ES2774160T3 - Receptores de antígenos quiméricos biespecíficos y usos terapéuticos de los mismos - Google Patents

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Abstract

Célula T genéticamente modificada que expresa un receptor de antígenos quimérico (CAR) biespecífico enlazado al receptor de factor de crecimiento epidérmico truncado (EGFRt), donde el producto de expresión tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID N.o: 3 o 12

Description

ES 2 774 160 T3
DESCRIPCIÓN
Receptores de antígenos quiméricos biespecíficos y usos terapéuticos de los mismos
CAMPO DE INVENCIÓN
[0001] La invención se refiere a receptores de antígenos quiméricos y a células genéticamente modificadas usando los mismos.
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN
[0002] Las inmunoterapias actuales están diseñadas para reconocer antígenos únicos en células cancerosas. Sin embargo, por ejemplo, las células cancerosas son inestables y algunas células pueden dejar de poseer el antígeno diana. Estas células, denominadas variantes de escape por pérdida de antígeno, escapan a la destrucción por la terapia y pueden continuar creciendo y extendiéndose. Casucci y Bondanza 2011, Journal of Cancer 2: 378-382 revelan la combinación de un control terapéutico con un CAR, donde la región de reconocimiento de antígeno es un scFv. Patel et al., 2000, Cancer Gene Therapy, 7: 1127-1134, revelan CARs biespecíficos (también llamados CIRs por respuesta inmunitaria quimérica en inglés) que llevan el scFv de, por ejemplo, TAG-72, CEA, HlVenv gp120, HlVenv gp41, con el objetivo de tratar variantes de escape. Los autores usan el gen suicida HSV-1 TK como "control terapéutico". La US20050113564 divulga CARs que comprenden un scFv anti-CD19. Por lo tanto, hay una necesidad en la técnica de terapias que eviten o minimicen fracasos terapéuticos en cáncer y otras enfermedades.
RESUMEN DE LA INVENCIÓN
[0003] La invención es como se describe en las reivindicaciones.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS
[0004] Se ilustran formas de realización ejemplares en las figuras referenciadas. Se pretende que las formas de realización y las figuras descritas aquí se consideren ilustrativas más que restrictivas.
La figura 1 representa una representación esquemática de un receptor de antígenos quimérico. ASTR es una región de reconocimiento específico de antígeno, L es un conector, ESD es un dominio separador extracelular, TM es un dominio transmembrana, CSD es un dominio coestimulador e ISD es un dominio de señalización intracelular.
La figura 2 representa (a) los componentes de un CAR anti-CD19xCD20 y (b) un ADNc completo empaquetado en un plásmido de transferencia del vector de lentivirus epHIV-7.
La figura 3 representa, conforme a una forma de realización de la presente invención, la secuencia de ácido nucleico de una GMCSFRss de CAR biespecífico CD19scFv-Gly4Serlconector-CD20scFv-IgG4Bisagra-CD28tm-41BB-CD3zeta-T2A-EGFRt_epHIV7 (SEQ ID 1).
La figura 4 representa, conforme a una forma de realización de la presente invención, las secuencias de ácido nucleico y aminoácidos de una GMCSFRss de CAR biespecífico CD19scFv-Gly4Serlconector-CD20scFv-IgG4Bisagra-CD28tm-41 BB-CD3zeta-T2A-EGFRt_epHIV7 (SEQ ID 3).
La figura 5 representa una construcción transgénica CD19scFv-Gly4Serlconector-CD20scFv-IgG4bisagra-CD28tm-CD28gg-CD3Zeta.
La figura 6 representa el desarrollo de una plataforma CyCR para sostener el crecimiento independiente de yc exógena, (a) diagramas esquemáticos de receptores de citocina de tipo salvaje frente a quiméricos. El receptor de citocina constitutivo IL-7Ra (CyCR7) consiste en la citocina IL-7 humana ligada a la cadena de longitud total de IL-7Ra humano mediante un conector (G4S)2. El receptor de citocina constitutivo IL-2RP (CyCR2) es idéntico a CyCR7 excepto en que el dominio de señalización intracelular IL-7Ra está sustituido con el dominio citoplásmico IL-2/IL-15RP humano, (b) diagrama de la construcción de expresión CyCR-T2A-CD19t.
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La figura 7 representa las secuencias de ácido nucleico y aminoácidos de un CAR de esqueleto que comprende la región bisagra de la lgG4, el dominio transmembrana de CD28, el dominio coestimulador de 4-1BB y el dominio citoplásmico de CD3zeta.
La figura 8 representa la secuencia de ácido nucleico de GMCSFRss-CD19scFv-Gly4Serconector-CD20scFvhulgGBisagra/CH2/CH3-CD28tm/CD28cito-41BB-CD3zeta. GMCSFRss es la secuencia señal de GMCSFR.
La figura 9 representa las secuencias de ácido nucleico y aminoácidos de GMCSFRss-CD19scFv-Gly4Serconector-CD20scFv-hulgGBisagra/CH2/CH3-CD28tm/CD28cito-41BB-CD3zeta. GMCSFRss es la secuencia señal de GMCSFR.
La figura 10 representa, conforme a una forma de realización de la presente invención, la secuencia de ácido nucleico de una forma de realización de la invención, específicamente el GMCSFRss-CD19scFv-Gly4Serconector-CD20scFv-CD8aBisagra-CD8atm-41BB-CD3zeta-T2A-EGFRt. GMCSFRss es la secuencia señal de GMCSFR (SEQ ID 10).
La figura 11 representa, conforme a una forma de realización de la presente invención, las secuencias de ácido nucleico y aminoácidos de una forma de realización de la invención, específicamente GMCSFRss-CD19scFv-Gly4Serconector-CD20scFv-CD8aBisagra-CD8atm-41BB-CD3zeta-T2A-EGFRt. GMCSFRss es la secuencia señal de GMCSFR (SEQ ID 12).
La figura 12 representa la secuencia de ácido nucleico de T2A-EGFRt.
La figura 13 representa las secuencias de ácido nucleico y aminoácidos de T2A-EGFRt.
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN
[0005] A menos que se defina de otro modo, los términos técnicos y científicos usados aquí tienen el mismo significado que entiende comúnmente una persona experta en la materia a la que esta invención pertenece. Singleton et al., Dictionary of Microbiology and Molecular Biology, 3a ed., J. Wiley & Sons (Nueva York, NY 2001); March, Advanced Organic Chemistry Reactions, Mechanisms and Structure, 5a ed., J. Wiley & Sons (Nueva York, NY 2001); y Sambrook y Russel, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3a ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press (Cold Spring Harbor, NY 2001) proporcionan a una persona experta en la materia una guía general para muchos de los términos usados en la presente solicitud.
[0006] Una persona experta en la materia reconocerá muchos métodos y materiales similares o equivalentes a aquellos descritos aquí, que podrían usarse en la práctica de la presente invención. De hecho, la presente invención no se limita de ninguna manera a los métodos y materiales descritos. Para fines de la presente invención, los términos siguientes se definen a continuación.
[0007] La invención descrita aquí proporciona receptores de antígenos quiméricos. Los receptores de antígenos quiméricos son receptores diseñados que injertan una especificidad inmunitaria sobre una célula genéticamente modificada. Mediante el alojamiento de especificidades para múltiples antígenos en un único receptor de antígenos quimérico (CAR), pueden conseguirse varios beneficios, incluidos, entre otros, una reducción significativa en el esfuerzo en comparación con producir múltiples productos de células T por paciente.
[0008] La invención se define en las reivindicaciones.
Definiciones
Componentes de los receptores de antígenos quiméricos
[0009] "Región de reconocimiento específico de antígeno" (ASTR) como se utiliza en este caso se refiere a la región del CAR que reconoce antígenos específicos. Los CARs de la divulgación comprenden al menos dos regiones de reconocimiento que reconocen al menos dos antígenos diferentes. En una forma de realización de la divulgación, los CARs comprenden tres o más regiones de reconocimiento que reconocen al menos tres o más antígenos diferentes.
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Las regiones de reconocimiento en el CAR son extracelulares. En algunas formas de realización de la divulgación, las regiones de reconocimiento específico de antígeno comprenden un anticuerpo o un equivalente funcional del mismo o un fragmento del mismo o un derivado del mismo y cada una de las regiones de reconocimiento reconocen un antígeno diferente. Las regiones de reconocimiento pueden comprender una cadena pesada de longitud total, fragmentos Fab, fragmentos Fv monocatenarios (scFv), anticuerpos monocatenarios bivalentes o diacuerpos, cada uno de los cuales es específico para el antígeno diana. Hay, sin embargo, numerosas alternativas, tales como citocinas enlazadas (que conduce al reconocimiento de células que llevan el receptor de citocina), aficuerpos, dominios de unión a ligandos de receptores de origen natural, un ligando proteico/peptídico soluble para un receptor (por ejemplo, en una célula tumoral), péptidos y vacunas para provocar una respuesta inmunitaria, que pueden usarse cada uno en varias formas de realización de la invención. De hecho, casi cualquier molécula que se una a un antígeno dado con una alta afinidad se puede usar como una región de reconocimiento específico de antígeno, como será apreciado por las personas expertas en la materia.
[0010] "Receptor de antígenos quimérico" o "CAR" o "CARs" como se utiliza en este caso se refiere a receptores diseñados, que injertan una especificidad de antígeno sobre las células (por ejemplo, células T tales como células T vírgenes, células T de memoria central, células T de memoria efectora o combinaciones de las mismas). Los CARs se conocen también como receptores de células T artificiales, receptores de células T quiméricos o inmunorreceptores quiméricos. Los CARs de la divulgación comprenden al menos dos regiones de reconocimiento específico de antígeno, un dominio extracelular, un dominio transmembrana, uno o más dominios coestimuladores y un dominio de señalización intracelular. Las dos o más regiones de reconocimiento específico de antígeno reconocen al menos dos antígenos diferentes y pueden estar dispuestas en tándem y separadas por secuencias conectoras. El dominio separador extracelular es opcional. Los CARs de la invención son biespecíficos. Un CAR biespecífico es específico para dos antígenos diferentes.
[0011] "Dominio coestimulador" (CSD) como se utiliza en este caso se refiere a la porción del CAR que mejora la proliferación, la supervivencia y/o el desarrollo de las células de memoria. Los CARs de la divulgación pueden comprender uno o más dominios coestimuladores. Cada dominio coestimulador comprende el dominio coestimulador de cualquiera de uno o más de entre, por ejemplo, miembros de la superfamilia TNFR, CD28, CD137 (4-1BB), CD134 (0X40), Dap10, CD27, CD2, CD5, ICAM-1, LFA-1 (CD11a/CD18), Lck, TNFR-I, TNFR-II, Fas, CD30, CD40 o combinaciones de los mismos. Otros dominios coestimuladores (por ejemplo, de otras proteínas) serán evidentes para las personas expertas en la materia.
[0012] "Dominio separador extracelular" (ESD) como se utiliza en este caso se refiere a la región hidrófila que está entre la región de reconocimiento específico de antígeno y el dominio transmembrana. Los CARs de la divulgación pueden o pueden no comprender un dominio separador extracelular. Los dominios separadores extracelulares incluyen, pero de forma no limitativa, fragmentos Fc de anticuerpos o fragmentos o derivados de los mismos, regiones bisagra de anticuerpos o fragmentos o derivados de los mismos, regiones CH2 de anticuerpos, regiones CH3 de anticuerpos, secuencias separadoras artificiales o combinaciones de los mismos. Los ejemplos de dominios separadores extracelulares incluyen, pero de forma no limitativa, la bisagra de CD8a y espaciadores artificiales constituidos por polipéptidos que pueden ser tan pequeños como, por ejemplo, la Gly3 o los dominios CH1 y CH3 de las IgGs (tal como la IgG4 humana). En algunos CARs, el dominio separador extracelular es cualquiera de uno o más de entre (i) una bisagra, regiones CH2 y CH3 de la IgG4, (ii) una región bisagra de la IgG4, (iii) una bisagra y una CH2 de la IgG4, (iv) una región bisagra de CD8a, (v) una bisagra, regiones CH2 y CH3 de la IgG1, (vi) una región bisagra de la IgG 1 o (vi) una bisagra y una región CH2 de la IgG1. Otros dominios separadores extracelulares serán evidentes para las personas expertas en la materia.
[0013] "Dominio de señalización intracelular" (ISD) o "dominio citoplásmico" como se utiliza en este caso se refieren a la porción del CAR que transduce la señal de función efectora y dirige la célula a ejecutar su función especializada. Los ejemplos de dominios que transducen la señal de función efectora incluyen, pero de forma no limitativa, la cadena U del complejo receptor de células T o cualquiera de sus homólogos (por ejemplo, la cadena v, las cadenas Fc£R1y y k, la cadena MB1 (Iga), la cadena B29 (Igk), etc.), la cadena zeta de la CD3 humana, polipéptidos de CD3 (A, 5 y w), tirosina quinasas de la familia syk (Syk, ZAP 70, etc.), tirosina quinasas de la familia src (Lck, Fyn, Lyn, etc.) y otras moléculas implicadas en la transducción de células T, tales como CD2, CD5 y CD28. Otros dominios de señalización intracelulares serán evidentes para las personas expertas en la materia.
[0014] "Conector" (L) o "dominio conector" o "región conectora" como se utiliza en este caso se refieren a una región oligo- o polipeptídica de aproximadamente 1 a 100 aminoácidos de longitud, que enlaza cualquiera de los dominios/las regiones de un CAR de la divulgación. Los conectores pueden estar compuestos de residuos flexibles como la glicina y la serina de modo que los dominios proteicos adyacentes son libres de moverse el uno con respecto al otro. Se pueden
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usar conectares más largos cuando es deseable asegurar que dos dominios adyacentes no interfieren estéricamente entre sí. Los conectores pueden ser escindibles o no escindibles. Los ejemplos de conectores escindibles incluyen conectores 2A (por ejemplo, T2A), conectores de tipo 2A o equivalentes funcionales de los mismos y combinaciones de los mismos. En algunos CARs, los conectores incluyen el conector de tipo 2A picornaviral, secuencias CHYSEL de teschovirus porcino (P2A), virus de Thosea asigna (T2A) o combinaciones, variantes y equivalentes funcionales de los mismos. En otros CARs, las secuencias conectoras pueden comprender el motivo Asp-Val/Ile-Glu-X-Asn-Pro-Gly(2A)-Pro(2B), que resulta en la escisión entre la glicina 2A y la prolina 2B. Otros conectores serán evidentes para las personas expertas en la materia.
[0015] "Dominio transmembrana" (TMD) como se utiliza en este caso se refiere a la región del CAR que cruza la membrana plasmática. El dominio transmembrana es la región transmembrana de una proteína transmembrana (por ejemplo, proteínas transmembrana de tipo l), una secuencia hidrofóbica artificial o una combinación de las mismas. Otros dominios transmembrana serán evidentes para las personas expertas en la materia.
Otros
[0016] "Variantes de escape por pérdida de antígeno" como se utiliza en este caso se refiere a células que muestran una expresión reducida o una pérdida de expresión del antígeno diana, cuyos antígenos son reconocidos por los CARs de la invención.
