WO2025137828A1 - 一种基因点突变小鼠模型构建方法 - Google Patents

一种基因点突变小鼠模型构建方法 Download PDF

Info

Publication number
WO2025137828A1
WO2025137828A1 PCT/CN2023/141592 CN2023141592W WO2025137828A1 WO 2025137828 A1 WO2025137828 A1 WO 2025137828A1 CN 2023141592 W CN2023141592 W CN 2023141592W WO 2025137828 A1 WO2025137828 A1 WO 2025137828A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
mice
mouse
mutation
kcnq2
point mutation
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
PCT/CN2023/141592
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
胡昱
林剑邦
李梦奇
吴代强
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Shenzhen Institute of Advanced Technology of CAS
Original Assignee
Shenzhen Institute of Advanced Technology of CAS
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Shenzhen Institute of Advanced Technology of CAS filed Critical Shenzhen Institute of Advanced Technology of CAS
Priority to PCT/CN2023/141592 priority Critical patent/WO2025137828A1/zh
Publication of WO2025137828A1 publication Critical patent/WO2025137828A1/zh
Anticipated expiration legal-status Critical
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K67/00—Rearing or breeding animals, not otherwise provided for; New or modified breeds of animals
    • A01K67/027—New or modified breeds of vertebrates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/87—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation
    • C12N15/89—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation using microinjection

