WO2025211477A1 - 유전자 마커를 이용한 설폰요소제 의존성 예측용 조성물 및 그 예측 방법 - Google Patents

유전자 마커를 이용한 설폰요소제 의존성 예측용 조성물 및 그 예측 방법

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    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material

Definitions

  • the present invention relates to a composition for predicting sulfonylurea dependence and a method for predicting sulfonylurea dependence.
  • Sulfonylureas are among the most potent hypoglycemic agents with a long history. However, compared to other classes of drugs, they carry a higher risk of hypoglycemia. Furthermore, with the development of other oral hypoglycemic agents with proven cardiovascular protective effects, their overall prescription priority has declined. However, a significant reliance on sulfonylureas for glycemic control has been identified in some patient populations, suggesting a need for preferential treatment with sulfonylureas in these specific patients. However, no clinical characteristics or markers are known to predict this preference.
  • the present invention seeks to discover a gene that determines sulfonylurea dependence and provide a composition for predicting sulfonylurea dependence.
  • the present invention seeks to provide a method for providing information for predicting sulfonylurea dependence.
  • rs777077261 (C>A) of KCNB2 (Potassium Voltage-Gated Channel Subfamily B Member 2); rs202112906(C>T) of GHSR (Growth hormone secretagogue receptor); rs28944173 (T>C) of NOS2 (Nitric oxide synthase 2); rs3792268 (C>A) in CAPN10 (Calpain 10); rs199670165 (C>A), rs17848945 (C>T), rs755372392 (G>A), rs200840955 (G>A), rs200842352 (C>A), or rs45489599 (C>T) of Fatty acid synthase ( FASN ); A composition for predicting sulfonylurea dependence in a diabetic patient, comprising a preparation that identifies mutations of rs185358392 (G>A), rs769120237 (G>
  • a method for providing information for predicting sulfonylurea dependence in diabetic patients wherein in the above 3, the confirmation is performed by adding a primer or probe that specifically binds to at least one of the genes and confirming the sequence thereof.
  • the present invention relates to genes such as KCNB2, GHSR , NOS2 , CAPN10 , FASN , KCNH6, DIS3L2 , and NR0B2. It can be used as a marker to predict whether a diabetic patient is highly effective in lowering blood sugar levels with sulfonylureas and to provide information for this purpose.
  • Figure 1 is a schematic diagram of a method for deriving a sulfonylurea-dependent associated mutation of the present invention using a retrospective method.
  • DM diabetes mellitus
  • FPG fasting plasma glucose
  • MAF minor allele frequency
  • SNV single nucleotide variant
  • SU sulfonylurea
  • WES whole exome sequencing
  • Figure 2 shows the blood concentration of HbA1c (glycated hemoglobin) or FPG (fasting plasma glucose) after discontinuation of sulfonylurea administration in a retrospective study of the present invention.
  • HbA1c glycated hemoglobin
  • FPG fasting plasma glucose
  • FPG fasting plasma glucose
  • peak highest measures within 6 months after SU discontinuation
  • SU sulfonylurea
  • Figure 3 is a schematic diagram of a method for prospectively verifying candidate mutations derived from a retrospective study of the present invention.
  • FPG fasting plasma glucose
  • SU sulfonylurea
  • WES whole exome sequencing
  • Figure 4 shows the blood concentration of HbA1c (glycated hemoglobin) or FPG (fasting plasma glucose) after discontinuation of sulfonylurea administration in a prospective study of the present invention.
  • FPG fasting plasma glucose
  • peak highest measures within 20 weeks after SU discontinuation
  • SU sulfonylurea
  • Figure 5 is a schematic diagram of a method for extracting UK Biobank registrants to verify mutations in the derived genes of the present invention in a large population.
  • eGFR estimated glomerular filtration calculated by the CKD-EPI method
  • SU sulfonylurea
  • Figure 6 is a schematic diagram of a method for extracting variants from a public genetic database to verify the candidate genes of the present invention in a large-scale population group, UK Biobank.
  • Figure 7 summarizes the literature supporting the hypothesis that loss-of-function mutations in NR0B2 regulate the SU response in insulin-secreting cells through the transcription factors HNF1A and HNF4A.
  • References include: EMBO J. 1998; 17(22): 6701; Diabetes. 2022; 71(4): 862; Cell Death Dis. 2022; 13(1): 89; Proc Natl Acad Sci US A. 2001; 98(2): 575; Diabetes. 2013; 62(11): 3909.
  • GSIS glucose-stimulated insulin secretion
  • HNF hepatocyte nuclear factor
  • NR0B2 Nuclear Receptor Subfamily 0 Group B Member 2
  • SU sulfonylureas
  • the sulfonylurea dependence refers to the degree to which a diabetic patient must take only a sulfonylurea or take a sulfonylurea preferentially over other drugs to lower blood sugar levels. That is, when taking a conventionally known hypoglycemic agent other than a sulfonylurea, such as Metformin, Gliptin, or Pioglitazone, blood sugar levels do not decrease or the effect is not as expected, but when taking a sulfonylurea, the expected blood sugar level effect can be achieved. Therefore, this means that a sulfonylurea should be taken preferentially.
  • Each of the above genes may have a sequence in the predicted target.
  • the above sequences for each species are all known.
  • the diabetic patient may be included within the scope of the present invention regardless of the type of diabetes.
  • the patient may have type 2 diabetes mellitus (T2DM), but is not limited thereto.
  • T2DM type 2 diabetes mellitus
  • the method for providing information for predicting sulfonylurea dependence in diabetic patients may further include a step of obtaining genotype information of the individual by amplifying and sequencing DNA from a biological sample isolated from the individual. Any method known to those skilled in the art for DNA amplification, sequencing, and obtaining genotype information may be used without limitation.
  • SU-independent controls were selected from patients with diabetes for more than 10 years and were clinically matched to SU-dependent patients by age, sex, and antidiabetic medication. Patients were excluded from the analysis if they had impaired renal function (serum creatinine >1.4 mg/dL or estimated glomerular filtration rate [eGFR] ⁇ 50 mL/min/1.73 m2), clinically significant liver disease, were taking medications that could affect glycemic control, such as glucocorticoids, or developed serious medical problems during the change in SU use.
  • eGFR is estimated glomerular filtration rate
  • SU is sulfonylurea
  • T2DM is type 2 diabetes mellitus.
  • SNVs single nucleotide variants
  • EAS East Asians
  • Example 4 Validation of SU drug effects according to candidate gene mutations in a large population.
  • the UK Biobank is a community cohort of approximately 500,000 adults enrolled between 2006 and 2010 (Nucleic acids research 47.D1 (2019): D1005-D1012). Of these, 23,104 patients were coded as having type 2 diabetes. To exclude type 1 diabetes or youth-onset diabetes with an atypical course, we excluded patients with an age of onset ⁇ 30 years. A total of 1,991 patients were excluded, including those with missing genetic information. In addition, 1,213 patients with diabetes and renal dysfunction (GFR ⁇ 40 ml/min/1.73 m 2 ), which significantly affects drug metabolism, were excluded. Finally, 19,900 patients were included in the analysis (Figure 5), and their clinical characteristics are shown in Table 5.
  • BMI body mass index
  • eGFR estimated glomerular filtration rate
  • the candidate mutation derivation process selected mutations specific to East Asians. Therefore, among the 19,900 individuals in the UK Biobank, which is primarily Caucasian, only 148 individuals harbored the 28 candidate mutations in Table 4. Furthermore, we anticipated that there would be mutations that were not yet selected in the candidate mutation derivation targeting a small number of Korean patients. Therefore, we added mutations predicted to affect protein function from the 10 genes in Table 4 from the publicly available SNV database dbNSFP (Genome Medicine. (2020) 12:103).
  • the criteria for selecting additional variants were as follows: 1) if the variant frequency (global allele frequency) is less than 5% and the in silico prediction using Polyphen or SIFT predicts a change in protein function, 2) for the gene FASN : a variant with a frequency of less than 5% in a specific domain (PF00975, PF08659, PF08242: Pfam), and 3) for the gene KCNH6 : a variant with a frequency of less than 5% in a specific domain (PF00027, PF00520: Pfam).
