WO2025150892A1 - 턱관절 질환의 예방 또는 치료용 줄기세포 스페로이드 치료제 및 이의 제조방법 - Google Patents

턱관절 질환의 예방 또는 치료용 줄기세포 스페로이드 치료제 및 이의 제조방법

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WO2025150892A1
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stem cell
temporomandibular joint
stem cells
group
cells
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이부규
김현정
윤소연
김예린
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University of Ulsan Foundation for Industry Cooperation
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Asan Foundation
University of Ulsan Foundation for Industry Cooperation
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    • C12N2513/00—3D culture

Definitions

  • osteoarthritis includes various pathological changes, such as abnormalities in synoviocyte function, apoptosis and hyperproliferation of chondrocytes, and activation of immune cells. These changes have a significant impact on the joint microenvironment, which is important for cartilage regeneration. Therefore, the treatment of temporomandibular joint arthritis requires a multifaceted approach that suppresses the inflammatory response and provides a microenvironment that promotes cartilage formation.
  • the surface of the temporomandibular joint is covered with fibrous cartilage, not hyaline cartilage, and the pathology of temporomandibular joint arthritis is different from other arthritis.
  • hyaline cartilage is mainly composed of type II collagen
  • this fibrous cartilage is mainly composed of type I collagen.
  • the fiber orientation of this temporomandibular joint surface is arranged so that the type I collagen fibers overlap each other in a wave-like manner, so that most of the fibers are in contact with the surface. This characteristic allows it to withstand shear forces better, while hyaline cartilage is resistant to compressive loads.
  • temporomandibular joint cartilage is derived from cranial neural crest cells, so it has a different ecological origin. Furthermore, one of the most interesting biological aspects that sets it apart from other cartilages is its ability to remodel itself in response to changes in position, joint function, and mechanical load. Perhaps these important structural differences significantly alter the clinical presentation of pathological changes in the temporomandibular joint (Zhao et al ., 2022, Front Physiol. 13:859517).
  • one aspect of the present invention provides a method for producing a stem cell spheroid, including a step of 3-dimensionally culturing stem cells; and a step of treating the 3-dimensionally cultured stem cells with an inflammatory cytokine.
  • another aspect of the present invention provides a pharmaceutical composition for preventing or treating temporomandibular joint disease, comprising a three-dimensional stem cell spheroid as an active ingredient, which overexpresses at least one gene selected from the group consisting of IDO (indoleamine 2,3-dioxygenase) and FGF2 (fibroblast growth factor 2).
  • IDO indoleamine 2,3-dioxygenase
  • FGF2 fibroblast growth factor 2
  • the stem cell spheroid of the present invention When the stem cell spheroid of the present invention is used, the expression of inflammatory factors and extracellular matrix decomposition factors of cartilage cells around the lesion can be reduced, ultimately preventing cartilage loss in the temporomandibular joint and promoting regeneration of cartilage and subchondral bone. Ultimately, the stem cell spheroid of the present invention can prevent cartilage loss in the temporomandibular joint and promote regeneration of cartilage and subchondral bone, thereby improving the viability of cartilage cells, and thus can be usefully used for the fundamental prevention and treatment of temporomandibular joint disease.
  • Figure 4 is a diagram showing the expression level of the TGF-beta1 gene and the secretion amount of IDO for testing the method for producing a 3D cultured mesenchymal stem cell spheroid with enhanced anti-inflammatory function.
  • Figure 8 is a diagram showing the amount of hFGF secretion in 2D and 3D cultures of several cell lines with enhanced anti-inflammatory function.
  • One aspect of the present invention provides a method for producing stem cell spheroids.
  • the method for producing a stem cell spheroid of the present invention includes a step of culturing stem cells in three dimensions (3D culture), and a step of treating the 3D cultured stem cells with an inflammatory cytokine.
  • the stem cell may be an induced pluripotent stem cell (iPS cell), an embryonic stem cell, or an adult stem cell. Preferably, it may be an adult stem cell.
  • the mesenchymal stem cells may be isolated from a mammal, specifically, a human.
  • the mesenchymal stem cells may be derived from bone, cartilage, fat, tendon, nerve tissue, fibroblasts, bone marrow, umbilical cord blood, embryonic yolk sac, umbilical cord tissue, skin, peripheral blood, muscle, liver, fetal membrane, synovium, anterior cruciate ligament, articular chondrocytes, and fibrocartilage.
  • the mesenchymal stem cells may be derived from umbilical cord tissue.
  • the mesenchymal stem cells used were those isolated from human umbilical cord tissue.
  • the isolated mesenchymal stem cells can be cultured as needed.
  • cell basic media such as DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's Medium), MEM (Minimal Essential Medium), BME (Basal Medium Eagle), RPMI 1640, F-10, F-12, ⁇ -MEM ( ⁇ -Minimal Essential Medium), G-MEM (Glasgow's Minimal Essential Medium), ISDM (Iscove's Modified Dulbecco's Medium), and MSCGM can be used.
  • the step of culturing the stem cells in three dimensions may mean culturing the stem cells to form aggregates into a three-dimensional shape, and the three-dimensional culturing may mean culturing the cells in a three-dimensionally aggregated state, and may mean culturing the cells in a three-dimensional spheroid shape.
  • the spheroid means a cell spherical aggregate in which a large number of cells have a lump shape, and may be a three-dimensional (3D) cell formation (Aggregate) shape. Therefore, the step of culturing the stem cells in three dimensions may be performed without limitation using any conventional culturing method that can culture cells in three dimensions.
  • the contact-dependent interaction of the stem cells may be improved, so that various cell functions such as cell survival rate and protein secretion may be improved, and cell survival, homing, stem cell characteristics, differentiation potential, angiogenesis, and anti-inflammatory characteristics may be enhanced, and an immune phenotype profile may be provided.
  • the above three-dimensional culturing step can use a cell basic medium such as DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's Medium), MEM (Minimal Essential Medium), BME (Basal Medium Eagle), RPMI 1640, F-10, F-12, ⁇ -MEM ( ⁇ -Minimal Essential Medium), G-MEM (Glasgow's Minimal Essential Medium), ISDM (Iscove's Modified Dulbecco's Medium), and MSCGM.
  • a medium containing growth factors such as insulin, hydrocortisone, EGF, FGF, NGF, and LIF, or serum essential for growth such as fetal bovine serum, horse serum, goat serum, human serum, and umbilical cord serum can be used.
  • the above three-dimensional culturing step may be performed at a temperature of 30 to 50°C, for example, 31 to 47°C, 32 to 44°C, 33 to 41°C, and particularly 37°C, and may be performed for more than 0 and less than or equal to 200 hours, for example, 10 to 190 hours, 20 to 180 hours, 30 to 170 hours, 40 to 160 hours, 50 to 150 hours, 60 to 140 hours, 70 to 135 hours, 80 to 130 hours, 90 to 125 hours, and particularly 96 to 120 hours.
  • the above three-dimensional culturing step may be performed under carbon dioxide CO 2 conditions, and specifically, may be performed under 5% CO 2 conditions.
  • the step of culturing the stem cells in three dimensions may be culturing the stem cells in three dimensions by seeding 300 to 100,000 stem cells per spheroid, for example, seeding 500 to 100,000, 1,000 to 90,000, 5,000 to 80,000, 10,000 to 70,000, 20,000 to 60,000, 30,000 to 55,0000 or more, 33,000 to 50,0000, 35,000 to 48,0000, 37,000 to 46,000, 38,000 to 42,000, and particularly, 40,000 stem cells per spheroid. It could mean culturing in three dimensions.
  • the inflammatory cytokine refers to a cytokine that induces an inflammatory response occurring in the body, and may preferably be IFN- ⁇ (interferon-gamma), TNF- ⁇ (tumor necrosis factor- ⁇ ) or IL-1 ⁇ (interleukin-1 ⁇ ), but is not limited thereto.
  • the stem cells according to the manufacturing method of the present invention may have improved therapeutic efficacy for temporomandibular joint arthritis by being treated with the above inflammatory cytokines.
  • the step of treating the above stem cells with inflammatory cytokines may mean culturing the above stem cells in the culture medium with inflammatory cytokines added for a certain period of time before using the above stem cells as a therapeutic agent to enhance anti-inflammatory function.
  • the method of culturing stem cells in a culture medium containing the above-mentioned inflammatory cytokine may be to culture the stem cells in a two-dimensional manner or in a three-dimensionally aggregated state.
  • Pellet culture may be, for example, to form a cell pellet by centrifuging a suspension containing cells or using a pellet culture plate, and to culture the pellet as is.
  • the manufacturing method of the present invention may further include a step of culturing the isolated stem cells prior to the three-dimensional cell culture step of the stem cells.
  • a medium for culturing the isolated stem cells a cell basic medium such as DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's Medium), MEM (Minimal Essential Medium), BME (Basal Medium Eagle), RPMI 1640, F-10, F-12, ⁇ -MEM ( ⁇ -Minimal Essential Medium), G-MEM (Glasgow's Minimal Essential Medium), ISDM (Iscove's Modified Dulbecco's Medium), and MSCGM can be used, and additionally, a medium containing growth factors such as insulin, hydrocortisone, EGF, FGF, NGF, LIF, or serum essential for growth such as fetal bovine serum, horse serum, goat serum, human serum, and umbilical cord serum can be used.
  • the stem cell spheroid manufactured by the above manufacturing method may overexpress at least one gene selected from the group consisting of IDO (indoleamine 2,3-dioxygenase) and FGF2 (fibroblast growth factor 2).
  • the stem cell spheroid may overexpress the IDO or FGF2 gene, and most preferably overexpress both IDO and FGF2.
  • the term "expression” means the biosynthesis of nucleic acids or proteins from genes encoded in a cell, and "overexpression” means that the level of expression of a specific gene is excessively increased compared to unstimulated cells that have not been separately treated.
  • unstimulated cells that have not been separately treated are generally a state in which no separate treatment has been performed to regulate factors to be expressed, or a state in which they have not been modified, and can be used with the same meaning as “Naive cells” and “unstimulated cells.”
  • stem cells it means a state before differentiation by a specific factor or environment, and can be used with the same meaning as “Naive stem cells” and “unstimulated stem cells.”
  • the stem cell spheroid of the present invention means that the level of mRNA or protein of at least one gene selected from the group consisting of IDO and FGF2 is increased compared to the level in cells that have not been separately treated. Therefore, the level of mRNA or protein of at least one gene selected from the group consisting of IDO and FGF2 in the lysate or culture medium of the stem cell spheroid may be increased compared to the level in stem cells that have not been separately treated.
  • the "increase" in the expression level may be 1% or more, 3% or more, 5% or more, 7% or more, 9% or more, 10% or more, 15% or more, 20% or more, 25% or more, 30% or more, 35% or more, 40% or more, 45% or more, 50% or more, 55% or more, 60% or more, 65% or more, 70% or more, 75% or more, 80% or more, 85% or more, 90% or more, 95% or more, 100% or more, 200% or more, 300% or more, 500% or more, 700% or more, 1000% or more, 2000% or more, 5000% or more, 7000% or more, 10000% or more, It is not limited to this.
  • the concentration of the IDO in the stem cell spheroid manufactured by the above manufacturing method, may be 0.5 ng/ml or more at the quantitative limit, and the concentration of the FGF2 may be 6 pg/ml or more.
  • the concentration of the IDO may be 8 ng/ml or more, and the concentration of the FGF2 may be 20 pg/ml or more.
  • the concentration of each protein may be measured in the culture supernatant under the condition of 10 5 cells/ml. Therefore, in the culture supernatant, the concentration of the IDO may be 0.5 to 30 ng/ml or more, and the concentration of the FGF2 may be 6 to 120 pg/ml or more based on 10 5 cells/ml.
  • the expression levels of IDO and FGF2 genes were measured. As a result, it was confirmed that when the stem cell spheroid of the present invention was treated, the expression levels of IDO and FGF2 increased.
  • the stem cell spheroid may further include a step of selecting stem cells expressing a concentration of IDO of 0.5 ng/ml or more, a quantitative limit thereof, and a concentration of FGF2 of 6 pg/ml or more, based on 10 5 cells/ml in the culture supernatant.
  • the present invention provides a stem cell spheroid that overexpresses at least one gene selected from the group consisting of IDO (indoleamine 2,3-dioxygenase) and FGF2 (fibroblast growth factor 2).
  • the stem cell spheroid may be manufactured by the above-described manufacturing method.
  • the above stem cell spheroid may be a stem cell induced to overexpress IDO and/or FGF2. Therefore, the stem cell spheroid is effective in preventing or treating temporomandibular joint disease.
