros; R6 es H o Ci-C alquilo y R7 es seleccionado de un grupo que consiste en H, OH, halo, (C1-C7 alquilo), (C2-C7 alquenilo), OCF3, N02, CN, NC, 0(C:.-C7 alquilo), C02H, C02(Ci-C7 alquilo), NHR6, arilo y heteroarilo.

En algunas realizaciones, R4 es seleccionado de un grupo que consiste en CH3, CH2 (C!-C4 alquilo), CH2 (Ci-C4) alquenilo, CH2(C0-C4 alquilo) OH, CH2(C0-C4 alquilo) SH, CH2 (C0-C3 alquilo) SCH3í CH2(C0-C3 alquilo) CONH2, CH2(C0-C3 alquilo) COOH, CH2 (C0-C4 alquilo) NH2 y CH2(C0-C3 alquilo) NHC (NH2+) NH2.

Entre los ejemplos no taxativos de los aminoácidos B en estas realizaciones se incluyen alanina (N-Ci-Ci0alquilo) , leucina (N-Ci-Ci0alquilo) , metionina (N-Ci-Ci0alquilo) , asparagina (N-Ci- Ci0alquilo) , ácido glutámico (N-Ci-Ci0alquilo) , ácido aspártico (N-Ci-Cioalquilo) , glutamina (N-Ci-Ci0alquilo) , histidina (N-Ci- Ci0alquilo) , lisina (N-Ci-C10alquilo) , arginina (N-Ci-Cioalquilo) , serina (N-Ci-Ci0alquilo) y cisteína (N-Ci-Ci0alquilo) .

En algunas realizaciones, el aminoácido B es seleccionado de un grupo que consiste en alanina (N-Ci-C6alquilo) , leucina (N-Ci-C6alquilo) , metionina (N-Ci-C6alquilo) , asparagina (N-Ci-Cealqüilo) , ácido glutámico (N-Cx-Cgalquilo) , ácido aspártico (N-Ci-C6alquilo) , glutamina (N-Ci-C6alquilo) , histidina (N-Ci-C6alquilo) , lisina (N-Ci-C6alquilo) , arginina (N-Ci-C6alquilo) , serina (N-C!-C6alquilo) y cisteína (N-Ci-C6alquilo) .

Por ejemplo, el aminoácido B puede incluir alanina (N-metilo) , leucina (N-metilo) , metionina (N-metilo) , asparagina (N-metilo) , ácido glutámico (N-metilo) , ácido aspártico ( -metilo) , glutamina (N-metilo) , histidina (N-metilo) , lisina (N-metilo) , arginina (N-metilo) , serina (N-metilo) y cisteína (N-metilo) .

En algunas realizaciones, R4 es seleccionado de un grupo que consiste en CH2(C0-C3 alquilo) (C3-C6 cicloalquilo) , CH2(C0-C3 alquilo) (C2-C5 heterocyclic) , CH2(C0-C3 alquilo) (C6-Cio arilo)R7, CH2(Ci-C3 alquilo) ( C3-C9 heteroarilo) y CH2 (C0-Ci2 alquilo) (Wi) Ci-C12 alquilo, en donde i es un heteroátomo seleccionado de un grupo que consiste en N, S y 0, y en donde R7 es seleccionado de un grupo que consiste en H y OH.

Loe ejemplos no taxativos del aminoácido B en estas realizaciones incluyen fenilalanina (N-Ci-Ci0alquilo) , tirosina (N-Cx-Cioalquilo) y triptofán (N-Ci-Ci0alquilo) . En algunas realizaciones, el aminoácido B es seleccionado de un grupo que consiste en fenilalanina (N-Ci-C6alquilo) , tirosina (N-Ci-C6alquilo) y triptofán (N-Ci-C6alquilo) . Por ejemplo, el aminoácido B puede incluir fenilalanina (N-metilo) , tirosina (N-metilo) y triptofán(N-metilo) .

En algunas realizaciones, el aminoácido B es prolina. En algunas realizaciones, la prolina se excluye de la sub-categor£a IB.

Sub-Categoría IC: el aminoácido B del element profármaco del dipéptido disustituido en la posición beta.

En algunas realizaciones, el profármaco comprende la estructura: A-B-Q; en donde Q es un peptide de la superfamilia de glucagón; en donde A-B comprende la estructura: O ¾ R8 j en donde Ri y R2 son independientemente seleccionados de un grupo que consiste en H, Ci-Ci8 alquilo, C2-Ci8 alquenilo, (Ci-Ci8 alquilo) OH, (Ci-Cj.8 alquilo) SH, (C2-C3 alquilo) SCH3 , (C!-C alquilo) CONH2 , (d-C4 alquilo) COOH, (C1-C4 alquilo) NH2, (C1-C4 alquilo) NHC (NH2+) NH2 , (C0-C4 alquilo) (C3-C6 cicloalquilo) , (C0-C4 alquilo) (C2-C5 heterocíclico) , (C0-C4 alquilo) (C6-Ci0 arilo)R7, (C1-C4 alquilo) (C3-C9 heteroarilo) y C1-C12 alquilo (Wi) C1-C12 alquilo, en donde x es un heteroátomo seleccionado de un grupo que consiste en N, S y 0, o Ri y R2 junto con los átomos a los cuales están unidos forman a C3-Ci2 cicloalquilo o Ri y R junto con los átomos a los cuales están unidos forman a C3-C12 cicloalquilo; R3 es C1-C18 alquilo; R4 es independientemente seleccionado de un grupo que consiste en CH(Ci-C8 alquilo) 2, CH (C2-C8 alquenilo) 2 , CH(Ci-C8 alquilo) (OH) , CH(Ci-C8 alquilo) ( (Ci-Ce alquilo) SH) , CH(C!-C3 alquilo) ( (Ci-C8 alquilo) (NH2)) ; R8 es H; R5 es NHR6 o R5 y R2 junto con los átomos a los cuales están unidos forman un anillo heterocíclico de 4 , 5 o 6 miembros; R6 es H or Ci-C4 alquilo y R7 es seleccionado de un grupo que consiste en H, OH, halo, ( C1-C7 alquilo), (C2-C7 alquenilo) , OCF3, N02, CN, NC, 0( Ci-C7 alquilo), C02H, C02 ( C1-C7 alquilo), HR6, arilo y heteroarilo.

En algunas realizaciones, R4 es CH(C!-C8 alquilo) 2 00 CH( Ci-C8 alquilo) OH. Los ejemplos no taxativos de aminoácido B incluye isoleucina (N- Ci - Ci0alquilo) , valina (N- Ci - Ci0alquilo) y treonina (N-Ci-Cioalquilo) . En algunas realizaciones, el aminoácido B es seleccionado de un grupo que consiste en isoleucina (N- Ci -C6alquilo) , valina (N- Ci-C6alquilo) y treonina (N- Ci-C6alquilo) . Por ejemplo, el aminoácido B puede incluir isoleucina (N-metilo) , valina (N-metilo) y treonina (N-metilo) .

Categoría II: Composición de aminoácido A del element profármaco del dipéptido En algunas realizaciones, la semi ida del profármaco depende del número de sustituyentes en la posición alfa del aminoácido A. Por ejemplo, un profármaco que comprende un aminoácido A que es un aminoácido a-monosustituido (por ej . , Ala) experimentará la descomposición más lentamente y tiene un semivida más larga que un profármaco que comprende un aminoácido A que es un aminoácido OÍ, -disustituido (por ej . : Aib) .

En algunas realizaciones, la semivida del profármaco depende del grado de alquilación en el grupo amino alfa del aminoácido A. Generalmente, a mayor grado de alquilación, menor proporción de descomposición y mayor semivida del profármaco. Por ejemplo, un elemento profármaco de dipeptido que tiene Ala N-alquilado se escindirá más lentamente y tiene una semivida más prolongada que Ala.

La composición de un aminoácido A del elemento profármaco de dipeptido puede clasificarse en las siguientes sub-categorías : IIA e IIB. Generalmente, los elementos profármacos del dipéptido en la sub-categoría IIA se descomponen más rápido que los elementos profármacos del dipéptido en la sub-categoría IIB.

Sub-Categoría IIA: el aminoácido A en el element profármaco del dipéptido es disustituido en la posición alfa.

En algunas realizaciones, el aminoácido A del element porfármaco del dipéptido es disustituido en la posición alfa. En estas realizaciones, Ri y R2 de la estrutura descripta en las subcategorías IA, IB e IC son independientemente seleccionados de un grupo que consiste en Ci-do alquilo, C2-C10 alquenilo, (Cx-Cio alquilo) OH, (C1-C10 alquilo) SH, (C2-C3 alquilo) SCH3 , (Ci-C4 alquilo) CONH2, (C1-C4 alquilo) COOH, (C1-C4 alquilo) NH2, (C1-C4 alquilo) NHC (NH2+)NH2, (C0-C4 alquilo) (C3-C6 cicloalquilo) , (C0-C4 alquilo) (C2-C5 heterocíclico) , (C0-C4 alquilo) (C6-C10 arilo)R7, (Ci-C4 alquilo) (C3-C9 heteroarilo) y 0?-0?2 alquilo (Wx) C1-C12 alquilo, en donde ?? es un heteroátomo seleccionado de un grupo que consiste en N, S y O, o Ri y R2 junto con los átomos a los cuales están unidos forman un C3-C12 cicloalquilo y en donde R7 es seleccionado de un grupo que consiste en H y OH.

Por ejemplo, el aminoácido A puede incluir ácido aminoisobutírico (Aib) .

Sub-Categoría IIB: el aminoácido A del element profármaco del dipéptido no es sustituido o es monosustituido en la posición alfa .

En algunas realizaciones, el aminoácido A del element profármaco del dipéptido no es sustituido o es monosustituido en la posición alfa. En estas realizaciones, Ri de la estructura descripta en las sub-categorías IA, IB e IC es H, y R2 de las estructuras descriptas en las sub-categorías IA, IB e IC es seleccionado de un grupo que consiste en H, C1-C10 alquilo, C2-Ci0 alquenilo, (Ci-Cio alquilo) OH, (Ci-Cio alquilo) SH, (C2-C3 alquilo) SCH3 , (C1-C4 alquilo) CONH2, (Cx-C4 alquilo) COOH, (C1-C4 alquilo) H2, (C1-C4 alquilo) HC (NH2+) NH2 , (C0-C4 alquilo) (C3-C6 cicloalquilo) , (C0-C4 alquilo) (C2-C5 heterocíclico) , (C0-C4 alquilo) (C6-Ci0 arilo)R7, (Ci-C4 alquilo) (C3-C9 heteroarilo) y C1-C12 alquilo (Wi) C1-C12 alquilo, en donde R7 es seleccionado de un grupo que consiste en H y OH, en donde Wi es un heteroátomo seleccionado de un grupo que consiste en N, S y 0, o Ri y R2 junto con los átomos a los cuales están unidos forman un C3-Ci2 cicloalquilo o R2 y Rs junto con los átomos a los cuales están unidos forman un anillo heterocíclico de 4 , 5 o 6 miembros .

En algunas realizaciones, el aminoáido A del elemento profármaco del dipéptido tiene estereoquímica d'. Los ejemplos no taxativos del aminoácido A en estas realizaciones incluyen lisina, cisteína y alanina. Por ejemplo, d-lisina, d-cisteína y d-alanina. En algunas realÍ2aciones , la estereoquímica d puede aumentar la semivida a través de la degradación proteolítica del péptido del profármaco.

En algunas realizaciones, el aminoácido A es N-alquilado con un grupo que tiene 1 a 4 átomos de carbono como Ala (N-Ci-C4alquilo) , Lys (N-Ci-C4alquilo) y Cys (N-Ci-C4alquilo) . Por ejemplo, un aminoácido A puede ser Ala (N-metilo) , Lys (N-metilo) y Cys (N-metilo) . La N-alquilación del aminoácido A reduce la proporción de descomposición del elemento profármaco del dipeptido a partir de Q y proporciona una semivida más prolongada.

Category III: Sitio de conjugación del element profármaco del dipéptido (A-B) con el peptide de la superfamilia de glucagón (Q) En algunas realizaciones, la semivida del profármaco depende del impedimento estérico, la nucleofilicidad y la estabilidad del grupo que se desprende en Q durante la fomación de dicetopiperazina . A menor impedimento estérico del grupo quemse desprende, menor nucleofilicidad del grupo que se despende o a mayor estabilidad de dicho grupo después de la descomposición, menor duración de la semivida del profármaco. El tipo de grupo que se desprende en Q puede determinarse por el tipo de unión entre A-B y un grupo amino de Q, según lo descripto a continuación en las sub-categorías IIIA e IIIB. Generalmente, los elementos profármacos del dipéptido en la sub-categoría IIIA se descomponen más lentamente de Q y tienen una semivida más prolongada que los elementos profármacos del dipéptido . en sub-categoría IIIB.

Sub-Categoría IIIA: A-B unido a un grupo amino alifático de Q En algunas realizaciones, A-B está unido a Q a través de una unión amida entre A-B y un grupo amino alifático de Q para generar un proármaco con una semivida de descomposición química (ti/2) de A-B a partir de Q de al menos, aproximadamente, 1 hora a, aproximadamente, 1 semana en PBS, bajo condiciones fisiológicas, según lo descripto anteriormente.

En algunas realizaciones, A-B está unido a Q a través de un grupo amino alfa de aminoácido de extremo N de Q. Por ejemplo, un elemento profármaco del dipéptido que tiene un aminoácido B de cualquiera de las sub-categorías IA, IB e IC y un aminoácido A de cualquiera de las sub-categorías IIA e IIB pueden unirse al aminoácido de extremo N de Q para generar un profármaco con una semivida de descomposición química (ti/2) de A-B a partir de Q de al menos, aproximadamente, 1 hora a, aproximadamente, 1 semana en PBS, bajo condiciones fisiológicas.

En algunas realizaciones, A-B está ligado a Q a través de un grupo amino en una cadena lateral de un aminoácido de Q. Por ejemplo, un elemento profármaco de dipéptido que tiene un aminoácido B de cualquiera de las sub-categorías IA, IB e IC y un aminoácido de cualquiera de las subcategorías IIA e IIB pueden unirse a un grupo amino alifático de una cadena lateral de un aminoácido de Q para generar un profármaco con una semivida de descomposición química (ti/2) de A-B a partir de Q de al menos, aproximadamente, 1 hora a, aproximadamente, 1 semana en PBS, bajo condiciones fisiológicas.

En algunas realizaciones, cuando A-B está ligado a Q a través de una unión amida entre A-B y un grupo amino alifático de Q, o bien A debe ser un aminoácido , a-disustituido (sub-categoría IIA) o bien B debe ser N-alquilado (cualquiera de las sub-categorías IA, IB o IC) , o ambos. Por ejemplo, cuando A es un aminoácido OÍ-monosustituido (por ej . Ala) , B no está N-alquilado y A-B está unido a Q a través de un grupo amino alifático de Q y, entonces, no habrá descomposición importante de A-B.

En otras realizaciones, cuando A-B está ligado a el grupo amino alfa de F7GLP-1 (8-37) , A-B no es Gly-Gly (N-Me) .

En otras realizaciones opcionales, cuando A-B está ligado a Q a través de una unión amida entre A-B y un grupo amino alifático de Q y A es un aminoácido que no está sustituido en la posición alfa (por ej . Glicina) y B es un aminoácido de la sub-categoría IA (glicina N-alquilada) , el sustituyente N-alquilo del aminoácido B tiene una longitud de al menos 5 átomos de carbono (por ejemplo, N-C5-C8alquilo) .

En otras realizaciones, cuando A-B está ligado a Q a través de una unión amida entre A-B y un grupo amino alifático de Q y el aminoácido A no está sustituido o está monosutituido en la posición alfa (sub-categoría IIB) , el aminoácido B no es prolina. En algunas realizaciones, cuando A-B está ligado a Q a través de una unión amida entre A-B y una grupo amino alifático de Q, A-B no es Gly-PRO. En algunas realizaciones, cuando el aminoácido B es prolina, el aminoácido A proviene de la sub-categoría IIA.

Sub-Categoría IIIB: A-B unido a un grupo amino aromático de Q En algunas realizaciones, A-B está ligado a Q a través de una unión amida entre A-B y un grupo amino aromático de una cadena lateral de un aminoácido de Q para generar un profármaco con una semivida de descomposición química (ti/2) de A-B a partir de Q de al menos, aproximadamente 1 hora a, aproximadamente, 1 semana en OBS, bajo condiciones fisiológicas, según lo descripto en la presente descripción. Por ejemplo, un elemento profármaco del dipéptido que tiene un aminoácido B de cualquiera de las sub-categorías IA, IB e IC y un aminoácido A de cualquiera de las sub-categorías IIA e IIB puede unirse a un grupo amino aromático de una cadena lateral de un aminoácido de Q para generar un profármaco con una semivida de descomposición química (t1/2) de A-B a partir de Q de al menos, aproximadamente, 1 hora a, aproximadamente, 1 semana en PBS, bajo condiciones fisiológicas.

Cualquiera de los aminoácidos definidos por la Categoría I puede combinarse con cualquiera de los aminoácidos defeinidos por la Categoría II para formar un elemento profármaco de dipeptido. Este elemento profármaco de dipeptido puede unirse a cualquiera de las posiciones descriptas en la Categoría III.

La semivida del profármaco puede sintonizarse a través de la selección de: (i) el número de sustituyentes en la posición alfa de un aminoácido A; (ii) el grado de N-alquilación de los aminoácidos A y B; (iii) el número de sustituyentes en la posición beta del aminoácido B; (iv) el volumen de la cadena lateral del aminoácido B y (v) el impedimento estérico, la nucleofilicidad y la estabilidad del grupo que se desprende en Q durante la formación de dicetopiperazina .

Modificación del elemento profármaco del dipéptido A-B Los elementos profármacos del dipéptido descriptos anteriormente pueden modificatse para comprender un grupo hidrofílico, un grupo acilo o un grupo alquilo, según lo descripto anteriormente. En algunas realizaciones, el elementeo profármaco del dipéptido incluye lisina que es conjugada con un grupo acilo o un grupo alquilo a través de su grupo amino de cadena lateral . En algunas realizaciones, el element profármaco del dipéptido incluye cisteína que es conjugada con un grupo hidrofílico (por ej . , 40 kD PEG) a través del grupo sulfhidrilo de cadena lateral. El grupo hidrofílico, el grupo acilo y el grupo alquilo puede ser directamente conjugados con el elemento profármaco del dipéptido o a través de un espaciador. En algunos ejemplos de realizaciones, el grupo hidrofílico, el grupo alquilo y/o el grupo acilo son conjugados con el aminoácidoA del elemento profármaco del dipéptido.

En algunas realizaciones, los siguientes elementos profármacos del dipéptido son PEGuilados: dCys-Gly (N-Hexilo) dCys-Gly(N-Metilo) y dCys-Phe (N-Metilo) . En algunas realizaciones, los siguientes elementos profármacos del dipéptido incluyen un grupo acilo: dLys-Gly (N-Hexilo) , dLys-Gly (N-Metilo) y dLys-Phe(N-Metilo) . En algunas realizaciones, los siguientes elementos profármacos del dipéptido incluyen un grupo alquilo: dLys-Gly (N-Hexilo) , dLys-Gly (N-Metilo) y dLys-Phe (N-Metilo) .

Ejemplos de realizaciones El element profármaco del dipéptido de la invención puede incluir combinaciones de cualquiera de los aminoácidos B de la Categoría I con cualquiera de los aminoácidos A de la Categoría II. En la tabla que aparece a continuación, se enumeran ejemplos no taxativos de aminoácidos adecuados para el aminoácido A y para el aminoácido B del elemento profármaco del dipéptido.