[0017] "Enfermedades asociadas a células B" como se utiliza en este caso incluyen inmunodeficiencias de células B, enfermedades autoinmunes y/o proliferación celular excesiva/descontrolada asociada a células B (incluidos linfomas y/o leucemias). Los ejemplos de tales enfermedades, donde los CARs biespecíficos de la divulgación se pueden usar para métodos terapéuticos incluyen, pero de forma no limitativa, lupus eritematoso sistémico (LES), diabetes, artritis reumatoide (AR), artritis reactiva, esclerosis múltiple (EM), pénfigo vulgar, enfermedad celíaca, enfermedad de Crohn, enfermedad inflamatoria intestinal, colitis ulcerosa, enfermedad tiroidea autoinmune, agammaglobulinemia ligada al cromosoma X, leucemia linfoblástica aguda pre-B, lupus eritematoso sistémico, inmunodeficiencia variable común, leucemia linfocítica crónica, enfermedades asociadas a una deficiencia de IgA selectiva y/o deficiencia de subclases de IgG, linfomas de linaje B (linfoma de Hodgkin y/o linfoma no Hodgkin), inmunodeficiencia con timoma, hipogammaglobulinemia transitoria y/o síndrome de hiper IgM, al igual que enfermedades de células B mediadas por virus tales como la enfermedad linfoproliferativa mediada por EBV, e infecciones crónicas donde las células B participan en la patofisiología.
[0018] "Resultados beneficiosos" pueden incluir, pero no están limitados de ninguna manera a, reducir o aliviar la gravedad de la condición de enfermedad, prevenir que la condición de enfermedad empeore, curar la condición de enfermedad, prevenir el desarrollo de la condición de enfermedad, reducir las probabilidades de que un paciente desarrolle la condición de enfermedad y prolongar la vida o la esperanza de vida de un paciente.
[0019] "Cáncer" y "canceroso" describen o se refieren a la condición fisiológica en mamíferos que se caracteriza típicamente por un crecimiento celular no regulado. Los ejemplos de cáncer incluyen, pero de forma no limitativa, linfomas de células B (linfomas de Hodgkin y/o linfomas no Hodgkin), tumor cerebral, cáncer de mama, cáncer de colon, cáncer pulmonar, cáncer hepatocelular, cáncer gástrico, cáncer pancreático, cáncer cervical, cáncer ovárico, cáncer de hígado, cáncer de vejiga, cáncer de las vías urinarias, cáncer de tiroides, cáncer renal, carcinoma, melanoma, cáncer del cuello y de la cabeza, cáncer cerebral y cáncer de próstata, incluidos, pero de forma no limitativa, cáncer de próstata dependiente de andrógenos y cáncer de próstata independiente de andrógenos.
[0020] "Coexpresar" como se utiliza en este caso se refiere a la expresión simultánea de dos o más genes. Los genes pueden ser ácidos nucleicos que codifican, por ejemplo, una proteína única o una proteína quimérica como una única cadena polipeptídica. Por ejemplo, los CARs de la invención se coexpresan con un control terapéutico (factor de crecimiento epidérmico truncado (EGFRt)), donde el CAR está codificado por una primera cadena polinucleotídica y el control terapéutico está codificado por una segunda cadena polinucleotídica. La primera y la segunda cadena polinucleotídica están enlazadas por una secuencia de ácido nucleico que codifica un conector escindible. En formas de realización de la divulgación, los polinucleótidos que codifican el CAR y el sistema de control terapéutico se pueden enlazar mediante secuencias IRES. Alternativamente, un CAR y un control terapéutico pueden estar codificados por dos polinucleótidos diferentes que no están enlazados mediante un conector, sino que, en cambio, están codificados por, por ejemplo, dos vectores diferentes. Además, los CARs pueden estar coexpresados con un control terapéutico y CCR, un control terapéutico y DHFR (por ejemplo, DHFR mutante) o un control terapéutico y CCR y DHFR (por ejemplo, DHFR mutante). Un CAR, control terapéutico y CCR pueden estar coexpresados y codificados por las secuencias
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polinucleotídicas primera, segunda y tercera, respectivamente, donde las secuencias polinucleotídicas primera, segunda y tercera están enlazadas mediante secuencias IRES o secuencias que codifican conectores escindibles. Alternativamente, las secuencias pueden no estar enlazadas mediante conectores sino, en cambio, codificadas mediante, por ejemplo, vectores separados. Un CAR, control terapéutico y DHFR (por ejemplo, DHFR mutante) pueden estar coexpresados y codificados por las secuencias polinucleotídicas primera, segunda y cuarta, respectivamente, donde las secuencias polinucleotídicas primera, segunda y cuarta están enlazadas mediante secuencias IRES o mediante secuencias que codifican conectores escindibles. Alternativamente, las secuencias pueden no estar enlazadas mediante conectores sino, en cambio, codificadas mediante, por ejemplo, vectores separados. Un CAR, control terapéutico, CCR y DHFR (por ejemplo, DHFR mutante) pueden estar coexpresados y codificados por las secuencias polinucleotídicas primera, segunda, tercera y cuarta, respectivamente, donde las secuencias polinucleotídicas primera, segunda, tercera y cuarta están enlazadas mediante secuencias IRES o secuencias que codifican conectores escindibles. Alternativamente, las secuencias pueden no estar enlazadas mediante conectores sino, en cambio, codificadas mediante, por ejemplo, vectores separados. Si las secuencias anteriormente mencionadas están codificadas por vectores separados, estos vectores se pueden transfectar simultánea o consecutivamente.
[0021] "Condiciones", "condiciones de enfermedad", "enfermedades" y "estado patológico" como se utiliza en este caso incluyen estados fisiológicos donde las células enfermas pueden ser reconocidas con CARs de la divulgación, expresando, por ejemplo, anticuerpos contra los antígenos específicos en las células enfermas. Los ejemplos de antígenos que pueden ser reconocidos incluyen, pero de forma no limitativa, antígenos expresados en células B (tales como CD19 y CD20), antígenos expresados en carcinomas, sarcomas, linfomas, leucemia, tumores de células germinales, blastomas, antígenos expresados en varias células inmunitarias y antígenos expresados en células asociadas a varias enfermedades hematológicas, enfermedades autoinmunes y/o enfermedades inflamatorias.
[0022] "Enfermedad reconocida por células modificadas genéticamente" como se utiliza en este caso abarca el reconocimiento de cualquier célula implicada de cualquier manera en cualquier enfermedad por las células modificadas genéticamente de la divulgación, con independencia de si las células modificadas genéticamente reconocen células enfermas o células sanas para efectuar un resultado terapéuticamente beneficioso. Las células modificadas genéticamente incluyen, pero de forma no limitativa, células T, células NK, células madre hematopoyéticas, células madre embrionarias pluripotentes o células madre embrionarias modificadas genéticamente. Las células modificadas genéticamente expresan CARs, CARs que pueden reconocer cualquiera de los antígenos expresados en la superficie de las células diana. Los ejemplos de antígenos que pueden ser reconocidos incluyen, pero de forma no limitativa, antígenos expresados en células B; antígenos expresados en carcinomas, sarcomas, linfomas, leucemia, tumores de células germinales y blastomas; antígenos expresados en varias células inmunitarias; y antígenos expresados en células asociadas a varias enfermedades hematológicas, enfermedades autoinmunes y/o enfermedades inflamatorias. Otros antígenos que pueden ser reconocidos serán evidentes para las personas expertas en la materia.
[0023] "Función efectora" se refiere a la función especializada de una célula diferenciada. La función efectora de una célula T, por ejemplo, puede ser una actividad citolítica o una actividad auxiliar, incluida la secreción de citocinas.
[0024] "Células modificadas genéticamente", "células redirigidas", "células genéticamente modificadas" o "células modificadas" como se utiliza en este caso se refieren a células que expresan CARs.
[0025] "Célula inmunitaria" como se utiliza en este caso se refiere a las células del sistema inmunitario de mamíferos, incluidas, pero de forma no limitativa, células presentadoras de antígenos, células B, basófilos, células T citotóxicas, células dendríticas, eosinófilos, granulocitos, células T auxiliares, leucocitos, linfocitos, macrófagos, mastocitos, células de memoria, monocitos, células asesinas naturales, neutrófilos, fagocitos, células plasmáticas y células T.
[0026] "Respuesta inmunitaria" como se utiliza en este caso se refiere a inmunidades incluidas, pero de forma no limitativa, inmunidad innata, inmunidad humoral, inmunidad celular, inmunidad, respuesta inflamatoria, inmunidad (adaptativa) adquirida, autoinmunidad y/o inmunidad hiperactiva.
[0027] "Mamífero" como se utiliza en este caso se refiere a cualquier miembro de la clase Mammalia, incluidos, sin limitación, seres humanos y primates no humanos tales como chimpancés y otros simios y especies de mono; animales de granja tales como ganado bovino, oveja, cerdos, cabras y caballos; mamíferos domésticos tales como perros y gatos; animales de laboratorio incluidos roedores tales como ratones, ratas y conejillos de Indias, y similares. El término no indica una edad o sexo particular. Así, sujetos adultos y recién nacidos, al igual que fetos, ya sean machos o hembras, se destinan estar incluirdos en el alcance de este término.
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[0028] "Polinucleótido" como se utiliza en este caso incluye, pero no está limitado a, ADN, ARN, ADNc (ADN complementario), ARNm (ARN mensajero), ARNr (ARN ribosómico), ARNhc (ARN horquillado corto), ARNnp (ARN nuclear pequeño), ARNnop (ARN nucleolar pequeño), miARN (microARN), ADN genómico, ADN sintético, ARN sintético y/o ARNt.
[0029] "ADN desnudo" como se utiliza en este caso se refiere a ADN que codifica un CAR clonado en un vector de expresión adecuado en una orientación apropiada para la expresión. Vectores virales que se pueden usar incluyen, pero no están limitados a, vectores lentivirales SIN, vectores retrovirales, vectores de virus espumoso, vectores de virus adenoasociados (AAV), vectores híbridos y/o transposones plasmídicos (por ejemplo, el sistema de transposón bella durmiente) o sistemas vectores basados en integrasas. Otros vectores que se pueden usar en relación con formas de realización alternativas de la invención serán evidentes para las personas expertas en la materia.
[0030] "Fragmento variable monocatenario", "fragmentos variables de anticuerpos monocatenarios" o anticuerpos "scFv" como se utilizan en este caso se refieren a formas de anticuerpos que comprenden las regiones variables solo de las cadenas ligeras y pesadas, conectadas por un péptido conector.
[0031] "Célula diana" como se utiliza en este caso se refiere a células que están implicadas en una enfermedad y pueden ser reconocidas por células modificadas genéticamente (incluidas, pero de forma no limitativa, células T modificadas genéticamente, células NK, células madre hematopoyéticas, células madre pluripotentes y células madre embrionarias). Otras células dianas serán evidentes para las personas expertas en la materia.
[0032] Los términos "célula T" y "linfocito T" son intercambiables y se usan como sinónimos aquí. Los ejemplos incluyen, pero de forma no limitativa, células T vírgenes, células T de memoria central, células T de memoria efectora o combinaciones de las mismas.
[0033] "Agentes terapéuticos" como se utiliza en este caso se refiere a agentes que se utilizan para, por ejemplo, tratar, inhibir, prevenir, mitigar los efectos de, reducir la gravedad de, reducir la probabilidad de desarrollar, ralentizar la progresión de y/o curar una enfermedad. Las enfermedades reconocidas por los agentes terapéuticos incluyen, pero de forma no limitativa, carcinomas, sarcomas, linfomas, leucemia, tumores de células germinales, blastomas, antígenos expresados en varias células inmunitarias y antígenos expresados en células asociadas a varias enfermedades hematológicas, enfermedades autoinmunes y/o enfermedades inflamatorias.
[0034] "Controles terapéuticos" como se utiliza en este caso se refiere a agentes que regulan proliferación celular, facilitan la selección celular (por ejemplo, la selección de células que expresan los receptores de antígenos quiméricos de la invención), facilitan el seguimiento de las células o una combinación de los mismos. La regulación de la proliferación celular puede comprender opcionalmente regular por aumento la proliferación celular para promover la propagación celular. La regulación de la proliferación celular puede comprender opcionalmente regular por disminución la proliferación celular para reducir o inhibir la propagación celular. Los agentes que sirven como controles terapéuticos pueden promover opcionalmente el enriquecimiento de células que expresan los receptores de antígenos quiméricos biespecíficos que pueden resultar en una ventaja terapéutica.
[0035] "Transducción" como se utiliza en este caso se refiere a la introducción de un ácido nucleico extraño en una célula usando un vector viral.
[0036] "Transfección" como se utiliza en este caso se refiere a la introducción de un ácido nucleico extraño en una célula usando tecnología del ADN recombinante. El término "transformación" significa la introducción de un gen, una secuencia de ADN o ARN "extraña" (es decir, extrínseca o extracelular) en una célula huésped, de modo que la célula huésped expresará el gen o la secuencia introducida para producir una sustancia deseada, tal como una proteína o enzima codificada por el gen o la secuencia introducida. El gen o la secuencia introducida también se puede denominar un gen o una secuencia "clonada" o "extraña", puede incluir secuencias de control o reguladoras, tales como secuencias de inicio, de parada, promotoras, señal, de secreción u otras usadas por la maquinaria genética de una célula. El gen o la secuencia puede incluir secuencias no funcionales o secuencias sin función conocida. Una célula huésped que recibe y expresa ADN o ARN introducido se ha "transformado" y es un "transformante" o un "clon." El ADN o el ARN introducido en una célula huésped puede venir de cualquier fuente, incluidas células del mismo género o especie que la célula huésped o células de un género o especie diferente.
[0037] "Tratamiento" y "tratar", como se utiliza en este caso, se refieren tanto a un tratamiento terapéutico como a medidas profilácticas o preventivas, donde el objeto es prevenir o ralentizar (disminuir) la condición patológica
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reconocida, prevenir la condición patológica, perseguir u obtener resultados beneficiosos o reducir las probabilidades del individuo que está desarrollando la condición, incluso si el tratamiento es, en última instancia, fallido. Aquellos que necesitan un tratamiento incluyen aquellos ya con la condición al igual que aquellos propensos a tener la condición o aquellos en los que debe prevenirse la condición.
[0038] "Tumor", como se utiliza en este caso, se refiere a todo crecimiento y proliferación celular neoplásica, ya sea maligna o benigna, y todas las células y los tejidos precancerosos y cancerosos.
[0039] "Vector", "vector de clonación" y "vector de expresión" como se utiliza en este caso se refieren al vehículo mediante el que una secuencia polinucleotídica (por ejemplo, un gen extraño) se puede introducir en una célula huésped, para transformar el huésped y promover la expresión (por ejemplo, transcripción y traducción) de la secuencia introducida. Los vectores incluyen plásmidos, fagos, virus, etc.
Descripción de la invención
Receptores de antígenos quiméricos
[0040] Aunque no se desea estar limitado por ninguna de las premisas, se cree que los receptores de antígenos quiméricos biespecíficos de la presente invención pueden superar fracasos terapéuticos convencionales debido a, por ejemplo, el brote de variantes de escape por pérdida de antígeno que pueden surgir en el curso de varias terapias cuando se reconoce un único antígeno. Por consiguiente, la invención se dirige a secuencias de aminoácidos de CARs biespecíficos referidas por las SEQ N.os 3 y 12, secuencias de ácido nucleico que codifican a las mismas, vectores y virus que comprenden dichas secuencias de ácido nucleico y células modificadas genéticamente que comprenden dichos CARs biespecíficos (células redirigidas).