  • the above stem cell spheroid may have a concentration of IDO of 0.5 ng/ml or more and a concentration of FGF2 of 6 pg/ml or more in the culture supernatant based on 10 5 cells/ml.
  • the above stem cell spheroid may have a concentration of IDO of 6 ng/ml or more and a concentration of FGF2 of 20 pg/ml or more in the culture supernatant based on 10 5 cells/ml.
  • Another aspect of the present invention provides a pharmaceutical composition for preventing or treating temporomandibular joint disease.
  • 'temporomandibular joint disorder' may mean, but is not limited to, inflammation, cartilage damage, degeneration, loss or defect of the temporomandibular joint.
  • the surface of the temporomandibular joint is covered with fibrous cartilage, not hyaline cartilage, unlike other joints. While hyaline cartilage is mainly composed of type 2 collagen, this fibrous cartilage is mainly composed of type 1 collagen.
  • the fiber direction of this temporomandibular joint surface is arranged so that the type 1 collagen fibers overlap each other while crossing like waves, and most of the fibers are in contact with the surface. Due to this characteristic, it can withstand shear force better, while hyaline cartilage is resistant to compressive load.
  • the stem cell of the present invention is particularly excellent for preventing or treating temporomandibular joint disease.
  • the above stem cell spheroids can reduce the death rate of chondrocytes and fibrocartilage stem cells present in cartilage.
  • the stem cells of the present invention were treated, the proliferation and survival ability of fibrocartilage stem cells increased (see Example 8 and FIG. 9).
  • the stem cells of the present invention were treated in a rat temporomandibular joint arthritis model, it was confirmed that there was a regenerative effect on cartilage and subchondral bone (see Example 8 and FIG. 10).
  • the pharmaceutical composition of the present invention may contain a pharmaceutically acceptable carrier.
  • the pharmaceutically acceptable carriers mentioned above are those commonly used in the preparation of formulations and include, but are not limited to, lactose, dextrose, sucrose, sorbitol, mannitol, starch, acacia gum, calcium phosphate, alginate, gelatin, calcium silicate, microcrystalline cellulose, polyvinylpyrrolidone, cellulose, water, syrup, methyl cellulose, methyl hydroxybenzoate, propyl hydroxybenzoate, talc, magnesium stearate and mineral oil.
  • the stem cell spheroids can be used by mixing with a pharmaceutically acceptable carrier according to a conventional method.
  • the carrier may be selected from the group consisting of a medium, a buffer, and a biocompatible polymer.
  • the biocompatible polymer may be selected from commonly known polymers capable of supporting cells and/or maintaining cell activity in a two-dimensional or three-dimensional structure. Examples of the biocompatible polymer include at least one selected from the group consisting of hyaluronic acid, hydroxyapatite, chitosan, collagen, and fibrin.
  • composition of the present invention may be formulated using methods well known in the art so as to provide rapid or delayed release of the active ingredient after administration to a subject.
  • the formulation may be in the form of a tablet, powder, solution, sterile injectable solution, sterile powder, or the like. The formulation will be conveniently in a single-use dosage form.
  • the above pharmaceutical composition can be prepared in a unit dosage form or by being placed in a multi-dose container by formulating it using a pharmaceutically acceptable carrier and/or excipient according to a method that can be easily performed by a person having ordinary skill in the art to which the present invention pertains, and the like.
  • the formulation may be in the form of a solution, suspension or emulsion in an oil or aqueous medium, or in the form of an extract, powder, granules, tablets, capsules or gel (e.g., hydrogel), and may additionally contain a dispersant or stabilizer.
  • the dosage of the pharmaceutical composition may be, but is not limited to, 0.0001 ⁇ g to 100 mg, 0.001 ⁇ g to 100 mg, 0.01 ⁇ g to 100 mg, 0.1 ⁇ g to 100 mg, or 1.0 ⁇ g to 1000 mg per day, and may be prescribed in various ways depending on factors such as the formulation method, administration method, patient's age, weight, sex, pathological condition, food, administration time, administration route, excretion rate, and reaction sensitivity.
  • composition of the present invention can be used alone or in combination with methods using surgery, radiotherapy, hormone therapy, chemotherapy, and biological response modifiers for the treatment or prevention of temporomandibular joint disease.
  • a use of stem cell spheroids overexpressing at least one gene selected from the group consisting of IDO (indoleamine 2,3-dioxygenase) and FGF2 (fibroblast growth factor 2) is provided for treating or preventing temporomandibular joint disease.
  • a method for preventing or treating temporomandibular joint disease comprising administering to a subject in need of prevention or improvement of temporomandibular joint disease a stem cell spheroid that overexpresses at least one gene selected from the group consisting of IDO (indoleamine 2,3-dioxygenase) and FGF2 (fibroblast growth factor 2).
  • IDO indoleamine 2,3-dioxygenase
  • FGF2 fibroblast growth factor 2
  • composition for preventing or treating temporomandibular joint disease ” of the present invention can be equally applied to the above-described method for treating, preventing, or improving temporomandibular joint disease, and are not described repeatedly in order to avoid excessive complexity of the specification.
  • the pharmaceutical composition for preventing or treating temporomandibular joint disease of the present invention When the pharmaceutical composition for preventing or treating temporomandibular joint disease of the present invention is used, it was confirmed that the expression of inflammatory factors and extracellular matrix decomposition factors of cartilage cells can be reduced. In addition, by activating the proliferation of fibrocartilage stem cells, it is possible to ultimately prevent cartilage loss in the temporomandibular joint and promote the regeneration of cartilage and subchondral bone, thereby improving the viability of cartilage cells, so it is excellent in the prevention and treatment of temporomandibular joint disease.
  • the 3D cultured hUC-MSCs of the present invention were used as a cell therapy agent with the inflammatory cytokine IFN- ⁇ .
  • the groups were divided into four groups: (1) vehicle control without any treatment, (2) pre-priming stimulated before 3D culture, (3) stimulation 24 hours after 3D culture, and (4) stimulation 48 hours after 3D culture (Fig. 2).
  • Live/dead cell analysis was performed on the hUC-MSCs of the four groups. Specifically, the Live/dead cell analysis image stained with Calcein AM (green) shows viable cells, and the Live/dead cell analysis image stained with ethidium homodimer-1 (red) shows dead cells.
  • the survival rate of the hUC-MSCs of the four groups was analyzed on days 3, 4, and 5 using the CCK-8 cell proliferation assay.
  • the gene expression level of TGF- ⁇ 1 of hUC-MSCs under each cytokine treatment condition was analyzed using qPCR.
  • the gene expression level analysis was performed on days 3, 4, and 5 after culture.
  • the secretion amount of indoleamine-pyrrole 2,3-dioxygenase (IDO) in the supernatant of the four groups of hUC-MSCs was compared and analyzed using enzyme linked immunosorbent assay (ELISA).
  • Example 4 3D culture cell number conditions for producing spheroids in 96 wells
  • IDO indoleamine-pyrrole 2,3-dioxygenase
  • Example 5 3D culture cell number conditions for producing spheroids in microwells
  • IDO indoleamine-pyrrole 2,3-dioxygenase
  • the gene expression level of the IDO-1 showed an increasing trend from groups (1) to (4), and then a decreasing trend in group (5).
  • the secretion amount of IDO also showed a similar trend to the gene expression level, and it was confirmed that IDO was secreted at a higher level in group (4) than in the other groups.
  • the 2000 cells/spheroid group was the most effective in 3D culture of the stem cell spheroid in microwell of the present invention and in the anti-inflammatory function as a cell therapeutic agent.
  • the anti-inflammatory activity (TGF-beta3, TGF-beta1, IL-10, IL-1RA, TSG6) and cartilage regeneration-related genes (BMP2, BMP6, BMP7, FGF2, THBS2) of hUC-MSCs of the present invention were compared according to the differences in 2D and 3D culture methods. Specifically, the 2D was compared with the group treated with and without cytokines, and the 3D was compared with the group treated with cytokines.
  • the expression level was down-regulated in the 2D group when treated with cytokines, but in the 3D group treated with cytokines, the degree of decrease in gene expression was not only recovered, but also significantly up-regulated.
  • Example 7 Effect of the mesenchymal stem cell spheroid derived from the umbilical cord of the present invention according to the culture method
  • Example 8 Confirmation of effectiveness in an experimental animal model of temporomandibular joint disease
  • Samples for pathological tissue analysis were collected from the mandibular joint of the above-mentioned temporomandibular joint experimental animal model and fixed in 10% neutral buffered formalin. After the Micro-CT imaging, the sample was decalcified and made into a paraffin block to prepare the tissue. The TMJ paraffin block was cut into serial sections with a thickness of 5 um in the sagittal direction, stained with Fast green/Safranin O, and observed for 2, 4, and 8 weeks.
  • a pain test (mechanical hypernociception) was performed using a mechanical allodynia test (von Frey microfilament).
  • the test method is to measure the threshold intensity of the force that induces a reflex response (head withdrawal) in the TMJ OA lesion of the animal model.
  • the head withdrawal threshold (HWT) is defined as the lowest force of the filament that induced a response at least three times.
  • the HWT measurements were performed at one-week intervals, and the average value of four rats per group was calculated. Head withdrawal was evaluated by applying successive filaments starting from low force to the metastatic area of the rats. Technical reproducibility was performed by two experimenters.
  • both the 2D MSCs and 3D MSCs treatment groups showed some degree of recovery, but there was a distinct difference in the recovery speed.
  • the D+0 criterion of Fig. 11 (B) refers to the time when OA was induced by MIA injection, and at the 2-week (2W) point after treatment with the injection of 2D MSCs and 3D MSCs, the 3D MSCs treatment group was confirmed to recover at a very fast speed. This result shows that the treatment efficacy is further enhanced when 3D MSCs are injected in the pain response.

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Abstract

본 발명은 턱관절 질환의 예방 또는 치료용 줄기세포 스페로이드 치료제 및 이의 제조방법에 관한 것이다. 구체적으로는, IDO및 FGF2로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나의 유전자를 과발현하는 줄기세포 스페로이드를 유효성분으로 포함하며, 이를 이용하는 경우, 턱관절의 연골 소실을 예방하고 뼈의 재생을 촉진하며, 항염증 효과가 있어, 턱관절염의 근본적인 예방 및 치료에 유용하게 이용될 수 있다.

Description

턱관절 질환의 예방 또는 치료용 줄기세포 스페로이드 치료제 및 이의 제조방법
[관련 출원과의 상호 인용]
본 출원은 2024년 01월 09일에 출원된 한국특허출원 제10-2024-0003851호에 기초한 우선권의 이익을 주장하며, 해당 한국특허출원 문헌에 개시된 모든 내용은 본 명세서의 일부로서 포함된다.
본 발명은 턱관절 질환의 예방 또는 치료용 줄기세포 스페로이드 치료제 및 이의 제조방법에 관한 것이다.
턱관절(temporomandibular joint, TMJ)는 아래턱과 두개골의 관절 사이의 연결로 이루어진 특이한 관절로, 상악골과 하악골 사이의 관절인데, 이 관절은 말하기, 저작, 호흡 등과 같은 일상적인 기능을 수행하는데 중요한 역할을 한다. 턱관절 장애(TMJ disorder: TMD)는 아래턱과 두개골 사이 근육과 관절에 통증과 기능장애를 유발하는 다양한 상태를 포괄하는데, 이는 신체적, 사회적 및 심리적 요인과 연관된 복합적이고 복잡한 질환이다.
턱관절 장애의 하위 유형 중 하나인 턱관절염(TMJ osteoarthritis, TMJ OA)은 주로 연골과 관절하부뼈에 영향을 미치는 진행성 퇴행성 질환이다. 턱관절염의 특징으로는 연골세포의 사멸, 세포외 기질(extracellular matrix, ECM)의 분해 및 관절하부뼈의 신생에 의한 변화가 있다. 이 질환은 연골의 점진적인 붕괴로 나타나며, 이는 비정상적인 연골세포 기능과 조직의 분해 및 재생 기작의 불균형으로 설명된다. 오랫동안 관절염은 저염증성 및 무균적 질환으로 여겨져 왔지만, 최근에는 턱관절염 환자의 관절액에서 염증 인자 및 기타 염증 매개체가 높게 검출된다는 것이 보고되고 있으며, 이는 염증이 턱관절염의 발병 및 진행에서 중요한 역할을 한다는 것을 시사한다. 이러한 염증성 사이토카인은 관절 내에 존재하는 연골 세포, 관절주위 세포 및 거대세포에 의해 방출되어 관절연골의 염증을 유발시킨다. 또한, 관절염의 병태생리학에서는 염증, 세포외 기질의 분해 및 합성 감소, 세포 자멸 및 증식의 저하 등이 병증의 진행과 관절 손상을 악화시키는 요인으로 알려져 있으며, 여러 TNF-α와 IL-1β와 같은 전염증 매개체 및 활성 산소와 질소종(nitrogen species) 등의 대사산물이 관절염의 시작과 진행에 기여한다고 보고되어 있다. 이러한 신호 분자들은 MMP13 및 ADAMTS5와 같은 단백질 분해 효소의 분비를 촉진하여 연골세포의 이화작용을 유발한다.
