WO2026004642A1 - 高次構造形成能等を測定する方法 - Google Patents

高次構造形成能等を測定する方法

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WO2026004642A1
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polypeptide
expression
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浩子 宮寺
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University of Tsukuba NUC
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Publication date
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
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    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G—PHYSICS
    • G16—INFORMATION AND COMMUNICATION TECHNOLOGY [ICT] SPECIALLY ADAPTED FOR SPECIFIC APPLICATION FIELDS
    • G16B—BIOINFORMATICS, i.e. INFORMATION AND COMMUNICATION TECHNOLOGY [ICT] SPECIALLY ADAPTED FOR GENETIC OR PROTEIN-RELATED DATA PROCESSING IN COMPUTATIONAL MOLECULAR BIOLOGY
    • G16B50/00—ICT programming tools or database systems specially adapted for bioinformatics

Definitions

  • the present invention relates to a method for measuring the ability of cells to form multimers containing multiple polypeptides, a method for measuring the ability of polypeptides to form three-dimensional structures, and a method for measuring the ability of polypeptides to maintain localization at the cell membrane, as well as a method for screening conditions for forming higher-order structures and maintaining localization at the cell membrane using these methods.
  • Analysis methods for the higher-order structure formation ability of proteins and other substances include, for example, analytical methods using electrophoresis, spectroscopic analysis of purified proteins, and analytical methods based on protein structural analysis.
  • Analytical methods using electrophoresis such as immunoprecipitation and Western blotting, quantitatively detect the presence of proteins in cell lysates using binding molecules such as antibodies.
  • analytical methods using electrophoresis require that proteins be prepared from cell lysates and often denatured.
  • Analytical methods based on structural analysis allow for detailed analysis of protein structure based on the protein's crystal structure, etc.
  • crystallization of proteins and structural analysis require a great deal of effort.
  • biomolecules such as proteins themselves, but also to analyze the interactions between biomolecules and other molecules (e.g., candidate drugs and other proteins). This is because all reactions within the body are based on intermolecular binding, and the promotion, modification, and/or inhibition of these bindings can result in medicinal effects or side effects.
  • Non-Patent Document 1 Non-Patent Document 1
  • Analytical methods using flow cytometry and image cytometry are known as methods that can detect the presence of proteins and other substances at the cell level without denaturing them.
  • flow cytometry and image cytometry were developed for the purpose of qualitative analysis of immunophenotypes, cell cycles, etc., and are not necessarily suitable for quantitative analysis due to differences in detection sensitivity between instruments (models), as well as differences in measured values that are prone to occur due to differences in cell state and reagent products.
  • MHC Major Histocompatibility Complex
  • the present invention aims to provide a method for analyzing interactions using a cell system that is simpler than cell-free measurement systems, can be applied regardless of the type of protein, and can also be used to analyze immune molecules and MHC.
  • a method for measuring the ability of a test polypeptide and a target polypeptide to form multimers in cells comprising: an expression step of expressing the test polypeptide and the target polypeptide in a plurality of the cells; a reference range setting step of analyzing a reference amount obtained from a cell population sorted for reference and setting a reference range for the expression amount of the test polypeptide; a measurement step of measuring a test expression amount and a test presentation amount of the test polypeptide in a cell population sorted for measurement; an extraction step of extracting information on the test expression amount and the test presentation amount for cells whose test expression amount is within the reference range; a relational equation derivation step of deriving a relational equation between the test expression amount and the test presentation amount from the extracted information; and a multimerization value acquisition step of acquiring a multimerization value from the relational equation,
  • [2] The method according to [1], wherein the multimer formation value is a derivative of the test expression level.
  • [3] The method according to [1] or [2], wherein the relational expression is a linear equation in which the test expression level is a variable, and the multimer formation value is a coefficient of the test expression level.
  • [4] The method according to any one of [1] to [3], wherein the test polypeptide is a membrane protein.
  • [5] The method according to [4], wherein the membrane protein is a subunit of MHC.
  • [6] The method according to any one of [1] to [5], wherein the expression level of the test polypeptide is measured based on the expression level of a labeled protein coupled to the expression of the test polypeptide.
  • [7] The method according to any one of [1] to [6], wherein the measurement is carried out by any one or more selected from the group consisting of flow cytometry, image cytometry, and mass cytometry.
  • the membrane protein is a subunit of MHC, and the measurement of the expression level of the test polypeptide is carried out by measuring the expression level of a labeled protein conjugated to the expression of the test polypeptide by flow cytometry.
  • a method for measuring fluctuations in multimer formation ability under target conditions comprising: a control value measurement step of measuring a multimer formation value under control conditions according to the method described in [1] to obtain a control value; a treatment value measurement step of measuring a multimer formation value under the target conditions according to the method described in [1] to obtain a treatment value; and a calculation step of calculating a fluctuation value based on the obtained control value and treatment value.
  • a method for measuring the binding ability of a multimeric receptor on a cell membrane to a test ligand comprising: a control value measurement step of measuring a multimer formation value according to the method described in [1] and obtaining a control value; a test value measurement step of measuring a multimer formation value according to the method described in [1] and obtaining a test value; and a calculation step of calculating a ligand binding value for the test ligand based on the obtained control value and test value, wherein the control value measurement step uses a fusion protein of a subunit of the multimeric receptor and a control ligand, and another subunit of the multimeric receptor, as the test polypeptide and the target polypeptide, respectively; and the test value measurement step uses a fusion protein of a subunit of the multimeric receptor and the test ligand, and another subunit of the multimeric receptor, as the test polypeptide and the target polypeptide, respectively.
  • a method for screening conditions for multimer formation in cells comprising: a control value measurement step of measuring a multimer formation value under control conditions according to the method described in [1] to obtain a control value; a candidate value measurement step of measuring a multimer formation value under candidate conditions according to the method described in [1] to obtain a candidate value; and a determination step of determining that the candidate conditions are suitable for multimer formation if the candidate value is higher than the control value, and/or determining that the candidate conditions are not suitable for multimer formation if the candidate value is lower than the control value.
  • the method according to [13] wherein the conditions for multimer formation are the type of drug to which the cells are exposed.
  • a method for measuring the three-dimensional structure formation ability of a test polypeptide in a cell, wherein the cell is capable of transiently expressing the test polypeptide as a cell membrane protein comprising: an expression step of expressing the test polypeptide in a plurality of the cells; a reference range setting step of analyzing a reference amount obtained from a cell population sorted for reference and setting a reference range for the expression amount of the test polypeptide; a measurement step of measuring a test expression amount and a test presentation amount of the test polypeptide in a cell population sorted for measurement; an extraction step of extracting information on the test expression amount and the test presentation amount for cells whose test expression amount is within the reference range; a relational equation derivation step of deriving a relational equation between the test expression amount and the test presentation amount from the extracted information; and a three-dimensional structure formation value acquisition step of acquiring a three-dimensional
  • a method for measuring the ability of a test polypeptide to maintain cell membrane localization in cells, wherein the cells are capable of transiently expressing the test polypeptide as a cell membrane protein comprising: an expression step of expressing the test polypeptide in a plurality of the cells; a reference range setting step of analyzing a reference amount obtained from a cell population sorted for reference and setting a reference range for the expression amount of the test polypeptide; a measurement step of measuring a test expression amount and a test presentation amount of the test polypeptide in a cell population sorted for measurement; an extraction step of extracting information on the test expression amount and the test presentation amount for cells where the test expression amount is within the reference range; a relational equation derivation step of deriving a relational equation between the test expression amount and the test presentation amount from the extracted information; and a cell membrane localization value acquisition step of acquiring a cell membrane localization value from the relational equation, wherein the reference range setting step is a reference cell sorting step of sorting
  • a method for measuring a variation in three-dimensional structure forming ability under target conditions comprising: a control value measurement step of measuring a three-dimensional structure forming value under control conditions according to the method described in [16] and obtaining a control value; a treatment value measurement step of measuring a three-dimensional structure forming value under the target conditions according to the method described in [16] and obtaining a treatment value; and a calculation step of calculating a variation value based on the obtained control value and treatment value.
  • a method for measuring fluctuations in the ability to maintain cell membrane localization under target conditions comprising: a control value measurement step of measuring a cell membrane localization value under control conditions according to the method described in [16-1] or [16-2] to obtain a control value; a treatment value measurement step of measuring a cell membrane localization value under the target conditions according to the method described in [16-1] or [16-2] to obtain a treatment value; and a calculation step of calculating a fluctuation value based on the obtained control value and treatment value.
  • a method for screening conditions for the formation of a three-dimensional structure of a test polypeptide in a cell comprising: a control value measurement step of measuring a three-dimensional structure formation value under control conditions according to the method described in [16] to obtain a control value; a candidate value measurement step of measuring a three-dimensional structure formation value under candidate conditions according to the method described in [16] to obtain a candidate value; and a determination step of determining that the candidate conditions are suitable for the formation of a three-dimensional structure of the test polypeptide if the candidate value is higher than the control value, and/or determining that the candidate conditions are not suitable for the formation of a three-dimensional structure of the test polypeptide if the candidate value is lower than the control value.
  • a method for screening conditions for maintaining the cell membrane localization of a test polypeptide in a cell comprising: a control value measurement step of measuring a cell membrane localization value under control conditions according to the method described in [16-1] or [16-2] to obtain a control value; a candidate value measurement step of measuring a cell membrane localization value under candidate conditions according to the method described in [16-1] or [16-2] to obtain a candidate value; and a determination step of determining that the candidate conditions are suitable for maintaining the cell membrane localization of the test polypeptide if the candidate value is higher than the control value, and/or determining that the candidate conditions are not suitable for maintaining the cell membrane localization of the test polypeptide if the candidate value is lower than the control value.
  • [18-2] The method according to any one of [16-1], [16-2], [17-1], and [18-1], wherein the test polypeptide is a G protein-coupled receptor.
  • a program for calculating a higher-order structure formation value or a cell membrane localization value of a test polypeptide in a cell comprising: a reference range setting step of analyzing a reference amount obtained from a cell population sorted for reference and setting a reference range for the expression amount of the test polypeptide; an extraction step of extracting information on the test expression amount and the test presentation amount for cells in which the test expression amount is within the reference range, based on the test expression amount and the test presentation amount of the test polypeptide measured in a cell population sorted for measurement; and an extraction step of extracting information on the test expression amount and the test presentation amount for cells in which the test expression amount is within the reference range, based on the extracted information.
  • the reference range setting step includes a reference amount acquisition step of acquiring the expression amount of the test polypeptide measured in the sorted reference cell group as a reference amount, a reference amount analysis step of analyzing the reference amount in terms of its expression amount, and a setting step of setting the reference range based on the results of the analysis.
  • the reference range setting process further includes a confirmation step of confirming the presence or absence of expression of the test polypeptide for each cell based on the expression level of the test polypeptide in the cell, and a reference cell separation step of obtaining data for a cell group containing cells expressing the test polypeptide for reference.
  • the method for measuring the multimerization ability of the present invention makes it possible to quantitatively measure the multimerization ability of a test polypeptide and a target polypeptide.
  • the method of the present invention for measuring the binding affinity between a multimeric receptor and a test ligand makes it possible to quantitatively measure the binding affinity between a multimeric receptor and a test ligand.
  • the method of the present invention for measuring the ability to form a three-dimensional structure and/or the ability to maintain localization at the cell membrane can quantitatively measure the ability of a test polypeptide to form a three-dimensional structure and/or the ability to maintain localization at the cell membrane.
  • the method of the present invention for measuring changes in the ability to form higher-order structures and/or the ability to maintain cell membrane localization can measure changes in the ability to form multimers and/or the ability to form three-dimensional structures and/or the ability to maintain cell membrane localization under target conditions.
  • the method of the present invention for screening conditions for forming higher-order structures and/or maintaining cell membrane localization makes it possible to screen candidate conditions for conditions that are suitable and/or unsuitable for forming multimers and/or forming three-dimensional structures and/or maintaining cell membrane localization.
  • the program of the present invention allows the method of the present invention to be automatically executed by a computer, etc.
  • FIGS. 1A and 1B are schematic diagrams showing exemplary relationships between test expression levels, test presentation levels, and multimerization ability in a method for measuring multimerization ability.
  • Figures 1A and 1B exemplarily show states in which the expression level (test expression level) and the abundance on the cell membrane (test presentation level) of a test polypeptide are different.
  • the gene and polypeptide of the test polypeptide are indicated in black, and the gene and polypeptide of the target polypeptide are indicated in white.
  • 1 is a flow chart exemplarily showing steps (S0101 to S0106) of a method for measuring multimer formation ability.
  • 10 is a flowchart illustrating details (S0110 to S0114) of the reference range setting step S0102.
  • FIG. 10 is a flowchart illustrating details (S0115 to S0117) of the measurement step S0103.
  • 1 is a schematic diagram illustrating an example of an outline of the reference range setting step S0102, in which black circles indicate cells expressing the test polypeptide and white circles indicate cells not expressing the test polypeptide.
  • 6A and 6B are schematic diagrams illustrating an example of an outline of steps in a method for measuring multimer formation ability.
  • FIG. 6A shows an outline of the measurement step S0103
  • FIG. 6B shows the extraction step S0104
  • FIG. 6C shows the relational equation deriving step S0105.
  • black circles represent cells expressing a test polypeptide
  • white circles represent cells not expressing a test polypeptide.
  • FIG. 1 is a schematic diagram showing the structure of the plasmid vector for expressing the ⁇ subunit of MHC class II used in Example 1.
  • “Amp r” represents the ampicillin resistance gene
  • "5'LTR” and “3'LTR” represent the 5'- and 3'-side retroviral LTRs (Long Terminal Repeats)
  • " ⁇ ” represents the retroviral packaging signal
  • "SV40” represents the SV40 (Simian Virus 40) promoter
  • “Puro r " represents the puromycin resistance gene.
  • Figure 1 is a schematic diagram showing the structure of the plasmid vector for expressing the ⁇ subunit of MHC class II used in Example 1.
  • “Amp r” represents the ampicillin resistance gene
  • “5'LTR” and “3'LTR” represent the 5' and 3' retroviral LTRs
  • " ⁇ ” represents the retroviral packaging signal
  • "IRES” represents the IRES (internal ribosome entry site)
  • “GFP” represents the GFP gene.
  • “peptide” represents the ligand
  • “linker 1” represents a linker composed of the amino acid sequence SGG
  • “linker 2” represents a linker composed of the amino acid sequence GGGGSIEGRGGGSGSA.
  • 9B shows how gate 2 is set using gate 1 as the population.
  • 1 is a cell density plot showing the gate settings used in Example 1.
  • Gate 2 is used as the population, and gates 3 and 4 are set.
  • 11A shows cell density plots (color-coded by percentile) illustrating the gate settings used in Example 1.
  • Fig. 11A shows how gate 5 was set for data separated by gate 4
  • Fig. 11B shows the criteria for setting a and b in Fig. 11A when setting gate 5
  • Fig. 11C shows how gates 6 to 9 were set to divide gate 5.
  • 12A and 12B are cell density plots showing examples of gate positions used in Example 1. Fig.
  • FIG. 12A shows the distribution of fluorescence intensity for each cell in a cell sample in which cells for measuring test expression levels and test presentation levels were treated with an isotype control antibody, and the positions of gates 5 and 6 to 9.
  • Fig. 12B shows the distribution of fluorescence intensity for each cell in a group in which cells for measuring test expression levels and test presentation levels were treated with an anti-HLA antibody, and the positions of gates 5 and 6 to 9.
  • This figure shows the derivation of the relational equation for the heterodimer of DQA1 * 01:02 and DQB1 * 06:02, which are MHCs measured in Example 1.
  • "isotype control” and " ⁇ -HLA antibody” represent data from cell samples treated with an isotype control antibody and an anti-HLA antibody, respectively.
  • Each data point represents the median value of GFP fluorescence intensity and PE fluorescence intensity in gates 7, 8, and 9, starting from the low value.
  • the equation represents an approximation, and the R2 value represents the coefficient of determination.
  • This figure shows the derivation of the relational equation for the heterodimer of DQA1 * 03:01 and DQB1 * 03:02, which are MHCs measured in Example 2.
  • "isotype control” and " ⁇ -HLA antibody” represent data from cell samples treated with an isotype control antibody and an anti-HLA antibody, respectively.
  • Each data point represents the median value of GFP fluorescence intensity and PE fluorescence intensity in gates 6 and 7, starting from the low value.
  • the equation represents an approximation
  • the R2 value represents the coefficient of determination.
  • This figure shows the results of comparing ligand binding values depending on the type of ligand in Example 3. For each ⁇ subunit, the ligand binding value is shown, with the control value when G15 is used as the ligand being set at 1.
  • FIG. 16A shows the results for the case where DRB1 * 04:01 was used as the ⁇ subunit
  • FIG. 16B shows the results for the case where DRB1 * 04:05 was used as the ⁇ subunit.
  • the formula indicates an approximate formula
  • the R2 value indicates the coefficient of determination.
  • 17A and 17B show the results of comparison with the predicted IC50 values in Example 4. The results are shown for the case where DRA * 01:01 was used as the ⁇ subunit.
  • FIG. 17A shows the results for the case where DRB1 * 15:02 was used as the ⁇ subunit
  • FIG. 17B shows the results for the case where DRB3 * 01:01 was used as the ⁇ subunit.
  • the formula indicates an approximate formula
  • the R2 value indicates the coefficient of determination.
  • 18A and 18B show the results of comparison with the predicted IC50 values in Example 4.
  • Figure 18A shows the results when DQA1 * 03:01 and DQB1 * 03:01 were used
  • Figure 18B shows the results when DQA1 * 01:03 and DQB1 * 06:01 were used.
  • the equations represent approximate equations
  • the R2 values represent the coefficient of determination.
  • This figure shows the results of verifying compatibility between measurement models in Example 5.
  • the ligand binding values are shown with the control value set to 1 when G15 is used as the ligand.
  • G9 indicates the results when a peptide consisting of nine glycine amino acids was used as the ligand
  • pep. 1a indicates the results when peptide 1a
  • pep. 1b indicates peptide 1b
  • pep. 1c indicates peptide 1c
  • pep. 2b indicates peptide 2b
  • pep. 2c indicates peptide 2c
  • pep. 2d indicates the results when peptide 2d was used as the ligand.
  • Error bars for the "SA3800" data indicate standard deviation.
  • This figure shows the results of verifying compatibility between measurement models in Example 5. The ligand binding values are shown with the control value set to 1 when G15 is used as the ligand.
  • G9 and “G12” indicate the results when peptides consisting of 9 and 12 glycine amino acids were used as the ligand, respectively; “pep. 1d” indicates the results when peptide 1d, “pep. 1e” indicates the results when peptide 1e, “pep. 2a” indicates the results when peptide 2a, and “pep. 2b” indicates the results when peptide 2b were used as the ligand.
  • the error bars for the "SA3800" data indicate the standard deviation.
  • Figure 21A shows the values of each index of ligand binding strength ("Rank” and “Rank_BA” values according to NetMHCIIpan-4.0, and predicted IC50 values) predicted in silico using a known method when each peptide was used as a ligand.
  • Figure 21B shows the ligand binding values calculated from the measurement results of the method of the present invention. This figure shows the results of a comparison between flow cytometry measurements ("Flow Cytometry”) and image cytometry measurements (“Imaging Cytometry”) in Example 7. The ligand binding values are shown, with the result when G15 was used as the ligand set at 1. In the figure, "G15” indicates the results when a peptide consisting of 15 glycine amino acids was used as the ligand, "pep.
  • FIGS. 24A and 24B show the difference in fluctuation values when abacavir sulfate and carbamazepine-related compounds were used in Example 8.
  • Figure 24A shows the fluctuation values calculated as the ratio to the results when only DMSO or PBS solvent was added without adding any drug.
  • Figure 24B shows the fluctuation values calculated as the difference from the results when only DMSO or PBS solvent was added without adding any drug.
  • each series indicates the type of drug added.
  • IL2Ra wild type indicates the results for mouse IL-2 receptor ⁇ (wild type)
  • IL2Ra mutant type indicates the results for mouse IL-2 receptor ⁇ (Y129H mutant type).
  • Error bars indicate standard deviation.
  • This figure shows the difference in results when a ligand and antagonist are added when using orexin receptor 1 (OX1R) in Example 10. The values shown are based on the result of adding only DMSO solvent without adding any ligand or drug, taking a value of 1.
  • ligand indicates the type of ligand added
  • antagonist indicates the type of antagonist added.
  • - indicates that no antagonist was added
  • pep. 3a indicates the results when peptide 3a, "pep.
  • a first aspect of the present invention is a method for measuring multimer formation ability.
  • the method of this aspect includes, as essential steps, an expression step, a reference range setting step, a measurement step, an extraction step, a relational equation deriving step, and a multimer formation value acquisition step.
  • the multimer formation ability of a test polypeptide and a target polypeptide in a cell can be measured.
  • the term "cell” refers to a structural unit of an organism.
  • the term "cell” as used herein includes any cell, and the species from which it originates is not particularly limited. For example, it may be a cell derived from a unicellular organism or a multicellular organism. Preferably, it is a cell derived from a multicellular organism such as a eukaryote.
  • the type of multicellular organism is not particularly limited, and it may be an animal or a plant.
  • the term "cell” as used herein is, for example, a cell derived from an animal.
  • Examples of animals include mammals, including primates (including humans, chimpanzees, marmosets, etc.), companion animals (including dogs, cats, etc.), livestock (including pigs, cows, sheep, goats, etc.), and laboratory animals (including rodents such as mice, rats, and guinea pigs), as well as birds, amphibians, reptiles, insects, etc.
  • the type of tissue from which the cell originates is not particularly limited.
  • it may be any cell constituting a multicellular organism.
  • cells derived from multicellular organisms it may include endoderm-derived cells, mesoderm-derived cells, ectoderm-derived cells, or combinations thereof.
  • Cell population refers to a group containing multiple cells. As used herein, cell populations include both those in which the cells that make up the population have some kind of relationship with each other and those that contain cells that are unrelated to each other.
  • Polypeptide refers to two or more amino acids linked by peptide bonds.
  • polypeptide as used herein broadly encompasses not only proteins, but also short chains known as peptides and oligopeptides.
  • Higher-order structure refers to the secondary, tertiary, and quaternary structures that a polypeptide adopts.
  • higher-order structure particularly refers to tertiary and quaternary structures, and includes multimers and three-dimensional structures.
  • ability to form higher-order structures includes the ability to form three-dimensional structures and the ability to form multimers.
  • Conformation refers to the three-dimensional structure of the entire molecule.
  • the term “conformation” is used synonymously with the tertiary structure of a polypeptide.
  • structural ability refers to the ability of a polypeptide to maintain a 3D structure in the environment in which it exists.
  • structural ability encompasses both the effects of the polypeptide's 3D structure formation (folding) reaction, and the effects of both the polypeptide's 3D structure formation reaction and its unfolding (unfolding) reaction.
  • Multimer refers to a complex formed by the association of multiple molecules.
  • multimer particularly refers to a set of polypeptides that have a quaternary structure.
  • complex refers not only to polypeptides but also to structures formed by the association of multiple molecules, and includes multimers.
  • Subunit refers to one molecule that constitutes a multimer.
  • multimers broadly encompass those containing multiple subunits. For example, they include both homomultimers formed only from the same type of subunits and heteromultimers containing different types of subunits.
  • multimerization ability refers to the ability of the subunits that make up a multimer to maintain a multimeric state in the environment in which they exist. As used herein, multimerization ability encompasses both the effects of the multimerization reaction of subunits, and the effects of both the multimerization reaction of subunits and the dissociation reaction from the multimeric state into subunits.
  • Intermolecular forces include any force that acts between molecules to form a non-covalent bond, such as hydrophobic interactions, van der Waals forces, Coulomb forces, and hydrogen bonds.
  • the associated molecules may be of the same type or different types.
  • Membrane protein refers to a protein present on a biological membrane.
  • Biological membranes here include any membrane structure composed of a lipid bilayer present in the body, such as the cell membrane, nuclear membrane, Golgi apparatus membrane, endoplasmic reticulum membrane, mitochondrial membrane (including inner and outer membranes), chloroplast membrane (including inner and outer membranes), and other vesicles.
  • Cell membrane protein refers to a protein present on the cell membrane.
  • cell membrane protein includes transmembrane proteins, cell membrane surface proteins, and lipid-modified proteins.
  • Cell membrane surface proteins and lipid-modified proteins are proteins that do not have a transmembrane domain.
  • a "transmembrane domain” is a protein domain that has affinity for the lipid bilayer that makes up the cell membrane and penetrates the lipid bilayer.
  • the protein domain that is exposed on the outside of the cell is called the extracellular domain
  • the protein domain that is exposed on the inside of the cell is called the intracellular domain.
  • some lipid-modified proteins and cell membrane surface proteins are not entirely embedded in the cell membrane, and the entire protein can be called an extracellular domain or an intracellular domain.
  • MHC major histocompatibility complex
  • MHC refers to a membrane-spanning glycoprotein complex present on the cell membrane, which forms a heterodimer and expresses itself on the cell surface in a state bound to an antigenic peptide.
  • MHC is used synonymously with MHC antigen.
  • MHC is treated as a receptor protein that binds to an antigenic peptide (ligand).
  • MHC is broadly divided into class I and class II.
  • display when used in reference to a cell membrane protein, broadly refers to the protein being present on the cell membrane.
  • On the cell membrane means being in contact with the cell membrane.
  • the state of being “on the cell membrane” broadly includes states of being in direct or indirect contact with the cell membrane.
  • a state of being in direct contact with the cell membrane includes a state in which part of the molecule (a protein's transmembrane domain or a covalently bound lipid moiety) is present in the lipid bilayer of the cell membrane, as well as a state in which the surface of the molecule is in contact with the cell membrane through electrostatic interactions or the like.
  • a state of being in indirect contact with the cell membrane refers to a state in which the molecule is in contact with a molecule that is in direct contact with the cell membrane, or a state in which the molecule is associated with a molecule that is in direct contact with the cell membrane.
  • receptor refers to a protein that specifically recognizes a particular substance. Receptors as used herein include both proteins that recognize substances endogenous to cells and proteins that recognize substances exogenous to cells. Receptors as used herein also include proteins that bind to ligands and form stable higher-order structures.
  • Multimeric receptor refers to a receptor protein that forms a multimer.
  • Ligand refers to a substance that specifically binds to a receptor protein.
  • ligand broadly refers to substances that can bind to a receptor protein and substances that can contact the ligand-binding site of a receptor protein.
  • sorting refers to separating cells. In addition to the operation of moving cells from a container, “sorting” broadly includes situations such as measuring or observing a portion of cells without moving them from the container.
  • fractionation broadly includes not only aspects such as fractionation, but also aspects such as handling certain information separately from other information.
  • a “relational equation” is an equation that expresses the relationship between multiple phenomena. There are no particular limitations on the relational equation used in this specification, but it is preferably an equation, and more preferably a mathematical expression. A relational equation used in this specification is, for example, a functional expression.
  • binding molecule refers to any molecule capable of binding to a target molecule. Binding molecules include antibodies, their antigen-binding fragments, antigen-binding derivatives, aptamers, and the like. For example, antibodies include both monoclonal and polyclonal antibodies, such as IgG antibody molecules and IgM antibody molecules. Antibodies include complete antibodies, Fab, Fab', and F(ab') 2 fragments, and single-chain antibody (scFv) fragments in which the heavy chain variable region (VH) and light chain variable region (VL) are linked via a linker.
  • VH heavy chain variable region
  • VL light chain variable region
  • maintenance on the cell membrane or “maintenance of localization on the cell membrane” refers to the amount of a protein on the cell membrane being maintained within a certain range. There are no particular limitations on the reasons why a protein is no longer maintained on the cell membrane and the amount of the protein on the cell membrane changes. Examples include destabilization of the protein's three-dimensional structure, dissociation of a protein complex, and/or internalization due to protein activation.
  • the method of this embodiment includes, as essential steps, an expression step, a reference range setting step, a measurement step, an extraction step, a relational equation deriving step, and a multimer formation value obtaining step.
  • test presentation amount the amount of dimers of the test polypeptide and target polypeptide present on the cell surface
  • the amount of dimers on the cell membrane of the cell in FIG. 1A is two
  • the amount of dimers on the cell membrane of the cell in FIG. 1B is four. Therefore, at first glance, the dimer formation ability of the test polypeptide in cell B appears to be twice that of cell A.
  • the intracellular expression level of the test polypeptide is higher in cell B than in cell A.
  • cell B expresses more than twice the test polypeptide as cell A. Therefore, by correcting the test presentation amount using the expression level of the test polypeptide in the cell (test expression level), it can be determined that the test polypeptide in cell A has a higher ability to form multimers than the test polypeptide in cell B, and the dimer formation ability of each test polypeptide of A and B can be properly evaluated.
  • test expression level the expression level of the test polypeptide in cell A has a higher ability to form multimers than the test polypeptide in cell B, and the dimer formation ability of each test polypeptide of A and B can be properly evaluated.
  • Expression step S0101 is an essential step in which the test polypeptide and the polypeptide of interest are expressed in a plurality of cells.
  • test polypeptide and “subject polypeptide” refer to polypeptides that constitute a multimer to be measured.
  • the terms test polypeptide and subject polypeptide are used for convenience, and which polypeptide in a given multimer is the test polypeptide can be determined arbitrarily.
  • the multimer formed by the test polypeptide is not particularly limited, as long as it is a complex formed by the association of multiple polypeptides.
  • multimers in this specification include enzyme-substrate complexes, ligand-receptor complexes, antigen-antibody complexes, and complexes of multiple proteins that function in concert (including enzyme complexes, immune receptor complexes, etc.).
  • the multimer may be one in which the test polypeptide is known to actually form that multimer, or it may not be one in which it is known to form that multimer.
  • the primary purpose is to quantitatively measure the ability to form multimers, this method can be used with known multimers; if the primary purpose is to measure the presence or absence of multimer formation, the multimer formed by the test polypeptide and the target polypeptide will be unknown.
  • the multimer may have a stable structure, or may have a structure that is stable only under specific conditions.
  • both multimers that have a stable structure in the extracellular environment and multimers that have a stable structure in the intracellular environment can be used.
  • it can be used in the method of this embodiment by expressing it as a cell membrane protein so that at least a portion of the test polypeptide is located extracellularly.
  • it when using a multimer that has a stable structure in the intracellular environment, it can be used in the method of this embodiment by expressing it as a cell membrane protein so that at least a portion of the test polypeptide is located extracellularly.
  • further covalent bonds may be formed after association through intermolecular interactions.
  • the number of molecules constituting the multimer is not particularly limited, as long as it is plural.
  • the multimer may be composed of 2 or more molecules, 3 or more molecules, 4 or more molecules, 5 or more molecules, or more molecules.
  • the multimer may be composed of, for example, 20 or fewer molecules, 18 or fewer molecules, 17 or fewer molecules, 16 or fewer molecules, 15 or fewer molecules, 14 or fewer molecules, 13 or fewer molecules, 12 or fewer molecules, 11 or fewer molecules, 10 or fewer molecules, 8 or fewer molecules, 7 or fewer molecules, 6 or fewer molecules, 5 or fewer molecules, 4 or fewer molecules, or 3 or fewer molecules. If it is unknown whether the test polypeptide forms a multimer, the method of this embodiment may be carried out without specifically considering the number of molecules constituting the multimer.
  • All of the molecules constituting a multimer may be identical (i.e., a homomultimer), or some of them may be different (i.e., a heteromultimer).
  • the number of test polypeptide molecules contained in one multimer is not particularly limited, but may be, for example, 18 molecules or less, 16 molecules or less, 14 molecules or less, 12 molecules or less, 11 molecules or less, 10 molecules or less, 8 molecules or less, 7 molecules or less, 6 molecules or less, 5 molecules or less, 4 molecules or less, 3 molecules or less, or 2 molecules or less, and preferably 2 molecules or less or 1 molecule.
  • the test polypeptide may be a membrane protein or a non-membrane protein, as long as it can be expressed as a membrane protein in the cells described below. If the test polypeptide is a membrane protein, there are no particular limitations on its specific type.
  • the test polypeptide may be a membrane protein.
  • Test polypeptides that are not membrane proteins include, for example, receptor ligands and antigen peptides that bind to MHC.
  • exogenous polypeptides are preferably used as test polypeptides, but endogenous polypeptides may also be used as long as the timing of their expression can be controlled.
  • Exogenous polypeptides include polypeptides derived from the same organism as the cell, polypeptides derived from the same species as the cell, and polypeptides derived from a different species than the cell. Polypeptides may be artificial or natural.
  • the test polypeptide and/or target polypeptide may be linked to a tag.
  • tags include epitope tags.
  • Epitope tags include, but are not limited to, His tags, Strep-tag (registered trademark) II, FLAG (registered trademark) tags, and Myc tags.
  • the test polypeptide and/or target polypeptide may be linked to the tag directly or indirectly; for example, the polypeptide and tag may be linked via an artificial sequence directly linking them, or via a linker, protease cleavage sequence, restriction enzyme recognition sequence, etc.
  • the type of cell membrane protein used in this embodiment is not particularly limited, as long as the formation of multimers is a protein necessary for migration to and/or maintenance on the cell membrane.
  • the cell membrane protein used in other embodiments can be any cell membrane protein suitable for that purpose.
  • the protein when measuring the ability to form a three-dimensional structure, there is no particular limitation on the protein, as long as it is necessary for migration to and/or maintenance on the cell membrane.
  • the ability to maintain cell membrane localization there is no particular limitation on the protein, as long as it is capable of migrating to the cell membrane and the ease of maintenance on the cell membrane is affected by conditions such as the state of the protein or the presence or absence of a ligand.
  • "necessary" for migration to and/or maintenance on the cell membrane means that satisfying the conditions makes it easier to migrate to and/or maintain on the cell membrane.
  • the protein may be a transmembrane protein, a surface membrane protein, or a lipid-modified protein, or may be a protein that localizes on the cell membrane under specific conditions.
  • cell membrane proteins include transporter proteins (including channel proteins such as ion channels, selective channels such as aquaporins, and non-selective channels such as connexins; pump proteins including proteins that use ion movement as energy, such as sodium ion pumps, proton pumps, and ATPases; as well as symporters and antiporters), cell membrane protein receptors (including enzyme-linked receptors, ion channel receptors, and G protein-coupled receptors), cell adhesion molecules, membrane-bound ligands, and membrane antigens.
  • transporter proteins including channel proteins such as ion channels, selective channels such as aquaporins, and non-selective channels such as connexins
  • pump proteins including proteins that use ion movement as energy, such as sodium ion pumps, proton pumps,
  • Cell membrane protein receptors e.g., MHC
  • membrane-bound ligands and membrane antigens e.g., MHC
  • membrane antigens e.g., MHC
  • membrane-bound ligands and membrane antigens can be used; specifically, MHC can be used.
  • a ligand binds to an enzyme-linked receptor (e.g., receptor tyrosine kinase)
  • dimerization or multimerization is induced, activating the enzyme bound to the receptor and initiating signal transduction based on an enzymatic reaction.
  • enzyme-linked receptors e.g., receptor tyrosine kinase
  • dimerization or multimerization is induced, activating the enzyme bound to the receptor and initiating signal transduction based on an enzymatic reaction.
  • cytokine receptors e.g., interleukin receptors such as IL-2 receptor
  • ionotropic receptors are heteropolymers, and when a ligand binds to them, their conformation changes, causing them to function as channels that regulate the membrane permeability of ions.
  • ionotropic receptors include glutamate receptors, nicotinic receptors, GABA receptors, serotonin receptors, and glycine receptors.
  • G protein-coupled receptors initiate signal transmission by undergoing structural changes upon ligand binding or by activating G proteins present in the cytoplasm. It is known that some receptors, such as G protein-coupled receptors, are internalized within the cell through interactions with beta-arrestins in the cytoplasm upon ligand binding. This internalization phenomenon is known to occur, for example, in G protein-coupled receptors such as orexin receptor 1 (OX1R), orexin receptor 2 (OX2R), and dopamine receptors.
  • OX1R orexin receptor 1
  • OX2R orexin receptor 2
  • the specific type is not particularly limited.
  • it may be either MHC class I or MHC class II.
  • MHC class I is composed of a dimer of an ⁇ subunit and ⁇ 2 microglobulin, is present in all nucleated cells and platelets, and activates CD8-positive cytotoxic T cells.
  • MHC class II is composed of a dimer of an ⁇ subunit and ⁇ subunit, is expressed in antigen-presenting cells, and activates CD4-positive helper T cells.
  • the multimer is MHC, either of its subunits can be used as the test polypeptide.
  • human MHC is called human leukocyte antigen (HLA).
  • HLA classified as MHC class I (HLA class I)
  • HLA class I MHC class I
  • ⁇ 2-microglobulin is less polymorphic.
  • HLA class I is further classified into isotypes such as HLA-A, HLA-B, HLA-C, HLA-E, HLA-F, and HLA-G, and each isotype is further classified into several serological types.
  • HLA-A Serological types of HLA-A include, for example, HLA-A1, -A2, -A3, -A9, -A10, -A11, -A19, -A28, -A36, -A43, and -A80.
  • HLA-A genes include HLA-A * 01:01, -A * 02:01, -A * 03:01, and -A * 24:02.
  • HLA-B serological types include HLA-B5, -B7, -B8, -B12, -B13, -B14, -B15, -B16, -B17, -B18, -B21, -B22, -B27, -B35, -B37, -B40, -B41, -B42, -B46, -B47, -B48, -B53, -B57, -B59, -B67, -B70, -B73, -B78, and -B81.