[0041] Los CARs de la invención reconocen CD19 y CD20. Los CARs biespecíficos se coexpresan con un control terapéutico; el receptor de factor de crecimiento epidérmico truncado (EGFRt). Los polinucleótidos que codifican el CAR y el EGFRt están enlazados mediante secuencias polinucleotídicas que codifican conectores escindibles. Los CARs de la invención se construyen de modo que se puedan expresar en células, que a su vez proliferan en respuesta a la presencia de al menos una molécula que interactúa con al menos una región de reconocimiento específico de antígeno, por ejemplo, un antígeno.
[0042] Otros aspectos/formas de realización de la invención se describen en las reivindicaciones.
[0043] En algunas divulgaciones, los controles terapéuticos comprenden cualquiera de uno o más de entre receptor de factor de crecimiento epidérmico truncado (EGFRt), timidina quinasa, citosina desaminasa, nitrorreductasa, xantinaguanina fosforribosil transferasa, caspasa 8 humana, caspasa 9 humana, purina nucleósido fosforilasa, linamarasa/linamarina/glucosa oxidasa, desoxirribonucleósidos quinasa, peroxidasa de rábano (HRP)/ácido indol-3-acético (IAA), gamma-glutamilcisteína sintetasa, CD20/alfaCD20, quimera de CD34/timidina quinasa, caspasa-2 dependiente de dox, timidina quinasa mutante (HSV-TKSR39) o sistema AP1903/Fas. En una divulgación, los CARs están enlazados a EGFRt mediante un conector escindible o secuencias IRES. En la invención, un CAR biespecífico está enlazado a EGFRt mediante un conector escindible.
[0044] Los CARs descritos aquí se pueden sintetizar como cadenas polipeptídicas únicas y pueden comprender al menos dos regiones de reconocimiento específico de antígeno, un dominio separador extracelular, un dominio transmembrana, uno o más dominios coestimuladores y un dominio de señalización intracelular. En este CAR, las regiones de reconocimiento específico de antígeno están en el extremo N-terminal, dispuestas en tándem, y están separadas por un péptido conector. La región de reconocimiento específico de antígeno está enlazada a un dominio separador extracelular que está enlazado al dominio transmembrana. El dominio transmembrana está enlazado al dominio coestimulador. El dominio coestimulador está enlazado al dominio de señalización intracelular que está en el extremo C-terminal. Si se usa más de un dominio coestimulador, los múltiples dominios coestimuladores pueden estar dispuestos en tándem con el dominio transmembrana en su extremo N-terminal y el dominio de señalización intracelular en su extremo C-terminal. Los polinucleótidos que codifican estos polipéptidos pueden comprender además una secuencia señal N-terminal que dirige el CAR a la superficie celular como una proteína transmembrana de tipo I. La región de reconocimiento específico de antígeno puede ser de orientación extracelular y el dominio de señalización intracelular puede ser citoplásmico.
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[0045] La figura 1 muestra una representación esquemática de un receptor de antígenos quimérico.
[0046] Un dominio separador extracelular en el CAR es opcional. En tal CAR, las regiones de reconocimiento específico de antígeno están en el extremo N-terminal, dispuestas en tándem, y separadas por un péptido conector. La región de reconocimiento específico de antígeno se puede enlazar al dominio transmembrana. El dominio transmembrana se puede enlazar al dominio coestimulador. El dominio coestimulador se puede enlazar al dominio de señalización intracelular, que está en el extremo C-terminal. Si se usa más de un dominio coestimulador, los múltiples dominios coestimuladores pueden estar dispuestos en tándem con el dominio transmembrana en su extremo N-terminal y el dominio de señalización intracelular en su extremo C-terminal. Los polinucleótidos que codifican estos polipéptidos pueden comprender además una secuencia señal N-terminal que dirija el CAR a la superficie celular como una proteína transmembrana de tipo I. La región de reconocimiento específico de antígeno puede ser de orientación extracelular y el dominio de señalización intracelular puede ser citoplásmico.
Regiones de reconocimiento específico de antígeno de receptores de antígenos quiméricos
[0047] Los CARs de la divulgación pueden reconocer varios (tal como dos o más, tres o más) antígenos diferentes. En la invención, el CAR es un CAR biespecífico y reconoce CD19 y CD20. Como se ha descrito anteriormente, las regiones de reconocimiento específico de antígeno de un CAR de la divulgación pueden estar dispuestas en tándem y pueden estar separadas por péptidos conectores. Los antígenos reconocidos por un CAR pueden ser antígenos en una única célula enferma (tal como una célula B cancerosa) o antígenos que se expresan en células separadas que contribuye cada uno a la enfermedad. Los antígenos reconocidos son antígenos que están o directa o indirectamente implicados en una enfermedad.
[0048] En un CAR biespecífico, al menos dos anticuerpos específicos de antígeno diferentes o fragmentos de los mismos o derivados de los mismos se pueden clonar en la región de reconocimiento específico de antígeno. Los anticuerpos pueden ser específicos para cualquier, pero al menos dos, antígenos de elección distintos. El anticuerpo específico para el antígeno puede ser el fragmento Fab del anticuerpo o el fragmento variable monocatenario (scFv) del anticuerpo.
[0049] Por ejemplo, la figura 2 representa un CAR específico para CD19 y CD20. Usando métodos bien conocidos por una persona experta en la materia, los scFvs específicos para múltiples, pero al menos dos, antígenos diferentes se pueden clonar aguas arriba (es decir, hacia el extremo N-terminal) de los dominios IgG4-CD28-zeta siempre y cuando los antígenos diana se expresen en células que puedan ser reconocidas por las células modificadas genéticamente descritas a continuación. Tales técnicas se explican completamente en la bibliografía. (Sambrook et al, "Molecular Cloning: A Laboratory Manual" (1989), Current Protocols in Molecular Biology. Volúmenes I-III [Ausubel, R. M., ed. (1994)], Cell Biology: A Laboratory Handbook. Volúmenes I-III [J. E. Celis, ed. (1994))], Current Protocols in Immunology. Volúmenes I-III [Coligan, J. E., ed. (1994)], Oligonucleotide Synthesis. (M. J. Gait ed. 1984), Nucleic Acid Hybridization [B. D. Hames y S. J. Higgins eds. (1985)], Transcription And Translation [B. D. Hames y S. J. Higgins, eds. (1984)], Animal Cell Culture [R. I. Freshney, ed. (1986)], Immobilized Cells And Enzymes [IRL Press, (1986)], Practical Guide To Molecular Cloning B. Perbal (1984), Current Prptocols in Immunology (J. E. Coligan, A. M. Kruisbeek, D. H. Margulies, E. M. Shevach y W. Strober, eds., 1991), Annual Review of Immunology, al igual que monografías en revistas tales como Advances in Immunology).
[0050] En una divulgación, cada región de reconocimiento específico de antígeno comprende la cadena pesada de IgG en toda su longitud (específica para el antígeno diana) que tiene los dominios de Ig (Fc) Vh, CH1, bisagra y los CH2 y CH3, si el dominio Vh solo es suficiente para conferir especificidad de antígeno ("anticuerpos de dominio único"). La cadena pesada de IgG de longitud total se puede enlazar al dominio coestimulador y el dominio de señalización intracelular mediante el dominio transmembrana apropiado. Si ambos, los dominios Vh y Vl, son necesarios para generar una región de reconocimiento específico de antígeno completamente activa, el CAR que contiene VH y la cadena ligera lambda en toda su longitud (IgL) se introducen ambos en las células para generar una región de reconocimiento específico de antígeno activa. En una divulgación, un dominio separador extracelular se puede enlazar entre el dominio de unión específico de antígeno y el dominio transmembrana. Las células incluyen, pero de forma no limitativa, linfocitos T (células T), células asesinas naturales, células madre hematopoyéticas y/o células madre embrionarias/pluripotentes inducidas capaces de dar lugar a una progenie terapéuticamente pertinente.
[0051] En otra divulgación, cada región de reconocimiento específico de antígeno del CAR comprende al menos dos fragmentos variables de anticuerpo monocatenarios (scFv), cada uno específico de un antígeno diana diferente. Se han desarrollado scFvs, donde el extremo C-terminal de un dominio variable (Vh o Vl) está ligado al extremo N-terminal del
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otro (Vl o Vh, respectivamente) mediante un conectar polipeptídico, sin alterar significativamente la unión de antígenos o la especificidad de la unión. (Chaudhary et al., A recombinant single-chain immunotoxin composed of anti-Tac variable regions and a truncated diphtheria toxin. 1990 Proc. Natl. Acad. Sci., 87: 9491; Bedzyk et al. Immunological and structural characterization of a high affinity anti-fluorescein single-chain antibody. 1990 J. Biol. Chem., 265: 18615). El conector conecta el extremo N-terminal del Vh con el extremo C-terminal de Vl o el extremo C-terminal de Vh con el extremo N-terminal de Vl. Estos scFvs carecen de las regiones constantes (Fc) presentes en las cadenas ligeras y pesadas del anticuerpo nativo. Los scFvs, específicos para al menos dos antígenos diferentes, están dispuestos en tándem y enlazados al dominio coestimulador y el dominio de señalización intracelular mediante un dominio transmembrana. En una divulgación, un dominio separador extracelular se puede enlazar entre la región de unión específica de antígeno y el dominio transmembrana.
[0052] En otra divulgación, cada fragmento scFv puede estar fusionado con todos o una porción de los dominios constantes de la cadena pesada. La región de reconocimiento específico de antígeno resultante, específica para al menos dos antígenos diferentes, se une al dominio coestimulador y el dominio de señalización intracelular mediante un dominio transmembrana. En una divulgación, un dominio separador extracelular se puede enlazar entre el dominio de unión específico de antígeno y el dominio transmembrana.
[0053] En otra divulgación, cada región de reconocimiento específico de antígeno del CAR comprende un fragmento variable monocatenario divalente (o bivalente) (di-scFvs, bi-scFvs). En CARs que comprenden di-scFVs, dos scFvs específicos para cada antígeno están enlazados produciendo una cadena peptídica única con dos regiones Vh y dos Vl, produciendo un scFvs en tándem. (Xiong, Cheng-Yi; Natarajan, A; Shi, XB; Denardo, GL; Denardo, SJ (2006). "Development of tumor targeting anti-MUC-1 multimer: effects of di-scFv unpaired cysteine location on PEGylation and tumor binding". Protein Engineering Design and Selection 19 (8): 359-367; Kufer, Peter; Lutterbüse, Ralf; Baeuerle, Patrick A. (2004). "A revival of bispecific antibodies". Trends in Biotechnology 22 (5): 238-244). Los CARs que comprenden al menos dos regiones de reconocimiento específico de antígeno expresarían dos scFvs específicos para cada uno de los dos antígenos. La región de reconocimiento específico de antígeno resultante, específica para al menos dos antígenos diferentes, se une al dominio coestimulador y el dominio de señalización intracelular mediante un dominio transmembrana. En una divulgación, un dominio separador extracelular se puede enlazar entre el dominio de unión específica de antígeno y el dominio transmembrana.
[0054] En una divulgación adicional, cada región de reconocimiento específico de antígeno del CAR comprende un diacuerpo. En un diacuerpo, los scFvs se crean con péptidos conectores que son demasiado cortos para que las dos regiones variables se plieguen juntas, llevando a los scFvs a dimerizar. Conectores todavía más cortos (uno o dos aminoácidos) conducen a la formación de trímeros, los denominados triacuerpos o tricuerpos. También pueden usarse tetracuerpos.
[0055] Para crear los CARs de la presente divulgación, dos o más regiones de reconocimiento específico de antígeno individuales se conectan entre sí, o de manera covalente o de manera no covalente, en una única molécula de proteína. Un conector oligo- o polipeptídico, una región bisagra de Fc o bisagra de membrana se pueden usar para conectar estos dominios entre sí. Los CARs pueden comprender dos o más de las diferentes regiones de reconocimiento específico de antígeno conectadas en diferentes combinaciones. Por ejemplo, dos o más regiones de reconocimiento específico de antígeno que contengan secuencias de inmunoglobulina (por ejemplo, scFvs y/o anticuerpos de dominio único) se pueden enlazar entre sí.
Dianas de regiones de reconocimiento específico de antígeno de receptores de antígenos quiméricos
[0056] En algunas divulgaciones, la región de reconocimiento específico de antígeno del CAR (por ejemplo, CAR biespecífico) reconoce antígenos específicos para cáncer, enfermedad inflamatoria, trastornos neuronales, diabetes, enfermedad cardiovascular, enfermedades infecciosas o una combinación de las mismas. Los ejemplos de antígenos que pueden ser reconocidos por los CARs (por ejemplo, CARs biespecíficos) incluyen, pero de forma no limitativa, antígenos expresados en células B, antígenos expresados en carcinomas, sarcomas, linfomas, leucemia, tumores de células germinales, blastomas, antígenos expresados en varias células inmunitarias y antígenos expresados en células asociadas a varias enfermedades hematológicas, enfermedades autoinmunes y/o enfermedades inflamatorias. Los CARs de la invención, que son específicos para CD19 y CD20, pueden ser capaces de redirigir la función efectora de las células que los expresan a cualquiera de ambos antígenos diana. Esta característica de la construcción puede superar el problema de las variantes de escape por pérdida de antígeno durante el reconocimiento, por ejemplo, de neoplasias del linaje de células B genéticamente inestables usando la especificidad de antígeno único.
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[0057] Los antígenos específicos para cáncer que pueden ser reconocidos por los CARs (por ejemplo, CARs biespecíficos) de la divulgación incluyen, pero de forma no limitativa, cualquiera de uno o más de entre 4-1BB, 5T4, antígeno de adenocarcinoma, alfa-fetoproteína, BAFF, célula de linfoma B, antígeno C242, CA-125, anhidrasa carbónica 9 (CA-IX), C-MET, CCR4, CD152, CD19, CD20, CD200, CD22, CD221, CD23 (receptor de IgE), CD28, CD30 (TNFRSF8), CD33, CD4, CD40, CD44 v6, CD51, CD52, CD56, CD74, CD80, CEA, CNT0888, CTLA-4, DR5, EGFR, EpCAM, CD3, FAP, dominio B extra de fibronectina, receptor de folato 1, gangliósido GD3, GD2, glicoproteína 75, GPNMB, HER2/neu, HGF, quinasa del receptor de factor de difusión humano, receptor de IGF-1, IGF-I IgG 1, L1-CAM, IL-13, IL-6, receptor de factor de crecimiento insulínico I, integrina a5k1, integrina avk3, M0RAb-009, MS4A1, MUC1, mucina CanAg, ácido N-glicolilneuramínico, NPC-1C, PDGF-R a, PDL192, fosfatidilserina, células de carcinoma prostático, RANKL, RON, R0R1, SCH 900105, SDC1, SLAMF7, TAG-72, tenascina C, TGF beta 2, TGF- k, TRAIL-R1, TRAIL-R2, antígeno tumoral CTAA16.88, VEGF-A, VEGFR-1, VEGFR2 o vimentina. Otros antígenos específicos para cáncer serán evidentes para las personas expertas en la materia. Los ejemplos de CARs que reconocen los antígenos anteriores incluyen, pero de forma no limitativa, CARs biespecíficos, CARs biespecíficos coexpresados con EGFRt, CARs biespecíficos coexpresados con EGFRt y CCR, CARs biespecíficos coexpresados con EGFRt y DHFR (por ejemplo, DHFR mutante) o CARs biespecíficos coexpresados con EGFRt y CDR y DHFR (por ejemplo, DHFR mutante).