En algunas realizaciones, el elemento profármaco del dipéptido oncluye la combinación de cualquiera de los A1-A77 con cualquiera de los B1-B113. Por ejemplo, las combinaciones del aminoácido A y el aminoácido B del elemento profármaco del dipéptido pueden incluir: Al-Bl; A1-B2; A1-B3; A1-B4; A1-B5; A1-B6; A1-B7; A1-B8 A1-B9; A1-B10; Al-Bll; A1-B12; A1-B13; A1-B14; A1-B15 A1-B16 A1-B17 A1-B18; A1-B19 A1-B20 A1-B21 A1-B22; A1-B23 A1-B24 A1-B25 A1-B26 A1-B27 A1-B28 A1-B29 A1-B30; A1-B31 A1-B32 A1-B33 A1-B34 A1-B35 A1-B36 A1-B37 A1-B38; A1-B39 A1-B40 A1-B41 A1-B42 A1-B43 A1-B44 A1-B45 A1-B46; A1-B47 A1-B48 A1-B49 A1-B50 A1-B51 A1-B52 A1-B53 A1-B54; A1-B55 A1-B56 A1-B57 A1-B58 A1-B59 A1-B60 A1-B61 A1-B62; A1-B63 A1-B64 A1-B65 A1-B66 A1-B67 A1-B68 A1-B69 A1-B70; A1-B71 A1-B72 A1-B73 A1-B74 A1-B75 A1-B76 A1-B77 A1-B78; A1-B79 A1-B80 A1-B81 A1-B82 A1-B83 A1-B84 A1-B85 A1-B86; A1-B87 A1-B88 A1-B89 A1-B90 A1-B91 A1-B92 A1-B93 A1-B94; A1-B95 A1-B96 A1-B97; A1-B98; A1-B99; A1-B100; A1-B101; A1-B102; A1-B103; Al-B104; A1-B105; A1-B106; A1-B107; A1-B108; A1-B109; A1-B110; Al-Blll; A1-B112; A1-B113; A2-B1; A2-B2; A2-B3; A2-B4; A2-B5; A2-B6; A2-B7; A2-B8; A2-B9 A2-B10 A2-B11 A2-B12; A2-B13; A2-B14; A2-B15; A2-B16 A2-B17 A2-B18 A2-B19 A2-B20; A2-B21; A2-B22; A2-B23; A2-B24 A2-B25 A2-B26 A2-B27 A2-B28; A2-B29; A2-B30 ; A2-B31; A2-B32 A2-B33 A2-B34 A2-B35 A2-B36; A2-B37; A2-B38; A2-B39; A2-B40 A2-B41 A2-B42 A2-B43 A2-B44; A2-B45; A2-B46; A2-B47; A2-B48 A2-B49 A2-B50 A2-B51 A2-B52 ; A2-B53 ; A2-B54 ; A2-B55; A2-B56 A2-B57 A2-B58 A2-B59 A2-B60; A2-B61; A2-B62; A2-B63 ; A2-B64 A2-B65 A2-B66 A2-B67 A2-B68; A2-B69; A2-B70; A2-B71; A2-B72 A2-B73 A2-B74 A2-B75 A2-B76; A2-B77; A2-B78; A2-B79; A2-B80 A2-B81 A2-B82 A2-B83 A2-B84; A2-B85; A2-B86 ; A2-B87; A2-B88 A2-B89 A2-B90 A2-B91 A2-B92; A2-B93; A2-B94; A2-B95; A2-B96 A2-B97 A2-B98 A2-B99 A2-B100; A2-B101; A2-B102; A2-B103; A2-B104; A2 B105; A2-B106; A2-B107; A2-B108; A2-B109; A2-B110; A2-B111; A2 B112; A2-B113; A3-B1; A3-B2; A3-B3; A3-B4; A3-B5; A3-B6; A3-B7; A3-B8; A3-B9 A3-B10; A3-B11; A3-B12; A3-B13; A3-B14; A3-B15; A3-B16; A3"-B17 A3-B18; A3-B19; A3-B20; A3-B21; A3-B22; A3-B23; A3-B24; A3-B25 A3-B26; A3-B27; A3-B28; A3-B29; A3-B30; A3-B31; A3-B32; A3-B33 A3-B34; A3-B35; A3-B36; A3-B37; A3-B38; A3-B39; A3-B40; A3-B41 A3-B42; A3-B43; A3-B44; A3-B45; A3-B46; A3-B47; A3-B48; A3-B49 A3-B50; A3-B51; A3-B52; A3-B53; A3-B54; A3-B55; A3-B56; A3-B57 A3-B58; A3-B59; A3-B60; A3-B61; A3-B62; A3-B63; A3-B64; A3-B65 A3-B66; A3-B67; A3-B68; A3-B69; A3-B70; A3-B71; A3-B72; A3-B73 A3-B74; A3-B75; A3-B76; A3-B77; A3-B78; A3-B79; A3-B80; A3-B81 A3-B82; A3-B83; A3-B84; A3-B85; A3-B86; A3-B87; A3-B88; A3-B89 A3-B90; A3-B91; A3-B92; A3-B93; A3-B94; A3-B95; A3-B96; A3-B97 A3-B98; A3-B99; A3-B100; A3-B101; A3-B102; A3-B103; A3-B104; A3 B105; A3-B106; A3-B107; A3-B108; A3-B109; A3-B110; A3-B111; A3 · B112; A3-B113; A4-B1; A4-B2; A4-B3; A4-B4; A4-B5; A4-B6; A4-B7; A4-B8; A4-B9 A4-B10; A4-B11; A4-B12 A4-B13 A4-B14; A4-B15; A4-B16 A4-B17 A4-B18; A4-B19; A4-B20 A4-B21 A4-B22; A4-B23; A4-B24 A4-B25 A4-B26; A4-B27; A4-B28 A4-B29 A4-B30; A4-B31; A4-B32 A4-B33 A4-B34; A4-B35; A4-B36 A4-B37 A4-B38; A4-B39; A4-B40 A4"÷B41 A4-B42 ; A4-B43 ; A4-B44 A4-B45 A4-B46; A4-B47; A4-B48 A4-B49 A4-B50; A4-B51; A4-B52 A4-B53 A4-B54; A4-B55; A4-B56 A4-B57 A4-B58; A4-B59; A4-B60 A4-B61 A4-B62; A4-B63; A4-B64 A4-B65 A4-B66; A4-B67; A4-B68 A4-B69 A4-B70; A4-B71; A4-B72 A4-B73 A4-B74; A4-B75; A4-B76 A4-B77 A4-B78; A4-B79; A4-B80 A4-B81 A4-B82 ; A4-B83; A4-B84 A4-B85 A4-B86; A4-B87; A4-B88 A4-B89 A4-B90; A4-B91; A4-B92 A4-B93 A4-B94; A4-B95; A4-B96 A4-B97 A4-B98; A4-B99; A4-B100; A4-B101; A4-B102; A4-B103; A4-B104; A4-B105; A4-B106; A4-B107; A4-B108; A4-B109; A4-B110; A4-B111; A4-B112; A4-B113; A5-B1; A5-B2; A5-B3; A5-B4; A5-B5; A5-B6; A5-B7; A5-B8; A5-B9; A5-B10 A5-B11; A5-B12; A5-B13; A5-B14; A5-B15; A5-B16; A5-B17; A5-B18 A5-B19; A5-B20; A5-B21; A5-B22; A5-B23; A5-B24; A5-B25; A5-B26 A5-B27; A5-B28; A5-B29; A5-B30; A5-B31; A5-B32; A5-B33; A5-B34 A5-B35; A5-B36; A5-B37; A5-B38; A5-B39; A5-B40; A5-B41; A5-B42 A5-B43 A5-B44; A5-B45 A5-B46; A5-B47; A5-B48 A5-B49; A5-B50 A5-B51 A5-B52; A5-B53 A5-B54; A5-B55; A5-B56 A5-B57; A5-B58 A5-B59 A5-B60; A5-B61 A5-B62; A5-B63 ; A5-B64 A5-B65; A5-B66 A5-B67 A5-B68; A5-B69 A5-B70; A5-B71; A5-B72 A5-B73; A5-B74 A5-B75 A5-B76; A5-B77 A5-B78; A5-B79; A5-B80 A5-B81; A5-B82 A5-B83 A5-B84; A5-B85 A5-B86; A5-B87; A5-B88 A5-B89; A5-B90 A5-B91 A5-B92 ; A5-B93 A5-B94; A5-B95; A5-B96 A5-B97; A5-B98 A5-B99 A5-B100; A5-B101; A5-B102; A5-B103; A5-B104; A5- B105; A5-B106; A5-B107; A5-B108; A5-B109; A5-B110; A5-B111; A5-B112; A5-B113; A6-B1; A6-B2; A6-B3; A6-B4; A6-B5; A6-B6; A6-B7; A6-B8; A6-B9; A6-B10 A6-B11 A6-B12; A6-B13; A6-B14; A6-B15; A6-B16 A6-B17; A6-B18 A6-B19 A6-B20; A6-B21; A6-B22; A6-B23; A6-B24 A6-B25; A6-B26 A6-B27 A6-B28; A6-B29; A6-B30; A6-B31; A6-B32 A6-B33; A6-B34 A6-B35 A6-B36; A6-B37; A6-B38; A6-B39; A6-B40 A6-B41; A6-B42 A6-B43 A6-B44; A6-B45; A6-B46; A6-B47; A6-B48 A6-B49; A6-B50 A6-B51 A6-B52; A6-B53; A6-B54; A6-B55; A6-B56 A6-B57; A6-B58 A6-B59 A6-B60; A6-B61; A6-B62; A6-B63; A6-B64 A6-B65; A6-B66 A6-B67 A6-B68; A6-B69; A6-B70; A6-B71; A6-B72 A6-B73 ; A6-B74; A6-B75; A6-B76; A6-B77; A6-B78; A6-B79; A6-B80; A6-B81; A6-B82; A6-B83; A6-B84; A6-B85; A6-B86; A6-B87; A6-B88; A6-B89; A6-B90; A6-B91; A6-B92; A6-B93; A6-B94; A6-B95; A6-B96; A6-B97; A6-B98; A6-B99; A6-B100; A6-B101; A6-B102; A6-B103; A6-B104; A6-B105; A6-B106; A6-B107; A6-B108; A6-B109; A6-B110; A6-B111; A6-B112; A6-B113; A7-B1; A7-B2; A7-B3; A7-B4; A7-B5; A7-B6; A7-B7; A7-B8; A7-B9; A7-B10 A7-B11 A7-B12 A7-B13 ; A7-B14; A7-B15 A7-B16; A7-B17; A7-B18 A7-B19 A7-B20 A7-B21; A7-B22; A7-B23 A7-B24; A7-B25; A7-B26 A7-B27 A7-B28 A7-B29; A7-B30; A7-B31 A7-B32; A7-B33; A7-B34 A7-B35 A7-B36 A7-B37; A7-B38; A7-B39 A7-B40; A7-B41; A7-B42 A7-B43 A7-B44 A7-B45; A7-B46; A7-B47 A7-B48; A7-B49; A7-B50 A7-B51 A7-B52 A7-B53 ; A7-B54; A7-B55 A7-B56; A7-B57; A7-B58 A7-B59 A7-B60 A7-B61; A7-B62 ; A7-B63 A7-B64; A7-B65; A7-B66 A7-B67 A7-B68 A7-B69; A7-B70; A7-B71 A7-B72; A7-B73; A7-B74 A7-B75 A7-B76 A7-B77 ; A7-B78; A7-B79 A7-B80; A7-B81; A7-B82; A7-B83; A7-B84; A7-B85; A7-B86; A7-B87 A7-B88; A7-B89; A7-B90; A7-B91; A7-B92; A7-B93; A7-B94; A7-B95 A7-B96; A7-B97; A7-B98; A7-B99; A7-B100; A7-B101; A7-B102; A7-B103; A7-B104; A7-B105; A7-B106; A7-B107; A7-B108; A7-B109; A7-B110; A7-B111; A7-B112; A7-B113; A8-B1; A8-B2; A8-B3; A8-B4; A8-B5; A8-B6; A8-B7; A8-B8; A8-B9; A8-B10; A8-B11; A8-B12; A8-B13; A8-B14; A8-B15; A8-B16; A8-B17; A8-B18; A8-B19; A8-B20; A8-B21; A8-B22; A8-B23; A8-B24; A8-B25; A8-B26; A8-B27 A8-B28 A8-B29 A8-B30; A8-B31; A8-B32 A8-B33; A8-B34; A8-B35 A8-B36 A8-B37 A8-B38; A8-B39; A8-B40 A8-B41; A8-B42; A8-B43 A8-B44 A8-B45 A8-B46; A8-B47; A8-B48 A8-B49; A8-B50; A8-B51 A8-B52 A8-B53 A8-B54; A8-B55; A8-B56 A8-B57; A8-B58; A8-B59 A8-B60 A8-B61 A8-B62; A8-B63; A8-B64 A8-B65; A8-B66; A8-B67 A8-B68 A8-B69 A8-B70; A8-B71; A8-B72 A8-B73; A8-B74; A8-B75 A8-B76 A8-B77 A8-B78; A8-B79; A8-B80 A8-B81; A8-B82; A8-B83 A8-B84 A8-B85 A8-B86; A8-B87; A8-B88 A8-B89; A8-B90; A8-B91 A8-B92 A8-B93 A8-B94; A8-B95; A8-B96 A8-B97; A8-B98; A8-B99 A8-B100; A8-B101; A8-B102; A8-B103; A8-B104; A8-B105; A8-B106; A8-B107; A8-B108; A8-B109; A8-B110; A8-B111; A8-B112; A8-B113; A9-B1; A9-B2; A9-B3; A9-B4; A9-B5; A9-B6; A9-B7; A9-B8; A9-B9; A9-B10; A9-B11 A9-B12 A9-B13 A9-B14; A9-B15; A9-B16 A9-B17; A9-B18; A9-B19 A9-B20 A9-B21 A9-B22; A9-B23; A9-B24 A9-B25; A9-B26; A9-B27 A9-B28 A9-B29 A9-B30; A9-B31; A9-B32 A9-B33 ; A9-B34; A9-B35 A9-B36 A9-B37 A9-B38; A9-B39; A9-B40 A9-B41; A9-B42; A9-B43 A9-B44 A9-B45 A9-B46; A9-B47; A9-B48 A9-B49; A9-B50; A9-B51 A9-B52 A9-B53 A9-B54; A9-B55; A9-B56 A9-B57; A9-B58; A9-B59 A9-B60 A9-B61 A9-B62; A9-B63; A9-B64 A9-B65; A9-B66; A9-B67 A9-B68 A9-B69 A9-B70; A9-B71; A9-B72 A9-B73; A9-B74; A9-B75 A9-B76 A9-B77 A9-B78; A9-B79; A9-B80 A9-B81; A9-B82; A9-B83 A9-B84 A9-B85 A9-B86; A9-B87; A9-B88 A9-B89; A9-B90; A9-B91 A9-B92 A9-B93 A9-B94; A9-B95; A9-B96 A9-B97; A9-B98; A9-B99; A9-B100; A9-B101; A9-B102; A9-B103; A9-B104; A9-B105; A9-B106; A9-B107; A9-B108; A9-B109; A9-B110; A9-B111; A9-B112; A9-B113; A10-B1; A10-B2; A10-B3; A10-B4; A10-B5; A10-B6; A10-B7; A10-B8; A10-B9; AIO-BIO; A10-B11; A10-B12; A10-B13; A10-B14; A10-B15; A10-B16; A10-B17; A10-B18; A10-B19; A10-B20 A10-B21 A10-B22; A10-B23 A10-B24 A10-B25; A10 B26; A10-B27 A10-B28 A10-B29; A10-B30 A10-B31 A10-B32; A10 B33; A10-B34 A10-B35 A10-B36; A10-B37 A10-B38 A10-B39; A10 B40; A10-B41 A10-B42 A10-B43 ; A10-B44 A10-B45 A10-B46; A10 B47; A10-B48 A10-B49 A10-B50; A10-B51 A10-B52 A10-B53; A10 B54; A10-B55 A10-B56 A10-B57; A10-B58 A10-B59 A1Q-B60; A10 B61; A10-B62 A10-B63 A10-B64; A10-B65 A10-B66 A10-B67; A10 B68; A10-B69 A10-B70 A10-B71; A10-B72 A10-B73 A10-B74; A10 B75; A10-B76 A10-B77 A10-B78 ; A10-B79 A10-B80 A10-B81; A10 B82; A10-B83 A10-B84 A10-B85; A10-B86 A10-B87 A10-B88; A10 B89; A10-B90 A10-B91 A10-B92 ; A10-B93 A10-B94 A10-B95; A10 B96; A10-B97 A10-B98 A10-B99; A10-B100; A10-B101; A10-B102; A10-B103; A10-B104; A10-B105; A10-B106; A10-B107; A10-B108; A10-B109; A10-B110; AlO-Blll; A10-B112; A10-B113; All-Bl; A11-B2; A11-B3; A11-B4; A11-B5; A11-B6; A11-B7; A11-B8; A11-B9; A11-B10; All-Bll; 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A74-B108; A74-B109; A74-B110; A74-B111; A74-B112; A74-B113 ; A75-B1; A75-B2; A75-B3; A75-B4; A75-B5; A75-B6; A75-B7; A75-B8 A75-B9; A75-B10; A75-B11; A75-B12; A75-B13; A75-B14 A75-B15 A75-B16; A75-B17 A75-B18 A75-B19; A75-B20 A75-B21 A75-B22 A75-B23; A75-B24 A75-B25 A75-B26 ; A75-B27 A75-B28 A75-B29 A75-B30; A75-B31 A75-B32 A75-B33; A75-B34 A75-B35 A75-B36 A75-B37; A75-B38 A75-B39 A75-B40; A75-B41 A75-B42 A75-B43 A75-B44; A75-B45 A75-B46 A75-B47; A75-B48 A75-B49 A75-B50 A75-B51; A75-B52 A75-B53 A75-B54; A75-B55 A75-B56 A75-B57 A75-B58; A75-B59 A75-B60 A75-B61; A75-B62 A75-B63 A75-B64 A75-B65; A75-B66 A75-B67 A75-B68; A75-B69 A75-B70 A75-B71 A75-B72; A75-B73 A75-B74 A75-B75; A75-B76 A75-B77 A75-B78 A75-B79; A75-B80 A75-B81 A75-B82; A75-B83 A75-B84 A75-B85 A75-B86; A75-B87 A75-B88 A75-B89; A75-B90 A75-B91 A75-B92 A75-B93; A75-B94 A75-B95 A75-B96; A75-B97 A75-B98 A75-B99 A75-B100; A75-B101; A75-B102; A75-B103; A75-B104; A75-B105; A75-B106; A75-B107; A75-B108; A75-B109; A75-B110; A75-B111; A75-B112; A75-B113; A76-B1; A76-B2; A76-B3; A76-B4; A76-B5; A76-B6; A76-B7; A76-B8; A76-B9; A76-B10; A76-B11; A76-B12; A76-B13; A76-B14; A76-B15; A76-B16; A76-B17; A76-B18; A76-B19; A76-B20; A76-B21; A76-B22; 5 A76-B23; A76-B24; A76-B25; A76-B26; A76-B27; A76-B28; A76-B29 A76-B30; A76-B31 A76-B32 A76-B33 A76-B34; A76-B35 A76-B36 A76-B37; A76-B38 A76-B39 A76-B40 A76-B41; A76-B42 A76-B43 A76-B44; A76-B45 A76-B46 A76-B47 A76-B48; A76-B49 A76-B50 A76-B51; A76-B52 A76-B53 A76-B54 A76-B55; A76-B56 A76-B57 A76-B58; A76-B59; A76-B60; A76-B61; AA7766--BB6622 ;; AA7766--BB6633; A76-B64 A76-B65; A76-B66; A76-B67; A76-B68; AA7766--BB6699;; AA7766--BB7700; A76-B71 A76-B72; A76-B73; A76-B74; A76-B75 A76-B76; A76-B77 A76-B78 A76-B79; A76-B80; A76-B81; A76-B82 A76-B83 ; A76-B84 A76-B85 A76-B86; A76-B87; A76-B88; A76-B89 A76-B90 ; A76-B91 A76-B92 A76-B93; A76-B94; A76-B95; A76-B96 A76-B97; A76-B98 A76-B99 A76-B100; A76-B101; A76-B102; A76-B103; A76-B104; A76-B105; A76-B106; A76-B107; A76-B108; A76-B109 A76-B110; A76-B111; A76-B112; A76-B113 ; A77-B1; A77-B2; A77-B3; A77-B4; A77-B5; A77-B6; A77-B7; A77-B8 A77-B9; A77-B10; A77-B11; A77-B12; A77-B13; A77-B14; A77-B15 A77-B16; A77-B17 A77-B18; A77-B19 A77-B20; A77-B21; A77-B22 A77-B23; A77-B24 A77-B25; A77-B26 A77-B27; A77-B28; A77-B29 A77-B30; A77-B31 A77-B32; A77-B33 A77-B34; A77-B35; A77-B36 A77-B37; A77-B38 A77-B39; A77-B40 A77-B41; A77-B42; A77-B43 A77-B44; A77-B45 A77-B46; A77-B47 A77-B48; A77-B49; A77-B50 A77-B51; A77-B52 A77-B53; A77-B54 A77-B55; A77-B56; A77-B57 A77-B58; A77-B59 A77-B60; A77-B61 A77-B62; A77-B63; A77-B64 A77-B65; A77-B66 A77-B67; A77-B68 A77-B69; A77-B70; A77-B71 A77-B72; A77-B73; A77-B74; A77-B75; A77-B76; A77-B77; A77-B78; A77-B79; A77-B80; A77-B81; A77-B82; A77-B83; A77-B84; A77-B85; A77-B86; A77-B87; A77-B88; A77-B89; A77-B90; A77-B91; A77-B92; A77-B93; A77-B94; A77-B95; A77-B96; A77-B97; A77-B98; A77-B99; A77-B100; A77-B101; A77-B102; A77-B103; A77-B104; A77-B105; A77- B106; A77-B107; A77-B108; A77-B109; A77-B110; A77-B111; A77-B112; A77-B113; Sub-Categoría IA; el aminoácido B del element profármaco del dipéptido es glicina N-alquilada En algunas realizaciones, el aminoácido B del lemento profármaco del dipéptido es glicina N-alquilada. En la tabla que aparece a continuación se enumeran ejemplos no taxativos de elementos profármacos del dipéptido que tienen glicina N-alquilada como aminoácido B.

Sub-Categoría IB: el aminoácido B del elemento profármaco del dipéptido no está sustituido o está monosustituido en la posición beta En algunas realizaciones, el aminoácido B del elemento profármaco del dipéptido no está sustituido o está monosustituido en la posición beta y tiene una cadena lateral relativamente no voluminosa. En la tabla que aparece a continuación se enumeran ejemplos no taxativos de elementos profármacos de dipéptido que tienen un aminoácido B que no está sustituido o está monosustituido en la posición beta y una cadena lateral relativamente no voluminosa.

En algunas realizaciones, el aminoácido B del elemento profármaco del dipéptido está monosustituido en la posición beta y tienen una cadena lateral relativamente voluminosa, según lo muestra la siguiente tabla.