  • HLA-B genes include HLA-B * 07:02, -B * 08:01, -B * 15:02, -B * 44:02, -B * 51:01, -B * 52:01, -B * 57:01, -B * 57:02, and -B * 57:03.
  • HLA-C serological types include HLA-Cw1, -Cw2, -Cw3, -Cw4, -Cw5, -Cw6, -Cw7, and -Cw8.
  • HLA-C genes include HLA-C * 01:02, -C * 03:03, -C * 04:01, -C * 07:01, and -C * 07:02.
  • HLA class II While the genes encoding the ⁇ subunit of HLA (HLA class II), which is classified as MHC class II, are relatively unaltered, the genes encoding the ⁇ subunit are highly polymorphic, with over 1,000 alleles registered for each of the HLA-DRB1, -DQB1, and -DPB1 loci. HLA class II is further classified into isotypes such as HLA-DR, HLA-DQ, and HLA-DP. Each isotype is further classified into several serological or cytological types.
  • HLA-DR serological types include HLA-DR1, -DR2, -DR3, -DR4, -DR5, -DR6, -DR7, -DR8, -DR9, -DR10, -DR51, -DR52, and -DR53.
  • HLA-DR ⁇ subunit genes include HLA-DRA * 01:01.
  • HLA-DR ⁇ subunit genes include HLA-DRB1 * 03:01, -DRB1 * 04:05, -DRB1*07:01, -DRB1 * 09:01, -DRB1 *15:01, -DRB1* 15 :02, -DRB3 * 01:01, -DRB3 * 02:02, -DRB3 * 03:01, -DRB4 * 01:03, -DRB5 * 01:01, -DRB5 * 01:02, etc.
  • HLA-DP cytological types include HLA-DPw1, -DPw2, -DPw3, -DPw4, -DPw5, -DPw6, etc.
  • HLA-DP ⁇ subunit genes examples include HLA-DPA1 * 01:03, -DPA1 * 02:02, etc.
  • HLA-DP ⁇ subunit genes examples include HLA-DPB1 * 02:01, -DPB1 * 04:01, -DPB1 * 04:02, -DPB1 * 05:01, -DPB1 * 09:01, etc.
  • HLA-DQ serological types include HLA-DQ1, -DQ2, -DQ3, -DQ4, etc.
  • HLA-DQ ⁇ subunit genes include HLA-DQA1 * 01:02, -DQA1 * 02:01, -DQA1*03:01, -DQA1 * 05:01, etc.
  • HLA-DQ ⁇ subunit gene examples include HLA-DQB1 * 02:01, -DQB1 * 03:01, -DQB1 * 03:03, -DQB1 * 04:01, -DQB1 * 06:01, and -DQB1 * 06:02.
  • the subject polypeptide is a polypeptide whose ability to form a multimer with a test polypeptide is measured by the method of this embodiment.
  • target polypeptide As mentioned above, the distinction between target polypeptide and test polypeptide is for convenience's sake. Therefore, the basic details of target polypeptides are the same as those for test polypeptides. Here, only the differences from test polypeptides will be described.
  • target polypeptide is not particularly limited, as long as it is a polypeptide that has the potential to form a multimer with the test polypeptide.
  • the target polypeptide may be a polypeptide known to associate with the test polypeptide, or a polypeptide whose association with the test polypeptide is unknown.
  • the target polypeptide may be an endogenous polypeptide or an exogenous polypeptide.
  • the number of target polypeptides is not particularly limited, as long as it is one or more types.
  • the number of target polypeptides may be two or more types, three or more types, four or more types, or five or more types, or may be, for example, 20 or fewer types, 18 or fewer types, 16 or fewer types, 14 or fewer types, 12 or fewer types, 10 or fewer types, 8 or fewer types, 6 or fewer types, 5 or fewer types, 4 or fewer types, 3 or fewer types, or 2 or fewer types.
  • the number of molecules of each target polypeptide contained in one multimer is not particularly limited, but may be, for example, 10 molecules or less, 8 molecules or less, 4 molecules or less, 3 molecules or less, 2 molecules or less, or 1 molecule.
  • the cells used in the method of this embodiment are capable of transiently expressing the test polypeptide as a cell membrane protein, and are capable of expressing the polypeptide of interest as a cell membrane protein.
  • the type of cells used is not particularly limited as long as they are capable of expressing the test polypeptide and the target polypeptide.
  • any of the cells described above in the definition section can be used.
  • the cells used may be cells that normally express the test polypeptide and/or the target polypeptide, or may be cells that have been modified by specific manipulation to express those polypeptides.
  • the specific type of cell is not particularly limited, but examples include animal-derived cells, vertebrate-derived cells, mammalian-derived cells, and human-derived cells.
  • the cells may be derived from the same organism as the organism from which the test polypeptide and target polypeptide are derived, or may be derived from a different organism.
  • Cultured cells are also suitable for use.
  • the cultured cells may be primary cultured cells, subcultured cells, or established cell lines.
  • tumor-derived cells immortalized cells, antigen-presenting cells (B cells, dendritic cells, macrophages, etc.), cells differentiated from pluripotent stem cells such as ES cells and iPS cells, and their established cell lines can be used.
  • Cells into which at least one gene for a test polypeptide or a target polypeptide has been introduced can be used.
  • the method for gene introduction can be any known method and is not particularly limited.
  • the gene can be integrated into genomic DNA, or can be introduced into the cell as a nucleic acid molecule independent of genomic DNA.
  • the vector used for gene introduction can be any known vector and is not particularly limited.
  • viruses, plasmids, cosmids, artificial chromosomes, etc. can be used as vectors.
  • Viruses include various vectors derived from retroviruses, adenoviruses, adeno-associated viruses, lentiviruses, etc.
  • Plasmids include pKA1, pCDM8, pSVK3, pMSG, pSVL, pBK-CMV, pBK-RSV, pEBV, pRS, pcDNA3, pMSG, pYES2, pMXs-puro, pMXs-IB, pMXs-IRES-GFP, etc.
  • the genes for both polypeptides may be contained in the same vector, or may be contained in separate vectors. Furthermore, the introduction method used in this case may be a common method, or different methods may be used.
  • the cells are capable of expressing the test polypeptide and the target polypeptide as cell membrane proteins.
  • test polypeptide and the target polypeptide themselves are cell membrane proteins or portions thereof, they can be expressed as cell membrane proteins by expressing the test polypeptide and the target polypeptide as is. If at least one of the test polypeptide and the target polypeptide is a membrane protein other than a cell membrane protein, they can be expressed as a cell membrane protein, for example, by replacing the localization signal sequence for another organelle with an endoplasmic reticulum localization signal sequence.
  • test polypeptide and the target polypeptide are not a membrane protein, they can be expressed as a cell membrane protein, for example, by expressing the test polypeptide as a fusion protein with a cell membrane protein (including membrane proteins modified into cell membrane proteins as described above) or a portion thereof. In this case, any of the cell membrane proteins described above for the test polypeptide can be used as the cell membrane protein.
  • the test polypeptide presentation amount changes depending on the association between the test polypeptide and the target polypeptide. Therefore, the cells used in this embodiment express both polypeptides in a manner such that the translocation of the multimer to the cell membrane changes depending on the association between the test polypeptide and the target polypeptide.
  • the cells express both polypeptides in a manner in which the association between the test polypeptide and the target polypeptide is essential for the translocation of the multimer to the cell membrane.
  • the method of this embodiment can be carried out by expressing them as they are.
  • the method of this embodiment can be carried out by detecting an indicator that reflects the abundance of multimers containing the test polypeptide and/or the target polypeptide on the cell membrane when measuring the test polypeptide presentation amount. If the test polypeptide and/or the target polypeptide is not a cell membrane protein, the method of this embodiment can be carried out by expressing them as cell membrane proteins that can be expressed in the manner described above.
  • the cells can transiently express the test polypeptide.
  • transiently expressible refers to the fact that the test polypeptide is not present as a cell membrane protein in the cells at the start of the expression step, but that the test polypeptide can be expressed as a cell membrane protein after the start of the expression step. That is, the test polypeptide has never been expressed as a cell membrane protein in the cells before the expression step, or even if it has been expressed, the expression level is low or depleted at the start of the expression step.
  • the end of expression of the test polypeptide is not particularly limited, as long as it continues to be expressed until the end of this process. For example, it may be expressed so that expression ceases simultaneously with the end of this process, or it may be expressed so that it can continue to be expressed even after the end of this process.
  • the cells are capable of expressing a polypeptide of interest.
  • the expression mode of the target polypeptide is not particularly limited as long as the timing and amount of expression of the target polypeptide in this step are not rate-limiting for the transfer of the multimer to the cell membrane or the maintenance of the expression state on the membrane.
  • the target polypeptide may be constitutively expressed or may be conditionally expressible.
  • the target polypeptide is expressed before the start of the expression step.
  • promoter refers to a gene expression regulatory region capable of controlling the expression of a gene or the like located downstream (3' end) thereof. Promoters can be classified based on the location at which a gene or the like under expression control is expressed, and are divided into ubiquitous promoters (systemic promoters) and site-specific promoters.
  • a ubiquitous promoter is a promoter that controls the expression of a target gene or the like (referred to as a "target gene or the like") in all cells, i.e., the entire host organism.
  • a site-specific promoter is a promoter that controls the expression of a target gene or the like only in specific cells or tissues.
  • the promoters controlling the test polypeptide and target polypeptide of the present invention may be either ubiquitous promoters or site-specific promoters.
  • promoters When classified based on the timing of expression, promoters are classified as constitutively active promoters, inducible promoters, or stage-specific active promoters.
  • Constitutively active promoters can constitutively express a target gene, etc., within a cell.
  • Inducible promoters can induce the expression of a target gene, etc., within a cell at any time based on an inducing stimulus.
  • Stage-specific active promoters can induce the expression of a target gene, etc., within a cell only at a specific stage of development.
  • a promoter that controls the expression of a test polypeptide or target polypeptide may be a constitutively active promoter, inducible promoter, or stage-specific active promoter.
  • the target polypeptide may be an endogenous polypeptide, and its promoter may be an endogenous promoter.
  • the duration of this step is not particularly limited, as long as it allows for sufficient expression of the test polypeptide.
  • the step can be carried out for 1 hour or more, 2 hours or more, 3 hours or more, 5 hours or more, 6 hours or more, 9 hours or more, 12 hours or more, 18 hours or more, 24 hours or more, 30 hours or more, 36 hours or more, 42 hours or more, 48 hours or more, 50 hours or more, 55 hours or more, 60 hours or more, 70 hours or more, 72 hours or more, 80 hours or more, 84 hours or more, 90 hours or more, or 96 hours or more.
  • the conditions for this step are not particularly limited and can be set appropriately depending on the cells used. Culture methods for different cell types are well known in the art, and any of these can be used. For example, various media, additives, etc. are commercially available, and these may also be used.
  • the culture environment is not particularly limited. Culture can be performed in a commonly used environment, for example, at 37°C and 5% CO2.
  • Reference range setting process S0102 is an essential step in which a reference amount obtained from a cell population sorted for reference is analyzed to set a reference range for the expression amount of a test polypeptide. This step can be performed simultaneously with or after the expression step.
  • This process includes a confirmation step, a reference cell sorting step, a reference amount acquisition step, a reference amount analysis step, and a setting step.
  • this step first, the presence or absence of expression of the test polypeptide in the cells is confirmed ((1) in Figure 5). Then, a plurality of cells including cells expressing the test polypeptide are sorted as a reference cell population ((2) in Figure 5). The expression level of the test polypeptide in the sorted cell population is measured, and this expression level is obtained as a reference amount ((3) in Figure 5). The obtained reference amount is analyzed for the expression level of the test polypeptide and compiled in any format such as a graph ((4) in Figure 5), and a reference range is set based on the results of the analysis ((5) in Figure 5). The reference range set in this step is used in the subsequent extraction step. Each step is explained below.
  • Confirmation step S0110 This step is a step for confirming whether or not the test polypeptide is expressed in the cells ((1) in Figure 5).
  • the indicator used to determine the presence or absence of expression is not particularly limited, as long as it reflects the expression of the test polypeptide.
  • the amount of transcription product of the test polypeptide, the amount of translation product, the amount of label bound to the test polypeptide, the amount of transcription product coupled with the expression of the test polypeptide, the expression amount of labeled protein coupled with the expression of the test polypeptide, the amount of label coupled with the function of the test polypeptide, etc. can be used.
  • label is not particularly limited.
  • small molecule labels labeled peptides, labeled proteins, etc.
  • Specific types of labels include, for example, luminescent substances, fluorescent substances, enzymes, radioactive substances, metal isotopes, quantum dots, enzyme substrates, enzyme cofactors, enzyme inhibitors, dyes, metal ions, and combinations thereof.
  • Luminescent substances include, for example, acridinium esters, 3-(2'-spiroadamantane)-4-methoxy-4-(3"-phosphoryloxy)phenyl-1,2-dioxetane (AMPPD), luminol and its modifications, 4-aminophthalhydrazide, various coelenterazines, and luciferin.
  • fluorescent substances include fluorescent dyes such as FITC, Texas Red, PE, PerCP, APC, Cy3, Cy5, Cy7, FAM, HEX, VIC, JOE, Rox, TET, Bodipy493, NBD, TAMRA, Qdot (registered trademark), DAPI, DyLight (registered trademark), Pacific Blue TM , eFluor TM , Brilliant Violet TM , BD Horizon TM , Alexa-Fluor (registered trademark) dyes, and tandem dyes thereof; and fluorescent proteins such as GFP, EGFP, BFP, CFP, YFP, and mCHERRY.
  • fluorescent dyes such as FITC, Texas Red, PE, PerCP, APC, Cy3, Cy5, Cy7, FAM, HEX, VIC, JOE, Rox, TET, Bodipy493, NBD, TAMRA, Qdot (registered trademark), DAPI, DyLight (registered trademark), Pacific Blue TM , eF
  • Enzymes include, for example, proteases, peroxidases, phosphatases (e.g., alkaline phosphatase), sulfatases, peptidases, glycosidases, hydrolases, oxidoreductases, lyases, transferases, isomerases, ligases, and synthetases.
  • radioactive substances examples include 14 C, 123 I, 124 I, 125 I, 131 I, Tc99m, 32 P, 35 S, and 3 H.
  • metal isotopes examples include 169 Tm, 167 Er, and 144 Nd.
  • the label When a label is bound to the test polypeptide, the label may be bound directly to the test polypeptide or indirectly via a linker or the like. Furthermore, in addition to labels that are directly detectable, labels that become detectable after additional processing, such as the enzyme substrates mentioned above, can also be used.
  • a "labeled protein coupled to the expression of a test polypeptide” refers to a labeled protein whose expression level correlates with that of the test polypeptide.
  • examples of such proteins include labeled proteins whose gene is under the control of the same promoter as the test polypeptide and is expressed simultaneously with the test polypeptide (polycistronic expression), and labeled proteins whose gene is under the control of a promoter that competes with the promoter of the test polypeptide and whose expression level decreases in accordance with the expression level of the test polypeptide.
  • polycistronic expression for polycistronic expression, for example, IRES, IGR-IRES, self-cleaving peptides such as 2A peptides (P2A, T2A, E2A, F2A), etc. can be used.
  • a labeled protein having a gene under the control of the same promoter, particularly in the same vector or a different vector can be used to confirm the expression of the test polypeptide in this step. Even in such cases, if there is a clear correlation between the expression level of the test polypeptide and the expression level of the labeled protein, such a labeled protein can also be used in the measurement in the reference amount acquisition step by making corrections based on that information, etc.
  • labeled proteins include proteins whose presence can be directly detected, as well as proteins whose presence can be indirectly detected.
  • proteins whose presence can be directly detected include the various fluorescent proteins mentioned above.
  • proteins whose presence can be indirectly detected include enzymes that become detectable in the presence of a specific substrate, and proteins that migrate onto the cell membrane and can be detected by the method described below in the presentation amount measurement step.
  • a label conjugated to the function of a test polypeptide refers to a label that can be detected based on the function of the test polypeptide.
  • part of the test polypeptide is an enzyme, the expression of the test polypeptide can be detected based on the enzymatic reaction by using its substrate as a label.
  • the method for determining the presence or absence of expression is not particularly limited, as long as it can detect the expression of biomolecules in individual cells.
  • the biomolecules to be detected are not limited to polypeptides, but may also be proteins or nucleic acids.
  • the method does not disrupt the cell structure and can measure the intracellular localization and amount.
  • the presence or absence of expression can be determined visually, using a microscope (e.g., a stereomicroscope, a confocal microscope, a fluorescence microscope, etc.), based on the presence or absence of detection using a detection device, or by measuring the expression level.
  • the specific method is not particularly limited. For example, a method that detects the amount of biomolecules in each cell can be used.
  • Examples of such methods include methods using devices such as a microscope image analyzer or a plate image analyzer, flow cytometry, image cytometry, and mass cytometry.
  • detection methods based on fluorescence detection the specific method is not particularly limited.
  • methods using fluorescently labeled antibodies or Förster resonance energy transfer (FRET), bimolecular fluorescence complementation assay (BiFc), proximity ligation assay (PLA), single-molecule fluorescence detection methods, spectroscopy, etc. can be used.
  • FRET Förster resonance energy transfer
  • BiFc bimolecular fluorescence complementation assay
  • PDA proximity ligation assay
  • Methods that can be used to quantify nucleic acids include, but are not limited to, detection methods using nucleic acid staining reagents and methods that count the number of reads per cell using a next-generation sequencer.
  • the level of expression used to determine whether expression is occurring is not particularly limited. For example, it is sufficient that the expression is greater than that of cells not expressing the test polypeptide (control cells), or that the expression is significantly greater than that of control cells.
  • the cells used in this step may be live cells or fixed cells.
  • Reference cell sorting step S0111 This step is a step of separating a cell population containing cells expressing a test polypeptide as a reference cell population ((2) in Figure 5). This step can be performed simultaneously with or after the confirmation step.
  • the method of sorting is not particularly limited.
  • the desired number of cells may be selected from an already separated cell population (e.g., a cell population separated into small compartments in a culture vessel), or cells may be sorted from any multiple positions within a cell population in one compartment, or multiple already separated cell populations may be collected and sorted as a single cell group.
  • the cells in the culture vessel can be used as the measurement subject as they are.
  • cell populations consisting of 600 cells or more, 1,000 cells or more, 2,000 cells or more, 3,000 cells or more, 5,000 cells or more, 7,000 cells or more, 10,000 cells or more, 20,000 cells or more, 30,000 cells or more, 40,000 cells or more, or 50,000 cells or more can be sorted.
  • the number of cell populations to be separated is not particularly limited, as long as it is one or more. For example, one or more, two or more, three or more, four or more, five or more, or six or more cell populations can be separated.
  • the number of cell populations can be increased or decreased depending on, for example, the number of types of test polypeptides and the number of types of experimental conditions in the expression process.
  • any additional processing can be performed for processing in the reference amount acquisition step, etc.
  • the cell group can be detached from the culture vessel, etc., and suspended in a liquid such as a medium in this step.
  • Reference amount acquisition step S0112 the expression level of the test polypeptide in the sorted cell population is measured and obtained as a reference level ((3) in Figure 5). This step can be performed simultaneously with or separately from the confirmation step.
  • the expression level of the test polypeptide is measured and obtained as a reference level.
  • the expression level of the test polypeptide broadly encompasses the amount of transcription product and the amount of translation product, and is not particularly limited.
  • the expression level of the test polypeptide can be measured using the indicators described in the confirmation step.
  • the expression level of the test polypeptide can be measured based on the expression level of a labeled protein conjugated to the expression of the test polypeptide.
  • the indicator used to measure the expression level may be the same as or different from the indicator used in the confirmation step. Preferably, the same indicator is used in both the confirmation step and this step.
  • the methods described in the confirmation step can be used.
  • a method for detecting the amount of biomolecules in each cell can be used.
  • Techniques for detecting the amount of biomolecules in each cell include microscope image analyzers, plate image analyzers, flow cytometry, image cytometry, and mass cytometry.
  • the biomolecules to be detected are not limited to polypeptides, and may also be proteins or nucleic acids.
  • flow cytometry When flow cytometry is used for measurement, there are no particular limitations on the light source irradiation method, wavelength adjustment (detection) method (e.g., spectral type, filter method, etc.), the presence or absence of a cell sorting device, and the sorting method.
  • wavelength adjustment (detection) method e.g., spectral type, filter method, etc.
  • image cytometry examples include analysis using laser scanning cytometry and confocal laser microscopes.
  • the expression level of the test polypeptide may be measured for all cells in the cell population sorted in the reference cell sorting step, or may be measured only for a portion of cells that meet certain criteria.
  • exclusion processing It is possible to separate data on some cells from the data on each cell group and not include them in subsequent analysis (exclusion processing). There are no particular restrictions on the criteria for performing exclusion processing. For example, data derived from dead cells, cell debris, and aggregated cells can be separated and excluded.
  • FSC forward scatter
  • SSC side scatter
  • dead cells can be labeled using any reagent that stains dead cells, and data on dead cells can be excluded based on that label.
  • two-dimensional development surfaces for combinations such as SSC-Area (or SSC-Width) and SSC-Height, or FSC-Area (or FSC-Width) and FSC-Height can be used to exclude data on aggregated cells that deviate from the distribution of single cells based on methods commonly used in the art.
  • any additional treatment can be performed as long as it does not interfere with the measurement of the expression level of the test polypeptide.
  • a treatment may be performed to prevent non-specific binding of antibodies to Fc receptors on the cell surface.
  • Control treatments (such as the application of a negative control reagent) for the measurement conditions used in the measurement step can also be performed.
  • an isotype control antibody or the like as a negative control reagent
  • the antibody or other binding molecule used is not particularly limited as long as it is a binding molecule prepared for an antigen that is not present in the cell type or cell sample used in this step.
  • a commercially available antibody can be used as an isotype control antibody.
  • staining conditions for the isotype control antibody There are no particular limitations on the staining conditions for the isotype control antibody. It is preferable to match the staining conditions when applying the antibody used in the presentation amount measurement step of the measurement process described below.
  • Reference amount analysis step S0113 This step is a step in which the data on the reference amount is analyzed for the expression amount of the test polypeptide ((4) in Figure 5).
  • Analysis here refers to the process of compiling and/or organizing reference amount data to generate analysis data for use in the setting step.
  • the specific content of the analysis is not particularly limited, as long as the method can aggregate and/or organize the reference amount data in relation to the magnitude of the expression amount values.
  • it can include organizing the reference amount in relation to the expression amount values of the test polypeptide in any format, such as a table or graph.
  • the setting step utilizes information on the expression amount of the test polypeptide and the cell count. Therefore, it is preferable that the analysis in this step be performed so that the distribution of cells in relation to the magnitude of the expression amount values of the test polypeptide can be analyzed.
  • the data may be sorted according to the magnitude of the expression amount values of the test polypeptide, or the relationship between the expression amount of the test polypeptide and the cell count may be organized in the form of a graph.
  • a graph format When a graph format is used, it may be a histogram in which the expression amount of the test polypeptide and the cell count are arranged on the horizontal and vertical axes, or a density plot or contour plot of cells in which data is expanded on two axes using two different parameters.
  • the distribution of cells with respect to the expression level of the test polypeptide e.g., a histogram with the expression level of the test polypeptide on the horizontal axis and the number of cells on the vertical axis, or a two-dimensional dot plot, density plot, or contour plot developed using the expression level of the test polypeptide and another index
  • the distribution of cells with low expression levels of the test polypeptide (non-expressing cell group) and cells with high expression levels of the test polypeptide (expressing cell group) can be ascertained.
  • a level for distinguishing between the non-expressing cell group and the expressing cell group can be set at the overlapping portion of these groups, or at the boundary between them if they do not overlap.
  • the method for estimating the level position is not particularly limited. An appropriate known estimation method can be selected depending on the degree of overlap between the two groups. For example, any known method for separating a multimodal distribution into a unimodal distribution can be used.
  • each cell group can be distinguished using a gate that encompasses either the non-expressing cell group or the expressing cell group, or both groups.
  • the position of the level or gate for distinguishing between non-expressing and expressing cell populations is not particularly limited.
  • the level can be set so that the proportion of test polypeptide-expressing cells out of the total number of cells contained in the expressing cell population is 40% or more.
  • the level can be set so that the proportion of test polypeptide-expressing cells out of the cells contained in the expressing cell population is 40% or more, 50% or more, 60% or more, 70% or more, 80% or more, 85% or more, 95% or more, or 99% or more.
  • exclusion processing was not performed or was insufficient in the reference amount acquisition step, that exclusion processing can be performed in this step.
  • the specific content of the exclusion processing is not particularly limited.
  • exclusion processing can be performed based on the criteria described in the reference amount acquisition step.
  • exclusion processing can be performed based on criteria other than the correspondence between the expression level of the test polypeptide and the number of cells, for example.
  • Analysis can be performed using any software.
  • analytical software such as Excel, programs running R or Python, etc., or any known software for flow cytometry can be used when flow cytometry is used for measurement. Any software commonly used in the selected measurement method can be used.
  • Specific examples of flow cytometry software include, but are not limited to, FCS Express (De Novo Software), BD FACSDiva TM (Becton Dickinson), BD Accuri TM (Becton Dickinson), FlowJo TM (Becton Dickinson), Kaluza (Beckman Coulter), NovoExpress (Agilent), Forecyt® (Saltorius), and Attune NxT (Thermo Fisher).
  • FCS Express De Novo Software
  • BD FACSDiva TM Becton Dickinson
  • BD Accuri TM Becton Dickinson
  • FlowJo TM Becton Dickinson
  • Kaluza Beckman Coulter
  • NovoExpress Ag
  • Setting step S0114 This step is a step of setting a reference range for the expression level of the test polypeptide based on the results of the reference level analysis step ((5) in Figure 5).
  • the term “reference range” refers to the range of test expression levels used in the extraction step described below, and is set for the expression level of the test polypeptide in this step.
  • the expression level of the test polypeptide can be, for example, the expression level of the labeled protein conjugated to the expression of the test polypeptide described above in the confirmation step.
  • the criteria for setting the reference range are not particularly limited, as long as the expression level values of the test polypeptide included in the reference range are expression level values that can be used to calculate the higher-order structure formation value in the relational equation derivation step described below (for example, a range in which the relationship between the test expression level and the test presentation amount in the measurement step described below follows a predetermined relational equation (including a linear equation or a higher-order equation), or a range in which a certain degree of quantitation is observed in the measured value (such as the detectable range of the instrument)).
  • the method for processing the analysis data in this case is not particularly limited, and can be performed, for example, using the various software described above in the reference amount analysis step.
  • the expression level of the test polypeptide or any index related thereto can be used.
  • the specific index used in this case is not particularly limited.
  • an index that reflects the difference in the expression level of the test polypeptide between a non-expressing cell group and an expressing cell group, or an index that reflects the efficiency of gene introduction of the test polypeptide, such as the proportion of cells expressing the test polypeptide (proportion of expressing cells) can be used as an index.
  • the proportion of expressing cells can be calculated as the ratio of the number of cells in the expressing cell group to the total number of cells in the analysis data.
  • the specified ratio can be set based on information such as the general transfection efficiency of the method used for gene transfer and the characteristics of the cell type used, or it may be set based on knowledge gained through actual experiments.
  • reference ranges can be set based on multiple types of predetermined ratios, and by performing the measurement process and subsequent steps, results based on each reference range can be obtained, and the appropriate result can be selected from among them.
  • a percentile contour (first percentile contour) for defining the lower limit of the reference range and a percentile contour (second percentile contour) for defining the upper limit can be selected, and the lowest expression level of the test polypeptide corresponding to the first percentile contour can be set as the lower limit of the reference range, and the highest expression level of the test polypeptide corresponding to the second percentile contour can be set as the upper limit of the reference range.
  • the percentile values of the first and second percentile contours may be the same or different, and are not particularly limited.
  • the percentile value of the second percentile contour may be lower than the percentile value of the first percentile contour.
  • the percentile value of the first percentile contour may be, for example, the 1st percentile, 20th percentile, 40th percentile, 50th percentile, 60th percentile, 70th percentile, 75th percentile, 80th percentile, etc.
  • the percentile value of the second percentile contour may be, for example, the 80th percentile, 60th percentile, 40th percentile, 30th percentile, 20th percentile, 10th percentile, 5th percentile, 1st percentile, etc.
  • Combinations of percentile values for the first and second percentile contour lines can be, for example, the 60th percentile and the 20th percentile, the 60th percentile and the 10th percentile, the 60th percentile and the 1st percentile, the 80th percentile and the 20th percentile, the 80th percentile and the 10th percentile, the 80th percentile and the 1st percentile, etc.
  • any combination of percentile values can be used depending on the density distribution of the cell population (density of the contour lines), the degree of separation between expressing and non-expressing cell groups, the specific value of the predetermined ratio, etc.
  • the reference range previously set for that experimental condition can be applied directly to the extraction process for other experimental runs or measurements using different measuring devices (models).
  • the reference range established in this step as the numerical range of the expression level of the test polypeptide is applied, regardless of the numerical distribution of the test expression level in the cell population sorted and measured in the measurement step described below.
  • the "measurement step” is an essential step in which the test expression level and test presentation level are measured in a cell population sorted for measurement. This step can be performed simultaneously with or after the expression step. This step can also be performed simultaneously with or separately from the reference range setting step.
  • this step is performed simultaneously with the reference range setting step, for example, the test expression level and test presentation level are measured for all cells, and a portion of those cells can be used as references for the reference range setting step. Furthermore, for example, when this step is performed separately from the reference range setting step, this step may be performed after the reference range setting step, or the reference range setting step may be performed after this step, or portions of both steps may be performed simultaneously.
  • This process includes a measurement cell sorting step, an expression level measurement step, and a presentation level measurement step.
  • this step first, a plurality of cells are sorted into a cell population for measurement ((1) in Figure 6A). Then, in the cell population for measurement, the expression level of the test polypeptide is measured, and the expression level data is obtained as the "test expression level” ((2) in Figure 6A). At the same time, the amount of the test polypeptide present on the cell membrane is measured, and the amount data is obtained as the "test presentation amount” ((3) in Figure 6A).
  • the test expression level and presentation amount data obtained in this step are used in the extraction step using the reference ranges set in the reference range setting step. Each step is explained below.
  • Measurement cell sorting step S0115 This step is a step in which a plurality of cells are sorted as a cell group for measurement ((1) in Figure 6A).
  • the method and criteria for separating the cell population for measurement are not particularly limited. Depending on the purpose, only cells that meet specific criteria can be separated. In this case, the criteria are not particularly limited.
  • the culture conditions and gene transfer conditions for the reference cell group and the measurement cell group are preferably the same.
  • the reference cell group and the measurement cell group are composed of cells with the same properties, such as cells of the same type that have been gene transferred under the same conditions and cultured under the same culture conditions.
  • cell groups sorted from the same culture vessel can be used as the reference cell group and the measurement cell group.
  • Expression level measurement step S0116 This step is a step of measuring the expression level of a test polypeptide in a cell population for measurement and obtaining the test expression level ((2) in Figure 6A). This step can be performed simultaneously with or after the measurement cell sorting step.
  • This step may be performed on all cells measured in the expression level measurement step, or on a portion of those cells. For example, measurement in this step may be performed only if the test expression level measured in the expression level measurement step meets a certain level. In this case, the level is not particularly limited. For example, the determination may be made based on whether the test expression level is within a reference range.
  • This step can be carried out in the same way as the expression level measurement step, but in this step the amount of test polypeptide present on the cell membrane is quantitatively measured and obtained as the "test presentation amount.” Therefore, the measurement method and indicator used are those that can detect the intracellular localization of the polypeptide to the extent that it can be determined whether or not it is present on the cell membrane.
  • the indicator is not particularly limited as long as it can distinguish between polypeptides present on the cell membrane and those present in the cytoplasm.
  • indicators that can be used include the amount of label on a binding molecule that detects a cell surface antigen, the amount of label on a binding molecule that distinguishes between a test polypeptide present on the cell membrane, the amount of activity (enzyme activity, etc.) of a test polypeptide on the cell membrane, the amount of test polypeptide in a cell membrane fraction, and the amount of label bound to a target polypeptide that can distinguish between when it associates with a test polypeptide and when it associates with the test polypeptide.
  • the label detected in this step is preferably a label that can be detected separately from the label detected in the expression level measurement step, for example, a label that is different from the label detected in the expression level measurement step.
  • the detection method may be selected appropriately depending on the marker used.
  • any of the methods described in the reference range setting step can be used.
  • this step is carried out using the same detection method and measuring equipment as the expression level measurement step.
  • any one or more of this step, the extraction step, the relational equation deriving step, and the multimer formation value obtaining step may be performed two or more times.
  • the test polypeptide and/or target polypeptide to be measured may be different each time, or may be the same for multiple times.
  • this step is performed repeatedly, it is preferable that the gene introduction method and conditions, and expression step conditions are the same for the samples used in the reference range setting step and the repeated this step.
  • any one or more of this step, the extraction step, and the relational equation deriving step may also be performed on a cell population that has been treated in the same way as the cells measured in the reference amount obtaining step (for example, treatment with an isotype control antibody).
  • Extraction step is a step of extracting information on the test expression level and the test presentation level for cells whose test expression level is within the reference range. This step can be performed simultaneously with or after the measurement step. As used herein, “extraction” refers to the operation of separating a portion of the data and subjecting it to subsequent analysis.
  • this process can be performed simultaneously with the measurement process by setting a detection range on the measurement device that corresponds to the reference range.
  • the extraction method is not particularly limited. For example, information on the test expression level and test presentation level may be extracted for all cells whose test expression level falls within the reference range, or data for only a portion of those cells may be extracted.
  • cell samples containing a certain number of cells or less in each section can be excluded from the extraction process.
  • samples can be excluded if the number of cells contained in each section is less than the number of cells described below.
  • Relational equation derivation process S0105 The "relational equation deriving step” is a step of deriving a relational equation between the test expression level and the test presentation level from the extracted information. This step can be performed simultaneously with or after the extraction step.
  • relational equation is not particularly limited, as long as it reflects the relationship between the test expression level and the test presentation level.
  • the relational equation may use the test expression level as one of the explanatory variables and the test presentation level as the target variable. Note that a relational equation in which the explanatory variable and target variable are reversed can also be used.
  • the degree of the relational expression may be a linear expression, a quadratic expression, a cubic expression, or an expression of higher degree.
  • it may be an expression of degree one or less, including radical roots, or it may be a fractional expression of negative degree.
  • the relational expression is a functional expression, i.e., each value of the explanatory variable corresponds to at most one value of the objective variable.
  • relational equation for example, a commonly used, well-known mathematical equation can be used.
  • Such mathematical equations include linear functions, the Michaelis-Menten equation, the Hill equation, the logistic equation, sigmoid function equations such as the hyperbolic tangent function equation, the Gompertz function equation, the arctangent function equation, and the Gudermann function equation, as well as equations for saturation curves.
  • a linear equation can be used as a suitable relational equation.
  • the derivation method may involve first determining the type of relational equation and then ascertaining its coefficients and constant terms, or it may involve a derivation method in which the type of relational equation can change depending on the specific data for the test expression level and test presentation level.
  • the method for obtaining the multimer formation value is based on a relational equation, and is not particularly limited as long as it is possible to obtain a value that correlates with the ease with which the test polypeptide migrates onto the cell membrane.
  • Any arithmetic operation can be performed when calculating the multimer formation value from the coefficients.
  • the arithmetic operation in this case is not particularly limited, but examples include arithmetic operations on the coefficients, exponentiation, radical roots, and combinations of these.
  • the comparison method is not particularly limited. Examples include taking the difference or quotient. In this case, it is preferable that the multimer formation values to be compared are calculated using a common method.
  • the multimerization value correlates with one or more known indices of multimerization ability.
  • known indices of multimerization ability include IC50 value, EC50 value, and dissociation constant ( KD ).
  • the degree of correlation is not particularly limited.
  • the correlation coefficient may be 0.2 or more, 0.3 or more, 0.4 or more, 0.5 or more, 0.6 or more, 0.7 or more, or 0.8 or more, or a significant correlation may be observed.
  • an index reflecting the strength of interaction between multimer subunits can be easily obtained with the same amount of effort as performing cell expression analysis by flow cytometry or the like. Furthermore, the multimer formation value can be calculated without performing measurements under multiple conditions, such as repeatedly measuring multiple cell samples with different cell numbers or gene introduction amounts.
  • the multimer formation value calculated by the method of this embodiment provides equivalent values even when different detection instruments (models) are used, and can be compared between instruments (models) and facilities.
  • a second aspect of the present invention is a method for measuring the binding affinity of a test ligand to a multimeric receptor.
  • the method of this aspect includes, as essential steps, a control value measurement step, a test value measurement step, and a calculation step.
  • control value measurement step is an essential step in which the multimer formation value is measured according to the method described in the first embodiment and obtained as a control value.
  • the basic structure of the test polypeptide is similar to that of the test polypeptide described in the first aspect.
  • the subunit contained in the test polypeptide may or may not be a membrane protein.
  • it is a membrane protein such as a cell membrane protein. Examples of such membrane proteins include MHC subunits.
  • the composition of the control ligand is not particularly limited, but it is usually a polypeptide. If it is a polypeptide, its sequence is not particularly limited.
  • amino acid sequences that can be used include sequences containing uncharged polar amino acids with low polarity side chains (Asn, Gln, Ser, Thr), and sequences containing neutral amino acids (Gly, Ile, Val, Leu, Ala, Pro).
