WO2025230010A1 - ＣＤ１ｄ導入前にＣＤ１ｄリガンドでインキュベートされた細胞 - Google Patents

ＣＤ１ｄ導入前にＣＤ１ｄリガンドでインキュベートされた細胞

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WO2025230010A1
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expression
antigen
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眞一郎 藤井
佳奈子 清水
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RIKEN
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    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/10—Cells modified by introduction of foreign genetic material

Definitions

  • the present disclosure provides cells incubated with a CD1d ligand prior to CD1d introduction, and a method for producing such cells.
  • Natural killer T (NKT) cells are immune cells that share the characteristics of T cells and natural killer (NK) cells. They are activated by CD1d ligands, consisting of glycolipids loaded onto CD1d, a major histocompatibility complex (MHC)-like molecule on antigen-presenting cells (APCs). Activated NKT cells are known to directly enhance cytotoxicity via perforin/granzyme B, as well as induce their own differentiation and proliferation through the production of cytokines such as interferon gamma (IFN- ⁇ ) and interleukin-4 (IL-4), thereby activating T cells, NK cells, and B cells.
  • CD1d ligands consisting of glycolipids loaded onto CD1d, a major histocompatibility complex (MHC)-like molecule on antigen-presenting cells (APCs).
  • MHC major histocompatibility complex
  • APCs antigen-presenting cells
  • Activated NKT cells are known to directly enhance cytotoxicity via perforin/granzyme
  • Fujii et al. exogenously expressed CD1d and cancer antigens in human-derived cells and then pulsed the cells with ⁇ -GalCer to produce aAVC (Patent Documents 1 to 5).
  • the aAVC activated NKT cells via the CD1d/ ⁇ -GalCer complex, and the activated NKT cells produced cytokines such as IFN- ⁇ , activating NK cells and other cells.
  • administration of aAVC demonstrated an NK cell-dependent antitumor effect (Patent Documents 1 to 4, Non-Patent Documents 5 and 6).
  • aAVC administered to mice was rapidly killed in vivo by activated NKT cells, and the resulting cell fragments were taken up by dendritic cells.
  • Dendritic cells that had taken up the aAVC fragments presented the cancer antigen incorporated into MHC on their surface and induced cancer antigen-specific T cells.
  • administration of aAVC also demonstrated an antitumor effect via the induction of cancer antigen-specific T cells (Patent Documents 1 to 3, Non-Patent Documents 5 and 6).
  • aAVC can potently induce two immune mechanisms: innate immune activation through NK cell activation via NKT cell activation, and adaptive immune induction through the induction of antigen-specific T cells.
  • a composition comprising cells, The composition, wherein the cells are derived from a human and express a complex of CD1d and a CD1d ligand on the cell surface and intracellularly, respectively, and the amount of the complex intracellularly is significantly greater than the amount of the complex on the cell surface.
  • composition according to (1) or (2) above The cells have a higher NKT cell activation ability compared to control cells;
  • control cells are cells that have not been pre-incubated in the presence of a CD1d ligand before introducing or inducing expression of CD1d, and in which CD1d has been introduced or induced to express, and then the cells have been post-incubated in the presence of a CD1d ligand, and in which the conditions other than whether the incubation with the CD1d ligand is pre-incubation or post-incubation are the same for the cells in the composition and the control cells.
  • (4) The composition according to any one of (1) to (3) above, wherein the cells are CD1d-negative before introduction or induction of expression of CD1d.
  • composition containing cells capable of activating NKT cells, comprising: Incubating (preincubating) cells derived from a human in the presence of a CD1d ligand; introducing CD1d into the cells or inducing expression of CD1d; and incubating the obtained cells in the presence or absence of a CD1d ligand (post-incubation).
  • This method allows for obtaining cells that express CD1d protein and have NKT cell activity.
  • post-incubation is carried out in the absence of a CD1d ligand.
  • any of the above-mentioned inventions, wherein the introduction or induction of expression of CD1d comprises introduction of a nucleic acid encoding CD1d into cells.
  • the introduction or induction of expression of CD1d comprises introduction of mRNA encoding CD1d into cells.
  • the invention according to (23) above, wherein the introduction of the nucleic acid encoding CD1d into the cells is carried out under serum-free conditions.
  • the introduction of the nucleic acid encoding CD1d into the cells is carried out under serum-free conditions.
  • a composition comprising cells, The cells express at least a complex of CD1d and a CD1d ligand extracellularly, and the expression of the complex is above the detection limit of flow cytometry (e.g., the composition (1) above). That is, the expression level of the complex is greater than or equal to the value measured by an isotype antibody.
  • the MFI of the surface is 71.1, and the MFI of the intracellular is 323 or greater.
  • the MFI of the surface is 101, and the MFI of the intracellular is 516 or greater.
  • FIG. 1 This shows the effect of medium composition on protein expression during nucleic acid transfection.
  • the figure shows CD1d expression in the cells used (HEK293sf cells).
  • HEK293sf cells This is an experimental scheme in which cells are incubated in the presence or absence of a CD1d ligand (here, ⁇ -GalCer) after or without electroporation (EP), and then recovered and co-cultured with NKT cells to measure the activation of NKT cells and the amount of interferon- ⁇ (IFN- ⁇ ) produced by the NKT cells.
  • a CD1d ligand here, ⁇ -GalCer
  • EP electroporation
  • FIG. 6A shows the expression levels of human CD1d (hCD1d) on the cell surface and the expression levels of antigen protein (here, OVA) within the cells under each experimental condition.
  • the experimental conditions are summarized below.
  • condition 1 the gene encoding CD1d was not transfected (EP), but pretreatment (48 hours) and posttreatment (4 hours or 24 hours) with a CD1d ligand were performed.
  • condition 2 the gene was transfected, followed by pretreatment and posttreatment with a CD1d ligand.
  • condition 3 the gene was transfected, followed by posttreatment with a CD1d ligand.
  • Net mean fluorescence intensity (netMFI) was calculated and displayed in relation to the expression level (same below).
  • Figure 7A shows the cell surface and intracellular expression of the CD1d/CD1d ligand complex under conditions 1 to 3.
  • mouse CD1d mCD1d
  • human CD1d hCD1d
  • condition 1 a gene encoding CD1d was introduced (EP) followed by post-treatment (6 hours) with a CD1d ligand; in condition 2, post-treatment was performed without the introduction; in condition 3, the introduction was performed but without the post-treatment; and in condition 4, neither the gene introduction nor the post-treatment was performed.
  • condition 2 a gene encoding CD1d was introduced (EP) followed by post-treatment (6 hours) with a CD1d ligand; in condition 2, post-treatment was performed without the introduction; in condition 3, the introduction was performed but without the post-treatment; and in condition 4, neither the gene introduction nor the post-treatment was performed.
  • the cell surface expression and intracellular expression of CD1d/CD1d ligand complex under conditions 1 to 4 shown in FIG. 8A are shown.
  • the cell surface expression and intracellular expression of CD1d under conditions 1 to 4 shown in FIG. 8A are shown.
  • the experimental conditions are summarized as follows: Under condition 1, a gene encoding CD1d was introduced (EP), followed by pretreatment (48 hours) and posttreatment (6 hours) with a CD1d ligand; under condition 2, the gene was introduced and then pretreated (48 hours) with a CD1d ligand; under condition 3, the gene was introduced and then pretreated (6 hours) with a CD1d ligand; and under condition 4, the gene was introduced and then pretreated (2 hours) with a CD1d ligand.
  • the cell surface expression and intracellular expression of CD1d/CD1d ligand complex under conditions 1 to 4 shown in FIG. 9A are shown.
  • the cell surface expression and intracellular expression of CD1d under conditions 1 to 4 shown in FIG. 9A are shown.
  • condition 1 cells were pretreated with CD1d ligand (48 hours), transfected with a gene encoding CD1d (EP), and then cultured in the absence of CD1d ligand for 16 hours (condition 1), 24 hours (condition 2), 48 hours (condition 3), 72 hours (condition 4), and 96 hours (condition 5).
  • condition 1 cells were pretreated with CD1d ligand (48 hours), transfected with a gene encoding CD1d (EP), and then cultured in the absence of CD1d ligand for 16 hours (condition 1), 24 hours (condition 2), 48 hours (condition 3), 72 hours (condition 4), and 96 hours (condition 5).
  • condition 1 cells were pretreated with CD1d ligand (48 hours), transfected with a gene encoding CD1d (EP), and then cultured in the absence of CD1d ligand for 16 hours (condition 1), 24 hours (condition 2), 48 hours (condition 3), 72 hours (condition 4), and 96 hours (condition 5).
  • condition 1 cells were pretreated with CD
  • mammal refers to non-human primates such as chimpanzees, gorillas, orangutans, monkeys, marmosets, and bonobos; and non-human mammals (e.g., Carnivora, Artiodactyla, Perissodactyla, and Rodents) such as pigs, rats, mice, cows, sheep, goats, horses, cats, and dogs.
  • non-human mammals e.g., Carnivora, Artiodactyla, Perissodactyla, and Rodents
  • aAVC artificial adjuvant vector cells
  • aAVC can activate natural killer T cells (NKT cells) and are taken up by dendritic cells (DCs), which are antigen-presenting cells.
  • NKT cells natural killer T cells
  • DCs dendritic cells
  • Activated NKT cells mature dendritic cells that have taken up antigen, and the mature dendritic cells migrate to lymphoid tissues and induce antigen-specific T cells (e.g., CD4+ T cells, CD8+ T cells, etc.).
  • aAVC drive or trigger this series of processes (NKT cell activation, phagocytosis by dendritic cells, maturation of dendritic cells after phagocytosis by activated NKT cells, and migration of dendritic cells to lymphoid tissues).
  • aAVC express antigenic peptides, they are beneficial because they have the ability to activate NKT cells even in the absence of antigenic peptides.
  • aAVC By expressing antigenic peptides, aAVC exhibit the ability to induce specific immunity (acquired immunity) against antigenic peptides. In this way, aAVC can activate both innate immunity and antigen-specific acquired immunity, thereby promoting the immune elimination of cancer cells and pathogens.
  • antigen refers to a substance that has antigenicity.
  • An antigen is typically a substance against which specific immunity should be induced.
  • the antigen may preferably be an antigen that is accessible to the immune system from outside the cell.
  • the antigen may be exogenous or endogenous.
  • Exogenous antigens include, but are not limited to, pathogens (e.g., viruses, bacteria, fungi, parasites, etc.).
  • An antigen may be, for example, an endogenous factor that is selectively present in specific tissues or specific cells that are the target of specific immune attack, or an endogenous factor that is selectively expressed in a pathological state.
  • Endogenous factors include, but are not limited to, cancer antigens.
  • Cancer antigens are antigens that are specifically expressed in cancer and preferably do not show substantial expression in normal tissues or normal cells.
  • an "antigenic peptide” refers to an antigenic protein or a fragment thereof.
  • Antigens can be, for example, nucleic acids, lipids, glycolipids, glycans, peptides, etc.
  • Antigenic peptides can be, for example, proteins selectively expressed in cancer cells (e.g., cancer antigens), or antigens selectively expressed in pathogen-infected cells (e.g., proteins constituting pathogens, proteins selectively expressed in target cells, or fragments thereof).
  • Antigens (antigenic peptides, etc.) are present intracellularly or on the cell membrane. This is because they are taken up by dendritic cells and presented as antigens.
  • antigenic peptides When presented as antigens, they are presented as short protein fragments, so antigenic peptides can be proteins or protein fragments as long as they can be presented by dendritic cells. Antigenic peptides can be, for example, membrane proteins or parts of their extracellular domains.
  • starting cells refer to cells prior to the treatment of the present invention.
  • the treatment of the present invention includes at least pre-incubating the starting cells in the presence of a CD1d ligand and introducing a nucleic acid encoding CD1d into the cells obtained above.
  • preincubation means incubating (culturing) cells under conditions suitable for maintaining the cells before introducing or inducing expression of CD1d into the cells. Incubation can be carried out, for example, in the presence or preferably absence of serum (preferably under xeno-free conditions). As used herein, "xeno-free" means not containing components of a species different from the cells.
  • post-incubation refers to incubating (culturing) cells under conditions suitable for maintaining the cells after introducing or inducing expression of CD1d into the cells. Incubation can be performed, for example, in the presence or preferably in the absence of serum (preferably under xeno-free conditions).
  • CD1d may refer to naturally occurring CD1d or a functional variant thereof.
  • CD1d may be endogenously expressed in the human-derived cells used, or may be exogenously expressed in the human-derived cells used.
  • “expressed” means expressed somewhere on the cell, and in one embodiment, means expressed on the cell surface.
  • aAVC expresses exogenous CD1d.
  • the CD1d used in the present invention is CD1d derived from a mammal (e.g., human, monkey, mouse, rat, dog, chimpanzee, etc.).
  • the CD1d used in the present invention is human CD1d.
  • CD1d negative means not expressing CD1d. CD1d negativity can be determined by flow cytometry, taking into account the background signal.
  • human CD1d is a protein consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1.
  • human CD1d is a protein consisting of an amino acid sequence in which one or several, in some embodiments 1 to 10, 1 to 7, 1 to 5, 1 to 3, or 1 to 2 amino acids have been deleted, substituted, inserted, and/or added to the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1, and which has the function of CD1d.
  • human CD1d is a protein consisting of an amino acid sequence that has at least 90% or more, 95% or more, 96% or more, 97% or more, 98% or more, or 99% or more identity to the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1, and which has the function of CD1d.
  • CD1d includes its ability to bind to CD1d ligands (e.g., ⁇ -galactosylceramide ( ⁇ -GalCer), ⁇ -C-galactosylceramide ( ⁇ -C-GalCer), 7DW8-5, and isoglobotrihexosylceramide (iGb3)).
  • CD1d ligands e.g., ⁇ -galactosylceramide ( ⁇ -GalCer), ⁇ -C-galactosylceramide ( ⁇ -C-GalCer), 7DW8-5, and isoglobotrihexosylceramide (iGb3).
  • the binding ability of CD1d to CD1d ligands can be easily evaluated by those skilled in the art using known methods.
  • the function of CD1d can also be evaluated using as an index the ability to activate human NKT cells by aAVC. This ability to activate human NKT cells can be evaluated by the method described in Patent Document 1 or Example
  • ⁇ -GalCer is a substance represented by CAS RN: 158021-47-7, molecular formula: C50H99NO9 , and molecular weight: 858.34, and is one of the CD1d ligands.
  • ⁇ -GalCer may be synthesized according to techniques known in the art, or commercially available products (e.g., ⁇ -galactosylceramide (Funakoshi, Cat. KRN7000)) may be used.
  • Cells may be loaded with ⁇ -GalCer by culturing CD1d-expressing cells in a medium containing ⁇ -GalCer.
  • exogenous and “exogenous” are used interchangeably to refer to the artificial introduction of a gene or nucleic acid into a target cell by genetic engineering, gene transfer, or other manipulation, as well as to the gene or nucleic acid artificially introduced into the target cell, and the protein expressed therefrom.
  • An exogenous gene may be operably linked to a promoter sequence that drives expression of the gene.
  • endogenous or intrasic means something that is originally present in a cell.
  • human-derived cells mean that the cells are obtained from a human, or that the cells are a cell line obtained by subculturing the cells, e.g., human cells.
  • the human-derived cells used in the present invention are immortalized cells or cell lines derived from human tissue. Immortalized cells and cell lines can be prepared by those skilled in the art using methods known to those skilled in the art.
  • the cells of the present disclosure are mammalian cells (preferably human cells).
  • the cells of the present disclosure have at least the ability to activate NKT cells.
  • Cells that present CD1d complexed with a CD1d ligand have the ability to activate NKT cells.
  • the cells of the present disclosure have CD1d complexed with a CD1d ligand.
  • the cells of the present disclosure can express an antigen, thereby inducing antigen-specific adaptive immunity.
  • the present disclosure also provides cells (aAVCs) that further express such antigens.
  • CD1d cells that have formed a complex with a CD1d ligand have been prepared by contacting cells with a CD1d ligand after CD1d introduction or expression induction (or by incubating (post-incubating) in the presence of a CD1d ligand). This was because it was thought that contacting cells with a CD1d ligand before CD1d expression on the cells would be meaningless if CD1d, which receives the ligand, was not expressed.
