WO2025127151A1 - アルロース増量剤 - Google Patents

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WO2025127151A1
WO2025127151A1 PCT/JP2024/044463 JP2024044463W WO2025127151A1 WO 2025127151 A1 WO2025127151 A1 WO 2025127151A1 JP 2024044463 W JP2024044463 W JP 2024044463W WO 2025127151 A1 WO2025127151 A1 WO 2025127151A1
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WO
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allulose
epimerase
enzyme
amino acid
fructose
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PCT/JP2024/044463
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English (en)
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祐子 栗谷
卓磨 林
翔 永木
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Amano Enzyme Inc
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Amano Enzyme Inc
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    • A—HUMAN NECESSITIES
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    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
    • C12P19/02—Monosaccharides

Definitions

  • This technology relates to an allulose extender. More specifically, it relates to an allulose extender using a specific enzyme, an allulose-containing food or drink using the allulose extender, a method for producing an allulose-containing food or drink, and a method for increasing allulose in a fructose-containing food or drink.
  • Patent Document 1 discloses a method for producing low-calorie juice, which is characterized by treating fruit juice with an ultrafiltration membrane to retain cloudy fruit juice, which is made by concentrating the sugars contained in the fruit juice, in the membrane, and allowing clear fruit juice with reduced sugar content to pass through the membrane.
  • Patent Document 2 discloses a method for producing vegetable or fruit juice, which involves adding lactic acid bacteria to vegetable or fruit juice, multiplying the lactic acid bacteria, and reducing the sugar concentration in the vegetable or fruit juice through lactic acid fermentation.
  • the technology of treating fruit juice with a membrane has the problem that the richness and thick texture of the fruit juice are lost due to the removal of sugars.
  • the technology of multiplying lactic acid bacteria and reducing calories through lactic acid fermentation requires sterilization and alcohol removal processes, so a technology that makes subsequent processes easier is needed.
  • the main objective of this technology is to provide a technique for increasing the amount of allulose in raw materials or fructose-containing food and beverages.
  • the present technology first provides an allulose extender containing D-allulose-3-epimerase.
  • the D-allulose-3-epimerase may be derived from Asaia krungthepensis.
  • the allulose extender of the present technology may further comprise a glucosyltransferase.
  • the present technology also provides allulose-containing food and beverage products in which the allulose extender is used.
  • the present technology also provides a method for producing allulose-containing food or beverage, which includes a step of treating a raw material or a fructose-containing food or beverage with D-allulose-3-epimerase.
  • the method for producing an allulose-containing food or beverage according to the present technology may further include a step of treating the raw material or the fructose-containing food or beverage with glucosyltransferase.
  • the present technology also provides a method for increasing the amount of allulose in fructose-containing food or beverage, which comprises a step of treating a raw material or a fructose-containing food or beverage with D-allulose-3-epimerase.
  • the method for increasing allulose in a fructose-containing food or beverage according to the present technology may further include a step of treating the raw material or the fructose-containing food or beverage with glucosyltransferase.
  • this technology also provides D-allulose-3-epimerase, which has excellent allulose production ability.
  • glycine is sometimes represented as G, alanine (Ala) as A, valine (Val) as V, leucine (Leu) as L, isoleucine (Ile) as I, phenylalanine (Phe) as F, tyrosine (Tyr) as Y, tryptophan (Trp) as W, serine (Ser) as S, threonine (Thr) as T, cysteine (Cys) as C, methionine (Met) as M, aspartic acid (Asp) as D, glutamic acid (Glu) as E, asparagine (Asn) as N, glutamine (Gln) as Q, lysine (Lys) as K, arginine (Arg) as R, histidine (His) as H, and proline (Pro) as
  • amino acid sequence displayed is such that the left end is the N-terminus and the right end is the C-terminus.
  • non-polar amino acids include alanine, valine, leucine, isoleucine, proline, methionine, phenylalanine, and tryptophan.
  • Uncharged amino acids include glycine, serine, threonine, cysteine, tyrosine, asparagine, and glutamine.
  • Acidic amino acids include aspartic acid and glutamic acid.
  • Basic amino acids include lysine, arginine, and histidine.
  • modifications of amino acid sequences and/or nucleotide sequences include not only artificial modifications (substitution, addition, insertion, deletion, inversion, etc.), but also naturally occurring modifications (substitution, addition, insertion, deletion, inversion, etc.), i.e., modifications in which the sequences were originally different.
  • substitution includes not only the case where an amino acid residue substitution is artificially introduced, but also the case where an amino acid residue substitution is naturally introduced, that is, the case where the amino acid residue is originally different.
  • the substitution of the amino acid residue may be an artificial substitution or a natural substitution, but artificial substitution is preferable.
  • the amino acid residue at the mutation point (the amino acid residue to be substituted) is expressed by a combination of the above-mentioned one letter representing the type of amino acid and a number representing the position of the amino acid. For example, when the 57th arginine is substituted with glycine, it is expressed as "R57G".
  • isolated is used interchangeably with “purified”.
  • isolated is used to distinguish from the natural state, i.e., the state that exists in nature.
  • the artificial operation of "separating” results in an "isolated state” that is a state different from the natural state.
  • the thing that is isolated is clearly and decisively different from the natural product itself.
  • an "equivalent sequence” refers to an amino acid sequence or base sequence that is partially different from a reference amino acid sequence (in the present technology, SEQ ID NOs: 1, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 16, 17, 20, 21, 22, or 23) or base sequence (in the present technology, SEQ ID NOs: 2, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 18, or 19), but the difference does not substantially affect the function of the protein (in the present technology, D-allulose-3-epimerase activity or glucosyltransferase activity).
  • an enzyme having a polypeptide chain consisting of an equivalent amino acid sequence, or an enzyme encoded by a polynucleotide consisting of an equivalent base sequence exhibits D-allulose-3-epimerase activity or glucosyltransferase activity.
  • Allulose extender contains D-allulose-3-epimerase and may also contain glucosyltransferase, other enzymes, and other components as necessary.
  • the inventors of the present application have discovered that by allowing D-allulose-3-epimerase to act on raw materials or fructose-containing food and beverages during the production of allulose-containing food and beverages, the amount of allulose in the produced allulose-containing food and beverages can be increased.
  • D-allulose-3-epimerase D-allulose-3-epimerase that can be used in the present technology is an enzyme that has the activity of catalyzing epimerization using D-fructose as a substrate to produce allulose, and is a type of ketose-3-epimerase. Note that the D-allulose-3-epimerase that can be used in the present technology may also be an enzyme that has other functions as long as it has D-allulose-3-epimerase activity. In the present technology, the effect of increasing the amount of allulose can be achieved by producing allulose-containing food and drink using D-allulose-3-epimerase.
  • D-allulose-3-epimerase that can be used in the present technology is not particularly limited, but examples include D-allulose-3-epimerase derived from microorganisms of the genus Asaia (e.g., Asaia krungthepensis, etc.), the genus Arthrobacter (e.g., Arthrobacter globiformis, etc.), and the genus Pseudomonas (e.g., Pseudomonas cichorii, etc.).
  • D-allulose-3-epimerase derived from microorganisms of the genus Asaia (e.g., Asaia krungthepensis, etc.), the genus Arthrobacter (e.g., Arthrobacter globiformis, etc.), and the genus Pseudomonas (e.g., Pseudomonas cichorii, etc.).
  • D-allulose-3-epimerase derived from a microorganism of the genus Asaia is used, and more preferably, D-allulose-3-epimerase derived from Asaia krungusapensis is used.
  • Allulose is classified as a ketose and is also known as psicose. It is also known as a rare sugar because it exists naturally but in small quantities. Allulose is about 70% as sweet as sucrose, but has only 1/10 the calories, and has been reported to suppress the rise in postprandial blood sugar levels and have anti-obesity properties. Therefore, increasing the amount of allulose in fructose-containing foods and beverages can achieve a low-calorie effect.
  • D-allulose-3-epimerase derived from Asaia clungsapensis means D-allulose-3-epimerase produced by a microorganism (which may be a wild type or a mutant strain) classified as Asaia clungsapensis, or D-allulose-3-epimerase obtained by genetic engineering techniques using the D-allulose-3-epimerase gene.
  • a recombinant produced by a host microorganism into which the D-allulose-3-epimerase gene obtained from Asaia clungsapensis (or a gene modified from said gene) has been introduced also falls under "D-allulose-3-epimerase derived from Asaia clungsapensis.”
  • the Asaia krungthepensis strain is not particularly limited as long as it does not impair the action or effect of the present technology, and any strain generally available from biological resource institutions, etc. can be used.
  • microorganisms that produce enzymes that can be used in this technology may be cultured.
  • microorganisms that produce D-allulose-3-epimerase include microorganisms of the genus Asaia, and examples of Asaia microorganisms include Asaia krungthepensis.
  • Microorganisms that can be used may be wild-type strains or mutant strains (e.g., mutant strains induced by ultraviolet irradiation, etc.).
  • the culture conditions in the culture process can be set appropriately, taking into consideration the properties of the microorganisms to be cultured.
  • Solid or liquid media can be used for culturing the microorganisms.
  • aeration and agitation culture can also be used for industrial production.
  • the nutrient source for the medium substances required for the growth of microorganisms can be used as appropriate.
  • the carbon source any assimilable carbon compound can be used, such as glucose, sucrose, lactose, maltose, molasses, pyruvic acid, etc.
  • the nitrogen source any assimilable nitrogen compound can be used, such as peptone, meat extract, yeast extract, casein hydrolysate, and alkaline extract of soybean meal.
  • salts such as phosphates, carbonates, sulfates, magnesium, calcium, potassium, iron, manganese, and zinc; specific amino acids; and specific vitamins can also be used as appropriate, as needed.