  • pLoF (predicted loss of function) variants were selected using the gnomAD browser, which include not only coding region SNVs but also multiple nucleotide variants in nearby locations, causing the following changes: transcript_ablation, splice_acceptor_variant, splice_donor_variant, stop_gained, and frameshift_variant (Fig. 6).
  • HbA1c and drug use according to the presence of selected variants in 10 candidate genes ( CAPN10 , DIS3L2 , FASN , GHSR , GIPR , KCNB2 , KCNH6 , NOS2 , NR0B2 , THADA )
  • BMI body mass index
  • eGFR estimated glomerular filtration rate
  • MTF metformin
  • SU sulfonylurea
  • PSM propensity score matching
  • the study group which had at least one selected mutation in one of the seven genes, consisted of 4,857 subjects, and their clinical characteristics are shown in Table 16. Compared to the control group, the subjects were older, had lower age at diagnosis, had lower renal function, had fewer males, and had poorer glycemic control.
  • BMI body mass index
  • eGFR estimated glomerular filtration rate
  • HbA1c glycemic control
  • MTF metformin
  • SU sulfonylurea
  • the prescription rate of SU increases in patients with a longer disease duration, and it can be inferred that as the disease duration increases, feedback on drug effects is reflected, and the prescription pattern is tailored to genetic susceptibility. Therefore, if mutation carriers have a good glycemic response to SU, as the disease duration increases, the rate of SU use will increase, leading to improved glycemic control and a significant reduction in insulin use. When limited to patients with a disease duration of 72 months or longer, there were 1,673 mutation carriers, and the rate of SU use was over 40% (Table 8).
  • the mutation carriers respond well to SU and have good blood sugar control, but also the insulin prescription progressed slowly, and the significant hyperglycemia observed in the early stage of diabetes (duration of disease less than 72 months) disappeared.
  • HbA1c Characteristics of HbA1c and drug use according to the presence of selected variants in seven candidate genes ( THADA, GIPR, KCNH6, KCNB2, DIS3L2, GHSR, NR0B2 )
  • Example 4 To summarize the contents of Example 4, the characteristics of carriers of selected variants in 7 candidate genes ( THADA, GIPR, KCNH6, KCNB2, DIS3L2, GHSR, NR0B2 ) were analyzed using UK Biobank data, and they were younger and had fewer males. When other clinical factors were adjusted, it was found that metformin and sulfonylureas were used more frequently due to poor glycemic control, but insulin used when sulfonylureas failed was used less. This was more prominent in the later period when sulfonylurea use increased, and at the same time, hyperglycemia observed in the early stage of the disease disappeared. This is the corresponding This suggests that mutation carriers respond well to sulfonylureas.
  • Example 5 Validation of candidate genes: Rare mutations with a high probability of altering protein function.
  • the NR0B2 rs74315349 (G>A) mutation Due to the premature termination at the 34th amino acid position of the 207-amino acid peptide, the expression level of the NR0B2 protein is expected to be minimal.
  • the mutation was not reproduced in Example 1, where SU dependence was prospectively demonstrated, the rs150546920 (C>G) mutation was additionally observed in NR0B2 , and the in silico prediction model predicted that this mutation also has a high probability of affecting protein function (Table 4).
  • Nuclear receptor subfamily 0 group B member 2 (commonly referred to as small heterodimer partner, SHP), a protein expressed in NR0B2 , is an orphan nuclear receptor that binds to and influences various proteins. Among them, it is well known that it reacts with the transcription factors HNF1 and HNF4 to inhibit their activity. Mutations in HNF1A and HNF4A cause maturity onset diabetes of the young (MODY) (MODY-1, MODY-3), in which case the response to sulfonylureas is prominent, so SU is used as the first-line drug. In insulin-secreting cells, mutations in HNF1A and HNF4A or their suppression of expression decreases cellular glucose sensing, glycolysis, and ATP content (EMBO J.
  • variants predicted to change protein function in 7 genes were selected as candidates and analyzed with data from a large cohort, the UK Biobank, it was found that variant carriers had a low frequency of insulin use despite poor glycemic control, suggesting a good response to SU, a drug used immediately before insulin.
  • the variant carriers' poor glycemic control became similar to that of the control group, and the insulin use rate was still low (Example 4: Figs. 5, 6, Table 17).

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Abstract

본 발명은 KCNB2(Potassium Voltage-Gated Channel Subfamily B Member 2)의 rs777077261(C>A); GHSR(Growth hormone secretagogue receptor)의 rs202112906(C>T); NOS2(Nitric oxide synthase 2)의 rs28944173(T>C); CAPN10(Calpain 10)의 rs3792268(C>A); FASN(Fatty acid synthase)의 rs199670165(C>A), rs17848945(C>T), rs755372392(G>A), rs200840955(G>A), rs200842352(C>A) 또는 rs45489599(C>T); KCNH6(Potassium Voltage-Gated Channel Subfamily H Member 6)의 rs185358392(G>A), rs769120237(G>A), rs201884071(G>A) 또는 rs766766661(C>T); DIS3L2(DIS3 like 3'-5' exoribonuclease 2)의 rs14847401(G>A), rs37551700(G>A) 또는 rs774656238(A>G); 또는 NR0B2(Nuclear Receptor Subfamily 0 Group B Member 2)의 rs74315349(G>A) 또는 rs150546920(C>G) 변이;를 확인함으로써, 당뇨병 환자에 대한 설폰요소제(sulfonylurea) 의존성을 예측할 수 있는 조성물, 방법에 대한 것이다.

Description

유전자 마커를 이용한 설폰요소제 의존성 예측용 조성물 및 그 예측 방법
본 발명은 설폰요소제 의존성 예측용 조성물 및 설폰요소제 의존성 예측 방법에 관한 것이다.
당뇨병 발병에 대한 감수성 관련 마커의 연구와 비교할 때, 당뇨병 치료제 효과와 관련된 마커의 연구는 미미한 실정이다. 그리하여 당뇨병 치료제 사용에 대해 임상적 의의가 있는 유전자 마커에 대한 경쟁 기술은 존재하지 않고 의료진의 경험 및 환자의 임상적 특징에 기반한 처방이 이루어지고 있는 상황이다.
현재 임상에서 사용되는 당뇨병 치료제로는 9 가지 계열의 약제가 있고 한국을 비롯하여 미국, 유럽의 학회에서 권장하는 처방 지침이 있으나(Standards of Medical Care in Diabetes. Diabetes Care Jan 2022, 대한당뇨병학회 당뇨병 진료지침 2021), 이 지침들은 혈당 강하 효과에 대한 예측에 기반하고 있지 않으며 예측에 기여하지도 않는다.
설폰요소제(sulfonylureas)는 가장 오랜 역사를 가진 강력한 혈당강하제에 해당하나, 다른 계열 약제와 비교하여 저혈당의 위험이 높은데다가, 심혈관 보호 효능이 입증된 다른 경구 혈당강하제가 개발됨에 따라, 전반적인 처방 우선순위가 감소하였다. 그러나 일부 환자군에서 혈당 조절을 위해 설폰요소제에 크게 의존하는 경향이 있는 것이 확인되었고, 이들 특정 환자에서는 설폰요소제를 우선적으로 사용하여야 할 필요성이 있으나 이를 예측할 수 있는 임상적 특징이나 마커는 알려져 있지 않는 실정이다.
이에 당뇨병 치료를 위한 설폰요소제 의존성에 관련된 마커의 발굴 및 그를 기반으로 하는 설폰요소제에 대한 민감성 여부를 확인하기 위한 기술의 개발이 필요하다.
본 발명은 설폰요소제 의존성을 결정하는 유전자를 발굴하여, 설폰요소제 의존성 예측용 조성물을 제공하고자 한다.
본 발명은 설폰요소제 의존성을 예측하기 위한 정보 제공 방법을 제공하고자 한다.