골관절염의 발병은 활막세포(synoviocyte) 기능의 이상, 연골세포의 세포자멸(apoptosis) 및 과증식, 면역세포의 활성화 등 다양한 병리적 변화를 포함한다. 이러한 변화들은 연골 재생에 중요한 관절 미세환경에 큰 영향을 미친다. 따라서, 턱관절염의 치료는 염증 반응을 억제하고 연골 형성을 촉진하는 미세환경을 제공하는 다면적인 접근이 필요하다.
턱관절의 표면은 유리연골(hyaline cartilage)이 아닌 섬유연골(fibrous cartilage)로 덮여 있으며, 턱관절염의 병리 과정은 다른 관절염과는 구별된다. 유리 연골은 주로 2형 콜라겐으로 이루어져 있는 반면, 이 섬유 연골은 주로 1형 콜라겐으로 이루어져 있다. 이 턱관절 표면의 섬유 방향은 1형 콜라겐 섬유가 파도처럼 교차하면서 서로 겹치게 되어 대부분의 섬유가 표면과 접촉하도록 배치되어 있다. 이 특성으로 인해 전단력(shear force)를 더 잘 견디게 해주는 반면, 유리 연골은 압축 하중에 대한 저항성을 지니고 있다. 또한, 무릎의 관절 연골과 달리, 턱관절 연골은 뇌신경능선(cranial neural crest) 세포에서 유래하므로, 생태학적으로 출발점이 다르다. 더욱이, 다른 연골과는 다른 가장 흥미로운 생물학적 측면 중 하나는, 턱관절의 위치, 관절 기능 및 기계적 하중 변화에 대응하여 재구성할 수 있는 능력에 있다. 아마도 이러한 중요한 구조적 차이로 인해 턱관절의 병적 변화의 임상적 표현이 크게 변경된다(Zhao et al., 2022, Front Physiol. 13:859517).
턱관절에 만성 관절염 또는 이로 인해 디스크가 천공이 되면, SZ의 섬유연골은 염증성 손상의 위험성을 가지며, 손상되면, 하악의 기능 및 성장 제한을 포함한 영구적인 조직 손실과 기능 장애를 초래할 수도 있다. 따라서, 섬유 연골 내 섬유연골 줄기세포의 재생 능력을 보존하는 것 또한 턱관절염의 연골 재생을 위한 효과적인 치료 전략 중 하나로 제시되고 있다. 그러나 이러한 턱관절염의 복잡한 특성으로 인해, 현재 사용가능한 치료법은 주로 증상 관리를 목적으로 한다.
따라서, 만성염증을 조절할 수 있는 효과적인 항염 인자를 투여함으로써 병증이 개선될 것으로 기대했지만, 덱사메타존과 같은 기존의 항염 약물제재는 일시적인 항염작용은 있으나, 반감기가 매우 짧고, 손상된 세포재생에 효과가 없을 뿐 아니라 전신에 부작용 등으로 장기적인 관점에서 임상적용에 한계가 있다.
한편, 지난 수십년간, 중간엽 줄기세포(mesenchymal stem cell, MSC)는 전임상 및 임상 시험에서 재생 요법으로 연구되어왔다. 그러나, 같은 조직에서 분리된 다양한 기증자의 중간엽 줄기세포는 이질적이며 서로 다른 치료 효과를 가지고 있으므로, 현재는 이 문제를 해결하기 위해 더 표준화된 치료 효능 표현형을 유도하는 데 많은 연구가 이루어지고 있다. 이러한 방편으로, 최근에는 중간엽 줄기세포를 활성화시키고 항염증 및 면역조절 인자의 분비를 증가시키기 위한 목적으로 다양한 프라이밍(priming) 방법이 제안되었다. 이 중, 효과적인 프라이밍 방법 중 하나는 세포를 염증성 사이토카인이나 성장인자에 노출시키는 것인데, 이러한 노출 과정에 의해 중간엽 줄기세포는 세포의 항상성 상태를 유지하기 위한 중요한 인자들을 상향 조절한다. 또한 MSC는 세포와 세포사이 상호작용이 증가된 공간 세포 조직을 제공함으로써 생체 내 MSC 틈새를 밀접하게 재구성하는 3차원(3D) 구조(즉, MSC spheroids)에서 결합하고 조립할 수 있는 놀라운 능력을 가지고 있다. 이러한 맥락에서 3D spheroids는 MSC에 강화된 생존, 귀소, 줄기세포 특성, 분화 가능성, 혈관 신생 및 항염증 특성과 함께 MSC에 안정적인 면역 표현형 프로필을 제공한다. 그러나 턱관절의 위치나 구조 상, 턱관절염 동물 모델의 생성과 치료제 주사에 있어 고도의 기술이 필요하기 때문에 타관절에 비하여 치료제의 발굴과 연구의 진행이 활발히 이루어지지 않고 있다.
이에, 턱관절의 퇴화된 연골을 재생하고, 염증을 감소시켜 턱관절염으로의 진행을 예방하고 개선하는 기술의 연구 및 개발이 필요한 실정이다.
본 발명의 일 목적은 턱관절 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
또한, 본 발명의 다른 목적은 턱관절 질환 예방 또는 치료용 줄기세포의 제조방법을 제공하는 것이다.
그러나, 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
상기의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명의 일 측면은 줄기세포를 3차원 배양(3-Dimensional culture)하는 단계; 및 상기 3차원 배양된 줄기세포에 염증성 사이토카인을 처리하는 단계;를 포함하는, 줄기세포 스페로이드의 제조방법을 제공한다.
또한, 본 발명의 다른 측면은 IDO(indoleamine 2,3-dioxygenase) 및 FGF2(fibroblast growth factor 2)로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나의 유전자를 과발현하는, 3차원의 줄기세포 스페로이드를 유효성분으로 포함하는, 턱관절 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명의 줄기세포 스페로이드를 이용하는 경우, 병변 주위의 연골 세포의 염증 인자와 세포 외 기질 분해 인자의 발현을 감소시키며, 궁극적으로 턱관절의 연골 소실을 예방하고, 연골 및 연골하부 뼈의 재생을 촉진할 수 있다. 궁극적으로 본 발명의 줄기세포 스페로이드는 턱관절의 연골 소실을 예방하고, 연골 및 연골하부 뼈의 재생을 촉진하여 연골세포의 생존성을 향상시킬 수 있어 턱관절 질환의 근본적인 예방 및 치료에 유용하게 이용될 수 있다.
다만, 본 발명의 효과는 상기에서 언급한 효과로 제한되지 아니하며, 언급되지 않은 또 다른 효과들은 하기의 기재로부터 당업자에게 명확히 이해될 수 있을 것이다.
도 1a 및 도 1b는 제대 유래 중간엽 줄기세포의 면역학적 특성을 나타내는 도면이다.
도 2는 항염 기능 강화 3D 배양 중간엽 줄기세포 스페로이드 치료제 제조방법의 확립을 위한 염증성 사이토카인 자극(priming) 조건에 관한 모식도이다.
도 3은 항염 기능 강화 3D 배양 제대 유래 중간엽 줄기세포 스페로이드 의 제조방법 테스트를 위한 Live/dead, CCK8를 나타내는 도면이다.
도 4는 항염 기능 강화 3D 배양 제대 유래 중간엽 줄기세포 스페로이드 의 제조방법 테스트를 위한 TGF-beta1의 유전자의 발현양과 IDO 분비량을 나타내는 도면이다.
도 5는 96웰 플레이트에서 항염 기능 강화 3D 배양 제대 유래 중간엽 줄기세포 스페로이드 형성에 필요한 세포수 조건을 확립하기 위한 스페로이드 크기와 IDO 분비량을 분석한 결과를 나타내는 도면이다.
도 6은 마이크로 웰에서 항염 기능 강화 3D 배양 제대 유래 중간엽 줄기세포 스페로이드 형성에 필요한 세포수 조건을 확립하기 위한 IDO-1의 유전자 발현양과 IDO 분비량을 분석한 결과를 나타내는 도면이다.
도 7은 항염 기능 강화에 따른 2D와 3D의 항염증 활성 유전자(TGF-beta3, TGF-beta1, IL-10, IL-1RA, TSG6) 및 연골 재생 관련 유전자(BMP2, BMP6, BMP7, FGF2, THBS2) 발현양을 나타내는 도면이다.
도 8은 항염 기능이 강화된 여러 세포주의 2D와 3D 배양에서 hFGF 분비량을 나타내는 도면이다.
도 9는 본 발명에서 확립된 제조방법을 이용하여 제조한 3D MSCs 스페로이드와 치료 효능 비교를 위한 2D MSCs를 턱관절 환자에게서 분리한 synovium-derived cells in temporomandibular disorder patients(TMD-SDCs)와 공배양 한 후, 세포 증식률을 분석한 CCK8, 증식정도를 확인하기 위한 현미경 촬영 이미지, 사이토카인 유전자 발현양을 나타내는 도면이다.
도 10은 랫드 턱관절염 모델에서의 2D MSCs와 3D MSCs의 치료 효능을 보여주는 micro-CT 이미지를 나타내는 도면이다.
도 11은 랫드 턱관절염 모델에서의 2D MSCs와 3D MSCs의 치료 효능을 보여주는 병리조직학적 결과와 통증검사 평가를 나타내는 도면이다.
도 12는 랫드 턱관절염 모델의 하악과두 내의 2D MSCs와 3D MSCs의 생존 및 치료 효능 지속 기간을 비교하기 위해 인간 미토콘드리아(human mitochondria) 검출 유무를 확인한 결과를 나타내는 도면이다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
1. 줄기세포 스페로이드와 이의 제조방법
본 발명의 일 측면은, 줄기세포 스페로이드의 제조방법을 제공한다.
본 발명의 줄기세포 스페로이드의 제조방법은 줄기세포를 3차원 배양(3-Dimensional culture, 3D culture)하는 단계, 및 상기 3차원 배양된 줄기세포에 염증성 사이토카인을 처리하는 단계;를 포함한다.
상기 줄기세포는 미분화 세포로서, 자기 재생을 통해 오랫동안 분열할 수 있으며, 특정 환경 하에서는 다양한 종류의 세포로 분화할 수 있는 세포를 의미한다.
본 발명의 일 측면에 있어서, 상기 줄기세포는 유도된 다능력 줄기세포(induced pluripotent stem cell: iPS cells), 배아유래 줄기세포 또는 성체 줄기세포일 수 있다. 바람직하게는 성체 줄기세포일 수 있다.
본 발명의 일 측면에 있어서, 상기 성체 줄기세포는 중간엽 줄기세포, 지방유래 줄기세포, 내피 줄기세포 또는 조혈 줄기세포일 수 있으며, 바람직하게는 중간엽 줄기세포일 수 있다.
본 발명에서 용어, "중간엽 줄기세포(mesenchymal stem cell, MSC)"는 뼈(bone), 연골(cartilage), 지방(fat), 힘줄, 신경 조직(nerve tissue), 섬유아세포(fibroblast) 및 근육 세포(muscle cell) 등 구체적인 장기의 세포로 분화되기 전의 다분화 전구 세포(multipotent progenitor)를 의미한다.
본 발명의 일 측면에 있어서, 상기 중간엽 줄기세포는 포유동물, 구체적으로, 인간으로부터 분리된 것일 수 있다. 상기 중간엽 줄기세포는 뼈, 연골, 지방, 힘줄, 신경조직, 섬유아세포, 골수, 제대혈, 배낭(embryonic yolk sac), 제대조직, 피부, 말초혈액, 근육, 간, 태아막(fetal membrane), 활액막(synovium), 전십자인대(anterior cruciate ligament), 관절연골세포(articular chondrocytes) 및 섬유연골(fibrocartilage)로부터 유래한 것일 수 있다. 바람직하게는, 제대조직으로부터 유래한 것일 수 있다.
본 발명의 일 구현예에서, 상기 중간엽 줄기세포는 인간 제대조직으로부터 분리된 것을 사용하였다.