Definitions

  • CRISPR/Cas9 is a technology that uses Cas9 nuclease to edit targeted genes under the guidance of sgRNA (small guide RNA).
  • the working principle of CRISPR/Cas9 is that CRRNA (CRISPR-derived RNA, gene editing technology) combines with tracrRNA (trans-activating crRNA) through base pairing to form a tracrRNA/crRNA complex. This complex guides the Cas9 protein to cut double-stranded DNA at the sequence target site paired with crRNA.
  • RNAs By artificially designing two RNAs, crRNA and tracrRNA, they are transformed into sgRNA with guiding function, thereby guiding the Cas9 protein to cut DNA at a fixed point and generate a double-stranded DNA gap with a flat end, thereby initiating the DNA damage repair mechanism, mainly through NHEJ (Nonhomologous end joining) or HR (Homologous recombination) to connect the sequences at the upstream and downstream ends of the break.
  • NHEJ Nonhomologous end joining
  • HR Homologous recombination
  • the present application provides a method for constructing a gene point mutation mouse model, which aims to solve at least one of the above-mentioned technical problems in the prior art to a certain extent.
  • a method for constructing a gene point mutation mouse model comprising:
  • a pair of identification primers F1 and R1 were designed at both ends of the mutation site, and the offspring mice were identified to screen out Kcnq2 T274M/+ point mutation mice with successful knock-in of the T274M mutation.
  • sgRNA CCCGTAGCCAATG GTCGTCA, and use SpCas9 to detect sgRNA;
  • ssODN was designed: GCCCAAGTAACCAGAGCCCCTTACCCCTCAGATCATGCTGA CGACC ATTGGCTACGG GGACAAGTACCCTCA, and c.821C>T,822 C>G leads to p.AThr274Met mutation was introduced after homologous recombination.
  • the technical solution adopted in the embodiment of the present application also includes: injecting a certain amount of After the administration of PMSG and hCG, the mice were mated with male mice, and the fertilized eggs were collected from the mated female mice, specifically:
  • the technical solution adopted in the embodiment of the present application also includes: injecting the Cas9 protein, ssODN and sgRNA into the pronucleus of the fertilized egg by microinjection technology, and transplanting the injected fertilized egg into the ampulla of the oviduct of the surrogate mother mouse, and further includes:
  • the surrogate mother mouse is weighed at set intervals to determine whether the fertilized egg is successfully pregnant.
  • the technical solution adopted in the embodiment of the present application also includes: after obtaining the offspring after the surrogate mother mouse gives birth, it also includes:
  • the offspring were tail-clipped, numbered, and subjected to PCR testing to obtain F0 mice.
  • the technical solution adopted in the embodiment of the present application also includes: according to the site of the Kcnq2 gene point mutation, a pair of identification primers F1 and R1 are designed at both ends of the mutation site respectively, specifically:
  • F1 GCCTTGTTTGGCACTAGTATGG, R1:CCTACATCCTTGGAATTATCTAGC.
  • the technical solution adopted in the embodiment of the present application also includes: the offspring mice are identified to screen out Kcnq2 T274M/+ point mutation mice with successful knock-in of T274M mutation: specifically:
  • the F0 mice were amplified by PCR primers and sent for sequencing.
  • the product amplified by the primers in the knockout mice was 788 bp.
  • the F0 mice were identified by Sanger sequencing.
  • F0 mice with c.821C>T,822 C>G were identified as Kcnq2 T274M/+ positive F0 mice with successful knock-in of T274M mutation;
  • the Kcnq2 T274M/+ positive F0 mice were used as the father/mother and mated with wild-type mice to obtain F1 mice. PCR primer amplification and identification were performed on the F1 mice after a set time of birth, and Sanger sequencing was used to identify the F1 mice. The F1 mice with sequencing results of c.821C>T, 822 C>G were identified as Kcnq2 T274M/+ positive F1 mice.
  • the beneficial effects of the embodiments of the present application are as follows: the method for constructing a gene point mutation mouse model in the embodiment of the present application designs sgRNA and ssODN with the T274M mutation on Kcnq2 Exon6 as the target, injects Cas9 protein containing azide non-natural amino acid, DBCO-modified ssODN and screened gRNA by microinjection technology, and constructs a Kcnq2 T274M/+ point mutation knock-in mouse model based on CRISPR/Cas9.
  • the preparation is simple and the repeatability is strong. While improving the editing efficiency, a larger number of Kcnq2 T274M/+ point mutation mice can be obtained.
  • FIG1 is a flow chart of a method for constructing a gene point mutation mouse model according to an embodiment of the present application
  • FIG2 is a schematic diagram of the Kcnq2 T274M/+ mouse preparation strategy of the present application example
  • FIG3 is a peak diagram of Kcnq2 T274M/+ mouse identification according to an embodiment of the present application.
  • first”, “second”, and “third” in this application are used for descriptive purposes only and should not be understood as indicating or implying relative importance or implicitly indicating the number of the indicated technical features.
  • the feature of “first”, “second” and “third” may include at least one of the features explicitly or implicitly.
  • the meaning of “multiple” is at least two, such as two, three, etc., unless otherwise clearly and specifically limited.
  • all directional indications (such as up, down, left, right, front, back %) are only used to explain the relative position relationship, movement, etc. between the components under a certain specific posture (as shown in the accompanying drawings). If the specific posture changes, the directional indication also changes accordingly.
  • the present invention uses azide non-natural amino acid-containing Cas9 protein, DBCO-modified ssODN and screened sgRNA for injection through microinjection technology, which is simple to prepare and has high HDR efficiency, and can obtain a larger number of Kcnq2-T274M knock-in positive F0 mice.
  • Figure 1 is a flow chart of the method for constructing a gene point mutation mouse model according to an embodiment of the present application.
  • the method for constructing a gene point mutation mouse model according to an embodiment of the present application comprises the following steps:
  • mice 4-6 week old SPF (Specific pathogen Free, referring to animals without specific microorganisms and parasites in the body) grade female mice are selected as egg donors, 10 IU (International Unit, medical potency unit) of PMSG is injected into the female mice intraperitoneally, and 0.8 IU of hCG is injected into the mice intraperitoneally after a set interval (48h), and then the mice are mated with male mice with normal reproductive capacity, and the mouse fertilized eggs are collected, and the fertilized eggs are digested, washed, and stored in an incubator at 37°C for use.
  • the above parameters such as age, injection parameters, interval time, and storage temperature can be set according to the actual application scenario.

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Environmental Sciences (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Animal Husbandry (AREA)
  • Biodiversity & Conservation Biology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

本申请公开了一种基因点突变小鼠模型构建方法，包括：以Kcnq2 Exon6上的T274M突变为靶点设计sgRNA和ssODN；选取设定周龄的雌性小鼠作为卵子供体，在所述雌性小鼠腹腔注射一定剂量的血清促性腺激素和人体绒膜促性腺激素后与种公鼠进行交配，并对交配后的雌性小鼠进行受精卵采集；通过显微注射技术将Cas9蛋白、ssODN和sgRNA注射入所述受精卵的原核内，将注射后的受精卵移植到代孕母鼠的输卵管壶腹部中，并在代孕母鼠分娩后获得仔鼠；根据Kcnq2基因点突变的位点，分别在突变位点两端设计一对鉴定引物F1,R1，并对所述仔鼠进行鉴定，筛选出成功敲入T274M突变的Kcnq2 T274M/+点突变小鼠。