Sub-Categoría IC: aminoácido B del elemento profármaco del dipéptido disustituido en la posición beta En algunas realizaciones, el aminoácido B del elemento profámaco del dipéptido es disustituido en la posición beta. En la tabla que aparece a continuación se enumeran ejemplos no taxativos de elementos profármacos del dipéptido que tienen un aminoácido B que está disustituido en la posición beta.

Profármacos El elemento profármaco del dipéptido se conjuga con cualquiera de los péptido relacionados con glucagón a través de cualquiera de las posiciones que interfiere con la actividad del péptido relacionado con glucagón (por ej . , con la amina alfa del aminoácido de extremo N) , un grupo amino alifático en una cadena lateral de un aminoácido de Q (por ej . , una cadena lateral de lisina) , un grupo amino aromático de una cadena lateral de Q (por ej . , aminofenilalina, aminonaftilalanina, aminotriptofán, aminofenilglicina, aminohonofenilalanina) . Entre los ejempoos de posiciones de cuando A-B está ligado a un grupo amino alifático en una cadena lateral de un aminoácido de Q se incluyen posiciones 12, 16, 17, 18, 20, 28 o 29 de glucagón nativo (SEQ ID NO: 701) . Entre los ejemplos de posiciones de cuando A-B está ligado a un grupo amino aromático en una cadena lateral de un aminoácido de Q se incluyen las posiciones 10, 13, 22 o 25 de glucagón nativo (SEQ ID NO: 701) . En algunas realizaciones, el elemento profármaco del dipeptido de la invención se conjuga con cualquiera de los SEQ ID NOs: 1-564, 566-570, 573-575, 577, 579- 580, 585-612, 616, 618-632, 634-642, 647, 657-684, 701-732, 742- 768, 801-878, 883-919, 1001-1262, 1301-1371, 1401-1518, 1701- 1708, 1710, 1711, 1731-1734, 1738, 1740, 1741, 1745, and 1747- 1776. Por ejemplo, el elemento profármaco del dipeptido puede conjugarse con cualquiera de los SEQ ID NOs: 742-768.

En algunos ejemplos de realizaciones, Aib-Gly (N-Hexilo) , dLys- Gly (N-Hexilo) , dCys-Gly (N-Hexilo) , dAla-Gly (N-Hexilo) , Aib-Gly (N- Metilo) , dLys-Gly (N-Metilo) , dCys-Gly (N-Metilo) , dAla-Gly (N- Hexilo) , Aib-Phe (N-Metilo) , dLys-Phe (N-Metilo) , dCys-Phe(N- Metilo) o dAla-Phe (N-Metilo) es conjugado con el grupo amino alfa del extremo N de cualquiera de los SEQ ID NOs : 742-745, 748-770, según lo representan los SEQ ID NOs.: 769-794 y tal como se muestra en la siguiente tabla.

Métodos de Uso Péptidos de la Superfamilia de Glucagón En general los profármacos que comprenden un péptido de la superfamilia de glucagón o un péptido relacionado con glucagón, tales como un péptido de la Clase 1, 2, 3, 4,5 o 6, se pueden usar con cualquier fin para el cual se han usado los péptidos de la superfamilia de glucagón y los péptidos relacionados con glucagón (véase por ejemplo lo detallado anteriormente) . Por ejemplo, se cree que los análogos de profármacos de péptidos bioactivos revelados son adecuados para cualquier uso que se ha descrito previamente para el péptido bioactivo parental correspondiente. Por consiguiente, los análogos de profármacos de péptidos relacionados con glucagón descritos en la presente se pueden usar para tratar la hipoglicemia, hiperglicemia, diabetes, u otras enfermedades metabólicas que derivan de niveles altos/bajos de glucagón en sangre o niveles altos/bajos de glucosa en sangre. De acuerdo con algunas realizaciones el paciente a quien se debe tratar usando el profármaco revelado en la presente es un animal domesticado, y en otra realización el paciente a quien se debe tratar es un humano.

En algunas realizaciones, los profármacos se usan para reducir o suprimir el apetito, reducir la ingesta de alimentos, inducir la pérdida de peso, o contribuir al mantenimiento del peso. Se espera que dichos métodos para reducir el apetito o promover la pérdida de peso corporal sean útiles en la reducción del peso corporal, la prevención del aumento de peso, o el tratamiento de la obesidad por diferentes causas, que incluyen la obesidad inducida por fármacos y la reducción de complicaciones asociadas con la obesidad que incluyen enfermedad vascular (enfermedad de las arterias coronarias, ataque, enfermedad vascular periférica, reperfusión de isquemia, etc.), hipertensión, inicio de diabetes tipo II, hiperlipidemias y enfermedades musculoesqueléticas .

En otras realizaciones, los profármacos se usan en conjunto con la administración parenteral de nutrientes a pacientes no diabéticos en un hospital, por ejemplo pacientes que reciben nutrición parenteral o nutrición parenteral total. Ejemplos no taxativos incluyen pacientes con cirugía, pacientes en estado de coma, pacientes con enfermedad del tracto digestivo o con un tracto gastrointestinal no funcional (por ejemplo, debido a la remoción quirúrgica, obstrucción o capacidad de absorción deteriorada, enfermedad de Crohn, colitis ulcerativa, obstrucción del tracto gastrointestinal, fístula del tracto gastrointestinal, pancreatitis aguda, intestino isquémico, cirugía gastrointestinal mayor, ciertas anomalías congénitas del tracto gastrointestinal, diarrea prolongada, o síndrome de intestino corto debido a una cirugía, pacientes en estado de shock y pacientes que están sometiéndose a proceso curativos suelen recibir la administración parenteral de carbohidratos junto con diferentes combinaciones de lípidos, electrolitos, minerales, vitaminas y aminoácidos. El profármaco de péptido de la superfamilia de glucagón y la composición para nutrición parenteral se pueden administrar simultáneamente, en diferentes momentos, antes, o después uno de otro, siempre que el profármaco de péptido de la superfamilia de glucagón esté ejerciendo el efecto biológico deseado en el momento en que se está digiriendo la composición para nutrición parenteral. Por ejemplo, la nutrición parenteral se puede administrar, 1, 2 o 3 veces por día, mientras que el profármaco de péptido de la superfamilia de glucagón se administra una vez por día, tres veces por semana, dos veces por semana, una vez por semana, una vez cada dos semanas, una vez cada tres semanas o una vez por mes .

El síndrome metabólico, también llamado síndrome X, síndrome de resistencia a la insulina, o síndrome de Reaven, es un trastorno que afecta a más de 50 millones de estadounidenses. El síndrome metabólico generalmente se caracteriza por un agrupamiento de por lo menos tres o más de los siguientes factores de riesgo: (1) obesidad abdominal (exceso de tejido grao dentro y alrededor del abdomen) , (2) dislipidemia aterogénica (trastornos de grasa en sangre que incluyen triglicéridos altos, bajo colesterol HDL y alto colesterol LDL que aumentan la acumulación de placa en las paredes arteriales) , (3) presión sanguínea elevada, (4) resistencia a la insulina o intolerancia de glucosa, (5) estado protrombótico (por ejemplo, alto inhibidor 1 de activador de fibrinógeno o plasminógeno en sangre) y (6) estado proinflamatorio (por ejemplo, proteína reactiva C elevada en sangre) . Otros factores de riesgo pueden incluir edad avanzada, desequilibrio hormonal y predisposición genética.

El síndrome metabólico está asociado con un aumento del riesgo de enfermedad cardiaca coronaria y otros trastornos relacionados con la acumulación de placa vascular, tales como ataque y enfermedad vascular periférica, denominada enfermedad cardiovascular aterosclerótica (ASCVD) . Los pacientes con síndrome metabólico pueden avanzar desde un estado de resistencia a la insulina en sus primeras etapas hasta la diabetes de tipo II completa con un mayor aumento del riesgo de ASCVD. Sin intentar atarnos a ninguna teoría particular, la relación entre la resistencia a la insulina, el síndrome metabólico y la enfermedad vascular pueden incluir uno o más mecanismos patógenos concurrentes que incluyen deterioro de la vasodilatación estimulada por la insulina, reducción en la disponibilidad de NO asociada con la resistencia a la insulina debido al aumento del estrés oxidativo, y anomalías en las hormonas derivadas de los adipositos, tales como adiponectina (Lteif y Mather, Can. J. Cardiol . 20 (suppl. B):66B-76B (2004) ) .

Según el Panel de Tratamiento de Adultos del Programa Nacional de Educación de Colesterol de 2001 (ATP III) , tres cualquiera de las características precedentes en el mismo individuo cumplen con los criterios para el síndrome metabólico: (a) obesidad abdominal (circunferencia de cintura superior a 102 cm en los hombres y superior a 85 cm en las mujeres) , (b) triglicéridos en suero (150 mg7dl o más) , (c) colesterol HDL (40 mg/dl o menos en los hombres y 80 mg/dl o menos en las mujeres), (d) presión sanguínea (130/85 o más) , y (e) glucosa en sangre en ayunas (110 mg/dl o más) . Según la Organización Mundial de la Salud (OMS) un individuo que tiene altos niveles de insulina (una elevada glucosa en sangre en ayunas o una elevada glucosa postprandial sola) con por lo menos dos de los criterios precedentes cumple con los criterios para síndrome metabólico: (a) obesidad abdominal (relación de cintura a cadera superior a 0,9, un índice de masa corporal de por lo menos 30 kg/m2, o una medida de la cintura superior a 37 pulgadas) , (b) un panel de colesterol que indica un nivel de triglicéridos de por lo menos 150 mg/dl o un colesterol HDL inferior a 35 mg/dl, (c) presión sanguínea de 140/90 o más, o estar en tratamiento por presión sanguínea elevada) . (Mathur, Ruchi , "Metabolic Syndrome," ed. Shiel, Jr., William C, MedicineNet.com, May 11, 2009).

Para los fines de la presente, si un individuo cumple con los criterios de alguno o ambos criterios expuestos por el Panel de Tratamiento de Adultos del Programa Nacional de Educación de Colesterol de 2001 o de la OMS, ese individuo se considera afectado por Síndrome Metabólico.

Sin atarnos a ninguna teoría, los péptidos de glucagon descritos en la presente son útiles para tratar el síndrome metabólico. Por consiguiente, la invención proporciona un método para prevenir o tratar el síndrome metabólico o reducir uno, dos, tres o más factores de riesgo de él, en un sujeto, que comprende administrar al sujeto un péptido de glucagon descrito en la presente en una cantidad eficaz para prevenir o tratar el síndrome metabólico o el factor de riesgo de él .

La enfermedad de hígado graso no alcohólico (NAFLD) se refiere a un amplio espectro de enfermedades del hígado que van desde el hígado graso simple (esteatosis) a esteatohepatitis no alcohólica (NASH) , a cirrosis (cicatriz avanzada, irreversible del hígado) . La totalidad de las etapas del NAFLD tienen en común la acumulación de grasa (infiltración grasa) en las células hepáticas (hepatocitos) . El hígado graso simple es la acumulación anormal de cierto tipo de grasa, triglicérido, en las células hepáticas sin inflamación o cicatriz. En la NASH, la acumulación de grasa está asociada con niveles variables de inflamación (hepatitis) y cicatrices (fibrosis) del hígado. Las células inflamatorias pueden destruir las células hepáticas (necrosis hepatocelular) . En los términos "esteatohepatitis" y "esteatonecrosis" , esteato se refiere a la infiltración grasa, hepatitis se refiere a la inflamación en el hígado, y necrosis se refiere a la destrucción de las células hepáticas. NASH finalmente puede derivar en cicatrices del hígado (fibrosis) y luego en cicatrices avanzadas, irreversibles (cirrosis) . La cirrosis causada por NASH es la última y más grave etapa en el espectro de NAFLD. (Mendler, ichel, "Fatty Liver: Nonalcoholic Fatty Liver Disease (NAFLD) and Nonalcoholic Steatohepatitis (NASH)," ed. Schoenfield, Leslie J. , MedicineNet.com, August 29, 2005) .

La enfermedad de hígado alcohólico o enfermedad del hígado inducida por el alcohol, comprende tres enfermedades hepáticas distinguibles patológicamente relacionadas o provocadas por el consumo prolongado de alcohol: hígado graso (esteatosis) , hepatitis crónica o aguda, y cirrosis. La hepatitis alcohólica puede ir desde una hepatitis moderada, con ensayos de laboratorio anormales que son la única indicación de la enfermedad, hasta disfunción hepática grave con complicaciones tales como ictericia (piel de color amarillo provocada por la retención de bilirrubina) , encefalopatía hepática (disfunción neurológica provocada por la insuficiencia hepática) , ascitis (acumulación de fluidos en el abdomen) , hemorragia por várices esofágicas (venas varicosas en el esófago) , coagulación sanguínea anormal y estado de coma. Histológicamente, la hepatitis alcohólica tiene una apariencia característica con degeneración de distensión de los hepatocitos, inflamación con neutrófilos y algunas veces cuerpos de Mallory (agregados anormales de proteínas de filamentos intermedias celulares) . La cirrosis se caracteriza anatómicamente por nodulos esparcidos en el hígado combinados con fibrosis. (Worman, Howard J.f "Alcoholic Liver Disease" , Columbia University Medical Center website) .

Sin atarnos a ninguna teoría particular, los péptidos relacionados con glucagón de la clase 2 y de la clase 3 descritos en la presente son útiles para el tratamiento de la enfermedád de hígado alcohólico, NAFLD, o cualquier etapa de ella, que incluye por ejemplo, esteatosis, esteatohepatitis , hepatitis, inflamación hepática, NASH, cirrosis, o complicaciones de ellas. Por consiguiente, la invención proporciona un método para prevenir o tratar la Enfermedad de Hígado Alcohólico, NAFLD, o cualquier etapa de ella, en un sujeto que comprende administrar a un sujeto un péptido de glucagón de la clase 2 o de la clase 3 descrito en la presente en una cantidad eficaz para prevenir o tratar la enfermedad de hígado alcohólico, NAFLD, o las etapas de ella. Dichos métodos de tratamiento incluyen la reducción en uno, dos, tres o más de los siguientes: contenido de grasa del hígado, incidencia o progresión de cirrosis, incidencia de carcinoma hepatocelular, signos de inflamación, por ejemplo, niveles anormales de enzima hepática (por ejemplo, aspartato aminotransferasa AST y/o alanina aminotransferasa ALT o LDH) , ferritina en suero elevada, bilirrubina en suero elevada, y/o signos de fibrosis, por ejemplo niveles elevados de TGF-beta. En realizaciones preferidas, los péptidos de glucagon de la clase 2 o de la clase 3 se usan para tratar a pacientes que han avanzado más allá del hígado graso simple (esteatosis) y presentan signos de inflamación o hepatitis. Dichos métodos pueden derivar, por ejemplo, en la reducción de niveles de AST y/o ALT.

Se ha mostrado que GLP-1 y exendina 1 tienen algún efecto neuroprotector . La invención también proporciona usos de los péptidos de la superfamilia de glucagón en el tratamiento de enfermedades neurodegenerativas, que incluyen en forma no taxativa, enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Parkinson, esclerosis múltiple, esclerosis lateral amilotrófica , otros trastornos relacionados con la desmielinización, demencia senil, demencia subcortical, demencia arteriosclerótica, demencia asociada al SIDA, u otras demencias, un cáncer del sistema nervioso central, lesión cerebral traumática, lesión de la médula espinal, ataque o isquemia cerebral, vasculitis cerebral, epilepsia, enfermedad de Huntington, síndrome de Tourette, síndrome de Guillain Barré, enfermedad de Wilson, enfermedad de Pick, trastornos neuroinflamatorios, encefalitis, encefalomielitis o meningitis de origen viral, fúngico o bacteriano u otras infecciones del sistema nervioso central, enfermedades priónicas, ataxia cerebelosa, degeneración cerebelosa, síndromes de degeneración espinocerebelosa, ataxia de Friedreichs, ataxia telangiectasia, dismiotrofia espinal, parálisis supranuclear progresiva, distonía, espasticidad muscular, temblores, retinitis pigmentosa, degeneración de los cuerpos estriados y de la sustancia nigra, encefalomiopatía mitocondrial , lipofuscinosis neuronal ceroidea, encefalopatías hepáticas, encefalopatías renales, encef lopatías metabólicas, encefalopatías inducidas por toxinas, y lesión cerebral inducida por la radiación.

Por consiguiente, la invención proporciona un método para prevenir o tratar enfermedades neurodegenerativas, o reducir uno, dos, tres o más factores de riesgo de ellas, en un sujeto, que comprende administrar al sujeto un péptido de glucagón descrito en la presente en una cantidad eficaz para prevenir o tratar una enfermedad neurodegenerativa, o el factor de riesgo de ella.

El método de tratamiento de acuerdo con la presente invención comprende los pasos de administrar los profármacos revelados en la presente a un paciente usando cualquier vía de administración estándar que incluye, parenteral, tal como intravenosa, intraperitoneal , subcutánea o intramuscular, intratecal, transdérmica, rectal, oral, nasal o por inhalación. En algunas realizaciones la composición se administra en forma subcutánea o intramuscular, opcionalmente en un depósito o como parte de una composición de liberación lenta.

Composiciones y combinaciones Los profármacos de la invención se pueden administrar solos o en combinación con un segundo agente tal como agentes antidiabéticos o antiobesidad. En algunos aspectos, se administra un profármaco en combinación con un segundo profármaco o un miembro de la superfamilia de glucagón, que incluye por ejemplo un péptido relacionado con glucagón. En ciertas realizaciones, un profármaco se administra en combinación con un agente antidiabético, que incluye en forma no taxativa insulina, sulfonilureas , tales como tolbutamida (Orinase) , acetohexamida (Dymelor) , tolazamida (Tolinase) , clorpropamida (Diabinese) , glipizida (Glucotrol) , gliburida (Diabeta, Micronase, Glynase) , glimepirida (Amaryl) , o gliclazida (Diamicron) ; meglitinidas, tales como repaglinida (Prandin) o nateglinida (Starlix) ; biguanidas tales como metformina (Glucophage) o fenformina; tiazolidindionas tales como rosiglitazona (Avandia) , pioglitazona (Actos) , o troglitazona (Rezulin) , u otros inhibidores de PPARg; inhibidores de alfa glucosidasa que inhiben la digestión de los carbohidratos, tales como miglitol (Glyset) , acarbosa (Precose / Glucobay) ; exenatida (Byetta) o pramlintida; inhibidores de dipeptidil peptidasa-4 (DPP-IV) , tales como los inhibidores de vildagliptina o sitagliptina; inhibidores del SGLT (transportador 1 de glucosa dependiente de sodio); o inhibidores de la FBPasa (fructosa 1,6-bisfosfatasa) .

Los agentes antiobesidad conocidos en el arte o que se están investigando incluyen en forma no taxativa supresores del apetito, que incluyen estimuladores de tipo de fenetilamida, fentermina (opcionalmente con fenfluramina o dexfenfluramina) , dietilpropión (Tenuate ®) , fendimetrazina (Prelu-2 ®, Bontril ®) , benzfetamina (Didrex ®) , sibutramina ( eridia ®, Reductil ®) , rimonabant (Acomplia ®) , otros antagonistas de los receptores canabinoides ; oxintomodulina ; clorhidrato de fluoxetina (Prozac) ; Qnexa (topiramato y fentermina) , Excalia (bupropion y zonisamida) o Contrave (bupropion y naltrexona) o inhibidores de lipasa, similares a Xenical (Orlistat) o Cetilistat (también denominada ATL-962) , o GT 389-255.

Los profármacos de la presente invención también se pueden administrar a pacientes que sufren pérdida catabolica. Se estima que más de la mitad de los pacientes con cáncer experimentan pérdida catabolica que se caracteriza por pérdida de peso no intencional y progresiva, debilidad, y baja grasa y músculo corporal. El síndrome es igualmente común en pacientes con SIDA y también puede estar presente en enfermedades bacterianas y parásitas, artritis reumatoide, y enfermedades crónicas del intestino, hígado, pulmones, y corazón. Se lo suele asociar a la anorexia y puede manifestarse como una condición en la vejez o como resultado de un trauma físico. La pérdida catabolica es un síntoma que disminuye la calidad de vida, empeora la condición subyacente, y es la principal causa de muerte. Las composiciones farmacéuticas que comprenden los profármacos revelados en la presente se pueden formular y administrar a pacientes usando portadores farmacéuticamente aceptables estándar y vías de administración conocidas para los expertos en el arte. Por consiguiente, la presente invención también comprende composiciones farmacéuticas que comprenden uno o más de los profármacos revelados en la presente, o una sal farmacéuticamente aceptable de éllos, en combinación con un portador farmacéuticamente aceptable. En algunas realizaciones la composición farmacéutica comprende una concentración de 1 mg/ml del profármaco a pH de 4,0 a 7,0 en un sistema de tampón de fosfato. Las composiciones farmacéuticas pueden comprender el profármaco como el único componente farmacéuticamente activo, o los profármacos se pueden combinar con uno o más agentes activos adicionales. De acuerdo con algunas realizaciones se proporciona una composición que comprende un profármaco de la presente invención. Alternativamente, se puede proporcionar una composición para inducir la pérdida de peso o prevenir el aumento de peso que comprende un profármaco y un péptido antiobesidad. Los péptidos antiobesidad adecuados incluyen aquellos revelados en las patentes estadounidenses 5.691.309, 6.436.435 o en la solicitud de patente estadounidense 20050176643.