  • the culture temperature may be set appropriately within a range in which the microorganisms to be cultured can grow and the microorganisms can produce the enzymes that can be used in the present technology.
  • the culture temperature may be set, for example, to about 15°C to 37°C.
  • the culture time may be, for example, about 12 hours to 48 hours.
  • the culture process may be terminated, for example, when the enzymes that can be used in the present technology reach their maximum yield.
  • the D-allulose-3-epimerase that can be used in this technology can be prepared from the culture medium of the microorganism from which the D-allulose-3-epimerase described above is derived.
  • Specific preparation methods include a method of recovering D-allulose-3-epimerase from the culture medium or cells of the above microorganism.
  • the cells can be recovered from the culture medium in advance by filtration, centrifugation, or the like as necessary, and the enzyme can then be separated and/or purified.
  • the cells can be recovered from the culture medium in advance by pressure treatment, ultrasonic treatment, or the like to extract the enzyme, and the enzyme can then be separated and/or purified.
  • known protein separation and/or purification methods can be used without any particular limitation, and examples of such methods include centrifugation, UF concentration, salting out, and various chromatography methods using ion exchange resins, etc.
  • the separated and/or purified enzyme can be powdered by a drying method such as freeze-drying or vacuum drying, and can also be powdered using an appropriate excipient and/or drying aid in the drying method.
  • the separated and/or purified enzyme can also be liquefied by adding an appropriate additive and sterilizing by filtration.
  • D-allulose-3-epimerase is the D-allulose-3-epimerase derived from Asaia clungsapensis shown below.
  • the amino acid sequence of D-allulose-3-epimerase derived from wild-type Asaia clungsapensis is shown in SEQ ID NO: 1.
  • DNA base sequences encoding the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 include the base sequences shown in SEQ ID NO: 2 and 15.
  • the base sequence shown in SEQ ID NO: 15 is the base sequence of DNA encoding wild-type D-allulose-3-epimerase derived from Asaia clungsapensis
  • the base sequence shown in SEQ ID NO: 2 is the base sequence obtained by changing the base sequence shown in SEQ ID NO: 15 to a codon suitable for Escherichia coli. Therefore, the DNA in this technology can be appropriately designed by a person skilled in the art using the base sequence shown in SEQ ID NO: 2 as a reference sequence.
  • the amino acid sequences of the modified D-allulose-3-epimerase disclosed in WO 2023/157936 are shown in SEQ ID NOs: 3 to 8.
  • the base sequences of the DNA encoding the amino acid sequences shown in SEQ ID NOs: 3 to 8 are shown in SEQ ID NOs: 9 to 14.
  • the concept of "D-allulose-3-epimerase” in this specification includes D-allulose-3-epimerase obtained by artificially replacing a part of the amino acid sequence of the wild-type D-allulose-3-epimerase described above, and D-allulose-3-epimerase that has been naturally replaced to have such an amino acid sequence. Therefore, the concept of "D-allulose-3-epimerase” in this specification also includes the modified D-allulose-3-epimerase described above (also referred to as "mutant D-allulose-3-epimerase").
  • amino acid sequences of modified D-allulose-3-epimerase are shown in SEQ ID NOs: 16 (M22K) and 17 (G14R).
  • base sequences of DNA encoding the amino acid sequences shown in SEQ ID NOs: 16 and 17 are shown in SEQ ID NOs: 18 and 19.
  • the present technology also provides a polypeptide shown in any one of (1) to (4) below.
  • amino acid substitutions in (5) above include single substitutions of M22K only, G14R only, or F111W only; double substitutions of M22K and G14R, M22K and F111W, or G14R and F111W; and triple substitutions of M22K, G14R, and F111W.
  • the amino acid modification introduced may include only one type of modification (e.g., only substitution, etc.) from among substitution, addition, insertion, and deletion, or may include two or more types of modifications (e.g., substitution and insertion, etc.).
  • the number of amino acid differences at any difference site may be one or several, for example, 1 to 80, preferably 1 to 70, 1 to 60, 1 to 50, 1 to 40, or 1 to 30, more preferably 1 to 20, 1 to 10, 1 to 9, 1 to 8, 1 to 7, 1 to 6, 1 to 5, or 1 to 4, even more preferably 1 to 3, and particularly preferably 1, 2, or 1.
  • the above amino acid substitutions in (1) and (5) are retained.
  • sequence identity to the amino acid sequences of (1) and (5) above may be 70% or more, but is preferably 80% or more, more preferably 85% or more, 90% or more, 95% or more, 96% or more, even more preferably 97% or more, even more preferably 98% or more, and particularly preferably 99% or more.
  • sequence identity refers to the value of amino acid sequence identity obtained by the bl2seq program (Tatiana A. Tatsusova, Thomas L. Madden, FEMS Microbiol. Lett., Vol. 174, p247-250, 1999) of BLASTPACKAGE [sgi32 bit edition, Version 2.0.12; available from the National Center for Biotechnology Information (NCBI)].
  • the parameters can be set to Gap insertion Cost value: 11, Gap extension Cost value: 1.
  • polypeptides (2) and (6), as well as (3) and (7) above, are substantially identical to the polypeptides (1) and (5) above.
  • sequences selected from the group consisting of M22K, G14R, A56E, N57H, R58G, and F111W may be part of a larger protein (e.g., a fusion protein, etc.).
  • a fusion protein e.g., a fusion protein, etc.
  • sequences added to a fusion protein include sequences that are useful for purification, such as multiple histidine residues, and additional sequences that ensure stability during recombinant production.
  • a preferred embodiment of the amino acid substitution to be introduced is a conservative substitution. That is, examples of substitutions in the above polypeptides (2) and (6), and (3) and (7) include, for example, substitution of a nonpolar amino acid before the substitution with another nonpolar amino acid, substitution of an uncharged amino acid before the substitution with another uncharged amino acid, substitution of an acidic amino acid before the substitution with another acidic amino acid, and substitution of a basic amino acid before the substitution with another basic amino acid.
  • "having D-allulose-3-epimerase activity” means that D-allulose-3-epimerase activity can be detected when measured using the "Method for Measuring D-allulose-3-epimerase Activity" in the Examples described below, and preferably means that the D-allulose-3-epimerase activity is equivalent to that of the above polypeptides (1) and (5), specifically, the relative activity is approximately 0.8 to 1.2 when the D-allulose-3-epimerase activity of the above polypeptides (1) and (5) is taken as 1.
  • the above polypeptides (1) to (7) are referred to as D-allulose-3-epimerase derived from Asaia kulungsapensis so long as they have D-allulose-3-epimerase activity.
  • the present technology also provides DNA as set forth in any one of (1) to (3) below.
  • Examples of the base sequence of DNA encoding the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 include the base sequences shown in SEQ ID NO: 2 and SEQ ID NO: 15.
  • the base sequence shown in SEQ ID NO: 15 is the base sequence of DNA encoding wild-type D-allulose-3-epimerase derived from Asaia kluangsapensis
  • the base sequence shown in SEQ ID NO: 2 is the base sequence of the base sequence shown in SEQ ID NO: 15 modified to have codons suitable for Escherichia coli. Therefore, the DNA according to the present technology can be appropriately designed by those skilled in the art using the base sequence shown in SEQ ID NO: 2 as a reference sequence.
  • the base sequences shown in SEQ ID NOs: 18 and 19 are base sequences in which the codons have been changed to be suitable for E. coli.
  • the DNA encoding D-allulose-3-epimerase is not limited to the above sequence, and may be DNA consisting of a sequence equivalent to the above sequence.
  • an equivalent sequence includes DNA having a base sequence that has a homology of 70% or more, preferably 80% or more, more preferably 85% or more, even more preferably 90% or more, 95% or more, 96% or more, 97% or more, even more preferably 98% or more, and particularly preferably 99% or more with the base sequence of the DNA shown in (1) or (2) above, as long as it encodes a polypeptide having D-allulose-3-epimerase activity.
  • DNA "homology” is calculated using publicly available or commercially available software with an algorithm for comparing a reference sequence with a query sequence. Specifically, BLAST, FASTA, or GENETYX (Software Development Co., Ltd.) can be used, and these can be used with default parameters.
  • DNA encoding D-allulose-3-epimerase also includes base sequences in which several bases have been mutated by substitution, addition, insertion or deletion corresponding to the substitution, addition, insertion or deletion of the amino acid sequence described above, as long as it encodes a polypeptide having D-allulose-3-epimerase activity.
  • base sequences complementary to DNA consisting of a base sequence encoding the above-mentioned polypeptide are also equivalent sequences, and DNA that hybridizes with DNA consisting of said base sequence under stringent conditions is also included in DNA encoding D-allulose-3-epimerase, as long as it encodes a polypeptide having D-allulose-3-epimerase activity. Hybridization can be performed according to standard methods. The same applies below.
  • the DNA encoding D-allulose-3-epimerase can also be isolated from a microorganism that produces the above-mentioned specified polypeptide.
  • the target DNA can be isolated from the genome of the microorganism by PCR or hybridization using the genomic DNA of Asaia kulungsapensis as a template and a primer or probe designed from known amino acid sequence information taking into account gene degeneracy, or a primer or probe designed based on known base sequence information.
  • the DNA encoding D-allulose-3-epimerase includes various types of DNA resulting from codon degeneracy.
  • Various types of DNA encoding the same amino acid sequence can be artificially produced easily using known genetic engineering techniques. For example, in the genetic engineering production of a protein, if the codons used in the original gene encoding the target protein are used infrequently in the host, the expression level of the protein may be low. In such cases, the codon usage frequency can be optimized for the host without changing the encoded amino acid sequence, thereby achieving high expression of the target protein.