Description

一种基因点突变小鼠模型构建方法 技术领域
本申请属于转基因技术领域，特别涉及一种基因点突变小鼠模型构建方法。
背景技术
CRISPR/Cas9是一种由sgRNA(small guide RNA，小向导RNA)指导，利用Cas9核酸酶对靶向基因进行编辑的技术。CRISPR/Cas9的工作原理是CRRNA(CRISPR-derived RNA，基因编辑技术)通过碱基配对与tracrRNA(trans-activating crRNA，反式激活crRNA)结合形成tracrRNA/crRNA复合物，此复合物会引导Cas9蛋白在与crRNA配对的序列靶位点剪切双链DNA，通过人工设计crRNA和tracrRNA两种RNA，改造成具有引导作用的sgRNA，从而引导Cas9蛋白对DNA的定点切割，并产生一个平末端的双链DNA缺口，进而启动DNA损伤修复机制，主要通过NHEJ(Nonhomologous end joining，非同源末端连接)或HR(Homologous recombination，同源重组)的方式将断裂上下游两端的序列连接起来。随着CRISPR/Cas9技术的普及，让基因点突变小鼠模型的构建变得简便且易得。例如，2019年由Milh et al.构建的Kcnq2-T274M敲入小鼠，杂合即可表现出自发癫痫。但由于该模型使用的是ES细胞(Embryonic stem cell，胚胎干细胞)打靶技术，得到的阳性小鼠数目不够稳定，且可重复性较差。
发明内容
本申请提供了一种基因点突变小鼠模型构建方法，旨在至少在一定程度上解决现有技术中的上述技术问题之一。
为了解决上述问题，本申请提供了如下技术方案：
一种基因点突变小鼠模型构建方法，包括：
以Kcnq2 Exon6上的T274M突变为靶点设计sgRNA和ssODN；
选取设定周龄的雌性小鼠作为卵子供体，在所述雌性小鼠腹腔注射一定剂量的PMSG和hCG后，与种公鼠进行交配，并对交配后的雌性小鼠进行受精卵采集；
通过显微注射技术将Cas9蛋白、ssODN和sgRNA注射入所述受精卵的原核内，将注射后的受精卵移植到代孕母鼠的输卵管壶腹部中，并在代孕母鼠分娩后获得仔鼠；
根据Kcnq2基因点突变的位点，分别在突变位点两端设计一对鉴定引物F1,R1，并对所述仔鼠进行鉴定，筛选出成功敲入T274M突变的Kcnq2T274M/+点突变小鼠。
本申请实施例采取的技术方案还包括：所述以Kcnq2 Exon6上的T274M突变为靶点设计sgRNA和ssODN，具体为：
设计sgRNA:CCCGTAGCCAATG GTCGTCA，利用SpCas9对sgRNA进行检测；
设计ssODN:GCCCAAGTAACCAGAGCCCCTTACCCCTCAGATCATGCTGA CGACC ATTGGCTACGG GGACAAGTACCCTCA，同源重组后引入c.821C>T,822 C>G leads to p.AThr274Met突变。
本申请实施例采取的技术方案还包括：所述选取设定周龄的雌性小鼠作为卵子供体，具体为：
选取4-6周龄的SPF级雌性小鼠作为卵子供体。
本申请实施例采取的技术方案还包括：所述在所述雌性小鼠腹腔注射一定 剂量的PMSG和hCG后，与种公鼠进行交配，并对交配后的雌性小鼠进行受精卵采集，具体为：
在所述雌性小鼠腹腔注射10 IU的PMSG，并在设定间隔时间后在雌性小鼠腹腔注射0.8 IU的hCG，然后使所述雌性小鼠与生殖能力正常的种公鼠进行交配，采集雌性小鼠受精卵，并将所述受精卵进行消化洗涤后存放于设定温度的培养箱中。
本申请实施例采取的技术方案还包括：所述通过显微注射技术将Cas9蛋白、ssODN和sgRNA注射入所述受精卵的原核内，将注射后的受精卵移植到代孕母鼠的输卵管壶腹部中之后，还包括：
每隔设定时间对所述代孕母鼠进行体重称量，判断所述受精卵是否怀孕成功。
本申请实施例采取的技术方案还包括：所述在代孕母鼠分娩后获得仔鼠之后，还包括：
在分娩设定时间后对所述仔鼠进行剪尾编号以及PCR检测，得到F0小鼠。
本申请实施例采取的技术方案还包括：所述根据Kcnq2基因点突变的位点，分别在突变位点两端设计一对鉴定引物F1,R1具体为：
F1:GCCTTGTTTGGCACTAGTATGG，R1:CCTACATCCTTGGAATTATCTAGC。
本申请实施例采取的技术方案还包括：所述对所述仔鼠进行鉴定，筛选出成功敲入T274M突变的Kcnq2T274M/+点突变小鼠：具体为：
对所述F0小鼠进行PCR引物扩增并送测序，该引物在基因敲除小鼠中扩增的产物为788 bp；并采用Sanger测序对所述F0小鼠进行鉴定，将测序结果为 c.821C>T,822 C>G的F0小鼠鉴定为成功敲入T274M突变的Kcnq2T274M/+阳性F0小鼠；
将所述Kcnq2T274M/+阳性F0小鼠作为父/母本，与野生型小鼠交配获得F1小鼠，对所述F1小鼠出生设定时间后进行PCR引物扩增鉴定，并采用Sanger测序对所述F1小鼠进行鉴定，将测序结果为c.821C>T,822 C>G的F1小鼠鉴定为Kcnq2T274M/+阳性F1小鼠。