1. KCNB2(Potassium Voltage-Gated Channel Subfamily B Member 2)의 rs777077261(C>A); GHSR(Growth hormone secretagogue receptor)의 rs202112906(C>T); NOS2(Nitric oxide synthase 2)의 rs28944173(T>C); CAPN10(Calpain 10)의 rs3792268(C>A); FASN(Fatty acid synthase)의 rs199670165(C>A), rs17848945(C>T), rs755372392(G>A), rs200840955(G>A), rs200842352(C>A) 또는 rs45489599(C>T); KCNH6(Potassium Voltage-Gated Channel Subfamily H Member 6)의 rs185358392(G>A), rs769120237(G>A), rs201884071(G>A) 또는 rs766766661(C>T); DIS3L2(DIS3 like 3'-5' exoribonuclease 2)의 rs14847401(G>A), rs37551700(G>A) 또는 rs774656238(A>G); 또는 NR0B2(Nuclear Receptor Subfamily 0 Group B Member 2)의 rs74315349(G>A) 또는 rs150546920(C>G) 변이;를 확인하는 제제를 포함하는 당뇨병 환자에 대한 설폰요소제(sulfonylurea) 의존성 예측용 조성물.
2. 위 1에 있어서, 상기 제제는 상기 유전자 중 적어도 하나에 특이적으로 결합하는 프라이머 또는 프로브인 당뇨병 환자에 대한 설폰요소제(sulfonylurea) 의존성 예측용 조성물.
3. KCNB2(Potassium Voltage-Gated Channel Subfamily B Member 2)의 rs777077261(C>A); GHSR(Growth hormone secretagogue receptor)의 rs202112906(C>T); NOS2(Nitric oxide synthase 2)의 rs28944173(T>C); CAPN10(Calpain 10)의 rs3792268(C>A); FASN(Fatty acid synthase)의 rs199670165(C>A), rs17848945(C>T), rs755372392(G>A), rs200840955(G>A), rs200842352(C>A) 또는 rs45489599(C>T); KCNH6(Potassium Voltage-Gated Channel Subfamily H Member 6)의 rs185358392(G>A), rs769120237(G>A), rs201884071(G>A) 또는 rs766766661(C>T); DIS3L2(DIS3 like 3'-5' exoribonuclease 2)의 rs14847401(G>A), rs37551700(G>A) 또는 rs774656238(A>G); 또는 NR0B2(Nuclear Receptor Subfamily 0 Group B Member 2)의 rs74315349(G>A) 또는 rs150546920(C>G) 변이;를 확인하는 단계를 포함하는 당뇨병 환자에서의 설폰요소제 의존성 예측을 위한 정보 제공 방법.
4. 위 3에 있어서, 상기 확인은 상기 유전자 중 적어도 하나에 특이적으로 결합하는 프라이머 또는 프로브를 가하여 그 서열을 확인함으로써 수행되는 당뇨병 환자에서의 설폰요소제 의존성 예측을 위한 정보 제공 방법.
5. 위 3에 있어서, 상기 변이 중 적어도 하나를 가진 개체가 설폰요소제 의존성을 가졌다는 정보를 제공하는 단계;를 더 포함하는 당뇨병 환자에서의 설폰요소제 의존성 예측을 위한 정보 제공 방법.
본 발명은 KCNB2, GHSR, NOS2, CAPN10, FASN, KCNH6, DIS3L2, NR0B2 등의 유전자를 마커로 사용하여, 설폰요소제에 의한 혈당 강하 효과가 뛰어난 당뇨병 환자인지 여부를 예측, 이를 위한 정보를 제공하는 데에 사용할 수 있다.
도 1은 후향적 방법으로 본 발명의 설폰요소제 의존성 연관 변이를 도출하기 위한 방법 모식도를 확인한 것이다.
DM, diabetes mellitus; FPG, fasting plasma glucose; MAF, minor allele frequency; SNV, single nucleotide variant; SU, sulfonylurea; WES, whole exome sequencing
도 2는 본 발명의 후향적 연구에서 설폰요소제 복용 중단 후 HbA1c(당화 헤모글로빈) 또는 FPG(fasting plasma glucose)의 혈중 농도를 확인한 것이다.
값은 평균 ± 표준편차로 나타내었다.
***, p < 0.001 between the 2 groups by 2-way repeated measures ANOVA
FPG, fasting plasma glucose; peak, highest measures within 6 months after SU discontinuation; SU, sulfonylureas
도 3은 본 발명의 후향적 연구에서 도출된 후보변이를 전향적으로 검증하기 위한 방법 모식도를 확인한 것이다.
FPG, fasting plasma glucose; SU, sulfonylurea; WES, whole exome sequencing
도 4는 본 발명의 전향적 연구에서 설폰요소제 복용 중단 후 HbA1c(당화 헤모글로빈) 또는 FPG(fasting plasma glucose)의 혈중 농도를 확인한 것이다.
값은 평균 ± 표준편차로 나타내었다.
**, p < 0.01 between the 2 groups by 2-way ANOVA
FPG, fasting plasma glucose; peak, highest measures within 20 weeks after SU discontinuation; SU, sulfonylureas
도 5는 본 발명의 도출된 유전자들의 변이를 대규모 인구집단에서 검증하기 위해 UK Biobank 등록자 추출 방법 모식도를 확인한 것이다.
eGFR, estimated glomerular filtration calculated by the CKD-EPI method; SU, sulfonylureas
도 6은 본 발명의 후보 유전자를 대규모 인구집단 UK Biobank에서 검증하기 위해, 공개된 유전자 데이터베이스로부터 변이 추출 방법 모식도를 확인한 것이다.
SU, sulfonylureas; WES, whole exome sequencing
dbNSFP v4. (http:/database.liulab.science/dbNSFP)
genomAD exomes (https:/gnomad.broadinstitute.org)
도 7은 NR0B2의 단백 기능 상실 변이가 인슐린 분비 세포에서 HNF1A, HNF4A 전사인자를 통해 SU 반응을 조절하는 근거에 대한 문헌을 요약 정리한 것이다. 근거 문헌은 다음과 같다: EMBO J. 1998;17(22):6701; Diabetes. 2022; 71(4): 862; Cell Death Dis. 2022;13(1):89; Proc Natl Acad Sci U S A. 2001;98(2):575; Diabetes. 2013; 62(11): 3909.
GSIS, glucose-stimulated insulin secretion; HNF, hepatocyte nuclear factor; NR0B2, Nuclear Receptor Subfamily 0 Group B Member 2; SU, sulfonylureas
이하 본 발명을 상세히 설명한다. 특별한 정의가 없는 한 본 명세서의 모든 용어는 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 기술자가 이해하는 당해 용어의 일반적인 의미와 동일하고 만약 본 명세서에 사용된 용어의 의미와 충돌하는 경우에는 본 명세서에 사용된 의미를 따른다.
본 발명은 KCNB2(Potassium Voltage-Gated Channel Subfamily B Member 2)의 rs777077261(C>A); GHSR(Growth hormone secretagogue receptor)의 rs202112906(C>T); NOS2(Nitric oxide synthase 2)의 rs28944173(T>C); CAPN10(Calpain 10)의 rs3792268(C>A); FASN(Fatty acid synthase)의 rs199670165(C>A), rs17848945(C>T), rs755372392(G>A), rs200840955(G>A), rs200842352(C>A) 또는 rs45489599(C>T); KCNH6(Potassium Voltage-Gated Channel Subfamily H Member 6)의 rs185358392(G>A), rs769120237(G>A), rs201884071(G>A) 또는 rs766766661(C>T); DIS3L2(DIS3 like 3'-5' exoribonuclease 2)의 rs14847401(G>A), rs37551700(G>A) 또는 rs774656238(A>G); 또는 NR0B2(Nuclear Receptor Subfamily 0 Group B Member 2)의 rs74315349(G>A) 또는 rs150546920(C>G) 변이;를 확인하는 제제를 포함하는 당뇨병 환자에 대한 설폰요소제(sulfonylurea) 의존성 예측용 조성물에 관한 것이다.
본 발명에서 상기 설폰요소제(sulfonylurea) 의존성은 당뇨병 환자의 혈당 강하를 위하여 오직 설폰요소제에 의하거나 또는 다른 약제에 비해 설폰요소제를 우선적으로 복용하여야 하는 정도를 의미한다. 즉, 설폰요소제가 아닌 종래 공지된 혈당강하제, 예를 들면 메트포르민(Metformin), 글립틴(Gliptin), 피오글리타존(Pioglitazone) 등을 복용하였을 때 혈당 강하가 나타나지 않거나 효과가 예측대로 나타나지 않으나, 설폰요소제를 복용한 경우에만 예측한 혈당 효과를 보일 수 있으므로, 우선적으로 설폰요소제를 복용해야 하는 것을 의미한다.