  • Methods for introducing mutations into genes and artificially modifying the amino acid sequence include known techniques such as the Kunkel method and the Gapped duplex method, and mutation introduction kits that utilize site-specific mutagenesis, such as the QuikChange Site-Directed Mutagenesis Kit (Stratagene), GeneArt Site-Directed Mutagenesis PLUS System (Invitrogen), and TaKaRa Site-Directed Mutagenesis System (Mutan-K, Mutan-Super Express Km, PrimeSTAR Mutagenesis Basal Kit, etc.: Takara Bio). Furthermore, confirmation of the DNA base sequence and whether the obtained DNA encodes the desired polypeptide can be carried out according to standard methods.
  • an expression cassette or recombinant vector containing DNA encoding the above-mentioned specific polypeptide (hereinafter also referred to as the "expression cassette related to this technology” or the “recombinant vector related to this technology”) can be obtained by linking a promoter and a terminator to DNA encoding D-allulose-3-epimerase, or by inserting the expression cassette related to this technology or the DNA encoding D-allulose-3-epimerase related to this technology into an expression vector.
  • the expression cassette or recombinant vector of the present technology may contain, as control elements, a promoter and a terminator, as well as transcription elements such as an enhancer, a CCAAT box, a TATA box, and an SPI site, if necessary. These control elements may be operably linked to the DNA of the present technology. "Operably linked" means that various control factors that regulate the DNA of the present technology are linked to the DNA of the present invention in a state that allows them to operate in a host cell.
  • the expression vector is preferably one constructed for genetic recombination from a phage, plasmid, or virus capable of autonomously replicating in a host.
  • expression vectors are known, and examples of commercially available expression vectors include pQE-based vectors (Qiagen), pDR540, pRIT2T (GE Healthcare Biosciences), and pET-based vectors (Merck).
  • the expression vector may be used in an appropriate combination with the host cell, and examples of such combinations include, when E. coli is used as the host cell, a combination of a pET-based vector and a DH5 ⁇ E. coli strain, a combination of a pET-based vector and a BL21 (DE3) E. coli strain, or a combination of a pDR540 vector and a JM109 E. coli strain.
  • transformant (hereinafter also referred to as “transformant according to the present technology”) can be obtained by transforming a host using an expression cassette according to the present technology or a recombinant vector according to the present technology.
  • the host used to produce the transformant is not particularly limited as long as it allows the introduction of a gene, the expression cassette or recombinant vector is stable, and it is capable of autonomous replication and capable of expressing the traits of the gene containing the DNA related to the present technology.
  • Suitable examples include bacteria belonging to the genus Escherichia such as Escherichia coli, the genus Bacillus such as Bacillus subtilis, the genus Pseudomonas such as Pseudomonas putida, the genus Asaia such as Asaia krungthepensis, and the like; yeast, etc.
  • animal cells, insect cells, plants, etc. may also be used.
  • the transformant according to the present technology can be obtained by introducing the expression cassette according to the present technology or the recombinant vector according to the present technology into a host.
  • the location of the DNA according to the present technology to be introduced is not particularly limited as long as the target gene can be expressed, and may be on a plasmid or on a genome.
  • Examples of the method for introducing the expression cassette according to the present technology or the recombinant vector according to the present technology include a recombinant vector method and a genome editing method.
  • the conditions for introducing the expression cassette or the recombinant vector into a host may be appropriately set according to the type of the host.
  • examples of the method include a method using competent cells treated with calcium ions, an electroporation method, etc.
  • examples of the method include an electroporation method, a spheroplast method, a lithium acetate method, etc.
  • examples of the method include an electroporation method, a calcium phosphate method, a lipofection method, etc.
  • examples of the method include a calcium phosphate method, a lipofection method, an electroporation method, etc.
  • examples of methods include electroporation, the Agrobacterium method, the particle gun method, and the PEG method.
  • Whether or not the expression cassette or recombinant vector of the present technology has been incorporated into the host can be confirmed by PCR, Southern hybridization, Northern hybridization, etc.
  • genomic DNA, the expression cassette, or the recombinant vector may be isolated and purified from the transformant.
  • the expression cassette or recombinant vector is separated and purified based on the lysate obtained by lysing the bacteria.
  • the lysis method may involve treatment with a lytic enzyme such as lysozyme, and if necessary, the use of proteases and other enzymes, as well as surfactants such as sodium lauryl sulfate (SDS). Furthermore, physical disruption methods such as freezing and thawing and French press treatment may be combined.
  • DNA can be separated and purified from the lysate by, for example, a suitable combination of deproteinization treatment using phenol treatment and protease treatment, ribonuclease treatment, alcohol precipitation treatment, and commercially available kits.
  • DNA can be cut in accordance with standard methods, for example, by restriction enzyme treatment.
  • a type II restriction enzyme that acts on a specific nucleotide sequence can be used as the restriction enzyme.
  • DNA can be linked to an expression cassette or expression vector using, for example, DNA ligase. Then, using the separated and purified DNA as a template, primers specific to the DNA involved in this technology are designed and PCR is performed. The amplified products obtained by PCR are subjected to agarose gel electrophoresis, polyacrylamide gel electrophoresis, capillary electrophoresis, etc., and stained with ethidium bromide and SYBR Green solution, etc., and the amplified products are detected as bands, whereby transformation can be confirmed.
  • the glucosyltransferase that can be used in the present technology is an enzyme that hydrolyzes sucrose to produce one or more carbohydrates selected from ⁇ -1,3 glucan and leucrose.
  • the ⁇ -1,3 glucan that can be produced by the glucosyltransferase of the present technology includes insoluble ⁇ -1,3 glucan and soluble ⁇ -1,3 glucan.
  • the insoluble ⁇ -1,3 glucan that can be produced by the glucosyltransferase of the present technology includes sugars with 7 or more sugars.
  • the soluble ⁇ -1,3 glucan that can be produced by the glucosyltransferase of the present technology includes nigerooligosaccharides such as nigerose, nigerotriose, nigerotetraose, nigeropentaose, and nigerohexaose.
  • the glucosyltransferase that can be used in the present technology may also be an enzyme that has other functions as long as it has glucosyltransferase activity.
  • glucosetransferase derived from Streptococcus thermophilus means a glucosyltransferase produced by a microorganism (whether a wild-type or mutant strain) classified as Streptococcus thermophilus, or a glucosyltransferase obtained by genetic engineering techniques using a glucosyltransferase gene. Therefore, a recombinant produced by a host microorganism into which a glucosyltransferase gene obtained from Streptococcus thermophilus (or a gene modified from said gene) has been introduced also falls under “glucosyltransferase derived from Streptococcus thermophilus.”
  • the strain of Streptococcus thermophilus is not particularly limited as long as it does not impair the action or effect of this technology, and any strain that is generally available from biological resource institutions, etc. can be used.
  • microorganisms that produce enzymes that can be used in this technology may be cultured.
  • microorganisms that produce glucosyltransferase include microorganisms of the genus Streptococcus, and examples of Streptococcus microorganisms include Streptococcus thermophilus.
  • Microorganisms that can be used may be wild-type strains or mutant strains (e.g., mutant strains induced by ultraviolet irradiation, etc.).
  • the nutrient source for the medium substances required for the growth of microorganisms can be used as appropriate.
  • the carbon source any assimilable carbon compound can be used, such as glucose, sucrose, lactose, maltose, molasses, pyruvic acid, etc.
  • the nitrogen source any assimilable nitrogen compound can be used, such as peptone, meat extract, yeast extract, casein hydrolysate, and alkaline extract of soybean meal.
  • salts such as phosphates, carbonates, sulfates, magnesium, calcium, potassium, iron, manganese, and zinc; specific amino acids; and specific vitamins can also be used as appropriate, as needed.
  • the culture temperature may be set appropriately within a range in which the microorganisms to be cultured can grow and the microorganisms can produce the enzymes that can be used in the present technology.
  • the culture temperature may be set, for example, to about 15°C to 37°C.
  • the culture time may be, for example, about 12 hours to 48 hours.
  • the culture process may be terminated, for example, when the enzymes that can be used in the present technology reach their maximum yield.
  • Glucosyltransferase that can be used in this technology can be prepared from the culture medium of the microorganism from which the glucosyltransferase is derived.
  • Specific preparation methods include a method of recovering glucosyltransferase from the culture medium or cells of the microorganism. For example, when a glucosyltransferase-secreting microorganism is used, the cells can be recovered from the culture medium in advance by filtration, centrifugation, etc., as necessary, and the enzyme can then be separated and/or purified.
  • the cells can be recovered from the culture medium in advance by pressure treatment, ultrasonic treatment, etc., to extract the enzyme, and the enzyme can then be separated and/or purified.
  • known protein separation and/or purification methods can be used without any particular limitation, and examples of such methods include centrifugation, UF concentration, salting out, and various chromatography methods using ion exchange resins, etc.
  • the separated and/or purified enzyme can be powdered by a drying method such as freeze-drying or vacuum drying, and can also be powdered using an appropriate excipient and/or drying aid in the drying method.
  • the separated and/or purified enzyme can also be liquefied by adding an appropriate additive and sterilizing by filtration.
  • glucosyltransferase is the glucosyltransferase derived from Streptococcus thermophilus shown below.
  • a glucosyltransferase derived from Streptococcus thermophilus containing a polypeptide consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 20 is included.
  • the amino acid sequence including the signal sequence and pro-sequence is shown in SEQ ID NO: 21.
  • Another specific example is a glucosyltransferase derived from Streptococcus thermophilus containing a polypeptide consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 22.
  • the amino acid sequence including the signal sequence and pro-sequence is shown in SEQ ID NO: 23.