相对于现有技术，本申请实施例产生的有益效果在于：本申请实施例的基因点突变小鼠模型构建方法以Kcnq2 Exon6上的T274M突变为靶点设计sgRNA和ssODN，将采用含叠氮非天然氨基酸的Cas9蛋白、DBCO修饰的ssODN和筛选所得gRNA通过显微注射技术进行注射，基于CRISPR/Cas9构建Kcnq2T274M/+点突变敲入小鼠模型，制备简单，可重复率强，在提高编辑效率的同时，能够得到更多数量的Kcnq2T274M/+点突变小鼠。
附图说明
图1是本申请实施例的基因点突变小鼠模型构建方法的流程图；
图2为本申请实施例的Kcnq2T274M/+小鼠制备策略示意图；
图3为本申请实施例的Kcnq2T274M/+小鼠鉴定峰图。
具体实施方式
下面将结合本申请实施例中的附图，对本申请实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅是本申请的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本申请中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本申请保护的范围。
本申请中的术语“第一”、“第二”、“第三”仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。由此，限定 有“第一”、“第二”、“第三”的特征可以明示或者隐含地包括至少一个该特征。本申请的描述中，“多个”的含义是至少两个，例如两个，三个等，除非另有明确具体的限定。本申请实施例中所有方向性指示(诸如上、下、左、右、前、后……)仅用于解释在某一特定姿态(如附图所示)下各部件之间的相对位置关系、运动情况等，如果该特定姿态发生改变时，则该方向性指示也相应地随之改变。此外，术语“包括”和“具有”以及它们任何变形，意图在于覆盖不排他的包含。例如包含了一系列步骤或单元的过程、方法、系统、产品或设备没有限定于已列出的步骤或单元，而是可选地还包括没有列出的步骤或单元，或可选地还包括对于这些过程、方法、产品或设备固有的其它步骤或单元。
在本文中提及“实施例”意味着，结合实施例描述的特定特征、结构或特性可以包含在本申请的至少一个实施例中。在说明书中的各个位置出现该短语并不一定均是指相同的实施例，也不是与其它实施例互斥的独立的或备选的实施例。本领域技术人员显式地和隐式地理解的是，本文所描述的实施例可以与其它实施例相结合。
为解决现有技术的不足，本发明中将采用含叠氮非天然氨基酸的Cas9蛋白、DBCO修饰的ssODN和筛选所得sgRNA通过显微注射技术进行注射，制备简单，HDR效率高，能够得到更大数量的Kcnq2-T274M敲入阳性F0小鼠。
具体地，请参阅图1，是本申请实施例的基因点突变小鼠模型构建方法的流程图。本申请实施例的基因点突变小鼠模型构建方法包括以下步骤：
S100：以Kcnq2(基因相关癫痫)Exon6上的T274M突变为靶点设计sgRNA和ssODN；
本步骤中，由于T274M突变(c.821C>T,822 C>G leads to p.AThr274Met)在人群中的发病率更高，因此本申请实施例选取T274M突变为靶点。T274M发生在Exon6上，首先设计sgRNA:CCCGTAGCCAATG GTCGTCA，经体外SpCas9(一种由crRNA和tracrRNA共同(或两者融合后形成的sgRNA)引导的DNA内切核酸酶)对sgRNA进行检测。同时设 ssODN:GCCCAAGTAACCAGAGCCCCTTACCCCTCAGATCATGCTGA CGACC ATTGGCTACGG GGACAAGTACCCTCA，同源重组后引入c.821C>T,822 C>G leads to p.AThr274Met突变。具体如图2所示，为本申请实施例的Kcnq2T274M/+小鼠制备策略示意图，其中，Wild type allele表示野生臂；ssODN表示单链寡核苷酸；Targeted allele表示靶向臂，Exon表示外显子；Coding region表示编码区域；Untranslated region表示非编码区。
S110：选取设定周龄的雌性小鼠作为卵子供体，在该小鼠腹腔注射一定剂量的血清促性腺激素(Pregnant Mare Serum Gonadotropin,PMSG)和人体绒膜促性腺激素(Human Chorionic Gonadotropin,hCG)后，与种公鼠进行交配，并对交配后的雌性小鼠进行受精卵采集；
本步骤中，选取4-6周龄的SPF(Specific pathogen Free,指机体内无特定微生物和寄生虫存在的动物)级雌性小鼠作为卵子供体，在雌性小鼠腹腔注射10 IU(International Unit，医学效价单位)的PMSG，并在设定间隔时间(48h)后在小鼠腹腔注射0.8 IU的hCG，然后使小鼠与生殖能力正常的种公鼠进行交配，采集小鼠受精卵，并将受精卵进行消化洗涤后存放于37℃的培养箱中待用。可以理解，上述周龄、注射参数、间隔时间以及存放温度等参数可根据实际应用场景进行设定。