  • CD1d-negative cells were pre-incubated in the presence of a CD1d ligand and, after CD1d introduction or expression induction, were not post-incubated in the presence of a CD1d ligand, they still had the ability to activate NKT cells. Furthermore, longer pre-incubation times resulted in superior NKT cell activation. This is thought to be due to the CD1d-negative cells taking up the CD1d ligand during the long pre-incubation period. Furthermore, it has been shown that pre-incubation in the presence of a CD1d ligand can enhance NKT cell activation more than post-incubation.
  • CD1d when cells express CD1d de novo (newly) after incorporating CD1d ligand, CD1d can efficiently form a complex with the CD1d ligand.
  • CD1d does not activate NKT cells without its ligand, and CD1d ligands do not activate NKT cells without CD1d.
  • CD1d-negative cells can incorporate CD1d ligands into cells upon contact with CD1d ligand, and when CD1d is expressed on the cell surface, CD1d can efficiently form a complex with CD1d ligand, thereby promoting NKT cell activation.
  • WO2021/112056A reveals that the amount of CD1d ligand bound to CD1d rather than the number of cells in aAVC is associated with high immune induction potential, and efficient binding of CD1d ligands to CD1d-expressing cells is thought to be important for achieving high immune induction potential.
  • the present disclosure may involve incubating starting cells in the presence of a CD1d ligand, followed by expressing CD1d on the cell surface.
  • the starting cells may be CD1d-positive or CD1d-negative, but the presence of CD1d presented de novo on the cell surface after incubation in the presence of a CD1d ligand is believed to be important.
  • CD1d de novo on the cell surface at that time such as introducing CD1d into cells, introducing a nucleic acid (e.g., DNA or RNA) encoding CD1d into cells, or inducing expression of a nucleic acid (e.g., DNA) encoding CD1d that has already been introduced into cells and is operably linked to an inducible promoter, by providing an inducer.
  • a nucleic acid e.g., DNA or RNA
  • the present invention is based on the fact that by preincubating cells in the presence of a CD1d ligand before introducing or inducing expression of CD1d, and allowing the cells to take up the CD1d ligand, it is possible to efficiently bind the CD1d ligand to CD1d after introducing or inducing expression of CD1d.
  • postincubation in the presence of a CD1d ligand after introducing or inducing expression of CD1d is not necessary, and preferably, postincubation in the presence of a CD1d ligand after introducing or inducing expression of CD1d can be performed.
  • postincubation in the presence of a CD1d ligand in addition to preincubation in the presence of a CD1d ligand the ability of cells to activate NKT cells can be improved.
  • the resulting cells express a complex of CD1d and a CD1d ligand at least extracellularly, with the expression of the complex being above the detection limit of flow cytometry.
  • the resulting cells further express a complex of CD1d and a CD1d ligand intracellularly, with the expression of the complex being above the detection limit of flow cytometry.
  • a composition that exhibits significantly increased expression of the complex by flow cytometry compared to cells obtained by culturing cells in the presence of a CD1d ligand only after gene transfer for 24 hours (provided that all conditions other than the timing of CD1d ligand treatment are the same).
  • CD1d is introduced by introducing a nucleic acid encoding CD1d into the cells.
  • the CD1d ligand can be ⁇ -GalCer (e.g., 500 ng/mL).
  • cells and compositions comprising the cells are provided.
  • the cells are preferably of the same species as the animal species to which the cells are to be administered. When administered to humans, the cells are preferably derived from humans.
  • the cells take up a CD1d ligand and then present CD1d on the cell surface. Before CD1d is presented on the cell surface, it is believed that CD1d forms a complex with the CD1d ligand.
  • the cells obtained in this manner present CD1d complexed with the CD1d ligand and free CD1d on the cell surface, and it is believed that incubation with additional CD1d ligand can cause the free CD1d to form a complex with the CD1d ligand.
  • uptake of CD1d ligand into cells can be achieved, for example, by incubating cells in the presence of CD1d ligand. There are also various other methods for uptake of CD1d ligand into cells.
  • incubation can be performed in the presence of serum or under serum-free conditions.
  • the cells are incubated (preincubated) in the presence of a CD1d ligand before introduction or induction of CD1d expression, and then present CD1d on the cell surface by introduction or induction of CD1d expression.
  • the cells may have a stronger NKT cell activation ability than conventional cells, i.e., control cells that have been incubated (postincubated) in the presence of a CD1d ligand after introduction or induction of CD1d expression. All conditions for the two cells being compared are the same except for the timing of incubation. Also, extending the preincubation time can improve NKT cell activation.
  • preincubation can be performed for a time sufficient for cellular uptake of the CD1d ligand (e.g., 12 to 80 hours, 24 to 72 hours, or 36 to 60 hours).
  • CD1d introduction can be by introduction of a CD1d protein or a nucleic acid encoding CD1d.
  • the nucleic acid is mRNA.
  • the mRNA has a structure suitable for translation of the CD1d protein (e.g., a cap structure, uracil-to-pseudouridine conversion, polyA, etc.).
  • Induction of CD1d expression can be achieved by expression of CD1d from an inducible promoter.
  • the CD1d protein preferably has a signal sequence for cell membrane localization, which enables efficient expression on the cell membrane.
  • the cells contain CD1d/CD1d ligand complexes on the cell surface and intracellularly.
  • the amount of intracellular CD1d/CD1d ligand complexes is significantly greater than the cell surface CD1d/CD1d ligand complexes, and preferably, the ratio (amount of intracellular complexes/amount of cell surface complexes) can be 1.1 or more, 1.2 or more, 1.3 or more, 1.4 or more, 1.5 or more, 2 or more, 3 or more, 4 or more, 5 or more, 6 or more, 7 or more, 8 or more, 9 or more, or 10 or more.
  • the ratio can be 10 or less, 9 or less, 8 or less, 7 or less, 6 or less, 5 or less, or 4 or less.
  • This ratio can be, for example, 2 to 10, 2 to 9, 2 to 8, 2 to 7, 2 to 6, 2 to 5, 3 to 10, 3 to 9, 3 to 8, 3 to 7, 3 to 6, 3 to 5, 4 to 10, 4 to 9, 4 to 8, 4 to 7, 4 to 6, or 4 to 5.
  • Such cells can preferably be obtained when cells are prepared by introducing mRNA encoding CD1d.
  • the cells have intracellular CD1d/CD1d ligand complexes 48 hours, 72 hours, or preferably 96 hours after the initiation of culture in the absence of CD1d ligand following gene transfection (preferably mRNA transfection) and medium replacement.
  • the intracellular CD1d/CD1d ligand complexes may comprise an effective amount of the complex.
  • the amount of intracellular CD1d/CD1d ligand complexes is significantly greater than the amount of CD1d/CD1d ligand complexes on the cell surface, and may preferably be 5 to 100 times, 10 to 80 times, 15 to 60 times, or 20 to 50 times the amount of CD1d/CD1d ligand complexes on the cell surface.
  • the gene transfection can be performed in a serum-free medium or a chemically defined medium, as described above.
  • the replacement medium can also be a serum-free medium or a chemically defined medium.
  • the cells can be obtained, for example, by culturing the cells in the presence of a CD1d ligand before gene transfection.
  • the culture time of the cells in the presence of a CD1d ligand before gene transfer can be, for example, 24 hours or more, 30 hours or more, 36 hours or more, 42 hours or more, 48 hours or more, 72 hours or more, or 96 hours or more.
  • the culture time of the cells in the presence of a CD1d ligand before gene transfer can be, for example, 120 hours or less, 96 hours or less, 84 hours or less, 72 hours or less, 60 hours or less, or 48 hours or less.
  • the culture time of the cells in the presence of a CD1d ligand before gene transfer can be, for example, 24 to 120 hours, 36 to 72 hours, or 36 to 60 hours. The upper and lower limits of this time can be as described above.
  • the cells contain CD1d/CD1d ligand complexes intracellularly even after administration, which can contribute to prolonged NKT cell activation.
  • Intracellular CD1d/CD1d ligand complexes can be detected by flow cytometry using BD's Cytofix/Cytoperm Fixation/Permeabilization Kit (#554714) and an anti-CD1d/ ⁇ -GalCer complex antibody.
  • the anti-CD1d/ ⁇ -GalCer complex antibody has affinity for the CD1d and ⁇ -GalCer complex, but has substantially no affinity for CD1d or ⁇ -GalCer.
  • An example of such an antibody is the anti-CD1d/ ⁇ -GalCer complex antibody (clone L363, #12-2019-82; e-Bioscience).
  • An inducible promoter is a promoter that inducibly promotes expression and is capable of inducing expression of a polynucleotide operably linked to the promoter in the presence of an inducer that drives the promoter (also referred to herein as an "inducer of an inducible promoter” or simply as an “inducer”).
  • a nucleic acid encoding CD1d operably linked to an inducible promoter may be introduced into cells either before or after preincubation, but de novo expression of CD1d on the cell surface can be induced by driving expression with an inducer after preincubation.
  • Inducible promoters include, for example, thermo-inducible promoters (e.g., heat shock promoters) and drug-inducible promoters.
  • the inducible promoter is a drug-inducible promoter.
  • drug-inducible promoter refers to a promoter in which the expression of a polynucleotide operably linked to the promoter is regulated by a drug that is an inducer.
  • Drug-inducible promoters include, for example, a cumate operator sequence, a lambda operator sequence (e.g., 12x ⁇ Op), and an inducible promoter of the tetracycline gene expression induction system (hereinafter referred to as a "tetracycline-inducible promoter").
  • the cumate operator sequence is inactive in the presence of the CymR repressor, but in the presence of the inducer Cumate, it dissociates from the CymR repressor and induces the expression of a polynucleotide operably linked to the promoter.
  • the ⁇ operator sequence induces expression of a polynucleotide operably linked to the promoter in the presence of an inducer (e.g., coumermycin) that dimerizes an activator ( ⁇ Rep-GyrB-AD) that has transcriptional activation ability through dimerization.
  • an inducer e.g., coumermycin
  • ⁇ Rep-GyrB-AD an activator
  • the tetracycline-inducible promoter induces expression of a polynucleotide operably linked to the promoter in the presence of inducers such as tetracycline or a derivative thereof (e.g., doxycycline) and a reverse tetracycline-controlled transactivator (rtTA) (e.g., Tet-On 3G).
  • inducers such as tetracycline or a derivative thereof (e.g., doxycycline) and a reverse tetracycline-controlled transactivator (rt
  • tetracycline-inducible promoter is the TRE3G promoter.
  • the drug-inducible promoter is a tetracycline-inducible promoter, and in another embodiment, the tetracycline-inducible promoter is the TRE3G promoter.
  • Constitutive promoters are not particularly limited, but examples include virus-derived promoters such as CMV (cytomegalovirus), RSV (respiratory syncytial virus), and SV40 (simian virus 40), as well as actin promoters and EF (elongation factor) 1 ⁇ promoters.
  • a constitutive promoter is a promoter that always drives transcription from a nucleic acid to which it is operably linked.
  • a nucleic acid encoding CD1d operably linked to a constitutive promoter is preferably introduced into cells after preincubation.
  • the timing of introduction is not necessarily limited to after preincubation, as long as it is possible to induce de novo expression of CD1d on the surface of cells into which CD1d ligand has been taken up.
  • the DNA is usually operably linked to a promoter.
  • the promoter may be an inducible promoter or a constitutive promoter. If it is desired to induce expression at a desired timing, an inducible promoter can be used as the promoter, and an inducer can be allowed to act at the desired timing to drive the inducible promoter to induce expression.
  • the introduction or induction of expression of CD1d into cells is preferably carried out under conditions of a serum concentration of 5% or less, or under serum-free conditions.
  • the introduction of nucleic acids can be carried out by conventional methods, but in one embodiment, the introduction of nucleic acids can be carried out by transfection, and in one preferred embodiment, the introduction of nucleic acids can be carried out by electroporation. In the production of cells capable of activating NKT cells, ⁇ -GalCer and cells have traditionally been incubated in the presence of serum, and nucleic acid introduction into cells has also been carried out in the presence of serum.
  • a method for producing cells capable of activating NKT cells comprises introducing a nucleic acid encoding CD1d and/or a nucleic acid encoding an antigen or antigenic peptide into cells under serum-free conditions, and incubating the cells in the presence of a CD1d ligand, thereby obtaining cells that present CD1d complexed with a CD1d ligand.
  • all steps from obtaining cells capable of NKT cell activation from the starting cells to obtaining aAVC are performed under serum-free conditions.
  • the serum-free conditions may preferably be xeno-free conditions.
  • the aAVC must express the antigen. If the cells are already expressing the antigen, it is not necessary to introduce a nucleic acid encoding the antigen peptide, but the production process may include introducing a nucleic acid encoding the antigen peptide. For example, if the starting cells are cancer cells or pathogen-infected cells, the cells are already expressing the antigen, so there is no need to express the antigen additionally.
  • the aAVC used in the present invention expresses a cancer antigen.
  • Any protein expressed in cancer cells can be used as the cancer antigen used in the present invention, including, for example, Wilmus Tumor 1 (WT-1), Human Carbohydrate Antigen 125 (CA-125), Carcinoembryonic Antigen (CEA), Human Telomerase Reverse Transcriptase (hTERT), and Mucin-1 (Mu Examples of cancer antigens include CTAG1B/NY-ESO-1, CTAG1B/NY-ESO-1, prostatic acid phosphatase (PAP), prostate specific antigen (PSA), prostate specific membrane antigen (PSMA), survivin b, mutant ras, and mutant p53.
  • WT-1 Wilmus Tumor 1
  • CA-125 Human Carbohydrate Antigen 125
  • CEA Carcinoembryonic Antigen
  • hTERT Human Telomerase Reverse Transcriptase
  • Mucin-1 Mucin-1
  • cancer antigens include CTAG
  • the cancer antigen used in the present invention is Wilmus tumor 1 (WT-1).
  • the WT-1 is human WT-1.
  • the aAVC expresses one type of cancer antigen.
  • the aAVC expresses multiple types of cancer antigens.
  • the cancer antigen may be a naturally occurring cancer antigen or a modified form thereof, as long as the aAVC expressing it exhibits an anti-tumor effect through immune action against the cancer antigen.
  • the cancer antigen may be an antigen endogenously expressed in the human-derived cells used, or an antigen exogenously expressed in the human-derived cells used.
  • the aAVC expresses an exogenous cancer antigen.
  • the aAVC expresses multiple types of exogenous cancer antigens.
  • the cells are cultured or incubated under conditions suitable for cell maintenance.
  • the conditions suitable for cell maintenance may be conditions suitable for cell maintenance, culture, or growth.
  • the culturing of cells for cell maintenance or growth is carried out by known methods. Examples of basal media include MEM medium (Science; 1952; 122: 501), DMEM medium (Virology; 1959; 8: 396-397), RPMI1640 medium (J. Am. Med. Assoc.; 1967; 199: 519-524), 199 medium (Proc. Soc. Exp. Biol. Med.; 1950; 73: 1-8), FreeStyle TM 293 Expression Medium (Thermo Fisher Scientific, Cat. 12338022), and CD 293 Medium (Thermo Fisher Scientific, Cat.
  • culture media examples include: Expi293TM Expression Medium (Thermo Fisher Scientific, Cat. 11913019), Expi293 TM Expression Medium (Thermo Fisher Scientific, Cat. A1435101), Eagle's medium, Eagle's minimum essential medium, and modified media thereof.
  • Culture media can contain, for example, serum (e.g., fetal bovine serum), serum replacement (e.g., KnockOut Serum Replacement: KSR), fatty acids or lipids, amino acids, vitamins, growth factors, cytokines, antioxidants, 2-mercaptoethanol, pyruvic acid, buffers, inorganic salts, antibiotics, and the like.
  • the medium used for culturing is a serum-free medium or, preferably, a chemically defined medium.
  • the medium has a composition suitable for culturing or incubating cells.
  • Culture conditions e.g., culture time, temperature, medium pH, CO2 concentration, etc.
  • the pH of the medium is preferably about 6 to 8
  • the culture temperature is not particularly limited, but is, for example, about 30 to 40°C, preferably about 37°C.
  • the CO2 concentration is about 1 to 10%, preferably about 5%.
  • the culture time is not particularly limited, but is generally about 15 to 336 hours. Aeration and stirring can also be performed as necessary.