  • the glucosyltransferase that can be used in the present technology may be not only the polypeptide shown in (1) below, but also a glucosyltransferase including the polypeptides shown in (2) to (4) below.
  • the glucosyltransferase that can be used in the present technology may be an artificial protein artificially designed based on the amino acid sequences of (1) to (4) below.
  • the lower limit of the glucosyltransferase content in the allulose extender according to the present technology can be freely set as long as it does not impair the effect of the present technology.
  • the glucosyltransferase content can be set to, for example, 0.0001 U or more per 1 g of fructose used in the production of allulose-containing food and beverages, and from the viewpoint of further enhancing the allulose-increasing effect, it can be set to preferably 0.001 U or more, more preferably 0.01 U or more, 0.03 U or more, 0.05 U or more, 0.1 U or more, 0.5 U or more, 1 U or more, 5 U or more, even more preferably 7.5 U or more, and even more preferably 10 U or more.
  • the upper limit of the glucosyltransferase content in the allulose extender according to the present technology is not particularly limited as long as it does not impair the effects of the present technology, but can be set to, for example, 500 U or less, 400 U or less, 300 U or less, 200 U or less, 100 U or less, or 50 U or less per 1 g of fructose used in the production of allulose-containing food and beverages.
  • glucosyltransferase activity is defined as 1 unit (1 U) of the amount of enzyme that hydrolyzes 1 ⁇ mol of sucrose per minute when treated at 30°C using 50 mM sucrose solution (50 mM potassium phosphate buffer, pH 7.0) as a substrate.
  • the allulose extender according to the present technology can be used in combination with other components as long as it does not impair the action or effect of the present technology.
  • other components for example, excipients, pH adjusters, colorants, flavoring agents, disintegrants, lubricants, stabilizers, enzymes, and other components that are usually used in formulations can be used.
  • components having known or future functions can be used in combination as appropriate according to the purpose.
  • Raw materials that can be used for the allulose-containing food and beverage or fructose-containing food and beverage of the present technology are not particularly limited in terms of origin, type, etc., as long as they do not impair the effects of the present technology, and can be freely selected depending on the target food and beverage, but raw materials containing fructose (fructose-containing raw materials) are preferred.
  • fruit juices include grapes, peaches, bananas, apples, strawberries, melons, mangoes, plums, cherries, oranges, Satsuma mandarins, lemons, grapefruits, limes, mandarins, yuzu, tangerines, temple oranges, tangelos, calamansi, persimmons, blueberries, pineapples, papayas, lychees, acerola, pears, pears, apricots, apricots, etc.
  • vegetable juices such as carrots, tomatoes, bell peppers, paprika, Japanese mustard spinach, kale, broccoli, spinach, asparagus, daikon radish, Chinese cabbage, celery, cabbage, beets, onions, lettuce, parsley, watercress, pumpkins, watermelons, corn, etc.
  • the fruit juices and/or vegetable juices may be used alone or in combination of two or more.
  • the fructose-containing food and drink includes fructose-containing food and drink produced by processing or cooking the above-mentioned raw materials.
  • the fructose-containing food and drink includes one or more selected from the group consisting of fruit juice beverages, vegetable juice beverages, and mixed juice beverages.
  • fruit juice beverages and vegetable juice beverages are included, and more preferably, apple juice beverages and carrot juice beverages are included.
  • the raw materials or fructose-containing food or beverage are the target of the allulose extender, and as described below, the allulose extender of this technology reduces the amount of fructose in the raw materials or fructose-containing food or beverage and increases the amount of allulose.
  • the allulose-containing food and beverage according to the present technology is a food and beverage produced by using an allulose extender in the above-mentioned raw material or fructose-containing food and beverage.
  • the amount of sugars contained in the allulose-containing food or beverage according to the present technology is not particularly limited, but it is preferable that the amount of fructose in the raw materials or raw materials of the fructose-containing food or beverage is reduced and the amount of allulose is increased.
  • the content of fructose (also called "fruit sugar") contained in the raw materials or fructose-containing food or beverage that can be used in the present technology can be freely set as long as it does not exert the action or effect of the present technology.
  • the fructose content is, for example, 1% by weight or more, 2% by weight or more, 3% by weight or more, 4% by weight or more, 5% by weight or more, or 6% by weight or more.
  • the sugar composition of allulose contained in the allulose-containing food and beverage according to the present technology is, for example, 1% or more, preferably 1.5% or more, more preferably 5% or more, and even more preferably 7.5% or more.
  • the upper limit of the sugar composition of allulose contained in the allulose-containing food and beverage according to the present technology is not particularly limited, and is, for example, 30% or less, 25% or less, 20% or less, or 15% or less.
  • the sugar composition of fructose contained in the allulose-containing food and beverage according to the present technology is, for example, 80% or less, preferably 70% or less, more preferably 65% or less, and even more preferably 50% or less.
  • the lower limit of the sugar composition of fructose contained in the allulose-containing food and beverage according to the present technology is not particularly limited, and is, for example, 20% or more, 30% or more, or 40% or more.
  • allulose-containing foods and beverages according to the present technology include one or more selected from the group consisting of fruit juice beverages, vegetable juice beverages, and mixed juice beverages.
  • Fruit juice beverages and vegetable juice beverages are preferred, and apple juice beverages and carrot juice beverages are more preferred.
  • the allulose extender according to the present technology can also be used for plant-derived molasses.
  • raw materials for plant-derived molasses include honey, agave syrup, maple syrup, etc.
  • the properties of the raw materials or fructose-containing food and drink when subjected to various enzyme treatments are not particularly limited as long as they do not impair the effects of the present technology, but are preferably in a liquid or paste form, and more preferably in a liquid form.
  • peeled or unpeeled raw materials can be used.
  • Method for producing allulose-containing food and drink, and method for increasing allulose in fructose-containing food and drink are methods including a step of acting D-allulose-3-epimerase on the raw material or fructose-containing food and drink (also referred to as "enzyme action step (I)").
  • the method for producing allulose-containing food and drink according to the present technology may further include a step of acting glucosyltransferase on the raw material or fructose-containing food and drink (also referred to as "enzyme action step (II)").
  • a step of acting glucosyltransferase on the raw material or fructose-containing food and drink also referred to as "enzyme action step (II)"
  • enzyme action step II
  • it is also possible to carry out general food and drink production steps and recovery steps before and after each step or at the same time as each step within the scope that does not impair the effects of the present technology. Each step will be described in detail below.
  • Enzyme action step (I) is a step of allowing D-allulose-3-epimerase to act on the raw material or the fructose-containing food or drink (including a step of allowing any of the polypeptides shown in (1) to (3) above to act on fructose).
  • other enzymes may be allowed to act as necessary. These enzymes may be used alone or in combination of two or more. When using in combination of two or more, two or more enzymes may be added simultaneously or separately to the raw material or the fructose-containing food or drink. The order in which two or more enzymes are added separately is not particularly limited. The details of the enzymes and the amounts added are the same as those used in "1. Allulose extender" above, so a description thereof will be omitted here.
  • each enzyme is not particularly limited, and as long as the enzyme can be added to the raw material or fructose-containing food or drink, it can be added by any method and at any time. In addition, each enzyme can be added in two or more separate portions.
  • the various conditions for the enzyme action step (I) can be freely set as long as they do not impair the effects of this technology.
  • the pH, temperature, action time, etc. can be set according to the physicochemical properties of the enzyme used, such as the optimum pH, stable pH range, optimum temperature, and temperature stability.
  • the optimal reaction conditions can be determined through preliminary experiments. Below are examples of conditions for allowing the enzyme to act.
  • the pH can be set, for example, to pH 2.0 to 13.0, preferably pH 2.5 to 12.0, and more preferably pH 3.0 to 8.0.
  • the temperature can be set, for example, to 20°C to 90°C, preferably 30°C to 80°C, and more preferably 40°C to 70°C.
  • the reaction time can be set, for example, to 10 minutes to 6 hours, preferably 30 minutes to 4 hours, and more preferably 1 hour to 3 hours.
  • the enzyme action step (II) is a step of allowing glucosyltransferase to act on the raw material or the fructose-containing food or drink.
  • the details and the amount of the enzyme to be added are the same as those of the enzyme used in "1. Allulose extender" described above, so the explanation is omitted here.
  • glucosyltransferase The specific method of adding glucosyltransferase is not particularly limited, and as long as the enzyme can be added to the raw material or the fructose-containing food or drink, it can be added by any method and at any time. In addition, glucosyltransferase can be added in two or more separate portions.
  • the pH, temperature, action time, etc. can be set according to the physicochemical properties of the enzyme used, such as the optimum pH, stable pH range, optimum temperature, and temperature stability.
  • the optimal reaction conditions can be determined through preliminary experiments. Below are examples of conditions when glucosyltransferase is allowed to act.
  • the pH can be set, for example, to pH 2.0 to 9.0, preferably pH 2.5 to 8.0, and more preferably pH 3.0 to 6.0.
  • the temperature can be set, for example, to 10°C to 70°C, preferably 20°C to 50°C, and more preferably 25°C to 45°C.
  • the reaction time can be set, for example, to 15 minutes to 120 hours, preferably 30 minutes to 72 hours, and more preferably 2 hours to 48 hours.
  • the raw material preparation step is a step of preparing each enzyme (D-allulose-3-epimerase and/or glucosyltransferase), each raw material (including fructose) used in the production of food and beverages, etc.
  • the raw materials may be prepared in the form of a composition mixed with other components, as long as the action and effect of the present technology are not impaired.
  • the enzyme inactivation step is a step of inactivating an enzyme after at least the above-mentioned enzyme action step (I).