S120：通过显微注射技术将Cas9蛋白、ssODN和sgRNA注射入受精卵的原核内，将注射后的受精卵移植到代孕母鼠的输卵管壶腹部中进行代孕，并在代孕母鼠分娩后获得仔鼠；
本步骤中，通过显微注射技术将含有叠氮非天然氨基酸的Cas9蛋白、DBCO修饰的ssODN和sgRNA注射入受精卵的原核内，再将受精卵移植到代孕母鼠输卵管壶腹部中，每隔设定时间(一周)对代孕母鼠进行体重称量，判断受精卵是否怀孕成功，如果怀孕成功，在注射19-21天后代孕母鼠分娩仔鼠，并在分娩设定时间(5天)后对仔鼠进行剪尾编号以及PCR(polymerase chain reaction，聚合酶链反应)检测，得到F0小鼠(F0小鼠是指剪尾鉴定得到的阳 性鼠，即首建鼠)。
S130：根据Kcnq2基因点突变的位点，分别在突变位点两端设计一对鉴定引物F1,R1，并对F0小鼠进行鉴定，筛选出成功敲入T274M突变的Kcnq2T274M/+点突变小鼠；
本步骤中，小鼠鉴定方式具体为：根据Kcnq2基因点突变的位点，分别在突变位点两端设计一对鉴定引物F1,R1,F1:GCCTTGTTTGGCACTAGTATGG，R1:CCTACATCCTTGGAATTATCTAGC；然后对F0小鼠进行PCR引物扩增并送测序，该引物在基因敲除小鼠中扩增的产物为788 bp；并采用Sanger测序对F0小鼠进行鉴定，将测序结果为c.821C>T,822 C>G的F0小鼠鉴定为成功敲入T274M突变的Kcnq2T274M/+阳性F0小鼠。选取Kcnq2T274M/+阳性F0小鼠作为父/母本进行繁育，将选取的Kcnq2T274M/+阳性F0小鼠与野生型小鼠交配获得F1小鼠(f1小鼠是指两个近交品系动物之间进行有计划交配所获得的第一代小鼠)，在F1小鼠出生设定时间(14天)后进行PCR引物扩增鉴定小鼠纯杂合，鉴定引物与F0小鼠相同，并采用Sanger测序对F1小鼠进行鉴定，将测序结果为c.821C>T,822 C>G的F1小鼠鉴定为Kcnq2T274M/+阳性F1小鼠。具体如图3所示，为本申请实施例的Kcnq2T274M/+小鼠鉴定峰图，其中WT表示野生型，KI表示敲入。利用本申请获得的Kcnq2T274M/+点突变小鼠可用于癫痫疾病的机制与治疗研究，还可以应用于其他有Kcnq2基因突变引起的疾病研究。
在本申请其他实施例中，还可以通过小鼠胚胎单细胞(ES细胞)打靶技术制备Kcnq2T274M/+点突变小鼠，利用细胞内染色体DNA和导入细胞的外源DNA在相同序列的区域内发生同源重组现象，在小鼠ES细胞中定点破坏内源基因，然后利用ES细胞发育的全能性，获得从ES细胞发育而来的敲入Kcnq2T274M/+点突变的杂合子小鼠。
为了验证本申请实施例的可行性和有效性，将含叠氮非天然氨基酸的Cas9蛋白、DBCO修饰的ssODN和gRNA通过显微注射技术注射入约40个 受精卵的原核内，分娩出25只后代，经鉴定其中7只为阳性小鼠。试验结果表明，本申请实施例的HDR(Homology directed repair，同源介导的双链DNA修复)效率高，能够得到更多数量的Kcnq2T274M/+点突变小鼠。
基于上述，本申请实施例的基因点突变小鼠模型构建方法以Kcnq2 Exon6上的T274M突变为靶点设计sgRNA和ssODN，将采用含叠氮非天然氨基酸的Cas9蛋白、DBCO修饰的ssODN和筛选所得gRNA通过显微注射技术进行注射，基于CRISPR/Cas9构建Kcnq2T274M/+点突变敲入小鼠模型，制备简单，在提高编辑效率的同时，能够得到更多数量的Kcnq2T274M/+点突变小鼠。利用本申请获得的Kcnq2T274M/+点突变小鼠可用于癫痫疾病的机制与治疗研究，还可以应用于其他有Kcnq2基因突变引起的疾病研究。
在本申请所提供的几个实施例中，应该理解到，所揭露的系统，装置和方法，可以通过其它的方式实现。例如，以上所描述的系统实施例仅仅是示意性的，例如，单元的划分，仅仅为一种逻辑功能划分，实际实现时可以有另外的划分方式，例如多个单元或组件可以结合或者可以集成到另一个系统，或一些特征可以忽略，或不执行。另一点，所显示或讨论的相互之间的耦合或直接耦合或通信连接可以是通过一些接口，装置或单元的间接耦合或通信连接，可以是电性，机械或其它的形式。
另外，在本申请各个实施例中的各功能单元可以集成在一个处理单元中，也可以是各个单元单独物理存在，也可以两个或两个以上单元集成在一个单元中。上述集成的单元既可以采用硬件的形式实现，也可以采用软件功能单元的形式实现。以上仅为本申请的实施方式，并非因此限制本申请的专利范围，凡是利用本申请说明书及附图内容所作的等效结构或等效流程变换，或直接或间接运用在其他相关的技术领域，均同理包括在本申请的专利保护范围内。