  • composition of the Present Disclosure provides a composition comprising the cells of the present disclosure.
  • the pharmaceutical composition is for use in treating cancer.
  • the CD1d ligand is ⁇ -GalCer.
  • the pharmaceutical composition can be prepared by a commonly used method using excipients commonly used in the art, i.e., pharmaceutical excipients and pharmaceutical carriers, etc. When formulating a pharmaceutical composition, excipients, carriers, additives, etc. appropriate for the dosage form can be used within a pharmaceutically acceptable range. Examples of dosage forms of these pharmaceutical compositions include parenteral preparations such as injections and infusions.
  • the pharmaceutical composition of the present disclosure may comprise a frozen product of the cells of the present disclosure.
  • the pharmaceutical composition of the present disclosure may comprise a frozen product of the cells of the present disclosure and a cryoprotectant. In one embodiment, the pharmaceutical composition of the present disclosure may comprise a suspension of the cells of the present disclosure. In one embodiment, the pharmaceutical composition of the present disclosure may comprise a suspension of the cells of the present disclosure and a cryoprotectant.
  • the present invention also provides use of the cells of the present disclosure for the manufacture of a pharmaceutical composition for use in treating cancer, wherein the cells express CD1d and an antigen (e.g., an antigenic peptide) and are loaded with a CD1d ligand on their surface. In one embodiment, the CD1d ligand is ⁇ -GalCer.
  • the present invention also provides use of the cells of the present disclosure for the manufacture of a pharmaceutical composition for use in treating cancer, wherein the cells express CD1d and an antigen (e.g., an antigenic peptide) and are loaded with a CD1d ligand on their surface.
  • the CD1d ligand is ⁇ -GalCer.
  • the present disclosure also provides a method for treating cancer, comprising administering the cells of the present disclosure to a subject.
  • the cells of the present disclosure express CD1d and an antigen (e.g., an antigenic peptide) or a fragment thereof, and carry a CD1d ligand on their surface.
  • the CD1d ligand is ⁇ -GalCer.
  • the term "subject” refers to a mammal (e.g., a human, a monkey, a mouse, a rat, a dog, a chimpanzee, etc.), and in one embodiment, the subject is a human.
  • the term “treatment” includes therapeutic treatment and prophylactic treatment.
  • the cells of the present disclosure When the cells of the present disclosure are administered to a subject, they can be administered to the subject in the form of a pharmaceutical composition containing the cells of the present disclosure and a pharmaceutically acceptable excipient.
  • the dosage and frequency of administration of the cells of the present disclosure to a subject can be adjusted appropriately depending on the type, location, and severity of the cancer, as well as the age, weight, and condition of the subject to be treated.
  • the cells of the present disclosure can be administered at a dose of, for example, 1 x 10 3 cells/kg to 1 x 10 9 cells/kg per administration to a subject.
  • the cells of the present disclosure can be administered to a subject by, for example, intravenous, intratumoral, intradermal, subcutaneous, intramuscular, intraperitoneal, or intraarterial injection or infusion.
  • the treatment method of the present invention can be used in combination with other cancer treatment methods. Examples of other cancer treatment methods include surgery, radiation therapy, hematopoietic stem cell transplantation, or treatment with other antican
  • Cancers that can be treated in accordance with the present disclosure include, but are not limited to, blood cancers such as acute lymphoblastic leukemia (ALL), acute myeloid leukemia (AML), Hodgkin's lymphoma, non-Hodgkin's lymphoma, B-cell lymphoma, multiple myeloma, and T-cell lymphoma, myelodysplastic syndrome, adenocarcinoma, squamous cell carcinoma, adenosquamous carcinoma, undifferentiated carcinoma, large cell carcinoma, non-small cell lung cancer, small cell lung cancer, mesothelioma, skin cancer, breast cancer, prostate cancer, bladder cancer, vaginal cancer, cervical cancer, head and neck cancer, uterine cancer, and ovarian cancer.
  • ALL acute lymphoblastic leukemia
  • AML acute myeloid leukemia
  • Hodgkin's lymphoma non-Hodgkin's lymphoma
  • B-cell lymphoma
  • cancers that can be treated include solid cancers such as cervical cancer, liver cancer, gallbladder cancer, bile duct cancer, kidney cancer, pancreatic cancer, lung cancer, colon cancer, colorectal cancer, rectal cancer, small intestine cancer, stomach cancer, esophageal cancer, testicular cancer, ovarian cancer, and brain tumors, as well as cancers of bone tissue, cartilage tissue, adipose tissue, muscle tissue, vascular tissue, and hematopoietic tissue, as well as sarcomas such as chondrosarcoma, Ewing's sarcoma, malignant hemangioendothelioma, malignant schwannoma, osteosarcoma, and soft tissue sarcoma, and blastomas such as hepatoblastoma, medulloblastoma, nephroblastoma, neuroblastoma, pancreatoblastoma, pleuropulmonary blastoma, and retino
  • compositions of the present disclosure can be used in combination with other pharmaceutical compositions for treatment, for example, other pharmaceutical compositions.
  • other pharmaceutical compositions for example, to treat cancer
  • the pharmaceutical compositions of the present disclosure can be used in combination with other pharmaceutical compositions for use in treating cancer.
  • Such other pharmaceutical compositions include anticancer agents, immune checkpoint inhibitors, and cancer immunotherapeutic agents (e.g., T cells, chimeric antigen receptor-expressing immune cells (T cells, NK cells, etc.)).
  • the immune checkpoint inhibitor administered to the subject is a PD-1-based immune checkpoint inhibitor or a CTLA-4-based immune checkpoint inhibitor.
  • the immune checkpoint inhibitor administered to the subject is a PD-1-based immune checkpoint inhibitor.
  • the immune checkpoint inhibitor administered to the subject is an anti-PD-1 antibody, an anti-PD-L1 antibody, or an anti-PD-L2 antibody. In one embodiment, the immune checkpoint inhibitor administered to the subject is nivolumab, pemprolizumab, avelumab, atezolizumab, or durvalumab. In one embodiment, the immune checkpoint inhibitor administered to the subject is nivolumab or pemprolizumab. In one embodiment, the immune checkpoint inhibitor used in combination with the aAVC-NY-ESO-1 cells of the present invention is pemprolizumab.
  • the immune checkpoint inhibitor that can be used in combination with the aAVC-NY-ESO-1 cells of the present invention is a CTLA-4-based immune checkpoint inhibitor.
  • the immune checkpoint inhibitor administered to the subject is an anti-CTLA-4 antibody, an anti-CD80 antibody, or an anti-CD86 antibody.
  • the immune checkpoint inhibitor administered to the subject is ipilimumab or tremelimumab.
  • the immune checkpoint inhibitor administered to the subject is nivolumab or pemprolizumab.
  • the immune checkpoint inhibitor administered to the subject is ipilimumab.
  • the immune checkpoint inhibitor may be administered simultaneously, sequentially, consecutively, or overlappingly with the pharmaceutical composition of the present disclosure.
  • Example 1 Antigen Delivery into Mammalian Cells.
  • a peptide as the antigen and examined the effect of the conditions for transfecting cells with nucleic acid encoding the antigen peptide on the expression level of the antigen peptide.
  • the antigen peptide was ovalbumin (OVA), a model antigen molecule.
  • OVA-encoding nucleic acid (10 ⁇ g; OVA mRNA (OZ Biosciences)
  • HEK293sf human embryonic kidney cells
  • electroporation 500 V, 30 ms
  • AIM-V is a mixture of Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM) and F12 medium, and contains purified human albumin, human transferrin, human insulin, cholesterol, L-glutamine, and an antibiotic (gentamicin sulfate).
  • DMEM Dulbecco's modified Eagle's medium
  • F12 F12 medium
  • CD1d expression on the surface and intracellularly of the above cells was measured using standard methods, using an anti-CD1d antibody (anti-human CD1d (clone 51.1 #350308; Biolegend)) and flow cytometry (LSRFortessa X-20, BD). The results are shown in Figure 2.
  • "Iso” indicates the negative control using an isotype antibody, with the expression level indicated by the gray peak, and the expression level of CD1d indicated by the red peak.
  • no CD1d expression was observed on the cell surface or intracellularly in the above cells. This result is consistent with previous results, and in particular, no CD1d expression was observed in 293 cells.
  • Example 2 NKT Cell Activation. Gene transfection and ⁇ -GalCer loading were performed under condition 1). HEK293sf cells (5 ⁇ 10 cells) were used. Human CD1d-encoding mRNA (5 ⁇ g) and OVA-encoding mRNA (10 ⁇ g) were transfected into HEK293sf cells (5 ⁇ 10 cells) by electroporation (500 V, 30 ms). Subsequently, the cells were cultured for 6 hours with or without the addition of ⁇ -GalCer (AIM-V, hereinafter) as a CD1d ligand at a final concentration of 500 ng/mL. The cells were harvested and seeded at 1 ⁇ 10 cells per well in a 96-well plate. A human NKT cell line (1 ⁇ 10 cells) was added and cocultured for 24 hours. The supernatant was collected, and IFN- ⁇ concentrations were measured by ELISA. The experimental scheme is shown in Figure 3A.
  • Example 3 Effect of Preincubation with CD1d Ligand.
  • CD1d-negative HEK293sf cells were preincubated in the presence of a CD1d ligand (500 ng/mL ⁇ -GalCer) for 48, 6, or 2 hours before electroporation. Then, in the absence of a CD1d ligand, HEK293sf cells (5 ⁇ 10 cells) were transfected with mRNA (5 ⁇ g) encoding human CD1d and mRNA (10 ⁇ g) encoding OVA by electroporation (500 V, 30 ms).
  • Example 4 Effect of pre-culture and post-transfection culture in the presence of CD1d ligand
  • HEK293sf cells were pre-cultured in the presence of CD1d ligand (500 ng/mL), followed by electroporation (EP) of mRNA (5 ⁇ g) encoding human CD1d and mRNA (10 ⁇ g) encoding OVA, followed by further culture of HEK293sf cells in the presence of CD1d ligand (500 ng/mL), and then co-culture with NKT cells after seeding.
  • CD1d ligand 500 ng/mL
  • EP electroporation
  • Example 5 Gene Expression Under each of the conditions (up to co-culture with NKT cells) in Examples 2 to 4 above, hCD1d protein expression was measured by flow cytometry, and OVA protein expression was measured by ELISA, and the results were compared (see Figure 6A). As shown in Figure 6B, no significant differences in hCD1d and OVA expression were observed under any of the conditions. This suggests that the activation of NKT cells in Examples 3 to 4 is not due to differences in the amount of hCD1d expression, but rather to the amount of CD1d ligand binding to hCD1d (in other words, the amount of hCD1d complexed with the CD1d ligand).
  • Example 6 Detection of CD1d/CD1d ligand complex The effect of pretreatment of non-CD1d-expressing cells with a CD1d ligand on the amount of CD1d/CD1d ligand complex was examined.
  • FIG. 7A we examined the effects of pretreatment with CD1d ligand (Gal) and electroporation (EP) on the amount of CD1d/CD1d ligand complexes.
  • solid arrows indicate treatment with CD1d ligand
  • dotted arrows indicate treatment without CD1d ligand.
  • Pretreatment of CD1d-nonexpressing cells with CD1d ligand was performed by preincubating CD1d-negative HEK293sf cells with CD1d ligand (500 ng/mL ⁇ -GalCer) for 48, 6, or 2 hours before electroporation.
  • Electroporation was performed by electroporating HEK293sf cells (5 ⁇ 10 cells ) with 5 ⁇ g of mRNA encoding human CD1d and 10 ⁇ g of mRNA encoding OVA in the absence of CD1d ligand (500 V, 30 ms). After culturing for 4 or 24 hours, the cells were harvested.
  • CD1d/CD1d ligand complexes on the cell surface and intracellularly were confirmed by flow cytometry using anti-mCD1d/ ⁇ GalCer complex antibody (clone L363, #12-2019-82; e-Bioscience) according to standard methods. Intracellular complex staining was performed using BD's Cytofix/Cytoperm Fixation/Permeabilization Kit (#554714). Specifically, cells were punctured with Fixation/Permeabilization solution, and anti-mCD1d/GalCer complex Ab or anti-mouse CD1d Ab was added in the presence of Perm/Wash buffer. After incubation on ice, the cells were washed and the antibody binding level was measured. CD1d expression was confirmed by flow cytometry using anti-mCD1d antibody (anti-mouse CD1d (clone 1B1, #553846, BD)).
  • Condition 1 in Figure 8A is a condition in which CD1d ligand was pulsed only after EP.
  • the amount of CD1d/CD1d ligand complex in the cells is significantly different. This suggests that the amount of the above complexes, not only extracellularly but also intracellularly, may contribute to NKT cell activation. Pulsing with a CD1d ligand for a long period (e.g., 48 hours) before gene transfer is thought to be effective, especially when the culture period after gene transfer is short.
  • Figure 7B suggests that the increase in the amount of intracellular complexes depends on the expression level of CD1d molecules.
  • Figure 9B suggests that extending the pulsing time with a CD1d ligand before gene transfer is effective, especially when the culture period after gene transfer is short.
  • Figure 8B shows that when CD1d ligand pulsing was performed only after gene transfer, the amount of CD1d/CD1d ligand complexes on the cell surface was equal to or greater than the amount of CD1d/CD1d ligand complexes intracellularly.
  • pretreatment time was further evaluated under the same conditions as above.
  • pretreatment in the presence of CD1d ligand was performed for 2, 6, or 48 hours before gene transfer (EP) by electroporation. EP was then performed, and the cells were then cultured for an additional 6 hours in the presence or absence of CD1d ligand before recovery.
  • EP gene transfer
  • CD1d ligand increases both on the cell surface and within the cells by expressing CD1d in cells that have taken up CD1d ligand.
  • CD1d ligand is internalized within cells, where CD1d and CD1d ligand can form a complex within the cells, and that this intracellular complex contributes significantly to the immunostimulatory activity of aAVC.
  • the intracellular CD1d/CD1d ligand complex is known to recycle to the cell surface, and the cytoplasm may function as a reservoir for the complex.
  • the long-term presence of the complex within the cells may be associated with its prolonged presentation on the cell surface.
  • the intracellular CD1d/CD1d ligand complex itself is thought to activate NKT cells. Therefore, the increase in intracellular CD1d/CD1d ligand complex and its long-term maintenance are suggested to favorably contribute to NKT cell activation.
  • specific NKT cell responses could also be induced under conditions 3 and 4 in Figure 9A (see Figure 4B), flow cytometry failed to detect clear complex formation signals, likely due to the trace amounts of complex formation (NKT cells were activated, and complex formation was considered sufficient for activation). Therefore, the fact that the complex is below the detection limit in flow cytometry does not mean that the complex is not formed, nor does it mean that an antigen-specific NKT cell response cannot be induced.
  • the cells were cultured in the absence of CD1d ligand for 16, 24, 48, 72, or 96 hours and then harvested (see Figure 10A).
  • Pretreatment, gene transfer by electroporation (EP), and subsequent culture were performed under the same conditions as above.
  • target antigen protein expression After gene transfer of a target antigen mRNA of interest, e.g., a cancer antigen mRNA, the expression level of antigen protein from mRNA often reaches its highest level between 6 and 16 hours.
  • target antigen protein expression is prioritized, the time for pulsing with CD1d ligand after EP is limited to a maximum of 16 hours.
  • complex expression 16 hours after gene transfer was limited.
  • pulsing cells with a CD1d ligand prior to EP allows the cells to incorporate the CD1d ligand in advance, significantly increasing the amount of complex on the cell surface and intracellularly after 16 hours of culture following EP.
  • the amount of intracellular complex which is thought to contribute to NKT cell activation, was maintained even after 96 hours (see Figure 10B). This is the first time that intracellular complexes have been observed 96 hours after mRNA transfection in cells obtained with a CD1d pulse prior to transfection; previously, intracellular complexes were below the detection limit 96 hours after mRNA transfection.
  • the present cells obtained with a CD1d pulse prior to transfection may continue to express the complex intracellularly for a long period of time even after administration, suggesting further utility as an aAVC.