De acuerdo con algunas realizaciones se proporciona una composición farmacéutica que comprende cualquiera de los profármacos novedosos revelados en la presente, preferentemente estériles y preferentemente a un nivel de pureza de por lo menos un 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99%, y un diluyente, portador o excipiente farmacéuticamente aceptable. Dichas composiciones pueden contener un derivado de profármaco de péptido bioactivo revelado en la presente, en donde el péptido activo resultante está presente a una concentración de por lo menos 0,5 mg/ml, 1 mg/ml, 2 mg/ml, 3 mg/ml, 4 mg/ml, 5 mg/ml, 6 mg/ml, 7 mg/ml, 8 mg/ml, 9 mg/ml, 10 mg/ml, 11 mg/ml, 12 mg/ml, 13 mg/ml, 14 mg/ml, 15 mg/ml, 16 mg/ml, 17 mg/ml, 18 mg/ml, 19 mg/ml, 20 mg/ml, 21 mg/ml, 22 mg/ml, 23 mg/ml, 24 mg/ml, 25 mg/ml o más. Dichas composiciones pueden contener un derivado de profármaco de péptido bioactivo de la Clase 1, 2 o 3 revelados en la presente, en donde el péptido activo resultante está presente a una concentración de por lo menos A, en donde A es 0,001 mg/ml, 0,01 mg/ml, 0,1 mg/ml, 0,5 mg/ml, 1 mg/ml, 2 mg/ml, 3 mg/ml, 4 mg/ml, 5 mg/ml, 6 mg/ml, 7 mg/ml, 8 mg/ml, 9 mg/ml, 10 mg/ml, 11 mg/ml, 12 mg/ml, 13 mg/ml, 14 mg/ml, 15 mg/ml, 16 mg/ml, 17 mg/ml, 18 mg/ml, 19 mg/ml, 20 mg/ml, 21 mg/ml, 22 mg/ml, 23 mg/ml, 24 mg/ml, 25 mg/ml o más. En otras realizaciones dichas composiciones pueden contener un péptido activo de la Clase 1, 2, o 3, a una concentración de máxima de B, en donde B es 0 mg/ml, 25 mg/ml, 24 mg/ml, 23, mg/ml, 22 mg/ml, 21 mg/ml, 20 mg/ml, 19 mg/ml, 18 mg/ml, 17 mg/ml, 16 mg/ml, 15 mg/ml, 14 mg/ml, 13 mg/ml, 12 mg/ml, 11 mg/ml 10 mg/ml, 9 mg/ml, 8 mg/ml, 7 mg/ml, 6 mg/ml, 5 mg/ml, 4 mg/ml, 3 mg/ml, 2 mg/ml, 1 mg/ml, o 0,1 mg/ml. En algunas realizaciones, las composiciones pueden contener un péptido relacionado con glucagón de la clase 1, 2 o 3 a una concentración en la gama de A a B mg/ml, por ejemplo, de 0,001 mg/ml a 30,0 mg/ml. En algunas realizaciones, las composiciones farmacéuticas comprenden soluciones acuosas que se esterilizan y opcionalmente se almacenan en diferentes recipientes. Los compuestos de la presente invención se pueden usar de acuerdo con algunas realizaciones para preparar soluciones preformuladas fáciles de inyectar. En otras realizaciones las composiciones farmacéuticas comprenden un polvo liofilizado. Las composiciones farmacéuticas se pueden empaquetar además como parte de un estuche que incluye un aparato descartable para administrar la composición a un paciente. Los envases o estuches pueden estar marcados para el almacenamiento a temperatura ambiente o a temperatura refrigerada.

Todos los métodos terapéuticos, composiciones farmacéuticas, estuches y otras realizaciones similares descritas en la presente contemplan que los compuestos profármacos incluyan todas las sales farmacéuticamente aceptables de ellos.

En algunas realizaciones el estuche está provisto de un aparato para administrar la composición de profármaco a un paciente. El estuche puede incluir además una variedad de envases, por ejemplo frascos, tubos, botellas y similares. Preferentemente, los estuches también incluyen instrucciones de uso. De acuerdo con algunas realizaciones el aparato del estuche es un aparato distribuidor en aerosol, en donde la composición se preempaqueta dentro del aparato de aerosol. En otra realización el estuche comprende una jeringa y una aguja y en algunas realizaciones la composición de profármaco está preempaquetada dentro de la jeringa.

Formulaciones farmacéuticas de péptidos relacionados con glucagón de la clase 1, 2 y 3 De acuerdo con algunas realizaciones se proporciona una composición farmacéutica en donde la composición comprende un péptido de glucagón de la presente invención, o una sal farmacéuticamente aceptable de él y un portador farmacéuticamente aceptable. La composición farmacéutica puede comprender cualquier ingrediente farmacéuticamente aceptable que incluye por ejemplo, agentes acidificantes, aditivos, adsorbentes, propulsores de aerosol, agentes de desplazamiento de aire, agentes de alquilación, agentes antiapelmazantes , anticoagulantes, antimicrobianos/conservantes, antioxidantes, antisépticos, bases, ligantes, agentes tampones, agentes quelantes, agentes de revestimiento, agentes colorantes, secantes, detergentes, diluyentes, desinfectantes, desintegradores, agentes dispersantes, agentes mej oradores de la disolución, colorantes, emolientes, agentes emulsionantes, rellenos, agentes formadores de película, mej oradores del sabor, agentes saborizantes , mej oradores del flujo, agentes gelificantes , agentes granuladores, agentes de humedecimiento, lubricantes, mucoadhesivos , bases de ungüentos, ungüentos, vehículos oleaginosos, bases orgánicas, bases de pastillas, pigmentos, plastificadores , agentes de pulido, conservantes, agentes secuestrantes, penetrantes en la piel, agentes solubilizadores , agentes estabilizadores, bases de supositorios, agentes activos superficiales, surfactantes , agentes de suspensión, agentes edulcorantes, agentes terapéuticos, agentes espesantes, agentes de toxicidad, agentes que aumentan la viscosidad, agentes adsorbentes de agua, cosolventes miscibles en agua, ablandadores de agua, o agente de humedecimiento.

En algunas realizaciones, las composiciones farmacéuticas comprenden uno cualquiera o una combinación de los siguientes componentes: acacia, acesulfamo de potasio, citrato de acetiltributilo, citrato de acetiltrietilo, agar-agar, albúmina, alcohol, alcohol deshidratado, alcohol desnaturalizado, alcohol diluido, ácido aleuriítico, ácido algínico, poliésteres alifáticos, alúmina, hidróxido de aluminio, estearato de aluminio, amilopectina, oí-amilosa, ácido ascórbico, palmitato de ascorbilo, aspartamo, agua bacteriostática para inyección, bentonita, magma de bentonita, cloruro de benzalconio, cloruro de bencetonio, ácido benzoico, alcohol bencílico, benzoato de bencilo, bronopol, hidroxianisol butilado, hidroxitolueno butilado, butilparabeno, butilparabeno de sodio, alginato de calcio, ascorbato de calcio, carbonato de calcio, ciclamato de calcio, fosfato de calcio anhidro dibásico, fosfato de calcio deshidratado dibásico, fosfato de calcio tribásico, propionato de calcio, silicato de calcio, sorbato de calcio, estearato de calcio, sulfato de calcio, sulfato de calcio semihidratado, aceite de cañóla, carbómero, dióxido de carbono, carboximetil celulosa de calcio, carboximetil celulosa de sodio, ß-caroteno, carragenina, aceite de ricino, aceite de ricino hidrogenado, cera emulsionante catiónica, acetato de celulosa, ftalato de acetato de celulosa, etil celulosa, celulosa microcristalina, celulosa en polvo, celulosa microcristalina silicificada , carboximetilcelulosa de sodio, alcohol cetoestearílico, cetrimida, alcohol cetílico, clorhexidina , clorobutanol , clorocresol, colesterol, acetato de clorhexidina, gluconato de clorhexidina, clorhidrato de clorhexidina, clorodifluoroetano (HCFC) , clorodifluorometano, clorofluorocarbonos (CFC) clorofenoxietanol , cloroxilenol , sólidos de jarabe de maíz, ácido cítrico anhidro, ácido cítrico monohidratado, manteca de cacao, agentes colorantes, aceite de maíz, aceite de semilla de algodón, cresol, m-cresol, o-cresol, p-cresol, croscarmelosa de sodio, crospovidona, ácido ciclámico, ciclodextrinas , dextrates, dextrina, dextrosa, dextrosa anhidra, diazolidinil urea, ftalato de dibutilo, sebacato de dibutilo, dietanolamina, ftalato dietilo, difluoroetano (HFC) , dimetil- 3-ciclodextrina, compuestos de tipo de ciclodextrina, tales como Captisol®, éter de dimetilo, ftalato de dimetilo, edentato de dipotasio, edentato de disodio, fosfato de hidrógeno de disodio, docusato de calcio, docusato de potasio, docusato de sodio, galato de dodecilo, bromuro de dodeciltrimetilamonio, fosfato de calcio de edentato, ácido édtico, eglumina, alcohol etílico, etilcelulosa, galato de etilo, laurato de etilo, etilmaltol, oleato de etilo, etilparabeno, etilparabeno de potasio, etilparabeno de sodio, etilvainillina, fructosa, fructosa líquida, fructosa molida, fructosa libre de pirógenos, fructosa en polvo, ácido fumárico, gelatina, glucosa, glucosa líquida, mezclas de gliceridos de ácidos grasos vegetales saturados, glicerina, behenato de glicerilo, monooleato de glicerilo, monoestearato de glicerilo, monoestearato de glicerilo autoemulsionante , palmitostearato de glicerilo, glicina, glicoles, glicofurol, goma guar, heptafluoropropano (HFC) , bromuro de hexadeciltrimetilamonio, jarabe de maíz de alta fructosa, albúmina de suero humano, hidrocarburos (HC) , ácido clorhídrico diluido, aceite vegetal hidrogenado, tipo II, hidroxietil celulosa, 2-hidroxietil- -ciclodextrina, hidroxipropil celulosa, hidroxipropil celulosa poco sustituida, 2-hidroxipropil- -ciclodextrina, hidroxipropil metilcelulosa, ftalato de hidroxipropil metilcelulosa, imidurea, índigo carmín, intercambiadores de iones, óxidos de hierro, alcohol isopropílico, miristato de isopropilo, palmitato de isopropilo, solución salina isotónica, caolín, ácido láctico, lactitol, lactosa, lanolina, alcoholes de lanolina, lanolina anhidra, lecitina, silicato de magnesio y aluminio, carbonato de magnesio, carbonato de magnesio normal, carbonato de magnesio anhidro, hidróxido de carbonato de magnesio, hidróxido de magnesio, lauril sulfato de magnesio, óxido de magnesio, silicato de magnesio, estearato de magnesio, trisilicato de magnesio, trisilicato de magnesio anhidro, ácido málico, malta, maltitol, solución de maltitol, maltodextrina, maltol, maltosa, manitol, triglicéridos de cadena media, meglumina, mentol, metilcelulosa, metacrilato de metilo, oleato de metilo, metilparabeno, metilparabeno de potasio, metilparabeno de sodio, celulosa microcristalina y carboximetilcelulosa de sodio, aceite mineral, aceite mineral liviano, aceite mineral y alcoholes de lanolina, aceite, aceite de oliva, monoetanolamina, montmorillonita, galato de octilo, ácido oleico, ácido palmítico, parafina, aceite de maní, petrolato, petrolato y alcoholes de lanolina, barniz farmacéutico, fenol, fenol licuado, fenoxietanol , fenoxipropanol , alcohol feniletílico, acetato fenilmercúrico, borato fenilmercúrico, nitrato fenilmercúrico, polacrilina, polacrilina de potasio, poloxámero, polidextrosa, polietilenglicol , óxido de polietileno, poliacrilatos , polímeros de bloque de polietileno-polioxipropileno, polimetacrilatos , éteres de alquilo de polioxietileno, derivados de aceite de ricino de polioxietileno, ésteres de ácidos grasos de sorbitol de polioxietileno, estearatos de polioxietileno, alcohol polivinílico, polivinilpirrolidona, alginato de potasio, benzoato de potasio, bicarbonato de potasio, bisulfito de potasio, cloruro de potasio, citrato de potasio, citrato de potasio anhidro, fosfato de hidrógeno de potasio, metabisulfito de potasio, fosfato de potasio monobásico, propionato de potasio, sorbato de potasio, povidona, propanol, ácido propiónico, carbonato de propileno, propilenglicol , alginato de propilenglicol , galato de propilo, propilparabeno, propilparabeno de potasio, propilparabeno de sodio, sulfato de protamina, aceite de colza, solución de Ringer, sacarina, sacarina de amonio, sacarina de calcio, sacarina de sodio, aceite de cártamo, saponita, proteínas de suero, aceite de sésamo, sílice coloidal, dióxido de silicio coloidal, alginato de sodio, ascorbato de sodio, benzoato de sodio, bicarbonato de sodio, bisulfito de sodio, cloruro de sodio, citrato de sodio anhidro, citrato de sodio deshidratado, cloruro de sodio, ciclamato de sodio, edentato de sodio, sulfato de dodecilo de sodio, lauril sulfato de sodio, metabisulfito de sodio, fosfato de sodio, fosfato de sodio dibásico, fosfato de sodio monobásico, fosfato de sodio tribásico, propionato de sodio anhidro, propionato de sodio, sorbato de sodio, glicolato de almidón de sodio, estearil fumarato de sodio, sulfito de sodio, ácido sórbico, ásteres de sorbitan (ásteres grasos de sorbitan) , sorbitol, solución de sorbitol al 70%, aceite de soja, cera de esperma de ballena, almidón, almidón de maíz, almidón de papa, almidón pregelatinizado, almidón de maíz esterilizable, ácido esteárico, ácido esteárico purificado, alcohol estearílico, sacarosa, azúcares, azúcar compresible, azúcar impalpable, esferas de azúcar, azúcar invertido, Sugartab, Amarillo de Ocaso FCF, parafina sintética, talco, ácido tartárico, tartrazina, tetrafluoroetano (HFC) , aceite de teobroma, timerosal, dióxido de titanio, alfa-tocoferol , acetato de tocoferilo, succinato de ácido de alfa tocoferilo, beta-tocoferol , delta-tocoferol , gamma-tocoferol, tragacanto, triacetina, citrato de tributilo, trietanolamina, citrato de trietilo, trimetil- -ciclodextrina, bromuro de trimetiltetradecilamonio, tampón Tris, edentato de trisodio, vainillina, aceite vegetal hidrogenado tipo I, agua, agua blanda, agua dura, agua libre de dióxido de carbono, agua libre de pirógenos, agua para inyección, agua estéril para inhalación, agua estéril para inyección, agua estéril para irrigación, ceras, cera emulsionante aniónica, cera de carnauba, cera emulsionante catiónica, cera de éster cetílico, cera microcristalina, cera emulsionante no iónica, cera de supositorio, cera blanca, cera amarilla, petrolato blanco, -grasa de lana, goma de xantano, xilitol, Zein, propionato de zinc. sales de zinc, estearato de zinc, o cualquier excipiente de Handbook of Pharmaceutical Excipiente , Third Edition, A. H. Kibbe (Pharmaceutical Press, London, UK, 2000) , que se incorpora en la presente como referencia en su toalidad. Re ington' s Pharmaceutical Sciences, Sixteenth Edition, E. W. Martin (Mack Publishing Co., Easton, Pa., 1980), que se incorpora en la presente como referencia en su totalidad, revela componentes usados en la formulación de composiciones farmacéuticamente aceptables y técnicas conocidas para su preparación. Excepto que algún agente convencional sea incompatible con las composiciones farmacéuticas, su uso en composiciones farmacéuticas está contemplado. También se pueden incorporar ingredientes activos suplementarios en las composiciones.

Las formulaciones farmacéuticas reveladas en la presente se pueden diseñar de manera que sean de acción corta, de liberación rápida, de acción prolongada, o de liberación sostenida como se describe a continuación. Las formulaciones farmacéuticas también se pueden formular para la liberación inmediata, la liberación controlada o para la liberación lenta. Las presentes composiciones además pueden comprender, por ejemplo, micelas o liposomas, o alguna otra forma encapsulada, o se pueden administrar en una forma de liberación prolongada para proporcionar un efecto de almacenamiento y/o suministro prolongado. Las formulaciones farmacéuticas reveladas se pueden administrar de acuerdo con cualquier régimen que incluye, por ejemplo, diario (1 vez por día, 2 veces por día, 3 veces por día, 4 veces por día, 5 veces por día, 6 veces por día) , cada dos días, cada tres días, cada cuatro días, cada cinco días, cada seis días, semanal, quincenal, cada tres semanas, mensual, o bimestral .

En algunas realizaciones, el componente (s) precedente puede estar presente en las composiciones farmacéuticas a cualquier concentración, como, por ejemplo, por lo menos A, en donde A es 0,0001% p/v, 0,001% p/v, 0,01% p/v, 0,1% p/v, 1% p/v, 2% w/v, 5% p/v, 10% p/v, 20% p/v, 30% p/v, 40% p/v, 50% p/v, 60% p/v, 70% p/v, 80% p/v, o 90% p/v. En algunas realizaciones el componente (s) precedente puede estar presente en las composiciones farmacéuticas a cualquier concentración, como por ejemplo, como máximo B, en donde B es 90% p/v, 80% p/v, 70% p/v, 60% p/v, 50% p/v, 40% p/v, 30% p/v, 20% p/v, 10% p/v, 5% p/v, 2% p/v, 1% p/v, 0,1% p/v, 0,001% p/v, o 0,0001%. En otras realizaciones el componente (s) precedente puede estar presente en la composición farmacéutica a una gama de concentración, como, por ejemplo, de A a B. En algunas realizaciones, A es 0,0001% y B es 90%.

Las composiciones farmacéuticas pueden formularse para lograr un pH fisiológicamente compatible. En algunas realizaciones, el pH de las composiciones farmacéuticas puede ser por lo menos 5, por lo menos 5,5, por lo menos 6, por lo menos 6,5, por lo menos 7, por lo menos 7,5, por lo menos 8, por lo menos 8,5, por lo menos 9, por lo menos 9,5, por lo menos 10, o por lo menos 10,5 hasta e incluyendo pH 11, según la formulación y la vía de administración. En ciertas realizaciones, las composiciones farmacéuticas pueden comprender agentes tampones para lograr un pH compatible fisiológico. Los agentes tampones pueden incluir cualquier compuesto capaz de regular al pH deseado, tal como, por ejemplo, tampones de fosfato (por ejemplo, PBS) , trietanolamina, Tris, bicina, TAPS, tricina, HEPES, TES, MOPS, PIPES, cacodilato, MES, y otros. En ciertas realizaciones la resistencia del tampón es por lo menos 0,5 mM, por lo menos 1 mM, por lo menos 5 mM, por lo menos 10 mM, por lo menos 20 mM, por lo menos 30 mM, por lo menos 40 mM, por lo menos 50 mM, por lo menos 60 mM, por lo menos 70 mM, por lo menos 80 mM, por lo menos 90 mM, por lo menos 100 mM, por lo menos 120 mM, por lo menos 150 mM, o por lo menos 200 mM. En algunas realizaciones la resistencia del tampón es no mayor de 300 mM (por ejemplo, como máximo 200 mM, como máximo 100 mM, como máximo 90 mM, como máximo 80 mM, como máximo 70 mM, como máximo 60 mM, como máximo 50 mM, como máximo 40 mM, como máximo 30 mM, como máximo 20 mM, como máximo 10 mM, como máximo 5 mM, como máximo 1 mM) Los compuestos profármacos revelados en la presente se pueden preparar mediante métodos sintéticos estándar, técnicas de ADN recombinante, o cualquier otro método de preparación de péptidos y proteínas de fusión. Aunque ciertos aminoácidos no naturales no se pueden expresar mediante técnicas de ADN recombinante, las técnicas para su preparación son conocidas en el arte. Los compuestos de esta invención que comprenden partes que no son péptidos se pueden sintetizar mediante reacciones de química orgánica estándar, además de las reacciones de química de péptidos estándar cuando son aplicables.

EJEMPLOS Protocolo de Pegilación General (Cys-maleimido) Generalmente, el péptido relacionado con glucagón que contiene Cys disuelta en solución salina con tampón de fosfato (5-11 mg/ml) y se agrega 0,01 ácido metilendiamino tetraacético (10%-15% de volumen total) . Se agrega exceso (2 veces) de reactivo de maleimio metoxiPEG (Dow) y la reacción se agita a temperatura ambiente mientras se monitorea el avance de la reacción mediante cromatografía de líquido de alto rendimiento (HPLC) . Después de 8-24 horas, la mezcla de la reacción se acidifica y se carga en una columna de fase invertida preparativa para la purificación usando 0,1% ácido tetrafluoroacético (TFA) /acetonitrilo en la modalidad de gradiente. Las fracciones apropiadas se combinaron y se liofilizaron para dar los derivados pegilados deseados.

EJEMPLO 1 Determinación de mitad de tiempo de descomposición de dipéptido (en PBS) en péptido de modelo Se usó un hexapéptido de modelo (HSRGTF-NH2; SEQ ID NO: 715) como modelo para determinar la semivida de diferentes dipéptidos unidos al hexapéptido a través de un enlace de amida. El hexapéptido se montó en un sintetizador de péptidos. Para confirmar la integridad de la síntesis y la disponibilidad de un extremo de N prolongable, la resina unida al péptido se descompuso con ácido fluorhídrico (HF) y se analizó. Luego se introdujeron sucesivamente sarcosina protegida con Boc y Usina en la resina unida al péptido para producir el péptido A (dipéptido - péptido de modelo) . El péptido A se descompuso con HF y se purificó mediante HPLC preparativa.