본 발명에서 상기 설폰요소제(sulfonylurea) 의존성 예측용 조성물은 상기 변이를 검출하는 제제에 의하여 당뇨병 환자가 상기 설폰요소제 의존성을 가지고 있는지 예측할 수 있는 조성물에 해당한다. 구체적으로, 상기 중 적어도 하나의 변이를 가지고 있는 환자의 경우 설폰요소제의 의존성이 높은 것으로 예측할 수 있다. 다만 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 각 유전자는 예측 대상에서의 서열을 갖는 것일 수 있다. 각 종에 대한 상기 서열들은 모두 공지되어 있다.
본 발명에서 상기 돌연변이를 확인하는 제제는 유전자 서열 등을 확인할 수 있는 것이라면 그 종류에 제한 없이 사용될 수 있다. 예를 들면 프라이머, 프로브, 항체, 또는 안티센스 핵산일 수 있고, 이에 제한되지 않는다. 상기 프라이머, 프로브 또는 안티센스 핵산을 사용하여 돌연변이 위치에 특정한 대립인자를 가진 핵산 서열을 증폭하거나 그 존재를 확인할 수 있다.
본 발명에서 상기 당뇨병 환자는 당뇨의 종류에 관계 없이 본 발명의 범위에 포함될 수 있다. 바람직하게는 2형 당뇨병(Type 2 diabetes mellitus, T2DM)일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한 본 발명은 개체로부터 분리된 생물학적 시료에서 KCNB2(Potassium Voltage-Gated Channel Subfamily B Member 2)의 rs777077261(C>A); GHSR(Growth hormone secretagogue receptor)의 rs202112906(C>T); NOS2(Nitric oxide synthase 2)의 rs28944173(T>C); CAPN10(Calpain 10)의 rs3792268(C>A); FASN(Fatty acid synthase)의 rs199670165(C>A), rs17848945(C>T), rs755372392(G>A), rs200840955(G>A), rs200842352(C>A) 또는 rs45489599(C>T); KCNH6(Potassium Voltage-Gated Channel Subfamily H Member 6)의 rs185358392(G>A), rs769120237(G>A), rs201884071(G>A) 또는 rs766766661(C>T); DIS3L2(DIS3 like 3'-5' exoribonuclease 2)의 rs14847401(G>A), rs37551700(G>A) 또는 rs774656238(A>G); 또는 NR0B2(Nuclear Receptor Subfamily 0 Group B Member 2)의 rs74315349(G>A) 또는 rs150546920(C>G) 변이;를 확인하는 단계를 포함하는 당뇨병 환자에서의 설폰요소제 의존성 예측을 위한 정보 제공 방법에 관한 것이다.
본 발명에서 상기 당뇨병 환자에서의 설폰요소제 의존성 예측을 위한 정보 제공 방법은 개체로부터 분리된 생물학적 시료로부터 DNA를 증폭, 시퀀싱 분석하여 개체의 유전형 정보를 수득하는 단계를 더 포함할 수도 있다. 상기 DNA 증폭, 시퀀싱 분석, 유전형 정보 수득 방법은 당업자에 의해 공지된 방법이라면 제한 없이 사용할 수 있다.
또한 본 발명의 상기 정보 제공 방법은 상기 변이 중 적어도 하나를 가진 개체가 설폰요소제 의존성을 가졌다는 정보를 제공하는 단계;를 더 포함할 수 있다.
이하, 본 발명을 구체적으로 설명하기 위해 실시예를 들어 상세하게 설명하기로 한다.
실험예 1. 후향적 의무기록 조회를 통한 SU 의존 환자 선별
2009년부터 2015년까지 서울대병원에 내원한, 낮은 용량의 설폰요소제(SU, 글리메피리드 등가물 ≤ 2 mg/일)를 복용하다가 중단한, 2형당뇨병을 앓고 있는 성인 환자를 대상으로 후향적 관찰연구를 진행하였다.
SU 의존성은 다음 기준을 모두 만족할 때로 정의되었다. (1) 낮은 용량의 SU(글리메피리드 등가물 ≤ 2mg/day) 복용하는 기간에 최소 6개월 동안 HbA1c ≤7.0% 이거나, 저혈당 위험이 있는 HbA1c ≤ 7.5 %인 군 (2) 다른 경구용 당뇨병 치료제를 추가하거나 투여했는지 여부와 무관하게, SU 제제를 중단한 후, HbA1c가 3개월 이내에 ≥ 1.2% 또는 6개월 이내에 ≥ 1.5% 증가한 군 (3) SU 재복용 군, (4) SU 재복용 3개월 이내에 HbA1c 감소가 ≥ 0.8%이거나 공복 혈당 감소가 ≥ 40 mg/dL인 군.
HbA1c가 SU 중단 후에 7.5% 미만으로 지속되고 2019년에 최종 데이터가 수집될 때까지 SU가 재개되지 않은 경우 SU 비의존성으로 간주되었다. SU 비의존성 대조군은 10년 이상 당뇨병 환자 중에서 선택되었으며 연령, 성별 및 항당뇨병제 별로 SU 의존 환자와 임상적으로 일치시켰다. 신장기능 장애(혈청 크레아티닌 >1.4mg/dL 또는 추정 사구체 여과율[eGFR] <50mL/min/1.73m²), 임상적으로 유의한 간 질환이 있거나, 글루코코르티코이드와 같이 혈당 조절에 영향을 미칠 수 있는 약물을 섭취하거나, SU 사용 변경 중 심각한 의학적 문제가 발생한 환자의 경우 분석 대상에서 제외하였다.
그 결과 SU 의존성을 나타내는 환자는 21명, SU 의존성을 나타내지 않는 대조군은 19명이 선정되었다. SU 의존성이 있는 환자들은 SU 중단 이후 유의한 혈당 증가 (20 주 후 HbA1c가 6.6 ± 0.4 %에서 8.8 ± 1.0 %로 증가) 및 SU 재복용 후 유의한 혈당 감소 (12 주 후 HbA1c가 6.9 ± 0.5 %)가 있었고, 공복혈당도 마찬가지 경향을 보여, SU 비의존성 대조군과 유의하게 구별되는 약물반응성이 확인되었다(도 2). 그러나. SU 중단 이전의 임상적 특징 및 항당뇨병 제제의 투여는 양 군에서 유사하였기 때문에(표 1), SU 중단 전에는 SU에 대한 반응성을 구별하기 어려움을 시사하였다.
SU 중단 전 임상적 특징 및 중단 후 당뇨병 제제의 비교
데이터는 평균 ± 표준편차 또는 중위값(범위)로 표시됨.
eGFR은 추정 사구체 여과율; SU는 설폰요소제; T2DM은 2형당뇨병.
*, Student's t-test, Mann Whitney test, Fisher's exact test로 분석됨
실험예 2. 전장 엑솜 시퀀싱(whole-exome sequencing, WES)
따라서, SU 의존성 환자의 유전적 특징을 분석하고자 하였다. 표본 수가 크지 않았기 때문에, effect size가 큰 rare variant를 찾기 위하여, 전장에서 엑솜 시퀀싱을 계획하였다. 21명의 SU 의존 환자 중, 자발적으로 서면 동의서를 제출한 17 명의 환자로부터 DNA 추출을 위한 혈액 샘플을 수집하였다. 해당 연구는 헬싱키 선언과 Good Clinical Practice의 원칙에 따라 수행되었고, 기관생명윤리위원회 (insutitutional review board)는 해당 연구를 승인하였다 (#1407-103-596). 엑솜 시퀀싱은 Macrogen(서울, 한국)에서 수행되었다. 간략하게, 혈액 백혈구로부터 DNA를 추출하고, SureSelect v4+UTR (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA)를 사용하여 엑솜 캡쳐링(exome capturing) 하였고, Hiseq2,000 sequencing system (Illumina Inc., San Diego, CA, USA)을 사용하여 100 배 커버리지로 시퀀싱 하였다. 시퀀스 리드는 BWA를 사용하여 UCSC genome assembly hg19 데이터에 얼라인 하였고, 변이체들은 SAMtoll과 ANNOVAR 소프트웨어를 사용하여 콜링 및 대응하였다.