[0058] En algunas divulgaciones, los receptores de antígenos quiméricos biespecíficos reconocen y se unen a al menos dos antígenos diferentes. Los ejemplos de parejas de al menos dos antígenos que se unen a CARs biespecíficos incluyen, pero de forma no limitativa, CD19 y CD20, CD19 y CD22, CD20 y L1-CAM, L1-CAM y GD2, EGFR y L1-CAM, EGFR y C-MET, EGFR y HER2, C-MET y HER2 y EGFR y R0R1. Otras parejas de antígenos específicos para cáncer serán evidentes para las personas expertas en la materia. En la invención, el receptor de antígenos quimérico biespecífico reconoce CD19 y CD20. Los ejemplos de CARs que reconocen los antígenos anteriores incluyen, pero de forma no limitativa, CARs biespecíficos, CARs biespecíficos coexpresados con EGFRt, CARs biespecíficos coexpresados con EGFRt y CCR, CARs biespecíficos coexpresados con EGFRt y DHFR (por ejemplo, DHFR mutante) o CARs biespecíficos coexpresados con EGFRt y CDR y DHFR (por ejemplo, DHFR mutante). Aquellos de la invención se denotan por las reivindicaciones.
[0059] Los antígenos específicos para enfermedades inflamatorias que pueden ser reconocidos por CARs de la divulgación incluyen, pero de forma no limitativa, cualquiera de uno o más de entre A0C3 (VAP-1), CAM-3001, CCL11 (eotaxina-1), CD125, CD147 (basigina), CD154 (CD40L), CD2, CD20, CD23 (receptor de IgE), CD25 (cadena a de receptor de IL-2), CD3, CD4, CD5, IFN-a, IFN-y, IgE, región Fc de IgE, IL-1, IL-12, IL-23, IL-13, IL-17, IL-17A, IL-22, IL-4, IL-5, IL-5, IL-6, receptor de IL-6, integrina a4, integrina a4k7, Lama glama, LFA-1 (CD11a), MEDI-528, miostatina, 0X-40, rhuMAb k7, escleroscina, S0ST, TGF beta 1, TNF-a o VEGF-A.0tros antígenos específicos para enfermedades inflamatorias serán evidentes para las personas expertas en la materia. Los ejemplos de CARs que reconocen los antígenos anteriores incluyen, pero de forma no limitativa, CARs biespecíficos, CARs biespecíficos coexpresados con EGFRt, CARs biespecíficos coexpresados con EGFRt y CCR, CARs biespecíficos coexpresados con EGFRt y DHFR (por ejemplo, DHFR mutante) o CARs biespecíficos coexpresados con EGFRt y CDR y DHFR (por ejemplo, DHFR mutante).
[0060] Los antígenos específicos para trastornos neuronales que pueden ser reconocidos por CARs de la divulgación incluyen, pero de forma no limitativa, cualquiera de una o más de entre beta-amiloide o MABT5102A. 0tros antígenos específicos para trastornos neuronales serán evidentes para las personas expertas en la materia. Los ejemplos de CARs que reconocen los antígenos anteriores incluyen, pero de forma no limitativa, CARs biespecíficos, CARs biespecíficos coexpresados con EGFRt, CARs biespecíficos coexpresados con EGFRt y CCR, CARs biespecíficos coexpresados con EGFRt y DHFR (por ejemplo, DHFR mutante) o CARs biespecíficos coexpresados con EGFRt y CDR y DHFR (por ejemplo, DHFR mutante).
[0061] Los antígenos específicos para diabetes que pueden ser reconocidos por CARs de la divulgación incluyen, pero de forma no limitativa, cualquiera de una o más de entre L-1 k o CD3. 0tros antígenos específicos para diabetes u otros trastornos metabólicos serán evidentes para las personas expertas en la materia. Los ejemplos de CARs que reconocen los antígenos anteriores incluyen, pero de forma no limitativa, CARs biespecíficos, CARs biespecíficos coexpresados con EGFRt, CARs biespecíficos coexpresados con EGFRt y CCR, CARs biespecíficos coexpresados con EGFRt y DHFR (por ejemplo, DHFR mutante) o CARs biespecíficos coexpresados con EGFRt y CDR y DHFR (por ejemplo, DHFR mutante).
[0062] Los antígenos específicos para enfermedades cardiovasculares que pueden ser reconocidos por CARs de la divulgación incluyen, pero de forma no limitativa, cualquiera de una o más de entre C5, miosina cardíaca, CD41 (integrina alfa-lIb), fibrina II, cadena beta, ITGB2 (CD18) y esfingosina-1-fosfato. 0tros antígenos específicos para enfermedades cardiovasculares serán evidentes para las personas expertas en la materia. Los ejemplos de CARs que
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reconocen los antígenos anteriores incluyen, pero de forma no limitativa, CARs biespecíficos, CARs biespecíficos coexpresados con EGFRt, CARs biespecíficos coexpresados con EGFRt y CCR, CARs biespecíficos coexpresados con EGFRt y DHFR (por ejemplo, DHFR mutante) o CARs biespecíficos coexpresados con EGFRt y CDR y DHFR (por ejemplo, DHFR mutante).
[0063] Los antígenos específicos para enfermedades infecciosas que pueden ser reconocidos por CARs de la divulgación incluyen, pero de forma no limitativa, cualquiera de una o más de entre toxina del carbunco, CCR5, CD4, factor de aglutinación A, citomegalovirus, glicoproteína B del citomegalovirus, endotoxina, Escheríchia coli, antígeno de superficie de la hepatitis B, virus de la hepatitis B, HIV-1, Hsp90, hemaglutinina A de la gripe, ácido lipoteicoico, Pseudomonas aeruginosa, glicoproteína del virus de la rabia, virus respiratorio sincitial y TNF-a. Otros antígenos específicos para enfermedades infecciosas serán evidentes para las personas expertas en la materia. Los ejemplos de CARs que reconocen los antígenos anteriores incluyen, pero de forma no limitativa, CARs biespecíficos, CARs biespecíficos coexpresados con EGFRt, CARs biespecíficos coexpresados con EGFRt y CCR, CARs biespecíficos coexpresados con EGFRt y DHFR (por ejemplo, DHFR mutante) o CARs biespecíficos coexpresados con EGFRt y CDR y DHFR (por ejemplo, DHFR mutante).
[0064] Los ejemplos adicionales de antígenos diana incluyen, pero de forma no limitativa, proteínas de superficie encontradas en células cancerosas de una forma específica o amplificada (por ejemplo, el receptor de IL-14, CD19, CD20 y CD40 para el linfoma de células B, los antígenos Lewis Y y CEA para una variedad de carcinomas, el antígeno Tag72 para cáncer de mama y colorrectal, EGF-R para cáncer pulmonar, proteína de unión a folato y la proteína HER-2 que está a menudo amplificada en los carcinomas de mama y ováricos humanos), o proteínas virales (por ejemplo, proteínas de la envoltura gp120 y gp41 del VIH, proteínas de la envoltura de los virus de la hepatitis B y C, la glicoproteína B y otras glicoproteínas de la envoltura del citomegalovirus humano, las proteínas de la envoltura de oncovirus tales como el virus del herpes asociado al sarcoma de Kaposi). Otras dianas potenciales de los CARs incluyen CD4, donde el ligando es la glicoproteína de la envoltura gp120 del VIH, y otros receptores virales, por ejemplo, ICAM, que es el receptor para el rinovirus humano, y la molécula receptora relacionada para el poliovirus.
[0065] Las dianas adicionales de los CARs incluyen antígenos implicados en enfermedades asociadas a las células B. Aún más dianas de los CARs serán evidentes para las personas expertas en la materia.
Dominios coestimuladores de receptores de antígenos quiméricos
[0066] Los CARs de la divulgación también pueden comprender un dominio coestimulador. Este dominio puede mejorar la proliferación celular, la supervivencia celular y el desarrollo de células de memoria. Los CARs pueden comprender uno o más dominios coestimuladores. Cada dominio coestimulador comprende el dominio coestimulador de cualquiera de uno o más de entre, por ejemplo, miembros de la superfamilia TNFR, CD28, CD137 (4-1BB), CD134 (OX40), Dap10, CD27, CD2, CD5, ICAM-1, LFA-1, Lck, TNFR-1, TNFR-II, Fas, CD30, CD40 o combinaciones de los mismos. También se pueden usar con los CARs dominios coestimuladores de otras proteínas. Dominios coestimuladores adicionales serán evidentes para las personas expertas en la materia. Si un CAR comprende más de un dominio coestimulador, estos dominios pueden estar dispuestos en tándem, opcionalmente separados por un conector. Los productos de la invención comprenden dominios 41BB.
Dominio separador extracelular de un receptor de antígenos quimérico
[0067] Los CARs de la divulgación pueden comprender además un dominio separador extracelular. En algunos CARs, este dominio facilita un plegamiento de las proteínas apropiado. El dominio separador extracelular comprende una región hidrófila que está unida a la región de reconocimiento específico de antígeno y el dominio transmembrana. Los dominios separadores extracelulares pueden incluir, pero de forma no limitativa, fragmentos Fc de anticuerpos o fragmentos o derivados de los mismos, regiones bisagra de anticuerpos o fragmentos o derivados de los mismos, regiones CH2 de anticuerpos, regiones CH3 de anticuerpos, secuencias separadoras artificiales o combinaciones de los mismos. Los ejemplos de dominios separadores extracelulares incluyen, pero de forma no limitativa, bisagra de CD8a, espaciadores artificiales constituidos por polipéptidos tales como Gly3, o los dominios CH1, CH3 de las IgG (tales como la IgG4 humana). Específicamente, el dominio separador extracelular puede ser (i) una bisagra, regiones CH2 y CH3 de la IgG4, (ii) una región bisagra de la IgG4, (iii) una bisagra y CH2 de la IgG4, (iv) una región bisagra de CD8a, (v) una bisagra, regiones CH2 y CH3 de la IgG1, (vi) una región bisagra de la IgG1 o (vi) una bisagra y CH2 de la IgG1 o una combinación de las mismas. Dominios separadores extracelulares adicionales serán evidentes para las personas expertas en la materia. Los productos de la invención comprenden los dominios bisagra de CD8a/bisagra de la IgG4.
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Dominio transmembrana de los receptores de antigenos quiméricos
[0068] Los CARs de la divulgación también pueden comprender un dominio transmembrana. El dominio transmembrana puede comprender la secuencia transmembrana de cualquier proteína que tenga un dominio transmembrana, incluida cualquiera de las proteínas transmembrana de tipo I, tipo II o tipo III. El dominio transmembrana de un CAR también puede comprender una secuencia hidrofóbica artificial. Los dominios transmembrana de los CARs se pueden seleccionar para que no dimericen. Dominios transmembrana adicionales serán evidentes para las personas expertas en la materia. Los productos de la invención comprenden dominios transmembrana de CD28/CD8a.
Dominio de señalización intracelular de receptores de antigenos quiméricos
[0069] Los CARs de la divulgación también pueden comprender un dominio de señalización intracelular. Este dominio puede ser citoplásmico y puede transducir la señal de función efectora y dirigir la célula para ejecutar su función especializada. Los ejemplos de dominios de señalización intracelular incluyen, pero de forma no limitativa, cadena U del receptor de las células T o cualquiera de sus homólogos (por ejemplo, la cadena v, las cadenas FcsRIy y k, la cadena MB1 (Iga), la cadena B29 (Igk), etc.), polipéptidos CD3 (A, 5 y £), tirosina quinasas de la familia syk, (Syk, ZAP 70, etc.), tirosina quinasas de la familia src (Lck, Fyn, Lyn, etc.) y otras moléculas implicadas en la transducción de las células T, tales como CD2, CD5 y CD28. Específicamente, el dominio de señalización intracelular puede ser la cadena zeta de CD3 humana, FcyRIII, FceRI, colas citoplásmicas de receptores de Fc, receptores citoplásmicos que llevan motivos de activación del inmunorreceptor basados en tirosina (ITAM) o combinaciones de los mismos. Dominios de señalización intracelular adicionales serán evidentes para las personas expertas en la materia. Los productos de la invención comprenden dominios CD3 zeta.
Conectores en los receptores de antigenos quiméricos
[0070] En algunas divulgaciones, dos o más componentes de los CARs están separados por uno o más conectores. Por ejemplo, en CARs que comprenden al menos dos regiones de reconocimiento específico de antígeno, la primera región de reconocimiento en el CAR puede estar separada de la segunda región de reconocimiento en el CAR mediante un conector. Adicionalmente, el CAR se puede enlazar a controles terapéuticos mediante un conector. Los conectores son una región oligo- o polipeptídica de aproximadamente 1 a 100 aminoácidos de longitud que enlazan cualquiera de los dominios/regiones del CAR de la invención. Los conectores pueden tener, por ejemplo, 5-12 aminoácidos de longitud, 5-15 aminoácidos de longitud o de 5 a 20 aminoácidos de longitud. Los conectores pueden estar compuestos de residuos flexibles como la glicina y la serina de modo que los dominios proteicos adyacentes sean libres de moverse el uno con respecto al otro. Se pueden usar conectores más largos, por ejemplo, aquellos más largos que 100 aminoácidos, y se pueden seleccionar para, por ejemplo, asegurar que dos dominios adyacentes no interfieren estéricamente el uno con el otro. Los ejemplos de conectores que se pueden usar incluyen, pero de forma no limitativa, conectores 2A (por ejemplo, T2A), conectores de tipo 2A o equivalentes funcionales de los mismos. Los productos de la invención comprenden conectores T2A.
Controles terapéuticos
[0071] Los controles terapéuticos regulan la proliferación celular, facilitan la selección celular (por ejemplo, la selección de células que expresan los receptores de antígenos quiméricos de la invención) o una combinación de los mismos. Opcionalmente, la regulación de la proliferación celular comprende regular por aumento la proliferación celular para promover la propagación celular. Opcionalmente, la regulación de la proliferación celular comprende regular por disminución para reducir o inhibir la propagación celular. Opcionalmente, los agentes que sirven como controles terapéuticos pueden promover el enriquecimiento de células que expresan los receptores de antígenos quiméricos biespecíficos que pueden resultar en una ventaja terapéutica. Los agentes que sirven como controles terapéuticos pueden interactuar bioquímicamente con composiciones adicionales para regular el funcionamiento de los controles terapéuticos. Por ejemplo, el EGFRt (un control terapéutico) puede interactuar bioquímicamente con el cetuximab para regular la función del EGFRt en la selección, el seguimiento, la ablación celular o una combinación de los mismos.
[0072] Los ejemplos de controles terapéuticos incluyen, pero de forma no limitativa, cualquiera de uno o más de entre receptor de factor de crecimiento epidérmico truncado (EGFRt), timidina quinasa, citosina desaminasa, nitrorreductasa, xantina-guanina fosforribosil transferasa, caspasa 8 humana, caspasa 9 humana, purina nucleósido fosforilasa, linamarasa/linamarina/glucosa oxidasa, desoxirribonucleósido quinasa, peroxidasa de rábano (HRP)/ácido indol-3-acético (IAA), gamma-glutamilcisteína sintetasa, CD20/alfaCD20, quimera de CD34/timidina quinasa, caspasa-2 dependiente de dox, timidina quinasa mutante (HSV-TKSR39), sistema AP1903/Fas, un receptor de citocina quimérico
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(CCR), un marcador de selección y combinaciones de los mismos. En algunas divulgaciones, los controles terapéuticos se coexpresan con receptores de antígenos quiméricos biespecíficos.