  • the proportion of these amino acids in the amino acid sequence of the control ligand is not particularly limited, but can be, for example, 50% or more, 60% or more, 70% or more, 80% or more, 90% or more, or 100%.
  • Specific amino acid sequences include, for example, polyglycine, a mixed sequence of serine and glycine, and a mixed sequence of alanine and glycine.
  • the size of the control ligand is not particularly limited, but it is preferably the same size as the test ligand.
  • the control ligand may have 15 or fewer, 10 or fewer, 6 or fewer, 5 or fewer, 4 or fewer, 2 or fewer, or 1 amino acid residues different from the number of amino acids in the test ligand, or the control ligand may be composed of the same number of amino acids as the test ligand.
  • the control ligand may have a number of amino acids that differs from the average (or median) number of amino acids of those polypeptides by a few or fewer, two or fewer, or one residue, or the same number of amino acids.
  • the test ligand may have a number of amino acids that differs from the average (or median) number of amino acids of those known polypeptides by a few or fewer, two or fewer, or one residue.
  • the length of the control ligand may be, for example, 8 to 13 amino acids, 8 to 11 amino acids, 8 to 10 amino acids, 8 amino acids, or 9 amino acids.
  • the length of the control ligand can be, for example, 8 to 40 amino acids, 8 to 33 amino acids, 8 to 30 amino acids, 8 to 25 amino acids, 8 to 24 amino acids, 8 to 20 amino acids, 8 to 18 amino acids, 8 to 17 amino acids, 8 to 16 amino acids, 9 to 15 amino acids, 11 to 15 amino acids, or 15 amino acids.
  • the control ligand can be, for example, a polyglycine or a mixed sequence of serine and glycine with the above-mentioned number of amino acids, specifically, for example, a polyglycine consisting of 9 amino acids (SEQ ID NO: 1), a polyglycine consisting of 12 amino acids (SEQ ID NO: 2), a polyglycine consisting of 15 amino acids (SEQ ID NO: 3), or a mixed sequence of serine and glycine consisting of 12 amino acids (SEQ ID NO: 4).
  • a polyglycine consisting of 9 amino acids SEQ ID NO: 1
  • SEQ ID NO: 2 a polyglycine consisting of 12 amino acids
  • SEQ ID NO: 3 a polyglycine consisting of 15 amino acids
  • SEQ ID NO: 4 a mixed sequence of serine and glycine consisting of 12 amino acids
  • a ligand with low binding, low functionality, or low activity for the target receptor can be used as a control ligand.
  • the receptor is an MHC
  • a peptide derived from any endogenous protein for example, if the target receptor is an MHC class II receptor, a peptide derived from the invariant chain (CD74)
  • CD74 invariant chain
  • control ligand and the subunit may be linked directly or via a linker.
  • control ligand and the subunit are linked via a linker.
  • linker used is not particularly limited, and any known linker can be used.
  • linkers that are cleavable in intracellular and/or extracellular environments, linkers that are not cleavable in these environments, and combinations thereof can be used.
  • the linker used herein may be a chemical linker (e.g., a disulfide linker or a maleimide linker) or a peptide linker, but a peptide linker is preferred.
  • peptide linkers consisting of, for example, 1 to 50, 5 to 40, 5 to 30, 5 to 25, or preferably 10 to 20 amino acid residues, such as a GS linker or GGS linker consisting of glycine and serine, can be used.
  • a GS linker contains one or more amino acid sequences represented by GGGGS, for example, 2 to 8 or 3 to 6 residues.
  • a GGS linker contains one or more GGS residues, for example, 2 to 6 or 2 to 4 residues.
  • the linker may also contain amino acid residues other than glycine and serine.
  • a cleavable linker its type is not particularly limited.
  • any linker known to be cleavable may be used, or the linker portion may be designed to be cleavable by combining a protease cleavage site such as LVGRPS (SEQ ID NO: 5) and/or IEGR (SEQ ID NO: 6) with any known linker.
  • the target polypeptide used in this step includes subunits that, together with the subunits contained in the test polypeptide, constitute a multimeric receptor. Other aspects of the target polypeptide are as described in the first embodiment.
  • control ligand and linker used for each calculation may be different each time, or the same for multiple calculations.
  • the same control ligand and linker are used.
  • a fusion protein of a subunit of a multimeric receptor and a test ligand is used as the test polypeptide, and another subunit of the multimeric receptor is used as the target polypeptide, and the multimer formation level is measured as the test value.
  • This step can be carried out in the same manner as the control value measurement step, except that the test polypeptide used is a fusion protein containing the test ligand as the ligand.
  • This step is preferably carried out under the same conditions as the control value measurement step (including the subunits contained in the test polypeptide and target polypeptide, the type of cell, etc.), except for the ligand used.
  • the test ligand is a ligand whose binding ability to a multimeric receptor is measured by the method of this embodiment. Therefore, the type of test ligand is not particularly limited and can be selected appropriately depending on the purpose. It may be a molecule known to bind to a multimeric receptor, or a molecule whose binding to a multimeric receptor is unknown. For example, a peptide ligand may be used.
  • the ligand binding value is a numerical value that indicates the binding ability of the test ligand to the multimeric receptor.
  • the ligand binding value can be calculated by performing any arithmetic processing on the test value and the control value.
  • the ligand binding value can be a value based on the ratio of the test value to the control value, or a value based on the difference between the test value and the control value. Further calculation processing may be performed as necessary.
  • a value based on the ratio of a test value to a control value is used, even if the individual measured values are prone to variability, it is possible to obtain an index of binding ability as a ratio that is less susceptible to the influence of such variability. Furthermore, if a value based on the difference between a test value and a control value is used, it is possible to obtain an index of binding ability that clearly distinguishes the difference, even if the amount of change in migration to the cell membrane associated with binding ability is small.
  • test polypeptide is expressed in multiple cells.
  • the test polypeptide can be transiently expressed in the cells as a cell membrane protein.
  • test polypeptide is not particularly limited. It may be a polypeptide that can associate with other polypeptides expressed in the cells used, but it is preferable that it does not associate with other cell membrane proteins expressed in the cells used, or that its abundance on the cell membrane does not change from a constant value due to association with other cell membrane proteins.
  • test polypeptide displayed in this method varies depending on the structural stability and cell membrane localization of the test polypeptide. Therefore, cells typically express the test polypeptide in a manner that allows translocation to the cell membrane as a result of the formation of a three-dimensional structure of the test polypeptide.
  • the test polypeptide is a cell membrane protein
  • the test polypeptide can be expressed as a cell membrane protein by expressing it as is.
  • the test polypeptide is a membrane protein other than a cell membrane protein, it can be expressed as a cell membrane protein, for example, by replacing the translocation signal sequence to another organelle with an endoplasmic reticulum translocation signal sequence.
  • test polypeptide is not a membrane protein
  • it can be expressed as a cell membrane protein by, for example, expressing the test polypeptide as a fusion protein with a cell membrane protein or a portion thereof, as described in the first embodiment.
  • the ability to form a three-dimensional structure is detected as the amount of translocation to the cell membrane, so it is preferable that the cell membrane protein into which the test polypeptide has been modified is configured so that the formation of a three-dimensional structure of the test polypeptide is essential for its translocation to the cell membrane.
  • test polypeptide when measuring the ability to maintain cell membrane localization using the method of this embodiment, the likelihood of the test polypeptide remaining on the cell membrane after translocation is measured. Therefore, it is preferable that a sufficient amount of the test polypeptide be configured to be capable of translocating to the membrane.
  • the test polypeptide can be configured to consist of the full-length sequence of the protein to be measured, have an endoplasmic reticulum translocation signal sequence, and be capable of being expressed in sufficient amounts, for example, overexpressed.
  • a target polypeptide that can be expressed as a cell membrane protein can be expressed in multiple cells in this step.
  • the content of the target polypeptide and its handling in subsequent steps are as described in the first embodiment.
  • the "reference range setting step” is an essential step in which a reference amount obtained from a cell population sorted for reference is analyzed to set a reference range for the expression level of a test polypeptide. This step is essential in both the method for measuring the ability to form a three-dimensional structure and the method for measuring the ability to maintain cell membrane localization. This step can be performed simultaneously with or after the expression step.
  • This process includes a confirmation step, a reference cell sorting step, a reference amount acquisition step, a reference amount analysis step, and a setting step.
  • the "measurement step” is an essential step in which the test expression level and test presentation level of the test polypeptide are measured in a cell population sorted for measurement. This step is essential in both the method for measuring the ability to form a three-dimensional structure and the method for measuring the ability to maintain cell membrane localization. This step can be performed simultaneously with or separately from the reference range setting step.
  • This process includes a step of sorting measurement cells, a step of measuring expression levels, and a step of measuring presentation levels.
  • the content of this step is similar to that of the measurement step of the first embodiment, and therefore a detailed description thereof will be omitted here.
  • Relational Equation Deriving Step is an essential step in which a relational equation between the test expression level and the test presentation level is derived from the extracted information. This step is essential in both the method for measuring the ability to form a three-dimensional structure and the method for measuring the ability to maintain cell membrane localization. This step can be performed simultaneously with or after the extraction step.
  • Step of Obtaining a Three-Dimensional Structure Formation Value is an essential step in the method for measuring three-dimensional structure formation ability, and is a step of obtaining a three-dimensional structure formation value from a relational equation.
  • a step of obtaining a cell membrane localization value is performed as an essential step instead of this step.
  • the "step of obtaining a cell membrane localization value” is a step of obtaining a cell membrane localization value from a relational equation. This step can be performed simultaneously with or after the step of deriving the relational equation.
  • an index reflecting the ease of formation of a three-dimensional structure (three-dimensional structure formation value or cell membrane localization value) can be easily obtained with the same amount of effort as performing expression analysis of cells by flow cytometry or the like.
  • the three-dimensional structure formation value and cell membrane localization value calculated by the method of this embodiment are equivalent even when different detection instruments (models) are used, and can be compared between instruments (models).
  • the method of this embodiment When the method of this embodiment is applied to a polypeptide that forms homomultimers, the ability to form a three-dimensional structure and the ability to form homomultimers can be examined simultaneously. Furthermore, by applying the method of this embodiment to a fusion protein of a monomeric receptor subunit and a test ligand, it can be used to calculate an index (ligand binding value) relating to the ligand binding ability of the monomeric receptor and the ligand. The processing performed in this case is similar to that described in the second embodiment.
  • a fourth aspect of the present invention is a method for measuring changes in higher-order structure formation ability, etc., due to target conditions.
  • the method of this aspect includes, as essential steps, a control value measurement step, a treatment value measurement step, and a calculation step.
  • a control value measurement step a measurement value measurement step
  • a treatment value measurement step a treatment value measurement step
  • a calculation step a calculation step.
  • control value measurement step is an essential step in which the higher-order structure formation ability (multimer formation value, tertiary structure formation value) and the ability to maintain cell membrane localization (cell membrane localization value) are measured under control conditions according to the method described in the first or third aspect, and the results are obtained as control values.
  • Control conditions are conditions under which the effects on the formation of higher-order structures (multimer formation and/or three-dimensional structure) of the test polypeptide and its ability to maintain its cell membrane localization are measured as control values.
  • control conditions are not particularly limited, as long as they are conditions under which the effect of the target conditions described below can be determined.
  • the control conditions share many conditions with the target conditions, and differ only in the target conditions whose effect is measured using the method of this embodiment.
  • other conditions e.g., cell density, etc.
  • differences in conditions other than the target conditions are permissible, as long as they do not affect the measurement results.
  • the "treatment value measurement step” is an essential step in which a multimer formation value, a three-dimensional structure formation value, or a cell membrane localization value is measured under target conditions according to the method described in the first or third aspect, and is obtained as a treatment value. This step can be performed simultaneously with or separately from the control value measurement step.
  • the target conditions are conditions for which the influence on the formation of higher-order structures (multimer formation and/or three-dimensional structure formation) of the test polypeptide and the maintenance of cell membrane localization is measured as a variation.
  • the target conditions may be any conditions that can affect the formation of higher-order structures or the maintenance of cell membrane localization of the test polypeptide, and the specific types of target conditions are not particularly limited. Examples include exposure to substances and exposure to the environment.
  • the effect of exposure to a substance there are no particular limitations on the type of substance used. Examples include medium additives, drugs, ligands, etc.
  • the substance may be a biological substance, an artificially synthesized compound, a low molecular weight substance, or a high molecular weight substance.
  • the effect of exposure to a substance there are no particular limitations on the parameters of interest. Examples of such parameters include the type of substance, concentration, and timing of addition.
  • the substance is a drug
  • the effect of the type of drug to which the cells are exposed can be measured as a variation value
  • the substance is a ligand
  • the effect of the type of ligand to which the cells are exposed can be measured as a variation value.
  • the type of environment used is not particularly limited. Examples include the composition of the atmosphere (e.g., the gas aerated into the culture medium), the composition of the culture medium, cell density, pH, etc.
  • the parameters of interest are not particularly limited. Examples of such parameters include the type and concentration of components, timing of exposure, etc.
  • the environment is the composition of the atmosphere, the effect of the type of components contained in the atmosphere to which the cells are exposed can be measured as a variation value.
  • Specific conditions can be set appropriately depending on the type of condition, and are not particularly limited. For example, they may be conditions known to affect the formation of higher-order structures or the maintenance of cell membrane localization, or they may be conditions known not to have such effects.
  • Calculation step is an essential step in which a variation value is calculated based on the obtained control value and treatment value. This step can be performed simultaneously with or separately from the treatment value measurement step.
  • this step calculates the effect of the target conditions on multimer formation as a variation value.
  • this step calculates the effect of the target conditions on three-dimensional structure formation and maintenance of cell membrane localization as a variation value.
  • Variation value refers to a numerical value that represents the degree to which the difference between the control conditions and the target conditions affects the formation of higher-order structures and the maintenance of cell membrane localization.
  • control value and the treatment value are used in the calculation in this step. Therefore, this step can be carried out by replacing the test value in the calculation step of the second embodiment with the treatment value.
  • the method for calculating the variation value (e.g., a relational equation) can be changed depending on the type of target condition and the purpose of performing the method of this embodiment.
  • the effects of exposure to substances or the environment on the formation of higher-order structures and the maintenance of cell membrane localization due to the interaction between the receptor and the ligand can be calculated as fluctuation values.
  • a fifth aspect of the present invention is a method for screening conditions for higher-order structure formation, etc.
  • the method of this aspect includes, as essential steps, a control value measurement step, a candidate value measurement step, and a determination step.
  • the method of this aspect makes it possible to screen for the ability to form higher-order structures (multimer formation conditions and/or three-dimensional structure formation conditions) and the ability to maintain cell membrane localization.
  • the control conditions used in this step are conditions that, by comparison, make it possible to determine whether the candidate conditions are suitable for the formation of higher-order structures or for maintaining cell membrane localization.
  • the specific content of such control conditions is not particularly limited.
  • any conditions that are generally used as comparison targets in screening candidate conditions can be used.
  • Specific examples include conditions that are known to have no advantageous or adverse effect on the formation of higher-order structures and/or the maintenance of cell membrane localization, conditions that are known to be unsuitable for the formation of higher-order structures and/or the maintenance of cell membrane localization, and conditions that are known to be suitable for the formation of higher-order structures and/or the maintenance of cell membrane localization.
  • processing value and “target condition” in the description of the fourth aspect are to be read as “candidate value” and “candidate condition,” respectively, in this process.
  • the program of the present invention may be configured to prompt the user for further instructions.
  • the program may be configured to prompt the user for instructions regarding one or more of the criteria for determining whether a cell is expressing (e.g., thresholds for test expression level or test presentation level), criteria for setting a reference range (e.g., percentage of expressing cells), the relational equation to be used and the method for deriving it, and the method for calculating the higher-order structure formation value from the relational equation.
  • the criteria for determining whether a cell is expressing e.g., thresholds for test expression level or test presentation level
  • criteria for setting a reference range e.g., percentage of expressing cells
  • timing or number of times instructions are requested from the user. For example, all instructions may be requested at once at the beginning, or instructions may be requested multiple times each time instructions are needed.
  • the virus solution for transduction was added to the NIH3T3 cells and incubated for at least 3 hours at 37°C.
  • the volume of virus solution added was 15 ⁇ L to 50 ⁇ L/well for stable expression plasmid vectors and 5 ⁇ L to 50 ⁇ L/well for transient expression plasmid vectors. Then, 1 mL/well of antibiotic-containing medium was added, and the cells were cultured for 48 hours after virus infection.
  • Flow cytometry measurements were performed using the following procedure.
  • the flow cytometer used was the Spectral Cell Analyzer SA3800 (Sony Corporation).
  • gate 1 the cell data extracted by gate 1 was expanded using FSC-Area and FSC-Height, and a rectangular gate 2 was set to extract data derived from single cells (Figure 9B). Cells not included in gate 2 were considered to be data on aggregated cells and were excluded.
  • Example 2 Changes in multimer formation value depending on the type of subunit (the purpose) We will examine the effect of subunit type (HLA allele) on the polymer formation value.
  • Example 2 The same procedures as in Example 1 were carried out except for the types of subunits used. DQA1 * 03:01 (SEQ ID NO: 14) was used as the ⁇ subunit, and DQB1 * 03:02 (SEQ ID NO: 15) was used as the ⁇ subunit. As in Example 1, a fusion protein was used in which a 15-mer polyglycine (G15: SEQ ID NO: 3) sequence was fused between the ⁇ subunit and the signal sequence on the N-terminus via a linker (Linker 2) (SEQ ID NO: 11).
  • G15 15-mer polyglycine
  • Linker 2 Linker 2
  • Example 1 the results of this example and Example 1 are consistent with the results of the heterodimer binding strength evaluated based on stability in the presence of the surfactant SDS reported in a previous study (Ettinger et al., J. Immunol., 1998, 161:6439-6445.). Furthermore, this method was able to quantify the multimer formation value of the heterodimer of DQA1 * 03:01 and DQB1 * 03:02, which was difficult to measure in the previous study.
  • Example 3 Changes in ligand binding values depending on the type of ligand (the purpose) The effect of the type of ligand on the ligand binding value is examined.
  • the method of the present invention makes it possible to discover peptide ligands that readily form multimers depending on the type of MHC, such as HLA alleles, without purifying the MHC protein. Furthermore, by treating the control value and test value in this Example and Example 4 as the control value and candidate value, respectively, they can be applied to screening for candidate peptide ligands that bind to MHC.
  • the HLA alleles used were combinations of DRA * 01:01 (sequence number 16) and DRB1 * 04:01 (sequence number 17) ( Figure 16A), DRA * 01:01 and DRB1 * 04:05 (sequence number 18) ( Figure 16B), DRA * 01:01 and DRB1 * 15:02 (sequence number 30) ( Figure 17A), DRA * 01:01 and DRB3 * 01:01 (sequence number 20) ( Figure 17B), DQA1 * 03 : 01 and DQB1 * 03:01 (sequence number 31) ( Figure 18A), and DQA1*01:03 (sequence number 32) and DQB1 * 06:01 (sequence number 33) ( Figure 18B).
  • the predicted IC50 values were predicted using NetMHCIIpan-4.0 (Reynisson et al., J. Proteome. Res., 2020, 19: 2304-2315.).
  • NetMHCIIpan-4.0 is a server that predicts the binding ability of MHC class II peptides, and outputs the Rank value (predicted percentile ranking based on the binding affinity dataset and peptide elution dataset), Rank_BA value (predicted percentile ranking based on the binding affinity dataset), and IC50 value as predicted values.
  • the amino acid sequence of the peptide shown in Table 3 was entered into NetMHCIIpan-4.0, and the value output as "nM" was obtained as the predicted IC50 value by selecting the desired HLA allele.
  • Example 5 Compatibility between measurement models (the purpose) Check compatibility between flow cytometer models used.
  • DRA * 01:01 SEQ ID NO: 16
  • DRB1 * 08:03 SEQ ID NO: 34
  • DRA * 01:01 SEQ ID NO: 16
  • DRB3 * 01:01 SEQ ID NO: 20
  • the peptides shown in Table 3 were used as ligands.
  • FACSCanto TM II The following parameters were used in the measurement using FACSCanto TM II. Excitation: 488 nm, FSC: 216 V, SSC: 390 V, FITC: 390 V, PE: 340 V, Fluorescence compensation: FL1 (vs. FL2): 23%, FL2 (vs. FL1): 4.0%, Flow rate: 300-1,000 events/sec, Area Scaling Factor: Blue: 0.83, FSC: 0.77 Data acquisition was performed using FACSDiva TM software.
  • Gates were set using analysis software (FCS Express ver. 6.06.00336 (De Novo Software)) in accordance with Example 1. Measurements using Epics-XL and FACSCanto TM II were performed one to two times. Measurements using SA3800 were performed one to four times. Ligand binding values were calculated as the ratio of the test value to the control value at G15. The number of cells used as the cell population for measurement in each run was 11,000 to 26,000 (Gate 1), and the number of cells within the reference range used to calculate the multimer formation value was 860 to 6,800 (Gate 5).
  • Example 6 Verification of the sensitivity of the method of the present invention (the purpose) The sensitivity of the ligand binding values calculated according to the present invention is compared with the sensitivity of the predicted binding rank values (Rank value and Rank_BA value) and predicted IC 50 value.
  • the peptides shown in Table 4 are peptides in which one amino acid at a time from the N-terminus or C-terminus of a partial peptide (peptide 1c) in the region from positions 49 to 63 of the ESAT-6 protein of Mycobacterium tuberculosis has been replaced with glycine.
  • the predicted binding value was the value output as the predicted binding rank ("Rank” or "Rank_BA”) by inputting the amino acid sequence of each peptide into NetMHCIIpan-4.0 and selecting the target HLA allele, as described in Example 4.
  • the value output as "nM” was used as the predicted IC50 value.
  • the ligand binding value obtained by the method of the present invention is an excellent index with extremely high sensitivity compared to the predicted binding rank and predicted IC 50 value.
  • Example 7 Measurement by image cytometry (the purpose) We will investigate whether it is possible to measure ligand binding values using image cytometry in a similar manner to flow cytometry.
  • GFP fluorescence intensity 10,738 the average boundary line (GFP fluorescence intensity 10,738) determined by assuming that each cell group follows a normal distribution in samples using isotype control antibodies was used as the threshold.
  • the lower and upper limits of the GFP fluorescence intensity for Gate 5 were set at the 60th and 20th percentiles of the cell density distribution of the GFP-positive cell group (GFP fluorescence intensity 24,044-61,802), respectively.
  • Gates 6 to 9 were set in the region that divides the GFP fluorescence intensity in gate 5 into four equal parts. The median fluorescence intensity of GFP and PE in each of gates 6 to 9 was calculated. The derivation of the relationship equation and calculation of the multimer formation value were performed in the same manner as in Example 1.
  • the ligand binding value was calculated as the ratio of the multimer formation value (test value) when each ligand was used to the multimer formation value (control value) when the control ligand G15 was used.
  • Samples prepared simultaneously with the image cytometry samples were analyzed by flow cytometry in the same manner as in Example 1, and the results were compared with those from image cytometry.
  • Example 8 Measurement of changes in higher-order structure formation ability due to drugs or compounds (the purpose) Changes in the ability to form higher-order structures due to binding of HLA class I with drugs are measured.
  • test polypeptides used were HLA class I ⁇ subunits (HLA-B * 57:01 (SEQ ID NO: 55), HLA-B * 57:03 (SEQ ID NO: 56), and HLA-B * 15:02 (SEQ ID NO: 57)), and the target polypeptide was ⁇ 2-microglobulin (SEQ ID NO: 58).
  • the drugs used were abacavir sulfate (Fujifilm Wako Pure Chemical Industries, Ltd.; product number: 017-26393) and carbamazepine-related compounds: oxcarbazepine (Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.; product number: O0363) (Compound 1), carbamazepine 10,11-epoxide (Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.; product number: D5982) (Compound 2), eslicarbazepine acetate (Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.; product number: E1046) (Compound 3), and carbamazepine (Fujifilm Wako Pure Chemical Industries, Ltd.; product number: 034-23701) (Compound 4).
  • Viral particle preparation and transduction into expression cells were performed in the same manner as in Example 1. However, expression cells were seeded 3 hours before transduction, and 0.5 mL/well of antibiotic-containing medium was added 2 hours after transduction (viral infection). Drugs were added by dissolving the drug in DMSO or PBS and adding the solution to the medium 24 hours after viral infection (final concentration 700 ⁇ M).
  • the variability was calculated as the ratio or difference between the higher-order structure formation value of the drug-added sample (treated value) and the higher-order structure formation value of the DMSO- or PBS-added sample (control value). The variability was calculated as the average of three trials.
  • Figure 23 shows the difference in fluctuation values depending on the type of allele when abacavir sulfate was used.
  • HLA-B * 57:01 the fluctuation value increased in an abacavir sulfate concentration-dependent manner, suggesting that abacavir sulfate binds to HLA-B * 57:01.
  • Drug eruptions caused by abacavir are known to be strongly associated with the HLA-B * 57:01 genotype.
  • Figure 24 shows the variation values obtained when abacavir sulfate and carbamazepine-related compounds were used with HLA-B * 57:01 as the allele.
  • abacavir sulfate was used as the drug ("Abacavir” in Figure 24)
  • the variation value was high, suggesting binding between HLA-B * 57:01 and abacavir sulfate.
  • carbamazepine-related compounds which are known not to bind strongly to HLA-B * 57:01, were used ("Compound 1" to "Compound 4" in Figure 24)
  • the variation values were low, suggesting only weak or no binding. Similar results were obtained when the difference-based values (Figure 24B) were used as when the ratio-based values ( Figure 24A) were used.
  • the method of the present invention makes it possible to discover differences in the binding ability of specific drugs to HLA and differences in the effects of each drug on specific HLA alleles without performing analyses such as immunoassays or mass spectrometry. Furthermore, by treating the control value and treatment value in this example as the control value and candidate value, respectively, it is possible to screen for candidate drugs that bind to MHC.
  • Example 9 Measurement of conformational values of membrane proteins other than MHC (the purpose) Using a cytokine receptor (mouse IL-2 receptor ⁇ subunit: IL-2R ⁇ ) as a membrane protein, we will investigate whether the effects of mutations that affect stability can be measured as three-dimensional structure formation values.
  • cytokine receptor mouse IL-2 receptor ⁇ subunit: IL-2R ⁇
  • PE-labeled antibodies were used as detection antibodies: Antibody for measuring test amount PE Rat Anti-Mouse CD25 Monoclonal antibody (BD Pharmingen TM , clone name: PC61) Isotype control antibody: PE Rat IgG1, ⁇ Isotype Control (Biolegend; clone name: RTK2071)
  • Example 10 Measurement of ability of G protein-coupled receptors to maintain cell membrane localization and effects of drugs (the purpose) It will be confirmed that the ability of G protein-coupled receptors to maintain their localization at the cell membrane can be measured by the method of the present invention, and the effects of drugs on the ability to maintain their localization at the cell membrane will be examined.
  • Orexin receptor 1 (SEQ ID NO: 61) and orexin receptor 2 (OX2R) (SEQ ID NO: 62) were used as G protein-coupled receptors.
  • the ligands used were the orexin B sequence (Peptide 3b), which is a ligand for these receptors, and two partial sequences of orexin A and orexin B (Peptide 3a and Peptide 3c, respectively) that have been reported to bind strongly to both OX1R and OX2R (Lang, et al., J. Med. Chem. 2004, 47:1153-1160). These peptides (C-terminal amidated, >90% purity, GenScript) (final concentration 10 ⁇ M) were synthesized. The sequences used are shown in Table 5.
  • the antagonists used were Almorexant HCl (AdooQ bioscience; product number: A14286-5; OX1R and OX2R antagonist) and SB-334867 (AdooQ bioscience; product number: A16695-5; OX1R selective antagonist) (final concentration 10 ⁇ M).
  • the experiment was conducted in the same manner as in Example 8, except that the type of test polypeptide and the type of drug were different.
  • OX1R Primary antibody; Antibody for measuring test amount Anti Orexin Receptor 1/HCRTR1 Rabbit mAb (Cell signaling technology; clone name: E5Q8B) Isotype control antibody normal rabbit IgG: sc-3888 (Santa Cruz Biotechnology) Secondary antibody; Goat Anti-Rabbit IgG H&L (PE) preadsorbed (abcam)
  • OX2R Primary antibody; Antibody for measuring test amount Invitrogen Anti Orexin Receptor 2 Monoclonal Antibody (Thermo Fisher; Clone name: 456738)
  • the variation was calculated as the ratio of the cell membrane localization value (treated value) of a sample to which a ligand or a ligand and antagonist had been added to the cell membrane localization value (control value) of a sample to which DMSO had been added.
  • the variation was calculated as the average of three trials.
  • Figures 26 and 27 show the difference in fluctuation values when a ligand or a ligand and an antagonist were added.
  • Figure 26 shows the results for OX1R
  • Figure 27 shows the results for OX2R.
  • the method of the present invention can measure the internalization phenomenon associated with ligand binding to a G protein-coupled receptor without performing analyses such as intracellular assays to detect Ca 2+ , and can detect the inhibitory effect of an antagonist. Furthermore, by treating the control value and treatment value in this example as the control value and candidate value, respectively, this method can be applied to the search for ligands of G protein-coupled receptors and the screening of agonists and antagonists. All publications, patents, and patent applications cited herein are hereby incorporated by reference in their entirety.

