WO2025252302A1 - Plasmide mit einer erhöhten replikationsrate - Google Patents

Plasmide mit einer erhöhten replikationsrate

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WO2025252302A1
WO2025252302A1 PCT/EP2024/065398 EP2024065398W WO2025252302A1 WO 2025252302 A1 WO2025252302 A1 WO 2025252302A1 EP 2024065398 W EP2024065398 W EP 2024065398W WO 2025252302 A1 WO2025252302 A1 WO 2025252302A1
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WO
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seq
sequence
plasmid
pas
plasmid vector
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PCT/EP2024/065398
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Ralph KRAFCZYK
Christian BOSCH
Hagen RICHTER
Johanna Koch
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Wacker Chemie AG
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Wacker Chemie AG
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Publication date
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/70—Vectors or expression systems specially adapted for E. coli

Definitions

  • the present invention relates to a plasmid vector comprising a) a replication origin; and b) a PAS region comprising i) a primosome assembly sequence PAS-forward (SEQ ID NO:2) located 3' to the replication origin and in the direction of replication; ii) a primosome assembly sequence PAS-reverse (SEQ ID NO:3) located 3' to the primosome assembly sequence PAS-forward and in the direction opposite to replication; and iii) a sequence X between the primosome assembly sequence PAS-forward and the primosome assembly sequence PAS-reverse, which has at most about 75% sequence identity with SEQ ID NO:1.
  • Plasmid DNA or plasmid vectors represent flexible and easily modifiable sources of recombinant DNA for a wide variety of research, industrial, and pharmaceutical applications. Particularly in the fields of modern medicine and gene therapy, plasmids serve, for example, as important raw materials in the production of mRNA or viral vectors, and can also be used as active ingredients themselves, for example, in the form of DNA vaccines.
  • Plasmid DNA is classically obtained via fermentation using recombinant bacteria, such as Escherichia coli.
  • a selected bacterial strain is transformed with a plasmid carrying the target gene and then cultured under suitable conditions.
  • the bacteria replicate and amplify the contained plasmid and thus the target gene it carries. This process is called cloning and allows for the efficient and sequence-accurate duplication of any target gene.
  • the frequency and efficiency of plasmid replication determine the amount of plasmid that can be obtained from each individual bacterial cell. These parameters depend, among other things, on the properties of the bacterial cell, but especially on the properties of the plasmid used.
  • Plasmids contain regulatory elements that are recognized by proteins of the respective host cell and lead to the expression of cis-acting effectors.
  • a DNA sequence containing the elements necessary for replication is called the origin of replication.
  • the regulatory elements encoded within the origin of replication can be either protein or RNA effectors. Regardless of their molecular structure, however, the mechanism of action is similar: One element assumes a positive regulatory function and initiates replication. A second element influences the expression or function of the first element and represses replication. The relative abundance of the two elements in the cell influences the number of plasmid copies in that cell.
  • RNAI ⁇ sub>1 ⁇ /sub>I is a 553 base pair RNA whose transcription is coordinated by the relatively weak RNAI ⁇ sub>1 ⁇ /sub>I promoter. After transcription, RNAI ⁇ sub>1 ⁇ /sub>I binds to the homologous sequence on the plasmid and initiates replication in a primer-like manner.
  • RNAI ⁇ sub>2 ⁇ /sub>I is a 108 base pair RNA completely homologous to RNAI ⁇ sub>1 ⁇ /sub>I, whose expression is coordinated by the relatively strong RNAI ⁇ sub>2 ⁇ /sub>I promoter.
  • the former inhibits the binding of the latter to the plasmid and thus prevents replication initiation. This interaction is stabilized by the gene product of the rop (repressor of primer) gene, which is encoded on many plasmids.
  • RNAI Since the promoter of RNAI is stronger than the promoter of RNAI I, an increasing number of plasmid copies leads to an overabundance of RNAI, resulting in a complete blockade of replication initiation.
  • the number of plasmid copies is limited by this regulatory mechanism.
  • the regulatory mechanism of plasmid replication must be adapted to maximize plasmid replication without creating an excessive metabolic burden for the bacterial cells used for cloning.
  • lower feeding rates are used in the initial bulking phase of fermentation in some pDNA production processes. However, these adjustments result in a longer fermentation time and thus a longer overall production process.
  • Plasmid titers are also suitable for shortening the fermentation and process duration.
  • plasmid DNA is typically produced in bacteria through a fermentative process.
  • high-copy plasmids such as pUC19 or pVAXl are used.
  • These plasmids represent variants of naturally occurring plasmids that have arisen either through random mutagenesis and selection or through directed design. Fundamental principles for creating high-copy plasmids are based on disrupting the interaction between regulatory elements or adjusting their relative concentrations within the cell.
  • the integration of replication-enhancing sequences has also proven to be an effective means of increasing the number of plasmids produced.
  • the number of copies can be identified.
  • plasmids used for cloning therapeutically relevant target genes possess a variant of the pMBl origin of replication, the so-called pUC origin.
  • pUC origin a variant of the pMBl origin of replication
  • These pUC plasmids differ from pMBl plasmids, i.e., plasmids with a pMBl origin such as pBR322, by the absence of the coding sequence for the regulatory protein Rop. Consequently, the Rop protein, which stabilizes the interaction between RNAI and RNAI ⁇ sub>1 ⁇ /sub>I and thus increases the effectiveness of RNAI, is missing (Tomi zawa et al.
  • RNAI I encoded on pUC plasmids possesses A single base exchange occurs, which, at temperatures above 37 °C, causes a structural change in RNAII. This structural change reduces the affinity of RNAI for RNAII, thus requiring a greater predominance of RNAI to halt replication.
  • RNAI/RNAII interaction is a highly effective means of increasing plasmid copy number. While plasmids with the pMBl origin of replication have a copy number of 10–20 per cell, the copy number of pUC plasmids is several hundred per cell (Shao B et al. Single-cell measurement of plasmid copy number and promoter activity. Nat Commun. 2021 Mar 5; 12 (1): 1475). Because of this beneficial effect, many known high-copy plasmids contain adaptations that further weaken the interaction between RNAI and RNAII, either additionally or in other ways.
  • the RNAI transcript can also be affected by structural changes that lead to an increase in the plasmid copy number per cell.
  • a spontaneous single-base exchange in the RNAI terminator region results in a strong increase in the plasmid copy number in plasmid pBR322 and the closely related plasmid ColEl. This exchange This results in impaired termination of the RNAI transcript, leading to the formation of a significantly longer RNA molecule instead of the 104 base pairs long RNAI.
  • Due to the altered tertiary structure of RNAI binding to RNAII is reduced, resulting in an increase in the plasmid copy number (Boros et al. High-copy-number derivatives of the plasmid cloning vector pBR322. Gene. 1984 Oct;30 (l-3):257-60).
  • RNAI and RNAII can also influence plasmid copy number.
  • the interaction between RNAI and RNAII is largely coordinated by bases located at the tips of three stem loops, situated in the 3' region of the RNAI transcript and the 5' region of the RNAI1 transcript, respectively.
  • EP1326989 describes the isolation of plasmid variants exhibiting substitutions in stem loop 2 (inc2) through undirected mutagenesis and subsequent selection. These plasmid variants showed a significant increase in plasmid copy number compared to the parental variant, which is attributed to a reduced affinity between the regulatory transcripts.
  • RNAI Ribonucleic Acids Res. 1985 Jul 25; 13(14): 5353-67.
  • An extreme form of adjustment of the relative transcript amount involves the complete removal of RNAI-based regulation. This is possible because the RNAI1/RNAI1 overlap region, while regulatory, is not functionally involved in plasmid replication.
  • Both the 108 base pair RNAI gene and the 36 base pair promoter region can be deleted.
  • the plasmid copy number in the cell is regulated solely by the strength or activity of the RNAI promoter.
  • Using an excessively strong RNAI promoter leads to cell-damaging runaway plasmid replication.
  • the use of inducible promoters allows for inducible control of the plasmid copy number by producing only a small amount of RNAI transcript in an early, non-induced phase, thereby preventing runaway plasmid replication (Panayotos, DNA replication regulated by the priming promoter. Nucleic Acids Res. 1984 Mar 26; 12(6): 2641-8).
  • RNAI transcript Another possibility for the controllable reduction of the amount of active RNAI transcript lies in the use of a competitive target sequence in the form of an antisense RNA.
  • This antisense RNA corresponds to the sequence complementary to RNAI and thus ultimately to the 108 base pair long 5' region of RNAI.
  • This principle was applied very early on to increase the plasmid copy number of pBR322 (Bachvarov et al. Construction of a ColEl plasmid bearing inducible high-copy- number phenotype. Folia Microbiol (Prague). 1990; 35(3): 177-82).
  • RNAI1 By integrating an additional, truncated RNAI1 gene, which was placed under the control of an inducible promoter, the copy number of pBR322 could be increased fourfold after induction.
  • the inducible, truncated RNAI1 gene can alternatively be expressed not from the same plasmid, but from a second, non-target plasmid or the bacterial chromosome.
  • An increase in the plasmid replication rate can also be achieved by overexpression of genes whose gene products catalyze the synthesis of nucleoid biosynthesis precursors.
  • the chromosomal integration of the genes rpiA and zwf in DH5a is associated with increased plasmid replication rates.
  • Such adaptations to the production process require the use of genetically modified microorganisms. These genomic adaptations can sometimes lead to changes in the relative molar concentrations of the nucleotides present in the cell.
  • the establishment of imbalances within the naturally occurring nucleotide pool is associated with greatly increased mutation rates in bacterial cells.
  • This SV40 enhancer sequence enables plasmid titers that are higher than those of other high-copy plasmids such as pVAXl (Thermo Fisher Scientific) or gWi z (Genlantis) by a factor of Two are increased.
  • modified plasmid backbones contribute to the more economical production of individual plasmids due to their improved maximum plasmid titers, but require a long fermentation process to reach maximum production capacity. To enable more efficient production, for example of pharmaceutically relevant plasmids, shortening the fermentation process time is of great importance.
  • One object of the invention is to provide plasmid vectors that enable high replication rates with substantially unchanged maximum plasmid titers.
  • An alternative object of the present invention is to provide plasmid vectors that enable the maximum production rate to be reached earlier with substantially unchanged maximum plasmid titers.
  • Another alternative object of the present invention is to provide plasmid vectors that enable the maximum relative plasmid titers to be reached earlier with substantially unchanged maximum plasmid titers.
  • a plasmid vector comprising a) a replication origin; and b) a PAS region comprising i) a primosome assembly sequence PAS-forward ( SEQ ID NO : 2 ) , which is localized 3' of the replication origin and in the direction of replication; ii) a primosome assembly sequence PAS-revers ( SEQ ID NO : 3 ) which is located 3 ' of the primosome assembly sequence PAS-forward and in the direction opposite to replication; and iii) a sequence X between the primosome assembly sequence PAS-forward and the primosome assembly sequence PAS-revers which has at most about 75% sequence identity with SEQ ID NO : 1 .
  • the plasmid vector according to the invention comprises a plasmid backbone into which a specific DNA sequence, namely a specific PAS region, has been inserted 3' of the origin of replication.
  • a specific DNA sequence namely a specific PAS region
  • the integration of this specific PAS region enables the maximum production rate to be reached earlier, with essentially unchanged high plasmid titers.
  • up to approximately 90% of the maximum plasmid titer can be achieved after approximately 24 hours of fermentation, whereas with analogous plasmids lacking the PAS region according to the invention, usually no more than approximately 60% of the maximum plasmid titer is reached after 24 hours of fermentation.
  • the present invention enables a reduction in fermentation time at very high, economically satisfactory plasmid titers by increasing the replication rate. This allows the fermentation process to be shortened by approximately half the time typically required in the prior art without significant loss of product yield. This enables both the more economical production of individual plasmids and increased flexibility within a production plant.
  • nucleic acid sequence refers to a person skilled in the art and refer to an individual and specific sequence of nucleotides.
  • nucleic acid refers to a sequence of nucleotides of any length, either ribonucleotides or deoxyribonucleotides. These terms include single-stranded and double-stranded DNA or RNA, genomic DNA, cDNA, mRNA, saRNA, gRNA, siRNA, miRNA, or circRNA, which may include purine and pyrimidine bases, nucleotide analogues, or other naturally occurring, chemically or biochemically modified, non-natural, or derivatized nucleotide bases.
  • Plasmid vector can be, for example, expression vectors, cloning vectors, transfer vectors, or storage vectors, or combinations thereof.
  • An expression vector can be used for the production of Expression products, such as mRNA, peptides, polypeptides, or proteins, are used.
  • a cloning vector is typically a vector that contains a cloning site, which can be used to insert nucleic acid sequences into the vector, for example, a nucleic acid sequence with an open reading frame.
  • a transfer vector is a vector suitable for transferring nucleic acid molecules into cells or organisms.
  • a storage vector is a vector that allows for the convenient storage of a nucleic acid molecule, such as an mRNA molecule. Thus, a storage vector can contain a sequence that corresponds, for example, to a desired mRNA sequence or a portion thereof.
  • sequence identity refers to the similarity of two nucleotide sequences, or amino acid sequences, expressed as a percentage. Sequence identity depends on the number of identical positions between the two sequences, taking into account the number and length of gaps that must be introduced to achieve optimal sequence alignment. As used here, sequence identity is determined using the Clustal Omega program with the default settings (Sievers et al. Fast, scalable generation of high-quality protein multiple sequence alignments using Clustal Omega. Molecular Systems Biology 7:539, 2011). It is known to those skilled in the art that sequence identity using the Clustal Omega program for nucleotide or amino acid sequences can be easily determined on the EMBL-EBI website.
  • homologous genes or “homologous sequences” here means that the DNA sequences of these genes or DNA segments are at least 70%, preferably at least 80%, identical to the original DNA sequence. preferably to at least 90% and particularly preferably to at least 95% identical, i.e., exhibiting a corresponding sequence identity.
  • the term "randomized sequence” means a nucleotide sequence in which each position has an independent and equal probability of being any nucleotide.
  • the random nucleotides can be any nucleotides, e.g., G, A, C, T, U, or chemical analogues thereof, in any order, where G represents guanyl nucleotides, A represents adenyl nucleotides, T represents thymidyl nucleotides, C represents cytidyl nucleotides, and U represents uracyl nucleotides.
  • origin of replication refers to a specific sequence at which DNA replication is initiated.
  • origin of replication encompasses both prokaryotic origins, such as bacterial origins, and eukaryotic origins, such as those found in mammals.
  • promoter refers to a DNA regulatory region located upstream (5’) of a coding sequence of a gene or a non-coding sequence, capable of binding an RNA polymerase and triggering the transcription of a downstream (3’) coding or non-coding sequence.
  • Suitable promoters can be derived from any organism, including prokaryotic and eukaryotic organisms.
  • a promoter can direct the transcription of a prokaryotic or eukaryotic gene.
  • a promoter may include additional recognition or binding sites for other factors involved in the regulation of gene transcription.
  • a promoter may be a constitutively active promoter, That is, a promoter that is constitutively in an active state, or it can be an inducible promoter, that is, a promoter whose state is controlled by an external stimulus, for example, being switched from an inactive to an active state.
  • an external stimulus could be, for example, a specific temperature, a compound, or a protein.
  • Constitutively active and inducible promoters are known to those skilled in the art.
  • inducible promoters examples include the lac promoter, which is inducible by isopropyl- ⁇ -D-thiogalactopyranoside (IPTG), the tetracycline-regulated promoter, the rhamnose-inducible promoter, and the arabinose promoter, which is inducible by arabinose.
  • lac promoter which is inducible by isopropyl- ⁇ -D-thiogalactopyranoside (IPTG)
  • IPTG isopropyl- ⁇ -D-thiogalactopyranoside
  • tetracycline-regulated promoter the tetracycline-regulated promoter
  • rhamnose-inducible promoter the rhamnose-inducible promoter
  • arabinose promoter which is inducible by arabinose.
  • operatively associated with a promoter means that the promoter causes or regulates the transcription of DNA that codes for a gene.
  • a "PAS region” here means a nucleotide sequence bounded in the 5' direction by a primosome assembly sequence on the light strand and in the 3' direction by a primosome assembly sequence on the heavy strand, encompassing both primosome assembly sequences and, if applicable, the nucleotide sequence located between them.
  • the light strand is defined as the strand of a plasmid that has a lower number of purine bases relative to the complementary strand
  • the heavy strand is defined as the strand of a plasmid that has a higher number of purine bases relative to the complementary strand.
  • a “primosome assembly sequence” here means a sequence to which at least one, preferably several, primosomes are attached. Proteins involved in replication bind to form a
  • a “titer” or “plasmid titer” within the meaning of the present invention is defined as the amount of plasmid product obtained during the fermentation of a bacterial strain.
  • the titer is expressed as the concentration of the plasmid product per fermentation volume in nmol/L or mg/ml.
  • production rate means a time derivative of the plasmid titer obtained during fermentation.
  • the production rate is given as plasmid titer per fermentation time (mg/L/h).
  • the present invention relates to a plasmid vector comprising a) a replication origin; and b) a PAS region comprising i) a primosome assembly sequence PAS-forward (SEQ ID NO:2) located 3' of the replication origin and in the direction of replication; ii) a primosome assembly sequence PAS-reverse (SEQ ID NO:3) located 3' of the primosome assembly sequence PAS-forward and in the direction opposite to replication; and iii) a sequence X between the primosome assembly sequence PAS-forward and the primosome assembly sequence PAS-reverse, which has at most about 75% sequence identity with SEQ ID NO:1.
  • the plasmid vector according to the invention comprises at least one
  • the plasmid vector comprises exactly a replication origin.
  • the replication origin can be any replication origin that mediates autonomous replication in the host cell in question. Examples of suitable replication origins are pUC, pMBl, ColEl, or pl5A, or a functionally active variant thereof.
  • the replication origin is a pUC replication origin.
  • the pUC replication origin comprises the SEQ ID NO: 4.
  • the plasmid vector of the present invention comprises a specific PAS region.
  • the PAS region includes a primosome assembly sequence PAS-forward (SEQ ID NO: 2).
  • the PAS-forward is located 3' from the origin of replication and in the direction of replication.
  • the distance of the primosome assembly sequence PAS-forward from the origin of replication can be chosen arbitrarily. In a preferred embodiment, the distance of the PAS-forward from the origin of replication is between about 110 and about 200 base pairs, more preferably between about 115 and about 150 base pairs, further preferably between about 115 and about 140 base pairs, and even more preferably between about 118 and 130 base pairs.