  • the enzyme action step (II) is performed, the enzyme can also be inactivated after the enzyme action step (II).
  • the enzyme deactivation step is not an essential step and can be carried out as necessary. Furthermore, when multiple enzymes are used in the enzyme action step (I) or enzyme action step (II) described above, the enzyme deactivation step can also be carried out between the actions of the enzymes. Furthermore, for example, when multiple enzymes are allowed to act in the enzyme action step (I) or enzyme action step (II), it is also possible to carry out the enzyme deactivation step midway through the enzyme action step (I) or enzyme action step (II). Furthermore, the enzyme deactivation step may be carried out between the enzyme action step (I) and the enzyme action step (II).
  • the method for inactivating the enzyme is not particularly limited, and a single general inactivation method may be used, or two or more general methods may be used in combination, depending on the properties of the enzyme to be inactivated.
  • a single general inactivation method may be used, or two or more general methods may be used in combination, depending on the properties of the enzyme to be inactivated.
  • an example is a method in which the enzyme is inactivated by heating to a temperature equal to or higher than the enzyme inactivation temperature.
  • the recovery step is a step of recovering the allulose-containing food and drink obtained through the enzyme action step (I) and, if necessary, other steps.
  • the specific recovery method may be one of the general recovery methods used in the production of allulose-containing food and drink, or a combination of two or more methods, depending on the state and type of the obtained allulose-containing food and drink.
  • the method according to the present technology described above can be embodied as including the following steps A to D.
  • E Step of recovering the produced allulose-containing food or drink
  • Steps C and D are not essential and can be carried out as necessary. Furthermore, step D can be carried out multiple times as necessary, after step B, during step B, after step C, during step C, during step E, or after step E. Furthermore, in step D, the enzyme can be inactivated by heating or the like in the manufacturing process of the allulose-containing food or drink. In addition, when multiple enzymes are used, the enzymes can also be inactivated between the actions of the enzymes (for example, between step B and step C). For example, when multiple enzymes are allowed to act in step B and/or step C, it is also possible to appropriately carry out step D during step B and/or step C. Furthermore, step B and step C can be carried out simultaneously, step C can be carried out after step B, or step B can be carried out after step C.
  • Glucosyltransferase activity measurement method 1700 ⁇ L of 50 mM potassium phosphate buffer (pH 7.0), 100 ⁇ L of 1 M sucrose solution (50 mM (1.71%) (17.1 g / L)), and 200 ⁇ L of enzyme solution were added to a test tube as substrates, mixed, and reacted at 30 ° C. for 1 hour. After the reaction, the amount of free fructose was measured using E-kit Liquid D-glucose / fructose (manufactured by JK International Co., Ltd.), and the activity was calculated as a relative value.
  • sucrose solution 50 mM phosphate buffer (pH 7.0)
  • the amount of enzyme that hydrolyzes 1 ⁇ mol of sucrose per minute was defined as 1 U, and the activity of the enzyme was calculated.
  • E. coli JM109 was transformed with the resulting amplification product to obtain a gene expression vector.
  • the D-allulose-3-epimerase sequence introduced into the gene expression vector was confirmed.
  • the gene expression vector was introduced into E. coli FBL21 (DE3).
  • the transformant was shake-cultured in LB medium at 37°C for 3 hours. After shaking culture at 25°C for 20 minutes, IPTG (final concentration 1 mM) was added and the transformant was shake-cultured at 25°C for 24 hours.
  • the cells were collected from the culture medium, suspended in 50 mM Tris-HCl buffer (pH 7.5), and disrupted using a bead shocker. The cells were centrifuged at 15,000 rpm for 10 minutes. The collected supernatant was used as the enzyme sample.
  • D-allulose-3-epimerase (Mutant 1 (M22K): D-allulose-3-epimerase having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 16, Mutant 2 (G14R): D-allulose-3-epimerase having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 17, Mutant 3 (F111W): D-allulose-3-epimerase having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 6) was added at 156 U per 1 g of fructose to each apple juice beverage (pH 4.0, 5.0, 6.0, and 7.0), and the enzyme reaction was carried out at 50°C for 2 hours. The apple juice beverage after the enzyme reaction was centrifuged at 15,000 G for 5 minutes, and each enzyme-treated apple juice beverage was prepared.