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Abstract

本開示は、ＣＤ１ｄ導入前にＣＤ１ｄリガンドでインキュベートされた細胞を含む、ＮＫＴ細胞活性化能を有する組成物を提供する。本開示はまた、細胞を含む組成物であって、　前記細胞は、ヒトに由来する細胞であり、細胞表面上及び細胞内にそれぞれＣＤ１ｄとＣＤ１ｄリガンドとの複合体を発現し、細胞内の前記複合体の量が、細胞表面上の前記複合体の量よりも有意に多い、組成物を提供する。本開示はさらに、細胞が抗原をさらに発現し、抗原特異的免疫をさらに誘導することができる組成物を提供する。

Description

ＣＤ１ｄ導入前にＣＤ１ｄリガンドでインキュベートされた細胞
　本開示は、ＣＤ１ｄ導入前にＣＤ１ｄリガンドでインキュベートされた細胞、及び当該細胞の製造方法が提供される。
　ナチュラルキラーＴ（ＮＫＴ）細胞は、Ｔ細胞及びナチュラルキラー（ＮＫ）細胞の特徴を有する免疫細胞であり、抗原提示細胞（ａｎｔｉｇｅｎ　ｐｒｅｓｅｎｔｉｎｇ　ｃｅｌｌ：ＡＰＣ）上の主要組織適合遺伝子複合体（ｍａｊｏｒ　ｈｉｓｔｏｃｏｍｐａｔｉｂｉｌｉｔｙ　ｃｏｍｐｌｅｘ：ＭＨＣ）様分子であるＣＤ１ｄに積載された糖脂質からなるＣＤ１ｄリガンドにより活性化される。活性化されたＮＫＴ細胞は、パーフォリン／グランザイムＢ等を介した直接的な細胞傷害性の増強に加え、インターフェロンガンマ（ＩＦＮ－γ）やインターロイキン－４（ＩＬ－４）等のサイトカイン産生を介して、ＮＫＴ細胞自身の分化及び増殖を誘導し、Ｔ細胞、ＮＫ細胞及びＢ細胞を活性化することが知られている。
　ＣＤ１ｄリガンドであるα－ＧａｌＣｅｒをパルスした樹状細胞（ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ　ｃｅｌｌ：ＤＣ）によって活性化されたＮＫＴ細胞は、各種がん細胞に対して細胞傷害性を示す。また、α－ＧａｌＣｅｒをパルスしたＤＣは、遊離α－ＧａｌＣｅｒを投与した場合と比べてＩＦＮ－γ産生ＮＫＴ細胞をより強く誘導し、高い抗腫瘍効果を示すことが報告されており（非特許文献１及び２）、肺がん患者を対象とした臨床試験も行われた（非特許文献３及び４）。
　藤井らは、ヒト由来細胞に外来的にＣＤ１ｄ及びがん抗原を発現させ、さらに該細胞にα－ＧａｌＣｅｒをパルスしたａＡＶＣを作製した（特許文献１～５）。当該ａＡＶＣは、ＣＤ１ｄ／α－ＧａｌＣｅｒ複合体を介してＮＫＴ細胞を活性化し、活性化されたＮＫＴ細胞はＩＦＮ－γ等のサイトカインを産生してＮＫ細胞等を活性化する。マウスモデルにおいて、ａＡＶＣ投与によるＮＫ細胞依存的な抗腫瘍効果が示されている（特許文献１～４、非特許文献５及び６）。また、マウスに投与されたａＡＶＣは生体内において活性化されたＮＫＴ細胞により速やかに殺傷され、該細胞断片は樹状細胞に取り込まれる。当該ａＡＶＣ断片を取り込んだ樹状細胞は、該細胞表面上のＭＨＣに取り込んだがん抗原を抗原提示し、がん抗原特異的なＴ細胞を誘導する。マウスモデルにおいて、ａＡＶＣ投与によるがん抗原特異的Ｔ細胞の誘導を介した抗腫瘍効果も示されている（特許文献１～３、非特許文献５及び６）。このように、ａＡＶＣはＮＫＴ細胞活性化を介したＮＫ細胞活性化による自然免疫活性化及び抗原特異的Ｔ細胞誘導による獲得免疫誘導の二つの免疫機構を強力に誘導し得ることが示されている。
国際公開番号２００７／０９７３７０ 国際公開番号２０１０／０６１９３０ 国際公開番号２０１３／０１８７７８ 国際公開番号２０２１／１１２０５６ 国際公開番号２０２１／１１２０５５
Ｔｈｅ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、１９９９；１６３（５）：２３８７－２３９１ Ｎａｔｕｒｅ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、２００２；３（９）：８６７－８７４ Ｔｈｅ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、２００９；１８２（４）：２４９２－２５０１ Ｃｌｉｎｉｃａｌ　Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ、２００５；１１（５）：１９１０－１９１７ Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ、２０１３；７３（１）：６２－７３ Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ、２０１６；７６（１３）：３７５６－３７６６
　従来、ａＡＶＣの製造においては、ＣＤ１ｄを発現した細胞をＣＤ１ｄリガンド存在下でインキュベートすることにより、ＣＤ１ｄリガンドを結合したＣＤ１ｄを提示する細胞を得ていた。このような細胞は、ＮＫＴＮＫＴ細胞の活性化に有益であった。細胞表面上にＣＤ１ｄが存在しなければ、ＣＤ１ｄリガンドは細胞に結合し得ないと考えられていたためである。本発明者らは、ＣＤ１ｄを導入又は発現誘導する前に、細胞をＣＤ１ｄリガンド存在下でインキュベートすることで、効果的にＮＫＴ細胞の活性化能を有する細胞が得られることを見出した。細胞が元々ＣＤ１ｄ陰性の細胞であってもこの方法によりＮＫＴ細胞の活性化能を付与できることは意外な結果であった。
　本開示によれば、例えば、以下の発明が提供される。
（１）細胞を含む組成物であって、
　前記細胞は、ヒトに由来する細胞であり、細胞表面上及び細胞内にそれぞれＣＤ１ｄとＣＤ１ｄリガンドとの複合体を発現し、細胞内の前記複合体の量が、細胞表面上の前記複合体の量よりも有意に多い、組成物。
（２）ＣＤ１ｄの導入又は発現誘導の後に、前記細胞がＣＤ１ｄリガンド存在下でさらにインキュベート（ポストインキュベート）されている、上記（１）に記載の組成物。
（３）上記（１）又は（２）に記載の組成物であって、
　前記細胞は、対照細胞と比較して、より高いＮＫＴ細胞活性化能を有し、
　対照細胞は、ＣＤ１ｄの導入又は発現誘導の前にＣＤ１ｄリガンド存在下でのプレインキュベートをなされておらず、ＣＤ１ｄの導入又は発現誘導がなされ、その後に前記細胞がＣＤ１ｄリガンド存在下でポストインキュベートされた細胞であり、ここで、ＣＤ１ｄリガンドとのインキュベートがプレインキュベートかポストインキュベートか以外の条件は組成物中の細胞と対照細胞とで同じである、組成物。
（４）前記細胞が、ＣＤ１ｄの導入又は発現誘導の前には、ＣＤ１ｄ陰性である、上記（１）～（３）のいずれかに記載の組成物。
（５）前記細胞が、抗原ペプチドを発現している、上記（１）～（４）のいずれかに記載の組成物。
（６）ＮＫＴ細胞活性化能を有する細胞を含む組成物を製造する方法であって、
　ヒトに由来する細胞をＣＤ１ｄリガンド存在下でインキュベート（プレインキュベート）することと、
　前記細胞にＣＤ１ｄを導入又はＣＤ１ｄを発現誘導することと、
　得られた細胞をＣＤ１ｄリガンド存在下又は非存在下でインキュベート（ポストインキュベート）することを含み、
　これにより、ＣＤ１ｄタンパク質を発現し、ＮＫＴ細胞活性可能を有する細胞を得る、方法。
（７）前記ポストインキュベートが、ＣＤ１ｄリガンド非存在下で行われる、上記（６）に記載の方法。
（８）前記ポストインキュベートが、ＣＤ１ｄリガンド存在下で行われる、上記（６）に記載の方法。
（９）前記細胞が、ＣＤ１ｄの導入又は発現誘導の前には、ＣＤ１ｄ陰性である、上記（６）～（８）のいずれかに記載の方法。
（２１）ＣＤ１ｄの導入又は発現誘導が、ＣＤ１ｄをコードする核酸の細胞への導入を含む、上記いずれかに記載の発明。
（２２）ＣＤ１ｄの導入又は発現誘導が、ＣＤ１ｄをコードするｍＲＮＡの細胞への導入を含む、上記いずれかに記載の発明。
（２３）ＣＤ１ｄをコードする核酸の細胞への導入が、エレクトロポレーション法による、上記（２１）に記載の発明。
（２４）ＣＤ１ｄをコードするｍＲＮＡの細胞への導入が、エレクトロポレーション法による、上記（２２）に記載の発明。
（２５）ＣＤ１ｄをコードする核酸の細胞への導入が、無血清条件下で行われる、上記（２３）に記載の発明。
（２６）ＣＤ１ｄをコードするｍＲＮＡの細胞への導入が、無血清条件下で行われる、上記（２４）に記載の発明。
（３１）前記細胞に抗原ペプチドを導入、又は抗原ペプチドを発現誘導することをさらに含む、上記いずれかに記載の方法。
（３２）抗原ペプチドを導入、又は抗原ペプチドを発現誘導することを含まない、上記いずれかに記載の方法。
（４１）ＮＫＴ細胞の活性化能を有する、上記いずれかに記載の細胞。
（４２）抗原ペプチドを発現し、ＮＫＴ細胞の活性可能及び抗原ペプチドに対する特異的免疫誘発能を有する、上記いずれかに記載の細胞。
（５１）細胞を含む組成物であって、
　前記細胞は、少なくとも細胞外にＣＤ１ｄとＣＤ１ｄリガンドとの複合体を発現し、前記複合体の発現は、フローサイトメトリの検出限界以上である、組成物｛例えば、上記（１）の組成物であり得る｝。即ち複合体の発現量がアイソタイプ抗体による測定値以上の数値を示す。例えば図７Ｂ　左　ＥＰ４ｈ後ではｓｕｒｆａｃｅのＭＦＩが７１．１、Ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒが３２３以上である。また、例えば図７Ｂ右ＥＰ２４ｈ後ではｓｕｒｆａｃｅのＭＦＩが１０１、　Ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒが５１６以上である。
（５２）前記細胞が、ヒトに由来する細胞である、上記（５１）に記載の組成物。
（５３）前記細胞が、抗原をさらに含む、上記（５１）に記載の組成物。
（５４）前記細胞が、抗原をさらに含む、上記（５２）に記載の組成物。
（５５）抗原が、抗原ペプチドである、上記（５３）に記載の組成物。
（５６）抗原が、抗原ペプチドである、上記（５４）に記載の組成物。
（５７）ＮＫＴ細胞を活性化することに用いるための、上記（５１）～（５６）のいずれかに記載の組成物。
（５８）抗原特異的な獲得免疫を誘導することに用いるための、上記（５３）～（５６）のいずれかに記載の組成物。
核酸のトランスフェクション時の培地組成が及ぼすタンパク質発現への影響を示す。 用いた細胞（ＨＥＫ２９３ｓｆ細胞）におけるＣＤ１ｄ発現を示す。 エレクトロポレーション（ＥＰ）の後又はＥＰせずに、ＣＤ１ｄリガンド（ここではα－ＧａｌＣｅｒ）存在下又は非存在下でインキュベートし、その後細胞を回収してＮＫＴ細胞と共培養してＮＫＴ細胞の活性化をＮＫＴ細胞が産生するインターフェロン－γ（ＩＦＮ－γ）量を測定する実験のスキームである。 図３Ａの実験の結果を示す。 ＥＰの前にＣＤ１ｄリガンド（ここではα－ＧａｌＣｅｒ）存在下でプレインキュベートし、ＥＰをして、その後、ＣＤ１ｄリガンド（ここではα－ＧａｌＣｅｒ）非存在下で６時間ポストインキュベートし、回収してＮＫＴ細胞と共培養してＮＫＴ細胞の活性化をＮＫＴ細胞が産生するインターフェロン－γ（ＩＦＮ－γ）量を測定する実験のスキームである。 図４Ａの実験の結果を示す。 ＥＰの前にＣＤ１ｄリガンド（ここではα－ＧａｌＣｅｒ）存在下でプレインキュベートし、ＥＰをして、その後、ＣＤ１ｄリガンド（ここではα－ＧａｌＣｅｒ）存在下で６時間ポストインキュベートし、回収してＮＫＴ細胞と共培養してＮＫＴ細胞の活性化をＮＫＴ細胞が産生するインターフェロン－γ（ＩＦＮ－γ）量を測定する実験のスキームである。 図５Ａの実験の結果を示す。 各実験条件におけるＥＰの前のプレインキュベートの条件及び有無、ＥＰの有無、及びポストインキュベートの条件を示す。 図６Ａの各実験条件における細胞表面上のヒトＣＤ１ｄ（ｈＣＤ１ｄ）の発現量、及び細胞内の抗原タンパク質（ここではＯＶＡ）の発現量を示す。 実験条件の概要を示す。条件１ではＣＤ１ｄをコードする遺伝子の導入（ＥＰ）をしないがＣＤ１ｄリガンドによる前処理（４８時間）及び後処理（４時間又は２４時間）が行われ、条件２では該遺伝子の導入をし、ＣＤ１ｄリガンドによる前処理及び後処理が行われ、条件３では該遺伝子の導入をし、ＣＤ１ｄリガンドによる後処理が行われた。発現量に関してネット平均蛍光強度（ｎｅｔＭＦＩ）を算出して表示した（以下同様）。ｎｅｔＭＦＩはアイソタイプ対照抗体のｎｅｔＭＦＩを控除することにより標準化されている（以下同様）。 図７Ａに示される条件１～３におけるＣＤ１ｄ／ＣＤ１ｄリガンド複合体の細胞表面発現（Ｓｕｒｆａｃｅ）と細胞内発現（Ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ）を示す。この場合、ヒトＣＤ１ｄ（ｈＣＤ１ｄ）の代わりにマウスＣＤ１ｄ（ｍＣＤ１ｄ）を使用した。 図７Ａに示される条件１～３におけるｍＣＤ１ｄの細胞表面発現と細胞内発現を示す。 実験条件の概要を示す。条件１ではＣＤ１ｄをコードする遺伝子の導入（ＥＰ）後にＣＤ１ｄリガンドによる後処理（６時間）が行われ、条件２では前記導入をせずに前記後処理が行われ、条件３では前記導入をするが前記後処理がなされず、条件４では前記遺伝子導入も前記後処理もなされなかった。 図８Ａに示される条件１～４におけるＣＤ１ｄ／ＣＤ１ｄリガンド複合体の細胞表面発現と細胞内発現を示す。 図８Ａに示される条件１～４におけるＣＤ１ｄの細胞表面発現と細胞内発現を示す。 実験条件の概要を示す。条件１では、ＣＤ１ｄをコードする遺伝子の導入（ＥＰ）をするが、ＣＤ１ｄリガンドによる前処理（４８時間）及び後処理（６時間）が行われ、条件２では、前記導入に加えてＣＤ１ｄリガンドによる前処理（４８時間）が行われ、条件３では、前記導入に加えてＣＤ１ｄリガンドによる前処理（６時間）が行われ、条件４では、前記導入に加えてＣＤ１ｄリガンドによる前処理（２時間）が行われた。 図９Ａに示される条件１～４におけるＣＤ１ｄ／ＣＤ１ｄリガンド複合体の細胞表面発現と細胞内発現を示す。 図９Ａに示される条件１～４におけるＣＤ１ｄの細胞表面発現と細胞内発現を示す。 実験条件の概要を示す。条件１では、ＣＤ１ｄリガンドによる前処理（４８時間）、ＣＤ１ｄをコードする遺伝子の導入（ＥＰ）に次いで１６時間（条件１）、２４時間（条件２）、４８時間（条件３）、７２時間（条件４）および９６時間（条件５）のＣＤ１ｄリガンド非存在下での培養がなされた。 図１０Ａに示される条件１～５におけるＣＤ１ｄ／ＣＤ１ｄリガンド複合体の細胞表面発現と細胞内発現を示す。 図１０Ａに示される条件１～５におけるＣＤ１ｄの細胞表面発現と細胞内発現を示す。
