BR112021004261A2

BR112021004261A2 - métodos para análise por espectrometria de massas de composições de células geneticamente modificadas

Info

Publication number: BR112021004261A2
Application number: BR112021004261-0A
Authority: BR
Inventors: Kenneth Mayo PRENTICE
Original assignee: Juno Therapeutics Inc
Priority date: 2018-09-11
Filing date: 2019-09-11
Publication date: 2021-05-25
Also published as: MA53612A; EA202190693A1; WO2020056047A1; JP2022500674A; EP3850366A1; KR20210081341A; AU2019339464A1; CA3111789A1; SG11202102108QA; US20220050114A1; IL281325A; CN113167796A; MX2021002574A

Abstract

MÉTODOS PARA ANÁLISE POR ESPECTROMETRIA DE MASSAS DE COMPOSIÇÕES DE CÉLULAS GENETICAMENTE MODIFICADAS. A presente invenção refere-se a métodos para gerar um perfil de espectrometria de massas (MS) de uma amostra de uma composição de células, tal como uma composição de células geneticamente modificadas. Em algumas modalidades, o perfil de espectrometria de massas inclui dados baseados em uma ou mais análise ou técnicas de espectrometria de massas. Neste pedido também estão apresentados métodos para, baseado em perfis de espectrometria de massas de uma ou mais amostras de tais composições de células: identificar um perfil de espectrometria de massas (MS) de uma composição de células geneticamente modificadas compreendendo células imunes compreendendo um receptor recombinante por comparação com um perfil de espectrometria de massas de referência; caracterizar um processo para produção de uma composição de células geneticamente modificadas; avaliar as proteínas de superfície celular de uma composição de células geneticamente modificadas; e avaliar um processo para produção de uma composição de células geneticamente modificadas.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para “MÉTODOS PARA ANÁLISE POR ESPECTROMETRIA DE MASSAS DE COMPOSIÇÕES DE CÉLULAS GENETICAMEN- TE MODIFICADAS”. Referência Remissiva a Pedidos Relacionados

[001] Este pedido reivindica prioridade do pedido provi- sório US N° 62/729,985 depositado em 11 de setembro de 2018, intitulado “Methods for Mass Spectrometry Analysis of Engineered Cell Compositions”, cuja íntegra encontra-se aqui incorporada a título de referência. Incorporação da Listagem de Sequências para Referência

[002] O presente pedido está sendo depositado com uma Listagem de Sequências em formato eletrônico. A Listagem de Sequências é apresentada como um arquivo intitulado 735042019040SeqList.txt, criado em 11 de setembro de 2019, que tem 43,886 bytes de tamanho. As informações em formato eletrônico da em 11 de setembro de estão aqui in- corporadas a título de referência. Campo

[003] Neste pedido estão apresentados métodos para ge- rar um perfil de espectrometria de ma ssas (MS) de uma amostra de uma composição de células, tal como uma com- posição de células geneticamente modificadas. Em algumas modalidades, o perfil de espectrometria de massas inclui da- dos baseados em uma ou mais análises ou técnicas de es- pectrometria de massas. Neste pedido também estão apre- sentados métodos para, baseados em perfis de espectrome- tria de massas de uma ou mais amostras de tais composi- ções de células: identificar um perfil de espectrometria de massas (MS) de uma composição de células genetic amente modificadas compreendendo células imunes compreendendo um receptor recombinante por comparação com um perfil de espectrometria de massas de referência; caracterizar um processo para produção de uma composição de células ge- neticamente modificadas; avaliar as proteínas de superfície celular de uma composição de células geneticamente modifi- cadas; e avaliar um processo para produção de uma compo- sição de células geneticamente modificadas. Antecedentes

[004] Terapias com células T autólogas tais como terapi- as com receptores de antígenos quiméricos (CAR) já se apresentaram como uma grande promessa para o tratamento de indivíduos com doenças, incluindo cânceres tais como neoplasmas de células B recidivantes e refratários, tais como leucemia linfoblástica aguda, leucemia linfocítica crônica, e linfomas não-Hodgkin. Embora tais terapias tenham um grande potencial para beneficiar indivíduos doentes, as tera- pias com células T autólogas geralmente são mais comple- xas que as terapias alternativas devido, em parte, ao fato de que o produto medicamentoso inclui células vivas obtidas de indivíduos com históricos genéticos diferentes e diferentes variações ou graus de uma doença e que as células devem ser processadas ou geneticamente modificadas para chegar a um produto medicamentoso final. Dada tal complexidade, é preciso tomar cuidado para garantir que as terapias celulares sejam produzidas com uma qualidade consistente através dos diferentes indivíduos. O que a técnica precisa é de mé- todos adicionais para analisar as composi ções celulares e os reagentes usados para gerar terapias celulares. Sumário

[005] Neste pedido estão apresentados métodos para identificação de um perfil de espectrometria de massas (MS) de uma composição de células geneticamente modificadas, o método incluindo: determinar um perfil de espectrometria de massas de teste de uma amostra de uma composição de cé- lulas geneticamente modificadas de teste ou de um subcon- junto da mesma usando uma técnica de espectrometria de massas, a referida composição de células genet icamente modificadas de teste contendo células imunes contendo um receptor recombinante; comparar o perfil de espectrometria de massas de teste com um perfil de espectrometria de mas- sas de referência; e identificar uma ou mais diferenças na presença, ausência ou nível de pelo menos um componente de dados no perfil de espectrometria de massas de teste em relação ao perfil de espectrometria de massas de referência, identificando assim um perfil de espectrometria de massas da composição de células contendo o r eceptor recombinante.

[006] Neste pedido também estão apresentados métodos para identificação de um perfil de espectrometria de massas (MS) de uma composição de células geneticamente modifi- cadas, os métodos incluindo: determinar um perfil de espec- trometria de massas de teste de uma amostra de uma com- posição de células geneticamente modificadas de teste ou de um subconjunto da mesma usando uma técnica de espectro- metria de massas, a referida composição de células geneti- camente modificadas de teste compreendendo células imu- nes compreendendo uma molécula de ácido nucleico codifi- cando um receptor recombinante; comparar o perfil de es- pectrometria de massas de teste com um perfil de espectro- metria de massas de referência; e identificar uma ou mais diferenças na presença, ausência ou nível de pelo menos um componente dos dados no perfil de espectrometria de mas- sas de teste em relação ao perfil de espectrometria de mas- sas de referência, identificando assim um perfil de espectro- metria de massas único para a amostra.

[007] Neste pedido também estão apresentados métodos para identificação de um perfil de espectrometria de massas (MS) de uma composição de células geneticamente modifi- cadas, o método compreendendo: determinar um perfil de espectrometria de massas de teste de uma amostr a de uma composição de células geneticamente modificadas de teste ou de um subconjunto da mesma usando uma técnica de es- pectrometria de massas, a referida composição de células geneticamente modificadas de teste compreendendo células imunes compreendendo um receptor recombinante; e identi- ficar uma ou mais diferenças na presença, ausência ou nível de pelo menos um componente dos dados no perfil de espec- trometria de massas de teste em relação ao perfil de espec- trometria de massas de referência, identificando assim um perfil de espectrometria de massas da composição de células compreendendo o receptor recombinante único para a amos- tra.

[008] Em algumas modalidades, o perfil de espectrome- tria de massas de referência é de uma amostra de uma com- posição de referência ou é um perfil médio de espectros de massas de inúmeras amostras de uma pluralidade de compo- sições de referência.

[009] Em algumas modalidades, o perfil de espectrome- tria de massas de referência baseia -se em uma amostra de uma composição de referência. Em algumas m odalidades, o perfil de espectrometria de massas de referência baseia -se em uma pluralidade de amostras de uma composição de refe- rência. Em algumas modalidades, o perfil de espectrometria de massas de referência baseia -se em inúmeras amostras de uma pluralidade de composições de referência.

[0010] Em algumas modalidades, a composição de células geneticamente modificadas é para uso em uma terapia com células autólogas. Em algumas modalidades, a composição de células geneticamente modificadas é produzida por um processo que inclui: selecionar ou isolar células imunes de uma amostra proveniente de um indivíduo, gerando assim uma composição fonte, opcionalmente em que a amostra bio- lógica é uma amostra de leucaférese, uma amostra de afére- se ou uma amostra de sangue tota l; incubar as células da composição fonte com um reagente estimulador, gerando as- sim uma composição estimulada, em que a incubação é op- cionalmente realizada na presença de uma ou mais citocinas; introduzir um ácido nucleico codificando o receptor recombi- nante em células imunes da composição estimulada, gerando assim uma composição transformada; e cultivar a composi- ção estimulada a 37º C por pelo menos 24 horas, gerando assim a composição de células geneticamente modificadas, em que a cultura é opcionalmente realizada na presença de uma ou mais citocinas.

[0011] Em algumas modalidades, a composição de refe- rência ou cada uma dentre a pluralidade de composições de células de referência não teve introduzida uma molécula de ácido nucleico codificando o receptor recombinante.

[0012] Em algumas modalidades, o perfil de espectrome- tria de massas de referência é de uma amostra de uma com-

posição de referência e a composição de células de referên- cia é uma composição de células fonte contendo as células imunes das quais a composição d e células de teste fora deri- vada ou obtida. Em algumas modalidades, o perfil de espec- trometria de massas de referência é de uma amostra de uma composição de referência, em que: a composição de células geneticamente modificadas contém células imunes obtidas de um indivíduo, as referidas células imunes contendo uma molécula de ácido nucleico codificando o receptor recombi- nante; e a composição de células de referência é uma com- posição de entrada contendo as células imunes obtidas do indivíduo que não contêm o ácido nucleico codificando o re- ceptor recombinante.

[0013] Em algumas modalidades, o perfil de espectrome- tria de massas de referência é de uma amostra de uma com- posição de referência e a composição de células de referên- cia é uma composição obtida depois, antes o u durante um estágio do processo de produção para produção de a compo- sição de células geneticamente modificadas.

[0014] Em algumas modalidades, o perfil de espectrome- tria de massas de referência é de uma amostra de uma com- posição de referência, a composição de células genetica- mente modificadas é produzida a partir de um estágio de um processo, e a composição de referência é obtida depois, an- tes ou durante o estágio no qual a composição de células geneticamente modificadas é produzida.

[0015] Em algumas modalidades, a composição de células geneticamente modificadas é uma amostra obtida de um in- divíduo que já recebera a composição de células genetica- mente modificadas. Em algumas modalidades, a amostra ob-

tida do individuo contém células imunes geneticamente modi- ficadas com o receptor recombinante, opcionalmente detec- tadas por citometria de fluxo ou reação em cadeia da polime- rase (PCR). Em algumas modalidades, a amostra obtida do individuo é uma amostra de sangue ou uma amostra de um tumor.

[0016] Em algumas modalidades, a amostra obtida do in- dividuo é obtida entre ou entre cerca de 6 e 30 dias, entre ou entre cerca de 14 e 29 dias, ou entre ou entre cerca de 17 e 22 dias depois da administração das células geneticamente modificadas ao indivíduo. Em algumas modalidades, a amos- tra é obtida do indivíduo no momento em que ou aproxima- damente quando ou imediatamente depois de células de pico expressando o receptor recombinante são detectáveis no sangue do indivíduo.

[0017] Em algumas modalidades, a composição de células geneticamente modificadas contém células que foram colo- cadas em contato com um agente para produzir uma ativida- de dependente de um receptor recombinante, opcionalmente em que o agente é um antígeno alvo que é capaz de ser li- gado pelo receptor recombinante ou é um anticorpo idiotí pico específico para o anticorpo.

[0018] Em algumas modalidades, o perfil de espectrome- tria de massas de referência é um perfil médio de espectros de massas de inúmeras amostras de uma pluralidade de composições de referência. Em algumas modalidades, cada uma dentre a pluralidade de composições de referência con- tém células contendo o receptor recombinante. Em algumas modalidades, cada uma dentre a pluralidade de composições de referência foi produzido pelo mesmo processo ou subs-

tancialmente o mesmo processo que a composição de célu- las geneticamente modificadas.

[0019] Neste pedido estão apresentados métodos para avaliação de um processo para produção de uma composição de células geneticamente modificadas, os métodos incluindo calcular a quantidade de variabilidade na presença, ausência ou nível de pelo menos um componente dos dados através de inúmeros perfis de espectrometria de massas baseados em amostras de uma pluralidade de composições de células geneticamente modificadas de referência ou um subconjunto da mesma, em que cada uma dentre a pluralidade de compo- sições de células geneticamente modificadas de referência compreende um receptor recombinante produzido pelo mes- mo processo ou substancialmente o mesmo processo.

[0020] Neste pedido estão apresentados métodos para avaliação de um processo para produção de uma composição de células geneticamente modificadas, os métodos incluindo: obter um perfil de espectrometria de massas médio de uma amostra de uma pluralidade de composições de células ge- neticamente modificadas de ref erência ou um subconjunto da mesma, em que cada uma dentre a pluralidade das composi- ções de referência contém um receptor recombinante produ- zido pelo mesmo processo ou substancialmente o mesmo processo; e determinar a presença, ausência ou nível de va- riabilidade ou variância do perfil de espectrometria de mas- sas médio. Em algumas modalidades, o método inclui ainda selecionar o processo para produção de uma composição de células geneticamente modificadas se a variabilidade ou va- riância do perfil de espectrom etria de massas entre a plurali- dade das composições de referência for de não mais que

40%, não mais que 30%, não mais que 20%, não mais que 10% ou não mais que 5%, ou variar de tal média em não mais que um desvio padrão entre data components.

[0021] Neste pedido estão apresentados métodos para avaliação de um processo para produção de uma composição de células geneticamente modificadas, os métodos incluindo: obter um perfil de espectrometria de massas médio de inú- meros perfis de espectrometria de massas baseados em amostras de uma pluralidade de composições de células ge- neticamente modificadas de referência ou um subconjunto da mesma, em que cada uma da pluralidade das composições de células geneticamente modificadas de referência compre- ende um receptor recombinan te produzido pelo mesmo pro- cesso ou substancialmente o mesmo processo; e produzir um perfil de espectrometria de massas de referência baseado no número de perfis de espectrometria de massas; e determinar a quantidade de variabilidade na presença, ausência ou nível de pelo menos um componente dos dados across the number variance do perfil de espectrometria de massas médio, de- terminando assim o grau de variância das composições de células produzidas pelo processo.

[0022] Em algumas modalidades, os métodos testam, usando perfis de espectrometria de massas, se um processo para produção de uma composições de células geneticamen- te modificadas resulta em variabilidade ou variância através uma pluralidade de composições de células geneticamente modificadas. Em algumas moda lidades, a extensão de tal va- riabilidade ou variância é avaliada usando um perfil de es- pectrometria de massas médio baseado em amostras da plu- ralidade de composições de células geneticamente modifica-

das.

[0023] Em algumas modalidades, o método inclui selecio- nar um processo para produção de uma composição de célu- las geneticamente modificadas se a quantidade de variabili- dade na presença, ausência ou nível do pelo menos um componente dos dados através dos inúmeros de perfis de espectrometria de massas é de não mais que 40%, não mais que 30%, não mais que 20%, não mais que 10% ou não mais que 5% do nível de pelo menos um componente dos dados no perfil de espectrometria de massas de referência.

[0024] Em algumas modalidades, o perfil médio de espec- troscopia de massas é de uma amostra de (1) células na composição de referência; (2) células CD3+ na composição; (3) células T CD4+ na composição; (4) células T CD8+ na composição; (5) receptor recombinante+ células na composi- ção; (6) receptor recombinante+células CD3+ na comp osi- ção; (7) receptor recombinante+CD8+ células na composi- ção; or (8) receptor recombinante+células CD4+ na composi- ção.

[0025] Em algumas modalidades, cada uma dentre a plura- lidade de composições de referência é produzida por um processo que inclui: selecion ar ou isolar células imunes de uma amostra proveniente de um indivíduo, gerando assim uma composição fonte, opcionalmente em que a amostra bio- lógica é uma amostra de leucaférese, uma amostra de afére- se ou uma amostra de sangue total; incubar as células da composição fonte com um reagente estimulador, gerando as- sim uma composição estimulada, em que a incubação é op- cionalmente realizada na presença de uma ou mais citocinas; introduzir um ácido nucleico codificando o receptor recombi-

nante nas células imunes da composição estimulada, geran- do assim uma composição transformada; e cultivar a compo- sição estimulada a 37º C por pelo menos 24 horas, gerando assim a composição de células geneticamente modificadas, em que a cultura é opcionalmente realizada na presen ça de uma ou mais citocinas.

[0026] Em algumas modalidades, o perfil de espectrome- tria de massas de teste e o perfil de espectrometria de mas- sas de referência individualmente é um perfil peptídico. Em algumas modalidades, o perfil de espectrometria de massas de referência é determinado usando a mesma técnica de es- pectrometria de massas que o perfil de espectrometria de massas de teste.

[0027] Neste pedido estão apresentados métodos para ca- racterização de um processo para produção de uma compo- sição de células geneticament e modificadas, os métodos in- cluindo: determinar um primeiro perfil de espectrometria de massas de uma amostra de uma primeira composição de cé- lulas usando uma técnica de espectrometria de massas; de- terminar um segundo perfil de espectrometria de massas de uma amostra de uma segunda composição de células usando uma técnica de espectrometria de massas; e identificar uma ou mais diferenças na presença, ausência ou nível de pelo menos um componente dos dados no primeiro perfil de es- pectrometria de massas em rel ação ao segundo perfil de es- pectrometria de massas, em que a primeira composição de células e a segunda composição de células contêm composi- tions em diferentes estágios de um processo de produção para produção de uma composição de células geneticamente modificadas. Em algumas modalidades, a primeira e a se-

gunda composições de células estão em diferentes estágios de produção de uma composição de células geneticamente modificadas e são selecionadas dentre: uma composição fon- te contendo células imunes selecion adas ou isoladas de uma amostra biológica de um indivíduo, opcionalmente em que a amostra biológica é uma amostra de leucaférese, uma amos- tra de aférese ou uma amostra de sangue total; uma compo- sição estimulada contendo células imunes da composição se- lecionada que fora colocada em contato com um reagente estimulador, opcionalmente em que o contato foi feito na presença de uma ou mais citocinas; uma composição trans- formada contendo células da composição estimulada conten- do um ácido nucleico codificando o rec eptor recombinante; e uma composição cultivada contendo células da composição transformada que foram cultivadas a ou a cerca de 37º C por pelo menos 24 horas, opcionalmente em que o cultivo foi realizado na presença de uma ou mais citocinas.

[0028] Em algumas modalidades, a primeira composição de células é uma composição de um estágio anterior ou de um instante anterior do processo de produção em relação à segunda composição de células.

[0029] Neste pedido estão apresentados métodos para ca- racterização de um processo par a produção de uma compo- sição de células geneticamente modificadas, os métodos in- cluindo: determinar um primeiro perfil de espectrometria de massas de uma amostra de uma primeira composição de cé- lulas usando uma técnica de espectrometria de massas; de- terminar um segundo perfil de espectrometria de massas de uma amostra de uma segunda composição de células usando uma técnica de espectrometria de massas; e identificar uma ou mais diferenças na presença, ausência ou nível de pelo menos um componente dos dados n o primeiro perfil de es- pectrometria de massas em relação ao segundo perfil de es- pectrometria de massas, em que a primeira composição de células e a segunda composição de células contêm células geneticamente modificadas produzidas por diferentes pro- cessos. Em algumas modalidades, os diferentes processes diferem em um ou mais dentre a presença ou concentração de soro; tempo em cultura; lote de reagente; manipulação ou armazenamento de um reagente; presença ou quantidade de um reagente estimulador; o tipo de u m reagente estimulador; presença ou quantidade de uma ou mais citocinas; presença ou quantidade de aminoácidos; temperatura; a fonte ou tipos de células imunes de uma composição fonte; a relação ou percentagem de células imunes em uma composição fonte, opcionalmente a relação de células CD4+/CD8+; densidade celular; cultura estática; cultura oscilante; perfusão; o tipo de vetor viral; o número de cópias do vetor; a presença de um adjuvante de transdução; densidade celular de uma compo- sição fonte em criopreservação; a extensão de expressão do receptor recombinante; a presença de um composto para modular um fenótipo celular.

[0030] Em algumas modalidades, o primeiro perfil de es- pectrometria de massas e o segundo perfil de espectrometria de massas individualmente é um perfil peptídico. Em algu- mas modalidades, o primeiro perfil de espectrometria de massas e o segundo perfil de espectrometria de massas são determinados pela mesma técnica de espectrometria de massas.

[0031] Neste pedido estão apresentados métodos para ca-

racterização de um receptor recombinante, os métodos inclu- indo obtaining, usando uma técnica de espectrometria de massas, um perfil de espectrometria de massas com pelo menos um componente dos dados de um receptor recombi- nante isolado de uma amostra de uma composi ção de células geneticamente modificadas ou um subconjunto da mesma compreendendo células imunes expressando ou compreen- dendo o receptor recombinante.

[0032] Neste pedido estão apresentados métodos para ca- racterização de um receptor recombinante, o método incluin- do obter um perfil de espectrometria de massas de teste de um receptor recombinante, usando uma técnica de espectro- metria de massas, de uma amostra de uma composição de células geneticamente modificadas de teste contendo células imunes expressando ou contendo o receptor recombinante, o referido perfil de espectrometria de massas incluindo pelo menos um componente dos dados.

[0033] Neste pedido estão apresentados métodos para ca- racterização de um receptor recombinante, os métodos inclu- indo: obter um perfil de espe ctrometria de massas de teste, usando uma técnica de espectrometria de massas, de uma amostra de uma composição de células geneticamente modi- ficadas de teste ou de um subconjunto da mesma compreen- dendo células imunes expressando ou compreendendo um receptor recombinante; obter um perfil de espectrometria de massas de referência, usando uma técnica de espectrometria de massas, de uma amostra de uma composição de referên- cia ou um subconjunto da mesma compreendendo células imunes, o referido perfil de espectrometria de massas de re- ferência compreendendo pelo menos um componente dos dados; e identificar uma ou mais diferenças na presença, au- sência ou nível de pelo menos um componente dos dados no perfil de espectrometria de massas de teste em relação ao perfil de espectrometria de massas de referência.

[0034] Em algumas modalidades, o método inclui ainda identificar uma ou mais diferenças no pelo menos um com- ponente dos dados em relação a um perfil de espectrometria de massas das mesmas células, porém não expressando o receptor recombinante.

[0035] Em algumas modalidades, a composição de células geneticamente modificadas e a composição de células de re- ferência são substancialmente similares exceto pela presen- ça do receptor recombinante, opcionalmente em que a com- posição de células geneticamente modificadas e a composi- ção de referência são produzidas por um processo substan- cialmente similar e/ou compreendem o mesmo tipo de células imunes.

[0036] Em algumas modalidades, a composição de células geneticamente modificadas fora estimulada na presença de um reagente estimulador. Em algumas modalidades, a com- posição de células geneticamente modificadas contém célu- las que foram colocadas em contato com um agente para produzir uma atividade dependente de um receptor recombi- nante, opcionalmente em que o agente é um antígeno alvo que é capaz de ser ligado pelo receptor recombinante ou é um anticorpo idiotípico específico para o anticorpo.

[0037] Em algumas modalidades, o método inclui ainda identificar uma ou mais diferenças no perfil de espectrome- tria de massas em relação a uma espectrometria de massas da mesma composição de células geneticamente modifica-

das, mas que não fora estimulada na presença de um rea- gente estimulador ou fora estimulada na presença de um re- agente estimulador diferente.

[0038] Em algumas modalidades, a composição de células é enriquecida nas células imunes. Em algumas modalidades, as células imunes incluem linfócitos. Em algumas modalida- des, os linfócitos incluem células T ou células exterminado- ras (NK) naturais. Em algumas modalidades, os linfócitos in- cluem células T e as células T são células T CD4+ e/ou CD8+. Em algumas modalidades, as células imunes são hu- manas.

[0039] Entre quaisquer das modalidades apre sentadas, qualquer uma das composições de células inclui uma compo- sição de células que é enriquecida em células imunes, tal como por seleção, isolamento ou purificação de células imu- nes provenientes de uma amostra biológica, por exemplo, por métodos baseados na imunoafinidade. Em algumas mo- dalidades, a composição de células geneticamente modifica- das é enriquecida nas células imunes. Em algumas modali- dades, a composição de referência é enriquecida nas células imunes. Em algumas modalidades, a composição de células geneticamente modificadas de referência é enriquecida nas células imunes. Em algumas modalidades, a composição fon- te é enriquecida nas células imunes. Em algumas modalida- des, a composição estimulada é enriquecida nas células imunes. Em algumas modalidades, a composição transfor- mada é enriquecida nas células imunes. Em algumas modali- dades, a composição de células geneticamente modificadas é enriquecida nas células imunes. Em algumas modalidades, a primeira composição de células é enriquecida nas célul as imunes. Em algumas modalidades, a segunda composição de células é enriquecida nas células imunes. Em algumas moda- lidades, a composição cultivada é enriquecida nas células imunes. Em algumas modalidades, cada uma dentre a com- posição de células geneticamente modificadas e a composi- ção de referência é enriquecida nas células imunes. Em al- gumas modalidades, cada uma dentre a composição de célu- las geneticamente modificadas e a composição geneticamen- te modificada de referência é enriquecida nas células imu- nes. Em algumas modalidades, cada uma dentre a primeira composição de células e a segunda composição de células é enriquecida nas células imunes.

[0040] Em algumas modalidades, as células imunes são células T, opcionalmente células T CD4+ e/ou CD8+, e o re- agente estimulador é capaz de ativar um ou mais domínios de sinalização intracelular de um ou mais componentes de um complexo de TCR e/ou um ou mais domínios de sinaliza- ção intracelular de uma ou mais moléculas coestimuladoras. Em algumas modalidades, o reagente estimulador inclui um agente primário que se liga especificamente a um membro de um complexo de TCR e um agente secundário que se liga especificamente a uma molécula coestimuladora de células T. Em algumas modalidades, o agente primário liga-se espe- cificamente à CD3 e/ou a molécula coestimuladora é selecio- nada do grupo que consiste em CD28, CD137 (4 -1-BB), OX40, ou ICOS. Em algumas modalidades, o reagente esti- mulador inclui um anticorpo anti -CD3 ou um fragmento de li- gação de antígeno do mesmo e um anticorpo an ti-CD28 ou um fragmento de ligação de antígeno do mesmo.

[0041] Em algumas modalidades, os agentes primário e secundário estão presentes na superfície de um suporte sóli- do, opcionalmente em que o suporte sólido é uma conta. Em algumas modalidades, os agentes primário e secundário es- tão presentes na superfície de um reagente oligomérico so- lúvel incluindo uma estreptavidina ou uma estreptavidina mu- teína.

[0042] Em algumas modalidades, o cultivo foi realizado em condições para promover a proliferação e/ou a expansão das células geneticamente modificadas.

[0043] Em algumas modalidades, a amostra é processada a partir da composição de células geneticamente modificadas por marcação de uma ou mais proteínas de superfície, lise das células, e isolamento da uma ou mais proteínas. Em al- gumas modalidades, o método inclui ainda a digestão da uma ou mais proteínas isoladas .

[0044] Neste pedido estão apresentados métodos para avaliação de proteínas de superfície de uma composição de células geneticamente modificadas incluindo (a) marcar uma ou mais proteínas de superfície presentes nas células de uma composição de células geneticamente modificadas ou um subconjunto da mesma, a composição de células geneti- camente modificadas contendo células expressando ou con- tendo um receptor recombinante, gerand o assim uma compo- sição de células marcadas; (b) lisar as células da composi- ção de células marcada, gerando assim uma composição de células lisadas; (c) isolar a uma ou mais proteínas de super- fície da composição de células lisadas para obter uma ou mais proteínas isoladas; e (d) submeter a uma ou mais prote- ínas isoladas a uma técnica de espectrometria de massas para obter um perfil de espectrometria de massas incluindo um ou mais componentes de dados.

[0045] Em algumas modalidades, antes de (d), o método inclui ainda a digestão da uma ou mais proteínas isoladas. Em algumas modalidades, a digestão é realizada por proteó- lise na presença de uma ou mais proteases que são capazes de clivar uma ou mais ligações peptídicas. Em alguns casos, a uma ou mais proteases são ou c ontêm tripsina.

[0046] Em algumas modalidades, a uma ou mais proteínas contêm proteínas da membrana da superfície celular. Em al- gumas modalidades, a lise das células inclui incubação na presença de um detergente. Em algumas modalidades, o de- tergente é um detergente não iônico. Em algumas modalida- des, o detergente é ou contém uma quantidade eficaz de Tri- ton X-100. Em algumas modalidades, o detergente é um de- tergente desnaturante. Em alguns exemplos, o detergente desnaturante é ou contém uma quantidade eficaz de dodecil sulfato de sódio (SDS). Em algumas modalidades, depois da lise das células, o método inclui ainda remover o detergente da composição lisada.

[0047] Em algumas modalidades, a marcação das proteí- nas superficiais inclui marcação com aminas primárias com biotina. Em alguns exemplos, a uma ou mais proteínas são isoladas usando um reagente contém avidina, estreptavidina, NeutrAvidin™ ou CaptAvidin™.

[0048] Em algumas modalidades, a técnica de espectrome- tria de massas inclui submeter a amostra à cromatografia lí- quida (LC) seguida por espectrometria de massas. Em algu- mas modalidades, a cromatografia líquida é cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC), cromatografia líquida de ultra-alta eficiência (UHPLC), ou cromatografia líquida de ul-

tra eficiência (UPLC). Em alguns casos, a cromatografia lí- quida é cromatografia líquida de ultra eficiência (UPLC).

[0049] Em algumas modalidades, a cromatografia líquida e a espectrometria de massas são realizadas online. Em algu- mas modalidades, a cromatografia líquida é selecionada den- tre cromatografia em fase normal (NP -), em fase reversa (RP) e de interação hidrofílica (HILIC). Em algumas modali- dades, o espectrômetro de massas que executa a espectro- metria de massas inclui um ou mais de um analisador de massas quadrupolo, com armadilha de ío ns, por tempo de voo (TOF), ou por ressonância ciclotrônica de íons por trans- formada de Fourier. Em algumas modalidades, o espectrôme- tro de massas inclui um analisador de massas com armadilha de íons que é um analisador de massas com armadilha de íons quadrupolo tridimensional, um analisador de massas com armadilha de íons cilíndrico, um analisador de massas com armadilha de íons quadrupolo linear, ou um analisador de massas Orbitrap. Em alguns exemplos, o espectrômetro de massas é um espectrômetro massas q uadrupolo-Orbitrap.

[0050] Em algumas modalidades, os componentes de da- dos são selecionados dentre informações sobre os íons de MS, cromatógrafo de íons totais (TIC) ou uma parte do mes- mo, cromatograma de íons extraídos (XIC) ou uma parte do mesmo, pico de sinais de íons de MS de peptídios, pico de sinais de íons de MS de proteínas, informações de identifi- cação de peptídios, informações de identificação de proteí- nas, informações qualitativas, informações quantitativas, in- formações estruturais, modificações pós-translacionais. Em algumas modalidades, o componente de dados é um XIC ou uma parte do mesmo, em que o XIC ou parte do mesmo ba-

seia-se em um ou mais valores m/z teóricos ou conhecidos de um ou mais componentes peptídicos do receptor recombi- nante. Em algumas modalidades, o um ou mais componentes peptídicos é um componente peptídico proteoliticamente cli- vado ou digerido, opcionalmente em que a protease é tripsi- na.

[0051] Em algumas de quaisquer tais modalidades, o re- ceptor recombinante é ou contém um receptor quimérico e/ou um receptor de antígeno recombinante. Em algumas modali- dades, o receptor recombinante é capaz de se ligar a um an- tígeno alvo que é associado, a específico para, e/ou expres- so em uma célula ou tecido de uma doença, distúrbio ou condição. Em alguns exemplos, a doença, distúrbio ou con- dição é uma doença ou distúrbio infeccioso, uma doença au- toimune, uma doença inflamatória, ou um tumor ou um cân- cer. Em alguns aspectos, o antígeno alvo é um antígeno tu- moral. Em alguns exemplos, o antígeno alvo é seleciona do dentre integrina αvβ6 (integrina avb6), antígeno de matura- ção de células B (BCMA), B7 -H3, B7-H6, anidrase carbônica 9 (CA9, também conhecida como CAIX or G250), um antíge- no câncer-testículo, antígeno câncer/testículo 1B (CTAG, também conhecido como NY-ESO-1 e LAGE-2), antígeno carcinoembrionário (CEA), uma ciclina, ciclina A2, ligante 1 de quimiocina C-C (CCL-1), CD19, CD20, CD22, CD23, CD24, CD30, CD33, CD38, CD44, CD44v6, CD44v7/8, CD123, CD133, CD138, CD171, proteoglicano sulfato de condroitina 4 (CSPG4), proteína de fator de crescimento epi- dérmico (EGFR), proteína truncada de fator de crescimento epidérmico (tEGFR), mutação do receptor de fator de cres- cimento epidérmico tipo III (EGFR vIII), glicoproteína epitelial

2 (EPG-2), glicoproteína epitelial 40 (EPG-40), efrinB2, re- ceptor de efrina A2 (EPHa2), receptor de estrogênio, recep- tor Fc like 5 (FCRL5; também conhecido como receptor Fc homólogo 5 ou FCRH5), receptor de acetilcolina fetal (fetal AchR), uma proteína de ligação de folato (FBP), receptor alfa de folato, gangliosídeo GD2, GD2 O -acetilado (OGD2), gan- gliosídeo GD3, glicoproteína 100 (gp100), glipicano-3 (GPC3), receptor 5D acoplado à proteína G (GPCR5D), Her2/neu (tirosina quinase receptora erb-B2), Her3 (erb-B3), Her4 (erb-B4), dímeros de erbB, antígeno associado à mela- noma humano de alto peso molecular (HMW -MAA), antígeno de superfície da hepatite B, antígeno leucocitário humano A1 (HLA-A1), antígeno leucocitário humano A2 (HLA -A2), recep- tor alfa de IL-22 (IL-22Rα), receptor alfa 2 de IL -13 (IL- 13Rα2), receptor do domínio inserto quinase (kdr), cadeia leve capa, molécula de adesão de células L1 (L1 -CAM), epí- topo CE7 de L1-CAM, repetição rica em leucina contendo o membro A da família 8 (LRRC8A), Lewis Y, antígeno associ- ado a melanoma (MAGE)-A1, MAGE-A3, MAGE-A6, MAGE- A10, mesotelina (MSLN), c-Met, citomegalovírus murino (CMV), mucina 1 (MUC1), MUC16, ligantes de membro D do grupo 2 de células exterminadoras naturais (NKG2D), melana A (MART-1), molécula de adesão de células neurais (NCAM), antígeno oncofetal, antígeno de melanoma preferencialmente expresso (PRAME), receptor de progesterona, um antígeno específico para próstata, antígeno de células-tronco da prós- tata (PSCA), antígeno membranar específico para próstata (PSMA), receptor órfão 1 rec eptor tirosina quinase like (ROR1), survivina, glicoproteína trofoblástica (TPBG, tam- bém conhecida como 5T4), glicoproteína 72 associada a tu-

mor (TAG72), proteína 1 relacionada à tirosinase (TRP1, também conhecida como TYRP1 ou gp75), proteína 2 relaci- onada à tirosinase (TRP2, também conhecida como dopa- croma tautomerase, dopacroma delta -isomerase ou DCT), receptor do fator de crescimento endotelial vascular (VEGFR), receptor do fator de crescimento endotelial vascu- lar 2 (VEGFR2), tumor de W ilms 1 (W T -1), um antígeno pa- tógeno-específico ou expresso em patógenos, ou um antíge- no associado a uma etiqueta universal, e/ou moléculas bioti- niladas, e/ou moléculas expressas por HIV, HCV, HBV ou ou- tros patógenos.

[0052] Em algumas de quaisquer tais modalidades, o re- ceptor recombinante é ou contém um receptor de antígeno funcional não-TCR ou um TCR ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo. Em algumas modalidades, o receptor recombinante é um receptor de antígeno quimérico (CAR).

[0053] Em algumas modalidades, a amostra é da compos i- ção de células ou um subconjunto da mesma selecionada dentre (1) células na composição de células, (2) células CD3+ na composição de células; (3) células T CD4+ na com- posição de células; (4) células T CD8+ na composição de cé- lulas; (5) receptor recombinan te+ células na composição de células; (6) receptor recombinante+células CD3+ na compo- sição de células, (7) receptor recombinante+CD8+ células na composição de células, ou (8) receptor recombinante+CD4+ células na composição de células, opcionalmente em que o receptor recombinante é um CAR.

[0054] Neste pedido são apresentadas composições de cé- lulas geneticamente modificadas produzidas por um processo no qual o perfil de espectrometria de massas de uma amos-

tra da composição de células geneticamente modificadas ou um subconjunto da mesma varia em não mais que 40%, não mais que 30%, não mais que 20%, não mais que 10% ou não mais que 5% entre o perfil de espectrometria de massas mé- dio de uma pluralidade de composições de células genetica- mente modificadas produzidas pel o processo, ou varia de tal média em não mais que um desvio padrão entre componen- tes de dados do perfil de espectrometria de massas.

[0055] Neste pedido são apresentadas composições de cé- lulas geneticamente modificadas produzidas por um processo no qual o nível de pelo menos um componente dos dados de um perfil de espectrometria de massas, obtido usando uma técnica de espectroscopia de massas, de uma amostra de uma composição de células geneticamente modificadas ou um subconjunto da mesma varia em não mais que 40 %, não mais que 30%, não mais que 20%, não mais que 10% ou não mais que 5% do nível de pelo menos um componente dos dados de um perfil de espectrometria de massas de referên- cia baseado em inúmeros perfis de espectrometria de mas- sas de amostras de uma plura lidade de composições de cé- lulas geneticamente modificadas produzidas pelo processo, ou varia de tal referência em não mais que o desvio padrão do nível de pelo menos um componente de dados através dos inúmeros de perfis de espectrometria de massas.

[0056] Em algumas modalidades, a composição de células geneticamente modificadas inclui um receptor recombinante. Em algumas modalidades, a composição de células geneti- camente modificadas inclui células imunes.

[0057] Em algumas modalidades, o processo para prdou- ção da composição de células geneticamente modificadas inclui (i) selecionar ou isolar células imunes de uma amostra proveniente de um indivíduo, gerando assim uma composição fonte, opcionalmente em que a amostra biológica é uma amostra de leucaférese, uma amostra de a férese ou uma amostra de sangue total; (ii) incubar as células da composi- ção fonte com um reagente estimulador, gerando assim uma composição estimulada, em que a incubação é opcionalmen- te realizada na presença de uma ou mais citocinas; (iii) in- troduzir um ácido nucleico codificando o receptor recombi- nante nas células imunes da composição estimulada, geran- do assim uma composição transformada; e (iv) cultivar a composição estimulada a 37º C por pelo menos 24 horas, ge- rando assim a composição de células ge neticamente modifi- cadas, em que a cultura é opcionalmente realizada na pre- sença de uma ou mais citocinas.

[0058] Em algumas modalidades, a composição de células é enriquecida nas células imunes. Em algumas modalidades, as células imunes incluem linfócitos. Em alg umas modalida- des, os linfócitos incluem células T ou células exterminado- ras (NK) naturais. Em alguns exemplos, os linfócitos incluem células T e as células T são células T CD4+ e/ou CD8+.

[0059] Em algumas modalidades, a composição de células geneticamente modificadas é enriquecida nas células imu- nes. Em algumas modalidades, a composição fonte é enri- quecida nas células imunes. Em algumas modalidades, a composição transformada é enriquecida nas células imunes.

[0060] Em algumas modalidades, as células imunes são humanas.

[0061] Em algumas modalidades, as células imunes são células T, opcionalmente células T CD4+ e/ou CD8+, e o re-

agente estimulador é capaz de ativar um ou mais domínios de sinalização intracelular de um ou mais componentes de um complexo de TCR e/ou um ou mais do mínios de sinaliza- ção intracelular de uma ou mais moléculas coestimuladoras. Em algumas modalidades, o reagente estimulador inclui um agente primário que se liga especificamente a um membro de um complexo de TCR e um agente secundário que se liga especificamente a uma molécula coestimuladora de células T. Em alguns casos, o agente primário liga -se especifica- mente à CD3 e/ou a molécula coestimuladora é selecionada do grupo que consiste em CD28, CD137 (4 -1-BB), OX40, ou ICOS.

[0062] Em algumas modalidades, o reagen te estimulador inclui um anticorpo anti-CD3 ou um fragmento de ligação de antígeno do mesmo e um anticorpo anti-CD28 ou um frag- mento de ligação de antígeno do mesmo. Em algumas moda- lidades, os agentes primário e secundário estão presentes na superfície de um suporte sólido, opcionalmente em que o su- porte sólido é uma conta. Em algumas modalidades, os agentes primário e secundário estão presentes na superfície de um reagente oligomérico solúvel incluindo a estreptavidi- na ou uma estreptavidina muteína.

[0063] Em algumas modalidades, o cultivo foi realizado em condições para promover a proliferação e/ou a expansão das células geneticamente modificadas. Em algumas modalida- des, a amostra é processada a partir da composição de célu- las geneticamente modificadas por marcação de uma ou mais proteínas de superfície, lise das células, e isolamento da uma ou mais proteínas. Em algumas modalidades, o método inclui ainda a digestão da uma ou mais proteínas isoladas.

Em algumas modalidades, a digestão é realizada por proteó- lise na presença de uma ou mais proteases que são capazes de clivar uma ou mais ligações peptídicas.

[0064] Em algumas modalidades, a uma ou mais proteases são ou contêm tripsina. Em algumas modalidades, a uma ou mais proteínas incluem proteínas da membrana da superfíci e celular. Em algumas modalidades, a lise das células inclui incubação na presença de um detergente. Em alguns exem- plos, o detergente é um detergente não iônico.

[0065] Em algumas modalidades, o detergente é ou con- tém uma quantidade eficaz de Triton X -100. Em alguns ca- sos, o detergente é um detergente desnaturante. Em algu- mas modalidades, o detergente desnaturante é ou contém uma quantidade eficaz de dodecil sulfato de sódio (SDS). Em algumas modalidades, depois da lise das células, o método inclui ainda remover o detergente da composição lisada.

[0066] Em algumas modalidades, a marcação das proteí- nas superficiais inclui marcação com aminas primárias com biotina.

[0067] Em algumas modalidades, a uma ou mais proteínas são isoladas usando um reagente compreendendo avidina, estreptavidina, NeutrAvidin™ ou CaptAvidin™.

[0068] Em algumas modalidades, a técnica de espectrome- tria de massas inclui submeter a amostra à cromatografia lí- quida (LC) seguida por espectrometria de massas. Em al- guns exemplos, a cromatografia líquida é cromatografia l í- quida de alta eficiência (HPLC), cromatografia líquida de ul- tra-alta eficiência (UHPLC), ou cromatografia líquida de ultra eficiência (UPLC). Em algumas modalidades, a cromatografia líquida é cromatografia líquida de ultra eficiência (UPLC). Em alguns casos, a cromatografia líquida e a espectrometria de massas são realizadas online. Em algumas modalidades, a cromatografia líquida é selecionada dentre cromatografia em fase normal (NP-), em fase reversa (RP) e de interação hi- drofílica (HILIC).

[0069] Em algumas modalidades, o espectrômetro de mas- sas que executa a espectrometria de massas inclui um ou mais de um analisador de massas quadrupolo, com armadi- lha de íons, por tempo de voo (TOF), ou por ressonância ci- clotrônica de íons por transformada de Fourier. Em algumas modalidades, o espectrômetro de massas inclui um analisa- dor de massas com armadilha de íons que é um analisador de massas com armadilha de íons quadrupolo tridimensional, um analisador de massas com armadilha de íons cilíndrico, um analisador de massas com armadilha de íons quadrupolo linear, ou um analisador de massas Orbitrap. Em algumas modalidades, o espectrômetro de massas é um espectrôme- tro massas quadrupolo-Orbitrap.

[0070] Em algumas modalidades, os componentes de da- dos são selecionados dentre inform ações sobre os íons de MS, cromatógrafo de íons totais (TIC) ou uma parte do mes- mo, cromatograma de íons extraídos (XIC) ou uma parte do mesmo, pico de sinais de íons de MS de peptídios, pico de sinais de íons de MS de proteínas, informações de identifi- cação de peptídios, informações de identificação de proteí- nas, informações qualitativas, informações quantitativas, in- formações estruturais, modificações pós-translacionais. Em algumas modalidades, o componente de dados é um XIC ou uma parte do mesmo, em que o XIC ou parte do mesmo ba- seia-se em um ou mais valores m/z teóricos ou conhecidos de um ou mais componentes peptídicos do receptor recombi- nante.

[0071] Em algumas modalidades, o um ou mais componen- tes peptídicos é um componente peptídico proteoliticamente clivado ou digerido, opcionalmente em que a protease é trip- sina.

[0072] Em algumas modalidades, o receptor recombinante é ou inclui um receptor quimérico e/ou um receptor de antí- geno recombinante. Em algumas modalidades, o receptor re- combinante é capaz de se ligar a um antígeno alvo que é as- sociado, a específico para, e/ou expresso em uma célula ou tecido de uma doença, distúrbio ou condição. Em alguns ca- sos, a doença, distúrbio ou condição é uma doença ou dis- túrbio infeccioso, uma doença autoimune, uma doença infla- matória, ou um tumor ou um câncer.

[0073] Em algumas modalidades, o antígeno alvo é um an- tígeno tumoral. Em alguns exemplos, o antígeno alvo é sele- cionado dentre integrina αvβ6 (integrina avb6), antígeno de maturação de células B (BCMA), B7 -H3, B7-H6, anidrase carbônica 9 (CA9, também conhecida como CAIX or G250), um antígeno câncer-testículo, antígeno câncer/testículo 1B (CTAG, também conhecido como NY-ESO-1 e LAGE-2), antí- geno carcinoembrionário (CEA), uma ciclina, ciclina A2, li- gante 1 de quimiocina C-C (CCL-1), CD19, CD20, CD22, CD23, CD24, CD30, CD33, CD38, CD44, CD44v6, CD44v7/8, CD123, CD133, CD138, CD171, proteoglicano sulfato de condroitina 4 (CSPG4), proteína de fator de crescimento epi- dérmico (EGFR), proteína truncada de fator de crescimento epidérmico (tEGFR), mutação do receptor de fator de cres- cimento epidérmico tipo III (EGFR vIII), glicoproteína epitelial

2 (EPG-2), glicoproteína epitelial 40 (EPG -40), efrinB2, re- ceptor de efrina A2 (EPHa2), receptor de estrogênio, recep- tor Fc like 5 (FCRL5; também c onhecido como receptor Fc homólogo 5 ou FCRH5), receptor de acetilcolina fetal (fetal AchR), uma proteína de ligação de folato (FBP), receptor alfa de folato, gangliosídeo GD2, GD2 O -acetilado (OGD2), gan- gliosídeo GD3, glicoproteína 100 (gp100), glipicano-3 (GPC3), receptor 5D acoplado à proteína G (GPCR5D), Her2/neu (tirosina quinase receptora erb-B2), Her3 (erb-B3), Her4 (erb-B4), dímeros de erbB, antígeno associado à mela- noma humano de alto peso molecular (HMW -MAA), antígeno de superfície da hepatite B, antígeno leucocitário humano A1 (HLA-A1), antígeno leucocitário humano A2 (HLA -A2), recep- tor alfa de IL-22 (IL-22Rα), receptor alfa 2 de IL -13 (IL- 13Rα2), receptor do domínio inserto quinase (kdr), cadeia leve capa, molécula de adesão de células L1 (L1 -CAM), epí- topo CE7 de L1-CAM, repetição rica em leucina contendo o membro A da família 8 (LRRC8A), Lewis Y, antígeno associ- ado a melanoma (MAGE)-A1, MAGE-A3, MAGE-A6, MAGE- A10, mesotelina (MSLN), c-Met, citomegalovírus murino (CMV), mucina 1 (MUC1), MUC16, lig antes de membro D do grupo 2 de células exterminadoras naturais (NKG2D), melana A (MART-1), molécula de adesão de células neurais (NCAM), antígeno oncofetal, antígeno de melanoma preferencialmente expresso (PRAME), receptor de progesterona, um antígeno específico para próstata, antígeno de células-tronco da prós- tata (PSCA), antígeno membranar específico para próstata (PSMA), receptor órfão 1 receptor tirosina quinase like (ROR1), survivina, glicoproteína trofoblástica (TPBG, tam- bém conhecida como 5T4), glic oproteína 72 associada a tu-

mor (TAG72), proteína 1 relacionada à tirosinase (TRP1, também conhecida como TYRP1 ou gp75), proteína 2 relaci- onada à tirosinase (TRP2, também conhecida como dopa- croma tautomerase, dopacroma delta -isomerase ou DCT), receptor do fator de crescimento endotelial vascular (VEGFR), receptor do fator de crescimento endotelial vascu- lar 2 (VEGFR2), tumor de W ilms 1 (W T -1), um antígeno pa- tógeno-específico ou expresso em patógenos, ou um antíge- no associado a uma etiqueta universal, e/ou mo léculas bioti- niladas, e/ou moléculas expressas por HIV, HCV, HBV ou ou- tros patógenos.

[0074] Em algumas modalidades, o receptor recombinante é ou inclui um receptor de antígeno funcional não -TCR ou um TCR ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo. Em al- gumas modalidades, o receptor recombinante é um receptor de antígeno quimérico (CAR).

[0075] Neste pedido estão apresentados métodos para avaliação de um reagente usado no processo de produção de uma composição de células geneticamente modificadas in- cluindo comparar um perfil de espectrometria de massas de uma amostra de um primeiro reagente com um perfil de es- pectrometria de massas de referência do reagente, em que o perfil de espectrometria de massas é obtido usando uma téc- nica de espectrometria de massas; e identifica r uma ou mais diferenças na presença, ausência ou nível de pelo menos um componente dos dados no perfil de espectrometria de mas- sas de teste em relação ao perfil de espectrometria de mas- sas de referência, identificando assim um perfil de espectro- metria de massas do reagente. Em algumas modalidades, o perfil de espectrometria de massas de referência é de uma amostra de um reagente de referência ou é um perfil médio de espectros de massas de inúmeras amostras de uma plura- lidade de lotes diferfentes do reagent e. Em algumas modali- dades, o perfil de espectrometria de massas de referência é um perfil de espectrometria de massas médio de uma amos- tra de uma pluralidade de lotes diferentes do reagente.

[0076] Em algumas modalidades, o método inclui ainda de- terminar a presença, ausência ou nível de variabilidade ou variância do perfil de espectrometria de massas da amostra para o perfil de espectrometria de massas médio. Em algu- mas modalidades, o método inclui ainda selecionar um rea- gente se a variabilidade ou variância do pe rfil de espectro- metria de massas entre the plurality of the different lots do reagente for não mais que 40%, não mais que 30%, não mais que 20%, não mais que 10% ou não mais que 5%, ou variar de tal média em não mais que um desvio padrão entre com- ponentes de dados do perfil de espectrometria de massas.

[0077] Em algumas modalidades, o método inclui ainda se- lecionar o reagente se a quantidade de variabilidade na pre- sença, ausência, ou nível de pelo menos um componente dos dados através dos inúmeros de perfis de esp ectrometria de massas for não mais que 40%, não mais que 30%, não mais que 20%, não mais que 10%, ou não mais que 5% do nível de pelo menos um componente dos dados no perfil de espec- trometria de massas de referência.

[0078] Em algumas modalidades, o método inclui ainda se- lecionar o reagente se o nível de pelo menos um componente dos dados do perfil de espectrometria de massas de teste variar em não mais que 40%, não mais que 30%, não mais que 20%, não mais que 10% ou não mais que 5% do nível de pelo menos um componente dos dados do perfil de espec- trometria de massas de referência, ou variar de tal nível em não mais que o desvio padrão do nível de pelo menos um componente de dados através dos inúmeros de perfis de es- pectrometria de massas.

[0079] Em algumas modalidades, a técnica de espectrome- tria de massas compreende submeter a amostra à cromato- grafia líquida (LC) seguida por espectrometria de massas. Em algumas modalidades, a cromatografia líquida é croma- tografia líquida de alta eficiência (HPLC), cromatografia lí- quida de ultra-alta eficiência (UHPLC), ou cromatografia lí- quida de ultra eficiência (UPLC). Em alguns casos, a croma- tografia líquida é cromatografia líquida de ultra eficiência (UPLC).

[0080] Em algumas modalidades, a cromatografia líquida e a espectrometria de massas são realizadas online. Em algu- mas modalidades, a cromatografia líquida é selecionada den- tre cromatografia em fase normal (NP -), em fase reversa (RP) e de interação hidrofílica (HILIC). Em algumas modali- dades, o espectrômetro de ma ssas que executa a espectro- metria de massas compreende um ou mais de um analisador de massas quadrupolo, com armadilha de íons, por tempo de voo (TOF), ou por ressonância ciclotrônica de íons por trans- formada de Fourier.

[0081] Em algumas modalidades, o espectrôm etro de mas- sas compreende um analisador de massas com armadilha de íons que é um analisador de massas com armadilha de íons quadrupolo tridimensional, um analisador de massas com armadilha de íons cilíndrico, um analisador de massas com armadilha de íons quadrupolo linear, ou um analisador de massas Orbitrap. Em algumas modalidades, o espectrômetro de massas é um espectrômetro massas quadrupolo -Orbitrap.

[0082] Em algumas modalidades, os componentes de da- dos são selecionados dentre informações sobre os íons de MS, cromatógrafo de íons totais (TIC) ou uma parte do mes- mo, cromatograma de íons extraídos (XIC) ou uma parte do mesmo, pico de sinais de íons de MS de peptídios, pico de sinais de íons de MS de proteínas, informações de identifi- cação de peptídios, informações de identificação de proteí- nas, informações qualitativas, informações quantitativas, in- formações estruturais, modificações pós-translacionais.

[0083] Em algumas modalidades, o reagente é um rea- gente capaz de estimular um sinal nas células de uma com- posição de células, opcionalmente uma composição de célu- las T. Em algumas modalidades, as células da composição de células compreendem um receptor recombinante, opcio- nalmente um receptor de antígeno quimérico. Em algumas modalidades, o reagente é capaz de estimular ou induzir uma atividade dependente de um receptor recombinante nas célu- las da composição de células. Breve Descrição dos Desenhos

[0084] As FIGS. 1A e 1B mostram leituras exemplificativas da análise por espectrometria de massas de proteínas de superfície celular isoladas de uma composição de células T (CAR-) fonte identificada e de uma composição de células T (CAR+) geneticamente modificadas identificada. A FIG. 1A representa um cromatograma de íons totais (TIC) exemplifi- cativo representando os íons de peptídio d e proteínas da su- perfície celular. A FIG. 1B representa um cromatograma de íons extraídos (XIC) exemplificativo para picos de peptídio associados a porções extracelulares e intracelulares de um CAR da composição de células T geneticamente modificadas e da composição de células T fonte.

[0085] A FIG. 2 representa perfis de análise por LC para três proteínas individuais presentes em um reagente, inclu- indo uma proteína com modificação pós -translacional (PTM) isolada de três lotes diferentes de uma matéria-prima exem- plificativa usada em um processo para produzir composições de células T (CAR+) geneticamente modificadas, e relações de massa para carga (m/z) para proteínas coeluídas.

[0086] A FIG. 3 representa uma análise por espectrometria de massas da percentagem relativa da Proteína 2 (com modi- ficações pós-translacionais (PTMs)) e da Proteína 3 em três amostras de titulação diferente do reagente bruto usado em um processo para produção de composições de células T (CAR+) geneticamente modificadas.

[0087] As FIGS. 4A-C mostra cromatogramas produzidos por HILIC-LC e por MS em tandem da liberação de N - glicanas a partir de células T ativadas CD3+ intactas inte- grais depois de tratamento com PNGase F. A FIG. 4A mostra um cromatograma de HILIC-FLR de N-glicanas liberadas por PNGase F a partir da composição de células T CD3+ ativa- das. A FIG. 4B mostra um cromatograma de íons extraídos (XIC) produzidos no primeiro estágio da MS em tandem para a N-glicana exemplificativa, A3S3F (massa teórica de 1113,0933), no estado carregado +3 usando uma tolerância de massa de 5 ppm. A FIG. 4C mostra a fragmentação por MS/MS de uma outra N-glicana exemplificativa, A3S4F (mas- sa teórica de 1210,4614), produzida no segundo estágio da MS em tandem. As caixas tracejadas na FIG. 4C indicam di-

ferentes ligações do resíduo n-acetil glucosamina. Descrição Detalhada

[0088] Neste pedido estão apresentados métodos para identificar perfis de espectrometria de massas de composi- ções de células, incluindo composições de células genetica- mente modificadas, por exemplo, composições de c élulas T CAR autólogas. Em alguns aspectos, os métodos apresenta- dos envolvem determinar um perfil de espectrometria de massas (por exemplo, um perfil de espectrometria de massas de teste) de uma amostra de uma composição de células ge- neticamente modificadas usando uma técnica de espectrome- tria de massas. Em alguns aspectos, a composição de célu- las geneticamente modificadas contém ou inclui células com- preendendo um receptor recombinante (por exemplo, um CAR). Em aspectos particulares, o perfil de espectromet ria de massas é comparado com um perfil de espectrometria de massas de referência, tal como um perfil de espectrometria de massas de referência de ou obtido de uma amostra de uma composição usada como uma referência (por exemplo, uma composição de células de referência) determinado usando a mesma técnica de espectrometria de massas, tal como identificar uma ou mais diferenças na presença, au- sência, ou nível de pelo menos uma espécie de peptídio, in- cluindo modificações pós-translacionais da mesma, em um perfil de espectrometria de massas de teste em relação a um perfil de espectrometria de massas de referência.

[0089] Neste pedido também estão apresentados métodos para caracterização de um processo, por exemplo, um pro- cesso de produção, para produção de uma compos ição de células geneticamente modificadas. Em certas modalidades,

perfis de espectrometria de massas de composições de célu- las obtidas em diferentes estágios do processo são analisa- dos para caracterizar o processo, ou, em alguns aspectos, para caracterizar as alterações sofridas pelas células duran- te o processo. Em alguns aspectos, perfis de espectrometria de massas de composições de células geneticamente modifi- cadas produzidas por diferentes processos, por exemplo, processos de produção para produção das c élulas genetica- mente modificadas, são analisados para caracterizar os pro- cessos, ou, em alguns aspectos, para caracterizar seme- lhanças ou diferenças de composições de células produczi- das por diferentes processos.

[0090] Em alguns aspectos, são apresentadas métod os para avaliação de um processo para produção de uma com- posição de células geneticamente modificadas. Em alguns aspectos, os métodos são ou incluem obter um perfil de es- pectrometria de massas médio de uma amostra de uma plu- ralidade de composições de célul as geneticamente modifica- das de referência ou um subconjunto da mesma e determinar a presença, ausência ou nível de variabilidade ou variância do perfil de espectrometria de massas médio. Em algumas modalidades, a pluralidade das composições de referência contém células expressando um receptor recombinante pro- duzido pelo mesmo processo ou substancialmente o mesmo processo.

[0091] Em alguns aspectos, são apresentadas métodos pa- ra avaliação de um processo para produção de uma compo- sição de células geneticamente modificadas. Em alguns as- pectos, os métodos são ou incluem obter inúmeros perfis de espectrometria de massas de amostras de uma pluralidade de composições de células geneticamente modificadas de referência ou um subconjunto da mesma, produzir um perfil de espectrometria de massas médio dos mesmos, e determi- nar a presença, ausência, ou nível de pelo menos uma espé- cie de peptídio, incluindo modificações pós -translacionais da mesma, no perfil de espectrometria de massas médio. Em alguns aspectos, os métodos incluem ainda determinar a quantidade de variabilidade ou variância no nível de pelo menos uma espécie de peptídio, incluindo modificações pós- translacionais da mesma, através da pluralidade de perfis de espectrometria de massas. Em alguns aspectos, a quantida- de de variabilidade ou variância no nível da pelo menos uma espécie de peptídio é comparado ao nível médio da pelo me- nos uma espécie de peptídio, determinando assim a exten- são de variabilidade através das amostras. Em algumas mo- dalidades, a pluralidade das composições de referência con- tém células expressando um receptor recombinante produzi- do pelo mesmo processo ou substancia lmente o mesmo pro- cesso.

[0092] Em alguns aspectos, são apresentadas métodos pa- ra avaliação de um processo para produção de uma compo- sição de células geneticamente modificadas. Em alguns as- pectos, os métodos são ou incluem obter inúmeros perfis de espectrometria de massas de amostras de uma pluralidade de composições de células geneticamente modificadas de referência ou um subconjunto da mesma e determinar a quantidade de variabilidade ou variância no nível de pelo menos uma espécie de peptídio, incluindo modific ações pós- translacionais da mesma, através da pluralidade de perfis de espectrometria de massas. Em algumas modalidades, a plu-

ralidade das composições de referência contém células ex- pressando um receptor recombinante produzido pelo mesmo processo ou substancialmente o mesmo processo.

[0093] Também são apresentados métodos para caracteri- zação de um processo para produção de células genetica- mente modificadas ou composições de células. Em alguns aspectos, os métodos envolvem obter um primeiro e um se- gundo perfil de espectrometria de massas de amostras de diferentes composições de células usando uma técnica de espectrometria de massas e identificar uma ou mais diferen- ças na presença, ausência, ou nível de pelo menos um com- ponente de dados nos perfis de espectrometria de massas. Em algumas modalidades, as composições de células são ou contêm compositions em diferentes estágios de um processo de produção para produção de uma composição de células geneticamente modificadas. Em certas modalidades, as com- posições contêm células geneticamente modificadas produ- zidas por diferentes processos.

[0094] Em alguns aspectos, os métodos apresentados são úteis para avaliar ou caracterizar um receptor recombinante, tal como por obtenção de um perfil de espectrometria de massas de teste de um receptor recombinante usando uma técnica de espectrometria de massas, de uma amostra. Em algumas modalidades, a amostra é de uma composição de células geneticamente modificadas de teste ou um subcon- junto da mesma compreendendo células imunes expressando ou compreendendo o receptor recombinante, o referido perfil de espectrometria de massas compreendendo pelo menos um componente dos dados.

[0095] Métodos adicionais apresentados neste pedido po-

dem ser empregados para analisar ou avaliar as proteínas superficiais de uma composição de células geneticamente modificadas. Em algumas modalidades, tais métodos incluem etapas de marcar uma ou mais proteínas de superfície pre- sentes nas células de uma composição de células genetica- mente modificadas ou um subconjunto da mes ma, lisar as células da composição de células marcada, isolar as proteí- nas de superfície, e em seguida submeter as proteínas de superfície a uma técnica de espectrometria de massas. Em alguns aspectos, os métodos produzem um perfil de espec- trometria de massas contendo componentes de dados, tais como componentes relacionados a uma ou mais proteínas de superfície, incluindo em alguns casos um receptor recombi- nante ou CAR.

[0096] Modalidades particulares contemplam que terapias celulares, e em particular terapias com células T adotivas, representam uma tecnologia poderosa para o tratamento, alívio, e/ou melhora de várias doenças, tal como câncer. As atuais ferramentas analíticas disponíveis para análise ou ca- racterização de composições de células terapêuticas ou far- macêuticas incluem o exame de marcadores de superfície celular ou internos tal como por citometria de fluxo ou ex- pressão gênica por técnicas tais como RNA -seq ou ATAC- seq. Embora tais técnicas possam ser úteis em alguns as- pectos para analisar ou caracteriz ar composições de células, essas técnicas apresentam limitações. Por exemplo, em al- guns aspectos, a detecção da expressão de proteínas, tal como por métodos baseados em citometria de fluxo, pode ser limitada pela quantidade de diferentes marcadores individu- ais que podem ser examinados em um único experimento.

Em alguns aspectos, tais ensaios concentram -se em alvos que, segundo previsto ou por hipótese, sofrem alterações em determinadas circunstâncias devido à quantidade limitada de alvos que podem ser avaliados. Ao contrário, análise da ex- pressão gênica por RNA-seq ou ATAC-seq é adequada para ampla triagem do genoma, permitindo a detecção imparcial de alvos que podem ser afetados por determinadas condi- ções. No entanto, uma limitação dessa técnica é que as al te- rações no nível de expressão gênica nem sempre estão cor- relacionadas com o as alterações no nível de expressão de proteínas funcionais.

[0097] Em modalidades particulares, neste pedido são apresentados métodos imparciais úteis para detectar, identi- ficar, e/ou quantificar proteínas, tais como proteínas de su- perfície celular, presentes em uma composição de células. Em aspectos particulares, uma vantagem dos métodos apre- sentados é que os métodos podem ser empregados para de- tectar alterações em uma proteína, por ex emplo, proteína superficial, em diferentes condições sem a necessidade de escolher ou predizer alvos específicos antes da análise. Em alguns aspectos, uma vantagem adicional dos métodos apre- sentados é que os métodos possibilitam a análise de proteí- nas, tais como proteínas superficiais funcionais, em larga escala. Assim sendo, em alguns aspectos, os métodos apre- sentados são adequados para serem usados seja isolada- mente ou em combinação com métodos existentes para a análise ou caracterização de composições de células, tais como composições para terapia celular.

[0098] Em alguns aspectos, as terapias celulares tais co- mo terapias com células T CAR são células vivas que são derivadas de indivíduos e são geneticamente modificadas para produzir um produto medicamentoso fi nal. Assim sendo, ao contrário de moléculas pequenas ou produtos biológicos tradicionais, em alguns casos, pode ser difícil manipular ge- neticamente de forma consistente composições para terapia celular que sejam adequadas para administração a um indi- víduo. Por exemplo, em alguns aspectos, as células originá- rias de pacientes individuais diferentes sofrendo de uma do- ença particular podem variar em certos atributos, tais como saúde da célula, viabilidade, atividade e capacidade de proli- feração. Tais diferenças podem dever-se a graus ou varia- ções diferentes da doença através dos pacientes, ou em al- guns aspectos, podem ser devidas a diferentes históricos genéticos ou ambientais dos pacientes. Em alguns aspectos, quaisquer diferenças entre as composições de células obti- das dos indivíduos podem ser exacerbadas por diferentes reações ao processo de manipulação genética. Em alguns aspectos, os métodos apresentados podem ser empregados para avaliar a variabilidade ou variância de uma terapia celu- lar gerada através de múltiplos indivíduos, ou para assegurar que uma composição de células individual esteja dentro de uma tolerância acietável em relação a um padrão ideal ou de referência antes da administração da terapia celular.

[0099] Em alguns aspectos, os métodos apresentados u ti- lizam espectrometria de massas para caracterizar algumas ou todas as proteínas de superfície celular presentes nas cé- lulas de uma composição de células, permitindo assim que diferentes aspectos das células sejam avaliados de uma só vez. Em alguns aspectos, os métodos apresentados identifi- cam e medem o nível ou quantidade das proteínas superfici-

ais individuais presentes nas células. Esta técnica é útil, in- ter alia, para monitorar alterações que ocorrem entre compo- sições de células individuais durante um pr ocesso de mani- pulação genética, ou para verificar a identidade e a qualida- de de uma terapia celular antes da administração da terapia celular a um pacientes. Em certos aspectos, uma vantagem dos métodos apresentados é que os métodos podem detectar alterações que não seriam percebidas por técnicas que se limitam a uma análise de apenas diversas proteínas alvo por vez, tais como técnicas que dependem da marcação de anti- corpos para detectar proteínas.

[00100] Em aspectos particulares, um único marcador ou proteína superficial não seria suficiente para detectar em que grau uma célula T possui uma propriedade particular. Uma vantagem dos métodos apresentados é que é possível avali- ar ao mesmo tempo as alterações em múltiplos marcadores associados a uma propriedade, possibilitando assim que al- terações ao longo de um continuum ao longo de diversas propriedades diferentes sejam detectadas em uma única ava- liação.

[00101] Os métodos apresentados neste pedido demons- tram que perfis de espectrometria de massas podem ser ge- rados com sucesso a partir de composições de células, tais como composições de terapia celular. Em alguns aspectos, os perfis de espectrometria de massas possibilitam ainda in- vestigação de componentes de dados associados a uma ou mais proteínas ou peptídios de uma compos ição de células geneticamente modificadas, incluindo modificações pós- translacionais do mesmo, para caracterizar terapias celula- res e o impacto que diferentes processos de manipulação genética podem ter nas células.

[00102] Uma vantagem particular dos métodos apre senta- dos inclui o alto grau de resolução atingido para detectar e medir uma multiplicidade de alvos proteicos em uma amos- tra. Em alguns aspectos, este alto grau de sensibilidade permite a detecção e quantificação de modificações pós - translacionais, tal como conjugação de glicanas às proteí- nas. Em alguns aspectos, as medidas ou quantificação de modificações pós-translacionais podem ser comparadas com outras leituras das amostras, tais como leituras genômicas produzidas por RNA-seq ou pelo “Assay for Transpos ase- Accessible Chromatin using sequencing” (ATAC-seq). Tais comparações são úteis, inter alia, para identificar ou avaliar como as alterações nas enximas no nível genômico podem influenciar modificações pós-translacionais específicas, e podem, em alguns casos, ser úteis para desenvolver outros ensaios para avaliar as propriedades ou a funcionalidade nas células. Por exemplo, em alguns aspectos, os métodos apre- sentados podem ser usados para detectar a glicosilação de proteínas de superfície celular, e tais d ados podem ser cor- relacionados com a expressão de genes de glicotransferases individuais. Em alguns aspectos, tal correlação poderia ser útil para identificar ou determinar como alterações no nível genético influenciam a função da célula.

[00103] Em certos aspectos, os métodos apresentados in- corporam espectrometria de massas para obter uma ferra- menta poderosa para analisar misturas complexas. Em al- guns aspectos, foi observado que em alguns casos, altera- ções nas condições de armazenamento ou manuseio das ma- térias-primas ou reagentes ou diferentes lotes de matéria -

prima ou reagente usads em um processo para produção de uma composição de células T geneticamente modificadas - em um processo de manipulação genética de células de res- to similar - podem estar correlacionadas, na composição ge- neticamente modificada final, com determinados parâmetros associados à atividade alterada ou variada do produto de cé- lulas T geneticamente modificadas (Pedido PCT publicado N° W O2018/157171). Por exemplo, em alguns aspectos, o de- senvolvimento, produção, ou manipulação genética de tera- pias celulares pode exigir reagentes complexos, tais como reagentes que são ou incluem uma ou mais proteínas. Em alguns aspectos, reagentes que atendem a todos os critérios de liberação do fabricante podem ap resentar variação de lote para lote e, portanto, em alguns aspectos, podem exigir aná- lise adicional para garantir que os reagentes não contribuem para variabilidade ou variência indesejada da terapia celular. Os métodos apresentados oferecem meios adiciona is para investigar tais misturas complexas para identificar potenciais alterações nas terapias celulares ou nos reagentes para ga- rantir que as terapias celulares ou os reagentes são adequa- dos e seguros para uso.

[00104] Em alguns aspectos, os métodos apresentados po- dem aprimorar ensaios baseados em espectrometria de mas- sas, por exemplo, LC-MS, para identificar diferenças (ou fal- ta delas) entre lotes de matérias -primas de reagentes, por exemplo, dos reagentes useados para manipulação genética de composições de células, no nível de proteínas. Em alguns aspectos, os ensaios baseados em espectrometria de mas- sas podem ser suficientemente sensíveis para detectar dife- renças entre os lotes de produção, inclusive diferenças que podem não afetar as interações entre o reagente e as célu- las, no entanto, em alguns aspectos, os métodos apresenta- dos permitem focar em um subconjunto de difereças biologi- camente relevantes. Assim sendo, em alguns aspectos, em- bora os métodos apresentados produzam uma análise impar- cial de uma composição de células ou de um reagente, os conjunts de dados resultantes, por exemplo, perfis de espec- trometria de massas, podem ser usados para avaliar um sub- conjunto de proteínas alvo que, segundo previsto ou por hi- pótese, são biologicalmente relevantes.

[00105] Todas as publicações, incluindo documentos paten- tários, artigos científicos e bancos de dados, mencionados neste pedido estão aqui incorporados em sua íntegra a título de referência para todos os efeitos na mesma medida em que cada publicação individual estaria in dividualmente incor- porada a título de referência. Se uma definição apresentada neste pedido for contrária ou de alguma forma inconsistente com uma definição apresentada nas patentes, pedidos, pedi- dos publicados e outras publicações que estão aqui incorpo- radas a título de referência, a definição apresentada neste pedido prevalece sobre a definição aqui incorporada a título de referência.