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Abstract

本発明は、無細胞の測定系よりも簡便で、タンパク質の種類によらずに応用可能であり、免疫分子やMHCの解析にも使用可能な、細胞系を用いた相互作用の解析方法を提供することを課題とする。　被験ポリペプチド及び対象ポリペプチドを複数の細胞に発現させる発現工程、参照用に分取した細胞群から得た参照量を解析し、被験ポリペプチドの発現量についての参照範囲を設定する参照範囲設定工程、測定用に分取した細胞群において、被験ポリペプチドの被験発現量及び被験提示量を測定する測定工程、被験発現量が参照範囲内にある細胞について、被験発現量及び被験提示量の情報を抽出する抽出工程、抽出された情報から、被験発現量と被験提示量の関係式を導出する関係式導出工程、及び関係式から多量体形成値を取得する多量体形成値取得工程を含む、細胞における被験ポリペプチドと対象ポリペプチドの多量体形成能を測定する方法を提供する。

Description

高次構造形成能等を測定する方法
　本発明は、細胞における複数のポリペプチドを含む多量体形成能を測定する方法、ポリペプチドの立体構造形成能を測定する方法及びポリペプチドの細胞膜局在性維持能を測定する方法、並びにそれらを利用した高次構造形成条件や細胞膜局在性維持条件をスクリーニングする方法に関する。
　生物学的な研究を行うには、タンパク質等の高次構造形成能の分析が重要である。これは、あらゆる生体機能の担い手がこれら生体分子であり、生体内でのあらゆる反応が分子間の結合に基づいていることから、生体機能における生体分子とその高次構造の寄与を明らかにすることがその生体機能の理解に直結するためである。
　タンパク質等の高次構造形成能の分析方法としては、例えば、電気泳動を用いる分析方法、精製タンパク質の分光学的分析方法、タンパク質の構造解析に基づく分析方法等が広く一般に使用されている。免疫沈降、ウェスタンブロット等の電気泳動を用いる分析方法では、抗体等の結合分子を用いて細胞破砕液中のタンパク質の存在が定量的に検出される。しかし、電気泳動を用いる分析方法ではタンパク質を細胞破砕液から調製し、多くの場合変性させる必要がある。構造解析に基づく分析方法では、タンパク質の結晶構造等に基づいてタンパク質の構造を詳細に解析することができる。しかし、タンパク質等の結晶化及び構造の解析に多大な労力を要する。
　一方、薬剤の開発等においては、タンパク質等の生体分子自体の分析のみならず、生体分子と他の分子（例えば、候補薬剤や他のタンパク質）との相互作用の解析がさらに重要となる。これは、生体内でのあらゆる反応が分子間の結合に基づいており、その促進、改変及び／又は抑制によって薬効や副作用が生じるためである。
　特に、候補薬剤やリガンド等の複数の分子について比較検討を行うためには、相互作用の強さ等についての数値が利用される。このような数値としては、例えば、EC50値やIC50値、解離定数(KD)値等が広く利用されており、ELISA、蛍光偏光、表面プラズモン共鳴法、近接場光（エバネッセント光）を用いた方法等で測定される。これらの解析では高純度の精製タンパク質等が必要であるため、多くの場合、組換えタンパク質の大量調製が必要となる。また、これらの数値の算出は、その薬剤等の効果を定量的に評価できる指標に基づいて、その薬剤等を所定の濃度で適用した場合の効果の量を解析することにより行われる。この際、そのような適切な指標を見出す必要があること、異なる条件についての複数回の実験が必要であること、薬剤等の濃度以外の条件をできるだけ生理的条件に近くする必要があること等、多くの制約が存在する。また、利用する指標や実験系によっては、その指標の測定と算出の過程に多くの要因が関与し、必ずしも相互作用の強さを直接的に反映するとは限らない点、異なる施設で測定すると値に違いが生じうる点、弱い結合の定量が困難である点等の問題があった（非特許文献１）。
Markossian S et al., Assay Guidance Manual [Internet]. Bethesda (MD): Eli Lilly & Company and the National Center for Advancing Translational Sciences; Last Updated: March 15, 2023
　相互作用の強さを直接的に反映する数値を得るためには、通常、対象となるタンパク質等を精製して無細胞の測定系を構築する必要がある。ここで、個々のタンパク質の性質や使用する溶媒、容器へのタンパク質等の吸着等によるタンパク質等の実効濃度の変化を無視できないことから、厳密には個々のタンパク質等の性質に合わせた実験系の構築が必要となる。しかし、実際の生体内におけるタンパク質等の生体分子の相互作用は、細胞膜の存在、pH、イオン濃度、その他の共存物質等の細胞内環境にも影響され、これらを無細胞の測定系で完全に再現することはできない。
　細胞系を用いて相互作用の解析を行うことができれば、無細胞の測定系よりも本来の生理的条件に近い環境でのタンパク質等の機能を知ることができる。また、相互作用の強さがタンパク質等や細胞の機能性に及ぼす影響を観察すること等もできる。しかしながら、そのためには細胞毎のばらつきを標準化した上で、変性していないタンパク質等についての定量的な解析が必要であり、そのままでこのような解析に利用可能な分析方法は存在しない。細胞系を用いて生体分子の相互作用の有無を検出する方法はいくつか知られている。例えば、フェルスター共鳴エネルギー移動（FRET）、近接ライゲーションアッセイ（PLA）等の細胞に発現する二種類の異なるタンパク質を蛍光標識し、その近接を蛍光顕微鏡下で検出する方法や、また、ツーハイブリッド法等のように二種類の異なるタンパク質の相互作用をレポーター遺伝子の発現で検出する方法等が挙げられる。しかしながら、これらの方法では分子が近接したか否かや、分子間相互作用の有無を判断することはできるが、分子間の相互作用の強さの測定はできない。また、細胞系を用いた薬剤のスクリーニングでは、細胞の表現型（増殖、形状等）の変化や特定の酵素反応の亢進又は阻害を観察することができるが、細胞内の薬剤の作用点や、薬剤とタンパク質との相互作用の強さについての情報は得られない。
　タンパク質等を変性させることなく、その存在を細胞単位で検出することができる方法としてフローサイトメトリーやイメージサイトメトリーを用いる分析方法が知られている。しかし、フローサイトメトリーやイメージサイトメトリーは免疫表現型や細胞周期等の定性的な解析を目的に開発された分析方法であり、機器（機種）間の検出感度の違い及び、細胞の状態、試薬類の製品間の違い等により測定値の違いが生じやすい等の点で定量的な解析には必ずしも適していない。
　このことから、細胞系を用いる場合であっても実験系を工夫する必要があること、相互作用を直接的に反映する指標の選択も困難であることから、細胞系を用いて無細胞の測定系よりも簡便にタンパク質の相互作用の強さを解析する方法を開発することは困難であると考えられてきた。
　近年、個人の特性に基づいて病気の診断や治療を行うオーダーメイド医療が注目される中、免疫応答の個体差に関わる免疫分子の機能解析の必要性が高まっている。なかでも、免疫疾患への感受性、ワクチンの効果や移植免疫等に深く関与する分子である主要組織適合性抗原（Major Histocompatibility Complex (MHC)）の機能について、そのサブユニット同士の相互作用、及びMHCと抗原ペプチドの相互作用を定量し、異なるアレルや抗原ペプチド間で比較解析することが、病態解明やワクチン開発に重要と考えられている。しかしながら、このような相互作用の指標を精度よく測定し比較可能な形で提供する解析方法は存在しなかった。
　そこで、本発明は、無細胞の測定系よりも簡便で、タンパク質の種類によらずに応用可能であり、免疫分子やMHCの解析にも使用可能な、細胞系を用いた相互作用の解析方法を提供することを課題とする。
　上記課題を解決するために本発明者らが鋭意研究を行った結果、細胞膜へのタンパク質の移行と相互作用の強さとの関係を利用し、データの取得方法や解析方法を工夫することにより、タンパク質の種類、使用する測定機器等の実験条件にかかわらず、互いに比較可能な、相互作用の強さを反映した数値を算出できることを見出した。本発明は、当該新規知見等に基づくものであり、以下を提供する。
［１］細胞における被験ポリペプチドと対象ポリペプチドの多量体形成能を測定する方法であって、前記細胞は、前記被験ポリペプチドを細胞膜タンパク質として一過的に発現可能であり、かつ、前記対象ポリペプチドを細胞膜タンパク質として発現可能であり、前記被験ポリペプチド及び前記対象ポリペプチドを複数の前記細胞に発現させる発現工程、参照用に分取した細胞群から得た参照量を解析し、前記被験ポリペプチドの発現量についての参照範囲を設定する参照範囲設定工程、測定用に分取した細胞群において、前記被験ポリペプチドの被験発現量及び被験提示量を測定する測定工程、前記被験発現量が前記参照範囲内にある細胞について、前記被験発現量及び前記被験提示量の情報を抽出する抽出工程、抽出された前記情報から、前記被験発現量と前記被験提示量の関係式を導出する関係式導出工程、及び前記関係式から多量体形成値を取得する多量体形成値取得工程を含み、前記参照範囲設定工程は、前記細胞において前記被験ポリペプチドの発現の有無を確認する確認ステップ、前記被験ポリペプチドの発現細胞を含む複数の前記細胞を参照用の細胞群として分取する参照細胞分取ステップ、前記参照用の細胞群において、前記被験ポリペプチドの発現量を測定し、参照量として取得する参照量取得ステップ、前記参照量を前記被験ポリペプチドの発現量について解析する参照量解析ステップ、及び前記解析の結果に基づいて前記参照範囲を設定する設定ステップを含み、前記測定工程は、複数の前記細胞を測定用の細胞群として分取する測定細胞分取ステップ、前記測定用の細胞群において、前記被験ポリペプチドの発現量を測定し、被験発現量として取得する発現量測定ステップ、及び前記測定用の細胞群において、細胞膜上に存在する前記被験ポリペプチドの量を測定し、被験提示量として取得する提示量測定ステップを含み、前記被験提示量は、前記被験ポリペプチドと前記対象ポリペプチドとの会合に従って変化する、前記方法。
［２］前記多量体形成値が前記被験発現量の導関数である、［１］に記載の方法。
［３］前記関係式が前記被験発現量を変数とする一次式であり、前記多量体形成値が前記被験発現量の係数である、［１］又は［２］に記載の方法。
［４］前記被験ポリペプチドが膜タンパク質である、［１］～［３］のいずれかに記載の方法。
［５］前記膜タンパク質がMHCのサブユニットである、［４］に記載の方法。
［６］前記被験ポリペプチドの発現量が前記被験ポリペプチドの発現と共役した標識タンパク質の発現量により測定される、［１］～［５］のいずれかに記載の方法。
［７］前記測定がフローサイトメトリー、イメージサイトメトリー及びマスサイトメトリーからなる群から選択されるいずれか一以上により行われる、［１］～［６］のいずれかに記載の方法。
［８］前記膜タンパク質がMHCのサブユニットであり、前記被験ポリペプチドの発現量の前記測定が、前記被験ポリペプチドの発現と共役した標識タンパク質の発現量をフローサイトメトリーにより測定することにより行われることを含む、［１］～［７］のいずれかに記載の方法。
［９］目的の条件による多量体形成能の変動を測定する方法であって、対照条件下で［１］に記載の方法に従って多量体形成値を測定し、対照値として取得する対照値測定工程、前記目的の条件下で［１］に記載の方法に従って多量体形成値を測定し、処理値として取得する処理値測定工程、及び得られた前記対照値及び前記処理値に基づいて、変動値を算出する算出工程を含む、前記方法。
［１０］細胞膜上での多量体型受容体と被験リガンドの結合能を測定する方法であって、［１］に記載の方法に従って多量体形成値を測定し、対照値として取得する対照値測定工程、［１］に記載の方法に従って多量体形成値を測定し、被験値として取得する被験値測定工程、及び得られた前記対照値及び前記被験値に基づいて、前記被験リガンドのリガンド結合値を算出する算出工程を含み、前記対照値測定工程では、前記被験ポリペプチド及び前記対象ポリペプチドとして、前記多量体型受容体のサブユニットと対照リガンドの融合タンパク質及び前記多量体型受容体の他のサブユニットを使用し、前記被験値測定工程では、前記被験ポリペプチド及び前記対象ポリペプチドとして、前記多量体型受容体のサブユニットと前記被験リガンドの融合タンパク質及び前記多量体型受容体の他のサブユニットを使用する、前記方法。
［１１］前記リガンド結合値が、前記被験値と前記対照値の比に基づく、［１０］に記載の方法。
［１２］前記リガンド結合値が、前記被験値と前記対照値の差に基づく、［１０］に記載の方法。
［１３］細胞における多量体形成条件をスクリーニングする方法であって、対照条件下で［１］に記載の方法に従って多量体形成値を測定し、対照値として取得する対照値測定工程、候補条件下で［１］に記載の方法に従って多量体形成値を測定し、候補値として取得する候補値測定工程、並びに前記候補値が前記対照値と比較して高い場合に、候補条件が多量体形成に適していると判定し、及び／又は前記候補値が前記対照値と比較して低い場合に、候補条件が多量体形成に適していないと判定する、判定工程を含む、前記方法。
［１４］前記多量体形成条件が細胞を曝露する薬剤の種類である、［１３］に記載の方法。
［１５］前記多量体形成条件がリガンドの種類である、［１３］に記載の方法。
［１６］細胞における被験ポリペプチドの立体構造形成能を測定する方法であって、前記細胞は、前記被験ポリペプチドを細胞膜タンパク質として一過的に発現可能であり、前記被験ポリペプチドを複数の前記細胞に発現させる発現工程、参照用に分取した細胞群から得た参照量を解析し、前記被験ポリペプチドの発現量についての参照範囲を設定する参照範囲設定工程、測定用に分取した細胞群において、前記被験ポリペプチドの被験発現量及び被験提示量を測定する測定工程、前記被験発現量が前記参照範囲内にある細胞について、前記被験発現量及び前記被験提示量の情報を抽出する抽出工程、抽出された前記情報から、前記被験発現量と前記被験提示量の関係式を導出する関係式導出工程、及び前記関係式から立体構造形成値を取得する立体構造形成値取得工程を含み、前記参照範囲設定工程は、前記細胞において前記被験ポリペプチドの発現の有無を確認する確認ステップ、前記被験ポリペプチドの発現細胞を含む複数の前記細胞を参照用の細胞群として分取する参照細胞分取ステップ、前記参照用の細胞群において、前記被験ポリペプチドの発現量を測定し、参照量として取得する参照量取得ステップ、前記参照量をその発現量について解析する参照量解析ステップ、及び前記解析の結果に基づいて前記参照範囲を設定する設定ステップを含み、前記測定工程は、複数の前記細胞を測定用の細胞群として分取する測定細胞分取ステップ、前記測定用の細胞群において、前記被験ポリペプチドの発現量を測定し、被験発現量として取得する発現量測定ステップ、及び前記測定用の細胞群において、細胞膜上に存在する前記被験ポリペプチドの量を測定し、被験提示量として取得する提示量測定ステップを含み、前記被験提示量は、前記被験ポリペプチドの構造安定性に従って変化する、前記方法。
［１６－１］細胞における被験ポリペプチドの細胞膜局在性維持能を測定する方法であって、前記細胞は、前記被験ポリペプチドを細胞膜タンパク質として一過的に発現可能であり、前記被験ポリペプチドを複数の前記細胞に発現させる発現工程、参照用に分取した細胞群から得た参照量を解析し、前記被験ポリペプチドの発現量についての参照範囲を設定する参照範囲設定工程、測定用に分取した細胞群において、前記被験ポリペプチドの被験発現量及び被験提示量を測定する測定工程、前記被験発現量が前記参照範囲内にある細胞について、前記被験発現量及び前記被験提示量の情報を抽出する抽出工程、抽出された前記情報から、前記被験発現量と前記被験提示量の関係式を導出する関係式導出工程、及び前記関係式から細胞膜局在値を取得する細胞膜局在値取得工程を含み、前記参照範囲設定工程は、前記細胞において前記被験ポリペプチドの発現の有無を確認する確認ステップ、前記被験ポリペプチドの発現細胞を含む複数の前記細胞を参照用の細胞群として分取する参照細胞分取ステップ、前記参照用の細胞群において、前記被験ポリペプチドの発現量を測定し、参照量として取得する参照量取得ステップ、前記参照量をその発現量について解析する参照量解析ステップ、及び前記解析の結果に基づいて前記参照範囲を設定する設定ステップを含み、前記測定工程は、複数の前記細胞を測定用の細胞群として分取する測定細胞分取ステップ、前記測定用の細胞群において、前記被験ポリペプチドの発現量を測定し、被験発現量として取得する発現量測定ステップ、及び前記測定用の細胞群において、細胞膜上に存在する前記被験ポリペプチドの量を測定し、被験提示量として取得する提示量測定ステップを含み、前記被験提示量は、前記被験ポリペプチドの細胞膜局在性に従って変化する、前記方法。
［１６－２］前記発現工程が、細胞膜タンパク質として発現可能である対象ポリペプチドを、複数の前記細胞に発現させることをさらに含む、［１６－１］に記載の方法。
［１７］目的の条件による立体構造形成能の変動を測定する方法であって、対照条件下で［１６］に記載の方法に従って立体構造形成値を測定し、対照値として取得する対照値測定工程、前記目的の条件下で［１６］に記載の方法に従って立体構造形成値を測定し、処理値として取得する処理値測定工程、及び得られた前記対照値及び前記処理値に基づいて、変動値を算出する算出工程を含む、前記方法。
［１７－１］目的の条件による細胞膜局在性維持能の変動を測定する方法であって、対照条件下で［１６－１］又は［１６－２］に記載の方法に従って細胞膜局在値を測定し、対照値として取得する対照値測定工程、前記目的の条件下で［１６－１］又は［１６－２］に記載の方法に従って細胞膜局在値を測定し、処理値として取得する処理値測定工程、及び得られた前記対照値及び前記処理値に基づいて、変動値を算出する算出工程を含む、前記方法。
［１８］細胞における被験ポリペプチドの立体構造形成条件をスクリーニングする方法であって、対照条件下で［１６］に記載の方法に従って立体構造形成値を測定し、対照値として取得する対照値測定工程、候補条件下で［１６］に記載の方法に従って立体構造形成値を測定し、候補値として取得する候補値測定工程、並びに前記候補値が前記対照値と比較して高い場合に、候補条件が前記被験ポリペプチドの立体構造の形成に適していると判定し、及び／又は前記候補値が前記対照値と比較して低い場合に、候補条件が前記被験ポリペプチドの立体構造の形成に適していないと判定する判定工程を含む、前記方法。
［１８－１］細胞における被験ポリペプチドの細胞膜局在性維持条件をスクリーニングする方法であって、対照条件下で［１６－１］又は［１６－２］に記載の方法に従って細胞膜局在値を測定し、対照値として取得する対照値測定工程、候補条件下で［１６－１］又は［１６－２］に記載の方法に従って細胞膜局在値を測定し、候補値として取得する候補値測定工程、並びに前記候補値が前記対照値と比較して高い場合に、候補条件が前記被験ポリペプチドの細胞膜局在性の維持に適していると判定し、及び／又は前記候補値が前記対照値と比較して低い場合に、候補条件が前記被験ポリペプチドの細胞膜局在性の維持に適していないと判定する判定工程を含む、前記方法。
［１８－２］前記被験ポリペプチドがGタンパク質共役型受容体である、［１６－１］、［１６－２］、［１７－１］又は［１８－１］のいずれかに記載の方法。
［１９］細胞における被験ポリペプチドの高次構造形成値又は細胞膜局在値を算出するプログラムであって、コンピュータに、参照用に分取された細胞群から得た参照量を解析し、前記被験ポリペプチドの発現量についての参照範囲を設定する参照範囲設定工程、測定用に分取された細胞群において測定された、前記被験ポリペプチドの被験発現量及び被験提示量に基づいて、前記被験発現量が前記参照範囲内にある細胞についての前記被験発現量及び前記被験提示量の情報を抽出する抽出工程、抽出された前記情報から、前記被験発現量と前記被験提示量の関係式を導出する関係式導出工程、及び前記関係式から高次構造形成値を取得する高次構造形成値取得工程又は前記関係式から細胞膜局在値を取得する細胞膜局在値取得工程を実行させるように構成され、前記参照範囲設定工程は、分取された前記参照用の細胞群において測定された前記被験ポリペプチドの発現量を参照量として取得する参照量取得ステップ、前記参照量をその発現量について解析する参照量解析ステップ、及び前記解析の結果に基づいて前記参照範囲を設定する設定ステップを含む、前記プログラム。
［２０］前記参照範囲設定工程が、前記細胞の前記被験ポリペプチドの発現量に基づいて、前記細胞毎に前記被験ポリペプチドの発現の有無を確認する確認ステップ、及び前記被験ポリペプチドの発現細胞を含む細胞群のデータを参照用として取得する参照細胞分離ステップをさらに含む、［１９］に記載のプログラム。
　本明細書は本願の優先権の基礎となる日本国特許出願番号2024-101522号の開示内容を包含する。
　本発明の多量体形成能を測定する方法によれば、被験ポリペプチドと対象ポリペプチドの多量体形成能を定量的に測定することができる。
　本発明の多量体型受容体と被験リガンドの結合能を測定する方法によれば、多量体型受容体と被験リガンドの結合能を定量的に測定することができる。
　本発明の立体構造形成能及び／又は細胞膜局在性維持能を測定する方法によれば、被験ポリペプチドの立体構造形成能及び／又は細胞膜局在性維持能を定量的に測定することができる。
　本発明の高次構造形成能及び／又は細胞膜局在性維持能の変動を測定する方法によれば、目的の条件による多量体形成能及び／又は立体構造形成能、及び／又は細胞膜局在性維持能の変動を測定することができる。
　本発明の高次構造形成条件及び／又は細胞膜局在性維持条件をスクリーニングする方法によれば、候補条件から、多量体形成及び／又は立体構造形成、及び／又は細胞膜局在性の維持に適している条件及び／又は適していない条件をスクリーニングすることができる。
　本発明のプログラムによれば、本発明の方法をコンピュータ等で自動で実行することができる。
多量体形成能を測定する方法における被験発現量と被験提示量、及び多量体形成能の例示的な関係を示す模式図である。図１Ａと図１Ｂは被験ポリペプチドの発現量（被験発現量）及び細胞膜上の存在量（被験提示量）がそれぞれ異なる状態を例示的に示す。図中、黒色で被験ポリペプチドの遺伝子及びポリペプチドを示し、白色で対象ポリペプチドの遺伝子及びポリペプチドを示す。 多量体形成能を測定する方法の工程（S0101～S0106）を例示的に示すフローチャートである。 参照範囲設定工程S0102の詳細（S0110～S0114）を例示的に示すフローチャートである。 測定工程S0103の詳細（S0115～S0117）を例示的に示すフローチャートである。 参照範囲設定工程S0102の概要を例示的に示す模式図である。図中、黒色円は被験ポリペプチド発現細胞を示し、白色円は被験ポリペプチド非発現細胞を示す。 多量体形成能を測定する方法の工程の概要を例示的に示す模式図である。図６Ａは測定工程S0103の概略を示し、図６Ｂは抽出工程S0104を示し、図６Ｃは関係式導出工程S0105を示す。図６Ａ及びＢ中、黒色円は被験ポリペプチド発現細胞を示し、白色円は被験ポリペプチド非発現細胞を示す。図６Ｃ中、黒色円は各細胞のデータに対応する。 実施例１において使用したMHCクラスIIのαサブユニットを発現させるためのプラスミドベクターの構造を示す模式図である。図中、「Ampr」はアンピシリン耐性遺伝子、「5'LTR」、「3'LTR」は5'側、3'側のレトロウイルスLTR（Long Terminal Repeat）、「Ψ」はレトロウイルスパッケージングシグナル、「SV40」はSV40（Simian Virus 40）プロモーター、「Puror」はピューロマイシン耐性遺伝子をそれぞれ示す。 実施例１において使用したMHCクラスIIのβサブユニットを発現させるためのプラスミドベクターの構造を示す模式図である。図中、「Ampr」はアンピシリン耐性遺伝子、「5'LTR」、「3'LTR」5'側、3'側のレトロウイルスLTR、「Ψ」はレトロウイルスパッケージングシグナル、「IRES」はIRES（internal ribosome entry site）、「GFP」はGFP遺伝子をそれぞれ示す。また、図中、「peptide」はリガンドを示し、「linker 1」はアミノ酸配列SGGで構成されるリンカー、「linker 2」はアミノ酸配列GGGGSIEGRGGGGSGSAで構成されるリンカーをそれぞれ示す。 実施例１において用いたゲート設定の様子を示す細胞の密度プロットである。図９Ａはゲート1を設定する様子を示し、図９Ｂはゲート1を母集団としてゲート2を設定する様子を示す。 実施例１において用いたゲート設定の様子を示す細胞の密度プロットである。ゲート2を母集団として、ゲート3及びゲート4を設定する様子を示す。 実施例１において用いたゲート設定の様子を示す細胞の密度プロット（パーセンタイルによる色表示）である。図１１Ａはゲート4で分離したデータについてゲート5を設定する様子を示し、図１１Ｂは、ゲート5の設定の際の図１１Ａ中のa及びbの設定基準を示し、図１１Ｃはゲート5を分割するゲート6～9を設定の様子を示す。 実施例１において用いたゲートの位置の例を示す細胞の密度プロットである。図１２Ａは被験発現量及び被験提示量測定用の細胞をアイソタイプコントロール抗体で処理した細胞試料における細胞毎の蛍光強度の分布と、ゲート5及びゲート6～9の位置を示し、図１２Ｂは被験発現量及び被験提示量測定用の細胞を抗HLA抗体処理した群における細胞毎の蛍光強度の分布と、ゲート5及びゲート6～9の位置を示す。 実施例１において測定したMHCであるDQA1*01:02とDQB1*06:02のヘテロダイマーに関する関係式の導出の様子を示す図である。図中、「isotype control」、「α-HLA antibody」はそれぞれアイソタイプコントロール抗体処理、抗HLA抗体処理した細胞試料のデータを示す。各データポイントは低値側から、ゲート7、8及び9におけるGFP蛍光強度及びPE蛍光強度の中央値を示す。図中、式は近似式を示し、R2値は決定係数を示す。 実施例２において測定したMHCであるDQA1*03:01とDQB1*03:02のヘテロダイマーに関する関係式の導出の様子を示す図である。図中、「isotype control」、「α-HLA antibody」はそれぞれアイソタイプコントロール抗体処理、抗HLA抗体処理した細胞試料のデータを示す。各データポイントは低値側から、ゲート6、7におけるGFP蛍光強度及びPE蛍光強度の中央値を示す。図中、式は近似式を示し、R2値は決定係数を示す。 実施例３におけるリガンドの種類によるリガンド結合値の比較結果を示す図である。各βサブユニットに関し、G15をリガンドとして使用した場合の対照値を1としたリガンド結合値を示す。図中、「peptide 1a」、「peptide 2a」、「peptide 2d」は各ペプチドをリガンドとして用いた場合の結果をそれぞれ示し、「G9」及び「G12」は、それぞれリガンドとして9アミノ酸及び12アミノ酸のグリシンからなるペプチドを用いた場合の結果を示し、「GGS12」は12アミノ酸のグリシン及びセリンからなるペプチドをリガンドとして用いた場合の結果を示す。エラーバーは標準偏差を示す。 実施例４における予測IC50値との比較結果を示す図である。αサブユニットとしてDRA*01:01を用いた場合の結果を示す。図１６ＡはβサブユニットとしてDRB1*04:01を用いた場合の結果を示し、図１６ＢはβサブユニットとしてDRB1*04:05を用いた場合の結果を示す。図中、式は近似式を示し、R2値は決定係数を示す。 実施例４における予測IC50値との比較結果を示す図である。αサブユニットとしてDRA*01:01を用いた場合の結果を示す。図１７ＡはβサブユニットとしてDRB1*15:02を用いた場合の結果を示し、図１７ＢはβサブユニットとしてDRB3*01:01を用いた場合の結果を示す。図中、式は近似式を示し、R2値は決定係数を示す。 実施例４における予測IC50値との比較結果を示す図である。図１８ＡはDQA1*03:01とDQB1*03:01を用いた場合の結果を示し、図１８ＢはDQA1*01:03とDQB1*06:01を用いた場合の結果を示す。図中、式は近似式を示し、R2値は決定係数を示す。 実施例５における測定機種間の互換性の検証結果を示す図である。G15をリガンドとして使用した場合の対照値を1としたリガンド結合値を示す。図中、「G9」はリガンドとして9アミノ酸のグリシンからなるペプチドを用いた場合の結果を示し、「pep. 1a」はpeptide 1a、「pep. 1b」はpeptide 1b、「pep. 1c」はpeptide 1c、「pep. 2b」はpeptide 2b、「pep. 2c」はpeptide 2c、「pep. 2d」はpeptide 2dをそれぞれリガンドとして用いた場合の結果を示す。「SA3800」のデータのエラーバーは標準偏差を示す。 実施例５における測定機種間の互換性の検証結果を示す図である。G15をリガンドとして使用した場合の対照値を1としたリガンド結合値を示す。図中、「G9」及び「G12」は、それぞれリガンドとして9アミノ酸及び12アミノ酸のグリシンからなるペプチドを用いた場合の結果を示し、「pep. 1d」はpeptide 1d、「pep. 1e」はpeptide 1e、「pep. 2a」はpeptide 2a、「pep. 2b」はpeptide 2bをそれぞれリガンドとして用いた場合の結果を示す。「SA3800」のデータのエラーバーは標準偏差を示す。 実施例６における本発明の方法の感度の検証結果を示す図である。図２１Ａは公知の方法を使用してin silico予測した、各ペプチドをリガンドとして使用した場合のリガンド結合強度の各指標の値（NetMHCIIpan-4.0による「Rank」及び「Rank_BA」値、並びに予測IC50値）を示す。図２１Ｂは本発明の方法の測定結果から算出したリガンド結合値を示す。 実施例７におけるフローサイトメトリーでの測定（「Flow Cytometry」）とイメージサイトメトリーでの測定（「Imaging Cytometry」）の比較結果を示す図である。G15をリガンドとして使用した場合の結果を1としたリガンド結合値を示す。図中、「G15」は、リガンドとして15アミノ酸のグリシンからなるペプチドを用いた場合の結果を示し、「pep. 1a」はpeptide 1a、「pep. 1b」はpeptide 1b、「pep. 1c」はpeptide 1c、「pep. 2d」はpeptide 2dをそれぞれリガンドとして用いた場合の結果を示す。 実施例８におけるアバカビル硫酸塩を用いた場合のHLAクラスIアレルの種類による変動値の違いを示す図である。薬剤の添加を行わず、PBS溶媒のみを添加した場合の結果（対照値）を1とした変動値を示す。図中、濃度は、添加したアバカビル硫酸塩の濃度を示し、アレルの種類は、使用したαサブユニットの種類を示す。エラーバーは標準偏差を示す。 実施例８における、アバカビル硫酸塩及びカルバマゼピン関連化合物を用いた場合の変動値の違いを示す図である。図２４Ａは、薬剤の添加を行わず、DMSO又はPBS溶媒のみを添加した場合の結果に対する比として算出した変動値を示す。図２４Ｂは、薬剤の添加を行わず、DMSO又はPBS溶媒のみを添加した場合の結果との差として算出した変動値を示す。図中、各系列は添加した薬剤の種類を示す。図中、「化合物1」はオクスカルバゼピン、「化合物2」はカルバマゼピン10,11-エポキシド、「化合物3」はエスリカルバゼピンアセタート、「化合物4」はカルバマゼピンを添加した場合の結果をそれぞれ示す。エラーバーは標準偏差を示す。 実施例９における膜タンパク質としてサイトカイン受容体（マウスIL-2受容体α）を用いた場合の結果を示す図である。図中、各系列は使用したマウスIL-2受容体αの種類を示す。図中、「IL2Ra野生型」はマウスIL-2受容体α（野生型）の結果を示し、「IL2Ra変異型」はマウスIL-2受容体α（Y129H変異型）の結果を示す。エラーバーは標準偏差を示す。 実施例１０におけるオレキシン受容体1（OX1R）を使用した場合のリガンド及びアンタゴニストを添加した場合の結果の違いを示す図である。リガンドと薬剤の添加を行わず、DMSO溶媒のみを添加した場合の結果を1とした変動値を示す。図中、「リガンド」は添加したリガンドの種類を示し、「アンタゴニスト」は添加したアンタゴニストの種類を示す。図中、「－」は、アンタゴニストを添加していないことを示し、「pep. 3a」はpeptide 3a、「pep. 3b」はpeptide 3b、「pep. 3c」はpeptide 3cをそれぞれリガンドとして用いた場合の結果を示す。エラーバーは標準偏差を示す。 実施例１０におけるオレキシン受容体2（OX2R）を使用した場合のリガンド及びアンタゴニストを添加した場合の結果の違いを示す図である。リガンドと薬剤の添加を行わず、DMSO溶媒のみを添加した場合の結果を1とした変動値を示す。図中、「リガンド」は添加したリガンドの種類を示し、「アンタゴニスト」は添加したアンタゴニストの種類を示す。図中、「－」は、アンタゴニストを添加していないことを示し、「pep. 3a」はpeptide 3a、「pep. 3b」はpeptide 3b、「pep. 3c」はpeptide 3cをそれぞれリガンドとして用いた場合の結果を示す。エラーバーは標準偏差を示す。
１．多量体形成能を測定する方法
１－１．概要
　本発明の第１の態様は多量体形成能を測定する方法である。本態様の方法は、発現工程、参照範囲設定工程、測定工程、抽出工程、関係式導出工程及び多量体形成値取得工程を必須工程として含む。本態様の方法によれば、細胞における被験ポリペプチドと対象ポリペプチドの多量体形成能を測定することができる。
１－２．定義
　本明細書で使用する用語について、以下で定義する。
　「細胞」とは、生物の構成単位をいう。本明細書における細胞はあらゆる細胞を含み、その由来する生物種は特に限定しない。例えば、単細胞生物種由来の細胞、多細胞生物種由来の細胞のいずれであってもよい。好ましくは真核生物等の多細胞生物種由来の細胞である。多細胞生物の種類は特に限定せず、動物又は植物等のいずれであってもよい。本明細書における細胞は、例えば動物由来細胞である。動物としては、例えば、霊長類（ヒト、チンパンジー、マーモセット等を含む）、伴侶動物（イヌ、ネコ等を含む）、家畜類（ブタ、ウシ、ヒツジ、ヤギ等を含む）、実験動物（マウス、ラット、モルモット等のげっ歯類を含む）等を含む哺乳動物の他、鳥類、両生類、爬虫類、昆虫類等を含む。また、細胞が由来する組織の種類は特に限定しない。例えば、多細胞生物を構成するいずれの細胞であってもよく、具体的には、多細胞生物由来細胞の場合、内胚葉由来細胞、中胚葉由来細胞、外胚葉由来細胞又はこれらの組合せを含む。
　「細胞群」とは、複数の細胞を含む集団をいう。本明細書における細胞群には、それを構成する細胞同士が何らかの関係を有しているもの、互いに無関係な細胞を含むもののいずれも含む。
　「ポリペプチド」とは、2個以上のアミノ酸がペプチド結合により連結したものをいう。特に、本明細書におけるポリペプチドには、タンパク質の他、ペプチドやオリゴペプチドと呼ばれる鎖長の短いものも広く包含する。
　「高次構造」とは、ポリペプチドがとる二次、三次及び四次構造をいう。本明細書における高次構造は、特に三次構造及び四次構造を指し、多量体及び立体構造を包含する。また、「高次構造形成能」は、立体構造形成能、多量体形成能を包含する。
　「立体構造」は、その分子全体がとる三次元的な構造をいう。本明細書においては、「立体構造」という用語はポリペプチドの三次構造と同義のものとして使用する。
　本明細書において「立体構造形成能」とは、ポリペプチドが、存在する環境下で立体構造を維持する能力を指す。本明細書における立体構造形成能には、ポリペプチドの立体構造形成（フォールディング）反応の影響、及びポリペプチドの立体構造形成反応と立体構造がほどける（アンフォールディング）反応の双方の影響のいずれも包含される。
　「多量体」とは、複数の分子が会合して構成される複合体をいう。本明細書においては、「多量体」は、特に四次構造をとった一組のポリペプチドを指す。これに対し、本明細書における「複合体」は、ポリペプチドに限らず、複数の分子が会合して構成される構造体を指し、多量体を包含する。
　「サブユニット」とは、多量体を構成する1分子をいう。本明細書における多量体には、複数のサブユニットを含むものであれば広く包含される。例えば、同種のサブユニットのみにより形成されるホモ多量体及び異種のサブユニットを含むヘテロ多量体のいずれも含む。
　本明細書において「多量体形成能」とは、多量体を構成するサブユニットが、存在する環境下で多量体状態を維持する能力を指す。本明細書における多量体形成能には、サブユニットの多量体形成反応の影響、及びサブユニットの多量体形成反応と多量体状態からサブユニットへの解離反応の双方の影響のいずれも包含される。
　「会合」とは、複数の分子が分子間相互作用によって結合し、複合体を形成することをいう。ここでの分子間力には、例えば、疎水性相互作用、ファンデルワールス力、クーロン力、水素結合等、分子間に働いて非共有結合を構成する任意の力が含まれる。会合する分子は同種の分子であってもよく、異種の分子であってもよい。
　「膜タンパク質」とは、生体膜上に存在するタンパク質をいう。ここでの生体膜には、例えば、細胞膜、核膜、ゴルジ体膜、小胞体膜、ミトコンドリア膜（内膜及び外膜を含む）、葉緑体膜（内膜及び外膜を含む）、その他の小胞等の、生体内に存在する脂質二重膜によって構成される任意の膜構造が含まれる。
　「細胞膜タンパク質」とは、細胞膜上に存在するタンパク質をいう。本明細書における「細胞膜タンパク質」には、膜貫通タンパク質、細胞膜表在性タンパク質及び脂質修飾タンパク質のいずれも含む。細胞膜表在性タンパク質及び脂質修飾タンパク質はいずれも膜貫通ドメインを有さないタンパク質である。
　「膜貫通ドメイン」とは、細胞膜を構成する脂質二重層に対する親和性を有し、脂質二重膜を貫通するタンパク質ドメインである。これに対し、細胞膜タンパク質のうち、細胞外側に露出しているタンパク質ドメインを細胞外ドメイン、細胞内側に露出しているタンパク質ドメインを細胞内ドメインと称する。例えば、脂質修飾タンパク質及び細胞膜表在性タンパク質の一部はその全体が細胞膜に埋め込まれておらず、タンパク質全体が細胞外ドメイン又は細胞内ドメインということができる。
　「MHC（主要組織適合性複合体）」とは、細胞膜上に存在する膜貫通型の糖タンパク質の複合体であり、ヘテロ二量体を形成して抗原ペプチドを結合した状態で細胞表面に発現する機能を有する細胞膜タンパク質をいう。本明細書におけるMHCはMHC抗原と同義のものとして使用される。本明細書においてMHCは抗原ペプチド（リガンド）を結合する受容体タンパク質として扱われる。MHCは、クラスI及びクラスIIに大別される。
　本明細書において「提示」とは、細胞膜タンパク質に関して使用される場合、タンパク質が細胞膜上に存在することを広く指す。
　「細胞膜上」とは、細胞膜に接触していることをいう。本明細書における「細胞膜上」に存在する状態には、細胞膜に直接的に又は間接的に接触している状態が広く含まれる。例えば、細胞膜に直接的に接触している状態には、その分子の一部（タンパク質の膜貫通ドメインや共有結合している脂質部分）が細胞膜の脂質二重層中に存在する状態の他、分子の表面が細胞膜に静電相互作用等により接触している状態を含む。また、細胞膜に間接的に接触している状態は、細胞膜に直接的に接触している分子に接触している状態又は細胞膜に直接的に接触している分子と会合している状態を指す。