　本明細書では、「哺乳動物」は、例えば、チンパンジー、ゴリラ、オランウータン、サル、マーモセット及びボノボなどの非ヒト霊長類；ブタ、ラット、マウス、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ウマ、ネコ及びイヌなどの非ヒト哺乳動物（例えば、食肉類、偶蹄類、奇蹄類及びげっ歯類）が挙げられる。
　本明細書では、「人工アジュバントベクター細胞」（ａＡＶＣ）とは、ＣＤ１ｄを発現し、かつ、抗原ペプチドを発現し、ＣＤ１ｄがＣＤ１ｄリガンドと複合体を形成している、細胞をいう。ａＡＶＣは、ナチュラルキラーT細胞（ＮＫＴ細胞）を活性化することができ、抗原提示細胞である樹状細胞（DC）により取り込まれる。活性化したＮＫＴ細胞は、抗原を取り込んだ樹状細胞を成熟させ、成熟した樹状細胞は、リンパ組織へ移動して抗原特異的なT細胞（CD4単独陽性T細胞、CD8単独陽性T細胞など）を誘導する。ａＡＶＣは、この一連のプロセス（ＮＫＴ細胞の活性化、樹状細胞による貪食、活性化ＮＫＴ細胞による貪食後樹状細胞の成熟化、及び樹状細胞のリンパ組織への遊走）を駆動し、又はそのトリガーを引く。ａＡＶＣは、抗原ペプチドを発現しているが、抗原ペプチドを発現しない場合でもＮＫＴ細胞の活性化能を有し、有益である。ａＡＶＣは、抗原ペプチドを発現することにより、抗原ペプチドに対する特異的免疫（獲得免疫）の誘導能を示す。このようにして、ａＡＶＣは、自然免疫と抗原特異的獲得免疫の両方を賦活化することができ、これにより、がん細胞や病原体の免疫による排除を促進する。
　本明細書では、「抗原」は、抗原性を有する物質を意味する。抗原は通常はそれに対する特異的免疫を誘導するべき物質である。抗原は好ましくは細胞外から免疫系がアクセス可能な抗原であり得る。抗原は外来性または内因性であり得る。外来性抗原としては、特に限定されないが、病原体（例えば、ウイルス、細菌、真菌、寄生虫等）が挙げられる。抗原は、例えば、特異的免疫の攻撃対象となる特定の組織もしくは特定の細胞に選択的に存在する内因性の因子、または病的状態において選択的に発現する内因性の因子であってもよい。内因性の因子としては、特に限定されないが例えば、がん抗原が挙げられる。がん抗原は、がんに特異的に発現する抗原であり、好ましくは正常組織及び正常細胞には実質的な発現を示さない。
　本明細書では、「抗原ペプチド」は、抗原性を有するタンパク質又は抗原性を有するその断片である。抗原は、例えば、核酸、脂質、糖脂質、糖鎖、ペプチド等であり得る。抗原ペプチドは、例えば、がん細胞に選択的に発現するタンパク質（例えば、がん抗原）、病原体感染細胞に選択的に発現する抗原（例えば、病原体を構成するタンパク質、標的細胞に選択的に発現するタンパク質、又はその断片）である。抗原（抗原ペプチド等）は、細胞内または細胞膜上に存在する。樹状細胞により取り込まれ、抗原提示されるためである。抗原提示される際には、短いタンパク質の断片として提示されるので、抗原ペプチドは、樹状細胞により抗原提示できる限り、タンパク質またはタンパク質の断片でもよい。抗原ペプチドとしては例えば、膜タンパク質又はその細胞外ドメインの一部であり得る。
　本明細書では、「出発細胞」とは、本発明の処理をする前の細胞である。本発明の処理は、出発細胞をＣＤ１ｄリガンド存在下でプレインキュベートすることと、ＣＤ１ｄをコードする核酸を前記で得られた細胞に導入ことを少なくとも含む。
　本明細書では、「プレインキュベート」は、細胞へのＣＤ１ｄの導入又は発現誘導の前に細胞の維持に適した条件下で細胞をインキュベート（培養）することを意味する。インキュベートは、例えば、血清存在下又は好ましくは非存在下（好ましくはゼノフリー条件下）で行うことができる。本明細書では、「ゼノフリー」は、細胞とは異なる種の成分を含まないことを意味する。
　本明細書では、「ポストインキュベート」は、細胞へのＣＤ１ｄの導入又は発現誘導の後に細胞の維持に適した条件下で細胞をインキュベート（培養）することを意味する。インキュベートは、例えば、血清存在下又は好ましくは非存在下（好ましくはゼノフリー条件下）で行うことができる。
　本明細書では、「ＣＤ１ｄ」とは、天然に存在するＣＤ１ｄ及びその機能を有する改変体であってよい。ＣＤ１ｄは、使用するヒト由来細胞に内在的に発現するＣＤ１ｄであってもよく、使用するヒト由来細胞に外来的に発現させたＣＤ１ｄであっても良い。１つの実施形態において、発現とは、細胞のいずれかの場所に発現していることを意味し、１つの実施形態において、細胞表面に発現していることを意味する。１つの実施形態において、ａＡＶＣは外来性ＣＤ１ｄを発現する。１つの実施形態において、本発明で使用されるＣＤ１ｄは哺乳類（例えば、ヒト、サル、マウス、ラット、イヌ、チンパンジー等）由来のＣＤ１ｄである。１つの実施形態において、本発明で使用されるＣＤ１ｄはヒトＣＤ１ｄである。本明細書では、「ＣＤ１ｄ陰性」とは、ＣＤ１ｄを発現していないことを意味する。ＣＤ１ｄが陰性であることは、フローサイトメトリによりバックグラウンドの信号を考慮して決定することができる。
　１つの実施形態において、ヒトＣＤ１ｄは、配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質である。１つの実施形態において、ヒトＣＤ１ｄは、配列番号１に示されるアミノ酸配列において１又は数個、ある実施形態では１～１０個、１～７個、１～５個、１～３個、又は１～２個のアミノ酸の欠失、置換、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、且つ、ＣＤ１ｄの機能を有するタンパク質である。１つの実施形態において、ヒトＣＤ１ｄは、配列番号１に示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、又は９９％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、且つ、ＣＤ１ｄの機能を有するタンパク質である。
　ＣＤ１ｄの機能としては、ＣＤ１ｄリガンド（例えば、α－ガラクトシルセラミド（α－ＧａｌＣｅｒ）、α－Ｃ－ガラクトシルセラミド（α－Ｃ－ＧａｌＣｅｒ）、７ＤＷ８－５、イソグロボトリヘキソシルセラミド（ｉＧｂ３））に結合する能力が挙げられる。ＣＤ１ｄのＣＤ１ｄリガンドへの結合能は公知の方法を用いて当業者に容易に評価され得る。また、ＣＤ１ｄの機能は、ａＡＶＣによるヒトＮＫＴ細胞を活性化する能力を指標に評価することもできる。このヒトＮＫＴ細胞の活性化能は、特許文献１又は本願実施例４に記載の方法で評価することができる。α－ＧａｌＣｅｒは、ＣＡＳ　ＲＮ：１５８０２１－４７－７、分子式：Ｃ５０Ｈ９９ＮＯ９及び分子量：８５８．３４で表される物質であり、ＣＤ１ｄリガンドの１つである。α－ＧａｌＣｅｒは、当該分野で公知の技術に従って合成してもよく、商業的に入手可能なもの（例えば、α－Ｇａｌａｃｔｏｓｙｌｃｅｒａｍｉｄｅ（フナコシ、Ｃａｔ．ＫＲＮ７０００））を使用してもよい。細胞へのα－ＧａｌＣｅｒの積載は、ＣＤ１ｄを発現する細胞をα－ＧａｌＣｅｒを含有する培地において培養することによって行いうる。
　本明細書中、「外来性」又は「外来的」とは、遺伝子又は核酸を遺伝子操作又は遺伝子導入等の操作により目的の細胞内に人為的に導入すること、及び目的の細胞内に人為的に導入された遺伝子又は核酸、並びにそれら発現タンパク質を指す用語として交換可能に使用される。外来性の遺伝子は、遺伝子の発現を駆動するプロモーター配列に作動可能に連結されうる。
　本明細書中、「内在性」又は「内在的」とは、細胞に元々備わったものであることを意味する。
　本明細書中、「由来」とは、細胞が得られた動物種を示すために用いられる。例えば、ヒト由来細胞は、当該細胞がヒトから得られた細胞であること、又は当該細胞を継代培養して得られた細胞株であることを意味し、例えば、ヒト細胞であることを意味する。１つの実施形態において、本発明で使用されるヒト由来細胞は、ヒト組織由来の不死化細胞又は株化細胞である。不死化細胞及び株化細胞は当業者により公知の方法を用いて作製することができる。
　本明細書における「同一性」とは、ＥＭＢＯＳＳ　Ｎｅｅｄｌｅ（Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．；２０１５；４３：Ｗ５８０－Ｗ５８４）を用いて、デフォルトで用意されているパラメータによって得られたＩｄｅｎｔｉｔｙの値を意味する。前記のパラメータは以下のとおりである。
　Ｇａｐ　Ｏｐｅｎ　Ｐｅｎａｌｔｙ　＝　１０
　Ｇａｐ　Ｅｘｔｅｎｄ　Ｐｅｎａｌｔｙ　＝　０．５
　Ｍａｔｒｉｘ　＝　ＥＢＬＯＳＵＭ６２
　Ｅｎｄ　Ｇａｐ　Ｐｅｎａｌｔｙ　＝　ｆａｌｓｅ
＜本開示の細胞及び当該細胞を製造する方法＞
　本開示の細胞は、哺乳動物細胞（好ましくはヒト細胞）である。本開示の細胞は、少なくともＮＫＴ細胞の活性化能を有する。ＣＤ１ｄリガンドと複合体を形成したＣＤ１ｄを提示した細胞は、ＮＫＴ細胞の活性可能を有する。したがって、本開示の細胞は、ＣＤ１ｄリガンドと複合体を形成したＣＤ１ｄを有する。本開示の細胞は、抗原を発現することにより、抗原特異的獲得免疫を誘導し得る。本開示ではそのような抗原をさらに発現した細胞（ａＡＶＣ）もまた提供する。
　従来、ＣＤ１ｄリガンドと複合体を形成したＣＤ１ｄ細胞は、ＣＤ１ｄの導入又は発現誘導の後に細胞をＣＤ１ｄリガンドと接触させる（あるいは、ＣＤ１ｄリガンド存在下でインキュベート（ポストインキュベート）する）ことにより調製されていた。これは、ＣＤ１ｄが細胞に発現する前にＣＤ１ｄリガンドを細胞に接触させても、リガンドを受け取るＣＤ１ｄの発現がなければ意義がないと考えられていたためである。しかしながら、後述する実施例で示されるように、仮にＣＤ１ｄ陰性の細胞をＣＤ１ｄリガンド存在下でプレインキュベートし、かつ、ＣＤ１ｄの導入又は発現誘導の後は、ＣＤ１ｄリガンド存在下でポストインキュベートしない場合であっても、ＮＫＴ細胞を活性化する能力を有した。また、プレインキュベート時間が長い方がＮＫＴ細胞を活性化する能力に優れた。このことは長いプレインキュベートにより、ＣＤ１ｄ陰性細胞がＣＤ１ｄリガンドを細胞に取り込んだ結果と考えられる。しかも、ＣＤ１ｄリガンド存在下でのプレインキュベートの方がポストインキュベートよりもＮＫＴ細胞活性可能を高め得ることが明らかになっている。したがって、ＣＤ１ｄリガンドを取り込んだ状態で細胞がｄｅ　ｎｏｖｏ（新規）にＣＤ１ｄを発現すると、ＣＤ１ｄは効率よくＣＤ１ｄリガンドと複合体を形成し得ることが示唆される。ＣＤ１ｄはリガンドなしではＮＫＴ細胞を活性化せず、ＣＤ１ｄリガンドはＣＤ１ｄなしではＮＫＴ細胞を活性化しない。このことは、ＣＤ１ｄ陰性細胞であってもＣＤ１ｄリガンドと接触させることにより細胞にＣＤ１ｄリガンドが取り込まれ、ＣＤ１ｄの細胞表面への発現の際にＣＤ１ｄは効率よくＣＤ１ｄリガンドと複合体を形成でき、このことによりＮＫＴ細胞の活性化が促進されるとの考えを支持する。WO2021/112056Aは、ａＡＶＣにおいて細胞数よりもＣＤ１ｄに結合したＣＤ１ｄリガンド量が免疫誘導能の高さと関連することを明らかにしており、ＣＤ１ｄ発現細胞にＣＤ１ｄリガンドを効率よく結合させることは高い免疫誘導能を得る上で重要であると考えられる。
　本開示では、出発細胞をＣＤ１ｄリガンド存在下でインキュベートし、その後、ＣＤ１ｄを細胞表面に発現させることを含み得る。出発細胞は、ＣＤ１ｄ陽性でもＣＤ１ｄ陰性でもよいが、ＣＤ１ｄリガンド存在下でインキュベートした後でｄｅ　ｎｏｖｏに細胞表面に提示されるＣＤ１ｄの存在が重要であると考えられる。ｄｅ　ｎｏｖｏに細胞表面にＣＤ１ｄを提示するには、そのタイミングで、ＣＤ１ｄを細胞に導入したり、ＣＤ１ｄをコードする核酸（例えば、ＤＮＡ又はＲＮＡ）を細胞に導入したり、又は、すでに細胞に導入されているＣＤ１ｄをコードする核酸（例えば、ＤＮＡ）であって、誘導型プロモーターに作動可能に連結されたものを、誘導因子を与えることで発現誘導することなど、当業者であれば様々な方法を活用できる。
　このように、本発明は、ＣＤ１ｄの導入又は発現誘導の前に細胞をＣＤ１ｄリガンド存在下でプレインキュベートし、細胞にＣＤ１ｄリガンドを取り込ませることにより、ＣＤ１ｄの導入又は発現誘導の後に効率よくＣＤ１ｄにＣＤ１ｄリガンドを結合させることができることに基づく。したがって、ＣＤ１ｄの導入又は発現誘導の前に細胞をＣＤ１ｄリガンド存在下でプレインキュベートする限り、ＣＤ１ｄの導入又は発現誘導の後にＣＤ１ｄリガンド存在下でポストインキュベートをしなくてもよいし、好ましくはＣＤ１ｄの導入又は発現誘導の後にＣＤ１ｄリガンド存在下でポストインキュベートをすることができる。ＣＤ１ｄリガンド存在下でのプレインキュベートに加えてＣＤ１ｄリガンド存在下でのポストインキュベートを実施することで、細胞によるＮＫＴ細胞の活性化能が向上し得る。また、プレインキュベート後にＣＤ１ｄが細胞膜表面に提示されることが重要であると考えられ、プレインキュベート後にＣＤ１ｄの発現が誘導される限り、ＣＤ１ｄの導入又は発現誘導の時期は問われないし、又はＣＤ１ｄが細胞に新規に生じる限り、ＣＤ１ｄの導入の必要もないであろう。
　ＣＤ１ｄリガンド存在下での細胞のプレインキュベートは、当該細胞によるＣＤ１ｄリガンドの取込みを誘発すると考えられる。これは、プレインキュベート後に細胞を洗浄して、それ以降の全ての工程をＣＤ１ｄリガンド非存在下で実施しても、細胞はＮＫＴ細胞の活性可能を有することから明らかである。
　これまでの遺伝子導入後のみＣＤ１ｄリガンド存在下で培養する手法では、フローサイトメトリで検出可能なレベルの前記複合体を細胞に発現させることができなかった。これに対して、本開示によれば、得られた細胞は、少なくとも細胞外にＣＤ１ｄとＣＤ１ｄリガンドとの複合体を発現し、前記複合体の発現は、フローサイトメトリの検出限界以上である。本開示によれば、得られた細胞は細胞内にＣＤ１ｄとＣＤ１ｄリガンドとの複合体をさらに発現し、前記複合体の発現は、フローサイトメトリの検出限界以上である。本開示のある態様では、遺伝子導入後のみＣＤ１ｄリガンド存在下で２４時間培養して得られる細胞と比較して、フローサイトメトリで複合体の有意に増大した発現量を示す組成物が提供される｛但し、ＣＤ１ｄリガンドの処理の時期以外の条件は同一とする｝。ＣＤ１ｄの導入は、ＣＤ１ｄをコードする核酸の細胞への導入により行われる。ＣＤ１ｄリガンドはα－ＧａｌＣｅｒ（例えば、500ng/mL）であり得る。