[00106] Os títulos de seções usados neste pedido têm a fi- nalidade de organização apenas e não devem ser interpreta- dos como limitativos da matéria descrita. I. ANÁLISE DE COMPOSIÇÕES DE CÉLULAS POR ESPECTROMETRIA DE MASSAS:

[00107] Em alguns aspectos do presente pedido estão apresentados métodos para identificação de um perfil de es- pectrometria de massas (MS) de uma composição de células,

tal como uma composição de células geneticamente modifi- cadas. Em algumas modalidades, as células geneticamente modificadas expressam uma proteína recombinante, tal como um receptor recombinante ou um CAR. Em modalidades par- ticulares, os métodos incluem uma etapa para determinar um perfil de espectrometria de massas , por exemplo, um perfil de espectrometria de massas de teste, de uma amostra da composição de células geneticamente modificadas (por exemplo, a composição de células de teste) usando uma téc- nica de espectrometria de massas. Em algumas modalida- des, o perfil de espectrometria de massas de teste é compa- rado com um perfil de espectrometria de massas de referên- cia, tal como para identificar differences entre um ou mais componentes de dados dos perfis de espectrometria de mas- sas.

[00108] Em alguns aspectos do presente pedido também são apresentados métodos para identificação de um perfil de espectrometria de massas (MS) de uma composição de célu- las geneticamente modificadas, os métodos compreendendo: (a) determinar um perfil de espectrometria de massas de tes- te de uma amostra de uma composição de células genetica- mente modificadas de teste usando uma técnica de espec- trometria de massas, a referida composição de células gene- ticamente modificadas de teste compreendendo células imu- nes compreendendo um receptor recombinante; (b) comparar o perfil de espectrometria de massas de teste com um perfil de espectrometria de massas de referência; e (c) identificar uma ou mais diferenças na presença, ausência, ou nível de pelo menos um componente dos dados no perfil de espec- trometria de massas de teste em relação ao perfil de espec-

trometria de massas de referência, identificando assim um perfil de espectrometria de massas da composição de células compreendendo o receptor recombinante. A. Perfil de espectrometria de massas

[00109] Em alguns aspectos a espectrometria de massas (MS) é uma ferramenta analítica poderosa capaz de reunir uma vasta quantidade de dados de uma amostra. Em certos aspectos, espectrometria de massas (tal como descrito de uma forma bastante simplificada) envolve a detecção de íons gerados a partir de uma amostra de acordo com suas rela- ções de massa para carga (m/z). Em aspectos particulares, os sinais de MS provenientes dos íons são usados para ge- rar espectros de massa, que r epresentam a abundância rela- tiva dos íons da amostra, ou fragmentos dos mesmos, em função de sua relação m/z. Em modalidades particulares, os dados obtidos de uma única análise por espectrometria de massas ou de uma série de análises por espectrometria de massas podem ser subsequentemente analisados, tal como por comparação com dados obtidos de uma outra amostra ou de uma outra análise por espectrometria de massas, em qualquer número de níveis informativos dos dados adquiri- dos, inclusive nos níveis de qualq uer combinação de infor- mações sobre os íons de MS, informações sobre identifica- ção/sequências de peptídios e/ou proteínas, informações so- bre modificações pós-translacionais, e informações sobre quantificação. Nos métodos revelados neste pedido, o perfil de espectrometria de massas de uma amostra ou composi- ção de células pode compreender pelo menos um componen- te dos dados selecionado dentre um único nível informativo ou qualquer combinação de níveis informativos dos dados adquiridos a partir de uma única aná lise por espectrometria de massas ou a partir de uma série de análises por espec- trometria de massas, incluindo qualquer componente de da- dos oriundo de qualquer análise subsequente dos dados de sinais de MS adquiridos e as informações resultantes dos mesmos. Em algumas modalidades, o componente de dados é um único ponto de dados, tal como a presença de um pep- tídio identificadou ou a quantidade de um peptídio identifica- do, incluindo modificações pós -translacionais do mesmo. Em algumas modalidades, o component e de dados é um conjunto de pontos de dados, tal como a presença de uma pluralidade de peptídios ou a quantidade de uma pluralidade de peptí- dios, incluindo modificações pós-translacionais dos mesmos.

[00110] Em algumas modalidades, o perfil de espectrome- tria de massas compreende um componente de dados com- preendendo informações sobre os íons de MS, tal como um sinal de um íon de MS. Em algumas modalidades, o perfil de espectrometria de massas compreende um comp onente de dados compreendendo informações sobre os íons de MS de uma ou mais espécies de proteína e/ou peptídio, incluindo modificações pós-translacionais dos mesmos. Em algumas modalidades, o perfil de espectrometria de massas compre- ende um componente de dados compreendendo informações sobre os íons de MS de uma ou mais espécies de íons de proteína e/ou peptídio, incluindo modificações pós - translacionais das mesmas. Em algumas modalidades, o per- fil de espectrometria de massas compreende um componente de dados compreendendo informações sobre os íons de MS de um ou mais fragmentos de uma espécie de proteína e/ou peptídio, incluindo modificações pós-translacionais dos mesmos. Em algumas modalidades, o perfil de espectrome- tria de massas compreende um componente de dados com- preendendo informações sobre os íons de MS de um ou mais fragmentos de uma espécie de íons de proteína e/ou peptí- dio, incluindo modificações pós -translacionais da mesma. Em algumas modalidades, o perfil de espectrometria de massas compreende um componente de dados compreendendo in- formações sobre os íons de MS de uma ou mais análises por MS, ou uma parte das mesmas. Em algumas modalidades, o perfil de espectrometria de massas compreende um compo- nente de dados compreendendo um cromatograma de cor ren- te iônica total. Em algumas modalidades, o perfil de espec- trometria de massas compreende um componente de dados compreendendo um cromatograma de corrente iônica total resultante de mais de uma análise por MS. Em algumas mo- dalidades, o perfil de espectrometria de massas compreende um componente de dados compreendendo uma parte de um cromatograma de corrente iônica total.

[00111] Em algumas modalidades, o perfil de espectrome- tria de massas compreende um componente de dados com- preendendo informações sobre os íons de MS manipuladas para incluir e/ou excluir um ou mais íons de MS. Em algumas modalidades, o perfil de espectrometria de massas compre- ende um componente de dados compreendendo um cromato- grama de íons extraídos (XIC ou EIC). Em certos aspectos, os métodos para produção de cromatogramas de íons extraí- dos são bastante conhecidos na literatura, e incluem isolar as informações sobre os íons de MS resultantes de uma aná- lie por MS de um ou mais valores m/z de interesse, por exemplo, valores m/z correlacionados com um ou mais peptí-

dios de interesse. Em algumas modalidades, o valor m/z de interesse inclui uma tolerância do intervalo de m/z, por exemplo, uma janela de m/z abrangendo o valor m/z de inte- resse. Em algumas modalidades, a tolerância do intervalo de m/z baseia-se no espectrômetro de massas usado para obter o perfil de espectrometria de massas. Em algumas modalida- des, a tolerância do intervalo de m/z é menor que cerca de 50 ppm, tal como menor que 40 ppm, 30 ppm, 20 ppm, 10 ppm, ou 5 ppm. Em algumas modalidad es, a tolerância do intervalo de m/z é de cerca de 50 ppm, tal como cerca de 40 ppm, 30 ppm, 20 ppm, 10 ppm, ou 5 ppm.

[00112] Em algumas modalidades, o perfil de espectrome- tria de massas compreende um componente de dados com- preendendo um cromatograma de íons ext raídos, em que as informações sobre os íons extraídos baseiam-se em uma propriedade de uma ou mais espécies de proteína e/ou de uma ou mais espécies de peptídio de inteesse, incluindo mo- dificações pós-translacionais das mesmas, tal como a m/z de íons de MS da uma ou mais espécies de proteína e/ou da uma ou mais espécies de peptídio de interesse, incluindo modificações pós-translacionais das mesmas. Em algumas modalidades, o perfil de espectrometria de massas compre- ende um componente de dados compreendendo u m cromato- grama de íons extraídos, em que as informações sobre os íons extraídos baseiam-se em de um ou mais estados carre- gados de uma ou mais espécies de proteína e/ou de uma ou mais espécies de peptídio de interesse, incluindo modifica- ções pós-translacionais das mesmas. Em algumas modalida- des, o perfil de espectrometria de massas compreende um componente de dados compreendendo um cromatograma de íons extraídos, em que as informações sobre os íons extraí- dos baseiam-se em informações teóricas sobre os íons d e MS. Em algumas modalidades, o perfil de espectrometria de massas compreende um componente de dados compreen- dendo um cromatograma de íons extraídos, em que as infor- mações sobre os íons extraídos baseiam -se em informações in silico sobre os íons de MS. Em algumas modalidades, o perfil de espectrometria de massas compreende um compo- nente de dados compreendendo um cromatograma de íons extraídos, em que as informações sobre os íons extraídos baseiam-se em informações in silico sobre os íons de MS re- presentando uma proteína teoricamente digerida por protea- ses. Em algumas modalidades, o perfil de espectrometria de massas compreende um componente de dados compreen- dendo um cromatograma de íons extraídos, em que as infor- mações sobre os íons extraídos baseiam -se em informações experimentais sobre os íons de MS.

[00113] Em algumas modalidades, o perfil de espectrome- tria de massas compreende um componente de dados com- preendendo um cromatograma de íons extraídos, em que as informações sobre os íons extraídos baseiam-se em uma propriedade de um receptor recombinante, tal como a m/z de um íon de MS do receptor recombinante, incluindo quaisquer modificações pós-translacionais da mesma. Em algumas mo- dalidades, o perfil de espectrometria de massas compreende um componente de dados compreendendo um cromatograma de íons extraídos, em que as informações sobre os íons ex- traídos baseiam-se em informações in silico sobre os íons de MS representando um receptor recombinante teoricamente digerido por proteases, incluindo quaisquer modificaçõe s pós-translacionais do mesmo.

Em algumas modalidades, o perfil de espectrometria de massas compreende um compo- nente de dados compreendendo um cromatograma de íons extraídos, em que as informações sobre os íons extraídos baseiam-se em informações experimen tais sobre os íons de MS de um receptor recombinante, incluindo quaisquer modi- ficações pós-translacionais da mesma.

Em algumas modali- dades, o perfil de espectrometria de massas compreende um componente de dados compreendendo um cromatograma de íons extraídos, em que as informações sobre os íons extraí- dos baseiam-se em uma propriedade de uma proteína trans- membranar, tal como a m/z de um íon de MS da proteína transmembranar, incluindo quaisquer modificações pós- translacionais da mesma.

Em algumas modalidades, o perfil de espectrometria de massas compreende um componente de dados compreendendo um cromatograma de íons extraí- dos, em que as informações sobre os íons extraídos basei- am-se em informações in silico sobre os íons de MS repre- sentando uma proteína transmembranar teoricamente digeri- da por proteases, incluindo quaisquer modificações pós - translacionais da mesma.

Em algumas modalidades, o perfil de espectrometria de massas compreende um componente de dados compreendendo um cromatograma de íons extraí- dos, em que as informações sobre os íons extraídos basei- am-se em informações experimentais sobre os íons de MS de uma proteína transmembranar, incluindo quaisquer modifica- ções pós-translacionais da mesma.

Em algumas modalida- des, o perfil de espectrometria de massas compreende um componente de dados compreendendo um cromatograma de íons extraídos, em que as informações sobre os íons extraí-

dos baseiam-se em uma propriedade de uma proteína de su- perfície celular, tal como a m/z of a MS ion of a proteína de superfície celular, incluindo quaisquer modificações pós - translacionais da mesma.

Em algumas modalidades, o perfil de espectrometria de massas compreende um componente de dados compreendendo um cromatograma de íons extraí- dos, em que as informações sobre os íons extraíd os basei- am-se em informações in silico sobre os íons de MS repre- sentando uma proteína de superfície celular teoricamente di- gerida por proteases, incluindo quaisquer modificações pós - translacionais da mesma.

Em algumas modalidades, o perfil de espectrometria de massas compreende um componente de dados compreendendo um cromatograma de íons extraí- dos, em que as informações sobre os íons extraídos basei- am-se em informações experimentais sobre os íons de MS de uma proteína de superfície celular, incluindo quaisq uer modi- ficações pós-translacionais da mesma.

Em algumas modali- dades, o perfil de espectrometria de massas compreende um componente de dados compreendendo um cromatograma de íons extraídos, em que as informações sobre os íons extraí- dos baseiam-se em uma propriedade de um receptor de antí- geno quimérico (CAR), tal como a m/z de um íon de MS do CAR, incluindo quaisquer modificações pós -translacionais do mesmo.

Em algumas modalidades, o perfil de espectrometria de massas compreende um componente de dados compre en- dendo um cromatograma de íons extraídos, em que as infor- mações sobre os íons extraídos baseiam -se em informações in silico sobre os íons de MS representando um CAR teori- camente digerido por proteases, incluindo quaisquer modifi- cações pós-translacionais do mesmo.

Em algumas modalida-

des, o perfil de espectrometria de massas compreende um componente de dados compreendendo um cromatograma de íons extraídos, em que as informações sobre os íons extraí- dos baseiam-se em informações experimentais sobre os íons de MS de um CAR, incluindo quaisquer modificações pós - translacionais do mesmo.

[00114] Em algumas modalidades, o perfil de espectrome- tria de massas compreende um componente de dados com- preendendo um ou mais picos de sinais de íons de MS de peptídios. Em algumas modalidades, o um ou mais picos de sinais de íons de MS de peptídios compreende um ou mais estados carregados de um peptídio, incluindo quaisquer mo- dificações pós-translacionais do mesmo. Em algumas moda- lidades, o um ou mais picos de sinais de íons de MS de pep- tídios compreende um ou mais estados carregados de um peptídio, incluindo quaisquer modificações pós-translacionais da mesma, em que o peptídio é proveniente de um receptor recombinante. Em algumas modalidades, o um ou mais picos de sinais de íons de MS de peptídios compreende um ou mais estados carregados de um peptídio, incluindo quaisquer modificações pós-translacionais do mesmo, em que o peptí- dio é proveniente de uma proteína transmembranar. Em al- gumas modalidades, o um ou mais picos de sinais de íons de MS de peptídios compreende um ou mais estados carregados de um peptídio, incluindo quaisquer modificações pós - translacionais do mesmo, em que o peptídio é proveniente de uma proteína de superfície celular. Em algumas modalida- des, o um ou mais picos de s inais de íons de MS de peptí- dios compreende um ou mais estados carregados de um pep- tídio, incluindo quaisquer modificações pós -translacionais da mesma, em que o peptídio é proveniente de um receptor de antígeno quimérico (CAR).

[00115] Em algumas modalidades, o perfil de espectrome- tria de massas compreende um componente de dados com- preendendo um ou mais picos de sinais de íons de MS de proteína. Em algumas modalidades, o um ou mais picos de sinais de íons de MS de proteína compreende um ou mais estados carregados de uma proteína, incluindo quaisquer modificações pós-translacionais da mesma. Em algumas mo- dalidades, o um ou mais picos de sinais de íons de MS de proteína compreende um ou mais estados carregados de uma proteína, incluindo quaisquer modificações pós - translacionais da mesma, em que a proteína é proveniente de um receptor recombinante ou um fragmento do mesmo. Em algumas modalidades, o um ou mais picos de sinais de íons de MS de proteína compreende um ou mais estados car- regados de uma proteína, incluindo quaisquer modificações pós-translacionais da mesma, em que a proteína é proveni- ente de uma proteína transmembranar ou um fragmento da mesma. Em algumas modalidades, o um ou mais picos de si- nais de íons de MS de proteína compreende um ou mais es- tados carregados de uma proteína, incluindo quaisquer modi- ficações pós-translacionais da mesma, em que a proteína é proveniente de uma proteína de superfície celular ou um fra- gmento da mesma. Em algumas modalidades, o um ou mais picos de sinais de íons de MS de proteí na compreende um ou mais estados carregados de uma proteína, incluindo quaisquer modificações pós-translacionais da mesma, em que a proteína é proveniente de um receptor de antígeno quimérico (CAR) ou um fragmento do mesmo.

[00116] Em algumas modalidades, o perfil de espectrome- tria de massas compreende um componente de dados com- preendendo informações de identificação de peptídios.

Em algumas modalidades, as informações de identificação de peptídios compreendem a identidade de um ou mais peptí- dios incluindo quaisquer modificações pós-translacionais da mesma, incluindo qualquer característica, propriedade ou observação do peptídio identificado obtido a partir de análise por uma técnica de espectrometria de massas, por exemplo, abundância e tempo de eluição em um cromatógrafo líquido.

Em algumas modalidades, as informações de identificação de peptídios compreendem a identidade de um ou mais pep- tídios, incluindo quaisquer modificações pós-translacionais dos mesmos, de uma única proteína.

Em algumas modalida- des, as informações de identificação de peptídios compreen- dem a identidade de um subconjunto pré -selecionado de peptídios, incluindo quaisquer modificações pós- translacionais dos mesmos, de uma proteína.

Em algumas modalidades, as informações de identificação de peptídi os compreendem informações sobre sequências de aminoáci- dos.

Em algumas modalidades, as informações de identifica- ção de peptídios compreendem a identidade de um ou mais peptídios, incluindo quaisquer modificações pós-transla- cionais dos mesmos, de um receptor recombinante, incluindo qualquer característica, propriedade ou observação do peptí- dio identificado obtido a partir de análise por uma técnica de espectrometria de massas.

Em algumas modalidades, as in- formações de identificação de peptídios compreendem a identidade de um subconjunto pré-selecionado de peptídios, incluindo quaisquer modificações pós-translacionais da mesma, de um receptor recombinante.

Em algumas modali- dades, as informações de identificação de peptídios compre- endem informações de sequência s de aminoácidos de um re- ceptor recombinante, incluindo quaisquer modificações pós - translacionais do mesmo, ou um ou mais fragmentos do mesmo.

Em algumas modalidades, as informações de identi- ficação de peptídios compreendem a identidade de um ou mais peptídios, incluindo quaisquer modificações pós - translacionais dos mesmos, de uma proteína transmembra- nar, incluindo qualquer característica, propriedade ou obser- vação do peptídio identificado obtido a partir de análise por uma técnica de espectrometria de mass as.

Em algumas mo- dalidades, as informações de identificação de peptídios com- preendem a identidade de um subconjunto pré -selecionado de peptídios, incluindo quaisquer modificações pós - translacionais da mesma, de uma proteína transmembranar.

Em algumas modalidades, as informações de identificação de peptídios compreendem informações de sequências de aminoácidos de uma proteína transmembranar, incluindo quaisquer modificações pós-translacionais da mesma, ou um ou mais fragmentos da mesma.

Em algumas modalidade s, as informações de identificação de peptídios compreendem a identidade de um ou mais peptídios, incluindo quaisquer mo- dificações pós-translacionais dos mesmos, de uma proteína de superfície celular, incluindo qualquer característica, pro- priedade ou observação do peptídio identificado obtido a par- tir de análise por uma técnica de espectrometria de massas.

Em algumas modalidades, as informações de identificação de peptídios compreendem a identidade de um subconjunto pré-selecionado de peptídios, incluindo quaisquer modifica-

ções pós-translacionais da mesma, de uma proteína de su- perfície celular. Em algumas modalidades, as informações de identificação de peptídios compreendem informações de se- quências de aminoácidos de uma proteína de superfície celu- lar, incluindo quaisquer modificações pós -translacionais da mesma, ou um ou mais fragmentos da mesma. Em algumas modalidades, as informações de identificação de peptídios compreendem a identidade de um ou mais peptídios, incluin- do quaisquer modificações pós -translacionais dos mesmos, de um receptor de antígeno quimérico (CAR), incluindo qual- quer característica, propriedade ou observação do peptídio identificado obtido a partir de análise por uma técnica de es- pectrometria de massas. Em algumas modalidades, as infor- mações de identificação de peptídios compreendem a identi- dade de um subconjunto pré-selecionado de peptídios de um CAR, incluindo quaisquer modificações pós -translacionais do mesmo. Em algumas modalidades, as informações de identi- ficação de peptídios compreendem informações de sequên- cias de aminoácidos de uma proteína CAR, incluindo quais- quer modificações pós-translacionais da mesma, ou um ou mais fragmentos da mesma.

[00117] Em algumas modalidades, o perfil de espectrome- tria de massas compreende um componente de dad os com- preendendo informações de identificação de proteínas. Em algumas modalidades, as informações de identificação de proteínas compreendem a identidade de uma ou mais proteí- nas incluindo quaisquer modificações pós -translacionais da mesma, incluindo qualquer característica, propriedade ou observação da proteína identificada obtida por análise por uma técnica de espectrometria de massas, por exemplo,

abundância e tempo de eluição em um cromatógrafo líquido.

Em algumas modalidades, as informações de identifi cação de proteínas compreendem a identidade de um ou mais re- ceptores recombinantes incluindo quaisquer modificações pós-translacionais da mesma, incluindo qualquer caracterís- tica, propriedade ou observação do um ou mais receptores recombinantes obtidos de análise por uma técnica de espec- trometria de massas.

Em algumas modalidades, as informa- ções de identificação de proteínas compreendem a identida- de de um subconjunto pré-selecionado de receptores recom- binantes incluindo quaisquer modificações pós-translacionais da mesma.

Em algumas modalidades, as informações de identificação de proteínas compreendem informações de se- quências de aminoácidos de um receptor recombinante, in- cluindo quaisquer modificações pós-translacionais da mes- ma, ou um ou mais fragmentos das mesmas.

Em algumas modalidades, as informações de identificação de proteínas compreendem a identidade de uma ou mais proteínas trans- membranares incluindo quaisquer modificações pós - translacionais das mesmas, incluindo qualquer característi- ca, propriedade ou observação da uma ou mais proteínas transmembranares obtidas de análise por uma técnica de es- pectrometria de massas.

Em algumas modalidades, as infor- mações de identificação de proteínas compreendem a identi- dade de um subconjunto pré-selecionado de proteínas transmembranares, incluindo quaisquer modificações pós- translacionais da mesma.

Em algumas modalidades, as in- formações de identificação de proteínas compreendem in- formações de sequências de aminoácidos de uma proteína transmembranar, incluindo quaisquer modificações pós-

translacionais da mesma, ou um ou mais fragmentos da mesma.

Em algumas modalidades, as informações de identi- ficação de proteínas compreendem a identidade de uma ou mais proteínas de superfície celular incluindo quaisquer mo- dificações pós-translacionais das mesmas, incluindo qual- quer característica, propriedade ou observação da uma ou mais proteínas de superfície celular obtidas de análise por uma técnica de espectrometria de massas.

Em algumas mo- dalidades, as informações de identificação de proteínas compreendem a identidade de um subconjunto pré- selecionado de proteínas de superfície celular, incluindo quaisquer modificações pós-translacionais das mesmas.

Em algumas modalidades, as informações de identificação de proteínas compreendem informações de sequências de ami- noácidos de uma proteína de superfície celular, incluindo quaisquer modificações pós-translacionais da mesma, ou um ou mais fragmentos da mesma.

Em algumas modalidades, as informações de identificação de proteínas compreendem a identidade de um ou mais receptores de antígenos quiméri- cos (CARs) incluindo quaisquer modificações pós - translacionais dos mesmos, incluindo qualquer característi- ca, propriedade ou observação do um ou mais CARs obtidos de análise por uma técnica de espec trometria de massas.

Em algumas modalidades, as informações de identificação de proteínas compreendem a identidade de um subconjunto pré - selecionado de CARs, incluindo quaisquer modificações pós- translacionais dos mesmos.

Em algumas modalidades, as in- formações de identificação de proteínas compreendem in- formações de sequências de aminoácidos de um CAR, inclu- indo quaisquer modificações pós -translacionais do mesmo,

ou um ou mais fragmentos do mesmo.

[00118] Em algumas modalidades, o perfil de espectrome- tria de massas compreende um componente de dados com- preendendo informações qualitativas, incluindo presença de um íon de MS, peptídio, e/ou proteína, incluindo quaisquer modificações pós-translacionais da mesma. Em algumas mo- dalidades, o perfil de espectrometria de massas compreende um componente de dados compreendendo informações quali- tativas de um receptor recombinante ou um ou mais fragmen- tos da mesma. Em algumas modalidades, o perfil de espec- trometria de massas compreende um componente de dados compreendendo informações qualitativas de uma proteína transmembranar ou um ou mais fragmentos da mesma. Em algumas modalidades, o perfil de espectrometria de massas compreende um componente de dados compreendendo in- formações qualitativas de uma proteína de superfície celular ou um ou mais fragmentos da mesma. Em algumas modali- dades, o perfil de espectrometria de massas compreende um componente de dados compreendendo informações qualitati- vas de um receptor de antígeno quimérico (CAR) ou um ou mais fragmentos da mesma.

[00119] Em algumas modalidades, o perfil de espectrome- tria de massas compreende um componente de dados com- preendendo informações quantitativas ( i.e., informações so- bre a abundância). Uma diversidade de técnicas de espec- trometria de massas quantitativa é conhecida na literatura. Técnicas de espectrometria de massas quantitativa são ca- pazes de fornecer, por exemplo, quantificação absoluta (por exemplo, via monitoramento de reações selecionadas), semi - quantificação (por exemplo, via marcação química), e quanti-

ficação relativa (por exemplo, via contagem espectral). Em algumas modalidades, as informações quantitativas baseiam - se na quantificação absoluta. Em algumas modalidades, as informações quantitativas baseiam-se na semi-quantificação. Em algumas modalidades, as informações quantitativas bsei- am-se na quantificação relativa.

[00120] Em algumas modalidades, o perfil de espectrome- tria de massas compreende um componente de dados com- preendendo informações estruturais. Em algumas modalida- des, o perfil de espectrometria de massas compreend e um componente de dados compreendendo modificações pós- translacionais, incluindo modifications que ocorrem de forma endógena e durante a preparação da amostra.

[00121] Em algumas modalidades, o perfil de espectrome- tria de massas compreende ainda um componente d e dados compreendendo informações teóricas. Em algumas modali- dades, as informações teóricas baseiam -se em informações conhecidas obtidas a partir de qualquer métodoincluindo, po- rém sem limitação, uma técnica de espectrometria de mas- sas. Por exemplo, um perfil de espectrometria de massas de referência pode compreender informações teóricas sobre os íons de MS com base na sequência conhecida de uma prote- ína ou peptídio.

[00122] Em algumas modalidades, os métodos revelados no presente pedido contemplam um perfil de esp ectrometria de massas compreendendo pelo menos um componente dos da- dos, em que o pelo menos um componente dos dados com- preende um ou mais pontos de dados. Em algumas modali- dades, em que um perfil de espectrometria de massas com- preendendo dois ou mais componentes de dados, os dois ou mais componentes de dados podendo compreender informa- ções de qualquer um de inúmeros níveis informativos dos dados adquiridos por uma técnica de espectrometria de mas- sas, por exemplo, informações de identificação de peptídios e informações quantitativas dos mesmos. Os perfis de espec- trometria de massas revelados neste pedido não se limitam às informações obtidas por meio de uma análise e/ou técnica de espectrometria de massas. Em algumas modalidades, o perfil de espectrometria de massas compreende um compo- nente de dados compreendendo informações médias ou combinadas, em que as informações médias ou combinadas compreendem dados de duas ou mais análises e/ou técnicas de espectrometria de massas.

[00123] Em algumas modalidades, os métodos re velados no presente pedido contemplam a produção e/ou o uso de um perfil de espectrometria de massas, tal como um perfil de espectrometria de massas de referência ou um perfil de es- pectrometria de massas de teste, que explica a variabilidade ou variância em um ou mais componentes de dados através de múltiplos perfis de espectrometria de massas ou análises por emas, ou em uma ou mais amostras analisadas, tal como uma pluralidade de composições de células geneticamente modificadas de teste. Por exemplo, o esp ecialista na técnica vai perceber facilmente que duas ou mais análises por es- pectrometria de massas da mesma amostra podem resultar em dados com uma alguma variabilidade, incluindo diferen- ças nos tempos de eluição medidos, nos valores m/z, na in- tensidade relativa ou valores de abundância, e em medidas associadas ou derivadas, tacs massa e AUC. Em algumas modalidades, o perfil de espectrometria de massas, tal como o perfil de espectrometria de massas de referência ou o per- fil de espectrometria de massas de t este, é uma média de duas ou mais análises por espectrometria de massas. Além disso, em algumas modalidades, pode ser desejável compilar pelo menos uma parte de dois ou mais perfis de espectrome- tria de massas ou dados das duas ou mais análises por es- pectrometria de massas para gerar um perfil de espectrome- tria de massas, tal como um perfil de espectrometria de mas- sas de referência, para uso nos métodos descritos neste pe- dido. Métodos para a geração de um perfil de espectrometria de massas, tal como um perfi l de espectrometria de massas de referência ou um perfil de espectrometria de massas de teste, a partir de dois ou mais perfis de espectrometria de massas ou dados de duas ou mais análises por espectrome- tria de massas são conhecidos na literatura e incluem , por exemplo, o software para proteômica disponível.

[00124] Em algumas modalidades, o valor m/z de uma es- pécie medida, tal como um peptídio ou proteína, incluindo modificações pós-translacionais da mesma, varia entre perfis ou análises de espectrometria de massa s. Em algumas mo- dalidades, a variação do valor m/z medido deve-se a flutua- ções nas medições feitas pelo espectrômetro de massas ou através de diferentes espectrômetros de massas.

[00125] Em algumas modalidades, os valores de intensida- de relativa ou abundância de u ma espécie medida, por exemplo, um peptídio, variam entre perfis ou análises de es- pectrometria de massas da mesma amostra. Em algumas modalidades, os valores de intensidade relativa ou abundân- cia de uma espécie medida, por exemplo, um peptídio, vari- am entre perfis ou análises de espectrometria de massas de múltiplas amostras da mesma composição de células. Em al- gumas modalidades, os valores de intensidade relativa ou abundância de uma espécie medida, por exemplo, um peptí- dio, variam entre perfis ou análises de espectrometria de massas de amostras de múltiplas composições de células.

[00126] Em algumas modalidades, os valores da área sob a curva (AUC) de uma espécie medida, por exemplo, um peptí- dio, variam entre perfis ou análises de espectrometria de massas da mesma amostra. Em algumas modalidades, os va- lores da AUC de uma espécie medida, por exemplo, um pep- tídio, variam entre perfis ou análises de espectrometria de massas de múltiplas amostras da mesma composição de cé- lulas. Em algumas modalidades, os valores da AUC de uma espécie medida, por exemplo, um peptídio, variam entre per- fis ou análises de espectrometria de massas de amostras de múltiplas composições de células.

[00127] Em algumas modalidades, os tempos de eluição de uma espécie medida, por exemplo, um peptídio, var iam entre perfis ou análises de espectrometria de massas da mesma amostra. Em algumas modalidades, os tempos de eluição de uma espécie medida, por exemplo, um peptídio, variam entre perfis ou análises de espectrometria de massas de múltiplas amostras da mesma composição de células. Em algumas modalidades, os tempos de eluição de uma espécie medida, por exemplo, um peptídio, variam entre perfis ou análises de espectrometria de massas de amostras de múltiplas compo- sições de células.

[00128] Em algumas modalidades, o perfil de espectrome- tria de massas, tal como o perfil de espectrometria de mas- sas de referência ou o perfil de espectrometria de massas de teste, é construído com base em um ou mais componentes de dados através de múltiplos perfis ou análises de espec- trometria de massas. Em algumas modalidades, cada um dos componentes de dados compreende um ou mais picos de si- nal de íons de MS.

[00129] Em algumas modalidades, o perfil de espectrome- tria de massas, tal como o perfil de espectrometria de mas- sas de referência ou o perf il de espectrometria de massas de teste, é um perfil de espectrometria de massas médio. Em algumas modalidades, o perfil de espectrometria de massas médio compreende o valor de intensidade médio de uma es- pécie medida, por exemplo, um peptídio, através de m últiplos perfis ou análises de espectrometria de massas. Em algumas modalidades, o perfil de espectrometria de massas médio compreende o valor de AUC médio de uma espécie medida, por exemplo, um peptídio, através de múltiplos perfis ou aná- lises de espectrometria de massas. Em algumas modalida- des, o perfil de espectrometria de massas médio compreende o tempo de eluição médio de uma espécie medida, por exemplo, um peptídio, através de múltiplos perfis ou análises de espectrometria de massas. Em algumas modali dades, o perfil de espectrometria de massas médio compreende a m/z média de uma espécie medida, por exemplo, um peptídio, através de múltiplos perfis ou análises de espectrometria de massas. Métodos exemplificativos para determinação de componentes de dados médios incluem, porém sem limita- ção, o cálculo da média, mediana, média ponderada, ou mo- do da presença, ausência, ou nível de componentes de da- dos brutos, normalizados, ou pré -processados.

[00130] Em algumas modalidades, o perfil de espectrome-

tria de massas de referência compreende ainda valores de intensidade não médios de todos os picos de sinal de íons de MS através de múltiplos perfis de espectrometria de massas. Em algumas modalidades, o perfil de espectrometria de mas- sas de referência compreende ainda valor es de AUC não médios de todos os picos de sinal de íons de MS através de múltiplos perfis de espectrometria de massas. Em algumas modalidades, o perfil de espectrometria de massas de refe- rência compreende os tempos de eluição não médios de to- dos os picos de sinal de íons de MS através de múltiplos per- fis de espectrometria de massas.

[00131] Os perfis de espectrometria de massas apresenta- dos neste pedido podem ser obtidos a partir de uma diversi- dade de amostras celulares que, por sua vez, podem ser preparadas e analisadas por uma técnica de espectrometria de massas por qualquer uma de inúmeras maneiras diferen- tes. Em algumas modalidades, o perfil de espectrometria de massas compreende um componente de dados compreen- dendo informações obtidas a partir de uma amostra c ompre- endendo proteínas, em que pelo menos duas alíquotas da amostra são preparadas para análise por uma ou mais técni- cas de espectrometria de massas usando pelo menos duas técnicas diferentes de preparação de amostras. Tendo em vista a presente invenção, o especialista na técnica facilmen- te reconhecerá o amplo escopo do que pode constituir um perfil de espectrometria de massas e que a exposição do presente pedido não se limita às descrições exemplificativas apresentadas neste relatório.

[00132] Os métodos revelados no presente pedido contem- plam perfis de espectrometria de massas obtidos, por exem-

plo, a partir de uma amostra de teste e de uma amostra de referência.

Em algumas modalidades, o perfil de espectrome- tria de massas é um perfil de espectrometria de massas de teste, em que o perfil de espectrometria de massas de teste é de uma amostra de uma composição de células genetica- mente modificadas de teste.

Em algumas modalidades, o perfil de espectrometria de massas é um perfil de espectro- metria de massas de teste, em que o perfil de espectrometria de massas de teste é de uma amostra de uma composição de células geneticamente modificadas de teste, a referida composição de células geneticamente modificadas de teste compreendendo células imunes compreendendo um receptor recombinante.

Em algumas modalidades, o perfil de espec- trometria de massas é um perfil de espectrometria de mas- sas de teste, em que o perfil de espectrometria de massas de teste compreende um ou mais componentes de dados compreendendo informações sobre uma amostra de uma composição de células geneticamente modificadas de teste.

Em algumas modalidades, o perfil de espectrometria de mas- sas é um perfil de espectrometria de massas de teste, em que o perfil de espectrometria de massas de teste compre- ende um ou mais componentes de dados compreendendo in- formações sobre uma amostra de uma composição de células geneticamente modificadas de teste, a referida composição de células geneticamente modificadas de teste compreen- dendo células imunes compreendendo um receptor recombi- nante.

Em algumas modalidades, o perfil de espectrometria de massas de teste compreende um ou mais componentes de dados compreendendo informações resultantes de uma ou mais análises de espectrometria de massas, em que a uma ou mais análises de espectrometria de massas são as mes- mas ou diferfentes. Em algumas modalidades, o perfil de es- pectrometria de massas de teste compreende um ou mais componentes de dados compreendendo informações resul- tantes de uma ou mais análises de espectrometria de mas- sas, em que a uma ou mais análises de espectrometria de massas são de amostras preparadas usando um ou mais técnicas diferentes de preparação de amostras. Em algumas modalidades, o perfil de espectrometria de massas de teste compreende um ou mais componentes de dados compreen- dendo informações resultantes de uma ou mais análises de espectrometria de massas, em que a uma ou mais análises de espectrometria de massas são as mesmas ou diferfentes, e em que a uma ou mais análises de espectrometria de mas- sas são de amostras preparadas usando um ou mais técnicas diferentes de preparação de amostras.

[00133] Em algumas modalidades, os métodos revelados neste pedido compreendem determinar um perfil de espec- trometria de massas de teste de uma amostra de uma com- posição de células geneticamente modificadas de teste usando uma técnica de espectrometria de massas, a referida composição de células geneticamente modificadas de teste compreendendo células imunes compreendendo um receptor recombinante. Em algumas modalidades, os métodos reve la- dos neste pedido compreendendo obter um perfil de espec- trometria de massas de teste de uma amostra de uma com- posição de células geneticamente modificadas de teste usando uma técnica de espectrometria de massas, a referida composição de células geneticamente modificadas de teste compreendendo células imunes compreendendo um receptor recombinante.

[00134] Em algumas modalidades, o perfil de espectrome- tria de massas é um perfil de espectrometria de massas de referência. Em algumas modalidades, o perfil de espectrome- tria de massas é um perfil de espectrometria de massas de referência, em que o perfil de espectrometria de massas de referência é de uma amostra de uma composição de células de referência. Em algumas modalidades, o perfil de espec- trometria de massas é um perfil de espectrometria de mas- sas de referência, em que o perfil de espectrometria de mas- sas de referência é de uma amostra de uma composição de células de referência, a referida composição de células de referência compreendendo células imunes. Em algumas mo- dalidades, o perfil de espectrometria de massas é um perfil de espectrometria de massas de referência, em que o perfil de espectrometria de massas de referência é de uma amos- tra de uma composição de células de referência, a referida composição de células de referência compreendendo células imunes antes de transfecção com um receptor recombinante.

[00135] Em algumas modalidades, o perfil de espectrome- tria de massas é um perfil de espectrometria de massas de referência, em que o perfil de espectrometria de massas de referência compreende um ou mais componentes de dados compreendendo informações sobre uma amostra de uma composição de células de referência. Em algumas modalida- des, o perfil de espectrometria de massas é um perfil de es- pectrometria de massas de referência, em que o perfil de es- pectrometria de massas de referência compreende um ou mais componentes de dados compreendendo informações sobre uma amostra de uma composição de células de refe-

rência, a referida composição de células de referência com- preendendo células imunes. Em algumas modalidades, o per- fil de espectrometria de massas é um perfil de espe ctrome- tria de massas de referência, em que o perfil de espectrome- tria de massas de referência compreende um ou mais com- ponentes de dados compreendendo informações sobre uma amostra de uma composição de células de referência, a refe- rida composição de célula s de referência compreendendo cé- lulas imunes antes de transfecção com um receptor recombi- nante. Em algumas modalidades, o perfil de espectrometria de massas de referência compreende um ou mais componen- tes de dados compreendendo informações resultantes de uma ou mais análises de espectrometria de massas, em que a uma ou mais análises de espectrometria de massas são as mesmas ou diferfentes. Em algumas modalidades, o perfil de espectrometria de massas de referência compreende um ou mais componentes de dados compreendendo informações resultantes de uma ou mais análises de espectrometria de massas, em que a uma ou mais análises de espectrometria de massas são de amostras preparadas usando um ou mais técnicas diferentes de preparação de amostras. Em algumas modalidades, o perfil de espectrometria de massas de refe- rência comp compreende um ou mais componentes de dados compreendendo informações resultantes de uma ou mais análises de espectrometria de massas, em que a uma ou mais análises de espectrometria de massas são as mesmas ou diferfentes, e em que a uma ou mais análises de espec- trometria de massas são de amostras preparadas usando um ou mais técnicas diferentes de preparação de amostras.

[00136] Em algumas modalidades, os métodos revelados neste pedido compreendem determinar um perfil de espec- trometria de massas de referência de uma amostra de uma composição de células geneticamente modificadas de refe- rência usando uma técnica de espectrometria de massas, a referida composição de células geneticamente modificadas de referência compreendendo células imunes. Em algumas modalidades, os métodos revelados neste pedido compreen- dem obter um perfil de espectrometria de massas de referên- cia de uma amostra de uma composição de células geneti- camente modificadas de referência usando uma técnica de espectrometria de massas, a referida composição de células geneticamente modificadas de referência compreendendo cé- lulas imunes.

[00137] Em algumas modalidades, os métodos revelados neste pedido compreendem determinar um perfil de espec- trometria de massas de referência de uma amostra de uma composição de células geneticamente modificadas de refe- rência usando uma técnica de espectrometria de massas, a referida composição de células geneticamente modificadas de referência compreendendo células imunes compreenden- do um receptor recombinante. Em algumas modalidades, os métodos revelados neste pedido compreendem obter um per- fil de espectrometria de massas de referência de uma amos- tra de uma composição de células geneticamente modifica- das de referência usando uma técnica de espectrometria de massas, no qual a composição de células geneticamente modificadas de referência contém ou é enriquecida em célu- las imunes expressando um receptor recombinante ou no qual tais células imunes contêm um polinucleotídeo hete rólo- go que codifica um receptor recombinante.

B. Comparando perfis de espectrometria de massas

[00138] Em algumas modalidades, os métodos revelados neste pedido compreendem comparar perfis de espectrome- tria de massas. Em algumas modalidades, os métodos reve- lados neste pedido compreendem comparar um ou mais per- fis de espectrometria de massas de teste. Em algumas mo- dalidades, os métodos revelados neste pedido compreendem comparar um ou mais perfis de espectrometria de massas de referência. Em algumas modalidades, os mé todos revelados neste pedido compreendem comparar um perfil de espectro- metria de massas de teste com um perfil de espectrometria de massas de referência. Em algumas modalidades, os mé- todos revelados neste pedido compreendem comparar um ou mais perfis de espectrometria de massas de teste com um ou mais perfis de espectrometria de massas de referência.

[00139] Em algumas modalidades, os métodos apresenta- dos para comparação de perfis de espectrometria de massas entre composições de células podem ser usados para escla- recer atributos ou propriedades de uma composição de célu- las geneticamente modificadas, incluindo atributos ou propri- edades do receptor recombinante ou de uma porção ou com- ponente do mesmo, que podem ser relacionados ou associa- dos a um proceso particular pa ra produção da composição de células geneticamente modificadas, ao efeito de determi- nadas condições de incubação ou cultura, incluindo a pre- sença ou ausência de certos reagentes, mudanças ou altera- ções na composição de células geneticamente modificadas por estimulação, manipulação genética (por exemplo, trans- dução) ou ativação dependente do receptor recombinante, tal como mediante exposição a um antígeno ou a um anticorpo anti-idiotípico. Em alguns aspectos, tais métodos podem ser usados para identificar al avancas celulares funcionais que podem informar ou facilitar processos para a produção de composições de células geneticamente modificadas. Em al- guns aspectos, os métodos apresentados são mais potentes e/ou fornecem informações ortogonais em comparação com os métodos existentes para avaliar a caracterização de pro- teínas celulares, tais como citometria de fluxo e métodos de análise baseados no transcriptoma. ased analysis methods. Por exemplo, os métodos de análise baseados em espectro- metria revelados neste pedido são capazes de oferecer a ca- pacidade de simultaneamente traçar o perfil de amostra celu- lar de forma imparcial (por exemplo, sem uma hipótese pré- via do alvo) para pelo menos o seguinte: expressão de pep- tídios e proteínas, informações sobre sequenciam ento, quan- tificação, localização celular (por exemplo, via a técnica de preparação de amostras selecionada, tal como isolamento de proteínas de superfície celular), e modificações pós -transla- cionais.

[00140] Assim sendo, em algumas modalidades, a utilidade dos métodos descritos neste pedido pode depender de um primeiro perfil de espectrometria de massas e um segundo perfil de espectrometria de massas, tal como um perfil de espectrometria de massas de teste e um perfil de espectro- metria de massas de referência, s endo capaz de proporcio- nar comparação cientificamente significativa, por exemplo, diferença na presença e/ou abundância de uma proteína ou peptídio. Em algumas modalidades, a geração de perfis de espectrometria de massas vai, assim, exigir desenho e/ou seleção de técnicas de preparação de amostras e/ou técni-

cas de espectrometria de massas para que um primeiro perfil de espectrometria de massas de uma primeira amostra e um segundo perfil de espectrometria de massas de uma segunda amostra contenham componente s de dados sobrepostos, em parte ou totalmente, atribuíveis a uma única proteína e/ou peptídio, se a única proteína e/ou peptídio estiver presente na primeira amostra e na segunda amostra. Por exemplo, em algumas modalidades, os métodos revelados neste ped ido compreendem analisar uma primeira amostra de uma primei- ra composição celular e uma segunda amostra de uma se- gunda composição celular usando as mesmas técnicas de preparação de amostras ou técnicas de preparação de amos- tras similares e as mesmas técnica s de espectrometria de massas ou técnicas de espectrometria de massas similares para gerar um primeiro perfil de espectrometria de massas da primeira amostra e um segundo perfil de espectrometria de massas da segunda amostra, permitindo assim uma com- paração do primeiro perfil de espectrometria de massas e do segundo perfil de espectrometria de massas.

[00141] Em algumas modalidades, os métodos revelados neste pedido compreendem identificar uma ou mais diferen- ças na presença, ausência, ou nível de pelo menos um com- ponente de dados in um perfil de espectrometria de massas de teste em relação ao perfil de espectrometria de massas de referência, identificando assim um perfil de espectrome- tria de massas de uma composição de células compreenden- do um receptor recombinante. Como descrito em todo este pedido, o pelo menos um componente dos dados compreen- dido em um perfil de espectrometria de massas inclui qual- quer dado informativo individual ou qualquer combinação de dados informativos obtidos de uma única análise de espec- trometria de massas ou de uma série de análises de espec- trometria de massas, incluindo qualquer dado individual de qualquer análise subsequente dos dados de sinais de MS adquiridos e as informações resultantes dos mesmos. Assim sendo, por exemplo, a uma ou ma is diferenças na presença, ausência, ou nível de pelo menos um componente de dados in um perfil de espectrometria de massas podem incluir dife- renças em: informações sobre os íons de MS, um cromató- grafo de íons totais (TIC) ou uma parte do mesmo, um cro- matograma de íons extraídos (XIC) ou uma parte do mesmo, pico de sinais de íons de MS de peptídios, pico de sinais de íons de MS de proteínas, informações de identificação de peptídios, tal como diferenças em sequências peptídicas, in- formações de identificação de proteínas, informações quali- tativas, informações quantitativas, informações estruturais, e modificações pós-translacionais.

[00142] Em algumas modalidades, os métodos revelados no presente pedido contemplam calcular a quantidade de varia- bilidade ou variância em um ou mais componentes de dados através de múltiplos perfis de espectrometria de massas ou análises por espectrometria de massas, ou em uma ou mais amostras analisadas, tal como uma pluralidade de composi- ções de células geneticamente modificadas de test e. Por exemplo, o especialista na técnica vai perceber facilmente que duas ou mais análises por espectrometria de massas da mesma amostra pode resultar em dados com alguma variabi- lidade, incluindo diferenças nos tempos de eluição medidos, valores m/z, valores de intensidade relativa ou abundância, e medidas associadas ou derivadas, tais como massa e AUC.

[00143] Em algumas modalidades, o valor m/z de uma es- pécie medida, tal como um peptídio ou proteína, incluindo modificações pós-translacionais da mesma, varies entre per- fis ou análises de espectrometria de massas. Em algumas modalidades, a variação do valor m/z medido deve-se a flu- tuações nas medidas feitas pelo espectrômetro de massas ou através de espectrômetros de massas diferentes. Em al- gumas modalidades, a quantidade de variabilidade ou vari- ância em os valores m/z medidos de uma espécie medida, por exemplo, um peptídio, é calculada.

[00144] Em algumas modalidades, os valores de intensida- de relativa ou abundância de uma espécie medida, por exemplo, um peptídio, variam e ntre perfis ou análises de es- pectrometria de massas da mesma amostra. Em algumas modalidades, os valores de intensidade relativa ou abundân- cia de uma espécie medida, por exemplo, um peptídio, vari- am entre perfis ou análises de espectrometria de massas de múltiplas amostras da mesma composição de células. Em al- gumas modalidades, os valores de intensidade relativa ou abundância de uma espécie medida, por exemplo, um peptí- dio, variam entre perfis ou análises de espectrometria de massas de amostras de múltiplas composições de células. Em algumas modalidades, a quantidade de variabilidade ou variância em os valores de intensidade relativa ou abundân- cia de uma espécie medida, por exemplo, um peptídio, é cal- culada.

[00145] Em algumas modalidades, os valores da área sob a curva (AUC) de uma espécie medida, por exemplo, um peptí- dio, variam entre perfis ou análises de espectrometria de massas da mesma amostra. Em algumas modalidades, os va-

lores da AUC de uma espécie medida, por exemplo, um pep- tídio, variam entre perfis ou aná lises de espectrometria de massas de múltiplas amostras da mesma composição de cé- lulas. Em algumas modalidades, os valores da AUC de uma espécie medida, por exemplo, um peptídio, variam entre per- fis ou análises de espectrometria de massas de amostras de múltiplas composições de células. Em algumas modalidades, a quantidade de variabilidade ou variância em os valores da AUC de uma espécie medida, por exemplo, um peptídio, é calculada.

[00146] Em algumas modalidades, os tempos de eluição de uma espécie medida, por exemplo, um peptídio, variam entre perfis ou análises de espectrometria de massas da mesma amostra. Em algumas modalidades, os tempos de eluição de uma espécie medida, por exemplo, um peptídio, variam entre perfis ou análises de espectrometria de massas de múltiplas amostras da mesma composição de células. Em algumas modalidades, os tempos de eluição de uma espécie medida, por exemplo, um peptídio, variam entre perfis ou análises de espectrometria de massas de amostras de múltiplas compo- sições de células. Em algumas modalidades, a quantidade de variabilidade ou variância em os tempos de eluição de uma espécie medida, por exemplo, um peptídio, é calculada.

[00147] Métodos exemplificativos para determinação da quantidade de variabilidade através de componentes de da- dos incluem, porém sem limitação, cálculo do desvio padrão, faixa, ou faixa interquartis do nível de componentes de dados brutos, normalizados, ou pré -processados, ou cálculo da probabilidade ou proporção da presença ou ausência de um ou componentes de dados brutos, normalizados, ou pré -

processados. C. Técnicas de espectrometria de massas

[00148] O presente pedido contempla uma diversidade de técnicas de espectrometria de massas adequadas para uso çom os métodos ou etapas dos métodos revelados neste pe- dido, incluindo determinar um perfil de espectrometria de massas. Em algumas modalidades, os métodos revelados neste pedido compreendem analisar uma amostra de uma composição de células geneticamente modificadas de teste usando uma ou mais técnicas de espectrometria de mass as. Em algumas modalidades, os métodos revelados neste pedi- do compreendem analisar uma amostra de uma composição de células de referência usando uma ou mais técnicas de espectrometria de massas. Como discutido neste pedido, em algumas modalidades, as técni cas de espectrometria de massas podem adquirir dados para apresentar uma vasta quantidade de informações sobre uma amostra, incluindo componentes de dados de qualquer combinação de informa- ções sobre os íons de MS, informações sobre identifica- ção/sequência de peptídios e/ou proteínas, informações so- bre modificações pós-translacionais, e informações sobre quantificação. Por sua vez, um componente de dados, ou uma pluralidade deste, adquirido por uma técnica de espec- trometria de massas é usado, por exemplo, para produzir um perfil de espectrometria de massas. As seguintes técnicas de espectrometria de massas exemplificadas nesta seção, as- sim como em todo este pedido, são técnicas exemplificativas de técnicas de espectrometria de massas úteis para produ- ção de um perfil de espectrometria de massas. No entanto, os métodos revelados neste pedido não se limitam à técnica de espectrometria de massas revelada neste pedido. Tendo em vista a presente exposição, o especialista na técnica per- ceberá a quantidade de técnica s de espectrometria de mas- sas úteis para os métodos revelados neste pedido.

[00149] Em algumas modalidades, a técnica de espectro- metria de massas compreende uma técnica de cromatografia líquida associada à espectrometria de massas. Em algumas modalidades, a técnica de espectrometria de massas com- preende uma técnica de cromatografia líquida associada à espectrometria de massas em tandem. Em algumas modali- dades, a técnica de espectrometria de massas compreende uma técnica de cromatografia líquida.

[00150] O presente pedido contempla uma diversidade de técnicas de cromatografia líquida adequados para os méto- dos revelados neste pedido. Em algumas modalidades, a técnica de espectrometria de massas compreende uma técni- ca de cromatografia líquida adequada para uma aplicação proteômica. Em algumas modalidades, a técnica de espec- trometria de massas compreende uma técnica de cromato- grafia líquida adequada para separação de peptídios. Em al- gumas modalidades, a técnica de espectrometria de massas compreende separação de peptídios por uma técnica de cro- matografia líquida.

[00151] As técnicas de cromatografia líquida contempladas pelo presente pedido incluem métodos para separação de peptídios e técnicas de cromatografia líquida compatíveis com técnicas de espectrometria de massas. Em algumas mo- dalidades, a técnica de cromatografia líquida compreende uma técnica de cromatografia líquida de alta eficiência. As- sim sendo, em algumas modalidades, a técnica de cromato-

grafia líquida compreende uma técnica de cromatografia lí- quida de ultra-alta eficiência. Em algumas modalidades, a técnica de cromatografia líquida compreende uma técnica de cromatografia líquida de alto fluxo. Em algumas modalida- des, a técnica de cromatografia líquida compreende uma técnica de cromatografia líquido de baixo fluxo, tal como uma técnica de cromatografia líquida de micro-fluxo ou uma téc- nica de cromatografia líquida de nano -fluxo. Em algumas modalidades, a técnica de cromatografia líquida compreende uma técnica de cromatografia líquida online acoplada a um espectrômetro de massas. Em algumas modalidades, a téc- nica de cromatografia líquida online é uma técnica de croma- tografia líquida de alta eficiência. Em algumas modalidades, a técnica de cromatografia líquida online é uma técnica de cromatografia líquida de ultra-alta eficiência.

[00152] As técnicas de cromatografia líquida contempladas neste pedido compreendem o uso de um cromatógrafo líqui- do. Em algumas modalidades, o cromatógrafo líquido com- preende um cromatógrafo líquido de alta eficiência. Em al- gumas modalidades, o cromatógrafo l íquido compreende um cromatógrafo líquido de ultra-alta eficiência. Em algumas modalidades, o cromatógrafo líquido compreende um croma- tógrafo líquido de alto fluxo. Em algumas modalidades, o cromatógrafo líquido compreende cromatógrafo líquido de baixo fluxo, tal como um cromatógrafo líquido de micro -fluxo ou um cromatógrafo líquido de nano -fluxo. Em algumas mo- dalidades, o cromatógrafo líquido compreende um cromató- grafo líquido online acoplado a um espectrômetro de massas. Em algumas modalidades, o cromatóg rafo líquido compreen- de um cromatógrafo líquido de alta eficiência online, em que o cromatógrafo líquido de alta eficiência online é acoplado a um espectrômetro de massas. Em algumas modalidades, o cromatógrafo líquido compreende um cromatógrafo líquido de ultra-alta eficiência online, em que o cromatógrafo líquido de ultra-alta eficiência online é acoplado a um espectrômetro de massas.

[00153] As técnicas de cromatografia líquida e os cromató- grafos líquidos contemplados para uso com os métodos reve- lados no presente pedido são adequados para separar amos- tras compreendendo uma mistura de proteínas e/ou uma mis- tura de peptídios, antes da introdução da referida amostra em um espectrômetro de massas, usando uma coluna de cromatografia. Em algumas modalidades, a técnica de cro- matografia líquida compreende uma técnica de cromatografia líquida em fase reversa. Em algumas modalidades, a técnica de cromatografia líquida compreende uma técnica de croma- tografia líquida em fase normal. Em algumas modalidades, a técnica de cromatografia líquida compreende uma técnica de cromatografia líquida de exclusão por tamanjo. Em algumas modalidades, a técnica de cromatografia líquida compreende a high-performance anion-exchange chromatography techni- que. Em algumas modalidades, a técnica de cromatografia líquida compreende uma técnica de cromatografia por intera- ção hidrofílica.

[00154] Em algumas modalidades, a técnica de cromatogra- fia líquida compreende uma técnica de eletroforese capilar (CE).

[00155] Em algumas modalidades, a técnica de espectro- metria de massas compreende uma técnica de classificação automática. Em algumas modalidades, o cromatógrafo líqui-

do é acoplado a um classificador automático.

[00156] Em algumas modalidades, a técnica de espectro- metria de massas compreende uma técnica de ionização. As técnicas de ionização contempladas pelo presente pedido in- cluem técnicas capazes de carregar proteínas e peptídios para análise via um espectrômetro de massas. Em algumas modalidades, a técnica de ionização é ionização por “elec- trospray” (ESI). Em algumas modalidades, a técnica de ioni- zação é ionização por “nano -electrospray” (nESI). Em algu- mas modalidades, a técnica de ionização é ionização quími- ca à pressão atmosférica. Em algumas modalidades, a técni- ca de ionização é fotoionização à pressão atmosférica. Em algumas modalidades, a técnica de ionização é ionização e dessorção a laser assistida por matriz (MALDI). Em algumas modalidades, a técnica de espectrometria de massas com- preende uma técnica de ionização por “electrospray”, ioniza- ção por “nano-electrospray”, ou ionização e dessorção a la- ser assistida por matriz (MALDI).

[00157] As técnicas de espectrometria de massas reveladas neste pedido compreendem analisar uma amostra compreen- dendo uma mistura de proteínas e/ou uma mistura de peptí- dios com um sistema de espectrôme ros de massa. Os siste- mas de espectrômetros de massas contemplados para uso com os métodos revelados neste pedido incluem espectrôme- tros de massas de alta resolução, espectrômetros de massas de massa resolução, e híbridos de qualquer combinação des- tes, e técnicas associadas aos mesmos. Em algumas modali- dades, o sistema de espectrômetros de massas compreende uma armadilha de íons. Em algumas modalidades, o sistema de espectrômetros de massas compreende uma armadilha de íons quadrupolo. Em algumas modalidades , o sistema de es- pectrômetros de massas compreende um orbitrap. Em algu- mas modalidades, o sistema de espectrômetros de massas compreende um quadrupolo-Orbitrap. Em algumas modalida- des, o sistema de espectrômetros de massas compreende um espectrômetro de massas por tempo de voo (TOF). Em algumas modalidades, o sistema de espectrômetros de mas- sas compreende um espectrômetro de massas quadrupolo - por tempo de voo (Q-TOF). Em algumas modalidades, o sis- tema de espectrômetros de massas compreende um espec- trômetro de massas quadrupolo, por tempo de voo, com ar- madilha de íons (QIT -TOF). Em algumas modalidades, o sis- tema de espectrômetros de massas compreende um quadru- polo triplo (QQQ). Em algumas modalidades, o sistema de espectrômetros de massas compreende um espect rômetro de massas por ressonância ciclotrônica de íons por transforma- da de Fourier (FT). Em algumas modalidades, o sistema de espectrômetros de massas compreende espectrômetro de massas quadrupolo-ressonância ciclotrônica de íons por transformada de Fourier (Q-FT).

[00158] Em algumas modalidades, o sistema de espectrô- metros de massas é acoplado a um cromatógrafo líquido, tal como um cromatógrafo líquido online. Em algumas modalida- des, o sistema de espectrômetros de massas é acoplado a um cromatógrafo líquido e a u m classificador automático.

[00159] Em algumas modalidades, a técnica de espectro- metria de massas compreende uma técnica de modo íons positivos. Em algumas modalidades, a técnica de espectro- metria de massas compreende uma técnica de modo íons negativos. Em algumas modalidades, a técnica de espectro-

metria de massas compreende uma técnica de espectrome- tria de massas por tempo de voo (TOF). Em algumas modali- dades, a técnica de espectrometria de massas compreende técnica de espectrometria de massas quadrupolo por tempo de voo (Q-TOF). Em algumas modalidades, a técnica de es- pectrometria de massas compreende uma técnica de espec- trometria de massas com mobilidade de íons. Em algumas modalidades uma técnica de espectrometria de massas de baixa resolução, tal como uma aborda gem com armadilha de íons, ou quadruplo simples ou triplo é apropriada.

[00160] Em algumas modalidades, a técnica de espectro- metria de massas compreende realizar a aquisição de dados de MS 1 com uma resolução de varredura de 120.000. Em al- gumas modalidades, a técnica de espectrometria de massas compreende realizar a aquisição de dados de MS 1 com uma faixa de varredura de cerca de 100 m/z a cerca de 2000 m/z, tal como cerca de 325 m/z a cerca de 2000 m/z. Em algumas modalidades, a técnica de espectrometria de massas com- preende realizar a aquisição de dados de MS 2 com uma reso- lução de varredura de 30.000. Em algumas modalidades, a técnica de espectrometria de massas compreende realizar a aquisição de dados de MS 2 com uma faixa de varredura de cerca de 100 m/z a cerca d e 2000 m/z, tal como cerca de 200 m/z a cerca de 2000 m/z.

[00161] Em algumas modalidades, a técnica de espectro- metria de massas compreende uma espectrometria de mas- sas em tandem. Em algumas modalidades, a técnica de es- pectrometria de massas compreende uma técnica de aquisi- ção dependente dos dados. Em algumas modalidades, a téc- nica de espectrometria de massas compreende uma técnica de aquisição independente dos dados. Em algumas modali- dades, a técnica de espectrometria de massas compreende uma técnica de aquisição por espectrometria de massas di- recionada, incluindo monitoramento de íons selecionados (SIM), monitoramento de reações selecionadas (SRM), e mo- nitoramento de múltiplas reações (MRM).

[00162] Em algumas modalidades, a técnica de espectro- metria de massas é uma técni ca de espectrometria de mas- sas quantitativa. Em algumas modalidades, a técnica de es- pectrometria de massas quantitativa é uma técnica de quanti- ficação absoluta, tal como SRM ou MRM. Em algumas moda- lidades, a técnica de espectrometria de massas quantitativa é uma técnica semi-quantitativa, tal como um método de quantificação à base de marcadores. Em algumas modalida- des, a técnica de espectrometria de massas quantitativa é uma técnica de quantificação relativa, tal como contagem espectral. Em algumas modalida des, a técnica de espectro- metria de massas quantitativa é uma técnica de quantifica- ção à base de marcadores. Em algumas modalidades, a téc- nica de espectrometria de massas quantitativa é uma técnica de quantificação livre de marcadores.

[00163] Em algumas modalidades, os métodos revelados neste pedido compreendem ainda processar os dados adqui- ridos por uma técnica de espectrometria de massas. Em al- gumas modalidades, a técnica de espectrometria de massas compreende processar os sinais de íons de MS obtidos de um peptídio ou proteína. Em algumas modalidades, a técnica de espectrometria de massas compreende a detecção de pi- cos. Em algumas modalidades, a técnica de espectrometria de massas compreende determinar a intensidade de ioniza-

ção de um íon de peptídio.

Em algumas modalidades, a téc- nica de espectrometria de massas compreende determinar a altura máxima de um íon de peptídio.

Em algumas modalida- des, a técnica de espectrometria de massas compreende de- terminar a área máxima do sinal de MS de íon de peptídio.

Em algumas modalidades, a técnica de espectrometria de massas compreende determinar o volume máximo de um peptídio e/ou proteína.

Em algumas modalidades, a técnica de espectrometria de massas compreende quantificar um íon de peptídio e/ou um íon de proteína.

Em algu mas modalida- des, a técnica de espectrometria de massas compreende quantificar um peptídio e/ou proteína.

Em algumas modalida- des, a técnica de espectrometria de massas compreende identificar a sequência de um peptídio e/ou uma proteína, tal como via um software para proteômica.

Em algumas modali- dades, o software para proteômica identifica uma sequência peptídica e/ou proteica usando bancos de dados conhecidos de sequências gênicas ou proteicas de um organismo, tal como um banco de dados de proteínas humanas ou de ca- mundongos.

Em algumas modalidades, o software para pro- teômica identifica uma sequência peptídica e/ou uma se- quência proteca de novo.

Em algumas modalidades, a técni- ca de espectrometria de massas compreende validar manu- almente a identificação de um peptídio e/ou proteína.

Em al- gumas modalidades, a técnica de espectrometria de massas compreende identificar um peptídio e/ou uma proteína via uma biblioteca espectral.

Geralemente, o uso de bibliotcas espectrais permite a imputação de conhecimentos ganhos sobre um sistema de peptídios e/ou de proteínas e resulta em maior velocidade de análise dos dados com menos erros.

D. Técnicas de preparação de amostras

[00164] Em alguns aspectos da presente invenção, os mé- todos revelados neste pedido compreendem a execução de uma técnica de preparação e amostras. Em geral, amostras celulares podem precisar ser processadas para serem com- patíveis com uma técnica de e spectrometria de massas, in- cluindo isolamento de proteínas/peptídios, remoção de de- tergentes, concentração/reunião de amostras em qualquer estágio, e/ou digesão proteolítica. Em algumas modalidades, a técnica de preparações de amostras compreende uma téc- nica de isolamento de polipeptídios. Em algumas modalida- des, a técnica de isolamento de peptídios isola um subcon- junto do proteoma celular, por exemplo, proteínas de super- fície celular, dos outros componentes celulares. Em algumas modalidades, a técnica de i solamento de polipeptídios isola- da o proteoma celular, por exemplo, para análise do prote- oma celular integral, dos outros componentes celulares. Em algumas modalidades, a técnica de preparação de amostras compreende uma técnica de processamento de polipeptídios. Em algumas modalidades dos métodos revelados neste pedi- do, os métodos compreendem a obtenção de uma amostra que seja compatível com uma técnica de espectrometria de massas.

1. Técnicas de isolamento de polipeptídios

[00165] Em algumas modalidades, os métodos revelados neste pedido oferecem uma técnica de isolamento de poli- peptídios, em que a técnica de isolamento de polipeptídios é adequada para isolar um subconjunto do proteoma celular dos outros componentes celulares. Em algumas modalida- des, os métodos revelados neste pedido compreendem uma técnica de isolamento de polipeptídios, em que a realização da técnica de isolamento de polipeptídios isola um receptor recombinante dos outros componentes celulares. Em algu- mas modalidades, os métodos revelados neste pedi do com- preendem uma técnica de isolamento de polipeptídios, em que a realização da técnica de isolamento de polipeptídios isola uma proteína transmembranar dos outros componentes celulares. Em algumas modalidades, os métodos revelados neste pedido compreendem uma técnica de isolamento de polipeptídios, em que a realização da técnica de isolamento de polipeptídios isola uma proteína de superfície celular dos outros componentes celulares. Em algumas modalidades, os métodos revelados neste pedido compreendem um a técnica de isolamento de polipeptídios, em que a realização da téc- nica de isolamento de polipeptídios isola um receptor de an- tígeno quimérico (CAR) dos outros componentes celulares.

[00166] Em algumas modalidades, a técnica de isolamento de polipeptídios compreende: (a) marcação de uma ou mais proteínas presentes em uma amostra de uma amostra de composição celular, gerando assim uma amostra de compo- sição celular marcada; (b) lise das células da amostra de composição celular marcada, gerando assim uma amostra de composição celular lisada; e (c) isolar a uma ou mais proteí- nas da composição de células lisadas para obter uma ou mais proteínas isoladas. Em algumas modalidades, a técnica de isolamento de polipeptídios compreende: (a) marcação de uma ou mais proteínas de superfície celular presentes nas células de uma amostra de composição de células genetica- mente modificadas, as células da amostra de composição de células geneticamente modificadas compreendendo um re-

ceptor recombinante, gerando assim uma amostra de compo- sição celular marcada; (b) lise das células da amostra de composição celular marcada, gerando assim uma amostra de composição celular lisada; e (c) isolamento da uma ou mais proteínas de superfície celular da amostra de composição celular lisada para obter uma ou mais proteínas isoladas.

[00167] Em algumas modalidades, a lise das células com- preende incubação na presença de um detergente. Em algu- mas modalidades, o detergente é um detergente não iônico, um detergente aniônico, um detergente catiônico, ou um de- tergente zwiteriônico. Detergentes exemplificativos incluem, porém sem limitação, maltosídeos, tiomaltosídeos, alquil gli- cosídeos, e glicóis. Detergentes exemplificativos incluem, porém sem limitação, n-decil-β-D-maltosídeo, n-dodecil-β-D- maltosídeo, n-undecil-β-D-maltosídeo, Cymal-5, Cymal-6, n- dodecil-β-D-tiomaltopiranosídeo, octil glucose, neopentil gli- col, polioxietileno, Triton X -100, Triton X-114, C8E4, C8E5, C12E8, anapoe-35 (Brij-35), anapoe-58 (Brij-58), N-40, Tween 20, Tween 80, brometo de etil trimetil amônio, octil glucosídeo, e octil tioglucosídeo.

[00168] Em algumas modalidades, a lise das células com- preende incubação na presença de um detergente não iôni- co, um detergente aniônico, um detergente catiônico, um de- tergente zwiteriônico, ou qualquer combinação de dois ou mais destes detergentes.

[00169] Em algumas modalidades, a lise das células com- preende incubação na presença de um detergente desnatu- rante. Em algumas modalidades, o detergente desnaturante é um detergente aniônico ou um detergente catiônico. Deter- gentes desnaturantes exemplificativos incluem, porém sem limitação, dodecil sulfato de sódio e brometo de etil trimetil amônio. Em algumas modalidades, o detergente desnaturan- te é ou compreende dodecil sulfato de sódio (SDS).

[00170] Em algumas modalidades, a lise das c élulas com- preende incubação na presença de um detergente não des- naturante. Em algumas modalidades, o detergente não des- naturante é um detergente não iônico ou um detergente zwi- teriônico. Detergentes não desnaturantes exemplificativos incluem, porém sem limitação, Triton X-100, sais biliares, tal como colato, e CHAPS.

[00171] Em algumas modalidades, o detergente é um de- tergente compatível com espectrometria de massas.

[00172] Em algumas modalidades, a lise das células com- preende incubação na presença de um detergente, em qu e a concentração do detergente de cerca de 0,1% a cerca de 5%, tal como qualquer um cerca de 0,1% a cerca de 4,5%, cerca de 0,1% a cerca de 4%, cerca de 0,5% a cerca de 3%, cerca de 0,5% a cerca de 2,5%, cerca de 0,5% a cerca de 2%, cerca de 0,5% a cerca de 1,5%, cerca de 0,8% a cerca de 1,2%, ou cerca de 0,9% a cerca de 1,1%. Em algumas modalidades, a lise das células compreende incubação na presença de um detergente, em que a concentração do de- tergente é menor que cerca de 5%, tal como menor que cer- ca de 4,5%, 4%, 3,5%, 3%, 2,5%, 2%, 1,5%, 1%, ou 0,5%. Em algumas modalidades, a lise das células compreende in- cubação na presença de um detergente, em que a concen- tração do detergente é maior que cerca de 0,5%, tal como maior que cerca de 1%, 1,5%, 2%, 2,5%, 3% , 3,5%, 4%, ou 4,5%. Em algumas modalidades, a lise das células compre- ende incubação na presença de um detergente, em que a concentração do detergente é cerca de 0,5%, 1%, 1,5%, 2%, 2,5%, 3%, 3,5%, 4%, 4,5%, ou 5%.

[00173] Em algumas modalidades, a marcação das pr oteí- nas superficiais compreende marcação com um agente de afinidade ou um identificador de afinidade. Em algumas mo- dalidades, labeling the proteínas superficiais compreende a marcação das proteínas superficiais compreende marcação com um agente de afinidade ou um identificador de afinida- de, em que agente de afinidade ou o identificador de afinida- de handle é impermeável a células. Em algumas modalida- des, a marcação das proteínas superficiais compreende mar- cação com biotina. Em algumas modalidades, a marcação das proteínas superficiais compreende marcação com aminas primárias com biotina. Em algumas modalidades, a marcação das proteínas superficiais compreende marcaçãol com um reagente da química de click.

[00174] Em algumas modalidades, a uma ou mais proteínas são isoladas usando um reagente compreendendo avidina, estreptavidina, NeutrAvidin™, ou CaptAvidin™. Em algumas modalidades, a uma ou mais proteínas são isoladas usando um reagente compreendendo um reagente da química de click complementar.

[00175] Em algumas modalidades, a técnica de isolamento de polipeptídios isola o proteoma celular, por exemplo, para análise do proteoma celular integral, dos outros componen- tes celulares.