Purificación preparativa usando HPLC Se realizó la purificación usando un análisis de HPLC sobre una columna Vydac C18 de 1 x 25 cm basada en sílice (tamaño de las partículas de 5 µ, tamaño de los poros de 300 A) . Los instrumentos usados fueron una bomba de Waters Associates modelo 600, un inyector modelo 717 y un detector de ¦ radiación ultravioleta modelo 486. Se usó una longitud de onda de 230 nm. El solvente A contenía 10% CH3CN /0,1% TFA en agua destilada, y el solvente B contenía 0,1% TFA en CH3CN. Se empleó un gradiente lineal (0 a 100% B en 2 horas) . La velocidad de flujo fue 10 mL/minuto y el tamaño de las fracciones fue de 4 mL. A partir de 150 mg de péptido crudo, se obtuvieron 30 mg del péptido puro (20% de rendimiento) .

El péptido A se disolvió a una concentración de 1 mg/mL en tampón de solución salina con tampón de fosfato (PBS) (pH 7,4). Luego se incubó a 37 °C en un baño de agua. Las muestras analizadas se recogieron en diferentes puntos de tiempo (5 horas, 8 horas, 24 horas, 31 horas, 47 horas) y se enfriaron con el mismo volumen de 0,1% TFA. Se usó HPLC para monitorear la reacción de descomposición. Los datos se monitorearon cualitativamente mediante cromatografía de líquido y espectrometría de masa (LC-MS) y se analizaron cuantitativamente mediante el software de Cromatografía Simple de Pico de HPLC para obtener el tiempo de retención y área pico relativa para la modificación de prof rmacos.

Análisis usando espectrometría de masa Los espectros de masa se obtuvieron usando un espectrómetro de masa cuadrapolo de electrospray Sciex API -III con una fuente de iones de ionización de lluvia de electrones estándar (ESI)... Las condiciones de ionización que se usaron son las siguientes: ESI en el modo de ion positivo; tensión de lluvia de iones, 3,9 kV, potencial del orificio, 60 V. El gas de nebulización y de cortina usado fue nitrógeno a una velocidad de flujo de 0,9 L/minuto. Se registraron espectros de masa de 600-800 Thompson (Th) a 0,5 Th por cada paso y 2 mseg de tiempo de permanencia. La muestra (1 mg/mL) se disolvió en acetonitrilo acuoso al 50% con ácido acético al 1% y se introdujo con una bomba de jeringa externa a una velocidad de 5 L/minuto.

Cuando los péptidos se analizaron en solución de PBS mediante ESI-MS, primero se desalinizaron usando una punta de extracción de fase sólida ZipTip que contiene 0,6 ^L de resina de C4, siguiendo las instrucciones dadas por el fabricante (Millipore Corporation, Billerica, MA, véase http://www.millipore.com/catalogue.nsf/docs/C5737).

Análisis usando HPLC Se realizaron análisis de HPLC usando un sistema de Cromatografía Beckman System Gold usando un detector de radiación ultravioleta a 214 nm y una columna Vydac de C8 de 150 mm x 4,6 mm. La velocidad de flujo fue 1 mL/minuto. El solvente A contenía 0,1% TFA en agua destilada y el solvente B contenía 0,1% TFA en CH3CN. Se empleó un gradiente lineal (0% a 30% B en 10 minutos) . Los datos se recogieron y se analizaron usando el software de Cromatografía Simple de Pico.

Las velocidades de descomposición iniciales se usaron para medir la constante de velocidad para la disociación de los profármacos respectivos. Las concentraciones del profármaco y el fármaco se estimaron a partir de sus áreas pico, "a" y "b" respectivamente, para cada uno de los diferentes tiempos de recolección (véase la Tabla 1) . Las constantes de velocidad de disociación de primer orden de los profármacos se determinaron graficando el logaritmo de la concentración del profármaco a diferentes intervalos de tiempo. La pendiente de este gráfico da la constante de velocidad wk" . Las semividas de la degradación de los diferentes profármacos luego se calcularon usando la fórmula ti/2 = 0,693/k.

Tabla 1. Datos de HPLC y LC- S de Descomposición del péptido A ( lys- sar-HSRGTF-NH2) en PBS Las semividas de la degradación de los diferentes profármacos se calcularon usando la fórmula ti2 = 0,693/k y se determinó que la semivida de la combinación de lys-sar sobre el péptido de modelo HSRGTF-NH2 (SEQ ID NO: 715) fue 14,0 horas.

EJEPLO 2 Determinación de semivida de Descomposición de Dipéptido (en plasma) sobre el péptido de modelo D Se usó otro hexapéptido de modelo (dHdTdRGdTdF-NH2 SEQ ID NO: 716) como modelo para determinar la servida de la combinación de dipéptidos en plasma. Se usaron aminoácidos D para prevenir otra descomposición enzimática del péptido de modelo excepto por la descomposición de profármaco. Le hexapéptido se sintetizó mediante un autosintetizador . Para confirmar que se pudo usar un extremo de N prolongado viable para la modificación del profármaco, la resina unida al péptido con HF para verificar la validez. Luego se introdujeron sucesivamente sarcosina protegida con Boc y lisina en la resina unida al péptido. El péptico B (dipéptido + péptido de modelo d) se descompuso con HF y se purificó mediante HPLC preparativa.

Purificación preparativa usando HPLC La purificación se realizó usando el análisis de HPLC sobre un columna de C18 Vydac de 1 x 25 cm basado en sílice (tamaños de las partículas de 5 µ, tamaño de los poros de 300 A) . Los instrumentos usados fueron una bomba Waters Associates modelo 600, un inyector modelo 717 y un detector de radiación ultravioleta modelo 486. Se usó una longitud de onda de 230 nm para todas las muestras. El solvente A contenía 10% CH3CN /0,1% TFA en agua destilada, y el solvente B contenía 0,1% TFA en CH3CN. Se empleó un gradiente lineal (0 a 100% B en 2 horas) . La velocidad de flujo fue 10 mL/minuto y el tamaño de la fracción fue 4 mL. A partir de 150 mg de péptido crudo, generalmente se obtuvieron 30 mg del péptido puro (20% de rendimiento) .

El péptido B se disolvió a 2 mg/mL de concentración en plasma (pH 7,4) . Luego se incubó en un baño de agua a 37 °C. Las muestras analíticas se recogieron en diferentes puntos de tiempo (5 horas, 11 h, 24 h, 32 h, 48 horas) . Las muestras se trataron con 10 veces el volumen de 0,1% TFA/ACN y se centrifugaron a 3000 rpm. El fluido de sobrenadante se recogió y se diluyó con el mismo volumen de 0,1% TFA/H20. Se usó la HPLC para monitorear la reacción de descomposición. Los datos se monitorearon cualitativamente mediante LC-MS y se analizaron cuantitativamente mediante software de Cromatografía simple de Pico de HPLC para obtener el tiempo de permanencia y el área de pico relativa.

Análisis usando espectrometría de masa Se obtuvieron espectros de masa usando un espectrómetro de masa cuadrapolo de electrospray API -III Sciex con una fuente de iones de ESI estándar. Las condiciones de ionización que se usaron son las siguientes: ESI en el modo de iones positivos; tensión de lluvia de iones, 3,9 kV, potencial de orificio, 60 V. El gas de nebulización y de cortina fue nitrógeno a una velocidad de flujo de 0,9 L/minuto. Se registraron espectros de masa de 600-800 Thompson a 0,5 Th por cada paso y un tiempo de permanencia de 2 mseg. La muestra (1 mg/mL) se disolvió en 50% acetonitrilo acuoso con 1% ácido acético y se introdujo con una bomba de jeringa externa a la velocidad de 5 pL/minuto.

Análisis usando HPLC Los análisis se realizaron usando un sistema de Cromatografía Beckman System Gold usando un detector de radiación ultravioleta a 214 nm y una columna Vydac de C8 de 160 mm x 4,6 mm. La velocidad de flujo fue 1 mL/minuto. El solvente A contenía 0,1% TFA en agua destilada y el solvente B contenía 0,1% TFA y 90% CH3CN. Se empleó un gradiente lineal (0% a 30% B en 10 minutos) . Los datos se recogieron y se analizaron usando el software de Cromatografía Simple de Pico.

Las velocidades de descomposición iniciales se usaron para medir la constante de velocidad para la disociación de los profármacos respectivos. Las concentraciones del profármaco y el fármaco se estimaron desde sus áreas de pico, "a" y "b" respectivamente, para cada uno de los diferentes tiempos de recolección (véase la Tabla 2) . Las constantes de velocidad de disociación de primer orden de los profármacos se determinaron graficando los logaritmos de la concentración del profármaco a diferentes intervalos de tiempo. La pendiente de este gráfico da la constante de velocidad "k" . Las semividas de la degradación de los diferentes profármacos luego se calcularon usando la fórmula formula ti/2 = 0,693/k.

Tabla 2. Datos de HPLC y LC-MS de Descomposición de péptido B (lys-sar-dHdTdRGdTdF-NH2) en plasma Las semividas de la degradación de los diferentes profármacos luego se calcularon usando la fórmula ti/2 = 0,693/k. Usando esta fórmula, se determinó que la semivida de la combinación de Lys-Sar en plasma sobre un péptido de modelo D dHdTdRGdTdF- H2 (SEQ ID NO: 716) era 18,6 horas.

EJEMPLO 3 Las semividas de descomposición de diferentes dipéptidos adicionales unidos al hexapéptido de modelo (HSRGTF-NH2; SEQ ID NO: 715) se determinaron usando los procedimientos descritos en el Ejemplo 1. Los datos generados en estos experimentos se presentan en las Tablas 3 y 4.

Tabla 3. Descomposición de los Dipéptidos A-B que están unidos a la cadena lateral de una para-amino-Phe de extremo de N de los HexaPéptidos de Modelo en PBS Tabla 4. Descomposición de los Dipéptidos A-B unidos a aminoácidos variables en la posición 1 (Xi) del Hexapéptido de Modelo (Xi-S R G T F-NH2 (SEQ ID NO: 732) ) en PBS NH2-A-B-X1-: 3 R G T F-NH2 Compuesto A B Xl t s (aminoácido) (aminoácido) (aminoácido) 1 F P H Ninguna descomposición 2 Hidroxil-F P H Ninguna descomposición 3 G P H Ninguna descomposición EJEMPLO 4 Síntesis de análogos de glucagón y GLP-1 Para investigar la posibilidad de preparar un derivado bioactivo de glucagón y GLP-1 se sintetizaron numerosos análogos de péptido. El procedimiento estándar se describe brevemente en la presente, y los detalles se discuten más adelante.

Materiales : Resina PAM (resina PAM es OCH2-fenilacetamidometil-copoliestireno-1% divinilbenceno) , (100-180 mesh, 1% DVB poliestireno entrecruzado; carga de 0,7-1,0 mmol/g) , aminoácidos protegidos con Boc y protegidos con Fmoc se compraron a Midwest Biotech. Otros reactivos tales como a-hidroxi-ácidos (ácido fenilacético y ácido glicólico) se compraron a Aldrich. Las síntesis de péptidos de fase sólida usando aminoácidos protegidos con Boc se realizaron en un Sintetizador de Péptidos Applied Biosystem 430A. La síntesis de aminoácidos protegidos con Fmoc se realizó usando el Sintetizador de Péptidos Applied Biosystems Modelo 433. La síntesis manual de depsipéptidos se realizó en recipientes de reacción sinterizados usando procedimientos análogos (Schnolzer, M. , et al., (1992) Int J Pept Protein Res 40 (3-4) : 180-193) .

Síntesis de Péptidos (aminoácidos Boc / descomposición con HF) La síntesis de estos análogos se realizó en un Sintetizador de Péptidos Applied Biosystems Modelo 430A. Los péptidos sintéticos se construyeron mediante el agregado secuencial de aminoácidos y los ésteres activados de cada aminoácido se generaron mediante el agregado de 0,9 mmol (3,8 mL de una solución 0,5 M) de 3- (Dietoxi-fosforiloxi) -3H-benzo [d] [1, 2 , 3] triazin-4-ona (DEPBT) en DMF a un cartucho que contiene 2 mmol de aminoácido protegido con Boc . Los aminoácidos se disolvieron haciendo burbujear gas nitrógeno a través del cartucho. Se agregó 1 mL de N,N-Diisopropiletilamina al cartucho para efectuar la formación del éster. Esta solución se transfirió al recipiente de la reacción que contenía 0,2 mmol del residuo del extremo de C unido a la resina PAM, se revolvió varias veces y se dejó acoplar a la resina durante 10 minutos. Después de lavar para eliminar los reactivos que no reaccionaron, el grupo protector de Boc del extremo de N se eliminó mediante el tratamiento con ácido trifluoroacético (TFA) durante 5 minutos. La resina se lavó con DMF y el ciclo se repitió para la cantidad de pasos deseada hasta que se montó la cadena. El recipiente de la reacción al final de la síntesis (generalmente, 30 aminoácidos) contenía aproximadamente 1,2-1,5 g de peptidil -resina PAM protegida. La resina se lavó muchas veces con dimetilformamida (DMF) , se trató con ácido trifluoroacético para eliminar el último grupo protector de t-Boc y finalmente se lavó otras varias veces con DMF, diclorometano (DCM) y se secó.

La dipeptidil-resina se trató con HF anhidro (el procedimiento se detalla más adelante en esta sección) y esto generalmente produjo aproximadamente 350 mg (50% de rendimiento) de un péptido desprotegido.

Síntesis de péptido (aminoácidos Fmoc / descomposición con HF) El esquema de síntesis se realizó manualmente con algunos aminoácidos en sitios selectivos. En este trabajo, los aminoácidos Fmoc se usaron solamente para sintetizar profármacos de serina interna, como parte de una estrategia sintética más amplia. Aquí, se debe señalar que aunque se ha usado la composición química de Fmoc en la sínteis, los péptidos siempre se deben construir sobre resina PA que necesitó tratamiento con HF para descomponer el péptido desde el soporte sólido. El rendimiento de estos péptidos es aproximadamente como se dijo anteriormente para la síntesis de Boc/PAM.

La síntesis se realizó como se describió en la sección previa. Al final del paso de acoplamiento, la peptidil -resina se trató con 20% piperidina para eliminar el grupo protector de Fmoc del extremo de N. Se lavó reiteradamente con DMF y este ciclo reptetido se repitió la cantidad deseada de pasos de acoplamiento. La peptidil -resina al final de la síntesis completa se secó usando DCM y el péptido se descompuso desde la resina con HF anhidro.

Síntesis de Depsipéptidos (formación de amino éster) En este caso, la peptidil-resina tenía una prolongación del extremo de cc-hidrixil-N en lugar de una amina de extremo de N y la acilación se hizo en el grupo a-hidroxilo. Esta reacción lleva un tiempo más prolongado que la del enlace de amida porque el grupo hidroxilo es un nucleófilo más débil comparado con la amina. El tiempo de la reacción fue generalmente de 12 horas.

Inicialmente, los esteres activados de cada aminoácido se generaron mediante el agregado de 1 mmol (0,155 mL de Diisopropilcarbodiimida (DIC) a un cartucho que contenía una solución de 2 mmol de residuo de aminoácido protegido con Boc en 2 mL de DCM. Este cartucho se enfrió a 37 °C durante 10 minutos y se agregó 0,9 mmol (244 mg) de dimetilaminopirídina (DMAP) al cartucho para acelerar la formación de éster. Esta mezcla se transfirió al recipiente de la reacción que contenía la peptidil-resina sobre la cual se sintetizó el péptido. El recipiente de la reacción se agitó durante 12 horas.

La peptidil-resina se secó usando DCM y se continuó la síntesis del péptido deseado. La peptidil-resina al final de la síntesis completa se secó usando DCM y finalmente se trató con HF anhidro para generar el péptido deseado.

Síntesis péptido de hidroxilo de extremo de N (prolongación de extremo de a-hidroxil-N) En seta reacción, la amina libre de la pepidil-resina reacciona con un a-hidroxil -ácido para formar una prolongación de extremo de a-hidroxil-N. Al respecto, se usaron dos de tales a-hidroxil-ácidos a saber ácido glicólico (OH-glicina) y ácido fenilláctico (OH-fenilalanina) . Estas síntesis también se realizaron manualmente. Los péptidos se construyeron mediante el agregado del a-hidroxil-ácido y se generaron esteres activados del a-hidroxil-ácido mediante el agregado de 0,9 mmol de DEPBT (270 mg) a un cartucho que contenía una solución de 1 mmol del residuo protegido con Boc en 2 mL de DMF. Se agregó DIEA ( (N, N-Diisopropiletilamina, 0,5 mL) al cartucho para acelerar la formación de éster. La mezcla se transfirió al recipiente de la reacción que contenía la peptidil -resina en la cual se sintetizó el péptido. El tiempo de la reacción fue de 6 horas.

La peptidil -resina se secó usando DCM y se continuó la síntesis del péptido deseado. La peptidil-resina al final de la síntesis completa se secó usando DCM y se descompuso mediante HF anhidro para generar el péptido libre.

Tratamiento con HF de la peptidil-resina La peptidil-resina (30 mg a 200 mg) se colocó en el recipiente de la reacción de fluoruro de hidrógeno (HF) para la descomposición. Se agregaron 500 µ?. de p-cresol al recipiente como un depurador de iones de carbono. El recipiente se montó al sistema de HF y se sumergió en una mezcla de metanol/hielo seco. El recipiente se vació con una bomba de vacío y 10 mL de HF se destilaron al recipiente de la reacción. Esta mezcla de la reacción de la peptidil-resina y el HF se agitó durante una hora a 0°G, después de lo cual se estableció un vacío y el HF se evacuó rápidamente (10-15 minutos) . El recipiente se retiró cuidadosamente y se llenó con aproximadamente 35 mL de éter para precipitar el péptido y para extraer el p-cresol y grupos protectores orgánicos de molécula pequeña derivados del tratamiento con HF. Esta mezcla se filtró usando un filtro de teflón y se repitió dos veces para eliminar todo el exceso de cresol. Este filtrado se descartó. El péptido precipitado se disolvió en aproximadamente 20 mL de 10% ácido acético (acuoso) . El filtrado, que contenía el péptido deseado, se recogió y se liofilizó.

Análisis usando espectrometria de masa Se obtuvieron espectros de masa usando un espectrómetro de masa de cuadrapolo de electrospray Sciex API -III con una fuente de iones de ESI estándar. Las condiciones de ionización que se usaron son las siguientes: ESI en el modo de iones positivos; tensión de lluvia de iones, 3,9 kV; potencial del orificio, 60 V. El gas de nebulización y cortina usado fue nitrógeno con una velocidad de flujo de 0,9 L/minuto. Se registraron espectros de masa de 600-800 Thompson a 0,5 Th por cada paso y un tiempo de permanencia de 2 mseg . La muestra (1 mg/mL) se disolvió en 50% acetonitrilo acuoso con 1% ácido acético y se introdujo con una bomba de jeringa extrena a una velocidad de 5 µ?/p??????* Cuando los péptidos se analizaron en solución de PBS mediante ESI-MS, primero se los desalinizó usando una punta de extracción de fase sólida ZipTip que contenía 0,6 µL de resina de C4, siguiendo las instrucciones dadas por el fabricante (Millipore Corporation, Billerica, MA, véase el sitio web de Millipore en millipore . com/'catalogue . nsf'/'docs/'C57'31') .

Análisis de Cromatografía de Liquido de Alto Rendimiento (HPLC) Se realizaron análisis preliminares con estos péptidos crudos para una aproximación de sus velocidades de conversión en tampón de solución salina con tampón de fosfato (PBS) (pH, 7,2) usando análisis de cromatografía de líquido de alto rendimiento (HPLC) y MALDI . Las muestras de péptidos crudo se disolvieron en el tampón de PBS a una concentración de 1 mg/mL. Un mL de la solución resultante se almacenó en un frasco de HPLC de 1,5 mL que luego se selló y se incubó a 37 °C. Se extrajeron alícuotas de 100 µ?, a diferentes intervalos de tiempo, se enfriaron a temperatura ambiente y e analizaron mediante HPLC.

Los análisis de HPLC se realizaron usando un sistema de Cromatografía Beckman System Gold USANDO UN DETECTOR DE RADIACIÓN ULTRAVIOLETA A 214 N. Se realizaron análisis de HPLC en una columna Vydac de C18 de 150 mm x 4,6 mm. La velocidad de flujo fue de 1 mL/minuto. El solvente A contenía 0,1% de TFA en agua destilada y el solvente B contenía 0,1% de TFA en 90% de CH3CN. Se empleó un gradiente lineal (40% a 70% de B en 15 minutos) . Los datos se recogieron y se analizaron usando el software de Cromatografía Simple de Pico.

Las velocidades de hidrólisis iniciales se usaron para medir la constante de velocidad para la disociación de los profármacos respectivos. Las concentraciones del profármaco y el fármaco se estimaron a partir de sus áreas pico respectivamente. La constante de velocidad de disociación de primer orden de los profármacos se determinaron graficando el logaritmo de la concentración del profármaco a diferentes intervalos de tiempo. La pendiente del gráfico da la constantote de velocidad "k" . Las semividas de la degradación de los diferentes profármacos luego se calcularon usando la fórmula ti2 = 0,693/k.