Claims (8)

  1. 一种基因点突变小鼠模型构建方法，其特征在于，包括：
    以Kcnq2 Exon6上的T274M突变为靶点设计sgRNA和ssODN；
    选取设定周龄的雌性小鼠作为卵子供体，在所述雌性小鼠腹腔注射一定剂量的PMSG和hCG后，与种公鼠进行交配，并对交配后的雌性小鼠进行受精卵采集；
    通过显微注射技术将Cas9蛋白、ssODN和sgRNA注射入所述受精卵的原核内，将注射后的受精卵移植到代孕母鼠的输卵管壶腹部中，并在代孕母鼠分娩后获得仔鼠；
    根据Kcnq2基因点突变的位点，分别在突变位点两端设计一对鉴定引物F1,R1，并对所述仔鼠进行鉴定，筛选出成功敲入T274M突变的Kcnq2T274M/+点突变小鼠。
  2. 根据权利要求1所述的基因点突变小鼠模型构建方法，其特征在于，所述以Kcnq2 Exon6上的T274M突变为靶点设计sgRNA和ssODN，具体为：
    设计sgRNA:CCCGTAGCCAATG GTCGTCA，利用SpCas9对sgRNA进行检测；
    设计ssODN:GCCCAAGTAACCAGAGCCCCTTACCCCTCAGATCATGCTGA CGACCATTGGCTACGG GGACAAGTACCCTCA，同源重组后引入c.821C>T,822C>G leads to p.AThr274Met突变。
  3. 根据权利要求2所述的基因点突变小鼠模型构建方法，其特征在于，所述选取设定周龄的雌性小鼠作为卵子供体，具体为：
    选取4-6周龄的SPF级雌性小鼠作为卵子供体。
  4. 根据权利要求3所述的基因点突变小鼠模型构建方法，其特征在于，所述在所述雌性小鼠腹腔注射一定剂量的PMSG和hCG后，与种公鼠进行交配，并对交配后的雌性小鼠进行受精卵采集，具体为：
    在所述雌性小鼠腹腔注射10IU的PMSG，并在设定间隔时间后在雌性小鼠腹腔注射0.8IU的hCG，然后使所述雌性小鼠与生殖能力正常的种公鼠进行交配，采集雌性小鼠受精卵，并将所述受精卵进行消化洗涤后存放于设定温度的培养箱中。
  5. 根据权利要求1至4任一项所述的基因点突变小鼠模型构建方法，其特征在于，所述通过显微注射技术将Cas9蛋白、ssODN和sgRNA注射入所述受精卵的原核内，将注射后的受精卵移植到代孕母鼠的输卵管壶腹部中之后，还包括：
    每隔设定时间对所述代孕母鼠进行体重称量，判断所述受精卵是否怀孕成功。
  6. 根据权利要求5所述的基因点突变小鼠模型构建方法，其特征在于，所述在代孕母鼠分娩后获得仔鼠之后，还包括：
    在分娩设定时间后对所述仔鼠进行剪尾编号以及PCR检测，得到F0小鼠。
  7. 根据权利要求6所述的基因点突变小鼠模型构建方法，其特征在于，所述根据Kcnq2基因点突变的位点，分别在突变位点两端设计一对鉴定引物F1,R1具体为：
    F1:GCCTTGTTTGGCACTAGTATGG，R1:CCTACATCCTTGGAATTATCTAGC。
  8. 根据权利要求7所述的基因点突变小鼠模型构建方法，其特征在于，所述对所述仔鼠进行鉴定，筛选出成功敲入T274M突变的Kcnq2T274M/+点突变小鼠：具体为：
    对所述F0小鼠进行PCR引物扩增并送测序，该引物在基因敲除小鼠中扩增的产物为788bp；并采用Sanger测序对所述F0小鼠进行鉴定，将测序结果为c.821C>T,822C>G的F0小鼠鉴定为成功敲入T274M突变的Kcnq2T274M/+阳性F0小鼠；
    将所述Kcnq2T274M/+阳性F0小鼠作为父/母本，与野生型小鼠交配获得F1小鼠，对所述F1小鼠出生设定时间后进行PCR引物扩增鉴定，并采用Sanger测序对所述F1小鼠进行鉴定，将测序结果为c.821C>T,822C>G的F1小鼠鉴定为Kcnq2T274M/+阳性F1小鼠。
PCT/CN2023/141592 2023-12-25 2023-12-25 一种基因点突变小鼠模型构建方法 Pending WO2025137828A1 (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
PCT/CN2023/141592 WO2025137828A1 (zh) 2023-12-25 2023-12-25 一种基因点突变小鼠模型构建方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
PCT/CN2023/141592 WO2025137828A1 (zh) 2023-12-25 2023-12-25 一种基因点突变小鼠模型构建方法