[00176] Em algumas modalidades, a técnica de isolamento de polipeptídios compreende ainda uma etapa de purificação de polipeptídios compreendendo a remoção de uma substân- cia que não é compatível com uma técnica de espectrometria de massas, por exemplo, um tensoativo ou detergente, de uma amostra.

2. TÉCNICAS DE PROCESSAMENTO DE POLIPEPTÍDIOS

[00177] Em algumas modalidades, os métodos revelados neste pedido compreendem a realização de uma técnica de processamento de polipeptídios. Geralmente, depois de uma técnica de isolamento de polipeptídios, as amostras de poli- peptídio podem precisar ser processadas para compatibilida- de com uma técnica de espectrometria de massas, incluindo modificação com solvente, digestão proteolótica, e/ou con- centração. Estas técnicas de isolamento de polipeptídios são bastante conhecidas na literatura e são contempladas para uso nos métodos da presente invenção. Neste pedido estão apresentadas técnicas de processamento de polipeptídios, os métodos da presente invenção não estando limitados às mesmas.

[00178] Em algumas modalidades, a técnica de processa- mento de polipeptídios é uma técnica de processamento de proteínas totais. Em algumas modalidades, a técnica de pro- cessamento de proteínas totais compreende modificação ou ajuste de um solvente de uma amostra de polipeptídio. Em algumas modalidades, a técnica de processamento de prote- ínas totais compreende concentração de uma amostra de po- lipeptídio. Em algumas modalidades, a técnica de processa- mento de proteínas totais compreende desnaturação de uma proteína em uma amostra de polipeptídio. Em algumas moda- lidades, a técnica de processamento de proteínas totais compreende purificação de uma proteína em uma amostra de polipeptídio. Em algumas modalidades, modificação ou ajus- te de um solvente de uma amostra de polipeptídio, por exemplo, adição de um ácido à amostra de polipeptídio, tal como ácido trifluoroacético ou ácido fórmico.

[00179] Em algumas modalidades, a técnica de processa- mento de polipeptídios é uma técnica de processamento de polipeptídios baseada na digestão. Em algumas modalida- des, a técnica de processamento de polipeptídios baseada na digestão compreende denaturing uma proteína em uma amostra de polipeptídio. Em algumas modalidades, a técnica de processamento de polipeptídios baseada na digestão compreende modificação ou ajuste de um solvente de uma amostra de polipeptídio. Em algum as modalidades, a técnica de processamento de polipeptídios baseada na digestão compreende adição de um agente redutor e/ou um agente modificador de aminoácidos, tal como iodoacetamida, a uma amostra de polipeptídio. Em algumas modalidades, a técnica de processamento de polipeptídios baseada na digestão compreende uma técnica de digestão de polipeptídios, tal como por digestão proteolítica e/ou química. Em algumas modalidades, técnica de digestão de polipeptídios compre- ende digestão enzimática usando uma pr otease. Em algumas modalidades, a protease é uma ou mais de tripsina, Lys -C, IdeS, IdeZ, PNGase F, termolisina, pepsina, elastase, Arg -C, TEV, Glu-C, Asp-N, e Factor Xa. Em algumas modalidades, digestão da amostra compreende digestão química, tal como hidrólise ácida. Em algumas modalidades, a técnica de pro- cessamento de polipeptídios baseada na digestão compreen- de dessalinização de uma amostra de polipeptídio. Em algu- mas modalidades, a técnica de processamento de polipeptí- dios baseada na digestão compreend e concentração de uma amostra de polipeptídio. Em algumas modalidades, a técnica de processamento de polipeptídios baseada na digestão compreende purificação de um peptídio em uma amostra de polipeptídio. Em algumas modalidades, modificação ou ajus- te de um solvente de uma amostra de polipeptídio, por exemplo, adição de um ácido à amostra de polipeptídio, tal como ácido trifluoroacético ou ácido fórmico.

[00180] Em algumas modalidades, a amostra de polipeptí- dio é dividida em uma primeira e uma segunda alíquota, em que a primeira alíquota é processada usando uma primeira técnica de processamento de polipeptídios, em que a segun- da alíquota é processada usando uma segunda técnica de processamento de polipeptídios, e em que a primeira técnica de processamento de polipept ídios e a segunda técnica de processamento de polipeptídios são as mesmas. Em algumas modalidades, a amostra de polipeptídio é dividida em uma primeira e uma segunda alíquota, em que a primeira alíquota é processada usando uma primeira técnica de processam en- to de polipeptídios, em que em uma primeira e uma segunda alíquota, em que a segunda alíquota é processada usando uma segunda técnica de processamento de polipeptídios, e em que a primeira técnica de processamento de polipeptídios e a segunda técnica de processamento de polipeptídios são diferentes. E. Medição de glicanas

[00181] Em modalidades particulares, as alterações ou dife- renças na expressão de enzimas, por exemplo, glicotransfe- rases, podem ser avaliadas, analisadas, ou determinadas por detecção de N-glicanas presentes na superfície das células. Em alguns aspectos, as glicanas são presas a proteínas por modificação pós-translacional, tal como para resultar em gli-

coproteínas ou proteoglicanas. Em geral, as glicanas são en- contradas na superfície externa das células, tal como conju- gadas a proteínas superficiais. Em alguns aspectos, a glica- na contém um oligossacarídeo ou um grande número de mo- nossacarídeos que são ligados glicosidicamente.

[00182] Modaliddes particulares contemplam espécies es- pecíficas de glicana são conjugadas a proteínas por enzimas específicas, por exemplo, glicotransferases específicas, de- tecção da presença, ausência, nível, ou quantidade de uma ou glicanas específicas indicam a presença, ausência, nível, quantidade, ou atividade de enzimas específicas, por exem- plo, glicotransferases específicas, com atividde correspon- dente, por exemplo, conjugação da glicana específica a pro- teínas como uma modificação pós -translacional. Em algumas modalidades, a modificação pós -translacional de proteínas pela adição de glicanas específicas é medida por glicotrans- ferases específicas. Tais glicotransferases incluem, porém sem limitação, aquelas codificadas pelos MGAT1, MGAT2, MGAT3, MGAT4A, MGAT4B, MGAT5, e MGAT5B. Em algu- mas modalidades, a presença, ausência, nível, ou q uantida- de de glicanas, por exemplo, N -glicanas, presente na super- fície celular é detectada ou medida como uma leitura da pre- sença, ausência, nível, ou quantidade de uma ou mais glico- transferases. Em modalidades particulares, a presença, au- sência, nível, ou quantidade de glicanas, por exemplo, N- glicanas, presente na superfície celular é detectada ou me- dida como uma leitura da presença, ausência, nível, ou quantidade de uma ou mais glicotransferases codificadas por MGAT1, MGAT2, MGAT3, MGAT4A, MGAT4B, MGAT5, ou MGAT5B.

[00183] Em certas modalidades, a detecção das glicanas pode ser efetuada por uma técnica capaz de identificar e/ou quantificar quantidades de espécies individuais de glicanas. Em certas modalidades, uma espécie de glicanas inclui gli- canas que possuem estruturas idênticas que são diferentes das estruturas de outra espécie de glicana. Em modalidades particulares, a técnica é uma técnica de espectrometria de massas e/ou uma técnica de cromatografia líquida (LC), tal como cromatografia líquida de alta efi ciência (HPLC) ou cro- matografia líquida de ultra eficiência (UPLC). Em algumas modalidades, as glicanas são detectadas usando qualquer técnica adequada apresentada neste pedido, por exemplo, na Seção I.

[00184] Em certas modalidades, uma composição de célu- las é incubada, cultivada, ou tratada em condições adequa- das para remover, liberar, ou desprender glicanas, por exemplo, N-glicanas, da superfície das células da composi- ção. Em certas modalidades, uma composição de células é tratada, incubada, e/ou colocada em contato com um agente parar remover, separar, ou desprender glicanas, por exem- plo, N-glicanas, da superfície das células. Em modalidades particulares, as células são intactas, i.e., as células não são lisadas nem homogeneizadas antes de tratamento com o agente. Em certas modalidades, as células são células vivas. Em algumas modalidades, tratamento, incubação, e/ou con- tato das células com o agente não quebra e/ou rompe a membrana celular. Em algumas modalidades, as células são células vivas, e tratamento, incubação, e/ou contato das cé- lulas com o agente não destrói as células. Em certas modali- dades, as células são células vivas, e tratamento, incubação,

e/ou contato das células com o agente não induz morte celu- lar, por exemplo, apoptose ou necrose nas células.

[00185] Em algumas modalidades, a composição de células é tratada, incubada, e/ou colocada em contato com um agen- te tal como uma N-glicosidase, por exemplo, PNGase F, re- sultando na remoção, separação, e/ou desprendimento de glicanas, por exemplo, N-glicanas, do glicoconjugado expos- to na superfície. Em algumas modalidades, o glicoconjugado é uma proteína, por exemplo, uma glicoproteína. Em modali- dades particulares, o tratamento, contato, e/ou incubação da composição de células com o agente resulta na remoção, separação, e/ou desprendimento de glicanas da proteína ex- posta na superfície. Em modalidades particulares, as N - glicanas liberadas, removidas, e/ou desprendidas são intac- tas. Em algumas modalidades, a remoção, separação, e/ou desprendimento das glicanas da prote ína exposta na superfí- cie não danifica, digere, e/ou de altera de forma alguma a estrutura da glicana. Em modalidades particulares, a remo- ção, separação, e/ou desprendimento das glicanas da prote- ína exposta na superfície não danifica, digere, e/ou de alter a de forma alguma a estrutura da porção, por exemplo, proteí- na, da qual a glicana fora liberada. Em algumas modalida- des, a remoção, separação, e/ou desprendimento das glica- nas da proteína exposta na superfície resulta conversão de asparagina em aspartato, mas de forma alguma danifica, di- gere, e/ou altera a estrutura da proteína da qual a glicana fora liberada.

[00186] Em algumas modalidades, o agente é qualquer agente que facilita a remoção, separação, e/ou desprendi- mento de glicanas, por exemplo, N -glicanas, de um glicocon-

jugado, por exemplo, uma glicoproteína. Em certas modali- dades, o agente remove quimicamente a glicana do glicocon- jugado, por exemplo, porém sem limitação, por hidrazinólise ou β-eliminação de álcalis.

[00187] Em certas modalidades, o agente é uma enzima. Em modalidades particulares, o agente é uma enzima que remove, separada, e/ou desprende especificamente glicanas N- ou O-ligadas de um glicoconjungado. Em certas modali- dades, o agente é uma amidase. Em algumas modalidades, o agente é ou inclui uma glicosi dase, tal como uma N- glicosidase. Em modalidades particulares, o agente é ou in- clui endoglicosidase H (Endo H), endoglicosidase F (EndoF), N-glicosidase A (PNGase A), ou N-glicosidase F (PNGase F) ou combinações das mesmas. Em algumas modalidades, o agente é ou inclui uma amidase da classe das peptídio -N4- (N-acetil-beta-glucosaminil) asparagina amidases. Em moda- lidades particulares o agente é ou inclui uma PNGase F.

[00188] Em algumas modalidades, o agente é uma enzima que libera ou é capaz de liberar oligossacar ídeos de compri- mento total de proteínas e peptídios tendo carboidratos N - ligados. Em algumas modalidades, o agente é uma PNGase F que libera, ou é capaz de liberar oligossacarídeos de com- primento total de proteínas e peptídios tendo carboidratos N - ligados. Em certas modalidades, o agente não é ou não inclui endoglicosidases, tal como Endo F, Endo H, e Endo D. Em algumas modalidades, as endoglicosidases, tal como Endo F, Endo H, e Endo D não liberam oligossacarídeos de compri- mento total e/ou não clivam todas as classes comuns de oli- gossacarideos N-ligados de glicoproteínas.

[00189] Em certas modalidades, o agente não é uma pro-

tease. Em algumas modalidades, o agente não inclui uma protease. Em modalidades particulares, o agente não é uma serina protease, uma cisteína protease, uma trenonina pro- tease, uma protease aspártica, uma protease glutâmico, uma metaloprotease, ou asparagina peptídio liases. Em certas modalidades, o agente não é e não inclui uma endopeptida- se, por exemplo, tripsina, quimiotripsina, pepsina, papa ína, e elastase. Em modalidades particulares, o agente não é e não inclui tripsina.

[00190] Em modalidades particulares, incubação em condi- ções que são adequadas para remover, liberar, ou despren- der glicanas da superfície das células inclui colocar em con- tato, tratar, e/ou incubar as células com um agente. Em mo- dalidades particulares, o agente é ou inclui uma PNGase F. PNGase F é uma amidase da classe das peptídio -N4-(N- acetil-beta-glucosaminil) asparagina amidases. Em algumas modalidades, PNGase F é uma enzima ba cteriana que libera N-glicanas de uma asparagina. Em modalidades particulares, a PNGase F libera a N-glicana inteira, i.e., intacta, da aspa- ragina. Em certas modalidades, a PNGase F remove N - glicanas do tipo oligomanose, híbridas, e complexas presas à asparagina. Em modalidades particulares, a PNGase F libera N-glicanas presas ao nitrogênio das asparagina, convertendo assim a asparagina em aspartato. Em certas modalidades, a clivagem ocorre em uma posição do carboidrato que é adja- cente ao resíduo asparagina. Em modalidades particulares, o agente é ou inclui uma enzima que apresenta atividade de peptídio-N -(N-acetil-β-N-glucosaminil) asparagina aminida- se. Em certas modalidades, uma composição de células é tratada, colocada em contato, ou incubada com um agente que é ou inclui uma PNGase F.

[00191] Em algumas modalidades, a PNGase F é uma PGNase F recombinante. Em certas modalidades, a PNGase F uma PNGase F mutante. Em algumas modalidades, a PNGase F é uma PNGase F recombinante que é clonada a partir de Flavobacterium meningosepticum. Em modalidades particulares, a PNGase F é clonada a partir do gene inteiro da PNGase F de Flavobacterium meningosepticum. Em cer- tas modalidades, o gene inteiro da PNGase F de Flavobacte- rium meningosepticum é um gene de PNGase F descrit o em Tarentino et al., Journal of Biological Chemistry, 265(12): 6961-6966 (1990). Em modalidades particulares, o gene in- teiro da PNGase F é um gene da PNGase F que codifica um polipeptídio de PNGase F que é identificado pelo Acesso Uniprot número P21163,2. Em algumas modalidades, o gene inteiro da PNGase F é um gene da PNGase F que codifica um polipeptídio de PNGase F com a sequência de aminoáci- dos apresntada na SEQ ID NO: 61.

[00192] Em modalidades particulares, o agente é ou inclui a PNGase F que é produzida a partir de um polinucleotídeo que clonado a partir da PNGase inteira é o gene inteiro do peptídio N-glicosidase F(PNGase F) do genoma de Flavobac- terium meningosepticum, expresso e purificado nos vetores de expressão pET 29-b (Novagen) e pQE-T7(Qiagen) de T7. Em certas modalidades, o polinucleotídeo que codifica a PNGase F contém uma etiqueta histidina C -terminal in-frame. Em algumas modalidades, o polinucleotídeo codificando o construto de PNGase F etiquetado com HIS é transformado na cepa bacteriana BL21 Star (DE3) que carrega o gene para a T7 RNA polimerase sob controle do promotor lacUV5 que permite um alto nível de expressão induzível por isopropil - beta-D-tiogalactopiranoside (IPTG) de produtos genéticos provenientes de vetores de expressão T7 tal como pE T epQE. Em modalidades particulares, são realizadas trans- formação bacteriana e crescimento em cultura de células, as células bacterianas são colhidas por centrifugação, e as pe- lotas de células são lavadas com tampões contendo inibido- res de protease (SigmaFast livre de EDTA). Em modalidades particulares, os lisados de proteínas celulares totais são fei- tos em um homogeneizador de alta pressão Avestin C5. Em algumas modalidades, os métodos de purificação por FPLC para a proteína PNGase F recombinante etiquetad a com his- tidina utilizam colunas Ni -NTA (Qiagen) e IMAC HisTrap HP (GE Healthcare). Em algumas modalidades, o lisado de célu- las bacterianas resultantes de culturas induzidas por IPTG é carregado na coluna e ligado ao polipeptídio PNGase F com a etiqueta His C-terminal His tag é lavado e eluído com um gradiente escalonado de imidazol em tampão de ligação. Em algumas modalidades, a PNGase F purificada com terminal C é dialisada e armazenada em tampão PBS. Em modalidades particulares, o agente é ou inclui uma PNGase que é uma PNGase F recombinante com uma etiqueta His C -terminal ou é uma PNGase F que é idêntica a uma PNGase F produzida pelos métodos descritos em Powers et al. Analytical Chemis- try, 85(20):9799-806 (2013).

[00193] Em algumas modalidades, o agente é ou in clui uma PNGase F that é uma PNGase F comercialmente disponível. PNGase F comercialmente disponível inclui, porém sem limi- tação, PNGase F Proteomics Grade (Catálogo # P 7367, Sigma); PNGase F (Catálogo # P0704S e P0704L, New En-

gland Biolabs), PNGase F (Cat álogo # V4831, Promega), N- GLICANAASE (Catálogo #: GKE-5006A, GKE-5006B, GKE- 5006D, GKE-5016A, GKE-5016B, GKE-5016D, GKE-5010B, GKE-5016D, GKE-5020B, GKE-5020D, e GKE-5003, ProZyme), e PNGase F (Catálogo #: E -PNG01, QA Bio),RAPID PNGase F (Catálogo # P0710S, New England Bi- olabs), PNGASE F PRIME (N -Zyme Scientifics). Em certas modalidades, a PNGase F é ou é idêntica à PNGASE F PRIME (N-Zyme Scientifics).

[00194] Em modalidades particulares, as células são remo- vidas de uma amostra, solução, ou meio que contém glicana s superficiais liberadas. Em certas modalidades, as glicanas são removidas e/ou separadas do meio ou solução. Em al- gumas modalidades, a solução ou meio é evaporado. Em modalidades particulares, a solução ou meio é evaporado por centrifugação a vácuo, por exemplo, com um speedvac. Em modalidades particulares, as glicanas são removidas e/ou separadas do meio ou solução e são então ressuspedidas. Em algumas modalidades, as glicanas podem ser ressuspen- didas em um volume de um tampão ou solução. Em algumas modalidades, o tampão ou solução é adequado para armaze- namento. Em certas modalidades, o tampão é adequado para uso com uma técnica para detecção, identificação, e/ou de- tecção das glicanas. Em certas modalidades, o tampão ou solução é adequado para uma reação química, por exemplo, uma reação de derivação tal como a adição de um marcador detectável.

[00195] Em certas modalidades, glicanas, por exemplo, N - glicanas, são modificadas para melhorar e/ou aumentar a de- teção das glicanas. Em muitos casos, as glicanas podem não facilmente detectáveis devido à ausência de um cromóforo ou fluoróforo ou porção ativa fort e que seja detectável por cromatografia líquida e/ou por espectrometria de massas. Em algumas modalidades, a absorvência e resposta de fluores- cência da glicana podem ser relativamente fracas ou estar abaixo de um limiar de detecção. Em algumas modalidades, uma tática para maximizar a sensibilidade de um ensaio é converter o composto de interesse, i.e., a glicana, em um de- rivado que apresente uma resposta melhor para o método de detecção particular sendo utilizado. Em certas modalidades, o agente de derivatização afeta ou influencia a sensibilidade final e a precisão de uma análise maximizando a sensibilida- de, o rendimento e/ou a estabilidade das moléculas derivati- vas. Assim sendo, em algumas modalidades, as glicanas (por exemplo, N-glicanas) que foram liberadas das superfícies ce- lulares são derivatizadas antes de qualquer procedimento de análise ou detecção.

[00196] Em algumas modalidades, as glicanas são derivati- zadas antes de uma análise por HPLC e/ou espectrometria de massas. Em algumas modalidades, a sensibilid ade da de- tecção de N-glicanas por técnicas existentes, por exemplo, cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC) e/ou detec- ção óptica ou por espectrometria de massas (MS), pode ser melhorada e/ou aumentada por uma etapa de derivatização.

[00197] Em algumas modalidades, a glicana, por exemplo, uma N-glicana, é derivatizada para permitir ou melhorar a detecção por espectrometria de massas. Em certas modali- dades, a glicana é derivatizada para permitir que a glicana aceite uma carga com mais facilidade. Em certas mo dalida- des, uma glicana e/ou uma glicana derivatizada que é capaz de aceitar uma carga é detectável por espectrometria de massas. Em algumas modalidades, a glicana é derivatizada por adição de um grupo amino, por exemplo, um grupo amino terciário.

[00198] Em algumas modalidades, a derivatização é ou in- clui a adição de um marcador detectável às glicanas, por exemplo, N-glicanas. Em algumas modalidades, a adição é uma ligação covalente. Em certas modalidades, o marcador detectável preso aumentar o sinal e/ou reduz o ruído de fun- do durante a detecção das N-glicanas em comparação com a detecção de N-glicanas que não contêm um marcador detec- tável preso. Em certas modalidades, qualquer um de uma va- riedade de marcadores detectáveis pode ser usado de acor- do com a presente invenção, incluindo, porém sem limitação, marcadores fluorescentes, radiomarcadores e/ou marcadores quimioluminescentes. Em certas modalidades, o marcador detectável é um marcador fluorescente. Em certas modalida- des, a ligação, por exemplo, ligação covalent e, do marcador fluorescente não altera a migação N-glicana em uma coluna, por exemplo, uma coluna adequada para HPLC. Em modali- dades particulares, o marcador é um marcador fluorescente e permite que a glicana aceite uma carga com mais facilidade em comparação com uma glicana não marcada.

[00199] Em algumas modalidades, a derivatização das N - glicanas é realizada por uma técnica tradicional na literatura. Um grande número de técnicas de derivatização de N - glicanas já foi descrito e recapitulado em Ruhaak et al., Analytical and Bioanalytical Chemistry 397(8): 3457–3481 (2010). Em algumas modalidades, a derivatização é realiza- da por uma reação química que inclui duas ou mais etapas reacionais. Em algumas modalidades, a derivatização é rea- lizada por uma reação de amin ação redutora, permetilação, adição, adição de Michael, ou marcação com hidrazida. Em certas modalidades, é possível usar vários compostos que oferecem o grupo funcional requerido para a reação de mar- cação. Em certas modalidades, a derivatização é realizad a por uma reação química com uma única etapa reacional. Agentes de marcação que acrescentam um marcador a uma glicana por uma reação química com uma única etapa reaci- onal que são adequados para derivatizar e/ou ligar covalen- temente um macarcador detectável a uma N-glicana incluem agentes que contêm um grupo funcional que reage rapida- mente com aminas (tal como um isocianato, ou succidimidil- carbamato). Tais agentes de marcação e marcadores fluo- rescentes estão descritos no Pedido de Patente US N° US

20140242709.

[00200] Em certas modalidades, as N-glicanas são marca- das por aminação redutora. Nesta reação, um marcador con- tendo um grupo amina primária reage em uma reação de condensação com o grupo aldeído da glicana, resultando em uma imina ou base de Schiff, que é red uzida por um agente redutor para produzir uma amina secundária. Em algumas modalidades, a reação é realizada em dimetil sulfóxido con- tendo ácido acético, tetra-hidrofurano, ou metanol. Em algu- mas modalidades, a aminação redutora resulta na ligação es- tequiométrica de um marcador por N -glicana possibilitando uma quantificação direta baseada na fluorescência ou inten- sidade de absorvência de UV.

[00201] Various labels have been used for the reductive amination of glicanas. Em algumas modalidades, o marcador fluorescente que é ou inclui 2-aminobenzamida (2-AB), ácido 2-aminobenzoico (2-AA), 2-aminopiridina (PA), 2- aminoacridona (AMAC), ácido 2 -aminonaftaleno trissulfônico (ANTS), e ácido 1-aminopireno-3,6,8-trissulfônico (APTS), 3- (acetilamino)-6- aminoacridina (AA-Ac), 6-aminoquinolina (6- AQ), 7-aminometil-coumarina (AMC), 2-amino (6-amido- biotinil) piridina (BAP), 9-fluorenilmetoxicarbonil (FMOC)- hidrazida, 1,2-Diamino-4,5-metilenodioxi-benzeno (DMB), ou o-fenilenodiamina (OPD) é adicionado às glicanas.

[00202] Em modalidades particulares, as N-glicanas são marcadas com um marcador comercialmente disponível. Kits de marcação encontram-se disponíveis para as etiquetas 2 - AB, 2-AA, e PA (Ludger) assim como para marcação com APTS (Beckmancoulter) e ANTS (Prozyme). Em algumas modalidades, o agente de marcação e/ou o marcador fluo- rescente é RapiFluor-MS (W aters Technologies Corporation).

[00203] Em algumas modalidades, o agente de marcação contém uma porção fluorescente, e um grupo funcional que reage rapidamente com aminas (tal como um isocia nato, ou succidimidilcarbamato). Em algumas modalidades, o agente de marcação contém um ou mais de um grupo amino terciário ou outro ativo de MS, uma porção fluorescente, e um grupo funcional que reage rapidamente com aminas (tal como um isocianato, ou succidimidilcarbamato).

[00204] Em modalidades particulares, uma amostra da so- lução extracelular que contém as glicanas é preparada para análise, por exemplo, análise por espectrometria de massas. Em algumas modalidades, a amostra de glicanas, por exem- plo, N-glicanas, é purificada antes da análise. Em algumas modalidades, a purificação inclui qualquer método capaz de separar N-glicanas de quaisquer entidades que vão ou po- tencialmente vão, romper, ocultar e/ou enfraquecer a detec- ção das N-glicanas. Em algumas modalidades, a etapa de purificação é realizada para remover as N -glicanas dos detri- tos celulares, proteínas desglicosiladas, PNGase F, compo- nentes tampão/de formulação, tensoativos, subprodutos da reação de marcação, e/ou o excesso de reagentes de marca- ção e/ou derivatização. Em modalidades particulares, a eta- pa de purificação é realizada em glicanas marcadas, por exemplo, N-glicanas, por exemplo, glicanas com marcadores detectáveis presos covalentemente. Em certas modalidades, a etapa de purificação é realizada por qualquer técnica ade- quada para purificação de glicanas, incluindo, porém sem li- mitação, extração de fase sólida (SPE), extração líquido - líquido, filtração em gel, cromatografia em papel, e precipita- ção.

[00205] Em certas modalidades, as glicanas, por exemplo, as N glicanas, são analisadas por espectrometria de massas, tal como por qualquer técnica de espectrometria de massas adequada descerita neste pedido, por exemplo, na Seção I. Em modalidades particulares, uma composição de células, por exemplo, uma composição de células T de teste, é anali- sada por remoção das glicanas da superfície das células, pu- rificação e derivatização das glicanas, e medição das glica- nas por uma técnica de espectrometria de massas, por exemplo, LC-MS. Em algumas modalidades, a presença , au- sência, nível, ou quantidade de glicanas, por exemplo, N- glicanas, presentes na superfície celular é detectada ou me- dida como uma leitura da presença, ausência, nível, ou quantidade de uma ou mais glicotransferases. Em modalida-

des particulares, a prese nça, ausência, nível, ou quantidade de glicanas, por exemplo, N-glicanas, presentes na superfí- cie celular é detectada e medida e correlacionada com a pre- sença, ausência, nível, ou quantidade de uma ou mais glico- transferases detectadas na amostra, por exemplo, uma téc- nica genômica tal como RNA -seq ou “Assay for Transposase - Accessible Chromatin using sequencing” (ATAC-seq). Em modalidades particulares, a presença, ausência, nível, ou quantidade de glicanas, por exemplo, N-glicanas, presentes na superfície celular é detectada ou medida como uma leitu- ra da presença, ausência, nível, ou quantidade de uma ou mais glicotransferases codificadas por MGAT1, MGAT2, MGAT3, MGAT4A, MGAT4B, MGAT5, ou MGAT5B. II. COMPOSIÇÕES DE CÉLULAS

[00206] Em algumas modalidades, os métodos apre senta- dos neste pedido podem ser usados para determinar, medir, ou avaliar a presença, nível, quantidade, ou expressão de proteínas, por exemplo, proteínas superficiais, de uma com- posição de células por identificação de um perfil de espec- trometria de massas da composição de células. Em algumas modalidades, o perfil de espectrometria de massas é identifi- cado por qualquer um dos métodos apresentados descritos neste pedido, por exemplo, na Seção I. Em certas modalida- des, os métodos são ou incluem uma técnica de espectrome- tria de massas. Em algumas modalidades, os métodos apre- sentados podem ser usados para avaliar ou analisar a pre- sença, ausência, quantidade, nível e/ou abundância relativa de uma ou mais proteínas na superfície de as células da composição.

[00207] Em certas modalidades, um perfil de espectrome-

tria de massas (por exemplo, um perfil de espectrometria de massas de teste) é gerado a partir de uma composição de células de teste. Em modalidades particulares, uma compo- sição de células de teste pode ser qualquer composição de células em que um ou mais marcadores, aspectos, proprie- dades, fenótipos, ou atributos são medidos ou uma composi- ção que se deseja medir pelos métodos apresentados neste pedido, por exemplo, na Seção I, tal como por geração de um perfil de espectrometria de massas. Em algumas modali- dades, a composição de teste é uma composição de células de mamífero. Em particular a composição de teste é uma composição de células humanas. Em modalidades particula- res, a composição de células de teste é ou contém células que são adequadas para manipulação genética (por exemplo, para produzir uma terapia celular), que são coletadas duran- te um processo para manipulação genética (por exemplo, pa- ra produzir uma terapia celular), ou que foram geneticamente modificadas (por exemplo, uma terapia celular contendo cé- lulas geneticamente modificadas).

[00208] Em modalidades particulares, o perfil de espectro- metria de massas é gerado a partir de uma composição de células de teste, por exemplo, uma composição de células imunes contendo células T CAR, para analisar ou avaliar ní- veis, quantidades, ou alterações em proteínas, por exemplo, proteínas superficiais. Em algumas modalidades, os níveis, quantidades, ou alterações em proteínas, por exemplo, pro- teínas superficiais, indicam caracte rísticas funcionais e/ou fenotípicas, propriedades, ou atributos das células, tal como em termos de um ou mais dentre viabilidade, atividade meta- bólica, estado de diferenciação, capacidde proliferativa, es-

tado de ativação, ou atividade citolítica.

[00209] Em algumas modalidades, a composição de células de teste é uma terapia celular. Em modalidades particulares, a composição de células de teste é uma terapia celular que é uma candidata à administração a um indivíduo, por exemplo, um indivíduo humano. Em certas mod alidades, a composição de células de teste é uma terapia de células autólogas. Em certas modalidades, a composição de células de teste é uma terapia de células imunes. Em certas modalidades, a compo- sição de células de teste é uma terapia de células T CAR a u- tólogas. Em algumas modalidades, a composição de células de teste é uma composição de células que será desenvolvi- da, processada, ou geneticamente modificada em uma tera- pia celular. Em modalidades particulares, a terapia celular de teste é uma composição de células que será desenvolvida, processada, ou geneticamente modificada em uma terapia de células T CAR autólogas. Em certas modalidades, a compo- sição de células de teste é uma composição de células cole- tadas durante um processo para gerar ou manipular ge neti- camente uma terapia celular. Em várias modalidades, a com- posição de células de teste é uma composição de células co- letadas durante um processo para manipular geneticamente uma terapia de células T autólogas.

[00210] Em algumas modalidades, a composição de célu las de teste é uma composição de células humanas, por exem- plo, células imunes humanas tal como células T, que passará por um processo de manipulação genética, tal como para ge- rar uma composição de engineered células T. Em certas mo- dalidades, as células são adequadas ou que passarão por qualquer um dos processos para manipulação genética des-

critos neste pedido, por exemplo, na Seção III. Em certas modalidades, a composição de células de teste é uma com- posição de células humanas, por exemplo, células imunes humanas, que incluem células geneticamente modificadas que passaram por um processo para manipulação genética, tal como to generate uma composição de células T geneti- camente modificadas. Em certas modalidades, as células passaram por qualquer um dos process os para manipulação genética descritos neste pedido, por exemplo, na Seção III. Em modalidades particulares, a composição de células de teste é uma composição de células T que é adequada ou que passará por qualquer um dos processos para manipulação genética descritos neste pedido, por exemplo, na Seção III, para produzir uma composição de células T geneticamente modificadas contendo T células expressando um receptor re- combinante, por exemplo, um CAR. Em certas modalidades, a composição de células de teste é uma composição de célu- las T geneticamente modificadas contendo T células expres- sando um receptor recombinante, por exemplo, um CAR. Em certas modalidades, a composição de células T geneticamen- te modificadas passara por um processo para manipulação de células descrito neste pedido, por exemplo, na Seção III.

[00211] Em várias modalidades, a composição de células de teste é uma composição de células humanas, por exem- plo, células imunes humanas tal como células T, que coleta- das durante um processo para gerar uma comp osição de cé- lulas T geneticamente modificadas. Em certas modalidades, as células são coletadas durante qualquer estágio ou instan- te de qualquer um dos processos para gerar células geneti- camente modificadas descritos neste pedido, por exemplo,

na Seção III. Em modalidades particulares, a composição de células de teste contém células T ativadas ou estimuladas. Em certas modalidades, as células T ativadas ou estimuladas foram incubadas em condições estimuladoras, tal como qual- quer uma daquelas descritas neste pedido, por exemplo, na Seção III-B. Em certas modalidades, a composição de célu- las de teste contém células T transformadas ou transfecta- das. Em certas modalidades, um polinucleotídeo heterólogo, tal como um polinucleotídeo codificando um receptor recom- binantu or CAR, fora introduzido ou distribuído nas células T. Em modalidades particulares, o descrito neste pedido, por exemplo, na Seção III-C. Em modalidades particulares, a composição de células de teste contém células T cultivadas ou expandidas. Em certas modalidades, as células T foram cultivadas ou expandidas de acordo com qualquer método apresentado neste pedido, por exemplo, na Seção III -D.

[00212] Em algumas modalidades, a composição de células de teste inclui ou contém células imunes que expressam um receptor recombinante. Em modalidades particulares, a com- posição de células de teste contém células T, por exemplo, células T CD4+ ou células T CD8+ que expressam um recep- tor recombinante. Em certas modalidades, o receptor recom- binante é um antígeno receptor. Em modalidades particula- res, o receptor recombinante é um CAR. Em certas modali- dades, o receptor recombinante é qualquer CAR descrito neste pedido, por exemplo, na Seção II -C-1-a ou II-C-1-b. Em modalidades particulares, o receptor recombinante é u m TCR recombinante, por exemplo, um TCR recombinante des- crito neste pedido tal como na Seção II -C-1-c. Em algumas modalidades, o receptor recombinante é um CAR anti -CD19.

Em certas modalidades, o receptor recombinante é um CAR anti-BCMA.

[00213] Em certas modalidades, os perfis de espectrometria de massas são gerados a partir de mais de uma composição de células de teste. Em certas modalidades, os perfis de es- pectrometria de massas são gerados a partir de duas, três, quatro, cinco, mais de cinco, mais de dez, mai s de vinte, mais de cinquenta, ou mais de 100 composições de células de teste. Em certas modalidades, os perfis de espectrometria de massas são gerados a partir de mais de uma composição de células de teste para determinar um nível ou quantidade média, mediana, ou média de uma ou mais proteínas, por exemplo, proteínas superficiais, de uma pluralidade de com- posições de células de teste. Em algumas modalidades, os perfis de espectrometria de massas são gerados a partir de mais de uma composição de células de teste para determinar uma variabilidade ou variância no nível ou quantidade de uma ou mais proteínas, por exemplo, proteínas superficiais, entre uma pluralidade de composições de células de teste.

[00214] Em algumas modalidades, a composição de células de teste contém células expressando um receptor recombi- nante. Em algumas modalidades, o perfil de espectrometria de massas de uma composição de células de teste é compa- rado com o perfil de uma composição de células que expres- sam um receptor recombinante diferente. Em certas modali- dades, o perfil de espectrometria de massas da composição de células de teste é comparado com uma composição de células que não expressam um receptor recombinante. Em algumas modalidades, o perfil de espectrometria de massas da composição de células de teste pode ser comparado com um perfil de espectrometria de massas de uma composição de células que é produzida por um processo diferente. Em algumas modalidades, o perfil de espectrometria de massas de uma composição de células de teste é compa rado com uma composição de células de teste diferente de um estágio ou etapa diferente de um processo de produção.

[00215] Em modalidades particulares, o perfil de espectro- metria de massas de uma composição de células de teste é comparado com um perfil de espectrometria de massas de uma composição de células de células que foram coletadas em um estágio anterior de um processo de manipulação ge- nética, por exemplo, antes de as células da composição de células de teste serem coletadas. Em algumas modalidades, o perfil de espectrometria de massas de uma composição de células de teste é comparado com um perfil de espectrome- tria de massas de uma composição de células de células que foram coletadas em um estágio posterior de um processo de manipulação genética, por exempl o, depois de as células da composição de células de teste serem coletadas. Em algu- mas modalidades, um perfil de espectrometria de massas de uma composição de células de teste é comparado ao perfil de espectrometria de massas de uma composição de células que se encontrava no mesmo estágio de um processo de produção, mas que foi exposta a condições diferentes, por exemplo, diferentes das condições que as células da compo- sição de células de teste foram expostas.

[00216] Em algumas modalidades, um perfil de espectrome- tria de massas de uma composição de células de teste, por exemplo, um perfil de espectrometria de massas de teste é comparado com um perfil de espectrometria de massas de referência. Em certas modalidades, o perfil de espectrome- tria de massas de referência é um perfil teórico. Em algumas modalidades, o perfil teórico baseia -se em proteínas (e ní- veis, quantidades, ou modificações das mesmas) que se pre- viu estarem ou serem expressas pelas células da composi- ção de células. Em modalidades particulares, o perfil teórico baseia-se em proteínas (e níveis, quantidades, ou modifica- ções das mesmas) que se previu estarem ou serem expres- sas pelas células de uma composição de células que é con- siderada como uma composição de células ideal.

[00217] Em algumas modalidades, o pe rfil de espectrome- tria de massas de referência é obtido a partir de uma compo- sição de células de referência.

[00218] Em certas modalidades, uma composição de célu- las de referência contém células expressando um receptor recombinante. Em modalidades particulares, o receptor re- combinante também é expresso pelas células contidas na composição de células de teste. Em certas modalidades, uma composição de células de referência e a composição de células de teste contêm, cada uma, células expressando o mesmo receptor recombinante. Em algumas modalidades, uma composição de células de referência é gerada a partir de células obtidas do mesmo indivíduo que uma composição de teste. Em certas modalidades, uma composição de célu- las de referência é gerada a partir de células que foram obti- das de um indivíduo diferente do indivíduo do qual foram ob- tidas as células para gerar a composição de teste. Em moda- lidades particulares, a composição de células de referência (i) foi gerada a partir das células obtidas do mesmo indivíduo que as células usadas para gerar a composição de células de teste e (ii) contém células que expressam um receptor re- combinante diferente daquele das células na composição de teste. Em várias modalidades, a composição de células de referência (i) foi gerada a par tir das células obtidas de um indivíduo diferente diferente daquele das células usadas pa- ra gerar a composição de células de teste e (ii) contém célu- las que expressam o mesmo receptor recombinante que as células na composição de teste. Em certas modalidades, o receptor recombinante é um CAR.

[00219] Em algumas modalidades, uma composição de cé- lulas de referência contém células que foram coletadas em um estágio de um processo de manipulação genética anterior ao estágio em que as células da composição de células de teste foram coletadas. Em certas modalidades, a composição de células de referência contém contém células que foram coletadas em um estágio de um processo de manipulação genética posterior ao estágio em que as células da composi- ção de células de teste foram coletaas. Em certas modalida- des, a composição de células de referência contém células que foram coletadas no mesmo estágio de um processo de manipulação genética que as células da composição de tes- te. Em modalidades particulares, a composição de células de referência contém células que foram coletadas no mesmo es- tágio de um processo de manipulação genética que as célu- las da composição de teste, mas que foram expostas a con- dições diferentes.

[00220] Em modalidades particulares, o perfil de espectro- metria de massas de referência é obtido a partir de uma plu- ralidade de composições de células de referência. Em certas modalidades, a pluralidade inclui, inclui cerca de, ou inclui pelo menos 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 40, 50, 100, 200, 500, ou 1.000 composições de células de referência. Em mo- dalidades particulares, o perfil de espectrometria de massas de referência é ou inclui o valor médio, médio, ou mediano dos perfis de espectrometria de massas obtidos a partir do perfil de espectrometria de massas de referência . A. Tipos de células

[00221] Modalidades particulares contemplam que qualquer composição contendo células pode ser avaliada de acordo com o método aprsentado. Em algumas modalidades, a po- pulação de células é ou compreende uma linhagem celular ou células primárias. Em algumas modalidades, a população de células é ou compreende células primárias, tal como célu- las primárias obtidas de um indivíduo, por exemplo, um indi- víduo humano. Em algumas modalidades, a população de cé- lulas é ou compreende células -tronco, tal como células- tronco pluripotentes induzidas. Em algumas modalidades, a composição de células, por exemplo, uma composição fonte ou uma porção da mesma, tal como uma composição de cé- lulas de teste, é uma composição que é associada a um pro- cesso de produção de uma composição de células, incluindo células geneticamente modificadas com um ácido nucleico recombinante. Em algumas modalidades, a composição de células é uma composição farmacêutica.

[00222] Em certas modalidades, as células são ou incluem células eucarióticas. Em certas modalidades, as células da composição de células são células animais. Em algumas mo- dalidades, as células da composição são células de mamífe- ro. Em certas modalidades, as células são células de ca- mundongo, células de hamster, células de rato, ou c élulas de primatas não humanos. Em algumas modalidades, as células são células humanas.

[00223] Em algumas modalidades, as células são células de uma linhagem celular, por exemplo, células de ovário de hamster chinês (CHO), linhagem CV1 de rim de macado transformada por 5V40 (C057); linhagem 293 de rim embrio- nário humano; células renais de filhote de hamster (BHK); células de Sertoli de camundongo (TM4); células renais de macaco (CVI-76); células renais de macaco verde africano (VERO-76); células de carcinoma cervical humano (HELA); células renais de cachorro (MDCK); células hepáticas de bú- falo rato (BRL 3A); células pulmonares humanas (W 138); cé- lulas hepáticas humanas (Hep G2); células de tumor de ma- ma de camundongo (MMT); células de hepatoma de rato (HTC); células HIH/3T3, e células TRI. Para uma relação completa de linhagens de células de mamífero, os especialis- tas na técnica devem consultar o catálogo da American Type Culture Collection (ATCC, Mamassas, VA). Em algumas mo- dalidades, as células podem ser de uma variedade de tipos de células, por exemplo, fibroblastos, mioblastos, macrófa- gos, ou células epiteliais.

[00224] Em modalidades particulares, as células de uma composição são ou incluem células-tronco. Em certas moda- lidades, as células da composição de células são células- tronco pluripotentes, células -tronco multipotentes, células - tronco oligopotentes, e/ou células -tronco unipotentes. Em modalidades particulares, as células são células -tronco indu- zidas, por exemplo, células -tronco pluripotentes induzidas (ipsc). Em modalidades particulares, as células da composi- ção são células, por exemplo, que estão em processo de se-

rem reprogramadas, por exemplo, para pluripotência. Em al- gumas modalidades, as células são células -tronco em pro- cesso de diferenciação.

[00225] Em algumas modalidades, as células da composi- ção são células imunes. Em modalidades particulares, uma composição de células contém uma ou mais de células T, cé- lulas B, e/ou células NK. Em algumas modalidades as células da composição de células são células T CD3+. Em al gumas modalidades, as células são células T CD4+. Em certas mo- dalidades, as células são células T CD8+. Em algumas mo- dalidades, uma ou mais de células T efetoras, células T auxi- liares, células T citotóxicas, células T de memória, e células T supressoras. Em algumas modalidades, as células são cé- lulas exterminadoras naturais (NK). Em algumas modalida- des, as células são monócitos ou granulócitos, por exemplo, células mieloides, macrófagos, neutrófilos, células dendríti- cas, mastócitos, eosinófilos, e/ou basófilos.

[00226] Em algumas modalidades, a composição de células é ou inclui células T. Em modalidades particulares, células T são ou incluem os subtipos e populações de células T tal como um ou mais de células T naïve (T N ), células T efetoras (T E F F ), células T de memória e subtipos das mesmas, tal co- mo células T-tronco de memória (T S C M ), células T de memó- ria central T (T C M ), células T de memória efetora (T E M ), ou células T de memória efetora diferenciadas terminalmente, linfócitos infiltrantes de tumor (TIL), células T imaturas, célu- las T maduras, células T auxiliares, células T citotóxicas, cé- lulas T invariantes associada à mucosa (MAIT), células T re- guladoras de ocorrência natural e adaptativas (Treg), células T auxiliares, tal como células TH1, células TH2, células TH3,

células TH17, células TH9, células TH22, células T auxiliares foliculares, células T alfa/beta, e células T delta/gama. Em algumas modalidades, a célula é uma célula T reguladora (Treg). Em algumas modalidades, a células compreende ain- da uma FOXP3 recombinante ou variante da mesma. Em al- gumas modalidades, a composição de células é ou inclui cé- lulas T CD3+. Em certas modalidades, a composição de célu- las é ou inclui células T CD4+. Em certas modalidades, a composição de células é ou inclui células T CD8+.

[00227] Em certas modalidades, as proteínas superficiais de células primárias são avaliadas. Em algumas modalida- des, a composição de células contém células primárias, tal como aquelas isoladas diretamente de um indivíduo e/ou iso- ladas de um indivíduo e congelad as. Em algumas modalida- des, as células incluem um ou mais subconjuntos de células T ou outros tipos de células, tal como populações de células T totais, células T CD4+, células T CD8+, e subpopulações das mesmas, tal como aquelas definidas pela função, est ado de ativação, maturidade, potencial para diferenciação, ex- pansão, recirculação, localização, e/ou capacidade de per- sistência, específicidade para antígeno, tipo do receptor de antígeno, presença em um órgão ou compartimento particu- lar, perfil da secreção do marcador ou das citocinas, e/ou grau de diferenciação. Em relação ao indivíduo a ser tratado, as células podem ser alogênicas e/ou autólogas.

[00228] Em algumas modalidades, uma ou mais células da composição são células geneticamente modificadas. Em al- guns casos, a uma ou mais células são geneticamente modi- ficadas para conter um ácido nucleico recombinante, por exemplo, para conter um ácido nucleico heterólogo e/ou ex-

pressar uma proteína heteróloga. Em algumas modalidades, o ácido nucleico recombinante codif ica uma proteína recom- binante. Em alguns casos, a proteína recombinante pode ser qualquer proteína que se queira que seja expressa ou produ- zida por uma composição de células recombinantes. Em al- gumas modalidades, a proteína recombinante é um receptor recombinante. Em algumas modalidades, o ácido nucleico recombinante é ou inclui um vetor viral, por exemplo, um ve- tor lentiviral ou retroviral, que é transferido ou introduzido na célula para expressão da proteína recombinante. B. Composições de células geneticamente modificadas

[00229] Em certas modalidades, as células geneticamente modificadas contêm um polinucleotídeo heterólogo que codi- fica um receptor recombinante. Em algumas modalidades, o receptor recombinante é um receptor quimérico ou um recep- tor de antígeno, tal como um receptor de antígeno quimérico (CAR) ou um receptor de células T (TCR). Em certas modali- dades, as células geneticamente modificadas são produzi- das, fabricadas, ou geradas por qualquer método descrito neste pedido, por exemplo, na Seção III. Em cert as modali- dades, um perfil de espectrometria de massas é medido, de- terminado, ou obtido a partir de células geneticamente modi- ficadas que foram produzidas, fabricadas, ou geradas por um método descrito neste pedido, por exemplo, na Seção III

[00230] Em algumas modalidades, todas ou parte das célu- las em uma composição contêm ou são geneticamente modi- ficadas para conter um receptor geneticamente modificado, tal como um receptor de antígeno quimérico (CAR), ou um receptor de células T (TCR). Em modalidades particulare s, todas ou parte das células em uma composição expressam o receptor geneticamente modificado. Em algumas modalida- des, as composições contendo células geneticamente modifi- cadas são enriquecidas para tais células. Em certas modali- dades, as células de um det erminado tipo tal como células T ou células T CD8+ ou CD4+ são enriquecidas ou seleciona- das. Em modalidades particulares, a composição de células é uma composição de células terapêutica e/ou farmacêutica, tal como para terapia celular adotiva. Em algumas m odalida- des, um perfil de espectrometria de massas é medido, de- terminado, ou obtido a partir de uma composição de células terapêutica, por exemplo, uma terapia celular. Em algumas modalidades, um perfil de espectrometria de massas é medi- do, determinado, ou obtido a partir de uma composição de células geneticamente modificadas contendo células T CAR+.

1. Receptores Recombinantes

[00231] Em algumas modalidades, um perfil de espectrome- tria de massas é medido, determinado, ou obtido a partir de células geneticamente modificadas, tal como células imunes, tal como células T, que expressam um ou mais receptores recombinantes. Entre os receptores estão receptores de an- tígeno e receptores contendo um ou mais componentes do mesmo. Os receptores recombinantes podem incluir recepto- res quiméricos, tal como aqueles contendo domínios de liga- ção de ligante ou fragmentos de ligação dos mesmos e do- mínios ou regiões de sinalização intracelular, receptores de antígeno funcionais diferentes de TCR, receptores de antí- geno quiméricos (CARs), e receptores de células T (TCRs), tal como TCRs recombinantes ou transgênicos, receptores de autoanticorpo quiméricos (CAAR) e componentes de qual-

quer um dos acima. O receptor recombinante, tal como um CAR, geralmente inclui o domínio de ligação de antígeno (ou ligante) extracelular ligado a um ou mais componentes de si- nalização intracelular, em alguns aspectos via ligantes e/ou domínios transmembranares. Em algumas modalidades, as células geneticamente modificadas expressam dois ou mais receptores que contêm componentes, domínios ou regiões diferentes. Em alguns aspectos, dois ou mais receptores permitem a regulação ou o controle espacial ou temporal da especificidade, ligação de antígeno (ou ligante), função e/ou expressão dos receptores recombinantes.

[00232] Em algumas modalidades, os perfis de espectrome- tria de massas obtidos de diferentes composições de células expressando o mesmo receptor recombinante, por exemplo, um CAR ou TCR recombinante, são comparados. Em certas modalidades, os perfis de espectrometria d e obtidos de dife- rentes composições de células expressando o mesmo recep- tor recombinante que foram gerados por diferentes proces- sos de manipulação genética são comparados. Em algumas modalidades, os perfis de espectrometria de massas podem ser comparados para avaliar mudanças nas propriedades das células em resposta aos diferentes processos de manipula- ção genética. Em algumas modalidades, os perfis de espec- trometria de massas são comparados para detectar seme- lhanças ou diferenças nos níveis ou quantidades do receptor recombinante presente na superfície celular. Em modalida- des particulares, os perfis de espectrometria de massas são comparados para detectar semelhanças ou diferenças nos níveis ou quantidades de modicações pós -translacionais, por exemplo, conjugação de glicanas, no receptor recombinante.

[00233] Em algumas modalidades, perfis de espectrometria de massas obtidos de diferentes composições de células ex- pressando o mesmo receptor recombinante, por exemplo, um CAR ou TCR recombinante, são coletados, tal co mo para de- terminar ou calcular um perfil de espectrometria de massas médio, mediano, ou parte do mesmo. Em modalidades parti- culares, perfis de espectrometria de massas obtidos de dife- rentes composições de células expressando o mesmo recep- tor recombinante são coletados, tal como para determinar ou calcular um nível ou quantidade média, mediana, ou média de uma ou mais proteínas individuais expressas na superfí- cie das células das composições. Em modalidades particula- res, perfis de espectrometria de massas obt idos de diferen- tes composições de células expressando o mesmo receptor recombinante são coletados, para determinar ou calcular um nível ou quantidade média, mediana, ou média de uma ou mais mofidificações pós-translacionais individuais em uma ou mais proteínas que são expressas na superfície celular. Em algumas modalidades, o perfil de espectrometria de massas médio, médio, ou mediano ou uma parte do mesmo pode ser- vir como um perfil de proteínas de referência.

[00234] Em modalidades particulares, perfis de espectro- metria de massas obtidos de diferentes composições de cé- lulas expressando o mesmo receptor recombinante, por exemplo, um CAR ou TCR recombinante, são coletados para determinar ou calcular a variabilidade ou variância através dos perfis de espectrometria de massas ou partes dos mes- mos. Em modalidades particulares, perfis de espectrometria de massas obtidos de diferentes composições de células ex- pressando o mesmo receptor recombinante são coletados pa-

ra determinar ou calcular a variabilidade ou variância atra vés das composições de células para a quantidade de uma ou mais proteínas individuais expressas na superfície celular. Em algumas modalidades, perfis de espectrometria de mas- sas obtidos de diferentes composições de células expres- sando o mesmo receptor reco mbinante são coletados para determinar ou calcular a variabilidade ou variância através das composições de células para a quantidade de uma ou mais modificações pós-translacionais individuais. a. Receptores de antígeno quiméricos (CARs)

[00235] Em algumas modalidades, as células geneticamen- te modificadas, tal como células T, expressam um receptor recombinante tal como um receptor de antígeno quimérico (CAR) com especificidade para um antígeno (ou marcador ou ligante) particular, tal como um antígeno expresso na super- fície de um tipo de célula particular. Em algumas modalida- des, o antígeno é um polipeptídio. Em algumas modalidades, o antígeno é um carboidrato ou outra molécula. Em algumas modalidades, o antígeno é seletivamente expresso ou supe- rexpresso nas células da doença ou condição, por exemplo, as células tumorais ou patogênicas, em relação a células ou tecidos normais ou não alvo, por exemplo, em células ou te- cidos saudáveis. Em outras modalidades, o antígeno é ex- presso em células normais e/ou é express o nas células ge- neticamente modificadas. Em alguns aspectos, o receptor re- combinante, por exemplo, um CAR, inclui uma ou mais regi- ões ou domínios selecionados dentre uma região ou domínio de ligação de ligando (por exemplo, antígeno) extracelular, por exemplo, qualquer um dos anticorpos ou fragmentos descritos neste pedido, e em uma região de sinalização in-

tracelular. Em algumas modalidades, a região ou domínio de ligação de ligando (por exemplo, antígeno) extracelular é ou inclui um scFv ou um anticorpo de domínio V H único e a regi- ão ou domínio de sinalização intracelular é ou contém uma ITAM. Em alguns aspectos, a região ou domínio de sinaliza- ção intracelular inclui um domínio de sinalização de uma ca- deia CD3-zeta (CD3ζ) ou uma porção do mesmo. Em alguns aspectos, as regiões ou domínios de ligação de ligando (por exemplo, antígeno) extracelular e as regiões ou domínios de sinalização intracelular são ligadas ou conectadas via um ou mais ligantes e/ou domínios transmembranares. Em algumas modalidades, o receptor de ant ígeno quimérico inclui um do- mínio transmembranar disposto entre o domínio extracelular e a região de sinalização intracelular.

[00236] Receptores de antígeno exemplificativos, incluindo CARs, e métodos para manipulação genética e introdução de tais receptores em células, incluem aqueles descritos, por exemplo, na Publicação de Pedido de Patente Internacional N° W O2000/14257, W O2013/126726, W O2012/129514, W O2014/031687, W O2013/166321, W O2013/071154, W O2013/123061, Publicação de Pedido de Patente US N° US2002131960, US2013287748, US20130149337, Patentes US N° 6,451,995, 7,446,190, 8,252,592, 8,339,645, 8,398,282, 7,446,179, 6,410,319, 7,070,995, 7,265,209, 7,354,762, 7,446,191, 8,324,353, e 8,479,118, e Publicação de Pedido de Patente Europeia N° EP2537416, e/ou aquel es descritos por Sadelain et al., Cancer Discov. 2013 April; 3(4): 388–398; Davila et al. (2013) PLoS ONE 8(4): e61338; Turtle et al., Curr. Opin. Immunol., 2012 October; 24(5): 633 -39; e W u et al., Cancer, 2012 March 18(2): 160 -75. Em alguns as-

pectos, os receptores de antígeno incluem um CAR descrito na Patente US N° 7,446,190, e aqueles descritos na Publica- ção de Pedido de Patente Internacional N° W O 2014/055668. Exemplos dos CARs incluem CARs revelados nas referências mencionadas acima, tal como os docum entos W O2014/031687, US 8,339,645, US 7,446,179, US 2013/0149337, US 7,446,190, US 8,389,282, Kochenderfer et al., 2013, Nature Reviews Clinical Oncology, 10, 267 -276 (2013); W ang et al. (2012) J. Immunother. 35(9): 689 -701; e Brentjens et al., Sci Transl Med. 2013 5(177).

[00237] Em algumas modalidades, o receptor recombinante, por exemplo, receptor de antígeno contém um domínio de li- gação de antígeno ou ligante extracelular que se liga, por exemplo, que se liga especificamente, a um antígeno, um li- gante e/ou um marcador. Entre os receptores de antígeno estão receptores de antígeno funcionais diferentes de TCR, tal como receptores de antígeno quiméricos (CARs). Em al- gumas modalidades, o antígeno receptor é um CAR que con- tém um domínio de reconhecimento de antígeno extracelular que se liga especificamente a um antígeno. Em algumas mo- dalidades, o CAR é construído com uma especificidade para um antígeno, marcador ou ligante particular, tal como um an- tígeno expresso em em um tipo de célula particular a ser di- recionada por terapia adotiva, por exemplo, um marcador de câncer, e/ou um antígeno que destinado a induzir uma res- posta amortecedora, tal como um antígeno expresso em um tipo de célula normal ou não doente. Portanto, o CAR tipica- mente inclui em sua porção extracelu lar uma ou mais molé- culas de ligação de ligando (por exemplo, antígeno), tal co- mo um ou mais fragmentos, domínios, ou porções de ligação de antígeno, ou um ou mais domínios variáveis de anticorpo, e/ou moléculas de anticorpo. Em algumas modalidades, o CAR inclui uma ou mais porções de ligação de antígeno de uma molécula de anticorpo, tal como um fragmnto de anti- corpo de cadeia única (scFv) derivado da cadeia pesada va- riável (V H ) e da cadeia leve variável (V L ) de um anticorpo monoclonal (mAb), ou de um antic orpo de domínio único (sdAb), tal como sdFv, nanocorpo, V H H e V N A R . Em algumas modalidades, um fragmento de ligação de antígeno compre- ende regiões variáveis de anticorpo unidas por um ligante flexível.

[00238] Em algumas modalidades, o CAR contém um anti- corpo ou fragmento de ligação de antígeno (por exemplo , scFv) que reconhece especificamente um antígeno ou ligan- te, tal como um antígeno intacto, expresso na superfície de uma célula. Em algumas modalidades, o antígeno ou lifante é uma proteína expressa na superfíci e das células. Em algu- mas modalidades, o antígeno ou ligante é um polipeptídio. Em algumas modalidades, ele é um carboidrato ou outra mo- lécula. Em algumas modalidades, o antígeno ou ligante é se- letivamente expresso ou superxpresso nas células da doença ou condição, por exemplo, as células tumorais ou patogêni- cas, em comparação com células ou tecidos normais ou não alvo. Em outras modalidades, o antígeno é expresso em cé- lulas normais e/ou é expresso nas células geneticamente modificadas.

[00239] Em algumas modalidades, entre os antígenos vi- sados pelos receptores quiméricos estão aqueles expressos no contexto de uma doença, condição, ou tipo de célula a ser atacado pela terapia celular adotiva. Entre as doenças e condições estão doenças e distúrbios proliferativos, neoplá- sicos, e malignos, incluindo cânceres e tumores, incluindo cânceres hematológicos, cânceres do sistema imunológico, tal como linfomas, leucemias, e/ou mielomas, tal como B, T, e leucemias mieloides, linfomas, e mielomas múltiplos.

[00240] Em algumas modalidades, o antígeno ou ligante é um antígeno tumoral ou marcador de câncer. Em algumas modalidades, o antígeno ou ligante o antígeno é ou inclui in- tegrina αvβ6 (integrina avb6), antígeno de maturação de cé- lulas B (BCMA), B7-H3, B7-H6, anidrase carbônica 9 (CA9 , também conhecida como CAIX or G250), um antígeno cân- cer-testículo, antígeno câncer/testículo 1B (CTAG, também conhecido como NY-ESO-1 e LAGE-2), antígeno carcinoem- brionário (CEA), uma ciclina, ciclina A2, ligante 1 de quimio- cina C-C (CCL-1), CD19, CD20, CD22, CD23, CD24, CD30, CD33, CD38, CD44, CD44v6, CD44v7/8, CD123, CD133, CD138, CD171, proteoglicano sulfato de condroitina 4 (CSPG4), proteína de fator de crescimento epidérmico (EGFR), proteína truncada de fator de crescimento epidérmi- co (tEGFR), mutação do receptor de fator de crescimento epidérmico tipo III (EGFR vIII), glicoproteína epitelial 2 (EPG-2), glicoproteína epitelial 40 (EPG -40), efrinB2, recep- tor de efrina A2 (EPHa2), receptor de estrogênio, receptor Fc like 5 (FCRL5; também conhecido co mo receptor Fc homólo- go 5 ou FCRH5), receptor de acetilcolina fetal (fetal AchR), uma proteína de ligação de folato (FBP), receptor alfa de fo- lato, gangliosídeo GD2, GD2 O -acetilado (OGD2), gangliosí- deo GD3, glicoproteína 100 (gp100), glipicano -3 (GPC3), re- ceptor 5D acoplado à proteína G (GPCR5D), Her2/neu (tiro- sina quinase receptora erb-B2), Her3 (erb-B3), Her4 (erb-

B4), dímeros de erbB, antígeno associado à melanoma hu- mano de alto peso molecular (HMW -MAA), antígeno de su- perfície da hepatite B, antígeno le ucocitário humano A1 (HLA-A1), antígeno leucocitário humano A2 (HLA -A2), recep- tor alfa de IL-22 (IL-22Rα), receptor alfa 2 de IL -13 (IL- 13Rα2), receptor do domínio inserto quinase (kdr), cadeia leve capa, molécula de adesão de células L1 (L1 -CAM), epí- topo CE7 de L1-CAM, repetição rica em leucina contendo o membro A da família 8 (LRRC8A), Lewis Y, antígeno associ- ado a melanoma (MAGE)-A1, MAGE-A3, MAGE-A6, MAGE- A10, mesotelina (MSLN), c-Met, citomegalovírus murino (CMV), mucina 1 (MUC1), MUC16, ligantes de me mbro D do grupo 2 de células exterminadoras naturais (NKG2D), melana A (MART-1), molécula de adesão de células neurais (NCAM), antígeno oncofetal, antígeno de melanoma preferencialmente expresso (PRAME), receptor de progesterona, um antígeno específico para próstata, antígeno de células -tronco da prós- tata (PSCA), antígeno membranar específico para próstata (PSMA), receptor órfão 1 receptor tirosina quinase like (ROR1), survivina, glicoproteína trofoblástica (TPBG, tam- bém conhecida como 5T4), glicoproteína 7 2 associada a tu- mor (TAG72), proteína 1 relacionada à tirosinase (TRP1, também conhecida como TYRP1 ou gp75), proteína 2 relaci- onada à tirosinase (TRP2, também conhecida como dopa- croma tautomerase, dopacroma delta -isomerase ou DCT), receptor do fator de crescimento endotelial vascular (VEGFR), receptor do fator de crescimento endotelial vascu- lar 2 (VEGFR2), tumor de W ilms 1 (W T -1), um antígeno pa- tógeno-específico ou expresso em patógenos, ou um antíge- no associado a uma etiqueta universal, e/ou moléculas bio ti-

niladas, e/ou moléculas expressas por HIV, HCV, HBV ou ou- tros patógenos. Antígenos visados pelos receptores em al- gumas modalidades incluem antígenos associados a uma malignidade de células B, tal como qualquer um de ínumeros marcadores de células B conhe cidos. Em algumas modalida- des, o antígeno é ou inclui CD20, CD19, CD22, ROR1, CD45, CD21, CD5, CD33, Igkappa, Iglambda, CD79a, CD79b or CD30. Em algumas modalidades, o antígeno é ou inclui um antígeno patógeno-específico ou expresso em patógenos, tal como a viral antigen (por exemplo, a viral antigen from HIV, HCV, HBV), antígenos bacterianos, e/ou antígenos parasitá- rios.

[00241] Em algumas modalidades, o anticorpo ou um frag- mento de ligação de antígeno ( por exemplo, domínio scFv ou V H ) reconhece especificamente u m antígeno, tal como CD19. Em algumas modalidades, o anticorpo ou um fragmento de ligação de antígeno é derivado, ou é uma variante, de um an- ticorpo ou fragmento de ligação de antígeno que se liga es- pecificamente à CD19.

[00242] Em algumas modalidades os domínios scFv e/ou V H são derivados de FMC63. FMC63 geralmente refere -se a um anticorpo IgG1 monoclonal de camundongo criado contra cé- lulas Nalm-1 e -16 expressando CD19 de origem humana (Ling, N. R., et al. (1987). Leucocyte typing III. 302). O anti- corpo FMC63 compreende CDR H1 apresentada na SEQ ID NO: 38; CDR H2 apresentada na SEQ ID NO:39; CDR H3 apresentada na SEQ ID NOS: 40 ou 54; e CDR L1 apresen- tada na SEQ ID NO: 35; CDR L2 apresentada na SEQ ID NO:36 ou 55; e CDR L3 apresentada na SEQ ID NO:37 ou

56. O anticorpo FMC63 compreende a região variável da ca-

deia pesada (V H ) compreendendo a sequência de aminoáci- dos de SEQ ID NO: 41 e a região variável da cadeia leve (V L ) compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:

42. Em algumas modalidades, o scFv comp reende uma ca- deia leve variável contendo uma sequência de CDR L1 de SEQ ID NO:35, uma sequência de CDR L2 de SEQ ID NO:36, e uma sequência de CDR L3 de SEQ ID NO:37 e/ou uma ca- deia pesada variável contendo uma sequência de CDR H1 de SEQ ID NO:38, uma sequência de CDR H2 de SEQ ID NO:39, e uma sequência de CDR H3 de SEQ ID NO:40, ou uma variante de qualquer uma das acima tendo pelo menos 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou mais de identidade de se- quência com a mesma. Em algumas modalidades, o scFv compreende uma região da cadeia pesada variável de FMC63 apresentada na SEQ ID NO:41 e uma região da ca- deia leve variável de FMC63 apresentada na SEQ ID NO:42, ou uma variante de qualquer uma das acima tendo pelo me- nos 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou mais de identidade de se- quência com a mesma. Em algumas modalidades, a cadeia pesada variável e a cadeia leve variável estão conectadas por um ligante. Em algumas modalidades, o ligante está apresentado na SEQ ID NO:58. Em algumas modalidades, o scFv compreende, em ordem, uma V H , um ligante, e uma V L . Em algumas modalidades, o scFv compreende, em ordem, uma V L , um ligante, e uma V H . Em algumas modalidades, o scFv é codificado por uma seq uência de nucleotídeos apre- sentada na SEQ ID NO:57 ou uma sequência que apresenta pelo menos 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%,

93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, ou 99% de identidade de sequência com a SEQ ID NO:57. Em algumas modalidades, o scFv compreende a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO:43 ou uma sequência que apresenta pelo me- nos 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, ou 99% de identidade de sequência com a SEQ ID NO:43.

[00243] Em algumas modalidades, o domíni o scFv e/ou V H domain é derivado de SJ25C1. SJ25C1 é um anticorpo IgG1 monoclonal de camundongo criado contra células Nalm -1 e - 16 expressando CD19 de origem humana (Ling, N. R., et al. (1987). Leucocyte typing III. 302). O anticorpo SJ25C1 com- preende as sequências de CDR H1, H2 e H3 apresentadas nas SEQ ID NOS: 47-49, respectivamente, e as sequências de CDR L1, L2 e L3 apresentadas nas SEQ ID NOS: 44 -46, respectivamente. O anticorpo SJ25C1 compreende a região variável da cadeia pesada (V H ) compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 50 e a região variável da ca- deia leve (V L ) compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 51. Em algumas modalidades, o svFv com- preende uma cadeia leve variável contendo uma sequência de CDR L1 apresentada na SEQ ID NO:44; uma CDR L2 apresentada na SEQ ID NO: 45; e uma CDR L3 apresentada na SEQ ID NO:46; e/ou uma cadeia pesada variável conten- do uma CDR H1 apresentada na SEQ ID NO:47, uma CDR H2 apresentada na SEQ ID NO:48, e uma CDR H3 apresen- tada na SEQ ID NO:49, ou uma variante de qualquer uma das acima tendo pelo menos 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou mais de identidade de sequência com a mesma. Em algumas modalidades, o scFv compreende uma região da cadeia pe- sada variável de SJ25C1 apresentada na SEQ ID NO:50 e uma região da cadeia leve variável de SJ25C1 apresentada na SEQ ID NO:51, ou uma variante de qualquer uma das acima tendo pelo menos 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o u mais de identidade de sequência com a mesma. Em algumas modali- dades, a cadeia pesada variável e a cadeia leve variável es- tão conectadas por um ligante. Em algumas modalidades, o ligante está apresentado na SEQ ID NO:52. Em algumas mo- dalidades, o scFv compreende, em ordem, uma V H , um ligan- te, e uma V L . Em algumas modalidades, the scFv compreen- de, em ordem, uma V L , um ligante, e uma V H . Em algumas modalidades, o scFv compreende a sequência de aminoáci- dos apresentada na SEQ ID NO:53 ou uma sequência que apresenta pelo menos 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, ou 99% de identidade de sequência com a SEQ ID NO:53.

[00244] Em alguns aspectos, o CAR contém um domínio de ligação de ligante (por exemplo, antígeno) que de liga ou re- conhece, por exemplo, que se liga especificamente, a uma etiqueta universal ou a um epítopo universal. Em alguns as- pectos, o domínio de ligação pode ligar uma molécula, uma etiqueta, um polipeptídio e/ou um epítopo que pode ser liga- do a uma molécula de ligação diferente (por exemplo, anti- corpo ou fragmento de ligação de antígeno) que reconhece um antígeno associado a uma doença ou distúrbio. Etiquetas ou epítopos exemplificativos incluem um corante (por exem- plo, isotiocinato de fluoresceína) ou uma biotina. Em alguns aspectos, uma molécula de ligação (por exemplo, anticorpo ou fragmento de ligação de antígeno) ligada a uma etiqueta, que reconhece o antígeno associado a uma doença ou dis- túrbio, por exemplo, antígeno tumoral, com uma célula gene- ticamente modificada expressando um CAR específico para a etiqueta, para efetuar citotoxidade ou outra função efetora da célula geneticamente modificada. Em alguns aspectos, a es- pecificidade do CAR para o antígeno associado a uma doen- ça ou distúrbio é proporcionado pela molé cula de ligação eti- quetada (por exemplo, anticorpo), e diferentes moléculas de ligação etiquetas podem ser usadas para atacar antígenos diferentes. CARs exemplificativos específicos para uma eti- queta universal ou para um epítopo universal incluem aque- les descritos, por exemplo, nos documentos US 9,233,125, W O 2016/030414, Urbanska et al., (2012) Cancer Res 72: 1844–1852, e Tamada et al., (2012). Clin Cancer Res 18:6436–6445.

[00245] Em algumas modalidades, o CAR contém um anti- corpo TCR-like, tal como um anticorpo ou fragmento de liga- ção de antígeno (por exemplo, scFv) que reconhece especifi- camente um antígeno intracelular, tal como um antígeno as- sociado a tumor, apresentado na superfície celular como um complexo complexo de histocompatibilidade maior complex (MHC)-peptídio. Em algumas modalidades, um anticorpo ou porção de ligação de antígeno do mesmo que reconhece um complexo MHC-peptídio pode ser expresso nas células como parte de um receptor recombinante, tal como um receptor de antígeno. Entre os receptores de antígeno estão receptores de células não T (TCR) funcionais, tal como receptores de antígeno quiméricos (CARs). Em algumas modalidades, um CAR contendo um anticorpo ou fragmento de ligação de an-

tígeno que apresenta especificidade TCR -like direcionada contra complexos peptídio-MHC também são chamados de CAR TCR-like. Em algumas modalidades, o CAR é um CAR TCR-like e o antígeno é um antígeno peptídico processado, tal como um antígeno peptídico de uma proteína intracelular, que, como um TCR, é reconhecida na sup erfície celular no contexto de uma molécula de MHC. Em algumas modalida- des, o domínio de ligação de antígeno extracelular específico para um complexo MHC-peptídio de um CAR TCR-like é liga- do a um ou mais componentes de sinalizaão intracelular, em alguns aspectos via ligantes e/ou domínios transmembrana- res. Em algumas modalidades, tais moléculas podem tipica- mente mimetizar ou se aproximar de um sinal através de um receptor de antígeno natural, tal como um TCR, e, opcional- mente, um sinal através de tal recept or em combinação com um receptor coestimulador.