  • the PAS region further includes a primosome assembly sequence PAS-revers ( SEQ ID NO : 3 ) which is located 3 ' of the primosome assembly sequence PAS-forward and in the direction opposite to replication .
  • a primosome assembly sequence PAS-revers SEQ ID NO : 3
  • the PAS region comprises a sequence X between the primosome assembly sequence PAS-forward and the primosome assembly sequence PAS-reverse.
  • the sequence X according to the invention is characterized in that it has at most approximately 75% sequence identity with SEQ ID NO: 1.
  • sequence X has at most 75% sequence identity with SEQ ID NO:1.
  • sequence X has at most about 70%, preferably at most 70%, sequence identity with SEQ ID NO:1.
  • sequence X has at most about 65%, preferably at most 65%, sequence identity with SEQ ID NO:1.
  • sequence X has at most about 60%, preferably at most 60%, sequence identity with SEQ ID NO:1. In a further preferred embodiment, sequence X has at most about 55%, preferably at most 55%, sequence identity with SEQ ID NO:1. In a further preferred embodiment, sequence X has at most about 50%, preferably at most 50%, sequence identity with SEQ ID NO:1.
  • the sequence X has a length of about 100 to about 200 base pairs, more preferably a length of about 120 to about 180 base pairs, more preferably a length of about 130 to about 170 base pairs, more preferably a length of about 140 to about 160 base pairs, even more preferably a length of about 148 to about 150 base pairs, and most preferably a length of about 149 base pairs. In a particularly preferred embodiment, the sequence X has a length of 149 base pairs.
  • the PAS region 3' of a replication origin is integrated into a plasmid vector.
  • the PAS region comprises a primosome assembly sequence PAS-forward (PAS-for) with the sequence SEQ ID NO: 2, a primosome assembly sequence PAS-revers (PAS-rev) with the sequence SEQ ID NO: 3, and a sequence located between PAS-forward and PAS-revers (sequence X).
  • the plasmid vector has no other sequences besides the PAS region according to the invention.
  • the plasmid vector has no further primosome assembly sequences besides those of the PAS region.
  • the PAS region according to the invention is based on the PAS region of plasmid pBR322 (Marians et al. Maximal Limits of the Escherichia coli Replication Factor Y Effector Site Sequences in pBR322 DNA, J Biol Chem. 1982 May 25;257 (10):5656-62). Surprisingly, it was found that a modification of this sequence results in an increased production rate and improved replication efficiency.
  • sequence segment (SEQ ID NO: 1) was modified such that the sequence identity of the resulting modified sequence (sequence X) to the corresponding sequence segment within the PAS region of plasmid pBR322 (SEQ ID NO: 1) is at most 75%.
  • sequence identity of the resulting modified sequence (sequence X) to the corresponding sequence segment within the PAS region of plasmid pBR322 (SEQ ID NO: 1) is at most 75%.
  • sequence segments are identical to the PAS region of plasmid pBR322.
  • the modification of the PAS region of the plasmid pBR322, i.e., the reduction of the sequence identity of sequence X, can be performed starting from SEQ ID NO:1 by any method known in the field.
  • the reduction of sequence identity is achieved, for example, by substitution of base pairs.
  • the reduction of sequence identity is achieved by randomized substitution or randomization of the sequence SEQ ID NO:1 or one
  • sequence order of variable-sized segments within SEQ ID NO:1 is randomized, and the resulting randomized sequences are used to substitute the corresponding sequence order of SEQ ID NO:1.
  • sequence order of the entire SEQ ID NO:1 is randomized, and the resulting randomized sequence is used to substitute SEQ ID NO:1.
  • the randomization of the base sequence can be performed, for example, using the online tool "Shuffle DNA" (https://www.bioinformatics.org/sms2/shuffle_dna.html). This randomization does not add or remove bases not present in the sequence.
  • the relative proportion of G/C bases in relation to A/T bases is not changed; only the sequence of bases contained in the sequence is changed.
  • the sequence SEQ ID NO:1 is substituted by a modified sequence X.
  • the modified sequence X can have more or fewer base pairs, or the same number of base pairs as SEQ ID NO:1. In a preferred embodiment, the modified sequence X has the same number of base pairs as SEQ ID NO:1.
  • the plasmid vector is inserted between the 3' of the origin of replication PAS-forward (SEQ ID NO: 2) and PAS-reverse (SEQ ID NO:3) primosome assembly sequences located at the origin of replication.
  • the plasmid vector according to the invention comprises the sequence SEQ ID NO: 6 as sequence X.
  • the PAS region preferably has the SEQ ID NO: 7.
  • the plasmid vector according to the invention comprises the sequence SEQ ID NO: 8 as sequence X.
  • the PAS region preferably has the SEQ ID NO: 9.
  • the plasmid vector according to the invention comprises the sequence SEQ ID NO: 10 as sequence X.
  • the PAS region preferably has the SEQ ID NO: 11.
  • the plasmid vector according to the invention comprises the sequence SEQ ID NO: 12 as sequence X.
  • the PAS region preferably has the SEQ ID NO: 13.
  • the plasmid vector according to the invention comprises the sequence SEQ ID NO: 14 as sequence X.
  • the PAS region preferably has the SEQ ID NO: 15.
  • the plasmid vector according to the invention comprises the sequence SEQ ID NO: 16 as sequence X.
  • the PAS region preferably has the SEQ ID NO: 17.
  • sequence X is selected from the group consisting of SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, and SEQ ID NO: 16.
  • Sequence X selected from the group consisting of SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, and SEQ ID NO: 14 is particularly preferred.
  • Sequence X selected from the group consisting of SEQ ID NO: 10 and SEQ ID NO: 12 is even more preferred.
  • the plasmid vector according to the invention does not contain a rop gene.
  • transcription and translation of these partial sequences does not yield a functional ROP gene.
  • the plasmid vector of the invention comprises an insertion sequence with at least one recognition site for at least one restriction endonuclease.
  • the insertion sequence comprises a nucleic acid region that has one or more recognition sequences or recognition sites for one or more restriction endonucleases.
  • the plasmid vector comprises an insertion sequence with several consecutive recognition sequences for several different restriction endonucleases.
  • Each of the recognition sequences can be used for cleavage of the plasmid vector and integration of a nucleic acid.
  • a nucleic acid with an open reading frame sequence is integrated.
  • the nucleic acid can encode any gene of interest, for example, a reporter gene such as GFP, a gene for the expression of a any target protein, a gene that serves as a template for the production of mRNA, or a gene for the production of a viral particle.
  • a reporter gene such as GFP
  • a gene for the expression of a any target protein e.g., GFP
  • a gene that serves as a template for the production of mRNA e.g., a gene for the expression of a viral particle.
  • the plasmid vector according to the invention comprises a selection marker, wherein the selection marker is preferably selected from the group consisting of an antibiotic resistance gene, a toxin, an antitoxin, and a reporter element.
  • the selection marker is suitable for distinguishing those host cells containing the plasmid vector from those host cells that do not contain the plasmid vector.
  • Suitable selection markers are known to those skilled in the art. For example, genes encoding antibiotic resistance, a toxin, an antitoxin, or a reporter element are suitable as selection markers.
  • auxotrophy markers encoding an essential gene that is deleted in the respective bacterial strain containing the plasmid are suitable as selection markers.
  • Suitable genes that confer antibiotic resistance are known to a person skilled in the art.
  • the preferred antibiotic against which resistance is conferred by the selection marker is chosen from the group consisting of ampicillin, tetracycline, kanamycin, geneticin, chloramphenicol, spectinomycin, hygromycin, sulfonamide, trimethoprim, bleomycin, zeocin, gentamicin, and blistidin.
  • Suitable selection markers also include toxins such as sacB and hok, antitoxins such as sacB antisense RNA and sok, and reporter elements such as GFP.
  • the plasmid vector according to the invention exhibits a higher replication rate in fermentation culture after 24 h compared to an analogous plasmid vector with the unmodified sequence SEQ ID NO : 1 , i.e., with a plasmid vector that is identical except for the modified sequence.
  • Sequence X is identical to the plasmid vector according to the invention.
  • a higher replication rate means that at a certain time point in the fermentation culture, for example after about 24 h, preferably at least 120%, more preferably at least 130%, even more preferably at least 140%, particularly preferably at least 150%, and especially preferably at least 160% of the plasmid titer is obtained, compared to an analogous plasmid vector with the unmodified sequence SEQ ID NO : 1, i.e., with a plasmid vector that is identical to the plasmid vector according to the invention except for the modified sequence X.
  • the plasmid vector of the present invention reaches at least about 70% of the maximum plasmid titer after 24 h in fermentation culture, which is reached after about 30 h to 42 h, preferably after about 42 h. More preferably, the plasmid vector reaches at least about 75% of the maximum plasmid titer after 24 h in fermentation culture, which is reached after about 30 h to 42 h, preferably after about 42 h. More preferably, the plasmid vector reaches at least about 80% of the maximum plasmid titer after 24 h in fermentation culture, which is reached after about 30 h to 42 h, preferably after about 42 h. Even more preferably, the plasmid vector according to the invention reaches at least about 85% of the maximum plasmid titer after 24 h in fermentation culture, which is reached after about 30 h to 42 h, preferably after about 42 h.
  • the present invention relates to a method for cloning DNA sequences using the plasmid vector of the invention.
  • a DNA sequence of interest is cloned into a plasmid vector according to the invention, preferably into an insertion sequence. which is present on the plasmid vector.
  • the plasmid vector thus obtained with the inserted DNA sequence of interest is introduced into a suitable bacterial strain, and the resulting bacteria with the introduced plasmid vector are cultured in a suitable fermentation medium. After a specific period, the bacteria are harvested, the cell pellet is isolated, the cells are lysed, and the plasmid vector is isolated.
  • Any bacterial strain suitable for plasmid production can be used for a fermentation culture. Suitable bacterial strains for plasmid production are well known to those skilled in the art.
  • the bacterial strain is preferably characterized by being a Gram-negative bacterium, more preferably a strain of the genus Enterobacteriaceae, particularly preferably a strain of the species Escherichia coli (E. coli), especially preferably E. coli K12 or E. coli B.
  • the process for the fermentative production of plasmid DNA is carried out such that the fermentation volume or production scale is at least about 0.5 liters, preferably the fermentation volume is at least about 10 liters, more preferably at least about 300 liters, particularly preferably at least about 1000 liters and even more preferably at least about 10,000 liters.
  • Media for cultivating the production strain in shake flasks and fermenters are familiar to those skilled in the art of microbial cultivation. They typically consist of a carbon source, a nitrogen source, and additives such as vitamins, salts, and trace elements, which optimize cell growth and plasmid production.
  • all common media known to those skilled in the art for cultivating microorganisms are suitable as fermentation media. These include complex media, mineral salt media, or minimal salt media to which a specific proportion of complex components, such as yeast extract, is added.
  • additional components can be added to the medium to improve cell growth, for example, vitamins, salts, amino acids, and/or trace elements.
  • all sugars, sugar alcohols, or organic acids, or their salts, that are usable by host cells can be used as a carbon source for fermentation.
  • carbon sources are acetic acid and its derived acetate salts, ethanol, glycerol, citric acid and their salts, or pyruvate and their salts.
  • Preferred carbon sources for fermentation are selected from the group consisting of glucose, fructose, sucrose, mannose, xylose, and arabinose, as well as mixtures thereof.
  • Particularly preferred carbon sources for fermentation are glucose and sucrose, with glucose being especially preferred.
  • the carbon source can be completely introduced into the fermentation medium at the beginning of the fermentation, or none or only a portion of the carbon source can be introduced at the beginning and added during the course of the fermentation.
  • a preferred embodiment involves introducing part of the carbon source at the beginning and adding part during the course of the fermentation.
  • Suitable nitrogen sources include ammonia, either gaseous or in aqueous solution as NH4OH, or salts of ammonia, such as ammonium sulfate, ammonium chloride, ammonium phosphate, ammonium acetate, or ammonium nitrate.
  • Other suitable nitrogen sources include nitrate salts, such as KNO3, NaNOa, ammonium nitrate, Ca(NOa)2, and Mg(NOa)2.
  • Further suitable nitrogen sources include urea and complex amino acid mixtures such as yeast extract, proteose peptone, malt extract, soy peptone, or casamino acids.
  • salts of the elements phosphorus, chlorine, sodium, magnesium, nitrogen, potassium, calcium, and/or iron can be added to the fermentation medium, as well as trace amounts of salts of the elements molybdenum, boron, cobalt, manganese, zinc, copper, and/or nickel.
  • Organic acids such as citrate, amino acids such as isoleucine, and vitamins such as vitamin B1 or vitamin B6 can also be added.
  • Other additives include all types of fatty acids, monocarboxylic acids, or dicarboxylic acids, in the form of free fatty acids or salts thereof.
  • Fermentation takes place under pH and temperature conditions that promote the growth and plasmid vector production of the respective host cells.
  • the pH of the fermentation culture is usually preferably between approximately pH 5 and pH 9. More preferred is a pH range of approximately pH 5.5 to pH 8. Particularly preferred is a pH range of approximately pH 6.0 to pH 7.5.
  • the temperature of the culture is typically preferably between about 20°C and about 40°C. A temperature range between about 25°C and about 37°C is preferred, and a temperature range between about 30°C and about 37°C is particularly preferred.
  • the cultivation period in the process according to the invention is preferably between about 10 h and about 96 h.
  • a cultivation period of about 20 h to about 72 h is preferred.
  • a cultivation period of about 20 h to about 48 h is further preferred. More preferably, the cultivation period is about 20 h to about 28 h, even more preferably about 22 h to about 26 h, still more preferably about 23 h to about 25 h, and most preferably about 24 h.
  • the growth of the production strain can take place in an anaerobic cultivation without oxygen supply, or in an aerobic cultivation with oxygen supply.
  • the inventive method is preferably carried out in an aerobic cultivation with oxygen.
  • a The oxygen content is set to a saturation of at least about 10% (v/v), particularly preferably at least about 25% (v/v), and even more preferably at least about 50% (v/v).
  • Methods and devices for regulating the oxygen saturation in a fermentation culture are known to those skilled in the art.
  • the regulation of the oxygen saturation is carried out automatically, according to the prior art, by a combination of gas supply and stirring speed.
  • Oxygen supply can be achieved by any suitable method, for example, by introducing compressed air or pure oxygen.
  • oxygen supply is achieved by introducing compressed air.
  • the compressed air supply range for aerobic cultivation is, for example, from approximately 0.05 volumes of compressed air per volume of fermentation medium per minute (vvm) to approximately 10 vvm.
  • the compressed air supply ranges from approximately 0.2 vvm to approximately 8 vvm, more preferably from approximately 0.4 to approximately 6 vvm, and particularly preferably from 0.8 to 5 vvm.
  • the stirring speed during fermentation in the process according to the invention is, for example, about 700 revolutions per minute (rpm), preferably about 1800 rpm, more preferably about 2500 rpm, and particularly preferably about 3000 rpm.
  • the cultivation of the host cells is carried out in so-called batch mode.
  • a culture medium is inoculated with a starter culture of host cells carrying a plasmid vector according to the invention. Cell growth then occurs without further feeding from nutrient sources.
  • cultivation takes place in the so-called fed-batch mode, also known as infeed mode.
  • biomass is obtained by adding additional nutrient sources after an initial growth phase in batch mode. These are referred to as feed or infeed.
  • the infeed can consist of the carbon source, the nitrogen source, one or more vitamins or trace elements important for production, or a combination of these components.
  • the components can be added to the infeed as a mixture or separately. Additionally, other media components and specific additives that increase plasmid production, such as amino acids, can also be added to the infeed.
  • the infeed can be supplied continuously or discontinuously in portions. A combination of continuous and discontinuous infeed is also possible.
  • the method for cloning DNA sequences using the plasmid vector according to the invention is a fermentative method in fed-batch mode.
  • preferred carbon sources in the feed are selected from glucose, sucrose, glucose- or sucrose-containing vegetable hydrolysates, as well as mixtures thereof in any desired mixing ratio.
  • a particularly preferred carbon source in the feed is glucose.
  • the carbon source is added to the culture in such a way that the content of The carbon source in the fermenter during the production phase does not exceed approximately 10 g/L.
  • the maximum concentration of the carbon source in the fermenter during the production phase is approximately 2 g/L, more preferably approximately 0.5 g/L, and particularly preferably approximately 0.1 g/L.
  • Figure 1 shows a schematic representation of a section of the plasmid vector according to the invention with the origin of replication and the PAS region with the primosome assembly sequence PAS-for, the primosome assembly sequence PAS-rev and the sequence X between PAS-for and PAS-rev.
  • FIG. 2 shows a schematic plasmid map of the pVAXl plasmid.
  • pCMV refers to the cytomegalovirus promoter.
  • Kanamycin refers to the kanamycin resistance gene.
  • BGH pA refers to the polyA region of the bovine growth hormone gene.
  • FIG. 3 shows a schematic representation of different PAS regions.
  • PASBR322 denotes the PAS region of the control plasmid pVAX1-PASBR322.
  • PAS 09, PAS 10, PAS 18, PAS31, PAS38, and PAS39 denote PAS regions with different modified sequence segments.
  • the light bar indicates the sequence segment that is modified relative to SEQ ID NO: 1.
  • Figure 4 shows the plasmid titer [nmol/L ] of different plasmid vectors according to the invention in fermentation culture at time 24 hours, as well as at time 42 hours .
  • Figure 5 shows the relative plasmid titer of different plasmid vectors according to the invention after fermentation over 24 hours. The percentage of this titer is given in relation to the titer obtained after 42 hours.
  • SEQ ID NO:1 was used as the reference sequence. All sequences X to be compared with SEQ ID NO:1 were compared to the reference sequence in a pairwise sequence alignment (mBed algorithm; cluster size for mBed Guide Trees: 100) created using the Clustal Omega 1.2.2 alignment tool integrated into Geneious Prime® 2023.0.2 Build 2023-01-09 11:52. Within the sequence comparison, all positions with identical bases in both the reference sequence and the sequence being compared were counted. The number of these identical positions was then divided by the total number of bases in the reference sequence to determine the percentage of sequence identity.
  • mBed algorithm cluster size for mBed Guide Trees: 100
  • Example 1 Production of the plasmid production strain E. coli WCM105 AfliC AyddS AendA
  • the starting strain for the generation of the bacterial strain E. coli WCM105 AfliC AyddS AendA was the one described in EP2418276 Bl.
  • the bacterial strain E. coli WCM105 AfliC AyddS is used, which in turn was generated from the strain E. coli WCM105.
  • E. coli WCM105 is producible according to EP0338410B1.