분리된 중간엽 줄기세포는 필요에 따라 배양할 수도 있다. 중간엽 줄기세포를 배양하기 위한 배지로는, DMEM(Dulbecco's Modified Eagle's Medium), MEM(Minimal Essential Medium), BME(Basal Medium Eagle), RPMI 1640, F-10, F-12, α-MEM(α-Minimal Essential Medium), G-MEM(Glasgow's Minimal Essential Medium), ISDM(Iscove's Modified Dulbecco's Medium) 및 MSCGM 등의 세포 기본 배지를 사용할 수 있고, 추가로 이 기본배지에 인슐린, 하이드로코르티손, EGF, FGF, NGF, LIF 등의 성장인자 또는 우태아혈청, 말혈청, 염소혈청, 인간혈청, 제대혈청 등의 성장에 필수적인 혈청 등이 포함된 배지를 사용할 수도 있다. 또한, 본 발명에서 세포 배양 배지에는 필요에 따라 한 가지 이상의 보조 성분을 첨가할 수 있는데, 우태아혈청, 말 또는 인간 등의 혈청을 비롯하여, 미생물의 오염을 막기 위한 항생제 및 항진균제 등을 사용할 수 있다.
분리 또는 배양된 줄기세포는 사용 전까지 당업계에 공지된 방법에 의해 보관될 수 있다. 일반적으로 줄기세포는 동결보호(cyoprotection) 처리한 후 냉동 보관할 수 있다. 상기 동결보호 처리는 당업계에 공지된 DMSO, 글리세롤, 폴리비닐피롤리돈, 폴리에틸렌 글리콜, 알부민, 덱스트란, 수크로스, 에틸렌 글리콜, i-에리스리톨, D리비톨, D-만니톨, D-솔비톨, i-이노시톨, D-락토스 또는 콜린 클로라이드와 같은 동결보호제를 이용하여 수행할 수 있다.
상기 줄기세포를 3차원 배양하는 단계는 상기 줄기세포들이 집합체를 형성하여 3차원의 형태가 되도록 배양하는 것을 의미할 수 있고, 상기 3차원 배양은 세포를 3차원적으로 응집된 상태에서 배양하는 것으로, 세포를 3차원 스페로이드 형태로 배양하는 것을 의미할 수 있다. 상기 스페로이드는 다수의 세포가 덩어리 형태를 가진 세포 원형의 집합체를 의미하는 것으로, 3차원(3D)으로 세포가 형성(Aggregate) 형태일 수 있다. 따라서, 상기 줄기세포를 3차원 배양하는 단계는 배양 방식이 세포를 3차원으로 배양할 수 있는 통상의 방식이라면 제한없이 사용하여 수행할 수 있다. 상기와 같이 3차원 배양하여 줄기세포 스페로이드를 형성하는 경우에는, 줄기세포의 세포 접합 상호작용(contact-dependent interaction)이 향상돼 세포의 생존율, 단백질 분비 등 다방면의 세포 기능이 향상될 수 있고, 세포의 생존, 귀소, 줄기세포의 특성, 분화 가능성, 혈관 신생 및 항염증 특성이 강화될 수 있으며, 면역 표현형 프로필을 제공할 수 있다.
구체적으로, 상기 3차원 배양하는 단계는 DMEM(Dulbecco's Modified Eagle's Medium), MEM(Minimal Essential Medium), BME(Basal Medium Eagle), RPMI 1640, F-10, F-12, α-MEM(α-Minimal Essential Medium), G-MEM(Glasgow's Minimal Essential Medium), ISDM(Iscove's Modified Dulbecco's Medium) 및 MSCGM 등의 세포 기본 배지를 사용할 수 있고, 추가로 이 기본배지에 인슐린, 하이드로코르티손, EGF, FGF, NGF, LIF 등의 성장인자 또는 우태아혈청, 말혈청, 염소혈청, 인간혈청, 제대혈청 등의 성장에 필수적인 혈청 등이 포함된 배지를 사용할 수도 있다. 상기 3차원 배양하는 단계는 30 내지 50℃, 예를 들어, 31 내지 47℃, 32 내지 44℃, 33 내지 41℃, 특히 37℃의 온도에서 수행되는 것일 수 있고, 0초과 200시간 이하, 예를 들어, 10 내지 190 시간, 20 내지 180 시간, 30 내지 170 시간, 40 내지 160 시간, 50 내지 150 시간, 60 내지 140 시간, 70 내지 135 시간, 80 내지 130 시간, 90 내지 125 시간, 특히 96 내지 120시간 동안 배양하는 것일 수 있다. 또한, 상기 3차원 배양하는 단계는 이산화탄소 CO2 조건에서 수행되는 것일 수 있고, 구체적으로, 5% CO2 조건에서 수행되는 것일 수 있다.
상기 줄기세포를 3차원 배양하는 단계는 하나의 스페로이드 당 300 내지 100,000개의 줄기세포를 분주(seeding)하여 3차원 배양하는 것일 수 있고, 예를 들어, 하나의 스페로이드 당 500 내지 100,000개 , 1000 내지 90,000개, 5,000 내지 80,000개, 10,000 내지 70,000개, 20,000 내지 60,000개, 30,000 내지 55,0000개 이상, 33,000 내지 50,0000개, 35,000 내지 48,0000개, 37,000 내지 46,000개, 38,000 내지 42,000개, 특히, 40,000개의 줄기세포를 분주하여 3차원 배양하는 것을 의미할 수 있다.
구체적으로, 상기 줄기세포를 3차원 배양하는 단계는 96웰 플레이트 또는 마이크로웰에서 수행될 수 있다.
상기 줄기세포를 3차원 배양하는 단계에서 상기 줄기세포를 96 웰 플레이트에서 3차원 배양할 수 있고, 이 때, 상기 줄기세포로부터 스페로이드를 형성하기 위한 초기 세포 수는 하나의 스페로이드 당 10000 내지 80000개일 수 있고(10000 내지 80000 cells/spheroid), 구체적으로, 하나의 스페로이드 당 20000 내지 80000개(20000 내지 80000 cells/spheroid), 30000 내지 70000개(30000 내지 70000 cells/spheroid) 또는 30000 내지 60000개(30000 내지 60000 cells/spheroid)일 수 있고, 특히 하나의 스페로이드 당 40000개(40000 cells/spheroid)일 수 있다.
상기 줄기세포를 3차원 배양하는 단계에서 상기 줄기세포를 마이크로웰 플레이트에서 3차원 배양할 수 있고, 이 때, 상기 줄기세포로부터 스페로이드를 형성하기 위한 초기 세포 수는 하나의 스페로이드 당 300 내지 3000개일 수 있고(300 내지 3000 cells/spheroid), 구체적으로, 500 내지 3000개(500 내지 3000 cells/spheroid) 또는 1000 내지 3000개(1000 내지 3000 cells/spheroid)일 수 있고, 특히 하나의 스페로이드 당 2000개(2000 cells/spheroid)일 수 있다.
상기 3차원 배양 시 초기 세포 수가 상기 범위를 만족하는 경우에는, 스페로이드가 적정한 크기로 형성될 수 있고, 상기와 같이 형성된 스페로이드의 2,3-이산소화효소(indoleamine-pyrrole 2,3-dioxygenase, IDO) 분비량 및 발현량이 높아, 우수한 항염증 활성을 나타낼 수 있다.
상기 3차원 배양된 줄기세포에 염증성 사이토카인을 처리하는 단계에 있어서, 상기 염증성 사이토카인은 체내에서 발생하는 염증 반응을 유발시키는 사이토카인을 의미하며, 바람직하게는 IFN- γ(interferon-gamma), TNF-α(tumor necrosis factor-α) 또는 IL-1β(interleukin-1β)일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 본 발명의 제조방법에 따른 줄기세포는 상기와 같은 염증성 사이토카인을 처리됨으로써 줄기세포의 턱관절염에 대한 치료 효능을 향상된 것일 수 있다.
본 발명의 일 측면에 있어서, 상기 염증성 사이토카인은 2 내지 1000IU/mL를 처리할 수 있으며, 예를 들어, 10 내지 500IU/mL, 30 내지 300IU/mL, 50 내지 200IU/mL, 특히, 100IU/mL를 처리할 수 있다. 상기 범위보다 낮은 농도의 사이토카인을 처리하는 경우 목적하는 유전자의 발현이 충분하지 않아, 턱관절 질환의 치료 효과가 나타나지 않을 수 있고, 높은 농도의 사이토카인을 처리하는 경우, 중간엽 줄기세포의 세포사멸을 유발할 수 있다.
상기 줄기세포에 염증성 사이토카인을 처리하는 단계는 상기 줄기세포를 항염증 기능을 강화하기 위하여 치료제로 사용 전, 염증성 사이토카인을 첨가한 상기 배양액에서 일정 시간 배양하는 것을 의미할 수 있다.
상기 염증성 사이토카인을 첨가한 배양액에서 줄기세포를 배양하는 방법으로는 줄기세포를 2차원적 배양하거나 또는 3차원적으로 응집된 상태에서 배양하는 것일 수도 있다. 펠렛 배양은 예를 들면, 세포를 포함하는 현탁액을 원심분리 혹은 펠렛 배양용 플레이트를 사용하여 세포 펠렛을 형성시키고, 이 펠렛을 그대로 배양하는 것일 수 있다.
상기 염증성 사이토카인을 처리하는 단계는 상기 줄기세포의 3차원 세포 배양 단계 이전, 상기 줄기세포의 3차원 세포 배양 이후에 수행될 수 있다. 구체적으로, 상기 줄기세포의 3차원 세포 배양 이후에 상기 염증성 사이토카인을 상기 줄기세포에 처리하는 단계는 상기 줄기세포를 3차원 세포 배양한 지 0 초과 120 이하의 시간이 경과되는 시점에 수행되는 것일 수 있고, 예를 들어, 줄기세포를 3차원 세포 배양한 지 6 내지 60시간이 경과되는 시점, 8 내지 55시간이 경과되는 시점, 12 내지 48시간이 경과되는 시점, 18 내지 36시간이 경과되는 시점, 20 내지 32시간이 경과되는 시점, 22 내지 28시간이 경과되는 시점, 특히, 24시간이 경과되는 시점에 수행되는 것일 수 있다.
본 발명의 구체적인 실시예에서는 상기 염증성 사이토카인의 처리 시점을 각각 3D 배양 이전, 3D 배양 이후 24 시간 경과된 시점 및 3D 배양 이후 48 시간 경과된 시점으로 하여 본 발명의 줄기세포 스페로이드의 항염 기능을 비교했다. 그 결과, 3D 배양 이전에 염증성 사이토카인을 처리하는 경우에 비하여, 3D 배양 이후 24 시간 경과된 시점에 처리한 경우에 줄기세포 스페로이드의 증식률이 가장 우수하고, 항염증 활성이 가장 높은 것으로 확인되었다.
또한, 본 발명의 제조방법은 상기 줄기세포의 3차원 세포 배양 단계 이전에, 분리된 줄기세포를 배양하는 단계를 더 포함할 수도 있다. 상기 분리된 줄기세포를 배양하기 위한 배지로는, DMEM(Dulbecco's Modified Eagle's Medium), MEM(Minimal Essential Medium), BME(Basal Medium Eagle), RPMI 1640, F-10, F-12, α-MEM(α-Minimal Essential Medium), G-MEM(Glasgow's Minimal Essential Medium), ISDM(Iscove's Modified Dulbecco's Medium) 및 MSCGM 등의 세포 기본 배지를 사용할 수 있고, 추가로 이 기본배지에 인슐린, 하이드로코르티손, EGF, FGF, NGF, LIF 등의 성장인자 또는 우태아혈청, 말혈청, 염소혈청, 인간혈청, 제대혈청 등의 성장에 필수적인 혈청 등이 포함된 배지를 사용할 수도 있다.
상기 제조방법에 의하여 제조된 상기 줄기세포 스페로이드는 IDO(indoleamine 2,3-dioxygenase) 및 FGF2(fibroblast growth factor 2)로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나의 유전자를 과발현하는 것일 수 있다.
구체적으로, 상기 줄기세포 스페로이드는 IDO또는 FGF2 유전자를 과발현하는 것일 수 있고, 가장 바람직하게는 IDO및 FGF2 모두를 과발현하는 것일 수 있다.
상기 IDO(indoleamine 2,3-dioxygenase)는 많은 종류의 세포들, 특히 수지상세포, 골수세포, 인체 내 중간엽 줄기세포 및 대부분의 종양세포들에 의해 생성되는 단백질이다. 종래의 연구들에서 IDO가 인간 중간엽세포의 면역 조절 능력에 중요한 역할을 하는 것이 입증되었는데, 이 효소는 트립토판을 분해하여 이펙터 T 세포(effector T cell)의 증식을 억제하고, 조절 T 세포(regulatory T cell, Treg)으로의 분화도 유도함으로써, 면역을 조절한다. 인간의 경우 IDO1 유전자에 의해 암호화된다. 본 명세서에 있어서, IDO는 IDO1, IDO-1과 상호교환적으로 사용될 수 있다.