[00246] Uma menção ao “complexo de histocompatibilidade maior” (MHC) refere-se a uma proteína, geralmente uma gli- coproteína, que contém um sítio de ligação de peptídio poli- mórfico ou uma ranhura de ligação que, em al guns casos, pode complexar com antígenos peptídicos de polipeptídios, incluindo antígenos peptídicos processados pela maquinaria celular. Em alguns casos, as moléculas de MHC podem apresentadas ou expressas na superfície celular, inclusive como um complexo com peptídio, i.e., um complexo MHC - peptídio, para apresentação de um antígeno em uma confor- mação reconhecível um por receptor de antígeno em células T, tal como TCRs ou um anticorpo TCR -like. Geralmente, moléculas de MHC classe I são heterodímeros tendo uma cadeia α que atravessa membranas, em alguns casos com três domínios α, e uma microglobulina β2 associada de forma não covalente. Geralmente, as moléculas de MHC classe II são compostas de duas glicoproteínas transmembranares, α e β, sendo que ambas tipicamente atravessam a membrana. Uma molécula de MHC pode incluir uma porção eficz de um MHC que contém um ou mais sítios de ligação de antígeno para ligar um peptídio e as sequências necessárias para re- conhecimento pelo receptor de antígenos apropriado. Em al- gumas modalidades, as moléculas MHC classe I distribuem peptídios que originam no citosol para a superfície celular, onde um complexo MHC-peptídio é reconhecido por células T, tal como geralmente células T CD8+, porém em alguns casos células T CD4+. Em algumas modalidades, as molécu- las MHC classe II distribuem peptídios que originam no sis- tema vesicular para a superfície celular, onde eles são tipi- camente reconhecidos por células T CD4+. Geralmente, as moléculas de MHC são codificadas por um grupo de loc os ligados, que são coletivamente denominados H-2 no antíge- no leucocitário (HLA) de camundongo e humano nos seres humanos. Portanto, tipicamente um MHC humano também pode ser chamado de antígeno leucocitário humano (HLA).

[00247] O termo “complexo MHC-peptídio” ou “complexo peptídio-MHC” ou variações do mesmo, refere -se a um com- plexo ou associação de um antígeno peptídico e uma molé- cula de MHC, such as, geralmente, por interações não cova- lentes do peptídio na ranhura ou fenda de ligação da molécu- la de MHC. Em algumas modalidades, o complexo MHC - peptídio está presente ou é apresentado na superfície das células. Em algumas modalidades, o complexo MHC-peptídio pode ser especificamente reconhecido por um receptor de antígeno, tal como um TCR, um CAR TCR-like ou porções de ligação de antígeno do mesmo.

[00248] Em algumas modalidades, um peptídio, tal como um antígeno ou epítopo peptídico, de um polipeptídio pode ser associado a uma molécula de MHC, tal como para reco- nhecido por um receptor de antígeno. Geralmente, o peptídio é derivado ou é à base de um fragmento de uma molécula biológica mais comprida, tal como um polipeptídio ou proteí- na. Em algumas modalidades, o peptídio tipicamente tem cerca de 8 a cerca de 24 aminoácidos de comprimento. Em algumas modalidades, um peptídio t em um comprimento de ou de cerca de 9 a 22 aminoácidos para reconhecimento co- mo complexo de MHC Classe II. Em algumas modalidades, um peptídio tem um comprimento de ou de cerca de 8 a 13 aminoácidos para reconhecimento como complexo de MHC Class I. Em algumas modalidades, depois do reconhecimento do peptídio no contexto de uma molécula, tal como o com- plexo MHC-peptídio, o receptor de antígeno, tal como TCR ou CAR TCR-like, produz ou desencadeia um sinal de ativa- ção para a célula T que induz uma resposta de células T, tal como proliferação de células T, produção de citocinas, uma resposta de células T citotóxica ou outra resposta.

[00249] Em algumas modalidades, um anticorpo TCR -like ou porção de ligação de antígeno, é conhecido ou pode ser produzido por métodos conhecidos (vide, por exemplo, Pedi- do US Publicado N° US 2002/0150914; US 2003/0223994; US 2004/0191260; US 2006/0034850; US 2007/00992530; US20090226474; US20090304679; e Publicação de Pedido Internacional N° 03/068201).

[00250] Em algumas modalidades, um anticorpo ou porção de ligação do mesmo que se liga especificamente a um com- plexo MHC-peptídio pode ser produzido por imunização de um hospedeiro com uma quantidade eficaz de um imunógeno contendo um complexo MHC-peptídio específico. Em alguns casos, o peptídio do complexo MHC-peptídio é um epítopo de antígeno capaz de se ligar ao MHC, tal como um antígeno tumoral, por exemplo, um antígeno tumoral universal, um an- tígeno para mieloma ou outro antígeno descrito abaixo. Em algumas modalidades, uma quantidade eficaz do i munógeno é então administrada a um hospedeiro para provocar uma resposta imunológica, onde imunógeno retém uma forma tri- dimensional do mesmo por um período de tempo suficiente para provocar uma resposta imunológica contra a apresenta- ção tridimensional do peptídio na ranhura de ligação da mo- lécula de MHC. O soro coletado do hospedeiro é então anali- sado para determinar se anticorpos desejados que reconhe- cem a apresentação tridimensional do peptídio na ranhura de ligação da molécula de MHC estão sendo produzidos. Em al- gumas modalidades, os anticorpos produzidos podem ser avaliados para confirmar que o anticorpo pode diferenciar o complexo MHC-peptídio da molécula de MHC isolada, do peptídio de interesse isolado, e de um complexo de MHC e peptídio irrelevante. Os anticorpos desejados podem ser en- tão isolados.

[00251] Em algumas modalidades, um anticorpo ou porção de ligação de antígeno do mesmo que se liga especificamen- te a um complexo MHC-peptídio pode ser produzido empre- gando-se métodos de exibição de bibliotecas de an ticorpos, tal como bibliotecas de anticorpos fágicos. Em algumas mo- dalidades, é possível gerar bibliotecas de exibição em fagos de formas mutantes de Fab, scFv ou de outros anticorpos, por exemplo, nas quais a biblioteca é mutada em um ou mais resíduos de uma ou mais CDRs. Vide, por exemplo , Publica- ção de Pedido de Patente US N° US20020150914, US20140294841; e Cohen CJ. et al. (2003) J Mol. Recogn. 16:324-332.

[00252] O termo “anticorpo” neste pedido é usado em seu sentido mais amplo e inclui anticorpos policlonais e mono- clonais, incluindo anticorpos intactos e fragmentos funcionais (de ligação de antígeno) de anticorpos, incluindo fragmentos de ligação de antígeno de fragmento (Fab), fragmentos F(ab’) 2 , fragmentos Fab’, fragmentos de Fv, fragmentos IgG recombinantes (rIgG), regiões variáveis da cadeia pesada (V H ) capazes de se ligar especificamente ao antígeno, frag- mentos de anticorpo de cadeia única, incluindo fragmentos variáveis de cadeia única (scFv), e anticorpos de domínio único (por exemplo, sdAb, sdFv, nanoc orpo, V H H ou V N A R ) ou fragmentos. O termo abrange formas geneticamente modifi- cadas e/ou de outra forma modificadas de imunoglobulinas, tal como intracorpos, pepticorpos, anticorpos quiméricos, an- ticorpos totalmente humanos, anticorpos humanizados, e an- ticorpos heteroconjugados, anticorpos multiespecíficos, por exemplo, biespecíficos, diacorpos, triacorpos, e tetracorpos, tandem di-scFv, tandem tri-scFv. A menos que especificado em contrário, o termo “anticorpo” deve ser entendido como abrangendo fragmentos funcionais do mesmo. O termo tam- bém abrange anticorpos intactos ou de comprimento integral, incluindo anticorpos de qualquer classe ou sub-classe, inclu- indo IgG e sub-classes da mesma, IgM, IgE, IgA, e IgD. Em alguns aspectos, o CAR é um CAR biespecífic o, por exem-

plo, contendo dois domínios de ligação de antígeno com es- pecificidades diferentes.

[00253] Em algumas modalidades, as proteínas de ligação de antígeno, anticorpos e fragmentos de ligação de antígeno dos mesmos reconhecem especificamente um antígeno de um anticorpo de comprimento integral. Em algumas modali- dades, a cadeia pesada e a cadeia leve de um anticorpo po- dem ser de comprimento integral ou podem uma porção de ligação de antígeno (um Fab, F(ab’)2, Fv ou um fragment de Fv de cadeia única Fv (scFv)). Em outras modalidades, a re- gião constante da cadeia pesada do anticorpo é selecionada dentre, por exemplo, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgM, IgA1, IgA2, IgD, e IgE, particularmente selecionada dentre, por exemplo, IgG1, IgG2, IgG3, e IgG4, mais particularmente, IgG1 (por exemplo, IgG1 humana). Em uma outra modalida- de, a região constante da cadeia pesada do anticorpo é sele- cionada dentre, por exemplo, capa ou lambda, particularmen- te capa.

[00254] Entre os anticorpos e fragmentos de anticorpo apresentados. Um “fragmento d e anticorpo” refere-se a uma molécula diferente de um anticorpo intacto que compreende uma porção de um anticorpo intacto que se liga ao antígeno ao qual o anticorpo intacto se liga. Exemplos de fragmentos de anticorpo incluem, porém sem limitação, Fv, Fab , Fab’, Fab’-SH, F(ab’) 2 ; diacorpos; anticorpos lineares; regiões va- riáveis da cadeia pesada (V H ), moléculas de anticorpo de ca- deia única tal como scFvs e anticorpos simples de V H de do- mínio único; e anticorpos multispecíficos formados a partir de fragmentos de anticorpo. Em modalidades particulares, os anticorpos são fragmentos de anticorpo de cadeia única compreendendo uma região variável da cadeia pesada e/ou uma região variável de cadeia da cadeia leve, tal como scFvs.

[00255] O termo “região variável” ou “domí nio variável” re- fere-se ao domínio de uma cadeia pesada ou leve de um an- ticorpo que está envolvida na ligação do anticorpo ao antíge- no. Os domínios variáveis da cadeia pesada e da cadeia leve (V H e V L , respectivamente) de um anticorpo nativo geralmen- te têm estruturas similares, com res, with cada domínio com- preendendo quatro regiões de esqueleto conservdas (FRs) e três CDRs. (Vide, por exemplo, Kindt et al. Kuby Immuno- logy, 6th ed., W .H. Freeman and Co., page 91 (2007). Um único domínio V H ou V L pode ser suficiente para conferir es- pecificidade de ligação de antígeno. Além disso, anticorpos que se ligam a um antígeno particular podem ser isolados um domínio V H ou V L de um anticorpo que se liga ao antígeno para rastrear uma biblioteca de domínios V L ou V H comple- mentares, respectivamente. Vide, por exemplo, Portolano et al., J. Immunol. 150:880-887 (1993); Clarkson et al., Nature 352:624-628 (1991).

[00256] Anticorpos de domínio único (sdAb) são fragmentos de anticorpo compreendendo todo ou uma porção do domínio variável da cadeia pesada ou todo ou uma porção do domínio variável da cadeia leve de um anticorpo. Em certas modali- dades, um anticorpo de domínio único é um anticorpo de domínio único humano. Em algumas modalidades, o CAR compreende um domínio da cadeia pesada de um anticorpo que se liga especificamente ao antígeno, tal como um mar- cador de câncer ou antígeno de superfície celular de uma céloula ou doença a ser atacada, tal como uma célula tumo-

ral ou uma célula cancerosa, tal como qualquer um dos antí- genos alvo descritos neste pedido ou conhecidos. Anticorpos de domínio único exemplificativos incluem sdFv, nanocorpo, V H H ou V N A R .

[00257] Fragmentos de anticorpo podem ser feitos por vá- rias técnicas, incluindo, porém sem limitação, digestão pro- teolítica de um anticorpo intacto assim como produção por células hospedeiras recombinantes. Em algumas modalida- des, os anticorpos são fragmentos prod uzidos de forma re- combinante, tal como fragmentos compreendendo arranjos que não ocorrem naturalmente, tal como aqueles com duas ou mais regiões ou cadeias de anticorpo unidas por ligantes sintéticos, por exemplo, ligantes peptídicos, e/ou que não podem ser produzidos por digestão enzimática de um anti- corpo intacto de ocorrência natural. Em algumas modalida- des, os fragmentos de anticorpo são scFvs.

[00258] Um anticorpo “humanizado” é um anticorpo no qual todos ou substancialmente todos os resíduos aminoacídicos das CDRs são derivados de CDRs não humanas e todos ou substancialmente todos os resíduos aminoacídicos dos FRs são derivados de FRs humanos. Um anticorpo humanizado pode incluir opcionalmente pelo menos uma porção de uma região constante de anticorpo de um a nticorpo humano. Uma “forma humanizada” de um anticorpo não humano refere -se a uma variante do anticorpo não humano que sofrera humani- zação, tipicamente para reduzir a imunogenicidade para se- res humanos, retendo ao mesmo a especificidade e afinidade do anticorpo não humano parental. Em algumas modalida- des, alguns resíduos de FR em um anticorpo humanizado são substituídos por resíduos correspondentes de um anti-

corpo não humano (por exemplo, o anticorpo do qual são de- rivados os resíduos de CDR), por exemplo, para restaurar ou aumentar a especificidade ou afinidade do anticorpo.

[00259] Portanto, em algumas modalidades, o receptor de antígeno quimérico, incluindo CARs TCR-like, inclui uma porção extracelular contendo um anticorpo ou fragmento de anticorpo. Em algumas modalidades, o anticorpo ou fragmen- to inclui um scFv. Em alguns aspectos, o anticorpo ou frag- mento de ligação de antígeno pode ser obtido por rastrea- mento de uma pluralidade, tal como uma biblioteca de fra- mentos ou moléculas de ligação de antígeno, tal com o por rastreamento de uma biblioteca de scFv para ligação a um antígeno ou ligante específico.

[00260] Em alguns aspectos, o receptor recombinante, por exemplo, um receptor de antígeno quimérico, inclui uma por- ção extracelular contendo um ou mais domínios de ligaç ão de ligante (por exemplo, antígeno), tal como um anticorpo ou fragmento do mesmo, e uma ou mais regiões ou domínios de sinalização intracelular (também intercambiavelmente cha- mados de domínio ou região de sinalização citoplasmática). Em alguns aspectos, o receptor recombinante, por exemplo, CAR, inclui ainda um espaçador e/ou um domínio ou porção transmembranar. Em alguns aspectos, o espaçador e/ou do- mínio transmembranar pode ligar a porção extracelular con- tendo o domínio de ligação de ligante (por exempl o, antíge- no) e as regiões ou domínios de sinalização intracelular.

[00261] Em algumas modalidades, o receptor recombinante tal como o CAR inclui ainda um espaçador, que pode ser ou incluir pelo menos uma porção de uma região constante de imunoglobulina ou uma variante ou versão modificada da mesma, tal como uma região de dobradiça, por exemplo, uma região de dobradiça da IgG4, e/ou um região de C H 1/C L e/ou Fc.

Em algumas modalidades, o receptor recombinante com- preende ainda um espaçador e/ou uma região de dobradiça . Em algumas modalidades, a região ou porção constante é de uma IgG humana, tal como IgG4 ou IgG1. Em alguns aspec- tos, a porção da região constante funciona como uma região espaçadora entre o componente de reconhecimento de antí- geno, por exemplo, scFv, e domínio transmembranar.

O es- paçador pode ser um comprimento que proporciona maior responsividade da célula depois de ligação ao antígeno, em relação à ausência do espaçador.

Em alguns exemplos, o espaçador tem ou tem cerca de 12 aminoácidos de compri- mento ou não é maior que 12 aminoácidos de comprimento.

Espaçadores exemplificativos incluem aqueles que têm pelo menos cerca de 10 a 229 aminoácidos, cerca de 10 a 200 aminoácidos, cerca de 10 a 175 aminoácidos, cerca de 10 a 150 aminoácidos, cerca de 10 a 125 a minoácidos, cerca de 10 a 100 aminoácidos, cerca de 10 a 75 aminoácidos, cerca de 10 a 50 aminoácidos, cerca de 10 a 40 aminoácidos, cer- ca de 10 a 30 aminoácidos, cerca de 10 a 20 aminoácidos, or cerca de 10 a 15 aminoácidos, e incluindo qualquer número inteiro entre os limites de qualquer um dos intervalos lista- dos.

Em algumas modalidades, uma região espaçadora tem cerca de 12 aminoácidos ou menos, cerca de 119 aminoáci- dos ou menos, ou cerca de 229 aminoácidos ou menos.

Em algumas modalidades, o espaçador é menor que 250 amino- ácidos de comprimento, menor que 200 aminoácidos de comprimento, menor que 150 aminoácidos de comprimento, menor que 100 aminoácidos de comprimento, menor que 75 aminoácidos de comprimento, menor que 50 aminoácidos de comprimento, menor que 25 aminoácidos de comprimento, menor que 20 aminoácidos de comprimento, menor que 15 aminoácidos de comprimento, menor que 12 aminoácidos de comprimento, ou menor que 10 aminoácidos de comprimento. Em algumas modalidades, o espaçador tem ou tem cerca de 10 a 250 aminoácidos de comprimento, 10 a 150 aminoáci- dos de comprimento, 10 a 100 aminoácidos de comprimento, 10 a 50 aminoácidos de comprimento, 10 a 25 aminoácidos de comprimento, 10 a 15 aminoácidos de comprimento, 15 a 250 aminoácidos de comprimen to, 15 a 150 aminoácidos de comprimento, 15 a 100 aminoácidos de comprimento, 15 a 50 aminoácidos de comprimento, 15 a 25 aminoácidos de com- primento, 25 a 250 aminoácidos de comprimento, 25 a 100 aminoácidos de comprimento, 25 a 50 aminoácidos de com- primento, 50 a 250 aminoácidos de comprimento, 50 a 150 aminoácidos de comprimento, 50 a 100 aminoácidos de com- primento, 100 a 250 aminoácidos de comprimento, 100 a 150 aminoácidos de comprimento, ou 150 a 250 aminoácidos de comprimento. Espaçador exemplificativos incluem a dobradi- ça de IgG4 isolada, a dobradiça de IgG4 ligada aos domínios C H 2 e C H 3, ou a dobradiça de IgG4 ligada ao domínio C H 3. Espaçadores exemplificativos incluem, porém sem limita- ção,aqueles descritos em Hudecek et al. (2013) Clin. Cancer Res., 19:3153, Hudecek et al. (2015) Cancer Immunol Res. 3(2): 125–135 ou na Publicação de Pedido de Patente Inter- nacional N° W O2014031687.

[00262] Em alguns aspectos, o espaçador contém apenas uma região de dobradiça de uma IgG, tal como apenas uma dobradiça da IgG4 ou da IgG1, tal como o espaçador somen-

te de dobradição apresentado na SEQ ID NO:1, e é codifica- do pela sequência apresentada na SEQ ID NO: 2. Em outras modalidades, o espaçador é uma dobradiça da Ig, por exem- plo, uma dobradiça da IgG4, ligada a um domínio C H 2 e/ou C H 3. Em algumas modalidades, o espaçador é uma dobradi- ça da Ig, por exemplo, uma dobradiça da IgG4, ligada aos domínios C H 2 e C H 3 domains, tal como apresentado na SEQ ID NO:4. Em algumas modalidades, o espaçador é uma do- bradiça da Ig, por exemplo, uma dobradiça da IgG4, ligada apenas a um domínio C H 3, tal como apresentado na SEQ ID NO:3. Em algumas modalidades, o espaçador é ou compre- ende uma sequência rica em glicina -serina ou outro ligante flexível tal como ligantes flexíveis conhecidos. Em alguma s modalidades, a região ou porção constante é da IgD. Em al- gumas modalidades, o espaçador tem a sequência apresen- tada na SEQ ID NO: 5. Em algumas modalidades, o espaça- dor tem uma sequência de aminoácidos que apresenta pelo menos ou pelo menos cerca de 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou mais de identidade de sequência com qualquer uma das SEQ ID NOS: 1, 3, 4 e 5.

[00263] Em algumas modalidades, o espaçador pode ser todo ou em parte derivado da IgG4 e/ou IgG2. Em algumas modalidades, o espaçador pode ser um polipeptídio quiméri- co contendo uma ou mais de uma dobradiça, sequências de C H 2 e/ou C H 3 derivadas da IgG4, IgG2, e/ou IgG2 e IgG4. Em algumas modalidades, o espaçador pode conter muta- ções, tal como uma ou mais mutações em um único aminoá- cido ou em um ou mais domínios. Em alguns exemplos, a modificação aminoacídica é uma substituição de uma serina

(S) por uma prolina (P) na região de dobradiça de uma IgG4. Em algumas modalidades, a modificação aminoacídica é uma substituição de uma asparagina (N) por uma glutamina (Q) para reduzir a heterogeneidade da glicosilação, tal como uma substituição de N por Q em uma posição correspondente à posição 177 na região C H 2 da sequência da região cons- tante da cadeia pesada da IgG4 apresentad a na SEQ ID NO: 60 (Acesso Uniprot N° P01861; posição correspondente à posição 297 pela numeração EU e posição 79 da sequência espaçadora dobradiça-C H 2-C H 3 apresentada na SEQ ID NO:4) ou uma substituição de N por Q na posição correspon- dente à posição 176 na região C H 2 da sequência da região constante da cadeia pesada da IgG2 apresentada na SEQ ID NO: 59 (Acesso Uniprot N° P01859; posição correspondente à posição 297 pela numeração EU).

[00264] Em alguns aspectos, o espaçador é um espaçador polipeptídico tal como um ou mais selecionado dentre: (a) compreende ou consiste em toda ou uma porção de uma do- bradiça de imunoglobulina ou uma versão modificada da mesma ou compreende cerca de 15 aminoácidos ou menos, e não compreende uma região extracelular de CD28 ou uma região extracelular de CD8, (b) compreende ou consiste em toda ou uma porção de uma dobradiça de imunoglobulina, opcionalmente uma dobradiça da IgG4, ou uma versão modi- ficada da mesma e/ou compreende cerca de 15 aminoácidos ou menos, e não compreende uma região extracelular de CD28 ou uma região extracelular de CD8, ou (c) tem ou tem cerca de 12 aminoácidos de comprimento e/ou compreende ou consiste em toda ou uma porção de uma dobradiça de imunoglobulina, opcionalmente uma IgG4, ou uma versão modificada da mesma; ou (d) consiste em ou compreende a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NOS: 1, 3-5 ou 27-34, ou uma variante de qualquer uma das acima tendo pelo menos 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou mais de iden- tidade de sequência com a mesma, ou (e) compreende ou consiste na fórmula X 1 PPX 2 P, onde X 1 é glicina, cisteína ou arginina e X 2 é cisteína ou treonina.

[00265] Em algumas modalidades, o domínio de ligação ou reconhecimento de ligante (por exemplo, antígeno) do CAR é ligado a um ou mais componentes de sinalização intracelular, tal como uma região ou domínio de sinalização intracelular, e/ou componentes de sinalização intracelular que mimetizam a ativação através de um complexo de receptores de antíge- no, tal como um complexo de TCR, e/ou sinal via outro re- ceptor de superfície celular. Portanto, em algumas modalida- des, o componente de ligação de antígeno (por exemplo, an- ticorpo) é ligado a uma ou regiões ou domínios de sinaliza- ção transmembranar e intracelular. Em algum as modalida- des, o domínio transmembranar é fusionado ao domínio ex- tracelular. Em algumas modalidades, é usado um domínio transmembranar que é naturalmente associado a um ou mais dos domínios no receptor, por exemplo, CAR,. Em alguns ca- sos, o domínio transmembranar é selecionado ou modificado por substituição aminoacídica para evitar a ligação de tais domínios aos domínios transmembranares das mesmas pro- teínas membranares periféricas ou de proteínas membrana- res periféricas diferentes para minimizar interaçõe s com ou- tros membros do complexo de receptores.

[00266] O domínio transmembranar em algumas modalida-

des é derivado de uma fonte natural ou de uma fonte sintéti- ca. Quando a fonte é natural, o domínio em alguns aspectos é derivado de qualquer proteína ligada à membr ana ou prote- ína transmembranar. Regiões transmembranares incluem aquelas derivadas de (i.e., compreendem pelo menos as re- giões transmembranares) da cadeia alfa, beta ou zeta do re- ceptor de células T, CD28, CD3 épsilon, CD45, CD4, CD5, CD8, CD9, CD16, CD22, CD33, CD37, CD64, CD80, CD86, CD134, CD137 (4-1BB), ou CD154. Alternativamente, o do- mínio transmembranar em algumas modalidades é sintético. Em alguns aspectos, o domínio transmembranar sintético compreende resíduos predominantemente hidrófobos tal co- mo leucina e valina. Em alguns aspectos, um tripleto de feni- lalanina, triptofano e valina será encontrado em cada extre- midade de um domínio transmembranar sintético. Em algu- mas modalidades, a ligação é por ligantes, espaçadores, e/ou domínios transmembranares. Em alguns aspectos, o domínio transmembranar contém uma porção transmembra- nar de CD28 ou uma variante da mesma. O domínio extrace- lular e a transmembrana podem ligados direta ou indireta- mente. Em algumas modalidades, o domínio extracelular e a transmembrana são ligados por um espaçador, tal como qualquer um daqueles descritos neste pedido.

[00267] Em algumas modalidades, o domínio transmembra- nar do receptor, por exemplo, do CAR é um domínio trans- membranar da CD28 humana ou variante da mesma, por exemplo, um domínio transmembranar de 27 aminoácidos de uma CD28 humana (Acesso N°: P10747,1), ou é um domínio transmembranar que compreende a sequência de aminoáci- dos apresentada na SEQ ID NO: 8 ou uma sequência de aminoácidos que apresenta pelo menos ou pelo menos cerca de 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou mais de identidade de se- quência com a SEQ ID NO:8; em algumas modalidades, o domínio transmembranar contendo uma porção do receptor recombinante compreende a sequência de aminoác idos apresentada na SEQ ID NO: 9 ou uma sequência de aminoá- cidos tendo pelo menos or pelo menos cerca de 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou mais de identidade de sequência com as mesmas.

[00268] Em alguns aspectos, o receptor recombinante, por exemplo, CAR, inclui uma região ou domínio de sinalização intracelular (também intercambiavelmente chamado de domí- nio ou região de sinalização citoplasmática). Em algumas modalidades, a região de sinalização intracelular compreen- de um domínio de sinalização intracelular. Em algumas mo- dalidades, a região ou domínio de sinalização intracelular é ou compreende um domínio de sinalização primária, um do- mínio de sinalização que é capaz de estimular e/ou induzir um sinal de ativação primário em uma célula T, um domínio de sinalização de um componente do receptor de células T (TCR) (por exemplo, um domínio ou região de sinalização in- tracelular de uma cadeia CD3-zeta (CD3ζ) ou uma variante funcional ou porção de sinalização da mesma), e/ou um do- mínio de sinalização compreendendo um motivo de ativação à base de tirosina imunorreceptora (ITAM). Em algumas mo- dalidades, o receptor recombinante, por exemplo, CAR, inclui uma porção extracelular contendo o anticorpo ou fragmento e uma região ou domínio de sinalização intracelular.

[00269] Em algumas modalidades, o receptor recombinante, por exemplo, CAR, inclui pelo menos um ou mais componen- tes de sinalização intracelular, tal como uma região ou domí- nio de sinalização intracelular. Entre as regiões de sinaliza- ção intracelular estão aquelas que mimetizam ou se aproxi- ma de um sinal através de um receptor de antígeno natural, um sinal através de tal receptor em combinação com um re- ceptor coestimulador, e/ou um sinal através de receptor co- estimulador isolado. Em algu mas modalidades, um ligante oligo- ou polipeptídico curto, por exemplo, um ligante de en- tre 2 e 10 aminoácidos de comprimento, tal como um ligante contendo glicinas e serinas, por exemplo, um dubleto glicina- serina, está presente e forma uma ligação entre o domínio transmembranar e o domínio de sinalização citoplasmático do CAR.

[00270] Em algumas modalidades, depois da ligação ao CAR, o domínio citoplasmático ou região de sinalização in- tracelular do CAR estimula e/ou ativa pelo menos uma das funções efetoras ou respostas normais da célula imune, por exemplo, célula T geneticamente modificada para expressar o CAR. Por exemplo, em alguns contextos, o CAR induz uma função de uma célula T tal como atividade citolítica ou ativi- dade auxiliar de T, tal como secreção de c itocinas ou outros fatores. Em algumas modalidades, uma porção truncada de uma região ou domínio de sinalização intracelular de um componente de receptor de antígeno ou molécula coestimu- ladora é usada no lugar de uma cadeia imunoestimuladora intacta, por exemplo, se ela transduzir o sinal da função efe- tora. Em algumas modalidades, as regiões de sinalização in- tracelular, por exemplo, compreendendo um domínio ou do-

mínios intracelulares, incluem as sequências citoplasmáticas do receptor de células T (TCR), e e m alguns aspectos tam- bém aquelas de co-receptores que no contexto natural agem em uníssono com tal receptor para iniciar a transdução de sinal subsequente ao acoplamento do receptor de antígeno, e/ou qualquer derivado ou variante de tais moléculas, e/ou quaisquer sequências sintéticas que tenham a mesma capa- cidade funcional. Em algumas modalidades, as regiões de sinalização intracelular, por exemplo, compreendendo um ou mais domínios intracelulares, incluem as sequências cito- plasmática de uma região ou domí nio que está envolvimento no fornecimento de sina coestimulador.

[00271] Em algumas modalidades, o receptor inclui um componente intracelular de um complexo de TCR, tal como uma cadeia TCR CD3 que medeia a ativação e a citotoxici- dade das células T, por exemplo, a cadeia CD3 zeta. Portan- to, em alguns aspectos, o domínio de ligação de antígeno ou o domínio de reconhecimento de antígeno é ligado a um ou mais módulos de sinalização celular. Em algumas modalida- des, os módulos de sinalização celular incluem o domínio transmembranar de CD3, domínios de sinalização intracelu- lar de CD3, e/ou outros domínios transmembranares de CD. Em algumas modalidades, o receptor, por exemplo, CAR, in- clui ainda uma porção de uma ou mais moléculas adicionais tal como receptor gama de Fc (Fc R γ), CD8 alfa, CD8 beta, CD4, CD25, ou CD16. Por exemplo, em alguns aspectos, o CAR inclui uma molécula quimérica entre CD3 zeta (CD3ζ) ou FcR γ e um ou mais de CD8 alfa, CD8 beta, CD4, CD25 ou CD16.

[00272] No contexto de um TCR natural, ativação total ge-

ralmente requer não apenas sinalização através do TCR, mas também um sinal coestimulador. A ativação de células T é em alguns aspectos descrita como sendo mediada por duas classes de sequências de sinalização citoplasmática: aque- las que iniciam a ativação primár ia dependente do antígeno através do TCR (regiões ou domínios de sinalização cito- plasmática primária), e aquelas que agem de forma indepen- dente do antígeno para proporcionar um sinal secundário ou coestimulador (regiões ou domínios de sinalização citoplas- mática secundária). Em alguns aspectos, o CAR inclui um ou ambos destes componentes de sinalização.

[00273] Em alguns aspectos, o CAR inclui uma região de sinalização citoplasmática primária que regula a estimulação e/ou ativação primária do complexo de TCR. As reg iões de sinalização citoplasmática primária que agem de forma esti- muladora podem conter motivos que são conhecidos como motivos de ativação à base de tirosina imumorreceptora ou ITAMs. Exemplos de ITAM contendo regiões de sinalização citoplasmática primária primárias incluem aquelas derivadas de TCR ou CD3 zeta (CD3ζ), receptor de Fc (FcR) gama ou FcR beta. Em algumas modalidades, as regiões ou domínios de sinalização citoplasmática no CAR contêm um domínio de sinalização citoplasmática, uma porção do mesmo, ou uma sequência derivada de CD3 zeta. Em algumas modalidades, a região de sinalização intracelular (ou citoplasmática) com- preende uma cadeia CD3 humana, opcionalmente um domí- nio de sinalização estimuladora de CD3 zeta ou uma variante funcional do mesmo, tal como um domínio citoplasmático 112 AA da isoforma 3 da CD3ζ humana (Acesso N°: P20963,2) ou um domínio de sinalização de CD3 zeta descrito na Patente

US N° 7,446,190 ou na Patente US N° 8,911,993. Em algu- mas modalidades, a região de sinalização intrac elular com- preende a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 13, 14 ou 15 ou uma sequência de aminoácidos que apresenta pelo menos ou pelo menos cerca de 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou mais de identid ade de sequência com a SEQ ID NO: 13, 14 ou 15.

[00274] Por conseguinte, em algumas modalidades, para promover estimulação e/ou ativação total, um ou mais com- ponentes para gerar um sinal secundário ou coestimulador também estão incluídos no CAR. Em outras modalida des, o CAR não inclui um componente para gerar um sinal coesti- mulador. Em alguns aspectos, um CAR adicional é expresso na mesma célula e oferece o componente para gerar o sinal secundário ou coestimulador.

[00275] Em algumas modalidades, o CAR inclui uma região de sinalização e/ou uma porção transmembranar de um re- ceptor coestimulador, tal como CD28, 4 -1BB, OX40 (CD134), CD27, DAP10, DAP12, ICOS e/ou outros receptores coesti- muladores. Em alguns aspectos, o mesmo CAR inclui tanto a região de sinalização citoplasmát ica primária quanto compo- nentes de sinalização coestimuladores.

[00276] Em algumas modalidades, um ou mais receptores recombinantes diferentes podem conter uma ou mais regiões ou domínios de sinalização intracelular diferentes. Em algu- mas modalidades, a região de sinalização citoplasmática primária é incluída em um CAR, ao passo que o componente coestimulador é apresentado por um outro receptor, por exemplo, um outro CAR que reconhece um outro antígeno.

Em algumas modalidades, os CARs incluem CARs ativadores ou estimuladores, e CARs coestimuladores, ambos expres- sos na mesma célula (vide, W O2014/055668).

[00277] Em certas modalidades, a região de sinalização in- tracelular compreende um domínio transmembranar e de si- nalização de CD28 ligado a um domínio intracelular de CD3 (por exemplo, CD3 zeta). Em algumas modalidades, a região de sinalização intracelular compreende domínios coestimula- dores de CD28 e CD137 quiméricas (4 -1BB, TNFRSF9), liga- dos a um domínio intracelular de CD3 zeta.

[00278] Em algumas modalidades, o CAR abrange um ou mais, por exemplo, dois ou mais, domínios coestimuladores e regiões de sinalização citoplasmática primária, na porção ci- toplasmática. CARs exemplificativos incluem componentes intracelulares, tal como regiões ou domínios de sinalização intracelular, de CD3-zeta, CD28, CD137 (4-1BB), OX40 (CD134), CD27, DAP10, DAP12, NKG2D e/ou ICOS. Em al- gumas modalidades, o receptor de antígeno quimérico con- tém uma região ou domínio de sinalização intracelular de uma molécula coestimuladora de células T, por exemplo, de CD28, CD137 (4-1BB), OX40 (CD134), CD27, DAP10, DAP12, NKG2D e/ou ICOS, em alguns casos, entre o domí- nio transmembranar e a região ou domínio de sinalizaçã in- tracelular. Em alguns aspectos, a molécula coestimuladora de células T é uma ou mais de CD28, CD137 (4-1BB), OX40 (CD134), CD27, DAP10, DAP12, NKG2D e/ou ICOS.

[00279] Em algumas modalidades, a região ou domínio de sinalização intracelular compreende um domínio de sinaliza- ção coestimuladora intracelular da CD28 humana ou uma va- riante ou porção funcional da mes ma, tal como um domínio de 41 aminoácidos da mesma e/ou um domínio com uma substituição de LL por GG nas posições 186-187 de uma pro- teína CD28 nativa. Em algumas modalidades, o domínio de sinalização intracelular pode compreender a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 10 ou 11 ou uma sequência de aminoácidos que apresenta pelo menos ou pelo menos cerca de 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou mais de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 10 ou 11. Em a lgumas mo- dalidades, a região intracelular compreende ou uma região ou domínio de sinalização coestimuladora intracelular da CD137(4-1BB) ou uma variante ou porção funcional da mes- ma, tal como um domínio citoplasmático de 42 aminoácido de uma 4-1BB humana (Acesso N° Q07011,1) ou uma variante ou porção funcional da mesma, tal como a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 12 ou uma sequên- cia de aminoácidos que apresenta pelo menos ou pelo menos cerca de 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou mais de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 12.

[00280] Em alguns casos, os CARs são denominados CARs de primeira, segunda, terceira ou quarta geração. Em alguns aspectos, um CAR de primeira geração é aquele que propor- ciona apenas um sinal de estimulação ou ativação primário, por exemplo, via um sinal induzida pela cadeia CD3 depois de ligação do antígeno; em alguns aspectos, um CAR de se- gunda geração é aquele que proporciona tal sinal e um sinal coestimular, tal como aquele incluindo uma ou mais regiões ou domínios de sinalização intracelular de um ou mais recep- tores coestimuladores tal como CD28, CD137 (4 -1BB), OX40

(CD134), CD27, DAP10, DAP12, NKG2D, ICOS e/ou outros receptores coestimuladores; em alguns aspectos, um CAR de terceira geração é aquele que inclui múltiplos domínios coes- timuladores de diferentes receptores coestimuladores, por exemplo, selecionados dentre CD28, CD137 (4 -1BB), OX40 (CD134), CD27, DAP10, DAP12, NKG2D, ICOS e/ou outros receptores coestimuladores; em a lguns aspectos, um CAR de quarta geração é aquele que três ou mais domínios coesti- muladores de diferentes receptores coestimuladores, por exemplo, selecionados dentre CD28, CD137 (4 -1BB), OX40 (CD134), CD27, DAP10, DAP12, NKG2D, ICOS e/ou outros receptores coestimuladores.

[00281] Em algumas modalidades, a célula é geneticamente modificada para expressar uma ou mais moléculas e/ou poli- peptídios adicionais e/ou abordagens combinatoriais e/ou de direcionamento múltiplo são usadas para regular, controlar, ou modular a função e/ou atividade do CAR. Abordagens exemplificativas empregadas para CARs e abordagens com- binatoriais estão descritas, por exemplo, na seção de abor- dagens combinatoriais e de direcionamento múltiplo.

[00282] Em algumas modalidades, o CAR contém um anti- corpo, por exemplo, um fragmento de anticorpo, um domínio transmembranar que é ou contém uma porção transmembra- nar da CD28 ou uma variante funcional da mesma, e uma re- gião de sinalização intracelular contendo uma porção de si- nalização da CD28 ou uma variante funcional da mesma e uma porção de sinalização da CD3 zeta ou uma variante fun- cional da mesma. Em algumas modalidades, o CAR contém um anticorpo, por exemplo, um fragmento de anticorpo, um domínio transmembranar que é ou contém uma porção transmembranar da CD28 ou uma variante funcional da mesma, e um domínio de sinalização intracelular contendo uma porção de sinalização de uma 4 -1BB ou uma variante funcional da mesma e uma porção de sinalização da CD3 ze- ta ou uma variante funcional da mesma. Em algumas desta s modalidades, o receptor inclui ainda um espaçador contendo uma porção de uma molécula de Ig, tal como uma molécula de Ig humana, tal como uma dobradiça de Ig, por exemplo, uma dobradiça da IgG4, tal como uma dobradiça -espaçador apenas.. b. Receptor de autoanticorpo quimérico (CAAR)

[00283] Em algumas modalidades, o receptor recombinante é um receptor de autoancorpo quimérico (CAAR). Em algu- mas modalidades, o CAAR liga -se, por exemplo, liga-se es- pecificamente ou reconhece, um autoanticorpo. Em algumas modalidades, uma célula expressando CAAR, tal como uma célula T geneticamente modificada para expressar um CAAR, pode ser usada para ligar ou destruir células expressando o autoancorpo, mas não células expressando anticorpo normal. Em algumas modalidades, células expre ssando CAAR podem ser usadas para tratar uma doença autoimune associada à expressão de auto-antígenos, tal como doenças autoimunes. Em algumas modalidades, células expressando CAAR podem direcionar células B que produzem essencialmente os auto- anticorpos e apresentam os autoanticorpos em suas superfí- cies celulares, marcam essas células B como alvos doença - específicos para intervenção terapêutica. Em algumas moda- lidades, células expressando CAAR podem ser usadas para direcionar e destruir de forma eficiente a s células B patogê- nicas em doenças autoimunes direcionando as células B causadoras da doença usando um receptor de autoanticorpo antígeno-específico. Em algumas modalidades, o receptor recombinante é um CAAR, tal como qualquer uma daqueles descritos na Publicação do Pedido de Patente US N° US 2017/0051035.

[00284] Em algumas modalidades, o CAAR compreende um domínio de ligação de autoanticorpo, um domínio transmem- branar, e uma ou mais regiões ou domínios de sinalização intracelular (também intercambiavelmente chamados de do- mínio ou região de sinalização citoplasmática). Em algumas modalidades, a região de sinalização intracelular compreen- de um domínio de sinalização intracelular. Em algumas mo- dalidades, o domínio de sinalização intracelular é ou com- preende um domínio de sinalização primária, um domínio de sinalização que é capaz de estimular e/ou induzir um sinal de ativação primário em uma célula T, um domínio de sinali- zação de um componente do receptor de células T (TCR) (por exemplo, um domínio ou região de sinali zação intracelu- lar de uma cadeia CD3-zeta (CD3ζ) ou uma variante funional ou porção de sinalização da mesma), e/ou um domínio de si- nalização compreendendo um motivo de ativação à base de tirosina imunorreceptora (ITAM).

[00285] Em algumas modalidades, o domínio d e ligação de autoanticorpo compreende um autoantígeno ou um fragmento do mesmo. A escolha do autoantígeno pode depender do tipo de autoanticorpo sendo direcionado. Por exemplo, o autoan- tígeno pode ser escolhido por reconhecer um autoanticorpo em uma célula alvo, tal como uma célula B, associada a um estado de doença particular, por exemplo, uma doença au- toimune, tal como uma doença autoimune mediada por auto-

anticorpos. Em algumas modalidades, a doença autoimune inclui pênfigo vulgar (PV). Autoantígenos exem plificativos in- cluem desmogleína 1 (Dsg1) e Dsg3. c. Receptores de células T (TCRs)

[00286] Em algumas modalidades, células geneticamente modificadas, tal como células T, expressam um receptor de células T (TCR) ou uma porção de ligação de antígeno do mesmo que reconhece um epítopo intracelular e/ou um epí- topo de peptídio ou epítipo de célula T de um polipeptídio al- vo, tal como um antígeno de uma proteína tumoral, viral ou autoimune. Em alguns aspectos, o receptor recombinante é ou inclui um TCR recombinante.

[00287] Em algumas modalidades, um “receptor de células T” ou “TCR” é uma molécula que contém uma cadeia variável α e uma cadeia variável β (também conhecidas como TCRα e TCRβ, respectivamente) ou uma cadeia variável γ e uma ca- deia variável δ (também conhecidas como TCRα e TCRβ, respectivamente), ou porções de ligação de antígeno das mesmas, e que é capaz de se ligar especificamente a um peptídio ligado a uma molécula de MHC. Em algumas moda- lidades, o TCR está na forma αβ. Tipicamente, os TCRs que existem nas formas αβ e γδ geralmente são estruturalmente semelhantes, mas as células T expressando os mesmos po- dem ter localizações ou funções anatômicas distintas. Um TCR pode ser encontra na superfície de uma célula ou em uma forma solúvel. Geralmente, um TCR é encontrado n a superfície de células T (ou linfócitos T) onde geralmente ele é responsável por reconhecer antígenos ligados a moléculas do complexo de histocompatibilidade maior (MHC).

[00288] A menos que indicado em contrário, o termo “TCR”

deve ser entendido como abrangendo TCRs totais assim co- mo porções de ligação de antígeno ou fragmentos de ligação de antígeno dos mesmos. Em algumas modalidades, o TCR é um TCR intacto ou de comprimento integral, incluindo TCRs na forma αβ ou na forma γδ. Em algumas modalidades, o TCR é uma porção de ligação de antígeno que menor que o TCR de comprimento integral, mas que se liga a um peptídio específico ligado em uma molécula de MHC, tal como que se liga a um complexo MHC-peptídio. Em alguns casos, uma porção ou fragmento de ligação de ant ígeno de um TCR po- de conter apenas uma porção dos domínios estruturais de um TCR de comprimento integral ou intacto, mas ainda é ca- paz de se ligar ao epítopo do peptídio, tal como o complexo MHC-peptídio, ao qual o TCR total se liga. Em alguns casos, uma porção de ligação de antígeno contém os domínios vari- áveis de um TCR, tal como a cadeia variável α (V α ) e a ca- deia variável β (V  ) de um TCR, ou fragmentos de ligação de antígeno dos mesmos suficientes para formar um sítio de li- gação para ligação a um complexo MHC-peptídio específico.

[00289] Em algumas modalidades, os domínios variáveis do TCR contêm alças hipervariáveis, ou regiões determinantes de complementaridade (CDRs), que geralmente são os prin- cipais contribuintes para reconhecimento do antígeno e ca- pacidade e especificidade de ligação. Em algumas modalida- des, uma CDR de um TCR ou combinação da mesma forma todo ou substancialmente todo o sítio de ligação de antígeno de uma dada molécula de TCR. As várias CDRs em uma re- gião variável de uma cadeia de TCR geralm ente são separa- das por regiões de esqueleto (FRs), que geralmente apre- sentam menos variabilidade entre as moléculas de TCR em comparação com as CDRs (vide, por exemplo, Jores et al., Proc. Nat’l Acad. Sci. U.S.A. 87:9138, 1990; Chothia et al., EMBO J. 7:3745, 1988; vide também Lefranc et al., Dev. Comp. Immunol. 27:55, 2003). Em algumas modalidades, a CDR3 é a principal CDR responsável pela ligação ou especi- ficidade do antígeno, ou é a mais importante entre as três CDRs de uma dada região variável do TCR pa ra reconheci- mento do antígeno, e/ou para interação com a porção peptí- dica processada do complexo peptídio -MHC. Em alguns con- textos, a CDR1 da cadeia alfa pode interagir com a porção N-terminal de determinados peptídio antigêncios. Em alguns contextos, a CDR1 da cadeia beta pode interagir com a por- ção C-terminal do peptídio. Em alguns contextos, a CDR2 contribui mais fortemente para ou é a principal CDR respon- sável pela interação ou reconhecimento da porção MHC do complexo MHC-peptídio. Em algumas modalidades, a região variável da cadeia β pode conter ainda uma outra região hi- pervariável (CDR4 ou HVR4), que geralmente está envolvida na ligação de superantígeno e não no reconhecimento de an- tígeno (Kotb (1995) Clinical Microbiology Reviews, 8:411 - 426).

[00290] Em algumas modalidades, um TCR também pode conter um domínio constante, um domínio transmembranar e/ou uma cauda citoplasmática curta (vide, por exemplo, Janeway et al., Immunobiology: The Immune System in Health and Disease, 3rd Ed., Current Biology Publications, p. 4:33, 1997). Em alguns aspectos, cada cadeia do TCR pode ter um domínio variável N-terminal de imunoglobulina, um domínio constante de imunoglobulina, uma região transmem- branar, e uma cauda citoplasmática curta na extremidade C-

terminal. Em algumas modalidades, um TCR é associado a proteínas invariantes do complexo de CD3 envolvido na me- diação da transdução de sinal.

[00291] Em algumas modalidades, uma cadeia do TCR con- tém um ou mais domínios constantes. Por exem plo, a porção extracelular de uma dada cadeia do TCR (por exemplo, ca- deia α ou cadeia ) pode conter domínios imunoglobulina - like, tal como um domínio variável (por exemplo, Vα ou V ; tipicamente os aminoácidos 1 a 116 com base na numeração de Kabat Kabat et al., “Sequences of Proteins of Immunolo- gical Interest, US Dept. Health and Human Services, Public Health Service National Institutes of Health, 1991, 5th ed.) e um domínio constante (por exemplo, domínio constante da cadeia α ou Cα, tipicamente as po sições 117 a 259 da cadeia com base na numeração de Kabat ou domínio constante da cadeia  ou C  , tipicamente as posições 117 a 295 da cadeia com base em Kabat) adjacentes à membrana celular. Por exemplo, em alguns casos, a porção extracelular do TCR formada pelas duas cadeias contém dois domínios constan- tes próximos à membrana, e dois variáveis distantes da membrana, cada um destes domínios contendo CDRs. O do- mínio constante do TCR pode conter sequências de conexão curtas nas quais um resíduo cisteína form a uma ligação dis- sulfeto, ligando assim as duas cadeias do TCR. Em algumas modalidades, um TCR pode ter um resíduo cisteína adicional em cada uma das cadeias α e β, de modo que o TCR contém duas ligações dissulfeto nos domínios constantes.

[00292] Em algumas modalidades, as cadeias do TCR con- têm um domínio transmembranar. Em algumas modalidades, o domínio transmembranar é positivamente carregado. Em alguns casos, a cadeia do TCR contém uma cauda citoplas- mática. Em alguns casos, a estrutura permite que o TCR se associe a outras moléculas como CD3 e subuniddes da mesma. Por exemplo, um TCR contendo domínios constantes com uma região transmembranar pode ancorar a proteína na membrana celular e associar -se a subunidades invariantes do aparelho cou complexo de sinalizaç ão da CD3. As caudas intracelulares das subunidades de sinalização da CD3 (por exemplo, cadeias CD3γ, CD3δ, CD3ε e CD3ζ) contêm um ou mais motivos de ativação à base de tirosina imunorreceptora ou ITAM que estão envolvidos na capacidade de sinalização do complexo de TCR.

[00293] Em algumas modalidades, o TCR contém vários domínios ou regiões. Em alguns casos, o domínio ou região exata pode variar dependendo da modelagem estrutural ou de homologia particular ou de outros atributos usados para descrever um domínio particular. Fica entendido que a men- ção a aminoácidos, incluindo uma sequência específica apresentada como SEQ ID NO: usada para descrever a or- ganização do domínio de um receptor recombinante, por exemplo, TCR, é feita com fins ilustrativos e não se destina a limitar o escopo das modalidades apresentadas. Em alguns casos, o domínio específico (por exemplo, variável ou cons- tante) pode ser vários aminoácidos (tal como um, dois, três ou quatro) mais comprido ou mais curto. Em alguns aspec- tos, os resíduos de um TCR são conhecidos ou podem ser identificados de acordo com o sistema de numeração Inter- national Immunogenetics Information System (IMGT) (vide, por exemplo, www.imgt.org; vide também Lefranc et al. (2003) Developmental and Comparative Immunology, 2&;55-

77; e The T Cell Factsbook 2nd Edition, Lefranc and LeFranc Academic Press 2001). Com o uso deste sistema, as se- quências da CDR1 em uma cadeia TCR Vα chains e/ou em uma cadeia Vβ correspondem aos aminoácidos presentes en- tre os resíduos números 27-38, inclusive, as sequências da CDR2 em uma cadeia TCR Vα e/ou em uma cadeia Vβ cor- respondem aos aminoácidos presentes entre os resíduos números 56-65, inclusive, e as sequências da CDR3 em uma cadeia TCR Vα e/ou em uma cadeia Vβ correspondem aos aminoácidos presentes entre os resíduos números 105-117, inclusive.

[00294] Em algumas modalidades, cada uma da cadeia α e da cadeia β de um TCR contém ainda um domínio constante. Em algumas modalidades, o domínio constante da cadeia α (Cα) e o domínio constante da cadeia β (Cβ ) são individual- mente de um mamífero, tal como é um domínio constante humano ou murino. Em algumas modalidades, o domínio constante da cadeia é adjacente à membrana celular. Por exemplo, em alguns casos, a porção extracelular do TCR formado pelas duas cadeias contém dois domínios constan- tes próximos à membrana, e dois domínios constantes dis- tantes da membrana, estes domínios variáveis contendo, ca- da um, CDRs.

[00295] Em algumas modalidades, cada um do domínio Cα e do domínio Cβ é humano. Em algumas modalidades, a Cα é codificada pelo gene TRAC (IMGT nomenclature) ou é uma variante do mesmo. Em algumas modalidades, a C  é codifi- cada pelo gene TRBC1 ou TRBC2 (nomenclatura IMGT) ou é uma variante do mesmo. Em algumas modalidades, qualquer um dos TCRs apresentados ou f ragmentos de ligação de an-

tígeno dos mesmos pode ser um TCR quimérico humano/de camudondo. Em alguns casos, o TCR ou fragmento de liga- ção de antígeno do mesmo tem uma cadeia α e/ou uma ca- deia β compreendendo uma região constante de camundon- go. Em alguns aspectos, as regiões Cα e/ou Cβ são regiões constantes de camundongo. Em algumas de quaisquer tais modalidades, o TCR ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo é codificado por uma sequência de nucleotídeos que fora códon-otimizada.

[00296] Em algumas de quaisquer tais modalidades, a mo- lécula de ligação ou TCR ou fragmento de ligação de antíge- no do mesmo é isolada ou purificada ou é recombinante. Em algumas de quaisquer tais modalidades, a molécula de liga- ção ou TCR ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo é humana.

[00297] Em algumas modalidades, o TCR pode ser um he- terodímero de duas cadeias α e β que são ligadas, tal como por uma ligação dissulfeto ou ligações dissulfeto. Em algu- mas modalidades, o domínio constante do TCR pode conter sequências de conexão curtas nas quais um resíduo cisteína forma uma ligação dissulfeto, ligando assim as duas cadeias do TCR. Em algumas modalidades, um TCR pode ter um re- síduo adicionada em cada uma da cadeia α e da cadeia β, de modo que o TCR contém duas ligações dissulfeto nos domí- nios constantes. Em algumas modalidades, cada um do do- mínio constante e do domínio variável contém ligações dis- sulfeto formadas por resíduos cisteína.

[00298] Em algumas modalidades, o TCR pode ser um he- terodímero de duas cadeias α e β (ou opcionalmente γ e δ) ou pode ser um construto de TCR de cadeia única. Em algu-

mas modalidades, o TCR é um heterodímero contendo duas cadeias separadas (cadeias α e β ou cadeias γ e δ) que são ligadas, tal como por uma ligação dissulfeto ou ligações dis- sulfeto.

[00299] Em algumas modalidades, o TCR pode ser gerado a partir de sequências de TCR conhecidas, tal como sequên- cias das cadeias Vα,β, para o qual uma sequência codifica- dora de comprimento substancialmente integral se encontra facilmente disponível. Métodos para obtenção sequências de TCR de comprimento ingetral, incluindo sequências das ca- eias V, das fontes celulares são bastante conhecidos. Em algumas modalidades, ácidos nucleicos codificando o TCR podem ser obtidos de uma variedade de fontes, tal como por amplificação por reação em ca deia da polimerase (PCR) de ácidos nucleicos codificadore de TCR contidos em uma ou mais células dadas ou isolados de uma ou mais células da- das, ou por síntese de sequências de TCR DNA disponíveis ao público.

[00300] Em algumas modalidades, os receptores recombi- nantes incluem TCRs recombinantes e/ou TCRs clondos de células T de ocorrência natural. Em algumas modalidades, um clone de célula T de alta afinidade para um antígeno alvo (por exemplo, um antígeno para câncer) é identificado, isola- do de um paciente, e introduzido nas células. Em algumas modalidades, o clone de TCR para um antígeno alvo fora ge- rado em camundongos trasgênicos geneticamente modifica- dos com genes do sistema imunológico humano (por exem- plo, o sistema de antígenos leucocitários humano, ou HLA). Vide, por exemplo, antígenos para tumor (vide, por exemplo, Parkhurst et al. (2009) Clin Cancer Res. 15:169–180 e Cohen et al. (2005) J Immunol. 175:5799 –5808. Em algumas moda- lidades, exibição em fagos é usada para isolar TCRs contra um antígeno alvo (vide, por exemplo, Varela-Rohena et al. (2008) Nat Med. 14:1390–1395 e Li (2005) Nat Biotechnol. 23:349–354.

[00301] Em algumas modalidades, o TCR é obtido de uma fonte biológica, tal como de células tal como uma célula T (por exemplo, célula T citotóxica), hibridomas de células T ou outra fonte disponível ao público. Em algumas modalida- des, as células T podem ser obtidas de células isoladas in vivo. Em algumas modalidades, o TCR é um TCR seleciona- do timicamente. Em algumas modalidades, o TCR é um TCR restrito a neoepítopo. Em algumas modalidades, as células T podem ser um hibridoma ou clone de células T cultivadas. Em algumas modalidades, o TCR ou uma porção de ligação de antígeno da mesma ou fragmento de ligação de antígeno da mesma pode ser gerada sinteticamente a par tir de infor- mações da sequência do TCR.

[00302] Em algumas modalidades, o TCR é gerado a partir de um TCR identificado ou selecionado a partir doo rastrea- mento de uma biblioteca de TCRs candidatos contra um an- tígeno polipeptídico alvo, ou epítopo de célula T alvo do mesmo. Bibliotecas de TCR podem ser geradas por amplica- ção do repertório de Vα e Vβ de células T isoladas de um in- divíduo, incluindo células presentes nas PBMCs, no baço ou em outro órgão linfoide. Em alguns casos, as células T po- dem amplificadas a partir de linfócitos infiltrantes de tumor (TILs). Em algumas modalidades, bibliotecas de TCR podem ser geradas a partir de células CD4+ ou CD8+. Em algumas modalidades, os TCRs podem ser amplificados a partir de uma fonte de células T de um indivíduo normal o u saudável, i.e., bibliotecas de TCRs normais. Em algumas modalidades, os TCRs podem ser amplificados a partir de uma fonte de cé- lulas T de um indivíduo enfermo, i.e., bibliotecas de TCRs enfermos. Em algumas modalidades, iniciadores degenera- dos são usados para amplificar o repertório de genes da Vα e Vβ, tal como por RT -PCR em amostras, tal como células T, obtidas de seres humanos. Em algumas modalidades, biblio- tecas, tal como bibliotecas de TCR de cadeia única TCR (scTv), podem ser montadas a partir de bi bliotecas de Vα e Vβ naïve em que os produtos amplificados são clonados ou montados de forma a ficarem separados por um ligante. De- pendendo da fonte do indivíduo e das células, as bibliotecas podem ser HLA alelo-específicas. Alternativamente, em al- gumas modalidades, bibliotecas de TCR podem ser geradas por mutagênese ou diversificação de uma molécula de TCR parental ou de arcabouço.

[00303] Em alguns aspectos, os TCRs são submetidos a evolução direcionada, tal como por mutagênese, por exem- plo, da cadeia α ou β. Em alguns aspectos, resíduos particu- lares nas CDRs do TCR são alterados. Em algumas modali- dades, TCRs selecionados podem ser modificados por matu- ração de afinidade. Em algumas modalidades, células T antí- geno-específicas podem ser selecionadas, tal como por ras- treamento para avaliar a atividade da CTL contra o peptídio. Em alguns aspectos, TCRs, por exemplo, presentes nas cé- lulas T antígeno-específicas, podem ser selecionados, tal como por atividade de ligação, por exemplo, afinidade ou avidez particular para o antígeno.

[00304] Em algumas modalidades, o TCR ou porção de li-

gação de antígeno do mesmo é um TCR que fora modificado ou geneticamente modificado. Em algumas modalidades, mé- todos de evolução direcionada são usados para gerar TCRs com propriedades alteradas, tal como afinidade mais alta pa- ra um complexo MHC-peptídio específico. Em algumas moda- lidades, a evolução direcionada é botida por métodos de exi- bição incluindo, porém sem limitação, exibição em leveduras (Holler et al. (2003) Nat Immunol, 4, 55 -62; Holler et al. (2000) Proc Natl Acad Sci U S A, 97, 5387 -92), exibição em fagos (Li et al. (2005) Nat Biotechnol, 23, 349 -54), ou exibi- ção em células T (Chervin et al. (2008) J Immunol Methods, 339, 175-84). Em algumas modalidades, as abordagens de exibição envolvem manipulação genética, ou modificação, de um TCR conhedido, parental ou de referência. Por exemplo, em alguns casos, um TCR do tipo selvagem pode ser usado como um molde para produção de TCRs mutageneizados nos quais um ou mais resíduos das CDRs são mutados , e mutan- tes com uma propriedade alterada desejada, tal como afini- dade mais alta para um antígeno alvo desejado, são selecio- nados.

[00305] Em algumas modalidades, o antígeno é um antíge- no tumoral que pode ser um antígeno glioma -associado, go- nadotropina coriônica β humana, alfafetoproteína (AFP), an- tígeno para maturação de células B (BCMA, BCM), receptor do fator ativador de células B (BAFFR, BR3), e/ou ativador transmembranar e interator CAML (TACI), receptor-like 5 de Fc (FCRL5, FcRH5), AFP reativo à lectina, tire oglobulina, RAGE-1, MN-CA IX, telomerase transcriptase reversa huma- na, RU1, RU2 (AS), carboxil esterase intestinal, mut hsp70 - 2, M-CSF, Melanina-A/MART-1, W T-1, S-100, MBP, CD63,

MUC1 (por exemplo, MUC1-8), p53, Ras, ciclina B1, HER - 2/neu, antígeno carcinoembrionário (CEA), gp100, MAGE -A1, MAGE-A2, MAGE-A3, MAGE-A4, MAGE-A5, MAGE-A6, MAGE-A7, MAGE-A8, MAGE-A9, MAGE-A10, MAGE-A11, MAGE-A11, MAGE-B1, MAGE-B2, MAGE-B3, MAGE-B4, MAGE-C1, BAGE, GAGE-1, GAGE-2, pl5, tirosinase, proteína 1 relacionada à tirosinase (TRP-1), proteína 2 relacionada à tirosinase (TRP-2), β-catenina, NY-ESO-1, LAGE-1a, PP1, MDM2, MDM4, EGVFvIII, Tax, SSX2, telomerase, TARP, pp65, CDK4, vimentina, S100, eIF -4A1, p78 induzível por IFN, e melanotransferrina (p97), Uroplakin II, antígeno es pe- cífico para próstata (PSA), calicreína humana (huK2), antí- geno membranar específico para próstata (PSM), e fosfatase ácida da próstata (PAP), elastase neutrofílica, efrina B2, BA - 46, beta-catenina, Bcr-abl, E2A-PRL, H4-RET, IGH-IGK, MYL-RAR, Caspase 8 ou um antígeno para B-Raf. Outros an- tígenos para tumor podem incluir qualquer antígeno derivado de FRa, CD24, CD44, CD133, CD 166, epCAM, CA -125, HE4, Oval, receptor de estrogênio, receptor de progesterona, uPA, PAI-1, CD19, CD20, CD22, ROR1, mesotelina, CD3 3/IL3Ra, c-Met, PSMA, Glycolipid F77 , GD -2, fator de crescimento in- sulínico (IGF)-I, receptor de IGF-II e de IGF-I. Antígenos as- sociados a tumor específicos ou epítopos de células T espe- cíficos são conhecidos (vide, por exemplo, van der Bruggen et al. (2013) Cancer Immun, disponível em www.cancerimmunity.org/peptide/; Cheever et al. (2009) Clin Cancer Res, 15, 5323-37).

[00306] Em algumas modalidades, o antígeno é um antíge- no viral. Muitos alvos dos antígenos virais já foram identifi- cados e são conhecidos, incluin do peptídios derivados de genomas virais no HIV, HTLV e em outros vírus (vide, por exemplo, Addo et al. (2007) PLoS ONE, 2, e321 ; Tsomides et al. (1994) J Exp Med, 180, 1283-93; Utz et al. (1996) J Vi- rol, 70, 843-51). Antígenos virais exemplificativos inc luem, porém sem limitação, um antígeno da hepatite A, hepatite B (por exemplo, antígenos do núcleo e da superfície do HBV (HBVc, HBVs)), hepatite C (HCV), vírus Epstein -Barr (por exemplo, EBVA), papilomavírus humano (HPV; por exemplo , E6 e E7), vírus da imunodeficiência humana tipo 1 (HIV1), sarcoma de Kaposi, vírus do herpes (KSHV), vírus do papi- loma humano (HPV), vírus influenza, vírus Lassa, HTLN -1, HIN-1, HIN-II, CMN, EBN ou HPN. Em algumas modalidades, a proteína alvo é um antígeno bacteriano ou outro antígeno patogênico, tal como antígenos para Mycobacterium tubercu- losis (MT), tripanossoma, por exemplo, Tiypansoma cruzi (T. cruzi), antígenos tais como antígenos superficiais (TSA), ou antígenos para malária. Antígenos ou epítopos virais especí- ficos ou outros antígenos patogênicos ou epítopos de células T são conhecidos (vide, por exemplo, Addo et al. (2007) PLoS ONE, 2:e321 ; Anikeeva et al. (2009) Clin Immunol, 130:98-109).

[00307] Em algumas modalidades, o antígeno é um antíge- no derivado de um vírus associado a câncer, tal como um ví- rus oncogênico, por exemplo, um vírus oncogênico é aquele em que a infecção por certos vírus leva sabidamente ao de- senvolvimento de diversos tipos de câncer, por exemplo, he- patite A, hepatite B (por exemplo, antígenos do núcleo e da superfície do HBV) (HBVc, HBVs), vírus do papiloma humano (HPV), infecções virais devido à hepatite, vírus Epstein -Barr (EBV), vírus 8 do herpes humano (HHV -8), vírus 1 da leuce-

mia humana de células T (HTLV -1), vírus 1 da leucemia hu- mana de células T (HTLV-2), ou um antígeno de citomegalo- vírus (CMV).

[00308] Em algumas modalidades, o antígeno viral é um an- tígeno para HPV, que, em alguns casos, pode levar a um maior risco de desenvolver câncer cervical. Em algumas mo- dalidades, o antígeno pode ser um antígeno para HPV-16, e um antígeno para HPV-18, e antígeno para HPV-31, um antí- geno para HPV-33 antigen ou antígeno para HPV -35. Em al- gumas modalidades, o antígeno viral é um antígeno para HPV-16 (por exemplo, regiões seroreativas das proteínas E1, E2, E6 e/ou E7 do HPV-16, vide, por exemplo, Patente US N° 6,531,127) ou um antígeno para HPV-18 (por exemplo, regi- ões serorereativas das proteínas L1 e/ou L2 do HPV -18, tal como descrito na Patente US N° 5,840,306). Em algumas modalidades, o antígeno viral é um antígeno para HPV-16 que é proveniente das proteínas E6 e/ou E7 do HPV -16. Em algumas modalidades, o TCR é um TCR direcionado contra uma HPV-16 E6 ou HPV-16 E7. Em algumas modalidades, o TCR é um TCR descrito, por exemplo, nos documentos W O 2015/184228, W O 2015/009604 e W O 2015/009606.

[00309] Em algumas modalidades, o antígeno viral é um an- tígeno para HBV ou para HCV, que, em alguns casos, pode levar a um maior risco de desenvolver câncer de fígado do que em indivíduos HBV- ou HCV-negativos. Por exemplo, em algumas modalidades, o antígeno heterólogo é um antígeno para HBV, tal como um antígeno para o núcleo da hepatite B ou um antígeno para o envelope da hepatite B (US2012/0308580).

[00310] Em algumas modalidades, o antígeno viral é um an-

tígeno para EBV, que, em alguns casos, pode leva r a um maior risco de desenvolver linfoma de Burkitt, carcinoma na- sofaríngeo e doença de Hodgkin do que em indivíduos EBV- negativos. Por exemplo, EBV é um vírus de herpes humano que, em alguns casos, é encontrado associado a numerosos tumores humanos de origem tecidual diversa. Embora princi- palmente encontrados como uma infecção assintomática, os tumores EBV-positivos podem ser caracterizados pela ex- pressão de produtos genéticos virais, tal como EBNA -1, LMP-1 e LMP-2A. Em algumas modalidades, o antígeno het e- rólogo é um antígeno para EBV que pode incluir o antígeno nuclear para a proteína condutora de Epstein -Barr (EBNA)-1, EBNA-2, EBNA-3A, EBNA-3B, EBNA-3C, EBNA (EBNA-LP), proteínas membranares latentes LMP -1, LMP-2A e LMP-2B, EBV-EA, EBV-MA ou EBV-VCA.

[00311] Em algumas modalidades, o antígeno viral é um an- tígeno para HTLV-1 ou para HTLV-2, que, em alguns casos, pode levar a um maior risco de desenvolver leucemia de cé- lulas T do que em indivíduos HTLV -1- ou HTLV-2-negativos. Por exemplo, em algumas modalidades, o a ntígeno heterólo- go é um antígeno para HTLV, tal como TAX.

[00312] Em algumas modalidades, o antígeno viral é um an- tígeno para HHV-8, que, em alguns casos, pode levar a um maior risco de desenvolver sarcoma de Kaposi do que em indivíduos HHV-8-negativos. Em algumas modalidades, o an- tígeno heterólogo é um antígeno para CMV, tal como pp65 ou pp64 (vide, Patente US N° 8,361,473).

[00313] Em algumas modalidades, o antígeno é um autoan- tígeno, tal como um antígeno de um polipeptídio associado a uma doença ou distúrbio autoimune. Em algumas modalida-

des, a doença ou distúrbio autoimune pode ser esclerose múltipla (MS), artrite reumatoide (RA), síndrome de Sjogren, esclerodermia, polimiosite, dermatomiosite, lúpus eritemato- so sistêmico, artrite reumatoide juvenil, espondilite alquilo- sante, miastenia grave (MG), penfigoide bolhoso (anticorpos para a membrana basal na junção dérmica -epidérmica), pên- figo (anticorpos para o complexo mucopolissacarídeo proteí- na ou cimento intracelular), glomerulonefrite (anticorpos para a membrana basal glomerular), síndrome de Goodpasture, anemia hemolítica autoimune (anticorpos para eritrócitos), doença de Hashimoto (anticorpos para tireoide), anemia per- niciosa (anticorpos para o fator intrínseco), púrpura trombo- citopênica idiopática (anticorpos para plaquetas), doença de Grave, ou doença de Addison (anticorpos para tireoglobuli- na). Em algumas modalidades, o autoantígeno, tal como um autoantígeno associado a uma das doenças autoimunes aci- ma, pode ser colágeno, tal como colágeno tipo II, proteína de choque térmico micobacteriana, tireoglobulina, receptor de acetil colina (AcHR), proteína básica mielínica (MBP) ou pro- teína proteolipídica (PLP). Epítopos ou antígenos específicos associados a doenças autoimunes são conhecidos (vide, por exemplo, Bulek et al. (2012) Nat Immunol, 13:283-9; Harkio- laki et al. (2009) Immunity, 30:348-57; Skowera et al. (2008) J Clin Invest, 1(18): 3390-402).

[00314] Em algumas modalidades, peptídios de um polipep- tídio alvo para uso na produção ou geração de um TCR de interesse são conhecidos ou podem ser facilmente identifica- dos. Em algumas modalidades, peptídios adequaos para uso na geração de TCRs ou porções de ligação de antígeno po- dem ser determinados com base na presença de um motivo restrito de HLA em um polipeptídio alvo de interesse, tal co- mo um polipeptídio alvo descrito abaixo. Em algumas moda- lidades, os peptídios são identificados com a ajuda de mode- los de previsão computadorizados. Em alguns exemplos, mo- tivos de ligação de HLA-A0201 e os sítios de clivagem pro- teassomas e imunoproteassomas usando modelos de previ- são computadorizados são conhecidos. Em algumas modali- dades, para prever sítios de ligação de MHC classe I, tais modelos incluem, porém sem limitação ProPred1 (Singh and Raghava (2001) Bioinformatics 17(12):1236 -1237, e SYFPEITHI (vide, Schuler et al. (2007) Immunoinformatics Methods in Molecular Biology, 409(1): 75 -93 2007). Em al- gumas modalidades, o epítopo restrito de MHC é HLA -A0201, que é expresso em aproximadamente 39 -46% de todos ins indivíduos caucasianos e, portant o, representa uma escolha de antígeno para MHC para uso na preparação de um TCR ou outra molécula de ligação do peptídio de MHC.

[00315] Em algumas modalidades, o TCR ou porção de li- gação de antígeno do mesmo pode ser uma proteína natural produzida recombinantlemente ou uma forma mutada da mesma na qual uma ou mais propriedades, tal como caracte- rítica de ligação, foram alteradas. Em algumas modalidades, um TCR pode ser derivado de uma de várias espécies ani- mais, tal como ser humano, camundongo, rato, ou outro ma- mífero. Um TCR pode estar em uma forma ligada a uma célu- la ou pode estar em uma forma solúvel. Em algumas modali- dades, para os proósitos dos métodos apresentados, o TCR está em uma forma ligada a uma célula expressa na superfí- cie de uma célula.