Purificación preparativa usando HPLC Una vez que se identificó un profármaco que presenta una ti2 apropiada, el profármaco se purificó. La purificación se realizó usando análisis de HPLC sobre una columna Vydac de C18 de 1 x 25 cm basada en sílice (tamaño de las partículas 5 µ, tamaño de los poros 300 A°). Los instrumentos usados fueron: bomba Watera Associates modelo 600, inyector modelo 717 y detector de radiación ultravioleta modelo 486. Se usó una longitud de onda de 214 nm para todas las muestras. El solvente A contenía 10% 10% CH3CN /0,1% TFA en agua destilada y el solvente B contenía 0,1% TFA en CH3CN. Se empleó un gradiente lineal (0 a 100% B'-en 2 horas) . La velocidad de flujo fue 1,2 mL/minuto y el tamaño de la fracción fue de 6 mL. A partir de 350 mg de péptido crudo, generalmente se obtuvieron 80 mg del péptido puro (23% de rendimiento) .

EJEMPLO 5 Diseño Experimental de Bioensayo: Ensayo de Gen Informante (repórter) basado en Luciferasa para detección de cAMP La capacidad de cada análogo de glucagón y GLP-1 o profármaco para inducir cAMP se midió en un ensayo de informante basado en luciferasa de luciérnaga. La producción de cAMP que se induce es directamente proporcional a la unión de glucagón o GLP-1 a su receptor. Células HEK293 co-transíectadas con el receptor de glucagón o GLP-1, respectivamente, y gen de luciferasa unido a un elemento sensible a cAMP se emplearon para el bioensayo.

Se privó de suero a las células cultivando durante 16 horas en Medio Esencial Mínimo de Dulbecco (Invitrogen, Carlsbad, CA) suplementado con 0,25% de Suero de Crecimiento Bovino (HyClone, Logan, UT) y luego se incubaron con diluciones en serie de análogos o profármacos de GLP-1 durante 5 horas a 37 °C, 5% C02en placas "Biocoat" recubiertas con poli-D-Lisina de 96 receptáculos (BD Biosciences, San José, CA) . Al final de la incubación, se agragaron 100 µL de reactivo de sustrato de luminiscencia LucLite (Perkin Elmer, ellesley, MA) a cada receptáculo. La placa se agitó brevemente, se incubó 10 minutos a la sombra y en la luz se midió la salida en un contador de centelleo de líquido MicroBetal450 (Perkin Elmer, Wellesley, MA) . Se calcularon las 5 concentraciones del 50% efectivas (EC50) usando el software Origin (OriginLab, Northampton, MA) .

EJEMPLO 6 Bioactividad de Profármacos basados en Amida de Péptido L0 relacionado con glucagón I) GLP-1 El péptido C24 GLP-1 (7-36) (HAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFICWLVKGR; SEQ ID NO: 717) se montó en un sintetizador de péptidos. Para confirmar que se pudo usar un extremo de N prolongado viable para L5 la modificación del profármaco, un pequeño porcentaje de resina unida al péptido se descompuso con HF para verificar la validez de la síntesis. El péptido sintetizado tiene una masa de 3.329,8 Dalton. La actividad de unión al receptor de GLP-1 se determinó en el ensayo de luciferasa del receptor de GLP-1 descrito en el 20 Ejemplo 5.

II) Agregado de péptldos al extremo de N de GLP Los dipéptidos se unieron en forma covalente al extremo de N de glucagón o GLP-1 para estudiar tendencias diferenciales para ciclación intramolecular y descomposición a través de la formación de dicetopiperazina (DKP) .

Los análogos de GLP-1 y glucagón prolongados de dipéptido biológicamente inactivo se convirtieron en el fármaco de péptido activo al descomponer el enlace de amida junto con la formación de DKP. La misma conversión se puede realizar con sarcosina (Sar) o prolina como aminoácido "B" en el dipéptido A-B de los análogos de GLP-1. Se previeron profármacos con semividas variadas modificando químicamente los sustituyentes en los carbonos alfa del primer (A) aminoácido y segundo (B) aminoácido del dipéptido de la Fórmula I. Por ejemplo, un elemento de profármaco de dipéptido que comprende prolina y ácido amino-isobutírico (Aib) se introdujeron sucesivamente en el C24 GLP (SEQ ID NO: 717) , so the first peptide was named Aib"1-?0, C24GLP (7-36) donde el primer aminoácido (aminoácido "Xaa"1") del péptido es ácido amino-isobutírico y el segundo aminoácido (aminoácido "Xaa0") es prolina. Todos los péptidos mencionados en adelante tienen la misma nomenclatura sistemática. La estereoquímica para cada compuesto sintetizado es el isómero L a menos que se indique de otro modo, cuando los aminoácidos se diseñan con un número en la posición de superíndice después del código de tres letras del aminoácido. El péptido se preparó en forma sintética mediante síntesis de fase sólida como se describió anteriormente. La síntesis se confirmó mediante análisis de ESI-MS (3479,9 Da).

III) Pegilación de profármaco de 6LP La pegilación es un método útil para proteger péptidos y reducir el aclaramiento del péptido por los ríñones. Por consiguiente, para los siguientes experimentos el profármaco P°, C24GLP (7-36) se pegiló con 40k Da de PEG con funcionalidad de maleimido sobre el grupo -SH de la 24-Cys de Aib_1-P°, C24GLP (7-36) a través de una reacción de Michael. El péptido relacionado con glucagón pegilado se denominó 40k PEG- Aib"1-?0, C24GLP (7-36) . Este péptido pegilado se purificó mediante HPLC preparativa y se confirmó mediante ALDI -TOF-MS (44000-46000, pico ancho.

IV) Actividad de GLP-1 en PBS Para explorar la posible formación de DKP y la regeneración simultánea del fármaco parental, 40k PEG-Aib_1-P° , C24GLP (7-36) se incubó en tampón PBS a 37 °C durante aproximadamente 10 días. Se recogieron muestras en diferentes puntos de tiempo (30 h, 54 h, 168 h, 240 h) . Para investigar la actividad restaurada de GLP-1 después de la descomposición del profármaco de dipéptido a través de la formación de DKP, todas las muestras recogidas se analizaron usando un bioensayo. Más específicamente, la actividad de unión al receptor de los profármacos de GLP se determinó en el ensayo de Luciferasa del receptor de GLP descrito en el Ejemplo 5.

Tabla 5. Datos de Bioensayo en diferentes puntos de tiempo de 40k PEG- Aib"1-P°,C2GLP (7-36) en PBS La semivida de la degradación del fármaco paraental 40k PEG-Aib" 1-P°, C24GLP (7-36) en plasma se calculó luego usando la fórmula ti2 = 0,693/k y se determinó que fue 140 horas.

V) Actividad de 6LP-1 en plasma Para explorar la posible formación de DKP y la regeneración simultánea del fármaco parental, dLys^-Sar0, C24GLP (7-36) se incubó en plasma a 37 °C durante aproximadamente 30 h. Se recogieron muestras en diferentes puntos de tiempo (1 h, 12 h, 30 h) . Para investigar la actividad restaurada después de la descomposición del dipéptido desde GLP-1 a través de la formación de DKP, todas las muestras recogidas se analizaron usando un bioensayo. Más específicamente, la actividad de unión al receptor de los profármacos de GLP se determinó en el ensayo de luciferasa de receptor de GLP descrito en el Ejemplo 5.

Tabla 6. Datos de bioensayo en diferentes puntos de tiempo de dLys"1-Sar°,C24GLP(7-36) in plasma La semivida de la degradación del fármaco parental, dLys"1-Sar°, C24GLP (7-36) en plasma se calculó luego usando la fórmula ti/2 = 0,693/k y se determinó que era de 10 horas.

EJEMPLO 7 Efectos in vivo de Profármacos de Péptidos de la Superfamilia de Glucagón en Ratones Se inyecta en forma intraperitoneal a ratones con obesidad inducida por una dieta (DIO) , con una sola dosis semanal de un péptido de la superfamilia de glucagón (SEQ ID NOs : 1-684, 1701-1776, 1801-1921) . Se pesa diariamente a los ratones (N=8) después de la inyección inicial con lo siguiente: vehículo solamente o péptido de la superfamilia de glucagón, a 0,5 nmol/kg, 3 nmol/kg, 10 nmol/kg, 15 nmol/kg, o 70 nmol/kg, o un derivado de profármaco del péptido de la superfamilia de glucagón en donde un dipéptido está unido al extremo de N del péptido de la superfamilia de glucagón a través de un enlace de amida en donde el dipéptido es Aib"1 Pro0, Aib"1 dPro0, Lys"1 Sar°, dAla"1 Pro0, Ac-Aib"1 Pro0, Lys"1 (X) Sar° (X representa una cadena de 1 K PEG unida a la cadena lateral de Lys), Lys"1 (Y) Sar° (Y representa una terc-butil glicina unida a la cadena lateral de Lys) , dLys"1 Sar°, dLys_1Gly (N-Hexyl) °, o dLys"1 F (N-Me) 0 (administrado a 0,5 nmol/kg, 3 nmol/kg, 10 nmol/kg, 15 nmol/kg o 70 nmol/kg) .

Una solución salina que contiene 25% (v/v) de glucosa se inyecta a una dosis de 1,5 g/kg de peso corporal en el punto de tiempo de 0 minuto. Se miden los niveles de glucosa en sangre en los puntos de tiempo de -60, 0, 15, 30, 60, y 120 minutos. El peso corporal, la ingesta de alimentos, la glucosa en sangre y la composición corporal se miden los días 0 y 1.

EJEMPLO 8 Inducción de Perdida de Peso en Ratones con Administración de Análogos de Glucagón Se inyectó en forma intraperitoneal a ratones con obesidad inducida por una dieta (DIO) con una sola dosis semanal de 15 o 70 mmol/kg de análogo de glucagón. Se pesó a los ratones diariamente (N=9) después de la inyección inicial con lo siguiente: solamente vehículo T, Péptido A de la Superfamilia de Glucagón ("Peptide A") a 15 nmol/kg (>) o 70 nmol/kg (?) , o un derivado de profármaco del Péptido A en donde un dipéptido está unido al extremo de N del Péptido A a través de un enlace de amida en donde el dipéptido es Aib"1 Pro0 (administrado a 15 nmol/kg (O) o 70 nmol/kg (·) ) , Aib"1 dPro0 (administrado a 70 nmol/kg (O) ) , Lys"1 Sar° (administrado a 70 nmol/kg (?) ) , dAla"1 Pro0 (administrado a 70 nmol/kg (^) ) o Ac-Aib"1 Pro0 (administrado a 70 nmol/kg (¦) ) . Los resultados del experimento se muestran en la Figura 1. Obsérvese que el compuesto Ac-Aib"1 Pro0 Péptido A es incapaz de descomponerse para formar dicetopiperazina, sin embargo el compuesto presenta algún nivel de actividad más allá de aquella observada para el vehículo. Esto se - debe presumiblemente a la baja actividad residual del profármaco. El péptido A es un análogo pegilado de glucagón que comprende 7 sustituciones en relación con el glucagón antivo (SEQ ID NO: 701) , una amida de extremo de C y pegilacion con un PEG de 40 kDa con funcionalidad de maleimido.

La Figura 2 es un gráfico que muestra el cambio del peso corporal en ratones con obesidad inducida por una dieta (DIO) a los cuales se inyectó con una sola dosis semanal de 0,5, 3, 15 o 70 nmol/kg de vehículo solamente (?) , Péptido A, (a 0,5 A, 3 15 T o 70 4 nmol/kg/día) o Lys"1 Sar° Péptido A, (a 0,5 ?, 3 t>, 15 V o 70 <1 nmol/kg/día) . A todas las dosis los dos fármacos parecen estar produciendo un efecto similar y por lo tanto el beneficio del agregado del elemento de profármaco de dipéptido parece ser mínimo. Esto se debe igualmente a la descomposición enzimática del dipéptido y a la activación rápida del profármaco administrado.

EJEMPLO 9 Ensayo de tolerancia de glucosa usando análogos de profármaco de glucagón Se inyectó en forma intraperitoneal a ratones con obesidad inducida por una dieta (DIO) (N=8) , con una dosis de 15 o 70 mmol/kg de uno de los siguientes: (A) Péptido A, (a 15 <3 o 70 -4 nmol/kg/día) , (B) Lys"1 Sar° Péptido A, (a 15 t> o 70 ? nmol/kg/día) , o (C) dLys"1 Sar° Péptido A, (a 15 ?, o 70 ¦ nmol/kg/día) .

Se inyectó una solución salina que comprende 25% (v/v) de glucosa a una dosis de 1,5 g/kg de peso corporal en el punto de tiempo de 0 minutos . Se midieron los niveles de glucosa en sangre en los puntos de tiempo de -60, 0, 15, 30, 60, y 120 minutos. La Figura 3 presenta los datos de este experimento.

La Figura 4 es un gráfico de los niveles de glucosa en sangre (mg/dL) en ratones con DIO (N=8) a los cuales se inyectó en forma intraperitoneal en el punto de tiempo de -15 minutos con vehículo solamente (T) o una dosis de 2 nmol/kg de uno de los siguientes compuestos : (A) Lys"1 Sar° Péptido A (¦) , (B) Lys^íX), Sar° Péptido A (A), (X representa una cadena de 1 K PEG unida a la cadena lateral de Lys) (C) Lys"1 (Y), Sar° Péptido A (?) , (Y representa una terc-butil glicina unida a la cadena lateral de Lys side chain) (D) dLys"1 Sar° Péptido A, (?) .

Una solución salina que comprende 25% (v/v) de glucosa se inyectó a una dosis de 1,5 g/kg de peso corporal en el punto de tiempo de 0 minuto. Se midieron los niveles de glucosa en sangre en los puntos de tiempo de -15, 0, 15, 30, 60, y 120 minutos.

La Figura 5 es un gráfico de los niveles de glucosa en sangre (mg/dL) en ratones con DIO (N=8) a los cuales se inyectó con un péptido relacionado con glucagón y luego con una solución de glucosa. Se inyectó a los ratones en forma intraperitonéal en el punto de tiempo de -15 minutos con vehículo (T) , una dosis de 20 nmol/kg para dLys'1 Sar° Péptido A (?) , o una dosis de 0,67 nmol/kg de uno de los siguientes compuestos: (A) Lys"1 Sar° Péptido A (¦) , (B) Lys"1 (X) , Sar° Péptido A (A), (X representa una cadena de 1 K PEG unida a la cadena lateral de Lys) (C) Lys"1 (Y), Sar° Péptido A (?) , (Y representa una terc-butil glicina unida a la cadena lateral de Lys) .

Los datos de las Figuras 3-5 indican que el dipéptido de Lys" 1,Sar° no actúa como un elemento de profármaco cuando está unido al extreno de N. Sin embargo la modificación de los aminoácidos del dipéptido, específicamente la sustitución de D-aminoácido (dLys"1) mantiene el compuesto inactivo (presumiblemente impidiendo la descomposición enzimática) . El profármaco entonces se puede activar basado en la estructura y la estereoquímica del elemento de profármaco de dipéptido y la resistencia del nucleófilo. Como se muestra en la Figura 5, aún a una dosis mucho más alta (una dosis de 20 mmol/kg contra una dosis de 0,67 mmol/kg) el dLys"1 Sar° Péptido A proporciona un efecto de profármaco .

EJEMPLO 10 Se inyectó en forma intraperitoneal a ratones con obesidad inducida por una dieta (DIO) con una dosis de 15 o 70 mmol/kg de uno de los siguientes compuestos: (A) Péptido A, (a 15 ? o 70 ? nmol/kg/día) , (B) dLys"1 Sar° Péptido A, (a 15 ?, o 70 ¦ nmol/kg/día) , o (C) Lys"1 Sar° Péptido A, (a 15 D> o 70 ? nmol/kg/día) . en el punto de tiempo de -60 minutos. A 0 minuto y a 24 horas, se inyectó en forma intraperitoneal 25% de glucosa en solución salina a una dosis de 1,5 g por kg de peso corporal. Se midieron los niveles de glucosa en sangre en los puntos de tiempo de -60, 0, 15, 30, 60 y 120. El peso corporal, la ingesta de alimentos, la glucosa en sangre y la composición corporal se midieron los días 0 y 1, con N=8 ratones con DIO por grupo con un peso corporal promedio inicial de 55 g. La Figura 6 es un gráfico de los niveles de glucosa en sangre (mg/dL) en ratones con DIO (N=8) a los cuales se inyectó en forma intraperitoneal en el punto de tiempo de -60 minutos con vehículo solamente (T) o una dosis de 15 o 70 nmol/kg de los compuestos descritos anteriormente.

Se inyectó una solución salina que comprende 25% (v/v) de glucosa a una dosis de 1,5 g/kg de peso corporal en el punto de tiempo de 0 minutos y 24 horas después. Se midieron los niveles de glucosa en sangre en los puntos de tiempo de -60, 0, 15, 30, 60, y 120 minutos en relación con la primera administración de la solución de glucosa (es decir, el punto de tiempo de 0 minuto) .

La Figura 7 es un gráfico de los niveles de glucosa en sangre (mg/dL) en ratones con DIO mice (N=8) a los cuales se inyectó en forma intraperitoneal en el punto de tiempo de -60 minutos con vehículo solamente (Y) o una dosis de 15 o 70 nmol/kg de uno de los siguientes compuestos: (A) Péptido A, (a 15 ? o 70 ? nmol/kg/día) , (B) dLys"1 Sar° Péptido A, (a 15 o 70 V nmol/kg/día) , o (C) Lys"1 Sar° Péptido A, (a 15 ?, o 70 ¦ nmol/kg/día) .

Se inyectó una solución salina que comprende 25% (v/v) de glucosa a una dosis de 1,5 g/kg de peso corporal en el punto de tiempo de 0 minutos y 24 horas después. Los niveles de glucosa en sangre indicados se midieron en los puntos de tiempo de 0, 15, 30, 60, y 120 minutos en relación con la administración a las 24 horas de la segunda solución de glucosa.

La Figura 8 muestra la pérdida de peso en ratones con DIO (N=8) a los cuales se inyectó en forma intraperitoneal con los compuestos indicados a una dosis de 15 o 70 nmol/kg. Los pesos corporales indicados se determinaron 7 días después de las administraciones de los compuestos.

EJEMPLO 11 Se inyectó en forma intraperitoneal a ratones con obesidad inducida por una dieta (DIO) con vehículo solo o una dosis de 15 mmol/kg de péptido de profármaco 24, 8, 4 o 1 hora antes del desafío de glucosa con una inyección de 25% de glucosa en solución salina a 1,5 g/kg de peso corporal. Los niveles de glucosa en sangre indicados se midieron en los puntos de tiempo de 0, 15, 30, 60, y 120 minutos en relación con el desafío con solución de glucosa. Los resultados del estudio se ilustran en la Figura 9 e indican que tanto Lys"1 Sar° Péptido A (Figura 9A) como dLys"1 Sar° Péptido A (Figura 9B) reducen la elevación de la glucosa en sangre en relación con el vehículo control. Una comparación entre los resultados de los dos profármacos, indica la diferencia entre la eficacia de la glucosa en sangre inicial control en relación con el período de tiempo que se ha estado incubando el profármaco. En ratones a los cuales se administró el esteroisómero "d" , el control inicial de glucosa en sangre (es decir, el primer punto de tiempo) fue malo cuando se administró el profármaco una hora antes del desafío y mejor cuando se administró bastante tiempo antes del desafío (es decir el mayor control inicial fue con el profármaco en los puntos de tiempo de 8 y 24 horas) . Este estudio respalda la conclusión de que los profármacos que comprenden el estereoisómero "d" permanecen en uniforma inactiva durante un período de tiempo mayor que los profármacos que comprenden un esteroisómero "1" .

EJEMPLO 12 Tres prof rmacos del Péptido B de la Superfamilia de Glucagón ("Péptido B") y del Péptido C de la Superfamilia de Glucagón "Péptido C") se sintetizaron de acuerdo con el siguiente procedimiento : 1) dK-Sar-Peptide C, en donde dK es la isoforma D de Lys, Sar es sarcosina, y el Péptido C es un análogo de glucagón que comprende 8 sustituciones en relación con el glucagón nativo (SEQ ID NO: 701) , una amida del extremo de, y pegylación con un PEG de 40k Da con funcionalidad de yodoacetilo.

La secuencia de péptido se montó usando la síntesis de péptido de fase sólida. Después del acoplamiento y la desprotección del último residuo His, la resina unida al péptido reaccionó con 5 veces de exceso de Boc-sarcosina, DEPBT y DIEA en DMF, a temperatura ambiente durante 6 horas. La reacción se monitoreó mediante el ensayo de ninhidrina. Después de terminar el acoplamiento, la resina se lavó 3 veces con DMF y DCM, en consecuencia. El protector de Boc se eliminó con TFA. La resina se lavó con DEM, DMF y se hizo neutra con DIEA. El péptido unido a resina reaccionó nuevamente con 5 veces Boc-dLys, DEPBT y DIEA, a temperatura ambiente toda la noche. La resina luego se trató con TFA para eliminar la protección de Boc y se lavó con DCM, DMF. Finalmente, la resina se trató con 20% de piperidina en DMF para eliminar el grupo formilo en 25Trp y se secó bajo vacío. El péptido finalmente se descompuso mediante la reacción con HF a 4°C durante 1 hora y se precipitó con éter etílico anhidro. Después de la filtración, el péptido se recogió con 20% acetonitrilo (MeCN) en agua y se liofilizó en polvo. El péptido se purificó mediante HPLC preparativa (columna de C5 ; velocidad de flujo de 10 ml/minuto; tampón A 10% MeCN y 0,1% TFA en agua; Tampón B: 0,1% TFA en ACN; un gradiente lineal de B% de 0-40% (0-80 minutos)). El compuesto se verificó mediante ESI-MS (3612.8 Dalton) .