  • the pKD3 derivative was generated as follows: Regions PCR01 (SEQ ID NO: 21) and PCR02 (SEQ ID NO: 24), each 250 base pairs long and homologous to the wild-type endA gene, or to upstream and downstream regions, were first amplified using the oligonucleotides Pp489 (SEQ ID NO: 19) and Pp490 (SEQ ID NO: 20) and Pp493 (SEQ ID NO: 22) and Pp494 (SEQ ID NO: 23), respectively, and chromosomal DNA of strain WCM105 AfliC AyddS as a template.
  • the cat expression cassette (SEQ ID NO: 27) was amplified using the oligonucleotides Pp491 (SEQ ID NO: 25) and Pp492 (SEQ ID NO: 26) and pKD3 as a template.
  • the resulting amplicons were then combined by overlap extension PCR (Horton et al. 2013, Gene Splicing by Overlap Extension: Tailor-Made Genes Using the Polymerase Chain Reaction, BioTechniques 54, 129-33) to form a combined amplicon PCR04 (SEQ ID NO: 28), and this was inserted into the plasmid pKD3, which had been cut with the restriction enzymes Paei and Ndel (Thermo Fisher Scientific).
  • the resulting plasmid was designated pKD3-AendA.
  • the PCR for amplification of the cat cassette was performed using pKD3-AendA as a template and the Oligonucleotides Pp495 (SEQ ID NO:29) and Pp496 (SEQ ID NO:30) were synthesized.
  • the first 250 nucleotides of amplicon PCR05 are homologous to the 5'-side sequence of the open reading frame (ORF) of the endA gene, and the last 250 nucleotides of amplicon PCR05 are homologous to the 3'-side sequence of the endA ORF. This resulted in the linear DNA fragment PCR05 (SEQ ID NO:31), which contained the cat cassette.
  • the strain E. coli WCM105 AfliC AyddS was transformed with the plasmid pKD46 (Coli Genetic Stock Center CGSC#: 7739), resulting in the strain E. coli WCM105 AfliC AyddS pKD46. Competent cells of the strain WCM105 AfliC AyddS pKD46, prepared according to the procedure described by Datsenko and Wanner (so), were transformed with the linear DNA fragment PCR05 (SEQ ID NO:31) containing the cat cassette.
  • the plasmid pKD46 was cured by cultivation at the non-permissive temperature 37 °C and the strain E.coli WCM105 AfliC AyddS endA: : cat was isolated by selection on LB agar plates and LB agar chloramphenicol (20 mg/1 ) plates.
  • the cat cassette was removed from the chromosome of E. coli WCM105 EfliC EyddS endA : cat.
  • the strain E. coli WCM105 EfliC EyddS endA: : cat was transformed with the plasmid pCP20 (Cherepanov et al.
  • E. coli WCM105 EfliC EyddS EendA as a template.
  • the sequence of the original endA locus was verified by sequencing the PCR product.
  • the resulting strain was named E. coli WCM105 EfliC EyddS EendA.
  • the plasmid pVAXl (Thermo Fisher Scientific, see Figure 2) was used as the starting vector for the production of a control plasmid containing the PAS region of plasmid pBR322.
  • pVAXl was linearized by cutting with the restriction enzymes Bsp68I and Hindi (Thermo Fisher Scientific).
  • the 444 base-pair amplicon PCR06 (SEQ ID NO: 36), containing the PAS region, was generated by PCR.
  • the amplicon PCR06 was generated from pBR322.
  • the first 21 nucleotides of Pp237 are homologous to the 5'-soapy sequence of the Bsp68I site, and the first 21 nucleotides of Pp073 are homologous to the 3'-located sequence of the Hindi site.
  • the amplicon PCR06 was integrated into the linearized plasmid pVAXl by in-fusion cloning (Takara Bio). Plasmids that successfully integrated the amplicon were identified by colony PCR using the oligonucleotides Pp081 (SEQ ID NO: 37) and pVAXl-seq-rv (SEQ ID NO: 38).
  • the integrated sequence was verified by Sanger sequencing using the oligonucleotides pVAXl-seq2-rv (SEQ ID NO: 39) and pVAXl-seq23-fw (SEQ ID NO: 40).
  • the resulting control plasmid was named pVAXl-PASBR322.
  • the plasmid pVAXl (Thermo Fisher Scientific, see Figure 2) was used as the starting vector for the production of the plasmid pVAXl-PAS09.
  • the sequence of 64 consecutive nucleobases located 22 base pairs apart (3') of the PAS-for sequence was randomized.
  • the base sequence randomization was performed using the online tool "Shuffle DNA”.
  • This process initially generated PAS region 09 (SEQ ID NO: 7) in silico.
  • a DNA fragment containing PAS region 09 (SEQ ID NO: 60) was then created using gene synthesis (GeneArt). This DNA fragment was integrated into the plasmid pVAXl, which had been linearized by restriction enzyme cutting with Bsp68I and Hindi (Thermo Fisher Scientific), using in-fusion cloning (Takara Bio). Plasmids that had successfully integrated the fragment were identified by colony PCR using the oligonucleotides Pp081 (SEQ ID NO:37) and pVAXl-seq-rv (SEQ ID NO:38).
  • Verification of the integrated sequence was performed by Sanger sequencing using the oligonucleotides pVAXl-seq2-rv (SEQ ID NO:39) and pVAXl-seq23-fw (SEQ ID NO:40).
  • the resulting plasmid was designated pVAXl-PAS09.
  • the plasmid pVAXl (Thermo Fisher Scientific, see Figure 2) was used as the starting vector for the production of the plasmid pVAXl-PASlO.
  • the integrated sequence was verified by Sanger sequencing using the oligonucleotides pVAX-seq2-rv (SEQ ID NO: 39) and pVAX-seq23-fw (SEQ ID NO: 40).
  • the resulting plasmid was designated pVAXl-PASlO.
  • the plasmid pVAXl (Thermo Fisher Scientific, see Figure 2) was used as the starting vector for the production of plasmid pVAXl-PAS18.
  • the sequence of 64 consecutive nucleobases located 22 base pairs 3' apart from the PAS-for sequence was replaced, as previously described, by the randomized sequence segment PAS09 (SEQ ID NO: 41), and the sequence of 63 consecutive nucleobases located 86 base pairs 3' apart from the PAS-for sequence was replaced, as previously described, by the randomized sequence segment PAS10 (SEQ ID NO: 58).
  • a fragment (SEQ ID NO: 62) generated by gene synthesis (GeneArt) and containing the PAS18 region was integrated, as previously described, into the plasmid pVAXl linearized by restriction enzyme cut with Bsp68I and Hindi. Plasmids that successfully integrated the fragment were identified by colony PCR using the oligonucleotides Pp081 (SEQ ID NO: 37) and pVAXl-seq-rv (SEQ ID NO: 38). Verification of the integrated sequence was performed by Sanger sequencing using the oligonucleotides pVAX-seq2-rv (SEQ ID NO: 39) and pVAXl-seq23-fw. (SEQ ID NO: 40) . The resulting plasmid was named pVAXl-PAS18 .
  • the plasmid pVAXl (Thermo Fisher Scientific, see Figure 2) was used as the starting vector for the production of the plasmid pVAXl-PAS31.
  • the sequence of 22 consecutive nucleobases located immediately 3' of the PAS-for sequence was randomized using the online tool "Shuffle DNA" as previously described. This process generated the randomized sequence segment PAS31 (SEQ ID NO: 59). Within the PAS region BR322, the 22 nucleobases located immediately 3' of the PAS-for sequence were substituted by the randomized sequence segment PAS31 (SEQ ID NO: 59) as previously described.
  • PAS9 SEQ ID N0:41
  • PAS10 SEQ ID NO: 58
  • Plasmids containing the combined The amplicons that had successfully integrated were identified by colony PCR using the oligonucleotides Pp081 (SEQ ID NO: 37) and pVAXl-seq-rv (SEQ ID NO: 38). Verification of the integrated sequence was performed by Sanger sequencing using the oligonucleotides pVAXl-seq2-rv (SEQ ID NO: 39) and pVAXl-seq23-fw (SEQ ID NO: 40). The resulting plasmid was designated pVAXl-PAS31.
  • the plasmid pVAXl (Thermo Fisher Scientific, see Figure 2) was used as the starting vector for the production of the plasmid pVAXl-PAS38.
  • the sequence of 64 consecutive nucleobases located 22 base pairs apart (3' of the PAS-for sequence) was substituted, as previously described, by the randomized sequence segment PAS10 (SEQ ID NO: 58). This process initially generated the PAS region 38 (SEQ ID NO: 15) in silico.
  • oligonucleotides Pp335 (SEQ ID NO: 42) and Pp384 (SEQ ID NO: 48) or Pp385 (SEQ ID NO: 49) and pVAX-seq2-rv (SEQ ID NO: 39), as well as pVAXl-PASBR322 as a template, the amplicons PCR09 (SEQ ID NO: 50) and PCR10 (SEQ ID NO: 51) were generated. The resulting amplicons were then combined into a single amplicon (SEQ ID NO: 52) by overlap-extension PCR (Horton et al.
  • Plasmids that had successfully integrated the combined amplicon were identified by colony PCR using the oligonucleotides Pp081 (SEQ ID NO: 37) and pVAX1-seq-rv (SEQ ID NO: 38). Verification of the integrated sequence was performed by Sanger sequencing using the oligonucleotides pVAX2-rv (SEQ ID NO: 39) and pVAX23-fw. (SEQ ID NO: 40) . The resulting plasmid was named pVAXl-PAS38 .
  • the plasmid pVAXl (Thermo Fisher Scientific, see Figure 2) was used as the starting vector for the production of the plasmid pVAXl-PAS39.
  • the sequence of 63 consecutive nucleobases located 86 base pairs apart (3' of the PAS-for sequence) was substituted, as previously described, by the randomized sequence segment PAS09 (SEQ ID NO: 41). This process initially generated the PAS region 39 (SEQ ID NO: 17) in silico.
  • Plasmids that had successfully integrated the combined amplicon were identified by colony PCR using the oligonucleotides Pp081 (SEQ ID NO: 37) and pVAXl-seq-rv (SEQ ID NO: 38). Verification of the integrated sequence was achieved by Sanger sequencing using the oligonucleotides pVAX-seq2-rv (SEQ ID NO: 39) and pVAX-seq23-fw (SEQ ID NO: 40). The resulting plasmid was designated pVAXl-PAS39.
  • Example 3 Fermentative production of plasmid DNA on a 1 L scale
  • the strain E For the production of the plasmid vectors pVAXl-PASBR322, pVAXl-PAS09, pVAXl-PASlO, pVAXl-PAS18, pVAXl-PAS31, pVAXl-PAS38, and pVAXl-PAS39, the strain E.
  • coli WCM105 EfliC EyddS EendA was individually transformed with each of the plasmids pVAXl, pVAXl-PASBR322, pVAXl-PAS09, pVAXl-PASlO, pVAXl-PAS18, pVAXl-PAS31, pVAXl-PAS38, and pVAXl-PAS39 using the CaC12 method. Selection for plasmid-containing cells was performed using kanamycin (20 mg/L).
  • the production of the individual, transformed strains was carried out in 1 stirred tank fermenters (Eppendorf).
  • 0.6 L of a mineral salt medium (5 g/L ( NH4 ) 2SO4 , 5 g/L KH2PO4, 0.5 g/L NaCl, 1.5 g/L MgSO4 ⁇ 7 H2O , 0.25 g/L CaCl2 ⁇ 2 H2O , 0.075 g/L FeSO4 ⁇ 7 H2O, 1 g/L NasCitrate ⁇ 2 H2O, and 50 mg/L kanamycin) including 15 g/L glucose, enriched with complex components and 10 g/L yeast extract (ProCel 251 MG), were inoculated with a pre-culture cultivated in fermentation medium to an OD600 of approximately 0.05.
  • a mineral salt medium 5 g/L ( NH4 ) 2SO4 , 5 g/L KH2PO4, 0.5 g/L NaCl, 1.5 g/L MgSO4
  • Inoculation represents point 0 of the fermentation process, or the start of fermentation.
  • a temperature of 30 °C was maintained, and the pH was kept constant at approximately 7.0 by adding NH4OH or HaPCh.
  • the culture was initially stirred at 700 rpm and aerated with 2 ⁇ L of compressed air purified through a sterile filter. Under these initial conditions, the oxygen probe was calibrated to 100% saturation prior to inoculation.
  • the target value for O2 saturation during fermentation was set to 30%. After the O2 saturation dropped below the target value, a regulatory cascade was initiated to restore it to the target level. During this process, the stirring speed was increased to a maximum of 1,800 rpm.
  • Glucose feeding began after the initial glucose had been metabolized. Before feeding began, the temperature was increased from 30°C to 37°C. increased. After the administration of 100 g of pure glucose, the
  • plasmid DNA was first isolated using the GeneJET Plasmid Miniprep Kit (Thermo Fisher Scientific), and the concentration in the elution fraction was then determined using UV/VIS spectrometry. To calculate the plasmid titer in the initial sample, the measured plasmid concentration was first multiplied by the elution volume and then divided by the volume of the fermentation broth used for sampling.
  • Figure 4 shows the plasmid titer (nmol/L) of the plasmid vector pVAXl, the plasmid vector pVAXl-PASBR322, and the plasmid vectors according to the invention, pVAXl-PAS 09, pVAXl-PAS l O, pVAXl-PAS 18, pVAXl-PAS31, pVAXl-PAS38, and pVAXl-PAS39, in fermentation culture at 24 hours and at 42 hours. It can be seen that the plasmid titers of the plasmid vectors according to the invention are significantly higher at 24 hours than the plasmid titers of the control plasmid vector pVAXl-PASBR322.
  • Figure 5 shows the relative plasmid titer of the plasmid vector pVAXl, the plasmid vector pVAXl-PASBR322, and the plasmid vectors according to the invention, pVAXl-PAS 09, pVAXl-PAS l O, pVAXl-PAS 18, pVAXl-PAS31, pVAXl-PAS38, and pVAXl-PAS39, in fermentation culture after fermentation for 24 hours.
  • the percentage of this titer is given in relation to the titer obtained after 42 hours. It can be seen that with the plasmid vectors according to the invention, significantly higher relative plasmid titers can be achieved. are the plasmid titers of the control plasmid vector pVAXl-PASBR322 .

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Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft einen Plasmidvektor, umfassend a) einen Replikationsursprung; und b) eine PAS-Region, umfassend i) eine Primosomenassemblierungssequenz PAS-forward (SEQ ID NO:2), die 3´des Replikationsursprungs und in Richtung der Replikation lokalisiert ist; ii) eine Primosomenassemblierungssequenz PAS-revers (SEQ ID NO:3), die 3´ der Primosomenassemblierungssequenz PAS-forward und in Richtung entgegen der Replikation lokalisiert ist; und iii) eine Sequenz X zwischen der rimosomenassemblierungssequenz PAS-forward und der Primosomenassemblierungssequenz PAS-revers, welche höchstens etwa 75% Sequenzidentität zur SEQ ID NO:1 aufweist.

Description

Plasmide mit einer erhöhten Replikationsrate
Die vorliegende Erfindung betrifft einen Plasmidvektor, umfassend a) einen Replikationsursprung; und b) eine PAS-Region, umfassend i) eine Primosomenassemblierungssequenz PAS-forward (SEQ ID NO:2) , die 3'des Replikationsursprungs und in Richtung der Replikation lokalisiert ist; ii) eine Primosomenassemblierungssequenz PAS-revers (SEQ ID NO:3) , die 3' der Primosomenassemblierungssequenz PAS-forward und in Richtung entgegen der Replikation lokalisiert ist; und iii) eine Sequenz X zwischen der Primosomenassemblierungssequenz PAS-forward und der Primosomenassemblierungssequenz PAS-revers, welche höchstens etwa 75% Sequenzidentität zur SEQ ID NO:1 aufweist .
Das Prinzip vieler neuer Therapieformen besteht in der Nutzung einer genetischen Information zur Wirkstoff Synthese in einer Zielzelle. Hierfür wird die genetische Information in Form eines Zielgens zur Verfügung gestellt. Um eine effiziente Übertragung des Zielgens in eine Zielzelle erreichen zu können, muss das zu übertragende Zielgen zunächst in ausreichender Menge synthetisiert werden. Plasmid-DNA (pDNA) bzw. Plasmidvektoren stellen flexible und leicht zu modifizierende Quellen rekombinanter DNA für verschiedenste Forschungsanwendungen, industrielle und pharmazeutische Anwendungen dar. Insbesondere im Bereich der modernen Medizin oder Gentherapie dienen Plasmide beispielsweise bei der Produktion von mRNA oder von viralen Vektoren einerseits als wichtige Rohmaterialien, und können andererseits, beispielsweise in Form von DNA-Impfstoffen, auch selbst als Wirkstoff zum Einsatz kommen. Bei der Entwicklung und Anwendung neuer Technologien ist der Bedarf an qualitativ hochwertiger Plasmid-DNA in den letzten Jahren stark angestiegen. Da die Bereitstellung von großen Mengen hochreiner Plasmid-DNA oft einen limitierenden Faktor darstellt , ist die Verbesserung der vorhandenen Prozesse zur Herstellung von Plasmid-DNA von zentraler Bedeutung .
Plasmid-DNA wird klassischerweise mittels Fermentation unter Nutzung rekombinanter Bakterien, wie beispielsweise Escheri chia coli , gewonnen . Hierzu wird ein ausgewählter Bakterienstamm mit einem Plasmid, welches das Zielgen trägt , trans formiert und anschließend unter geeigneten Bedingungen kultiviert . Bei der Teilung und Vermehrung der Bakterien repli zieren und vermehren diese das enthaltene Plasmid und damit das darauf enthaltene Zielgen . Dieser Prozess wird als Klonierung bezeichnet und erlaubt eine ef fi ziente und sequenztreue Verviel fältigung beliebiger Zielgene . Häufigkeit und Ef fi zienz der Plasmidreplikation bestimmen dabei die Menge an Plasmid, die aus j eder einzelnen Bakterienzelle gewonnen werden kann . Diese Parameter hängen mitunter von den Eigenschaften der Bakterienzelle , insbesondere aber von den Eigenschaften des verwendeten Plasmids ab .