　本開示によれば、細胞及び当該細胞を含む組成物が提供される。前記細胞は、好ましくは投与対象となる動物種と同じ種の細胞である。ヒトに投与する場合には、好ましくはヒトに由来する。細胞は、ＣＤ１ｄリガンドを取り込み、その後にＣＤ１ｄを細胞表面に提示させる。ＣＤ１ｄが細胞表面に提示される前にＣＤ１ｄはＣＤ１ｄリガンドと複合体を形成していると考えられる。このようにして得られる細胞は、ＣＤ１ｄリガンドと複合体を形成しているＣＤ１ｄと、フリーのＣＤ１ｄを細胞表面に提示しており、更なるＣＤ１ｄリガンドとのインキュベートによりフリーのＣＤ１ｄにＣＤ１ｄリガンドとの複合体を形成させることができると考えられる。
　ある好ましい態様では、細胞へのＣＤ１ｄリガンドの取込みは、例えば、細胞をＣＤ１ｄリガンド存在下でインキュベートすることにより達成することができる。その他、細胞にＣＤ１ｄリガンドを取り込ませる方法は様々に存在し得る。
　ある好ましい態様では、インキュベートは、血清存在下、又は無血清条件下で行われ得る。
　ある好ましい態様では、前記細胞は、ＣＤ１ｄの導入又は発現誘導の前にＣＤ１ｄリガンド存在下でインキュベート（プレインキュベート）されており、その後ＣＤ１ｄの導入又は発現誘導によりＣＤ１ｄを細胞表面に提示しており、ある好ましい態様では、従来型の細胞、すなわち、ＣＤ１ｄの導入又は発現誘導の後にＣＤ１ｄリガンド存在下でインキュベート（ポストインキュベート）された対照細胞と比較して、より強いＮＫＴ細胞の活性化能を有し得る。ここで、比較する両者の細胞に関して、インキュベートのタイミング以外の条件はすべて同じである。ここでまた、プレインキュベートの時間を長くすることにより、ＮＫＴ細胞の活性可能を向上させることができる。これは、プレインキュベートの時間を長くすることにより細胞に取り込まれるＣＤ１ｄリガンドの量が増えるためと思われる。したがって、ある好ましい態様では、ＣＤ１ｄリガンドの細胞取込みに十分な時間（例えば、１２時間～８０時間、２４時間～７２時間、または３６時間～６０時間）のプレインキュベートがなされ得る。ＣＤ１ｄの導入は、ＣＤ１ｄタンパク質又はＣＤ１ｄをコードする核酸の導入によることができる。核酸は好ましい態様ではmＲＮＡである。ｍＲＮＡは、ＣＤ１ｄタンパク質の翻訳に適する構造（例えば、キャップ構造、ウラシルのシュードウリジンへの変更、ポリA等）を有する。また、ＣＤ１ｄの発現誘導は、誘導型プロモーターからのＣＤ１ｄの発現が挙げられる。ＣＤ１ｄタンパク質は、細胞膜局在のためのシグナル配列を有することが好ましく、これにより、効果的な細胞膜上への発現を可能とする。
　本開示のある態様では、前記細胞は、細胞表面及び細胞内にＣＤ１ｄ／ＣＤ１ｄリガンド複合体を含む。ある好ましい態様では、細胞内ＣＤ１ｄ／ＣＤ１ｄリガンド複合体の量は、細胞表面ＣＤ１ｄ／ＣＤ１ｄリガンド複合体よりも有意に多く、好ましくは、その比（細胞内複合体量／細胞表面複合体量）は、１．１以上、１．２以上、１．３以上、１．４以上、１．５以上、２以上、３以上、４以上、５以上、６以上、７以上、８以上、９以上、または１０以上であり得る。また、例えば当該比は、１０以下、９以下、８以下、７以下、６以下、５以下、または４以下であり得る。当該比は、例えば、２～１０、２～９、２～８、２～７、２～６、２～５、３～１０、３～９、３～８、３～７、３～６、３～５、４～１０、４～９、４～８、４～７、４～６、または４～５であり得る。このような細胞は、好ましくは、ＣＤ１ｄをコードするｍＲＮＡの導入により細胞を調製する場面で得られ得る。
　本開示のある態様では、前記細胞は、遺伝子導入（好ましくはｍＲＮＡ導入）と培地交換後のＣＤ１ｄリガンド非存在下での培養開始後４８時間、もしくは７２時間、または好ましくは９６時間の時点で細胞内にＣＤ１ｄ／ＣＤ１ｄリガンド複合体を有する。細胞内のＣＤ１ｄ／ＣＤ１ｄリガンド複合体は有効量の当該複合体を含み得る。ある態様では、細胞内のＣＤ１ｄ／ＣＤ１ｄリガンド複合体の量は、細胞表面上のＣＤ１ｄ／ＣＤ１ｄリガンド複合体の量より有意に多く、好ましくは、細胞表面上のＣＤ１ｄ／ＣＤ１ｄリガンド複合体の量の５倍～１００倍、１０倍～８０倍、１５倍～６０倍、または２０～５０倍であり得る。前記遺伝子導入は、前記のように無血清培地または化学的に定義された培地中で行うことができる。交換用の培地も、無血清培地または化学的に定義された培地であり得る。前記細胞は、例えば、遺伝子導入前の細胞のＣＤ１ｄリガンド存在下での培養により得られ得る。遺伝子導入前の細胞のＣＤ１ｄリガンド存在下での培養時間は、例えば、２４時間以上、３０時間以上、３６時間以上、４２時間以上、４８時間以上、７２時間以上、または９６時間以上であり得る。遺伝子導入前の細胞のＣＤ１ｄリガンド存在下での培養時間は、例えば、１２０時間以下、９６時間以下、８４時間以下、７２時間以下、６０時間以下、または４８時間以下であり得る。遺伝子導入前の細胞のＣＤ１ｄリガンド存在下での培養時間は、例えば、２４時間～１２０時間、３６時間～７２時間、または３６時間～６０時間であり得る。この時間の上限および下限は上記に記載された通りとすることができる。上記細胞は、投与後も細胞内にＣＤ１ｄ／ＣＤ１ｄリガンド複合体を含み、ＮＫＴ細胞の活性化の長期化に寄与し得る。
　細胞内のＣＤ１ｄ／ＣＤ１ｄリガンド複合体の検出は、BDのCytofix/Cytoperm Fixation /Permeabilization Kit (#554714)、及び抗ＣＤ１ｄ／α－ＧａｌＣｅｒ複合体抗体を用いたフローサイトメトリにより確認することができる。抗ＣＤ１ｄ／α－ＧａｌＣｅｒ複合体抗体は、ＣＤ１ｄおよびα－ＧａｌＣｅｒが複合体に対して親和性を有し、ＣＤ１ｄおよびα－ＧａｌＣｅｒに対しては実質的に親和性を有しないことが好ましい。そのような抗体としては、例えば、抗ＣＤ１ｄ／αＧａｌＣｅｒ複合体抗体(clone L363, # 12-2019-82; e-Bioscience）が挙げられる。
　誘導型プロモーターは、誘導的に発現を促進するプロモーターであり、当該プロモーターを駆動する誘導因子（本明細書において、「誘導型プロモーターの誘導因子」又は単に「誘導因子」とも称する）の存在下において、該プロモーターに作動可能に連結されたポリヌクレオチドの発現を誘導することができるプロモーターをいう。誘導型プロモーターに作動可能に連結したＣＤ１ｄをコードする核酸は、プレインキュベートの更に前に細胞に導入されていてもよく、プレインキュベートの後に細胞に導入されてもよいが、プレインキュベートの後に誘導因子により発現を駆動させることで、細胞表面上にｄｅ　ｎｏｖｏのＣＤ１ｄの発現を誘導することができる。
　誘導型プロモーターとしては、例えば、温熱誘導型プロモーター（例えば、ヒートショックプロモーター）、薬剤誘導型プロモーターが挙げられる。１つの実施形態において、誘導型プロモーターは、薬剤誘導型プロモーターである。本明細書において、「薬剤誘導型プロモーター」とは、誘導因子である薬剤により該プロモーターに作動可能に連結されたポリヌクレオチドの発現が調節されるプロモーターを意味する。薬剤誘導型プロモーターとしては、例えば、Ｃｕｍａｔｅオペレーター配列、λオペレーター配列（例えば、１２×λＯｐ）、テトラサイクリン遺伝子発現誘導系の誘導型プロモーター（以下、「テトラサイクリン系誘導型プロモーター」という）等が挙げられる。Ｃｕｍａｔｅオペレーター配列は、ＣｙｍＲリプレッサー存在下において不活性であるが、誘導因子であるＣｕｍａｔｅの存在下において、ＣｙｍＲリプレッサーと解離して、該プロモーターに作動可能に連結されたポリヌクレオチドの発現を誘導する。λオペレーター配列は、二量体化により転写活性化能を有するアクチベーター（λＲｅｐ－ＧｙｒＢ－ＡＤ）を二量体化する誘導因子（例えば、クメルマイシン）の存在下において、該プロモーターに作動可能に連結されたポリヌクレオチドの発現を誘導する。テトラサイクリン系誘導型プロモーターは、誘導因子であるテトラサイクリン又はその誘導体（例えば、ドキシサイクリン等）及びリバーステトラサイクリン制御性トランス活性化因子（ｒｔＴＡ）（例えば、Ｔｅｔ－Ｏｎ　３Ｇ）の存在下において、該プロモーターに作動可能に連結されたポリヌクレオチドの発現を誘導する。テトラサイクリン系誘導型プロモーターとしては、例えば、ＴＲＥ３Ｇプロモーターが挙げられる。１つの実施形態において、薬剤誘導型プロモーターは、テトラサイクリン系誘導型プロモーターであり、１つの実施形態において、テトラサイクリン系誘導型プロモーターは、ＴＲＥ３Ｇプロモーターである。
　構成的プロモーターとしては、特に限定されないが例えば、ＣＭＶ（ｃｙｔｏｍｅｇａｌｏｖｉｒｕｓ）、ＲＳＶ（ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ　ｓｙｎｃｙｔｉａｌ　ｖｉｒｕｓ）、ＳＶ４０（ｓｉｍｉａｎ　ｖｉｒｕｓ　４０）等のウイルス由来プロモーター、アクチンプロモーター、ＥＦ（ｅｌｏｎｇａｔｉｏｎ　ｆａｃｔｏｒ）１αプロモーター等が挙げられる。構成的プロモーターは、常に作動可能に連結した核酸からの転写を駆動するプロモーターである。構成的プロモーターに作動可能に連結したＣＤ１ｄをコードする核酸は、プレインキュベートの後に細胞に導入することが好ましい。もちろん、ＣＤ１ｄリガンドが取り込まれた細胞表面上にｄｅ　ｎｏｖｏにＣＤ１ｄを発現誘導できる限り、導入の時期は必ずしもプレインキュベートの後に限定されない。
　核酸がＤＮＡである場合には、通常、当該ＤＮＡはプロモーターに作動可能に連結される。プロモーターは、誘導型プロモーターでも、構成的プロモーターでもよい。発現誘導を狙ったタイミングで誘発させたい場合には、プロモーターとして誘導型プロモーターを用い、狙ったタイミングで誘導因子を作用させて当該誘導型プロモーターに発現誘導を駆動させればよい。
　本開示によれば、細胞へのＣＤ１ｄの導入又は発現誘導（特にＣＤ１ｄ及び及び／又は、抗原または抗原ペプチドをコードする核酸（好ましくはmＲＮＡ）の導入）は、5％以下の血清濃度条件下、又は無血清条件下で行うことが好ましい。核酸の導入は、常法により実施され得るが、ある態様では、トランスフェクションの方法により、ある好ましい態様では、核酸の導入は、エレクトロポレーション法により実施され得る。ＮＫＴ細胞の活性化能を有する細胞の製造においては、これまで、血清存在下でα－ＧａｌＣｅｒと細胞とをインキュベートしており、細胞への核酸導入も血清存在下で行われていた。したがって、本開示によれば、ＮＫＴ細胞の活性化能を有する細胞を製造する方法であって、細胞に無血清条件下でＣＤ１ｄをコードする核酸、及び／又は、抗原もしくは抗原ペプチドをコードする核酸を導入することと、ＣＤ１ｄリガンド存在下で細胞をインキュベートすることとを含み、これにより、ＣＤ１ｄリガンドと複合体を形成したＣＤ１ｄを提示する細胞を得る、方法が提供される。ある態様では、出発細胞からＮＫＴ細胞の活性可能を有する細胞の取得、及びその後のａＡＶＣの取得までの全工程は、無血清条件下で行われる。無血清条件は、好ましくはゼノフリーの条件下であり得る。
　ａＡＶＣは、抗原を発現している必要がある。すでに細胞が抗原を発現している場合には、改めて抗原ペプチドをコードする核酸を導入することは必要ではないが、改めて抗原ペプチドをコードする核酸を導入することを製造工程に含めてもよいであろう。例えば、出発細胞が、がん細胞や病原体感染細胞である場合には、すでに当該細胞は抗原を発現しているから改めて抗原を追加的に発現させる必要まではない。
　１つの実施形態において、本発明で使用されるａＡＶＣは、がん抗原を発現する。本発明で使用されるがん抗原として、がん細胞において発現がみられる任意のタンパク質が使用でき、例えば、Ｗｉｌｍｕｓ　Ｔｕｍｏｒ　１（ＷＴ－１）、Ｈｕｍａｎ　Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ　Ａｎｔｉｇｅｎ　１２５（ＣＡ－１２５）、Ｃａｒｃｉｎｏｅｍｂｒｙｏｎｉｃ　Ａｎｔｉｇｅｎ（ＣＥＡ）、Ｈｕｍａｎ　Ｔｅｌｏｍｅｒａｓｅ　Ｒｅｖｅｒｓｅ　Ｔｎａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ（ｈＴＥＲＴ）、Ｍｕｃｉｎ－１（Ｍｕｃ－１）、Ｍｕｃｉｎ－２（Ｍｕｃ－２）、Ｃａｎｃｅｒ／Ｔｅｓｔｉｓ　ａｎｔｉｇｅｎ　１Ｂ（ＣＴＡＧ１Ｂ／ＮＹ－ＥＳＯ－１）、Ｐｒｏｓｔａｔｉｃ　Ａｃｉｄ　Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ（ＰＡＰ）、Ｐｒｏｓｔａｔｅ　Ｓｐｅｃｉｆｉｃ　Ａｎｔｉｇｅｎ（ＰＳＡ）、Ｐｒｏｓｔａｔｅ　Ｓｐｅｃｉｆｉｃ　Ｍｅｍｂｒａｎｅ　Ａｎｔｉｇｅｎ（ＰＳＭＡ）、Ｓｕｒｖｉｖｉｎ　ｂ、変異ｒａｓ、変異ｐ５３等が挙げられる。１つの実施形態において、本発明で使用されるがん抗原として、Ｗｉｌｍｕｓ　Ｔｕｍｏｒ　１（ＷＴ－１）が挙げられる。１つの実施形態において、ＷＴ－１はヒトＷＴ－１である。１つの実施形態において、１つの実施形態において、ａＡＶＣは、１種のがん抗原を発現する。１つの実施形態において、ａＡＶＣは、複数種のがん抗原を発現する。がん抗原としては、それを発現するａＡＶＣが該がん抗原に対する免疫作用により抗腫瘍効果を示すものである限り、天然に存在するがん抗原又はその改変体であってもよい。がん抗原は、使用するヒト由来細胞に内在的に発現する抗原であってもよく、又、使用するヒト由来細胞に外来的に発現させた抗原であってもよい。１つの実施形態において、ａＡＶＣは、外来性がん抗原を発現する。１つの実施形態において、ａＡＶＣは、複数種の外来性がん抗原を発現する。