[0073] Los ejemplos de agentes que regulan el funcionamiento de los controles terapéuticos incluyen, pero de forma no limitativa, cualquiera de uno o más de entre Herceptin, metotrexato, cetuximab, análogos de timidina (por ejemplo, ganciclovir), (E)-5-(2-bromovinil)-2'-desoxiuridina (BVDU), 5-fluorocitosina (5-FC), 5-(azaridin-1-il)-2,4-dinitrobenzamida (CB1954), 6-tioguanina, un fármaco dimerizante sintético (por ejemplo, AP1903), fosfato de fludarabina, linamarina (lin), análogos de nucleósidos (por ejemplo, BVDU, difluorodesoxicitidina (dFdC), 1-k-D-arabinofuranosiltimina (ara-T)), ácido indol-3-acético (IAA), 1-butionina-S,R-sulfoximina (BSO), rituximab (RTX), doxiciclina, inhibidores de tirosina quinasas o combinaciones de los mismos. Estos agentes se pueden administrar antes, durante o después del uso de los controles terapéuticos.
[0074] Como se ha descrito anteriormente, los CARs se pueden sintetizar como cadenas polipeptídicas únicas. Si el CAR es un CAR biespecífico, la secuencia polinucleotídica que codifica el CAR puede estar, por ejemplo, en la siguiente configuración en la dirección N-terminal a C-terminal: secuencia señal N-terminal - región de reconocimiento específico de antígeno 1 - conector - región de reconocimiento específico de antígeno 2 - dominio separador extracelular - dominio transmembrana - dominio coestimulador - dominio de señalización intracelular. Tal CAR puede comprender dos o más dominios coestimuladores.
[0075] Alternativamente, la secuencia polinucleotídica que codifica el CAR puede estar en la siguiente configuración en la dirección N-terminal a C-terminal: secuencia señal N-terminal - región de reconocimiento específico de antígeno 1 -conector - región de reconocimiento específico de antígeno 2 - dominio transmembrana - dominio coestimulador -dominio de señalización intracelular. Tal CAR puede comprender dos o más dominios coestimuladores.
[0076] Si un CAR comprende más de dos regiones de reconocimiento específico de antígeno, la secuencia polinucleotídica que codifica el CAR puede estar en la siguiente configuración en la dirección N-terminal a C-terminal: secuencia señal N-terminal - región de reconocimiento específico de antígeno 1-conector - región de reconocimiento específico de antígeno 2 - conector - (región de reconocimiento específico de antígeno)n-dominio transmembrana -dominio coestimulador - dominio de señalización intracelular. Tal CAR puede comprender además un dominio separador extracelular. Cada región de reconocimiento específico de antígeno puede estar separada por un conector. Tal CAR puede comprender dos o más dominios coestimuladores.
[0077] La divulgación proporciona una secuencia de ácido nucleico del esqueleto de un CAR ejemplar que incluye un dominio separador extracelular, un dominio transmembrana, un dominio coestimulador y un dominio de señalización intracelular. Específicamente, un esqueleto ejemplar para un CAR puede comprender, en la orientación N-terminal a C-terminal, IgG4bisagra-CD28tm-41BB-CD3zeta, donde el dominio separador extracelular es la región bisagra de la IgG4, el dominio transmembrana es la región transmembrana de CD28, el dominio coestimulador es de 4-1BB y el dominio de señalización intracelular es de la cadena zeta de CD3 (figura 7). Al menos dos o más regiones de reconocimiento específico de antígeno se pueden insertar en el extremo N-terminal en la bisagra de la IgG4.
[0078] La invención proporciona secuencias de ácido nucleico donde el CAR es específico para CD19 y CD20. Las secuencias que codifican CARs biespecíficos anti-CD19xCD20 de la divulgación se exponen en las figuras 3, 8, 10, 4, 9 y 11. En estas figuras, el CAR biespecífico comprende scFvs específicos para CD19 y CD20 con cada scFv separado por un conector, unido a un dominio separador extracelular, que está unido a los dominios coestimulador y de señalización intracelular mediante un dominio transmembrana. Aunque los CARs representan un conjunto de secuencias de scFv, se puede usar cualquier scFv específico de CD19 y CD20. En una forma de realización particular de la invención, el CAR biespecífico específico de CD19 y CD20 es CD19scFv-Gly4Serconector-CD20scFv-IgG4-Bisagra-CD28tm-41 BB(cito)-zeta(cito) y está codificado por las secuencias expuestas en las figuras 3 y 4 (SEQ IDs 1 y 3, respectivamente). Este CAR biespecífico comprende fragmentos Fv monocatenarios específicos para CD19 y CD20 enlazados por un conector Gly4Ser, un dominio separador extracelular bisagra de la IgG4, un dominio transmembrana de CD28, un dominio coestimulador de 41BB y el dominio citoplásmico de la cadena zeta de CD3.
[0079] En otra divulgación, el CAR biespecífico específico de CD19 y CD20 comprende CD19scFv-Gly4serconector-CD20scFv-hulgG4-bisagraCH2CH3-CD28tm/cito-41BB-zeta (figuras 8-9). Este CAR biespecífico comprende fragmentos Fv monocatenarios específicos para CD19 y CD20 enlazados por un conector Gly4Ser, una bisagra de la IgG4 humana, dominio separador extracelular CH2 y CH3, un dominio transmembrana de CD28, un dominio coestimulador de 4-1BB y el dominio citoplásmico de la cadena zeta de CD3.
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[0080] En otra forma de realización de la invención, el CAR biespecífico específico de CD19 y CD20 es CD19-Gly4serconector-CD20scFv-CD8abisagra-CD8aTM-41BBcoestim-zetac¡to (figuras 10-11; SEQ IDs 10 y 12, respectivamente). Este CAR biespecífico comprende fragmentos Fv monocatenarios específicos para CD19 y CD20 enlazados por un conector Gly4Ser, un dominio separador extracelular bisagra de CD8alfa, un dominio transmembrana de CD8alfa, un dominio coestimulador de 41BB y el dominio citoplásmico de la cadena zeta de CD3.
[0081] Las secuencias de aminoácidos y ácido nucleico de productos de la invención se muestran en las figuras 3 (SEQ ID 1), 4 (SEQ ID 3), 10 (SEQ ID 10) y 11 (SEQ ID 12).
Receptor de factor de crecimiento epidérmico truncado (EGFRt)
[0082] El receptor de factor de crecimiento epidérmico humano (huEGFR) (EGFR; ErbB-1, HER1 en seres humanos) es un receptor tirosina quinasa de la familia ErbB de receptores de factores de crecimiento que no es expresado por las células de los sistemas hematopoyético y linfopoyético. La unión de ligandos (EGF, TGF-a) ocurre en los dominios extracelulares N-terminales I y II del EGFR resultante de la transición de los monómeros inactivos del receptor tirosina quinasa a homodímeros activos.
[0083] El dominio extracelular III del EGFR contiene los sitios de unión de anticuerpos (por ejemplo, cetuximab (Erbitux), un anticuerpo quimérico de IgG1). Se cree que el EGFR humano se puede volver incapaz de unir ligandos (eGf , TGF-a) por eliminación de los dominios I y II y desprovisto de actividad de señalización por deleción de su cola citoplásmica, a la vez que retiene un sitio de unión a anticuerpos intacto (por ejemplo, sitio de unión a cetuximab), por ejemplo en el dominio extracelular III, IV o una combinación de los mismos (Wang et al., A transgene-encoded cell surface polypeptide for selection, in vivo tracking, and ablation of engineered cells Blood 118(5): 1255-1263).
[0084] Un polipéptido de EGFRt truncado descrito aquí tiene al menos tres usos para ingeniería genética de terapias celulares: purificación celular ex vivo, seguimiento celular in vivo y ablación celular. El EGFRt, para el uso como un control terapéutico con CARs, se une opcionalmente a cualquiera de uno o más de entre ARNip específico de EGFR, una molécula pequeña que reconoce EGFR, un anticuerpo anti-EGFR o una combinación de los mismos. En otra divulgación, el EGFRt comprende la secuencia expuesta en las figuras 12 o 13 o secuencias que son aproximadamente un 70%, aproximadamente un 75%, aproximadamente un 80%, aproximadamente un 85%, aproximadamente un 90% o aproximadamente un 95% homólogas a las secuencias expuestas en las figuras 12 o 13.
[0085] El huEGFRt puede estar coexpresado con CARs para purificar células que expresan los CARs (por ejemplo, purificación celular ex vivo), seguir células (por ejemplo, seguimiento de células in vitro o in vivo) que expresan los CARs o regular células (por ejemplo, in vivo o in vitro o ex vivo) que expresan los CARs activando la ablación celular según sea necesario.
Receptor de citocinas quimérico (CCR)
[0086] Basándose en las limitaciones de usar citocinas yc exógenas en la inmunoterapia adoptiva, la invención proporciona células T con un mecanismo de señalización de citocinas yc intrínseco. La utilidad de las señales de los receptores de citocinas quiméricos constitutivos forzados IL-2/IL-15RP (CyCR2) y el receptor IL-7Ra (CyCR7) se compararon. Como se describe a continuación, los receptores de citocinas quiméricos tienen la capacidad para mejorar la supervivencia, la persistencia y el injerto in(vivo de células T citotóxicas (CTLs).
[0087] Por consiguiente, los CARs de la divulgación pueden estar coexpresados con CCR. Por ejemplo, un CAR biespecífico puede estar coexpresado con EGFRt y CCR. Alternativamente, un CAR biespecífico puede estar coexpresado con CCR. Los ejemplos de receptor de citocinas quimérico incluyen, pero de forma no limitativa, citocina IL-7-conector- IL7Ra, citocina IL-7-conector-dominio extracelular de IL-7Ra- dominio transmembrana de IL-7Ra-dominio citoplásmico de IE-2PP, citocina IL-7-conector-IL2Rp.
[0088] Un CCR que comprende citocina IL-7-conector- IL7Ra comprende una secuencia señal N-terminal unida al extremo N-terminal de la citocina IL-7 que está enlazada mediante un conector a los dominios extracelular, transmembrana y citoplásmico del IL-7Ra (la cadena alfa del receptor de IL-7).
[0089] Un CCR que comprende citocina IL-7-conector-dominio extracelular de IL-7Ra-dominio transmembrana de IL-7Ra-dominio citoplásmico de IL-2RP comprende una secuencia señal N-terminal unida al extremo N-terminal de la
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citocina IL-7 que está enlazada mediante un conector al dominio extracelular y el dominio transmembrana del IL-7Ra y al dominio citoplásmico del IL-2RP (la cadena beta del receptor de IL-2).
[0090] Un CCR que comprende citocina IL-7-conector-IL2Rk comprende una secuencia señal N-terminal unida al extremo N-terminal de la citocina IL-7 que está enlazada mediante un conector a los dominios extracelular, transmembrana y citoplásmico del IL-2Rp.
Receptor de dihidroxifolato (DHFR)
[0091] La modificación genética de células T para coexpresar un transgén terapéutico y un transgén resistente a fármacos que confiera resistencia a fármacos linfotóxicos proporciona la oportunidad de seleccionar células terapéuticas tanto in vivo como ex vivo. Un transgén de enzima humana mutado, mutante doble de la dihidrofolato reductasa (DHFRFS; L22F, F31S), que confiere resistencia de las células T diseñadas al metotrexato (MTX), lo que permite la selección de células que coexpresan un receptor de antígenos quimérico específico de CD19 (CD19CAR) que específicamente reconoce células tumorales del linaje B.
[0092] Los CARs de la divulgación (por ejemplo, CARs biespecíficos) pueden estar coexpresados con DHFR (por ejemplo, DHFR mutante). Además, un CAR biespecífico puede estar coexpresado con EGFRt, CCR y DHFR (incluido DHFR mutante). Alternativamente, un CAR biespecífico puede estar coexpresado con EGFRt y DHFR (incluido DHFR mutante).
[0093] Otros marcadores de selección que se pueden usar con CARs incluyen, pero de forma no limitativa, ADN metilado-proteína-cisteína metiltransferasa (MDMT), inosina monofosfato deshidrogenasa II (IMPDH2) o una combinación de las mismas. La MDMT hace a las células resistentes a la quimioterapia y por lo tanto se puede usar si se desea una sinergia entre la quimioterapia y la terapia con células T.
[0094] Los vectores que codifican CARs de la divulgación también se proporcionan aquí. Los vectores que codifican CARs también codifican EGFRt. Opcionalmente, los vectores que codifican CARs y EGFRt también codifican CCR o DHFR (por ejemplo, DHFR mutante). Opcionalmente, los vectores que codifican CARs y EGFRt también codifican CCD y DHFR (por ejemplo, DHFR mutante). Opcionalmente, los vectores pueden codificar un CAR biespecífico y EGFRt, un CAR biespecífico y EGFRt y CCR, un CAR biespecífico y EGFRt y DHFR (por ejemplo, DHFR mutante) o un CAR biespecífico y EGFRt y CCR y DHFR (por ejemplo, DHFR mutante). Los vectores que se pueden usar para expresar CARs incluyen, pero de forma no limitativa, vectores de lentivirus, vectores de gamma retrovirus, vectores de virus espumoso, vectores de AAV, vectores de adenovirus, virus híbridos diseñados, ADN desnudo (incluidos, pero de forma no limitativa, vectores mediados por transposones, tales como Bella durmiente, Piggybak, e integrasas tal como Phi31.
[0095] Vectores de la invención se describen en las reivindicaciones. En una forma de realización ejemplar de la invención, el CAR biespecífico específico para CD19 y CD20 descrito aquí es expresado mediante un vector lentiviral como se ilustra en la figura 5.
Células genéticamente modificadas de la invención
[0096] La divulgación proporciona también células genéticamente modificadas que comprenden y expresan de forma estable CARs. Un CAR expresado por una célula genéticamente modificada puede comprender al menos dos regiones de reconocimiento específico de antígeno, un dominio extracelular, un dominio transmembrana, uno o más dominios coestimuladores y un dominio de señalización intracelular. La secuencia polinucleotídica que codifica el CAR también puede comprender una secuencia señal N-terminal. En una divulgación, el CAR es un CAR biespecífico. Cada uno de los al menos dos regiones de reconocimiento específico de antígeno, dominio separador extracelular, dominio transmembrana, uno o más dominios coestimuladores y un dominio de señalización intracelular se describen arriba. Los dominios de reconocimiento específico de antígeno pueden ser capaces de unirse específicamente, de una manera no restringida por el MHC, a un antígeno que normalmente no se une a un receptor de células T de esa manera.
[0097] En una divulgación, las células genéticamente modificadas que expresan CARs (por ejemplo, CARs biespecíficos) coexpresan EGFRt. Además, las células genéticamente modificadas que expresan CARs (por ejemplo, CARs biespecíficos) pueden coexpresar EGFRt y CCR. Las células genéticamente modificadas que expresan CARs (por ejemplo, CARs biespecíficos) pueden coexpresar opcionalmente EGFRt y DHFR (por ejemplo, DHFR mutante).
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Las células genéticamente modificadas que expresan CARs (por ejemplo, CARs biespecíficos) pueden coexpresar opcionalmente EGFRt, CCR y DHFR (por ejemplo, DHFR mutante).
[0098] Las células genéticamente modificadas expresan un CAR que tiene al menos dos regiones de reconocimiento específico de antígeno que son específicas para al menos dos antígenos diana diferentes. En una divulgación, las regiones de reconocimiento específico de antígeno comprenden anticuerpos específicos de diana o equivalentes funcionales o fragmentos o derivados de los mismos. El anticuerpo específico de antígeno puede ser el fragmento Fab del anticuerpo o el fragmento variable monocatenario (scFv) del anticuerpo.