Plasmide enthalten regulatorische Elemente , welche von Proteinen der j eweiligen Wirts zelle erkannt werden und zur Expression Cis- agierender Ef fektoren führen . Eine DNA-Sequenz , welche die zur Replikation notwendigen Elemente enthält , wird als Replikationsursprung bezeichnet . Bei den regulatorischen Elementen, die innerhalb des Replikationsursprungs kodiert sind, kann es sich sowohl um Protein- , als auch RNA-Ef f ektoren handeln . Unabhängig vom molekularen Aufbau ist der Wirkmechanismus allerdings ähnlich : Ein Element übernimmt eine positiv regulatorische Funktion und initiiert die Replikation . Ein zweites Element beeinflusst Expression oder Funktion des ersten Elements und reprimiert die Replikation . Die relative Häufigkeit , mit der die beiden Elemente in der Zelle vorliegen, beeinflusst die Zahl der Plasmidkopien in einer Zelle . Die Kopienzahl von Plasmiden, die beispielsweise den pMBl- oder den damit nah verwandten ColEl-Replikationsursprung enthalten, wird durch die Interaktion der zueinander komplementären RNAs RNAI I und RNAI beeinflusst . RNAI I ist eine 553 Basenpaare lange RNA, deren Transkription durch den relativ schwachen RNAI I-Promotor koordiniert wird . Nach der Transkription bindet RNAI I an die homologe Sequenz auf dem Plasmid und initiiert im Stile eines Primers die Replikation . RNAI ist eine 108 Basenpaare lange und zu RNAI I vollständig homologe RNA, deren Expression durch den relativ starken RNAI-Promotor koordiniert wird . Durch Interaktion der homologen Bereiche von RNAI und RNAI I behindert erstere die Bindung zweiterer an das Plasmid und damit die Replikationsinitiation . Diese Interaktion wird durch das Genprodukt des auf vielen Plasmiden kodierten rop ( repressor of primer ) -Gens stabilisiert . Da der Promotor von RNAI stärker ist als der Promotor von RNAI I , kommt es bei steigender Zahl an Plasmidkopien zu einem Überangebot von RNAI , was zu einer vollständigen Blockade der Replikationsinitiation führt . Die Zahl der Plasmidkopien ist durch diesen regulatorischen Mechanismus nach oben hin begrenzt . Um eine höhere Zahl an Plasmidkopien und damit eine ef fi zientere Vermehrung des auf einem Plasmid enthaltenen Zielgens zu erreichen, muss der regulatorische Mechanismus der Plasmidreplikation derart angepasst werden, dass die Plasmidreplikation maximiert wird, ohne eine zu starke metabolische Bürde für die zur Klonierung eingesetzten Bakterienzellen zu erzeugen . Zur Vermeidung eines Plasmidverlusts durch Erhöhung der metabolischen Bürde werden bei einigen pDNA-Produktionsprozessen in der initialen Massebildungsphase der Fermentation niedrigere Fütterungsraten eingesetzt . Diese Anpassungen haben allerdings eine Verlängerung der Fermentationsdauer und damit des Produktionsprozesses insgesamt zur Folge . Zur weiteren Erhöhung der Produktionsef fi zienz und damit zur Senkung der Produktionskosten bei der Plasmidproduktion ist neben der Erhöhung der Plasmidtiter auch eine Verkürzung der Fermentations- und Prozessdauer geeignet .
Derzeit wird Plasmid-DNA in der Regel in einem fermentativen Prozess in Bakterien produziert . Um möglichst hohe Titer an Plasmid-DNA und somit auch des Zielgens zu erreichen, werden hierbei sogenannte „high copy" Plasmide wie beispielsweise pUC19 oder pVAXl eingesetzt . Solche Plasmide stellen Varianten natürlich vorkommender Plasmide dar, die entweder durch zufällige Mutagenese und Selektion oder durch gerichtetes Design entstanden sind . Grundsätzliche Prinzipien zur Erstellung von high copy Plasmiden beruhen auf der Störung der Interaktion zwischen den regulatorischen Elementen, bzw . einer Anpassung ihrer relativen Konzentration innerhalb der Zelle . Darüber hinaus konnte auch die Integration von Sequenzen, welche die Replikation unterstützen, als wirksames Mittel zur Erhöhung der
Kopienzahl identi fi ziert werden .
Viele Plasmide , die zur Klonierung von therapeutisch relevanten Zielgenen eingesetzt werden, beispielsweise pUC19 , pVAXl oder pBluescript , besitzen eine Variante des pMBl Replikationsursprungs , den sogenannten pUC Replikationsursprung . Solche sogenannten pUC-Plasmide unterscheiden sich von pMBl-Plasmiden, d . h . Plasmiden mit einem pMBl Origin wie beispielsweise pBR322 , durch das Fehlen der kodierenden Sequenz für das Regulatorprotein Rop . Dadurch fehlt das Regulatorprotein Rop, welches die Interaktion zwischen RNAI und RNAI I stabilisiert und dadurch die Ef fektivität von RNAI erhöht ( Tomi zawa et al . Control of ColEl plasmid replication : enhancement of binding of RNA I to the primer transcript by the Rom protein . Cell . 1984 Oct ; 38 ( 3 ) : 871- 8 ) . Die Schwächung der RNAI/RNAI I Interaktion durch das Fehlen von Rop hat somit einen positiven Ef fekt auf die Zahl der Plasmidkopien in der Zelle . Darüber hinaus besitzt die auf pUC-Plasmiden kodierte RNAI I einen Einzelbasenaustausch, der bei Temperaturen ab 37 °C eine Strukturänderung der RNAII hervorruft. Diese Strukturänderung mindert die Affinität von RNAI zu RNAII, wodurch ein größeres Übergewicht an RNAI nötig ist, um die Replikation zum Erliegen zu bringen. Somit kann diese verringerte Bindungsaffinität der regulatorischen RNAs eine erhöhte Plasmidkopienzahl bewirken (Muesing et al.; A single base-pair alteration is responsible for the DNA overproduction phenotype of a plasmid copy-number mutant. Cell. 1981 Apr;24 (l) :235-42) . Als Resultat kann in einem Produktionsprozess aus jeder einzelnen Zelle eine größere Zahl an Plasmiden und damit ein insgesamt höherer Plasmidtiter erzielt werden. Aufgrund der oben beschriebenen temperaturabhängigen Erhöhung der Plasmidkopienzahl wird bei vielen Fermentationsprozessen des Stands der Technik eine Kultivierungstemperatur von 37 °C verwendet.
Die Deregulierung der RNAI/RNAII-Interaktion ist ein ausgesprochen probates Mittel zur Erhöhung der Plasmidkopienzahl. Während Plasmide mit dem pMBl- Replikationsursprung eine Kopienzahl von 10-20 pro Zelle aufweisen, beträgt die Kopienzahl von pUC-Plasmiden mehrere hundert pro Zelle (Shao B et al. Single-cell measurement of plasmid copy number and promoter activity. Nat Commun. 2021 Mar 5; 12 (1) :1475) . Aufgrund dieses positiven Effekts enthalten viele im Stand der Technik bekannte high copy Plasmide Anpassungen, welche die Interaktion zwischen RNAI und RNAII zusätzlich, oder auf andere Art und Weise schwächen.
Neben dem positiv regulatorischen RNAII Transkript kann auch das RNAI-Transkript von Strukturänderungen betroffen sein, die eine Erhöhung der Plasmidkopienzahl pro Zelle bewirken. Ein spontaner Einzelbasenaustausch in der RNAI-Terminatorregion führt im Plasmid pBR322 und dem nah verwandten Plasmid ColEl zu einer starken Erhöhung der Plasmidkopienzahl . Dieser Austausch resultiert in einer Behinderung der Termination des RNAI- Transkripts, wodurch anstelle der 104 Basenpaare langen RNAI ein deutlich längeres RNA-Molekül gebildet wird. Aufgrund der dadurch veränderten Tertiärstruktur von RNAI ist die Bindung an RNAII vermindert, was eine Erhöhung der Plasmidkopienzahl zur Folge hat (Boros et al. High-copy-number derivatives of the plasmid cloning vector pBR322. Gene. 1984 Oct;30 (l-3) :257-60) .
Auch Substitutionen im Überlappungsbereich von RNAI und RNAII können die Plasmidkopienzahl beeinflussen. Die Interaktion zwischen RNAI und RNAII wird maßgeblich über jene Basen koordiniert, welche an der Spitze dreier Stammschleifen lokalisiert sind, die sich in der 3 '-Region des RNAI-Transkripts bzw. der 5 '-Region des RNAI I-Transkripts befinden. In EP1326989 wird beschrieben, dass durch ungerichtete Mutagenese und anschließender Selektion Plasmidvarianten isoliert wurden, welche Substitutionen in der Stammschleife 2 (inc2) aufweisen. Diese Plasmidvarianten zeigten im Vergleich zur parentalen Variante eine deutliche Erhöhung in der Plasmidkopienzahl, was auf eine verminderte Affinität der regulatorischen Transkripte zueinander zurückzuführen ist.
Neben den oben beschriebenen Basenaustauschen sind auch Punktmutationen in Stammschleife 1 (incü) und Stammschleife 3 (incl) bekannt. All diese Substitutionen befinden sich im Überlappungsbereich von RNAI und RNAII, wodurch die Komplementarität der entsprechenden Transkripte erhalten bleibt. Dennoch führen sie aufgrund der niedrigeren freien Energie von A-U Interaktionen im Vergleich zu G-C Interaktionen zur Verringerung der Interaktionsstärke und somit der Affinität (Trivedi et al. High-Level Production of Plasmid DNA by Escherichia coli DH5a ShsacB by Introducing inc Mutations. Appl Environ Microbiol. 2014 Dec;80 (23) :7154-60) . Ein weiterer wichtiger Faktor für die Plasmidkopienzahl ist neben der Interaktionsstärke zwischen RNAI und RNAI I auch deren relative Verfügbarkeit . Diese wird unter anderem durch die relative Stärke der korrespondierenden Promotoren bestimmt . Der Austausch des relativ schwachen RNAI I Promotors durch einen Promotor mit höherer Aktivität führt zu einer Erhöhung der Plasmidkopienzahl ( Castagnoli et al . Analysis of dominant copy number mutants of the plasmid pMBl . Nucleic Acids Res . 1985 Jul 25 ; 13 ( 14 ) : 5353- 67 ) . Eine extreme Form der Anpassung der relativen Transkriptmenge besteht in der vollständigen Entfernung der RNAI basierten Regulation . Diese ist möglich, da der RNAI /RNAI I-Überlappungsbereich zwar regulatorisch, nicht aber funktional an der Plasmidreplikation beteiligt ist . Sowohl das 108 Basenpaar lange RNAI-Gen, als auch die 36 Basenpaare lange Promotorregion können deletiert werden . Die in der Zelle vorliegende Plasmidkopienzahl wird in diesem Fall nur noch durch die Stärke bzw . Aktivität des RNAI I-Promotors reguliert , was bei Verwendung eines zu starken RNAI I-Promotors zum Auftreten von zellschädigender, sogenannter „runaway plasmid repli ca ti on" führt . Die Verwendung induzierbarer Promotoren erlaubt eine induzierbare Steuerung der Plasmidkopienzahl , indem in einer frühen, nicht induzierten Phase lediglich wenig RNAI I-Transkript gebildet und dadurch eine runaway plasmid repli ca ti on verhindert wird ( Panayotatos , DNA replication regulated by the priming promoter . Nucleic Acids Res . 1984 Mar 26 ; 12 ( 6 ) : 2641- 8 ) .
Eine weitere Möglichkeit zur steuerbaren Reduzierung der Menge an aktivem RNAI-Transkript liegt in der Verwendung einer kompetitiven Zielsequenz im Sinne einer antisene-RNA. Diese antisense-RNA entspricht der zu RNAI komplementären Sequenz und damit letztlich dem 108 Basenpaare langen 5 ' -Bereich von RNAI I . Dieses Prinzip wurde bereits sehr früh zur Erhöhung der Plasmidkopienzahl von pBR322 angewendet (Bachvarov et al . Construction of a ColEl plasmid bearing inducible high-copy- number phenotype . Folia Microbiol ( Praha ) . 1990 ; 35 ( 3 ) : 177- 82 ) . Durch die Integration eines zusätzlichen, trunkierten RNAI I- Gens , welches unter Kontrolle eines induzierbaren Promotors gestellt wurde , konnte die Kopienzahl von pBR322 nach Induktion um das Vierfache erhöht werden . Das induzierbare , trunkierte RNAI I-Gen kann alternativ nicht vom selben Plasmid, sondern von einem zweiten, nicht-Zielplasmid oder dem bakteriellen Chromosom exprimiert werden .
Eine Erhöhung der Plasmidreplikationsrate kann auch durch Überexpression von Genen erreicht werden, deren Genprodukte die Synthese von Vorstufen der Nukleoidbiosynthese katalysieren . Die chromosmale Integration der Gene rpiA und zwf ist in DH5a mit erhöhten Plasmidreplikationsraten verbunden . Solche Anpassungen des Produktionsprozesses erfordern die Verwendung gentechnisch veränderter Mikroorganismen . Solche genomischen Anpassungen können mitunter zu einer Änderung der relativen molaren Konzentrationen der in der Zelle vorliegenden Nukleotide führen Die Einstellung von Ungleichgewichten innerhalb des natürlich vorkommenden Nukleotid-Pools wird in bakteriellen Zellen mit stark erhöhten Mutationsraten assoziiert .
Die Integration von reproduktions fördernden Elementen auf dem Plasmidrückgrat konnte ebenfalls erfolgreich zur Erhöhung der Plasmidkopienzahl eingesetzt werden . Durch Deletionsanalyse konnte gezeigt werden, dass die SV40 enhancer Sequenz kritisch für die erhöhten Plasmidtiter ist , die mit dem Plasmid pNTCUltra erzielt werden kann (Williams et al . Generic plasmid DNA production platform incorporating low metabolic burden seedstock and fed-batch fermentation processes . Biotechnol Bioeng . 2009 Aug 15 ; 103 ( 6 ) : 1129-43 ) . Die Integration dieser SV40 enhancer Sequenz ermögl icht Plasmidtiter, welche gegenüber anderen high copy Plasmiden wie beispielsweise pVAXl ( Thermo Fisher Scienti fic ) oder gWi z ( Genlantis ) um einen Faktor von zwei erhöht sind . Diese angepassten Plasmidrückgrate tragen aufgrund ihrer verbesserten maximalen Plasmidtiter zur ökonomischeren Produktion einzelner Plasmide bei , benötigen aber zur Ausbildung der maximalen Produktionsleistung einen langen Fermentationsprozess . Um eine ef fi zientere Produktion, beispielsweise von pharmazeutisch relevanten Plasmiden, zu ermöglichen, ist die zeitliche Verkürzung von Fermentationsprozessen von großer Bedeutung .
Speziell angepasste Plasmidrückgrate bzw . Plasmidvektoren, mit denen sowohl hohe Plasmidtiter als auch hohe Replikationsraten erreicht werden können, ohne dass Bakterienstämme speziell angepasst werden müssen, sind deshalb für die Herstellung von Plasmid-DNA von großem Vorteil .
Eine Aufgabe der Erfindung ist die Bereitstellung von Plasmidvektoren, welche hohe Replikationsraten ermöglichen, bei im Wesentlichen unveränderten maximalen Plasmidtitern . Eine alternative Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist die Bereitstellung von Plasmidvektoren, welche ein früheres Erreichen der maximalen Produktionsrate ermöglichen, bei im Wesentlichen unveränderten maximalen Plasmidtitern . Eine weitere alternative Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist die Bereitstellung von Plasmidvektoren, welche ein früheres Erreichen der maximalen relativen Plasmidtiter ermöglichen, bei im Wesentlichen unveränderten maximalen Plasmidtitern .
Die Aufgaben der Erfindung werden gelöst durch einen Plasmidvektor, umfassend a ) einen Replikationsursprung; und b ) eine PAS-Region, umfassend i ) eine Primosomenassemblierungssequenz PAS- forward ( SEQ ID NO : 2 ) , die 3 ' des Replikationsursprungs und in Richtung der Replikation lokalisiert ist ; ii ) eine Primosomenassemblierungssequenz PAS-revers ( SEQ ID NO : 3 ) , die 3 ' der Primosomenassemblierungssequenz PAS- forward und in Richtung entgegen der Replikation lokalisiert ist ; und iii ) eine Sequenz X zwischen der Primosomenassemblierungssequenz PAS-forward und der Primosomenassemblierungssequenz PAS-revers , welche höchstens etwa 75% Sequenzidentität zur SEQ ID NO : 1 aufweist .
Der erfindungsgemäße Plasmidvektor umfasst ein Plasmidrückgrat , in welches 3 ' des Replikationsursprungs eine spezi fische DNA- Sequenz eingefügt wurde , nämlich eine spezi fische PAS-Region . Die Integration dieser spezi fischen PAS-Region ermöglicht ein früheres Erreichen der maximalen Produktionsrate , bei im Wesentlichen unveränderten hohen Plasmidtitern . So können mit Plasmiden, welche die erfindungsgemäße PAS-Region aufweisen, bereits nach etwa 24 Stunden Fermentations zeit bis zu etwa 90 % des maximalen Plasmidtiters erreicht werden, während mit analogen Plasmiden ohne die erfindungsgemäße PAS-Region nach 24 Stunden Fermentations zeit zumeist nicht mehr als etwa 60 % der maximalen Plasmidtiter erreicht werden .
Somit ermöglicht die vorliegende Erfindung durch die Erhöhung der Replikationsrate eine Verkürzung der Fermentations zeit bei sehr hohen, wirtschaftlich zufriedenstellenden Plasmidtitern . Dadurch kann der Fermentationsprozess ohne maßgebliche Einbußen bei der Produktausbeute annähernd um die Häl fte der im Stand der Technik üblichen Zeit verkürzt werden . Dies ermöglicht sowohl die ökonomischere Herstellung von einzelnen Plasmiden als auch die Erhöhung der Flexibilität innerhalb einer Produktionsanlage .
Definitionen
Sofern es nicht anderweitig def iniert ist , haben die hierin verwendeten technischen und wissenschaftlichen Fachbegrif fe die gleiche Bedeutung, wie sie von einem Fachmann auf dem Gebiet der vorliegenden Erfindung übl icherweise verstanden wird . Jedes technische Merkmal , das bei den folgenden Definitionen erwähnt wird, kann auf j ede Aus führungs form der Erfindung angewendet werden .
Die Begri f fe „Nukleinsäuresequenz" , „Nukleotidsequenz" , „DNA- Sequenz" und „RNA-Sequenz" sind einem Fachmann bekannt und beziehen sich auf eine individuelle und bestimmte Abfolge von Nukleotiden .