실험예 3. 후보 변이의 도출(도1)
유전자 기반 분석을 위해, 베타 세포 기능 및 베타 세포 질량과 관련이 있는 것으로 보고된 260 개의 표적 유전자를 선택하였고, 전장 엑솜 시퀀싱 결과 이들 유전자에서 아미노산 서열을 변화시키는 단일 뉴클레오티드 변이체(SNV)가 선별되었다. 2형당뇨병은 rare variant의 영향이 큰 complex disease일 뿐 아니라(Am J Hum Genet. 2001;69:124), 앞서 기술하였듯이 본 연구의 표본 수가 작다는 한계로 인하여, uncommon variant (minor allele frequency < 5%, 1000 Genomes Phase 1)로 제한하였다. 한편, 약물 반응 유전자의 변이는 인종 별 차이가 큰 것으로 알려져 있다(Genome Med. 2017;9(1):117.) SU 사용이 유독 동아시아인(EAS)에서 많다는 것은 동아시아 환자의 SU 반응이 좋다는 것을 시사하므로(Diabetes Obes Metab. 2023 Jan;25(1):208), minor allele frequency가 전세계 평균 빈도에 비해 동아시아인(EAS)에서 높은 변이가 선별되었다.
다음으로, SU 의존성 환자에 밀집된 변이를 선택하기 위해, 동아시아인과 한국인 T2DM 환자 코호트 (SNUH 프로젝트, http:/ /koex.snu.ac.kr, Experimental & Molecular Medicine (2017) 49, e356) 두 대조군과 비교하여 승산비(Odds Ratio)가 2 이상인 변이를 선별하였다. 그 결과, 70개 유전자의 94개 단일 뉴클레오타이드 변이(SNV)가 SU 의존성 관련 변이체의 후보로 선택되었다(표 2).
흔치 않은/아미노산 변경/동아시안 집중된/SU의존환자에 집중된 SNV 후보군
1 ABCC8:NM_000352:exon12:c.G1678A:p.V560M, 51 KCNQ1:NM_000218:exon10:c.C1343G:p.P448R,
2 ACLY:NM_198830:exon18:c.C2093T:p.P698L,ACLY:NM_001096:exon19:c.C2123T:p.P708L, 52 LBR:NM_002296:exon12:c.G1528A:p.A510T,LBR:NM_194442:exon12:c.G1528A:p.A510T,
3 AKAP5:NM_004857:exon2:c.G871A:p.G291R, 53 LRP5:NM_002335:exon2:c.C290T:p.A97V,
4 APOA5:NM_052968:exon4:c.G538C:p.V180L,APOA5:NM_001166598:exon4:c.G538C:p.V180L, 54 LRP5:NM_002335:exon9:c.G1871A:p.R624Q,
5 APOA5:NM_052968:exon4:c.G553T:p.G185C,APOA5:NM_001166598:exon4:c.G553T:p.G185C, 55 MARCKS:NM_002356:exon2:c.C821T:p.A274V,
6 ARAP1:NM_001040118:exon18:c.G2518A:p.E840K,ARAP1:NM_015242:exon16:c.G1783A:p.E595K,ARAP1:NM_001135190:exon15:c.G1600A:p.E534K, 56 MC4R:NM_005912:exon1:c.G914A:p.R305Q,
7 ARAP1:NM_001040118:exon7:c.G883A:p.G295R,ARAP1:NM_015242:exon5:c.G148A:p.G50R,ARAP1:NM_001135190:exon5:c.G148A:p.G50R, 57 MGEA5:NM_012215:exon1:c.G137A:p.G46E,MGEA5:NM_001142434:exon1:c.G137A:p.G46E,
8 BLK:NM_001715:exon4:c.G252C:p.K84N, 58 MICU1:NM_001195519:exon3:c.T215G:p.L72R,MICU1:NM_001195518:exon8:c.T809G:p.L270R,
9 CACNA1A:NM_001127222:exon19:c.C2759G:p.A920G,CACNA1A:NM_001127221:exon19:c.C2762G:p.A921G, 59 MYO5A:NM_000259:exon20:c.C2491T:p.R831C,MYO5A:NM_001142495:exon20:c.C2491T:p.R831C,
10 CACNA1D:NM_001128839:exon30:c.C3854T:p.A1285V,CACNA1D:NM_001128840:exon30:c.C3854T:p.A1285V,CACNA1D:NM_000720:exon31:c.C3914T:p.A1305V, 60 NNT:NM_182977:exon14:c.C1987T:p.L663F,NNT:NM_012343:exon14:c.C1987T:p.L663F,
11 CACNA1E:NM_001205293:exon20:c.C2731T:p.R911W,CACNA1E:NM_000721:exon20:c.C2731T:p.R911W,CACNA1E:NM_001205294:exon19:c.C2674T:p.R892W, 61 NNT:NM_182977:exon3:c.A188G:p.K63R,NNT:NM_012343:exon3:c.A188G:p.K63R,
12 CACNA1H:NM_021098:exon10:c.C2030T:p.S677L,CACNA1H:NM_001005407:exon10:c.C2030T:p.S677L, 62 NOS2:NM_000625:exon19:c.A2239G:p.T747A,
13 CAPN10:NM_023083:exon4:c.C598A:p.P200T,CAPN10:NM_023085:exon4:c.C598A:p.P200T, 63 NR0B2:NM_021969:exon1:c.C100T:p.R34X,
14 CASR:NM_000388:exon4:c.G1192A:p.D398N,CASR:NM_001178065:exon4:c.G1192A:p.D398N, 64 OXCT1:NM_000436:exon2:c.C173T:p.T58M,
15 CASR:NM_000388:exon7:c.G2824A:p.E942K,CASR:NM_001178065:exon7:c.G2854A:p.E952K, 65 PAM:NM_138822:exon19:c.T2153C:p.F718S,PAM:NM_001177306:exon19:c.T2153C:p.F718S,PAM:NM_000919:exon19:c.T2153C:p.F718S,PAM:NM_138766:exon19:c.T2153C:p.F718S,PAM:NM_138821:exon18:c.T1832C:p.F611S,
16 CCKAR:NM_000730:exon2:c.A305G:p.N102S, 66 PAX4:NM_006193:exon1:c.G92A:p.R31Q,
17 CD38:NM_001775:exon3:c.C418T:p.R140W, 67 PC:NM_001040716:exon15:c.A1702G:p.T568A,PC:NM_000920:exon14:c.A1702G:p.T568A,PC:NM_022172:exon13:c.A1702G:p.T568A,
18 DIS3L2:NM_152383:exon13:c.G1448A:p.R483Q, 68 PCK2:NM_004563:exon9:c.C1379T:p.P460L,
19 DIS3L2:NM_152383:exon13:c.G1600A:p.G534R, 69 PDE4C:NM_001098818:exon1:c.C88T:p.L30F,
20 EIF2AK3:NM_004836:exon12:c.G2014A:p.E672K, 70 PDE8B:NM_001029853:exon18:c.C2084T:p.T695M,PDE8B:NM_003719:exon19:c.C2144T:p.T715M,PDE8B:NM_001029852:exon18:c.C1979T:p.T660M,PDE8B:NM_001029851:exon16:c.C1853T:p.T618M,PDE8B:NM_001029854:exon18:c.C2003T:p.T668M,
21 EPHA5:NM_004439:exon17:c.A2876G:p.H959R,EPHA5:NM_182472:exon16:c.A2810G:p.H937R, 71 PRKCE:NM_005400:exon9:c.G1130C:p.R377P,
22 FAM3D:NM_138805:exon5:c.C178T:p.P60S, 72 PSMD9:NM_002813:exon1:c.G31A:p.G11S,
23 FASN:NM_004104:exon22:c.G3557T:p.C1186F, 73 RAPGEF3:NM_001098531:exon2:c.C79T:p.R27W,
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28 FOXA2:NM_021784:exon2:c.G274A:p.A92T,FOXA2:NM_153675:exon3:c.G256A:p.A86T, 78 SCN9A:NM_002977:exon15:c.A2359G:p.M787V,