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2025137828A1 true WO2025137828A1 (zh) 2025-07-03

Family

ID=96216280

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/CN2023/141592 Pending WO2025137828A1 (zh) 2023-12-25 2023-12-25 一种基因点突变小鼠模型构建方法

Country Status (1)

Country Link
WO (1) WO2025137828A1 (zh)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN121227804A (zh) * 2025-12-03 2025-12-30 中国医学科学院基础医学研究所 一种Clock基因定点突变小鼠模型的构建方法及应用

Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2006096648A2 (en) * 2005-03-07 2006-09-14 University Of Utah Research Foundation Mouse model
CN106929533A (zh) * 2017-03-10 2017-07-07 上海交通大学医学院附属新华医院 Kars基因点突变小鼠模型的构建方法及其应用
WO2018219093A1 (zh) * 2017-05-27 2018-12-06 南京农业大学 一种基于CRISPR/Cas9技术的Glrx1基因敲除动物模型的构建方法
CN113881708A (zh) * 2021-01-05 2022-01-04 清华大学 对动物受精卵进行电转染基因编辑的方法及其应用
CN114262709A (zh) * 2021-12-27 2022-04-01 首都医科大学宣武医院 含有trem2突变基因的类小胶质细胞系、小鼠模型及其构建方法
CN115843747A (zh) * 2022-12-02 2023-03-28 吉林大学 一种Lama3基因点突变的小鼠模型及其构建方法

Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2006096648A2 (en) * 2005-03-07 2006-09-14 University Of Utah Research Foundation Mouse model
CN106929533A (zh) * 2017-03-10 2017-07-07 上海交通大学医学院附属新华医院 Kars基因点突变小鼠模型的构建方法及其应用
WO2018219093A1 (zh) * 2017-05-27 2018-12-06 南京农业大学 一种基于CRISPR/Cas9技术的Glrx1基因敲除动物模型的构建方法
CN113881708A (zh) * 2021-01-05 2022-01-04 清华大学 对动物受精卵进行电转染基因编辑的方法及其应用
CN114262709A (zh) * 2021-12-27 2022-04-01 首都医科大学宣武医院 含有trem2突变基因的类小胶质细胞系、小鼠模型及其构建方法
CN115843747A (zh) * 2022-12-02 2023-03-28 吉林大学 一种Lama3基因点突变的小鼠模型及其构建方法

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
BRUN LUCILE, VIEMARI JEAN-CHARLES, VILLARD LAURENT: "Mouse models of Kcnq2 dysfunction", EPILEPSIA, vol. 63, no. 11, 1 November 2022 (2022-11-01), US, pages 2813 - 2826, XP093330354, ISSN: 0013-9580, DOI: 10.1111/epi.17405 *
MATHIEU MILH; PIERRE ROUBERTOUX; NAJOUA BIBA; JULIE CHAVANY; ADELINE SPIGA GHATA; CAMILLE FULACHIER; STEPHAN CHRISTOPHER COLLINS; : "A knock-in mouse model for KCNQ2-related epileptic encephalopathy displays spontaneous generalized seizures and cognitive impairment", EPILEPSIA, vol. 61, no. 5, 2 April 2020 (2020-04-02), US, pages 868 - 878, XP071214380, ISSN: 0013-9580, DOI: 10.1111/epi.16494 *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN121227804A (zh) * 2025-12-03 2025-12-30 中国医学科学院基础医学研究所 一种Clock基因定点突变小鼠模型的构建方法及应用

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Mehravar et al. Mosaicism in CRISPR/Cas9-mediated genome editing
CN108660161A (zh) 基于CRISPR/Cas9技术的制备无嵌合基因敲除动物的方法
JP2019047794A (ja) 動物における性成熟の制御
CN107287245A (zh) 一种基于CRISPR/Cas9技术的Glrx1基因敲除动物模型的构建方法
CN105296537A (zh) 一种基于睾丸内注射的基因定点编辑技术
US20180084767A1 (en) Animal models for cardiomyopathy
WO2017143894A1 (zh) 免疫缺陷小鼠、其制备方法及应用
CN115807037B (zh) 一种遗传可控的四倍体鱼的选育方法及三倍体鱼的制备方法
WO2018045727A1 (zh) 粘多糖贮积症ii型动物模型的构建方法及应用
CN108347908A (zh) 具有增加的热耐受性的经遗传修饰的动物
Saunders The history of transgenesis
CN117701634A (zh) 一种itgb5条件性基因敲除小鼠模型、构建方法及其应用
WO2025137828A1 (zh) 一种基因点突变小鼠模型构建方法
JP2023116719A (ja) 安定した表現型を示す疾患モデルブタおよびその作製方法
US20230167443A1 (en) Optimised Methods for Cleavage of Target Sequences
CN119859634A (zh) 一种基于CRISPR/Cas9构建miR-181a-2敲除小鼠动物模型的方法及其应用
CN120210217A (zh) 一种基因点突变小鼠模型构建方法
CN116606883A (zh) 一种快速高效构建条件性基因敲除动物模型的方法及应用
US20180271068A1 (en) Genetically-Edited Swine
CN104774870B (zh) 可多次交换的无标记定点整合转基因系统及其应用
CN111705063B (zh) Asgr1突变基因及其在制备哺乳动物肝损伤敏感模型中的应用
US20240276958A1 (en) Sgrna and constructing dual pig model of severe immunodeficiency and liver injury and use thereof
CN118931969A (zh) 用作肺动脉高压模型的kcnk3蛋白e182q突变型小鼠及其制备方法和应用
CN118931970A (zh) 用作肺动脉高压模型的kcnk3蛋白r245p突变型小鼠及其制备方法和应用
HK40082953A (zh) 用於切割靶序列的经优化方法

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 23962526

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1