[00316] Em algumas modalidades, o TCR recombinante é um TCR de comprimento integral. Em algumas modalidades, o TCR recombinante é uma porção de ligação de antígeno. Em algumas modalidades, o TCR é um TCR dimérico (dTCR). Em algumas modalidades, o TCR é um TCR de ca- deia única (scTCR). Em algumas modalidades, um dTCR ou scTCR tem as estruturas descritas, por exemplo, na Publica- ção de Pedido de Patente Internacional N° W O 03/020763, W O 04/033685 e W O 2011/044186.

[00317] Em algumas modalidades, o TCR recombinante contém uma sequência correspondente à sequência trans- membranar. Em algumas modalidades, o TCR contém uma sequência correspondente a sequências citoplasmáticas. Em algumas modalidades, o TCR é capable de formar um com- plexo de TCR com CD3. Em algumas modalidades, qualquer um dos TCRs recombinantes, incluindo um dTCR ou scTCR, pode ser ligado a domínios de sinalização que produzem um TCT ativo na superfície de uma célula T. Em algumas moda- lidades, o TCR recombinante é expresso na superfície das células. Em algumas modalidades do dTCR ou do scTCR contendo ligações dissulfeto inter-cadeias introduzidas ou geneticamente modificadas, as ligações dissulfeto nativas não estão presentes. Em algumas modalidades, a uma ou mais das cisteínas nativas que formam ligações dissulfeto nativas inter-cadeias são substituídas por outro resíduo, tal como por uma serina ou alanina. Em algumas modalidades, uma ligação dissulfeto introduzida ou geneticamente modifi- cada pode ser formada por mutação de resíduos não cisteína no primeiro e no segundo segmento pa ra cisteína. Ligações dissulfeto não nativas exemplificativas de um TCR estão descritas no PCT Internacional publicado N°

W O2006/000830.

[00318] Em certas modalidades, um TCR contém uma ou mais modificações para introduzir um ou mais resíduos ciste- ína que são capazes de formar uma ou mais pontes dissulfe- to não nativas entre a cadeia TCRα e a cadeia TCRβ. Em al- gumas modalidades, o TCR contém uma cadeia TCRα ou uma porção da mesma contendo um domínio constante de TCRα contendo um ou mais resíduos cisteína capazes de formar uma ligação dissulfeto não nativa com uma cadeia TCRβ. Em algumas modalidades, o transgene codifica uma cadeia TCRβ ou uma porção da mesma contendo um domínio constante de TCRβ contendo um ou mais resíduos cisteína capazes de formar uma ligação dissulfeto não nativa com uma cadeia TCRα. Em algumas modalidades, o TCR com- preende uma cadeia TCRα e/ou TCRβ e/ou um domínio cons- tante da cadeia TCRα e/ou TCRβ contendo uma ou mais mo- dificações para introduzir uma ou mais ligações dissulfeto. Em algumas modalidades, o transgene codifica uma cadeia TCRα e/ou TCRβ e/ou uma TCRα e/ou TCRβ com uma ou mais modificações para remover ou prevenir uma ligação dissulfeto nativa, por exemplo, entre a TCRα pelo transgene e a cadeia TCRβ endógena, ou entre a TCRβ pelo tran sgene e a cadeia TCR α endógena. Em algumas modalidades, uma ou mais cisteínas nativas que formam e/ou são capazes de formar uma ligação dissulfeto nativa inter -cadeias são substi- tuídas por outro resíduo, por exemplo, serina ou alanina. Em algumas modalidades, a cisteína é introduzida em um ou mais dos resíduos Thr48, Thr45, Tyr10, Thr45, e Ser15 com referência à numeração de um domínio constante de TCRα. Em certas modalidades, as cisteínas podem ser introduzidas no resíduo Ser57, Ser77, Ser17, Asp59, ou Gl u15 do domínio constante da cadeia TCRβ. Ligações dissulfeto não nativas exemplificativas de um TCR estão descritas nos PCTs inter- nacionais publicados N° W O2006/000830, W O 2006/037960 e Kuball et al. (2007) Blood, 109:2331-2338.

[00319] Em algumas modalidades, o T CR recombinante é um TCR dimérico (dTCR). Em algumas modalidades, o dTCR contém um primeiro polipeptídio no qual uma sequência cor- respondente a uma região variável da cadeia TCR α é fundi- da ao terminal N de uma sequência correspondente a uma sequência extracelular da região constante da cadeia TCR α, e um segundo polipeptídio no qual uma sequência corres- pondente a uma região variável da cadeia TCR β é fundida ao terminal N de uma sequência correspondente a uma se- quência extracelular da região constante da cadeia TCR β, o primeiro polipeptídio e o segundo polipeptídio sendo ligados por uma ligação dissulfeto. Em algumas modalidades, a liga- ção corresponder à ligação dissulfeto nativa inter -cadeias presentes em αβ TCRs diméricos nativos. Em algumas moda- lidades, as ligações dissulfeto inter -cadeias não estão pre- sentes em um TCR nativo. Por exemplo, em algumas modali- dades, uma ou mais cisteínas podem ser incorporadas nas sequências extracelulares da região constante do par dTCR polipeptídio. Em alguns casos, tanto uma ligação dissulfeto nativa quanto uma ligação dissulfeto não nativa podem ser desejáveis. Em algumas modalidades, o TCR contém uma sequência transmembranar para ancorar a membrana.

[00320] Em algumas modalidades, o dTCR contém uma ca- deia TCR α contendo um domí nio α variável, um domínio α constant e e um primeiro motivo de dimerização preso ao terminal C do domínio α constante, e uma cadua TCR β com- preendendo um domínio β variável, um domínio β constante e um primeiro motivo de dimerização preso ao terminal C do domínio β constante, em que o primeiro e o segundo motivos de dimerização interagem para formar uma ligação covalente entre um aminoácido no primeiro motivo de dimerização e um aminoácido no segundo motivo de dimerização ligando a ca- deia TCR α e a cadeia TCR β uma à outra.

[00321] Em algumas modalidades, o TCR recombinante é um TCR de cadeia única (scTCR ou scTv). Tipicamente, um scTCR pode ser gerado por métodos conhecidos. Vide, por exemplo, Soo Hoo, W . F. et al. PNAS (USA) 89, 4759 (1992); W ülfing, C. and Plückthun, A., J. Mol. Biol. 242, 655 (1994); Kurucz, I. et al. PNAS (USA) 90 3830 (1993); Publicação de Pedido de Patente Internacional N° W O 96/13593, W O 96/18105, W O 99/60120, W O 99/18129, W O 03/020763, W O 2011/044186; e Schlueter, C. J. et al. J. Mol. Biol. 256, 859 (1996). Em algumas modalidades, o scTCR contém uma liga- ção dissulfeto não nativa inter -cadeias introduzida para faci- litar a associação das cadeias do TCR (vide, por exemplo, Publicação de Pedido de Patente Internacional N° W O 03/020763). Em algumas modalidades, o scTCR é um TCR truncado não ligado por dissulfeto no qual zíperes leucina heterólogos fundidos aos terminais C dos mesmos facilitam a associação de cadeias (vide, por exemplo, Publicação de Pedido de Patente Internacional N° W O 99/601 20). Em algu- mas modalidades, o scTCR contém um domínio variável TCRα covalentemente ligado a um domínio variável TCRβ via um ligante peptídico (vide, por exemplo, Publicação de Pedi- do de Patente Internacional N° W O 99/18129).

[00322] Em algumas modalidades, o scT CR contém um primeiro segmento constituído por uma sequência de amino- ácidos correspondente a uma região variável da cadeia TCR α, um segundo segmento constituído por uma sequência de aminoácidos correspondente a uma região variável da cadeia TCR β fundido ao terminal N de uma sequência de aminoáci- dos corresponde a uma sequência extracelular do domínio constante da cadeia TCR β, uma sequência de ligante ligan- do o terminal C do primeiro segmento ao terminal N do se- gundo segmento. Em algumas modalidades, o scT CR contém um primeiro segmento constituído de uma sequênia da regi- ão variável da cadeia α fundido ao terminal N de uma se- quência extracelular do domínio constante da cadeia α, e um segundo segmento constituído de uma sequênia da região variável da cadeia β fundido ao terminal N de uma sequência transmembranar constante extracelular da cadeia β, e, opci- onalmente, uma sequência de ligante ligando o terminal C do primeiro segmento ao terminal N do segundo segmento. Em algumas modalidades, o scTCR contém um pri meiro segmen- to constituído por uma sequência da região variável da ca- deia TCR β fundida ao terminal N de uma sequência extrace- lular do domínio constante da cadeia β, e um segundo seg- mento constituído por uma sequência da região variável da cadeia α fundida ao terminal N de uma sequência constante e transmembrane extracelular da cadeia α, e, opcionalmente, uma sequência de ligante ligando o terminal C do primeiro segmento ao terminal N do segundo segmento.

[00323] Em algumas modalidades, o ligante dos scTCRs que liga o primeiro e o segundo segmentos do TCR pode ser qualquer ligante capaz de formar um único cordão polipeptí-

dico, enquanto retém a especificidade de ligação dos TCRs. Em algumas modalidades, a sequência de ligante pode ter, por exemplo, a fórmula -P-AA-P- onde P é prolina e AA re- presenta uma sequência de aminoácidos na qual os aminoá- cidos são glicina e serina. Em algumas modalidades, o pri- meiro e o segundo segmentos são pareados de modo as se- quências da região variável dos mesmos sejam orientadas para tal ligação. Asim sendo, em alguns casos, o ligante tem um comprimento suficiente para cobrir a distância entre o terminal C do primeiro segmento e o terminal N do segundo segmento, ou vice-versa, mas não é comprido o bastante pa- ra bloquear ou reduzir a ligaçã o do scTCR ao ligante alvo. Em algumas modalidades, o ligante pode conter de ou de cerca de 10 a 45 aminoácidos, tal como 10 a 30 aminoácidos ou 26 a 41 resíduos aminoacídicos, por exemplo, 29, 30, 31 ou 32 aminoácidos. Em algumas modalidades, o ligante te m a fórmula -PGGG-(SGGGG) 5 -P- onde P é prolina, G é glicina e S é serina (SEQ ID NO:22). Em algumas modalidades, o ligante tem a sequência GSADDAKKDAAKKDGKS (SEQ ID NO:23).

[00324] Em algumas modalidades, o scTCR contém uma ligação dissulfeto covalente ligando um resíduo da região de imunoglobulina do domínio constante da cadeia α a uma re- síduo da região de imunoglobulina do domínio constante da cadeia β. Em algumas modalidades, a ligação dissulfeto in- ter-cadeias em um TCR nativo não está presente. Por exem- plo, em algumas modalidades, uma ou mais cisteínas podem ser incorporadas nas sequências extracelulares da região constante do primeiro e do segundo segmentos do polipeptí- dio scTCR. Em alguns casos, tanto uma ligação dissulfeto nativa quanto uma ligação dissulfeto não nativa podem ser desejáveis.

[00325] Em algumas modalidades, o TCR ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo apresenta uma atinidade com uma constante de dissocição de equilíbrio (K D ) para um antí- geno alvo de entre ou entre cerca de 10 - 5 e 10 - 1 2 M e todos os valores individuais e faixas ali contidos. Em algumas mo- dalidades, o antígeno alvo é um complexo ou ligante MHC- pepídio. III. MÉTODOS PARA PRODUÇÃO DE CÉLULAS GENETICA-

MENTE MODIFICADAS

[00326] Em alguns aspectos, neste pedido estão apresen- tados métodos para estimular, ativar, modificar geneticamen- te, cultivar, e/ou expandir uma ou mais populações de célu- las, por exemplo, células T enriquecidas. Em algumas moda- lidades, a uma ou mais populações de células são estimula- das ou ativadas, tal como por incubação das células em con- dições estimuladoras e/ou na presença de um reagente esti- mulador. Em certas modalidades, a uma ou mais populações de células T enriquecidas são geneticamente modificadas, tal como por introdução de um polinucleotídeo heterólogas nas células da uma ou mais populações. Em certas modali- dades, a uma ou mais populações de células T enriquecidas são cultivadas, por exemplo, cultivatadas em condições que promovem ou permitiem a divisão, o crescimento ou a ex- pansão de células T, tal como por um perío do de tempo fixo ou até um valor limítrofe para que a expansão seja atingida. Em algumas modalidades, o processo de manipulação gené- tica inclui as etapas de estimular e então transduzir as célu- las. Em modalidades particulares, o processo de manipula-

ção genética inclui as etapas de estimular, transduzir, e en- tão expandia as células. Em certas modalidades, as células não são expandidas.

[00327] Em modalidades particulares, neste pedido estão apresentados métodos para gerar uma composição de célu- las T geneticamente modificadas a partir de uma população de células T inicial, por exemplo, uma população de células T fonte. Em algumas modalidades, uma população de células T enriquecida é incubada em condições estimuladoras, ge- rando assim uma população estimulada. Em certas modali- dades, um polinucleotídeo heterólogo é introduzido nas célu- las da população estimulada, gerando assim uma população transformada. Em certas modalidades, a população transfor- mada é então expandida, tal como por um período de tempo fixo ou até uma expansão limítrofe ser atingida, resultando assim em uma população expandida. Em modalidades parti- culares, a população transformada ou a população expandida é recolhida ou coletada, e opcionalmente formulada, tal como para administração a um indivíduo ou para criopreservação. Em algumas modalidades, a população é ou contém células T CD4+ e células T CD8+.

[00328] Em certas modalidades, neste pedido estão apre- sentados métodos para gerar uma composição de células T geneticamente modificadas a partir de duas populações de células T iniciais, por exemplo, populações de células T fon- te. Em algumas modalidades, as duas populações de células T enriquecidas são incubadas separadamente em condições estimuladoras, gerando assim duas populações estimuladas separadas. Em certas modalidades, um polinucleotídeo hete- rólogo é introduzido nas células das duas populações esti-

muladas separadas, gerando assim duas populações trans- formadas separadas. Em certas modalidades, as duas popu- lações transformadas separadas são então expandidas, tal como por um período de tempo fixo ou até uma expansão li- mítrofe ser atingida, resultando assim em duas populações expandidas sepradas. Em modalidades particulares, as duas populações transformadas separadas ou as duas populações expandidas separadas são recolhidas ou coletadas, e opcio- nalmente formuladas, tal como para administração a um indi- víduo ou para criopreservação. Em modalidades particulares, as duas populações separadas são provenientes ou deriva- das da mesma amostra biológica ou de amostras biológ icas diferentes do mesmo indivíduo. Em algumas modalidades, as duas populações separadas são ou contêm uma população de células T CD4+ enriquecidas e uma população de células T CD8+ separada.

[00329] Em algumas modalidades, os métodos apresenta- dos neste pedido podem ser usados para determinar, medir, ou avaliar a presença, nível, quantidade ou expressão de proteínas, por exemplo, proteínas superficiais, de células an- tes, durante ou depois do término de um processo para gerar gerar células geneticamente modificadas . Em algumas moda- lidades, o perfil de espectrometria de massas é obtido por qualquer um dos métodos apresentados descritos neste pe- dido, por exemplo, na Seção I. Em algumas modalidades, os métodos apresentados podem ser usados para medir, moni- torar, ou avaliar os efeitosde um processo de manipulação genética a presença, ausência, quantidade, nível e/ou abun- dância relativa de uma ou mais proteínas, por exemplo, pro- teínas superficiais.

[00330] Em certas modalidades, um perfil de espectrome- tria de massas é obtido a partir de células de uma composi- ção de células geneticamente modificadas. Em modalidades particulares, um perfil de espectrometria de massas é obtido a partir de células que vão passar ou estão passando pelo processo de manipulação genética de células, por exemplo, tal como qualquer processo de manipulação genética des- crito neste pedido, tal como na Seção III. Em certas modali- dades, as células passaram por qualquer um dos processos de manipulação genética descritos neste pedido, por exem- plo, na Seção III. Em algumas modalidades, o processo de manipulação genética de células é ou inclui etapas para ge- rar células expressando um receptor recombinante. Em mo- dalidades particulares, o receptor recombinante é um CAR. Em certas modalidades, o receptor recombinante é qualquer CAR descrito neste pedido, por exemplo, na Seção II -C-1-a ou II-C-1-b. Em modalidades particulares, o receptor recom- binante é um TCR recombinante, por exemplo, um TCR re- combinante descrito neste pedido tal como na Seção II-C-1- c. Em algumas modalidades, o receptor recombinante é um CAR anti-CD19. Em certas modalidades, o receptor recombi- nante é um CAR anti-BCMA. Em certas modalidades, o perfil de espectrometria de massas é obtido a partir de uma com- posição de células para medir ou identificar um CAR expres- so pelas células geneticamente modificadas. Em modalida- des particulares, o perfil de espectrometria de massas é ob- tido a partir de uma composição de células durante um pro- cesso de manipulação genética de células expressando CAR.

[00331] Em modalidades particulares, os perfis de espec- trometria de massas são obtidos a partir de duas ou mais composições de células contendo células coletadas em dife- rentes estágios ou instantes de um processo de manipulação genética. Em algumas modalidades, as duas ou mais compo- sições de células são geradas a partir do mesmo indivíduo ou de indivíduos diferentes. Em certas modalidades, os per- fis de espectrometria de massas podem ser analisados ou comparados um ao outro para identificar os efeitos do pro- cesso de manipulação genética nas células, por exemplo, expressão de proteínas superficiais, ou em alguns aspectos, alterações nas características, propriedades, ou atributos tal como, porém sem limitação, viabilidade, diferenciação, ou potencial proliferativo.

[00332] Em modalidades particulares, os perfis de espec- trometria de massas são obtidos a partir de duas ou mais composições de células contendo células coletadas nos mesmos estágios ou instantes de diferentes processos de manipulação genética, por exemplo, diferentes processos de manipulação genética para gerar células expressando o mesmo receptor recombinante. Em modalidades particulares, as duas ou mais composições de células são geradas a partir do mesmo indivíduo ou dos mesmos indivíduos. Em certas modalidades, os perfis de esp ectrometria de massas podem ser analisados ou comparados um ao outro para identificar os efeitos de diferentes processos de manipulação genética nas células.

[00333] Em algumas modalidades, perfis de espectrometria de massas expressando o mesmo receptor recombinan te, por exemplo, CAR, gerado a partir de diferentes processos de manipulação genética são gerados, tal como para comparar os determinar os efeitos dos processos de manipulação ge-

nética nas células geneticamente modificadas resultantes. Em certas modalidades, os processos de produção são dife- rentes em relação a uma ou mais etapas, ou reagentes do processo. Em algumas modalidades, os processoss diferem no uso de pelo menos um reagente. Em algumas modalida- des, o reagente é um reagente estimulador, tal como qua l- quer reagente estimulador descrito neste pedido, por exem- plo, na Seção III-B. Em algumas modalidades, o reagente pode incluir anticorpos, por exemplo, anticorpos anti -CD3 an- tibodies, citocinas, por exemplo, IL-2, anticorpos anti-CD3 e/ou anti-CD28 solúveis, reagentes estimuladores à base de contas ou partículas oligoméricas, ou células irradiadas ex- pressando antígeno. Em algumas modalidades, o reagente é um vetor para distribuição de genes, por exemplo, um vetor viral.

[00334] Modalidades particulares contemplam que os méto- dos apresentados também podem ser empregados para ana- lisar ou caracterizar reagentes que são usados na produção ou manutenção de composições de células T geneticamente modificadas. Em certas modalidades, the reagents, tal como qualquer um dos reagentes descritos neste pedido, por exemplo, na Seção III, pode contger proteínas e pode, por- tanto, ser investigado por espectrometria de massas de acordo com os métodos descritos neste pedido.

[00335] Em alguns aspectos, a variabilidade entre doses unitárias de uma composição de células pode ser devida a um ou mais aspectos dos processos de produção na geração ou produção de uma terapia de células geneticamente modi- ficadas. Em alguns casos, alterações nas matérias-primas ou no manuseio ou armazenamento das mesma s pode impactar variáveis que, como observado neste pedido, têm um impac- to no risco de toxicidade e/ou desfechos. Em alguns aspec- tos, a variabilidade de lote para lote ou armazenamen- to/manuseio das matérias-primas e/ou o uso de diferentes matérias-primas entre os processos realizados em inúmeros indivíduos, pode ter um impacto, tal como aumentar a varia- bilidade ou aumentar ou diminuir certos aspectos das com- posições de células geradas, tal como aspectos que, se alte- rados, podem resultar em variabilidade no risco de toxicidade ou de desfechos clínicos entre os indivíduos que recebem as terapias celulares, particularmente entre indivíduos que dife- rem em certos atributos específicos do paciente.

[00336] Em algumas modalidades, são apresentadas abor- dagens que envolvem avaliação, testagem, e/ou controle de potenciais impactos ou variabilidade em um ou mais de tais atributos ou riscos ou probabilidades, como resultado de ma- térias-primas (tal como qualquer uma ou todas as matérias - primas), lotes, reagentes ou armazenamento ou manuseio dos mesmos, ou alteração nos mesmos por qualquer um dos métodos apresentados. Em algumas modalidades, tais abor- dagens incluem ensaios tais como aqueles realizados antes do uso de tal matéria-prima, lote, armazenamento ou manu- seio, na produção de uma composição de células a ser ad- ministrada a um indivíduo ou antes de tal administração. Em alguns aspectos, os ensaios avaliam o impacto da matéria - prima, lote, ou método de manuseio ou armazenamento, em um ou mais atributos em uma composição de célul as tal co- mo aqueles que, como observado neste pedido, têm um im- pacto no risco de toxicidade ou desfecho ou exacerbm o im- pacato de variabilidde de pacientes para paciente em tais desfechos. Em alguns aspectos, os ensaios avaliam se hou- ve um grau aceitavelmente baixo de variabilidade ou variân- cia no material, lote, ou método de armazenamento ou ma- nuseio em relação a um outro material, lote, ou método de armazenamento ou manuseio, ou um impacto aceitavelmente em tais um ou mais atributos. Em certas modalidades , os en- saios são ou incluem o uso de espectrometria de massas, tal como qualquer um dos métodos apresentados neste pedido, por exemplo, na Seção I. Em certas modalidades, os ensaios são ou incluem a geração de perfis de espectrometria de massas.

[00337] Em alguns aspectos, a matéria-prima, lote, ou mé- todo de armazenamento ou manuseio é liberado para uso na produção da terapia celular a ser administrada ao paciente - ou tal terapia celular é administrada ao paciente - se, tal co- mo somente se ou somente depois, o en saio, por exemplo, aqueles envolvendo espectrometria de massas tal como pe- los métodos descritos neste pedido, confirmar que tal varia- bilidade ou variância ou impacto está dentro da faixa ou va- lor ou limite aceitável. Em algumas modalidades, a determi- nação de que a variabilidade em um ou mais de tais atributos se encontra abaixo de um certo nível com uma nova matéria - prima ou lote ou método de armazenamento ou manuseio, pode reduzir o risco de toxicidade ou redução na resposta depois da implementação de tal nova matéria-prima ou lote ou método de armazenamento ou manuseio. Em algumas modalidades, entre tais métodos apresentados encontram -se métodos que analisam uma composição antes da liberação do produto e/ou ajustam a estratégia de dosagem com base em tais parâmetros.

[00338] As observações foram consistentes com a interpre- tação de que pode ser vantajoso - por exemplo, identificando uma dose segura e eficaz da composição de células - consi- derar (por exemplo, ensaio antes da liberação do produto e/ou fator na estratégia de dosagem) o grau de variabilidade em fatores que podem contribuir para certas atividades célu- la/antígeno-específicas em uma composição, pela perspecti- va de composições produzidas a partir de células derivados de diferentes indivíduos, e/ou na presenç a de uma ou mais condições diferentes de armazenamento ou manuseio da ma- téria-prima ou dos reagentes, por exemplo, usando lotes di- ferentes de reagentes ou de outras matérias-primas. Em al- guns aspectos, é vantajoso reduzir a variabilidade em tais parâmetros e/ou confirmar a faixa de variabilidade aceitável entre tais condições/lotes diferentes tal como quando se in- troduz um novo lote ou reagente armazenado ou manuseado em condições diferentes, tal como usando um ensaio de es- pectrometria de massas descrito ne ste pedido, por exemplo, na Seção I.

[00339] Em algumas modalidades, os métodos, artigos de manufatura, composições, doses e estratégias de dosagem são vantajosos por levarem em consideração em quando re- levante, ajustarem ou corrigirem, potenciais fontes de varia- bilidade, incluindo aquelas que derivam de mudança nos re- agentes e/ou variabilidade de paciente para paciente. Por exemplo, em algumas modalidades, pode ser vantajoso pro- duzir células T geneticamente modificadas por um processo que envolve o uso de um reagente de estimulação/expansão (ou lote do mesmo) de células T que esteja abaixo ou dentro de uma faixa de variabilidade ou variância aceitável, segun-

do verificado por um ensaio de liberação, em relação a um valor limítrofe de um parâmetro, por exemplo, um p erfil de espectrometria de massas ou um nível, quantidade, concen- tração, ou modificação de uma ou mais proteínas do rea- gente,

[00340] Em algumas modalidades, o reagente é um rea- gente que é ou contém proteínas. Em modalidades particula- res, o reagente é usado dura nte o processo de manipulação genética para estimular, ativar, tranduzir, transfectar, trans- formar, cultivar, ou expandir as células. Em algumas modali- dades, o perfil de proteínas é ou é A. Isolamento ou seleção de células a partir de amostras

[00341] Em algumas modalidades, as etapas de processa- mento incluem o isolamento de células ou composições das mesmas de amostras biológicas, tac aquelas obtidas ou deri- vadas de um indivíduo, tal como um indivíduo tendo uma do- ença ou condição particular ou comm necessidade de u ma terapia celular ou a quem a terapia celular será administra- da. Em alguns aspectos, o indivíduo é um ser humano, tal como um indivíduo que é um paciente com necessidade de uma intervenção terapêutica particular intervention, tal como a terapia de células adotivas para a qual as células estão sendo isoladas, processadas, e/ou geneticamente modifica- das. Por conseguinte, as células em algumas modalidades são células primários, por exemplo, células primárias huma- nas. Em algumas modalidades, as células compree ndem CD4+ e células T CD8+. Em algumas modalidades, as célu- las compreendem CD4+ ou células T CD8+. As amostras in- cluem tecido, fluido, e outras amostras coletadas diretamen- te do indivíduo. A amostra biológica pode ser uma amostra obtida diretamente de uma fonte biológica ou uma amostra que é processada. Amostras biológicas incluem, porém sem limitação, fluidos corporais, tais como amostras de sangue, plasma, soro, fluido cerebroespinhal fluid, fluido sinovial, urina e suor, tecido e órgãos, incluindo amostr as processa- das derivadas destes.

[00342] Em alguns aspectos, as células geralmente são cé- lulas eucarióticas, tal como células de mamífero, e tipica- mente são células humanas. Em algumas modalidades, as células são derivadas do sangue, osso, medula, linfa, ou ór- gãos linfoides, são células do sistema imunológico, tal como células da imunidade inata ou adaptativa, por exemplo, célu- las mieloides ou linfoides, incluindo linfócitos, tipicamente células T e/ou células NK. Outras células exemplificativas incluem células-tronco, tal como células-tronco multipotentes e pluripotentes, incluindo células -tronco pluripotentes induzi- das (iPSCs). As células são tipicamente células primárias, tal como aquelas isoladas diretamente de um indivíduo e/ou iso- ladas de um indivíduo e congel adas. Em algumas modalida- des, as células incluem um ou mais subconjuntos de células T ou outros tipos de células, tal como populações de células T totais, células CD4+, células CD8+, e subpopulações das mesmas, tal como aquelas definidas pela função, estad o de ativação, maturidade, potencial para diferenciação, expan- são, recirculação, localização, e/ou capacidade de persistên- cia, especificidade para antígenos, tipos do receptor de antí- geno, presença em um órgão ou compartimento particular, perfil de secreção de marcadores ou citocinas, e/ou grau de diferenciação. Em relação ao indivíduo a ser tratado, as cé- lulas podem ser alogênicas e/ou autólogas. Entre os métodos encontram-se “off-the-shelf”. Em alguns aspectos, tal como para techologias “off-the-shelf”, as células são pluripotentes e/ou multipotentes, tal como células -tronco, tal como células- tronco pluripotentes induzidas (iPSCs). Em algumas modali- dades, os métodos incluem isolamento de células do indiví- duo, preparação, processamento, cultivo, e/ou manipu lação genética das mesas, como descrito neste pedido, e reintro- dução das mesmas no mesmo paciente, antes ou depois de criopreservação.

[00343] Entre os subtipos e subpopulações de células T e/ou de células T CD4+ e/ou de células T CD8+ estão células T naïve T (T N ), células T efetoras (T E F F ), células T de memó- ria e subtipos das mesmas, tal como células T -tronco de memória (T S C M ), células T de memória central T (T C M ), célu- las T de memória efetora (T E M ), ou células T de memória efe- tora diferenciadas terminalmente, li nfócitos infiltrantes de tumor (TIL), células T imaturas, células T maduras, células T auxiliares, células T citotóxicas, células T invariantes asso- ciada à mucosa (MAIT), células T reguladoras de ocorrência natural e adaptativas (Treg), células T auxiliare s, tal como células TH1, células TH2, células TH3, células TH17, células TH9, células TH22, células T auxiliares foliculares, células T alfa/beta, e células T delta/gama. Em algumas modalidades, a célula é uma célula T reguladora (Treg). Em algumas mo- dalidades, a células compreende ainda uma FOXP3 recombi- nante ou variante da mesma.

[00344] Em algumas modalidades, as células são células exterminadoras naturais (NK). Em algumas modalidades, as células são monócitos ou granulócitos, por exemplo, células mieloides, macrófagos, neutrófilos, células dendríticas, mas-

tóscitos, eosinófeilos, e/ou basófilos.

[00345] Em algumas modalidades, a preparação das células geneticamente modificadas inclui uma ou mais etapas de cul- tura e/ou preparação. As células para manipulação genética podem ser isoladas de uma amostra, tal como uma amostra biológica, por exemplo, uma amostra obtida ou derivada de um indivíduo. Em algumas modalidades, o indivíduo do qual a célula é isolada é um indivíduo tendo uma doença ou con- dição ou com necessidade de uma terapia celular ou a quem a terapia celular será administrada. O indivíduo em algumas modalidades é um ser humano com necessidade de uma in- tervenção terapêutica particular, tal como a terapia celular adotiva para a qual as células estão isoladas, processa das, e/ou geneticamente modificadas.

[00346] Por conseguinte, as células em algumas modalida- des são células primárias, por exemplo, células primárias humanas. As amostras incluem amostras de tecido, fluido, e outras amostras coletadas diretamente do indivíduo, as sim como amostras resultantes de uma ou mais etapas de pro- cessamento, tal como separação, centrifugação, manipula- ção genética (por exemplo, transdução com vetor viral), la- vagem, e/ou incubação. A amostra biológica pode ser uma amostra obtida diretamente de uma fonte biológica ou uma amostra que é processada, amostras biológicas incluem, po- rém sem limitação, fluidos corporais, tal como amostras de sangue, plasma, sero, fluido cerebroespinhal, fluiro sinovial, urina e suor, tecido e orgãos, ncluindo amostras processadas derivadas destas.

[00347] Em alguns aspectos, a amostra da qual as células são derivadas ou isoladas é sangue ou uma amostra deriva-

da de sangue, ou é ou é derivada de um produto de aférese ou leucaférese. Amostras exemplificativas incluem sangue total, células mononucleares de sangue periférico (PBMCs), leucócitos, medula óssea, timo, biopsia de tecido, tumor, leucemia, linfoma, linfonodo, tecido linfoide associado ao in- testino, tecido linfoide associado à mucosa, baço, ou outros tecidos linfoides, fígado, pulmão, estômago, intestino, cólon, rim, pâncreas, mama, osso, próstata, cérvice, testículos, ovários, amídala, ou outro órgão, e/ou células derivadas dos mesmos. As amostras incluem, no contexto de terapia celu- lar, por exemplo, terapia celular adotiva , amostras de fontes autólogas e alogênicas.

[00348] Em algumas modalidades, as células são derivadas de linhagens de células, por exemplo, linhagens de células T. As células em algumas modalidades são obtidas de uma fonte xenogênica, por exemplo, de camundongo, rato, prima- ta não humano, ou porco.

[00349] Em algumas modalidades, isolamento das células inclui uma ou mais etapas de preparação e/ou de separação de células não baseada na afinidade. Em alguns exemplos, as células são lavadas, centrifugadas, e/ou incubadas na presença de um ou mais reagentes, por exemplo, para remo- ver componentes indesejados, enriquecer para componentes desejados, lisar ou remover células sensíveis a reagentes particulares. Em alguns exemplos, as células são separadas com base em uma ou mais propriedades, tal como densida- de, propriedades aderentes, tamanho, sensibilidade e/ou re- sistência a componentes particulares.

[00350] Em alguns exemplos, células do sangue circulante de um indivíduo são obtidas, por exemplo, por aférese ou leucaférese. As amostras, em alguns aspectos, contêm linfó- citos, incluindo células T, monócitos, granulócitos, células B, outras células sanguíneas brancas nucleadas, células san- guíneas vermelhas, e/ou plaquetas, e em alguns aspectos contêm células diferentes das células sanguíneas vermelhas e plaquetas.

[00351] Em algumas modalidades, as células sanguíneas coletadas do indivíduo são lavadas, por exemplo, para remo- ver a fração de plasma e colocar as células em um tampão ou meio apropriado para etapas de processametno subse- quentes. Em algumas modalidades, as células são lavadas com solução salina tamponada com fosfato (PBS). Em algu- mas modalidades, a solução de lavagem não possui cátios de cálcio e/ou de magnésio e/ou muitos ou todos os cátions divalentes. Em alguns aspectos, uma etapa de lavagem é re- alizada em uma centrífuga “flow-through” semi-automática (por exemplo, o processador de células Cobe 2991, Baxter) de acordo com as instruções do fabricante. Em alguns as- pectos, uma etapa de lavagem é realizada por filtração tan- gencial (TFF) de acordo com as instruções do fabricante. Em algumas modalidades, as células são ressuspendidas em uma variedade de tampões biocompatíveis depois da lava- gem, tal como, por exemplo, PBS livre de Ca + + /Mg + + . Em cer- tas modalidades, os componentes de uma amostra de células do sangue são removidos e as células são diretamente res- suspendidas no meio de cultura.

[00352] Em algumas modalidades, os métodos de prepara- ção incluem etapas de congelamento, por exemplo, criopre- servação, das células, antes ou depois de isolamento, sele- ção e/ou enriquecimento e/ou incuba ção para transdução e manipulação genética. Em algumas modalidades, a etapa de congelamento e a etapa de descongelamento subsequente removem os granulócitos e, até certo ponto, os monócitos na população de células. Em algumas modalidades, as células são suspendidas em uma solução de congelamento, por exemplo, subsequente a uma etapa de lavagem para remover o plasma e as plaquetas. Qualquer uma de uma variedade de soluções e parâmetros de congelamento em alguns aspectos pode ser usada. Um exemplo envolve o u so de PBS contendo 20% de DMSO de 8% de albumina sérica humana (HSA), ou outro meio de congelamento de células adequados. Este é então diluído 1:1 com meio de modo que a concentração final de DMSO e de HSA sejam de 10% e 4%, respectivamente. As células geralmente são então congeladas a -80° C, a uma taxa de 1° por minuto e armazenadas na fase vapor de um tanque de armazenamento de nitrogênio líquido.

[00353] Em algumas modalidades, isolamento das células ou populações inclui i uma ou mais etapas de preparação e/ou de separação de células não baseada na afinidade. Em alguns exemplos, as células são lavadas, centrifugadas, e/ou incubadas na presença de um ou mais reagentes, por exem- plo, para remover componentes indesejados, enriquecer para componentes desejados, lisar ou remover células sensíveis a reagentes particulares. Em alguns exemplos, as células são separadas com base em uma ou mais propriedades, tal como densidade, propriedades aderentes, tamanho, sensibilidade e/ou resistência a componentes particulares. Em al gumas modalidades, os métodos incluem métodos de separação de células baseados na densidade, tal como a preparação de células sanguíneas brancas de sangue periférico por lise das células sanguíneas vermelhas e centrifugaçãso através de um gradiente de Percoll ou Ficoll.

[00354] Em algumas modalidades, os métodos incluem mé- todos de separação de células baseados na densidade, tal como a preparação de células sanguíneas brancas de san- gue periférico por lise das células sanguíneas vermelhas e centrifugaçãso através de um gradiente de Percoll ou Ficoll.

[00355] Em algumas modalidades, os métodos de isolamen- to incluem a separação de diferentes tipos de células com base na expressão ou presença na célula de uma ou mais moléculas específicas, tal como marcadores superficiais, por exemplo, proteínas superficiais, marcadores intracelulares, ou ácido nucleico. Em algumas modalidades, é possível usar qualquer método conhecido para separação baseada em tais marcadores. Em algumas modalidades, a separação ocorre por separação baseada na afinidade ou na imunoafinidade. Por exemplo, o isolamento em alguns aspectos inclui sepa- ração de células e populações de células baseada na ex- pressão das células ou no nível de expressão de um ou mais marcadores, tipicamente marcadores de superfície celular , por exemplo, por incubação com um reagente de seleção, tal como um anticorpo ou parceiro de ligação que se liga especi- ficamente a tais marcadores, geralmente seguido por etapas de lavagem e separação das células que se ligaram ao anti- corpo ou parceiro de ligação, das células que não se ligaram ao anticorpo ou parceiro de ligação.

[00356] Em algumas modalidades, pelo menos uma parte da etapa de seleção inclui incubação das células com um re- agente de seleção. A incubação com um reagente ou reagen- tes de seleção, por exemplo, como parte dos métodos de se-

leção que podem ser realizados com um ou mais reagentes de seleção para seleção de um ou mais tipos diferentes de células com base na expressão ou presença na ou sobre a célula de uma ou mais moléculas específicas, tal como mar- cadores superficiais, por exemplo, proteínas superficiais, marcadores intracelulares, ou ácido nucleico. Em algumas modalidades, qualquer método conhecido que usa um rea- gente ou reagentes de seleção para separação baseada em tais marcadores pode ser usado. Em algumas modalidades, o reagente ou reagentes de seleção resultam em uma separa- ção que é uma separação baseada na afinidade ou na imu- noafinidade. Por exemplo, a seleção em alguns aspectos in- clui incubação com um reagente ou reagentes para separ a- ção de células e populações de células com base na expres- são das células ou o no nível de expressão de um ou mais marcadores, tipicamente marcadores de superfície celular, por exemplo, por incubação com um um anticorpo ou parcei- ro de ligação que se liga e specificamente a tais marcadores, geralmente seguido por etapas de lavagem e separação das células que se ligaram ao anticorpo ou parceiro de ligação, das células que não se ligaram ao anticorpo ou parceiro de ligação. Em algumas modalidades, a seleção e/ou outros as- pectos do processo são como descrito na Publicação de Pe- dido de Patente Internacional Número W O/2015/164675.

[00357] Em alguns aspectos de tais processos, um volume de células é misturado com uma quantidade de um reagente de seleção baseada na afinidade desejado. A seleção base- ada na imunoafinidade pode ser realizada usando qualquer sistema ou método que resulte em uma interação energética fovorável entre as células sendo separada e a molécula li-

gando-se especificamente ao marcador na célula, por exem- plo, o anticorpo ou outro parceiro de ligação na superfície sólida, por exemplo, partícula. Em algumas modalidades, os métodos são realizados usando partículas tais como contas, por exemplo, contas magnéticas, que são revestidas com um agente de seleção (por exemplo, anticorpo) específico para o marcador das células. As partículas (por exemplo, contas) podem ser incubadas ou misturadas com células em um reci- piente, tal como um tubo ou bolsa, com agitação ou mistura- ção, com uma relação constante densidade celul ar para par- tícula (por exemplo, conta) para auxiliar na promoção de in- terações energeticamente favorecidas. Em outros casos, os métodos incluem a seleção de células nas quais toda ou par- te da seleção é realizada na cavidade interna de uma câmara centrífuga, por exemplo, em rotação centrífuga. Em algumas modalidades, a incubação das células com reagentes de se- leção, tal como reagentes de seleção baseada na imunoafi- nidade, é efetuada em uma câmara centrífuga. Em certas modalidades, o isolamento ou separação é realizado usando um sistema, dispositivo ou aparelho descrito no Pedido de Patente Internacional, Publicação Número W O2009/072003, ou US 20110003380 A1. Em um exemplo, o sistema é um sistema descrito na Publicação Internacional Número W O2016/073602.

[00358] Em algumas modalidades, ao conduzir tais etapas de seleção ou partes destas (por exemplo, incubação partí- culas revestidas com anticorpo, por exemplo, contas magné- ticas) na cavidade de uma câmara centrífuga, o usuário con- segue controlar certos parâmetros, tal co mo volume de vá- rias soluções, adição de solução durante o processamento e cronometram do mesmo, o pode oferecer vantagens em rela- ção a outros métodos disponíveis. Por exemplo, a capacida- de de reduzir o volume de líquido na cavidade durante a in- cubação pode aumentar a concentração das partículas (por exemplo, reagente de contas) usadas na seleção, e assim o potencial químico da solução, sem afetar o número total de células na cavidade. Isto, por sua vez, pode aumentar as in- terações pareadas entre as células sendo processadas e as partículas usadas para seleção. Em algumas modalidades, a realização da etapa de incubação na câmara, por exemplo, quando associada aos sistemas, conjunto de circuitos, e con- trole descritos neste pedido, permite que usuário efetue a agitação da solução em instantes desejados durante a incu- bação, o que também melhora a interação.

[00359] Em algumas modalidades, pelo menos uma parte da etapa de seleçãao é realizada em uma câmara centrífuga, que inclui incubação das células com um reagente de se le- ção. Em alguns aspectos de tais processos, um volume de células é misturado com uma quantidade de reagente de se- leção baseada na afinidade desejado que é muito menor que aquela normalmente empregada ao se realizar seleções simi- lares em um tubo ou recipie nte para seleção do mesmo nú- mero de células e/ou volume de células de acordo com as instruções do fabricante. Em algumas modalidades, uma quantidade de reagente ou reagentes de seleção é de não mais que 5%, não mais que 10%, não mais que 15%, não mais que 20%, não mais que 25%, não mais que 50%, não mais que 60%, não mais que 70% ou não mais que 80% da quantidade empregada do mesmo reagente de seleção em- pregado para seleção de células em uma incubação em um tubo ou recipiente para o mesmo número de células e/ou o mesmo volume de células de acordo com as instruções do fabricante.

[00360] Em algumas modalidades, para seleção, por exem- plo, seleção das células baseada na imunoafinidade, as célu- las são incubadas na cavidade da câmara em uma composi- ção que também contém o tampão de seleção com o rea- gente de seleção, tal como uma molécula que se liga especi- ficamente a um marcador superficial em uma célula que se deseja enriquecer e/ou depletar, mas não em outras células na composição, tal como um anticorpo, que é opcionalme nte acoplado a um arcabouço tal como um polímero ou superfí- cie, por exemplo, conta, por exemplo, conta magnética, tal como contas magnéticas acopladas a anticorpos monoclonais específicos para CD4 e CD8. Em algumas modalidades, co- mo descrito, o reagente de seleção é adicionado às células na cavidade da câmara em uma quantidade é substancial- mente menor (por exemplo, que é não mais que 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70% ou 80% da quantidade) que a quantidade do reagente de seleção que é tipicamente usa- da ou que seria necessária para obter aproximadamente a mesma eficiência ou eficiência similar de seleção do mesmo número de células ou do mesmo volume de células quando a seleção é realizada em tubo com agitação ou rotação. Em algumas modalidades, a incubação é realizada com a adição de um tampão de seleção às células e um reagente de sele- ção para obter um volume alvo com incubação do reagente de, por exemplo, 10 mL a 200 mL, tal como pelo menos ou cerca de pelo menos ou cerca de ou 10 mL, 20 mL, 30 mL, 40 mL, 50 mL, 60 mL, 70 mL, 80 mL, 90 mL, 100 mL, 150 mL ou 200 mL. Em algumas modalidades, o tampão de seleção e o reagente de seleção são pré -misturados antes de serem adicionados às células. Em algumas modalidades, o tampão de seleção e o reagente de seleção são separadamente adi- cionados às células. Em algumas modalidades, a incubação de seleção é realizada em condição de misturação leve e pe- riódica, o que pode auxiliar na promoção de interações ener- geticamente favorecidas e assim permitir o uso de menos re- agente de seleção obtendo ao mesmo tempo uma alta efici- ência de seleção.

[00361] Em algumas modalidades, a duração total da incu- bação com o reagente de seleção é de ou de cerca de 5 mi- nutos a 6 horas, tal como 30 minutos a 3 horas, por exemplo, pelo menos ou cerca de pelo menos 30 minutos, 60 minutos, 120 minutos ou 180 minutos.

[00362] Em algumas modalidades, a incubação geralmente é realizada em condições de misturação, tal como na pre- sença de rotação, geralmente em força ou velocidade relati- vamente baixa, tal como uma vel ocidade mais baixa que aquela usada para pelotizar as células, tal como de ou de cerca de 600 rpm a 1700 rpm (por exemplo, a ou cerca de ou om 600 rpm, 1000 rpm, ou 1500 rpm ou 1700 rpm), tal como a uma RCF na amostra ou na parede da câmara ou em outro recipiente de ou de cerca de 80g a 100g (por exemplo, a ou cerca de ou pelo menos 80 g, 85 g, 90 g, 95 g, ou 100 g). Em algumas modalidades, a rotação é realizada em intervalos repetidos de uma volta em tal velocidade baixa seguido de um período de repouso, tal como uma volta e/ou repouso por 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, ou 10 segundos, tal como uma volta em aproximadamente 1 ou 2 segundos seguido por um re-

pouso por aproximadamente 5, 6, 7, ou 8 segundos.

[00363] Em algumas modalidades, tal processo é realizado dentro do sistema completamente fechado ao qual a câmara é integrada. Em algumas modalidades, este processo (e em alguns aspectos também uma ou mais etapas adicionais, tal como uma etapa de lavagem prévia lavando uma amostra contendo as células, tal como uma amostra de aférese) é re- alizado de forma automatizada, para que as células, o rea- gente, e outros componentes sejam forçados para dentro e para fora da câmara em instantes apropriados e a centrifu- gação seja efetuada, de modo a terminar a etapa de lavagem e ligação em um único sistema fechado usando um programa automatizado.

[00364] Em algumas modalidades, depois da incubação e/ou misturação das células e seleção do reagente e/ou rea- gentes, as células incubadas são submetidas a uma separa- ção para selecionar células com b ae na presença ou ausên- cia do reagente ou reagentes particulares. Em algumas mo- dalidades, a separação é efetuada no mesmo sistema fecha- do no qual fora realizada a incubação das células com o rea- gente de seleção. Em algumas modalidades, depois de incu- bação com os reagentes de seleção, as células incubadas, incluindo as células às quais o reagente de seleção se liga- ra, são transferidas para um sistema para separação das cé- lulas com base na imunoafinidade. Em algumas modalidades, o sistema para separação basea da na imunoafinidade é ou contém uma coluna de separação magnética.

[00365] Tais etapas de separação podem basear -se em se- paração positiva, em que as células que se ligaram aos rea- gentes ficam retidas para uso posterior, e/ou seleção negati-

va, em que as células que não se ligaram ao anticorpo ou ao parceiro de ligação ficam retidas. Em alguns exemplos, as duas frações ficam retidas para uso posterior. Em alguns as- pectos, a seleção negativa pode ser particularmente útil on- de não há anticorpo disponível que identif ique especifica- mente um tipo de célula em uma população heterogênea, de modo que a separação é realizada melhor com base nos marcadores expressos por células que não a população de- sejada.

[00366] Em algumas modalidades, as etapas processuais incluem ainda seleção negativa e/ou positiva das células in- cubadas, tal como usando um sistema ou aparelho que possa efetuar uma seleção baseada na afinidade. Em algumas mo- dalidades, o isolamento é realizado por enriquecimento para uma população de células particular por seleçã o positiva, ou depleção de uma população de células particular, por sele- ção negativa. Em algumas modalidades, a seleção positiva ou negativa é realizada por incubação das células com um ou mais anticorpos ou outro agente de ligação que se liga especificamente a um ou mais marcadores superficiais ex- pressos (marcador+) em um nível relativamente mais alto (marcador a l t o ) nas células positiva ou negativamente selecio- nadas, respectivamente.

[00367] A separação não precisa resultar em 100% de enri- quecimento ou remoção de uma população de células parti- cular ou das células expressando um marcador particular. Por exemplo, seleção positiva ou enriquecimento para célu- las de um tipo particular, tal como aquelas expressando um marcador, refere-se a aumentar o número ou a percenta gem de tais células, mas não precisa resultar em uma ausência completa de células que não expressam o marcador. Da mesma forma, seleção negativa, remoção, ou depleção de células de um tipo particular, tal como aquelas expressando um marcador, refere-se a reduzir o número ou a percenta- gem de tais células, mas não precisa resultar em uma em uma remoção completa de tais células.

[00368] Em alguns exemplos, são realizadas múltiplas ro- dadas das etapas de separação, onde a fração positiva ou negativamente selecionada pro veniente de uma etapa é submetida a uma outra etapa de separação, tal como uma seleção positiva ou negativa subsequente. Em alguns exem- plos, uma única etapa de separação pode depletar células expressando múltiplos marcadores simultaneamente, tal co- mo por incubação das células com uma pluralidade de anti- corpos ou parceiros de ligação, cada um deles específico pa- ra um marcador direcionado para seleção negativa. Da mes- ma forma, múltiplos tipos de células podem ser simultanea- mente selecionados positivamente por incubação das células com uma pluralidade de anticorpos ou parceiros de ligação expressos nos vários tipos de células.

[00369] Por exemplo, em alguns aspectos, subpopulações específicas de células T, tais como células positivas ou ex- pressando níveis altos de um o u mais marcadores superfici- ais, por exemplo, células T CD28 , CD62L , CCR7 , CD27 , CD127 , CD4 , CD8 , CD45RA , e/ou CD45RO + , são isoladas por técnicas de seleção positiva ou negativa. Em algumas moda- lidades, tais células são selecionadas incubação com um ou mais anticorpos ou parceiros de ligação que se ligam especi- ficamente a tais marcadores. Em algumas modalidades, o anticorpo ou parceiro de ligação pode ser conjugado, tal co-

mo diretamente ou indiretamente, a um suporte sólido ou ma- triz para efetuar a seleção, tal como uma conta magnética ou uma conta paramagnética.

[00370] Em algumas modalidades, o isolamento é realizado por enriquecimento para uma população de células particular por seleção positiva, ou depleção de uma população de célu- las particular, por seleção nega tiva. Em algumas modalida- des, a por seleção positiva ou negativa é realizada por incu- bação das células com um ou mais anticorpos ou outros agentes de ligação que se ligam especificamente a um ou mais marcadores superficiais expressos ou expressos (mar- cador + ) em um nível relativamente mais alto (marcador a l t o ) nas células positivamente ou negativamente selecionadas, respectivamente.

[00371] Em algumas modalidades, as células T são separa- das de uma amostra de PBMC por seleção negativa de mar- cadores expressos em células não T, tal como células B, monócitos, ou outras células sanguíneas brancas, tal como CD14. Em alguns aspectos, uma etapa de seleção CD4 + ou CD8 + é usada para separar células T auxiliares CD4 + e célu- las T citotóxicas CD8 + . Tais populações CD4 + e CD8 + podem ser ainda classificadas em subpopulações por seleção positi- va ou negativa de marcadores expressos ou expressos em um grau relativamente mais alto em uma ou mais subpopula- ções de células T naives, de memória, e/ou efetora.

[00372] Em algumas modalidades, as célul as CD8 + são ain- da enriquecidas para ou depletadas de células naïve, de memória central, de memória efetora, e/ou células -tronco de memória central, tal como por seleção positiva ou negativa baseada nos antígenos superficiais associados à respectiva subpopulação. Em algumas modalidades, o enriquecimento para células T de memória central (T C M ) é realizado para aumentar a eficácia, tal como melhorar a sobrevivência de longo prazo, a expansão, e/ou a implantação subsequente à administração, o que em alguns aspe ctos é particularmente robusto em tais subpopulações. Vide Terakura et al. (2012) Blood,1:72–82; W ang et al. (2012) J Immunother. 35(9):689-

701. Em algumas modalidades, combinar células T CD8+ en- riquecidas para T C M e células T CD4+ enriquecidas para T C M aumenta ainda mais a eficácia.

[00373] Nas modalidades, células T de memória estão pre- sentes nos dois subconjuntos CD62L + e CD62L - de linfócitos CD8 + do sangue periférico. PBMC pode ser enriquecido para ou depletado de frações CD62L - CD8 + e/ou CD62L + CD8 + , tal como usando anticorpos anti-CD8 e anti-CD62L.

[00374] Em algumas modalidades, o enriquecimento para células T de memória central (T C M ) baseia-se na expressão superficial positiva ou alta de CD45RO, CD62L, CCR7, CD28, CD3, e/ou CD 127; em alguns aspectos, ele baseia -se na seleção negativa para células expressando ou expressan- do altamente CD45RA e/ou granzima B. Em alguns aspectos, o isolamento de uma população CD8 + enriquecida para célu- las T C M é realizado por depleção das células expressando CD4, CD14, CD45RA, e seleção positiva ou enriquecimento para células expressando CD62L. Em um aspecto, o enrique- cimento para células T de memória central (T C M ) é realizado partindo de uma fração negativa de células selecionadas com base na expressão de CD4, que é submetida a uma se- leção negativa baseada na expressão de CD14 e CD45RA, e uma seleção positiva baseada em CD62L. Tais seleções em alguns aspectos são realizadas simultaneamente e em outros aspectos são realizadas sequencialmente, em qualquer or- dem. Em alguns aspectos, a mesma etapa de seleção base- ada em CD4 usada na preparação da população ou subpopu- lação de células CD8 + também é usada para gerar a popul a- ção ou subpopulação de células CD4 + , para que ambas as frações positiva e negativa resultantes da separação basea- da em CD4 fiquem retidas e sejam usadas em etapas subse- quentes dos métodos, opcionalmente depois de uma ou mais etapas adicionais de seleção positiva ou negativa.

[00375] Em um exemplo particular, uma amostra de PBMCs ou uma amostra de outra célula sanguínea branca é subme- tida à seleção de células CD4+, em que tanto a fração nega- tiva quanto a fração positiva ficam retidas. A fração negativa é então submetida à seleção negativa baseada na expressão de CD14 e CD45RA ou ROR1, e seleção positiva baseada em um marcador característico de células T de memória cen- tral, tal como CD62L or CCR7, onde tanto a seleção positiva quanto a seleção negativa são realizadas em qualquer or- dem.

[00376] As células T auxiliares CD4 + são classificadas em células naïve, de memória central, e de memória efetora por identificação das populações de células que possuem antí- genos de superfície celular. Linfócitos CD4 + podem ser obti- dos por métodos tradicionais. Em algumas modalidades, os linfócitos T CD4 + naïve são células T CD45RO - , CD45RA , CD62L , CD4+. Em algumas modalidades, células CD4+ de memória central são CD62L + e CD45RO + . Em algumas moda- lidades, as células CD4+ efetoras são CD62L - e CD45RO - .

[00377] Em um exemplo, para enriquecimento para células

CD4+ por seleção negativa, um coquetel de anticorpos mo- noclonais inclui tipicamente anticorpos para CD14, CD20, CD11b, CD16, HLA-DR, e CD8. Em algumas modalidades, o anticorpo ou parceiro de ligação é ligado a um suporte sólido ou matriz, tal como uma conta magnética ou uma conta pa- ramagnética, para permitir a separação de células para sele- ção positiva e/ou negativa. Por exemplo, em algumas moda- lidades, as células e populações de células são separadas ou isoladas por meio de técnicas de separação imunomagné- tica (ou afinidademagnética) (recapituladas em Methods in Molecular Medicine, vol. 58: Metastasis Research Protocols, Vol. 2: Cell Behavior In vitro and In vivo, p 17-25 Edited by: S. A. Brooks and U. Schumacher © Humana Press Inc., To- towa, NJ).

[00378] Em alguns aspectos, a amostra ou composição de células a ser separada é incubada com um reagente de sele- ção, tal como contendo material pequeno, magnetizável ou magneticamente responsivo, tal como partículas ou micropar- tículasmagneticamente responsivas, tal como contas para- magnéticas (por exemplo, tal como contas Dynalbeads ou MACS). O materialmagneticamente responsivo, por exemplo, partícula, geralmente é direta ou indiretamente peso a um parceiro de ligação, por exemplo, um anticorpo, que se liga especificamente a uma molécula, por exemplo, marcador su- perficial, presente na células, células, ou população de célu- las que se deseja separar, por exemplo, que se desejada se- lecionar negativamente ou positivamente.

[00379] Em algumas modalidades, a partícula ou conta magnética compreende um material magneticamente respon- sivo ligado a um membro de ligação específico, tal como um anticorpo ou outro parceiro de ligação. Existem muitos mate- riais magneticamente responsivos bastante conhecidos usa- dos em métodos de separação magnética. Partículas magné- ticas adequadas incluem aquelas descritas em Molday, Pa- tente US N° 4,452,773, e no Relatório Descritivo da Patente Europeia EP 452342 B, que estão aqui incorporados a título de referência. Partículas de tamanho coloidal, tal como aquelas descritas em Owen Patente US N° 4,795,698, e Li- berti et al., Patente US N° 5,200,084 são outros exemplos.

[00380] A incubação geralmente é realizada em condições nas quais os anticorpos ou parceiros de ligação, ou molécu- las, tal como anticorpos secundários ou outros reagentes, que se ligam especificamente a tais anticorpos ou parceiros de ligação, que são presos à partícula ou conta magnética, se ligam especificamente a moléculas de superfície celular se presentes nas células da amostra.

[00381] Em alguns aspectos, a amostra é colocada em um campo magnético, e as células tendo partículas magnetica- mente responsivas ou magnetizáveis presas às mesmas se- rão atraídas pelo magneto e separadas das células não mar- cadas. Para seleção positiva, as células que são atraídas pe- lo magneto ficam retidas; para seleção negativa, as células que não são atraídas (células não marcadas) ficam retidas. Em alguns aspectos, uma combinação de seleção positiva e negativa é feita durante a mesma etap a de seleção, onde a fração positiva e a fração negativa ficam retidas e são poste- riormente processadas ou submetidas a etapas de separação adicionais.

[00382] Em certas modalidades, as partículas magnetica- mente responsivas são aplicadas sobre anticorpos primários ou outros parceiros de ligação, anticorpos secundários, lecti- nas, enzimas, ou estreptavidina. Em certas modalidades, as partículas magnéticas são presas às células por meio de uma camada de anticorpos primários específicos para um ou mais marcadores. Em certas modalidades, as células, e não as contas, são marcadas com um anticorpo primário ou par- ceiro de ligação, e então partículas magnéticas revestidas com anticorpo secundário específico para o tipo célula ou outro parceiro de ligação (por exemplo, estrep tavidina)- são adicionadas. Em certas modalidades, partículas magnéticas revestidas com estreptavidina são usadas junto com anticor- pos primários ou secundários biotinilados.

[00383] Em algumas modalidades, as partículas magneti- camente responsivas são deixadas presas às células que são subsequentemente incubadas, cultivas e/ou geneticamente modificadas; em alguns aspectos, as partículas são deixadas presas às células para administração a um paciente. Em al- gumas modalidades, as partículas magnetizáveis ou magne- ticamente responsivas são removidas das células. Métodos para remoção de partículas magnetizáveis de células são conhecidos e incluem, por exemplo, o uso de anticorpos não marcados competitivos, de partículas magnetizáveis ou de anticorpos conjugados a ligantes cliváveis, etc. Em algumas modalidades, as partículas magnetizáveis são biodegradá- veis.

[00384] Em alguns aspectos, a separação é obtida em um procedimento no qual a amostra é colocada em um campo magnético, e as células tendo partículas magneticamente responsivas ou magnetizáveis presas às mesmas serão atra- ídas pelo magneto e separadas das células não marcadas.

Para seleção positiva, as células que são atraídas pelo mag- neto ficam retidas; para seleção negativa, as células que não são atraídas (células não marcada s) ficam retidas. Em al- guns aspectos, uma combinação de seleção positiva e nega- tiva é feita durante a mesma etapa de seleção, onde a fração positiva e a fração negativa ficam retidas e são posterior- mente processadas ou submetidas a etapas de separação adicionais.

[00385] Em algumas modalidades, a seleção baseada na afinidade é feita por classificação de células ativadas mag- neticamente (MACS) (Miltenyi Biotec, Auburn, CA). Os sis- temas de classificação de células ativadas magneticamente (MACS) são capazes de seleção de alta pureza de células tendo partículas magnetizadas presas às mesmas. Em certas modalidades, o MACS opera em um modo no qual as espé- cies não alvo e as espécies alvo são sequencialmente eluí- das depois da aplicação do campo magnético externo. Isto é, as células presas às partículas magnetizadas são mantidas no lugar enquanto que as espécies não presas são eluídas. Em seguida, depois de terminada esta primeira etapa de eluição, as espécies que ficaram aprisionadas no campo magnético e foram impedidas de s erem eluídas são liberadas de alguma forma para que possam ser eluídas e recupera- das. Em certos aspectos, as células não alvo são marcadas e depletadas da população heteróloga de células.

[00386] Em certas modalidades, o isolamento ou separação é realizada com a ajuda de um sistema, dispositivo, ou apa- relho que realiza uma ou mais das etapas de isolamento, preparação de células, separação, processamento, incuba- ção, cultura, e/ou formulação dos métodos. Em alguns as-

pectos, o sistema é usado para realizar cada uma dessas etapas em um ambiente fechado ou estéril, por exemplo, pa- ra minimizar erros, manipulação pelo usuário e/ou contami- nação. Em um exemplo, o sistema é um sistema descrito na Publicação PCT Internacional N° W O2009/072003, or US 20110003380 A1.

[00387] Em algumas modalidades, o sistema ou aparelho realiza uma ou mais mais, por exemplo, todas, das etapas de isolamento, processamento, manipulação genética, e formu- lação em um sistema integrado ou auto -contido, e/ou de for- ma automatizada ou programável. Em alguns aspe ctos, o sis- tema ou aparelho inclui um computador e/ou programa de computador em comunicação com o sistema ou aparelho, o que permite ao usuário programar, controlar, avaliar o desfe- cho, e/ou ajustar vários aspectos das etapas de processa- mento, isolamento, manipulação genética, e formulação.

[00388] Em alguns aspectos, a separaçãoa e/ou outras eta- pas são realizadas com a ajuda do sistema CliniMACS (Mil- tenyi Biotec), por exemplo, para separação automatizada de células em um nível de escala clínica em um sistema fecha- do e estéril. Os componentes podem inlcuir um microcompu- tador integrado, uma unidade de separação magnética, uma bomba peristáltica, e várias válvulas retentoras (“pinch val- ves”). O computador integrado em alguns aspectos controla todos os componentes do instrumento e direciona o sistema para executar procedimentos repetidos em uma sequência padronizada. A unidade de separação magnética em alguns aspectos inclui um magneto permanente móvel e um suporte para a coluna de seleção. A bomba peristáltica controla a ta- xa de fluxo em toda a tubulação e, junto com as válvulas re-

tentoras, garante o fluxo controle de tampão através do sis- tema e suspensão contínua das células.

[00389] O sistema CliniMACS em alguns aspectos utiliza partículas magnetiáveis acopladas a anticorpos que são apresentadas em uma solução não pirogênica estéril. Em al- gumas modalidades, depois da marcação das células com partículas magnéticas, as células são lavadas para remover o excesso de partículas. Uma bolsa com a preparação de cé- lulas é então conectada à tubulação que, por sua vez, é co- nectada a uma bolsa contendo tampão e a uma bolsa de co- leta de células. A tubulação consiste em tubos estéreis pré - montados, incluindo uma pré -coluna e uma coluna de sepa- ração, e é descartável. Depois de iniciado o prog rama de se- paração, o programa automaticamente introduz a amostra de célula na coluna de separação. As células marcadas ficam retidas dentro da coluna, ao passo que as células não mar- cadas são removidas por uma série de etapas de lavagem. Em algumas modalidades, as populações de células para uso com os métodos descritos neste pedido são não marcadas e não ficam retidas na coluna. Em algumas modalidades, as populações de células para uso nos métodos descritos neste pedido são marcadas e ficam retidas na colun a. Em algumas modalidades, as populações de células para uso nos méto- dos descritos neste pedido são eluídas da coluna depois da remoção do campo magnético, e são coletadas dentro da bolsa de coleta de células.

[00390] Em certas modalidades, a etapa de separação e/ ou outras etapas são realizadas com a ajuda do sistema Clini- MACS Prodigy (Miltenyi Biotec). O sistema CliniMACS Pro- digy em alguns aspectos é equipado com uma unidade de processamento de células que permite a lavagem e a centri- fugação automáticas das células por centrifugação. O siste- ma CliniMACS Prodigy também pode incluir uma câmera a bordo e um software de reconhecimento de imagens que de- termina o objetivo final ótimo do fracionamento celular dis- tinguindo as camadas macroscópicas do produto celular fon- te. Por exemplo, sangue periférico pode ser automaticamente separado em eritrócitos, células sanguíneas brancas e ca- madas de plasma. O sistema CliniMACS Prodigy também po- de incluir uma câmara integrada de cultivo de células que realiza protolocos de cultura d e células tais como, por exem- plo, diferenciação e expansão celular, carregamento de antí- genos, e cultura de células de longo prazo. Portas de entra- da podem possibilitar a remoção e o reabastecimento esté- reis de meios e as células podem ser monitoradas com a ajuda de um microscópio integrado. Vide, por exemplo, Kle- banoff et al. (2012) J Immunother. 35(9): 651–660, Terakura et al. (2012) Blood,1:72–82, e W ang et al. (2012) J Immu- nother. 35(9):689-701.

[00391] Em algumas modalidades, uma população de célu- las descrita neste pedido é coletada e enriquecida (ou deple- tada) via citometria de fluxo, onde células coloridas para múltiplos marcadores de superfície celular são carregadas em uma corrente fluida. Em algumas modalidades, uma po- pulação de células descrita neste pedido é coletada e enri- quecida (ou depletada) via separação em escala preparativa (FACS). Em certas modalidades, uma população de células descrita neste pedido é coletada e enriquecida (ou depleta- da) via o uso de chips de sistemas microeletromecânicas (MEMS) em combinação com um sistema de detecção base-

ado em FACS (vide, por exemplo, W O 2010/033140, Cho et al. (2010) Lab Chip 10:1567-1573; e Godin et al. (2008) J Bi- ophoton. 1(5):355–376). Nos dois casos, as células podem ser marcadas com múltiplos marcadores, possibilitando o isolamento de subconjuntos bem definidos de células T com alta pureza.

[00392] Em algumas modalidades, os anticorpos ou parcei- ros de ligação são marcados com um ou mais marcadores detectáveis, para facilitar a separação para seleção positiva e/ou negativa. Por exemplo, a separação pode ser baseada na ligação a anticorpos marcadores de forma fluorescente. Em alguns exemplos, a sepa ração de células baseada na li- gação de anticorpos ou de outros parceiros de ligação espe- cíficos para um ou mais marcadores de superfície celular é realizada em uma corrente fluida, tal como classificação de células ativadas por fluorescência (FACS), incluindo chips de sistemas de escala preparativa (FACS) e/ou sistemas mi- croeletromecânicos (MEMS), por exemplo, em combinação com um sistema de detecção por citometria de fluxo. Tais métodos permitem a seleção positiva e negativa baseada em múltiplos marcadores simultaneamente.

[00393] Em algumas modalidades, os métodos de prepara- ção incluem etapas de congelamento, por exemplo, criopre- servação, das células, seja antes ou depois de isolamento, incubação, e/ou manipulação genética. Em algumas modali- dades, a etapa de congelamento e subsequente desconge- lamento remove granulócitos e, até certo ponto, monócitos na população de células. Em algumas modalidades, as célu- las são suspendidas em uma solução de congelamento, por exemplo, seguindo-se uma etapa de lavagem para remover o plasma e as plaquetas. Qualquer um das várias soluções de congelamento e dos vários parâmetros conhecidos em alguns aspectos pode ser usado. Um exemplo envolve o uso de PBS contendo 20% de DMSO e 8% de albumina sérica humana (HSA), ou outro meio de congel amento de células adequado. Este é então diluído 1:1 com meio de modo que a concentra- ção final de DMSO e de HSA seja de 10% e 4%, respectiva- mente. As células são então congeladas a -80° C a uma taxa de 1° por minuto e armazenadas na fase vapor de um tanque de armazenamento de nitrogênio líquido.

[00394] Em algumas modalidades, células T antígeno - específicas, tal como células T CD4+ e/ou CD8+ antígeno- específicas, são obtidas por estimulação de linfócitos T naïve ou antígeno-específicos com antígeno. Por exemplo, linagens ou clones de células T antígeno -específicas podem ser gerados para antígenos de citomegalovírus por isolamen- to de células T de indivíduos infectados e estimulação das células in vitro com o mesmo antígeno. B. Ativação e estimulação de células T

[00395] Em algumas modalidades, a uma ou mais etapas de processamento incluem uma etapa de estimulação das célu- las isoladas, tal como populações de células selecionadas. A incubação pode ocorrer antes ou junto com a manipulação genética, tal como antes ou junto com a transdução de célu- las com um ácido nucleico ou vetor codificando o receptor recombinante (por exemplo, CAR). Em algumas modalidades, a estimulação resulta na ativação e/ou proliferação das célu- las, por exemplo, antes da transdução. Em algumas modali- dades, as células são incubadas em condições estimulado- ras.

[00396] Em algumas modalidades, os métodos apresenta- dos para produção de de células geneticamente modificadas incluem uma ou mais de uma etapa de cultivo, incubação, cultura, e/ou manipulação genética. Por exemplo, em algu- mas modalidades, são apresentados métodos para incubação e/ou manipulação genética das populações de células deple- tadas e composições iniciadoras de cultura. Em algumas modalidades, as populações de células são incubadas em uma composição iniciadora de cultura. A incubação e/ou a manipulação genética pode ser realizada em um vaso de cul- tura, tal como uma unidade, câmara, poço, coluna, tubo, tu- bulação, válvula, frasco, prato de cultura, bolsa, ou outro re- cipiente para cultura ou cultivo de células.

[00397] Em algumas modalidades, as células são incubadas e/ou cultivadas antes ou junto com manipulação genética. As etapas de incubação podem incluir cultura, cultivo, estimula- ção, ativação, e/ou propagação. Em algumas modalidades, as composições ou células sã o incubadas na presença de condições estimuladoras ou de um agente estimulador. Tais condições incluem aquelas desenhadas para induzir prolife- ração, expansão, ativação, e/ou sobrevivência das células na população, para mimetizar exposição a antígenos, e/ou para aprontar as células para manipulação genética, tal como pa- ra a introdução de um receptor recombinante, por exemplo, CAR.

[00398] As condições podem incluir um ou mais dentre mei- os particulares, temperatura, teor de oxigênio, teor de dióxi- do de carbono, tempo, agentes, por exemplo, nutrientes, aminoácidos, antibióticos, íons, e/ou fatores estimuladores, tais como citocinas, quimiocinas, antígenos, parceiros de li-

gação, proteínas de fusão, receptores solúveis recombinan- tes, e quaisquer outros agentes desenhado s para ativar as células.

[00399] Em algumas modalidades, as condições ou agentes estimuladores incluem um ou mais agentes, por exemplo, li- gantes, que é capaz de ativar uma região de sinalização in- tracelular de um complexo de TCR. Em alguns aspectos, o agente liga ou inicia a cascata de sinalização intracelular de TCR/CD3 em uma célula T. Tais agentes podem incluir anti- corpos, tais como aqueles específicos para um TCR, por exemplo, anti-CD3. Em algumas modalidades, as condições estimuladoras incluem um ou mais agen tes, por exemplo, li- gantes, que é capaz de estimular um receptor coestimulador, por exemplo, anti-CD28. Em algumas modalidades, tais agentes e/ou ligantes podem ser ligados a um suporte sólido tal como uma conta, e/ou uma ou mais citocinas. Opcional- mente, o método de expansão pode compreender ainda a etapa de adicionar um anticorpo anti -CD3 e/ou anti CD28 ao meio de cultura (por exemplo, a uma concentração de pelo menos cerca de 0,5 ng/ml). Em algumas modalidades, os agentes estimuladores incluem IL-2, IL-15 e/ou IL-7. Em al- guns aspectos, a concentração de IL -2 é pelo menos cerca de 10 unidades/mL. Em alguns aspectos, a concentração de IL-2 é pelo menos cerca de 50 unidades/mL, pelo menos cer- ca de 100 unidades/mL or pelo menos cerca de 200 unida- des/mL.