상기 FGF2(fibroblast growth factor 2)는 인체 내의 혈관, 근육, 뼈나 신경세포 등의 여러 세포에 작용하여 세포의 증식이나 분화를 촉진하며, 줄기세포의 자가 갱신(self-renewal)에 중요한 역할을 할 수 있다. 본 명세서에 있어서, FGF2는 bFGF, FGF basic과 상호교환적으로 사용될 수 있다. 최근 연구들에 의해 하악관절 연골의 표면 영역(superficial zone, SZ)에 섬유연골 줄기세포(fibrocartilage stem cell, FCSC)가 존재하는 점이 밝혀졌는데, 상기 FCSC는 관절 내 자연적 연골 분화 잠재력을 지니며 하악관절 내의 항상성 유지에 중요한 역할을 하는 것으로 보고되고 있다. 턱관절염 환경 내에서의 높은 FGF2의 발현은 상기 SZ에 존재하는 FCSC 유지에 기여하고, IL-1에 의한 ADAMTS5의 활성을 억제함으로 관절 연골을 보호할 수 있다.
본 명세서에서 용어 "발현(expression)"은 세포에서 암호화된 유전자로부터 핵산이나 단백질이 생합성되는 것을 의미하며, "과발현(overexpression)"은 별도의 처리를 하지 않은 상태의 무자극 세포보다 특정 유전자의 발현의 수준이 과도하게 증가한 것을 의미한다. 여기서, 별도의 처리를 하지 않은 상태의 무자극 세포는 일반적으로 발현되는 인자의 조절을 위해 별도의 처리를 하지 않은 상태이거나, 변형되지 않은 상태, "Naive cell", "무자극 세포" 와 동일한 의미로 사용될 수 있다. 줄기세포의 경우 특정 인자나 환경에 의해 분화하기 전의 상태를 의미하며, "Naive stem cell", "무자극 줄기세포"과 동일한 의미로 사용될 수 있다.
따라서 본 발명의 상기 줄기세포 스페로이드는 IDO및 FGF2로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나의 유전자의 mRNA 또는 단백질의 수준이 별도의 처리를 하지 않은 상태의 세포에서의 수준보다 증가되어 있는 것을 의미한다. 따라서 상기 줄기세포 스페로이드의 파쇄물이나 배양액에 상기 IDO및 FGF2로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나의 유전자의 mRNA 또는 단백질의 수준이 별도의 처리를 하지 않은 상태의 줄기세포에서의 수준보다 증가되어 있을 수 있다.
한편, 상기 발현 수준의 "증가"는 별도의 처리하지 않은 동종 줄기세포(예, 동종의 비변형 줄기세포) 대비, 1% 이상, 3% 이상, 5% 이상, 7% 이상, 9% 이상, 10% 이상, 15% 이상, 20% 이상, 25% 이상, 30% 이상, 35% 이상, 40% 이상, 45% 이상, 50% 이상, 55% 이상, 60% 이상, 65% 이상, 70% 이상, 75% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 100% 이상, 200% 이상, 300% 이상, 500% 이상, 700% 이상, 1000% 이상, 2000% 이상, 5000% 이상, 7000% 이상, 10000% 이상일수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 일측면에 있어서, 상기 제조방법으로 제조된 줄기세포 스페로이드에서 상기 IDO의 농도는 정량 한계는 0.5 ng/ml 이상, 상기 FGF2의 농도는 6 pg/ml 이상일 수 있다. 바람직하게는 상기 IDO의 농도는 8 ng/ml 이상, 상기 FGF2의 농도는 20 pg/ml 이상일 수 있다. 각각의 단백질의 농도가 상기 범위 미만인 경우, 항염증 효과가 충분히 나타나지 않을 수 있다. 이때, 상기 단백질의 농도는 105 cells/ml 조건의 배양 상등액에서 측정한 것일 수 있다. 따라서, 배양 상등액에서 105 cells/ml 기준으로, 상기 IDO의 농도는 0.5 내지 30 ng/ml 이상, 상기 FGF2의 농도는 6 내지 120 pg/ml 이상일 수 있다.
본 발명의 구체적인 일실시예에서는 본 발명의 줄기세포 스페로이드의 항염 활성을 평가하기 위하여, IDO 및 FGF2 유전자의 발현량을 측정하였다. 그 결과, 본 발명의 줄기세포 스페로이드를 처리한 경우에는, IDO 및 FGF2 발현량이 높아진 것을 확인할 수 있었다.
따라서, 상기 줄기세포 스페로이드는 배양 상등액에서 105 cells/ml 기준으로 상기 IDO의 농도는 정량 한계는 0.5 ng/ml 이상, 상기 FGF2의 농도는 6 pg/ml 이상을 발현하는 줄기세포를 선별하는 단계를 더 포함할 수 있다.
본 발명에서는 IDO(indoleamine 2,3-dioxygenase) 및 FGF2(fibroblast growth factor 2)로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나의 유전자를 과발현하는 줄기세포 스페로이드를 제공한다. 상기 줄기세포 스페로이드는 상술한 제조방법에 의하여 제조된 것일 수 있다.
상기 줄기세포 스페로이드는 IDO 및/또는 FGF2을 과발현하도록 유도된 줄기세포일 수 있다. 따라서, 상기 줄기세포 스페로이드는 턱관절 질환 예방 또는 치료에 효과가 있다.
상기 줄기세포 스페로이드는 배양 상등액에서 105 cells/ml 기준으로 상기IDO의 농도는 정량 한계는 0.5 ng/ml 이상, 상기 FGF2의 농도는 6 pg/ml 이상일 수 있다. 바람직하게는 상기 줄기세포 스페로이드는 배양 상등액에서 105 cells/ml 기준으로 상기 IDO의 농도는 6 ng/ml 이상, 상기 FGF2의 농도는 20 pg/ml 이상일 수 있다.
2. 턱관절 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물
본 발명의 또 다른 측면은 턱관절 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명의 상기 턱관절 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물은 상기 " 1. 줄기세포 스페로이드와 이의 제조방법 "에서 설명한 줄기세포 스페로이드를 유효성분으로 포함할 수 있고, 이에 대해서는 상기 항목에서 설명한 바를 원용하여 그 설명을 생략한다.
본 발명의 일 측면은 IDO(indoleamine 2,3-dioxygenase) 및 FGF2(fibroblast growth factor 2)로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나의 유전자를 과발현하는 줄기세포 스페로이드를 유효성분으로 포함하는, 턱관절 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
상술한 활성을 갖는 본 발명의 줄기세포 스페로이드는 턱관절 질환의 예방 또는 치료에 우수한 효능을 발휘할 수 있다.
본원에 있어서, '턱관절 질환'은 턱관절의 염증, 연골 손상, 변성, 상실 또는 결함을 의미할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 일 측면에 있어서, 상기 턱관절 질환은 측두하악관절장애 또는 저작근장애 일 수 있다.
턱관절의 표면은 다른 관절과는 다르게 유리 연골(hyaline cartilage)이 아니라, 섬유 연골(fibrous cartilage)로 덮여 있다. 유리 연골은 주로 2형 콜라겐으로 이루어져 있는 반면, 이 섬유 연골은 주로 1형 콜라겐으로 이루어져 있다. 이 턱관절 표면의 섬유 방향은 1형 콜라겐 섬유가 파도처럼 교차하면서 서로 겹치게 되어 대부분의 섬유가 표면과 접촉하도록 배치되어 있다. 이 특성으로 인해 전단력(shear force)를 더 잘 견디게 해주는 반면, 유리 연골은 압축 하중에 대한 저항성을 지니고 있다. 본 발명의 줄기세포는 턱관절 질환의 예방 또는 치료에 특히 우수하다.
본 발명의 일 측면에 있어서, 상기 측두하악관절장애는 염증성 장애, 관절원판 장애, 탈구, 강직 및 골절로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나로부터 유래한 것일 수 있다.
상기 염증성 장애는 구체적으로 관절낭염, 원판후조직염 또는 골관절염일 수 있으며, 상기 관절원판 장애는 선천성 및 발육 관절원판 장애(congenital and developmental disc derangement disorders) 또는 관절원판변위(disc displacement) 일 수 있다.
상기 저작근장애는 구체적으로 근막통증(myofascial pain), 근염(myositis), 근경련(myospasm), 국소근통증(local muscle soreness), 보호성근긴장(protective muscle splinting), 근경축(muscle contracture) 또는 신생물(neoplasia)일 수 있다.
본 명세서에서 용어 "예방"은 턱관절 질환에 걸릴 위험을 감소시키는 것을 의미하며, 상기 턱관절 질환 또는 이의 하나 이상의 임상적 증후가 진행되지 않도록 하여 질환의 발병을 억제하거나 지연시키는 모든 행위를 의미한다.
본 명세서에서 용어 "치료"는 턱관절 질환을 경감시키는 것을 의미하며, 상기 턱관절 질환의 하나 이상의 임상적 증후의 진행을 저지 또는 감소시켜 질환의 증세를 호전시키거나 이롭게 변경하는 모든 행위를 포함한다.
본 발명의 상기 약학적 조성물은 상기 줄기세포의 치료학적 유효량을 포함할 수 있다.
상기 용어 "치료학적 유효량"은 본 발명의 약학적 조성물의 유효성분인 줄기세포가 그 활성 또는 효능을 달성하는 데 충분한 양을 의미하고, 예컨대, 턱관절 질환의 치료 또는 예방의 효능을 달성하는 데 충분한 양을 의미한다.
상기 조성물은 적어도 하나의 줄기세포 스페로이드를 포함할 수 있다. 상기 줄기세포 스페로이드는 상기 " 1. 줄기세포 스페로이드와 이의 제조방법 "에서 설명한 것과 동일한 것이므로, 중복하여 서술하지 않는다.
상기 조성물의 줄기세포 스페로이드가 생산하는 유전자들의 단백질 발현 수준은 105 cells/ml 기준으로 상기 IDO의 농도는 정량 한계는 0.5 ng/ml 이상, 상기 FGF2의 농도는 6 pg/ml 이상일 수 있다. 단백질 발현 수준의 상한선은 통상적인 줄기세포에서 과발현되는 수준이라면 제한 없으며, 통상의 기술자가 적절히 변형한 범위도 본 발명에 포함될 수 있다. 바람직하게는 배양 상등액에서 105 cells/ml 기준으로 바람직하게는 상기 IDO의 농도는 8 ng/ml 이상, 상기 FGF2의 농도는 20 pg/ml 이상일 수 있다. 상기 단백질의 농도는 105 cells/ml 조건의 배양 상등액에서 측정한 것일 수 있다.
상기 줄기세포 스페로이드는, 상기 IDO 및/또는 FGF2를 생산하고 세포 외부로 분비하는 줄기세포일 수 있다. 즉, 상기 줄기세포 스페로이드는 자신이 IDO를 분비하고, 자신이 상기 FGF2와 상호작용하여 항염 작용을 하는 것일 수 있다. 또한, 줄기세포 스페로이드가 분비하는 IDO 및/또는 FGF2가 접촉하는 세포는, 예를 들면, 연골 손상, 변성, 상실, 또는 결함이 있는 조직에 존재하는 세포일 수 있다. 본 명세서에 있어서, "연골 손상, 변성, 상실, 또는 결함이 있는 조직에 존재하는 세포"란 상기 조직 자체 뿐만 아니라 연골 손상, 변성, 상실, 또는 결함에 의하여 노출되는 조직에 존재하는 세포일 수 있다. 예를 들면, 활액, 골막, 뼈, 및 골수로 이루어진 군으로부터 선택되는 것일 수 있다.
또한, 상기 줄기세포 스페로이드는 TNF-α 및 IL-1β로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 염증 유발 인자의 발현을 억제하는 것일 수 있다.
상기 TNF-α는 종양괴사인자로서, 활성화된 대식세포, 자연살생세포(NK cell: natural killer cell), 일부 T세포 또는 어떤 종인 종양세포로부터 생산되는 염증성 사이토카인이며, 관절염의 시작과 진행에 기여하는 것으로 알려져 있다.