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33 GIPR:NM_000164:exon9:c.C843A:p.Y281X, 83 THADA:NM_022065:exon11:c.G1326T:p.E442D,THADA:NM_001083953:exon11:c.G1326T:p.E442D,
34 GLIS3:NM_152629:exon3:c.G951T:p.E317D,GLIS3:NM_001042413:exon4:c.G1416T:p.E472D, 84 THADA:NM_022065:exon11:c.T1295A:p.V432D,THADA:NM_001083953:exon11:c.T1295A:p.V432D,
35 GLIS3:NM_152629:exon7:c.G1819A:p.A607T,GLIS3:NM_001042413:exon8:c.G2284A:p.A762T, 85 THADA:NM_022065:exon20:c.C2992G:p.R998G,THADA:NM_001083953:exon20:c.C2992G:p.R998G,
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37 GLP1R:NM_002062:exon2:c.G131A:p.R44H, 87 THADA:NM_022065:exon32:c.C4631G:p.S1544C,THADA:NM_001083953:exon32:c.C4631G:p.S1544C,
38 GPLD1:NM_001503:exon21:c.T2081C:p.M694T, 88 THADA:NM_022065:exon9:c.T776C:p.I259T,THADA:NM_001083953:exon9:c.T776C:p.I259T,
39 HLA-DRB5:NM_002125:exon2:c.C165A:p.F55L, 89 TRPM2:NM_003307:exon11:c.A1748G:p.N583S,
40 HNF4A:NM_001030003:exon2:c.C83T:p.A28V,HNF4A:NM_178850:exon2:c.C149T:p.A50V,HNF4A:NM_178849:exon2:c.C149T:p.A50V,HNF4A:NM_000457:exon2:c.C149T:p.A50V,HNF4A:NM_175914:exon2:c.C83T:p.A28V,HNF4A:NM_001030004:exon2:c.C83T:p.A28V, 90 TRPM2:NM_003307:exon26:c.C3830T:p.T1277M,
41 HTT:NM_002111:exon12:c.G1652A:p.G551E, 91 TRPM4:NM_017636:exon4:c.C290T:p.T97M,TRPM4:NM_001195227:exon4:c.C290T:p.T97M,
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43 IRS1:NM_005544:exon1:c.G2164A:p.G722S, 93 TRPV3:NM_145068:exon5:c.G443A:p.R148Q,
44 KANK1:NM_015158:exon3:c.C1991T:p.A664V,KANK1:NM_153186:exon2:c.C1517T:p.A506V, 94 WFS1:NM_001145853:exon2:c.A41G:p.Q14R,WFS1:NM_006005:exon2:c.A41G:p.Q14R,
45 KANK1:NM_015158:exon3:c.G1196A:p.R399Q,KANK1:NM_153186:exon2:c.G722A:p.R241Q, - -
46 KANK1:NM_015158:exon3:c.G1915A:p.V639I,KANK1:NM_153186:exon2:c.G1441A:p.V481I, - -
47 KCNB2:NM_004770:exon3:c.C2279A:p.T760N, - -
48 KCNH6:NM_030779:exon6:c.G1280A:p.R427Q, - -
49 KCNH6:NM_030779:exon6:c.G1354A:p.D452N, - -
50 KCNJ15:NM_170736:exon3:c.A88C:p.M30L,KCNJ15:NM_002243:exon4:c.A88C:p.M30L,KCNJ15:NM_170737:exon3:c.A88C:p.M30L, - -
실시예 1. 전향적으로 확인된 SU 의존 환자에서 WES를 이용한 유전자 검사
후향적 연구로부터 도출된 후보변이를 검증하기 위해, SU에 의존성을 보이는 환자를 전향적으로 선별하여 유전자 검사를 하는 임상연구를 수행하였다. (IRB No. H 1906 070 1041)
실험예 1에서 등록 환자 가운데 약 20%의 환자가 SU 의존성을 보이는 것으로 계산되었기 때문에, 10 명의 SU 의존 환자를 선별하기 위해 50 명의 환자가 필요하고, 15% 탈락율을 고려하여 총 58명의 환자를 모집하는 것으로 계획하였다(도 3). 등록 기준은 저용량의 SU(글리메피리드 등가물 2 mg/일 이하)를 복용하며 6개월 이상 동안 HbA1c가 ≤7.5% 인 2형 당뇨병 환자였다. 환자들에게 연구에 대한 서면 동의서를 받은 후, SU를 중단하고 다른 경구 당뇨병 치료제(글립틴 혹은 글리타존 제제)로 대체하였고, SU 의존성을 결정하기 위해 혈당과 HbA1c을 최대 20 주까지 관찰하였다. 혈당이 유의하게 악화된 경우(다음 중 하나: 12주 이내에 HbA1c가 1% 이상 증가, 20 주 이내에 HbA1c가 1.5% 이상 증가, 20주 이내에 공복 혈당이 80mg/dL 이상 증가), 환자는 SU-의존성으로 결정하였고, SU 복용을 재개하였다. 연구 수행 결과, 2 명의 환자가 연구 동의를 철회하여 탈락하였고, 7 명의 환자는 SU-의존성, 43 명은 그렇지 않은 것으로 나타났다. 다른 6 명의 환자는 20 주의 연구기간 동안에는 SU를 재개하지 않았지만, 이후에 SU를 재개하여(SU 중단 기간 평균 40주), 의존도가 모호하였다(도 3). 전향적으로 SU 의존성이 확인된 환자들의 혈당 변화 양상은 도 4에 제시되어 있고, 이들의 임상적 특징은 후향적 연구와 마찬가지로 통계적으로 유의한 차이가 없었다(표 3).
전향적으로 입증된 SU 의존성 환자 7명을 대상으로 엑솜 시퀀싱을 시행하여 유전자 정보를 획득하였다 (Macrogen, Korea; 실험예 2 참조),
전향적 임상연구로 확인된 SU 의존환자의 임상적 특징
실시예 2. 후보 변이의 검증_반복 변이
표 2의 94개 후보 변이 중, 실시예 1의 전향적으로 확인된 SU 의존 환자에서 재현된 변이는 총 9개이며 (연번 13, 23, 25, 30, 47, 62, 85, 86, 88), 표 4에 나열하였다. KCNB2, GHSR, NOS2, CAPN10, THADA, FASN 유전자에서 발견된 이들 변이의 낮은 빈도를 고려하면, 소수의 SU 의존 환자에서 반복적으로 관찰되었다는 현상은 상기 변이들이 이러한 임상 특징과 연관되어 있을 가능성을 시사한다.
SU 의존성과 연관된 후보 변이의 정보
B, benign; D, deleterious; EAS, East Asian; ND, not detected; PB, probably damaging; PS, possibly damaging; rsID, variant identification; SU, sulfonylureas; T, tolerated; T2D, type 2 diabetes
allele frequency and functional prediction source: https:/gnomad.broadinstitute.org, genomeAD exomes v2.1.1; http:/koex.snu.ac.kr/koex_main.php?section=search (Experimental & Molecular Medicine (2017) 49, e356)
실시예 3. 후보 유전자의 검증_다수 변이
후향적 모집 환자들에서 도출한 표 2의 후보 유전자들은 대부분 1 개의 후보 변이를 포함하는 것에 반해, THADA, FASN, GIPR, KCNH6, DIS3L2 에서는 다수의 변이가 관찰되었다. 전향적 모집 환자들의 엑솜 데이터로 실험예 3의 filtering 과정을 실시한 결과, 해당 유전자들 중 일부에서는 추가적인 변이가 발견되었다 (FASN 1개, KCNH6 2개, DIS3L2 1개, 표 4). NR0B2 유전자의 경우, 후향적 모집에서 도출된 변이가 1개 뿐이었지만, 전향적 모집 환자에서도 추가로 변이가 관찰되었고, 이들은 모두 동아시아인 기준 0.1% 미만의 희귀 변이이자 단백 기능에 영향을 줄 위험이 높다고 예측된다 (PB, D, stop-gain, 표 4). 즉, THADA, FASN, GIPR, KCNH6, DIS3L2, NR0B2에서, 변이 빈도가 매우 낮음에도 불구하고 (동아시아인 기준으로 대부분 1% 미만), 소수의 SU 의존 코호트에서 다수 관찰되는 변이들이 있고, 일부 변이는 단백의 기능에 영향을 미칠 위험이 매우 높기 때문에, 해당 유전자 및 그 변이들은 SU 의존성과 연관되어 있을 가능성을 시사한다.