El péptido resultante se PEGiló con 40 kDa de PEG con funcionalidad de yodoacetilo sobre el grupo tiol de 24-Cys. El péptido se disolvió en 4M urea / 50 nM tampón Tris (pH 6,6) a 4°C, toda la noche. El péptido PEGilado se purificó mediante HPLC preparativa y la identidad se confirmó mediante MALDI-TOF-MS (44000-46000, pico ancho) . 2) dK-Gly (N-Hexyl) -Péptido B, en donde dK es la isoforma D de Lys, Gly (N-Hexilo) es N-hexil-Glicina, y el Péptido B es un análogo de glucagón que comprende 8 sustituciones en relación con el glucagón nativo (SEQ ID NO: 701), una amida de extremo de C y pegilación con 40k Da de PEG con funcionalidad de maleimida.

La secuencia de péptido se montó usando la síntesis de péptido de fase sólida. La resina unida al péptido reaccionó con 5 veces de exceso de ácido bromoacético, DIC y HOBT en DMF, a temperatura ambiente durante 2 horas. Después de que se mostró un resultado de ensayo de ninhidrina negativo, la resina se lavó 3 veces con DMF y DCM en consecuencia. Luego la resina se trató con 10 veces de exceso de n-hexilamina y DIEA en DMF, a temperatura ambiente toda la noche. El péptido unido a la resina reaccionó nuevamente con 5 veces Boc-dLys, DEPBT y DIEA, a temperatura ambiente toda la noche. La resina luego se lavó 3 veces con DMF y DCM. El péptido unido a la resina reaccionó nuevamente con 5 veces Boc-dLys, DEPBT y DIEA, a temperatura ambiente durante 24 horas. La resina se trató con TFA para eliminar la protección con Boc y se lavó con DCM y DMF. Finalmente, la resina se trató con 20% de piperidina en DMF para eliminar el grupo formilo sobre 25Trp y se secó bajo vacío. El péptido finalmente se descompuso mediante la reacción con HF a 4°C durante 1 hora y se precipitó usando éter etílico anhidro. Después de la filtración el péptido se redisolvió usando 20% MecN en agua y se liofilizó a polvo. El péptido se purificó mediante HPLC preparativa (columna de C5; velocidad de flujo; tampón A 10% MeCN y 0,1% de TFA en agua; tampón B 0,1% TFA en MeCN, gradiente lineal B% desde 0-40% (0-80 minutos) ) . El compuesto se verificó mediante ESI-MS y tañía una masa de 3677,0 Dalton.

El péptido resultante se PEGiló con 40k Da PEG con funcionalidad de maleimido sobre el grupo tiol de 24-Cys. El péptido se disolvió en 4 M urea / 50 nM tampón Tris (pH 6,6) a 4°C, toda la noche. El péptido PEGilado se purificó mediante HPLC preparativa y la identidad se confirmó mediante MALDI -TOF-MS (44000-46000, pico ancho) . 3) dK-F (N-Me) -Péptido C, en donde dK es la isoforma D de Lys, F(N-Me) es N-metil-Phe, y el Péptido C es un análogo de glucagón que comprende 8 sustituciones en relación con el glucagón nativo (SEQ ID NO: 701) , una amida del extremo de C/ y pegilación con 40 kDa de PEG con una funcionalidad de yodoacetilo .

La secuencia del péptido se montó usando la síntesis de péptido de fase sólida. La resina unida al péptido reaccionó con 5 veces de exceso de N-metil fenil alanina, DEPBT y DIEA en DMF, a temperatura ambiente durante 6 horas. Después de que se mostró un resultado de ensayo de ninhidrina negativo la resina se lavó 3 veces con DMF y DCM, en consecuencia. La resina luego se trató con TFA para eliminar la protección de Boc, se lavó con DCM y DMF y se hizo neutra con DIEA. El péptido unido a resina reaccionó nuevamente con 5 veces Boc-dLys, DEPBT y DIEA, a temperatura ambiente toda la noche. La resina luego se trató con TFA para eliminar la protección con Boc y se lavó con DCM y DMF. Finalmente, la resina se trató con 20% de piperidina en DMF para eliminar al grupo formilo sobre 25Trp y se secó bajo vacío. El péptido finalmente se descompuso usando HF a 4°C durante 1 hora y se precipitó con éter etílico anhidro. Después de la filtración el péptido se redisolvió usando 20% MeCN en agua y se liofilizó a polvo. El péptido se purificó mediante HPLC preparativa. Condiciones de HPLC: columna de C5, velocidad de flujo: 10 ml/minuto, tampón A 10% MeCN y 0,1% TFA en agua, tampón B 0,1% TFA en MeCN, gradiente lineal B% de 0-40% (0-80 minutos) , insulina de PEG o análogo se recogió a aproximadamente.33%B. El compuesto deseado se verificó mediante ESI-MS y tenía una masa de 3701,0 Dalton.

El péptido resultante se PEGiló con 40 k Da de PEG con funcionalidad de yodoacetilo sobre el grupo de tiol de 24-Cys. El péptido se disolvió en 4 M urea 50 nM tampón Tris (pH 6,6 a 4°C, toda la noche. El péptido PEGilado se purificó mediante HPLC preparativa y la identidad se confirmó mediante MALDY-TOF-MS (44000-46000, pico ancho) .

Se usaron procedimientos similares para sintetizar profármacos que comprenden dLys-N-Metil-Glicina, dLys-N-Hexil-Glicina, y dLys-N-Metil-Fenilalanina unida a cualquiera de SEQ ID NOs . : 1-684, 701-731, 801-919, 1001-1262, 1301-1371, 1401-1518, 1701-1776, y 1801-1921.

EJEMPLO 13 Los tres profármacos descritos en el Ejemplo 12 se trató por sus efectos in vivo en ratones con obesidad inducida por una dieta (DIO) (cepa C57B16) . Se inyectó a nueve grupos de ocho ratones (con un peso corporal promedio inicial de 44,5 g) con vehículo solamente o 10 mmol/kg de un péptido de profármaco del Ejemplo 12 o el péptido parental (forma que no es profármaco que carece de un grupo profármaco de dipéptido) . Los ratones tenían 5,5 meses y habían estado con una dieta con alto contenido de grasa durante aproximadamente 2 meses . Se tomaron lós niveles de glucosa en sangre 0, 2, 4, 24 y 72 horas después de la inyección (Figura 11) . El peso corporal se moni oreó durante una semana después de la inyección y se midió el Día 0, 1, 3, 5, y 6, en donde el Día 0 fue el día de la inyección (Figura 12) . La ingesta de alimentos y la masa de grasa también se monitoreó durante estudio de una semana de duración) .

El peso corporal de los ratones que recibieron el péptido parental, el profármaco que contiene dK-Sar, el profármaco dK-Gly (N-Hexilo) cayó en forma estacionaria durante el transcurso del estudio, comparados con los ratones que recibieron el vehículo control. Como se esperaba, el péptido parental logró la mayor reducción en el peso corporal, lo cual sugiere que los profármacos administrados a dosis más altas pueden lograr los mismos efectos que el péptido parental.

El cambio en los niveles de glucosa en sangre (niveles de Día 7 -Día 0) fue el máximo para el péptido parental, aunque los profármacos dK-Sar y dK-Gly (N-Hexilo) también produjeron reducciones sustanciales, comparados con el vehículo control.

EJEMPLO 14 La velocidad de formación de DKP se moduló mediante la sustitución de la cadena lateral y/o alfa-amina del aminoácido "B" del profármaco de dipéptido A-B. La Tabla 7 muestra la velocidad de formación de DKP usando los profármacos dK-Sar y dK-Gly (N-Hexilo) , dK-F(N-Me) del Ejemplo 12.

Tabla 7. Modulación de Velocidad de Formación de DKP EJEMPLO 15 La actividad de unión al receptor de los siguientes péptidos y profármacos en 20% plasma humano se determinó en el tiempo usando el ensayo de Luciferasa de receptor de GLP descrito en el Ejemplo 5 : (A) GLP-1 (SEQ ID NO: 703), (B) Péptido C, (C) dLys"1 Sar° Quimera Péptido C, o (D) dLys"1 Gly (N-Hexilo) 0 Péptido B Como se muetra en la Tabla 8, las actividades de los profármacos de dLys"1 Sar° y dLys"1 Gly (N-Hexilo) 0 aumentaron gradualmente en el tiempo e igualaron a GLP-1 nativo dentro de las 48 horas (Figuras 13A y 13B) .

Tabla 8. Efecto de Tiempo y Conversión de Profármaco en Fármaco Activo *ensayo de incubación de 5 horas EJEMPLO 16 Se inyectó en forma subcutánea a ratones con obesidad inducida por una dieta, flacos (N=14, cepa C57B16 WT) ) con una dosis semanal de 3, 10, o 20 mmol/kg de vehículo o uno de los siguientes compuestos : (A) Péptido C, (B) dLys"1 Sar° Péptido C, o (C) dLys"1 Gly (N-Hexilo) 0 Péptido B.

Los ratones tenían un peso corporal promedio inicial de 31,2 g y se los pesó los días 1, 3, 5 y 7. Los niveles de glucosa en sangre se tomaron en forma intraperitoneal los días 1, 3 y 5. Los ratones tenían aproximadamente 5 meses y se los alimentó con una dieta de alimento regular durante aproximadamente 5 meses.

Los resultados del estudio se muestran en las Figuras 14-15. La Figura 14 muestra un gráfico que muestra el cambio en el peso corporal de los ratones con DIO los días 1, 3, 5 y 7. La Figura 15 muestra gráficos que muestran lso niveles de glucosa en sangre el día 1 (Figura 15A) , el día 3 (Figura 15B) y el día 5 (Figura 15C) .

EJEMPLO 17 La actividad de unión al receptor de los siguientes péptidos y profármacos en 20% plasma humano se determinó en el tiempo usando el ensayo de receptor de GLP-1 descrito en el Ejemplo 5: (A) GLP-1 , (B) Péptido C, (C) dLys"1 Gly (N-Hexilo) 0 Péptido C, (D) dLys"1 Sar° Péptido C, o (E) dLys"1 Phe (N-Metilo) 0 Péptido C.

Como se muetra en la Tabla 9, las actividades de los profármacos de dLys"1 Gly (N-Hexilo) 0 , dLys"1 Sar° y dLys"1 Phe (N-Metilo) 0 aumentaron gradualmente en el tiempo (Figuras 16A- 16C) . La semivida de los profármacos puede modificarse mediante la alteración de la estructura química del segundo aminoácido del elemento profármaco del dipéptido, también descripto en la Tabla 9.

Tabla 9. Efecto de Tiempo sobre EC50 del Profármaco y sobre la Conversión de Profármaco en Fármaco Activo EXEMPLO 18 La actividad de unión al receptor de los siguientes péptidos y profármacos en 20% plasma humano se determinó en el tiempo usando el ensayo de receptor de GLP-1 descrito en el Ejemplo 5: (A) GLP-1 , (B) Péptido D, (C) Aib"1 Sar° Péptido D, (D) dLys"1 Sar° Péptido D, (E) dLys"1 Gly (N-Hexilo) 0 Péptido D, (F) dLys"1 Phe (N-Metilo) 0 Péptido D.

Como se muetra en la Tabla 10, las actividades de los profármacos de Aib"1 Sar°, dLys"1 Sar°, dLys"1 Gly (N-Hexilo) 0 y dLys"1 Phe (N-Metilo) 0 aumentaron gradualmente en el tiempo (Figuras 17A- 17C) . El péptido D, un péptido relacionado con glucagón de clase 2, es un análogo del glucagón que comprende 3 sustituciones relativas al glucagón nativo (SEQ ID NO: 701) , una prolongación del extremo C, una amida del extremo C, acilación y peguilación.

Tabla 10. Efecto del Tiempo en la conversión del Profármaco en un Fármaco Activo.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un profármaco que comprende la estructura : A-B-Q en donde Q es un péptido de la superfamilia de glucagón en donde A-B comprende la estructura: O 4 R8 en donde Ri y R2 son independientemente seleccionados del grupo que consiste en H, Ci-Ci8 alquilo, C2-Ci8 alquenilo, (Ci-CiB alquilo) OH, (C1-C18 alquilo) SH, (C2-C3 alquilo) SCH3 , (C1-C4 alquilo) CO H2, (Cx-C4 alquilo) COOH, (C1-C4 alquilo) NH2, (C1-C4 alquilo) NHC (NH2+) NH2 , (C0-C4 alquilo) (C3-C6 cicloalquilo) , (C0-C4 alquilo) (C2-C5 heterocíclico) , (C0-C4 alquilo) (C6-Ci0 arilo)R7, (C1-C4 alquilo) (C3-C9 heteroarilo) y C1-C12 alquilo (Wi) C1-C12 alquilo, en donde Wx es un heteroátomo seleccionado del grupo que consiste en N, S y O, o Ri y R2 junto con los átomos a los cuales están unidos forman un C3-Ci2 cicloalquilo; R3 es C1-C18 alquilo; R4 y R8 son, cada uno, H; R5 es NHR6, o R5 y R2 junto con los átomos a los cuales están unidos forman un anillo heterocíclico de 4, 5 o 6 miembros; R6 es H o Ci - C4 alquilo; y, R7 es seleccionado del grupo que consiste en H , OH , halo, ( C1-C7 alquilo), ( C2 - C7 alquenilo) , OCF3 , N02, CN , NC , 0( Ci - C7 alquilo), C02H , C02{C1-C1 alquilo), NHR6 , arilo y heteroarilo; en donde A-B está unido a Q a través de una unión amida entre A-B y un grupo amono alifático de Q; en donde la semivida de descomposición química (ti/2) de A-B desde Q es al menos, aproximadamente, de 1 hora a, aproximadamente, 1 semana, en PBS bajo condiciones fisiológicas; con la condición de que cuando A-B está unido al grupo amino alfa en el extremo N de Q y (i) tanto Ri como R2 son H , y (ii) R3 es metilo, enotnces Q no es F7GLP-1 (8-37) .

2. El profármaco de acuerdo con la reivindicación 1, en donde B es seleccionado del grupo que consiste en glicina (N-metilo) , glicina (N-etilo) , glicina (N-propilo) , glicina (N-butilo) , glicina (N-pentilo) , glicina (N-hexilo) , glicina (N-heptilo) y glicina (N-octilo) .

3. El profármaco de acuerdo con la reivindicación 2, en donde B es glicina (N-metilo) .

4. El profármaco de acuerdo con la reivindicación 2, en donde B es glicina (N-hexilo) .

5. Un profármaco que comprende la estructura: A-B-Q; en donde Q es un péptido de la superfámilia de glucagón; en donde A-B comprende la estructura: en donde Ri y R2 son independientemente seleccionados del grupo que consiste en H, Ci-Ci8 alquilo, C2-Ci8 alquenilo, (Ci-Ci8 alquilo) OH, (QL-CIS alquilo) SH, (C2-C3 alquilo) SCH3, (C1-C4 alquilo) CONH2, (Q1.-C4 alquilo) COOH, (C1-C4 alquilo)NH2, (C1-C4 alquilo) NHC (NH2+)NH2, (C0-C4 alquilo) (C3-C6 cicloalquilo) , (C0-C4 alquilo) (C2-C5 heterocíclico) , (C0-C4 alquilo) (C6-C10 arilo)R7, (Ci-C4 alquilo) (C3-C9 heteroarilo) y C1-C12 alquilo (Wx) C1-C12 alquilo, en donde Wi es un heteroátomo seleccionado del grupo que consiste en N, S y 0, o Ri y R2 junto con los átomos a los cuales están unidos forman un C3-Ci2 cicloalquilo; R3 es Ci-Cis alquilo; R4 es seleccionado del grupo que consiste en CH3, CH2(Ci-Cio alquilo), CH2(C2-Ci0 alquenilo) , CH2(C0-C10 alquilo) OH, CH2(C0-C10 alquilo) SH, CH2(C0-C3 alquilo) SCH3 , CH2(C0-C3 alquilo) CONH2, CH2(C0-C3 alquilo) COOH, CH2 (C0-C3 alquilo) NH2, CH2(C0-C3 alquilo) NHC (NH2+) NH2, CH2 (C0-C3 alquilo) (C3-C6 cicloalquilo) , CH2 (C0-C3 alquilo) (C2-C5 heterocíclico) , CH2 (C0-C3 alquilo) (C6-C10 arilo)R7, CH2 (C1-C3 alquilo) (C3-C9 heteroarilo) y CH2(C0-Ci2 alquilo) (Wx) C1-C12 alquilo, en donde Wi es un heteroátomo seleccionado del grupo que consiste en N, S y O, o R4 y R3 junto con los átomos a los cuales están unidos forman un anillo heterocíclico de 4, 5 o 6 miembros; R8 es H; R5 es NHR6 o R5 y R2 junto con los átomos a los cuales están unidos forman un anillo heterocíclico de 4 , 5 o 6 miembros; R6 es H or Ci-C4 alquilo y R7 es seleccionado del grupo que consiste en H, OH, halo, (Ci-C7 alquilo), (C2-C7 alquenilo) , OCF3, N02, CN, NC, 0(Ci-C7 alquilo) , C02H, C02 (Cx-C7 alquilo), NHR6, arilo y heteroarilo; en donde A-B está unido a Q a través de una unión amida entre A-B y un grupo amino alifático de Q; en donde la semivida de descomposición química (ti/2) de A-B desde Q es al menos, aproximadamente, de 1 hor a, aproximadamente, 1 semana, en PBS bajo condiciones fisiológicas; opcionalmente , que excluyen Gly-Pro como A-B.

6. El profármaco de acuerdo con la reivindicación 5, en donde R4 es seleccionado del grupo que consiste en CH3, CH2(Ci-C4 alquilo), CH2(Ci-C ) alquenilo, CH2 (C0-C4 alquilo)OH, CH2(C0-C4 alquilo) SH, CH2(C0-C3 alquilo) SCH3 , CH2(C0-C3 alquilo) CONH2 , CH2(C0-C3 alquilo) COOH, CH2 (C0-C4 alquilo) NH2 y CH2 (C0-C3 alquilo) NHC (NH2+) NH2.

7. El profármaco de acuerdo con la reivindicación 6, en donde B es seleccionado del grupo que consiste en alanina (N-Ci-Ci0alquilo) , leucina (N-Ci-Ci0alquilo) , metionina (N-Ci-Ci0alquilo) , asparagina (N-Ci-Ci0alquilo) , ácido glutámico (N-Ci-C10alquilo) , ácido aspártico (N-Ci-Ci0alquilo) , glutamina (N-Ci-Ci0alquilo) , histidina (N-Ci-Ci0alquilo) , lisina (N-Cx-Cioalquilo) , arginina (N-Cx-Ci0alquilo) , serina (N-Ci-Ci0alquilo) y cisteína (N-Ci-C10alquilo) .

8. El profármaco de acuerdo con la reivindicación 7, en donde B es seleccionado del grupo que consiste en alanina (N-Ci-C6alquilo) , leucina (N- Ci-C6alquilo) , metionina (N-Ci-C6alquilo) , asparagina (N-Ci-C6alquilo) , ácido glutámico (N-Ci-C6alquilo) , ácido aspártico (N-Ci-C6alquilo) , glutamina (N-Ci-C3alquilo) , histidina (N-Ci-C6alquilo) , lisina (N-Cx-Cgalquilo) , arginina (N-C!-C6alquilo) , serina (N-Ci-C6alquilo) y and cisteína (N-Cx-Cgalquilo) .

9. El profármaco de acuerdo con la reivindicación 8, en donde B es seleccionado del grupo que consiste en alanina(N-metilo) , leucina (N-metilo) , metionina (N-metilo) , asparagina (N-metilo) , ácido glutámico (N-metilo) , ácido aspártico (N-metilo) , glutamina (N-metilo) , histidina (N-metilo) , lisin (N-metilo) , arginina (N-metilo) , serina (N-metilo) y cisteína (N-metilo) .

10. El profármaco de acuerdo con la reivindicación 5, en donde R4 es seleccionado del grupo que consiste en CH2(C0-C3 alquilo) (C3-C6 cicloalquilo) , CH2 (C0-C3 alquilo) (C2-C5 heterocíclico) , CH2(C0-C3 alquilo) (C6-Ci0 arilo)R7, CH2(Ci-C3 alquilo) (C3-C9 heteroarilo) y CH2(C0-Ci2 alquilo) (Wi) Ci-C12 alquilo, en donde Wi es un heteroatomo seleccionado del grupo que consiste en N, S y O, y en donde R7 es seleccionado del grupo que consiste en H y OH.

11. El profármaco de acuerdo con la reivindicación 10, en donde B es seleccionado del grupo que consiste en fenilalanina (N-Ci-Ci0alquilo) , t irosina (N-Ci-Ci0alquilo) y triptofán (?-0 -Ci0alquilo) .