상기 IL-1β는 다양한 세포 유형에서 급성 및 만성 염증 및 자가면역 질환에서 중요한 역할을 하는 염증성 사이토카인이다. 상기 IL-1β는 중요한 체내 평형 기능을 가지고 있지만, 골관절염을 포함한 다양한 질병 상태에서 발생하는 병리생리학적 변화와 관련이 있고, 전염증 매개체로서 관절염의 시작과 진행에 기여하는 점이 알려져 있다.
본 발명의 구체적인 실시예에서는 본 발명의 줄기세포 스페로이드를 처리한 랫드 턱관절염 모델에서 염증을 유발하는 인자인 TNF-α 및 IL-1β의 발현을 감소시키는 것을 확인하였다(실시예 8 및 도 11 참조).
또한, 상기 줄기세포 스페로이드는 ADAMTS5 및 MMP13 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 세포 외 기질 분해인자의 발현을 억제하는 것일 수 있다. 따라서, 상기 줄기세포는 세포 외 기질이 분해되는 것을 억제하는 것일 수 있다.
상기 ADAMTS5는 세포 외 기질을 분해하는 데에 관여하는 인자로 알려져 있으며, 골관절염과 같은 연공 퇴화성 질환에서 상기 ADAMTS5가 억제되는 것이 에그레칸(aggrecan)의 손실 억제에 기여하는 점과 연골세포의 이화작용을 유발하는 점이 알려져 있다. 상기 MMP13는 세포 외 기질을 분해하는 데에 관여하는 인자로서, 뼈관절에 참여하는 Col II 분해 뿐만 아니라 연골에 있는 다른 유형의 콜라겐(예: IV 형, IX 형, 연골 기질 성분인 단백질 다당 등)도 분해하는 것으로 알려져 있다.
본 발명의 구체적인 실시예에서는 턱관절염 환자로부터 분리한 세포와 본 발명의 줄기세포 스페로이드를 공배양한 경우, 세포 외 기질 분해인자인 ADAMTS5 및 MMP13의 발현량이 유의하게 감소시키는 것을 확인하였다(실시예 7 참조).
상기 줄기세포 스페로이드는 연골세포와 연골 내 존재하는 섬유연골 줄기세포의 사멸율 감소시킬 수 있다.
본 발명의 구체적인 실시예에서는 본 발명의 줄기세포를 처리하는 경우 섬유연골 줄기세포의 증식 및 생존 능력이 증가하는 것을 확인하였다(실시예 8 및 도 9 참조). 또한, 랫드 턱관절염 모델에서 본 발명의 줄기세포를 처리하는 경우, 연골 및 연골하부뼈의 재생 효과가 있음을 확인하였다(실시예 8 및 도 10 참조).
본 발명의 약학적 조성물은 약학적으로 허용되는 담체를 포함할 수 있다.
상기 약학적으로 허용되는 담체는 제제 시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
또한, 줄기세포 스페로이드는 통상적인 방법에 따라 약제학적으로 허용되는 담체와 혼합하여 사용할 수 있다. 상기 담체는 배지, 버퍼, 및 생체 적합성 중합체로 이루어진 군으로부터 선택되는 것일 수 있다. 상기 생체 적합성 중합체는 2차원적 또는 3차원적 구조 내에서 세포를 지지 및/또는 세포활성을 유지할 수 있는 통상적으로 알려진 중합체 중에서 선택되는 것일 수 있다. 상기 생체 적합성 중합체의 예는, 히알루론산, 히드록시아파타이트, 키토산, 콜라겐 및 피브린으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나이상이 포함된다.
본 발명의 조성물은 개체에 투여된 후 유효 성분의 신속 또는 지연된 방출을 제공할 수 있도록 당업계에 잘 알려진 방법을 사용하여 제형화될 수 있다. 제형은 정제, 분말, 용액, 멸균 주사용액, 멸균 분말 등의 형태일 수 있다. 상기 제형은 1회용 투약 형태가 편리할 것이다.
상기 약학적 조성물은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때, 제형은 오일 또는 수성 매질중의 용액, 현탁액 또는 유화액 형태이거나 엑스제, 분말제, 과립제, 정제, 캅셀제 또는 젤(예컨대, 하이드로젤) 형태일 수도 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
적합한 약학적으로 허용되는 담체 및 제제는 레밍턴의 약학적 과학(Remington's Pharmaceutical Sciences, 19th ed., 1995)에 상세히 기재되어 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 턱관절 질환을 치료하기 위한 적합한 모든 경로로 투여될 수 있으며, 예를 들어, 경구 또는 비경구로 투여할 수 있고, 비경구 투여인 경우에는 정맥내 주입, 피하 주입, 근육내 주입, 복강내 주입, 국소 투여, 경피 투여 등으로 투여할 수 있다.
상기 약학적 조성물의 투여량은 1일당 0.0001 μg 내지 100 mg, 0.001 μg 내지 100 mg, 0.01 μg 내지 100 mg, 0.1 μg 내지 100 mg, 또는 1.0 μg 내지 1000 mg 일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니며, 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하게 처방될 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 당해 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이 때 제형은 오일 또는 수성 매질중의 용액, 현탁액 또는 유화액 형태이거나 엑스제, 분말제, 과립제, 정제 또는 캅셀제 형태일 수도 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다.
상기 줄기세포는 적합한 희석제에 약 1x103 내지 약 1x107 세포/ml 농도로 현탁시켜 조성물의 형태로 개체에 투여할 수 있는데, 이 희석제는 세포를 보호 및 유지하고, 목적하는 턱관절 내강에 주입시 사용에 용이하도록 하는 용도로서 사용된다. 상기 희석제는 생리식염수, PBS, HBSS 등의 완충용액, 혈장 또는 혈액성분 등이 있을 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 턱관절 질환의 치료 또는 예방을 위하여 단독으로, 또는 수술, 방사선치료, 호르몬치료, 화학치료 및 생물학적 반응 조절제를 사용하는 방법들과 병용하여 사용할 수 있다.
본 발명의 다른 측면에서, IDO(indoleamine 2,3-dioxygenase) 및 FGF2(fibroblast growth factor 2)로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나의 유전자를 과발현하는 줄기세포 스페로이드를 턱관절 질환의 치료 또는 예방하는데 사용하는 용도를 제공한다.
본 발명의 다른 측면에서, 상술한 IDO(indoleamine 2,3-dioxygenase) 및 FGF2(fibroblast growth factor 2)로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나의 유전자를 과발현하는 줄기세포 스페로이드를 턱관절 질환의 예방 또는 개선이 필요한 대상체(subject)에 투여하는 것을 포함하는 턱관절 질환의 예방 또는 치료하는 방법을 제공한다.
상기 대상체는 인간 또는 인간을 제외한 동물일 수 있다. 또한, 상기 대상체는 턱관절 질환을 가진 인간 또는 인간을 제외한 동물일 수 있다.
상기 턱관절 질환의 치료, 예방, 또는 개선 방법에는 상술한 본 발명의 " 2. 턱관절 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물 "에 관해 설명된 내용이 모두 동일하게 적용될 수 있으며, 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위해 중복하여 기재하지 않는다.
본 발명의 턱관절 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 이용하는 경우, 연골 세포의 염증 인자와 세포 외 기질 분해 인자의 발현을 감소시킬 수 있음을 확인하였다. 또한, 섬유연골 줄기세포의 증식을 활성화시킴으로써 궁극적으로 턱관절의 연골 소실을 예방하고, 연골 및 연골하부 뼈의 재생을 촉진하여 연골세포의 생존성을 향상시킬 수 있어 턱관절 질환의 예방 및 치료에 효과가 우수하다.
이하, 본 발명을 실시예에 의하여 상세히 설명한다.
단, 하기 실시예는 본 발명을 구체적으로 예시하는 것이며, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 의해 한정되지 아니한다.
실시예 1: 제대유래 중간엽 줄기세포의 추출 및 3D 배양
인간 제대유래 중간엽 줄기세포는 일차적으로 혈액 성분을 제거하기 위해 PBS로세척되었으며, 그 후 작은 조각으로 잘라(0.5 -1 cm), 혈관을 제거한다. 제대의 Wharton's(WJ)의 젤리 부위는 0.5 -11 cm3 크기로 자른 후, LG-DMEM에 10% FBS 및 100 U/ml PS가 포함된 배양 용기에 직접 넣어 배양 확장했다. 세포집단이 생겨 70% 밀도에 도달하면, 0.05% 트립신-EDTA로 떼어내어, 상기 초기 세포 분리 후 대량 증식 과정의 세포 분주 밀도(seeding density)가 103 내지 4.5X103 cells/cm2가 되도록 계대 배양하였다. 상기와 같이 배양되어 증식된 줄기세포를 96 웰 플레이트(96-well CellCarrier Spheroid ULA plates (Perkin Elmer, Turku, Finland))에는 40,000개의 세포를 넣고, 마이크로웰 플레이트(aggrewell plate(stemcell technologies))에는 2000개의 세포를 각 웰에 넣은 후, 5% CO2, 37℃ 조건으로 96시간 내지 120시간 배양하여 본 발명의 줄기세포 스페로이드를 제작하였다.
실시예 2: 제대유래 중간엽 줄기세포 스페로이드의 면역학적 특성
상기 실시예 1의 제대유래 중간엽 줄기세포 스페로이드(이하, hUC-MSC)에 대한 세포 막 단백질 발현 분석은 유세포 분석법(Flow cytometry)을 사용하여 수행하였다. 상기 hUC-MSC를 얼음 위의 찬용액에서 항체와 함께 1시간 동안 배양되었다. CD73-PE, CD45-PE, CD90-PE, CD105-PE, CD11b-PE, CD19-PE 및 HLA-DR-PE 항체가 사용되었다.
그 결과, 도 1a 및 도 1b에 나타낸 바와 같이, 상기 hUC-MSC 세포주는 CD73, CD90 및 CD105에 대해 양성이며, CD11b, CD19, CD45 및 HLA-DR에 대해 음성을 나타냈다.
실시예 3: 본 발명의 제대유래 중간엽 줄기세포 스페로이드의 사이토카인 처리 조건
[3-1] 줄기세포의 증식률 비교
세포치료제로 사용할 본 발명의 3D 배양된 hUC-MSC를 염증성 사이토카인 IFN-γ으로 자극시키는 방법을 확립하기 위해 여러 조건을 세운 후 분석하였다. 그룹은(1) 아무 처리 하지 않은 vehicle control,(2) 3D 배양 전 미리 자극시킨 pre-priming,(3) 3D 배양 24시간 후 자극,(4) 3D 배양 48시간 후 자극 네 그룹으로 나누었다(도 2). 상기 네 그룹의 hUC-MSC에 대하여 Live/dead 셀 분석을 수행하였다. 구체적으로, 칼세인(Calcein AM, 녹색)으로 염색된 Live/dead 셀 분석 이미지는 생존 가능한 세포를 보여주고, 에티듐 호모다이머-1(ethidium homodimer-1, 빨강)로 염색된 Live/dead 셀 분석 이미지는 죽은 세포를 보여준다. 또한, 상기 네 그룹의 hUC-MSC를 배양한 후 3, 4, 5일에 CCK-8 세포 증식 분석방법을 통하여 생존율을 분석했다.
그 결과, 도 3에 나타낸 바와 같이, 배양 3일차에는 모든 그룹이 pre-priming 그룹을 제외하고 유사한 생존율을 나타내었고, pre-priming 그룹은 약간 낮은 생존율을 나타내는 것으로 확인되었다. 상기 Pre-priming 그룹과 상기 배양 48시간 후에 자극된 그룹은 덜 조밀한 구형 형태를 띄고 있었으며, 4일 이후에 유의한 세포 사멸이 있었고, 5일에 생존율이 현저히 낮아지는 것으로 확인되었다. 상기 Vehicle control 그룹과 상기 배양 24시간 후에 자극된 그룹은 4일에 약간의 세포 사멸을 보였으며, 5일과 4일 사이에 현저한 차이가 없는 것으로 나타났다. 따라서, 상기 24시간 후에 자극된 그룹이 3일부터 5일까지 가장 높은 세포 생존율을 나타내었다. 또한, CCK-8 세포 증식 분석 결과, 상기 vehicle control 그룹과 상기 배양 48시간 후에 자극된 두 그룹에서 시간이 지남에 따라 감소하는 경향을 보였으나, pre-priming 그룹과 배양 24시간 후에 자극된 두 그룹은 감소하는 추세를 보이다가 약간 증가하는 경향을 보이는 것으로 확인되었다. 결론적으로, 상기 배양 24시간 후에 자극된 그룹이 배양 후 3일, 4일, 5일차에 가장 증식이 잘되는 점을 알 수 있었다.