[00400] Em alguns aspectos, a incubação é realizada de acordo com técnicas tais como aquelas descritas na Patente US N° 6,040,177 concedida a Riddell et al., Klebanoff et al. (2012) J Immunother. 35(9): 651 –660, Terakura et al. (2012)

Blood,1:72–82, e/ou W ang et al. (2012) J Immunother. 35(9):689-701.

[00401] Em algumas modalidades, as células T são estimu- ladas por adição, à composição iniciadora de cultura, de cé- lulas alimentadoras, tais como células mononucleares de sangue periférico não divisoras (PBMC), (por exemplo, para que a população de células resultante contenha pelo menos cerca de 5, 10, 20, ou 40 ou mais células alimentadoras de PBMC para cada linfócito T na população inicial a ser expan- dida); e incubação da cultura (por exemplo, por um tempo suficiente para expandir os números de células T). Em al- guns aspectos, as células alimentadoras não divisoras po- dem compreender células alimentadoras de PBC irradiadas com radição gama. Em algumas modalidades, as PBMCs são irradiadas com raios gama na faixa de cerca de 3000 a 3600 rads para prevenir a divisão celular. Em alguns aspectos, as células alimentadoras são adicionadas ao meio de cultura antes da adição das populações de células T.

[00402] Em algumas modalidades, as células são estimula- das na presença de células expressand o antígenos, tais co- mo células expressando antígenos não divisoras. Em alguns casos, a incubação pode compreender ainda a adição de cé- lulas linfoblastoides (LCL) transformadas por EBV não divi- soras como células alimentadoras. As LCL podem ser irradi- adas com raios gama na faixa de cerca de 6000 as 10.000 rads. As células alimentadoras LCL em alguns aspectos são apresentadas em qualquer quantidade adequada, tal como uma relação de células alimentadoras LCL para linfócitos T iniciais de pelo menos cerca de 10:1.

[00403] Em algumas modalidades, pelo menos uma parte da incubação na presença de uma ou mais condições estimu- ladoras ou agentes estimuladores é realizada na cavidade interna de uma câmara centrífuga, por exemplo, em rotação centrífuga, tal como descrito na Publicação Internacional Número W O2016/073602. Em algumas modalidades, pelo menos uma parte da incubação realizada em uma câmara centrífuga inclui misturação com um reagente ou reagentes para induzir estimulação e/ou ativação. Em algumas modali- dades, células, tal como células selecionadas, são mistura- das com uma condição estimuladora ou com um agente esti- mulador na câmara centrífuga. Em alguns aspectos de tais processos, um volume de células é mistura com uma quanti- dade de uma ou mais condições estimuladoras ou de um ou mais agentes estimuladores que é muito menor que aquela normalmente empregada quando estimulações similares são realizadas em uma placa de cultura de células ou outro sis- tema.

[00404] Em algumas modalidades, o agente estimulador é adicionado às células na cavidade da câmara em uma quan- tidade é substancialmente menor (por exemplo, no máximo 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70% ou 80% da quan- tidade) que a quantidade do agente estimulador que é tipi- camente usada ou que seria necessária para atingir aproxi- madamente a mesma eficiência de seleção ou uma eficiência de seleção similar do mesmo número de células ou do mes- mo volume de células quando a seleção é efetuada sem mis- turação em uma câmara centrífuga, por exemplo, em um tubo ou bolsa com agitação ou rotaçã o periódica. Em algumas modalidades, a incubação é realizada por adição de um tam- pão de incubação às células e agente estimulador para atin-

gir um volume alvo com incubação do reagente de, por exemplo, 10 mL a 200 mL, tal como pelo menos ou cerca de pelo menos ou cerca de ou 10 mL, 20 mL, 30 mL, 40 mL, 50 mL, 60 mL, 70 mL, 80 mL, 90 mL, 100 mL, 150 mL, ou 200 mL. Em algumas modalidades, o tampão de incubação e o agente estimulador são pré-misturados antes de serem adi- cionados às células. Em algumas modalidades, o tampão de incubação e o agente estimulador são separadamente adici- onados às células. Em algumas modalidades, a incubação estimuladora é realizada com misturação suave e periódica, que pode auxiliar na promoção de interações energeticamen- te favorecidas e assim permitir o uso de mesmo agente esti- mulador e ao mesmo tempo estimulação e ativação das célu- las.

[00405] Em algumas modalidades, a incubação geralmente é realizada em condições de misturação, tal como na pre- sença de rotação, geralmente em uma força ou vel ocidade relativamente baixa, tal como uma velocidade mais baixa que aquela usada para pelotizar as células, tal como de ou de cerca de 600 rpm a 1700 rpm (por exemplo, a ou cerca de ou pelo menos 600 rpm, 1000 rpm, ou 1500 rpm ou 1700 rpm), tal como a uma RCF na amostra ou na parede da câmara ou de outro recipiente de ou de cerca de 80g a 100g (por exem- plo, a ou cerca de ou pelo menos 80 g, 85 g, 90 g, 95 g, ou 100 g). Em algumas modalidades, a rotação é realizada em intervalos repetidos de uma volta em tal velocidade baixa seguida por um período de repouso, tal como uma volta e/ou repouso de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, ou 10 segundos, tal como uma volta em aproximadamente 1 ou 2 segundos seguido por um repouso de aproximadamente 5, 6, 7, ou 8 segundos.

[00406] Em algumas modalidades, a duração total da inclu- bação, por exemplo, com o agente estimulador varia entre ou entre cerca de 1 hora e 96 horas, 1 hora e 72 horas, 1 hora e 48 horas, 4 horas e 36 horas, 8 horas e 30 horas ou 12 horas e 24 horas, tal como pelo me nos ou cerca de pelo menos 6 horas, 12 horas, 18 horas, 24 horas, 36 horas ou 72 horas. Em algumas modalidades, a incubação adicional ocorre por um período entre ou cerca de entre 1 hora e 48 horas, 4 ho- ras e 36 horas, 8 horas e 30 horas ou 12 horas e 24 h oras, inclusive.

[00407] Em modalidades particulares, as condições esti- muladoras incluem incubação, cultura e/ou cultivo das célu- las com um reagente estimulador. Em certas modalidades, o reagente estimulador contém ou inclui uma conta. Em certas modalidades, o início da estimulação corre quando as células são incubadas ou colocadas em contato com o reagente es- timulador. Em modalidades particulares, o reagente estimu- lador contém pu inclui um reagente oligomérico, por exem- plo, um oligômero estreptavidina muteína. E m modalidades particulares, o reagente estimulador ativa e/ou é capaz de ativar um ou mais domínios de sinalização intracelular de um ou mais componentes de um complexo de TCR e/ou um ou mais domínios de sinalização intracelular de uma ou mais moléculas coestimuladoras.

[00408] Em algumas modalidades, as condições estimula- doras ou os reagentes estimuladores incluem um ou mais agentes, por exemplo, que são capazes de ativar um domínio de sinalização intracelular de um complexo de TCR. Em al- gumas modalidades, um agente contemplado nesta invenção pode incluir, porém sem limitação, RNA, DNA, proteínas (por exemplo, enzimas), antígenos, anticorpos policlonais, anti- corpos monoclonais, fragmentos de anticorpo, carboidratos, lipídios, lectinas, ou qualquer outra biomolécula com uma afinidade para um alvo desejado. Em algumas modalidades, o alvo desejado é um de receptor de células T e/ou um com- ponente de um receptor de células T. Em certas modalida- des, o alvo desejado é CD3. Em certas modalidades, o alvo desejado é uma molécula coestimuladora de células T, por exemplo, CD28, CD137 (4-1-BB), OX40, ou ICOS. O um ou mais agentes podem ser presos direta ou indiretamente à conta por uma variedade de métodos conhecidos e disponí- veis na literatura. A ligação pode ser covalente, não covalen- te, eletrostática, ou hidrófoba e pode ser feita por diversos meios de ligação, incluindo, por exemplo, um meio químico, um meio mecânico, ou um meio enzimático. Em algumas mo- dalidades, o agente é um anticorpo ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo, tal como um Fab. Em algumas moda- lidades, uma biomolécula (por exemplo, um anticorpo anti- CD3 biotinilado) pode ser preso indiretamente à conta via uma outra biomolécula (por exemplo, um anticorpo anti - biotina) que é presa diretamente à conta.

[00409] Em algumas modalidades, o reagente estimulador contém um ou mais agentes (por exemplo, anticorpo) que é preso a uma conta (por exemplo, uma conta paramagnética) e se liga especificamente a uma ou mais das seguintes ma- cromoléculas em uma célula (por exemplo, uma célula T): CD2, CD3, CD4, CD5, CD8, CD25, CD27, CD28, CD29, CD31, CD44, CD45RA, CD45RO, CD54 (ICAM -1), CD127, MHCI, MHCII, CTLA-4, ICOS, PD-1, OX40, CD27L (CD70), 4 - 1BB (CD137), 4-1BBL, CD30L, LIGHT, IL-2R, IL-12R, IL-1R,

IL-15R; IFN-gamaR, TNF-alfaR, IL-4R, IL- 10R, CD18/CDl la (LFA-1), CD62L (L-selectina), CD29/CD49d (VLA-4), ligante Notch (por exemplo, Delta -like 1/4, Jagged 1/2, etc.), CCR1, CCR2, CCR3, CCR4, CCR5, CCR7, e CXCR3 ou fragmentos das mesmas incluindo os ligantes correspondentes a essas macromoléculas ou fragmentos das mesmas. Em algumas modalidades, um agente (por exemplo, anticorpo) preso à conta liga-se especificamente a uma ou mais das seguintes macromoléculas em uma célula (por exemplo, uma célula T): CD28, CD62L, CCR7, CD27, CD127, CD3, CD4, CD8, CD45RA, e/ou CD45RO.

[00410] Em algumas modalidades, um ou mais dos agentes presos à conta é um anticorpo. O anticorpo pode incluir um anticorpo policlonal ou um anticorpo monoclonal (incluindo anticorpos de comprimento integral que possuem uma região Fc de imunoglobulina), composições de anticorpos com es- pecificidade poliepitópica, anticorpos multiespecíficos (por exemplo, anticorpos biespecíficos, diacorpos, moléculas de cadeia única, assim como fragmentos de anticorpo (por exemplo, Fab, F(ab')2, e Fv). Em algumas modalidades, o reagente estimulador é um fragmento de anticorpo (incluindo fragmento de ligação de antígeno), por exemplo, um frag- mento Fab, Fab′-SH, Fv, scFv, ou (Fab′)2. Será observado que regiões constantes de qualquer isótipo podem ser us a- das para os anticorpos contemplados neste pedido, incluindo regiões constantes de IgG, IgM, IgA, IgD, e IgE, e que tais regiões constantes podem ser obtidas de qualquer espécie humana ou animal (por exemplo, espécie murina). Em algu- mas modalidades, o agente é um anticorpo que se liga a e/ou reconhece um ou mais componentes de um receptor de célu-

las T. Em modalidades particulares, o agente é um anticorpo anti-CD3. Em certas modalidades, o agente é um anticorpo que se liga a e/ou reconhece um co -receptor. Em algumas modalidades, o reagente estimulador compreende um anti- corpo anti-CD28.

[00411] Em certas modalidades, o reagente estimulador contém uma partícula, por exemplo, uma conta, que é conju- gada ou ligada a um ou mais agentes, por exemplo, biomolé- culas, que são capazes de ativar e/ou de expandir as célu- las, por exemplo, células T. Em algumas modalidades, o um ou mais agentes são ligados a uma conta. Em algumas mo- dalidades, a conta é biocompatível, i.e., composta de um ma- terial que é adequado para uso biológico. Em algumas moda- lidades, as contas são atóxicas para as células cultivadas, por exemplo, células T cultivadas. Em algumas modalidades, as contas podem ser quaisquer partículas que sejam capa- zes de prender os agentes de maneira que permita uma inte- ração entre o agente e uma célula.

[00412] Em algumas modalidades, o reagente estimulador contém uma conta e um ou mais agentes que interagem dire- tamente com uma macromolécula na superfície de uma célu- la. Em certas modalidades, a conta (por exemplo, uma conta paramagnética) interage com uma célula via um ou mais agentes (por exemplo, um anticorpo) específico para uma ou mais macromoléculas na célula (por exemplo, uma ou mais proteínas de superfície celular). Em certas modalidades, a conta (por exemplo, uma conta paramagnétic a) é marcada com um primeiro agente descrito neste pedido, tal como um anticorpo primário (por exemplo, um anticorpo anti -biotina) ou outra biomolécula, e então um segundo agente, tal como um anticorpo secundário (por exemplo, um anticorpo anti - CD3 biotinilada) ou outra segunda biomolécula (por exemplo, estreptavidina), é adicionado, e com isso o anticorpo secun- dário ou outra segunda biomolécula se liga especificamente a tais anticorpos primários ou outra biomolécula na partícula.

[00413] Em algumas modalidades, o reagente estimulador compreende um ou mais agentes que são presos a uma con- ta compreendendo um núcleo de óxido metálico (por exem- plo, um núcleo interno de óxido de ferro) e um revestimento (por exemplo, um revestimento protetor), onde o revestimen- to compreende poliestireno. Em certas modalidades, as con- tas são contas paramagnéticas monodispersas (por exemplo, superparamagnéticas) compreendendo um núcleo de ferro paramagnético (por exemplo, superparamagnético), por exemplo, um núcleo compreendendo magnetita (Fe3O4) e/ou magemita (γFe2O3) c e uma camada ou revestimento de po- liestireno. Em algumas modalidades, a conta é não porosa. Em algumas modalidades, as contas contêm uma superfície funcionalizada à qual os um ou mais agentes são presos. Em certas modalidades, os um ou mais agentes são presos co- valentemente às contas na superfície. Em algumas modali- dades, os um ou mais agentes incluem um anticorpo ou fra- gmento de ligação de antígeno do mesmo. Em algumas mo- dalidades, os um ou mais agentes incluem um anticorpo anti- CD3 e um anticorpo anti-CD28. Em algumas modalidades, os um ou mais agentes incluem um anticorpo anti -CD3 e/ou um anticorpo anti-CD28, e um anticorpo ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo capaz de se ligar a um anticorpo marcado (por exemplo, um anticorpo biotinilado), tal como um anticorpo anti-CD3 ou anti-CD28 marcado. Em certas modalidades, as contas têm uma densidade de cerca de 1,5 g/cm3 e uma área superficial de cerca de 1 m2/g a cerca de 4 m2/g. Em modalidades particulares, as contas sã o contas superparamagnéticas monodispersas que têm um diâmetro de cerca de 4,5 µm e uma densidade de cerca de 1,5 g/cm3. Em algumas modalidades, as contas são contas superpara- magnéticas monodispersas que têm um diâmetro médio de cerca de 2,8 µm e uma densidade de cerca de 1,3 g/cm3.

[00414] Em modalidades particulares, o reagente estimula- dor contém um reagente oligomérico, por exemplo, um rea- gente estreptavidina muteína, que é conjugado, ligado, ou preso a um ou mais agentes, por exemplo, que são capazes de ativar um domínio de sinalização intracelular de um com- plexo de TCR. Em algumas modalidades, os um ou mais agentes possuem um domínio de ligação ou parceiro de liga- ção preso (por exemplo, um parceiro de ligação C) que é ca- paz de se ligar ao reagente oligomérica e m um sítio de liga- ção particular (por exemplo, sítio de ligação Z). Em algumas modalidades, uma pluralidade do agente é ligada de forma reversível ao reagente oligomérico. Em várias modalidades, o reagente oligomérico tem uma pluralidade dos sítios de li- gação particulares que, em certas modalidades, são ligados de forma reversível a uma pluralidade de agentes no domínio de ligação (por exemplo, parceiro de ligação C). Em algumas modalidades, a quantidade de agentes ligados é reduzida ou diminuída na presença de um reagente competitivo, por exemplo, um reagente que também é capaz de sligar aos sí- tios de ligação particulares (por exemplo, sítio de ligação Z).

[00415] Em algumas modalidades, o reagente estimulador é ou inclui um sistema reversível no qual pelo menos u m agen-

te (por exemplo, um agente que é capaz de produzir um sinal em uma célula tal como uma célula T) é associado, por exemplo, associado de forma reversível, ao reagente oligo- mérico. Em algumas modalidades, o reagente contém uma pluralidade de sítios de ligação capazes de se ligar, por exemplo, ligar de forma reversível, ao agente. Em alguns ca- sos, o reagente é um reagente partícula oligomérica tendo pelo menos um agente preso capaz de produzir um sinal em uma célula tal como uma célula T. Em algumas moda lidades, o agente contém pelo menos um sítio de ligação, por exem- plo, um sítio de ligação B, que pode ligar especificamente um epítopo ou região da molécula e também contém um par- ceiro de ligação, também chamado, neste pedido, de parcei- ro de ligação C, que se liga especificamente a pelo menos um sítio de ligação do reagente, por exemplo, o sítio de liga- ção Z do reagente. Em algumas modalidades, a interação de ligação entre o parceiro de ligação C e o pelo menos um sítio de ligação Z é uma interação não cova lente. Em alguns ca- sos, a interação de ligação entre o parceiro de ligação C e o pelo menos um sítio de ligação Z é uma interação covalente. Em algumas modalidades, a interação de ligação, tal como tal como interação não covalente, entre o parceiro de liga ção C e o pelo menos um sítio de ligação Z é reversível.

[00416] Substâncias que podem ser usadas como reagen- tes oligoméricos em tais sistemas reversíveis são conheci- das, vide, por exemplo, as Patentes US N° 5,168,049; 5,506,121; 6,103,493; 7,776,562; 7,981,632; 8,298,782; 8,735,540; 9,023,604; e os Pedidos PCT Internacionais pu- blicados N° W O2013/124474 w W O2014/076277. Exemplos não limitativos de reagentes e parceiros de ligação capazes de formar uma interação reversível, assim como substâncias (por exemplo, reagentes competitivos) capazes de reverter tal ligação, estão descritos.

[00417] Em algumas modalidades, o reagente estimulador é um reagente de partícula oligomérica que é composto e/ou contém uma pluralidade de tetrâmetros de estreptavidina ou estreptavidina muteína. Em certas modalidades, o reagente partícula oligomérica apresentado neste pedido contém uma pluralidade de sítios de ligação que se ligam de forma rever- sível ou são capazes de se ligar de forma reversível a um ou mais agentes, por exemplo, um agente e stimulador e/ou um agente de seleção. Em algumas modalidades, a partícula oli- gomérica tem um raio, por exemplo, um raio médio, entre 80 nm e 120 nm, inclusive; um peso molecular, por exemplo, um peso molecular médio entre 7,5 x 10 6 g/mol e 2 x 10 8 g/mol, inclusive; e/ou uma quantidade, por exemplo, uma quantida- de média, entre 500 e 10.000 tetrâmeros de estreptavidina ou estreptavidina muteína, inclusive. Em algumas modalida- des, o reagente partícula oligomérica é ligado, por exemplo, ligado de forma reversível, a um ou mais agentes, tal um agente que se liga a uma molécula, por exemplo, receptora, na superfície de uma célula. Em certas modalidades, os um ou mais agentes são agentes descritos neste pedido, por exemplo, na Seção II-C-3. Em algumas modalidades, o agen- te é um Fab anti-CD3 e/ou um Fab anti-CD28, tal como um Fab que contém um parceiro de ligação, por exemplo, um peptídio de ligação de estreptavidina, por exemplo, Strep- tag® II. Em modalidades particulares, os um ou mais agentes é um Fab anti-CD3 e/ou um Fab anti CD28 contendo um par- ceiro de ligação, por exemplo, um peptídio de ligação de es-

treptavidina, por exemplo, Strep -tag® II. C. Métodos para introdução de um polinucleotídeo hete- rólogo

[00418] Em algumas modalidades, as etapas de processa- mento incluem a introdução de uma molécula de ácido nu- cleico codificando uma proteína recombinante. Vários méto- dos para introdução de componentes geneticamente modifi- cados, por exemplo, receptores recombinantes, por exemplo, CARs ou TCRs, são bastante conhecido s e podem ser usa- dos com os métodos e as composições apresentados. Méto- dos exemplificativos incluem aqueles para transferência de ácidos nucleicos codificando os polipeptídios ou receptores, incluindo via vetores virais, por exemplo, vetores retrovirais ou lentivirais vetores não virais ou transposons, por exemplo, o sistema de transposons Sleeping Beauty. Métodos para transferência de genes podem incluir transdução, eletropora- ção ou outro método que resulte na transferência de genes para a célula.

[00419] Em algumas modalidades, a transferência de genes é realizada primeiro estimulando -se a célula, tal como com- binando a mesma com um estímulo que induz uma resposta tal como proliferação, sobrevivência, e/ou ativação, por exemplo, segundo medida pela expressão de uma citocina ou de um marcador de ativação, seguido por transdução das cé- lulas ativadas, e expansão em cultura até números suficien- tes para aplicação clínica.

[00420] Em alguns contextos, pode ser desejável proteger contra o potencial de que a superexpressão de um fa tor es- timulador (por exemplo, uma linfocina ou uma citocina) pode- ria resultar potencialmente em um desfecho indesejado ou em eficácia mais baixa em um indivíduo, tal como um fator associado à toxicidade em um indivíduo. Assim sendo, em alguns contextos, as células geneticamente modificadas in- cluem segmentos de genes que fazem com que as células fiquem suscetíveis à seleção negativa in vivo, tal como me- diante administração em terapia adotiva. Por exemplo, em alguns aspectos, as células são geneticamente modi ficadas para que possam ser eliminadas como resultado de uma alte- ração na condição in vivo do paciente a quem elas são admi- nistradas. O fenótipo selecionável negativo pode resultar da inserção de um gene que confere sensibilidade a um agente administrado, por exemplo, um composto. Genes selecioná- veis negativos incluem o gene da timidina quinase do vírus do herpes simples tipo I (HSV -I TK) (W igler et al., Cell 2:223, 1977) que confere sensibilidade ao ganciclovir, o gene da hipoxantina fosforibosiltransferas e celular (HPRT), o gene da adenine fosforibosiltransferase celular (APRT), citosina dea- minase bacteriana (Mullen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 89:33 (1992)).

[00421] Em algumas modalidades, ácidos nucleicos recom- binantes são transferidos para células por meio de partículas virais infecciosas recombinantes, tais como, por exemplo, vetores derivados do vírus símio 40 (SV40), adenovírus, ví- rus adeno-associado (AAV). Em algumas modalidades, áci- dos nucleicos recombinantes são transferidos para células T por meio de vetores lentivirais ou vetores retrovirais recom- binantes, tais como vetores gama-retrovirais (vide, por exemplo, Koste et al. (2014) Gene Therapy 2014 Apr 3. doi: 10,1038/gt,2014,25; Carlens et al. (2000) Exp Hematol 28(10): 1137-46; Alonso-Camino et al. (2013) Mol Ther Nucl

Acids 2, e93; Park et al., Trends Biotechnol. 2011 November 29(11): 550–557.

[00422] Em algumas modalidades, o vetor retroviral tem uma sequência de repetição terminal longa (LTR), por exem- plo, um vetor retroviral derivado do vírus da leucemia murina de Moloney (MoMLV), vírus do sarcoma mieloproliferativo (MPSV), vírus de células-tronco embrionárias murinas (MESV), vírus de células-tronco murinas (MSCV), vírus for- mador de focos no baço (SFFV). A maioria dos vetores retro- virais é derivada de retrovírus murinos. Em algumas modali- dades, os retrovírus incluem aqueles derivados de qualquer fonte de células de aves ou de mamíferos. Os retrovírus são tipicamente anfotrópicos, o que significa que eles são capa- zes de infectar células hospedeiras de diversas espécies, in- cluindo seres humanos. Em uma modalidade, o gene a ser expresso substitui as sequências gag, pol e/ou env retrovi- rais. Inúmeros sistemas retrovira is ilustrativos já foram des- critos (por exemplo, Patentes US N° 5,219,740; 6,207,453; 5,219,740; Miller and Rosman (1989) BioTechniques 7:980 - 990; Miller, A. D. (1990) Human Gene Therapy 1:5 -14; Scar- pa et al. (1991) Virology 180:849 -852; Burns et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:8033 -8037; e Boris-Lawrie and Temin (1993) Cur. Opin. Genet. Develop. 3:102 -109).

[00423] Métodos para transdução lentiviral são conhecidos. Métodos exemplificativos estão descritos, por exemplo, em W ang et al. (2012) J. Immunother. 35(9): 689-701; Cooper et al. (2003) Blood. 101:1637–1644; Verhoeyen et al. (2009) Methods Mol Biol. 506: 97-114; e Cavalieri et al. (2003) Blo- od. 102(2): 497-505.

[00424] Em algumas modalidades, ácidos nucleicos recom-

binantes são transferidos para células T por eletroporação (vide, por exemplo, Chicaybam et al, (2013) PLoS ONE 8(3): e60298 and Van Tedeloo et al. (2000) Gene Therapy 7(16): 1431-1437). Em algumas modalidades, ácidos nucleicos re- combinantes são transferidos para células T via transposição (vide, por exemplo, Manuri et al. (2010) Hum Gene Ther 21(4): 427-437; Sharma et al. (2013) Molec Ther Nucl Acids 2, e74; e Huang et al. (2009) Methods Mol Biol 506: 115- 126). Outros métodos para introdução e expressão de mate- rial genético em células imunes incluem transfecção de fos- fato de cálcio (por exemplo, descrito em Current Protocols in Molecular Biology, John W iley & Sons, New York. N.Y.), fu- são de protoplastos, transfecção mediada por lipossomas ca- tiônicos, bombardeamento de micropartículas facilitada por partículas de tungstênio (Johnston, Nature, 346: 776 -777 (1990)); e coprecipitação de fosfato de estrôncio e DNA (Brash et al., Mol. Cell Biol., 7: 2031 -2034 (1987)).

[00425] Outras abordagens e vetores para transferência dos ácidos nucleicos codificando os produtos recombinantes são aquelas descritas, por exemplo, no pedido de patente internacional, Publicação N° W O2014055668, e na Patente US N° 7,446,190.

[00426] Em algumas modalidades, as células, por exemplo, células T, podem ser transfectadas durante ou depois da ex- pansão, por exemplo, com ácidos nucleicos codificando um receptor recombinante, por exemplo, um receptor de células T (TCR) ou um receptor de antígeno quimérico (CAR) . Esta transfecção para a introdução do gene do polipeptídio ou re- ceptor desejado pode ser realizada com qualquer vetor retro- viral adequado, por exemplo. A população de células geneti-

camente modificadas pode ser então liberada a partir do es- tímulo inicial (o estímulo CD3/CD28, por exemplo) e ser sub- sequentemente estimulada com um segundo tipo de estímulo (por exemplo, via um receptor introduzido de novo). Este se- gundo tipo de estímulo pode incluir um estímulo antigênico na forma de peptídio/molécula de MHC, o ligante (reticula- ção) cognato do receptor introduzido geneticamente (por exemplo, o ligante natural de um CAR) ou qualquer ligante (tal como um anticorpo) que se liga diretamente no esqueleto do novo receptor (por exemplo, reconhecendo regiões cons- tantes no receptor). Vide, por exemplo, Cheadle et al, “Chi- meric antigen receptors for T -cell based therapy” Methods Mol Biol. 2012; 907:645-66 ou Barrett et al., Chimeric Anti- gen Receptor Therapy for Cancer Annual Review of Medicine Vol. 65: 333-347 (2014).

[00427] Em alguns casos, é possível usar um vetor que não requeira que as células, por exemplo, células T, sejam ativa- das. Em alguns casos, as células podem ser selecionadas e/ou transduzidas antes da ativação. Assim sendo, as células podem ser geneticamente manipuladas antes ou depois do cultivo das células, e em alguns casos ao mesmo tempo ou durante pelo menos uma parte do cultivo.

[00428] Em alguns aspectos, as células são ainda geneti- camente modificadas para promover a expressão de citoci- nas ou outros fatores. Entre os ácidos nucleicos adicionais, por exemplo, genes para introdução são aqueles que melho- ram a eficácia da terapia, tal como promovendo a viabilidade e/ou função das células transferidas; genes que apresentam um marcador genético para seleção e/ou avaliação das célu- las, tal como para avaliar a sobrevivência ou localização in vivo; genes que aumentam a segurança, por exemplo, dei- xando a célula suscetível à seleção negativa in vivo como descrito por Lupton S. D. et al., Mol. and Cell Biol., 11:6 (1991); e Riddell et al., Human Gene Therapy 3:319-338 (1992); vide também as publicações do PCT/US91/08442 e do PCT/US94/05601 de Lupton et al. que descrevem o uso de genes de fusão selecionáveis bifuncionais derivados da fusão de um marcador selecionável positivo dominante com um marcador selecionável negativo. Vide, por exemplo, Rid- dell et al., Patente US N° 6,040,177, colunas 14-17.

[00429] Como descrito acima, em algumas modalidades, as células são incubadas e/ou cultivadas antes ou junto com manipulação genética. As etapas de incubação podem incluir cultura, cultivo, estimulação, ativação, propagação e/ou con- gelamento para preservação, por e xemplo, criopreservação.

[00430] Em algumas modalidades, a introdução é realizada colocando-se uma ou mais células de uma composição em contato com uma molécula de ácido nucleico codificando a proteína recombinante, por exemplo, receptor recombinante. Em algumas modalidades, o contato pode ser feito com cen- triguação, tal como espinoculação (por exemplo, inoculação centrífuga). Tais métodos incluem qualquer um daqueles descritos na Publicação Internacional Número W O2016/073602. Câmaras centrífugas exemplificativas i n- cluem aquelas produzidas e comercializadas pela Biosafe SA, incluindo aquelas para uso com o sistema Sepax® e Se- pax® 2, incluindo uma câmara centrífuga A -200/F e A-200 e vários kits para uso com tais sistemas. Câmaras, sistemas, e equipamentos e gabinetes de processamento exemplificati- vos estão descritos, por exemplo, na Patente US N°

6,123,655, Patente US N° 6,733,433 e pedido de patente US publicado, Publicação N° US 2008/0171951, e pedido de pa- tente internacional publicado, publicação n° W O 00/38762, cujas íntegras encontram-se aqui incorporadas a título de re- ferência. Kits exemplificativos para uso com tais sistemas incluem, porém sem limitação, kits descartáveis comerciali- zados pela BioSafe SA sob os nomes comerciais CS -430,1, CS-490,1, CS-600,1 ou CS-900,2.

[00431] Em algumas modalidades, o sistema é incluído e/ou assoacido a outros equipamentos, incluindo equipamentos para operar, automatizar, controlar e/ou monitorar aspectos da etapa de transdução e uma ou mais várias outras etapas de processamento realizadas no sistema, por exemplo, uma ou mais etapas de processamento que podem ser realizadas com ou junto com o sistema de câmara centrífuga descrito neste pedido ou na Publicação Internacional Número W O2016/073602. Este equipamento em algumas modalida- des está contido em um gabinete. Em algumas modalidades, o equipamento inclui um gabinete, que inclui um alojamento contendo um circuito de controle, uma centrífuga, uma tam- pa, motores, bombas, sensores, mostradores, e uma interfa- ce de usuário. Um dispositivo exem plificativo está descrita na Patente US N° 6,123,655, Patente US N° 6,733,433 e US 2008/0171951.

[00432] Em algumas modalidades, o sistema compreende uma série de recipientes, por exemplo, bolsas, tubos, tornei- ras, grampos, conectores, e uma câmara centrífuga. Em al- gumas modalidades, os recipientes, tal como bolsas, incluem um ou mais recipientes, tal como bolsas, contendo as células a serem transduzidas e as partícula de vetor viral, no mesmo recipiente ou em recipientes separados, tais como a mesma bolsa ou bolsas separadas. Em algumas modalidades, o sis- tema inclui ainda um ou mais recipientes, tal como bolsas, contendo um meio, tal como diluente e/ou solução de lava- gem, que é introduzido na câmara e/ou outros componentes para diluir, ressuspender, e/ou lavar comp onentes e/ou com- posições durante os métodos. Os recipientes podem estar conectados em uma ou mais posições no sistema, tal como em uma posiçãao correspondente a uma linha de entrada, uma linha de diluente, uma linha de lavagem, uma linha de despejo e/ou uma linha de saída.

[00433] Em algumas modalidades, a câmara está associada a uma centrífuga, que é capaz de efetuar a rotação da câma- ra, tal como em torno de seu eixo de rotação. A rotação pode ocorrer antes, durante, e/ou depois da incubação junto com a transdução das células e/ou em uma ou mais das outras eta- pas de processamento. Assim sendo, em algumas modalida- des, uma ou mais das várias etapas de processamento são realizadas com rotação, por exemplo, a uma força particular. A câmara é tipicamente capaz de rotaçã o vertical ou geral- mente vertical, para que a câmara fique na vertical durante a centrifugação e para que a parede laterial e o eixo fiquem verticais ou geralmente verticais em relação às paredes ex- tremas horizontais ou geralmente horizontais.

[00434] Em algumas modalidades, a composição contendo células, partículas virais e reagente pode ser girada, geral- mente em uma força ou velocidade relativamente baixo, tal como uma velocidade mais baixa que aquela usada para pe- lotizar as células, tal como de ou de cerca de 600 rpm a 1700 rpm (por exemplo, a ou cerca de ou pelo menos 600 rpm, 1000 rpm, ou 1500 rpm ou 1700 rpm). Em algumas mo- dalidades, a rotação é realizada em uma força, por exemplo, uma força centrífuga relativa, de ou de cerca de 100 g a 3200 g (por exemplo, a ou cerca de ou pelo menos a ou cer- ca de 100 g, 200 g, 300 g, 400 g, 500 g, 1000 g, 1500 g, 2000 g, 2500 g, 3000 g ou 3200 g), segundo medida, por exemplo, em uma parede interna ou externa da câmara ou cavidae. O termo “força centrífuga relativa” ou RCF ge ral- mente é entendido como sendo a força efetiva conferida a um objeto ou substância (tal como uma célula, amostra, ou pelota e/ou um ponto na câmara ou em outro recipiente sen- do girado), em relação à força gravitacional da terra, em ponto particular no espaço em relação ao eixo de rotação. O valor pode ser determinado por meios de fórmulas bastante conhecidas, levando em consideração a força gravitacional, a velocidade de rotação e o raio de rotação (distância do ei- xo de rotação e do objeto, substância, ou partícula onde a RCF está sendo medida).

[00435] Em algumas modalidades, durante pelo menos uma parte da manipulação genética, por exemplo, transducçãon, e/ou subsequente à manipulação genética as células são transferidas para um recipiente tal como uma bolsa para cul- tura das células geneticamente modificadas, tal como para cultivo ou expansão das células, como descrito acima. Em algumas modalidades, o recipiente para cultivo ou expansão das células é um bolsa de biorreator, tal como uma bolsa de perfusão.

1. Ácidos nucleicos e vetores

[00436] Em algumas modalidades, as células incluem um ou mais ácidos nucleicos introduzidos via manipulação gené-

tica, e assim expressam produtos recombinante ou geneti- camente modificados de tais ácidos nucleicos. Em algumas modalidades, os ácidos nucleicos são heterólogos, i.e., nor- malmente não estão presentes em uma célula ou amostra ob- tida da célula, tal como uma amostra obtida de outro orga- nismo ou célula, que, por exemplo, normalmente não é en- contrada na célula sendo geneticamente manipulada e/ou em um organismo do qual tal célula deriva. Em algumas modali- dades, os ácidos nucleicos não são de ocorrência natural, tal como um ácido nucleico não encontrado na natureza, inclu- indo um ácido nucleico compreendendo combinações quimé- ricas de ácidos nucleicos codificando vários domínions de múltiplos tipos de células diferentes.

[00437] Em algumas modalidades, os receptores recombi- nantes são codificados por um ou mais polinucleotídeos (por exemplo, moléculas de ácido nucleico). Em algumas modali- dades, as células que são usadas em terapia celular adotiva são geneticamente manipuladas por meio de vetores para manipulação genética.

[00438] Em alguns aspectos, o polinucleotídeo contém uma única sequência codificadora. Em outros casos, o polinucleo- tídeo contém pelo menos duas sequências codificadoras di- ferentes. Em alguns aspectos, o receptor recombinante é ou contém um receptor de antígeno quimérico (CAR). Em alguns aspectos, o receptor recombinante é ou contém um receptor de células T (TCR), por exemplo, um TCR transgê nico. Em algumas modalidades, os polinucleotídeos e vetores são usados para expressão do o receptor recombinante em célu- las.

[00439] Em alguns casos, a sequência de ácidos nucleicos codificando o receptor recombinante contém uma sequência sinal que codifica um polipeptídio. Em outros aspectos, a se- quência sinal pode codificar um peptídio sinal heterólogo ou não nativo, tal como o peptídio sinal exemplificativo da ca- deia alfa GMCSFR apresentado na SEQ ID NO: 25 e codifi- cado pela sequência de nucleotídeos apresentada na SEQ ID NO:24. Em alguns casos, a sequência de ácidos nucleicos codificando o receptor recombinante, por exemplo, receptor de antígeno quimérico (CAR) contém uma sequência sinal que codifica um peptídio sinal. Exemplos não limitativos de peptídios sinal incluem, por exemplo, o peptídio sinal da ca- deia alfa GMCSFR apresentado na SEQ ID NO: 25 e codifi- cado pela sequência de nucleotídeos apresentada na SEQ ID NO:24, ou o peptídio sinal alfa CD8 apresentado na SEQ ID NO:26.

[00440] Em algumas modalidades, o polinucl eotídeo codifi- cando o receptor recombinante contém pelo menos um pro- motor que é operacionalmente ligado para controlar a ex- pressão do receptor recombinante. Em alguns exemplos, o polinucleotídeo contém dois, três, ou mais promotores ope- racionalmente ligados para controlar a expressão do receptor recombinante.

[00441] Em certos casos nos quais moléculas de ácido nu- cleico codificam duas ou mais cadeias polipeptídicas diferen- tes, cada uma das cadeias polipeptídicas pode ser codificada por uma molécula de ácido nuclei co separada. Por exemplo, são apresentados dois ácidos nucleicos separados, e cada um pode ser individualmente transferido ou introduzido na célula para expressão na célula.

[00442] Em algumas modalidades, tal como aquelas nas quais o polinucleotídeo contém uma pr imeira e uma segunda sequência de ácidos nucleicos, as sequências codificadoras codificando cada uma das diferentes cadeias polipeptídicas podem ser operacionalmente ligadas a um promotor, que po- dem ser os mesmos ou diferentes.

Em algumas modalidades, a molécula de ácido nucleico pode conter um promotor que induz a expressão de duas ou mais cadeias polipeptídicas diferentes.

Em algumas modalidades, tais moléculas de áci- do nucleico podem ser multicistrônicas (bicistrônicas ou tri- cistrônicas, vide, por exemplo, Patente US N° 6,060,273). Em algumas modalidades, as unidades de transcrição podem ser geneticamente modificadas como uma unidade bicistrôni- ca contendo umjIRES (sítio interno de entrada do ribosso- ma), que permite coexpressão de produtos genéticos ((por exemplo, codificando um marcador de superfície celular ou uma forma modificada do mesmo e codificando o receptor recombinante) por uma messagem proveniente de único promotor.

Alternativamente, em alguns casos, um único pro- motor pode direcionar a expressão de um RNA que contém, em uma única fase de leitura aberta (ORF), dois ou três ge- nes (por exemplo, codificando um marcador de superfície ce- lular e codificando o receptor recombinante) separado de ou- tro por sequências codificando um peptídio auto -clivável (por exemplo, sequências 2A) ou um sítio de reconhecimento de protease (por exemplo, furina). A ORF codifica assim um único polipeptídio, que, durante (no caso de 2A) ou depois da translação, é processado nas proteínas individuais.

Em alguns casos, o peptídio, tal como um T2A, pode fazer com que o ribossoma pule a síntese (ribossoma saltador) de uma ligação peptídica no terminal C de um elemento de 2A, le-

vando à separação entre o final da sequência de 2A e o pep- tídio seguinte a jusante (vide, por exemplo, de Felipe, Gene- tic Vaccines and Ther. 2:13 (2004) e de Felipe et al. Traffic 5:616-626 (2004)). Vários elementos de 2A são conhecidos. Exemplos de sequências de 2A que podem ser usadas no métodos e sistemas revelados neste pedido, sem limitação, sequências de 2A do vírus da doença de pé -boca (F2A, por exemplo, SEQ ID NO: 21), vírus da rinite A equina (E2A, por exemplo, SEQ ID NO: 20), vírus Thosea asigna (T2A, por exemplo, SEQ ID NO: 6 ou 17), e teschovírus -1 suíno (P2A, por exemplo, SEQ ID NO: 18 ou 19) d escritas na Publicação de Patente US N° 20070116690.

[00443] Em algumas modalidades, o ácido nucleico codifi- cando um marcador de superfície celular e o ácido nucleico codificando o receptor recombinante são operacionalmente ligados ao mesmo promotor e são opcionalmente separados por um sítio interno de entrada do ribossoma (IRES), ou um ácido nucleico codificando um peptídio auto -clivável ou um peptídio que faz com que o ribossoma salte, que é opcional- mente um T2A, um P2A, um E2A ou um F2A. Em algumas modalidades, o ácido nucleico codificando um marcador de superfície celular e o ácido nucleico codificando o receptor recombinante são operacionalmente ligados a dois promoto- res diferentes. Em algumas modalidades, o ácido nucleico codificando um marcador de superfície celular e o ácido nu- cleico codificando o receptor recombinante estão presentes ou são inseridos em locais diferentes no genoma da célula.

[00444] Em algumas modalidades, o vetor contém uma se- quência de ácidos nucleicos codificando um ou mais marca- dores. Em algumas modalidades, o um ou mais marcadores são um marcador transduzível, um marcador suplente e/ou um marcador selecionável.

[00445] Em algumas modalidades, o marcador é um marca- dor transduzível ou um marcador suplente. Um marcador transduzível ou um marcador suplente pode ser usado para detectar células que foram introduzidas com o polinucleotí- deo, por exemplo, um polinucleotídeo codificando um recep- tor recombinante. Em algumas modalidades, o marcador transduzível pode indicar ou confirmar a modificação de uma célula. Em algumas modalidades, o marcador suplente é uma proteína que é feita para ser coexpressa na superfície celu- lar com o receptor recombinante, por exemplo, CAR. Em mo- dalidades particulares, tal marcador suplente é uma proteína superficial que fora modificada para ter pouca ou nenhuma atividade. Em certas modalidades, o marcador suplente é codificado no mesmo polinucleotídeo que codifica o receptor recombinante. Em algumas modalidades, a sequência de ácidos nucleicos codificando o receptor recombinante é ope- racionalmente ligada a uma sequência de ácidos nucleicos codificando um marcador, opcionalmente separada por um sítio interno de entrada do ribossoma (IRES), ou um ácido nucleico codificando um peptídio auto-clivável ou um peptídio que faz com que o ribossome salte, tal como uma sequência 2A, tal como uma T2A, uma P2A, uma E2A ou uma F2A. Ge- nes marcadores extrínsecos podem em alguns casos ser uti- lizados junto a célula geneticamente modificada para permitir a detecção ou seleção de células e, em alguns casos , tam- bém para promover o suicídio de células.

[00446] Marcadores suplentes exemplificativos podem in- cluir formas truncadas de polipeptídios de superfície celular,

tal como formas truncadas que não são funcionais e para não transduzir ou que não são capazes de tran sduzir um si- nal ou um sinal normalmente transduzido pela forma de com- primento integral do polipeptídio de superfície celular, e/ou não internalizam ou não são capazes de internalização.

Poli- peptídios de superfície celular truncados exemplificativos in- cluindo formas truncadas de fatores de crescimento ou de outros receptores tal como um receptor 2 do fator de cresci- mento epidérmico humano truncado (tHER2), um receptor de fator de crescimento epidérmico truncado (tEGFR, sequência de tEGFR exemplificativa apre sentada na SEQ ID NO: 7 ou 16) ou um antígeno membranar próstata -específico (PSMA) ou uma forma modificada do mesmo. tEGFR pode conter um epítopo reconhecido pelo anticorpo cetuximab (Erbitux®) ou outro anticorpo terapêutico ou molécula de ligação anti - EGFR, que pode ser usado para identificar ou selecionar cé- lulas que foram geneticamente modificadas com o construto tEGFR e uma proteína exógena codificada, e/ou para elimi- nar ou separar células expressando a proteína exógena codi- ficada.

Vide Patente US N° 8,802,374 e Liu et al., Nature Bi- otech. 2016 April; 34(4): 430 –434). Em alguns aspectos, o marcador, por exemplo, marcador suplente, inclui toda ou parte (por exemplo, forma truncada) de uma CD34, um NGFR, uma CD19 ou uma CD19 truncada, por exemplo, uma CD19 não humana truncada, ou um receptor de fator de crescimento epidérmico (por exemplo, tEGFR). Em algumas modalidades, o marcador é ou compreende uma proteína flu- orescente, tal como proteína fluorescente verde (GFP), pro- teína fluorescente verde melhorada (E GFP), tal como super- fold GFP (sfGFP), proteína fluorescente vermelha (RFP), tal como tdTomato, mCherry, mStrawberry, AsRed2, DsRed or DsRed2, proteína fluorescente ciano (CFP), proteína fluores- cente verde azulado (BFP), proteína fluorescente azul melho- rada (EBFP), e proteína fluorescente amarela (YFP), e vari- antes das mesmas, incluindo variantes de espécies, varian- tes monoméricas, e variantes códon -otimizadas e/ou melho- radas das proteínas fluorescentes. Em algumas modalidades, o marcador é ou compreende um a enzima, tal como uma luci- ferase, o gene lacZ de E. coli, fosfatase alcalina, fosfatase alcalina embrionária secretada (SEAP), cloranfenicol acetil transferase (CAT). Genes repórteres emissores de luz exem- plificativos incluem luciferase (luc), β-galactosidase, cloran- fenicol acetiltransferase (CAT), β-glucuronidase (GUS) ou variantes dos mesmos.

[00447] Em algumas modalidades, o marcador é um marca- dor selecionável. Em algumas modalidades, o marcador se- lecionável é ou compreende um polipeptídio que confere re- sistência a agentes ou fármacos exógenos. Em algumas mo- dalidades, o marcador selecionável é um gene de resistência a antibióticos. Em algumas modalidades, o marcador seleci- onável é um gene de resistência a antibióticos que confere resistência a antibióticos a uma célula de mamífero. Em al- gumas modalidades, o marcador selecionável é ou compre- ende um gene de resistência à puromicina, um gene de re- sistência à higromicina, um gene de resistência à blasticidi- na, um gene de resistência à neomicina, um gene de resis- tência à geneticina ou um gene de resistência à zeocina ou uma forma modificada dos mesmos.

[00448] Em algumas modalidades, o ácido nucleico codifi- cando o marcador é operacionalmente ligado a um polinucle-

otídeo codificando uma sequência de ligante, tal como uma sequência de ligante clivável, por exemplo, uma T2A. Por exemplo, um marcador, e opcionalmente uma sequência de ligante, podem ser qualquer um daqueles revelados na Pu- blicação PCT N° W O2014031687. Por exemplo, o marcador pode ser um EGFR truncado (tEGFR) que é, o pcionalmente, ligado a uma sequência de ligante, tal como uma sequência de ligante T2A clivável. Um polipeptídio exemplificativo para um EGFR truncado (por exemplo, tEGFR) compreende a se- quência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 7 ou 16 ou uma sequência de aminoácidos que apresenta pelo menos 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou mais de identidiade de se- quência com a SEQ ID NO: 7 ou 16.

[00449] Qualquer um dos receptores recombinantes descri- tos neste pedido pode ser codificado por polinucleotídeos contendo uma ou mais sequências de aminoácidos codifican- do um marcador de superfície celular e/ou receptores recom- binantes, em quaisquer combinações ou arranjos. Por exem- plo, um, dois, três ou mais polinucleotídeos podem codif icar um, dois, três ou mais polipeptídios diferentes, por exemplo, um marcador de superfície celular e/ou receptores recombi- nantes. Em algumas modalidades, um vetor ou construto contém uma sequência de ácidos nucleicos codificando um marcador de superfície celular, e um outro vetor ou construto contém uma sequência de ácidos nucleicos codificando um receptor recombinante, por exemplo, CAR. Em algumas mo- dalidades, o ácido nucleico codificando o um marcador de superfície celular e o ácido nucleico codificando o receptor recombinante são operacionalmente ligados a dois promoto-

res diferentes. Em algumas modalidades, o ácido nucleico codificando o receptor recombinante está presente a judante do ácido nucleico codificando o um marcador de superfície celular.

2. Vetores virais e preparação de vetores virais

[00450] Em algumas modalidades, o polinucleotídeo codifi- cando o receptor recombinante é introduzido em uma compo- sição contendo células cultivadas, tal como por transdução retroviral, transfecção, ou transformação.

[00451] Também são apresentados vetores ou construtos contendo tais ácidos nucleicos e/ou polinucleotídeos. Em al- gumas modalidades, os vetores ou construtos contêm um ou mais promotores operacionalmente ligados ao ácido nucleico codificando o receptor recombinante para induzir a expres- são do mesmo. Em algumas modalidades, o promotor é ope- racionalmente ligado a uma ou mais de uma molécula de ácido nucleico ou polinucleotídeo. Por conseguinte, também são apresentados vetores, tal como aqueles que contêm qualquer um dos polinucleotídeos apresentados neste pedi- do. Em algumas modalidades, o vetor inclui um primeiro poli- nucleotídeo codificando um marcador de superfície celular e um segundo polinucleotídeo codificando um receptor recom- binante, por exemplo, CAR.

[00452] Em alguns casos, o vetor é um vetor viral, tal como um vetor retroviral, por exemplo, um vetor lentiviral ou um vetor gama-retroviral. Também é apresentado um conjunto ou combinação de vetores. Em algumas modalidades, o con- junto ou combinação de vetores compreende um primei ro ve- tor e um segundo vetor, em que o primeiro vetor compreende o primeiro polinucleotídeo, por exemplo, um primeiro polinu-

cleotídeo codificando um marcador de superfície celular, e um segundo vetor compreende o segundo polinucleotídeo codificando um receptor recombinante, por exemplo, CAR. Também são apresentadas composições contendo tal conjun- to ou combinação de vetores. Em algumas modalidades, o conjunto ou combinação de vetores são usados juntos para modificação genética de células. Em algumas modalidad es, o primeiro e o segundo vetores no conjunto são introduzidos simultaneamente ou sequencialmente, em qualquer ordem, em uma célula para modificação genética.

[00453] Em algumas modalidades, os vetores incluem veto- res virais, por exemplo, vetores ou transposons r etrovirais ou lentivirais, vetores não virais, por exemplo, o sistema de transposons Sleeping Beauty, vetores derivado do vírus sí- mio 40 (SV40), adenovírus, vírus adeno -associado (AAV), vetores lentivirais ou vetores retrovirais, tal como vetores gama-retrovirais, vetores retrovirais derivados do vírus da leucemia murina de Moloney (MoMLV), vírus do sarcoma mi- eloproliferativo (MPSV), vírus de células -tronco embrionárias murinas (MESV), vírus de células -tronco murinas (MSCV), vírus formador de focos no baço (SFFV), ou vírus adeno- associado (AAV).

[00454] O genoma do vetor viral é tipicamente construído na forma de um plasmídeo que pode ser transferido para uma linhagem de células condicionadoras ou protutoras. Em qualquer um destes exemplos, o ácido nucleico codificando uma proteína recombinante, tal como um receptor recombi- nante, é inserido ou localizado em uma região do vetor viral, tal como geralmente em uma região não essencial do geno- ma viral. Em algumas modalidades, o ácido nucleico é inse-

rido no genoma viral no lugar de determinadas sequências virais para produzir um vírus que é defeituoso em replicação.

[00455] Qualquer um de uma variedade de métodos conhe- cidos pode ser usado para produzir partículas retrovirais cujo genom contém uma cópia do RNA do genoma do vetor vir al. Em algumas modalidades, pelo menos dois componentes es- tão envolvidos na confecção de um sistema de distribuiçã de genes de base viral: primeiro, plasmídeos acondicionadores, abrangendo as proteínas estruturais assim como as enzimas necessárias para gerar uma partícula de vetor viral, e segun- do, o próprio vetor viral, i.e., o material genético a ser trans- ferido. Salvaguardas de biossegurança podem ser introduzi- das no desenho de um ou dos dois desses componentes.

[00456] Em algumas modalidades, o plasmídeo acondi cio- nador pode conter todas as proteínas retrovirais, tal como HIV-1, que não as proteínas de envelope (Naldini et al., 1998). Em outras modalidades, os vetores virais não possu- em genes virais adicionais, tal como aqueles que estão as- sociados à virulência, por exemplo, vpr, vif, vpu e nef, e/ou Tat, um transativador primário do HIV. Em algumas modali- dades, vetores lentivirais, tais como vetores lentivirais à ba- se de HIV, compreendem apenas três genes do vírus paren- tal: gag, pol e rev, o que reduz ou elimina a possibilidade de reconstituição de um vírus do tipo selvagem através de re- combinação.

[00457] Em algumas modalidades, o genoma do vetor viral é introduzido em uma linhagem de células acondicionadoras que contém todos os componentes necessários para acondi- cionar o RNA genômico viral, transcrito a partir do genoma do vetor viral, em partículas virais. Alternativamente, o ge-

noma do vetor viral pode compreender um ou mais genes co- dificando componentes virais além de uma ou mais sequên- cias, por exemplo, ácidos nucleic os recombinantes, de inte- resse. Em alguns aspectos, para prevenir a replicação do genoma na célula alvo, no entanto, genes virais endógenos necessários para replicação são removidos e apresentados separadamente na linhagem de células acondicionadoras.

[00458] Em algumas modalidades, uma linhagem de células acondicionadoras é transfectada com um ou mais vetores plasmídicos contendo os componentes necessários para ge- rar as partículas. Em algumas modalidades, uma linhagem de células acondicionadoras é transfectada com um plasmí- deo contendo o genoma do vetor viral, incluindo as LTRs, as sequências condicionadoras cis-atuantes e a sequência de interesse, i.e., um ácido nucleico codificando um receptor de antígeno, tal como um CAR; e um ou mais plasmídeos auxili- ares codificando os componentes enzimáticos e/ou estrutu- rais do vírus, tal como Gag, pol e/ou rev. Em algumas moda- lidades, são utilizados múltiplos vetores para separar os vá- rios componentes genéticos que geram as partículas de vetor retroviral. Em algumas dessas mo dalidades, a apresentação de vetores separados à célula condicionadora reduz a pro- babilidade de eventos de recombinação que, do contrário, poderiam gerar vírus competentes em replicação. Em algu- mas modalidades, é possível usar um único vetor plasmídico tendo os componentes retrovirais.

[00459] Em algumas modalidades, a partícula de vetor re- troviral, tal como partícula de vetor lentiviral, é pseudotipifi- cada para aumentar a eficiência de transdução das células hospedeiras. Por exemplo, uma partícula de vetor retroviral,

tal como uma partícula de vetor lentiviral, em algumas moda- lidades é pseudotificada com uma VSV-G glicoproteína, que oferece uma ampla gama de células hospedeiras ampliando os tipos de células que podem ser transduzidas. Em algumas modalidades, uma linhagem de células acondicionadoras é transfectada com um plasmídeo ou polinucleotídeo codifi- cando uma glicoproteína de envelope não nativa, tal como para incluir envelopes xenotrópicos, politrópicos ou anfotró- picos, tal como o envelope do vírus Sindbis, GA LV ou VSV- G.

[00460] Em algumas modalidades, a linhagem de células acondicionadoras fornec os componentes, incluindo proteí- nas reguladoras e estruturais virais, que são necessários em trans para o acondicionamento do RNA genômico viral em partículas de vetor lentiviral. Em algumas modalidades, a li- nhagem de células acondicionadoras pode ser qualquer li- nhagem celular que seja capaz de expressar proteínas lenti- virais e produzir partículas funcionais de vetor lentiviral. Em alguns aspectos, as linhagens de células aco ndicionadoras adequadas incluem células 293 (ATCC CCL X), 293T, HeLA (ATCC CCL 2), D17 (ATCC CCL 183), MDCK (ATCC CCL 34), BHK (ATCC CCL-10) e Cf2Th (ATCC CRL 1430).

[00461] Em algumas modalidades, a linhagem de células acondicionadoras expressa estavelmente as proteínas virais. Por exemplo, em alguns aspectos, é possível construir uma linhagem de células acondicionadoras contendo os genes gag, pol, rev e/ou outros genes estruturais, porém sem a LTR e componentes acondicionadores. Em algumas modalidades, uma linhagem de células acondicionadoras pode ser transito- riamente transfectada com moléculas de ácido nucleico codi-

ficando uma ou mais proteínas virais junto com o genoma do vetor viral contendo uma molécula de ácido nucleico codifi- cando uma proteína heteróloga, e/ ou um ácido nucleico codi- ficando uma glicoproteína de envelope.

[00462] Em algumas modalidades, os vetores virais e os plasmídeos acondicionadores e/ou auxiliares são introduzi- dos via transfecção ou infecção na linhagem de células acondicionadoras. A linhagem de células acondicionadoras produz partículas de vetor viral que contêm o genoma do ve- tor viral. Métodos para transfecção ou infecção são bastante conhecidos. Exemplos não limitativos incluem métodos do fosfato de cálcio, DEAE-dextrana e lipofecçã, eletroporaç ão e microinjeção.

[00463] Quando um plasmídeo recombinante e LTR retrovi- ral LTR e sequências acondicionadoras são introduzidas em uma linhagem celular especial (por exemplo, por precipitação de fosfato de cálcio, por exemplo), as sequências acondicio- nadoras podem permitir que o transcrito de RNA do plasmí- deo recombinante seja acondicionado em partículas virais, que podem então ser secretadas no meio de cultura. O meio contendo os retrovírus recombinantes em algumas modalida- des é então coletado, opcionalmente conce ntrado, e usado para transferência de genes. Por exemplo, em alguns aspec- tos, depois da cotransfecção dos plasmídeos acondicionado- res e do vetor de transferência para a linhagem de células acondicionadoras, as partículas de vetor viral são recupera- das do meio de cultura a tituladas por métodos tradicionais usados pelos especialistas na técnica.

[00464] Em algumas modalidades, um vetor retroviral, tal como um vetor lentiviral, pode ser produzido em uma linha-

gem de células acondicionadoras, tal como uma linhagem de células HEK 293T exemplificativa, por introdução de plasmí- deos para possibilitar a geração de partículas lentivirais. Em algumas modalidades, uma célula acondicionadora é trans- fectada e/ou contém um polinucleotídeo codificando gag e pol, e um polinucleotídeo codificando um receptor recombi- nante, tal como um receptor de antígeno, por exemplo, um CAR. Em algumas modalidades, a linhagem de células acon- dicionadoras é opcionalmente e/ou adicionalmente transfec- tada com e/ou contém um polinucleotídeo codificado uma proteína rev. Em algumas modalidades, a linhagem de célu- las acondicionadoras é opcionalmente e/ou adicionalmente transfectada com e/ou contém um polinucleotídeo codificado uma glicoproteína de envelope não nativa, tal como VSV -G. Em algumas dessas modalid ades, aproximadamente dois de- pois da transfecção de célula, por exemplo, células T HEK 293, o sobrenadante celular contém vetores lentivirais re- combinantes, que podem ser recuperados e titulados.

[00465] As partículas de vetores lentivirais recuperados e/ou produzidos podem ser usadas para transduzir células alvo pelos métodos descritos. Uma vez nas células alvo, o RNA viral é transcrito de forma reversa, importado para o núcleo e integrado estavelmente no genoma hospedeiro. Um ou dois dias depois da integração do RNA viral, é possível detectar a expressão da protgeína recombinante, por exem- plo, receptor de antígeno, tal como CAR. D. Cultivo e/ou Expansão

[00466] Em algumas modalidades, os métodos apresenta- dos incluem uma ou mais etapas de cultivo de células gene- ticamente modificadas, por exemplo, cultivo de células em condições que estimulam a proliferação e/ou a expansão. Em certas modalidades, os métodos apresen tados não incluem etapas de cultivo de células geneticamente modificadas. Em certas modalidades, há um número mais alto de células ge- neticamente modificadas subsequente ao término do proces- so em relação ao número de células fonte iniciais a partir das quais as células foram geradas. Em várias modalidades, há um número mais baixo de células geneticamente modifi- cadas subsequente ao término do processo em relação ao número de células fonte iniciais a partir das quais as células foram geradas. Em algumas modali dades, células genetica- mente modificadas são cultivadas em condições que estimu- lam a proliferação e/ou a expansão subsequente a uma eta- pa de manipulação genética, por exemplo, introdução de um polipeptídio recombinante nas células por transdução ou transfecção. Em modalidades particulares, as células são cultivadas depois de terem sido incubadas em condições es- timuladoras e transduzidas ou transfectadas com um polinu- cleotídeo recombinante, por exemplo, um polinucleotídeo co- dificando um receptor recombinante. Em algumas modalida- des, o cultivo produz uma composição de saída contendo uma composição de células T enriquecidas que expresam o receptor recombinante (por exemplo, CAR).

[00467] Em algumas modalidades, as células geneticamen- te modificadas são cultivadas em um recipiente que pode ser preenchido, por exemplo, via a porta de alimentação, com um meio celular e/ou célula para cultivo das células adicio- nadas. As células podem ser provenientes de qualquer fonte de células para as se deseja a cultura das células, por exemplo, para expansão e/ou proliferação das células.

[00468] Em alguns aspectos, o meio de cultura é um meio de cultura adaptado que suporta o crescimento, cultivo, ex- pansão ou proliferação das células, tal como células T. Em alguns aspectos, o meio pode ser um líquido contendo uma mistura de sais, aminoácidos, vitaminas, açúcares ou qual- quer combinação destes. Em algumas modalidades, o meio de cultura contém ainda uma ou mais condições ou agentes estimuladores, tal como para estimular o cultivo, expansão ou proliferação das células durante a incubação. Em algumas modalidades, a condição estimuladora é ou inclui uma ou mais citocinas selecionadas dentre IL -2, IL-7 ou IL-15. Em algumas modalidades, a citocina é uma citocina recombinan- te. Em algumas modalidades, a concentração da uma ou mais citocinas no meio de cultura durante o cultivo ou incu- bação, independentemente, varia de ou de cerca de 1 IU/mL a 1500 IU/mL, tal como de ou cerca de 1 IU/mL a 100 IU/mL, 2 IU/mL a 50 IU/mL, 5 IU/mL a 10 IU/mL, 10 IU/mL a 500 IU/mL, 50 IU/mL a 250 IU/mL or 100 IU/mL a 200 IU/mL, 50 IU/mL a 1500 IU/mL, 100 IU/mL a 1000 IU/mL or 200 IU/mL a 600 IU/mL. Em algumas modalidades, a concentração da uma ou mais citocinas, independentemente, é de pelo menos ou pelo menos cerca de 1 IU/mL, 5 IU/mL, 10 IU/mL, 50 IU/mL, 100 IU/mL, 200 IU/mL, 500 IU/mL, 1000 IU/mL ou 1500 IU/mL.

[00469] Em alguns aspectos, as células são incubadas por pelo menos uma parte do tempo depois da transferência das células geneticamente modificadas e do meio de cultura. Em algumas modalidades, as condições estimuladoras geralmen- te incluem uma temperatura adequada para o crescimento de células imunes primárias, tal como linfócitos T humanos, por exemplo, pelo menos cerca de 25 graus Celsius, geralmente pelo menos cerca de 30 graus, e geralmente a ou cerca de 37 graus Celsius. Em algumas modalidades, as células são incubadas a uma temperatura de 25 a 38 graus Celsius, tal como 30 a 37 graus Celsius, por exemplo, a ou cerca de 37 graus Celsius ± 2 graus Celsius. Em algumas modalidades, a incubação é realizada por um período de tempo até que a cultura, por exemplo, cultivo ou expansão, resulte em uma densidade, número ou dose de células desejada ou limítrofe. Em algumas modalidades, a incubação é maior que ou maio r que cerca de ou ocorre por cerca de 24 horas, 48 horas, 72 horas, 96 horas, 5 dias, 6 dias, 7 dias, 8 dias, 9 dias ou mais.

[00470] Em algumas modalidades, as células são incubadas em condições para manter uma quantidade alvo de dióxido de carbono na cultura de células. Em alguns aspectos, isto garante cultivo, expansão e proliferação ótimos das células durante o crescimento. Em alguns aspectos, a quantidade de dióxido de carbono (CO 2 ) varia entre 10% e 0% (v/v) do refe- rido gás, tal como entre 8% e 2% (v/v) do re ferido gás, por exemplo, uma quantidade de ou de cerca de 5% (v/v) CO 2 .

[00471] Em algumas modalidades, as células T são expan- didas por adição de células alimentadoras, tal como células mononucleares não divisoras de sangue periférico (PBMC), à composição iniciadora de cultura (por exemplo, de modo que a população de células resultante contém pelo menos cerca de 5, 10, 20, ou 40 ou mais células alimentadoras PBMC pa- ra cada linfócito T na população inicial a ser expandida); e incubação da cultura (por exemplo, por um tempo suficiente para expandir os números de células T). Em alguns aspec-

tos, as células alimentadoras não divisoras podem compre- ender células alimentadoras PBMC irradiadas com raios ga- ma. Em algumas modalidades, as PBMCs são irradiadas com raios gama na faixa de cerca de 3000 a 3600 rads para pre- venir a divisão celular. Em alguns aspectos, as células ali- mentadoras são adicionadas ao meio de cultura antes da adição das populações de células T.

[00472] Em algumas modalidades, as condições estimula- doras incluem uma temperatura adequada para o crescimen- to de linfócitos T humanos, por exemplo, pelo menos cerca de 25 graus Celsius, geralmente pelo menos cerca de 30 graus, e geralmente a ou cerca de 37 graus Celsius. Opcio- nalmente, a incubação pode compreender ainda a ad ição de células linfoblastoides não divisoras transformadas por EBV (LCL) como células alimentadoras. As LCL podem ser irradi- adas com raios gama na faixa de cerca de 6000 a 10.000 rads. As células alimentadoras LCL em alguns aspectos são apresentadas em qualquer quantidade adequada, tal como uma relação de células alimentadoras LCL para linfócitos T iniciais de pelo menos cerca de 10:1.

[00473] Em algumas modalidades, as células são incubadas usando recipientes, por exemplo, bolsas, que são usados junto com um biorreator. Em alguns casos, o biorreator pode ser submetido a deslocamento ou oscilação, o que, em al- guns aspectos, pode aumentar a transferência de oxigênio. Deslocamento do biorreator pode incluir, porém sem limita- ção, rotação em torno de um eixo horizontal , rotação em tor- no de um eixo vertical, um movimento oscilatório ao longo de um eixo horizontal inclinado do biorreator ou qualquer com- binação destes. Em algumas modalidades, pelo menos uma parte da incubação é realizada com oscilação. A velocidade de oscilação e o ângulo de oscilação podem ser ajustados para atingir uma agitação desejada. Em algumas modalida- des o ângulo de oscilação é de ou é de cerca de 20°, 19°, 18°, 17°, 16°, 15°, 14°, 13°, 12°, 11°, 10°, 9°, 8°, 7°, 6°, 5°, 4°, 3°, 2° ou 1°. Em certas modalidades, o ângulo de oscila- ção varia entre 6-16°. Em outras modalidades, o ângulo de oscilação varia entre 7-16°. Em outras modalidades, o ângulo de oscilação varia entre 8-12°. Em algumas modalidades, a taxa de oscilação é de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 , 10, 11, 1 12, 13, 14 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40 rpm. Em algu- mas modalidades, a taxa de oscilação varia entre 4 e 12 rpm, tal como entre 4 e 6 rpm, inclusive. Pelo menos uma parte da expansão da cultura de células é realizada com um movimen- to oscilatório, tal como a um ângulo entre 5° e 10°, tal como 6°, a uma velocidade de oscilação constante, tal como uma velocidade entre 5 e 15 rpm, tal como 6 rmp ou 10 rpm. Cada uma das células CD4+ e CD8+ podem ser separadamente expandidas até que cada uma delas atinja uma quantidade ou densidade celular limítrofe.

[00474] Em algumas modalidades, pelo menos uma parte da incubação é realizada em condições estáticas. Em algu- mas modalidades, pelo menos um a parte da incubação é rea- lizada com perfusão, tal como remover lentamente o meio gasto e perfundir meio fresco durante a cultura. Em algumas modalidades, o método inclui uma etapa de perfusão de meio de cultura fresco na cultura de células, tal como atrav és de uma porta de alimentação. Em algumas modalidades, o meio de cultura adicionado durante a perfusão contém o um ou mais agentes estimuladores, por exemplo, uma ou mais cito- cinas recombinantes, tal como IL -2, IL-7 e/ou IL-15. Em al- gumas modalidades, o meio de cultura adicionado durante a perfusão é o mesmo meio de cultura usado durante uma in- cubação estática.

[00475] Em algumas modalidades, as células são expandi- das ou cultivadas na presença de um ou mais anticorpos an- ti-idiotípicos, tal como um anticorpo anti-idiotípico que se li- ga ou reconhece o receptor recombinante que é expresso pe- las células geneticamente modificadas.

[00476] Em algumas modalidades, subsequente à incuba- ção, o recipiente, por exemplo, bolsa, é reconectado a um sistema para executar a uma ou mais outras etapas de pro- cessamento para fabricação, geração ou produção da terapia celular, tal como ele é reconectado ao sistema que contém a câmara centrífuga. Em alguns aspectos, as células cultiva- das são transferidas da bolsa para a cavidade interna da câmara para formulação das células cultivadas. E. COMPOSIÇÕES E FORMULAÇÕES

[00477] Em modalidades particulares, o perfil de espectro- metria de massas é obtido a partir de uma composição de células geneticamente modificadas tal como uma composição de células formulada, por exemplo, uma terapia celular. Em certas modalidades, o perfil de espectrometria de massas é obtido a partir da composição de células para verificar que pelo menos uma parte do perfil de espectrometria de massas se encontra dentro de uma faixa tolerável, po r exemplo, não se encontra fora de uma variabilidade ou variância limítrofe. Em modalidades particulares, o perfil de espectrometria de massas é obtido a partir da composição de células para iden-

tificar ou verificar a presença de um receptor recombinante expresso pelas células da composição de células, por exem- plo, uma composição de células formulada ou terapia celular.

[00478] Em algumas modalidades, a dose de células com- preendendo células geneticamente modificadas com um re- ceptor de antígeno recombinante, por exe mplo, CAR ou TCR, é apresentada como uma composição ou formulação, tal co- mo uma composição ou formulação farmacêutica. Tais com- posições podem ser usadas conforme os métodos apresen- tados, e/ou com os artigos de manufatura ou composições apresentados, tal como na prevenção ou no tratamento de doenças, condições e distúrbios, ou em métodos de detec- ção, diagnóstico e prognóstico.

[00479] O termo “formulação farmacêutica” refere -se a uma preparação que se encontra em uma forma tal que permite que a atividade biológica d e um princípio ativo contido na mesma seja eficaz, que não contém componentes adicionais que são inaceitavelmente tóxicos para um indivíduo em quem a formulação seria administrada.

[00480] Um “carreador farmaceuticamente aceitável” refere - se a um ingrediente em uma formulação farmacêutica, dife- rente de um princípio ativo, que é atóxico para um indivíduo. Um carreador farmaceuticamente aceitável inclui, porém sem limitação, um tampão, excipiente, estabilizante ou conser- vante.