Der Begri f f „Nukleinsäure" bezieht sich auf eine Abfolge von Nukleotiden beliebiger Länge , entweder Ribonukleotide oder Desoxyribonukleotide . Diese Begri f fe umfassen einzelsträngige und doppelsträngige DNA oder RNA, genomische DNA, cDNA, mRNA, saRNA, gRNA, siRNA, miRNA oder circRNA, welche Purin- und Pyrimidin-Basen, Nukleotidanaloga oder auch andere natürlich vorkommende , chemisch oder biochemisch modi fi zierte , nichtnatürliche oder derivatisierte Nukleotid-Basen umfassen kann .
Die Begri f fe „Plasmidvektor" , „Plasmid" und „Plasmid-DNA" werden hierin austauschbar verwendet und beschreiben ein Konstrukt von extrachromosomalem genetischem Material , bevorzugt ein zirkuläres DNA- Duplexmolekül , das in einer Zelle unabhängig von chromosomaler DNA repli zieren kann . Der Begri f f Plasmidvektor wird in seiner allgemeinsten Bedeutung verwendet und umfasst j egliche Vehikel für eine Nukleinsäure bzw . ein Zielgen, die es beispielsweise ermöglichen, die Nukleinsäure bzw . das Zielgen in prokaryotische und/oder in eukaryotische Wirts zellen einzubringen und gegebenenfal ls in ein Genom zu integrieren . Plasmidvektoren können beispielsweise Expressionsvektoren, Klonierungsvektoren, Trans fervektoren oder Speichervektoren sein, oder Mischformen der genannten Vektoren . Ein Expressionsvektor kann für die Herstellung von Expressionsprodukten z.B. mRNA, Peptide, Polypeptide oder Proteine verwendet werden. Ein Klonierungsvektor ist typischerweise ein Vektor, der eine Klonierungsstelle enthält, die zum Einbau von Nukleinsäuresequenzen in den Vektor verwendet werden kann, beispielsweise eine Nukleinsäuresequenz mit einem offenen Leserahmen. Ein Transfervektor ist ein Vektor, der für den Transfer von Nukleinsäuremolekülen in Zellen oder Organismen geeignet ist. Ein Speichervektor ist ein Vektor, der die bequeme Speicherung eines Nukleinsäuremoleküls, z.B. eines mRNA- Moleküls, ermöglicht. So kann ein Speichervektor eine Sequenz enthalten, die beispielsweise einer gewünschten mRNA-Sequenz oder einem Teil davon entspricht.
Der Begriff „Sequenzidentität" bezeichnet die Übereinstimmung zweier Nukleotidsequenzen oder ggf. Aminosäuresequenzen, angegeben in Prozent. Die Sequenzidentität ist abhängig von der Anzahl an identischen Positionen zwischen den beiden Sequenzen, wobei die Anzahl und die Länge an Lücken („gaps") , die eingeführt werden müssen, um ein optimales Sequenzalignment zu erhalten, berücksichtigt wird. Wie hierin verwendet, wird die Sequenzidentität mit Hilfe des Programms Clustal Omega unter Verwendung der Standard-Einstellungen bestimmt (Sievers et al. Fast, scalable generation of high-quality protein multiple sequence alignments using Clustal Omega. Molecular Systems Biology 7:539, 2011) . Einem Fachmann ist bekannt, dass die Sequenzidentität unter Verwendung des Programms Clustal Omega für Nukleotidsequenzen oder Aminosäuresequenzen einfach auf der EMBL-EBI- Internet seife
(https : // www .ebi.ac.uk/j dispatcher/msa/ clustalo) bestimmt werden kann.
Unter „homologen Genen" bzw. „homologen Sequenzen" ist hierin zu verstehen, dass die DNA-Sequenzen dieser Gene bzw. DNA- Abschnitte zu mindestens 70%, bevorzugt zu mindestens 80%, bevorzugt zu mindestens 90% und besonders bevorzugt zu mindestens 95% identisch sind, d.h. eine entsprechende Sequenzidentität aufweisen.
Der Begriff „randomisierte Sequenz" bedeutet im Sinne der vorliegenden Erfindung eine Nukleotidsequenz, bei der jede Position eine unabhängige und gleiche Wahrscheinlichkeit hat, ein beliebiges Nukleotid zu sein. Bei den zufälligen Nukleotiden kann es sich um beliebige Nukleotide handeln, z.B. G, A, C, T, U oder chemische Analoga davon, in beliebiger Reihenfolge, wobei G für Guanylnukleotide, A für Adenylnukleotide, T für Thymidylnukleotide, C für Cytidylnukleotide und U für Uracylnukleotide steht.
Der Begriff „Replikationsursprung" bezieht sich auf eine bestimmte Sequenz, an der die DNA-Replikation eingeleitet wird. Der Begriff Replikationsursprung umfasst sowohl prokaryotische, z.B. bakterielle Replikationsursprünge, als auch eukaryotische Replikationsursprünge, beispielsweise aus Säugern.
Die Begriffe „Promotor", „Promotorregion" oder „Promotorsequenz" werden hierin austauschbar verwendet und beschreiben einen DNAregulatorischen Bereich, der stromaufwärts (5' ) zu einer kodierenden Sequenz eines Gens oder einer nicht-kodierenden Sequenz liegt, und der in der Lage ist, eine RNA-Polymerase zu binden und die Transkription einer stromabwärts (3' ) gelegenen, kodierenden oder nicht-kodierenden Sequenz auszulösen. Geeignete Promotoren können von beliebigen Organismen abgeleitet werden, einschließlich prokaryotischen und eukaryotischen Organismen. Ein Promotor kann die Transkription eines prokaryotischen oder eukaryotischen Gens steuern. Ein Promotor kann weitere Erkennungs- oder Bindungsstellen für weitere Faktoren umfassen, die an der Regulation der Transkription eines Gens beteiligt sind. Ein Promotor kann ein konstitutiv aktiver Promotor sein, d . h . ein Promotor, der sich konstitutiv in einem aktiven Zustand befindet , oder es kann ein induzierbarer Promotor sein, d . h . ein Promotor, dessen Zustand durch einen externen Stimulus kontrolliert wird, beispielsweise vom inaktiven in einen aktiven Zustand gebracht wird . Ein solcher externer Stimulus kann beispielsweise eine bestimmte Temperatur, eine Verbindung oder ein Protein sein . Einem Fachmann sind konstitutiv aktive und induzierbare Promotoren bekannt . Beispiele für induzierbare Promotoren umfassen den Lac-Promotor, der durch I sopropyl- ß-D- thiogalactopyranosid ( IPTG) induzierbar ist , den Tetracyclinregulierten Promotor, den Rhamnose-induzierbaren Promotor und den Arabinose-Promotor , der durch Arabinose induzierbar ist .
Wie hierin verwendet , bedeutet „operativ mit einem Promotor verbunden" , dass der Promotor die Transkription einer DNA bewirkt oder reguliert , die für ein Gen kodiert .
Eine „PAS-Region" bedeutet hierin eine Nukleotidsequenz , die in 5 ' Richtung durch eine Primosomenassemblierungssequenz auf dem leichten Strang und in 3 ' Richtung durch eine Primosomenassemblierungssequenz auf dem schweren Strang begrenzt wird und dabei beide Primosomenassemblierungssequenzen und ggf . die Nukleotidsequenz , die sich zwischen den beiden Primosomenassemblierungssequenzen befindet , umfasst . Dabei wird als leichter Strang derj enige Strang eines Plasmids bezeichnet , welcher relativ zum komplementären Strang eine geringere Anzahl an Purin Basen aufweist , und als schwerer Strang wird derj enige Strang eines Plasmids bezeichnet , welcher relativ zum komplementären Strang eine höhere Anzahl an Purin Basen aufweist .
Eine „Primosomenassemblierungssequenz" ( PAS ) bedeutet hierin eine Sequenz , an der mindestens ein, bevorzugt mehrere an der Replikation beteiligte Proteine binden, um eine
Replikationsinitiation zu vermitteln.
Ein „Titer" bzw. „Plasmidtiter" im Sinne der vorliegenden Erfindung ist definiert als die Menge an Plasmidprodukt, die bei der Fermentation eines Bakterienstammes erhalten wird. Der Titer wird als Konzentration des Plasmidprodukts pro Fermentationsvolumen in nmol/L oder mg/ml angegeben.
Die Begriffe „Produktionsrate", „Replikationsrate" und „Replikationseffizienz" werden hierin austauschbar verwendet und beschreiben eine Zeitableitung des bei der Fermentation erhaltenen Plasmidtiters. Die Produktionsrate wird als Plasmidtiter pro Fermentationsdauer (mg/L/h) angegeben.
Ausführliche Beschreibung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft einen Plasmidvektor, umfassend a) einen Replikationsursprung; und b) eine PAS-Region, umfassend i) eine Primosomenassemblierungssequenz PAS-forward (SEQ ID NO:2) , die 3'des Replikationsursprungs und in Richtung der Replikation lokalisiert ist; ii) eine Primosomenassemblierungssequenz PAS-revers (SEQ ID NO:3) , die 3' der Primosomenassemblierungssequenz PAS-forward und in Richtung entgegen der Replikation lokalisiert ist; und iii) eine Sequenz X zwischen der Primosomenassemblierungssequenz PAS-forward und der Primosomenassemblierungssequenz PAS-revers, welche höchstens etwa 75% Sequenzidentität zur SEQ ID NO:1 aufweist.
Der erfindungsgemäße Plasmidvektor umfasst mindestens einen
Replikationsursprung. Bevorzugt umfasst der Plasmidvektor genau einen Replikationsursprung . Der Replikationsursprung kann ein beliebiger Replikationsursprung sein, der die autonome Replikation in der betref fenden Wirts zelle vermittelt . Beispiele für geeignete Replikationsursprünge sind pUC, pMBl , ColEl oder pl 5A, oder eine funktionell aktive Variante davon . Bevorzugt ist der Replikationsursprung ein pUC Replikationsursprung . In einer besonders bevorzugten Aus führungs form umfasst der pUC Replikationsursprung die SEQ ID NO : 4 .
Der Plasmidvektor der vorliegenden Erfindung umfasst eine spezi fische PAS-Region . Die PAS-Region umfasst eine Primosomenassemblierungssequenz PAS- forward ( SEQ ID NO : 2 ) . Die PAS-forward ist 3 ' des Replikationsursprungs und in Richtung der Replikation lokalisiert . Die Entfernung der Primosomenassemblierungssequenz PAS- forward zum Replikationsursprung kann beliebig gewählt werden . In einer bevorzugten Aus führungs form beträgt die Entfernung der PAS- forward zum Replikationsursprung zwischen etwa 110 und etwa 200 Basenpaare , mehr bevorzugt zwischen etwa 115 und etwa 150 Basenpaare , weiter bevorzugt zwischen etwa 115 und etwa 140 Basenpaare , und noch mehr bevorzugt zwischen etwa 118 und 130 Basenpaare
Die PAS-Region umfasst weiter eine Primosomenassemblierungssequenz PAS-revers ( SEQ ID NO : 3 ) , die 3 ' der Primosomenassemblierungssequenz PAS- forward und in Richtung entgegen der Replikation lokalisiert ist .
Zudem umfasst die PAS-Region eine Sequenz X zwischen der Primosomenassemblierungssequenz PAS- forward und der Primosomenassemblierungssequenz PAS-revers . Die erfindungsgemäße Sequenz X ist dadurch gekennzeichnet , dass sie höchstens etwa 75% Sequenzidentität zur SEQ ID NO : 1 aufweist . In einer weiteren bevorzugten Aus führungs form weist die Sequenz X höchstens 75% Sequenzidentität zur SEQ ID NO:1 auf. In einer weiteren bevorzugten Aus führungs form weist die Sequenz X höchstens etwa 70%, bevorzugt höchstens 70% Sequenzidentität zur SEQ ID NO:1 auf. In einer weiteren bevorzugten Aus führungs form weist die Sequenz X höchstens etwa 65%, bevorzugt höchstens 65% Sequenzidentität zur SEQ ID NO:1 auf. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform weist die Sequenz X höchstens etwa 60%, bevorzugt höchstens 60% Sequenzidentität zur SEQ ID NO:1 auf. In einer weiteren bevorzugten Aus führungs form weist die Sequenz X höchstens etwa 55%, bevorzugt höchstens 55% Sequenzidentität zur SEQ ID NO:1 auf. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform weist die Sequenz X höchstens etwa 50%, bevorzugt höchstens 50% Sequenzidentität zur SEQ ID NO:1 auf .
In einer bevorzugten Aus führungs form weist die Sequenz X eine Länge zwischen etwa 100 bis etwa 200 Basenpaaren, weiter bevorzugt eine Länge zwischen etwa 120 bis etwa 180 Basenpaaren, mehr bevorzugt eine Länge zwischen etwa 130 bis etwa 170 Basenpaaren, mehr bevorzugt eine Länge zwischen etwa 140 bis etwa 160 Basenpaaren, noch mehr bevorzugt eine Länge zwischen etwa 148 bis etwa 150 Basenpaaren, und am meisten bevorzugt eine Länge von etwa 149 Basenpaaren auf. In einer besonders bevorzugten Aus führungs form weist die Sequenz X eine Länge von 149 Basenpaaren auf.
Erfindungsgemäß wird die PAS-Region 3 ' eines Replikationsursprungs in einen Plasmidvektor integriert. Die PAS-Region umfasst eine Primosomenassemblierungssequenz PAS- forward (PAS-for) mit der Sequenz SEQ ID NO: 2, eine Primosomenassemblierungssequenz PAS revers (PAS-rev) mit der Sequenz SEQ ID NO: 3 und eine Sequenz, die zwischen PAS-forward und PAS-revers lokalisiert ist (Sequenz X) . Bevorzugt weist der Plasmidvektor neben der erfindungsgemäßen PAS-Region keine weitere PAS-Region auf. In einer weiteren bevorzugten Aus führungs form weist der Plasmidvektor neben den Primosomenassemblierungssequenzen der PAS-Region keine weiteren Primosomenassemblierungssequenz auf .
Die erfindungsgemäße PAS-Region basiert auf der PAS-Region des Plasmids pBR322 (Marians et al. Maximal Limits of the Escherichia coli Replication Factor Y Effector Site Sequences in pBR322 DNA, J Biol Chem. 1982 May 25;257 (10) :5656-62) . Es wurde überraschenderweise gefunden, dass eine Modifikation dieser Sequenz eine erhöhte Produktionsrate bzw. verbesserte Replikationseffizienz bewirkt. Ausgehend von der PAS-Region des Plasmids pBR322 (SEQ ID NO: 5) wurde ein Sequenzabschnitt (SEQ ID NO:1) so modifiziert, dass die Sequenzidentität der resultierenden modifizierten Sequenz (Sequenz X) zum korrespondierenden Sequenzabschnitt innerhalb der PAS-Region des Plasmids pBR322 (SEQ ID NO:1) höchstens 75% aufweist. Die restlichen Sequenzabschnitte sind identisch gegenüber der PAS- Region des Plasmids pBR322.
Für den Bereich der PAS-Region des Plasmids pBR322, welcher erfindungsgemäß modifiziert wird, ist im Stand der Technik keine Funktionalität im Zusammenhang mit der Replikationsrate bekannt. Die Modifikation der Sequenz SEQ ID NO:1 bewirkt überraschenderweise im Vergleich zu analogen Plasmidvektoren mit der nicht modifizierten PAS-Region des Plasmids pBR322, eine neue Funktionalität, nämlich eine Steigerung der Produktionsrate, wobei erfindungsgemäß bereits nach etwa 24 Stunden Fermentationsdauer bis zu etwa 90 % der maximalen Produktionsleistung erhalten werden können, wohingegen mit der nicht modifizierten Sequenz üblicherweise etwa 30 bis 42 Stunden zum Erreichen der maximalen Produktionsleistung erforderlich sind. Die Modifikation der PAS-Region des Plasmids pBR322, d.h. die Verringerung der Sequenzidentität der Sequenz X, kann ausgehend von der SEQ ID NO:1 durch jede im Fachgebiet bekannte Methode durchgeführt werden. In einer Ausführungsform erfolgt die Verringerung der Sequenzidentität beispielsweise durch Substitution von Basenpaaren. Bevorzugt erfolgt die Verringerung der Sequenzidentität durch randomisierte Substitution oder Randomisierung der Sequenz SEQ ID NO : 1 oder eines
Sequenzabschnittes der Sequenz SEQ ID NO:1. In einer Aus führungs form wird beispielsweise zur Generierung einer Sequenz X die Sequenzabfolge von Abschnitten variabler Größe innerhalb der SEQ ID NO:1 randomisiert , und die entstandenen randomisierten Sequenzen zur Substitution der entsprechenden Sequenzabfolge der SEQ ID NO:1 verwendet. In einer anderen Aus führungs form wird zur Generierung einer Sequenz X die Sequenzabfolge der gesamten SEQ ID NO:1 randomisiert, und die entstandene randomisierte Sequenz zur Substitution der SEQ ID NO:1 verwendet. Die Randomisierung der Basenabfolge kann beispielsweise mittels des Online-Tools „Shuffle DNA" (https : // www . bio informatics . org/ sms2/ shuf f le_dna . html ) durchgeführt werden. Bei dieser Randomisierung werden keine nicht in der Sequenz vorkommenden Basen hinzugefügt und keine in der Sequenz vorkommenden Basen entfernt. Der relative Anteil an G/C Basen im Verhältnis zu A/T Basen wird nicht verändert, lediglich die Abfolge der in der Sequenz enthaltenen Basen wird verändert .
In einem bevorzugten Ausführungsbeispiel wird die Sequenz SEQ ID NO:1 durch eine modifizierte Sequenz X substituiert. Die modifizierte Sequenz X kann mehr oder weniger Basenpaare, oder die gleiche Anzahl an Basenpaaaren aufweisen, wie die SEQ ID NO:1. In einer bevorzugten Ausführungsform weist die modifizierte Sequenz X die gleiche Anzahl an Basenpaaren auf wie die SEQ ID NO:1. Die Integration der modifizierten Sequenz X in den Plasmidvektor erfolgt erfindungsgemäß zwischen den 3' des Replikationsursprungs gelegenen Primosomenassemblierungssequenzen PAS-forward (SEQ ID NO: 2) und PAS-revers (SEQ ID NO:3) .
In einer bevorzugten Aus führungs form umfasst der erfindungsgemäße Plasmidvektor als Sequenz X die Sequenz SEQ ID NO: 6. In dieser Aus führungs form weist die PAS-Region bevorzugt die SEQ ID NO: 7 auf.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform umfasst der erfindungsgemäße Plasmidvektor als Sequenz X die Sequenz SEQ ID NO: 8. In dieser Aus führungs form weist die PAS-Region bevorzugt die SEQ ID NO: 9 auf.