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Abstract

原料又はフルクトース含有飲食品においてアルロースを増量させる技術を提供すること。　本技術では、Ｄ－アルロース－３－エピメラーゼを含む、アルロース増量剤を提供する。前記アルロース増量剤は、グルコシルトランスフェラーゼを更に含んでいてもよい。また、本技術では、原料又はフルクトース含有飲食品にＤ－アルロース－３－エピメラーゼを作用させる工程を含む、アルロース含有飲食品の製造方法、及び原料又はフルクトース含有飲食品のアルロース増量方法も提供する。

Description

アルロース増量剤
　本技術は、アルロース増量剤に関する。より詳しくは、特定の酵素を用いたアルロース増量剤、前記アルロース増量剤が用いられたアルロース含有飲食品、アルロース含有飲食品の製造方法、及びフルクトース含有飲食品のアルロース増量方法に関する。
　近年、健康志向の社会動向を受け、食品市場において低カロリー化を謳う製品の開発が進んでいる。例えば、果汁飲料、野菜汁飲料、及びミックスジュース飲料は、利便性の高さから果物や野菜の摂取源として広く利用されており、健康の維持を目的として多くの消費者から好まれている。しかしながら、これらの飲料は果物や野菜由来の糖質を含んでおり、低カロリー化の観点からは糖質含有量をできる限り低減することが望ましい。
　例えば、特許文献１には、果汁を限外濾過膜で処理することにより、果汁に含有する糖分を濃縮した混濁果汁を膜で保持し、糖分が低減された清澄果汁を膜より透過させることを特徴とする、低カロリージュースの製造方法が開示されている。また、特許文献２には、野菜又は果物ジュースに乳酸菌を加え、該乳酸菌を増殖させ、乳酸発酵により該野菜又は果物ジュース中の糖濃度を減少させた野菜又は果物ジュースの製造方法が開示されている。しかしながら、例えば、果汁を膜処理する技術は、糖類除去により果汁のコクや濃厚感も失われてしまうという問題がある。また、乳酸菌を増殖させ、乳酸発酵によりカロリーを低減させる技術は、除菌やアルコール除去工程を要するため、後工程を容易にする技術が必要となってくる。
特表２０１５－５２２２９４号公報 特開平１０－２７１９８０号公報
　上述した通り、飲食品を低カロリー化する技術が開発されつつあるが、該技術はまだまだ開発の途である。
　そこで、本技術では、原料又はフルクトース含有飲食品においてアルロースを増量させる技術を提供することを主目的とする。
　本技術では、まず、Ｄ－アルロース－３－エピメラーゼを含む、アルロース増量剤を提供する。
　前記Ｄ－アルロース－３－エピメラーゼは、アサイア・クルングサペンシス（Ａｓａｉａ ｋｒｕｎｇｔｈｅｐｅｎｓｉｓ）由来であってもよい。
　本技術に係るアルロース増量剤は、グルコシルトランスフェラーゼを更に含んでいてもよい。
　本技術では、前記アルロース増量剤が用いられた、アルロース含有飲食品も提供する。
　また、本技術では、原料又はフルクトース含有飲食品にＤ－アルロース－３－エピメラーゼを作用させる工程を含む、アルロース含有飲食品の製造方法も提供する。
　本技術に係るアルロース含有飲食品の製造方法は、原料又はフルクトース含有飲食品にグルコシルトランスフェラーゼを作用させる工程を更に含んでいてもよい。
　更に、本技術では、原料又はフルクトース含有飲食品にＤ－アルロース－３－エピメラーゼを作用させる工程を含む、フルクトース含有飲食品のアルロース増量方法も提供する。
　本技術に係るフルクトース含有飲食品のアルロース増量方法は、原料又はフルクトース含有飲食品にグルコシルトランスフェラーゼを作用させる工程を更に含んでいてもよい。
　加えて、本技術では、アルロース生成能に優れたＤ－アルロース－３－エピメラーゼも提供する。
　以下、本技術に用いる技術用語の説明を行う。
＜アミノ酸表記＞
　アミノ酸配列における２０種類のアミノ酸残基は、一文字略記で表現することがある。
　すなわち、グリシン（Ｇｌｙ）はＧ、アラニン（Ａｌａ）はＡ、バリン（Ｖａｌ）はＶ、ロイシン（Ｌｅｕ）はＬ、イソロイシン（Ｉｌｅ）はＩ、フェニルアラニン（Ｐｈｅ）はＦ、チロシン（Ｔｙｒ）はＹ、トリプトファン（Ｔｒｐ）はＷ、セリン（Ｓｅｒ）はＳ、スレオニン（Ｔｈｒ）はＴ、システイン（Ｃｙｓ）はＣ、メチオニン（Ｍｅｔ）はＭ、アスパラギン酸（Ａｓｐ）はＤ、グルタミン酸（Ｇｌｕ）はＥ、アスパラギン（Ａｓｎ）はＮ、グルタミン（Ｇｌｎ）はＱ、リジン（Ｌｙｓ）はＫ、アルギニン（Ａｒｇ）はＲ、ヒスチジン（Ｈｉｓ）はＨ、プロリン（Ｐｒｏ）はＰで表現する場合がある。
＜アミノ酸配列＞
　本技術において、表示するアミノ酸配列は、左端がＮ末端、右端がＣ末端である。
＜アミノ酸の種類＞
　本技術において、「非極性アミノ酸」には、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、メチオニン、フェニルアラニン、及びトリプトファンが含まれる。「非電荷アミノ酸」には、グリシン、セリン、スレオニン、システイン、チロシン、アスパラギン、及びグルタミンが含まれる。「酸性アミノ酸」には、アスパラギン酸及びグルタミン酸が含まれる。「塩基性アミノ酸」には、リジン、アルギニン、及びヒスチジンが含まれる。
＜配列の改変（置換、付加、挿入、欠失、逆位等）＞
　本技術において、アミノ酸配列及び／又は塩基配列の改変は、人為的に行う改変（置換、付加、挿入、欠失、逆位等）のみならず、自然に発生した改変（置換、付加、挿入、欠失、逆位等）、すなわち、もともと配列が相違していた場合も含まれる。
＜置換＞
　本技術において、「置換」とは、人為的にアミノ酸残基の置換を導入した場合のみならず、自然にアミノ酸残基の置換が導入された場合、すなわち、もともとアミノ酸残基が相違していた場合も含まれる。本技術において、アミノ酸残基の置換は、人為的な置換であってもよく、自然な置換であってもよいが、人為的な置換が好ましい。また、変異点のアミノ酸残基（置換の対象となるアミノ酸残基）は、アミノ酸の種類を表す上記１文字とアミノ酸の位置を表す数字との組合せで表現する。例えば、５７番目のアルギニンがグリシンに置換された場合、「Ｒ５７Ｇ」と表現するものとする。
＜分離・精製＞
　本技術において、用語「分離」は、「精製」と交換可能に使用される。用語「分離」は、天然の状態、すなわち、自然界において存在している状態のものと区別するために使用される。「分離する」という人為的操作によって、天然の状態とは異なる状態である「分離された状態」となる。分離されたものは、天然物自体と明確且つ決定的に相違する。
＜等価な配列＞
　本技術において、「等価な配列」とは、基準となるアミノ酸配列（本技術では配列番号１、３、４、５、６、７、８、１６、１７、２０、２１、２２、又は２３）又は塩基配列（本技術では配列番号２、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１８、又は１９）と一部で相違するが、当該相違がタンパク質の機能（本技術ではＤ－アルロース－３－エピメラーゼ活性、又はグルコシルトランスフェラーゼ活性）に実質的な影響を与えていないアミノ酸配列又は塩基配列のことをいう。したがって、本技術において、等価なアミノ酸配列からなるポリペプチド鎖を有する酵素、又は等価な塩基配列からなるポリヌクレオチドでコードされる酵素は、Ｄ－アルロース－３－エピメラーゼ活性、又はグルコシルトランスフェラーゼ活性を示す。
　以下、本技術を実施するための好適な形態について説明する。なお、以下に説明する実施形態は、本技術の代表的な実施形態の一例を示したものであり、これにより本技術の範囲が狭く解釈されることはない。
１．アルロース増量剤
　本技術に係るアルロース増量剤は、Ｄ－アルロース－３－エピメラーゼを含有する。また、必要に応じて、グルコシルトランスフェラーゼや他の酵素、及びその他の成分を含有することもできる。
　本願発明者らは、後述する実施例に示す通り、アルロース含有飲食品の製造時等に、原料又はフルクトース含有飲食品に対してＤ－アルロース－３－エピメラーゼを作用させることにより、製造等されたアルロース含有飲食品のアルロースの量を増量させることを見出した。
　以下、本技術に用いることができる各成分について、詳細に説明する。
　（１）Ｄ－アルロース－３－エピメラーゼ
　本技術に用いることができるＤ－アルロース－３－エピメラーゼは、Ｄ－フルクトースを基質としてエピマー化を触媒し、アルロースを生成させる活性を有する酵素であり、ケトース－３－エピメラーゼの一種である。なお、本技術に用いることができるＤ－アルロース－３－エピメラーゼとしては、Ｄ－アルロース－３－エピメラーゼ活性がある限り、他の作用を更に有する酵素であってもよい。本技術では、Ｄ－アルロース－３－エピメラーゼを用いてアルロース含有飲食品を製造することで、アルロースの増量効果を発揮することができる。
　本技術に用いることができるＤ－アルロース－３－エピメラーゼの由来としては、特に限定されないが、例えば、アサイア（Ａｓａｉａ）属（例えば、アサイア・クルングサペンシス（Ａｓａｉａ ｋｒｕｎｇｔｈｅｐｅｎｓｉｓ）等）、アルスロバクター（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ）属（例えば、アルスロバクター・グロビフォルミス（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｇｌｏｂｉｆｏｒｍｉｓ）等）、プセウドモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属（例えば、プセウドモナス・シコリイ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｃｉｃｈｏｒｉｉ）等）微生物由来のＤ－アルロース－３－エピメラーゼ等が挙げられる。好ましくは、アサイア属微生物由来のＤ－アルロース－３－エピメラーゼが挙げられ、より好ましくはアサイア・クルングサペンシス由来のＤ－アルロース－３－エピメラーゼが挙げられる。
　アルロースは、ケトースに分類され、プシコースとも呼ばれる。また、天然に存在するが量が少ないので希少糖とも呼ばれる。アルロースは、スクロースの７０％程度の甘味があるが、カロリーはスクロースの１／１０であり、食後血糖値の上昇抑制、抗肥満等の機能が報告されている。したがって、フルクトース含有飲食品において、アルロースを増量させることで、低カロリー化効果が発揮される。
　ここでの「アサイア・クルングサペンシス由来のＤ－アルロース－３－エピメラーゼ」とは、アサイア・クルングサペンシスに分類される微生物（野生株であっても変異株であってもよい）が生産するＤ－アルロース－３－エピメラーゼ、或いはＤ－アルロース－３－エピメラーゼ遺伝子を利用して遺伝子工学的手法によって得られたＤ－アルロース－３－エピメラーゼであることを意味する。したがって、アサイア・クルングサペンシスより取得したＤ－アルロース－３－エピメラーゼ遺伝子（又は当該遺伝子を改変した遺伝子）を導入した宿主微生物によって生産された組換え体も「アサイア・クルングサペンシス由来のＤ－アルロース－３－エピメラーゼ」に該当する。