[0099] Las células genéticamente modificadas que pueden comprender y expresar CARs incluyen, pero de forma no limitativa, linfocitos T (células T), células T vírgenes (Tn), células T de memoria (por ejemplo, células T de memoria central (Tcm), células de memoria efectora (T em)), células asesinas naturales, células madre hematopoyéticas y/o células madre embrionarias/pluripotentes inducidas capaces de dar lugar a una progenie terapéuticamente pertinente. Opcionalmente, las células genéticamente modificadas son células autólogas. A modo de ejemplo, las células T individuales de la invención pueden ser CD4+/CD8-, CD4-/CD8+, CD4-/CD8- o CD4+/CD8+. Las células T pueden ser una población mixta de células CD4+/CD8- y CD4-/CD8+ o una población de un único clon. Las células T CD4+ de la invención pueden producir IL-2, IFNy, TNFa y otras citocinas de células T efectoras cuando se cocultivan in vitro con células que expresan los antígenos diana (por ejemplo, células tumorales CD20+ y/o CD19+). Las células T CD8~ de la invención pueden lisar células diana específicas de antígeno cuando se cocultivan in vitro con las células diana. En algunas formas de realización, las células T pueden ser cualquiera de una o más de entre células vírgenes CD45RA~ CD62L+, células de memoria central CD45r O~ CD62L+, células de memoria efectora CD62L- o una combinación de las mismas (Berger et al., Adoptive transfer of virus-specific and tumor-specific T cell immunity. Curr Opin Immunol 2009 21(2): 224-232)).
[0100] Las células T de la invención se describen en las reivindicaciones.
[0101] Las células modificadas genéticamente se pueden producir mediante transfección estable de células con ADN que codifica un CAR de la divulgación. El ADN que codifica un CAR (por ejemplo, CAR biespecífico) también puede codificar EGFRt, CCR y/o DHFR (por ejemplo, DHFR mutante). Opcionalmente, un primer polinucleótido codifica el CAR (por ejemplo, CAR biespecífico) y está enlazado, mediante secuencias IRES o un polinucleótido que codifica un conector escindible, a un segundo polinucleótido que codifica EGFRt. Opcionalmente, el primer polinucleótido codifica el CAR (por ejemplo, CAR biespecífico) y está enlazado, mediante secuencias IRES o un polinucleótido que codifica un conector escindible, a un segundo polinucleótido que codifica EGFRt y los polinucleótidos primero o segundo están enlazados a un tercer polinucleótido que codifica CCR o DHFR (por ejemplo, DHFR mutante), también mediante secuencias IRES o un polinucleótido que codifica un conector escindible. Opcionalmente, el primer polinucleótido codifica el CAR (por ejemplo, CAR biespecífico) y está enlazado, mediante secuencias IRES o un polinucleótido que codifica un conector escindible, a un segundo polinucleótido que codifica EGFRt y los polinucleótidos primero y segundo están enlazados a un tercer polinucleótido que codifica CCR y un cuarto polinucleótido que codifica DHFR (por ejemplo, DHFR mutante) mediante secuencias IRES o un polinucleótido que codifica un conector escindible. Los vectores virales se usan comúnmente para llevar genes heterólogos al interior de las células (por ejemplo, células T). Los ejemplos de vectores virales que se pueden usar para generar células modificadas genéticamente incluyen, pero de forma no limitativa, vectores lentivirales SIN, vectores retrovirales, vectores de virus espumoso, vectores de virus adenoasociados (AAV) y/o transposones plasmídicos (por ejemplo, el sistema de transposón Bella durmiente).
[0102] Varios métodos producen transfectantes estables que expresan CARs de la divulgación. En un procedimiento, un método de transfección estable y de redirección de células es por electroporación usando ADN desnudo. Mediante el uso de ADN desnudo, el tiempo requerido para producir células redirigidas puede reducirse significativamente. Los métodos adicionales para modificar genéticamente células usando ADN desnudo que codifica un CAR incluyen, pero de forma no limitativa, métodos de transformación químicos (por ejemplo, usando fosfato cálcico, dendrímeros, liposomas y/o polímeros catiónicos), métodos de transformación no químicos (por ejemplo, electroporación, transformación óptica, electrotransferencia de genes y/o administración hidrodinámica) y/o métodos basados en partículas (por ejemplo, empalafección (impalefection), usando una pistola génica y/o magnetofección). Las células transfectadas que demuestran la presencia de un único vector sin reorganizar integrado y la expresión del CAR se pueden expandir ex vivo. Opcionalmente, las células seleccionadas para la expansión ex vivo son Cd8~ y demuestra la capacidad de reconocer y lisar específicamente células diana específicas de antígeno.
[0103] También se pueden usar métodos de transducción viral para generar células redirigidas que expresan CARs. Los tipos celulares que se pueden usar para generar células modificadas genéticamente que expresan un CAR biespecífico incluyen, pero de forma no limitativa, linfocitos T (células T), células asesinas naturales, células madre
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hematopoyéticas y/o células madre embrionarias/pluripotentes inducidas capaces de dar lugar a una progenie terapéuticamente pertinente.
[0104] La estimulación de las células T por un antígeno bajo condiciones apropiadas resulta en la proliferación (expansión) de las células y/o la producción de IL-2. Las células que comprenden un CAR se expandirán en número en respuesta a la unión de uno o más antígenos a las regiones de reconocimiento específico de antígeno del CAR. La divulgación proporciona también un método de producción y expansión de células que expresan un CAR. El método comprende la transfección o la transducción de las células con el vector que expresa el CAR y la estimulación de las células con células que expresan los antígenos diana, antígenos diana recombinantes o un anticuerpo para el receptor para hacer que las células proliferen, para producir y expandir células T. Opcionalmente, las células pueden ser cualquiera de uno o más de entre linfocitos T (células T), células asesinas naturales (NK), células madre hematopoyéticas (HSCs) o células madre embrionarias/pluripotentes inducidas capaces de dar lugar a una progenie terapéuticamente pertinente.
[0105] Las células genéticamente modificadas de la invención expresan un CAR biespecífico que es específico de los antígenos CD19 y CD20. En otra divulgación, una célula T genéticamente modificada expresa los CARs biespecíficos CD19scFv-Gly4ser-conector-CD20scFv-hulgG4-bisagra-CD28-41BB(cito)-zeta(cito) o CD19scFv-Gly4ser-conector-CD20scFv-hulgG4-bisagraCH2CH3-CD28tm/cito-zeta o CD19-Gly4serconector-CD20scFv-CD8alfabisagra-CD8alfaTM-41BBcoestim-zeta-cito.
[0106] La divulgación proporciona un método de producción y expansión de células T que expresan un CAR específico de CD19 y específico de CD20. El método comprende usar un lentivirus para transducir células T de memoria central (tales como células T de sangre periférica) purificadas estimuladas con esferas CD3xCD28 con el vector que expresa el CAR biespecífico de CD19 y CD20, cultivando las células T en presencia de rhuIL-2 y/o IL-15 y volviendo a estimular las células T con células CD19~ y CD20~, CD19 y CD20 recombinantes o un anticuerpo para el receptor para hacer que las células T proliferen, para producir y expandir células T específicas de CD19 y específicas de CD20.
Métodos terapéuticos de la invención
[0107] Los CARs de la divulgación se pueden usar para superar fracasos terapéuticos que surgen de variantes de escape por pérdida de antígenos, para reducir la resistencia a terapias existentes y/o para tratar enfermedades asociadas a los antígenos reconocidos por los CARs.
[0108] Por consiguiente, la divulgación proporciona también métodos para tratar una enfermedad asociada al antígeno reconocido por un CAR en un sujeto que lo necesite. El método comprende proporcionar una composición que comprende un CAR y administrar una cantidad eficaz de la composición para tratar la enfermedad asociada al antígeno en el sujeto.
[0109] La divulgación proporciona también métodos para superar fracasos terapéuticos que surgen de variantes de escape por pérdida de antígenos en estados patológicos (por ejemplo, enfermedades de las células B) en sujetos que lo necesiten. El método comprende proporcionar una composición que comprende el CAR de la invención y administrar una cantidad eficaz de la composición para tratar la enfermedad asociada al antígeno en el sujeto.
[0110] En algunas divulgaciones, la composición comprende un polinucleótido que codifica el CAR, una proteína que comprende el CAR o células modificadas genéticamente que comprenden el CAR. Opcionalmente, las células modificadas genéticamente de la composición son linfocitos T (células T), células T vírgenes (TN), células T de memoria (por ejemplo, células T de memoria central (Tcm), células de memoria efectora (Tem)), células asesinas naturales (NK), células madre hematopoyéticas (HSCs) o células madre embrionarias/pluripotentes inducidas capaces de dar lugar a una progenie terapéuticamente pertinente, que expresan el CAR. Las composiciones se pueden administrar solas o conjuntamente con terapias existentes. Si otras terapias se usan conjuntamente, las composiciones se pueden administrar al mismo tiempo o consecutivamente con las otras terapias existentes.
Composiciones farmacéuticas
[0111] La presente descripción proporciona composiciones farmacéuticas que comprenden un excipiente farmacéuticamente aceptable y una cantidad terapéuticamente eficaz de un CAR (por ejemplo, un CAR biespecífico). El CAR en la composición puede ser cualquiera de uno o más de entre un polinucleótido que codifica el CAR, una
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proteína que comprende el CAR o células modificadas genéticamente que comprenden el CAR. La composición puede comprender además polinucleótidos que codifican EGFRt, CCR y/o DHFR (por ejemplo, DHFR mutante), proteínas coexpresadas con el Ca r incluidas EGFRt, CCR y/o DHFR o células modificadas genéticamente que expresan el CAR y coexpresan EGFRt, CCR y/o DHFR. "Excipiente farmacéuticamente aceptable" significa un excipiente que es útil en la preparación de una composición farmacéutica que sea segura generalmente, no tóxica y deseable, e incluye excipientes que son aceptables para uso veterinario al igual que para uso farmacéutico humano. Tales excipientes pueden ser sólidos, líquidos, semisólidos o, en el caso de una composición en aerosol, gaseosos. La invención proporciona composiciones farmacéuticas según las reivindicaciones 6 y 7.
[0112] En varias formas de realización, las composiciones farmacéuticas según la invención se pueden formular para la administración por cualquier vía de administración. "Vía de administración" puede referirse a cualquier vía de administración conocida en la técnica, incluidas, pero de forma no limitativa, aerosol, nasal, oral, intravenosa, intramuscular, intraperitoneal, inhalación, transmucosa, transdérmica, parenteral, bomba implantable, infusión continua, aplicación tópica, cápsulas y/o inyecciones.
[0113] Las composiciones farmacéuticas según la invención pueden contener también cualquier portador farmacéuticamente aceptable. "Portador farmacéuticamente aceptable" como se utiliza en este caso se refiere a un material, composición o vehículo farmacéuticamente aceptable que está implicado en llevar o transportar un compuesto de interés de un tejido, órgano o parte del cuerpo a otro tejido, órgano o parte del cuerpo. Por ejemplo, el portador puede ser un relleno, diluyente, excipiente, solvente o material de encapsulación líquidos o sólidos, o una combinación de los mismos. Cada componente del portador debe ser "farmacéuticamente aceptable" en el sentido de que debe ser compatible con los otros constituyentes de la formulación. También debe ser adecuado para usar en contacto con cualquier tejido u órgano con los que pueda entrar en contacto, lo que significa que no debe suponer un riesgo de toxicidad, irritación, respuesta alérgica, inmunogenicidad o cualquier otra complicación que sobrepase en exceso sus beneficios terapéuticos.
[0114] Las composiciones farmacéuticas según la invención pueden también encapsularse, comprimirse o prepararse en una emulsión o jarabe para la administración oral. Se pueden añadir portadores sólidos o líquidos farmacéuticamente aceptables para mejorar o estabilizar la composición, o para facilitar la preparación de la composición. Los portadores líquidos incluyen jarabe, aceite de cacahuete, aceite de oliva, glicerina, solución salina, alcoholes y agua. Los portadores sólidos incluyen almidón, lactosa, sulfato de calcio, dihidrato, terra alba, estearato de magnesio o ácido esteárico, talco, pectina, acacia, agar o gelatina. El portador también puede incluir un material de liberación prolongada tal como monoestearato de glicerilo o diestearato de glicerilo, solo o con una cera.
[0115] Los productos farmacéuticos se preparan siguiendo las técnicas convencionales de farmacia que implican molienda, mezclado, granulación y compresión, cuando sea necesario, para las formas en comprimidos; o molienda, mezclado y relleno para las formas en cápsulas de gelatina dura. Cuando se usa un portador líquido, la preparación será en forma de jarabe, elixir, emulsión o una suspensión acuosa o no acuosa. Tal formulación líquida se puede administrar directamente por vía oral o introducir en una cápsula de gelatina blanda.
[0116] Las composiciones farmacéuticas según la invención se pueden administrar en una cantidad terapéuticamente eficaz. La cantidad terapéuticamente eficaz precisa es la cantidad de la composición que producirá los resultados más eficaces en cuanto a eficacia de tratamiento en un sujeto dado. Esta cantidad variará dependiendo de una variedad de factores, incluidos, pero de forma no limitativa, las características del compuesto terapéutico (incluidas actividad, farmacocinética, farmacodinamia y biodisponibilidad), la condición fisiológica del sujeto (incluidos la edad, el sexo, el tipo y la fase de la enfermedad, la condición física general, la receptividad a una dosificación dada y el tipo de medicación), la naturaleza del portador o los portadores farmacéuticamente aceptables en la formulación y la vía de administración. Una persona experta en las técnicas clínicas y farmacológicas será capaz de determinar una cantidad terapéuticamente eficaz a través de experimentación rutinaria, por ejemplo, controlando la respuesta de un sujeto a la administración de un compuesto y ajustando la dosificación en consecuencia. Para una guía adicional, véase Remington: The Science and Practice of Pharmacy (Gennaro ed., 20a edición, Williams & Wilkins PA, EE.UU.) (2000).
EJEMPLOS
[0117] Los ejemplos siguientes se proporcionan para ilustrar mejor la invención reivindicada y no deben interpretarse como limitantes del alcance de la invención. En la medida en que se mencionan materiales específicos, es meramente para fines de ilustración y no están destinados a limitar la invención. Una persona experta en la materia puede
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desarrollar medios o reactivos equivalentes sin el ejercicio de capacidad inventiva y sin apartarse del alcance de la invención.
Ejemplo 1
[0118] La figura 1 es una representación esquemática de un receptor de antígenos quimérico biespecífico. La figura 2 representa los componentes de un CAR biespecífico anti-CD19xanti-CD20 biespecífico. La figura 2 representa también una representación esquemática del ADNc completo empaquetado en un plásmido de transferencia del vector de lentivirus epHIV-7. Las figuras 3 y 4 muestran las secuencias de ácido nucleico y de aminoácidos de productos de la invención, es decir, GMCsFss-CD19scFv-Gly4Serlconector-CD20scFv-IgG4Bisagra-CD28tm-41 BBzeta-T2A-EGFRt_epHIV7.