In einer anderen bevorzugten Aus führungs form umfasst der erfindungsgemäße Plasmidvektor als Sequenz X die Sequenz SEQ ID NO: 10. In dieser Aus führungs form weist die PAS-Region bevorzugt die SEQ ID NO: 11 auf.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform umfasst der erfindungsgemäße Plasmidvektor als Sequenz X die Sequenz SEQ ID NO: 12. In dieser Aus führungs form weist die PAS-Region bevorzugt die SEQ ID NO: 13 auf.
In noch einer weiteren bevorzugten Aus führungs form umfasst der erfindungsgemäße Plasmidvektor als Sequenz X die Sequenz SEQ ID NO: 14. In dieser Aus führungs form weist die PAS-Region bevorzugt die SEQ ID NO: 15 auf.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform umfasst der erfindungsgemäße Plasmidvektor als Sequenz X die Sequenz SEQ ID NO: 16. In dieser Aus führungs form weist die PAS-Region bevorzugt die SEQ ID NO: 17 auf. In einer weiteren Bevorzugten Aus führungs form ist die Sequenz X ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID NO : 6 , SEQ ID NO : 8 , SEQ ID NO : 10 , SEQ ID NO : 12 , SEQ ID NO : 14 und SEQ ID NO : 16 . Besonders bevorzugt ist die Sequenz X ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID NO : 6 , SEQ ID NO : 10 , SEQ ID NO : 12 und SEQ ID NO : 14 . Noch mehr bevorzugt ist die Sequenz X ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID NO : 10 und SEQ ID NO : 12 .
Der erfindungsgemäße Plasmidvektor weist in einer bevorzugten Aus führungs form kein rop-Gen auf . Das bedeutet im Rahmen dieser Erfindung, dass im Plasmidvektor höchstens etwa 50% , bevorzugt höchstens etwa 40% , mehr bevorzugt höchstens etwa 30% des of fenen Leserahmens des rop-Gens enthalten sind . In Aus führungs formen, in denen Teilsequenzen des of fenen Leserahmen des rop-Gens im Plasmidvektor enthalten sind, ergibt eine Transkription und Translation dieser Teilsequenzen kein funktions fähiges ROP-
Protein .
In einer bevorzugten Aus führungs form umfasst der Plasmidvektor der Erfindung eine Insertionssequenz mit mindestens einer Erkennungsstelle für mindestens eine Restriktionsendonuklease . Die Insertionssequenz umfasst eine Nukleinsäureregion, die eine oder mehrere Erkennungssequenzen bzw . Erkennungsstellen für eine oder mehrere Restriktionsendonukleasen aufweist . In einer bevorzugten Aus führungs form umfasst der Plasmidvektor eine Insertionssequenz mit mehreren, aufeinander folgenden Erkennungssequenzen für mehrere unterschiedliche Restriktionsendonukleasen . Jede der Erkennungssequenzen kann für eine Spaltung des Plasmidvektors und die Integration einer Nukleinsäure verwendet werden . Bevorzugt wird eine Nukleinsäure mit einer of fenen Leserahmensequenz integriert . Die Nukleinsäure kann ein beliebiges Gen von Interesse codieren, beispielsweise ein Reportergen wie etwa GFP, ein Gen zur Expression eines beliebigen Zielproteins , ein Gen, welches als Matri ze zur Produktion einer mRNA dient , oder ein Gen zur Produktion eines viralen Partikels .
In einer weiteren bevorzugten Aus führungs form umfasst der erfindungsgemäße Plasmidvektor einen Selektionsmarker, wobei der Selektionsmarker bevorzugt ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus einem Antibiotikaresistenzgen, einem Toxin, einem Antitoxin, und einem Reporterelement . Der Selektionsmarker ist geeignet , diej enigen Wirts zellen, die den Plasmidvektor enthalten, von den Wirts zellen zu unterscheiden, die den Plasmidvektor nicht enthalten . Geeignete Selektionsmarker sind einem Fachmann bekannt . Als Selektionsmarker sind beispielsweise Gene geeignet , die für eine Antibiotikaresistenz , ein Toxin, ein Antitoxin oder ein Reporterelement codieren . Weiterhin sind Auxotrophie-Marker als Selektionsmarker geeignet , die für ein essentielles Gen codieren, das im j eweiligen Bakterienstamm, der das Plasmid enthält , deletiert ist .
Geeignete Gene , welche eine Antibiotikaresistenz verleihen, sind einem Fachmann bekannt . Bevorzugt ist das Antibiotikum, gegen das durch den Selektionsmarker eine Resistenz verliehen wird, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Ampicillin, Tetracyclin, Kanamycin, Geneticin, Chloramphenicol , Spectinomycin, Hygromycin, Sulphonamid, Trimethoprim, Bleomycin, Zeocin, Gentamycin und Blasticidin .
Geeignete Selektionsmarker sind weiterhin Toxine wie beispielsweise sacB und hok, Antitoxine wie beispielsweise sacB antisense RNA und sok, und Reporterelemente wie etwa GFP .
In einer bevorzugten Aus führungs form weist der erfindungsgemäße Plasmidvektor in Fermentationskultur nach 24 h eine höhere Replikationsrate auf im Vergleich mit einem analogen Plasmidvektor mit der nicht modi fi zierten Sequenz SEQ ID NO : 1 , d . h . mit einem Plasmidvektor, der bis auf die modi fi zierte Sequenz X mit dem erfindungsgemäßen Plasmidvektor identisch ist . Unter einer höheren Replikationsrate ist zu verstehen, dass zu einem bestimmten Zeitpunkt der Fermentationskultur, beispielsweise nach etwa 24 h, bevorzugt mindestens 120% , mehr bevorzugt mindestens 130% , noch mehr bevorzugt mindestens 140% , besonders bevorzugt mindestens 150% , und insbesondere bevorzugt mindestens 160% des Plasmid-Titers erhalten wird, im Vergleich mit einem analogen Plasmidvektor mit der nicht modi fi zierten Sequenz SEQ ID NO : 1 , d . h . mit einem Plasmidvektor, der bis auf die modi fi zierte Sequenz X mit dem erfindungsgemäßen Plasmidvektor identisch ist .
In einer anderen bevorzugten Aus führungs form erreicht der Plasmidvektor der vorliegenden Erfindung in Fermentationskultur nach 24 h mindestens etwa 70% des maximalen Plasmidtiters , der nach etwa 30 h bi s 42 h, bevorzugt nach etwa 42 h erreicht wird . Bevorzugt erreicht der Plasmidvektor in Fermentationskultur nach 24 h mindestens etwa 75% des maximalen Plasmidtiters , der nach etwa 30 h bis 42 h, bevorzugt nach etwa 42 h erreicht wird . Mehr bevorzugt erreicht der Plasmidvektor in Fermentationskultur nach 24 h mindestens etwa 80% des maximalen Plasmidtiters , der nach etwa 30 h bis 42 h, bevorzugt nach etwa 42 h erreicht wird . Noch mehr bevorzugt erreicht der erfindungsgemäße Plasmidvektor in Fermentationskultur nach 24 h mindestens etwa 85% des maximalen Plasmidtiters , der nach etwa 30 h bis 42 h, bevorzugt nach etwa 42 h erreicht wird .
In einem weiteren Aspekt betri f ft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Klonierung von DNA-Sequenzen unter Verwendung des Plasmidvektors der Erfindung . Darunter versteht man eine fermentative Produktion des erfindungsgemäßen Plasmidvektors , welcher eine DNA-Sequenz von Interesse umfasst . Hierbei wird eine DNA-Sequenz von Interesse in einen erfindungsgemäßen Plasmidvektor kloniert , bevorzugt in eine Insertionssequenz , welche auf dem Plasmidvektor vorliegt . Der so erhaltene Plasmidvektor mit der insertierten DNA-Sequenz von Interesse wird in einen geeigneten Bakterienstamm eingebracht , und die erhaltenen Bakterien mit dem eingebrachten Plasmidvektor werden in einem geeigneten Fermentationsmedium kultiviert . Nach einem bestimmten Zeitraum werden die Bakterien geerntet , das Zellpellet wird isoliert , die Zellen werden aufgeschlossen und der Plasmidvektor wird isoliert . Methoden zur Klonierung von DNA-Sequenzen, Fermentationsverfahren, sowie Methoden zur I solierung von Plasmiden sind einem Fachmann gut bekannt . Zudem sind einem Fachmann analytische Verfahren zur Identi fi zierung, Quanti fi zierung und Bestimmung des Reinheitsgrades von PlasmidDNA gut bekannt , beispielsweise UV/VIS-Spektroskopie , HPLC, Fluores zenz Spektroskopie , Agarosegelelektrophorese , Kapillarelektrophorese , oder eine Kombination aus diesen Verfahren .
Für eine Fermentationskultur kann j eder für eine Plasmidproduktion geeignete Bakterienstamm verwendet werden . Einem Fachmann sind geeignete Bakterienstämme für eine Plasmidproduktion gut bekannt . Der Bakterienstamm ist bevorzugt dadurch gekennzeichnet , dass es sich bei dem Bakterienstamm um gramnegative Bakterien handelt , weiter bevorzugt um einen Bakterienstamm der Gattung Enterobacter! aceae, besonders bevorzugt um einen Stamm der Art Escheri chia coli ( E. coli ) , insbesondere bevorzugt um E. coli K12 oder E. coli B .
Bevorzugt wird das Verfahren zur fermentativen Produktion von Plasmid-DNA so durchgeführt , dass das Fermentationsvolumen bzw . der Produktionsmaßstab mindestens etwa 0 , 5 Liter beträgt , bevorzugt beträgt das Fermentationsvolumen mindestens etwa 10 Liter, mehr bevorzugt mindestens etwa 300 Liter, besonders bevorzugt mindestens etwa 1000 Liter und noch mehr bevorzugt mindestens etwa 10 . 000 Liter . Medien zur Anzucht des Produktionsstamms im Schüttelkolben und im Fermenter sind dem Fachmann aus der Praxis der mikrobiellen Kultivierung bekannt. Sie bestehen typischerweise aus einer Kohlenstoff quelle, einer Stickstoff quelle sowie Zusätzen wie Vitaminen, Salzen und Spurenelementen, durch die das Zellwachstum und die Plasmidproduktion optimiert werden. Als Fermentationsmedien kommen im Prinzip alle gängigen, dem Fachmann bekannten Medien für die Kultivierung von Mikroorganismen in Frage. Dabei können Komplexmedien, Mineralsalzmedien, oder Minimalsalzmedien, denen ein bestimmter Anteil von Komplex-Komponenten, wie z.B. Hefeextrakt zugesetzt wird, eingesetzt werden. Des Weiteren können dem Medium weitere Komponenten zugegeben werden, durch die das Zellwachstum verbessert wird, beispielsweise Vitamine, Salze, Aminosäuren und/oder Spurenelemente.
Als Kohlenstoff quelle für die Fermentation können prinzipiell alle von den Wirtszellen verwertbaren Zucker, Zuckeralkohole oder organische Säuren bzw. deren Salze verwendet werden. Dazu gehören alle Formen von Monosacchariden, umfassend Hexosen wie z.B. Glukose, Mannose, Fruktose oder Galaktose, sowie Pentosen wie z.B. Xylose, Arabinose oder Ribose, sowie alle daraus gebildeten Di- und Polysaccharide, wie z.B. Saccharose, Lactose, Maltose, Maltodextrin, Stärke, bzw. der daraus durch enzymatische oder chemische Hydrolyse freigesetzten Monomere oder Oligomere. Andere verwertbare Kohlenstoff quellen sind Essigsäure und davon abgeleitete Acetatsalze, Ethanol, Glycerin, Zitronensäure und Salze davon, oder Pyruvat und Salze davon. Bevorzugte Kohlenstoff quellen für die Fermentation sind ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Glucose, Fruktose, Saccharose, Mannose, Xylose und Arabinose, sowie Gemische davon. Besonders bevorzugte Kohlenstoff quellen für die Fermentation sind Glucose und Saccharose, insbesondere bevorzugt ist Glucose. Die Kohlenstoff quelle kann dabei zu Beginn der Fermentation vollständig im Fermentationsmedium vorgelegt werden oder es wird nichts oder nur ein Teil der Kohlenstoff quelle zu Beginn vorgelegt und die Kohlenstoff quelle wird über den Verlauf der Fermentation zugefüttert. Bevorzugt ist dabei eine Ausführungsform, bei der ein Teil der Kohlenstoff quelle vorgelegt wird und ein Teil über den Verlauf der Fermentation zugefüttert wird.
Als Stickstoff quelle für die Fermentation können alle geeigneten Substanzen eingesetzt werden. Geeignete Stickstoff quellen sind beispielsweise Ammoniak, entweder gasförmig oder in wässriger Lösung als NH4OH, oder Salze des Ammoniaks, wie z.B. Ammoniumsulfat, Ammoniumchlorid, Ammoniumphosphat, Ammoniumacetat oder Ammoniumnitrat. Weitere geeignete Stickstoff quellen sind beispielsweise Nitratsalze, wie KNO3, NaNOa, Ammoniumnitrat, Ca (NOa) 2, Mg(NOa)2. Andere geeignete Stickstoff quellen sind beispielsweise Harnstoff, komplexe Aminosäuregemische wie z.B. Hefeextrakt, Proteose Pepton, Malzextrakt, Sojapepton oder Casaminosäuren .
Weiter können dem Fermentationsmedium Salze der Elemente Phosphor, Chlor, Natrium, Magnesium, Stickstoff, Kalium, Calcium und/oder Eisen zugesetzt werden, sowie in Spuren Salze der Elemente Molybdän, Bor, Kobalt, Mangan, Zink, Kupfer und/oder Nickel. Weiter können dem Fermentationsmedium organische Säuren wie beispielsweise Citrat, Aminosäuren wie beispielsweise Isoleucin, und Vitamine wie beispielsweise Vitamin Bl oder Vitamin B6 zugesetzt werden. Weitere Medienzusätze umfassen alle Arten von Fettsäuren, Mono-Carbonsäuren oder Di-Carbonsäuren, in Form einer freien Fettsäure oder ein Salz davon.
Bei der Fermentation können verschiedene Parameter, wie z.B. die
Nährstoff-Zufuhr, der Sauerstoff-Partialdruck, der pH-Wert und die Temperatur der Kultur laufend kontrolliert und gesteuert werden .
Die Fermentation erfolgt unter pH- und Temperaturbedingungen, welche das Wachstum und die Plasmidvektorproduktion der j eweiligen Wirts zel len begünstigen . Der pH-Wert der Fermentationskultur liegt normalerweise bevorzugt etwa zwischen pH 5 bis pH 9 . Mehr bevorzugt ist ein pH-Bereich etwa zwischen pH 5 , 5 bis pH 8 . Besonders bevorzugt ist ein pH-Bereich etwa zwischen pH 6 , 0 bis pH 7 , 5 .
Die Temperatur der Kultur beträgt in der Regel vorzugsweise zwischen etwa 20 ° C und etwa 40 ° C . Bevorzugt ist ein Temperaturbereich zwischen etwa 25 ° C und etwa 37 °C, besonders bevorzugt ist ein Temperaturbereich zwischen etwa 30 ° C und etwa 37 °C .
Die Kultivierungsdauer im erfindungsgemäßen Verfahren beträgt bevorzugt zwischen etwa 10 h und etwa 96 h . Bevorzugt ist eine Kultivierungsdauer von etwa 20 h bis etwa 72 h . Weiter bevorzugt ist eine Kultivierungsdauer von etwa 20 h bis etwa 48 h . Mehr bevorzugt beträgt der Zeitraum der Kultivierung etwa 20 h bis etwa 28 h, noch mehr bevorzugt etwa 22 h bis etwa 26 h, noch mehr bevorzugt etwa 23 h bis etwa 25h und am meisten bevorzugt etwa 24 h .
Das Wachstum des Produktionsstammes kann in einer anaeroben Kultivierung ohne Sauerstof f zufuhr, oder in einer aeroben Kultivierung mit Sauerstof f zufuhr erfolgen . Bevorzugt wird das erfindungsgemäße Verfahren in einer aeroben Kultivierung mit Sauerstof f durchgeführt .
Bei einer aeroben Kultivierung von Wirtsbakterien zur Produktion des erfindungsgemäßen Plasmidvektors wird bevorzugt eine Sättigung des Sauerstof f-Gehalts von mindestens etwa 10% (v/v) , besonders bevorzugt von mindestens etwa 25% (v/v) und noch mehr bevorzugt von mindestens etwa 50% (v/v) eingestellt . Verfahren bzw . Vorrichtungen zur Regulation der Sauerstof f-Sättigung in einer Fermentationskultur sind einem Fachmann bekannt . In einer Aus führungs form erfolgt die Regulation der Sauerstof f-Sättigung entsprechend dem Stand der Technik automatisch über eine Kombination aus Gas zufuhr und Rührgeschwindigkeit .
Die Sauerstof fversorgung kann durch j edes geeignete Verfahren erfolgen, beispielsweise durch Eintrag von Pressluft oder durch Eintrag von reinem Sauerstof f . Bevorzugt erfolgt die Sauerstof fversorgung bei einer aeroben Kultivierung im erfindungsgemäßen Verfahren durch Eintrag von Pressluft . Der Bereich der Pressluft zufuhr bei einer aeroben Kultivierung beträgt beispielsweise von etwa 0 , 05 Volumen Pressluft pro Volumen Fermentationsmedium pro Minute (vvm) bis etwa 10 vvm . Bevorzugt erfolgt ein Presslufteintrag von etwa 0 , 2 vvm bis etwa 8 vvm, mehr bevorzugt von etwa 0 , 4 bis etwa 6 vvm und besonders bevorzugt von 0 , 8 bis 5 vvm .
Die Rührgeschwindigkeit bei der Fermentation im erfindungsgemäßen Verfahren beträgt beispielsweise etwa 700 Umdrehungen pro Minute ( rpm) , bevorzugt etwa 1800 rpm, mehr bevorzugt etwa 2500 rpm, und besonders bevorzugt etwa 3000 rpm .