실시예 4. 대규모 인구집단에서 후보 유전자 변이에 따른 SU 약물효과의 검증
다음으로, 도출된 후보변이 및 후보 유전자들이 대규모 인구집단에서 SU 반응과 연관되어 있는지 분석하기 위해, UK Biobank 자료를 이용하였다. UK Biobank는 2006~2010년 사이에 성인 약 50만 명이 등록된 영국 지역사회 코호트이다(Nucleic acids research 47.D1 (2019): D1005-D1012). 이 중 2형 당뇨병으로 코딩이 되어 있는 환자는 23,104 명인데, 1형 당뇨병이나 비전형적인 경과를 보이는 youth-onset diabetes를 제외하기 위하여 발병 연령이 30세 미만인 환자를 제외하였고, 유전자 정보가 없는 경우까지 총 1,991 명을 제외하였다. 또한 당뇨병 및 약물 대사에 유의한 영향을 미치는 신기능 저하 (GFR 40 ml/min/1.73m2 미만)가 동반된 환자 1,213명을 제외하고, 최종적으로 19,900 명이 분석에 사용되었고(도 5), 이들의 임상적 특징은 표 5와 같다.
UK biobank 분석 대상 환자의 임상적 특징
BMI, body mass index; eGFR, estimated glomerular filtration rate
Mean ± SD or median [interquartile range]
P, Student's t-test between the participants divided by DM duration
UK Biobank 등록 당시에 유럽에서 일반적인 당뇨병 약물은 3 개로, 사용 순서는 메트포르민, 설폰요소제, 인슐린이었다. 따라서 설폰요소제에 반응이 좋은 경우 인슐린 사용 비율은 낮을 것으로 예상하였다. 따라서, 후보 변이를 보유한 환자들의 인슐린 사용 비율을, 후보 변이를 보유하지 않은 사람들과 비교하고자 하였다.
그런데, 실험예 3에서 후보 변이 도출 과정은 동아시아인에 특이적인 변이를 선별한 관계로, 주로 코카시안으로 구성된 UK Biobank의 19,900 명 가운데, 표 4의 28개 후보 변이를 보유한 사람은 148 명뿐이었다. 또한, 소규모의 한국인 환자들을 대상으로 한 후보변이 도출에서 미처 선별되지 않은 변이가 있을 것으로 예상하였다. 이에, 공개된 SNV database인 dbNSFP (Genome Medicine. (2020) 12:103)에서, 표 4의 10 개 유전자로부터 단백 기능에 영향을 줄 것으로 예측되는 변이를 추가하였다. 추가 변이의 선별 기준은, 1) 변이 빈도(global allele frequency)가 5% 미만이면서 Polyphen 혹은 SIFT를 사용한 인 실리코 예측에서 단백 기능의 변화가 예상되는 경우, 2) 유전자 FASN의 경우: 특정 domain (PF00975, PF08659, PF08242: Pfam)의 빈도 5% 미만인 변이, 3) 유전자 KCNH6의 경우: 특정 domain (PF00027, PF00520: Pfam)의 빈도 5% 미만인 변이로 하였다. 추가적으로, gnomAD browser에서 pLoF (predicted loss of function) 변이를 선별하였는데, 여기에는 coding region SNV 뿐 아니라 근처 위치의 다수 뉴클레오타이드 변이가 포함되어 있고, 다음과 같은 변화를 유발한다: transcript_ablation, splice_acceptor_variant, splice_donor_variant, stop_gained, frameshift_variant(도 6).
이렇게 선별된 변이 중 UK Biobank에서 발견된 변이는 총 3,930 개인데, 선별 변이를 1개라도 보유한 환자는 시험군에, 그 외의 환자를 대조군에 설정하고 유전자 별로 분석을 시행한 결과, FASN, NOS2, CAPN10 유전자에서는 변이 보유자에서 인슐린 사용 비율이 감소하지 않아 제외하고(표 6~15), 나머지 7개 유전자에 대해 통합 분석을 진행하였다.
10개 후보 유전자 (CAPN10, DIS3L2, FASN, GHSR, GIPR, KCNB2, KCNH6, NOS2, NR0B2, THADA)의 선별변이 보유 여부에 따른 HbA1c 및 약물 사용의 특징
BMI, body mass index; eGFR, estimated glomerular filtration rate; MTF, metformin; SU, sulfonylurea; PSM, propensity score matching
Mean ± SD
P, Student's t-test or chi-squared test between the participants with and without the variants
7개 유전자의 선별 변이를 한 개라도 보유한 시험군은 4857 명이었고, 임상적 특징은 표 16과 같다. 대조군에 비하여 연령과 진단 연령, 신기능이 낮고, 남성이 적고, 혈당 조절은 불량하였다.
7개 후보 유전자 (THADA, GIPR, KCNH6, KCNB2, DIS3L2, GHSR, NR0B2)의 선별변이 보유 여부에 따른 임상적 특징
BMI, body mass index; eGFR, estimated glomerular filtration rate
Mean ± SD
이들 변이 보유자들을 연령, 성별, 체질량지수(BMI), 유병기간, 신기능(eGFR)과 매칭한 (propensity score matching, 1:2) 대조군 9610 명과 비교하였다 (표 17). 변이 보유자는 대조군에 비하여 혈당 조절(HbA1c)이 유의하게 불량하였고, 따라서 1차 약제 메트포르민(MTF) 사용 비율이 유의하게 높고, 설폰요소제(SU)도 사용 비율이 높은 경향을 보였으나(p=0.0993), 인슐린(insulin)은 유의하게 사용 비율이 낮았다(p=0.0233). 즉, 변이 보유자는 SU에 반응이 좋아 혈당 조절이 양호하므로 인슐린 처방이 느리게 진행된 것으로 해석할 수 있다.
한편, 2차 약제인 SU는 유병 기간이 긴 환자에서 그 처방 비율이 증가하는 데다가, 유병기간이 길어질수록 약물 효과의 피드백이 반영되어 처방 양상이 유전적 감수성에 맞추어진다고 추론할 수 있다. 따라서, 변이 보유자들이 SU에 대한 혈당 반응이 좋다면, 유병 기간이 길어 SU 사용 비율이 늘어나면서 혈당은 호전되고 인슐린 사용 감소는 두드러질 것이다. 유병기간이 72 개월 이상인 대상으로 한정한 경우, 변이 보유자는 1673 명이고 SU 사용 비율이 40% 이상이었다(표 8). 이들을 상기와 동일하게 PSM 매칭한 대조군 3346 명과 비교하였을 때, 전체 환자를 대상으로 한 경우보다 환자 수가 1/3로 줄었음에도 불구하고 인슐린 사용 비율이 유의하게 낮았다 (p=0.0191, 표 17). 그러나 혈당 조절 및 다른 약물 사용에는 차이가 없었다. 즉, 변이 보유자는 SU에 반응이 좋아 혈당 조절이 양호하므로 인슐린 처방이 느리게 진행되었을 뿐 아니라, 당뇨병 초기에(유병기간 72개월 미만) 관찰되었던 유의한 고혈당도 사라졌다고 해석할 수 있다.
7개 후보 유전자 (THADA, GIPR, KCNH6, KCNB2, DIS3L2, GHSR, NR0B2)의 선별변이 보유 여부에 따른 HbA1c 및 약물 사용의 특징
BMI, body mass index; eGFR, estimated glomerular filtration rate; MTF, metformin; SU, sulfonylurea; PSM, propensity score matching
Mean ± SD
실시예 4의 내용을 요약하면, UK Biobank 자료를 이용하여 7개 후보 유전자 (THADA, GIPR, KCNH6, KCNB2, DIS3L2, GHSR, NR0B2)의 선별변이 보유자의 특징을 분석한 결과, 이들은 연령이 어리고 남성이 적었다. 다른 임상 요인들을 보정하였을 때, 혈당 조절이 불량하여 메트포르민과 설폰요소제 사용이 더 많은 소견을 보였으나, 설폰요소제 실패 시 사용하는 인슐린은 오히려 적게 사용하였는데, 이는 설폰요소제 사용이 늘어난 후기 시점에 두드러졌으며 동시에 발병 초기에 관찰되던 고혈당이 소실되었다. 이는 해당 변이 보유자가 설폰요소제에 반응이 좋다는 것을 시사한다.