Ejemplo 2
[0119] La figura 5 es una representación esquemática que muestra la construcción de vector de un CAR ejemplar, es decir, la construcción transgénica CD19scFv-CD20scFv-IgG4-CD28tm-CD28coestim-CD3zeta. El transgén CD19scFv-CD20scFv-IgG4-CD28tmCD28coestim-CD3zeta se ensambló usando el método de ensamblaje de ADN isotérmico de un solo paso previamente descrito por Gibson et. Al. (Enzymatic assembly of DNA molecules upto several hindred kilobases. Nature Methods. 2009; 6: 343-345). Los dominios Vl y Vh de la construcción de scFv de CD19 se secuenciaron a partir de un transgén CD19CAR-CD28-Zeta previamente descrito (Schmitz N, Dreger P, Glass B, Sureda A. Allogeneic transplantation in lymphoma: current status. Haematologica. 2007; 92(11): 1533-1548) a través de una reacción en cadena de la polimerasa (PCR). Los dominios VH y VL del scFv de CD20 se ensamblaron por reacción en cadena de la polimerasa con empalme por solapamiento usando un transgén CD20R-CD28-Zeta previamente descrito (Michael Jensen et al., CD20 is a molecular target for scFvFc:zeta receptor redirected T-cells: implications for cellular immunotherapy of CD20+ malignancy. Biology of Blood and Marrow Transplant. 1998; 4: 75-83). Los dominios Vh y Vl del scFv de CD19 y del scFv de CD20 se enlazaron con un péptido conector de 18 residuos tal y como se ha descrito anteriormente. El dominio IgG4-CD28tm-CD28coestim se secuenció usando el transgén CD19R-CD28-CD3zeta por PCR. El vector lentiviral de destino CD3zeta-T2A-EGFRt_epHIV7 se preparó por digestión de restricción con NheI y RsrII de la porción CD19R-CD28 de un plásmido CD19R-CD28-Zeta-T2A-EGFRt_epHIV7 previamente descrito (Seitaro Terakura et al., Generation of CD19-CAR modified CD8+ T-cells derived from virus-specific central memory T-cells. Blood. Oct. 26, 2011). La construcción final CD19scFv-CD20scFv-IgG4-CD28tm-CD28coestim-CD3zeta se ensambló por el método de ensamblaje de ADN isotérmico de un solo paso de Gibson usando el vector de destino digerido por restricción Zeta-epHIV7 y los fragmentos de ADN CD19scFv, CD20scFv e IgG4-CD28tm-CD28coestim con cebadores para cada uno con un solapamiento de 30 pb en el extremo 5'.
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Ejemplo 3
[0120] Se transfectaron células HEK 293T con el plásmido de transferencia anti-CD19xCD20CAR-T2A-EGFRt epHIV-7 o con el plásmido de transferencia anti-CD20xCD19CAR-T2A-EGFRt epHIV-7. Las células transfectadas se tiñeron con anticuerpos anti-Fc biotinilados y estreptavidina PE (SA-PE) y luego se sometieron a un análisis por citometría de flujo para la detección de la expresión de los dos CARs anteriores. Tanto el CAR anti-CD19xCD20 como el CAR anti-CD20xCD19 se expresaron en células HEK 293T transfectadas.
[0121] El plásmido de transferencia epHIV-7 coexpresó EGFRt con los dos CARs biespecíficos anteriores. La coexpresión de EGFRt fue detectada en las mismas células transfectadas usando una combinación de tinción de anticuerpos anti-EGFR biotinilados/SA-PE y análisis por citometría de flujo.
Ejemplo 4
[0122] Las células T primarias humanas derivadas de sangre periférica fueron activadas con OKT3 y luego fueron transducidas mediante lentivirus con CAR anti-CD19 monoespecífico, CAR anti-CD20 monoespecífico o vector de lentivirus epHIV7 anti-CD19xCD20CAR-T2A-EGFRt biespecífico. El vector de lentivirus epHIV7 también codificó EGFRt junto con Ca r anti-CD19 monoespecífico, CAR anti-CD20 monoespecífico o anti-CD19xCD20 biespecífico. Así, las células que expresaban los CARs coexpresaron EGFRt. Las células transfectadas se tiñeron con anticuerpos anti-EGFR biotinilados y SA-PE y luego se sometieron a análisis por citometría de flujo para la detección de la expresión de EGFRt y la coexpresión de CARs monoespecíficos o biespecíficos. De las células transfectadas con CAR anti-CD19 monoespecífico, el 51% expresó EGFRt; de las células transfectadas con CAR anti-CD20 monoespecífico, el 38,5% expresó EGFRt; de las células transfectadas con el CAR anti-CD19xCD20 biespecífico, el 63,8% expresó EGFRt.
[0123] El complejo receptor de células T (TCR) en células transfectadas también se detectó en las mismas células transfectadas usando tinción con anticuerpos anti-TCRa y anti-TCRk conjugados con FITC y análisis por citometría de flujo.
Ejemplo 5
[0124] Se modificaron genéticamente células H9 para expresar CD19 o CD20 o tanto CD19 como CD20. Las células se tiñeron con anticuerpos anti-CD19 y anti-CD20 y luego se sometieron a análisis por citometría de flujo para detectar la expresión de CD19 y CD20. El análisis citométrico confirmó el perfil de expresión deseado de las células H9 CD19+CD20‘, CD19Cd 20~ y CD19+CD20+, es decir, las células H9 genéticamente modificadas expresaron CD19 o CD20 o tanto CD19 como CD20 simulando así células diana cancerosas, que contienen variantes de escape por pérdida de antígenos negativas para los antígenos. Como se describe posteriormente, estas líneas celulares se usaron posteriormente como células diana para estimular líneas de células T que expresan CARs, que actúan como células efectoras para matar las células diana.
[0125] Además, los niveles de expresión endógena de CD19 y CD20 en las líneas celulares SUP-B15 y DHL-6 se analizaron utilizando tinción con APC anti-CD19 y PE anti-CD20 y análisis por citometría de flujo. La línea celular SUP-B15 expresó un nivel alto de CD19 con un nivel bajo de CD20 (por tanto, CD19~CD20), y la línea celular DHL-16 expresó un nivel alto de CD20 con un nivel bajo de CD19 (por tanto, CD19CD20~).
Ejemplo 6
[0126] Un ensayo de liberación de cromo de 4 horas se usó para medir la lisis de las células diana por las células efectoras. Las células efectoras son células T humanas primarias transducidas mediante lentivirus para expresar CAR anti-CD19 monoespecífico, CAR anti-CD20 monoespecífico o CAR anti-CD19xCD20 biespecífico. Las células T efectoras con CAR anti-CD19xCD20 biespecífico lisaron eficazmente todas las células diana CD19+CD20‘, CD19CD20~ y CD19+CD20+, que incluyen las células H9 CD19+CD20‘, las células H9 CD19CD20~, las células H9 CD19+CD20+ y
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las células SUP-B15. Con proporciones efectoras a dianas de 1:1, 3:1, 10:1 y 30:1, fueron Usadas aproximadamente un 25%, un 45%, un 50% y un 60%, respectivamente, de células diana.
[0127] En cambio, las líneas de células T que expresan un CAR monoespecífico no consiguen lisar variantes de escape por pérdida de antígenos negativas para los antígenos, que escaparon de las células efectoras con CAR monoespecífico. Las células T efectoras con CAR anti-CD19 no consiguieron lisar las dianas CD19CD20+ y las células T efectoras con CAR anti-CD20 no consiguieron lisar las dianas CD19~CD20-.
Ejemplo 7
[0128] Las células T enriquecidas en CD4 que expresan CAR biespecífico fueron activadas para la secreción de citocinas (interferón gamma (IFN-g, IFN-y)) tras la estimulación con células diana CD19~CD20-, CD19 CD20~ y CD19+CD20+, que incluyen las células H9 CD19~CD20-, las células H9 CD19 CD20~, las células H9 CD19+CD20+ y las células SUP-B15. El contenido de IFN-y se midió por matriz de esferas de citocinas de los sobrenadantes de cultivos de células T y células diana después de 24 horas de cocultivo. Las células T enriquecidas en CD4 que expresan CAR biespecífico activadas secretaron al menos 2500 pg/ml de INF-g tras la estimulación con cada tipo de células diana. En cambio, las líneas de células T que expresan CAR monoespecífico no se activaron para la secreción de la citocina INF-g tras la estimulación con variantes de escape por pérdida de antígenos negativas para los antígenos, que escaparon de las células efectoras con CAR monoespecífico. Las células T CAR CD19 no consiguieron segregar IFN-y tras el cocultivo con células diana CD19CD20~, y las células T CAR CD20 no consiguieron segregar IFN-y tras el cocultivo con células diana CD19+CD20-.
Ensayo de estimulación in vitro
[0129]
• Estimuladores (3x10A5):
- TM-LCL - progenitor H9
- OKT3-TM-LCL - H9 CD19R
- SUP-B15 - H9 CD20R
- DHL-6 • - H9 CD19/20R
• Elementos que responden (1x10A6 en S1R2D17):
- simulación enriquecida en CD4 - simulación enriquecida en CD8
- CD19R enriquecido en CD4 - CD19R enriquecido en CD8
- CD20R enriquecido en CD4 - CD20R enriquecido en CD4
- CD19/20R enriquecido en CD4 - CD19/20R enriquecido en CD8
• Células incubadas durante 24 h y sobrenadante sin células se recogerán hoy para un ensayo BioPlex
Ejemplo 8
[0130] El ejemplo siguiente describe un receptor de antígenos quimérico específico de CD19 enlazado a un receptor de factor de crecimiento epidérmico truncado (EGFRt) mediante una secuencia T2A. El EGFRt se puede enlazar a y coexpresarse con otros receptores de antígenos quiméricos, por ejemplo, receptores de antígenos quiméricos biespecíficos.
[0131] Los solicitantes demostraron la utilidad de tal EGFR truncado (huEGFRt) expresado por células T transducidas para la purificación inmunomagnética usando cetuximab biotinilado, el seguimiento celular por citometría de flujo e inmunohistoquímica y la ablación celular in vivo después de la administración sistémica de cetuximab. En esta forma
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de realización ejemplar, el dominio I y el II del EGFRt se han eliminado, mientras que los dominios III y IV se han retenido.
[0132] La construcción lentiviral CD19CAR-T2A-EGFRt-epHIV7 contiene: (1) la secuencia de receptor de antígenos quimérico (CAR) que consiste en los segmentos génicos Vh y Vl del anticuerpo monoclonal (mAb) FMC63 específico de CD19, una bisagra-CH2-CH3 de la IgG4, los dominios transmembrana y citoplásmico de señalización de la molécula coestimuladora CD28 y el dominio citoplásmico de la cadena CD3U (Kowolik CK. et al., CD28 costimuation provided through a CD19-specific chimeric antigen receptor enhances in vivo persistence and antitumor efficacy of adoptively transferred T cells. Cancer Res. 2006, 66(22): 10995-11004; (2) la secuencia T2A autoescindible (Szymczak AL. et al., Correction of multi-gene deficiency in vivo using a "self-cleaving" 2A peptide-based retroviral vector. Nat Biotechnol 2004; 22(5): 589-594); y (3) la secuencia de EGFR truncado indicada.
Enriquecimiento inmunomagnético de células T humanas huEGFRt* después de la transducción lentiviral
[0133] El cetuximab biotinilado se usó o para la selección inmunomagnética o la selección FACS de células las huEGFRt* . Los solicitantes usaron cetuximab biotinilado conjuntamente con microesferas antibiotina disponibles comercialmente para la selección inmunomagnética de las células T humanas transducidas con un lentivirus autoinactivante que dirige la coexpresión de CD19CAR y huEGFRt.
[0134] Se estimularon subconjuntos de PBMCs o células T purificadas de memoria central (CD45RO+CD62L+ Tcm) o de memoria efectora (CD45RO+CD62L+ Tem) con esferas anti-CD3/anti-CD28 y luego se transdujeron con un vector lentiviral para generar un panel de líneas de células T humanas primarias, de las cuales 2,6%-40% expresaron huEGFRt y CAR. Las células no seleccionadas fueron marcadas con cetuximab biotinilado y microesferas anti-biotina; y luego fueron separadas para obtener de manera consistente una población celular seleccionada, de la cual un 90% expresa huEGFRt y CAR.
[0135] Las células T no seleccionadas y la fracción seleccionada se tiñeron con cetuximab biotinilado y o estreptavidina conjugada con PE o Ab anti-biotina conjugado con PE, y luego se sometieron a un análisis por citometría de flujo. La selección de células CD19CAR+EGFRt+ se realizó o 3 días después de la transducción de blastos OKT3 (enriquecidos del 38% al 98%), o después de 1 ciclo rápido de expansión de células derivadas de CD62LCD45RO* de memoria efectora transducidas (enriquecidas del 20% al 96%), después de 3 ciclos rápidos de expansión de células derivadas de TCM específicas de CMVpp65 transducidas (enriquecidas del 12% al 91%) o después de 2 ciclos rápidos de expansión de células derivadas de CD8~TCM transducidas (enriquecidas del 3% al 97%). La selección de células CD19CAR+EGFRt+IMPDH2dm+ se realizó después de 1 ciclo rápido de expansión de células derivadas de TCM transducidas (enriquecidas del 25 al 92%).
[0136] Las construcciones CD19CAR-T2A-EGFRt-IMPDH2dm contenidas en vectores lentivirales incluyen porciones de secuencia con optimización de codones del CAR coestimulador de CD28 específico de CD19 (CD19Ca r ), seguido de la T2A autoescindible y los marcadores de selección huEGFRt e IMPDH2dm (un mutante doble del gen de la inosina monofosfato deshidrogenasa 2 que permite la supervivencia celular tras la adición de micofenolato 27), junto con las secuencias del promotor del factor de alargamiento 1 (EF-lp), las secuencias señal de la cadena alfa del receptor de GM-CSF (GMCSFRss) y el codón de parada de 3 nucleótidos.
[0137] Antes de la selección inmunomagnética, una ventaja proliferativa de las células huEGFRt' sobre las células huEGFRt* se observó en cultivos de células T transducidas no seleccionadas sometidas a la expansión mediada por OKT3. Sin embargo, después de la selección inmunomagnética, el nivel de expresión de huEGFRt y la frecuencia de las células que lo expresan permanecieron estables durante 3 ciclos consecutivos de 14 días de expansión basada en OKT314. El factor de expansión de las células EGFRt~ después de la selección inmunomagnética mejoró significativamente sobre el de las células huEGFRt* en los cultivos no seleccionados.
[0138] Estos datos demuestran que el huEGFRt puede servir como un marcador de superficie celular único para las células T humanas transducidas y permiten la posterior purificación inmunomagnética con cetuximab de poblaciones de células que expresan huEGFRt estables que también expresan CARs.
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Seguimiento de células T huEGFRt* adoptivamente transferidas usando citometría de flujo e inmunohistoquímica
[0139] Para probar la utilidad del huEGFRt para seguir el injerto de células T adoptivamente transferidas, los solicitantes recogieron sangre y muestras de médula ósea de ratones deficientes NOD/Sc/d IL-2RyC injertados con células T humanas CD19CAR+EGFRt+.
[0140] Primero, muestras de sangre periférica y células mononucleadas de médula ósea no fijadas se sometieron a análisis por citometría de flujo después de ser teñidas con cetuximab biotinilado y estreptavidina conjugada con PE. Aunque el nivel de injerto de células T CD45~ humanas (20%-25%) fue similar en animales administrados o con células T negativas o con células T positivas para EGFRt, la tinción doble para CD45 y EGFR humanos permitió la resolución de células T huEGFRt* (es decir, que expresan el transgén) humanas de sus homólogas negativas para huEGFRt.