In einer Aus führungs form des erfindungsgemäßen Verfahrens erfolgt die Anzucht , d . h . die Kultivierung der Wirts zellen, im sogenannten Batch-Modus . Zur Gewinnung von Biomasse wird hierbei ein Anzuchtmedium mit einer Starterkultur der Wirts zellen, die einen erfindungsgemäßen Plasmidvektor tragen, inokuliert . Das Zellwachstum erfolgt dann ohne weitere Fütterung von Nährstof f quellen . In einer anderen Aus führungs form des erfindungsgemäßen Verfahrens erfolgt die Anzucht im sogenannten Fed-Batch-Modus , der auch als Anzucht im Zulauf-Modus bezeichnet wird . In dieser Aus führungs form erfolgt die Gewinnung von Biomas se , indem nach einer anfänglichen Phase des Wachstums im Batch-Modus zusätzliche Nährstof f quellen zugefüttert werden . Diese werden als Feed oder Zulauf bezeichnet . Der Zulauf kann aus der Kohlenstof f quelle , der Stickstof f quelle , einem oder mehreren für die Produktion wichtigen Vitaminen, Spurenelementen oder aus einer Kombination der genannten Komponenten bestehen . Dabei können die Komponenten dem Zulauf als Gemisch zusammen oder getrennt zudosiert werden . Zusätzlich können dem Zulauf auch andere Medienbestandteile sowie spezi fische , die Plasmidproduktion steigernde Zusätze , wie beispielsweise Aminosäuren, zugesetzt werden . Der Zulauf kann dabei kontinuierlich, oder diskontinuierlich in Portionen zugeführt werden . Es ist zudem eine Kombination aus kontinuierlichem und diskontinuierlichem Zulauf möglich .
Bevorzugt ist das Verfahren zur Klonierung von DNA-Sequenzen unter Verwendung des erfindungsgemäßen Plasmidvektors ein fermentatives Verfahren im Fed-Batch-Modus .
Im erfindungsgemäß bevorzugten Fed-Batch-Verfahren zur Klonierung von DNA-Sequenzen unter Verwendung des erfindungsgemäßen Plasmidvektors sind bevorzugte Kohlenstof f quellen im Zulauf ausgewählt aus Glukose , Saccharose , Glukose - oder Saccharose-enthaltende pflanzliche Hydrolysate , sowie Mischungen davon in einem beliebigen Mischungsverhältnis . Eine besonders bevorzugte Kohlenstof f quelle im Zulauf ist Glucose .
Bevorzugt wird im erfindungsgemäßen Verfahren die Kohlenstof f quelle der Kultur so zudosiert , dass der Gehalt der Kohlenstof f quelle im Fermenter während der Produktionsphase etwa 10 g/L nicht übersteigt . Bevorzugt beträgt die maximale Konzentration der Kohlenstof f quelle im Fermenter während der Produktionsphase etwa 2 g/L, weiter bevorzugt etwa 0 , 5 g/L, und besonders bevorzugt etwa 0 , 1 g/L .
Die Erfindung wird weiterhin im Folgenden anhand von Aus führungsbeispielen und den beigefügten Abbildungen näher beschrieben, ohne dadurch beschränkt zu werden .
Abbildung 1 zeigt eine schematische Darstellung eines Ausschnitts des erfindungsgemäßen Plasmidvektors mit dem Replikationsursprung und der PAS-Region mit der Primosomenassemblierungssequenz PAS- for, der Primosomenassemblierungssequenz PAS-rev und der Sequenz X zwischen PAS- for und PAS-rev .
Abbildung 2 zeigt eine schematische Plasmidkarte des Plasmids pVAXl . pCMV bezeichnet den Zytomegalieviruspromotor . Kanamycin bezeichnet das Kanamycin-Resistenzgen . BGH pA bezeichnet die PolyA-Region des bovinen Wachstumshormongens .
Abbildung 3 zeigt eine schematische Darstellung unterschiedlicher PAS-Regionen . PASBR322 bezeichnet die PAS- Region des Kontrollplasmids pVAXl-PASBR322 . PAS 09 , PAS 10 , PAS 18 , PAS31 , PAS38 und PAS39 bezeichnen PAS-Regionen mit unterschiedlichen modi fi zierten Sequenzabschnitten . Der hel le Balken gibt j eweils den Sequenzabschnitt an, welcher gegenüber der SEQ ID NO : 1 modi fi ziert ist .
Abbildung 4 zeigt den Plasmidtiter [nmol/L ] von unterschiedlichen erfindungsgemäßen Plasmidvektoren in Fermentationskultur zum Zeitpunkt 24 Stunden, sowie zum Zeitpunkt 42 Stunden . Abbildung 5 zeigt den relativen Plasmidtiter von unterschiedlichen erfindungsgemäßen Plasmidvektoren nach einer Fermentation über 24 Stunden . Es ist der prozentuale Anteil dieses Titers in Bezug auf den Titer angegeben, der nach 42 Stunden erhalten wird .
Beispiele
Alle Enzyme und Kits wurden gemäß den Anweisungen der Hersteller verwendet. Sofern nicht anders angegeben, wurden alle verwendeten Standardmethoden, molekularbiologischen und mikrobiologischen Verfahren wie beispielsweise Transformation von Bakterienzellen, Polymerase-Ketten-Reaktion (PCR) , Gensynthese, Isolierung und Reinigung von DNA, Modifikation von DNA mittels Restriktionsenzymen, Klenow- Fragment und/oder Ligase jeweils in der in der Literatur beschriebenen, von den jeweiligen Herstellern empfohlenen, bzw. einer dem Fachmann gut bekannten Art und Weise durchgeführt.
Bestimmung der Sequenzidentität
Zur Bestimmung der Sequenzidentität wurde die SEQ ID NO:1 jeweils als Referenzsequenz verwendet. Alle mit der Sequenz SEQ ID NO:1 zu vergleichenden Sequenzen X wurden in einem mit dem in Geneious Prime® 2023.0.2 Build 2023-01-09 11:52 integrierten Alignment Tool Clustal Omega 1.2.2 erstellten, paarweisen Sequenzvergleich (pairwise sequence alignment; mBed algorithm; Cluster size for mBed Guide Trees: 100) mit der Referenzsequenz verglichen. Innerhalb des Sequenzvergleichs wurden alle Positionen gezählt, die sowohl in der Referenzsequenz als auch in der zu vergleichenden Sequenz identische Basen aufweisen. Anschließend wurde die Anzahl dieser identischen Positionen durch die Gesamtzahl der Basen der Referenzsequenz geteilt, um die prozentuale Sequenzidentität zu ermitteln.
Beispiel 1: Herstellung des Plasmidproduktionsstamms E.coli WCM105 AfliC AyddS AendA
Als Ausgangsstamm für die Erzeugung des Bakterienstamms E. coli WCM105 AfliC AyddS AendA wurde der in EP2418276 Bl beschriebene Bakterienstamm E.coli WCM105 AfliC AyddS verwendet, welcher wiederum aus dem Stamm E.coli WCM105 erzeugt wurde. E.coli WCM105 ist herstellbar gemäß EP0338410B1.
Herstellung des Stamms E.coli WCM105 AfliC AyddS AendA: : cat pKD46
Zuerst wurden im Stamm E.coli WCM105 AfliC AyddS 443 Basenpaare der codierenden Region des chromosomalen Wildtyp-endA-Gens (SEQ ID NO: 18) durch eine Expressionskassette ersetzt, welche das Gen für eine Chloramphenicol-Acetyltransf erase (cat; UniProt No. P62577) umfasst. Zu diesem Zweck wurde als Matrize für die Amplif izierung dieser cat-Kassette mittels PCR ein Derivat des Plasmids pKD3 (Datsenko et al Proc Natl Acad Sei USA. 2000 Jun 6; 97 ( 12 ) : 6640-5. , https://www.addgene.org/45604/) verwendet. Das pKD3-Derivat wurde wie folgt erzeugt: Jeweils 250 Basenpaare lange, zum Wildtyp endA-Gen, bzw. zu stromaufwärts und stromabwärts gelegenen Regionen, homologe Regionen PCR01 (SEQ ID NO: 21) und PCR02 (SEQ ID NO: 24) wurden zunächst unter Verwendung der Oligonukleotide Pp489 (SEQ ID NO: 19) und Pp490 (SEQ ID NO:20) bzw Pp493 (SEQ ID NO:22) und Pp494 (SEQ ID NO:23) und chromosomaler DNA des Stamms WCM105 AfliC AyddS als Matrize amplif iziert . Parallel wurde die cat Expressionskassette (SEQ ID NO: 27) unter Verwendung der Oligonukleotide Pp491 (SEQ ID NO: 25) und Pp492 (SEQ ID NO:26) und pKD3 als Matrize amplif iziert . Die resultierenden Amplikons wurden anschließend durch Overlap- extensi on-PCR (Horton et al. 2013, Gene Splicing by Overlap Extension: Tailor-Made Genes Using the Polymerase Chain Reaction, BioTechniques 54, 129-33) zu einem kombinierten Amplikon PCR04 vereinigt (SEQ ID NO:28) , und dieses in das mit den Restriktionsenzymen Paei und Ndel (Thermo Fisher Scientific) geschnittene Plasmid pKD3 insertiert. Das resultierende Plasmid wurde mit pKD3-AendA bezeichnet. Die PCR zur Amplif izierung der cat-Kassette wurde mit pKD3-AendA als Matrize und den Oligonukleotiden Pp495 (SEQ ID NO:29) und Pp496 (SEQ ID NO:30) durchgeführt. Dabei sind die ersten 250 Nukleotide des Amplikons PCR05 homolog zur 5'-seitig gelegenen Sequenz des offenen Leserahmens (ORF) von endA-Gen und die letzten 250 Nukleotide des Amplikons PCR05 homolog zur 3 '-seifig gelegenen Sequenz des endA-ORFs . Es entstand so das lineare DNA-Fragment PCR05 (SEQ ID NO:31) , das die cat- Kassette enthielt.
Der Stamm E.coli WCM105 AfliC AyddS wurde mit dem Plasmid pKD46 (Coli Genetic Stock Center CGSC#: 7739) transformiert, was zu dem Stamm E.coli WCM105 AfliC AyddS pKD46 führte. Kompetente Zellen des Stammes WCM105 AfliC AyddS pKD46, welche nach den Angaben von Datsenko und Wanner (s.o.) hergestellt worden waren, wurden mit dem linearen DNA-Fragment PCR05 (SEQ ID NO:31) , dass die cat-Kassette enthielt, transformiert. Die Selektion auf Integration der catKassette in das Chromosom von WCM105 AfliC AyddS pKD46 an die Position des Wildtyp-endA-ORFs erfolgte auf LB-Agar-Platten, die 20 mg/1 Chloramphenicol enthielten. Auf diese Weise wurden Zellen erhalten, bei denen der Wildtyp-endA- ORF teilweise durch die cat-Kassette ersetzt worden war (E. coli WCM105 AfliC AyddS endA: : cat pKD46) . Dass die Integration an der korrekten Position im Chromosom erfolgte, wurde mittels PCR unter Verwendung der Oligonukleotide Pp505 (SEQ ID NO: 32) und Pp506 (SEQ ID NO: 33) und chromosomaler DNA der, Chloramphenicolresistenten Zellen E.coli AfliC AyddS endA: : cat pKD46 als Matrize bestätigt. Zellen des Stammes E.coli WCM105 AfliC AyddS endA: : cat pKD46 exprimierten nun das Gen cat, codierend eine Chloramphenicol-Acetyltransf eraseanstelle des endA-Wildtyp- Gens . Anschließend wurde das Plasmid pKD46 durch Kultivierung bei der nicht-permissiven Temperatur 37 °C kuriert und der Stamm E.coli WCM105 AfliC AyddS endA: : cat durch Selektion auf LB-Agar- Platten und LB-Agar-Chloramphenicol (20 mg/1 ) -Platten isoliert. In einem nächsten Schritt wurde die cat-Kassette aus dem Chromosom von E.coli WCM105 EfliC EyddS endA : cat entfernt. Hierzu wurde der Stamm E.coli WCM105 EfliC EyddS endA: : cat mit dem Plasmid pCP20 (Cherepanov et al. Gene disruption in Escherichia coli: TcR and KmR cassettes with the option of Flp- catalyzed excision of the antibiotic-resistance determinant, Gene. 1995;158:9-14.) transformiert. Die Isolation von bakteriellen Zellen, welche die cat-Kassette aus dem Chromosom eliminiert haben, erfolgte durch Selektion von Chloramphenicolsensitiven Zellen nach paralleler Kultivierung auf LB-Agar und LB-Agar-Chloramphenicol (20 mg/1 ) -Platten . Dass die Deletion an der korrekten Position im Chromosom erfolgte, wurde mittels PCR unter Verwendung der Oligonukleotide Pp505 (SEQ ID NO: 32) und Pp506 (SEQ ID NO: 33) und chromosomaler DNA der Chloramphenicolsensitiven Zellen E.coli WCM105 EfliC EyddS EendA als Matrize bestätigt. Durch Sequenzierung des PCR-Produkts wurde die Sequenz des ursprünglichen endA Lokus überprüft. Der resultierende Stamm wurde als E.coli WCM105 EfliC EyddS EendA bezeichnet .
Beispiel 2: Herstellung von Plasmidvektoren mit unterschiedlichen PAS-Regionen
Herstellung des Plasmidvektors pVAXl-PASBR322 mit der PAS-
Region des Plasmids pBR322
Als Ausgangsvektor für die Herstellung eines Kontrollplasmids mit der PAS-Region des Plasmids pBR322 wurde das Plasmid pVAXl (Thermo Fisher Scientific, vgl . Figur 2) verwendet. pVAXl wurde durch Schnitt mit den Restriktionsenzymen Bsp68I und Hindi (Thermo Fisher Scientific) linearisiert. Durch Verwendung von pBR322 als Matrize und den Oligonukleotiden Pp237 (SEQ ID NO: 34) und Pp073 (SEQ ID NO: 35) wurde mittels PCR das 444 Basenpaare lange Amplikon PCR06 (SEQ ID NO: 36) enthaltend die PAS-Region von pBR322 generiert. Dabei sind die ersten 21 Nukleotide von Pp237 homolog zur 5 '-seifig gelegenen Sequenz der Bsp68I- Schnittstelle und die ersten 21 Nukleotide von Pp073 homolog zur 3' gelegenen Sequenz der Hindi Schnittstelle. Durch In-Fusion- Klonierung (Takara Bio) wurde das Amplikon PCR06 in das linearisierte Plasmid pVAXl integriert. Plasmide, welche das Amplikon erfolgreich integriert hatten, wurden durch Kolonie- PCR mit den Oligonukleotiden Pp081 (SEQ ID NO: 37) und pVAXl-seq- rv (SEQ ID NO:38) identifiziert. Die Verifizierung der integrierten Sequenz erfolgte durch Sanger-Sequenzierung unter Verwendung der Oligonukleotide pVAX-seq2-rv (SEQ ID NO: 39) und pVAX-seq23-fw (SEQ ID NO: 40) . Das resultierende Kontrollplasmid wurde als pVAXl-PASBR322 bezeichnet.
Herstellung von Plasmidvektoren mit modifizierten PAS-Regionen
Herstellung des Plasmidvektors pVAXl-PAS09
Als Ausgangsvektor für die Herstellung des Plasmids pVAXl-PAS09 wurde das Plasmid pVAXl (Thermo Fisher Scientific, vgl . Figur 2) verwendet. Zur Erstellung einer PAS-Region mit einer modifizierten Sequenz wurde die Sequenzabfolge von 64 konsekutiven Nukleobasen, die im Abstand von 22 Basenpaaren 3 ' der PAS-for-Sequenz lokalisiert sind, randomisiert . Die Randomisierung der Basenabfolge wurde mit Hilfe des Online-Tools „Shuffle DNA"
(https : // www . bio informatics . org/ sms2/ shuf f le_dna . html ) durchgeführt. Bei der Randomisierung wurden keine nicht in der Sequenz vorkommenden Basen hinzugefügt und keine in der Sequenz vorkommenden Basen entfernt. Der relative Anteil an G/C Basen im Verhältnis zu A/T Basen wurde nicht verändert, lediglich die Abfolge der in der Sequenz enthaltenen Basen wurde verändert. Durch diesen Vorgang wurde der randomisierte Sequenzabschnitt PAS09 (SEQ ID NO: 41) generiert. Unter Verwendung der Bioinformatik-Software Geneious Prime (Geneious Prime® 2023.0.2 Build 2023-01-09 11:52) wurden innerhalb der PAS-Region BR322 die 64 im Abstand von 22 Basenpaaren 3' der PAS-for-Sequenz lokalisierten Nukleobasen durch den randomisierten Sequenzabschnitt PAS09 substituiert. Durch diesen Vorgang wurde die PAS-Region 09 (SEQ ID NO: 7) zunächst in silico generiert. Durch Gensynthese (GeneArt) wurde ein DNA-Fragment erstellt, welches die PAS-Region 09 umfasst (SEQ ID NO: 60) . Dieses DNA- Fragment wurde mittels In-Fusion Klonierung (Takara Bio) in das durch Schnitt mit den Restriktionsenzymen Bsp68I und Hindi (Thermo Fisher Scientific) linearisierte Plasmid pVAXl integriert. Plasmide, welche das Fragment erfolgreich integriert hatten, wurden durch Kolonie-PCR mit den Oligonukleotiden Pp081 (SEQ ID NO:37) und pVAXl-seq-rv (SEQ ID NO:38) identifiziert. Die Verifizierung der integrierten Sequenz erfolgte durch Sanger-Sequenzierung unter Verwendung der Oligonukleotide pVAX- seq2-rv (SEQ ID NO: 39) und pVAX-seq23-fw (SEQ ID NO: 40) . Das resultierende Plasmid wurde als pVAXl-PAS09 bezeichnet.
Herstellung des Plasmidvektors pVAXl-PASlO
Als Ausgangsvektor für die Herstellung des Plasmids pVAXl-PASlO wurde das Plasmid pVAXl (Thermo Fisher Scientific, vgl . Figur 2) verwendet. Die Sequenzabfolge von 63 konsekutiven Nukleobasen, die im Abstand von 86 Basenpaaren 3' der PAS-for-Sequenz lokalisiert sind, wurde wie zuvor beschrieben mit Hilfe des Online-Tools „Shuffle DNA" randomisiert . Durch diesen Vorgang wurde der randomisierte Sequenzabschnitt PAS10 (SEQ ID NO: 58) generiert. Innerhalb der PAS-Region BR322 wurden die 63 im Abstand von 86 Basenpaaren 3' der PAS-for-Sequenz lokalisierten Nukleobasen wie beschrieben durch den randomisierten Sequenzabschnitt PAS10 (SEQ ID NO: 58) substituiert. Durch diesen Vorgang wurde die PAS-Region 10 zunächst in silico generiert (SEQ ID NO: 9) . Unter Verwendung von In Fusion Klonierung wurde ein durch Gensynthese (GeneArt) erstelltes Fragment (SEQ ID NO: 61) , welches die PASIO-Region umfasst, wie zuvor beschrieben in das durch Schnitt mit den Restriktionsenzymen Bsp68I und Hindi linearisierte Plasmid pVAXl integriert. Plasmide, welche das Fragment erfolgreich integriert hatten, wurden durch Kolonie-PCR mit den Oligonukleotiden Pp081 (SEQ ID NO: 37) und pVAXl-seq-rv (SEQ ID NO: 38) identifiziert. Die Verifizierung der integrierten Sequenz erfolgte durch Sanger-Sequenzierung unter Verwendung der Oligonukleotide pVAX-seq2-rv (SEQ ID NO: 39) und pVAX-seq23-fw (SEQ ID NO: 40) . Das resultierende Plasmid wurde als pVAXl-PASlO bezeichnet.