　本明細書における「受容体」は、特定の物質を特異的に認識するタンパク質を指す。本明細書における受容体には、細胞にとって内因性の物質を認識するタンパク質及び細胞にとって外因性の物質を認識するタンパク質のいずれも含まれる。また、本明細書における受容体には、リガンドと結合して安定した高次構造を形成するタンパク質を含む。
　「多量体型受容体」とは、多量体を形成する受容体タンパク質を指す。
　「リガンド」とは、受容体タンパク質に特異的に結合する物質をいう。本明細書におけるリガンドは、受容体タンパク質に結合し得る物質及び受容体タンパク質のリガンド結合部位に接触し得る物質を広く指す。
　本明細書における「分取」は、細胞を取り分けることを指す。「分取」には細胞を容器から移動する操作の他、細胞を容器から移動することなく、その一部を測定や観察の対象とすること等の態様を広く含む。
　本明細書における「分離」は、分取等の態様の他、ある情報を他の情報から区別して扱うこと等の態様を広く含む。
　「関係式」とは、複数の事象同士の関係を表した式をいう。本明細書における関係式は特に限定しないが、好ましくは等式であり、また、好ましくは数式である。本明細書における関係式は、例えば関数式である。
　本明細書において「結合分子」とは、標的の分子に結合可能な任意の分子を指す。結合分子としては、抗体、その抗原結合性断片、抗原結合性誘導体及びアプタマー等が含まれる。例えば、抗体はモノクローナル抗体及びポリクローナル抗体のいずれも含み、例えば、IgG抗体分子、IgM抗体分子等が挙げられる。抗体には、完全抗体、Fab、Fab'、F(ab')2断片、また重鎖可変領域（VH）及び軽鎖可変領域（VL）をリンカーで連結した一本鎖抗体（scFv）断片等が含まれる。
　本明細書において「細胞膜上での維持」又は「細胞膜上での局在の維持」とは、あるタンパク質の細胞膜上での量が一定の範囲に維持されることを指す。細胞膜上に維持されなくなり、あるタンパク質の細胞膜上での量が変化する原因は特に限定しない。例えば、タンパク質の立体構造の不安定化、タンパク質複合体の解離及び／又はタンパク質の活性化による内在化等が挙げられる。
１－３．工程
　本態様の方法は、発現工程、参照範囲設定工程、測定工程、抽出工程、関係式導出工程及び多量体形成値取得工程を必須工程として含む。
　本態様の方法の概要を図１を参照して説明する。例えば、図１に示すような被験ポリペプチド（図中、黒色）及び対象ポリペプチド（図中、白色）を発現する細胞について考える。被験ポリペプチド及び対象ポリペプチドの二量体が細胞表面に存在する量（被験提示量）のみに基づいて、これを被験ポリペプチド及び対象ポリペプチドの二量体の形成能の指標とした場合、二量体の量は、図１Ａの細胞の細胞膜上には2つ、図１Ｂの細胞の細胞膜上には4つであるため、一見、Ｂの細胞の被験ポリペプチドの二量体形成能はＡの細胞の被験ポリペプチドの二量体形成能の2倍にみえる。しかし、被験ポリペプチドの細胞内での発現量はＡの細胞よりＢの細胞の方が多く、例えば、小胞体における被験ポリペプチドの量を見るとＢの細胞ではＡの細胞の2倍以上の被験ポリペプチドを発現している。従って、細胞内での被験ポリペプチドの発現量（被験発現量）を用いて被験提示量を補正することにより、Ａの細胞の被験ポリペプチドの方がＢの細胞の被験ポリペプチドよりも多量体の形成能は高いと判断でき、ＡとＢの各被験ポリペプチドの二量体形成能を適正に評価することができる。
　各工程について以下に説明する。
１－３－１．発現工程S0101
　「発現工程」は必須工程であり、被験ポリペプチド及び対象ポリペプチドを複数の細胞に発現させる工程である。
＜被験ポリペプチド＞
　本明細書における「被験ポリペプチド」及び「対象ポリペプチド」はいずれも、測定される多量体を構成するポリペプチドを指す。被験ポリペプチド及び対象ポリペプチドの呼称は便宜的なものであり、ある多量体において、どのポリペプチドを被験ポリペプチドとするかは任意に決定することができる。
　被験ポリペプチドが構成する多量体は、複数のポリペプチドが会合して構成される複合体であればよく、特に限定しない。例えば、本明細書における多量体には、酵素－基質複合体、リガンド－受容体複合体、抗原－抗体複合体、協働で機能する複数のタンパク質の複合体（酵素複合体、免疫受容体複合体等を含む）等のいずれも含まれる。
　多量体は、実際に被験ポリペプチドがその多量体を構成することが公知のものであってもよく、その多量体を構成することが知られていなくてもよい。例えば、多量体形成能の定量的な測定が主目的の場合には、公知の多量体に関して本態様の方法を使用することができ、多量体形成の有無の測定が主目的の場合には、被験ポリペプチドと対象ポリペプチドが構成する多量体は不明となる。
　多量体は安定な構造を有しても、特定の条件下のみにおいて安定な構造を有してもよい。例えば、細胞外環境にて安定な構造を有する多量体及び細胞内環境で安定な構造を有する多量体のいずれも使用することができる。細胞外環境にて安定な構造を有する多量体を使用する場合は、被験ポリペプチドの少なくとも一部が細胞外に位置するように細胞膜タンパク質として発現させることにより、本態様の方法に使用することができる。一方、細胞内環境にて安定な構造を有する多量体を使用する場合は、被験ポリペプチドの少なくとも一部が細胞外に位置するように細胞膜タンパク質として発現させることにより、本態様の方法に使用することができる。また、多量体において、分子間相互作用によって会合した後にさらに共有結合が形成されてもよい。
　多量体を構成する分子の数は複数であればよく、特に限定しない。例えば、2分子以上、3分子以上、4分子以上、5分子以上又はそれ以上の分子で構成される。また、例えば、20分子以下、18分子以下、17分子以下、16分子以下、15分子以下、14分子以下、13分子以下、12分子以下、11分子以下、10分子以下、8分子以下、7分子以下、6分子以下、5分子以下、4分子以下、3分子以下の分子で構成される。被験ポリペプチドが多量体を構成するか否かが不明である場合には、多量体を構成する分子数を具体的に想定しないで本態様の方法を実施してもよい。
　多量体はそれを構成する全ての分子が同一（つまり、ホモ多量体）であってもよく、その一部が異なっていてもよい（つまり、ヘテロ多量体）。1つの多量体に含まれる被験ポリペプチドの分子数は特に限定しないが、例えば、18分子以下、16分子以下、14分子以下、12分子以下、11分子以下、10分子以下、8分子以下、7分子以下、6分子以下、5分子以下、4分子以下、3分子以下、2分子以下であり、好ましくは2分子以下又は1分子である。
　被験ポリペプチドは、後述の細胞において細胞膜タンパク質として発現可能であればよく、それ自体は膜タンパク質であっても、膜タンパク質でなくてもよい。被験ポリペプチドが膜タンパク質である場合、その具体的な種類は特に限定しない。例えば、被験ポリペプチドは細胞膜タンパク質であってもよい。膜タンパク質ではない被験ポリペプチドとしては、例えば、受容体のリガンドやMHCに結合する抗原ペプチド等が含まれる。また、被験ポリペプチドとしては外因性のポリペプチドを好適に使用することができるが、その発現の時期を制御可能であれば、内因性のポリペプチドであってもよい。外因性のポリペプチドには、細胞と同じ生物個体由来のポリペプチド、細胞と同じ生物種由来のポリペプチド、及び細胞とは異なる生物種由来のポリペプチドのいずれも含まれる。ポリペプチドは人工のものであっても天然のものであってもよい。
　被験ポリペプチド及び／又は対象ポリペプチドは、タグと連結してもよい。タグとしてはエピトープタグ等が挙げられる。エピトープタグとしては、Hisタグ、Strep-tag（登録商標）II、FLAG（登録商標）タグ、Mycタグ等が挙げられるが、これらに限定されない。被験ポリペプチド及び／又は対象ポリペプチドとタグとの連結は直接的であっても間接的であってもよく、例えば、ポリペプチドとタグを直接連結した人工配列によって、又はリンカー、プロテアーゼ切断配列、制限酵素認識配列等を介して連結することができる。
　本態様で使用される細胞膜タンパク質の種類は、多量体の形成が細胞膜への移行及び／又は細胞膜上での維持に必要なタンパク質であれば特に限定しない。なお、他の態様で使用される細胞膜タンパク質は、その目的に適した細胞膜タンパク質を使用することができる。例えば、立体構造形成能を測定する場合には、立体構造の形成が細胞膜への移行及び／又は細胞膜上での維持に必要なタンパク質であれば特に限定しない。また、例えば、細胞膜局在性維持能を測定する場合には、細胞膜への移行が可能であり、タンパク質の状態又はリガンドの有無等の条件により細胞膜上での維持されやすさが影響されるタンパク質であれば特に限定しない。なお、細胞膜への移行及び／又は細胞膜上での維持に「必要」であるとは、その条件を満たすことにより細胞膜への移行及び／又は細胞膜上での維持がされやすくなることを指す。
　膜貫通タンパク質、細胞膜表在性タンパク質及び脂質修飾タンパク質のいずれであってもよく、特定の条件において細胞膜上に局在するタンパク質であってもよい。細胞膜タンパク質としては、トランスポータータンパク質（イオンチャネル、アクアポリン等の選択性チャネル、コネキシン等の非選択性チャネル等のチャネルタンパク質、Naイオンポンプ、プロトンポンプ、ATPアーゼ等のイオンの移動をエネルギーとして使用するタンパク質等を含むポンプタンパク質の他、シンポーター、アンチポーターを含む）、細胞膜タンパク質受容体（酵素結合型受容体、イオンチャネル型受容体、Gタンパク質共役型受容体等を含む）、細胞接着分子、膜結合型リガンド、膜抗原等が挙げられる。細胞膜タンパク質受容体、細胞接着分子、膜結合型リガンド、膜抗原（例えば、MHC）等を好適に使用することができる。好ましくは、膜結合型リガンド、膜抗原を使用することができ、具体的には、例えば、MHCを使用することができる。
　酵素結合型受容体（例えば受容体チロシンキナーゼ）は、リガンドが結合することにより二量体又は多量体化が誘導され、受容体に結合している酵素が活性化し酵素反応に基づくシグナル伝達を開始する。サイトカイン受容体（例えば、IL-2受容体等のインターロイキン受容体）等の酵素結合型受容体は立体構造の安定性等が細胞膜上での発現に影響することが示唆されている。
　イオンチャネル型受容体は、多くがヘテロ多量体であり、リガンドが結合することによりその立体構造が変化してイオンの膜透過性を調節するチャネルとして機能する。イオンチャネル型受容体としては、例えば、グルタミン酸受容体、ニコチン受容体、GABA受容体、セロトニン受容体、グリシン受容体等が挙げられる。
　細胞膜タンパク質がGタンパク質共役型受容体である場合、その具体的な種類は特に限定しない。Gタンパク質共役型受容体は、リガンドが結合することによる構造変化や細胞質側に存在するGタンパク質等を活性化すること等でシグナル伝達を開始する。Gタンパク質共役型受容体等の一部の受容体がリガンド等の結合により細胞質中のβアレスチンとの相互作用等により細胞内に内在化（Internalization）される現象が知られている。内在化現象は、例えば、オレキシン受容体1（OX1R）、オレキシン受容体2（OX2R）、ドーパミン受容体等のGタンパク質共役型受容体で起こることが知られている。
　多量体がMHCである場合、その具体的な種類は特に限定しない。例えば、MHCクラスI及びMHCクラスIIのいずれであってもよい。
　MHCクラスIはαサブユニットとβ2ミクログロブリンの二量体で構成され、全ての有核細胞及び血小板に存在し、CD8陽性の細胞傷害性T細胞を活性化する。一方、MHCクラスIIはαサブユニットとβサブユニットの二量体で構成され、抗原提示細胞で発現し、CD4陽性のヘルパーT細胞を活性化する。多量体がMHCである場合、そのいずれのサブユニットも被験ポリペプチドとして使用することができる。
　特にヒトのMHCはヒト白血球抗原（human leukocyte antigen (HLA)）と呼ばれ、MHCクラスIに分類されるHLA（HLAクラスI）ではαサブユニットをコードするHLA-A、-B、-C遺伝子座には多型が多く、対立遺伝子（アレル）としてそれぞれ4,000種類以上が登録されている。β2ミクログロブリンは多型性は少ない。HLAクラスIは、さらにHLA-A、HLA-B、HLA-C、HLA-E、HLA-F及びHLA-G等のアイソタイプに分類され、各アイソタイプはそれぞれいくつかの血清学的タイプに分類される。HLA-Aの血清学的タイプとしては、例えば、HLA-A1、-A2、-A3、-A9、-A10、-A11、-A19、-A28、-A36、-A43、-A80等が挙げられる。HLA-A遺伝子としては、例えば、HLA-A＊01:01、-A＊02:01、-A＊03:01、-A＊24:02等が挙げられる。HLA-Bの血清学的タイプとしては、例えば、HLA-B5、-B7、-B8、-B12、-B13、-B14、-B15、-B16、-B17、-B18、-B21、-B22、-B27、-B35、-B37、-B40、-B41、-B42、-B46、-B47、-B48、-B53、-B57、-B59、-B67、-B70、-B73、-B78、-B81等が挙げられる。HLA-B遺伝子としては、例えば、HLA-B＊07:02、-B＊08:01、-B*15:02、-B＊44:02、-B＊51:01、-B＊52:01、-B*57:01、-B*57:02、-B*57:03等が挙げられる。HLA-Cの血清学的タイプとしては、例えば、HLA-Cw1、-Cw2、-Cw3、-Cw4、-Cw5、-Cw6、-Cw7、-Cw8等が挙げられる。HLA-C遺伝子としては、例えば、HLA-C＊01:02、-C＊03:03、-C＊04:01、-C＊07:01、-C＊07:02等が挙げられる。
　MHCクラスIIに分類されるHLA（HLAクラスII）のαサブユニットをコードする遺伝子には多型が比較的少ないが、βサブユニットをコードする遺伝子には多くの多型が存在し、HLA-DRB1、-DQB1、-DPB1遺伝子座の対立遺伝子（アレル）としてそれぞれ1,000種類以上が登録されている。HLAクラスIIは、さらにHLA-DR、HLA-DQ及びHLA-DP等のアイソタイプに分類される。各アイソタイプはそれぞれいくつかの血清学的タイプ又は細胞学的タイプに分類される。HLA-DRの血清学的タイプとしてはHLA-DR1、-DR2、-DR3、-DR4、-DR5、-DR6、-DR7、-DR8、-DR9、-DR10、-DR51、-DR52、-DR53等が挙げられる。HLA-DRのαサブユニットの遺伝子としては、例えば、HLA-DRA＊01:01等が挙げられる。また、HLA-DRのβサブユニットの遺伝子としては、例えばHLA-DRB1＊03:01、-DRB1＊04:05、-DRB1*07:01、-DRB1＊09:01、-DRB1＊15:01、-DRB1＊15:02、-DRB3＊01:01、-DRB3＊02:02、-DRB3＊03:01、-DRB4＊01:03、-DRB5＊01:01、-DRB5＊01:02等が挙げられる。HLA-DPの細胞学的タイプとしては、HLA-DPw1、-DPw2、-DPw3、-DPw4、-DPw5、-DPw6等が挙げられる。HLA-DPのαサブユニットの遺伝子としては、例えば、HLA-DPA1＊01:03、-DPA1＊02:02等が挙げられる。また、HLA-DPのβサブユニットの遺伝子としては、例えば、HLA-DPB1＊02:01、-DPB1＊04:01、-DPB1＊04:02、-DPB1＊05:01、-DPB1＊09:01等が挙げられる。HLA-DQの血清学的タイプとしては、例えば、HLA-DQ1、-DQ2、-DQ3、-DQ4等が挙げられる。HLA-DQのαサブユニットの遺伝子としては、例えば、HLA-DQA1＊01:02、-DQA1＊02:01、-DQA1*03:01、-DQA1＊05:01等が挙げられる。また、HLA-DQのβサブユニットの遺伝子としては、例えば、HLA-DQB1＊02:01、-DQB1＊03:01、-DQB1＊03:03、-DQB1＊04:01、-DQB1＊06:01、-DQB1＊06:02等が挙げられる。
＜対象ポリペプチド＞
　対象ポリペプチドは、本態様の方法により被験ポリペプチドとの多量体形成能が測定されるポリペプチドである。
　上述したように、対象ポリペプチド及び被験ポリペプチドの別は便宜的なものである。従って、対象ポリペプチドの基本的な内容は被験ポリペプチドに関する記載に準ずる。ここでは、被験ポリペプチドとの相違点についてのみ記載する。
　対象ポリペプチドの種類は、被験ポリペプチドと多量体を形成する可能性があるポリペプチドであればよく、特に限定しない。例えば、対象ポリペプチドは被験ポリペプチドと会合することが公知のポリペプチドであっても、被験ポリペプチドと会合することが不明のポリペプチドであってもよい。また、対象ポリペプチドは内因性のポリペプチドであっても、外因性のポリペプチドであってもよい。
　対象ポリペプチドの数は1種類以上であればよく、特に限定しない。例えば、対象ポリペプチドは2種類以上、3種類以上、4種類以上、5種類以上であってよく、また、例えば、20種類以下、18種類以下、16種類以下、14種類以下、12種類以下、10種類以下、8種類以下、6種類以下、5種類以下、4種類以下、3種類以下、2種類以下であってよい。
　1つの多量体に含まれる各対象ポリペプチドの分子数は特に限定しないが、例えば、10分子以下、8分子以下、4分子以下、3分子以下、2分子以下又は1分子である。
＜細胞＞
　本態様の方法で使用される細胞は、被験ポリペプチドを細胞膜タンパク質として一過的に発現可能であり、かつ、対象ポリペプチドを細胞膜タンパク質として発現可能である。
　使用される細胞の種類は、被験ポリペプチド及び対象ポリペプチドを発現可能であれば特に限定しない。例えば、定義の項で上述したいずれの細胞も使用することができる。また、使用される細胞は、通常被験ポリペプチド及び／又は対象ポリペプチドを発現する細胞であってもよく、特定の操作によりそれらのポリペプチドを発現するように改変された細胞であってもよい。
　具体的な細胞の種類は特に限定しないが、例えば、動物由来の細胞、脊椎動物由来の細胞、哺乳動物由来の細胞、ヒト由来の細胞等が挙げられる。被験ポリペプチド及び対象ポリペプチドが由来する生物と同種の生物由来の細胞であってもよく、異種の生物由来の細胞であってもよい。また、培養細胞を好適に使用することができる。この場合、培養細胞は、初代培養細胞、継代培養細胞又は株化細胞のいずれであってもよい。例えば、腫瘍由来細胞、不死化細胞、抗原提示細胞（B細胞、樹状細胞、マクロファージ等）、ES細胞、iPS細胞等の多能性幹細胞から分化した細胞及びその株化細胞等を使用することができる。
　被験ポリペプチド及び対象ポリペプチドの少なくともいずれか一方の遺伝子が導入された細胞を使用することができる。遺伝子の導入方法としては、公知の任意の方法を使用することができ、特に限定しない。例えば、遺伝子がゲノムDNA中に組み込まれてもよく、ゲノムDNAとは独立した核酸分子として細胞内に導入されてもよい。遺伝子導入に使用されるベクターとしては、公知の任意のベクターを使用することができ、特に限定しない。例えば、ウイルス、プラスミド、コスミド、及び人工染色体等をベクターとして使用することができる。ウイルスには、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、レンチウイルス等に由来する種々のベクターが含まれる。プラスミドには、pKA1、pCDM8、pSVK3、pMSG、pSVL、pBK-CMV、pBK-RSV、pEBV、pRS、pcDNA3、pMSG、pYES2、pMXs-puro、pMXs-IB、pMXs-IRES-GFP等が含まれる。
　被験ポリペプチド及び対象ポリペプチドの両方の遺伝子を導入する場合、両ポリペプチドの遺伝子を同じベクターに含んでもよく、互いに別のベクターに含んでもよい。また、この場合に使用される導入方法としては、共通の方法を使用してもよく、別々の方法を使用してもよい。
　細胞は被験ポリペプチド及び対象ポリペプチドを細胞膜タンパク質として発現可能である。
　本明細書において「細胞膜タンパク質として発現可能」とは、本態様の方法に用いるのに際し、細胞膜タンパク質の形態で発現させることができることを指す。被験ポリペプチド及び対象ポリペプチド自体が細胞膜タンパク質又はその一部である場合、被験ポリペプチド及び対象ポリペプチドをそのまま発現させることによって細胞膜タンパク質として発現させることができる。また、被験ポリペプチド及び対象ポリペプチドの少なくとも一方が細胞膜タンパク質以外の膜タンパク質である場合、例えば、他の細胞小器官への移行シグナル配列を小胞体移行シグナル配列で置換することにより細胞膜タンパク質として発現させることができる。また、被験ポリペプチド及び対象ポリペプチドの少なくとも一方が膜タンパク質でない場合、例えば、被験ポリペプチドを細胞膜タンパク質（上述のように細胞膜タンパク質に改変した膜タンパク質を含む）又はその一部との融合タンパク質として発現させることにより細胞膜タンパク質として発現させることができる。この場合の細胞膜タンパク質としては、被験ポリペプチドに関して上述した任意の細胞膜タンパク質を使用することができる。
　後述の被験提示量は、被験ポリペプチドと対象ポリペプチドとの会合に従って変化する。従って、本態様で使用される細胞は、被験ポリペプチドと対象ポリペプチドとの会合に従って多量体の細胞膜への移行が変化するような態様で両ポリペプチドを発現する。例えば、被験ポリペプチドと対象ポリペプチドが会合することが多量体の細胞膜への移行に必須である態様等で細胞は両ポリペプチドを発現する。具体的には、例えば、被験ポリペプチド及び／又は対象ポリペプチドが細胞膜タンパク質であり、多量体の形成が細胞膜への移行に必須であることが知られている場合は、そのまま発現させることによって本態様の方法を実施することができる。また、例えば、被験ポリペプチド及び／又は対象ポリペプチドがホモ多量体等を形成して細胞膜への移行が可能である場合、被験提示量の測定の際に、被験ポリペプチド及び／又は対象ポリペプチドを含む多量体の細胞膜上での存在量を反映する指標を検出対象とすることによって本態様の方法を実施することができる。被験ポリペプチド及び／又は対象ポリペプチドが細胞膜タンパク質でない場合は、上述の態様で発現可能な細胞膜タンパク質として発現させることにより、本態様の方法を実施することができる。
　細胞は被験ポリペプチドを一過的に発現可能である。
　本明細書において「一過的に発現可能」とは、発現工程開始時点には細胞中に細胞膜タンパク質としての被験ポリペプチドが存在せず、発現工程開始時点以降に被験ポリペプチドを細胞膜タンパク質として発現させることができることを指す。すなわち、発現工程前にその細胞で被験ポリペプチドが細胞膜タンパク質として発現したことがないか、発現したことがあっても発現工程開始時点では発現量が低いか枯渇している。
　被験ポリペプチドの発現の終期は、本工程の終了時まで発現していればよく、特に限定しない。例えば、本工程の終了と同時に発現が停止するように発現させてもよく、本工程の終了後も継続して発現可能なように発現させてもよい。
　細胞は対象ポリペプチドを発現可能である。
　対象ポリペプチドの発現態様は、本工程において、対象ポリペプチドの発現時期とその量が多量体の細胞膜への移行や膜上での発現状態の維持の律速段階とならなければよく、特に限定しない。例えば、構成的に発現していてもよく、条件依存的に発現可能であってもよい。好ましくは、対象ポリペプチドは発現工程開始以前から発現している。
　これらのポリペプチドの発現を制御するプロモーターの種類は特に限定しない。
　本明細書において「プロモーター」とは、その下流（3'末端側）に配置された遺伝子等の発現を制御することのできる遺伝子発現調節領域である。発現制御下にある遺伝子等を発現させる場所に基づいて分類すると、プロモーターは、ユビキタスプロモーター（全身性プロモーター）と部位特異的プロモーターに分けられる。ユビキタスプロモーターは、全細胞、すなわち宿主個体全体で対象とする遺伝子等（「対象遺伝子等」と称する）の発現を制御するプロモーターである。また、部位特異的プロモーターは、特定の細胞又は組織でのみ対象遺伝子等の発現を制御するプロモーターである。本発明の被験ポリペプチド及び対象ポリペプチドを制御するプロモーターは、ユビキタスプロモーター又は部位特異的プロモーターのいずれであってもよい。
　発現の時期に基づいて分類すると、プロモーターは、構成的活性型プロモーター、発現誘導型プロモーター又は時期特異的活性型プロモーターに分類される。構成的活性型プロモーターは、細胞内で対象遺伝子等を恒常的に発現させることができる。発現誘導型プロモーターは、誘導刺激に基づいて細胞内で対象遺伝子等の発現を任意の時期に誘導することができる。また、時期特異的活性型プロモーターは、細胞内で対象遺伝子等を発生段階の特定の時期にのみ発現誘導することができる。被験ポリペプチド又は対象ポリペプチドの発現を制御するプロモーターは、構成的活性型プロモーター、発現誘導型プロモーター又は時期特異的活性型プロモーターのいずれであってもよい。特に、対象ポリペプチドは内因性のポリペプチドであってもよく、そのプロモーターは内因性のプロモーターであってもよい。
　本工程の時間は、被験ポリペプチドが十分量発現可能な時間であればよく、特に限定しない。例えば、1時間以上、2時間以上、3時間以上、5時間以上、6時間以上、9時間以上、12時間以上、18時間以上、24時間以上、30時間以上、36時間以上、42時間以上、48時間以上、50時間以上、55時間以上、60時間以上、70時間以上、72時間以上、80時間以上、84時間以上、90時間以上、96時間以上実施することができる。
　本工程の条件は特に限定しない。使用する細胞に応じて適宜設定することができる。細胞の種類に応じた培養方法は当技術分野において周知であり、そのいずれも使用することができる。例えば、各種培地、添加剤等が市販されているため、それらを使用してもよい。培養環境は特に限定しない。通常使用される環境、例えば、37℃、5％CO2環境下で培養することができる。
１－３－２．参照範囲設定工程S0102
　「参照範囲設定工程」は必須工程であり、参照用に分取した細胞群から得た参照量を解析し、被験ポリペプチドの発現量についての参照範囲を設定する工程である。本工程は発現工程と同時に又はその後に行うことができる。
　本工程は、確認ステップ、参照細胞分取ステップ、参照量取得ステップ、参照量解析ステップ及び設定ステップを含む。
　まず、図５を参照して本工程の概要を説明する。
　本工程ではまず、細胞において被験ポリペプチドの発現の有無を確認する（図５中(1)）。その上で、被験ポリペプチドの発現細胞を含む複数の細胞を参照用の細胞群として分取する（図５中(2)）。分取された細胞群において、被験ポリペプチドの発現量を測定し、その発現量を参照量として取得する（図５中(3)）。得られた参照量を被験ポリペプチドの発現量について解析してグラフ等の任意の形式で集計し（図５中(4)）、解析の結果に基づいて、参照範囲を設定する（図５中(5)）。本工程で設定された参照範囲は後の抽出工程において使用される。
　各ステップについて以下に説明する。
（１）確認ステップS0110
　本ステップは、細胞において被験ポリペプチドの発現の有無を確認するステップである（図５中(1)）。
　発現の有無を判断するための指標は、被験ポリペプチドの発現を反映する指標であればよく、特に限定しない。例えば、被験ポリペプチドの転写産物量、翻訳産物量、被験ポリペプチドに結合した標識の量、被験ポリペプチドの発現と共役した転写産物の量、被験ポリペプチドの発現と共役した標識タンパク質の発現量、被験ポリペプチドの機能と共役した標識の量等を使用することができる。
　標識の種類は特に限定しない。例えば、低分子の標識、標識ペプチド、標識タンパク質等を使用することができる。具体的な標識の種類としては、例えば、発光物質、蛍光物質、酵素、放射性物質、金属同位体、量子ドット、酵素基質、酵素補因子、酵素阻害剤、色素、金属イオン及びこれらの組合せ等が挙げられる。
　発光物質としては、例えば、アクリジニウムエステル、3-(2'-スピロアダマンタン)-4-メトキシ-4-(3"-ホスホリルオキシ)フェニル-1,2-ジオキセタン（AMPPD）、ルミノール及びその修飾体、4-アミノフタルヒドラジド、各種セレンテラジン、及びルシフェリン等が挙げられる。
　蛍光物質としては、例えば、FITC、Texas Red、PE、PerCP、APC、Cy3、Cy5、Cy7、FAM、HEX、VIC、JOE、Rox、TET、Bodipy493、NBD、TAMRA、Qdot(登録商標)、DAPI、DyLight(登録商標)、Pacific BlueTM、eFluorTM、Brilliant VioletTM、BD HorizonTM、Alexa-Fluor(登録商標)色素、及びこれらのタンデム色素等の蛍光色素；GFP、EGFP、BFP、CFP、YFP、mCHERRY等の蛍光タンパク質等が挙げられる。
　酵素としては、例えば、プロテアーゼ、ペルオキシダーゼ、フォスファターゼ（例えば、アルカリフォスファターゼ）、スルファターゼ、ペプチダーゼ、グリコシダーゼ、ヒドロラーゼ、オキシドレダクターゼ、リアーゼ、トランスフェラーゼ、イソメラーゼ、リガーゼ及びシンテターゼ等が挙げられる。
　放射性物質としては、例えば、14C、123I、124I、125I、131I、Tc99m、32P、35S及び3H等が挙げられる。また、金属同位体としては、169Tm、167Er、144Nd等が挙げられる。
　被験ポリペプチドに標識が結合している場合、標識は被験ポリペプチドに直接結合していても、リンカー等を介して間接的に結合していてもよい。また、標識としては、それが直接検出可能であるものに加え、上述の酵素基質等のように、追加の処理を行うことにより検出可能になるものを使用することができる。
　本明細書において「被験ポリペプチドの発現と共役した標識タンパク質」とは、被験ポリペプチドの発現量と相関する発現量を示す標識タンパク質を指す。このようなタンパク質としては、例えば、その遺伝子が被験ポリペプチドと同じ1つのプロモーターの制御下にあり、被験ポリペプチドと同時に発現（ポリシストロニック発現）する標識タンパク質、その遺伝子が被験ポリペプチドのプロモーターと競合するプロモーターの制御下にあり、被験ポリペプチドの発現量に従って発現量が減少する標識タンパク質等が挙げられる。ポリシストロニック発現には、例えば、IRES、IGR-IRES、2Aペプチド等の自己切断型ペプチド（P2A、T2A、E2A、F2A）等を使用することができる。
　また、本ステップでの確認と参照量取得ステップでの測定に使用する標識が異なる場合は、本ステップでは、特に同一のベクター内又は異なるベクター内で同種のプロモーターの制御下に遺伝子を有する標識タンパク質を被験ポリペプチドの発現の確認に使用することができる。このような場合であっても、被験ポリペプチドの発現量と標識タンパク質の発現量の間の相関が明確である場合は、その情報に基づいて補正すること等により、このような標識タンパク質を参照量取得ステップでの測定においても使用することができる。
　この場合の標識タンパク質には、その存在を直接検出可能なタンパク質の他、その存在を間接的に検出可能なタンパク質等が含まれる。その存在を直接検出可能なタンパク質としては、例えば、上述の各種蛍光タンパク質等が含まれる。また、その存在を間接的に検出可能なタンパク質としては、特定の基質の存在下で検出可能となる酵素や、細胞膜上に移行し、提示量測定ステップにおいて後述する方法により検出可能なタンパク質等が含まれる。
　被験ポリペプチドの機能と共役した標識とは、被験ポリペプチドの機能に基づいて検出可能となる標識を指す、例えば、被験ポリペプチドの一部が酵素である場合、その基質を標識として使用することにより、その酵素反応に基づいて、被験ポリペプチドの発現を検出することができる。
　発現の有無を判断する方法は、個々の細胞毎の生体分子の発現を検出可能であれば、特に限定しない。検出対象の生体分子はポリペプチドに限らず、タンパク質であってもよく、核酸であってもよい。細胞の構造を破砕しない方法や、細胞内局在及びその量を測定可能な方法であることが好ましい。例えば、目視によって、顕微鏡（例えば、実体顕微鏡、共焦点顕微鏡、蛍光顕微鏡等）を用いて、検出機器による検出の有無によって、又は発現量の計測によって、発現の有無を判断することができる。検出機器を用いた方法の場合、その具体的な方法は特に限定しない。例えば、細胞毎に生体分子の量を検出する方法を使用することができる。このような方法としては、顕微鏡イメージ解析装置、プレートイメージ解析装置等の装置を利用した方法、フローサイトメトリー、イメージサイトメトリー、マスサイトメトリー等が挙げられる。蛍光検出に基づく検出方法の場合、その具体的な方法は特に限定しない。例えば、蛍光標識抗体やフェルスター共鳴エネルギー移動（FRET）を用いた方法、二分子蛍光相補アッセイ（BiFc）、近接ライゲーションアッセイ（PLA）、単一分子蛍光検出方法、分光法等の方法が使用可能である。核酸を定量する場合の方法は、例えば、核酸染色試薬を用いる検出方法、次世代シーケンサで細胞毎のリード数をカウントする方法等が使用可能であるが、これらに限定されない。
　発現の程度を連続値として検出可能である場合、発現していると判断する際の発現の程度は特に限定しない。例えば、被験ポリペプチドを発現していない細胞（対照細胞）より多く発現していればよく、また、例えば、対照細胞と比較して有意に多く発現していればよい。
　本ステップで使用される細胞は、生細胞であってもよく、固定された細胞であってもよい。
（２）参照細胞分取ステップS0111
　本ステップは、被験ポリペプチドの発現細胞を含む細胞群を参照用の細胞群として分取するステップである（図５中(2)）。本ステップは確認ステップと同時に又はその後に行うことができる。
　分取する方法は特に限定しない。例えば、既に区分けされた細胞集団（例えば、培養容器内で小区画に区分けされた細胞集団）の中から所望の数の細胞を選択してもよく、1つの区画の細胞集団の中から、任意の複数の位置の細胞を分取してもよく、既に区分けされた複数の細胞集団をまとめて1つの細胞群として分取してもよい。測定にイメージサイトメトリーを使用する場合、培養容器中の細胞をそのまま測定の対象とすることができる。
　参照用に分取される細胞群の細胞数は特に限定しない。例えば、600細胞以上、1,000細胞以上、2,000細胞以上、3,000細胞以上、5,000細胞以上、7,000細胞以上、10,000細胞以上、20,000細胞以上、30,000細胞以上、40,000細胞以上、50,000細胞以上で構成される細胞群を分取することができる。
　分取される細胞群の数は1以上であればよく特に限定しない。例えば、1以上、2以上、3以上、4以上、5以上、6以上の細胞群を分取することができる。細胞群の数は、例えば、被験ポリペプチドの種類の数や発現工程での実験条件の種類の数に応じて増減させることができる。
　また、本ステップでは、参照量取得ステップ等での処理のために追加で任意の処理を行うことができる。例えば、参照用の細胞群が接着培養されている場合であって、参照量取得ステップにおいてフローサイトメトリーが使用される場合、本ステップにおいて細胞群を培養容器等から剥がし、培地等の液体中に懸濁することができる。
（３）参照量取得ステップS0112
　本ステップは、分取された細胞群において、被験ポリペプチドの発現量を測定し、参照量として取得するステップである（図５中(3)）。本ステップは、確認ステップと同時に又は別々に行うことができる。
　本ステップでは、被験ポリペプチドの発現量が測定され、参照量と称して取得される。被験ポリペプチドの発現量には転写産物量、翻訳産物量を広く包含し、特に限定しない。例えば、確認ステップにおいて記載した指標を使用して被験ポリペプチドの発現量を測定することができる。具体的には、例えば、被験ポリペプチドの発現量を、前記被験ポリペプチドの発現と共役した標識タンパク質の発現量により測定することができる。
　発現量を測定するための指標は確認ステップにおいて使用した指標と同一であってもよく、異なってもよい。好ましくは、確認ステップと本ステップでは同じ指標が使用される。
　被験ポリペプチドの発現量を測定する方法は特に限定しない。例えば、確認ステップにおいて記載した方法を使用することができる。具体的には、例えば、細胞毎に生体分子の量を検出する方法を使用することができる。細胞毎に生体分子の量を検出する手法としては顕微鏡イメージ解析装置、プレートイメージ解析装置、フローサイトメトリー、イメージサイトメトリー及びマスサイトメトリー等が挙げられる。検出対象の生体分子はポリペプチドに限らず、タンパク質であってもよく、核酸であってもよい。
　測定にフローサイトメトリーを使用する場合、光源の照射方式、波長の調整（検出）方式（例えば、スペクトル型、フィルター方式等）等、並びに細胞のソーティング装置の有無及びそのソーティング様式等は特に限定しない。測定にイメージサイトメトリーを使用する場合には、例えば、レーザー走査サイトメトリー及び共焦点レーザー顕微鏡での解析等が含まれる。
　被験ポリペプチドの発現量は、参照細胞分取ステップにて分取された細胞群の全ての細胞について測定されてもよく、特定の基準を満たす一部の細胞についてのみ測定されてもよい。
　各細胞群のデータからその一部の細胞のデータを分離して以降の解析に含めない処理（除外処理）を行うことができる。除外処理を行う場合の基準は特に限定しない。例えば、死細胞や細胞片、凝集細胞由来のデータを分離し、除外することができる。
　例えば、本ステップでフローサイトメトリーを使用する場合、前方散乱（FSC）及び側方散乱（SSC）に基づいて、いずれも低値を示す原点に近いデータを死細胞や細胞片のデータと見なして除外することができる。あるいは、死細胞を染色する任意の試薬を用いて死細胞を標識し、その標識に基づいて死細胞のデータを除外することができる。
　また、例えば、本ステップでフローサイトメトリーを使用する場合、SSC-Area（又はSSC-Width）とSSC-Height、FSC-Area（又はFSC-Width）とFSC-Height等の組合せについての二次元展開面を用い、当技術分野において通常使用される方法に基づいて単一細胞の分布から乖離した凝集細胞のデータを除外することができる。
　本ステップでは、被験ポリペプチドの発現量の測定を阻害しない範囲で、追加で任意の処理を行うことができる。例えば、リンパ球由来の細胞種を用いる場合は、細胞表面のFc受容体への抗体の非特異的結合を妨げる処理を行ってもよい。また、測定工程において使用する測定条件のためのコントロール処理（ネガティブコントロール試薬の適用等）を行うことができる。ネガティブコントロール試薬としてアイソタイプコントロール抗体等を適用する場合、使用される抗体等の結合分子は、本ステップにおいて使用される細胞種及び細胞試料に存在しない抗原に対して作製された結合分子であればよく、特に限定しない。例えば、アイソタイプコントロール抗体として市販されている抗体を使用することができる。アイソタイプコントロール抗体を使用する場合、提示量測定ステップにおいて使用される抗体と免疫生物種、免疫グロブリンサブクラス、及び一次抗体の標識の種類（及び／又は数）のいずれか一以上を一致させることが好ましい。
　アイソタイプコントロール抗体の染色条件は特に限定しない。後述する測定工程の提示量測定ステップにおいて使用される抗体を適用する際の染色条件と一致させることが好ましい。
（４）参照量解析ステップS0113
　本ステップは、参照量のデータを被験ポリペプチドの発現量について解析するステップである（図５中(4)）。