[3-2] 줄기세포 스페로이드의 항염증 활성 비교
다음으로, 상기 실시예 3-1의 네 그룹의 hUC-MSC의 면역 활성을 비교하기 위하여, qPCR을 사용하여 사이토카인 처리 조건 별 hUC-MSC의 TGF-β1의 유전자 발현 수준을 분석하였다. 상기 유전자 발현 수준 분석은 배양 후 3, 4, 5일에 수행되었다. 또한, 상기 네 그룹의 hUC-MSC의 상층액에서 효소결합면역흡착측정법(enzyme linked immunoassay, ELISA)을 이용하여 인돌아민 2,3-이산소화효소(indoleamine-pyrrole 2,3-dioxygenase, IDO)의 분비량을 비교 분석했다.
그 결과, 도 4A에 나타낸 바와 같이, 상기 배양 후 24시간이 지난 그룹을 제외한 세 그룹에서 3일부터 4일까지 TGF-β1의 유전자 발현 수준이 증가하는 경향을 보인 후 5일에 감소하는 추세를 나타내었다. 그러나, 상기 배양 24시간 후 자극된 그룹에서는 4일부터 뚜렷한 감소가 관찰되었으며, 5일까지 유지되었다. 또한, 상기 Vehicle control 그룹과 pre-priming 그룹은 4일에 TGF-β1 발현량이 약간 증가하였으나, 5일에 감소하는 반면에, 상기 배양 후 자극된 두 그룹은 TGF-β1 발현량이 계속 증가하는 것으로 확인되었다. 특히, 상기 배양 후 24시간이 지나 자극된 그룹은 전체 기간 동안 가장 높은 TGF-β1 발현 수준을 나타내었다. 또한, 도 4B에 나타낸 바와 같이, 상기 Vehicle control 그룹과 pre-priming 그룹에서는 IDO의 분비가 나타나지 않았으나, 상기 배양 후 자극된 두 그룹은 높은 수준으로 분비되는 것으로 확인되었다. 특히, 배양 24시간 후 자극된 그룹은 유의하게 더 높은 분비 수준을 나타내었다.
위와 같은 실험 결과를 바탕으로, 상기 배양 24시간 후 자극된 그룹이 가장 효과적인 세포 생존율과 항염증 효과를 나타내는 점을 알 수 있었다.
실시예 4: 96웰에서 스페로이드를 생산하기 위한 3D 배양 세포 수 조건
96웰에서 3D 배양으로 본 발명의 줄기세포 스페로이드 형성하기 위하여 필요한 세포수 조건을 확립하였다. 구체적으로, (1) 하나의 스페로이드 당 10000개의 세포를 배양하는 경우(10000 cells/spheroid), (2) 하나의 스페로이드 당 20000개의 세포를 배양하는 경우(20000 cells/spheroid, (3) 하나의 스페로이드 당 40000개의 세포를 배양하는 경우(40000 cells/spheroid) 및 (4) 하나의 스페로이드 당 80000개 세포를 배양하는 경우(80000 cells/spheroid)의 네 그룹으로 나누어, 96웰에서 실시예 1과 같이 3D 배양하였다. 이후, 상기 네 그룹의 hUC-MSC에 대한 항염증 활성을 비교하기 위해, hUC-MSC의 상층액에서 효소결합면역흡착측정법(enzyme linked immunoassay, ELISA)을 이용하여 인돌아민 2,3-이산소화효소(indoleamine-pyrrole 2,3-dioxygenase, IDO)의 분비량을 비교 분석하였다. 상기 IDO 분비량의 분석은 사이토카인 처리 후 48시간 후에 수행되었다. 또한, 상기 세포 수에 따른 스페로이드 크기 비교를 통해 3D 배양 세포 수 조건을 확립하였다.
그 결과, 도 5에 나타낸 바와 같이, 상기 네 그룹의 스페로이드 크기는 세포 수가 증가함에 따라 208.6 ± 5.4um, 253.6 ± 4.7um, 330.6 ± 6.9um, 409.2 ± 11.6um 순으로 증가하였다. 또한, IDO의 분비량은 스페로이드 크기가 증가함에 따라 같이 상승하는 경향성을 나타내었으며, 상기 (4) 그룹에서 다른 그룹에 비해 높은 수준의 IDO가 분비되는 것으로 확인되었다. 그러나, 종래의 여러 연구에서, 스페로이드 크기가 350~400um를 초과할 때, 내부에서 심각한 괴사가 일어난다는 사실이 확인되었다. 이에, 이러한 괴사를 방지하기 위한 최적의 스페로이드 크기는 350um이하로 유지하는 것이 가장 적합하다는 것을 확인할 수 있었다(singh S. K et al., 2020, Biotechniques, 69(5),333-338; Curcio E et al, 2007, Biomaterials, 28,5487-5497). 따라서, 위와 같은 실시예 4의 실험 결과를 바탕으로, 상기 40,000 cells/spheroid 그룹이 본 발명의 줄기세포 스페로이드의 96웰에서의 3D 배양 및 세포 치료제로서의 항염증 기능에 가장 효과적인 점을 알 수 있었다.
실시예 5: 마이크로웰에서 스페로이드를 생산하기 위한 3D 배양 세포수 조건
마이크로웰에서 3D 배양으로 본 발명의 줄기세포 스페로이드 형성하기 위하여 필요한 세포수 조건을 확립하였다. 구체적으로, (1) 하나의 스페로이드 당 300개의 세포를 배양하는 경우(300 cells/spheroid), (2) 하나의 스페로이드 당 500개의 세포를 배양하는 경우(500 cells/spheroid, (3) 하나의 스페로이드 당 1000 세포를 배양하는 경우(1000 cells/spheroid), (4) 하나의 스페로이드 당 2000 세포를 배양하는 경우(2000 cells/spheroid) 및 (5) 하나의 스페로이드 당 3000 세포를 배양하는 경우(3000 cells/spheroid)의 다섯 그룹으로 나누어, 마이크로웰에서 실시예 1과 같이 3D 배양하였다. 상기 다섯 그룹의 hUC-MSC에 대하여 항염증 활성을 비교하기 위해, qPCR을 사용하여 세포 수 별로 hUC-MSC의 인돌아민 2,3-이산소화효소(indoleamine-pyrrole 2,3-dioxygenase, IDO)의 유전자 발현 수준을 분석하였다. 상기 유전자 발현 수준 분석은 사이토카인 처리 후 48시간 후에 수행되었다. 또한, 상기 다섯 그룹의 hUC-MSC의 상층액에서 효소결합면역흡착측정법(enzyme linked immunoassay, ELISA)을 이용하여 IDO의 분비량을 비교 분석했다.
그 결과, 도 6에 나타낸 바와 같이, 상기 IDO-1의 유전자 발현 수준은 상기 (1)에서 (4) 그룹까지 증가하는 경향을 보인 후, 상기 (5) 그룹에서 감소하는 추세를 나타내었다. 또한, IDO의 분비량도 상기 유전자 발현 수준과 비슷한 경향성을 나타내며, 상기 (4) 그룹에서 다른 그룹에 비해 IDO가 높은 수준으로 분비되는 것으로 확인되었다. 위와 같은 실시예 5의 실험 결과를 바탕으로, 상기 2000 cells/spheroid 그룹이 본 발명의 줄기세포 스페로이드의 마이크로웰에서의 3D 배양 및 세포 치료제로서의 항염증 기능에 가장 효과적인 점을 알 수 있었다.
실시예 6: 항염증 활성 및 연골 분화능 확인
2D 배양과 3D 배양 방식의 차이에 따른 본 발명의 hUC-MSC의 항염증 활성 (TGF-beta3, TGF-beta1, IL-10, IL-1RA, TSG6) 및 연골 재생 관련 유전자(BMP2, BMP6, BMP7, FGF2, THBS2) 를 비교하였다. 구체적으로, 상기 2D는 사이토카인을 처리한 그룹과 안한 그룹으로 3D는 사이토카인 처리한 그룹으로 비교 분석을 하였다.
그 결과, 도 7A에서 나타낸 바와 같이, 사이토카인 처리한 2D 그룹과 사이토카인 처리한 3D 그룹이 유전자 발현양을 비교했을때, 3D 그룹에서 유의하게 증가하였다.
도 7B에서 나타낸 바와 같이, 2D 그룹에서 사이토카인을 처리함에 따라 발현양이 하향 조절됐지만 사이토카인을 처리한 3D 그룹에서 유전자 발현양 감소 정도를 만회할 뿐만 아니라 유의 하게 상향 조절되었다.
위와 같은 실험 결과를 바탕으로, 사이토카인을 처리해 3D 배양하는 방식이 효과적인 항염증 효과를 나타낼뿐 아니라 연골재생 효과를 나타낸다는 것을 알 수 있었다.
실시예 7: 배양 방식에 따른 본 발명의 제대유래 중간엽 줄기세포 스페로이드의 효과
[7-1] 증식 및 연골 분화능 확인
2D 배양과 3D 배양 방식의 차이에 따른 본 발명의 hUC-MSC의 증식 및 연골 분화능을 비교하였다. 구체적으로, 상기 2D 및 3D 배양은 동일 세포(105 cells/ml)를 사용하여 유지 배양하였고, 각 방식으로 배양한 1일 후, MSC 상층액에서 ELISA를 이용하여 FGF2(Fibroblast growth factor2) 분비량을 비교 분석했다.
그 결과, 도 8에 도시된 바와 같이, 여러 줄기세포주(#187, 193, 197, 199 및 291)를 대상으로 2D 배양, 3D 배양을 한 후 FGF2 분비량을 비교했을 때, 모든 세포주에서 3D 배양한 경우, FGF2의 분비량이 높아지는 것으로 확인되었다. 이러한 실험결과는 본 발명의 줄기세포는 3D로 배양 시 턱관절염에 대한 줄기세포의 치료 효능이 향상되는 것을 보여주는 결과이다.
[7-2] TMD-SDCs와 hUC-MSCs공배양 시 세포 증식률, 염증 및 세포 외 기질 분해 활성 확인
염증성 사이토카인 IFN-γ으로 자극시킨(Primed) 본 발명의 hUC-MSC를 측두하악관절 환자에게서 분리한 활막-유래 세포(synovium-derived cells in temporomandibular disorder patients, TMD-SDCs)와 공배양한 효과를 분석하였다. 구체적으로, 상기 hUC-MSC와 TMD-SDCs를 2D 및 3D 배양 방식으로 공배양 후, CCK8과 현미경 관찰을 통해 세포 증식률을 분석하였고, 염증성 사이토카인(TNF-alpha)과 세포 외 기질 분해 인자(MMP13 및ADAMTS5)의 유전자 발현을 RT-PCR로 분석하였다.
그 결과, 도 9에 도시된 바와 같이, 2D 공배양 군에 비해 3D 공배양 군에서 hUC-MSC이 더 높은 세포 증식률을 나타내었고, 2D 공배양 군과 3D 공배양 군 모두 TNF-alpha와 ADAMTS5를 유의하게 감소시키었으나, MMP13는 3D MSCs 공배양 그룹에서만 유의하게 감소시키는 것으로 확인되었다. 또한, 염증성 사이토카인 TNF-alpha의 유전자 발현양이 두 군에서 모두 유의하게 감소시키지만 3D 공배양 군에서 특히 더 큰 유의성을 나타내었다. 이는 3D 공배양 시, 2D 공배양에 비해 손상 부위의 세포 증식률을 더 높이고, 염증과 세포 외 기질 분해를 감소시켜 치료 효능을 향상시킨다는 것을 보여주는 결과이다.
실시예 8: 턱관절염 실험 동물 모델에서의 효과 확인
[8-1] 턱관절염 동물 모델의 제작
턱관절염 랫드 모델(Spragure Dawley Rat(230 ±13 g) female, 8주령)의 랫드를 다음과 같이 네 개의 그룹으로 무작위로 나누었다:(1) 정상대조군,(2) 턱관절염(Temporomandibular joint Osteoarthritis, TMJ OA) 유발,(3) TMJ OA 유발 + 염증성 사이토카인 자극(Primed) + 2D 배양된 MSCs 및 (4) TMJ OA 유발 + 염증성 사이토카인 자극(Primed) + 3D 배양된 MSCs 스페로이드. 상기 TMJ OA는 Monosodium iodoacetate(0.5 mg/ 50 ulsaline)을 양쪽 하악관절 내강에 주사하여 유발하였다. 상기 TMJ OA 유발 이후, 2주 후에 각 그룹 별로 상기 염증성 사이토카인으로 자극되고 2D 배양된 MSCs(이하, 2D MSCs) 4ⅹ105개의 세포 또는 상기 실시예 1의 상기 염증성 사이토카인으로 자극되고 3D 배양된 MSCs 스페로이드(이하, 3D MSCs) 10개(40,000 cellⅹ10)의 세포를 관절 내 주사하여 치료하였다. 상기 랫드는 치료 후 2주, 4주 및 8주간 관찰하고 분석하였다. 모든 동물 실험 절차는 아산의료원 생명과학연구소의 IACUC의 검토를 거쳐 승인되었으며, 동물자원 연구소의 지침에 따라 진행되었다.