실시예 5. 후보 유전자의 검증_ 단백기능 변화 가능성이 높은 희귀 변이
표 4의 28 개 후보 변이 중 stop-gained variant는 GIPR, KCNH6, NR0B2에서 각각 1개가 발견되었다. Stop-gained variant로 인한 펩타이드 번역(translation)의 중단은 nonsense-mediated decay (NMD)라는 기전을 통해 해당 유전자의 mRNA 전사를 억제하는 것이 잘 알려져 있다 (J Biol Chem. 2022 Nov;298(11):102592). 즉, 이들 변이들은 각각 GIPR, KCNH6, NR0B2 발현을 억제하는 이론적 배경을 가진다. 특히 NR0B2 rs74315349(G>A) 변이는 207 개의 아미노산으로 이루어진 펩타이드의 34 번째 아미노산 위치에서 조기 중단을 유발하여, NR0B2 단백 발현양은 거의 없을 것으로 예상된다. 전향적으로 SU 의존성이 입증된 실시예 1에서 해당 변이가 재현되지는 않았지만, rs150546920(C>G) 변이가 NR0B2에서 추가로 관찰되었는데, 인 실리코 예측 모델에 의하면 이 변이 역시 단백기능에 영향을 줄 확률이 높은 것으로 예측되었다(표 4).
NR0B2에서 발현되는 단백인 nuclear receptor subfamily 0 group B member 2 (일반적인 용어는 small heterodimer partner, SHP)은 orphan nuclear receptor로서 다양한 단백과 결합하여 영향을 미치는데, 그 중 HNF1, HNF4 전사인자와 반응하여 그 활성을 억제하는 것이 잘 알려져 있다. HNF1A, HNF4A 변이는 maturity onset diabetes of the young (MODY)를 유발하는데(MODY-1, MODY-3), 이 경우 설폰요소제에의 반응이 두드러져서 SU가 1차 약제로 이용되고 있다. 인슐린 분비 세포에서 HNF1A, HNF4A 변이나 발현 억제는 세포의 포도당 감지(glucose sensing), 해당작용(glycolysis) 및 ATP 함량을 감소시킨다 (EMBO J. 1998;17(22):6701-13; Diabetes. 2022; 71(4): 862). 반대로 HNF4A 효현제인 N-trans-caffeoyltyramine (NCT)를 간세포에 처리하면 ATP 생산 주체인 미토콘드리아 기능이 증진되었다(Cell Death Dis. 2022;13(1):89). 인슐린 분비 세포에서 NR0B2의 rs74315349(G>A) 변이는 HNF4A에 대한 억제능을 상실하게 하므로(Proc Natl Acad Sci U S A. 2001;98(2):575), 이로 인한 HNF4A 활성 증진은 미토콘드리아 기능 및 ATP 증가를 통해 ATP 의존적인 설폰요소제의 인슐린 분비효과를 증가시킬 것으로 추론할 수 있다(Diabetes. 2013; 62(11): 3909). 실제로, NR0B2의 rs74315349(G>A) 변이 환자는 인슐린분비가 증가되어 있는 것으로 보고되었다(Proc Natl Acad Sci U S A. 2001;98(2):575). 이상의 내용은 도 7에 도식화하였다.
실시예 5를 요약하면, NR0B2 단백의 기능 저하를 통해 ATP 생성과 관련된 전사인자의 활성을 증진시킨다는 기존의 보고를 고려하면, 소수의 SU 의존 환자에서 발견된 0.1% 미만 빈도의 NR0B2 단백 기능 저하 변이들은, ATP에 의존적인 SU 반응을 증가시킬 가능성이 있다.
종합하면, 후향적으로 선별한 SU 의존 환자로부터 다수의 후보 유전자, 후보 변이가 도출되었고(도 1, 도 2, 표 2), 전향적으로 SU 의존성이 확인된 환자 7명에서 흔치 않은 변이 일부가 재현되거나 추가되어, 10 개의 유전자에서 28 개의 변이가 선별되었다 (실시예 1: 도 3, 도 4, 표 4). 이들 변이의 빈도나 기능을 고려할 때(표 4, 도 7), SU 의존성과 연관되어 있을 가능성을 시사한다.
뿐만 아니라, 이들 가운데 7 개의 유전자(THADA, GIPR, KCNH6, KCNB2, DIS3L2, GHSR, NR0B2)에서 단백기능 변화가 예측되는 변이를 후보로 선별하여 대규모 코호트인 UK Biobank 자료를 분석하였을 때, 변이 보유자들은 혈당 조절이 불량함에도 불구하고 인슐린 사용 빈도가 낮아, 인슐린 직전에 사용하는 약제인 SU에 대한 반응이 좋다는 것을 시사하였다. 유병기간이 길어 약물에 대한 유전적 감수성이 처방 양상에 반영되고 SU의 사용이 증가하는 시기가 되면, 해당 변이 보유자는 불량했던 혈당이 대조군과 비슷해지고, 인슐린 사용율은 여전히 낮은 것을 관찰하였다(실시예 4: 도 5, 도 6, 표 17).
T2DM의 약물유전학은 현재 임상에 적용되고 있지 않지만, SU 의존성 환자와 같은 하위 집단에서는 적용 가능한 분야이다. 본 연구로부터 2형 당뇨병에서 SU에 대한 반응성과 관련된 새로운 뉴클레오티드 변이체를 발견하였고, 이는 유전자 분석을 통한 SU 반응을 예측하는 데에 기여할 수 있을 것이다.

Claims (5)

  1. NR0B2(Nuclear Receptor Subfamily 0 Group B Member 2)의 rs74315349(G>A) 변이를 확인하는 제제를 포함하는 2형 당뇨병 환자에 대한 설폰요소제(sulfonylurea) 의존성 예측용 조성물.
  2. 청구항 1에 있어서, 상기 제제는 상기 유전자에 특이적으로 결합하는 프라이머 또는 프로브인 2형 당뇨병 환자에 대한 설폰요소제(sulfonylurea) 의존성 예측용 조성물.
  3. 개체로부터 분리된 생물학적 시료에서 NR0B2(Nuclear Receptor Subfamily 0 Group B Member 2)의 rs74315349(G>A) 변이를 확인하는 단계를 포함하는 2형 당뇨병 환자에서의 설폰요소제 의존성 예측을 위한 정보 제공 방법.
  4. 청구항 3에 있어서, 상기 확인은 상기 유전자에 특이적으로 결합하는 프라이머 또는 프로브를 가하여 그 서열을 확인함으로써 수행되는 2형 당뇨병 환자에서의 설폰요소제 의존성 예측을 위한 정보 제공 방법.
  5. 청구항 3에 있어서, 상기 변이를 가진 개체가 설폰요소제 의존성을 가졌다는 정보를 제공하는 단계;를 더 포함하는 2형 당뇨병 환자에서의 설폰요소제 의존성 예측을 위한 정보 제공 방법.
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Title
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SUN WEIPING, YAO SIHONG, TANG JIELONG, LIU SHUAI, CHEN JUAN, DENG DAQING, ZENG CHUNPING: "Integrative analysis of super enhancer SNPs for type 2 diabetes", PLOS ONE, PUBLIC LIBRARY OF SCIENCE, US, vol. 13, no. 1, 31 January 2018 (2018-01-31), US , pages e0192105, XP093158073, ISSN: 1932-6203, DOI: 10.1371/journal.pone.0192105 *
SWEN J.J., GUCHELAAR H.J., BAAK-PABLO R.F., ASSENDELFT W.J.J., WESSELS J.A.M.: "Genetic risk factors for type 2 diabetes mellitus and response to sulfonylurea treatment", PHARMACOGENETICS AND GENOMICS, LIPPINCOTT WILLIAMS & WILKINS, PHILADELPHIA, PA, US, vol. 21, no. 8, 1 August 2011 (2011-08-01), US , pages 461 - 468, XP009554443, ISSN: 1744-6872, DOI: 10.1097/FPC.0b013e3283478173 *

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