　ここでの「解析」とは、参照量のデータの集計及び／又は整理等を行い、設定ステップに供する解析データとする処理を指す。
　参照量のデータを発現量の値の大きさに関して集計及び／又は整理できる方法であれば、具体的な解析の内容は特に限定しない。例えば、参照量を表、グラフ等の任意の形式で被験ポリペプチドの発現量の値に関して整理することを含む。特に、設定ステップでは、被験ポリペプチドの発現量と細胞数の情報が利用される。従って、被験ポリペプチドの発現量の値の大きさについての細胞の分布を分析可能なように本工程での解析が行われることが好ましい。例えば、被験ポリペプチドの発現量の値の大きさに従って整列してもよく、被験ポリペプチドの発現量と細胞数の関係をグラフの形式で整理してもよい。グラフの形式を使用する場合、横軸と縦軸に被験ポリペプチドの発現量と細胞数を配置するヒストグラムであってもよく、2種類の異なるパラメータでデータを2軸で展開した細胞の密度プロットや等高線プロットを用いてもよい。
　例えば、被験ポリペプチドの発現量についての細胞の分布（例えば、被験ポリペプチドの発現量を横軸、細胞数を縦軸としたヒストグラム、又は被験ポリペプチドの発現量と他の指標で二次元に展開したドットプロット、密度プロット、又は等高線プロット等）に基づいて被験ポリペプチドの発現量が低値側の細胞群（非発現細胞群）と被験ポリペプチドの発現量が高値側の細胞群（発現細胞群）の分布を把握した上で、これら各群の分布が互いに重複している場合にはこれらの各群の重複部分、重複していない場合にはその境界部分において、非発現細胞群と発現細胞群を区別するための水準を設定することができる。水準の位置の推定方法は特に限定しない。2群の重複の程度に応じて適切な公知の推定方法を選択することができる。例えば、多峰性分布の単峰性分布への公知の任意の分離方法を使用することができる。例えば、クラスター分析に基づく方法、各単峰性分布を公知の確率分布（正規分布、カイ二乗分布等を含む）に従うと仮定する方法、パーセンタイル（例えば、パーセンタイル等高線等）に基づく方法、任意のソフトウェアで使用可能な公知の方法、又はこれらの組合せを使用することができる。また例えば、非発現細胞群と発現細胞群の一方の群、又は各群を包含するゲートを用いて各細胞群を区別することができる。
　非発現細胞群と発現細胞群を区別するための水準の位置又はゲートの位置は特に限定しない。好ましくは、発現細胞群に包含される細胞総数のうち被験ポリペプチド発現細胞の割合が40％以上となるように、水準を設定することができる。例えば、発現細胞群に含まれる細胞のうち被験ポリペプチド発現細胞の割合が40％以上、50％以上、60％以上、70％以上、80％以上、85％以上、95％以上又は99％以上となるように設定することができる。
　参照量取得ステップにおいて除外処理を行わなかった又は除外処理が不十分であった場合、本ステップでその除外処理を行うことができる。除外処理の具体的な内容は特に限定しない。例えば、参照量取得ステップにおいて記載した基準に基づき、除外処理を行うことができる。また、例えば、被験ポリペプチドの発現量と細胞数の対応関係以外の基準に基づいて除外処理を行ってもよい。
　また、例えば、被験ポリペプチドの発現量が、発現細胞群における発現量分布から乖離した細胞（過剰発現細胞等）のデータを除外することができる。この場合の乖離の程度は特に限定しないが、被験ポリペプチド発現細胞のデータを過度に除外しないことが好ましい。この場合、例えば、除外前の発現細胞のうち、70％以上、80％以上、85％以上、90％以上、95％以上、99％以上の細胞のデータが保持されるように、乖離した細胞のデータが除外される。除外方法は特に限定されず、当技術分野において通常使用される方法に基づいて除外することができる。
　解析は、任意のソフトウェアを用いて行うことができる。例えば、エクセル等の解析ソフトウェア、RやPython等で作動するプログラム等の他、測定にフローサイトメトリーを用いる場合は、フローサイトメトリー用の任意の公知のソフトウェアを用いる等、選択した測定方法において通常使用される任意のソフトウェアを使用することができる。具体的なフローサイトメトリー用ソフトウェアとしては、例えば、FCS Express（De Novo Software社）、BD FACSDivaTM（ベクトン・ディッキンソン社）、BD AccuriTM（ベクトン・ディッキンソン社）、FlowJoTM（ベクトン・ディッキンソン社）、Kaluza（Beckman Coulter社）、NovoExpress（Agilent社）、Forecyt(登録商標)（Saltorius社）、Attune NxT（Thermo Fisher社）等が挙げられるが、これらに限定されない。これらのソフトウェアは、確認ステップ、参照量取得ステップ、設定ステップ、測定工程、抽出工程等においても使用することができる。データの除外処理や後述する抽出を行う際にこれらのソフトウェアを用いてゲートを設定することができるが、その際のゲート設定の基準は特に限定しない。
（５）設定ステップS0114
　本ステップは、参照量解析ステップの結果に基づいて、被験ポリペプチドの発現量についての参照範囲を設定するステップである（図５中(5)）。
　本明細書における「参照範囲」とは、後述の抽出工程において用いる被験発現量の範囲であり、本工程で被験ポリペプチドの発現量について設定される。被験ポリペプチドの発現量として、確認ステップにて上述した被験ポリペプチドの発現と共役した標識タンパク質の発現量等を使用することができる。
　参照範囲は、参照量解析ステップから得られたデータ（解析データ）に基づいて、発現細胞群における被験ポリペプチドの発現量値の分布範囲内に設定される。設定される具体的な範囲は特に限定せず、上述の分布範囲内の任意の位置に設定することができる。参照範囲に含まれる被験ポリペプチドの発現量値が後述の関係式導出工程での高次構造形成値の算出に用いることができる発現量値となるような範囲（例えば、測定工程において後述する被験発現量と被験提示量の関係が所定の関係式（一次式や高次式を含む）に従う範囲、測定値に一定の定量性が認められる範囲（機器の検出可能範囲等））等であればよく、設定する基準は特に限定しない。この際の解析データの処理方法は特に限定しないが、例えば、参照量解析ステップにて上述した各種ソフトウェアを用いて行うことができる。
　参照範囲を設定する方法は特に限定しない。例えば、被験ポリペプチドの発現量の具体的な値を用いて設定することができる。その際に使用される具体的な値は実験により得られる知見や測定工程での結果等によって適宜選択することができる。
　参照範囲の設定に用いる解析データの個数は特に限定しない。例えば、1個であっても、複数個であってもよい。また、解析データは細胞のデータであっても、標識粒子等の標識試薬をはじめとする非細胞粒子を使用したデータであっても、その組合せであってもよい。例えば、予め定めた実験条件で作成した参照用の細胞群の解析データを参照範囲設定に用いることができる。また例えば、細胞のデータを用いる場合と同等の発現量値を示すように人工的に加工した標識粒子等の非細胞粒子のデータを、参照範囲設定に用いることができる。
　参照範囲の設定に用いる解析データを選択する基準は特に限定しない。実験条件や測定工程での結果に基づく任意の基準を満たす解析データを用いることができ、ここで使用される具体的な基準は特に限定しない。
　解析データを選択する基準として、例えば、被験ポリペプチドの発現量又はそれと関連する任意の指標を用いることができる。この場合に使用される具体的な指標は特に限定しない。例えば、非発現細胞群と発現細胞群の被験ポリペプチドの発現量値の違いを反映する指標や、被験ポリペプチドの遺伝子の導入効率を反映する指標、例えば、被験ポリペプチドを発現する細胞の割合（発現細胞の割合）を指標として用いることができる。発現細胞の割合は、解析データの細胞総数に対する発現細胞群の細胞数の割合として算出することができる。
　発現細胞の割合を基準として用いる場合の具体的な方法は特に限定しない。例えば、この割合が所定の割合である解析データを参照範囲設定に用いる解析データとして選択することができる。
　所定の割合の具体的な値は特に限定しない。細胞の種類や発現の有無を判断する指標、遺伝子導入の方法等の条件に応じて適宜選択することができる。例えば、1％～90％、10％～90％、15％～80％、15％～60％、15％～50％、20％～80％、20％～60％、20％～50％、25％～80％、25％～60％、25％～50％、25％～35％、27％～33％等を所定の割合とすることができる。
　所定の割合の設定方法は特に限定しない。例えば、遺伝子導入に使用する方法の一般的な導入効率及び使用する細胞種の特性等の情報に基づいて設定してもよく、実際に実験することで得られた知見に基づいて設定してもよい。
　所定の割合は複数種類であってもよい。例えば、複数種類の所定の割合に基づいて参照範囲を設定し、測定工程以降を行うことでそれぞれの参照範囲に基づく結果を得て、その中から適切な結果を選択することができる。
　所定の割合を基準として選択した解析データを用いて、所定の設定方法となるように参照範囲を設定する場合、所定の設定方法の具体的な内容は特に限定しない。例えば、解析データにおける発現細胞群の被験ポリペプチドの発現量の下限値、上限値を参照範囲の数値範囲とすることができる。また、例えば、解析データの発現細胞群の密度プロットのパーセンタイル表示（色別の表示又は等高線表示等）を用いて、所定のパーセンタイル値の等高線（パーセンタイル等高線）に対応する被験ポリペプチドの発現量の数値を参照範囲の設定に用いることができる。
　ここで、パーセンタイル等高線とは、例えば、細胞の分布図において全体に対する割合（パーセンタイル値）を表示する細胞密度の等高線である。パーセンタイル等高線に基づく設定方法では、例えば、発現細胞群の単峰性の密度プロットにおける所定の値のパーセンタイル等高線を指標として、参照範囲の下限及び上限を決定することができる。例えば、発現細胞群の単峰性分布を、横軸を被験ポリペプチドの発現量、縦軸を被験ポリペプチドの提示量とした密度プロット（パーセンタイル等高線表示）を用いて表示し、参照範囲の下限を規定するためのパーセンタイル等高線（第1のパーセンタイル等高線）及び上限を規定するためのパーセンタイル等高線（第2のパーセンタイル等高線）を選択し、第1のパーセンタイル等高線に対応する被験ポリペプチドの発現量の最低値を参照範囲の下限とし、第2のパーセンタイル等高線に対応する被験ポリペプチドの発現量の最高値を参照範囲の上限とすることができる。この場合の第1及び第2のパーセンタイル等高線のパーセンタイル値は同一でも互いに異なってもよく、特に限定しない。第2のパーセンタイル等高線のパーセンタイル値は第1のパーセンタイル等高線のパーセンタイル値より低値とすることができる。第1のパーセンタイル等高線のパーセンタイル値は、例えば、1パーセンタイル、20パーセンタイル、40パーセンタイル、50パーセンタイル、60パーセンタイル、70パーセンタイル、75パーセンタイル、80パーセンタイル等とすることができる。第2のパーセンタイル等高線のパーセンタイル値は、例えば、80パーセンタイル、60パーセンタイル、40パーセンタイル、30パーセンタイル、20パーセンタイル、10パーセンタイル、5パーセンタイル、1パーセンタイル等とすることができる。第1及び第2のパーセンタイル等高線のパーセンタイル値の組合せとして、例えば、60パーセンタイルと20パーセンタイル、60パーセンタイルと10パーセンタイル、60パーセンタイルと1パーセンタイル、80パーセンタイルと20パーセンタイル、80パーセンタイルと10パーセンタイル、80パーセンタイルと1パーセンタイル等とすることができるが、細胞集団の密度分布の様子（等高線の密度）、発現細胞群と非発現細胞群との分離の程度、所定の割合の具体的な値等に応じて任意のパーセンタイル値の組合せとすることができる。
　参照範囲は実験条件毎又は実験回毎に設定することができる。例えば、使用する細胞の種類や被験ポリペプチドを検出する方法等の実験条件が複数種類ある場合、測定機器の検出感度が実験回毎に変動する場合、又は機器（機種）間の検出感度が異なる場合は、実験条件毎、実験回毎、又は測定機器（機種）毎に、所定の基準と所定の方法を用いて設定した被験ポリペプチドの発現量の範囲を参照範囲として使用することができる。この場合に用いる参照範囲の設定方法は、実験条件、実験回、又は測定機器（機種）等によって差異を生じうる要素（例えば測定機器の検出感度等）の影響を受けない方法であることが好ましい。また例えば、同じ実験条件で行う場合であって、測定機器の実験回毎又は機器（機種）間の検出感度の違いがない又は無視できる程度である場合は、その実験条件について予め設定された参照範囲を、他の実験回、又は異なる測定機器（機種）を用いた測定での抽出工程にそのまま適用することができる。
　なお、本発明の方法の抽出工程では、後述の測定工程で分取し測定された細胞群における被験発現量の数値分布にかかわらず、本工程で設定され被験ポリペプチドの発現量の数値範囲として規定された参照範囲が適用される。
　本工程において設定された参照範囲は、後の測定や実験に適した細胞試料を選択するために使用してもよい。この場合、例えば、発現工程及び参照範囲設定工程を、細胞試料の品質を評価する方法の一部分として使用することができる。この場合、発現工程にて複数の細胞において検出用ポリペプチドを発現させ、参照範囲設定工程にて検出用ポリペプチドの発現量についての参照範囲を設定した上で、細胞試料において発現する検出用ポリペプチドの発現量を測定し、発現量が参照範囲内にある細胞の割合が一定の範囲にある場合に細胞試料の品質が良いと評価される。この場合の検出用ポリペプチドは遺伝子導入の効率を反映する検出可能なタンパク質等であれば特に限定しない。例えば、上述の標識タンパク質を含むタンパク質を使用することができる。また例えば、発現量として検出用ポリペプチドの存在量を直接測定する代わりに、検出用ポリペプチドをコードする核酸の存在量を測定してもよい。この方法における評価の方法は特に限定しないが、例えば、抽出工程にて例示する参照範囲を利用した除外方法に準じて行うことができる。
１－３－３．測定工程S0103
　「測定工程」は必須工程であり、測定用に分取した細胞群において、被験発現量及び被験提示量を測定する工程である。本工程は発現工程と同時に又はその後に行うことができる。また本工程は参照範囲設定工程と同時に又は別々に行うことができる。
　本工程を参照範囲設定工程と同時に行う場合、例えば、全ての細胞について被験発現量及び被験提示量を測定すると共に、そのうちの一部の細胞を参照用として扱うことで参照範囲設定工程に使用することができる。また、例えば、本工程を参照範囲設定工程と別々に行う場合、本工程を参照範囲設定工程の後に行ってもよく、本工程の後に参照範囲設定工程を行ってもよく、両工程の一部が同時に行われてもよい。
　本工程は、測定細胞分取ステップ、発現量測定ステップ、及び提示量測定ステップを含む。
　まず、図６Ａを参照して本工程の概要を説明する。
　本工程ではまず、複数の細胞を測定用の細胞群として分取する（図６Ａ中(1)）。その上で、測定用の細胞群において、被験ポリペプチドの発現量を測定し、その発現量のデータを「被験発現量」として取得する（図６Ａ中(2)）と共に、細胞膜上に存在する被験ポリペプチドの量を測定し、その量のデータを「被験提示量」として取得する（図６Ａ中(3)）。本工程で得られた被験発現量及び被験提示量のデータは、参照範囲設定工程にて設定された参照範囲を用いて抽出工程に使用される。
　各ステップについて以下に説明する。
（１）測定細胞分取ステップS0115
　本ステップは、複数の細胞を測定用の細胞群として分取するステップである（図６Ａ中(1)）。
　本工程の基本的な内容は参照範囲設定工程の参照細胞分取ステップの記載に準ずる。そのため、ここでは参照細胞分取ステップとの相違点についてのみ記載する。
　測定用の細胞群を分取する方法及び基準は特に限定しない。目的に応じて、特定の基準を満たす細胞のみを分取することができる。この場合の基準は特に限定しない。
　参照用の細胞群と測定用の細胞群の培養条件及び遺伝子導入条件は、好ましくは同一である。例えば、参照用の細胞群と測定用の細胞群は、同一の条件で遺伝子導入され、同一の培養条件にて培養された同一種類の細胞等の同一の性質を有する細胞で構成される。参照用の細胞群と測定用の細胞群として、例えば、同じ培養容器から分取した細胞群を使用することができる。
　分取される細胞の数は特に限定しない。例えば、500細胞以上、800細胞以上、1,000細胞以上、1,500細胞以上、2,000細胞以上、3,000細胞以上、5,000細胞以上、7,000細胞以上、10,000細胞以上、15,000細胞以上、20,000細胞以上、25,000細胞以上、30,000細胞以上、50,000細胞以上を分取することができる。例えば、使用する細胞株や細胞種の形態が均一である場合は500細胞以上を分取することができる。また、測定値のばらつきを少なくしたい場合には30,000細胞以上を分取することができる。
　複数の細胞群を分取してもよい。その場合の細胞群の数は特に限定しない。
（２）発現量測定ステップS0116
　本ステップは、測定用の細胞群において、被験ポリペプチドの発現量を測定し、被験発現量として取得するステップである（図６Ａ中(2)）。本ステップは測定細胞分取ステップと同時に又はその後に行うことができる。
　本ステップの内容は参照範囲設定工程の参照量取得ステップの記載に準ずる。そのため、ここでの詳細な説明は省略する。参照量取得ステップとは異なり、本ステップでは、被験ポリペプチドの発現量を「被験発現量」と称して取得する。
　本ステップは、参照量取得ステップと同一の方法及び測定機器を用いて実施することが好ましい。
（３）提示量測定ステップS0117
　本ステップは、測定用の細胞群において、細胞膜上に存在する被験ポリペプチドの量を測定し、被験提示量として取得するステップである（図６Ａ中(3)）。本ステップは測定細胞分取ステップと同時に又はその後に行うことができる。本ステップは発現量測定ステップと同時に又は別々に行うことができる。
　本ステップは、発現量測定ステップにて測定された細胞全てに対して行ってもよく、その一部に対して行ってもよい。例えば、発現量測定ステップにて測定された被験発現量が一定水準を満たす場合のみ本ステップでの測定を行うことができる。この場合の水準は特に限定しない。例えば、被験発現量が参照範囲に含まれるか否かに基づいて判断してもよい。
　本ステップは発現量測定ステップと同様に行うことができるが、本ステップでは細胞膜上に存在する被験ポリペプチドの量が定量的に測定され、「被験提示量」と称して取得される。そのため、測定方法及び指標としては細胞膜上に存在するか否かを判断可能な程度にポリペプチドの細胞内局在を検出可能なものが使用される。
　指標は細胞膜上に存在するポリペプチドと細胞質内に存在するポリペプチドを区別して検出可能な指標であれば特に限定しない。例えば、細胞表面抗原を検出する結合分子の標識の量、細胞膜上に存在する被験ポリペプチドを区別して検出する結合分子の標識の量、細胞膜上の被験ポリペプチドの活性（酵素活性等）の量、細胞膜画分における被験ポリペプチドの量、被験ポリペプチドと会合した場合を区別して検出可能な対象ポリペプチドに結合した標識の量等を指標として使用することができる。
　結合分子を使用する場合、その結合分子の量が細胞膜上の被験ポリペプチドの量を反映するものであれば、その具体的な結合対象は特に限定しない。例えば、被験ポリペプチドの一部、多量体の一部、対象ポリペプチドの一部等が挙げられるが特に限定しない。例えば、被験ポリペプチドの一部（細胞外ドメイン等）に結合可能な結合分子を好適に使用することができる。
　使用される標識は特に限定しない。例えば、確認ステップに関して上述した標識を使用することができる。本ステップにおいて検出される標識は、発現量測定ステップにおいて検出される標識と区別して検出可能な標識、例えば、発現量測定ステップにおいて検出される標識と異なる標識であることが好ましい。
　検出方法は使用する標識に応じて適宜選択すればよい。例えば、参照範囲設定工程において記載した任意の方法を使用することができる。好ましくは、本ステップは、発現量測定ステップと同じ検出方法及び測定機器を用いて実施される。
　1回の参照範囲設定工程に対して、本工程、抽出工程、関係式導出工程及び多量体形成値取得工程のいずれか一以上が2回以上実施されてもよい。この場合、測定対象となる被験ポリペプチド及び／又は対象ポリペプチドは毎回異なっていても、複数回で共通していてもよい。本工程が反復して行われる場合は、参照範囲設定工程と反復される本工程で使用される試料に関し、遺伝子導入の方法や条件、発現工程の条件は共通していることが好ましい。反復が行われる場合、本工程、抽出工程及び関係式導出工程のいずれか一以上を、参照量取得ステップで測定された細胞と同じ処理（例えば、アイソタイプコントロール抗体による処理）がなされた細胞群においても行うことができる。
１－３－４．抽出工程S0104
　「抽出工程」は、被験発現量が参照範囲内にある細胞について、被験発現量及び被験提示量の情報を抽出する工程である。本工程は測定工程と同時に又はその後に行うことができる。本明細書において「抽出」とは、データの一部を分離し次の解析に供する操作を指す。
　例えば、参照範囲に従った検出範囲を測定機器上に設定すること等により、本工程を測定工程と同時に行うことができる。
　抽出方法は特に限定しない。例えば、被験発現量が参照範囲内にある全ての細胞について被験発現量及び被験提示量の情報を抽出してもよく、その一部の細胞についてのデータのみを抽出してもよい。
　例えば、追加で任意の基準に従ってデータを抽出する細胞を決定することができる。この場合に用いられる基準は特に限定しない。例えば、参照量取得ステップ及び参照量解析ステップに関して記載した基準を用いることができる。例えば、被験発現量又は/及び被験提示量が、発現細胞群の分布領域から解離した細胞のデータを除外することができる。測定工程が反復して行われた場合、本工程での抽出に供する細胞を決定するための基準としては、共通のものを使用することが好ましい。
　例えば、関係式導出工程において後述するように参照範囲を分割した区画毎の値に基づいて関係式を導出する場合、各区画に含まれる細胞数が一定以下である細胞試料を抽出工程の対象から除外することができる。その細胞数は特に限定しないが、例えば、各区画に含まれる細胞数として後述する細胞数に満たない場合に除外することができる。
　関係式導出工程において後述するように参照範囲を分割した区画毎の値に基づいて関係式を導出する場合に、各区画に含まれる細胞数の区画間の比率が一定の条件を満たさない細胞試料を抽出工程の対象から除外してもよい。具体的な条件は特に限定しないが、例えば、被験発現量が比較的低い区画（低発現の区画）に含まれる細胞数が、被験発現量が比較的高い区画（高発現の区画）と比べ、顕著に多い傾向となるように細胞が分布している細胞試料のデータ、又は被験発現量が比較的高い区画（高発現の区画）に含まれる細胞数が、被験発現量が比較的低い区画（低発現の区画）と比べ、顕著に多い傾向となるように細胞が分布している細胞試料のデータを抽出工程の対象から除外することができる。比率の具体的な値は特に限定しない。例えば、低発現の区画の細胞数が高発現の区画の細胞数より著しく多い細胞試料（2つの区画の細胞数の比率（低発現の区画/高発現の区画）が2倍より大きい、4倍より大きい、8倍より大きい、20倍より大きい、40倍より大きい等）を除外することができる。また、例えば、低発現の区画の細胞数が高発現の区画の細胞数より著しく少ない細胞試料（2つの区画の細胞数の比率（低発現の区画/高発現の区画）が0.3倍以下、0.4倍以下、0.5倍以下、0.6倍以下、0.9倍以下等）を除外することができる。例えば、参照範囲が3以上の区画に分割される場合、2つの区画の組合せの全て又は一部について各区画の細胞数の比率に基づく条件を設定することができる。
１－３－５．関係式導出工程S0105
　「関係式導出工程」は、抽出された前記情報から、被験発現量と被験提示量の関係式を導出する工程である。本工程は抽出工程と同時に又はその後に行うことができる。
　関係式の種類は、被験発現量と被験提示量の間の関係を反映したものであれば特に限定しない。例えば、関係式は、被験発現量を説明変数の1つとし、被験提示量を目的変数とする関係式である。なお、説明変数と目的変数を逆にした関係式も同様に使用することができる。
　例えば、関係式の次数は特に限定しない。例えば、一次式であっても、二次式であっても、三次式であっても、それ以上の次数を有する式であってもよい。あるいは、累乗根等を含む、次数が一以下の式であってもよく、又は次数が負の分数式であってもよい。
　また、関係式は、関数式の組合せによって構成されてもよい。この場合の関数式としては、例えば、一次関数式、二次関数式、三次関数式、四次関数式、三角関数式、指数関数式、対数関数式及びこれらの組合せ等が挙げられる。
　好ましくは、関係式は関数式である、つまり、説明変数の各値に対応する目的変数の値が最大で1つである。
　関係式としては、例えば、一般に広く使用される公知の数式を使用することができる。このような数式としては、一次関数、ミカエリス・メンテン式、ヒルの式、ロジスティック式、双曲線正接関数式、ゴンペルツ関数式、逆正接関数式、グーデルマン関数式等のシグモイド関数式の他、飽和曲線の式等が挙げられる。例えば、一次式を好適な関係式として使用することができる。
　また、関係式としては、参照範囲内の複数の定義域毎に異なる式で表される式を使用することができる。例えば、被験発現量が低い定義域では被験提示量が単調増加する式で表され、被験発現量が一定値以上の定義域では被験提示量が特定の値となるか、特定の値に漸近する式で表される数式を使用することができる。
　導出方法は、被験発現量と被験提示量の間の関係を反映した関係式を導出可能であれば特に限定しない。例えば、単回帰分析に一般に使用される任意の方法を使用することができる。具体的には、最小二乗法、最尤法、ファジィロバスト回帰等を使用することができる。
　例えば、先に関係式の種類を決定し、その係数や定数項等を確定するような導出方法であってもよく、被験発現量と被験提示量の具体的なデータによって関係式の種類が変わり得る導出方法であってもよい。
　導出は、抽出された情報を全て一度に扱って行ってもよく、その一部ずつに分離して扱って行ってもよい。例えば、参照範囲を被験ポリペプチドの発現量について複数の区画に分割して各区画に分離した被験発現量及び被験提示量を数値化し、その数値に基づいて関係式を導出することができる。具体的には、例えば、各区画における被験発現量の平均値（又は中央値）及び被験提示量の平均値（又は中央値）を算出し、それらの算出値に対して回帰分析を行うことにより、簡便に関係式の導出を行うことができる。回帰分析は、算出値に加えて被験発現量及び被験提示量がいずれも0である値を含むデータに基づいて実施することができる。
　この場合の区画の数は特に限定しない。例えば、2以上、3以上、4以上の区画に分離することができる。また、分離の方法は特に限定しない。例えば、被験ポリペプチドの発現量について等分割するゲートを用いて分離してもよく、不均等に分割するゲートを用いて分離してもよい。
　個々の区画に含まれる細胞数は特に限定しない。例えば、各区画が50細胞以上、100細胞以上、500細胞以上、1,000細胞以上、2,000細胞以上、5,000細胞以上、7,000細胞以上、10,000細胞以上含むことができる。例えば、使用する細胞株や細胞種の形態が均一である場合は各区画に50細胞以上含むことができる。また、各区画の平均値（又は中央値）のばらつきを少なくしたい場合には各区画に10,000細胞以上含むことができる。
　参照範囲を複数の区画に分割した場合、その全区画又は一部の区画を関係式の導出に使用することができる。一部の区画が関係式の導出に使用される場合、使用される区画の数は任意の方法で決定することができる。例えば、使用する区画の選択は、各区画に含まれる細胞数についての基準又は各区画に含まれる細胞数の区画間の関係についての基準に基づいて行うことができる。あるいは、2以上の区画の組合せを使用した関係式を複数導出し、一定の基準に従いそのうちの1つの関係式を多量体形成値の算出に使用してもよい。例えば、2以上の区画の組合せとして想定される全ての組合せのそれぞれを使用した関係式を導出し、そのうちの1つの関係式を多量体形成値の算出に使用することができる。この場合の基準は特に限定しないが、例えば、導出された複数の関係式のうち多量体形成値の値が最も大きくなるように関係式を選択することができる。複数の区画の組合せについて関係式を導出する場合、それぞれの導出方法は互いに同一であることが好ましい。
　測定工程が反復して行われた場合、本工程で使用される関係式の種類や導出方法等は、共通のものを使用することが好ましい。
１－３－６．多量体形成値取得工程S0106
　「多量体形成値取得工程」は、関係式から多量体形成値を取得する工程である。本工程は関係式導出工程と同時に又はその後に行うことができる。
　多量体形成値の取得方法は関係式に基づいており、被験ポリペプチドの細胞膜上への移行のしやすさと相関する値を取得可能であれば特に限定しない。
　例えば、関係式の導関数に基づいて多量体形成値を算出することができる。関係式が多項式である場合は、例えば1以上の項の係数に基づいて多量体形成値を算出することができる。この場合の係数は、好ましくは被験発現量を変数とする項の係数である。被験発現量を変数とする項が複数存在する場合は、そのいずれか1以上の項の係数を使用することができる。例えば、関係式が被験発現量を変数とする一次式である場合、多量体形成値として被験発現量の係数を使用することができる。
　多量体形成値を係数から算出する際に任意の演算処理を行うことができる。この場合の演算処理は特に限定しないが、例えば、係数に対する四則演算、累乗、累乗根及びこれらの組合せ等が挙げられる。
　例えば、測定工程においてコントロール処理等（参照量取得ステップで測定された細胞に行った処理等）がなされた細胞群についての測定も実施した場合、それらの細胞群から得られた多量体形成値との比較結果を、多量体形成値として使用することができる。この場合の比較方法は特に限定しない。例えば、差や商をとること等が挙げられる。この場合、比較する多量体形成値は互いに共通の方法で算出されることが好ましい。
　好ましくは、多量体形成値は公知の多量体形成能の指標のいずれか1つ以上と相関する。公知の多量体形成能の指標としては、例えば、IC50値、EC50値、解離定数（KD）等が挙げられる。この場合の相関の程度は特に限定しない。具体的には、例えば、相関係数が0.2以上、0.3以上、0.4以上、0.5以上、0.6以上、0.7以上、0.8以上であればよく、又は有意な相関であればよい。
　本発明の方法は被験ポリペプチドと対象ポリペプチドの異なる組合せを用いて複数回実施することができる。この場合の被験ポリペプチドと対象ポリペプチドの組合せは特に限定しない。例えば、複数の条件下で本発明の方法を複数回ずつ実施する場合に、条件間で被験ポリペプチドと対象ポリペプチドの1以上の組合せを共通させることができる。
１－４．効果
　本態様の方法によれば、フローサイトメトリー等により細胞の発現解析を行うのと同等の労力により、多量体のサブユニット間の相互作用の強さを反映した指標（多量体形成値）を簡便に取得することができる。また、例えば、細胞数や遺伝子導入量を変えた複数の細胞試料について繰り返し測定を行う等、複数の条件についての測定を行うことなく、多量体形成値を算出することができる。本態様の方法により算出される多量体形成値は、使用する検出機器（機種）が異なる場合であっても同等の数値が得られ、機器（機種）間や施設間で比較することが可能である。
２．被験リガンドの結合能を測定する方法
２－１．概要
　本発明の第２の態様は多量体型受容体と被験リガンドの結合能を測定する方法である。本態様の方法は、対照値測定工程、被験値測定工程及び算出工程を必須工程として含む。
２－２．工程
２－２－１．対照値測定工程
　「対照値測定工程」は必須工程であり、第１態様に記載の方法に従って多量体形成値を測定し、対照値として取得する工程である。
　本工程の基本的な内容は第１態様の記載に準ずる。そのため、ここでは第１態様との相違点についてのみ記載する。
　本工程では、被験ポリペプチドとして多量体型受容体のサブユニットと対照リガンドの融合タンパク質を使用し、対象ポリペプチドとして多量体型受容体の他のサブユニットを使用し、その多量体形成値を対照値として測定する。
　以下、各ポリペプチドについて記載する。
　被験ポリペプチドの基本的な構成は第１態様に記載の被験ポリペプチドに準ずる。被験ポリペプチドに含まれるサブユニットは膜タンパク質であってもよく、膜タンパク質でなくてもよい。好ましくは、細胞膜タンパク質等の膜タンパク質である。このような膜タンパク質としてMHCのサブユニット等が挙げられる。
　対照リガンドの構成は特に限定しないが、通常、ポリペプチドである。ポリペプチドである場合、その配列は特に限定しない。使用できるアミノ酸配列としては、例えば、低極性側鎖を有する無電荷極性アミノ酸（Asn, Gln, Ser, Thr）を含む配列、中性アミノ酸（Gly, Ile, Val, Leu, Ala, Pro）を含む配列等が挙げられる。対照リガンドのアミノ酸配列中のこれらのアミノ酸の割合は特に限定しないが、例えば、50％以上、60％以上、70％以上、80％以上、90％以上又は100％とすることができる。具体的なアミノ酸配列としては、例えば、ポリグリシン、セリンとグリシンの混合配列、アラニンとグリシンの混合配列等が挙げられる。
　対照リガンドの大きさは特に限定しないが、好ましくは被験リガンドと同等の大きさを有する。例えば、対照リガンドのアミノ酸数は被験リガンドのアミノ酸数と15個以下、10個以下、6個以下、5個以下、4個以下、2個以下又は1個異なるか、対照リガンドは被験リガンドのアミノ酸数と同じ数のアミノ酸で構成される。また、例えば、被験リガンドとして使用するポリペプチドが複数種類ある場合、そのポリペプチドのアミノ酸数の平均値（又は中央値）と数個以下、2個以下又は1個異なるか、それと同じ数のアミノ酸で構成される。あるいは、例えば、目的の受容体に結合することが公知のポリペプチドが複数種類存在する場合、被験リガンドはその公知のポリペプチドのアミノ酸数の平均値（又は中央値）と同じ数のアミノ酸、もしくはそれと数個以下、2個以下又は1個異なる数のアミノ酸で構成される。例えば、目的の受容体がMHCクラスIである場合、対照リガンドの長さを、例えば8～13アミノ酸、8～11アミノ酸、8～10アミノ酸、8アミノ酸又は9アミノ酸とすることができる。また、例えば、目的の受容体がMHCクラスIIである場合、対照リガンドの長さを、例えば8～40アミノ酸、8～33アミノ酸、8～30アミノ酸、8～25アミノ酸、8～24アミノ酸、8～20アミノ酸、8～18アミノ酸、8～17アミノ酸、8～16アミノ酸、9～15アミノ酸、11～15アミノ酸又は15アミノ酸とすることができる。例えば、目的の受容体がMHCクラスIIである場合の対照リガンドとして、例えば、上記アミノ酸数のポリグリシンやセリンとグリシンの混合配列、具体的には、例えば、9アミノ酸で構成されるポリグリシン（配列番号１）、12アミノ酸で構成されるポリグリシン（配列番号２）、15アミノ酸で構成されるポリグリシン（配列番号３）、12アミノ酸で構成されるセリンとグリシンの混合配列（配列番号４）等を使用することができる。
　また例えば、目的とする受容体についての低結合性、低機能性、又は低活性型リガンド等を対照リガンドとすることができる。例えば、受容体がMHCである場合、任意の内在性タンパク質に由来するペプチド（例えば目的の受容体がMHCクラスIIである場合、インバリアント鎖（CD74）に由来するペプチド）を対照リガンドとして用いることができる。
　融合タンパク質中で、対照リガンドとサブユニットは直接連結していてもよく、リンカーを介して連結していてもよい。好ましくは、対照リガンドとサブユニットはリンカーを介して連結している。
　使用されるリンカーの種類は特に限定されず、公知の任意のリンカーを使用することができる。例えば、細胞内環境及び／又は細胞外環境において切断可能なリンカー、それらの環境において切断されないリンカー、及びそれらの組合せのいずれも使用することができる。本明細書におけるリンカーは、化学リンカー（例えば、ジスルフィドリンカー及びマレイミドリンカー等）であってもペプチドリンカーであってもよいが、好ましくはペプチドリンカーである。具体的には、例えば1～50個、5～40個、5～30個、5～25個、好ましくは10～20個のアミノ酸残基からなるペプチドリンカー、例えば、グリシンとセリンから構成されるGSリンカーやGGSリンカー等を好適に使用することができる。GSリンカーはGGGGSで示されるアミノ酸配列を1～複数個、例えば、2～8個、3～6個含む。一方、GGSリンカーは、GGSを1～複数個、例えば、2～6個又は2～4個含む。リンカーは、グリシン及びセリン以外のアミノ酸残基を含んでもよい。切断可能なリンカーを使用する場合、その種類は特に限定しない。例えば、切断可能であることが公知の任意のリンカーを使用してもよく、LVGRPS（配列番号５）及び／又はIEGR（配列番号６）等のプロテアーゼ切断部位を公知の任意のリンカーと組み合わせることにより、リンカー部分が切断可能なように設計してもよい。
　融合タンパク質は、対照リガンドをコードする遺伝子と被験ポリペプチドに含まれるサブユニットをコードする遺伝子が融合した融合遺伝子によってコードすることができる。その具体的な構成は特に限定しない。
　本工程で使用される対象ポリペプチドには、被験ポリペプチドに含まれるサブユニットと共に多量体型受容体を構成するサブユニットが含まれる。対象ポリペプチドに係るその他の構成は第１態様の記載に準ずる。
　本態様の方法を複数回行い、同一の多量体型受容体に関して複数種類のリガンドについてリガンド結合値を算出する場合、各算出に使用される対照リガンド及びリンカーはその度毎に異なっても、複数回の算出において同じであってもよい。好ましくは、対照リガンド及びリンカーは共通のものが使用される。
２－２－２．被験値測定工程
　「被験値測定工程」は必須工程であり、第１態様に記載の方法に従って多量体形成値を測定し、被験値として取得する工程である。本工程は対照値測定工程と同時に又は別々に行うことができる。
　本工程では、被験ポリペプチドとして多量体型受容体のサブユニットと被験リガンドの融合タンパク質を使用し、対象ポリペプチドとして多量体型受容体の他のサブユニットを使用し、その多量体形成値を被験値として測定する。
　本工程では、使用される被験ポリペプチドが、リガンドとして被験リガンドを含む融合タンパク質であること以外は対照値測定工程に準じて行うことができる。本工程は、好ましくは、使用されるリガンド以外は対照値測定工程と条件（被験ポリペプチド及び対象ポリペプチドに含まれるサブユニット並びに細胞の種類等を含む）を揃えて実施される。
　被験リガンドは、多量体型受容体への結合能が本態様の方法で測定されるリガンドである。そのため、被験リガンドの種類は特に限定されず、目的に応じて適宜選択することができる。多量体型受容体への結合が知られている分子であっても、多量体型受容体への結合の有無が不明な分子であってもよい。例えば、ペプチドリガンドが使用される。
２－２－３．算出工程
　「算出工程」は必須工程であり、得られた対照値及び被験値に基づいて、被験リガンドのリガンド結合値を算出する工程である。本工程は被験値測定工程と同時に又は別々に行うことができる。