　本開示の方法では、細胞の培養又はインキュベートは、細胞の維持に適した条件下で行われる。細胞の維持に適した条件は、細胞の維持、培養、又は増殖に適した条件であり得る。細胞を維持するため、又は増殖させるための細胞の培養は、公知の方法により行われる。基礎培地としては、例えば、ＭＥＭ培地（Ｓｃｉｅｎｃｅ；１９５２；１２２：５０１）、ＤＭＥＭ培地（Ｖｉｒｏｌｏｇｙ；１９５９；８：３９６－３９７）、ＲＰＭＩ１６４０培地（Ｊ．Ａｍ．Ｍｅｄ．Ａｓｓｏｃ．；１９６７；１９９：５１９－５２４）、１９９培地（Ｐｒｏｃ．Ｓｏｃ．Ｅｘｐ．Ｂｉｏｌ．Ｍｅｄ．；１９５０；７３：１－８）、ＦｒｅｅＳｔｙｌｅＴＭ２９３　Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　Ｍｅｄｉｕｍ（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社、Ｃａｔ．１２３３８０２２）、ＣＤ　２９３　Ｍｅｄｉｕｍ（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社、Ｃａｔ．１１９１３０１９）、Ｅｘｐｉ２９３ＴＭ　Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　Ｍｅｄｉｕｍ（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社、Ｃａｔ．Ａ１４３５１０１）、イーグル培地、イーグル最小必須培地、及びその改変培地を使用することができる。培養培地は、例えば、血清（例えば、ウシ胎児血清）、血清代替物（例えば、ＫｎｏｃｋＯｕｔ　Ｓｅｒｕｍ　Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ：ＫＳＲ）、脂肪酸又は脂質、アミノ酸、ビタミン、増殖因子、サイトカイン、抗酸化剤、２－メルカプトエタノール、ピルビン酸、緩衝剤、無機塩類、抗生物質等を含むことができる。１つの実施形態において、培養に使用される培地は、無血清培地又は好ましくは化学的に定義された培地である。培地は、細胞の培養またはインキュベートに適した組成を有する。
　培養条件（例えば、培養時間、温度、培地のｐＨ、ＣＯ２濃度等の培養条件）は当業者により適宜選択され得る。培地のｐＨは約６～８であるのが好ましく、培養温度は、特に限定されるものではないが、例えば約３０～４０℃、好ましくは約３７℃である。また、ＣＯ２濃度は約１～１０％、好ましくは約５％である。培養時間は、特に限定されるものではないが、約１５～３３６時間行なわれる。必要により通気や撹拌を行うこともできる。
＜本開示の医薬組成物＞
　本開示によれば、本開示の上記細胞を含む組成物が提供される。１つの実施形態において、当該医薬組成物は、がんの処置に用いるための医薬組成物である。１つの実施形態において、ＣＤ１ｄリガンドは、α－ＧａｌＣｅｒである。当該医薬組成物は、当該分野において通常用いられる賦形剤、即ち、薬剤用賦形剤や薬剤用担体等を用いて、通常使用される方法によって調製することができる。医薬組成物の製剤化にあたっては、薬学的に許容される範囲で、これら剤型に応じた賦形剤、担体、添加剤等を使用することができる。これら医薬組成物の剤型の例としては、例えば、注射剤、点滴用剤等の非経口剤が挙げられる。１つの実施形態において、本発明の医薬組成物は、本開示の上記細胞の凍結物を含み得る。１つの実施形態において、本発明の医薬組成物は、本開示の上記細胞の凍結物及び凍結保護剤を含み得る。１つの実施形態において、本発明の医薬組成物は、本開示の上記細胞の懸濁液を含み得る。１つの実施形態において、本発明の医薬組成物は、本開示の上記細胞の懸濁液及び凍結保護剤を含み得る。本発明はまた、がんの処置に用いるための医薬組成物を製造するための本開示の上記細胞の使用であって、該細胞は、ＣＤ１ｄ及び抗原（例えば、抗原ペプチド）を発現し、該細胞の表面にＣＤ１ｄリガンドを積載している、使用を提供する。１つの実施形態において、ＣＤ１ｄリガンドは、α－ＧａｌＣｅｒである。本発明はまた、がんを処置するための本発明の本開示の上記細胞であって、ＣＤ１ｄ及び抗原（例えば、抗原ペプチド）を発現し、該細胞の表面にＣＤ１ｄリガンドを積載している、細胞を提供する。１つの実施形態において、ＣＤ１ｄリガンドは、α－ＧａｌＣｅｒである。
　本開示はまた、本開示の上記細胞を対象に投与する工程を含む、がんを処置する方法を提供する。当該方法において、本開示の上記細胞は、ＣＤ１ｄ及び抗原（例えば、抗原ペプチド）又はその断片を発現し、該細胞の表面にＣＤ１ｄリガンドを積載している。１つの実施形態において、ＣＤ１ｄリガンドは、α－ＧａｌＣｅｒである。本明細書において、「対象」とは、哺乳動物（例えば、ヒト、サル、マウス、ラット、イヌ、チンパンジー等）であり、１つの実施形態において、対象はヒトである。本明細書において、「処置」とは、治療的処置及び予防的処置を含む意味で用いられる。本開示の上記細胞を対象へ投与する場合、本開示の上記細胞及び薬学的に許容される賦形剤を含む医薬組成物の形態で対象に投与することができる。対象への本開示の上記細胞の投与量及び投与回数は、がんの種類、位置、重症度、処置を受ける対象の年齢、体重及び状態などに応じて適宜調節できる。本開示の上記細胞の投与量は、例えば、対象への一回の投与において１×１０3ｃｅｌｌｓ／ｋｇ～１×１０9ｃｅｌｌｓ／ｋｇを用いることができる。対象への本開示の上記細胞の投与方法としては、例えば、静脈内、腫瘍内、皮内、皮下、筋肉内、腹腔内、又は動脈内等への注射又は点滴により投与することができる。本発明の処置方法は、他のがん治療方法と併用して用いることができる。他のがん治療方法としては、手術、放射線治療、造血幹細胞移植、又は、他の抗がん剤による治療が挙げられる。
　本開示の処置の対象となるがんとしては、特に限定はされないが、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、ホジキンリンパ腫、ノンホジキンリンパ腫、Ｂ細胞リンパ腫、多発性骨髄腫、Ｔ細胞リンパ腫等の血液がん、骨髄異形成症候群、腺がん、扁平上皮がん、腺扁平上皮がん、未分化がん、大細胞がん、非小細胞肺がん、小細胞肺がん、中皮腫、皮膚がん、乳がん、前立腺がん、膀胱がん、膣がん、頸部がん、頭頸部がん、子宮がん、子宮頸がん、肝臓がん、胆のうがん、胆管がん、腎臓がん、膵臓がん、肺がん、結腸がん、大腸がん、直腸がん、小腸がん、胃がん、食道がん、精巣がん、卵巣がん、脳腫瘍等の固形がん、及び骨組織、軟骨組織、脂肪組織、筋組織、血管組織及び造血組織のがんの他、軟骨肉腫、ユーイング肉腫、悪性血管内皮腫、悪性シュワン腫、骨肉腫、軟部組織肉腫などの肉腫や、肝芽腫、髄芽腫、腎芽腫、神経芽腫、膵芽腫、胸膜肺芽腫、及び網膜芽腫などの芽腫等が挙げられる。１つの実施形態において、本発明の処置の対象となるがんは、ＮＹ－ＥＳＯ－１陽性のがんである。
　本開示の医薬組成物は、治療、例えば、他の医薬組成物と併用することができる。例えば、がんを処置するために、本開示の医薬組成物は、がんを処置することに用いるための他の医薬組成物と併用できる。そのような他の医薬組成物としては、抗がん剤、免疫チェックポイント阻害剤、がん免疫療法剤（例えば、T細胞、キメラ抗原受容体発現免疫細胞（T細胞、NK細胞等）など）が挙げられる。１つの実施形態において、対象に投与される免疫チェックポイント阻害剤はＰＤ－１系免疫チェックポイント阻害剤又はＣＴＬＡ－４系免疫チェックポイント阻害剤である。１つの実施形態において、対象に投与される免疫チェックポイント阻害剤はＰＤ－１系免疫チェックポイント阻害剤である。１つの実施形態において、対象に投与される免疫チェックポイント阻害剤は抗ＰＤ－１抗体、抗ＰＤ－Ｌ１抗体、又は抗ＰＤ－Ｌ２抗体である。１つの実施形態において、対象に投与される免疫チェックポイント阻害剤はニボルマブ、ペムプロリズマブ、アベルマブ、アテゾリズマブ、又はデュルバルマブである。１つの実施形態において、対象に投与される免疫チェックポイント阻害剤はニボルマブ又はペムプロリズマブである。１つの実施形態において、本発明のａＡＶＣ－ＮＹ－ＥＳＯ－１細胞と併用される免疫チェックポイント阻害剤はペムプロリズマブである。また別の実施形態において、本発明のａＡＶＣ－ＮＹ－ＥＳＯ－１細胞と併用され得る免疫チェックポイント阻害剤はＣＴＬＡ－４系免疫チェックポイント阻害剤である。１つの実施形態において、対象に投与される免疫チェックポイント阻害剤は抗ＣＴＬＡ－４抗体、抗ＣＤ８０抗体、又は抗ＣＤ８６抗体である。１つの実施形態において、対象に投与される免疫チェックポイント阻害剤はイピリムマブ又はトレメリムマブである。１つの実施形態において、対象に投与される免疫チェックポイント阻害剤はニボルマブ又はペムプロリズマブである。１つの実施形態において、対象に投与される免疫チェックポイント阻害剤はイピリムマブである。免疫チェックポイント阻害剤は、本開示の医薬組成物と、同時に、逐次的に、連続的に、又は重複的に投与され得る。
実施例１：哺乳動物細胞への抗原の導入
　本実施例では、抗原をペプチドとし、抗原ペプチドをコードする核酸の細胞への導入条件の抗原ペプチド発現量への影響を試験した。抗原ペプチドとしては、モデル抗原分子であるオボアルブミン（ＯＶＡ）を用いた。本実施例では、ＯＶＡをコードする核酸（10μg；ＯＶＡ mＲＮＡ（OZ Biosciences社））をヒト胎児腎臓細胞由来のHEK293sf細胞（5×106細胞）にエレクトロポレーション法（500V、30ms）によりトランスフェクションし、6時間後に細胞を回収して細胞溶解物を得てＯＶＡのタンパク質量を測定した。トランスフェクション時の培地として以下の4通りを試した：1) OPTI-MEM phenol red free； 2) OTPI-MEM phenol red +； 3) AIM-V（無血清培地）； 4) R10 (RMPI containing 10%ウシ胎児血清（FCS）)。AIM-Vは、ダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）とF12培地の混合培地である。AIM-Vは、精製ヒトアルブミン、ヒトトランスフェリン、ヒトインスリン、コレステロール、Ｌ－グルタミン、および抗生物質（ゲンタマイシン硫酸塩）を含む。
　結果は図1に示される通りであった。図1に示されるように、血清非存在下（すなわち条件1)～3)）では細胞による抗原タンパク質発現量が良好であったが、FCS存在下では細胞による抗原タンパク質の発現が弱いと認められた。これまではＣＤ１ｄリガンド（特にα-ガラクトシルセラミド（α－ＧａｌＣｅｒ）の細胞へのロードはFCS含有R10培地中で行われており、それでも効果が認められていたが、トランスフェクション条件、並びにＣＤ１ｄリガンドのロード時期及び条件は再考の余地がある。なお、フェノールレッドの有無では特に影響は認められなかった。上記実験結果に基づいて、以後、条件1)を用いることとした。
　上記細胞の表面上及び細胞内におけるＣＤ１ｄの発現を抗ＣＤ１ｄ抗体（anti-human CD1d (clone 51.1 #350308; Biolegend)）及びフローサイトメトリ（LSRFortessa X-20, BD）を用いて常法により測定した。結果は図2に示される通りであった。図2では、Isoはアイソタイプ抗体を用いた陰性対照を示し、グレーで塗られたピークにより発現量が示され、ＣＤ１ｄは赤い線によるピークにより発現量が示された。図2に示されるように、上記細胞では細胞表面上及び細胞内ではＣＤ１ｄの発現は認められない。この結果は従来の結果と一貫しており、特に293細胞ではＣＤ１ｄの発現が認められない。
実施例2：ＮＫＴ細胞活性化
　条件1)で細胞に遺伝子導入をし、かつα－ＧａｌＣｅｒのロードを実施した。細胞は、HEK293sf細胞とし、ヒトＣＤ１ｄをコードするmＲＮＡ（5μg）及びＯＶＡをコードするmＲＮＡ（10μg）をHEK293sf細胞（5×106細胞）にエレクトロポレーション法（500V、30ms）によりトランスフェクションした。その後、ＣＤ１ｄリガンドとしてα－ＧａｌＣｅｒを500ng/mLの終濃度で培地（AIM-Vであり、以下同様。）に添加し、又は添加せずに、6時間培養した。細胞を回収し、1×104細胞ずつ96穴プレートに播種してヒトＮＫＴ細胞株（1×105細胞）を加えて24時間共培養した。上清を回収し、IFN-γ濃度をELISAにより測定した。実験スキームは図３Ａに示される通りであった。
　結果は図4に示される通りであった。図3Bに示されるように、IFN-γの産生はエレクトロポレーション有り、かつα－ＧａｌＣｅｒのロードありの実験でのみ強く観察された。ＮＫＴ細胞の活性化（IFN-γの産生）にはＣＤ１ｄへのリガンドのロードが必須であることが理解できる。
実施例3：ＣＤ１ｄリガンドによる前培養の効果
　エレクトロポレーションの48時間前、6時間前、又は2時間前にＣＤ１ｄ陰性のHEK293sf細胞をＣＤ１ｄリガンド（500ng/mLのα－ＧａｌＣｅｒ）存在下で前培養し、その後、ＣＤ１ｄリガンド非存在下で、ヒトＣＤ１ｄをコードするmＲＮＡ（5μg）及びＯＶＡをコードするmＲＮＡ（10μg）をHEK293sf細胞（5×106細胞）にエレクトロポレーション法（500V、30ms）によりトランスフェクションした。6時間培養し、1×104細胞ずつ96穴プレートに播種してヒトＮＫＴ細胞株（1×105細胞）を加えて24時間共培養した。上清を回収し、IFN-γ濃度をELISAにより測定した。実験スキームは図4Aに示される通りであった。
　結果は図4Bに示される通りであった。図4Bに示されるように、ＮＫＴ細胞からのIFN-γの産生量は、ＣＤ１ｄ陰性のHEK293sf細胞のＣＤ１ｄリガンド存在下での前培養時間に依存するように増加した。すなわち、ＣＤ１ｄ陰性のHEK293sf細胞のＣＤ１ｄリガンド存在下での前培養は、ＮＫＴ細胞の活性化を促進した。ＣＤ１ｄを発現しない場合にはＣＤ１ｄとのインキュベートはＮＫＴ細胞の活性化を促進しないことは図3B（ＥＰ(-)かつGal(+)）から明らかである。したがって、陰性のHEK293sf細胞のＣＤ１ｄリガンド存在下での前培養が、ＮＫＴ細胞の活性化に影響することは予想外であった。
　また、ＣＤ１ｄ陰性のHEK293sf細胞のＣＤ１ｄリガンド存在下での48時間にわたる前培養は、ＣＤ１ｄ遺伝子導入後のＣＤ１ｄリガンド存在下での培養よりも、ａＡＶＣにより高いＮＫＴ細胞活性可能を与えることが示唆されている（図3B及び4B参照）。
実施例4：ＣＤ１ｄリガンド存在下における、前培養とトランスフェクション後の培養の効果
　図5Aでは、ＣＤ１ｄリガンド（500ng/mL）存在下におけるHEK293sf細胞の前培養、エレクトロポレーション（ＥＰ）によるヒトＣＤ１ｄをコードするmＲＮＡ（5μg）及びＯＶＡをコードするmＲＮＡ（10μg）の導入、その後のＣＤ１ｄリガンド（500ng/mL）存在下におけるHEK293sf細胞の更なる培養、播種後のＮＫＴ細胞との共培養を実施した。