　アサイア・クルングサペンシス（Ａｓａｉａ ｋｒｕｎｇｔｈｅｐｅｎｓｉｓ）の菌株は、本技術の作用や効果を損なわない限り特に限定されず、生物遺伝資源機関等から一般に入手可能な菌株を用いることができる。
　本技術では、必要に応じて、本技術に用いることができる酵素を産生する微生物を培養してもよい。Ｄ－アルロース－３－エピメラーゼを産生する微生物としては、例えば、Ａｓａｉａ属微生物等が挙げられ、Ａｓａｉａ属微生物としては、例えば、Ａｓａｉａ ｋｒｕｎｇｔｈｅｐｅｎｓｉｓ等が挙げられる。用いることができる微生物としては、野生株であっても変異株（例えば、紫外線照射による変異株等）であってもよい。
　培養工程における培養条件は、培養する微生物の性質等を考慮して、適宜設定することができる。微生物の培養は、固形培地又は液体培地を用いることができる。また、工業的製造を行う場合は、通気撹拌培養を用いることもできる。
　培地の栄養源としては、微生物の生育に必要とされる物質を適宜使用することができる。炭素源としては、資化可能な炭素化合物であればよく、例えば、グルコース、スクロース、ラクトース、マルトース、糖蜜、ピルビン酸等が挙げられる。窒素源としては、資化可能な窒素化合物であればよく、例えば、ペプトン、肉エキス、酵母エキス、カゼイン加水分解物、大豆粕アルカリ抽出物等が挙げられる。また、炭素源及び窒素源の他にも、例えば、リン酸塩、炭酸塩、硫酸塩、マグネシウム、カルシウム、カリウム、鉄、マンガン、亜鉛等の塩類；特定のアミノ酸；特定のビタミン等を、必要に応じて、適宜使用してもよい。
　培養温度は、培養する微生物が生育可能であり、且つ、当該微生物が本技術に用いることができる酵素を産生し得る範囲で、適宜設定すればよい。培養温度は、例えば、１５℃～３７℃程度に設定することができる。培養時間は、例えば、１２時間～４８時間程度が挙げられる。培養工程を終了するタイミングは、例えば、本技術に用いることができる酵素が最高収量に達するタイミングを見計らって完了することができる。
　本技術に用いることができるＤ－アルロース－３－エピメラーゼは、上述したＤ－アルロース－３－エピメラーゼの由来元となる微生物の培養液より調製することができる。具体的な調製方法としては、上記の微生物の培養液又は菌体よりＤ－アルロース－３－エピメラーゼを回収する方法が挙げられる。例えば、Ｄ－アルロース－３－エピメラーゼ分泌型微生物を用いる場合は、培養液から、必要に応じて予めろ過、遠心処理等によって菌体を回収した後、酵素を分離及び／又は精製することができる。また、Ｄ－アルロース－３－エピメラーゼ非分泌型微生物を用いる場合は、必要に応じて予め培養液から菌体を回収した後、菌体を加圧処理、超音波処理等によって破砕して酵素を抽出させた後、酵素を分離及び／又は精製することができる。酵素の分離及び／又は精製法としては、公知のタンパク質分離及び／又は精製法を特に限定されることなく用いることができ、例えば、遠心分離法、ＵＦ濃縮法、塩析法、イオン交換樹脂等を用いた各種クロマトグラフィー法等が挙げられる。分離及び／又は精製された酵素は、凍結乾燥、減圧乾燥等の乾燥法により粉末化することができ、また、当該乾燥法において適当な賦形剤及び／又は乾燥助剤を用いて粉末化することもできる。また、分離及び／又は精製された酵素は、適当な添加剤を加え、ろ過滅菌することで液状化することもできる。
　本技術では、Ｄ－アルロース－３－エピメラーゼの具体例として、以下に示すアサイア・クルングサペンシス由来のＤ－アルロース－３－エピメラーゼが挙げられる。例えば、野生型アサイア・クルングサペンシス由来のＤ－アルロース－３－エピメラーゼのアミノ酸配列を配列番号１に示す。また、配列番号１に示すアミノ酸配列をコードするＤＮＡの塩基配列としては、配列番号２及び１５に示す塩基配列が挙げられる。配列番号１５に示す塩基配列は、アサイア・クルングサペンシス由来の野生型Ｄ－アルロース－３－エピメラーゼをコードするＤＮＡの塩基配列であり、配列番号２に示す塩基配列は配列番号１５に示す塩基配列を大腸菌に適したコドンに変更した塩基配列である。したがって、本技術におけるＤＮＡは、配列番号２に示す塩基配列を基準配列として当業者が適宜設計することができる。
　また、他の具体例として、国際公開第２０２３／１５７９３６号で開示された改変型Ｄ－アルロース－３－エピメラーゼのアミノ酸配列を配列番号３～８に示す。また、配列番号３～８に示すアミノ酸配列をコードするＤＮＡの塩基配列を、配列番号９～１４に示す。なお、本明細書でいう「Ｄ－アルロース－３－エピメラーゼ」の概念には、上述した野生型のＤ－アルロース－３－エピメラーゼのアミノ酸配列の一部を人為的に置換して得られるＤ－アルロース－３－エピメラーゼや、そのようなアミノ酸配列を有するように自然置換されたＤ－アルロース－３－エピメラーゼも含まれる。したがって、本明細書でいう「Ｄ－アルロース－３－エピメラーゼ」の概念には、上述した改変型Ｄ－アルロース－３－エピメラーゼ（「変異型Ｄ－アルロース－３－エピメラーゼ」とも称される）等も含まれる。
　更に、他の具体例として、改変型Ｄ－アルロース－３－エピメラーゼのアミノ酸配列を配列番号１６（Ｍ２２Ｋ）及び１７（Ｇ１４Ｒ）に示す。また、配列番号１６及び１７に示すアミノ酸配列をコードするＤＮＡの塩基配列を、配列番号１８及び１９に示す。
　本技術では、以下の（１）から（４）のいずれかに示すポリペプチドも提供する。
（１）配列番号１に示すアミノ酸配列において、Ｇ１４Ｒ及び／又はＭ２２Ｋのアミノ酸置換を含むアミノ酸配列からなるポリペプチド、
（２）上記（１）に記載のアミノ酸配列において、１個又は数個のアミノ酸残基が置換、付加、挿入又は欠失されてなり、Ｄ－アルロース－３－エピメラーゼ活性を有し、且つ、Ｇ１４Ｒ及び／又はＭ２２Ｋのアミノ酸置換が保持されているポリペプチド、及び
（３）上記（１）に記載のアミノ酸配列に対する配列同一性が９０％以上であり、Ｄ－アルロース－３－エピメラーゼ活性を有し、且つ、Ｇ１４Ｒ及び／又はＭ２２Ｋのアミノ酸置換が保持されているポリペプチド。
（４）上記（１）～（３）のいずれかに記載のアミノ酸置換を含み、更に、Ａ５６Ｅ、Ｎ５７Ｈ、Ｒ５８Ｇ、及びＦ１１１Ｗからなる群より選択される１又は２以上のアミノ酸置換を含むポリペプチド。
　また、本技術では、以下の（５）から（７）のいずれかに示すポリペプチドも提供する。
（５）配列番号１に示すアミノ酸配列において、Ｍ２２Ｋ、Ｇ１４Ｒ、及びＦ１１１Ｗからなる群より選択される１又は２以上のアミノ酸置換を含むアミノ酸配列からなるポリペプチド、
（６）上記（１）に記載のアミノ酸配列において、１個又は数個のアミノ酸残基が置換、付加、挿入又は欠失されてなり、Ｄ－アルロース－３－エピメラーゼ活性を有し、且つ、Ｍ２２Ｋ、Ｇ１４Ｒ、及びＦ１１１Ｗからなる群より選択される１又は２以上のアミノ酸置換が保持されているポリペプチド、及び
（７）上記（１）に記載のアミノ酸配列に対する配列同一性が９０％以上であり、Ｄ－アルロース－３－エピメラーゼ活性を有し、且つ、Ｍ２２Ｋ、Ｇ１４Ｒ、及びＦ１１１Ｗからなる群より選択される１又は２以上のアミノ酸置換が保持されているポリペプチド。
　上記（５）のアミノ酸置換としては、Ｍ２２Ｋのみ、Ｇ１４Ｒのみ、Ｆ１１１Ｗのみの１重置換；Ｍ２２ＫとＧ１４Ｒ、Ｍ２２ＫとＦ１１１Ｗ、Ｇ１４ＲとＦ１１１Ｗの２重置換；Ｍ２２ＫとＧ１４ＲとＦ１１１Ｗの３重置換が挙げられる。
　上記（２）及び（６）のポリペプチドにおいて、導入されるアミノ酸の改変は、置換、付加、挿入、及び欠失の中から１種類の改変のみ（例えば、置換のみ等）を含むものであってもよく、２種以上の改変（例えば、置換と挿入等）を含んでいてもよい。上記（２）及び（６）のポリペプチドにおいて、任意相違部位におけるアミノ酸の相違の数は、１個又は数個であればよく、例えば、１個～８０個、好ましくは１個～７０個、１個～６０個、１個～５０個、１個～４０個、又は１個～３０個、より好ましくは１個～２０個、１個～１０個、１個～９個、１個～８個、１個～７個、１個～６個、１個～５個、又は１個～４個、更に好ましくは１個～３個、特に好ましくは１個又は２個或いは１個が挙げられる。ただし、上記（１）及び（５）のアミノ酸置換は保持される。
　また、上記（３）及び（７）のポリペプチドにおいて、上記（１）及び（５）のアミノ酸配列に対する配列同一性は、７０％以上であればよいが、好ましくは８０％以上、より好ましくは８５％以上、９０％以上、９５％以上、９６％以上、更に好ましくは９７％以上、より更に好ましくは９８％以上、特に好ましくは９９％以上が挙げられる。
　ここで、上記（３）及び（７）のポリペプチドにおいて、上記（１）及び（５）の各アミノ酸配列に対する配列同一性とは、上記（１）及び（５）のアミノ酸配列と比較して算出される配列同一性である。また、「配列同一性」とは、ＢＬＡＳＴＰＡＣＫＡＧＥ［ｓｇｉ３２ ｂｉｔ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｖｅｒｓｉｏｎ ２．０．１２；ａｖａｉｌａｂｌｅ ｆｒｏｍ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ）］のｂｌ２ｓｅｑ ｐｒｏｇｒａｍ（Ｔａｔｉａｎａ Ａ．Ｔａｔｓｕｓｏｖａ，Ｔｈｏｍａｓ Ｌ．Ｍａｄｄｅｎ，ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．，Ｖｏｌ．１７４，ｐ２４７-２５０，１９９９）により得られるアミノ酸配列の同一性の値を示す。パラメーターは、Ｇａｐ ｉｎｓｅｒｔｉｏｎ Ｃｏｓｔ ｖａｌｕｅ：１１、Ｇａｐ ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ Ｃｏｓｔ ｖａｌｕｅ：１に設定すればよい。
　なお、上記（２）及び（６）、並びに、上記（３）及び（７）のポリペプチドは、上記（１）及び（５）のポリペプチドと実質的に同一である。
　Ｍ２２Ｋ、Ｇ１４Ｒ、Ａ５６Ｅ、Ｎ５７Ｈ、Ｒ５８Ｇ、及びＦ１１１Ｗからなる群より選択される１又は２以上は、より大きいタンパク質（例えば、融合タンパク質等）の一部であってもよい。融合タンパク質において付加される配列としては、例えば、多重ヒスチジン残基のような精製に役立つ配列、組み換え生産の際の安定性を確保する付加配列等が挙げられる。
　上記（２）及び（６）、並びに、上記（３）及び（７）のポリペプチドにおいて、上記（１）及び（５）のポリペプチドに対してアミノ酸置換が導入されている場合、導入されるアミノ酸置換の好適な一態様として保存的置換が挙げられる。すなわち、上記（２）及び（６）、並びに、上記（３）及び（７）のポリペプチドにおける置換としては、例えば、置換前のアミノ酸が非極性アミノ酸であれば他の非極性アミノ酸への置換、置換前のアミノ酸が非荷電性アミノ酸であれば他の非荷電性アミノ酸への置換、置換前のアミノ酸が酸性アミノ酸であれば他の酸性アミノ酸への置換、及び置換前のアミノ酸が塩基性アミノ酸であれば他の塩基性アミノ酸への置換が挙げられる。