　リガンド結合値は被験リガンドの多量体型受容体への結合能を示す数値である。リガンド結合値の具体的な算出方法は、被験値と対照値に基づいた方法であれば特に限定しない。例えば、多量体形成値取得工程と同様に、被験値と対照値に関して任意の演算処理を行うことによりリガンド結合値を算出することができる。
　例えば、リガンド結合値として、被験値と対照値の比に基づく値又は被験値と対照値の差に基づく値を使用することができる。必要に応じてさらなる演算処理を行ってもよい。
２－３．効果
　本態様の方法によれば、多量体型受容体とリガンドの結合能に関する指標（リガンド結合値）を、測定機器（機種）や施設間の互換性が高い形で精度よく算出することができる。
　例えば、被験値の対照値に対する比に基づく値によれば、各測定値にばらつきが生じやすい場合であっても、そのようなばらつきの影響を受けにくい比率として結合能の指標を得ることができる。また、例えば、被験値と対照値の差に基づく値によれば、結合能に伴う細胞膜への移行の変化量が小さい場合であっても、その違いを明確に判別可能な結合能の指標を得ることができる。
３．立体構造形成能等を測定する方法
３－１．概要
　本発明の第３の態様は立体構造形成能等を測定する方法である。立体構造形成能の測定方法として実施する場合は、本態様の方法は、発現工程、参照範囲設定工程、測定工程、抽出工程、関係式導出工程及び立体構造形成値取得工程を必須工程として含む。また、細胞膜局在性維持能の測定方法として実施する場合は、本態様の方法は、発現工程、参照範囲設定工程、測定工程、抽出工程、関係式導出工程及び細胞膜局在値取得工程を必須工程として含む。本態様の方法によれば、細胞における被験ポリペプチドの立体構造形成能や細胞膜局在性維持能を測定することができる。
３－２．工程
３－２－１．発現工程
　「発現工程」は必須工程であり、被験ポリペプチドを複数の細胞に発現させる工程である。本工程は、立体構造形成能の測定方法及び細胞膜局在性維持能の測定方法のいずれにおいても必須工程である。
　本工程の基本的な内容は第１態様の発現工程の記載に準ずる。そのため、ここでは第１態様との相違点についてのみ記載する。
　本工程では、被験ポリペプチドを複数の細胞に発現させる。ここで、被験ポリペプチドは細胞において細胞膜タンパク質として一過的に発現可能である。
　本態様における被験ポリペプチドは、本態様の方法により立体構造形成能や細胞膜局在性維持能が測定されるポリペプチドである。
　被験ポリペプチドの種類は特に限定しない。使用される細胞に発現する他のポリペプチドと会合可能なポリペプチドであってもよいが、使用される細胞に発現する他の細胞膜タンパク質と会合しないか、他の細胞膜タンパク質と会合することによる細胞膜上の存在量が一定値から変化しないポリペプチドであることが好ましい。
　本態様の方法における被験提示量は、被験ポリペプチドの構造安定性や細胞膜局在性に従って変化する。従って、典型的には、細胞は、被験ポリペプチドの立体構造の形成に伴って細胞膜への移行が行われるような態様で被験ポリペプチドを発現する。例えば、被験ポリペプチドが細胞膜タンパク質である場合には、被験ポリペプチドをそのまま発現させることによって細胞膜タンパク質として発現させることができる。また、被験ポリペプチドが細胞膜タンパク質以外の膜タンパク質である場合、例えば、他の細胞小器官への移行シグナル配列を小胞体移行シグナル配列で置換することにより細胞膜タンパク質として発現させることができる。また、被験ポリペプチドが膜タンパク質でない場合、第１態様に記載のように、例えば、被験ポリペプチドを細胞膜タンパク質又はその一部との融合タンパク質として発現させることにより細胞膜タンパク質として発現させることができる。この場合、本態様の方法で立体構造形成能を測定する場合、立体構造形成能を細胞膜への移行量として検出するため、被験ポリペプチドを改変した細胞膜タンパク質は、被験ポリペプチドの立体構造の形成がその細胞膜への移行に必須であるように構成されることが好ましい。一方、本態様の方法で細胞膜局在性維持能を測定する場合、被験ポリペプチドの細胞膜上への移行後における被験ポリペプチドの膜上での維持されやすさが測定される。したがって、十分量の被験ポリペプチドが膜へ移行可能なように構成されることが好ましい。例えば、被験ポリペプチドが測定対象のタンパク質の全長配列で構成され、かつ、小胞体移行シグナル配列を有し、十分量の発現、例えば、過剰発現が可能なように構成することができる。
　本態様の方法で多量体の細胞膜局在性維持能を測定する場合には、本工程で複数の前記細胞に、細胞膜タンパク質として発現可能である対象ポリペプチドを発現させることができる。この場合の対象ポリペプチドの内容、及び以降の工程における扱いについては、第１態様の記載に準ずる。
３－２－２．参照範囲設定工程
　「参照範囲設定工程」は必須工程であり、参照用に分取した細胞群から得た参照量を解析し、被験ポリペプチドの発現量についての参照範囲を設定する工程である。本工程は、立体構造形成能の測定方法及び細胞膜局在性維持能の測定方法のいずれにおいても必須工程である。本工程は発現工程と同時に又はその後に行うことができる。
　本工程は、確認ステップ、参照細胞分取ステップ、参照量取得ステップ、参照量解析ステップ及び設定ステップを含む。
　本工程の内容は第１態様の参照範囲設定工程の記載に準ずる。そのため、ここでの詳細な説明は省略する。
３－２－３．測定工程
　「測定工程」は必須工程であり、測定用に分取した細胞群において、被験ポリペプチドの被験発現量及び被験提示量を測定する工程である。本工程は、立体構造形成能の測定方法及び細胞膜局在性維持能の測定方法のいずれにおいても必須工程である。本工程は参照範囲設定工程と同時に又は別々に行うことができる。
　本工程は、測定細胞分取ステップ、発現量測定ステップ及び提示量測定ステップを含む。
　本工程の内容は第１態様の測定工程の記載に準ずる。そのため、ここでの詳細な説明は省略する。
３－２－４．抽出工程
　「抽出工程」は必須工程であり、被験発現量が参照範囲内にある細胞について、被験発現量及び被験提示量の情報を抽出する工程である。本工程は、立体構造形成能の測定方法及び細胞膜局在性維持能の測定方法のいずれにおいても必須工程である。本工程は測定工程と同時に又はその後に行うことができる。
　本工程の内容は第１態様の抽出工程の記載に準ずる。そのため、ここでの詳細な説明は省略する。
３－２－５．関係式導出工程
　「関係式導出工程」は必須工程であり、抽出された情報から、被験発現量と被験提示量の関係式を導出する工程である。本工程は、立体構造形成能の測定方法及び細胞膜局在性維持能の測定方法のいずれにおいても必須工程である。本工程は抽出工程と同時に又はその後に行うことができる。
　本工程の内容は第１態様の関係式導出工程の記載に準ずる。そのため、ここでの詳細な説明は省略する。
３－２－６．立体構造形成値取得工程
　「立体構造形成値取得工程」は、立体構造形成能の測定方法における必須工程であり、関係式から立体構造形成値を取得する工程である。細胞膜局在性維持能の測定方法においては、本工程の代わりに細胞膜局在値取得工程が必須工程として行われる。「細胞膜局在値取得工程」は、関係式から細胞膜局在値を取得する工程である。本工程は関係式導出工程と同時に又はその後に行うことができる。
　本工程の基本的な内容は第１態様の多量体形成値取得工程の記載に準ずる。そのため、ここでの詳細な説明は省略する。立体構造形成能の測定方法においては、多量体形成値ではなく立体構造形成値として値が取得され、細胞膜局在性維持能の測定方法においては、多量体形成値ではなく細胞膜局在値として値が取得される。
３－３．効果
　本態様の方法によれば、フローサイトメトリー等により細胞の発現解析をするのと同等の労力により、立体構造の形成のしやすさを反映した指標（立体構造形成値や細胞膜局在値）を簡便に取得することができる。
　また、例えば、細胞数や遺伝子導入量を変えた複数の細胞試料について繰り返し測定を行う等、複数の条件についての測定を行うことなく、立体構造形成値や細胞膜局在値を算出することができる。本態様の方法により算出される立体構造形成値や細胞膜局在値は、使用する検出機器（機種）が異なる場合であっても同等の数値が得られ、機器（機種）間で比較することが可能である。
　本態様の方法を、ホモ多量体を形成するポリペプチドに適用する場合、立体構造の形成能とホモ多量体の形成能を同時に調べることができる。また、本態様の方法を単量体型受容体のサブユニットと被験リガンドとの融合タンパク質に適用することにより、単量体型受容体とリガンドのリガンド結合能に関する指標（リガンド結合値）の算出に適用することができる。その場合に行われる処理については第２態様の記載に準ずる。
４．高次構造形成能等の変動を測定する方法
４－１．概要
　本発明の第４の態様は目的の条件による高次構造形成能等の変動を測定する方法である。本態様の方法は、対照値測定工程、処理値測定工程及び算出工程を必須工程として含む。本態様の方法を使用することにより、目的の条件による多量体形成能、立体構造形成能及び／又は細胞膜局在性維持能の変動を測定することができる。
４－２．工程
４－２－１．対照値測定工程
　「対照値測定工程」は必須工程であり、対照条件下で第１態様又は第３態様に記載の方法に従って高次構造形成能（多量体形成値立体構造形成値）や細胞膜局在性維持能（細胞膜局在値）を測定し、対照値として取得する工程である。
　本工程の基本的な内容は第１態様及び第３態様の記載に準ずる。そのため、ここでは第１態様及び第３態様との相違点についてのみ記載する。
　対照条件とは、被験ポリペプチドの高次構造形成（多量体形成及び／又は立体構造形成）や細胞膜局在性維持能への影響を対照値として測定する対象となる条件である。
　対照条件の具体的な内容は、後述する目的の条件の影響を判断可能な条件であればよく、特に限定しない。好ましくは、対照条件は目的の条件と多くの条件を共有し、本態様の方法で影響が測定される対象の条件においてのみ相違する。例えば、本態様の方法で培地の組成の影響を値の変動として測定する場合、その他の条件（例えば、細胞密度等）は共通であることが好ましい。当業者にとっては明らかであるように、対象の条件以外の条件において、測定結果に影響を与えない範囲での相違は許容される。
４－２－２．処理値測定工程
　「処理値測定工程」は必須工程であり、目的の条件下で第１態様又は第３態様に記載の方法に従って多量体形成値、立体構造形成値又は細胞膜局在値を測定し、処理値として取得する工程である。本工程は対照値測定工程と同時に又は別々に行うことができる。
　本態様における目的の条件は、被験ポリペプチドの高次構造形成（多量体形成及び／又は立体構造形成）や細胞膜局在性の維持への影響を変動値として測定する対象となる条件である。目的の条件は被験ポリペプチドの高次構造形成や細胞膜局在性の維持に影響し得る条件であればよく、その具体的な種類は特に限定しない。例えば、物質への曝露、環境への曝露等が挙げられる。
　本態様において物質への曝露の影響が測定される場合、使用される物質の種類は特に限定しない。例えば、培地添加物、薬剤、リガンド等が挙げられる。この場合、物質は、生体物質であっても、人工的に合成された化合物であっても、低分子であっても、高分子であってもよい。物質への曝露の影響が測定される場合、注目されるパラメータは特に限定しない。例えば、このようなパラメータとしては、物質の種類、濃度、添加のタイミング等が挙げられる。例えば、物質が薬剤である場合、細胞を曝露する薬剤の種類による影響を変動値として測定することができ、物質がリガンドである場合、細胞を曝露するリガンドの種類による影響を変動値として測定することができる。
　本態様において環境への曝露の影響が測定される場合、使用される環境の種類は特に限定しない。例えば、雰囲気（例えば、培地に通気される気体）の組成、培地の組成、細胞密度、pH等が挙げられる。環境への曝露の影響が測定される場合、注目されるパラメータは特に限定しない。例えば、このようなパラメータとしては、成分の種類、濃度、曝露のタイミング等が挙げられる。例えば、環境が雰囲気の組成である場合、細胞を曝露する雰囲気に含まれる成分の種類による影響を変動値として測定することができる。
　具体的な条件は条件の種類によって適宜設定することができ、特に限定しない。例えば、高次構造形成や細胞膜局在性の維持への影響が知られている条件であってもよく、そのような影響が知られていない条件であってもよい。
４－２－３．算出工程
　「算出工程」は必須工程であり、得られた対照値及び処理値に基づいて、変動値を算出する工程である。本工程は処理値測定工程と同時に又は別々に行うことができる。
　具体的には、対照値及び処理値が第１態様に記載の方法により測定された場合、本工程により、目的の条件の多量体形成に与える影響が変動値として算出される。一方、対照値及び処理値が第３態様に記載の方法により測定された場合、本工程により、目的の条件の立体構造形成や細胞膜局在性の維持に与える影響が変動値として算出される。
　「変動値」とは、対照条件と目的の条件の違いが高次構造形成や細胞膜局在性の維持に与える影響の程度を表す数値を指す。
　本工程の基本的な内容は第２態様の算出工程に準ずる。そのため、ここでは第２態様との相違点についてのみ記載する。
　本工程での算出に使用されるのは対照値と処理値である。そのため、第２態様の算出工程における被験値を処理値と読み替えて本工程を行うことができる。
　変動値の算出方法（例えば関係式等）は、目的の条件の種類や本態様の方法を行う目的等によって変更することができる。
４－３．効果
　本態様の方法によれば、物質や環境への曝露等の影響に基づく高次構造形成能や細胞膜局在性維持能の変動値を、機器（機種）や施設間の互換性が高い形で算出することができる。
　例えば、処理値の対照値に対する比に基づく値を変動値として得ることにより、各測定値にばらつきが生じやすい場合であっても、そのようなばらつきの影響を受けにくい比率として目的の条件による高次構造形成能や細胞膜局在性維持能の変動を示す指標を得ることができる。また、例えば、処理値と対照値の差に基づく値によれば、目的の条件に応じて生じる変動値の変化量が小さい場合であっても、その違いを明確に判別可能な指標を得ることができる。
　また、被験ポリペプチドとして受容体のサブユニットと被験リガンドの融合タンパク質を用いて本態様の方法を適用することにより、受容体とリガンドの相互作用による高次構造形成や細胞膜局在性の維持に対する、物質や環境への曝露等の影響を変動値として算出することができる。
５．高次構造形成条件等をスクリーニングする方法
５－１．概要
　本発明の第５の態様は高次構造形成条件等をスクリーニングする方法である。本態様の方法は、対照値測定工程、候補値測定工程及び判定工程を必須工程として含む。本態様の方法によれば、高次構造形成能（多量体形成条件及び／又は立体構造形成条件）や細胞膜局在性維持能をスクリーニングすることができる。
５－２．工程
５－２－１．対照値測定工程
　「対照値測定工程」は必須工程であり、対照条件下で第１態様又は第３態様に記載の方法に従って高次構造形成能（多量体形成値及び／又は立体構造形成値）や細胞膜局在性維持能（細胞膜局在値）を測定し、対照値として取得する工程である。
　本工程の基本的な内容は第４態様の対照値測定工程の記載に準ずる。そのため、ここでは第４態様との相違点についてのみ記載する。
　本工程において使用される対照条件は、それとの比較によって、候補条件が高次構造の形成に適した条件か否か、又は細胞膜局在性の維持に適した条件か否かを判断可能な条件である。このような対照条件の具体的な内容は特に限定しない。例えば、対象となる候補条件のスクリーニングにおいて比較対象として一般に使用される任意の条件を使用することができる。具体的には、例えば、高次構造の形成及び／又は細胞膜局在性の維持に有利にも不利にも影響しないことが判明している条件、高次構造の形成及び／又は細胞膜局在性の維持に適さないことが判明している条件、高次構造の形成及び／又は細胞膜局在性の維持に適することが判明している条件等が挙げられる。
５－２－２．候補値測定工程
　「候補値測定工程」は必須工程であり、候補条件下で第１態様又は第３態様に記載の方法に従って高次構造形成能（多量体形成値及び／又は立体構造形成値）や細胞膜局在性維持能（細胞膜局在値）を測定し、候補値として取得する工程である。本工程は対照値測定工程と同時に又は別々に行うことができる。
　本工程の内容は第４態様の処理値測定工程の記載に準ずる。そのため、ここでは第４態様との相違点についてのみ記載する。
　なお、第４態様の記載における「処理値」及び「目的の条件」は、本工程では「候補値」及び「候補条件」とそれぞれ読み替えられる。
　通常、本態様の方法における候補条件は、複数の条件を含むことができる。この場合、各条件の種類は特に限定しない。例えば、複数の条件としては、同じ種類の条件で、その程度の大きさ等（例えば、細胞を曝露する薬剤の量等）を変化させた条件を含んでもよく、また、例えば、異なる種類の条件（例えば、細胞を曝露する薬剤の種類、細胞の薬剤への曝露と、雰囲気への曝露等）を含んでもよい。
５－２－３．判定工程
　「判定工程」は必須工程であり、候補値が対照値と比較して高い場合に、候補条件が高次構造の形成及び／又は細胞膜局在性の維持に適していると判定し、及び／又は候補値が対照値と比較して低い場合に、候補条件が高次構造の形成及び／又は細胞膜局在性の維持に適していないと判定する工程である。本工程は候補値測定工程と同時に又はその後に行うことができる。
　具体的には、対照値及び候補値が第１態様に記載の方法により測定された場合、本工程により、候補条件が多量体形成に適しているか判定される。一方、対照値及び候補値が第３態様に記載の方法により測定された場合、本工程により、候補条件が立体構造形成に適しているか判定される。
　例えば、対照条件として高次構造の形成及び／又は細胞膜局在性の維持に有利にも不利にも影響しないことが判明している条件を使用した場合、候補値が対照値と比較して高い場合に、候補条件が高次構造の形成及び／又は細胞膜局在性の維持に適していると判定し、及び候補値が対照値と比較して低い場合に、候補条件が高次構造の形成及び／又は細胞膜局在性の維持に適していないと判定することができる。
　また、例えば、対照条件として高次構造の形成及び／又は細胞膜局在性の維持に適さないことが判明している条件を使用した場合、候補値が対照値と比較して低い場合に、候補条件が高次構造の形成及び／又は細胞膜局在性の維持に適していないと判定することができる。一方、対照条件として高次構造の形成及び／又は細胞膜局在性の維持に適することが判明している条件を使用した場合、候補値が対照値と比較して高い場合に、候補条件が高次構造の形成及び／又は細胞膜局在性の維持に適していると判定することができる。
　例えば、細胞膜局在性維持能として、Gタンパク質共役型受容体の内在化現象に基づく変動値を測定する場合、細胞膜局在性の維持に適していない条件がGタンパク質共役型受容体を活性化する条件であり、細胞膜局在性の維持に適している条件がGタンパク質共役型受容体を活性化しない又は不活性化する条件である。
　対照値及び候補値は本工程による判定に供される前に任意の処理を施されてもよい。その場合の処理は特に限定しないが、例えば、対照値及び候補値を第２態様に記載のリガンド結合値に変換する処理、又は第４態様に記載の変動値に変換する処理を行うことができる。その場合に行われる処理については、それぞれ第２態様及び第４態様の記載に準ずる。
　候補値と対照値の比較方法は特に限定されず、複数種類の数値の比較に使用可能な任意の公知の方法を使用することができる。例えば、数値同士の単純な比較に基づいて、カットオフ値に基づいて、又は候補値と対照値の統計学的な有意差の有無に基づいて、判定することができる。
（i）カットオフ値に基づく判定方法
　「カットオフ値に基づく判定方法」とは、候補値を所定のカットオフ値と比較して、その比較結果により判定する方法である。
　本明細書において「カットオフ値」とは、候補値を陽性、陰性に判定するための境界値をいう。ここでいう陽性とは候補条件が高次構造の形成及び／又は細胞膜局在性の維持に適していることを、また陰性とは候補条件が高次構造の形成及び／又は細胞膜局在性の維持に適していないことを示す。カットオフ値の設定方法は、統計学分野で公知の方法に従えばよく、特に限定はしない。例えば、対照値及び高次構造の形成及び／又は細胞膜局在性の維持に適していることが公知の条件下で測定された値（多量体形成値、立体構造形成値又は細胞膜局在値）を含み、その母集団が正規分布する数値群において、特定のパーセンタイル値に対応する数値をカットオフ値とすることができる。例えば、高次構造の形成及び／又は細胞膜局在性の維持に適していることが公知の条件下で測定された値のほぼ全てが、前記数値群における90パーセンタイルに相当する数値よりも高い値を示す場合、90パーセンタイルに相当する数値をカットオフ値とすることができる。このとき、候補値が、カットオフ値よりも高い場合には候補条件は陽性、すなわち候補条件が高次構造の形成及び／又は細胞膜局在性の維持に適していると判定し、逆にカットオフ値以下の場合には候補条件は陰性、すなわち候補条件が高次構造の形成及び／又は細胞膜局在性の維持に適していないと判定することができる。
（ii）統計学的な検定に基づく判定方法
　統計学的な検定に基づく判定方法は、候補値が対照値よりも統計学的に有意に高いか否かで候補条件が高次構造の形成及び／又は細胞膜局在性の維持に適しているか否かを判定する。
　本明細書において、「有意」とは、統計学的に有意であることをいう。この場合の有意水準は特に限定しない。例えば、5％、1％、0.1％等を有意水準として使用することができる。統計学的処理の検定方法は、有意差の有無を判断可能な公知の検定方法を適宜使用すればよく、特に限定しない。例えば、スチューデントのt検定、対応のあるスチューデントのt検定、ウェルチのt検定、ウィルコクソンの順位和検定、分散分析、Tukey事後検定等を用いることができるが、特に限定しない。
　統計学的な検定に基づいて候補条件が高次構造の形成及び／又は細胞膜局在性の維持に適しているか否かを判定する場合、候補値が対照値よりも有意に大きい場合、その候補条件は高次構造の形成及び／又は細胞膜局在性の維持に適していると判定する。一方、候補値と対照値の間に有意差がないか、候補値が対照値より有意に小さい場合には、その候補条件は高次構造の形成及び／又は細胞膜局在性の維持に適していないと判定することができる。あるいは、候補値と対照値の間に有意差がない場合にはその候補条件は高次構造の形成及び／又は細胞膜局在性の維持に影響しないと判断してもよい。
５－３．効果
　本態様の方法によれば、多量体形成、立体構造形成及び／又は細胞膜局在性の維持について、適した条件及び／又は適さない条件をスクリーニングすることができる。例えば、多量体型受容体としてMHCを用い、ペプチドリガンドの種類を候補条件として本態様の方法を行うことにより、ワクチン（例えば、がん及び／又は感染症に対するワクチン）として有望なペプチドリガンドを簡便かつ正確にスクリーニングすることができる。
６．高次構造形成値を算出するプログラム
６－１．概要
　本発明の第６の態様は細胞における被験ポリペプチドの高次構造形成値及び／又は細胞膜局在値を算出するプログラムである。
　このプログラムは、コンピュータに、参照範囲設定工程、抽出工程、関係式導出工程、及び高次構造形成値取得工程又は細胞膜局在値取得工程を実行させるように構成されたプログラムである。このプログラムによれば、第１態様に記載の方法及び／又は第３態様に記載の方法における情報処理を行うことができる。
　本発明のプログラムにより実行される各工程の詳細は、第１態様及び第３態様において詳述した通りである。
　このプログラムは、参照範囲設定工程として、参照量取得ステップ、参照量解析ステップ及び設定ステップを実行させるように構成される。
　ユーザが適当な細胞群のデータの分離を求める場合には、さらに確認ステップ及び参照細胞分離ステップをコンピュータに実行させるように構成される。工程の詳細は、基本的に、第１態様及び第３態様において確認ステップ及び参照細胞分取ステップとしてそれぞれ詳述した通りである。
　参照細胞分離ステップは、被験ポリペプチドの発現細胞を含む細胞群のデータを参照用として取得するステップである。このステップでは、参照細胞分取ステップと異なり、データ上又はデータセット上で適当な細胞群のデータを分離する。
　ここで、確認ステップ及び参照細胞分離ステップを実行させるか否かは、ユーザが既に第１態様又は第３態様に記載の確認ステップ及び／又は参照細胞分取ステップを実施しているか否か等によって選択される。確認ステップ及び／又は参照細胞分離ステップの要否は、例えば、ユーザがそれを要求するか否かに従う。あるいは、処理対象のデータの種類に従って選択されるように構成されてもよい。また、参照量取得ステップ、参照量解析ステップ及び／又は設定ステップの要否や使用する基準等のパラメータもまた、処理対象のデータの種類に従って選択されるように構成されてもよい。例えば、処理対象のデータが被験ポリペプチドの発現細胞を所定の割合で含む細胞試料のデータである場合には、これらの全て又は一部のステップを省略し、又は各ステップで使用する基準を変更し、そうでない場合にはこれらのステップを実行するように構成することができる。
　本発明のプログラムは、ユーザにさらなる指示を求めるように構成されてもよい。例えば、発現細胞と判断するための基準（例えば、被験発現量や被験提示量の閾値等）、参照範囲を設定する基準（例えば、発現細胞の割合等）、使用する関係式及びその導出手法、並びに関係式からの高次構造形成値の算出方法の一以上に関してユーザに指示を求めるように構成されてもよい。
　ユーザへの指示の要求の時期及び回数は特に限定しない。例えば、最初に一度に全ての指示を要求してもよく、指示が必要になる度に複数回にわたって指示を要求してもよい。
　本発明のプログラムはさらに、第１態様～第５態様において詳述した追加の工程を適宜含むように構成することができる。
　プログラムは、記録媒体に保存したものであってもよい。記録媒体としては、例えば、CD-ROM、DVD等の光学記録媒体、半導体メモリ、フレキシブルディスク、ハードディスク等の情報格納媒体を挙げることができる。
６－２．効果
　本態様のプログラムを使用することにより、第１態様～第５態様の方法に必要な情報処理を自動で実行することができる。また、本態様のプログラムをイメージサイトメトリーやフローサイトメトリー等の測定及び／又は解析プログラムに組み込むことにより、1つの装置によって細胞試料の測定、分析及び情報処理を実施し、所望の指標を得ることができる。
＜実施例１．多量体形成能の測定＞
（目的）
　MHCのサブユニット同士の会合に関し多量体形成能を測定する。
（方法）
１．プラスミドの設計
　MHCクラスIIのαサブユニットを対象ポリペプチド、βサブユニットを被験ポリペプチドとして用いた。MHCクラスIIのαサブユニットを安定発現させるためのプラスミドベクターはpMXs-puro（Cell Biolabs社）を用いて設計した。安定発現用プラスミドベクターの構造の模式図を図７に示す。一方、MHCクラスIIのβサブユニットを一過的に発現させるためのプラスミドベクターはpMXs-IRES-GFP（Cell Biolabs社）を用いて設計した。一過的発現用プラスミドベクターの構造の模式図を図８に示す。
　αサブユニットの遺伝子配列としては、配列番号７に示すアミノ酸配列を有するDQA1*01:02をコードする塩基配列（配列番号８）を用いた。
　βサブユニットの遺伝子配列としては、配列番号９に示すアミノ酸配列を有するDQB1*06:02をコードする塩基配列（配列番号１０）を用いた。ここでは、βサブユニットのN末端側のシグナル配列との間にリンカー（Linker 2）（配列番号１１）を介して15merのポリグリシン（G15：配列番号３）配列を融合させた融合タンパク質を用いた。
　融合タンパク質のアミノ酸配列は配列番号１２に示され、それをコードする塩基配列は配列番号１３に示される。
２．ウイルス粒子の調製
　DMEM（Sigma-Aldrich社）に10％FBS、L-グルタミン（2mM）、抗生物質(antibiotic antimycotic solution (1x) （Sigma-Aldrich社）)を添加した培地（抗生物質含有培地）中でピューロマイシン（1μg/mL）、ブラストサイジンS（10μg/mL）存在下で維持したレトロウイルスパッケージング細胞（PLAT-E (Morita et al, Gene Ther., 2000. 7:1063-1066.)）に以下の手順でプラスミドを導入し、ウイルス粒子を調製した。
　PLAT-E細胞を6wellディッシュに2mLの抗生物質含有培地中1E6細胞/wellの細胞密度で播種した。播種後一晩の培養の後、DMEMに10％FBS、L-グルタミン（2mM）を添加した培地（抗生物質非含有培地）1mLで培地交換した。
　1.5μgのプラスミドDNAを50μLのOpti-MEMI（Thermo Fisher Scientific社）に入れ、4.5μLのFuGene（Promega社；製品番号：E2311）を使用して、製造者推奨のプロトコルに従ってプラスミドDNAを培地交換後のPLAT-E細胞にトランスフェクションした。
　トランスフェクションの24時間後に1mL/wellの抗生物質含有培地で培地交換を行った。培地交換の24時間後に培養上清をウイルス液として回収し、孔径0.45μmのフィルターを用いた濾過又は遠心によりPLAT-E細胞を除去した。
３．発現用細胞への形質導入
　発現用細胞として、NIH3T3細胞（マウス線維芽細胞株）を用いた。NIH3T3細胞を12wellディッシュに1mLのDMEM中0.5E5～2E5細胞/wellの細胞密度で播種し、一晩培養した。翌日、形質導入の直前に0.35mL/wellの抗生物質含有培地で培地交換を行った。
　1.5mLチューブにおいてウイルス液900μLに対して11.2μLのpolybrene（1μg/μL；Sigma-Aldrich社）を添加し、混合して形質導入用ウイルス液を調製した。形質導入用ウイルス液は回収後そのまま、もしくは-80℃で保管後に使用した。
　培地交換後のNIH3T3細胞に形質導入用ウイルス液を添加し、37℃において3時間以上インキュベートした。添加したウイルス液の液量は、安定発現用プラスミドベクターの場合は15μL～50μL/well、一過的発現用プラスミドベクターの場合は5μL～50μL/wellとした。
　その後、1mL/wellの抗生物質含有培地を添加し、ウイルス感染後48時間培養した。
４．抗体染色
　培地を除き、代わりに1mLのFCMバッファー（PBS、0.1％BSA含有）を添加し、細胞を容器から剥がし1.5mLチューブに分取した。分取した細胞懸濁液を300～500×gで2分間遠心し、上清を捨てて100μL～300μLのFCMバッファーを加え、抗体反応用細胞懸濁液を調製した。
　予め、各細胞試料につき0.1μgの一次抗体を分注した1.5mLチューブに抗体反応用細胞懸濁液を100μL添加し、4℃で15分間、遮光下でインキュベートした。
　FCMバッファーを用いて細胞を洗浄した後、各細胞試料につき0.2μgの二次抗体液（25μLのFCMバッファー中0.2μg）を添加し、4℃で15分間、遮光下でインキュベートした。
　インキュベート後、洗浄した細胞を600μLのFCMバッファーに懸濁し、フローサイトメトリー用細胞懸濁液を調製した。フローサイトメトリー用細胞懸濁液は、測定直前にナイロンメッシュ（孔径40μm）で濾過し凝集細胞を除去したものを使用した。
　抗体としては以下のものを用いた：
　一次抗体；
　　被験提示量測定用抗体　Mouse Anti-Human HLA-DP DQ DR Monoclonal antibody, Unconjugated（Bio-Rad Laboratories社；クローン名：WR18）
　　アイソタイプコントロール抗体　Mouse IgG2a Isotype Control antibody, Unconjugated（Medical & Biological Laboratories社；クローン名：6H3）
　二次抗体；
　　Goat F(ab')2 Anti-Mouse Ig, Human ads-PE antibody（Southern Biotechnology Associates社；カタログ番号：1012-09）。
　フローサイトメトリーによる測定は以下の手順で行った。フローサイトメーターとしては、スペクトル型セルアナライザーSA3800（ソニー社）を用いた。
　測定の際のパラメータとしては以下を用いた。
　励起：488nm、Window extension：Wide、Threshold CH：FSC、Threshold Value：16.0％、FSC Gain：17、SSC voltage：25.8％、Fluorescence PMT voltage：38.0％、流速：500～1,000イベント/秒、蛍光補正：なし
　データの取り込みはSA3800ソフトウェアを用いて行った。
　測定で得たデータはFCS Express ver.6.06.00336（De Novo Software社）により解析した。
５．GFP発現細胞の割合の確認
　本実施例ではβサブユニットの発現量をGFP発現量（GFP蛍光強度の測定値）に基づいて判断した。
　GFP発現細胞の割合の確認はフローサイトメトリーによって行った。具体的には、GFPの発現の有無の判断は以下のように行った。
　まず、GFP非発現細胞を用いてフローサイトメトリーでGFP蛍光強度及びPE蛍光強度を測定し、GFP蛍光強度とPE蛍光強度の展開面上でGFP非発現細胞群が示すGFP蛍光強度の最大値を閾値として確認した。次に、GFP発現細胞を含む細胞集団を測定し、閾値を上回るGFP蛍光強度を示す細胞をGFP発現細胞と判断した。
　GFP発現細胞の割合が、後述のゲート2を母集団としたときに30％程度を示す細胞試料にアイソタイプコントロール抗体を適用したものを用いて、参照範囲を設定した。
６．参照範囲の設定
　まず、測定された各細胞のデータをFSC-AreaとSSC-Areaで展開し、目的細胞集団を含むゲート1を設定した。ゲート1は、FSC-Area値及びSSC-Area値が共に低値を示す粒子等（粒子、死細胞や細胞片等）及びFSC-Area値及び/又はSSC-Area値が共に高値を示す細胞（凝集細胞や遺伝子導入後に細胞径や内部構造に変化が生じた細胞等）を除外する位置に設定した（図９Ａ）。
　次に、ゲート1により抽出された細胞のデータをFSC-AreaとFSC-Heightで展開し、単一細胞に由来するデータを抽出する矩形のゲート2を設定した（図９Ｂ）。ゲート2に含まれない細胞を凝集細胞のデータと見なして除外した。
　次に、ゲート2により抽出された細胞のデータをGFP蛍光強度とPE蛍光強度で展開し、GFP非発現細胞の90％以上を含む位置にゲート3を設定し、ゲート3に包含される細胞群を非発現細胞群とした（図１０）。同じ二次元展開面において、GFP発現細胞を含むゲート4を設定し、ゲート4に包含される細胞群を発現細胞群とした（図１０）。
　次に、ゲート4で抽出した細胞のデータをGFP蛍光強度とPE蛍光強度で展開した細胞の密度プロット（パーセンタイルによる色表示）で表示し、パーセンタイル等高線（色表示の境界）に基づいて、参照範囲をGFP蛍光強度について設定した（図１１Ａ）。ゲート4で抽出した細胞総数を母数とした密度プロットにおいて80パーセンタイルの色表示がなされている領域のうち、最も低いGFP蛍光強度の値（図１１Ａ及びＢ中「a」：80パーセンタイルの色表示と60パーセンタイルの色表示の境界に対応する値）を参照範囲の下限とした。一方、20パーセンタイルの色表示がなされている領域のうち、最も高いGFP発現量の値（図１１Ａ及びＢ中「b」：20パーセンタイルの色表示と1パーセンタイルの色表示の境界に対応する値）を参照範囲の上限とした。GFP蛍光強度が参照範囲に含まれる細胞のデータが、PEの蛍光強度にかかわらず抽出されるようにゲート5を設定した（図１１Ａ）。さらに、GFP蛍光強度の対数目盛に関しゲート5を4つの区画に等分割するゲート6～9を設定した（図１１Ｃ）。ゲート5はゲート4で抽出された細胞のデータのうち、GFP蛍光強度が参照範囲に含まれる細胞のデータを抽出するゲートであり、ゲート6～9はゲート5を分割するゲートである。
７．被験発現量と被験提示量の測定
　被験提示量測定用抗体を適用した細胞試料について、フローサイトメトリーによる測定を行った。測定方法及びゲート1～3の設定は参照範囲の決定の際と同様に行った。ゲート4は各細胞試料のGFP陽性PE陽性集団を包含する位置に設定した。ゲート4により抽出された細胞のデータに、参照範囲として予め設定されたゲート5の位置を変更することなくそのまま適用し、ゲート5に包含される細胞のデータを抽出した。
　さらに、ゲート5により抽出された細胞のデータについて、ゲート5を分割するゲート（ゲート6～9）の位置を変えることなくそのまま適用した（図１２Ｂ）。
　次に、ゲート6～9に含まれる細胞数の情報を基に、高次構造形成値の算出に適した細胞試料の選択を行った。具体的には以下の条件のいずれかを満たす細胞試料のデータを抽出工程の対象から除外した。
　各ゲート（ゲート6～9）が包含する細胞数が100未満：
　細胞数の比が以下（下限｜上限）の基準値の範囲（下限に開いた半開区間）外：
　　ゲート6/ゲート7細胞数比（0.5｜2）、ゲート6/ゲート8細胞数比（0.4｜8）、ゲート6/ゲート9細胞数比（0.3｜40）、ゲート7/ゲート8細胞数比（0.6｜4）、ゲート7/ゲート9細胞数比（0.5｜20）、ゲート8/ゲート9細胞数比（0.9｜8）。
　除外されなかった細胞試料のデータについて、ゲート6～9それぞれの区画におけるGFP蛍光強度（被験発現量）及びPE蛍光強度（被験提示量）の中央値をそれぞれ算出した。
　同様にして、各細胞試料についてアイソタイプコントロール抗体を適用して測定を行い（図１２Ａ）、ゲート6～9それぞれの区画におけるGFP及びPEの蛍光強度の中央値をそれぞれ算出した。
８．関係式の導出
　各細胞試料について、ゲート6、7、8及び9に関し、各区画のGFP蛍光強度の中央値とPEの蛍光強度の中央値の関係をグラフにプロットした。
　ゲート6、7、8及び9のデータポイントのうち2、3又は4点の全ての組合せと原点を用いて、回帰直線の式を最小二乗法により導出した。回帰直線の式の導出にはエクセルを用いた。回帰係数が最も大きい値を示す回帰直線の式を多量体形成値の算出に用いた。回帰係数（ここでは傾き）が最大値を示した回帰直線の式で用いたものと同じゲートのデータポイントを用いて、アイソタイプコントロール抗体を適用した細胞試料における回帰係数を算出した（図１３）。
９．多量体形成値の算出
　被験提示量測定用抗体を適用した細胞試料について導出されたGFP蛍光強度のPE蛍光強度に対する関係式（回帰直線）における回帰係数から、アイソタイプコントロール抗体を適用した細胞試料における回帰係数を引いた値を多量体形成値として算出した。
（結果）
　結果を図１３に示す。被験提示量測定用抗体を適用した細胞試料の回帰直線（図中、「α-HLA antibody」）の回帰係数値は1.35と、アイソタイプコントロール抗体を適用した細胞試料の回帰直線（図中、「isotype control」）の回帰係数値である0.16より大きかった。この結果から、β鎖にG15を融合したDQA1*01:02とDQB1*06:02のヘテロダイマーの多量体形成値は1.19（＝1.35－0.16）と算出された。
＜実施例２．サブユニットの種類による多量体形成値の変化＞
（目的）
　サブユニットの種類（HLAアレル）が多量体形成値に与える影響を調べる。
（方法）