　結果は図5Bに示される通りであった。図5Bに示されるように、ＣＤ１ｄリガンド（500ng/mL）存在下におけるHEK293sf細胞の前培養とＥＰ後のＣＤ１ｄリガンド（500ng/mL）存在下におけるHEK293sf細胞の更なる培養は、図3B及び4Bと比較しても、ＮＫＴ細胞を非常に強く活性化した。このことから、ＣＤ１ｄリガンド（500ng/mL）存在下におけるHEK293sf細胞の前培養とＥＰ後のＣＤ１ｄリガンド（500ng/mL）存在下におけるHEK293sf細胞の更なる培養は、ａＡＶＣの製造において重要である。
実施例5：遺伝子発現
　上記実施例2～4におけるそれぞれの条件（ＮＫＴ細胞との共培養まで）においてhＣＤ１ｄのタンパク質発現をフローサイトメトリで、ＯＶＡのタンパク質発現をELISAで測定し、比較した（図6A参照）。結果は図6Bに示されるように、いずれの条件でもhＣＤ１ｄ及びＯＶＡの発現に有意な差は認められなかった。このことは、実施例3～4におけるＮＫＴ細胞の活性化が、hＣＤ１ｄの発現量の差によるものではなく、hＣＤ１ｄに結合するＣＤ１ｄリガンドの量（言い換えるとＣＤ１ｄリガンドと複合体を形成しているhＣＤ１ｄの量）によるものであることを示唆する。
実施例6：ＣＤ１ｄ／ＣＤ１ｄリガンド複合体の検出
　ＣＤ１ｄ非発現細胞に対するＣＤ１ｄリガンドによる前処理が、ＣＤ１ｄ／ＣＤ１ｄリガンド複合体量に与える影響を調べた。
　具体的には、図７Ａに記載されるようにＣＤ１ｄリガンド（Ｇａｌ）による前処理の有無、およびエレクトロポレーション法（ＥＰ）によるＣＤ１ｄ遺伝子導入の有無が、ＣＤ１ｄ／ＣＤ１ｄリガンド複合体量に与える影響を調べた。図７Ａでは、塗られた矢印はＣＤ１ｄリガンド存在下での処理がなされたことを意味し、点線の矢印はＣＤ１ｄリガンド非存在下での処理がなされたことを意味する。ＣＤ１ｄ非発現細胞に対するＣＤ１ｄリガンドによる前処理は、エレクトロポレーションの48時間前、6時間前、又は2時間前にＣＤ１ｄ陰性のHEK293sf細胞をＣＤ１ｄリガンド（500ng/mLのα－ＧａｌＣｅｒ）存在下で前培養することにより実施した。エレクトロポレーション法（ＥＰ）は、ＣＤ１ｄリガンド非存在下で、ヒトＣＤ１ｄをコードするｍＲＮＡ（5μg）及びＯＶＡをコードするｍＲＮＡ（10μg）をHEK293sf細胞（5×106細胞）にエレクトロポレーション法（500V、30ms）により実施した。4時間または24時間培養して細胞を回収した。
　抗ｍＣＤ１ｄ／αＧａｌＣｅｒ複合体抗体(clone L363, # 12-2019-82; e-Bioscience）を用いたフローサイトメトリを用いて常法により細胞表面上および細胞内のＣＤ１ｄ／ＣＤ１ｄリガンド複合体の発現量を確認した。細胞内の複合体の染色はBDのCytofix/Cytoperm Fixation /Permeabilization Kit (#554714)を用いて行った。具体的にはFixation/Permeabilization solutionで細胞に穴をあけ、Perm/Wash buffer存在下でanti-mCD1d/GalCer complex Ab またはanti-mouse CD1d Abを加え、氷上でのインキュベート後に洗浄して抗体結合量を測定した。ＣＤ１ｄの発現は、抗ｍＣＤ１ｄ抗体（anti-mouse CD1d (clone 1B1 #553846 BD)）を用いたフローサイトメトリにより確認した。
　結果は、図７Ｂ及び７Ｃに示される通りであった。図７Ｃに示されるように、条件２及び３においてＣＤ１ｄの細胞表面発現が確認された。これに対して、図７Ｂに示されるように、ＣＤ１ｄリガンドでの前処理は、細胞表面上でのＣＤ１ｄ／ＣＤ１ｄリガンド複合体を大きく増加させた（図７Ｂ条件２参照）。この複合体の増大は、フローサイトメトリによってアイソタイプ抗体による測定値に対する有意な差として検出されたことは着目に値する。４時間後と２４時間後を比較すると、２４時間後において細胞表面の複合体発現が上昇している点については、ＣＤ１ｄリガンド前処理によって細胞内に蓄積されたＣＤ１ｄリガンドとエレクトロポレーション後に細胞内で生成されたＣＤ１ｄ分子が複合体を形成され、細胞表面に発現するも、すぐに分解されることなくリサイクリングされるため細胞表面上に蓄積するものと考えられた。対照的に、図７Ｂ条件３のようにＣＤ１ｄが発現してもＣＤ１ｄリガンドの処理がない場合は、細胞内、及び細胞表面いずれにもＣＤ１ｄ／ＣＤ１ｄリガンド複合体は検出されない（図７Ｂ条件３、及び図８Ａ～８Ｃ参照；図８では条件２～４は陰性対照である）。またエレクトロポレーションによる遺伝子導入をしない条件１では、細胞表面上でのＣＤ１ｄ発現も前記複合体発現も認められない（図７Ｂ及び７Ｃ条件１参照）。図８Ａ～Ｃの条件１のようにＣＤ１ｄｍＲＮＡエレクトロポレーション後にＣＤ１ｄリガンドを添加した場合はＣＤ１ｄの発現および複合体の発現も両方認められるが、図７条件１、及び３と同様にどちらか、あるいは両方が欠けた場合の図８条件２，３，及び４では複合体の発現は検出限界未満であった。よって抗体による複合体形成の検出については特異性が確認できた。図８Ａの条件１）は、ＥＰ後にのみＣＤ１ｄリガンドをパルスする条件である。図９Ｂと比較すると、細胞内におけるＣＤ１ｄ／ＣＤ１ｄリガンド複合体量が顕著に異なる。このことは、細胞外のみならず細胞内における上記複合体量がＮＫＴ細胞の活性化に寄与している可能性を示唆する。遺伝子導入後の培養期間が短い場合に特に、遺伝子導入前のＣＤ１ｄリガンドによる長い時間（例えば４８時間）のパルスが有効であると考えられる。図７Ｂによれば、細胞内複合体量の増大は、ＣＤ１ｄ分子の発現量に依存していると考えられた。一般的な傾向として、遺伝子導入前のＣＤ１ｄリガンドによるパルスの時間を長くすることは有効であると考えられる（図４Ｂ参照）が、図９Ｂによると、遺伝子導入後の培養期間が短い場合には特に、遺伝子導入前のＣＤ１ｄリガンドによるパルスの時間を長くすることが有効であることが示唆された。また、図８Ｂによると、遺伝子導入後のみのＣＤ１ｄリガンドパルスでは、細胞表面上のＣＤ１ｄ／ＣＤ１ｄリガンド複合体の量が、細胞内のＣＤ１ｄ／ＣＤ１ｄリガンド複合体の量と同じか、それよりも多かったが、遺伝子導入前の十分な時間のＣＤ１ｄリガンドパルスは、細胞表面上のＣＤ１ｄ／ＣＤ１ｄリガンド複合体の量に対する細胞内のＣＤ１ｄ／ＣＤ１ｄリガンド複合体の量を顕著に増加させた（図７Ｂ、図９Ｂ、及び図１０Ｂ参照）。このように遺伝子導入前のＣＤ１ｄリガンドでのパルスは明らかに細胞内のＣＤ１ｄリガンド複合体の量を増大させる。細胞表面上複合体量よりも多い細胞内複合体量を含む細胞（例えばａＡＶＣ）はこれまでに知られていない。ＣＤ１ｄリガンドが細胞内に浸透するのに時間がかかる可能性が示唆される。
　上記と同じ条件で前処理時間が細胞表面上でのＣＤ１ｄ／ＣＤ１ｄリガンド複合体量に与える影響をさらに評価した。図９Ａに示されるように、エレクトロポレーション法による遺伝子導入（ＥＰ）の前にＣＤ１ｄリガンド存在下での前処理の時間を２時間、６時間、または４８時間とし、その後、ＥＰを行って、さらにＣＤ１ｄリガンド存在下または非存在下で６時間培養して細胞を回収した。前処理、ＥＰ、およびＥＰ後の培養の条件は上記と同じである。
　結果は図９Ｂ及び９Ｃに示されるように、条件１～４のいずれでも同量のＣＤ１ｄの発現が認められる（図９Ｃ参照）のとは対照的に、細胞表面上（Ｓｕｒｆａｃｅ）でのＣＤ１ｄ／ＣＤ１ｄリガンド複合体量は前処理時間が長くなるほど増加し（図９Ｂ条件２～４参照）、ＥＰ後にＣＤ１ｄリガンド存在下でさらに培養すると複合体量がさらに増加した（図９Ｂ条件１及び２参照）。このように、細胞をＣＤ１ｄリガンドにより前処理することで新規に発現するＣＤ１ｄへのリガンドのロードが効率化され、細胞表面上での複合体量が向上すると考えられた。なお、図９Ｂに示されるように細胞内（Ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ）の複合体発現量も、ＣＤ１ｄリガンドでの前処理時間に応じて増加することが示されている。細胞内ＣＤ１ｄリガンド量は、このことからＣＤ１ｄリガンドを取り込んだ細胞にＣＤ１ｄを発現させることにより、細胞表面及び細胞内複合体量が増大することが示された。前処理での複合体発現量の増大効果の顕著さを考慮すると、ＣＤ１ｄリガンドは細胞内に取り込まれ、細胞内でＣＤ１ｄとＣＤ１ｄリガンドが複合体を形成することができること、およびこの細胞内で形成される複合体がａＡＶＣの免疫賦活能に大きく寄与すると考えられた。細胞内のＣＤ１ｄ／ＣＤ１ｄリガンド複合体は、細胞表面にリサイクリングすることが知られ、細胞質は、複合体のリザーバーとしての機能を果たし得る。特に細胞内における長期にわたる複合体の存在は、細胞表面への複合体の長期にわたる提示と関連し得る。また、細胞内のＣＤ１ｄ／ＣＤ１ｄリガンド複合体自体もＮＫＴ細胞を活性化させると考えられる。そのため、細胞内のＣＤ１ｄ／ＣＤ１ｄリガンド複合体の増加及びその長期の維持は、ＮＫＴ細胞の活性化に有利に寄与することが示唆される。なお、図９Ａ条件３及び４でも特異的なＮＫＴ細胞応答を誘導できる（図４Ｂ参照）が、おそらく複合体形成量が微量であるために、フローサイトメトリでは明らかな複合体の形成を示すシグナルを得ることはできなかった（ＮＫＴ細胞を活性化させており、活性化に十分な程度に複合体は形成していると考えられる）。したがって、フローサイトメトリで複合体が検出感度以下であることは、複合体を形成しないことを意味するものではなく、抗原特異的なＮＫＴ細胞応答の誘導ができないことを意味するものでもない。
　さらに、前処理を４８時間とし、エレクトロポレーションによる遺伝子導入を行った後に、ＣＤ１ｄリガンド非存在下で１６時間、２４時間、４８時間、７２時間または９６時間培養して細胞を回収した（図１０Ａ参照）。前処理、エレクトロポレーションによる遺伝子導入（ＥＰ）、およびその後の培養は上記と同じ条件で実施した。
　結果は、図１０Ｂ及び１０Ｃに示される通りであった。図１０Ｂに示されるように、ＣＤ１ｄ／ＣＤ１ｄリガンド複合体は、ＥＰ後の培養時間が１６～４８時間のときに、細胞表面及び細胞内で最も高く、ＥＰ後の培養時間が７２時間を超えると減少する傾向を示した。なお、図１０Ｃに示されるように条件１～５のいずれでも細胞表面及び細胞内でｍＣＤ１ｄの発現が確認されたが、細胞表面上でのｍＣＤ１ｄの発現はＥＰ後の培養時間が７２時間を超えると減少する傾向を示し、この減少傾向は複合体の発現と関連していると考えられた。目的とする標的抗原ｍＲＮＡ、例えばがん抗原ｍＲＮＡの遺伝子導入後、６～１６時間の間にｍＲＮＡからの抗原蛋白発現量が最も高くなる場合が多い。標的抗原蛋白の発現量を優先する場合ＥＰ後にＣＤ１ｄリガンドでパルスできる時間は最大１６時間に限定される。しかしながら、この場合に、ＥＰ後にのみリガンドをパルスする条件では、遺伝子導入１６時間後の複合体の発現は限定的であった。対照的に、本開示によれば、ＥＰより前にＣＤ１ｄリガンドを細胞にパルスすることにより、予めＣＤ１ｄリガンドを細胞に取り込ませることでＥＰ後１６時間の培養後の複合体量を細胞表面上及び細胞内において顕著に増大させ得る。また、今回の結果によると、ＮＫＴ細胞の活性化に寄与すると考えられる細胞内複合体量が９６時間でも維持された（図１０Ｂ参照）。ｍＲＮＡ導入９６時間後にも複合体が細胞内で観察されたのは導入前のＣＤ１ｄパルスで得られた今回の細胞が初めてであり、従来はｍＲＮＡ導入９６時間後には細胞内の複合体は検出限界未満であった。導入前のＣＤ１ｄパルスで得られた今回の細胞は、投与後にも細胞内で長時間にわたって複合体を発現し続ける可能性があり、ａＡＶＣとしての更なる有用性を示唆する。
　以上の結果から、ＣＤ１ｄの遺伝子導入の前及び／又は後の細胞のＣＤ１ｄリガンドによるインキュベートがａＡＶＣのＮＫＴ活性化能を向上させることが示された。

Claims (12)

  1. 　細胞を含む組成物であって、
    　前記細胞は、ヒトに由来する細胞であり、細胞表面上及び細胞内にそれぞれＣＤ１ｄとＣＤ１ｄリガンドとの複合体を発現し、細胞内の前記複合体の量が、細胞表面上の前記複合体の量よりも有意に多い、組成物。
  2. 　細胞を含む組成物であって、
    　前記細胞は、ヒトに由来する細胞であり、ＣＤ１ｄの導入又は発現誘導の前にＣＤ１ｄリガンド存在下でプレインキュベートされており、その後、ＣＤ１ｄの導入又は発現誘導がなされ、ＣＤ１ｄタンパク質を発現する、組成物。
  3. 　ＣＤ１ｄの導入又は発現誘導の後に、前記細胞がＣＤ１ｄリガンド存在下でさらにインキュベート（ポストインキュベート）されている、請求項２に記載の組成物。
  4. 　請求項２又は３に記載の組成物であって、
    　前記細胞は、対照細胞と比較して、より高いＮＫＴ細胞活性化能を有し、
    　対照細胞は、ＣＤ１ｄの導入又は発現誘導の前にＣＤ１ｄリガンド存在下でのプレインキュベートをなされておらず、ＣＤ１ｄの導入又は発現誘導がなされ、その後に前記細胞がＣＤ１ｄリガンド存在下でポストインキュベートされた細胞であり、ここで、ＣＤ１ｄリガンドとのインキュベートがプレインキュベートかポストインキュベートか以外の条件は組成物中の細胞と対照細胞とで同じである、組成物。
  5. 　前記細胞が、ＣＤ１ｄの導入又は発現誘導の前には、ＣＤ１ｄ陰性である、請求項２～４のいずれか一項に記載の組成物。
  6. 　前記細胞が、抗原を発現している、請求項１～５のいずれか一項に記載の組成物。
  7. 　ＮＫＴ細胞活性化能を有する細胞を含む組成物を製造する方法であって、
    　ヒトに由来する細胞をＣＤ１ｄリガンド存在下でインキュベート（プレインキュベート）することと、
    　前記細胞にＣＤ１ｄを導入又はＣＤ１ｄを発現誘導させることと、
    　得られた細胞をＣＤ１ｄリガンド存在下又は非存在下でインキュベート（ポストインキュベート）することを含み、
    　これにより、ＣＤ１ｄタンパク質を発現し、ＮＫＴ細胞活性可能を有する細胞を得る、方法。
  8. 　前記ポストインキュベートが、ＣＤ１ｄリガンド非存在下で行われる、請求項７に記載の方法。
  9. 　前記ポストインキュベートが、ＣＤ１ｄリガンド存在下で行われる、請求項７に記載の方法。
  10. 　前記細胞が、ＣＤ１ｄの導入又は発現誘導の前には、ＣＤ１ｄ陰性である、請求項７～９のいずれか一項に記載の方法。
  11. 　前記細胞が、抗原を含む、請求項７～１０のいずれか一項に記載の方法。
  12. 　前記細胞に抗原を発現させることをさらに含む、請求項１１に記載の方法。
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