[0141] Segundo, los solicitantes trataron de determinar si las muestras de tejido fijado incluido en parafina estándar eran susceptibles a la detección de infiltrados de células T huEGFRt* usando kits de diagnóstico específicos para EGFR. Los solicitantes realizaron análisis inmunohistoquímicos de fémures incluidos en parafina de ratones injertados y detectaron células huEGFRt* en la médula ósea. Estos datos sostienen la utilidad del huEGFRt para servir como un marcador de seguimiento para cuantificar la frecuencia y la distribución tisular de las células T adoptivamente transferidas.
La unión de cetuximab a huEGFRt sensibiliza las células T humanas a la ADCC
[0142] Una característica valiosa de un marcador de selección/seguimiento de superficie celular sería su capacidad para servir como un diana para la ablación celular /$ v/vo. Los solicitantes evaluaron la extensión a la que el Cetuximab unido a huEGFRt en células T activa la ADCC de células T huEGFRt* /$ v/tro y si la administración de Cetuximab podría atenuar el injerto de células T huEGFRt* adoptivamente transferidas en ratones Nod/sc/d.
[0143] Se cocultivaron células T huEGFRt* marcadas con 51Cr como las células diana y PBMCs activadas con GM-CSF frescas humanas como efectoras. Luego, la adición de Cetuximab sensibilizó específicamente las células T huEGFRt* para la citólisis ADCC por las efectoras. La lisis de las células T huEGFRt* se midió mediante un ensayo de liberación de cromo de 4 horas y los resultados mostraron que la adición de Cetuximab aumentó significativamente la lisis de menos de un 5% a aproximadamente un 50%, un 45%, un 40% y un 15%, respectivamente, con proporciones efectora a diana (efectora:diana) de 50:1, 25:1, 5:1 y 1:1.
[0144] En cambio, la adición del mAb específico de CD20 Rituxan no tuvo ningún efecto sobre la activación de la ADCC de las células T huEGFRt* en este ensayo.
[0145] A continuación, los solicitantes derivaron células T murinas CTLL-2 huEGFRt* que fueron modificadas adicionalmente para segregar IL-2 autocrina y expresar el indicador biofotónico de luciferasa de luciérnaga, y adoptivamente transfirieron estas células CTLL-2 ffLuc+huEGFRt+ mediante inyección intravenosa a ratones Nod/SCID, que posteriormente recibieron Cetuximab o Rituxan. El injerto /$ v/vo de CTLL-2 transferidas, medido por obtención de imágenes biofotónicas /$ v/vo, fue inhibido significativamente (97%, P< ,05) en ratones que recibieron Erbitux (1 mg intraperitonealmente a diario). La eliminación mediada por cetuximab de las células CTLL-2 ffLuc+huEGFRt+ ocurrió entre los 4 y 6 días. Estos datos sostienen el uso de la administración de Cetuximab como un control terapéutico para pacientes que reciben células T huEGFRt*.
Ejemplo 9
[0146] Este ejemplo describe células T con un mecanismo de señalización de citocina yc intrínseco y muestra que los receptores de citocinas quiméricos (CCR) IL-2/IL-15RP (CyCR2) e IL-7Ra (CyCR7) tienen la capacidad para mejorar la supervivencia, la persistencia y el injerto /$ v/vo de células T citotóxicas (CTLs). El antígeno CD19 truncado (CD19t) se enlazó a un CyCR mediante un conector T2A para mostrar la expresión del CyCR en la superficie celular. Los receptores de citocinas quiméricos descritos aquí se pueden enlazar a receptores de antígenos quiméricos, tales como los CARs biespecíficos descritos aquí.
[0147] Para desarrollar una plataforma de citocina yc independiente de ligando e intrínseca de las células, los solicitantes diseñaron receptores de citocina yc quiméricos (CyCR) compuestos por la citocina IL-7 ligada por diez
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aminoácidos al dominio extracelular del IL-7Ra. Para diseñar un CyCR que confiera una señal de IL-7R, la citocina IL-7 se ligó a la cadena IL-7Ra (CyCR7) de longitud total. Un CyCR que proporcione una señal de IL-2/IL-15RP se diseñó ligando la citocina IL-7 al dominio extracelular y transmembrana del IL-7Ra fusionado al dominio citoplásmico del IL-2/IL-15RP (CyCR2). Se espera que estos receptores quiméricos monocatenarios requieran la cadena yc endógena para la señalización.
[0148] Se generaron luego construcciones donde los transgenes CyCR estaban seguidos por la secuencia T2A autoescindible y un antígeno CD19 citoplásmicamente truncado (CD19t). CyCR y CD19t se expresan como un transcrito único y se escinden postraduccionalmente en el extremo C-terminal del péptido T2A autoescindible para producir dos proteínas de membrana de tipo 1 separadas CyCR(T2A) y CD19t. Basándose en la expresión de dos proteínas a partir de un único transcrito, la proporción de la expresión de CyCR(T2A) a CD19t es 1:1, por lo tanto, el CD19t de superficie celular es una indicación de la expresión en la superficie celular del CyCR. La transducción lentiviral y la expresión de estas construcciones podrían luego medirse por la expresión de CD19t de superficie, tal como la que se observa en ambas líneas celulares Jurkat y NK-92.
[0149] también se diseñó un tercer CyCR, que tiene una citocina IL-7 ligada a un IL-7Ra truncado (CYCR7t), al que le faltan los aminoácidos 1-126 del dominio extracelular del IL-7Ra. Un modelo molecular de la dimerización del CYCR7t con la cadena yc endógena es necesario para la transducción de señales. La falta de los aminoácidos 1-126 del dominio extracelular del IL-7Ra hace que el CYCR7t sea no funcional.
[0150] La expresión del CyCR7 truncado no señala o sostiene funcionalmente el crecimiento celular independiente de citocinas. La citometría de flujo detectó CD19t de la superficie celular en las líneas celulares Jurkat (95% CD19t~ CYCR7t~) y Teff (97% CD19t~ CyCR7P) transducidas con lentivirus. El análisis de transferencia Western de la fosforilación de STAT5 en la línea celular Jurkat que expresa CYCR7t no detectó un aumento obvio de STAT5 fosforilada en comparación con la línea celular Jurkat de control no transducida. Los controles positivos OKT3 estimularon PBMC cultivadas en 50 U/ml de IL-2 y 10 ng/ml de IL-15 y K562 mostraron una activación de STAT5 fosforilada aumentada. Por consiguiente, la expansión y la viabilidad de las CTLs transducidas con CYCR7t cultivadas durante 20 días eran todavía dependientes de citocinas.
[0151] Para determinar si CyCRs funcionales tales como CyCR2 y CyCR7 podrían sostener el crecimiento de las células T Cd 8~ primarias humanas en ausencia de citocina exógena, medimos la expansión de CTLs que expresan cada CyCR. Las células T primarias humanas que expresan CYCR7t fueron incapaces de expandirse en ausencia de citocina exógena. Tanto CyCR2 como CyCR7 fueron capaces de sostener la supervivencia y la proliferación de las células T CD8~ a través del mantenimiento de la viabilidad, de una manera similar a la de las células parentales cultivadas en 5 U/ml y 0,5 U/ml de IL-2, respectivamente. La expansión celular total aumentada medida para CTL CyCR2~ frente a CyCR7~ se correlaciona con la expresión aumentada (es decir, una MFI de 26 para el CyCR7 frente a 52 para el CyCR2) de Ki67, una proteína antigénica nuclear presente en las fases G1, S, G2 y M del ciclo celular. Se observó una expresión más alta de Bcl-2, una proteína antiapoptótica clave inducida en respuesta a la señalización de IL-2 e IL-7, para CTL CyCR7~ frente a CyCR2~, que sostiene la capacidad de CyCR7 para mantener la supervivencia de las células T primarias humanas. Juntos, estos datos sugieren que, aunque ambos CyCRs sostienen la viabilidad y la expansión de las células T independientes de citocinas, el CyCr2 proporciona una ventaja proliferativa, mientras que el CyCR7 mantiene la supervivencia para las CTLs CD8~ efectoras.
Las células T CD8C que expresan CyCR muestran un injerto independiente de citocinas in vivo
[0152] Los estudios por nuestro laboratorio y por otros indican que el injerto de CTL humanas en ratones deficientes IL-2ryC NOD/Scid depende de la administración exógena de IL-15 o IL-2 humanas. Para probar el potencial de la expresión de CyCR en las CTLs para superar esta dependencia, las células T efectoras parentales, CTLs CyCR7~, y CTLs CyCR2~ fueron inyectadas en la vena caudal de ratones deficientes IL-2RyC NOD/Scid inmunodeficientes en ausencia de administración de citocina exógena. El injerto total se comparó recogiendo al menos cuatro ratones por grupo el día 8, 17, 24 y 48 y analizando los niveles de células T en la sangre y la médula ósea.
[0153] En la sangre, las CTLs CyCR2~ tuvieron un injerto independiente de citocina exógena contundente significativo (p <0,007) en comparación con las CTLs CyCR7~ y las células parentales. En la médula ósea, tanto las CTLs CyCR7~ (P<0,03) como las CTLs CyCR2~ (P<0,0005) tuvieron un injerto independiente de citocina exógena significativo en comparación con las células parentales. Las CTLs CyCR2~ tuvieron un mayor injerto en comparación con las CTLs CyCR7~. Esto indica que tanto las CTLs CyCR7~ como las CTLs CyCR2~ son capaces de sostener el injerto independiente de citocina exógena, pero el porcentaje total de células fue diferente. La sangre sostuvo un porcentaje
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de injerto más alto de las CTLs CyCR2+ en comparación con la médula ósea. La médula ósea sostuvo el injerto de las CTLs CyCR7+ a lo largo de un periodo más largo de tiempo. De manera importante, el injerto no fue infinito, ya que las células ya no estaban presentes en la sangre y la médula ósea el día 48 en ninguno de los grupos.
[0154] Las señales de citocina yc intrínsecas celulares pueden reemplazar la necesidad de la administración de citocina exógena para el soporte de las CTLs adoptivamente transferidas. La provisión de receptores de citocinas intrínsecos celulares puede superar la principal limitación de la inmunoterapia adoptiva; la persistencia a largo plazo de las CTL adoptivamente transferidas. Esto puede eliminar la necesidad de administrar citocina exógena, lo que puede reducir toxicidades y efectos de activación inespecífica en los tipos celulares endógenos.
Ejemplo 10
[0155] Este ejemplo muestra que el receptor de antígenos quimérico de CD19 enlazado a EGFRt y DHFR puede ser regulado por el metotrexato. Usando los métodos descritos aquí, el receptor de dihidroxifolato descrito aquí puede enlazarse a receptores de antígenos quiméricos biespecíficos.
[0156] Los solicitantes han desarrollado un transgén seleccionable humano usando una variante de la dihidrofolato reductasa humana (hDHFR) que permitiría la selección de células T con el fármaco menos tóxico y farmacéuticamente disponible metotrexato (MTX). El MTX ejerce su efecto antiproliferativo a través de una inhibición competitiva de la DHFR, una enzima clave esencial para la síntesis de novo de nucleótidos timidilato.
[0157] En el presente ejemplo, los solicitantes evaluaron el potencial de la selección in vitro mediada por la DHFRfs (variante L22F/F31S de la hDHFR) de células T humanas primarias que coexpresan un receptor de antígenos quimérico específico de CD19 (CD19CAR para el reconocimiento de tumores que expresan CD19). En esta estrategia, hipotetizamos que la exposición de una población mixta transducida de células T al fármaco linfotóxico MTX debería llevar a la eliminación de las células T sin transducir y a la expansión selectiva de las células T que coexpresan células T DHFRfs/CD19CAR, aumentando la eficacia antitumoral de la población de células T como conjunto. Aquí los solicitantes muestran que la selección mediada por DHFRfs de células T modificadas génicamente impusieron la expresión del transgén terapéutico CD19CAR y permitieron la derivación de integrantes estables CAR~ en presencia de concentraciones clínicamente alcanzables de MTX (por ejemplo, 0,1 pM de MTX).
[0158] Para traducir el método de selección de hDHFRFS para una potencial utilidad terapéutica, los solicitantes han diseñado un vector lentiviral que coexpresa hDHFRFS conjuntamente con un receptor de antígenos quimérico específico de CD19 (CD19CAR) y un polipéptido EGFR humano truncado como marcador de seguimiento (huEGFRt), cada uno separado por una secuencia t 2a de salto ribosómico.
[0159] Las células T CTLL2 fueron transducidas primero con este vector lentiviral CD19CAR-huEGFRt-hDHFRFS y se evaluó su resistencia al MTX. Diez días después de la transducción lentiviral, el 7-8 % de las células fueron positivas para la expresión de CD19CAR y huEGFRt.
[0160] En ausencia de MTX, las células CTLL2 no transducidas y transducidas se expandieron con una tasa equivalente (21 y 27 veces respectivamente). Tras la incubación con MTX (0-0,1 pM) durante 8 días, una expansión de 7 veces con un 80% de supervivencia se observó con las células transducidas, mientras que la exposición de las células CTLL2 no transducidas a > 0,05 pM de MTX resultó en la fuerte inhibición de la expansión y la viabilidad de las células CTLL2 no transducidas.
[0161] La evaluación de los niveles de expresión de huEGFRt de las células CTLL2 transducidas después de 8 días en cultivo con diversas concentraciones de MTX reveló además un enriquecimiento mediado por MTX significativo de las células huEGFRt+ que expresan el transgén (49%, 93%, 98,5%, 99% a 0,01, 0,025, 0,05 y 0,1 pM de MTX, respectivamente).
[0162] Para caracterizar adicionalmente la dosis máxima de MTX que podría ser tolerada por las células CTLL2 seleccionadas, las células CTLL2 transducidas que se habían cultivado en 0,1 pM de MTX durante 8 días se volvieron a sembrar con un rango más amplio de concentraciones de MTX (hasta 0,75 pM). Estas células transducidas y seleccionadas pre-MTX fueron capaces de expandirse 90-100 veces con concentraciones de MTX de hasta 0,25 pM, lo que es equivalente a la expansión de las CTLL2 de control no transducidas en ausencia de MTX.

Claims (7)

ES 2 774 160 T3REIVINDICACIONES
1. Célula T genéticamente modificada que expresa un receptor de antígenos quimérico (CAR) biespecífico enlazado al receptor de factor de crecimiento epidérmico truncado (EGFRt), donde el producto de expresión tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID N.°: 3 o 12.
2. Polinucleótido codificante de:
a. un CAR biespecífico; y
b. un receptor de factor de crecimiento epidérmico truncado (EGFRt);
donde el polinucleótido tiene la secuencia de SEQ ID N.os 1 o 10.
3. Vector que comprende el polinucleótido según la reivindicación 2.
4. Vector según la reivindicación 3, donde el vector es un transposón plasmídico, un vector lentiviral, un vector retroviral, un vector de virus espumoso, un vector adenoviral, un vector de virus de ARN, un vector de virus de la viruela, un vector de virus de herpes o un vector de virus adenoasociado (AAV).
5. Célula T genéticamente modificada según la reivindicación 1, donde la célula es una célula T virgen, una célula T de memoria central o una célula T de memoria efectora.
6. Composición farmacéutica, que comprende:
a. una célula T genéticamente modificada, según la reivindicación 1; y
b. un soporte farmacéuticamente aceptable.
7. Composición farmacéutica según la reivindicación 6 para usar en el tratamiento de un cáncer.
ES13748596T 2012-02-13 2013-02-13 Receptores de antígenos quiméricos biespecíficos y usos terapéuticos de los mismos Active ES2774160T3 (es)

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