[00481] Em alguns aspectos, a escolha do carread or é em parte determinada pela célula ou agente particular e/ou pelo método de administração. Por conseguinte, existe uma vari- edade de formulações adequadas. Por exemplo, a composi- ção farmacêutica pode conter conservantes. Conservantes adequados podem incluir, por exemplo, metilparabeno, propi- lparabeno, benzoato de sódio, e cloreto de benzalcônio. Em alguns aspectos, usa-se uma mistura de dois ou mais con- servantes. Os conservantes ou misturas dos mesmos estão tipicamente presentes em uma quantidade de cerca de 0,0001% a cerca de 2% em peso da composição total. Carre- adores estão descritos, por exemplo, em Remington’s Phar- maceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980). Os carreadores farmaceuticamente aceitáveis geralmente são atóxicos para os receptores nas dosagens e concentrações empregadas, e incluem, porém sem limitação: tampões tais como fosfato, citrato, e outros ácidos orgânicos; antioxidan- tes incluindo ácido ascórbico e metionina; conservantes (tais como cloreto de octadecildimetilbenzil amônio; cloreto de hexametônio, cloreto de benzalcônio, cloreto de benzetônio, fenol, álcool butílico ou benzílico, alquil parabenos tais como metil ou propil parabeno; catecol; resorcinol; ciclo -hexanol; 3-pentanol; e m-cresol); polipeptídios de baixo peso molecu- lar (menos de cerca de 10 resíduos); proteínas, tais como albumina sérica, gelatina, ou imunoglobulinas; polímeros hi- drofílicos tais como polivinilpirrolidona; aminoácidos tais co- mo glicina, glutamina, asparagina, histidina, arginina, ou lisi- na; monossacarídeos, dissacarídeos, e outros carboidratos incluindo glucose, manose, ou dextrinas; agentes quelantes tais como EDTA; açúcares tais como sacarose, manitol, trea- lose ou sorbitol; contraíons formadores de sais tal como só- dio; complexos metálicos (por exemp lo, complexos Zn- proteína); e/or tensoativos não iônicos tal como polietilene glicol (PEG).

[00482] Agentes tamponantes em alguns aspectos estão incluídos nas composições. Agentes tamponantes adequados incluem, por exemplo, ácido cítrico, citrato de sódio, ácido fosfórico, fosfato de potássio, e vários outros ácidos e sais. Em alguns aspectos, uma mistura de dois ou mais agentes tamponantes é usada. O agente tamponante ou misturas do mesmo estão tipicamente presentes em uma quantidade de cerca de 0,001% a cerca de 4% em peso da composição to- tal. Métodos para preparação de composições farmacêuticas que podem ser administradas são conhecidos. Métodos exemplificativos estão descritos mais detalhadamente m, por exemplo, Remington: The Science and Practice of Pharmacy, Lippincott W illiams & W ilkins; 21st ed. (May 1, 2005).

[00483] A formulação ou composição também pode conter mais de um princípio ativo útil para a indicação, doença ou condição particular sendo prevenida ou tratada com as célu- las ou agentes, onde as respectivas atividades não afetam adversamente uma à outra. Tais princípios ativos estão ade- quadamente presentes em combinação em quantidades que são eficazes para a finalidade pretendida. Assim sendo, em algumas modalidades, a composição farmacêutica inclui ain- da outros agentes farmacologicamente ativos ou drogas, tais como agentes quimiterapêuticos, por exemplo, asparaginase, busulfan, carboplatina, cisplatina, daunorubicina, doxorubici- na, fluorouracil, gencitabina, hidroxiureia, metotrexato, pacli- taxel, rituximab, vimblastina, vincristina, etc. Em algumas modalidades, os agentes ou células são administrados na forma de um sal, por exemplo, um sal farmaceuticamente aceitável. Sais de adição de ácidos farmaceuticamente acei- táveis adequados incluem aqueles derivados de ácidos mine- rais, tais como ácido clorídrico, ácido bromídrico, ácido fos-

fórico, ácido metafosfórico, ácido nítrico, e ácido sulfúrico, e ácidos orgânicos, tais como ácido tartárico, ácido acético, ácido cítrico, ácido málico, ácido láctico, ácido fumário, áci- do benzoico, ácido glicólido, ácido glucônico, ácido succíni- co, e ácido arilsulfônico, por exemplo, ácido p -toluenossulfô- nico.

[00484] A composição farmacêutica em algumas modalida- des contém agentes ou células em quantidades eficazes para tratar ou prevenir a doença ou condição, tal como uma quan- tidade terapeuticamente eficaz ou uma quantidade profilati- camente eficaz. A eficácia terapêutica ou profilática em al- gumas modalidades é monitorada pela avaliação periódica dos indivíduos tratados. Para administrações r epetidas por vários dias ou mais, dependendo da condição, o tratamento é repetido até que ocorra uma supressão desejada dos sinto- mas da doença. Entretanto, outros esquemas posológicos podem ser úteis e podem ser determinados. A dosagem de- sejada pode ser distribuída pela administração de um único bolo da composição, por múltiplas administrações de um bolo da composição, ou por infusão contínua da composição.

[00485] Os agentes ou células podem ser administrados por qualquer meio adequado, por exemplo, por infusão de bolo, por injeção, por exemplo, injeções intravenosas ou subcutâ- neas, injeção intraocular, injeção periocular, injeção sub - retiniana, injeção intravítrea, injeção trans -séptica, injeção subesclerótica, injeção intracoroidal, injeção intracameral, injeção subconjectival, injeção subconjuntival, injeção sub- tendínea, injeção retrobulbar, injeção peribulbar, ou distri- buição justascleral posterior. Em algumas modalidades, eles são administrados por administração parenteral, intrapulmo-

na, e intranasal, e, se desejado, para tratamento local, por administração intralesional. Infusões parenterais incluem administração intramuscular, intravenosa, intra -arterial, in- traperitoneal, ou subcutânea. Em algumas modalidades, uma dada dose é administrada pela administração de um único bolo das células ou agente. Em algumas modalidades, ela é administrada por múltiplas administrações de um bolo das células ou agente, por exemplo, por um período não superior a 3 dias, ou por infusão contínua das células ou agente.

[00486] Para a prevenção ou tratamento de doenças, a do- sagem apropriada pode depender do tipo de doença a ser tratada, do tipo de agente ou agentes, do tipo de receptores recombinantes, da gravidade e da evolução da doença, se o agente ou células são administrados para fins pre ventivos ou terapêuticos, de terapia anterior, do histórico clínico do indi- víduo e da resposta ao agente ou células, e a critério do mé- dico assistente. As composições são em algumas modalida- des adequadamente administradas ao indivíduo em uma só vez ou em uma série de tratamentos.

[00487] As células ou agentes podem ser administrados usando técnicas de administração, formulações e/ou disposi- tivos tradicionais. São apresentadas formulações e dispositi- vos, tais como seringas e frascos, para armazenamento e administração das composições. No que diz respeito às célu- las, a administração pode ser autóloga ou heteróloga. Por exemplo, células ou progenitores imunorresponsivos podem ser obtidos de um indivíduo, e administrados ao mesmo indi- víduo ou a um outro indivíduo compa tível. Células imunor- responsivas derivadas de sangue periférico ou suas progê- nies (por exemplo, derivadas in vivo, ex vivo ou in vitro) po-

dem ser administradas por injeção localizada, incluindo ad- ministração através de um cateter, injeção sistêmica, injeçã o localizada, injeção intravenosa ou administração parenteral. Quando se administra uma composição terapêutica (por exemplo, uma composição farmacêutica contendo uma célula imunorresponsiva geneticamente modificada ou um agente que tratada ou melhora sinto mas de neurotoxicidade), ela ge- ralmente será formulada em uma forma de dosagem unitária injetável (solução, suspensão, emulsão).

[00488] Formulações incluem aquelas para administração oral, intravenosa, intraperitoneal, subcutânea, pulmonar, transdérmica, intramuscular, intranasal, bucal, sublingual, ou supositório. Em algumas modalidades, o agente ou popula- ções de células são administrados por via parenteral. O ter- mo “parenteral”, conforme usado neste pedido, inclui admi- nistração intravenosa, intramuscular, subcu tânea, retal, va- ginal, e intraperitoneal administration. Em algumas modali- dades, o agente ou populações de células são administrados a um indivíduo usando distribuição sistêmica periférica por injeção intravenosa, intraperitoneal, ou subcutânea.

[00489] As composições em algumas modalidades são apresentadas como preparações líquidas estéreis, por exem- plo, soluções aquosas isotônicas, suspensões, emulsões, dispersões, ou composições viscosas, que podem em alguns aspectos ser tamponadas em um pH selecionado. Prepara- ções líquidas normalmente são mais fáceis de preparar que geís, outras composições viscosas, e composições sólidas. Adicionalmente, as composições líquidas são bem mais con- venientes de administrar, especialmente por injeção. As composições viscosas, por outro lado, podem ser formuladas em uma faixa de viscosidade apropriada para proporcionar períodos de contato mais longos com tecidos específicos. As composições líquidas ou viscosas podem compreender car- readores, que podem ser um solvente ou um meio de dispe r- são contendo, por exemplo, água, solução salina, solução salina tamponada com fosfato, poliol (por exemplo, glicerol, propileno glicol, polietileno glicol líquido) e misturas adequa- das dos mesmos.

[00490] As soluções injetáveis estéreis podem ser prepara- das por incorporação do agente ou células em um solvente, tal como em mistura com um carreador, diluente, ou excipi- ente adequado, tal como água estéril, solução salina fisioló- gica, glicose, dextrose, ou similar.

[00491] As formulações a serem usadas para administração in vivo geralmente são estéreis. A esterilidade pode ser fa- cilmente obtida, por exemplo, por filtração através de mem- branas de filtração estéreis. IV. DEFINIÇÕES

[00492] A menos que definido em contrário, todos os ter- mos da arte, notações e outros termos técnicos e cient íficos ou terminologia usados neste pedido têm o mesmo significa- do que aquele comumente conhecido pelo especialista na técnica à qual a matéria reivindicada pertence. Em alguns casos, termos com significados comumente conhecidos são definidos neste pedido para fins de clareza e/ou fácil refe- rência, e a inclusão de tais definições neste relatório não de- vem ser necessariamente interpretadas como representando uma diferença significativa em relação ao que é normalmente conhecido na técnica.

[00493] Conforme usado neste pedido, as formas no singu-

lar “um”, “uma”, e “o/a” incluem seus referentes no plural a menos que nitidamente indicado pelo contexto. Por exemplo, “um” ou “uma” significa “pelo menos um” ou “um ou mais”. Fica entendido que os aspectos e variações descrito s neste relatório incluem “consistindo em” e/ou “consistindo essenci- almente em” aspectos e variações.

[00494] Em todo este relatório descritivo, vários aspectos da matéria reivindicada estão apresentados no formato de um intervalo. Deve ficar entendido que a descr ição no forma- to de intervalos é feita meramente a título de conveniência e concisão e não deve interpretado como uma limitação infle- xível do escopo da matéria reivindicada. Por conseguinte, a descrição de um intervalo deve ser considerada como des- crevendo especificamente todos os sub-intervalos possíveis assim como os valores numéricos individuais naquele inter- valo. Por exemplo, quando se apresenta um intervalo de va- lores, entende-se que cada valor interveniente, entre o limite superior e o inferior daquele intervalo e qualquer outro valor mencionado ou interveniente naquele intervalo mencionadoa está abrangido pela matéria reivindicada. O limite superior e o inferior desses intervalos menores podem estar indepen- dentemente incluídos nos intervalos menores, e também es- tão abrangidos pela matéria reivindicada, sujeito a qualquer limite especificamente excluído no intervalo mencionado. Onde o intervalo mencionado inclui um ou ambos os limites, intervalos excluindo um ou ambos os limites incluídos tam- bém estão incluídos na matéria reivindicada. Isto se aplica independentemente da amplitude do intervalo.

[00495] O termo “cerca de” conforme usado neste pedido refere-se à faixa de erro usual para o respectivo valor facil-

mente conhecido. A menção a “cerca de” um valor ou parâ- metro neste pedido inclui (e descreve) modalidades que es- tão voltadas para aquele valor ou parâmetro per se. Por exemplo, uma descrição indicando “cerca de X” inclui uma descrição de “X”.

[00496] Conforme usado neste pedido, a especificação de que nucleotídeos ou posições de aminoácidos “correspondem a” nucleotídeos ou posições de aminoácidos em uma se- quência mencionada, tal como apresentado na listagem de Sequências, refere-se a nucleotídeos ou posições de amino- ácidos identificados após alinhamento com a sequência mencionada para maximizar a identidade usando um algorit- mo de alinhamento padrão, tal como o algoritmo GAP. Com o alinhamento das sequências é possível identifica resíduos correspondentes, por exemplo, usando resíduos aminoacídi- cos conservados e idênticos como guias. Em geral, para identificar posições correspondentes, as sequências de ami- noácidos são alinhadas de forma que a coincidência de or- dem mais alta seja obtida, vide, por exemplo: Computational Molecular Biology, Lesk, A.M., ed., Oxford University Press, New York, 1988; Biocomputing: Informatics and Genome Pro- jects, Smith, D.W ., ed., Academic Press, New York, 1993; Computer Analysis of Sequence Data, Part I, Griffin, A.M., and Griffin, H.G., eds., Humana Press, New.Jersey, 1994; Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinje, G., Academic Press, 1987; e Sequence Analysis Primer, Gribs- kov, M. and Devereux, J., eds., M Stockton Press, New York, 1991; Carrillo et al. (1988) SIAM J Applied Math 48: 1073).

[00497] O termo “vetor,” conforme usado neste pedido, re- fere-se a uma molécula de ácido nucleico capaz de propagar um outro ácido nucleico ao qual ele está ligado. O termo in- clui o vetor como uma estrutura de ácido nucleico auto - replicante assim como o vetor incorporado no genoma de uma célula hospedeira na qual ele fora introduzido. Determi- nados vetores são capazes de direcionar a expressão de ácidos nucleicos aos quais eles estão operacionalmente li- gados. Neste pedido tais vetores são denominados “vetores de expressão”. Entre os vetores encontram -se vetores viriais, tais como vetores retrovirais, por exemplo, vetores gama - retrovirais e lentivirais.

[00498] Os termos “célula hospedeira”, “linhagem de célula hospedeira”, e “cultura de células hospedeiras” são usados intercambiavelmente e referem-se a células nas quais fora introduzido um ácido nucleico exógeno, incluindo a progênie de tais células. Células hospedeiras incluem “transforman- tes” e “células transformadas”, que incluem a célula tra ns- formada primária e a progênie derivada da mesma indepen- dente do número de passagens. A progênie pode não ser completamente idêntica em termos do teor de ácido nucleico a uma célula parental, mas pode conter mutações. Progênies mutantes que têm a mesma função ou atividade biológica analisada ou selecionada na célula originalmente transfor- mada também estão incluídas.

[00499] Conforme usado neste pedido, a afirmação de que uma célula ou população de células é “positiva” para um marcador particular refere -se à presença detectável sobre ou na célula de um marcador particular, tipicamente um marca- dor superficial. Ao se referir a um marcador superficial, o termo refere-se à presença de expressão na superfície se- gundo detectado por citometria de fluxo, por exemplo, colo-

rindo com um anticorpo que se liga especificamente ao mar- cador e detectando o referido anticorpo, em que a coloração é detectável por citometria de fluxo em um nível substanci- almente acima da coloração detectada ao se realizar o mes- mo procedimento com um con trole compatível com o isótipo em condições de resto idênticas e/ou em um nível substanci- almente similar àquele para a célula sabidamente positiva para o marcador, e/ou em um nível substancialmente mais alto que aquele para uma célula sabidamente negativa o marcador.

[00500] Conforme usado neste pedido, a afirmação de que uma célula ou população de células é “negativa” para um marcador particular refere -se à ausência de presença detec- tável significativa sobre ou na célula de um marcador parti- cular, tipicamente um marcador superficial. W hen referring to a surface marker, o termo refere -se à ausência de expressão na superfície segundo detectado por citometria de fluxo, por exemplo, colorindo com um anticorpo que se liga especifica- mente ao marcador e detectando o refe rido anticorpo, em que a coloração não é detectada por citometria de fluxo em um nível substancialmente acima da coloração detectada ao se realizar o mesmo procedimento com um controle compatí- vel com o isótipo em condições de resto idênticas, e/ou em um nível substancialmente mais baixo que aquele para a cé- lula sabidamente positiva para o marcador, e/ou em um nível substancialmente similar àquele para uma célula sabidamen- te negativa para o marcador.

[00501] Conforme usado neste pedido, “percentagem (%) de identidade de sequências de aminoácidos” e “percenta- gem de identidade” quando usado em relação a uma sequên-

cia de aminoácidos (sequência polipeptídica de referência) é definida como a percentagem de resíduos aminoacídicos em uma sequência candidata (por exemplo, o anticorpo em questão ou fragmento) que são idênticos aos resíduos ami- noacídicos na sequência polipeptídica de referência, depois de alinhamento das sequências e introdução de hiatos, se necessário, para atingir a percentagem máxima de identida- de de sequências, e não considerando quaisquer substitui- ções conservativas como parte da identidade de sequências. Alinhamento para fins de determinação da percentagem de identidade de sequências de aminoácidos pode ser obtido de várias maneiras conhecidas,, por exemp lo, por um software de computador disponível ao público tal como software BLAST, BLAST-2, ALIGN ou Megalign (DNASTAR). É possí- vel determinar parâmetros apropriados para alinhamento de sequências, incluindo quaisquer algoritmos necessários para obter alinhamento máximo sobre o comprimento integral das sequências sendo comparadas.

[00502] Uma substituição aminoacídica pode incluir a subs- tituição de um ou aminoácido em um polipeptídio por um ou- tro aminoácido. A substituição pode ser uma substituição aminoacídica conservativa ou uma substituição aminoacídica não conservativa. Substituições aminoacídicas podem ser introduzidas em uma molécula de ligação, por exemplo, anti- corpo, de interesse e osprodutos analisados quanto a uma atividade desejada, por exemplo, ligação de antígeno manti- da/melhorada, imunogenicidade reduzida, ou ADCC ou CDC melhorada.

[00503] Os aminoácidos geralmente podem ser agrupados de acordo com as seguintes propriedades comuns das cadei-

as laterais: (1) hidrófobos: Norleucina, Met, Ala, Val, Leu, Ile; (2) hidrofílicos neutros: Cys, Ser, Thr, Asn, Gln; (3) ácidos: Asp, Glu; (4) básicos: His, Lys, Arg; (5) resíduos que incluenciam a oridentação das ca- deias: Gly, Pro; (6) aromáticos: Trp, Tyr, Phe.

[00504] Em algumas modalidades, substituições conservati- vas podem envolver a troca de um membro de uma dessas classes por outro membro da mesma classe. Em algumas modalidades, substituições aminoacídicas não conservativas podem envolver a troca de um membro de uma dessas clas- ses por um membro de outra classe.

[00505] Conforme usado neste pedido, uma composição re- fere-se a qualquer mistura de dois ou mais produtos, subs- tâncias, ou compostos, incluindo células. Pode ser uma solu- ção, uma suspensão, um líquido, um pó, uma pasta, aquosa, não aquosa ou qualquer combinação destes.

[00506] Conforme usado neste pedido, um “indivíduo” é um mamífero, tal como um ser humano ou outro animal, e tipi- camente é um ser humano. V. MODALIDADES EXEMPLIFICATIVAS

[00507] Entre as modalidades apresentadas estão:

1. Um método para identificação de um perfil de espectro- metria de massas (MS) de uma composição de células gene- ticamente modificadas, o método compreendendo: (a) determinar um perfil de espectrometria de massas de tes- te de uma amostra de uma composição de células genetica- mente modificadas de teste ou de um subconjunto da mesma usando uma técnica de espectrometria de massas, a referida composição de células geneticamente modificadas de teste compreendendo células imunes compreendendo um receptor recombinante; (b) comparar o perfil de espectrometria de mas sas de teste com um perfil de espectrometria de massas de referência; e (c) identificar uma ou mais diferenças na presença, ausência ou nível de pelo menos um componente dos dados no perfil de espectrometria de massas de teste em relação ao perfil de espectrometria de massas de referência, identificando as- sim um perfil de espectrometria de massas da composição de células compreendendo o receptor recombinante.

2. O método da modalidade 1, em que o perfil de espec- trometria de massas de referência é de uma amostra de uma composição de referência ou é um perfil médio de espectros de massas de inúmeras amostras de uma pluralidade de composições de referência.

3. O método da modalidade 1 ou reivindicação 2, em que a composição de células geneticamente modificadas é para uso em uma terapia com células autólogas.

4. O método de qualquer uma das modalidades 1 -3, em que a composição de células geneticamente modificadas é produzido por um processo compreendendo: (i) selecionar ou isolar células imunes de uma amostra pro- veniente de um indivíduo, gerando assim uma composição fonte, opcionalmente em que a amostra biológica é uma amostra de leucaférese, uma amostra de aférese ou uma amostra de sangue total; (ii) incubar as células da composição fonte com um reagente estimulador, gerando assim uma composição estimulada, em que a incubação é opcionalmente realizada na presença de uma ou mais citocinas; (iii) introduzir um ácido nucleico codificando o receptor re- combinante nas células imunes da composição estimulada, gerando assim uma composição transformada; e (iv) cultivar a composição estimulada a 37º C por pelo menos 24 horas, gerando assim a composição de células genetica- mente modificadas, em que a cultura é opcionalmente reali- zada na presença de uma ou mais citocinas.

5. O método de qualquer uma das modalidades 2 -4, em que a composição de referência ou cada uma dentre a plura- lidade de composições de células de referência não teve in- troduzida uma molécula de ácido nucleico codificando o re- ceptor recombinante.

6. O método de qualquer uma das modalidades 1 -5, em que o perfil de espectrometria de massas de referência é de uma amostra de uma composição de referência e a composi- ção de células de referência é uma composição de células fonte compreendendo as células imunes das qu ais a compo- sição de células de teste fora derivada ou obtida.

7. O método de qualquer uma das modalidades 1 -6, em que o perfil de espectrometria de massas de referência é de uma amostra de uma composição de referência, em que: a composição de células genet icamente modificadas com- preende células imunes obtidas de um indivíduo, as referidas células imunes compreendendo uma molécula de ácido nu- cleico codificando o receptor recombinante; e a composição de células de referência é uma composição de entrada compreendendo as células imunes obtidas do indiví- duo que não compreendem o ácido nucleico codificando o receptor recombinante.

8. O método de qualquer uma das modalidades 1 -7, em que o perfil de espectrometria de massas de referência é de uma amostra de uma composição de referência e a composi- ção de células de referência é uma composição obtida de- poism antes ou durante um estágio do processo de produção para produção da composição de células geneticamente mo- dificadas.

9. O método de qualquer uma das modalidades 1-8, em que a composição de células geneticamente modificadas é uma amostra obtida de um indivíduo que já recebera a com- posição de células geneticamente modificadas.

10. O método da modalidade 9, em que a amostra obtida do individuo compreende células imun es geneticamente modifi- cadas com o receptor recombinante, opcionalmente detecta- das por citometria de fluxo ou reação em cadeia da polime- rase (PCR).

11. O método da modalidade 9 ou da modalidade 10, em que a amostra obtida do individuo é uma amostra de sang ue ou uma amostra de um tumor.

12. O método de qualquer uma das modalidades 9 -11, em que a amostra obtida do individuo é obtida entre ou entre cerca de 6 e 30 dias, entre ou entre cerca de 14 e 29 dias, ou entre ou entre cerca de 17 e 22 dias depois da adm inis- tração das células geneticamente modificadas ao indivíduo.

13. O método de qualquer uma das modalidades 9 -12, em que a amostra é obtida do indivíduo no momento em que ou aproximadamente quando ou imediatamente depois de célu- las de pico expressando o re ceptor recombinante são detec- táveis no sangue do indivíduo.

14. O método de qualquer uma das modalidades 1 -8, em que a composição de células geneticamente modificadas compreende células que foram colocadas em contato com um agente para produzir uma ativida de dependente de um re- ceptor recombinante, opcionalmente em que o agente é um antígeno alvo que é capaz de ser ligado pelo receptor re- combinante ou é um anticorpo anti-idiotípico específico para o anticorpo.

15. O método de qualquer uma das modalidades 2-14, em que o perfil de espectrometria de massas de referência é um perfil médio de espectros de massas de inúmeras amostras de uma pluralidade de composições de referência.

16. O método da modalidade 15, em que cada uma dentre a pluralidade de composições de referência compreende célu- las compreendendo o receptor recombinante.

17. O método da modalidade 15 ou da modalidade 16, em que cada uma dentre a pluralidade de composições de refe- rência foi produzido pelo mesmo processo ou substancial- mente o mesmo processo que a composição de células gene- ticamente modificadas.

18. Método para avaliação de um processo para produção de uma composição de células geneticamente modificadas, o método compreendendo: (a) obter um perfil de espectrometria de massas médio de uma amostra de uma pluralidade de composições de células geneticamente modificadas de referência ou um subconjunto da mesma, em que cada uma dentre a pluralidade das com- posições de referência compreende um receptor recombinan- te produzido pelo mesmo processo o u substancialmente o mesmo processo; e

(b) determinar a presença, ausência ou nível de variância do perfil de espectrometria de massas médio.

19. O método da modalidade 18, compreendendo ainda se- lecionar o processo para produção de uma composição de células geneticamente modificadas se a variância do perfil de espectrometria de massas entre a pluralidade das compo- sições de referência for de não mais que 40%, não mais que 30%, não mais que 20%, não mais que 10% ou não mais que 5%, ou variar de tal média em n ão mais que um desvio pa- drão entre os componentes de dados do perfil de espectro- metria de massas.

20. O método da modalidade 18 ou da modalidade 19, em que o perfil médio de espectroscopia de massas é de uma amostra baseada em cada uma dentre uma pluralida de de composições de células geneticamente modificadas de refe- rência ou um subconjunto da mesma, em que cada uma den- tre a pluralidade de composições de células geneticamente modificadas de referência é selecionada dentre (1) células em uma composição geneticamente modificada de referên- cia, (2) células CD3+ em uma composição geneticamente modificada de referência; (3) células T CD4+ em uma com- posição geneticamente modificada de referência; (4) células T CD8+ em uma composição geneticamente modificada de referência; (5) células receptor recombinante+ em uma com- posição geneticamente modificada de referência; (6) células receptor recombinante+CD3+ em uma composição genetica- mente modificada de referência, (7) receptor recombinan- te+CD8+ células em uma composição geneticamente modifi- cada de referência, ou (8) células receptor recombinan- te+CD4+ em uma composição geneticamente modificada de referência.

21. O método da modalidade 18 ou da modalidade 19, em que cada uma dentre a pluralidade de composições de refe- rência é produzido por um processo compreendendo: (i) selecionar ou isolar células imunes de uma amostra pro- veniente de um indivíduo, gerando assim uma composição fonte, opcionalmente em que a amostra biológica é uma amostra de leucaférese, uma amostra de aférese ou uma amostra de sangue total; (ii) incubar as células da composição fonte com um reagente estimulador, gerando assim uma composição estimulada, em que a incubação é opcionalmente realizada na presença de uma ou mais citocinas; (iii) introduzir um ácido nucleico codificando o receptor re- combinante nas células imunes da composição estimulada, gerando assim uma composição transformada; e (iv) cultivar a composição estimulada a 37º C por pelo menos 24 horas, gerando assim a composição de células genetica- mente modificadas, em que a cultura é opcionalmente reali- zada na presença de uma ou mais citocinas.

22. O método de qualquer uma das modalidades 1 -17, em que o perfil de espectrometria de massas de teste e o perfil de espectrometria de massas de referência individualmente é um perfil peptídico.

23. O método de qualquer uma das modalidades 1 -17 e 22, em que o perfil de espectrometria de massas de referência é determinado usando a mesma técnica de espectrometria de massas que o perfil de espectrometria de mas sas de teste.

24. Método para caracterização de um processo para produ- ção de uma composição de células geneticamente modifica-

das, o método compreendendo: (a) determinar um primeiro perfil de espectrometria de mas- sas de uma amostra de uma primeira composiçã o de células ou um subconjunto da mesma usando uma técnica de espec- trometria de massas; (b) determinar um segundo perfil de espectrometria de mas- sas de uma amostra de uma segunda composição de células ou um subconjunto da mesma usando uma técnica de espec- trometria de massas; e (c) identificar uma ou mais diferenças na presença, ausência ou nível de pelo menos um componente de dados no primeiro perfil de espectrometria de massas em relação ao segundo perfil de espectrometria de massas, em que a primeira composição de células e a segunda com- posição de células compreendem composições em estágios diferentes de um processo de produção para produção de uma composição de células geneticamente modificadas.

25. O método da modalidade 24, em que a primeira e a se- gunda composições de células estão em estágios diferentes de produção de uma composição de células geneticamente modificadas e são selecionadas dentre: (i) uma composição fonte compreendendo células imunes se- lecionadas ou isoladas de uma amostra biológica de um indi- víduo, opcionalmente em que a amostra biológica é uma amostra de leucaférese, uma amostra de aférese ou uma amostra de sangue total; (ii) uma composição estimulada compreendendo células imu- nes da composição selecionada que foram colocadas em contato com um reagente estimulador, opcionalmente em que o contato foi feito na presença de uma ou mais citocinas;

(iii) uma composição transformada compreendendo células da composição estimulada compreendendo um ácido nuclei- co codificando o receptor recombinante; e (iv) uma composição cultivada compreendendo células da composição transformada que foram cultivadas a ou a cerca de 37ºC por pelo menos 24 horas, opcionalmente em que o cultivo foi realizado na presença de uma ou mais citocinas.

26. O método da modalidade 24 ou da modalidade 25, em que a primeira composição de células é uma composição de um estágio anterior ou de um instante anterior do processo de produção em relação à segunda composição de células.

27. Método para caracterização de um processo para pr odu- ção de uma composição de células geneticamente modifica- das, o método compreendendo: (a) determinar um primeiro perfil de espectrometria de mas- sas de uma amostra de uma primeira composição de células ou um subconjunto da mesma usando uma técnica de espec- trometria de massas; (b) determinar um segundo perfil de espectrometria de mas- sas de uma amostra de uma segunda composição de células ou um subconjunto da mesma usando uma técnica de espec- trometria de massas; e (c) identificar uma ou mais diferenças na presença, ausência ou nível de pelo menos um componente dos dados no primei- ro perfil de espectrometria de massas em relação ao segun- do perfil de espectrometria de massas, em que a primeira composição de células e a segunda com- posição de células compreendem células geneticamente mo- dificadas produzidas por diferentes processos.

28. O método da modalidade 27, em que os diferentes pro-

cessos diferem em um ou mais dentre a presença ou a con- centração de soro; tempo em cultura; lote de reagente; ma- nipulação ou armazenamento de um reagente; presença ou quantidade de um reagente estimulador; o tipo de um rea- gente estimulador; presença ou quantidade de uma ou mais citocinas; presença ou quantidade de aminoácidos; tempera- tura; a fonte ou tipos de células imunes de uma c omposição fonte; a relação ou percentagem de células imunes em uma composição fonte, opcionalmente a relação de células CD4+/CD8+; densidade celular; cultura estática; cultura osci- lante; perfusão; o tipo de vetor viral; o número de cópias do vetor; a presença de um adjuvante de transdução; densidade celular de uma composição fonte em criopreservação; a ex- tensão de expressão do receptor recombinante; a presença de um composto para modular um fenótipo celular.

29. O método de qualquer uma das modalidades 24 -28, em que o primeiro perfil de espectrometria de massas e o se- gundo perfil de espectrometria de massas individualmente é um perfil peptídico.

30. O método de qualquer uma das modalidades 24 -29, em que o primeiro perfil de espectrometria de massas e o se- gundo perfil de espectrometria de massas são determinados usando a mesma técnica de espectrometria de massas.

31. Método para caracterização de um receptor recombinan- te, o método compreendendo obter um perfil de espectrome- tria de massas de teste de um recepto r recombinante, usan- do uma técnica de espectrometria de massas, de uma amos- tra de uma composição de células geneticamente modifica- das de teste ou de um subconjunto da mesma compreenden- do células imunes expressando ou compreendendo o recep-

tor recombinante, o referido perfil de espectrometria de mas- sas compreendendo pelo menos um componente dos dados.

32. O método da modalidade 31, compreendendo ainda identificar uma ou mais diferenças no pelo menos um com- ponente dos dados em relação a um perfil de espectrometria de massas das mesmas células, porém sem expressar o re- ceptor recombinante.

33. O método da modalidade 31 ou da modalidade 32, em que a composição de células geneticamente modificadas fora estimulada na presença de um reagente estimulador.

34. O método de qualquer uma das modalidades 31 -33, em que a composição de células geneticamente modificadas compreende células que foram colocadas em contato com um agente para produzir uma atividade dependente de um re- ceptor recombinante, opcionalmente em que o agen te é um antígeno alvo que é capaz de ser ligado pelo receptor re- combinante ou é um anticorpo idiotípico específico para o anticorpo.

35. O método de qualquer uma das modalidades 31 -34, compreendendo ainda identificar uma ou mais diferenças no perfil de espectrometria de massas em relação a uma espec- trometria de massas da mesma composição de células gene- ticamente modificadas, mas que não fora estimulada na pre- sença de um reagente estimulador ou fora estimulada na presença de um reagente estimulador diferente .

36. O método de qualquer uma das modalidades 1 -35, em que a composição de células é enriquecida nas células imu- nes.

37. O método de qualquer uma das modalidades 1 -36, em que as células imunes compreendem linfócitos.

38. O método da modalidade 37, em que os linfócitos com- preendem células T ou células exterminadoras (NK) naturais.

39. O método da modalidade 38, em que os linfócitos com- preendem células T e as células T são células T CD4+ e/ou CD8+.

40. O método de qualquer uma das modalidades 1 -39, em que as células imunes são humanas.

41. O método de qualquer uma das modalidades 4, 21, 25 e 28-40, em que as células imunes são células T, opcional- mente células T CD4+ e/ou CD8+, e o reagente estimulador é capaz de ativar um ou mais domínios de sinalização i ntra- celular de um ou mais componentes de um complexo de TCR e/ou um ou mais domínios de sinalização intracelular de uma ou mais moléculas coestimuladoras.

42. O método da modalidade 41, em que o reagente estimu- lador compreende um agente primário que se lig a especifi- camente a um membro de um complexo de TCR e um agente secundário que se liga especificamente a uma molécula co- estimuladora de células T.

43. O método da modalidade 42, em que o agente primário liga-se especificamente à CD3 e/ou a molécula coes timula- dora é selecionada do grupo que consiste em CD28, CD137 (4-1-BB), OX40, ou ICOS.

44. O método de qualquer uma das modalidades 4, 21, 25 e 28-43, em que o reagente estimulador compreende um anti- corpo anti-CD3 ou um fragmento de ligação de antígeno do mesmo e um anticorpo anti-CD28 ou um fragmento de liga- ção de antígeno do mesmo.

45. O método de qualquer uma das modalidades 42 -44, em que os agentes primário e secundário estão presentes na superfície de um suporte sólido, opcionalmente em que o su- porte sólido é uma conta.

46. O método de qualquer uma das modalidades 42 -44, em que os agentes primário e secundário estão presentes na superfície de um reagente oligomérico solúvel compreenden- do a estreptavidina ou uma estreptavidina muteína.

47. O método de qualquer uma das modalidades 4, 21, 25 e 28-46, em que o cultivo foi realizado em condições para promover a proliferação e/ou a expansão das células geneti- camente modificadas.

48. O método de qualquer uma das modalidades 1 -47, em que a amostra é processada a partir da composição de célu- las geneticamente modificadas por marcação de uma ou mais proteínas de superfície, lise das células, e isolamento da uma ou mais proteínas.

49. O método da modalidade 48, compreendendo ainda a digestão da uma ou mais proteínas isoladas.

50. Um método para avaliação de proteínas de superfície de uma composição de células geneticamente modificadas, o método compreendendo: (a) marcar uma ou mais proteínas de superfície presentes nas células de uma composição de células genetica mente modificadas ou um subconjunto da mesma, a composição de células geneticamente modificadas compreendendo células expressando ou compreendendo um receptor recombinante, gerando assim uma composição de células marcadas; (b) lisar as células da composiçã o de células marcada, ge- rando assim uma composição de células lisadas; (c) isolar a uma ou mais proteínas de superfície da composi- ção de células lisadas para obter uma ou mais proteínas iso-

ladas; e (d) submeter a uma ou mais proteínas isoladas a uma técni- ca de espectrometria de massas para obter um perfil de es- pectrometria de massas compreendendo um ou mais compo- nentes de dados.

51. O método da modalidade 50, em que antes de (d) com- preendendo ainda a digestão da uma ou mais proteínas iso- ladas.

52. O método da modalidade 49 ou da modalidade 51, em que a digestão é realizada por proteólise na presença de uma ou mais proteases que são capazes de clivar uma ou mais ligações peptídicas.

53. O método da modalidade 52, em que a uma ou mais pro- teases são ou compreendem tripsina.

54. O método de qualquer uma das modalidades 48 -53, em que a uma ou mais proteínas compreendem proteínas da membrana da superfície celular.

55. O método de qualquer uma das modalidades 48 -54, em que a lise das células compreende incubaç ão na presença de um detergente.

56. O método da modalidade 55, em que o detergente é um detergente não iônico.

57. O método da modalidade 56, em que o detergente é ou compreende uma quantidade eficaz de Triton X-100.

58. O método da modalidade 55, em que o detergente é um detergente desnaturante.

59. O método da modalidade 58, em que o detergente des- naturante é ou compreende uma quantidade eficaz de dode- cil sulfato de sódio (SDS).

60. O método de qualquer uma das modalidades 55 -59, em que depois da lise das células, o método compreende ainda remover o detergente da composição lisada.

61. O método de qualquer uma das modalidades 48 -60, em que a marcação das proteínas superficiais compreende mar- cação com aminas primárias com biotina.

62. O método da modalidade 61, em que a uma ou mais pro- teínas são isoladas usando um reagente compreendendo avidina, estreptavidina, NeutrAvidin™ ou CaptAvidin™.

63. O método de qualquer uma das modalidades 1 -62, em que a técnica de espectrometria de massas compreende submeter a amostra à cromatografia líquida (LC) seguida por espectrometria de massas.

64. O método da modalidade 63, em que a cromatografia líquida é cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC), cromatografia líquida de ultra-alta eficiência (UHPLC), ou cromatografia líquida de ultra eficiência (UPLC).

65. O método da modalidade 63 ou da modalidade 64, em que a cromatografia líquida é cromatografia líquida de ultra eficiência (UPLC).

66. O método de qualquer uma das modalidades 63 -65, em que a cromatografia líquida e a espectrometria de massas são realizadas online.

67. O método de qualquer uma das modalidades 63 -66, em que a cromatografia líquida é selecionada dentre cromato- grafia em fase normal (NP), em fase reversa (RP) e de inte- ração hidrofílica (HILIC).

68. O método de qualquer uma das modalidades 63 -67, em que o espectrômetro de massas que executa a espectrome- tria de massas compreende um ou mais de um analisador de massas quadrupolo, com armadilha de íons, por tempo de voo (TOF), ou por ressonância ciclo trônica de íons por trans- formada de Fourier.

69. O método da modalidade 68, em que o espectrômetro de massas compreende um analisador de massas com armadi- lha de íons que é um analisador de massas com armadilha de íons quadrupolo tridimensional, um anali sador de massas com armadilha de íons cilíndrico, um analisador de massas com armadilha de íons quadrupolo linear, ou um analisador de massas Orbitrap.

70. O método da modalidade 69, em que o espectrômetro de massas é um espectrômetro massas quadrupolo -Orbitrap.

71. O método de qualquer uma das modalidades 1 -70, em que os componentes de dados são selecionados dentre in- formações sobre os íons de MS, cromatógrafo de íons totais (TIC) ou uma parte do mesmo, cromatograma de íons extraí- dos (XIC) ou uma parte do mesmo, pico de sinais de íons de MS de peptídios, pico de sinais de íons de MS de proteínas, informações de identificação de peptídios, informações de identificação de proteínas, informações qualitativas, informa- ções quantitativas, informações estrutura is, modificações pós-translacionais.

72. O método da modalidade 71, em que o componente de dados é um XIC ou uma parte do mesmo, em que o XIC ou parte do mesmo baseia-se em um ou mais valores m/z teóri- cos ou conhecidos de um ou mais componentes peptídicos do receptor recombinante.

73. O método da modalidade 72, em que o um ou mais com- ponentes peptídicos é um componente peptídico proteoliti- camente clivado ou digerido, opcionalmente em que a pro- tease é tripsina.

74. O método de qualquer uma das modalidades 1 -73, em que o receptor recombinante é ou compreende um receptor quimérico e/ou um receptor de antígeno recombinante.

75. O método de qualquer uma das modalidades 1 -76, em que o receptor recombinante é capaz de se ligar a um antí- geno alvo que é associado, a específico para, e/ou expresso em uma célula ou tecido de uma doença, distúrbio ou condi- ção.

76. O método da modalidade 75, em que a doença, distúrbio ou condição é uma doença ou distúrbio infeccioso, uma do- ença autoimune, uma doença inflamatória, ou um tu mor ou um câncer.

77. O método da modalidade 75 ou da modalidade 76, em que o antígeno alvo é um antígeno tumoral.

78. O método de qualquer uma das modalidades 75 -77, em que o antígeno alvo é selecionado dentre integrina αvβ6 (in- tegrina avb6), antígeno de maturação de células B (BCMA), B7-H3, B7-H6, anidrase carbônica 9 (CA9, também conheci- da como CAIX or G250), um antígeno câncer -testículo, antí- geno câncer/testículo 1B (CTAG, também conhecido como NY-ESO-1 e LAGE-2), antígeno carcinoembrionário (CEA), uma ciclina, ciclina A2, ligante 1 de quimiocina C-C (CCL-1), CD19, CD20, CD22, CD23, CD24, CD30, CD33, CD38, CD44, CD44v6, CD44v7/8, CD123, CD133, CD138, CD171, proteo- glicano sulfato de condroitina 4 (CSPG4), proteína de fator de crescimento epidérmico (EGFR) , proteína truncada de fa- tor de crescimento epidérmico (tEGFR), mutação do receptor de fator de crescimento epidérmico tipo III (EGFR vIII), gli- coproteína epitelial 2 (EPG-2), glicoproteína epitelial 40 (EPG-40), efrinB2, receptor de efrina A2 (EPHa2), rec eptor de estrogênio, receptor Fc like 5 (FCRL5; também conhecido como receptor Fc homólogo 5 ou FCRH5), receptor de acetil- colina fetal (fetal AchR), uma proteína de ligação de folato (FBP), receptor alfa de folato, gangliosídeo GD2, GD2 O - acetilado (OGD2), gangliosídeo GD3, glicoproteína 100 (gp100), glipicano-3 (GPC3), receptor 5D acoplado à proteí- na G (GPCR5D), Her2/neu (tirosina quinase receptora erb - B2), Her3 (erb-B3), Her4 (erb-B4), dímeros de erbB, antígeno associado à melanoma humano de alto peso molecular (HMW -MAA), antígeno de superfície da hepatite B, antígeno leucocitário humano A1 (HLA-A1), antígeno leucocitário hu- mano A2 (HLA-A2), receptor alfa de IL-22 (IL-22Rα), receptor alfa 2 de IL-13 (IL-13Rα2), receptor do domínio inserto qui- nase (kdr), cadeia leve capa, molécula de adesão de células L1 (L1-CAM), epítopo CE7 de L1-CAM, repetição rica em leucina contendo o membro A da família 8 (LRRC8A), Lewis Y, antígeno associado a melanoma (MAGE) -A1, MAGE-A3, MAGE-A6, MAGE-A10, mesotelina (MSLN), c-Met, citomega- lovírus murino (CMV), mucina 1 (MUC1), MUC16, ligantes de membro D do grupo 2 de células exterminadoras naturais (NKG2D), melana A (MART -1), molécula de adesão de célu- las neurais (NCAM), antígeno oncofetal, antígeno de mela- noma preferencialmente expresso (PRAME), receptor de pro- gesterona, um antígeno específico para próstata, antígeno de células-tronco da próstata (PSCA), antígeno membranar específico para próstata (PSMA), receptor órfão 1 receptor tirosina quinase like (ROR1), survivina, glicoproteína trofo- blástica (TPBG, também conhecida como 5T4), glicoproteína 72 associada a tumor (TAG72), proteína 1 relacionada à tiro- sinase (TRP1, também conhecida como TYRP1 ou gp75),

proteína 2 relacionada à tirosinase (TRP2, também conheci- da como dopacroma tautomerase, dopacroma delta- isomerase ou DCT), receptor do fator de crescimento endote- lial vascular (VEGFR), receptor do fator de crescimento en- dotelial vascular 2 (VEGFR2), tumor de W ilms 1 (W T -1), um antígeno patógeno-específico ou expresso em patógenos, ou um antígeno associado a uma etiqueta universal, e/ou molé- culas biotiniladas, e/ou moléculas expressas por HIV, HCV, HBV ou outros patógenos.

79. O método de qualquer uma das modalidades 1 -78, em que o receptor recombinante é ou compreende um receptor de antígeno funcional não-TCR ou um TCR ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo.

80. O método de qualquer uma das modalidades 1 -79, em que o receptor recombinante é um receptor de antígeno qui- mérico (CAR).

81. O método de qualquer uma das modalidades 1 -80, em que a amostra é da composição de células ou um subconjun- to da mesma selecionada dentre (1) células na composição de células, (2) células CD3+ na composição de células; (3) células T CD4+ na composição de células; (4) células T CD8+ na composição de células; (5) receptor recombinante+ células na composição de células; (6) receptor recombinan- te+células CD3+ na composição de células, (7) receptor re- combinante+CD8+ células na composição de células, ou (8) receptor recombinante+CD4+ células na composição de célu- las, opcionalmente em que o receptor recombinante é um CAR.

82. Uma composição de células geneticamente modificadas, em que a composição de células geneticamente modificadas é produzida por um processo no qual o perfil de espectrome- tria de massas, obtido usando uma técnica de espectrocopia de massas, de uma amostra da composição de células gene- ticamente modificadas ou um subconjunto da mesma varia em não mais que 40%, não mais que 30%, não mais que 20%, não mais que 10% ou não mais que 5% entre o perfi l de espectrometria de massas médio de uma pluralidade de composições de células geneticamente modificadas produzi- das pelo processo, ou varia de tal média em não mais que um desvio padrão entre componentes de dados do perfil de espectrometria de massas.

83. A composição de células geneticamente modificadas da modalidade 82, em que a composição de células genetica- mente modificadas compreende um receptor recombinante.

84. A composição de células geneticamente modificadas da modalidade 82 ou da modalidade 83, em que a composição de células geneticamente modificadas compreende células imunes.

85. A composição de células geneticamente modificadas da modalidade 84, em que o processo para prdoução da compo- sição de células geneticamente modificadas compreende: (i) selecionar ou isolar células imunes de uma amostra pro- veniente de um indivíduo, gerando assim uma composição fonte, opcionalmente em que a amostra biológica é uma amostra de leucaférese, uma amostra de aférese ou uma amostra de sangue total; (ii) incubar as células da composição fonte com um reagente estimulador, gerando assim uma composição estimulada, em que a incubação é opcionalmente realizada na presença de uma ou mais citocinas;

(iii) introduzir um ácido nucleico codificando o receptor re- combinante nas células imunes da composição estimulada, gerando assim uma composição transformada; e (iv) cultivar a composição estimulada a 37º C por pelo menos 24 horas, gerando assim a composição de células genetica- mente modificadas, em que a cultura é opcionalme nte reali- zada na presença de uma ou mais citocinas.

86. A composição de células geneticamente modificadas da modalidade 84 ou da modalidade 85, em que a composição de células é enriquecida nas células imunes.

87. A composição de células geneticamente modif icadas de qualquer uma das modalidades 84-86, em que as células imunes compreendem linfócitos.

88. A composição de células geneticamente modificadas da modalidade 87, em que os linfócitos compreendem células T ou células exterminadoras (NK) naturais.

89. A composição de células geneticamente modificadas da modalidade 88, em que os linfócitos compreendem células T e as células T são células T CD4+ e/ou CD8+.

90. A composição de células geneticamente modificadas de qualquer uma das modalidades 84-89 , em que as células imunes são humanas.

91. A composição de células geneticamente modificadas de qualquer uma das modalidades 85-90, em que as células imunes são células T, opcionalmente células T CD4+ e/ou CD8+, e o reagente estimulador é capaz de ativar um ou mais domínios de sinalização intracelular de um ou mais componentes de um complexo de TCR e/ou um ou mais do- mínios de sinalização intracelular de uma ou mais moléculas coestimuladoras.

92. A composição de células geneticamente modificadas da modalidade 91, em que o reagente estimulador compreende um agente primário que se liga especificamente a um mem- bro de um complexo de TCR e um agente secundário que se liga especificamente a uma molécula coestimuladora de célu- las T.

93. A composição de células geneticam ente modificadas da modalidade 92, em que o agente primário liga -se especifica- mente à CD3 e/ou a molécula coestimuladora é selecionada do grupo que consiste em CD28, CD137 (4 -1-BB), OX40, ou ICOS.

94. A composição de células geneticamente modificadas de qualquer uma das modalidades de qualquer uma das modali- dades 85-93, em que o reagente estimulador compreende um anticorpo anti-CD3 ou um fragmento de ligação de antígeno do mesmo e um anticorpo anti -CD28 ou um fragmento de li- gação de antígeno do mesmo.

95. A composição de células geneticamente modificadas de qualquer uma das modalidades 92-94, em que os agentes primário e secundário estão presentes na superfície de um suporte sólido, opcionalmente em que o suporte sólido é uma conta.

96. A composição de células geneticamente modificadas de qualquer uma das modalidades 92-95, em que os agentes primário e secundário estão presentes na superfície de um reagente oligomérico solúvel compreendendo a estreptavidi- na ou uma estreptavidina muteína.

97. A composição de células geneticamente modificadas de qualquer uma das modalidades 85-96, em que o cultivo foi realizado em condições para promover a proliferação e/ou a expansão das células geneticamente modificadas.

98. A composição de células geneticamente modificadas de qualquer uma das modalidades 82-97, em que a amostra é processada a partir da composição de células geneticamente modificadas por marcação de uma ou mais proteínas de su- perfície, lise das células, e isolamento da uma ou mais prote- ínas.

99. A composição de células geneticamente modificadas da modalidade 98, compreendendo ainda a digestão da uma ou mais proteínas isoladas.

100. A composição de células geneticamente modificadas da modalidade 98 ou da modalidade 99, em que a digestão é realizada por proteólise na presença de uma ou mais protea- ses que são capazes de clivar uma ou mais ligações peptídi- cas.

101. A composição de células geneticamente modificadas da modalidade 100, em que a uma ou mais proteases são ou compreendem tripsina.

102. A composição de células geneticamente modificadas de qualquer uma das modalidades 98-101, em que a uma ou mais proteínas compreendem proteínas da membrana da su- perfície celular.

103. A composição de células geneticamente modificadas de qualquer uma das modalidades 98-102, em que a lise das cé- lulas compreende incubação na presença de um detergente.

104. A composição de células geneticamente modificadas da modalidade 55, em que o detergente é um detergente não iônico.

105. A composição de células geneticamente modificadas da modalidade 104, em que o detergente é ou compreende uma quantidade eficaz de Triton X-100.

106. A composição de células geneticamente modificadas da modalidade 105, em que o detergente é um detergente des- naturante.

107. A composição de células geneticamen te modificadas da modalidade 106, em que o detergente desnaturante é ou compreende uma quantidade eficaz de dodecil sulfato de só- dio (SDS).

108. A composição de células geneticamente modificadas de qualquer uma das modalidades 98-107, em que depois da lise das células, o método compreende ainda remover o de- tergente da composição lisada.

109. A composição de células geneticamente modificadas de qualquer uma das modalidades 98-108, em que a marcação das proteínas superficiais compreende marcação com aminas primárias com biotina.

110. A composição de células geneticamente modificadas da modalidade 109, em que a uma ou mais proteínas são isola- das usando um reagente compreendendo avidina, estreptavi- dina, NeutrAvidin™ ou CaptAvidin™.

111. A composição de células geneticamente modificadas de qualquer uma das modalidades 82-110, em que a técnica de espectrometria de massas compreende submeter a amostra à cromatografia líquida (LC) seguida por espectrometria de massas.

112. A composição de células geneticamente modifi cadas da modalidade 111, em que a cromatografia líquida é cromato- grafia líquida de alta eficiência (HPLC), cromatografia líquida de ultra-alta eficiência (UHPLC), ou cromatografia líquida de ultra eficiência (UPLC).

113. A composição de células geneticam ente modificadas da modalidade 111 ou da modalidade 112, em que a cromato- grafia líquida é cromatografia líquida de ultra eficiência (UPLC).

114. A composição de células geneticamente modificadas de qualquer uma das modalidades 111-113, em que a cromato- grafia líquida e a espectrometria de massas são realizadas online.

115. A composição de células geneticamente modificadas de qualquer uma das modalidades 111-114, em que a cromato- grafia líquida é selecionada dentre cromatografia em fase normal (NP-), em fase reversa (RP) e de interação hidrofílica (HILIC).

116. A composição de células geneticamente modificadas de qualquer uma das modalidades 111-115, em que o espectrô- metro de massas que executa a espectrometria de massas compreende um ou mais de um analisador de massas qua- drupolo, com armadilha de íons, por tempo de voo (TOF), ou por ressonância ciclotrônica de íons por transformada de Fourier.

117. A composição de células geneticamente modificadas da modalidade 116, em que o espectrômetro de massas com- preende um analisador de massas com armadilha de íons que é um analisador de massas com armadilha de íons qua- drupolo tridimensional, um analisador de massas com arma- dilha de íons cilíndrico, um analisador de massas com arma- dilha de íons quadrupolo linear, o u um analisador de massas Orbitrap.

118. A composição de células geneticamente modificadas da modalidade 117, em que o espectrômetro de massas é um espectrômetro massas quadrupolo -Orbitrap.

119. A composição de células geneticamente modificadas de qualquer uma das modalidades 82-118, em que os compo- nentes de dados são selecionados dentre informações sobre os íons de MS, cromatógrafo de íons totais (TIC) ou uma par- te do mesmo, cromatograma de íons extraídos (XIC) ou uma parte do mesmo, pico de sinais de í ons de MS de peptídios, pico de sinais de íons de MS de proteínas, informações de identificação de peptídios, informações de identificação de proteínas, informações qualitativas, informações quantitati- vas, informações estruturais, modificações pós -transla- cionais.

120. A composição de células geneticamente modificadas da modalidade 119, em que o componente de dados é um XIC ou uma parte do mesmo, em que o XIC ou parte do mesmo baseia-se em um ou mais valores m/z teóricos ou conhecidos de um ou mais componentes peptídicos do receptor recombi- nante.

121. A composição de células geneticamente modificadas da modalidade 120, em que o um ou mais componentes peptídi- cos é um componente peptídico proteoliticamente clivado ou digerido, opcionalmente em que a protease é tripsina.

122. A composição de células geneticamente modificadas de qualquer uma das modalidades 82-121, em que o receptor recombinante é ou compreende um receptor quimérico e/ou um receptor de antígeno recombinante.

123. A composição de células geneticame nte modificadas de qualquer uma das modalidades 82-122, em que o receptor recombinante é capaz de se ligar a um antígeno alvo que é associado, a específico para, e/ou expresso em uma célula ou tecido de uma doença, distúrbio ou condição.

124. A composição de células geneticamente modificadas da modalidade 123, em que a doença, distúrbio ou condição é uma doença ou distúrbio infeccioso, uma doença autoimune, uma doença inflamatória, ou um tumor ou um câncer.

125. A composição de células geneticamente modific adas da modalidade 123 ou da modalidade 124, em que o antígeno alvo é um antígeno tumoral.

126. A composição de células geneticamente modificadas de qualquer uma das modalidades 123-125, em que o antígeno alvo é selecionado dentre integrina αvβ6 (integrina avb6), antígeno de maturação de células B (BCMA), B7-H3, B7-H6, anidrase carbônica 9 (CA9, também conhecida como CAIX or G250), um antígeno câncer-testículo, antígeno cân- cer/testículo 1B (CTAG, também conhecido como NY-ESO-1 e LAGE-2), antígeno carcinoembrionário (CEA), uma ciclina, ciclina A2, ligante 1 de quimiocina C-C (CCL-1), CD19, CD20, CD22, CD23, CD24, CD30, CD33, CD38, CD44, CD44v6, CD44v7/8, CD123, CD133, CD138, CD171, proteo- glicano sulfato de condroitina 4 (CSPG4), proteína de fator de crescimento epidérmico (EGFR), proteína truncada de fa- tor de crescimento epidérmico (tEGFR), mutação do receptor de fator de crescimento epidérmico tipo III (EGFR vIII), gli- coproteína epitelial 2 (EPG-2), glicoproteína epitelial 40 (EPG-40), efrinB2, receptor de efrina A2 (EPHa2), receptor de estrogênio, receptor Fc like 5 (FCRL5; também conhecido como receptor Fc homólogo 5 ou FCRH5), receptor de acetil- colina fetal (fetal AchR), uma proteína de ligação de folato (FBP), receptor alfa de folato, gangliosídeo GD2, GD2 O- acetilado (OGD2), gangliosídeo GD3, glicoproteína 100

(gp100), glipicano-3 (GPC3), receptor 5D acoplado à proteí- na G (GPCR5D), Her2/neu (tirosina quinase receptora erb - B2), Her3 (erb-B3), Her4 (erb-B4), dímeros de erbB, antígeno associado à melanoma humano de alto peso molecular (HMW -MAA), antígeno de superfície da hepatite B, antígeno leucocitário humano A1 (HLA-A1), antígeno leucocitário hu- mano A2 (HLA-A2), receptor alfa de IL-22 (IL-22Rα), receptor alfa 2 de IL-13 (IL-13Rα2), receptor do domínio in serto qui- nase (kdr), cadeia leve capa, molécula de adesão de células L1 (L1-CAM), epítopo CE7 de L1-CAM, repetição rica em leucina contendo o membro A da família 8 (LRRC8A), Lewis Y, antígeno associado a melanoma (MAGE) -A1, MAGE-A3, MAGE-A6, MAGE-A10, mesotelina (MSLN), c-Met, citomega- lovírus murino (CMV), mucina 1 (MUC1), MUC16, ligantes de membro D do grupo 2 de células exterminadoras naturais (NKG2D), melana A (MART -1), molécula de adesão de célu- las neurais (NCAM), antígeno oncofetal, antígeno de mela- noma preferencialmente expresso (PRAME), receptor de pro- gesterona, um antígeno específico para próstata, antígeno de células-tronco da próstata (PSCA), antígeno membranar específico para próstata (PSMA), receptor órfão 1 receptor tirosina quinase like (ROR1), survivina, glicoproteína trofo- blástica (TPBG, também conhecida como 5T4), glicoproteína 72 associada a tumor (TAG72), proteína 1 relacionada à tiro- sinase (TRP1, também conhecida como TYRP1 ou gp75), proteína 2 relacionada à tirosinase (TRP2, também conhec i- da como dopacroma tautomerase, dopacroma delta - isomerase ou DCT), receptor do fator de crescimento endote- lial vascular (VEGFR), receptor do fator de crescimento en- dotelial vascular 2 (VEGFR2), tumor de W ilms 1 (W T -1), um antígeno patógeno-específico ou expresso em patógenos, ou um antígeno associado a uma etiqueta universal, e/ou molé- culas biotiniladas, e/ou moléculas expressas por HIV, HCV, HBV ou outros patógenos.

127. A composição de células geneticamente modificadas de qualquer uma das modalidades 82-126, em que o receptor recombinante é ou compreende um receptor de antígeno fun- cional não-TCR ou um TCR ou fragmento de ligação de antí- geno do mesmo.

128. A composição de células geneticamente modificadas de qualquer uma das modalidades 8, em que o receptor recom- binante é um receptor de antígeno quimérico (CAR).

129. Um método para avaliação de um reagente usado no processo de produção de uma composição de células geneti- camente modificadas, o método compreendendo: (a) comparar um perfil de espectrometria de massas de uma amostra de um primeiro reagente com um perfil de espectro- metria de massas de referência do reagente, em que o perfil de espectrometria de massas é obtido usando uma técnica de espectrometria de massas; e (c) identificar uma ou mais diferenças na presença, ausência ou nível de pelo menos um componente dos dados no perfil de espectrometria de massas de teste em relação ao perfil de espectrometria de massas de referência, identificando as- sim um perfil de espectrometria de massas do reagente.

130. O método da modalidade 129, em que o perfil de espec- trometria de massas de referência é de uma amostra de um reagente de referência ou é um perfil médio de espectros de massas de inúmeras amostras de uma pluralidade de lotes diferfentes do reagente.

131. O método da modalidade 130, em que o perfil de espec- trometria de massas de referência é um perfil de espectro- metria de massas médio de uma amostra de uma pluralidade de lotes diferentes do reagente.

132. O método da modalidade 131, compreendendo ainda de- terminar a presença, ausência ou nível de variância do perfil de espectrometria de massas da amostra para o perfil de es- pectrometria de massas médio.

133. O método da modalidade 132, compreendendo ainda se- lecionar um reagente se a variância do perfil de espectrome- tria de massas entre a pluralidade de lotes diferentes do re- agente for não mais que 40%, não mais que 30%, não mais que 20%, não mais que 10% ou não mais que 5%, ou variar de tal médica em não mais que um desvio padrão entre com- ponentes de dados do perfil de espectrometria de massas.

134. O método de qualquer uma das modalidades 129 -133, em que a técnica de espectrometria de massas compreende submeter a amostra à cromatografia líquida (LC) seguida por espectrometria de massas.

135. O método da modalidade 134, em que a cromatografia líquida é cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC), cromatografia líquida de ultra-alta eficiência (UHPLC), ou cromatografia líquida de ultra eficiência (UPLC).

136. O método da modalidade 135 ou da modalidade 135, em que a cromatografia líquida é cromatografia líquida de ultra eficiência (UPLC).

137. O método de qualquer uma das modalidades 134 -136, em que a cromatografia líquida e a espectrometria de mas- sas são realizadas online.

138. O método de qualquer uma das modalidades 134-137,

em que a cromatografia líquida é selecionada dentre croma- tografia em fase normal (NP-), em fase reversa (RP) e de in- teração hidrofílica (HILIC).

139. O método de qualquer uma das modalidades 134 -138, em que o espectrômetro de massa s que executa a espectro- metria de massas compreende um ou mais de um analisador de massas quadrupolo, com armadilha de íons, por tempo de voo (TOF), ou por ressonância ciclotrônica de íons por trans- formada de Fourier.

140. O método da modalidade 139, em que o espectrômetro de massas compreende um analisador de massas com arma- dilha de íons que é um analisador de massas com armadilha de íons quadrupolo tridimensional, um analisador de massas com armadilha de íons cilíndrico, um analisador de massas com armadilha de íons quadrupolo linear, ou um analisador de massas Orbitrap.

141. O método da modalidade 140, em que o espectrômetro de massas é um espectrômetro massas quadrupolo -Orbitrap.

142. O método de qualquer uma das modalidades 129 -410, em que os componentes de dados são selecionados dentre informações sobre os íons de MS, cromatógrafo de íons to- tais (TIC) ou uma parte do mesmo, cromatograma de íons extraídos (XIC) ou uma parte do mesmo, pico de sinais de íons de MS de peptídios, pico de sinais de íons de MS de proteínas, informações de identificação de peptídios, infor- mações de identificação de proteínas, informações qualitati- vas, informações quantitativas, informações estruturais, mo- dificações pós-translacionais.

143. O método de qualquer uma das moda lidades 129-142, em que o reagente é um reagente capaz de estimular um si-

nal nas células de uma composição de células, opcionalmen- te uma composição de células T.

144. O método da modalidade 143, em que as células da composição de células compreendem um receptor recombi- nante, opcionalmente um receptor de antígeno quimérico.

145. O método da modalidade 144, em que o reagente é ca- paz de estimular ou induzir uma atividade dependente de um receptor recombinante nas células da composição de células. VI. EXEMPLOS

[00508] Os exemplos a seguir estão incluídos a título ilus- trativo apenas e não se destinamm a limitar o escopo da in- venção. Exemplo 1: Análise da expressão de proteínas superfici- ais de células T por espectrometria de massas

[00509] A expressão de proteínas superficiais de cél ulas coletadas antes ou depois de um processo exemplificativo de manipulação genética para gerar composições de células T contendo receptores de antígenos quiméricos (CAR) expres- sando células T foi analisada por cromatografia líquida - espectrometria de massas em tandem (LC-MS/MS). Compo- sições de células T fonte iniciais enriquecidas para células T CD4+ ou CD8+ foram obtidas a partir de amostras humanas de leucaférese por enriquecimento baseado na imunoafinida- de e foram criocongeladas. As células T CD4+ ou CD 8+ fo- ram subsequentemente descongeladas, ativadas com contas paramagnéticas anti-CD3/anti-CD28, e transduzidas com um vetor viral codificando um CAR anti -CD19, seguido por ex- pansão e criopreservação das composições de células gene- ticamente modificadas. O CAR anti-CD19 contido em um scFv anti-CD19 derivado de um anticorpo murino, um espa-

çador derivado de Ig, um domínio transmembranar derivado de CD28 humana, um domínio de sinalização intracelular de- rivado de 4-1BB humana e um domínio de sinalização deri- vado de CD3 zeta humana.

[00510] As análises por LC-MS/MS foram realizadas em amostras de peptídios subsequente ao isolamento de proteí- nas da superfície celular de amostras de células T tanto da composição de células fonte inicial quanto da composição de células geneticamente modificadas CAR+. Em suma, amos- tras de células T da composição de células fonte inicial e da composição de células geneticamente modificadas CAR+ cri- opreservada ambas contendo aproximadamente 15 -150 x10 6 células foram descongeladas e lavadas. Para marcar as pro- teínas superficiais via aminas primárias na superfície de cé- lulas intactas, as células foram ressuspendidas em uma so- lução de sulfo-NHS-SS-Biotina por adição de PBS gelado a um frasco de biotina (Pierce; Cat. No. 89881). Cada amostra de células ressuspendidas foi transferida para um balão de cultura de células de 25 cm 2 e mais uma alíquota da solução de biotina foi adicionada a cada amostra. Os balões de cultu- ra de células foram então incubados em um a chapa agitado- ra (300 rpm) a 4°C por 30 minutos. Para as amostras da composição de células geneticamente modificadas, o isola- mento de proteínas da superfície celular foi realizado por lise das células com um detergente leve, isolando as proteínas marcadas com a ajuda de um reagente de afinidade à base de agarose (por exemplo, Thermo Scientific™ NeutrAvidin™ Agarose), e liberando as proteínas marcadas com tampão de amostra dodecil sulfato de sódio (SDS) (62,5mM de Tris•HCl, pH 6,8, 1% de SDS, 10% de glicer ol) contendo 50 mM DTT.

Para amostras da composição de células fonte inicial, as proteínas de superfície celular foram eluídas com 200 μL de tampão de amostra dodecil sulfato de sódio (SDS).

[00511] Cada amostra da composição fonte inicial ou da composição de células geneticamente modificadas foi então processada para remover tensoativos por diálise usando um filtro limite de peso molecular nominal (NMW L) de 10.000 com troca de tampão por 400 µL de tampão UA (8M de ureia em 0,1M de Tris-HCl, pH 8,3) para reduzir a s ligações dissul- feto, seguido pela adição de 100 μL de iodoacetamida 50 mM para alquilar os grupos tiol livres nas cisteínas. Depois de lavagem dos filtros com 100 μL de bicarbonato de amônio 50 mM/ureia 3 M seguida por centrifugação várias vezes, as amostras foram coletadas. Em alguns casos, as amostras fo- ram reunidas antes de o procedimento de filtração descrito acima ser efetuado.

[00512] As amostras resultantes foram então submetidas à digestão com tripsina por uma noite a 37 °C. Subsequente à incubação, cada digestão foi resfriada bruscamente pela adi- ção de 10% de ácido trifluoroacético (TFA).

[00513] Amostras da composição de células fonte inicial e da composição de células geneticamente modificadas foram então concentradas conforme necessário (com base em uma avaliação inicial da abundância de peptídios usando croma- tografia líquida) antes da análise por espectrometria de mas- sas). Em alguns casos, as amostras foram reunidas antes do procedimento de concentração descrito acima. Cada amostra foi analisada por um método de espectrometria de massas em tandem usando um espectrômetro de massas quadrupolo Orbitrap híbrido acoplado a um cromatógrafo líquido. Os da-

dos de espectrometria de massas foram adquiridos por uma técnica de aquisição dependente de dados (20 íons mais abundantes selecionados). A configuração do espectrômetro de massas incluiu: resolução da massa MS 1 de 120.000; fai- xa de varredura da MS 1 de 325 – 2000 m/z; MS 1 AGC alvo de 5e5; lista de inclusão de precisão de 5 ppm; resolução da massa MS 2 de 30.000; faixa de varredura da MS 2 de 200 – 2000 m/z; janela de isolamento de 4 m/z; MS 2 AGC alvo de 1e5, e uma energia de fragmentação de 22 (NCE).

[00514] Os conjuntos de dados obtidos de cada análise por LC-MS/MS descrita acima foram analisados pelo software ProteomeDiscover (ThermoScientific v2,1) com o banco de dados de proteomas humanos adquirido na UNIPROT e o banco de dados comum Repository of Adventitious Proteins adquirido na Global Proteome Machine. As configurações do algoritmo de busca incluíram: peptídios trípticos ; clivagem perdida máxima de 2; comprimento mínio do peptído de 6; tolerância de massa do precursor de 10 ppm; tolerância de massa do fragmento de 0,02 Da; modificações dinâmicas pa- ra oxidação de metioninas e marcação de lisinas com biotina; modificações estáticas para carboximetilação de cisteínas; uso de armadilhas com 1% ou menos de FDR; e taxa de falsa descoberta de 1% ou menos (FDR).

[00515] Os peptídio foram validados manualmente usando um cromatograma de íons extraídos de 5 ppm e impressão digital visual de MS 2 .

[00516] A FIG. 1A é uma imagem exemplificativa de um cromatograma de íons totais (TIC) resultante de uma análise por LC-MS/MS de uma amostra da composição de células fonte inicial (metade inferior) e um TIC resultante de uma análise por LC-MS/MS de uma amostra corresponde da com- posição de células geneticamente modificadas (metade supe- rior). Como mostrado na FIG. 1A, foram observadas diferen- ças nos picos correspondentes a diferenças nos íons de pep- tídio das proteínas de superfície celular entre a composição de células fonte inicial e a composição de células genetica- mente modificadas. Usando a técnica de LC -MS/MS descrita acima, foram identificadas 1406 proteínas de superfície celu- lar no total, incluindo 397 proteínas que eram únicas para a composição de células fonte e 223 proteínas que eram úni- cas para a composição de células geneticamente modifica- das.

[00517] Estes dados são consistentes com uma capacidade de análise por LC-MS/MS para distinguir perfis de expressão de proteínas superficiais de composições de células T cole- tadas em diferentes estágios de um processo de manipula- ção genética.

[00518] Um cromatograma de íons extraídos (XIC) foi ge- rado por separação dos íons associados ao CAR anti -CD19 usando massas teóricas de peptídios trípticos dos compo- nentes do CAR (com uma tolerância de 5 ppm do teórico), e foram comparados com a composição fonte inicial e a com- posição de células T geneticamente modificadas. A Fig 1B representa uma imagem exemplificativa de XIC combinados de uma amostra da composição de células fonte inicial (me- tade inferior) e uma amostra correspondente da composição de células geneticamente modificadas CAR+ (metade superi- or). Foram identificados picos de peptídios associados às porções extracelular e intracelular do CAR, com os picos P1 a P19 representando a região extracelular. Foram observa-

das diferenças nos picos no XIC obtido da composição de células geneticamente modificadas, que incluíam células T expressando CAR, em comparação com as células fonte ini- cial que continham células expressando CAR (FIG. 1B ). Al- guns picos associados ao CAR anti -CD19 foram observados no XIC obtido das células fonte inicial, consistente com com- ponentes do CAR também sendo expressos como parte de proteínas endógenas, por exemplo, domínio de sinalização CD3 zeta. Exemplo 2: Análise de reagentes para um processo de manipulação de células T CAR T por espectrometria de massas

[00519] Foi observado que em alguns casos, modificações nas condições de armazenamento ou manuseio das maté- rias-primas ou reagentes de diferentes lotes de matérias - primas ou reagentes usasdos em um processo para produção de uma composição de células T geneticamente modificadas - em um processo similar de manipulação genética de células - podem estar correlacionadas, na composição geneticamen- te modificada final, com cert os parâmetros associados à ati- vidade alterada ou variada do produto de células T geneti- camente modificadas.

[00520] Diferentes lotes de uma matéria-prima exemplifica- tiva usada em um processo para produzir uma composição de células T geneticamente modificadas CAR+, e que foi identificada como um reagente que requeria titulação no pro- cesso devido à variabilidade entre lotes, foram analisados por LC-MS/MS para avaliar a presença ou ausência de dife- renças entre os lotes. Sabia -se ou suspeitava-se a matéria- prima continha três proteínas diferentes. Foram coletadas amostras do reagente de três lotes de fabricação diferentes que atendiam aos critérios de distribuição do fabricante. As proteínas foram isoladas do reagente e analisadas por LC - MS/MS em um processo similar ao descrito no Exemplo 1.