[8-2] 턱관절염 실험 모델의 micro-CT 촬영
상기 랫드 턱관절염 모델의 생체 내 micro-CT 영상 촬영은 bench-top cone-beam-type in vivo animal scanner(SkyScan 167, Bruker-microCT, Knotich, Belgium)을 사용하여 수행하였다. 2D 및 3D 이미지는 DataViewer(SkyScan) 및 CTvox(Bruker)를 사용하여 그룹 간 관절 연골하부뼈 변화를 비교하였다.
그 결과, 도 10에 도시된 바와 같이, 상기 두 MSC 치료 그룹의 연골하부뼈가 시간이 경과함에 따라 회복되는 것을 확인할 수 있다. 하지만 치료속도에 있어 3D MSCs 치료 그룹이 확연한 차이를 보이며, 8주 경과 후 3D MSCs 치료 그룹은 관절 외곽 측면이 거의 완전히 회복된 것을 확인할 수 있다. 이는 3D MSCs가 연골하부의 손상을 더 빨리 회복시키는 것을 보여주는 결과이다.
[8-3] 턱관절염 실험 모델의 병리조직학적 분석
상기 턱관절염 실험 동물모델의 하악관절 중 병리조직분석용 시료를 채취하여, 10% 중성 버퍼 포르말린에 고정하였다. 상기 Micro-CT 촬영 후, 상기 시료는 탈회 과정을 거쳐 파라핀 블럭으로 제작하여 조직을 준비하였다. 상기 TMJ 파라핀 블럭은 sagittal 방향으로 5 um의 두께의 연속된 단면으로 절단하였고, Fast green/Safranin O 염색한 후, 2주, 4주 및 8주간 관찰하였다.
그 결과, 도 11의 (A)에 도시된 바와 같이, 상기 2D MSCs 치료 그룹과 비교하여 3D MSCs 치료 그룹에서 표면 변화가 적고 프로테오글리칸 손실이 회복되는 것으로 확인되었다. 또한, 2주 지점에서 두 그룹 모두 연골세포의 감소, 세포 배열의 변화, 섬유층의 비정상적 과대성장, 세포질의 변화 및 Safranin O(SO) 염색의 심한 손실이 관찰되었으나, 두 그룹 모두 시간이 지남에 따라 점진적으로 회복을 보여주었고, 8주 지점에서 3D MSCs 치료 그룹은 세포 배열, 섬유층 및 세포질 면에서 원래의 형태에 가까운 수준으로 회복된 것으로 확인되었다. 이는 3D MSCs를 주입했을 때, 2D MSCs보다 줄기세포의 턱관절염에 대한 치료 효능이 향상되는 것을 보여준다.
[8-4] 턱관절염 실험 모델의 행동 실험
상기 랫드 턱관절염 모델에 대하여 기계적이질통검사(von Frey microfilament)를 이용해 통증 검사(Mechanical hyper-nociception)를 수행하였다. 상기 검사 방법은 동물 모델의 TMJ OA 병변에 반사 반응(head withdrawal)이 유발되는 힘의 임계 강도를 측정하는 것이다. Head withdrawal의 임계값(HWT)은 최소한 세 번 이상 반응을 유발한 필라멘트의 가장 낮은 힘으로 정의된다. 상기 HWT 측정은 일주일 간격으로 시행되었으며, 그룹 당 네 마리의 쥐의 평균값으로 계산하였고, 랫드의 전이비후 부위에 낮은 힘부터 시작하는 연속된 필라멘트를 적용하여 머리 철수를 평가하였다. 기술적 재현성은 두 명의 실험자에 의해 수행되었다.
그 결과, 도 11의 (B)에 도시된 바와 같이, 2D MSCs 및 3D MSCs 치료 그룹은 모두 어느 정도의 회복을 보여주지만, 회복 속도에 뚜렷한 차이가 있는 것으로 확인되었다. 도 11 (B)의 D+0 기준은 MIA 주사로 OA가 유발된 시간을 의미하며, 상기 2D MSCs와 3D MSCs를 주입하여 치료한 후 2주(2W) 지점에서, 3D MSCs 치료 그룹은 매우 빠른 속도로 회복하는 것으로 확인되었다. 이는 통증반응에서도 3D MSCs를 주입 시 치료 효능이 더 향상되는 것을 보여주는 결과이다.
[8-5] 2D와 3D 스페로이드의 턱관절염 동물 모델 하악과두 내의 인간 미토콘드리아(Human mitochondria) 잔존 여부 확인
상기 턱관절염 실험 동물 모델의 하악과두 내의 2D MSCs와 3D MSCs의 생존 및 치료 효능 지속 기간을 비교하였다. 구체적으로, 상기 실시예 8-1의 동물 모델의 하악관절 중 병리조직분석용 시료를 채취하여, 인간 미토콘드리아(human mitochondria) 검출 유무를 확인하였다.
그 결과, 도 12에 나타낸 바와 같이, 상기 2D MSCs와 3D MSCs를 주입하여 치료한 후 4주(4W) 지점에서, 3D MSCs 치료군에서만 human mitochondria가 검출되었으며, 8주(8W) 지점에서는 두 그룹 치료군 모두에서 human mitochondria가 검출되지 않았다. 이는, 본 발명의 3D MSCs가 세포 치료에 효과적인 세포 형태이며, 치료 효능 지속 시간은 약 4주라는 것을 보여주는 결과이다.
상기에서는 본 발명의 대표적인 실시예를 예시적으로 설명하였으나, 본 발명의 범위는 상기와 같은 특정 실시예에만 한정되지 아니하며, 해당 분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 본 출원의 청구범위에 기재된 범주 내에서 적절하게 변경이 가능할 것이다.

Claims (23)

  1. 줄기세포를 3차원 배양(3-Dimensional culture)하는 단계; 및
    상기 3차원 배양된 줄기세포에 염증성 사이토카인을 처리하는 단계;
    를 포함하는, 줄기세포 스페로이드의 제조방법.
  2. 청구항 1에 있어서,
    상기 줄기세포는 유도된 다능력 줄기세포(induced pluripotent stem cell: iPS cells), 배아유래 줄기세포 및 성체 줄기세포로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나인 것인, 줄기세포 스페로이드의 제조방법.
  3. 청구항 2에 있어서,
    상기 성체 줄기세포는 중간엽 줄기세포, 지방유래 줄기세포, 내피 줄기세포 및 조혈 줄기세포로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나인 것인, 줄기세포 스페로이드의 제조방법.
  4. 청구항 3에 있어서,
    상기 중간엽 줄기세포는 뼈, 연골, 지방, 힘줄, 신경조직, 섬유아세포, 골수, 제대혈, 배낭(embryonic yolk sac), 제대조직, 피부, 말초혈액, 근육, 간, 태아막(fetal membrane), 활액막(synovium), 전십자인대(anterior cruciate ligament), 관절연골세포(articular chondrocytes) 및 섬유연골(fibrocartilage)로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나로부터 유래한 것인, 줄기세포 스페로이드의 제조방법.
  5. 청구항 1에 있어서,
    상기 3차원 배양하는 단계는 하나의 스페로이드 당 300 내지 100,000개의 줄기세포를 분주(seeding)하여 배양하는 것인, 줄기세포 스페로이드의 제조방법.
  6. 청구항 1에 있어서,
    상기 염증성 사이토카인은 IFN-γ(interferon-gamma), TNF-α(tumor necrosis factor-α) 및 IL-1β(interleukin-1β)로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나인 것인, 줄기세포 스페로이드의 제조방법.
  7. 청구항 1에 있어서,
    상기 염증성 사이토카인은 2 내지 1000IU/mL의 농도로 처리하는 것인, 줄기세포 스페로이드의 제조방법.
  8. 청구항 1에 있어서,
    상기 염증성 사이토카인은 상기 3차원 세포 배양한 지 0 초과 120 이하의 시간이 경과된 이후에 처리하는 것인, 줄기세포 스페로이드의 제조방법.
  9. 청구항 1에 있어서,
    상기 줄기세포 스페로이드는 IDO(indoleamine 2,3-dioxygenase) 및 FGF2(fibroblast growth factor 2)로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나의 유전자가 과발현된 것인, 줄기세포 스페로이드의 제조방법.
  10. 청구항 9에 있어서,
    상기 IDO의 농도는 정량 한계는 0.5 ng/ml 이상, 상기 FGF2의 농도는 6 pg/ml 이상인, 줄기세포 스페로이드의 제조방법.
  11. 청구항 1에 있어서,
    상기 줄기세포 스페로이드는 턱관절 질환 예방 또는 치료용인 것인, 줄기세포 스페로이드의 제조방법.
  12. 청구항 1에 있어서,
    상기 줄기세포 스페로이드는 하기 i) 내지 iii) 중 적어도 하나의 특징을 갖는 것인, 줄기세포 스페로이드의 제조방법:
    i) TNF-α 및 IL-1β로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 염증 유발 인자의 발현을 억제,
    ii) ADAMTS5 및 MMP13 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 세포 외 기질 분해인자의 발현을 억제, 및
    iii) 연골세포와 연골 내 존재하는 섬유연골 줄기세포의 사멸율 감소.
  13. IDO(indoleamine 2,3-dioxygenase) 및 FGF2(fibroblast growth factor 2)로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나의 유전자를 과발현하는, 3차원의 줄기세포 스페로이드를 유효성분으로 포함하는, 턱관절 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  14. 청구항 13에 있어서,
    상기 3차원의 줄기세포 스페로이드는 청구항 1의 줄기세포 스페로이드의 제조방법에 의해 제조된 것인, 턱관절 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  15. 청구항 13에 있어서,
    상기 IDO의 농도는 정량 한계는 0.5 ng/ml 이상, 상기 FGF2의 농도는 6 pg/ml 이상인, 턱관절 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  16. 청구항 13에 있어서,
    상기 줄기세포는 유도된 다능력 줄기세포(induced pluripotent stem cell: iPS cells), 배아유래 줄기세포 및 성체 줄기세포로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나인 것인, 턱관절 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  17. 청구항 16에 있어서,
    상기 성체 줄기세포는 중간엽 줄기세포, 지방유래 줄기세포, 내피 줄기세포 및 조혈 줄기세포로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나인 것인, 턱관절 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  18. 청구항 17에 있어서,
    상기 중간엽 줄기세포는 뼈, 연골, 지방, 힘줄, 신경조직, 섬유아세포, 골수, 제대혈, 배낭(embryonic yolk sac), 제대조직, 피부, 말초혈액, 근육, 간, 태아막(fetal membrane), 활액막(synovium), 전십자인대(anterior cruciate ligament), 관절연골세포(articular chondrocytes) 및 섬유연골(fibrocartilage)로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나로부터 유래한 것인, 턱관절 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  19. 청구항 13에 있어서,
    상기 턱관절 질환은 측두하악관절장애 또는 저작근장애인 것인, 턱관절 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  20. 청구항 19에 있어서,
    상기 측두하악관절장애는 염증성 장애, 관절원판 장애, 탈구, 강직 및 골절로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나로부터 유래하는 것인, 턱관절 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  21. 청구항 20에 있어서,
    상기 염증성 장애는 관절낭염, 원판후조직염 및 골관절염로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나이고,
    상기 관절원판 장애는 선천성 및 발육 관절원판 장애(congenital and developmental disc derangement disorders) 및 관절원판변위(disc displacement) 로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나인, 턱관절 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  22. 청구항 19에 있어서,
    상기 저작근장애는 근막통증(myofascial pain), 근염(myositis), 근경련(myospasm), 국소근통증(local muscle soreness), 보호성근긴장(protective muscle splinting), 근경축(muscle contracture) 및 신생물(neoplasia)로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나인, 턱관절 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  23. 청구항 13에 있어서,
    상기 줄기세포 스페로이드는 하기 i) 내지 iii) 중 적어도 하나의 특징을 갖는 것인, 턱관절 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물:
    i) TNF-α 및 IL-1β로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 염증 유발 인자의 발현을 억제,
    ii) ADAMTS5 및 MMP13 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 세포 외 기질 분해인자의 발현을 억제, 및
    iii) 연골세포와 연골 내 존재하는 섬유연골 줄기세포의 사멸율 감소.
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