12. El profármaco de acuerdo con la reivindicación 11, en donde B es seleccionado del grupo que consiste en fenilalanina (N-Ci-C6alquilo) , tirosina (N-Ci-C6alquilo) y triptofán (N-Ci-C6alquilo)

13. El profármaco de acuerdo con la reivindicación 12, en donde B es seleccionado del grupo que consiste en fenilalanina (N-metilo) , tirosina (N-metilo) y triptof n (N-metilo) .

14. El profármaco de acuerdo con la reivindicación 5, en donde B es prolina.

15. Un profármaco que comprende la estructura: A-B-Q; en donde Q es un péptido de la superfamilia de glucagón; en donde A-B comprende la estructura: en donde Ri y R2 son independientemente seleccionados del grupo que consiste en H, Ci-Ci8 alquilo, C2-Ci8 alquenilo, (Ci-Ci8 alquilo) OH, (Ci-Ci8 alquilo) SH, (C2-C3 alquilo) SCH3 , (Cx-C4 alquilo) CONH2, (C1-C4 alquilo) COOH, (C1-C4 alquilo) NH2, (C1-C4 alquilo) NHC (NH2+)NH2, (C0-C4 alquilo) (C3-C6 cicloalquilo) , (C0-C4 alquilo) (C2-C5 heterocíclico) , (C0-C alquilo) (C8-Ci0 arilo)R7, (Ci- C4 alquilo) (C3-C9 heteroarilo) y C1 - C12 alquilo (Wi) C1 - C12 alquilo, en donde Wx es un heteroátomo seleccionado del grupo que consiste en N, S y 0, o Ri y R2 junto con los átomos a los cuales están 5 unidos forman un C3 - C12 cicloalquilo ; o Ri y R2 junto con los átomos a los cuales están unidos forman un C3- C12 cicloalquilo; R3 es Ci-Ci8 alquilo; R es independientemente seleccionado del grupo que consiste en CH(Ci-C8 alquilo) 2, CH (C2-C8 alquenilo)2, CH(d-C8 L0 alquilo) (OH) , CH(C!-C8 alquilo) ( (Ci-C8 alquilo) SH) y CH(C!-C3 alquilo) ( (Ci-C8 alquilo) (NH2>) ; R8 es H; R5 es NHR6 o R5 y R2 junto con los átomos a los cuales están unidos forman un anillo heterocíclico de 4 , 5 o 6 miembros; L5 R6 es H o C1-C4 alquilo y R7 es seleccionado del grupo que consiste en H, OH, halo, (Cx-Cv alquilo), (C2-C7 alquenilo) , 0CF3, N02, CN, NC, 0(Ci-C7 alquilo), C02H, C02 (Ci-C6 alquilo), NHR6, arilo y heteroarilo; en donde A-B está unido a Q a través de una unión amida 20 entre A-B y un grupo amino alifático de Q; en donde la semivida de descomposición química (ti/2) de A-B desde Q es al menos, aproximadamente, de 1 hora a, aproximadamente, 1 semana, en PBS bajo condiciones fisiológicas.

16. El profármaco de acuerdo con la reivindicación 15, en donde R4 es CH(Ci-C8 alquilo) 2 o CH(Ci-C8 alquilo) OH.

17. El profármaco de acuerdo con la reivindicación 16, en donde B es seleccionado del grupo que consiste en isoleucina (N-Ci-Cioalquilo) , valina (N-Ci-Ci0alquilo) y treonina (N-Cx-Cioalquilo) .

18. El profármaco de acuerdo con la reivindicación 17, en donde B es seleccionado del grupo que consiste en isoleucina (N-Ci-C6alquilo) , valina (N-C!-C6alquilo) y treonina (N-Ci-C6alquilo) .

19. El profármaco de acuerdo con la reivindicación 18, en donde B es seleccionado del grupo que consiste en isoleucina (N-metilo) , valina (N-metilo) y treonina (N-metilo) .

20. El profármaco de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el grupo amino alifático es el grupo amino alfa en el aminoácido de extremo N de Q.

21. El profármaco de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el grupo amino alifático es un grupo amino alifático en una cadena lateral de Q.

22. Un profármaco que comprende la estructura: A-B-Q; en donde Q es un péptido de la superfamilia de glucagón; en donde A-B comprende la estructura: O R4 R8 1 en donde Ri y R2 son independientemente seleccionados del grupo que consiste en H, Ci-Ci8 alquilo, C2-Ci8 alquenilo, (Ci-C18 alquilo) OH, (Ci-Ci8 alquilo) SH, (C2-C3 alquilo) SCH3, (C!-C4 alquilo) CONH2, (C1-C4 alquilo) COOH, (C1-C4 alquilo) NH2, (Cx-C4 alquilo) NHC (NH2+)NH2, (C0-C4 alquilo) (C3-C6 cicloalquilo) , (C0-C4 alquilo) (C2-C5 heterocíclico), (C0-C4 alquilo) (C6-Ci0 arilo)R7, (Ci-C4 alquilo) (C3-C9 heteroarilo) y Ci-C12 alquilo (Wi) C1-C12 alquilo, en donde Wx es un heteroátomo seleccionado del grupo que consiste en N, S y 0, o Ri y R2 junto con los átomos a los cuales están unidos forman un C3-Ci2 cicloalquilo; R3 es Ci-Cie alquilo; R4 y R8 son, cada uno, H; R5 es NHR6 o R5 y R2 junto con los átomos a los cuales están unidos forman un anillo heterocíclico de 4 , 5 o 6 miembros; R6 es H or C1-C4 alquilo y R7 es seleccionado del grupo que consiste en H, OH, halo, (C1-C7 alquilo) , (C2-C7 alquenilo) , OCF3, N02, CN, NC, 0(Ci-C7 alquilo), C02H, C02(Ci-C7 alquilo), HR6, arilo y heteroarilo ; en donde A-B está unido a Q a través de una unión amida entre A-B y un grupo amino aromático en una cadena lateral de aminoácido de Q; en donde la semivida de descomposición química (ti/2) de A-B desde Q es al menos, aproximadamente, de 1 hora a, aproximadamente, 1 semana, en PBS bajo condiciones fisiológicas.

23. El profármaco de acuerdo con la reivindicación 22, en donde B es seleccionado del grupo que consiste en glicina (N-metilo) , glicina (N-etilo) , glicina (N-propilo) , glicina (N-butilo) , glicina (N-pentilo) , glicina (N-hexilo) , glicina (N-heptilo) y glicina (N-octilo) .

24. El profármaco de acuerdo con la reivindicación 23, en donde B es glicina (N-metilo) .

25. El profármaco de acuerdo con la reivindicación 23, en donde B es glicina (N-hexilo) .

26. Un profármaco que comprende la estructura: A-B-Q; en donde Q is un péptido de la superfamilia de glucagón; en donde A-B comprende la estructura: en donde Ri y R2 son independientemente seleccionados del grupo que consiste en H, Ci-C18 alquilo, C2-C18 alquenilo, (Ci-Ci8 alquilo) OH, (Ci-Ci8 alquilo) SH, (C2-C3 alquilo) SCH3 , (C1-C4 alquilo) CONH2, (Cx-C4 alquilo) COOH, (Ci-C4 alquilo) H2, (C1-C4 alquilo) NHC (NH2+)NH2, (C0-C4 alquilo) (C3-C6 cicloalquilo) , (C0-C4 alquilo) (C2-C5 heterocíclico) , (C0-C4 alquilo) (C3-Ci0 arilo)R7, (Ci-C4 alquilo) (C3-C9 heteroarilo) y Ci-Ci2 alquilo (Wi) C1-C12 alquilo, en donde Wi es un heteroátomo seleccionado del grupo que consiste en N, S y 0, o Ri y R2 junto con los átomos a los cuales están unidos forman un C3-Ci2 cicloalquilo; R3 es Ci-C18 alquilo; R4 es seleccionado del grupo que consiste en CH3, CT QL-CIO alquilo) , CH2 (C2-C10 alquenilo) , CH2 (C0-Ci0 alquilo) OH, CH2 (C0-C10 alquilo) SH, CH2 (C0-C3 alquilo) SCH3 , CH2 (C0-C3 alquilo) CONH2, CH2(C0-C3 alquilo) COOH, CH2(C0-C3 alquilo) NH2, CH2(C0-C3 alquilo) NHC ( H2+)NH2/ CH2 (C0-C3 alquilo) (C3-C6 cicloalquilo) , CH2(C0-C3 alquilo) (C2-C5 heterocíclico) , CH2(C0-C3 alquilo) (Cg-Cio arilo)R7, CH2 (Ci-C3 alquilo) (C3-C9 heteroarilo) y CH2(C0-C12 alquilo) (Vl ) C-¡_-C12 alquilo, en donde Wi es un heteroátomo seleccionado del grupo que consiste en N, S y O, o R4 y R3 junto con los átomos a los cuales están unidos forman un anillo heterocíclico de 4 , 5 o 6 miembros; R8 es H; R5 es NHR6 o R5 y R2 junto con los átomos a los cuales están unidos forman un anillo heterocíclico de 4 , 5 o 6 miembros; R6 es H or Ci-C4 alquilo y R7 es seleccionado del grupo que consiste en H, OH, halo, (C!-C7 alquilo), (C2-C7 alquenilo) , OCF3, N02, CN, NC, 0(d-C7 alquilo), C02H, C02(Ci-C7 alquilo), HR6, arilo y heteroarilo; en donde A-B está unido a Q a través de una unión amida entre A-B y un grupo amino aromático en una cadena lateral de aminoácido de Q; en donde la semivida de descomposición química (ti/2) de A-B desde Q es al menos, aproximadamente, de 1 hora a, aproximadamente, 1 semana, en PBS bajo condiciones fisiológicas.

27. El profármaco de acuerdo con la reivindicación 26, en donde R4 es seleccionado del grupo que consiste en CH3, CH2(Ci-C4 alquilo), CH2(Ci-C4) alquenilo, CH2(C0-C4 alquilo) OH, CH2(C0-C4 alquilo) SH, CH2(C0-C3 alquilo) SCH3 , CH2 (C0-C3 alquilo) CONH2 , CH2 (C0-C3 alquilo) COOH, CH2(C0-C4 alquilo) NH2 y CH2(C0-C3 alquilo) NHC (NH2+) NH2.

28. El profármaco de acuerdo con la reivindicación 27, en donde B es seleccionado del grupo que consiste en alanina (N-Ci-C10alquilo) , leucina (N-Ci-Ci0alquilo) , metionina (N-Ci-C10alquilo) , asparagina (N-Ci-C10alquilo) , ácido glutámico (N-Ci-Ci0alquilo) , ácido aspártico (N-Ci-Cioalquilo) , glutamina (N-Ci-Ci0alquilo) , histidina (N-Ci-Ci0alquilo) , lisina (N-Ci-C10alquilo) , arginina (N-Ci-C10alquilo) , serina (N-Cx-Cioalquilo) y cisteína (N-Ci-Ci0alquilo) .

29. El profármaco de acuerdo con la reivindicación 28, en donde B es seleccionado del grupo que consiste en alanina (N-Ci-C6alquilo) , leucina (N- Ci-C6alquilo) , metionina (N-Ci-C6alquilo) , asparagina (N-Ci-C6alquilo) , ácido glutámico (N-Ci-C6alquilo) , ácido aspártico (N-Ci-C6alquilo) , glutamina (N-Ci-C6alquilo) , histidina (N-Ci-C6alquilo) , lisina (N-Ci-Cgalquilo) , arginina (N-Ci-C6alquilo) , serina (N-Ci-C3alquilo) y cisteína (N-Ci-C6alquilo) .

30 . El profármaco de acuerdo con la reivindicación 29, en donde B es seleccionado del grupo que consiste en alanina (N-metilo) , leucina (N-metilo) , metionina (N-metilo) , asparagina (N-metilo) , ácido glutámico (N-metilo) , ácido aspártico (N-metilo) , glutamina (N-metilo) , histidina (N-metilo) , lisina (N-metilo) , arginina (N-metilo) , serina (N-metilo) y cisteína (N-metilo) .

31 . El profármaco de acuerdo con la reivindicación 26, en donde R4 es seleccionado del grupo que consiste en CH2(C0-C3 alquilo) (C3-C6 cicloalquilo) , CH2(C0-C3 alquilo) (C2-C5 heterocíclico) , CH2 ( C0 - C3 alquilo) ( C6 - Ci0 arilo)R7, CH2 ( Ci - C3 alquilo) (C3-C9 heteroarilo) y CH2(C0-C12 alquilo) (Wj C1-C12 alquilo, en donde Wi es un heteroátomo seleccionado del grupo que consiste en N, S y O, y en donde R7 es seleccionado del grupo que consiste en H y OH.

32 . El profármaco de acuerdo con la reivindicación 31, en donde B es seleccionado del grupo que consiste en fenilalanina (N-Ci -Ci0alquilo) , tirosina (N-Ci - Ci0alquilo) y triptofán (N- Ci -C10alquilo) .

33 . El profármaco de acuerdo con la reivindicación 32, en donde B es seleccionado del grupo que consiste en fenilalanina (N-Ci - C6alquilo) , tirosina (N- Ci - C6alquilo) y triptofán (N-Ci - C6alquilo) .

34. El profármaco de acuerdo con la reivindicación 33, en donde B es seleccionado del grupo que consiste en fenilalanina (N-metilo) , tirosina (N-metilo) y triptofán (N-metilo) .

35. El profármaco de acuerdo con la reivindicación 26, en donde B es prolina.

36. Un profármaco que comprende la estructura: A-B-Q; en donde Q es un péptido de la superfamilia de glucagón; en donde A-B comprende la estructura: O R4 R8 t en donde Ri y R2 son independientemente seleccionados del grupo que consiste en H, Ci-Ci8 alquilo, C2-C18 alquenilo, (Ci-C18 alquilo) OH, (Ci-Ci8 alquilo) SH, (C2-C3 alquilo) SCH3 , (Ci-C4 alquilo) CONH2/ (C1-C4 alquilo) COOH, (C1-C4 alquilo) NH2, (C1-C4 alquilo) NHC (NH2+) H2, (C0-C4 alquilo) (C3-C6 cicloalquilo) , (C0-C4 alquilo) (C2-C5 heterocíclico) , (C0-C4 alquilo) (C6-Ci0 arilo) R7, (Ci-C4 alquilo) (C3-C9 heteroarilo) y C1-C12 alquilo (Wi) Ci-C12 alquilo, en donde Wi es un heteroátomo seleccionado del grupo que consiste en N, S y 0, o Ri y R2 junto con los átomos a los cuales están unidos forman un C3-C12 cicloalquilo o RX y R2 junto con los átomos a los cuales están unidos forman un C3-C12 cicloalquilo; R3 es Cx-Cis alquilo; R4 es independientemente seleccionado del grupo que consiste en CH(Ci-C8 alquilo) 2, CH (C2-C8 alquenilo)2, CH CQL-CS alquilo) (OH) , OKCi-Ce alquilo) ( (Ci-C8 alquilo) SH) y CH(d-C3 alquilo) ( (Ci-C8 alquilo) (NH2) ) ; R8 es H; R5 es NHR6 o R5 y R2 junto con los átomos a los cuales están unidos forman un anillo heterocíclico de 4 , 5 o 6 miembros; R6 es H or C1-C4 alquilo y R7 es seleccionado del grupo que consiste en H, OH, halo, (Ci-C7 alquilo), (C2-C7 alquenilo) , 0CF3, N02, CN, NC, 0(Ci-C7 alquilo), C02H, C02 (Ci-C7 alquilo), NHR6, arilo y heteroarilo; en donde A-B está unido a Q a través de una unión amida entre A-B y un grupo amino aromático en una cadena lateral de aminoácido de Q; en donde la semivida de descomposición química (ti/2) de A-B desde Q es al menos, aproximadamente, de 1 hora a, aproximadamente, 1 semana, en PBS bajo condiciones fisiológicas.

37. El profármaco de acuerdo con la reivindicación 36, en donde R4 es CH(Ci-C8 alquilo) 2 o CH(Ci-C8 alquilo) OH.

38. El profármaco de acuerdo con la reivindicación 37, en donde B es seleccionado del grupo que consiste en isoleucina (N-Ci-Ci0alquilo) , valina (N-Cx-Cioalquilo) y treonina (N-Ci-Ci0alquilo) .

39. El profármaco de acuerdo con la reivindicación 38, en donde B es seleccionado del grupo que consiste en isoleucina (N-Ci-C6alquilo) , valina (N-Ci-C6alquilo) y treonina (N-Ci-C6alquilo) .

40. El profármaco de acuerdo con la reivindicación 39, en donde B es seleccionado del grupo que consiste en isoleucina (N-metilo) , valina (N-metilo) y treonina (N-metilo) .

41. El profármaco de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde Rx y R2 son independientemente seleccionados del grupo que consiste en Ci-Ci0 alquilo, C2-Ci0 alquenilo, (Ci-Ci0 alquilo) OH, (Ci-Cio alquilo) SH, (C2-C3 alquilo) SCH3, (Ci-C4 alquilo) CONH2 , (d-Oj alquilo) COOH, (Ci-C4 alquilo) NH2, (Ci-C4 alquilo) NHC (NH2+) NH2 , (C0-C4 alquilo) (C3-C6 cicloalquilo) , (C0-C4 alquilo) (C2-C5 heterocíclico) , (C0-C4 alquilo) (C6-Cio arilo)R7, (Ci-C4 alquilo) (C3-C9 heteroarilo) y Cx-Ci2 alquilo (Wi) C1-C12 alquilo, en donde i es un heteroátomo seleccionado del grupo que consiste en N, S y 0, o Ri y R2 junto con los átomos a los cuales están unidos forman un C3-Ci2 cicloalquilo, y en donde R7 es seleccionado del grupo que consiste en H y OH.

42. El profármaco de acuerdo con la reivindicación 41, en donde A es ácido aminoisobutírico .

43. El profármaco de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde Rx es H y R2 es seleccionado del grupo que consiste en H, Ci-Ci0 alquilo, C2-Ci0 alquenilo, (Ci-Cio alquilo) OH, (C1.-C10 alquilo) SH, (C2-C3 alquilo) SCH3, ( L-C alquilo) C0NH2 , (Q1-C4 alquilo) COOH, (CX-C alquilo) NH2, (C1-C4 alquilo) NHC (NH2+) NH2 , (C0-C4 alquilo) (C3-C6 cicloalquilo) , (C0-C4 alquilo) (C2-C5 heterocíclico) , (C0-C4 alquilo) (C6-Ci0 arilo)R7, (Ci-C4 alquilo) (C3-C9 heteroarilo) y Cx-C12 alquilo ( ].) Ci-Ci2 alquilo, en donde R7 es seleccionado del grupo que consiste en H y OH , en donde Wi es un heteroátomo seleccionado del grupo que consiste en N, S y 0, o Ri y R2 junto con los átomos a los cuales están unidos forman un C3-Ci2 cicloalquilo, o R2 y R5 junto con los átomos a los cuales están unidos forman un anillo heterocíclico de 4 , 5 o 6 miembros.

44. El profármaco de acuerdo con la reivindicación 43, en donde A es seleccionado del grupo que consiste en lisina, cisteína y alanina.

45. El profármaco de acuerdo con la reivindicación 43 o 44, en donde A tiene d-estereoquímica .

46. El profármaco de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde A-B es seleccionado del grupo que consiste en Aib-Gly (N-Hexilo) , dLys-Gly (N-Hexilo) , dCys-Gly (N-Hexilo) , dAla-Gl (N-Hexilo) , Aib-Gly (N-Metilo) , dLys-Gly (N-Metilo) , dCys-Gl (N-Metilo) , dAla-Gly (N-Hexilo) , Aib-Phe(N-Metilo) , dLys-Phe (N-Metilo) , dCys-Phe (N-Metilo) o dAla-Phe(N-Metilo) .

47. El profármaco de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes en donde Q es seleccionado del grupo que consiste en SEQ ID NOs : 1-564, 566-570, 573-575, 577, 579-580, 585-612, 616, 618-632, 634-642, 647, 657-684, 701-732, 742-768, 801-878, 883-919, 1001-1262, 1301-1371, 1401-1518, 1701-1708, 1710, 1711, 1731-1734, 1738, 1740, 1741, 1745 y 1747-1776.

48. El profármaco de acuerdo con la reivindicación 47, en donde Q es seleccionado del grupo que consiste en SEQ ID NOs : 742-768.

49. El profármaco de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, que además comprende un grupo hidrofílico unido de forma covalente al profármaco.

50. El profármaco de acuerdo con la reivindicación 49, en donde el grupo hidrofílico es un glicol de polietileno.

51. El profármaco de acuerdo con la reivindicación 50, en donde el glicol de polietileno está unido de forma covalente con A-B.

52. El profármaco de acuerdo con la reivindicación 51, en donde el glicol de polietileno está unido de forma covalente con A-B a través de un espaciador.

53. El profármaco de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, que además comprende un grupo acilo o grupo alquilo unido de forma covalente al profármaco.

54. El profármaco de acuerdo con la reivindicación 52 en donde dicho grupo acilo o grupo alquilo está unido de forma covalente con A-B.

55. El profármaco de acuerdo con la reivindicación 54, en donde dicho grupo acilo o grupo alquilo está unido de forma covalente con A-B a través de un espaciador.

56. El profármaco de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes en donde la semivida de descomposición química (t1/2) de A-B desde Q es de, aproximadamente, 6horas a, aproximadamente, 72 horas en PBS bajo condiciones fisiológicas.