[00521] As proteínas foram separadas por cromatografia em fase reversa. Como mostrado na FIG. 2, diferentes perfis fo- ram observados entre os três lotes diferentes consistente com uma diferença nas quantidades relativas ou proprieda- des das proteínas entre lotes. Análise apenas por LC, no en- tanto, demonstrou a coeluição de diversas proteínas. Para distinguir as proteínas que coeluíram, relações de massa pa- ra carga (m/z) foram pré-selecionadas e detectadas na análi- se (FIG. 2, canto superior esq uerdo). Como mostrado no complemento da FIG. 2, as diferentes proteínas coeluídas puderam ser separadamente detectadas, demonstrando a uti- lidade desse método para identificar diferenças entre lotes de reagentes contendo proteínas cujas quas ou propriedades (por exemplo, modificação pós -translacional) podem diferir.

[00522] Amostras do reagente bruto em três níveis de titu- lação diferentes foram ainda analisadas para duas das prote- ínas que se suspeitava serem mais prováveis de impactar o processo para produção de uma composição de células T geneticamente modificadas. A percentagem relativa de cada uma das duas proteínas em cada uma das amostras tituladas foi quantificada. Como mostrado na FIG. 3, análise dos com- ponentes do reagente por espectrometria de massas indicou que a percentagem relativa da segunda proteína (mais modi- ficações pós-translacionais, PTM, da segunda proteína) do reagente era inversamente correlacionada com a percenta- gem relativa de uma terceira proteína. Estes resultados são consistentes com um efeito combinado proposto da terceira proteína e segunda proteína no processo de manipulação genética de células T CAR conforme mostrado pela correla- ção inversa de suas quantidades relativas nos diferentes ní- veis de titulação. Juntos, estes resultados são consi stentes com um uso de espectrometria de massas, em combinação com o que se sabe sobre a relevância biológica de compo- nentes de proteínas para o processo de manipulação genéti- ca, para auxiliar na identificação da variabilidade de lote pa- ra lote de reagente e de potenciais impactos no processo de fabricação. Exemplo 3: Mapeamento de glicanas N-ligadas superfici- ais de uma composição de células

[00523] Para mapear o perfil de glicanas N -ligadas na su- perfície celular de uma composição de células, composições de células T criopreservadas exemplificativas contendo célu- las expressando um receptor de antígeno quimérico (CAR) foram individualmente descongeladas, diluídas 1:10 em um meio de cultura de células aquecido até 37º C, e uma amos- tra de 1-2,5 x10 6 células foi transferida para um tubo novo.

[00524] A amostra de células transferida foi lavada em so- lução salina tamponada com fosfato (PBS), seguida por re- constituição da suspensão de células com aproximadamente 198 µL de PBS. Aproximadamente 2 µL de PNGase F PRIME (N-Zyme Scientifics; disponível na Bulldog Bio, Catálogo No. NZPP050) foram adicionados à suspensão de células con- tendo células intactas inteiras, seguido por incubação por 30 minutos a 37ºC com misturação delicada. Para obter N - glicanas superficiais liberadas, a suspensão de células foi centrifugada e o sobrenadante foi recolhido em um tubo lim-

po que foi imediatamente evaporado até a secura com centri- fugação solução a vácuo.

[00525] Foram adicionados 5 µL de um reagente de marca- ção composto de um grupo marcador N-hidroxissuccinimida (NHS) carbamato, um fluoróforo de quinolona, e uma amina terciária básica (por exemplo, marcador Glycoworks™ Rapi- Fluor-MS™). A amostra foi misturada, incubada por aproxi- madamente 5 minutos à temperatura ambiente, seguido por resfriamento brusco do marc ador pela adição de aproxima- damente 365 µL de acetonitrila à amostra. A amostra foi mis- turada e centrifugada. Extração de fase sólida (SPE) foi rea- lizada na amostra para remover completamente as N- glicanas antes de análise adicional. A amostra de N-glicanas foi evaporada até a secura com uma centrífuga a vácuo e em seguida ressuspendida em um diluente adequado para análi- se.

[00526] As glicanas foram separadas por cromatografia lí- quida HILIC e detectadas por fluorescência (W aters ACQUITY I-Class) (HILIC-FLR) e espectrometria de massas em tandem (ionização por “electrospray” positiva (ESI), Q - Exactive™ HF (Thermo Scientific)), i.e., HILIC -ESI-MS/MS, para quantificação relativa e identificação.

[00527] Como mostrado na FIG. 4A, o cromatograma de HILIC-FLR comentado revelou que o mapa de N-glicanas na superfície celular de células CD3+ ativadas anti-CD3/anti- CD28 era uma mistura complexa de tipos de glicanas.

[00528] Para espectrometria de massas em tandem (MS/MS), as partículasx foram ionizadas por ESI e separa- das por sua relação de massa para carga no primeiro estágio da espectrometria de massas. A FIG. 4B representa um cro-

matograma de íons extraídos (XIC) produzido a partir do pri- meiro estágio de espectrometria de massas para a N-glicana A3S3F exemplificativa no estado carregado +3 usando uma tolerância de massa de 5 ppm. Foram observados múltiplos picos cromatográficos da N -glicana com distribuições isotó- picas idênticas, o que é consistente com a provável presen ça de diferenças de ligação entre as unidades monossacarídi- cas da estrutura da glicana. Depois do primeiro estágio, as glicanas sofreram fragmentação e os fragmentos resultantes foram separados e medidos no segundo estágio da MS/MS. A fragmentação por MS/MS da N-glicana A3S4F exemplificati- va, fragmentada por dissociação colisionada de alta energia (HCD) a uma energia de colisão normalizada (NCE) igual a 15, está mostrada na FIG. 4C. Combinada com os dados de MS de alta resolução do primeiro estágio, a fragm entação de A3S4F confirmou a presença de uma ligação ácido n -acetil neuramínico no segundo resíduo galactose terminal canôni- co, assim como um sítio único em um resíduo n -acetil gluco- samina da mesma antena (FIG. 4C, caixas). Esses resulta- dos demonstram que MS/MS combinada com os dados de MS de alta resolução podem identificar estruturas de glicanas, incluindo estruturas de glicanas únicas, subsequente à sepa- ração e detecção por HILIC-FLR. Exemplo 4: Identificação de alterações nas glicotransferases por mapeamento das glicanas N- ligadas superficiais

[00529] As glicanas N-ligadas superficiais de uma primeira e uma segunda composição de células são isoladas e mar- cadas de maneira similar àquela descrita no Exemplo 3. As N-glicanas são separadas por cromatografia líquida HILIC e detectadas por fluorescência e espectrometria de massas por HILIC-ESI-MS/MS para quantificação relativa e identificação de maneira similar àquela descrita no Exemplo 3. Os perfis de N-glicanas resultantes da primeira e da segunda compo- sições de células são comparados para identificar diferenças na expressão das N-glicanas individuais. Como genes de gli- cotransferases específicos estão relacionados com a ligação N-glicana, os resultados são correlacionados com dados ge- nômicos (tal como por RNA -seq ou pelo “Assay for Transpo- sase-Accessible Chromatin using sequencing” (ATAC-seq)) obtidos de amostras da primeira e da segunda composição. A correlação identifica alterações na expressão de genes de glicotransferases que acompanha alterações específicas na expressão de N-glicana superficiais.

[00530] A presente invenção não tem seu escopo limitado às modalidades particulares reveladas, que são apresenta- das, por exemplo, para ilustrar vários aspectos da invenção. Várias modificações nas composições e métodos descritos ficarão evidentes a partir da descrição e dos ensinamentos constantes neste pedido. Tais variações podem ser coloca- das em práticas sem se afastar do verdadeiro escopo e espí- rito descrição e se enquadram no escopo da presente descri- ção. Sequências # SEQUENCE ANOTAÇÃO 1 ESKYGPPCPPCP spacer (IgG4dobradiça) (aa) 2 GAATCTAAGTACGGACCGCCCTGCCCCCCTTGCCCT espaçador (IgG4dobradiça) (nt) 3 ESKYGPPCPPCPGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENN Dobradiça-CH3 espaçador

YKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK 4 ESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVD Dobradiça-CH2-CH3 espa- GVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQ çador

PREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSF FLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK

# SEQUENCE ANOTAÇÃO 5 RWPESPKAQASSVPTAQPQAEGSLAKATTAPATTRNTGRGGEEKKKEKEKEEQEERETKTPE IgD-dobradiça-Fc

CPSHTQPLGVYLLTPAVQDLWLRDKATFTCFVVGSDLKDAHLTWEVAGKVPTGGVEEGLLER HSNGSQSQHSRLTLPRSLWNAGTSVTCTLNHPSLPPQRLMALREPAAQAPVKLSLNLLASSD PPEAASWLLCEVSGFSPPNILLMWLEDQREVNTSGFAPARPPPQPGSTTFWAWSVLRVPAPP

SPQPATYTCVVSHEDSRTLLNASRSLEVSYVTDH 6 LEGGGEGRGSLLTCGDVEENPGPR T2A 7 MLLLVTSLLLCELPHPAFLLIPRKVCNGIGIGEFKDSLSINATNIKHFKNCTSISGDLHILP tEGFR

VAFRGDSFTHTPPLDPQELDILKTVKEITGFLLIQAWPENRTDLHAFENLEIIRGRTKQHGQ FSLAVVSLNITSLGLRSLKEISDGDVIISGNKNLCYANTINWKKLFGTSGQKTKIISNRGEN SCKATGQVCHALCSPEGCWGPEPRDCVSCRNVSRGRECVDKCNLLEGEPREFVENSECIQCH PECLPQAMNITCTGRGPDNCIQCAHYIDGPHCVKTCPAGVMGENNTLVWKYADAGHVCHLCH

PNCTYGCTGPGLEGCPTNGPKIPSIATGMVGALLLLLVVALGIGLFM 8 FWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWV CD28 (aminoácidos 153-179 de Acesso N° P10747) 9 IEVMYPPPYLDNEKSNGTIIHVKGKHLCPSPLFPGPSKP CD28 (aminoácidos 114-179 FWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWV de Acesso N° P10747) 10 RSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRS CD28 (aminoácidos 180-220 de P10747) 11 RSKRSRGGHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRS CD28 (LL para GG) 12 KRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCEL 4-1BB (aminoácidos 214- 255 de Q07011.1) 13 RVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNEL CD3 zeta

QKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR 14 RVKFSRSAEPPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNEL CD3 zeta

QKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR 15 RVKFSRSADAPAYKQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNEL CD3 zeta

QKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR 16 RKVCNGIGIGEFKDSLSINATNIKHFKNCTSISGDLHILPVAFRGDSFTHTPPLDPQELDIL tEGFR

KTVKEITGFLLIQAWPENRTDLHAFENLEIIRGRTKQHGQFSLAVVSLNITSLGLRSLKEIS DGDVIISGNKNLCYANTINWKKLFGTSGQKTKIISNRGENSCKATGQVCHALCSPEGCWGPE PRDCVSCRNVSRGRECVDKCNLLEGEPREFVENSECIQCHPECLPQAMNITCTGRGPDNCIQ CAHYIDGPHCVKTCPAGVMGENNTLVWKYADAGHVCHLCHPNCTYGCTGPGLEGCPTNGPKI

PSIATGMVGALLLLLVVALGIGLFM 17 EGRGSLLTCGDVEENPGP T2A 18 GSGATNFSLLKQAGDVEENPGP P2A 19 ATNFSLLKQAGDVEENPGP P2A 20 QCTNYALLKLAGDVESNPGP E2A 21 VKQTLNFDLLKLAGDVESNPGP F2A 22 -PGGG-(SGGGG)5-P- wherein P is proline, G is glycine and S is Linker serine 23 GSADDAKKDAAKKDGKS Ligante 24 atgcttctcctggtgacaagccttctgctctgtgagttaccacacccag- Sequência sinal da cadeia cattcctcctgatccca alfa GMCSFR 25 MLLLVTSLLLCELPHPAFLLIP Sequência sinal da cadeia alfa GMCSFR 26 MALPVTALLLPLALLLHA Peptídio sinal CD8 alfa 27 EPKSCDKTHTCPPCP Dobradiça 28 ERKCCVECPPCP Dobradiça

# SEQUENCE ANOTAÇÃO 29 ELKTPLGDTHTCPRCPEPKSCDTPPPCPRCPEPKSCDTPPPCPRCPEPKSCDTPPPCPRCP Dobradiça 30 ESKYGPPCPSCP Dobradiça 31 X1PPX2P Dobradiça X1 is glycine, cysteine or arginine X2 is cysteine or threonine 32 YGPPCPPCP Dobradiça 33 KYGPPCPPCP Dobradiça 34 EVVVKYGPPCPPCP Dobradiça 35 RASQDISKYLN FMC63 CDR L1 36 SRLHSGV FMC63 CDR L2 37 GNTLPYTFG FMC63 CDR L3 38 DYGVS FMC63 CDR H1 39 VIWGSETTYYNSALKS FMC63 CDR H2 40 YAMDYWG FMC63 CDR H3 41 EVKLQESGPGLVAPSQSLSVTCTVSGVSLPDYGVSWIRQPPRKGLEWLGVIWGSETTYYNSA FMC63 VH

LKSRLTIIKDNSKSQVFLKMNSLQTDDTAIYYCAKHYYYGGSYAMDYWGQGTSVTVSS 42 DIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCRASQDISKYLNWYQQKPDGTVKLLIYHTSRLHSGVPSRF FMC63 VL

SGSGSGTDYSLTISNLEQEDIATYFCQQGNTLPYTFGGGTKLEIT 43 DIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCRASQDISKYLNWYQQKPDGTVKLLIYHTSRLHSGVPSRF FMC63 scFv

SGSGSGTDYSLTISNLEQEDIATYFCQQGNTLPYTFGGGTKLEITGSTSGSGKPGSGEGSTK GEVKLQESGPGLVAPSQSLSVTCTVSGVSLPDYGVSWIRQPPRKGLEWLGVIWGSETTYYNS

ALKSRLTIIKDNSKSQVFLKMNSLQTDDTAIYYCAKHYYYGGSYAMDYWGQGTSVTVSS 44 KASQNVGTNVA SJ25C1 CDR L1 45 SATYRNS SJ25C1 CDR L2 46 QQYNRYPYT SJ25C1 CDR L3 47 SYWMN SJ25C1 CDR H1 48 QIYPGDGDTNYNGKFKG SJ25C1 CDR H2 49 KTISSVVDFYFDY SJ25C1 CDR H3 50 EVKLQQSGAELVRPGSSVKISCKASGYAFSSYWMNWVKQRPGQGLEWIGQIYPGDGDTNYNG SJ25C1 VH

KFKGQATLTADKSSSTAYMQLSGLTSEDSAVYFCARKTISSVVDFYFDYWGQGTTVTVSS 51 DIELTQSPKFMSTSVGDRVSVTCKASQNVGTNVAWYQQKPGQSPKPLIYSATYRNSGVPDRF SJ25C1 VL

TGSGSGTDFTLTITNVQSKDLADYFCQQYNRYPYTSGGGTKLEIKR 52 GGGGSGGGGSGGGGS Ligante 53 EVKLQQSGAELVRPGSSVKISCKASGYAFSSYWMNWVKQRPGQGLEWIGQIYPGDGDTNYNG SJ25C1 scFv

KFKGQATLTADKSSSTAYMQLSGLTSEDSAVYFCARKTISSVVDFYFDYWGQGTTVTVSSGG GGSGGGGSGGGGSDIELTQSPKFMSTSVGDRVSVTCKASQNVGTNVAWYQQKPGQSPKPLIY

SATYRNSGVPDRFTGSGSGTDFTLTITNVQSKDLADYFCQQYNRYPYTSGGGTKLEIKR 54 HYYYGGSYAMDY FMC63 HC-CDR3 55 HTSRLHS FMC63 LC-CDR2 56 QQGNTLPYT FMC63 LC-CDR3 57 gacatccagatgacccagaccacctccagcctgagcgccagcctgggcgaccgggtgac- Sequência codificando scFv catcagctgccgggccagccaggacatcagcaagtacctgaactggtatcagcagaa- gcccgacggcaccgtcaagctgctgatctaccacaccagccggctg- cacagcggcgtgcccagccggtttagcggcagcggctccggcaccgactacagcctgac- catctccaacctggaacaggaagatatcgccacctacttttgccagcagggcaacacac- tgccctacacctttggcggcggaacaaagctggaaatcaccggcagcacctccggcagcgg- caagcctggcagcggcgagggcagcaccaagggcgaggtgaagctgcaggaaa- gcggccctggcctggtggcccccagccagagcctgagcgtgacctgcac-

# SEQUENCE ANOTAÇÃO cgtgagcggcgtgagcctgcccgactacggcgtgagctggatccggcagccccccag- gaagggcctggaatggctgggcgtgatctggggcagcgagaccacctacta- caacagcgccctgaagagccggctgaccatcatcaaggacaacagcaa- gagccaggtgttcctgaagatgaacagcctgcagaccgacgacac- cgccatctactactgcgccaagcactactactacggcggcagctacgccatggac- tactggggccagggcaccagcgtgaccgtgagcagc 58 GSTSGSGKPGSGEGSTKG Ligante 59 ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGL

YSLSSVVTVPSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTVERKCCVECPPCPAPPVAGPSVFLFPP KPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRVVSVLT Human IgG2 Fc (Uniprot VVHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLV P01859)

KGFYPSDISVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEA

LHNHYTQKSLSLSPGK 60 ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGL

YSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPSCPAPEFLGGPSVFLFP PKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVL IgG4 Fc Humana (Uniprot TVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCL P01861)

VKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHE

ALHNHYTQKSLSLSLGK 61 mrkllifsisaylmagivsckgvdsatpvtedrlalnavnapadntvniktfdkvknafgd- Sequência de aminoácidos da glsqsaegtftfpadvttvktikmfiknecpnktcdewdryanvyvknkttgewyeigr- PNGase F de Flavobacterium fitpywvgteklprgleidvtdfksllsgntelkiytetwlakgreysvdfdivygtp- meningosepticum dykysavvpviqynkssidgvpygkahtlglkkniqlptntekaylrttisgwghakpyda- gsrgcaewcfrthtiainnantfqhqlgalgcsanpinnqspgnwapdragwcpgmavptri- dvlnnsltgstfsyeykfqswtnngtngdafyaissfviaksntpisapvvtn

Claims

REIVINDICAÇÕES

1. Método para identificação de um perfil de espec- trometria de massas (MS) de uma composição de células ge- neticamente modificadas, caracterizado pelo fato de que compreende: (a) determinar um perfil de espectrometria de massas de teste de uma amostra de uma composição de células ge- neticamente modificadas de teste ou de um subconjunto da mesma usando uma técnica de espectrometria de massas, a referida composição de células geneticamente modificadas de teste compreendendo células imunes compreendendo um receptor recombinante; (b) comparar o perfil de espectrometria de massas de teste com um perfil de espectrometria de massas de referên- cia; e (c) identificar uma ou mais diferenças na presença, au- sência ou nível de pelo menos um componente dos dados no perfil de espectrometria de massas de teste em relação ao perfil de espectrometria de massas de referência, identifi- cando assim um perfil de espectrometria de mas sas único para a amostra.

2. Método, de acordo com a reivindicação 1, carac- terizado pelo fato de que o perfil de espectrometria de mas- sas de referência baseia-se em uma amostra de uma compo- sição de referência, uma pluralidade de amostras de uma composição de referência, ou uma pluralidade de amostras de uma pluralidade de composições de referência.

3. Método, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que a composição de células ge- neticamente modificadas é para uso em uma terapia com cé-

lulas autólogas.

4. Método, de acordo com qualquer uma das reivin- dicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que a composição de células geneticamente modificadas é produzida por um processo compreendendo: (i) selecionar ou isolar células im unes de uma amostra proveniente de um indivíduo, gerando assim uma composição fonte, opcionalmente em que a amostra biológica é uma amostra de leucaférese, uma amostra de aférese ou uma amostra de sangue total; (ii) incubar as células da composição fonte c om um re- agente estimulador, gerando assim uma composição estimu- lada, em que a incubação é opcionalmente realizada na pre- sença de uma ou mais citocinas; (iii) introduzir um ácido nucleico codificando o receptor recombinante nas células imunes da composição estimulada, gerando assim uma composição transformada; e (iv) cultivar a composição estimulada a 37º C por pelo menos 24 horas, gerando assim a composição de células ge- neticamente modificadas, em que a cultura é opcionalmente realizada na presença de uma ou mais citocinas.

5. Método, de acordo com qualquer uma das reivin- dicações 2 a 4, caracterizado pelo fato de que a composição de referência ou cada uma dentre a pluralidade de composi- ções de referência não teve introduzida uma molécula de ácido nucleico codificando o receptor recombinante.

6. Método, de acordo com qualquer uma das reivin- dicações 1 a 5, caracterizado pelo fato de que o perfil de es- pectrometria de massas de referência é de uma amostra de uma composição de referência e a composição de referência compreende as células imunes a partir das quais a composi- ção de células geneticamente modificadas fora derivada ou obtida.

7. Método, de acordo com qualquer uma das reivin- dicações 1 a 6, em que o perfil de espectrometria de massas de referência é de uma amostra de uma composição de refe- rência, caracterizado pelo fato de que: a composição de células geneticamente modificadas compreende células imunes obtidas de um indivíduo, as refe- ridas células imunes compreendendo uma molécula de ácido nucleico codificando o receptor recombinante; e a composição de referência compreende as células imunes obtidas do indivíduo que não compreendem o ácido nucleico codificando o receptor recombinante.

8. Método, de acordo com qualquer uma das reivin- dicações 1 a 7, caracterizado pelo fato de que o perfil de es- pectrometria de massas de referência é de uma amostra de uma composição de referência, a composição de células ge- neticamente modificadas é produzida a partir de um estágio de um processo, e a composição de referência é obtida de- pois, antes ou durante o estágio no qual a composição de células geneticamente modificadas é produzida.

9. Método, de acordo com qualquer uma das reivin- dicações 1 a 8, caracterizado pelo fato de que a composição de células geneticamente modificadas é uma amostra obtida de um indivíduo que já recebera uma composição de células geneticamente modificadas.

10. Método, de acordo com a reivindicação 9, ca- racterizado pelo fato de que a amostra obtida do individuo compreende células imunes geneticamente modificadas com o receptor recombinante, opcionalmente detectadas por ci- tometria de fluxo ou reação em cadeia da polimerase (PCR).

11. Método, de acordo com a reivindicação 9 ou 10, caracterizado pelo fato de que a amostra obtida do individuo é uma amostra de sangue ou uma amostra de um tumor.

12. Método, de acordo com qualquer uma das rei- vindicações 9 a 11, caracterizado pelo fato de que a amostra obtida do individuo é obtida entre ou entre cerca de 6 e 30 dias, entre ou entre cerca de 14 e 29 dias, ou entre ou entre cerca de 17 e 22 dias depois da administração da composi- ção de células geneticamente modificadas ao indivíduo.

13. Método, de acordo com qualquer uma das rei- vindicações 9 a 12, caracterizado pelo fato de que a amostra é obtida do indivíduo no momento em que , ou aproximada- mente quando, ou imediatamente depois, de as células imu- nes geneticamente modificadas com o receptor recombinante estarem detectáveis ao máximo no sangue do indivíduo.

14. Método, de acordo com qualquer uma das rei- vindicações 1 a 8, caracterizado pelo fato de que a composi- ção de células geneticamente modificadas compreende célu- las que foram colocadas em contato com um agente para produzir uma atividade dependente de um receptor recombi- nante, opcionalmente em que o agente é um antígeno alvo que é capaz de ser ligado pelo receptor recombinante ou é um anticorpo idiotípico específico para o anticorpo.

15. Método, de acordo com qualquer uma das rei- vindicações 2 a 4 e 8 a 14, caracterizado pelo fato de que o perfil de espectrometria de massas de referência é um perfil de espectrometria de massas médio baseado em inúmeras amostras de uma pluralidade de composições de referência.

16. Método, de acordo com a reivindicação 15, ca- racterizado pelo fato de que cada uma dentre a pluralidade de composições de referência compreendem células compre- endendo o receptor recombinante.

17. Método, de acordo com a reivindicação 15 ou 16, caracterizado pelo fato de que cada uma dentre a plura- lidade de composições de referência foi produzido pelo mesmo processo ou substancialmente o mesmo processo que a composição de células geneticamente modificadas.

18. Método, para avaliação de um processo par a produção de uma composição de células geneticamente mo- dificadas, caracterizado pelo fato de que compreende calcu- lar a quantidade de variabilidade na presença, ausência ou nível de pelo menos um componente dos dados através de inúmeros perfis de espectrometria de massas baseados em amostras de uma pluralidade de composições de células ge- neticamente modificadas de referência ou um subconjunto da mesma, em que cada uma dentre a pluralidade de composi- ções de células geneticamente modificadas de referência compreende um receptor recombinante produzido pelo mes- mo processo ou substancialmente o mesmo processo.

19. Método, para avaliação de um processo para produção de uma composição de células geneticamente mo- dificadas, caracterizado pelo fato de que compreende: (a) obter inúmeros perfis de espectrometria de massas baseados em amostras de uma pluralidade de composições de células geneticamente modificadas de referência ou um subconjunto da mesma, em que cada uma dentre a pluralida- de de composições de células geneticamente modificadas de referência compreende um receptor recombinante produzido pelo mesmo processo ou substancialmente o mesmo proces- so; (b) produzir um perfil de espectrometria de massas de referência baseado no número de perfis de espectrometria de massas; e (c) determinar a quantidade de variabilidade na presen- ça, ausência ou nível de pelo menos um componente dos da- dos através dos inúmeros de perfis de espectrometria de massas.

20. Método, de acordo com a reivindicação 19, ca- racterizado pelo fato de que ainda compreende selecionar um processo para produção de uma composição de células geneticamente modificadas se a quantidade de variabilidade na presença, ausência ou nível do pelo menos um compo- nente dos dados através dos inúmeros de perfis de espec- trometria de massas for não mais que 40%, não mais que 30%, não mais que 20%, não mais que 10% ou não mais que 5% do nível de pelo menos um componente dos dados no perfil de espectrometria de massas de referência.

21. Método, de acordo com qualquer uma das rei- vindicações 18 a 20, caracterizado pelo fato de que cada uma dentre a pluralidade de composições de células geneti- camente modificadas de referência é selecionada dentre (1) células em uma composição geneticamente modificada de referência, (2) células CD3+ em uma composição genetica- mente modificada de referência; (3) células T CD4+ em uma composição geneticamente modificada de referência; (4) cé- lulas T CD8+ em uma composição geneticamente modificada de referência; (5) células receptor recombinante+ em uma composição geneticamente modificada de referência; (6) cé-

lulas receptor recombinante+CD3+ em uma composição ge- neticamente modificada de referência, (7) receptor recombi- nante+CD8+ células em uma composição geneticamente mo- dificada de referência, or (8) células receptor recombinan- te+CD4+ em uma composição geneticamente modificada de referência.

22. Método, de acordo com qualquer uma das rei- vindicações 18 a 20, caracterizado pelo fato de que cada uma dentre a pluralidade de composições de referência é produzido por um processo compreendendo: (i) selecionar ou isolar célul as imunes de uma amostra proveniente de um indivíduo, gerando assim uma composição fonte, opcionalmente em que a amostra biológica é uma amostra de leucaférese, uma amostra de aférese ou uma amostra de sangue total; (ii) incubar as células da composição fo nte com um re- agente estimulador, gerando assim uma composição estimu- lada, em que a incubação é opcionalmente realizada na pre- sença de uma ou mais citocinas; (iii) introduzir um ácido nucleico codificando o receptor recombinante nas células imunes da composição estimulada, gerando assim uma composição transformada; e (iv) cultivar a composição estimulada a 37º C por pelo menos 24 horas, gerando assim a composição de células ge- neticamente modificadas, em que a cultura é opcionalmente realizada na presença de uma ou mais citocinas.

23. Método, de acordo com qualquer uma das rei- vindicações 1 a 17, caracterizado pelo fato de que cada um dentre o perfil de espectrometria de massas de teste e o per- fil de espectrometria de massas de referência é um perfi l de peptídios.

24. Método, de acordo com qualquer uma das rei- vindicações 1 a 17 e 23, caracterizado pelo fato de que o perfil de espectrometria de massas de referência é determi- nado usando a mesma técnica de espectrometria de massas que o perfil de espectrometria de massas de teste.

25. Método, para caracterização de um processo para produção de uma composição de células geneticamente modificadas, caracterizado pelo fato de que compreende: (a) determinar um primeiro perfil de espectrometria de massas de uma amostra de uma primeira composição de cé- lulas ou um subconjunto da mesma usando uma técnica de espectrometria de massas; (b) determinar um segundo perfil de espectrometria de massas de uma amostra de uma segunda composição d e cé- lulas ou um subconjunto da mesma usando uma técnica de espectrometria de massas; e (c) identificar uma ou mais diferenças na presença, au- sência ou nível de pelo menos um componente de dados no primeiro perfil de espectrometria de massas em relação ao segundo perfil de espectrometria de massas, em que a primeira composição de células e a segunda composição de células compreendem composições em dife- rentes estágios de um processo de produção para produção de uma composições de células geneticamente modific adas.

26. Método, de acordo com a reivindicação 25, ca- racterizado pelo fato de que a primeira e a segunda compo- sições de células estão em diferentes estágios de produção de uma composição de células geneticamente modificadas e são selecionadas dentre:

(i) uma composição fonte compreendendo células imu- nes selecionadas ou isoladas de uma amostra biológica de um indivíduo, opcionalmente em que a amostra biológica é uma amostra de leucaférese, uma amostra de aférese ou uma amostra de sangue total; (ii) uma composição estimulada compreendendo células imunes da composição fonte que fora colocada em contato com um reagente estimulador, opcionalmente em que o con- tato foi feito na presença de uma ou mais citocinas; (iii) uma composição transformada compreenden do cé- lulas da composição estimulada compreendendo um ácido nucleico codificando o receptor recombinante; e (iv) uma composição cultivada compreendendo células da composição transformada que foram cultivadas a , ou a cerca de, 37ºC por pelo menos 24 horas, opcionalmente em que o cultivo foi realizado na presença de uma ou mais cito- cinas.

27. Método, de acordo com a reivindicação 25 ou 26, caracterizado pelo fato de que a primeira composição de células é de um estágio anterior ou ponto de tempo anterior do processo de produção comparado a segunda composição de células.

28. Método, para caracterização de um processo para produção de uma composição de células geneticamente modificadas, caracterizado pelo fato de que compreende: (a) determinar um primeiro perfil de espectrometria de massas de uma amostra de uma primeira composição de cé- lulas ou um subconjunto da mesma usando uma técnica de espectrometria de massas; (b) determinar um segundo perfil de espectrometria de massas de uma amostra de uma segunda composição de cé- lulas ou um subconjunto da mesma usando uma técnica de espectrometria de massas; e (c) identificar uma ou mais diferenças na presença, au- sência ou nível de pelo menos um componente dos dados no primeiro perfil de espectrometria de massas em relação ao segundo perfil de espectrometria de massas, em que a primeira composição de células e a segunda composição de células compreendem células geneticamente modificadas produzidas por diferentes processos.

29. Método, de acordo com a reivindicação 28, ca- racterizado pelo fato de que os diferentes processos diferem em um ou mais dentre a presença ou concentração de soro; tempo em cultura; lote de reagente; manipulação ou armaze- namento de um reagente; presença ou quantidade de um re- agente estimulador; o tipo de um reagente estimulador; pre- sença ou quantidade de uma ou mais citocinas; presença ou quantidade de aminoácidos; temperatura; a fonte ou tipos de células imunes de uma composição fonte; a relação ou per- centagem de células imunes em uma composição fonte, op- cionalmente a relação de células CD4+/CD8+; densidade ce- lular; cultura estática; cultura oscilante; perfusão; o tipo de vetor viral; o número de cópia s do vetor; a presença de um adjuvante de transdução; densidade celular de uma compo- sição fonte em criopreservação; a extensão de expressão do receptor recombinante; a presença de um composto para modular um fenótipo celular.

30. Método, de acordo com qualquer uma das rei- vindicações 25 a 29, caracterizado pelo fato de que cada um dentre o primeiro perfil de espectrometria de massas e o se-

gundo perfil de espectrometria de massas é um perfil de pep- tídios.

31. Método, de acordo com qualquer uma das rei- vindicações 25 a 30, caracterizado pelo fato de que o primei- ro perfil de espectrometria de massas e o segundo perfil de espectrometria de massas são determinados usando a mes- ma técnica de espectrometria de massas.

32. Método, para caracterização de um receptor re- combinante, caracterizado pelo fato de que compreende a obtenção, usando uma técnica de espectrometria de massas, de um perfil de espectrometria de massas com pelo menos um componente dos dados de um receptor recomb inante iso- lado de uma amostra de uma composição de células geneti- camente modificadas ou um subconjunto da mesma compre- endendo células imunes expressando ou compreendendo o receptor recombinante.

33. Método, para caracterização de um receptor re- combinante, caracterizado pelo fato de que compreende: (1) obter um perfil de espectrometria de massas de tes- te, usando uma técnica de espectrometria de massas, de uma amostra de uma composição de células geneticamente modificadas de teste ou de um subconju nto da mesma com- preendendo células imunes expressando ou compreendendo um receptor recombinante, o referido perfil de espectrometria de massas compreendendo pelo menos um componente dos dados; (2) obter um perfil de espectrometria de massas de re- ferência, usando uma técnica de espectrometria de massas, de uma amostra de uma composição de referência ou um subconjunto da mesma compreendendo células imunes, o re-

ferido perfil de espectrometria de massas de referência com- preendendo pelo menos um componente dos d ados; e (3) identificar uma ou mais diferenças na presença, au- sência ou nível de pelo menos um componente dos dados no perfil de espectrometria de massas de teste em relação ao perfil de espectrometria de massas de referência .

34. Método, de acordo com a reivindicação 33, ca- racterizado pelo fato de que a composição de células geneti- camente modificadas e a composição de referência são substancialmente similares exceto pela presença do receptor recombinante, opcionalmente em que a composição de célu- las geneticamente modificadas e a composição de referência são produzidas por um processo substancialmente similar e/ou compreendem o mesmo tipo de células imunes.

35. Método, de acordo com a reivindicação 33 ou 34, caracterizado pelo fato de que a composição de células geneticamente modificadas fora estimulada na presença de um reagente estimulador.

36. Método, de acordo com qualquer uma das rei- vindicações 4, 22, 26, 29, e 35, caracterizado pelo fato de que as células imunes são células T, opcionalmente células T CD4+ e/ou CD8+, e o reagente estimulador é capaz de ati- var um ou mais domínios de sina lização intracelular de um ou mais componentes de um complexo de TCR e/ou um ou mais domínios de sinalização intracelular de uma ou mais moléculas coestimuladoras.

37. Método, de acordo com a reivindicação 36, ca- racterizado pelo fato de que o reagente estimulador compre- ende um agente primário que se liga especificamente a um membro de um complexo de TCR e um agente secundário que se liga especificamente a uma molécula coestimuladora de células T.

38. Método, de acordo com a reivindica ção 37, ca- racterizado pelo fato de que o agente primário liga -se espe- cificamente à CD3 e/ou a molécula coestimuladora é selecio- nada do grupo que consiste em CD28, CD137 (4 -1-BB), OX40, ou ICOS.

39. Método, de acordo com qualquer uma das rei- vindicações 4, 22, 26, e 35 a 38, caracterizado pelo fato de que o reagente estimulador compreende um anticorpo anti - CD3 ou um fragmento de ligação de antígeno do mesmo e um anticorpo anti-CD28 ou um fragmento de ligação de antí- geno do mesmo.

40. Método, de acordo com qualquer uma das rei- vindicações 37 a 39, caracterizado pelo fato de que os agen- tes primário e secundário estão presentes na superfície de um suporte sólido, opcionalmente em que o suporte sólido é uma conta.

41. Método, de acordo com qualquer uma das rei- vindicações 37 a 39, caracterizado pelo fato de que os agen- tes primário e secundário estão presentes na superfície de um reagente oligomérico solúvel compreendendo a estrepta- vidina ou uma estreptavidina muteína.

42. Método, de acordo com a reivindicação 35, ca- racterizado pelo fato de que o reagente estimulador é ou compreende um agente para produzir uma atividade depen- dente de um receptor recombinante, opcionalmente em que o agente é um antígeno alvo que é capa z de ser ligado pelo receptor recombinante ou é um anticorpo idiotípico específi- co para o anticorpo.

43. Método, de acordo com qualquer uma das rei- vindicações 4, 9 a 14, 33, w 35 a 42, caracterizado pelo fato de que ainda compreende identificar uma ou mais diferenças no perfil de espectrometria de massas de teste em relação a um perfil de espectrometria de massas de uma segunda composição de células geneticamente modificadas que não fora estimulada na presença de um reagente estimulad or ou fora estimulada na presença de um reagente estimulador di- ferente.

44. Método, de acordo com qualquer uma das rei- vindicações 1 a 43, caracterizado pelo fato de que a compo- sição de células, tal como independentemente a composição de células geneticamente modificadas, a composição de re- ferência, a composição de células geneticamente modifica- das de referência, a composição fonte, a composição estimu- lada, a composição transformada, a composição de células geneticamente modificadas, a primeira composição de célu- las, a segunda composição de células, e a composição culti- vada, é enriquecida nas células imunes.

45. Método, de acordo com qualquer uma das rei- vindicações 1 a 44, caracterizado pelo fato de que as células imunes compreendem linfócitos.

46. Método, de acordo com a reivindicação 45, ca- racterizado pelo fato de que os linfócitos compreendem célu- las T ou células exterminadoras (NK) naturais.

47. Método, de acordo com a reivindicação 46, ca- racterizado pelo fato de que os lin fócitos compreendem célu- las T e as células T são células T CD4+ e/ou CD8+.

48. Método, de acordo com qualquer uma das rei- vindicações 1 a 47, caracterizado pelo fato de que as células imunes são humanas.

49. Método, de acordo com qualquer uma das rei- vindicações 4, 22, 26, e 29 a 31, caracterizado pelo fato de que o cultivo foi realizado em condições para promover a proliferação e/ou a expansão das células geneticamente mo- dificadas.

50. Método, de acordo com qualquer uma das rei- vindicações 1 a 49, caracterizado pelo fato de que a amostra é processada a partir da composição de células genetica- mente modificadas por marcação de uma ou mais proteínas de superfície, lise das células, e isolamento da uma ou mais proteínas superficiais para obter uma ou mais proteínas iso- ladas.

51. Método, de acordo com a reivindicação 50, ca- racterizado pelo fato de que ainda compreende a digestão da uma ou mais proteínas isoladas.

52. Método, para avaliação de proteínas de su per- fície de uma composição de células geneticamente modifica- das, caracterizado pelo fato de que compreende: (a) marcar uma ou mais proteínas de superfície presen- tes nas células de uma amostra de uma composição de célu- las geneticamente modificadas ou um subconjunto da mes- ma, a composição de células geneticamente modificadas compreendendo células expressando ou compreendendo um receptor recombinante, gerando assim uma composição de células marcadas; (b) lisar as células da composição de células marcada, gerando assim uma composição de células lisadas; (c) isolar a uma ou mais proteínas de superfície da composição de células lisadas para obter uma ou mais prote-

ínas isoladas; e (d) submeter a uma ou mais proteínas isoladas a uma técnica de espectrometria de massas para obter um perfil de espectrometria de massas compreendendo um ou mais com- ponentes de dados.

53. Método, de acordo com a reivindicação 52, ca- racterizado pelo fato de que antes de (d) ainda compreende a digestão da uma ou mais proteínas isoladas.

54. Método, de acordo com a reivindicação 51 ou 53, caracterizado pelo fato de que a digestão é realizada por proteólise na presença de uma ou mais proteases capazes de clivar uma ou mais ligações peptídicas.

55. Método, de acordo com a reivindicação 54, ca- racterizado pelo fato de que a uma ou mais proteases é ou compreende tripsina.

56. Método, de acordo com qualquer uma das rei- vindicações 50 a 55, caracterizado pelo fato de que a uma ou mais proteínas isoladas compreendem proteínas da membra- na da superfície celular.

57. Método, de acordo com qualquer uma das rei- vindicações 50 a 56, caracterizado pelo fato de que a lise das células compreende incubação na presença de um de- tergente.

58. Método, de acordo com a reivindicação 57, ca- racterizado pelo fato de que o detergente é um detergente não iônico.

59. Método, de acordo com a reivindicação 58, ca- racterizado pelo fato de que o detergente é ou compreende uma quantidade eficaz de Trit on X-100.

60. Método, de acordo com a reivindicação 57, ca-

racterizado pelo fato de que o detergente é um detergente desnaturante.

61. Método, de acordo com a reivindicação 60, ca- racterizado pelo fato de que o detergente desnaturante é ou compreende uma quantidade eficaz de dodecil sulfato de só- dio (SDS).

62. Método, de acordo com qualquer uma das rei- vindicações 57 a 61, caracterizado pelo fato de que ainda compreende, depois da lise das células, remoção do deter- gente das células lisadas.

63. Método, de acordo com qualquer uma das rei- vindicações 50 a 62, caracterizado pelo fato de que a marca- ção da uma ou mais proteínas superficiais compreende mar- cação com aminas primárias com biotina.

64. Método, de acordo com a reivindicação 63, ca- racterizado pelo fato de que a uma ou mais proteínas super- ficiais são isoladas usando um reagente compreendendo avi- dina, estreptavidina, NeutrAvidin™ ou CaptAvidin™.

65. Método, de acordo com qualquer uma das rei- vindicações 1 a 64, caracterizado pelo fato de que a técnica de espectrometria de massas compreende submeter a amos- tra à cromatografia líquida (LC) seguida por espectrometria de massas.

66. Método, de acordo com a reivindicação 65, ca- racterizado pelo fato de que a cromatografia líquida é croma- tografia líquida de alta eficiência (HPLC), cromatografia lí- quida de ultra-alta eficiência (UHPLC), ou cromatografia lí- quida de ultra eficiência (UPLC).

67. Método, de acordo com a reivindicação 65 ou 66, caracterizado pelo fato de que a cromatografia líquida é cromatografia líquida de ultra eficiência (UPLC).

68. Método, de acordo com qualquer uma das rei- vindicações 65 a 67, caracterizado pelo fato de que a croma- tografia líquida e a espectrometria de massas são realizadas online.

69. Método, de acordo com qualquer uma das rei- vindicações 65 a 68, caracterizado pelo fato de que a croma- tografia líquida é selecionada dentre cromatografia em fase normal (NP-), em fase reversa (RP) e de interação hidrofílica (HILIC).

70. Método, de acordo com qualquer uma das rei- vindicações 65 a 69, caracterizado pelo fato de que o espec- trômetro de massas que executa a espectrometria de massas compreende um ou mais de um analisador de massas qua- drupolo, com armadilha de íons, por tempo de voo (TOF), ou por ressonância ciclotrônica de íons por transformada de Fourier.

71. Método, de acordo com a reivindicação 70, ca- racterizado pelo fato de que o espectrômetro de massas compreende um analisador de massas com armadilha de íons que é um analisador de massas com armadilha de íons quadrupolo tridimensional, um analisador de massas com armadilha de íons cilíndrico, um analisador de massas com armadilha de íons quadrupolo linear, ou um analisador de massas Orbitrap.

72. Método, de acordo com a reivindicação 71, ca- racterizado pelo fato de que o espectrômetro de massas é um espectrômetro massas quadrupolo -Orbitrap.

73. Método, de acordo com qualquer uma das rei- vindicações 1 a 72, caracterizado pelo fato de que o pelo menos um componente dos dados é selecionado dentre in- formações sobre os íons de MS, cromatógrafo de íons totais (TIC) ou uma parte do mesmo, cromatograma de íons extraí- dos (XIC) ou uma parte do mesmo, pico de sinais de íons de MS de peptídios, pico de sinais de íons de MS de proteínas, informações de identificação de peptídios, informações de identificação de proteínas, informações qualitativas, informa- ções quantitativas, informações estruturais, e modificações pós-translacionais.

74. Método, de acordo com a reivindicação 73, ca- racterizado pelo fato de que o pelo menos um componente dos dados é um XIC ou uma parte do mesmo, em que o XIC ou parte do mesmo baseia-se em um ou mais valores m/z teóricos ou conhecidos de um ou mais componentes peptídi- cos do receptor recombinante.

75. Método, de acordo com a reivindicação 74, ca- racterizado pelo fato de que o um ou mais componentes pep- tídicos é um componente peptídico proteoliticamente clivado ou digerido, opcionalmente em que o um ou mais componen- tes peptídicos é proteoliticamente clivado ou digerido por tripsina.

76. Método, de acordo com qualquer uma das rei- vindicações 1 a 75, caracterizado pelo fato de que o receptor recombinante é ou compreende um receptor quimérico e/ou um receptor de antígeno recombinante.

77. Método, de acordo com qualquer uma das rei- vindicações 1 a 76, caracterizado pelo fato de que o receptor recombinante é capaz de se ligar a um antígeno alvo que é associado, a específico para, e/ou expresso em uma célula ou tecido de uma doença, distúrbio ou condição.

78. Método, de acordo com a reivindicação 77 , ca- racterizado pelo fato de que a doença, distúrbio ou condição é uma doença ou distúrbio infeccioso, uma doença autoimu- ne, uma doença inflamatória, ou um tumor ou um câncer.

79. Método, de acordo com a reivindicação 77 ou 78, caracterizado pelo fato de que o antígeno alvo é um an- tígeno tumoral.

80. Método, de acordo com qualquer uma das rei- vindicações 77 a 79, caracterizado pelo fato de que o antí- geno alvo é selecionado dentre integrina αvβ6 (integrina avb6), antígeno de maturação de células B (BCMA), B7 -H3, B7-H6, anidrase carbônica 9 (CA9, também conhecida como CAIX or G250), um antígeno câncer -testículo, antígeno cân- cer/testículo 1B (CTAG, também conhecido como NY-ESO-1 e LAGE-2), antígeno carcinoembrionário (CEA), uma ciclina, ciclina A2, ligante 1 de quimiocina C-C (CCL-1), CD19, CD20, CD22, CD23, CD24, CD30, CD33, CD38, CD44, CD44v6, CD44v7/8, CD123, CD133, CD138, CD171, proteo- glicano sulfato de condroitina 4 (CSPG4), proteína de fator de crescimento epidérmico (EGFR), proteína truncada de fa- tor de crescimento epidérmico (tEGFR), mutação do receptor de fator de crescimento epidérmico tipo III (EGFR vIII), gli- coproteína epitelial 2 (EPG-2), glicoproteína epitelial 40 (EPG-40), efrinB2, receptor de efr ina A2 (EPHa2), receptor de estrogênio, receptor Fc like 5 (FCRL5; também conhecido como receptor Fc homólogo 5 ou FCRH5), receptor de acetil- colina fetal (fetal AchR), uma proteína de ligação de folato (FBP), receptor alfa de folato, gangliosídeo GD2, GD2 O- acetilado (OGD2), gangliosídeo GD3, glicoproteína 100 (gp100), glipicano-3 (GPC3), receptor 5D acoplado à proteí-

na G (GPCR5D), Her2/neu (tirosina quinase receptora erb - B2), Her3 (erb-B3), Her4 (erb-B4), dímeros de erbB, antígeno associado à melanoma humano de alto peso molecular (HMW -MAA), antígeno de superfície da hepatite B, antígeno leucocitário humano A1 (HLA-A1), antígeno leucocitário hu- mano A2 (HLA-A2), receptor alfa de IL-22 (IL-22Rα), receptor alfa 2 de IL-13 (IL-13Rα2), receptor do domínio inserto qui- nase (kdr), cadeia leve capa, molécula de adesão de células L1 (L1-CAM), epítopo CE7 de L1-CAM, repetição rica em leucina contendo o membro A da família 8 (LRRC8A), Lewis Y, antígeno associado a melanoma (MAGE) -A1, MAGE-A3, MAGE-A6, MAGE-A10, mesotelina (MSLN), c-Met, citomega- lovírus murino (CMV), mucina 1 (MUC1), MUC16, ligantes de membro D do grupo 2 de células exterminadoras naturais (NKG2D), melana A (MART -1), molécula de adesão de célu- las neurais (NCAM), antígeno oncofetal, a ntígeno de mela- noma preferencialmente expresso (PRAME), receptor de pro- gesterona, um antígeno específico para próstata, antígeno de células-tronco da próstata (PSCA), antígeno membranar específico para próstata (PSMA), receptor órfão 1 receptor tirosina quinase like (ROR1), survivina, glicoproteína trofo- blástica (TPBG, também conhecida como 5T4), glicoproteína 72 associada a tumor (TAG72), proteína 1 relacionada à tiro- sinase (TRP1, também conhecida como TYRP1 ou gp75), proteína 2 relacionada à tirosinase ( TRP2, também conheci- da como dopacroma tautomerase, dopacroma delta - isomerase ou DCT), receptor do fator de crescimento endote- lial vascular (VEGFR), receptor do fator de crescimento en- dotelial vascular 2 (VEGFR2), tumor de W ilms 1 (W T -1), um antígeno patógeno-específico ou expresso em patógenos, ou um antígeno associado a uma etiqueta universal, e/ou molé- culas biotiniladas, e/ou moléculas expressas por HIV, HCV, HBV ou outros patógenos.

81. Método, de acordo com qualquer uma das rei- vindicações 1 a 80, caracterizado pelo fato de que o receptor recombinante é ou compreende um receptor de antígeno fun- cional não TCR ou um TCR ou fragmento de ligação de antí- geno do mesmo.

82. Método, de acordo com qualquer uma das rei- vindicações 1 a 81, caracterizado pelo fato de que o receptor recombinante é um receptor de antígeno quimérico (CAR).

83. Método, de acordo com qualquer uma das rei- vindicações 1 a 82, caracterizado pelo fato de que a amostra compreende (1) células em uma composição de células, (2) células CD3+ em uma composição de células; (3) células T CD4+ em uma composição de células; (4) células T CD8+ em uma composição de células; (5) receptor recombinante+ cé- lulas em uma composição de células; (6) receptor recombi- nante+células CD3+ em uma composição de células, (7) re- ceptor recombinante+CD8+ células em uma composição de células, ou (8) receptor recombinante+células CD4+ em uma composição de células, opcionalmente em que o receptor re- combinante é um CAR.

84. Composição de células geneticamente modifi- cadas, caracterizada pelo fato de que uma composição de células geneticamente modificadas é produzida por um pro- cesso no qual o nível de pelo menos um componente dos da- dos de um perfil de espectrometria de massas, obtido usando uma técnica de espectroscopia de massas, de uma amostra de uma composição de células geneticamente modificadas ou um subconjunto da mesma vari a em não mais que 40%, não mais que 30%, não mais que 20%, não mais que 10% ou não mais que 5% do nível de pelo menos um componente dos dados de um perfil de espectrometria de massas de refe- rência baseado em inúmeros perfis de espectrometria de massas de amostras de uma pluralidade de composições de células geneticamente modificadas produzidas pelo proces- so, ou varia de tal referência em não mais que o desvio pa- drão do nível de pelo menos um componente de dados atra- vés dos inúmeros de perfis de espectrometria de massas.

85. Composição de células geneticamente modifi- cadas, de acordo com a reivindicação 84, caracterizada pelo fato de que a composição de células geneticamente modifi- cadas compreende um receptor recombinante.

86. Composição de células geneticamente modifi- cadas, de acordo com a reivindicação 84 ou 85, caracteriza- da pelo fato de que a composição de células geneticamente modificadas compreende células imunes.

87. Composição de células geneticamente modifi- cadas, de acordo com a reivindicação 86, caracterizada pelo fato de que o processo para produção da composição de cé- lulas geneticamente modificadas compreende: (i) selecionar ou isolar células imunes de uma amostra proveniente de um indivíduo, gerando assim uma composição fonte, opcionalmente em que a amostra biológica é uma amostra de leucaférese, uma amostra de aférese ou uma amostra de sangue total; (ii) incubar as células da composição fonte com um re- agente estimulador, gerando assim uma composição estimu- lada, em que a incubação é opcionalmente realizada na pre-

sença de uma ou mais citocinas; (iii) introduzir um ácido nucleico codificando o receptor recombinante nas células imunes da composição estimulada, gerando assim uma composição transformada; e (iv) cultivar a composição estimulada a 37º C por pelo menos 24 horas, gerando assim a composição de células ge- neticamente modificadas, em que a cultura é opcionalmente realizada na presença de uma ou mais citocinas.

88. Composição de células geneticamente modifi- cadas, de acordo com a reivindicação 86 ou 87, caracteriza- da pelo fato de que a composição de células, tal como inde- pendentemente a composição de células geneticamente mo- dificadas, a composição fonte, a composição estimulada, e a composição transformada, é enriquecida nas células imunes.

89. Composição de células geneticamente modifi- cadas, de acordo com qualquer uma das reivindicações 86 a 88, caracterizada pelo fato de que as células imunes com- preendem linfócitos.

90. Composição de células geneticamente modifi- cadas, de acordo com a reivindicação 89, caracterizada pelo fato de que os linfócitos compreendem células T ou células exterminadoras (NK) naturais.

91. Composição de células geneticamente modifi- cadas, de acordo com a reivindicação 90, caracterizada pelo fato de que os linfócitos compreendem células T e as células T são células T CD4+ e/ou CD8+.

92. Composição de células geneticamente modifi- cadas, de acordo com qualquer uma das reivindicações 86 a 91, caracterizada pelo fato de que as células imunes são humanas.

93. Composição de células geneticamente modifi- cadas, de acordo com qualquer uma das reivindicações 87 a 92, caracterizada pelo fato de que as células imunes são cé- lulas T, opcionalmente células T CD4+ e/ou CD8+, e o rea- gente estimulador é capaz de ativar um ou mais domínios de sinalização intracelular de um ou mais componentes de um complexo de TCR e/ou um ou mais domínios de sinalização intracelular de uma ou mais moléculas coestimuladoras.

94. Composição de células geneticamente modifi- cadas, de acordo com a reivindicação 93, caracterizada pelo fato de que o reagente estimulador compreende um agente primário que se liga especificamente a um membro de um complexo de TCR e um agente secundário que se liga espe- cificamente a uma molécula coestimuladora de células T.

95. Composição de células geneticamente modifi- cadas, de acordo com a reivindicação 94, caracterizada pelo fato de que o agente primário liga-se especificamente à CD3 e/ou a molécula coestimuladora é selecionada do grupo que consiste em CD28, CD137 (4-1-BB), OX40, ou ICOS.

96. Composição de células geneticamente modifi- cadas, de acordo com qualquer uma das reivindicações 87 a 95, caracterizada pelo fato de que o reagente estimulador compreende um anticorpo anti-CD3 ou um fragmento de liga- ção de antígeno do mesmo e um anticorpo anti-CD28 ou um fragmento de ligação de antígeno do mesmo.

97. Composição de células geneticamente modifi- cadas, de acordo com qualquer uma das reivindicações 94 a 96, caracterizada pelo fato de que os agentes primário e se- cundário estão presentes na superfície de um suporte sólido, opcionalmente em que o suporte sólido é uma conta.

98. Composição de células geneticamente modifi- cadas, de acordo com qualquer uma das reivindicações 94 a 97, caracterizada pelo fato de que os agentes primário e se- cundário estão presentes na superfície de um reagente oli- gomérico solúvel compreendendo a estreptavidina ou uma estreptavidina muteína.

99. Composição de células geneticamente modifi- cadas, de acordo com qualquer uma das reivindicações 87 a 98, caracterizada pelo fato de que o cultivo foi realizado em condições para promover a proliferação e/ou a expansão da composição de células geneticamente modificadas.

100. Composição de células geneticamente modifi- cadas, de acordo com qualquer uma das reivindicações 84 a 99, caracterizada pelo fato de que a amostra é processada a partir da composição de células geneticamente modificadas por marcação de uma ou mais proteínas de superfície, lise das células, e isolamento da uma ou mais proteínas superfi- ciais para obter uma ou mais proteínas isoladas.

101. Composição de células geneticamente modifi- cadas, de acordo com a reivindicação 100, caracterizado pe- lo fato de que ainda compreende a digestão da uma ou mais proteínas isoladas.

102. Composição de células geneticamente modifi- cadas, de acordo com a reivindicação 100 ou 101, caracteri- zada pelo fato de que a digestão é realizada por proteólise na presença de uma ou mais proteases capazes de clivar uma ou mais ligações peptídicas.

103. Composição de células geneticamente modifi- cadas, de acordo com a reivindicação 102, caracterizada pe- lo fato de que a uma ou mais proteases são ou compreendem tripsina.

104. Composição de células geneticamente modifi- cadas, de acordo com qualquer uma das reivindicações 100 a 103, caracterizada pelo fato de que a uma ou mais proteí- nas isoladas compreendem proteínas da membrana da su- perfície celular.

105. Composição de células geneticamente modifi- cadas, de acordo com qualquer uma das reivindicações 100 a 104, caracterizada pelo fato de que a lise das células com- preende incubação na presença de um detergente.

106. Composição de células geneticamente modifi- cadas, de acordo com a reivindicação 105, caracterizada pe- lo fato de que o detergente é um detergente não iônico.

107. Composição de células geneticamente modifi- cadas, de acordo com a reivindicação 106, caracterizada pe- lo fato de que o detergente é ou compreende uma quantida- de eficaz de Triton X-100.

108. Composição de células geneticamente modifi- cadas, de acordo com a reivindicação 105, caracterizada pe- lo fato de que o detergente é um detergente desnaturante.

109. Composição de células geneticamente modifi- cadas, de acordo com a reivindicação 108, caracterizada pe- lo fato de que o detergente desnaturante é ou compreende uma quantidade eficaz de dodecil sulfato de sódio (SDS).

110. Composição de células geneticamente modifi- cadas, de acordo com qualquer uma das reiv indicações 100 a 109, caracterizada pelo fato de que depois da lise das cé- lulas, o método compreende ainda a remoção do detergente das células lisadas.

111. Composição de células geneticamente modifi-

cadas, de acordo com qualquer uma das reivindicações 100 a 110, caracterizada pelo fato de que a marcação das proteí- nas superficiais compreende marcação com aminas primárias com biotina.

112. Composição de células geneticamente modifi- cadas, de acordo com a reivindicação 111, caracterizada pe- lo fato de que a uma ou mais proteínas superficiais são iso- ladas usando um reagente compreendendo avidina, estrepta- vidina, NeutrAvidin™ ou CaptAvidin™.

113. Composição de células geneticamente modifi- cadas, de acordo com qualquer uma das reivindicações 84 a 112, caracterizada pelo fato de que a técnica de espectrome- tria de massas compreende submeter a amostra à cromato- grafia líquida (LC) seguida por espectrometria de massas.

114. Composição de células geneticamente modifi- cadas, de acordo com a reivindicação 113, caracterizada pe- lo fato de que a cromatografia líquida é cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC), cromatografia líquida de ultra-alta eficiência (UHPLC), ou cromatografia líquida de ultra eficiên- cia (UPLC).

115. Composição de células geneticamente modifi- cadas, de acordo com a reivindicação 113 ou 114, caracteri- zada pelo fato de que a cromatografia líquida é cromatogra- fia líquida de ultra eficiência (UPLC).

116. Composição de células geneticamente modifi- cadas, de acordo com qualquer uma das reivindicações 113 a 115, caracterizada pelo fato de que a cromatografia líquida e a espectrometria de massas são realizadas online.

117. Composição de células geneticamente modifi- cadas de acordo com qualquer uma das reivindicações 113 a

116, caracterizada pelo fato de que a cromatografia líquida é selecionada dentre cromatografia em fase normal (NP-), em fase reversa (RP) e de interação hidrofílica (HILIC).

118. Composição de células geneticamente modifi- cadas, de acordo com qualquer uma das reivindicações 113 a 117, caracterizada pelo fato de que o espectrômetro de massas que executa a espectrometria de massas compreen- de um ou mais de um analisador de massas quadrupolo, com armadilha de íons, por tempo de voo (TOF), ou por resso- nância ciclotrônica de íons por transformada de Fourier.

119. Composição de células geneticamente modifi- cadas, de acordo com a reivindicação 118, caracterizada pe- lo fato de que o espectrômetro de massas compreende um analisador de massas com armadilha de íons que é um ana- lisador de massas com armadilha de íons quadrupolo tridi- mensional, um analisador de massas com armadilha de íons cilíndrico, um analisador de massas com armadilha de íons quadrupolo linear, ou um analisador de massas Orbitrap.

120. Composição de células geneticamente modifi- cadas, de acordo com a reivindicação 119, caracterizada pe- lo fato de que o espectrômetro de massas é um espectrôme- tro massas quadrupolo-Orbitrap.

121. Composição de células geneticamente modifi- cadas, de acordo com qualquer uma das reivindicações 84 a 120, caracterizada pelo fato de que o pelo menos um com- ponente dos dados é selecionado dentre informações sobre os íons de MS, cromatógrafo de íons totais (TIC) ou uma par- te do mesmo, cromatograma de íons extraídos (XIC) ou uma parte do mesmo, pico de sinais de íons de MS de peptídios, pico de sinais de íons de MS de proteínas, informações de identificação de peptídios, informações de identificação de proteínas, informações qualitativas, informações quantitati- vas, informações estruturais, e modificações pós- translacionais.

122. Composição de células geneticamente modifi- cadas, de acordo com a reivindicação 121, caracterizada pe- lo fato de que o componente de dados é um XIC ou uma par- te do mesmo, em que o XIC ou parte do mesmo baseia-se em um ou mais valores m/z teóricos ou conhecidos de um ou mais componentes peptídicos do rece ptor recombinante.

123. Composição de células geneticamente modifi- cadas, de acordo com a reivindicação 122, caracterizada pe- lo fato de que o um ou mais componentes peptídicos é um componente peptídico proteoliticamente clivado ou digerido, opcionalmente em que o um ou mais componentes peptídicos são proteoliticamente clivados ou digeridos por tripsina.

124. Composição de células geneticamente modifi- cadas, de acordo com qualquer uma das reivindicações 85 a 123, caracterizada pelo fato de que o receptor recombinante é ou compreende um receptor quimérico e/ou um receptor de antígeno recombinante.

125. Composição de células geneticamente modifi- cadas, de acordo com qualquer uma das reivindicações 85 a 124, caracterizada pelo fato de que o receptor recombinante é capaz de se ligar a um antígeno alvo que é associado, a específico para, e/ou expresso em uma célula ou tecido de uma doença, distúrbio ou condição.

126. Composição de células geneticamente modifi- cadas, de acordo com a reivindicação 125, caracterizada pe- lo fato de que a doença, distúrbio ou condição é uma doença ou distúrbio infeccioso, uma doença autoimune, uma doença inflamatória, ou um tumor ou um câncer.

127. Composição de células geneticamente modifi- cadas, de acordo com a reivindicação 125 ou 126, caracteri- zada pelo fato de que o antígeno alvo é um antígeno tumoral.

128. Composição de células geneticamente modifi- cadas, de acordo com qualquer uma das reivindicações 125 a 127, caracterizada pelo fato de que o antígeno alvo é sele- cionado dentre integrina αvβ6 (integrina avb6), antígeno de maturação de células B (BCMA), B7 -H3, B7-H6, anidrase carbônica 9 (CA9, também conhecida como CAIX or G250), um antígeno câncer-testículo, antígeno câncer/testículo 1B (CTAG, também conhecido como NY-ESO-1 e LAGE-2), antí- geno carcinoembrionário (CEA), uma ciclina, ciclina A2, li- gante 1 de quimiocina C-C (CCL-1), CD19, CD20, CD22, CD23, CD24, CD30, CD33, CD38, CD44, CD44v6, CD44v7/8, CD123, CD133, CD138, CD171, proteoglicano sulfato de condroitina 4 (CSPG4), proteína de fator de crescimento epi- dérmico (EGFR), proteína truncada de fator de crescimento epidérmico (tEGFR), mutação do receptor de fator de cres- cimento epidérmico tipo III (EGFR vIII), glicoproteína epitelial 2 (EPG-2), glicoproteína epitelial 40 (EPG-40), efrinB2, re- ceptor de efrina A2 (EPHa2), receptor de estrogênio, recep- tor Fc like 5 (FCRL5; também conhecido como receptor Fc homólogo 5 ou FCRH5), receptor de acetilcolina fetal (fetal AchR), uma proteína de ligação de folato (FBP), receptor alfa de folato, gangliosídeo GD2, GD2 O-acetilado (OGD2), gan- gliosídeo GD3, glicoproteína 100 (gp100), glipicano-3 (GPC3), receptor 5D acoplado à proteína G (GPCR5D), Her2/neu (tirosina quinase receptora erb-B2), Her3 (erb-B3),

Her4 (erb-B4), dímeros de erbB, antígeno associado à mela- noma humano de alto peso molecular (HMW -MAA), antígeno de superfície da hepatite B, antígeno leucocitário humano A1 (HLA-A1), antígeno leucocitário humano A2 (HLA-A2), recep- tor alfa de IL-22 (IL-22Rα), receptor alfa 2 de IL-13 (IL- 13Rα2), receptor do domínio inserto quinase (kdr), cadeia leve capa, molécula de adesão de células L1 (L1 -CAM), epí- topo CE7 de L1-CAM, repetição rica em leucina contendo o membro A da família 8 (LRRC8A), Lewis Y, antígeno associ- ado a melanoma (MAGE)-A1, MAGE-A3, MAGE-A6, MAGE- A10, mesotelina (MSLN), c-Met, citomegalovírus murino (CMV), mucina 1 (MUC1), MUC16, ligantes de membro D do grupo 2 de células exterminadoras naturais (NKG2D), melana A (MART-1), molécula de adesão de células neurais (NCAM), antígeno oncofetal, antígeno de melanoma preferencialmente expresso (PRAME), receptor de progesterona, um antígeno específico para próstata, antígeno de células-tronco da prós- tata (PSCA), antígeno membranar específico para próstata (PSMA), receptor órfão 1 receptor tirosina quinase like (ROR1), survivina, glicoproteína trofoblástica (TPBG, tam- bém conhecida como 5T4), glicoproteína 72 associada a tu- mor (TAG72), proteína 1 relacionada à tirosinase (TRP1, também conhecida como TYRP1 ou gp75), proteína 2 relaci- onada à tirosinase (TRP2, também conhecida como dopa- croma tautomerase, dopacroma delta-isomerase ou DCT), receptor do fator de crescimento endotelial vascular (VEGFR), receptor do fator de crescimento endotelial vascu- lar 2 (VEGFR2), tumor de W ilms 1 (W T -1), um antígeno pa- tógeno-específico ou expresso em patógenos, ou um antíge- no associado a uma etiqueta universal, e/ou moléculas bioti-

niladas, e/ou moléculas expressas por HIV, HCV, HBV ou ou- tros patógenos.

129. Composição de células geneticamente modifi- cadas, de acordo com qualquer uma das reivindicações 85 a 128, caracterizada pelo fato de que o receptor recombinante é ou compreende um receptor de antígeno funcional não TCR ou um TCR ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo.

130. Composição de células geneticamente modifi- cadas, de acordo com qualquer uma das reivindicações 85 a 129, caracterizada pelo fato de que o receptor recombinante é um receptor de antígeno quimérico (CAR).

131. Método, para avaliação de um reagente usado no processo de produção de uma composição de células ge- neticamente modificadas, caracterizado pelo fato de que compreende: (a) comparar um perfil de espectrometria de massas de teste de uma amostra de um reagente com um perfil de es- pectrometria de massas de referência do reagente, em que o perfil de espectrometria de massas de teste é obtido usando uma técnica de espectrometria de massas; e (c) identificar uma ou mais diferenças na presença, au- sência ou nível de pelo menos um componente dos dados no perfil de espectrometria de massas de teste em relação ao perfil de espectrometria de massas de referência, identifi- cando assim um perfil de espectrometria de massas do rea- gente.

132. Método, de acordo com a reivindicação 131, caracterizado pelo fato de que o perfil de espectrometria de massas de referência é de uma amostra de um reagente de referência ou é baseado em inúmeros perfis de espectrome- tria de massas de amostras de uma pluralidade de lotes di- ferfentes do reagente.

133. Método, de acordo com a reivindicação 132, caracterizado pelo fato de que o perfil de espectrometria de massas de referência é um perf il de espectrometria de mas- sas médio baseado em amostras de uma pluralidade de lotes diferfentes do reagente.

134. Método, de acordo com a reivindicação 133, caracterizado pelo fato de que ainda compreende determinar diferenças na presença, ausência ou nível do pelo menos um componente dos dados entre o perfil de espectrometria de massas de teste e o perfil de espectrometria de massas mé- dio.

135. Método, de acordo com a reivindicação 132 ou 133, caracterizado pelo fato de que ainda compreende sele- cionar o reagente se a quantidade de variabilidade na pre- sença, ausência, ou nível de pelo menos um componente dos dados através dos inúmeros de perfis de espectrometria de massas for não mais que 40%, não mais que 30%, não mais que 20%, não mais que 10%, ou não mais que 5% do nível de pelo menos um componente dos dados no perfil de espec- trometria de massas de referência.

136. Método, de acordo com a reivindicação 132 ou 134, caracterizado pelo fato de que ainda compreende sele- cionar se o nível de pelo menos um componente dos dados do perfil de espectrometria de massas de teste variar em não mais que 40%, não mais que 30%, não mais que 20%, não mais que 10% ou não mais que 5% do nível de pelo menos um componente dos dados do perfil de espectrometria de massas de referência, ou variar de tal nível em não mais que o desvio padrão do nível de pelo menos um componente de dados através dos inúmeros de perfis de espectrometria de massas.

137. Método, de acordo com qualquer uma das rei- vindicações 131 a 136, caracterizado pelo fato de que a téc- nica de espectrometria de massas compreende submeter a amostra à cromatografia líquida (LC) seguida por espectro- metria de massas.

138. Método, de acordo com a reivindicação 137, caracterizado pelo fato de que a cromatografia líquida é cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC), cromatogra- fia líquida de ultra-alta eficiência (UHPLC), ou cromatografia líquida de ultra eficiência (UPLC).

139. Método, de acordo com a reivindicação 137 ou 138, caracterizado pelo fato de que a cromatografia líquida é cromatografia líquida de ultra eficiência (UPLC).

140. Método, de acordo com qualquer uma das rei- vindicações 137 a 139, caracterizado pelo fato de que a cro- matografia líquida e a espectrometria de massas são realiza- das online.

141. Método, de acordo com qualquer uma das rei- vindicações 137 a 140, caracterizado pelo fato de que a cro- matografia líquida é selecionada dentre croma tografia em fa- se normal (NP-), em fase reversa (RP) e de interação hidrofí- lica (HILIC).

142. Método, de acordo com qualquer uma das rei- vindicações 137 a 141, caracterizado pelo fato de que o es- pectrômetro de massas que executa a espectrometria de massas compreende um ou mais de um analisador de mas-

sas quadrupolo, com armadilha de íons, por tempo de voo (TOF), ou por ressonância ciclotrônica de íons por transfor- mada de Fourier.

143. Método, de acordo com a reivindicação 142, caracterizado pelo fato de que o espectrômetro de massas compreende um analisador de massas com armadilha de íons que é um analisador de massas com armadilha de íons quadrupolo tridimensional, um analisador de massas com armadilha de íons cilíndrico, um analisador de massas com armadilha de íons quadrupolo linear, ou um analisador de massas Orbitrap.

144. Método, de acordo com a reivindicação 143, caracterizado pelo fato de que o espectrômetro de massas é um espectrômetro massas quadrupolo -Orbitrap.

145. Método, de acordo com qualquer uma das rei- vindicações 131 a 144, caracterizado pelo fato de que o pelo menos um componente dos dados é selecionado dentre in- formações sobre os íons de MS, cromatógrafo de íons totais (TIC) ou uma parte do mesmo, crom atograma de íons extraí- dos (XIC) ou uma parte do mesmo, pico de sinais de íons de MS de peptídios, pico de sinais de íons de MS de proteínas, informações de identificação de peptídios, informações de identificação de proteínas, informações qualitativas, informa- ções quantitativas, informações estruturais, e modificações pós-translacionais.

146. Método, de acordo com qualquer uma das rei- vindicações 131 a 145, caracterizado pelo fato de que o rea- gente é um reagente capaz de estimular um sinal nas célu las de uma composição de células, opcionalmente uma composi- ção de células T.

147. Método, de acordo com a reivindicação 146, caracterizado pelo fato de que as células da composição de células compreendem um receptor recombinante, opcional- mente um receptor de antígeno quimérico.

148. Método, de acordo com a reivindicação 147, caracterizado pelo fato de que o reagente é capaz de estimu- lar ou induzir uma atividade dependente de um receptor re- combinante nas células da composição de células.