　使用したサブユニットの種類が異なる以外は実施例１と同様に行った。αサブユニットとしてDQA1*03:01（配列番号１４）、βサブユニットとしてDQB1*03:02（配列番号１５）をそれぞれ用いた。実施例１と同様に、βサブユニットのN末端側のシグナル配列との間にリンカー（Linker 2）（配列番号１１）を介して15merのポリグリシン（G15：配列番号３）配列を融合させた融合タンパク質を用いた。
　関係式の導出には、回帰係数値が最も大きかったゲート6及び7の値を用い、実施例１と同様に行った。
（結果）
　結果を図１４及び表１に示す。DQA1*03:01とDQB1*03:02のヘテロダイマーでの、被験提示量測定用抗体を適用した場合の回帰係数値と、アイソタイプコントロール抗体を適用した細胞試料の回帰係数値の比較から、多量体形成値は0.11（＝0.29－0.18）と算出された（図１４）。
　実施例１の場合と同様にG15と融合したMHCを用いた場合であっても、サブユニットの種類によって多量体形成値に違いが見られた。これはHLAの種類（アレル）によるαサブユニットとβサブユニット間の結合強度の違いを反映していると考えられる。
　表１に示す通り、本実施例の結果と実施例１の結果は、先行研究（Ettinger et al, J. Immunol., 1998, 161:6439-6445.）にて報告されている、界面活性剤SDS存在下での安定性に基づいて評価されたヘテロダイマーの結合強度の結果と一致する。さらに、本方法では、先行研究では測定が困難であったDQA1*03:01とDQB1*03:02のヘテロダイマーの多量体形成値を定量することができた。
　これにより、本発明の方法により、電気泳動、ウェスタンブロット、及び界面活性剤での処理等を行うことなく、簡便かつ正確に多量体形成能を定量化できること、及び構造安定性が低い多量体についても多量体形成能を定量化できることが示された。
＜実施例３．リガンドの種類によるリガンド結合値の変化＞
（目的）
　リガンドの種類がリガンド結合値に与える影響を調べる。
（方法）
　αサブユニットとしてDRA*01:01（配列番号１６）を用い、βサブユニットとして、DRB1*04:01（配列番号１７）、DRB1*04:05（配列番号１８）、DRB1*09:01（配列番号１９）及びDRB3*01:01（配列番号２０）を用いた。また、リガンドとしては、以下の表２に示す結核菌（Mycobacterium tuberculosis H37Rv）のCFP-10及びESAT-6タンパク質に由来するペプチドを用いた。サブユニットの種類とリガンド配列が異なる以外は実施例１と同様に行った。被験値と対照値（対照リガンドであるG15を用いた場合の多量体形成値）の比に基づく値をリガンド結合値として算出した。リガンド結合値は3～8回の試行の平均値として算出した。
（結果）
　結果を図１５に示す。リガンド結合値はリガンドの種類によって違いが見られた。リガンド結合値に基づいて、例えば、βサブユニットがDRB1*09:01の場合にはESAT-6由来のペプチド（peptide 2a、peptide 2d）と多量体を形成しやすい一方、βサブユニットがDRB3*01:01の場合にはCFP-10由来のペプチド（peptide 1a）と多量体を形成しやすいことが分かった。また、βサブユニットがDRB1*04:05の場合にはESAT-6由来のペプチドの中でも、peptide 2aと多量体を比較的形成しやすいことが分かった。
　以上のことから、本発明の方法によれば、MHCタンパク質の精製を行うことなく、HLAアレル等のMHCの種類によって多量体を形成しやすいペプチドリガンドを見出すことができることが示された。なお、本実施例及び実施例4における対照値、被験値をそれぞれ対照値、候補値として扱うことによりMHCに結合する候補ペプチドリガンドのスクリーニングに適用することができる。
＜実施例４．IC50値との比較＞
（目的）
　本発明の方法によって得られたリガンド結合値を予測IC50値と比較する。
（方法）
　HLAのアレルとして、DRA*01:01（配列番号１６）とDRB1*04:01（配列番号１７）（図１６Ａ）、DRA*01:01とDRB1*04:05（配列番号１８）（図１６Ｂ）、DRA*01:01とDRB1*15:02（配列番号３０）（図１７Ａ）、DRA*01:01とDRB3*01:01（配列番号２０）（図１７Ｂ）、DQA1*03:01とDQB1*03:01（配列番号３１）（図１８Ａ）、DQA1*01:03（配列番号３２）とDQB1*06:01（配列番号３３）（図１８Ｂ）の組合せを用いた。
　これらと以下の表３に示すリガンドに関する多量体形成値の測定を、サブユニットの種類とリガンド配列が異なる以外は実施例１、３と同様に行った。被験値と対照値（対照リガンドであるG15を用いた場合の多量体形成値）の比に基づく値をリガンド結合値として算出した。
　予測IC50値は、NetMHCIIpan-4.0（Reynisson et al., J. Proteome. Res., 2020, 19: 2304-2315.）を用いて予測した。NetMHCIIpan-4.0はMHCクラスIIとペプチドの結合能を予測するサーバーであり、Rank値（結合親和性データセットとペプチド溶出データセットを基に予測したパーセンタイル順位）、Rank_BA値（結合親和性データセットを基に予測したパーセンタイル順位）及びIC50値を予測値として出力する。NetMHCIIpan-4.0に表３に示すペプチドのアミノ酸配列を入力し、目的のHLAアレルを選択することにより「nM」として出力された値を予測IC50値として取得した。
　リガンド結合値と予測IC50値との間の相関を、ピアソンの相関係数を算出することにより検証した。相関係数の算出はエクセルを用いて行った。
（結果）
　結果を図１６～１８に示す。測定対象としたHLAとペプチドのいずれの組合せについても、リガンド結合値と予測IC50値との間に正の相関が見られ、幅広い種類のアレルのαサブユニット及びβサブユニットの組合せにおいて、相関係数は0.8以上と高水準であった（図１６～１８）。このことから、本発明の方法で得られる多量体形成値はリガンド結合能を反映した値であることが示された。また、無細胞の測定系において正確な結合測定が困難な、弱い結合親和性（IC50値：1E4nM～1E5nM）の範囲においても本方法では定量可能であった。
　これにより、本発明の方法により、簡便かつ正確にリガンド結合値を測定できることが確認された。
＜実施例５．測定機種間の互換性＞
（目的）
　使用するフローサイトメーターの機種間の互換性を調べる。
（方法）
　実施例１、３と同様に多量体形成値の測定を行いリガンド結合値を算出した。フローサイトメーターとしてEpics-XL（ベックマン・コールター社）（フィルター方式セルアナライザー）又はFACSCantoTMII（ベクトン・ディッキンソン社）（フィルター方式セルアナライザー）を用いて測定を行い、SA3800（ソニー社）（スペクトル型セルアナライザー）を用いて測定し算出されたリガンド結合値と比較した。
　Epics-XLとSA3800の比較では、DRA*01:01（配列番号１６）とDRB1*08:03（配列番号３４）の組合せを使用した。また、FACSCantoTM IIとSA3800の比較では、DRA*01:01（配列番号１６）とDRB3*01:01（配列番号２０）の組合せを使用した。
　リガンドとしては表３に示すペプチドを使用した。
　Epics-XLを用いた測定では以下のパラメータを使用した。
　励起：488nm、前方散乱光（Forword Scatter；FS）：30、側方散乱光（Side Scatter; SS）：400、第一蛍光（FL1）：620V、第二蛍光（FL2）：680V、蛍光補正：FL1（対FL2）：10％、FL2（対FL1）：0％、流速：300～1,000イベント/秒
　データの取り込みはEXPO32ソフトウェアを用いて行った。
　FACSCantoTM IIを用いた測定では以下のパラメータを使用した。
　励起：488nm、FSC：216V、SSC：390V、FITC：390V、PE：340V、蛍光補正：FL1（対FL2）：23％、FL2（対FL1）：4.0％、流速：300～1,000イベント/秒、Area Scaling Factor：Blue：0.83、FSC：0.77
　データの取り込みはFACSDivaTMソフトウェアを用いて行った。
　ゲートの設定は実施例１に準じて、解析ソフトウェア（FCS Express ver.6.06.00336（De Novo Software社））を用いて行った。Epics-XL及びFACSCantoTM IIでの測定は、1～2回の試行を行った。SA3800での測定は、1～4回の試行を行った。リガンド結合値はG15での対照値に対する被験値の比として算出した。各試行で測定用の細胞群として使用した細胞の数は、11,000～26,000個（ゲート1）であり、多量体形成値の算出に用いた参照範囲内の細胞の数は860～6,800個（ゲート5）であった。
（結果）
　結果を図１９及び２０に示す。異なる機種のフローサイトメーターを使用した場合でも、リガンド結合値のリガンドの種類による傾向は、機種間でよく一致した。加えて、その傾向のみならず、その数値が、いずれのリガンドを使用した場合も異なる機種間で高度に一致することが分かった。これにより、本発明の方法で算出されたリガンド結合値は、非常に高い測定機種間の互換性を有することが示された。
＜実施例６．本発明の方法の感度の検証＞
（目的）
　本発明により算出されるリガンド結合値の感度を予測結合ランク値（Rank値及びRank_BA値）及び予測IC50値の感度と比較する。
（方法）
　本発明の方法によるリガンド結合値の測定は、使用したリガンドとサブユニットが異なること以外は実施例１、３と同様に行った。HLAアレルとしてはDRA*01:01（配列番号１６）とDRB1*08:03（配列番号３４）の組合せを用いた。リガンドとしては表４に示すペプチドを用い、リガンド結合値はG9での対照値に対する被験値の比として算出した。
　表４に示すペプチドは、結核菌のESAT-6タンパク質の49位～63位の領域の部分ペプチド（peptide 1c）について、N末端又はC末端から1アミノ酸ずつグリシンに置換したペプチドである。
　結合予測値としては、実施例４に記載の通り、NetMHCIIpan-4.0に各ペプチドのアミノ酸配列を入力し、目的のHLAアレルを選択することにより予測結合ランク（「Rank」又は「Rank_BA」）として出力された値を用いた。予測IC50値としては、「nM」として出力された値を用いた。
（結果）
　結果を図２１Ｂに示す。本発明の方法により算出したリガンド結合値の結果によれば、peptide 1cのN末端側から3番目までの残基に加え、4番目の残基（グルタミン）をグリシンに置換した場合（1c 5-15）、及びC末端側から3番目までの残基に加え4番目の残基（グルタミン酸）をグリシンに置換した場合（1c 1-11）にリガンド結合値が急激に低下した（図２１Ｂ）。一般にグルタミン及びグルタミン酸はいずれも側鎖が分子間相互作用に大きく寄与することが知られている。特に、DRB1*08:03と共通の多型を持つHLAの構造解析の結果から、DRB1*08:03の抗原ペプチドC末端側の結合ポケットには酸性アミノ酸がアンカー残基として収容されることが推定されるため（Jones et al, Nat. Rev. Immunol., 2006, 6:271-282.）、この結果は確からしいと考えられる。
　予測結合ランク（「Rank」、「Rank_BA」）及び予測IC50値の傾向は、リガンド結合値と概ね一致した（図２１Ａ）。しかしながら、特に予測結合ランク（「Rank」）は値が単調減少する訳でもないことから、どの残基がリガンド結合に重要であるか明確に判別することはできなかった。また、予測結合ランク（「Rank_BA」）、予測IC50値の結果によっても、MHCとの結合の強さに関わる残基の判別は困難であった（図２１Ａ）。
　以上のことから、本発明の方法によるリガンド結合値は、予測結合ランク及び予測IC50値と比較しても極めて感度が高い優れた指標であることが示された。
＜実施例７．イメージサイトメトリーでの測定＞
（目的）
　イメージサイトメトリーを用いてフローサイトメトリーと同様にリガンド結合値を測定可能かを調べる。
（方法）
　検出機器が異なる以外は基本的に実施例１、３と同様に行った。αサブユニットとしてDQA1*01:02（配列番号７）を用い、βサブユニットとして、DQB1*06:02（配列番号９）を用いた。また、リガンドとしては、表２に示す結核菌（Mycobacterium tuberculosis H37Rv）のCFP-10及びESAT-6タンパク質に由来するペプチドを用いた。24wellプラスチックプレートを2%ゼラチンでコートし細胞を撒いた。実施例１と同じ抗体を用いて抗体染色をプレート上で行った後、細胞を4％パラホルムアルデヒド/PBSで固定した。固定液をPBSに置換し4℃、18時間遮光保管後に共焦点定量イメージサイトメーターCellVoyager CQ1（横河電機社）を用いて撮影を行った。撮影は以下の条件で行った。
　GFPの検出：励起488nm、蛍光BP525/50nm
　PE（MHC)の検出：励起561nm、蛍光BP617/713nm
　各検体について10視野（対物レンズ:x10）を撮影した。画像データをCellPathfinder（横河電機社）を用いて解析し、細胞毎の蛍光強度値を算出した。GFP陰性細胞群、陽性細胞群の分離には、アイソタイプコントロール抗体を用いた試料において各細胞群が正規分布に従うと仮定して定めた境界線の平均値（GFP蛍光強度10,738）を閾値として用いた。実施例１と同様に、ゲート5のGFP蛍光強度の下限値、上限値をGFP陽性細胞群の細胞密度分布60パーセンタイル、20パーセンタイルの位置（GFP蛍光強度24,044～61,802）にそれぞれ設定した。
　ゲート5においてGFP蛍光強度を4等分する領域にゲート6～9を設定した。ゲート6～9それぞれの区画におけるGFP及びPEの蛍光強度の中央値をそれぞれ算出した。関係式の導出及び多量体形成値の算出は実施例１と同様に行った。
　各リガンドを用いた場合の多量体形成値（被験値）と対照リガンドであるG15を用いた場合の多量体形成値（対照値）の比に基づく値をリガンド結合値として算出した。イメージサイトメトリー用試料と同時に作製した試料についてフローサイトメトリーによる解析を実施例１と同様に行い、イメージサイトメトリーでの結果と比較した。
（結果）
　結果を図２２に示す。リガンド結合値はリガンドの種類によって違いが見られ、そのいずれについてもフローサイトメトリーでの測定とイメージサイトメトリーでの測定において同等の結果が得られた。
　以上のことから、イメージサイトメトリーを使用した場合であっても、本発明の方法を用いることにより、フローサイトメトリーと同様の精度でリガンド結合値を測定できることが示された。
＜実施例８．薬剤や化合物による高次構造形成能の変動の測定＞
（目的）
　HLAクラスIと薬剤との結合による高次構造形成能の変動を測定する。
（方法）
　被験ポリペプチドとしてHLAクラスI αサブユニット（HLA-B*57:01（配列番号５５）、HLA-B*57:03（配列番号５６）及びHLA-B*15:02（配列番号５７））、対象ポリペプチドとしてβ2ミクログロブリン（配列番号５８）をそれぞれ使用した。薬剤としては、アバカビル硫酸塩（富士フイルム和光純薬社；製品番号：017-26393）、及びカルバマゼピン関連化合物である、オクスカルバゼピン（東京化成社；製品番号：O0363）（化合物1）、カルバマゼピン10,11-エポキシド（東京化成社；製品番号：D5982）（化合物2）、エスリカルバゼピンアセタート（東京化成社；製品番号：E1046）（化合物3）、カルバマゼピン（富士フイルム和光純薬社；製品番号：034-23701）（化合物4）を使用した。
　ウイルス粒子の調製、及び発現用細胞への形質導入は実施例１と同様に行った。ただし、発現用細胞の播種は形質導入の3時間前に行い、形質導入（ウイルス感染）の2時間後に0.5mL/wellの抗生物質含有培地を添加した。薬剤の添加は、薬剤をDMSO又はPBSに溶解した溶液をウイルス感染24時間後に培地中に添加（終濃度700μM）することにより行った。
　なお、実施例１に記載された抗体と異なる抗体としては以下のものを使用した。
　一次抗体；
　　被験提示量測定用抗体　Anti-human HLA-A,B,C Antibody（Biolegend社；クローン名：W6/32）
　薬剤添加した検体の高次構造形成値（処理値）とDMSO又はPBSを添加した検体の高次構造形成値（対照値）の比、又は差に基づく値を変動値として算出した。変動値は3回の試行の平均値として算出した。
（結果）
　結果を図２３及び２４に示す。
　図２３は、アバカビル硫酸塩を用いた場合のアレルの種類による変動値の違いを示す図である。HLA-B*57:01の場合には、変動値がアバカビル硫酸塩の濃度依存的に高くなり、アバカビル硫酸塩がHLA-B*57:01に結合していることが示唆された。アバカビルが原因となる薬疹はHLA-B*57:01遺伝型との強い関連が知られている。一方、HLA-B*57:03やHLA-B*15:02等のアバカビルによる薬疹との関連が報告されていないアレルの変動値には、アバカビル硫酸塩の添加は影響しなかった。
　アバカビルはHLA-B*57:01アレルに特異的に作用することが構造解析及びT細胞応答の解析に基づいて示唆されており（Illing et al. Nature, 2012, 486: 554-558.）、図２３に示す測定結果はこの報告ともよく一致する。
　図２４は、アレルとしてHLA-B*57:01を使用した場合に、アバカビル硫酸塩及びカルバマゼピン関連化合物を用いた場合の変動値を示す図である。薬剤としてアバカビル硫酸塩を使用した場合（図２４中、「アバカビル」）は変動値が高値となり、HLA-B*57:01とアバカビル硫酸塩との結合が示唆された。HLA-B*57:01と強い結合をしないことが知られているカルバマゼピン関連化合物を用いた場合（図２４中、「化合物1」～「化合物4」）は変動値が低値であり、弱く結合するに過ぎないか、又は結合していないことが示唆された。なお、差に基づく値を使用した場合（図２４Ｂ）も、比に基づく値を使用した場合（図２４Ａ）と同様の結果が得られた。
　以上のことから、本発明の方法によれば、免疫アッセイや質量分析等の解析を行うことなく、特定の薬剤に関するHLAとの結合能の相違や、特定のHLAアレルに対する薬剤ごとの影響の相違を見出すことができることが示された。なお、本実施例における対照値、処理値をそれぞれ対照値、候補値として扱うことにより、MHCに結合する候補薬剤のスクリーニングを行うことができる。
＜実施例９．MHC以外の膜タンパク質における立体構造形成値の測定＞
（目的）
　膜タンパク質としてサイトカイン受容体（マウスIL-2受容体αサブユニット：IL-2Rα）を用い、安定化に影響する変異の影響を立体構造形成値として測定できるかを調べる。
（方法）
　マウスIL-2Rαの野生型タンパク質（配列番号５９）又はY129H変異型タンパク質（配列番号６０）を被験ポリペプチドとして使用した以外は、基本的に実施例１と同様に測定を行った。
　なお、検出用抗体としては以下のPE標識抗体を用いた：
　　被験提示量測定用抗体　PE Rat Anti-Mouse CD25 Monoclonal antibody（BD PharmingenTM、クローン名：PC61）
　　アイソタイプコントロール抗体　PE Rat IgG1, κ Isotype Control（Biolegend社；クローン名：RTK2071）
（結果）
　結果を図２５に示す。マウスIL-2Rα（野生型）を使用した場合には、立体構造形成値は6.04であった（図２５中、「IL2Ra野生型」）。一方、マウスIL-2Rα（Y129H変異型）を使用した場合の立体構造形成値は0.03と極めて低かった（図２５中、「IL2Ra変異型」）。
　先行研究（Permanyer et al. Cell. Mol. Immunol., 2021, 18:398-414.）では、Y129H変異がIL-2Rαの安定化に影響していることが推測されており、野生型とY129H変異型を293T細胞株に強制発現するとY129H変異型では表面発現量が減少することが報告されている。図２５に示す結果はこの報告とよく一致する。
　以上のことから、本発明の方法がMHC以外の膜タンパク質や単量体として発現させた膜タンパク質に対しても有用であり、変異による膜上の受容体量の変化を正確に検出できることが示された。
＜実施例１０．Gタンパク質共役型受容体の細胞膜局在性維持能の測定と薬剤の影響＞
（目的）
　本発明の方法によりGタンパク質共役型受容体の細胞膜局在性維持能を測定できることを確認すると共に、細胞膜局在性維持能に対する薬剤の影響を調べる。
（方法）
　Gタンパク質共役型受容体としてオレキシン受容体1（OX1R）（配列番号６１）及びオレキシン受容体2（OX2R）（配列番号６２）を用いた。リガンドとしては、これらの受容体のリガンドであるオレキシンBの配列（Peptide 3b）及び、OX1R、OX2Rの両方と強く結合することが報告されているオレキシンA及びオレキシンBの2種類の部分配列（それぞれPeptide 3a、Peptide 3c）（Lang, et al., J. Med. Chem. 2004, 47:1153-1160）の合成ペプチド（C末端アミド化、純度>90%、GenScript社）（終濃度10μM）を用いた。使用した配列を表５に示す。
　アンタゴニストとして、Almorexant HCl（AdooQ bioscience社；製品番号：A14286-5；OX1R及びOX2Rアンタゴニスト）及びSB-334867（AdooQ bioscience社；製品番号：A16695-5；OX1R選択的アンタゴニスト）（終濃度10μM）を用いた。被験ポリペプチドの種類と薬剤の種類が異なる以外は実施例８と同様に行った。
　なお、実施例１に記載された抗体と異なる抗体としては以下のものを使用した。
OX1R：
　一次抗体；
　　被験提示量測定用抗体　Anti Orexin Receptor 1/HCRTR1 Rabbit mAb（Cell signaling technology社；クローン名：E5Q8B）
　　アイソタイプコントロール抗体　normal rabbit IgG: sc-3888（Santa Cruz Biotechnology社）
　二次抗体；
　　Goat Anti-Rabbit IgG H&L (PE) preadsorbed（abcam社）
OX2R：
　一次抗体；
　　被験提示量測定用抗体　Invitrogen Anti Orexin Receptor 2 Monoclonal Antibody（Thermo Fisher社；クローン名：456738）
　リガンド、又はリガンドとアンタゴニストを添加した検体の細胞膜局在値（処理値）とDMSO添加した検体の細胞膜局在値（対照値）の比に基づく値を変動値として算出した。変動値は3回の試行の平均値として算出した。
（結果）
　結果を図２６及び２７に示す。図２６及び２７は、リガンド、又はリガンドとアンタゴニストを添加した場合の変動値の違いを示す図である。図２６はOX1Rの結果を、図２７はOX2Rの結果をそれぞれ示す。
　アンタゴニストを使用していない場合（図２６及び２７中、「アンタゴニスト」が「－」）、リガンドのみを添加した場合の変動値は、溶媒（DMSO）のみを添加した場合（図２６及び２７中、「リガンド」が「－」）と比較して顕著に低下した。Gタンパク質共役型受容体は活性化されると、周囲の細胞膜ごと細胞内に取り込まれ内在化することが知られている。上述の通り、これらのリガンドはOX1R、OX2Rに高い親和性で結合することが報告されていることから、図２６及び２７のリガンド添加時の結果は、このGタンパク質共役型受容体の内在化（Internalization）現象をよく反映している。
　一方、OX1RとOX2Rの両方に作用するアンタゴニストであるAlmorexant HClをリガンドと共に添加した場合は（図２６及び２７中、「アンタゴニスト」が「Almorexant」）、リガンドのみ添加の場合に認められた内在化現象がOX1R、OX2Rの両方で抑制された。一方、OX1R特異的に作用するアンタゴニストであるSB-334867をリガンドと共に添加した場合には（図２６及び２７中、「アンタゴニスト」が「SB-334867」）、OX1R（図２６）において変動値が上昇した半面、OX2R（図２７）においては、アンタゴニスト非存在下と同様に変動値は顕著に低下した。このことから、OX1R特異的に内在化が阻害されたことが示唆された。
　以上のことから、本発明の方法によれば、Ca2+を検出する細胞内アッセイ等の解析を行うことなくGタンパク質共役型受容体へのリガンド結合に伴う内在化現象を測定することができ、アンタゴニストによる阻害効果を検出できることが示唆された。なお、本実施例における対照値、処理値をそれぞれ対照値、候補値として扱うことによりGタンパク質共役型受容体のリガンドの探索や、アゴニスト、アンタゴニストのスクリーニングに適用することができる。
　本明細書で引用した全ての刊行物、特許及び特許出願はそのまま引用により本明細書に組み入れられるものとする。
S0101　発現工程
S0102　参照範囲設定工程
S0103　測定工程
S0104　抽出工程
S0105　関係式導出工程
S0106　多量体形成値取得工程
S0110　確認ステップ
S0111　参照細胞分取ステップ
S0112　参照量取得ステップ
S0113　参照量解析ステップ
S0114　設定ステップ
S0115　測定細胞分取ステップ
S0116　発現量測定ステップ
S0117　提示量測定ステップ

Claims (23)

  1. 　細胞における被験ポリペプチドと対象ポリペプチドの多量体形成能を測定する方法であって、
    　前記細胞は、前記被験ポリペプチドを細胞膜タンパク質として一過的に発現可能であり、かつ、前記対象ポリペプチドを細胞膜タンパク質として発現可能であり、
    　前記被験ポリペプチド及び前記対象ポリペプチドを複数の前記細胞に発現させる発現工程、
    　参照用に分取した細胞群から得た参照量を解析し、前記被験ポリペプチドの発現量についての参照範囲を設定する参照範囲設定工程、
    　測定用に分取した細胞群において、前記被験ポリペプチドの被験発現量及び被験提示量を測定する測定工程、
    　前記被験発現量が前記参照範囲内にある細胞について、前記被験発現量及び前記被験提示量の情報を抽出する抽出工程、
    　抽出された前記情報から、前記被験発現量と前記被験提示量の関係式を導出する関係式導出工程、及び
    　前記関係式から多量体形成値を取得する多量体形成値取得工程
    を含み、
    　前記参照範囲設定工程は、
    　　前記細胞において前記被験ポリペプチドの発現の有無を確認する確認ステップ、
    　　前記被験ポリペプチドの発現細胞を含む複数の前記細胞を参照用の細胞群として分取する参照細胞分取ステップ、
    　　前記参照用の細胞群において、前記被験ポリペプチドの発現量を測定し、参照量として取得する参照量取得ステップ、
    　　前記参照量を前記被験ポリペプチドの発現量について解析する参照量解析ステップ、及び
    　　前記解析の結果に基づいて前記参照範囲を設定する設定ステップ
    　を含み、
    　前記測定工程は、
    　　複数の前記細胞を測定用の細胞群として分取する測定細胞分取ステップ、
    　　前記測定用の細胞群において、前記被験ポリペプチドの発現量を測定し、被験発現量として取得する発現量測定ステップ、及び
    　　前記測定用の細胞群において、細胞膜上に存在する前記被験ポリペプチドの量を測定し、被験提示量として取得する提示量測定ステップ
    　を含み、
    　前記被験提示量は、前記被験ポリペプチドと前記対象ポリペプチドとの会合に従って変化する、前記方法。
  2. 　前記関係式が前記被験発現量を変数とする一次式であり、前記多量体形成値が前記被験発現量の係数である、請求項１に記載の方法。
  3. 　前記被験ポリペプチドが膜タンパク質である、請求項１に記載の方法。
  4. 　前記膜タンパク質がMHCのサブユニットである、請求項３に記載の方法。
  5. 　前記被験ポリペプチドの発現量が前記被験ポリペプチドの発現と共役した標識タンパク質の発現量により測定される、請求項１に記載の方法。
  6. 　前記測定がフローサイトメトリー、イメージサイトメトリー及びマスサイトメトリーからなる群から選択されるいずれか一以上により行われる、請求項１に記載の方法。
  7. 　前記膜タンパク質がMHCのサブユニットであり、前記被験ポリペプチドの発現量の前記測定が、前記被験ポリペプチドの発現と共役した標識タンパク質の発現量をフローサイトメトリーにより測定することにより行われることを含む、請求項４に記載の方法。
  8. 　目的の条件による多量体形成能の変動を測定する方法であって、
    　対照条件下で請求項１に記載の方法に従って多量体形成値を測定し、対照値として取得する対照値測定工程、
    　前記目的の条件下で請求項１に記載の方法に従って多量体形成値を測定し、処理値として取得する処理値測定工程、及び
    　得られた前記対照値及び前記処理値に基づいて、変動値を算出する算出工程
    を含む、前記方法。
  9. 　細胞膜上での多量体型受容体と被験リガンドの結合能を測定する方法であって、
    　請求項１に記載の方法に従って多量体形成値を測定し、対照値として取得する対照値測定工程、
    　請求項１に記載の方法に従って多量体形成値を測定し、被験値として取得する被験値測定工程、及び
    　得られた前記対照値及び前記被験値に基づいて、前記被験リガンドのリガンド結合値を算出する算出工程
    を含み、
    　前記対照値測定工程では、前記被験ポリペプチド及び前記対象ポリペプチドとして、前記多量体型受容体のサブユニットと対照リガンドの融合タンパク質及び前記多量体型受容体の他のサブユニットを使用し、
    　前記被験値測定工程では、前記被験ポリペプチド及び前記対象ポリペプチドとして、前記多量体型受容体のサブユニットと前記被験リガンドの融合タンパク質及び前記多量体型受容体の他のサブユニットを使用する、
    前記方法。
  10. 　前記リガンド結合値が、前記被験値と前記対照値の比に基づく、請求項９に記載の方法。
  11. 　前記リガンド結合値が、前記被験値と前記対照値の差に基づく、請求項９に記載の方法。
  12. 　細胞における多量体形成条件をスクリーニングする方法であって、
    　対照条件下で請求項１に記載の方法に従って多量体形成値を測定し、対照値として取得する対照値測定工程、
    　候補条件下で請求項１に記載の方法に従って多量体形成値を測定し、候補値として取得する候補値測定工程、並びに
    　前記候補値が前記対照値と比較して高い場合に、候補条件が多量体形成に適していると判定し、及び／又は
    　前記候補値が前記対照値と比較して低い場合に、候補条件が多量体形成に適していないと判定する、判定工程
    を含む、前記方法。
  13. 　前記多量体形成条件が細胞を曝露する薬剤の種類である、請求項１２に記載の方法。
  14. 　前記多量体形成条件がリガンドの種類である、請求項１２に記載の方法。
  15. 　細胞における被験ポリペプチドの立体構造形成能を測定する方法であって、
    　前記細胞は、前記被験ポリペプチドを細胞膜タンパク質として一過的に発現可能であり、
    　前記被験ポリペプチドを複数の前記細胞に発現させる発現工程、
    　参照用に分取した細胞群から得た参照量を解析し、前記被験ポリペプチドの発現量についての参照範囲を設定する参照範囲設定工程、
    　測定用に分取した細胞群において、前記被験ポリペプチドの被験発現量及び被験提示量を測定する測定工程、
    　前記被験発現量が前記参照範囲内にある細胞について、前記被験発現量及び前記被験提示量の情報を抽出する抽出工程、
    　抽出された前記情報から、前記被験発現量と前記被験提示量の関係式を導出する関係式導出工程、及び
    　前記関係式から立体構造形成値を取得する立体構造形成値取得工程
    を含み、
    　前記参照範囲設定工程は、
    　　前記細胞において前記被験ポリペプチドの発現の有無を確認する確認ステップ、
    　　前記被験ポリペプチドの発現細胞を含む複数の前記細胞を参照用の細胞群として分取する参照細胞分取ステップ、
    　　前記参照用の細胞群において、前記被験ポリペプチドの発現量を測定し、参照量として取得する参照量取得ステップ、
    　　前記参照量をその発現量について解析する参照量解析ステップ、及び
    　　前記解析の結果に基づいて前記参照範囲を設定する設定ステップ
    　を含み、
    　前記測定工程は、
    　　複数の前記細胞を測定用の細胞群として分取する測定細胞分取ステップ、
    　　前記測定用の細胞群において、前記被験ポリペプチドの発現量を測定し、被験発現量として取得する発現量測定ステップ、及び
    　　前記測定用の細胞群において、細胞膜上に存在する前記被験ポリペプチドの量を測定し、被験提示量として取得する提示量測定ステップ
    　を含み、
    　前記被験提示量は、前記被験ポリペプチドの構造安定性に従って変化する、前記方法。
  16. 　目的の条件による立体構造形成能の変動を測定する方法であって、
    　対照条件下で請求項１５に記載の方法に従って立体構造形成値を測定し、対照値として取得する対照値測定工程、
    　前記目的の条件下で請求項１５に記載の方法に従って立体構造形成値を測定し、処理値として取得する処理値測定工程、及び
    　得られた前記対照値及び前記処理値に基づいて、変動値を算出する算出工程
    を含む、前記方法。
  17. 　細胞における被験ポリペプチドの立体構造形成条件をスクリーニングする方法であって、
    　対照条件下で請求項１５に記載の方法に従って立体構造形成値を測定し、対照値として取得する対照値測定工程、
    　候補条件下で請求項１５に記載の方法に従って立体構造形成値を測定し、候補値として取得する候補値測定工程、並びに
    　前記候補値が前記対照値と比較して高い場合に、候補条件が前記被験ポリペプチドの立体構造の形成に適していると判定し、及び／又は
    　前記候補値が前記対照値と比較して低い場合に、候補条件が前記被験ポリペプチドの立体構造の形成に適していないと判定する判定工程
    を含む、前記方法。
  18. 　細胞における被験ポリペプチドの細胞膜局在性維持能を測定する方法であって、
    　前記細胞は、前記被験ポリペプチドを細胞膜タンパク質として一過的に発現可能であり、
    　前記被験ポリペプチドを複数の前記細胞に発現させる発現工程、
    　参照用に分取した細胞群から得た参照量を解析し、前記被験ポリペプチドの発現量についての参照範囲を設定する参照範囲設定工程、
    　測定用に分取した細胞群において、前記被験ポリペプチドの被験発現量及び被験提示量を測定する測定工程、
    　前記被験発現量が前記参照範囲内にある細胞について、前記被験発現量及び前記被験提示量の情報を抽出する抽出工程、
    　抽出された前記情報から、前記被験発現量と前記被験提示量の関係式を導出する関係式導出工程、及び
    　前記関係式から細胞膜局在値を取得する細胞膜局在値取得工程
    を含み、
    　前記参照範囲設定工程は、
    　　前記細胞において前記被験ポリペプチドの発現の有無を確認する確認ステップ、
    　　前記被験ポリペプチドの発現細胞を含む複数の前記細胞を参照用の細胞群として分取する参照細胞分取ステップ、
    　　前記参照用の細胞群において、前記被験ポリペプチドの発現量を測定し、参照量として取得する参照量取得ステップ、
    　　前記参照量をその発現量について解析する参照量解析ステップ、及び
    　　前記解析の結果に基づいて前記参照範囲を設定する設定ステップ
    　を含み、
    　前記測定工程は、
    　　複数の前記細胞を測定用の細胞群として分取する測定細胞分取ステップ、
    　　前記測定用の細胞群において、前記被験ポリペプチドの発現量を測定し、被験発現量として取得する発現量測定ステップ、及び
    　　前記測定用の細胞群において、細胞膜上に存在する前記被験ポリペプチドの量を測定し、被験提示量として取得する提示量測定ステップ
    　を含み、
    　前記被験提示量は、前記被験ポリペプチドの細胞膜局在性に従って変化する、前記方法。
  19. 　目的の条件による細胞膜局在性維持能の変動を測定する方法であって、
    　対照条件下で請求項１８に記載の方法に従って細胞膜局在値を測定し、対照値として取得する対照値測定工程、
    　前記目的の条件下で請求項１８に記載の方法に従って細胞膜局在値を測定し、処理値として取得する処理値測定工程、及び
    　得られた前記対照値及び前記処理値に基づいて、変動値を算出する算出工程
    を含む、前記方法。
  20. 　細胞における被験ポリペプチドの細胞膜局在性維持条件をスクリーニングする方法であって、
    　対照条件下で請求項１８に記載の方法に従って細胞膜局在値を測定し、対照値として取得する対照値測定工程、
    　候補条件下で請求項１８に記載の方法に従って細胞膜局在値を測定し、候補値として取得する候補値測定工程、並びに
    　前記候補値が前記対照値と比較して高い場合に、候補条件が前記被験ポリペプチドの細胞膜局在性の維持に適していると判定し、及び／又は
    　前記候補値が前記対照値と比較して低い場合に、候補条件が前記被験ポリペプチドの細胞膜局在性の維持に適していないと判定する判定工程
    を含む、前記方法。
  21. 　前記被験ポリペプチドがGタンパク質共役型受容体である、請求項１８～２０のいずれか一項に記載の方法。
  22. 　細胞における被験ポリペプチドの高次構造形成値又は細胞膜局在値を算出するプログラムであって、
    　コンピュータに、
    　参照用に分取された細胞群から得た参照量を解析し、前記被験ポリペプチドの発現量についての参照範囲を設定する参照範囲設定工程、
    　測定用に分取された細胞群において測定された、前記被験ポリペプチドの被験発現量及び被験提示量に基づいて、前記被験発現量が前記参照範囲内にある細胞についての前記被験発現量及び前記被験提示量の情報を抽出する抽出工程、
    　抽出された前記情報から、前記被験発現量と前記被験提示量の関係式を導出する関係式導出工程、及び
    　前記関係式から高次構造形成値を取得する高次構造形成値取得工程又は
    　前記関係式から細胞膜局在値を取得する細胞膜局在値取得工程
    を実行させるように構成され、
    　前記参照範囲設定工程は、
    　　分取された前記参照用の細胞群において測定された前記被験ポリペプチドの発現量を参照量として取得する参照量取得ステップ、
    　　前記参照量をその発現量について解析する参照量解析ステップ、及び
    　　前記解析の結果に基づいて前記参照範囲を設定する設定ステップ
    　を含む、前記プログラム。
  23. 　前記参照範囲設定工程が、
    　前記細胞の前記被験ポリペプチドの発現量に基づいて、前記細胞毎に前記被験ポリペプチドの発現の有無を確認する確認ステップ、及び
    　前記被験ポリペプチドの発現細胞を含む細胞群のデータを参照用として取得する参照細胞分離ステップ
    をさらに含む、請求項２２に記載のプログラム。
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