Herstellung des Plasmidvektors pVAXl-PAS18
Als Ausgangsvektor für die Herstellung des Plasmids pVAXl-PAS18 wurde das Plasmid pVAXl (Thermo Fisher Scientific, vgl . Figur 2) verwendet. Innerhalb der PAS-Region BR322 wurde die Sequenzabfolge von 64 konsekutiven, im Abstand von 22 Basenpaaren 3' der PAS-for-Sequenz lokalisierten Nukleobasen wie zuvor beschrieben durch den randomisierten Sequenzabschnitt PAS09 (SEQ ID NO:41) , und die Sequenzabfolge von 63 konsekutiven, im Abstand von 86 Basenpaaren 3' der PAS-for-Sequenz lokalisierten Nukleobasen wie zuvor beschrieben durch den randomisierten Sequenzabschnitt PAS10 (SEQ ID NO: 58) substituiert. Durch diese Vorgänge wurde die PAS-Region 18 (SEQ ID NO: 11) zunächst in silico generiert. Unter Verwendung von In Fusion Klonierung wurde ein durch Gensynthese (GeneArt) erstelltes Fragment (SEQ ID NO: 62) , welches die PAS18-Region umfasst, wie zuvor beschrieben in das durch Schnitt mit den Restriktionsenzymen Bsp68I und Hindi linearisierte Plasmid pVAXl integriert. Plasmide, welche das Fragment erfolgreich integriert hatten, wurden durch Kolonie-PCR mit den Oligonukleotiden Pp081 (SEQ ID NO: 37) und pVAXl-seq-rv (SEQ ID NO: 38) identifiziert. Die Verifizierung der integrierten Sequenz erfolgte durch Sanger-Sequenzierung unter Verwendung der Oligonukleotide pVAX-seq2-rv (SEQ ID NO: 39) und pVAX-seq23-fw (SEQ ID NO: 40) . Das resultierende Plasmid wurde als pVAXl-PAS18 bezeichnet .
Herstellung des Plasmidvektors pVAXl-PAS31
Als Ausgangsvektor für die Herstellung des Plasmids pVAXl-PAS31 wurde das Plasmid pVAXl (Thermo Fisher Scientific, vgl . Figur 2) verwendet. Die Sequenzabfolge von 22 konsekutiven Nukleobasen, die unmittelbar 3' der PAS-for-Sequenz lokalisiert sind, wurde wie zuvor beschrieben mit Hilfe des Online-Tools „Shuffle DNA" randomisiert . Durch diesen Vorgang wurde der randomisierte Sequenzabschnitt PAS31 (SEQ ID NO: 59) generiert. Innerhalb der PAS-Region BR322 wurden die 22 unmittelbar 3' der PAS-for- Sequenz lokalisierten Nukleobasen wie zuvor beschrieben durch den randomisierten Sequenzabschnitt PAS31 (SEQ ID NO: 59) substituiert. Innerhalb der PAS-Region BR322 wurde die Sequenzabfolge von 64 konsekutiven, im Abstand von 22 Basenpaaren 3' der PAS-for-Sequenz lokalisierten Nukleobasen wie zuvor beschrieben durch den randomisierten Sequenzabschnitt PAS09 (SEQ ID N0:41) , und die Sequenzabfolge von 63 konsekutiven, im Abstand von 86 Basenpaaren 3' der PAS-for-Sequenz lokalisierten Nukleobasen wie zuvor beschrieben durch den randomisierten Sequenzabschnitt PAS10 (SEQ ID NO: 58) substituiert. Durch diese Vorgänge wurde die PAS-Region 31 (SEQ ID NO: 13) zunächst in silico generiert. Unter Verwendung der Oligonukleotide Pp335 (SEQ ID NO: 42) und Pp338 (SEQ ID NO: 43) bzw Pp339 (SEQ ID NO:44) und pVAX-seq2-rv (SEQ ID NO:39) , sowie pVAXl-PAS18 als Matrize wurden die Amplikons PCR07 (SEQ ID NO: 45) und PCR08 (SEQ ID NO: 46) generiert. Die resultierenden Amplikons wurden anschließend durch Overlap-extensi on-PCR (Horton et al. 2013) zu einem kombinierten Amplikon vereinigt (SEQ ID NO: 47) und dieses unter Verwendung von In Fusion Klonierung wie zuvor beschrieben in das durch Schnitt mit den Restriktionsenzymen Alw44I und Hindi (Thermo Fisher Scientific) linearisierte Plasmid pVAXl integriert. Plasmide, welche das kombinierte Amplikon erfolgreich integriert hatten, wurden durch Kolonie- PCR mit den Oligonukleotiden Pp081 (SEQ ID NO: 37) und pVAXl-seq- rv (SEQ ID NO:38) identifiziert. Die Verifizierung der integrierten Sequenz erfolgte durch Sanger-Sequenzierung unter Verwendung der Oligonukleotide pVAX-seq2-rv (SEQ ID NO: 39) und pVAX-seq23-fw (SEQ ID NO: 40) . Das resultierende Plasmid wurde als pVAXl-PAS31 bezeichnet.
Herstellung des Plasmidvektors pVAXl-PAS38
Als Ausgangsvektor für die Herstellung des Plasmids pVAXl-PAS38 wurde das Plasmid pVAXl (Thermo Fisher Scientific, vgl . Figur 2) verwendet. Innerhalb der PAS-Region BR322 wurde die Sequenzabfolge von 64 konsekutiven, im Abstand von 22 Basenpaaren 3' der PAS-for-Sequenz lokalisierten Nukleobasen wie zuvor beschrieben durch den randomisierten Sequenzabschnitt PAS10 (SEQ ID NO: 58) substituiert. Durch diesen Vorgang wurde die PAS-Region 38 (SEQ ID NO: 15) zunächst in silico generiert. Unter Verwendung der Oligonukleotide Pp335 (SEQ ID NO: 42) und Pp384 (SEQ ID NO: 48) bzw Pp385 (SEQ ID NO: 49) und pVAX-seq2-rv (SEQ ID NO: 39) , sowie pVAXl-PASBR322 als Matrize wurden die Amplikons PCR09 (SEQ ID NO: 50) und PCR10 (SEQ ID NO: 51) generiert. Die resultierenden Amplikons wurden anschließend durch Overlap-extensi on-PCR (Horton et al. 2013) zu einem kombinierten Amplikon vereinigt (SEQ ID NO: 52) und dieses unter Verwendung von In Fusion Klonierung wie zuvor beschrieben in das durch Schnitt mit den Restriktionsenzymen Alw44I und Hindi (Thermo Fisher Scientific) linearisierte Plasmid pVAXl integriert. Plasmide, welche das kombinierte Amplikon erfolgreich integriert hatten, wurden durch Kolonie-PCR mit den Oligonukleotiden Pp081 (SEQ ID NO: 37) und pVAXl-seq-rv (SEQ ID NO: 38) identifiziert. Die Verifizierung der integrierten Sequenz erfolgte durch Sanger-Sequenzierung unter Verwendung der Oligonukleotide pVAX-seq2-rv (SEQ ID NO: 39) und pVAX-seq23-fw (SEQ ID NO: 40) . Das resultierende Plasmid wurde als pVAXl-PAS38 bezeichnet .
Herstellung des Plasmidvektors pVAXl-PAS39
Als Ausgangsvektor für die Herstellung des Plasmids pVAXl-PAS39 wurde das Plasmid pVAXl (Thermo Fisher Scientific, vgl . Figur 2) verwendet. Innerhalb der PAS-Region BR322 wurde die Sequenzabfolge von 63 konsekutiven, im Abstand von 86 Basenpaaren 3' der PAS-for-Sequenz lokalisierten Nukleobasen wie zuvor beschrieben durch den randomisierten Sequenzabschnitt PAS09 (SEQ ID NO: 41) substituiert. Durch diesen Vorgang wurde die PAS-Region 39 (SEQ ID NO: 17) zunächst in silico generiert. Unter Verwendung der Oligonukleotide Pp 335 (SEQ ID NO: 42) und Pp386 (SEQ ID NO: 53) bzw. Pp387 (SEQ ID NO: 54) und PppVAX-seq2- rv (SEQ ID NO: 39) , sowie pVAXl-PASBR322 als Matrize wurden die Amplikons PCR11 (SEQ ID NO: 55) und PCR12 (SEQ ID NO: 56) generiert. Die resultierenden Amplikons wurden anschließend durch Overlap-extension-PCR (Horton et al. 2013) zu einem kombinierten Amplikon vereinigt (SEQ ID NO: 57) und dieses unter Verwendung von In Fusion Klonierung wie zuvor beschrieben in das durch Schnitt mit den Restriktionsenzymen Alw44I und Hindi (Thermo Fisher Scientific) linearisierte Plasmid pVAXl integriert. Plasmide, welche das kombinierte Amplikon erfolgreich integriert hatten, wurden durch Kolonie-PCR mit den Oligonukleotiden Pp081 (SEQ ID NO: 37) und pVAXl-seq-rv (SEQ ID NO: 38) identifiziert. Die Verifizierung der integrierten Sequenz erfolgte durch Sanger-Sequenzierung unter Verwendung der Oligonukleotide pVAX-seq2-rv (SEQ ID NO: 39) und pVAX-seq23-fw (SEQ ID NO: 40) . Das resultierende Plasmid wurde als pVAXl-PAS39 bezeichnet .
Beispiel 3: Fermentative Produktion von Plasmid-DNA im 1 L- Maßstab Für die Produktion der Plasmidvektoren pVAXl-PASBR322 , pVAXl- PAS09, pVAXl-PASlO, pVAXl-PAS18, pVAXl-PAS31, pVAXl-PAS38 und pVAXl-PAS39 wurde der Stamm E.coli WCM105 EfliC EyddS EendA jeweils einzeln mit den Plasmiden pVAXl, pVAXl-PASBR322 , pVAXl- PAS09, pVAXl-PASlO, pVAXl-PAS18, pVAXl-PAS31, pVAXl-PAS38 und pVAXl-PAS39 mittels der CaC12-Methode transformiert. Die Selektion auf plasmidhaltige Zellen erfolgte mittels Kanamycin ( 20 mg/ 1 ) .
Die Produktion der einzelnen, transformierten Stämme wurde in 1 1 Rührkesselfermentern (Eppendorf) durchgeführt. 0, 6 1 eines Mineralsalzmediums (5 g/L (NH4)2SO4, 5g/L KH2PO4, 0,5 g/L NaCl, 1,5 g/L MgSO4 x 7 H2O, 0,25 g/L CaCl2 x 2 H2O, 0, 075 g/L FeSO4 x 7 H2O, 1 g/L NasCitrat x 2 H2O, und 50 mg/L Kanamycin) inkl . 15 g/1 Glukose, angereichert mit Komplexkomponenten 10 g/L Hefeextrakt (ProCel 251 MG) , wurden mit einer Vorkultur, die in Fermentationsmedium kultiviert worden war, auf eine OD600 von etwa 0,05 angeimpft. Das Animpfen stellt den Zeitpunkt 0 der Fermentation bzw. den Fermentationsbeginn dar. Während der Fermentation wurde eine Temperatur von 30 °C eingestellt und der pH-Wert durch Zudosierung von NH4OH bzw. HaPCh bei einem Wert von etwa 7,0 konstant gehalten. Die Kultur wurde zu Beginn mit 700 rpm gerührt und mit 2 vvm einer über einen Sterilfilter entkeimten Druckluft begast. Unter diesen Startbedingungen war die Sauerstoff sonde vor der Inokulation auf 100% Sättigung kalibriert worden. Der Soll-Wert für die 02-Sättigung während der Fermentation wurde auf 30 % eingestellt. Nach Absinken der 02-Sättigung unter den Soll-Wert wurde eine Regulationskaskade gestartet, um die 02-Sättigung wieder an den Soll-Wert heranzuführen. Dabei wurde die Rührgeschwindigkeit auf max. 1.800 rpm gesteigert. Die Fütterung mit Glukose wurde nach der Verstoffwechselung der initial zugegebenen Glukose gestartet. Vor dem Fütterungsstart wurde die Temperatur von 30 °C auf 37 °C erhöht . Nach der Zuführung von 100 g reiner Glukose wurde die
Glukosefütterungsrate um 60 % reduziert .
Nach 24 und nach 42 h Kultivierungsdauer wurden j eweils Proben entnommen, die Zellen wurden durch Zentri fugation vom Fermentationsmedium abgetrennt und der Gehalt der Plasmid-DNA im Zellpellet wurde bestimmt . Hierzu wurde die Plasmid-DNA zunächst unter Verwendung des GeneJET Plasmid-Miniprep-Kits ( Thermo Fisher Scienti fic ) isoliert und die Konzentration in der Elutions fraktion anschließend mit Hil fe von UV/VIS Spektrometrie bestimmt . Zur Berechnung des Plasmidtiters in der Ausgangsprobe wurde die gemessene Plasmidkonzentration zunächst mit dem Elutionsvolumen multipli ziert und anschließend durch das Volumen der zur Beprobung verwendeten Fermentationsbrühe dividiert .
In Abbildung 4 ist der Plasmidtiter (nmol/L ) des Plasmidvektors pVAXl , des Plasmidvektors pVAXl-PASBR322 , und der erfindungsgemäßen Plasmidvektoren, pVAXl-PAS 09 , pVAXl-PAS l O , pVAXl-PAS 18 , pVAXl-PAS31 , pVAXl-PAS38 und pVAXl-PAS39 in Fermentationskultur zum Zeitpunkt 24 Stunden, sowie zum Zeitpunkt 42 Stunden abgebi ldet . Dabei ist zu erkennen, dass die Plasmidtiter der erfindungsgemäßen Plasmidvektoren zum Zeitpunkt 24 Stunden deutlich höher sind als die Plasmidtiter des Kontrollplasmidvektors pVAXl-PASBR322 .
In Abbildung 5 ist der relative Plasmidtiter des Plasmidvektors pVAXl , des Plasmidvektors pVAXl-PASBR322 und der erfindungsgemäßen Plasmidvektoren, pVAXl-PAS 09 , pVAXl-PAS l O , pVAXl-PAS 18 , pVAXl-PAS31 , pVAXl-PAS38 und pVAXl-PAS39 in Fermentationskultur nach einer Fermentation über 24 Stunden gezeigt . Es ist der prozentuale Anteil dieses Titers im Bezug auf den Titer angegeben, der nach 42 Stunden erhalten wird . Dabei ist zu erkennen, dass mit den erfindungsgemäßen Plasmidvektoren relative Plasmidtiter erreicht werden können, die deutlich höher sind als die Plasmidtiter des Kontrollplasmidvektors pVAXl- PASBR322 .

Claims

Patentansprüche
1. Plasmidvektor, umfassend a) einen Replikationsursprung; und b) eine PAS-Region, umfassend i) eine Primosomenassemblierungssequenz PAS-forward (SEQ ID NO:2) , die 3'des Replikationsursprungs und in Richtung der Replikation lokalisiert ist; ii) eine Primosomenassemblierungssequenz PAS-revers (SEQ ID NO:3) , die 3' der Primosomenassemblierungssequenz PAS-forward und in Richtung entgegen der Replikation lokalisiert ist; iii) eine Sequenz X zwischen der Primosomenassemblierungssequenz PAS-forward und der Primosomenassemblierungssequenz PAS-revers, welche höchstens etwa 75% Sequenzidentität zur SEQ ID NO:1 aufweist .
2. Plasmidvektor nach Anspruch 1, worin die Sequenz X höchstens etwa 70% Sequenzidentität zur SEQ ID NO:1 aufweist.
3. Plasmidvektor nach Anspruch 1, worin die Sequenz X höchstens etwa 65% Sequenzidentität zur SEQ ID NO:1 aufweist.
4. Plasmidvektor nach Anspruch 1, worin die Sequenz X höchstens etwa 60% Sequenzidentität zur SEQ ID NO:1 aufweist.
5. Plasmidvektor nach einem der vorhergehenden Ansprüche, worin der Plasmidvektor kein rop-Gen aufweist.
6. Plasmidvektor nach einem der vorhergehenden Ansprüche, worin der Replikationsursprung ein pUC Replikationsursprung ist.
7. Plasmidvektor nach einem der vorhergehenden Ansprüche, worin der Plasmidvektor eine Insertionssequenz mit mindestens einer Erkennungsstelle für mindestens eine Restriktionsendonuklease umfasst .
8. Plasmidvektor nach einem der vorhergehenden Ansprüche, weiter umfassend einen Selektionsmarker, wobei der Selektionsmarker bevorzugt ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus einem Antibiotikaresistenzgen, einem Toxin, einem Antitoxin, und einem Reporterelement .
9. Plasmidvektor nach einem der vorhergehenden Ansprüche worin die Sequenz X ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO : 8 , SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14 und SEQ ID NO: 16.
10. Plasmidvektor nach einem der Ansprüche 1-8 worin die Sequenz X ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12 und SEQ ID NO: 14.
11. Plasmidvektor nach einem der Ansprüche 1-8 worin die Sequenz X ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID NO: 10 und SEQ ID NO: 12.
12. Plasmidvektor nach einem der vorhergehenden Ansprüche, worin der Plasmidvektor in Fermentationskultur nach 24 h eine höhere Replikationsrate aufweist im Vergleich mit einem analogen Plasmidvektor mit der nicht modifizierten Sequenz SEQ ID NO:1.
13. Plasmidvektor nach einem der vorhergehenden Ansprüche, worin der Plasmidvektor in Fermentationskultur nach 24 h mindestens etwa 70% des maximalen Plasmidtiters erreicht, der nach etwa 42h erreicht wird.
14. Verfahren zur Klonierung von DNA-Sequenzen unter Verwendung des Plasmidvektors nach einem der Ansprüche 1-13.
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