　上記（２）及び（６）、並びに、上記（３）及び（７）のポリペプチドにおいて、「Ｄ－アルロース－３－エピメラーゼ活性を有する」とは、後述する実施例における「Ｄ－アルロース－３－エピメラーゼ活性測定方法」で測定した場合に、Ｄ－アルロース－３－エピメラーゼ活性が検出できることを意味し、好ましくは、上記（１）及び（５）のポリペプチドとＤ－アルロース－３－エピメラーゼ活性が同等であること、具体的には、上記（１）及び（５）のポリペプチドのＤ－アルロース－３－エピメラーゼ活性を１とした場合の相対活性が０．８～１．２程度を示すことを意味する。
　上記（１）～（７）のポリペプチドは、Ｄ－アルロース－３－エピメラーゼ活性を有する限り、アサイア・クルングサペンシス由来のＤ－アルロース－３－エピメラーゼと称する。
　本技術では、以下の（１）から（３）のいずれかに示すＤＮＡも提供する。
（１）配列番号１６又は１７のいずれかに記載のポリペプチドをコードするＤＮＡ、
（２）配列番号１８又は１９のいずれかに示す塩基配列からなるポリヌクレオチド、
（３）配列番号１８又は１９のいずれかに示す塩基配列と等価の配列からなり、Ｄ－アルロース－３－エピメラーゼ活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ。
　配列番号１に示すアミノ酸配列をコードするＤＮＡの塩基配列として、配列番号２及び配列番号１５に示す塩基配列が挙げられる。配列番号１５に示す塩基配列はアサイア・クルングサペンシス由来の野生型Ｄ－アルロース－３－エピメラーゼをコードするＤＮＡの塩基配列であり、配列番号２に示す塩基配列は配列番号１５に示す塩基配列を大腸菌に適したコドンに変更した塩基配列である。したがって、本技術に係るＤＮＡは、配列番号２に示す塩基配列を基準配列として当業者が適宜設計することができる。
　なお、配列番号１８及び１９に示す塩基配列は、大腸菌に適したコドンに変更した塩基配列である。
　Ｄ－アルロース－３－エピメラーゼをコードするＤＮＡは上記配列に限定されるものではなく、上記配列と等価な配列からなるＤＮＡでもよい。ここで、等価な配列とは、上述した（１）又は（２）に示されるＤＮＡの塩基配列と７０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは８５％以上、更に好ましくは９０％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、より更に好ましくは９８％以上、特に好ましくは９９％以上の相同性を有する塩基配列を有するＤＮＡも、それがＤ－アルロース－３－エピメラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする限り、Ｄ－アルロース－３－エピメラーゼをコードするＤＮＡに含まれる。
　ここで、ＤＮＡの「相同性」は、基準配列を照会配列として比較するアルゴリズムをもった公開又は市販されているソフトウェアを用いて計算される。具体的には、ＢＬＡＳＴ、ＦＡＳＴＡ、又はＧＥＮＥＴＹＸ（ソフトウエア開発株式会社製）等を用いることができ、これらはデフォルトパラメーターに設定して使用すればよい。
　また、上述したアミノ酸配列の置換、付加、挿入又は欠失に対応して、数個の塩基に置換、付加、挿入又は欠失の変異が生じた塩基配列も、それがＤ－アルロース－３－エピメラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする限り、Ｄ－アルロース－３－エピメラーゼをコードするＤＮＡに含まれる。更に、上述したポリペプチドをコードする塩基配列からなるＤＮＡと相補的な塩基配列も等価な配列であり、該塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡも、これがＤ－アルロース－３－エピメラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする限り、Ｄ－アルロース－３－エピメラーゼをコードするＤＮＡに含まれる。なお、ハイブリダイゼーション法は、常法に従って行うことができる。以下、同様である。
　Ｄ－アルロース－３－エピメラーゼをコードするＤＮＡは、上記所定のポリペプチドを産生する微生物から分離することもできる。例えば、アサイア・クルングサペンシスのゲノムＤＮＡを鋳型として、既知のアミノ酸配列情報から遺伝子の縮重を考慮して設計したプライマー若しくはプローブ又は既知の塩基配列情報に基づいて設計したプライマー又はプローブを用いたＰＣＲ又はハイブリダイゼーション法により、前記微生物のゲノムから目的のＤＮＡを分離することができる。
　Ｄ－アルロース－３－エピメラーゼをコードするＤＮＡには、コドンの縮重に由来する多種のＤＮＡが包含される。同じアミノ酸配列をコードする多種のＤＮＡを人為的に作製することは、公知の遺伝子工学的手法を用いて容易に行うことができる。例えば、遺伝子工学的なタンパク質の生産において、目的のタンパク質をコードする本来の遺伝子上で使用されているコドンが宿主中では使用頻度の低いものであった場合には、タンパク質の発現量が低いことがある。このような場合にはコードされているアミノ酸配列に変化を与えることなく、コドン利用頻度を宿主に最適化することにより、目的タンパク質の高発現を図ることができる。
　遺伝子に変異を導入し、人為的にアミノ酸配列を改変する方法としては、Ｋｕｎｋｅｌ法やＧａｐｐｅｄ ｄｕｐｌｅｘ法等の公知の手法、及び部位特異的突然変異誘発法を利用した変異導入キット、例えば、ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ Ｓｉｔｅ－Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔ（ストラタジーン社製）、ＧｅｎｅＡｒｔ Ｓｉｔｅ－Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ ＰＬＵＳ Ｓｙｓｔｅｍ（インビトロジェン社製）、ＴａＫａＲａ Ｓｉｔｅ－Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｍｕｔａｎ－Ｋ，Ｍｕｔａｎ－Ｓｕｐｅｒ Ｅｘｐｒｅｓｓ Ｋｍ、ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｂａｓａｌ Ｋｉｔ等：タカラバイオ社製）等を用いることができる。なお、ＤＮＡの塩基配列の確認や得られたＤＮＡが目的のポリペプチドをコードするＤＮＡであるかどうかの確認は、常法に従って行うことができる。
　本技術では、上記所定のポリペプチドをコードするＤＮＡを含む発現カセット又は組換えベクター（以下、「本技術に係る発現カセット」又は「本技術に係る組換えベクター」とも称する）は、Ｄ－アルロース－３－エピメラーゼをコードするＤＮＡにプロモーター及びターミネーターを連結することにより、又は、発現ベクターに本技術に係る発現カセット若しくは本技術に係るＤ－アルロース－３－エピメラーゼをコードするＤＮＡを挿入することにより得ることができる。
　本技術に係る発現カセット又は本技術に係る組換えベクターには、制御因子として、プロモーター及びターミネーターの他、更に必要に応じて、エンハンサー、ＣＣＡＡＴボックス、ＴＡＴＡボックス、ＳＰＩ部位等の転写要素が含まれていてもよい。これらの制御因子は、本技術に係るＤＮＡに作動可能に連結されていればよい。作動可能に連結とは、本技術に係るＤＮＡを調節する種々の制御因子と本発明のＤＮＡが、宿主細胞中で作動し得る状態で連結されることをいう。
　本技術に係る組換えベクターについて、発現ベクターとしては、宿主内で自律的に増殖し得るファージ、プラスミド、又はウイルスから遺伝子組換え用として構築されたものが好適である。このような発現ベクターは公知であり、例えば、商業的に入手可能な発現ベクターとしては、ｐＱＥ系ベクター（株式会社キアゲン製）、ｐＤＲ５４０、ｐＲＩＴ２Ｔ（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス株式会社製）、ｐＥＴ系ベクター（メルク株式会社製）等が挙げられる。発現ベクターは、宿主細胞との適切な組み合わせを選んで使用すればよく、例えば、大腸菌を宿主細胞とする場合には、ｐＥＴ系ベクターとＤＨ５α大腸菌株の組み合わせ、ｐＥＴ系ベクターとＢＬ２１（ＤＥ３）大腸菌株の組み合わせ、又はｐＤＲ５４０ベクターとＪＭ１０９大腸菌株の組み合わせ等が挙げられる。
　また、本技術に係る発現カセット又は本技術に係る組換えベクターを用いて宿主を形質転換することによって形質転換体（以下、「本技術に係る形質転換体」とも称する）が得られる。
　形質転換体の製造に使用される宿主としては、遺伝子の導入が可能で、発現カセット又は組換えベクターが安定であり、且つ、自律増殖可能で本技術に係るＤＮＡを含む遺伝子の形質を発現できるのであれば特に制限されないが、例えば、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）等のエッシェリヒア属、バチルス・ズブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）等のバチルス属、シュードモナス・プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ）等のシュードモナス属、アサイア・クルングサペンシス（Ａｓａｉａ ｋｒｕｎｇｔｈｅｐｅｎｓｉｓ）等のアサイア属等に属する細菌；酵母等が好適な例として挙げられる。また、その他にも、動物細胞、昆虫細胞、植物等であってもよい。
　本技術に係る形質転換体は、宿主に本技術に係る発現カセット又は本技術に係る組換えベクターを導入することによって得ることができる。本技術に係るＤＮＡを導入する場所も、目的の遺伝子が発現できる限り特に限定されず、プラスミド上であってもよいし、ゲノム上であってもよい。本技術に係る発現カセット又は本技術に係る組換えベクターを導入する方法としては、例えば、組換えベクター法、ゲノム編集法等が挙げられる。宿主に発現カセット又は組換えベクターを導入する条件は、宿主の種類等に応じて、適宜設定すればよい。宿主が細菌の場合であれば、例えば、カルシウムイオン処理によるコンピテントセルを用いる方法、エレクトロポレーション法等が挙げられる。宿主が酵母の場合であれば、例えば、電気穿孔法（エレクトロポレーション法）、スフェロプラスト法、酢酸リチウム法等が挙げられる。宿主が動物細胞の場合であれば、例えば、エレクトロポレーション法、リン酸カルシウム法、リポフェクション法等が挙げられる。宿主が昆虫細胞の場合であれば、例えば、リン酸カルシウム法、リポフェクション法、エレクトロポレーション法等が挙げられる。宿主が植物胞の場合であれば、例えば、エレクトロポレーション法、アグロバクテリウム法、パーティクルガン法、ＰＥＧ法等が挙げられる。
　本技術に係る発現カセット又は本技術に係る組換えベクターが宿主に組み込まれたか否かの確認は、ＰＣＲ法、サザンハイブリダイゼーション法、ノーザンハイブリダイゼーション法等により行うことができる。ＰＣＲ法によって本技術に係る発現カセット又は本技術に係る組換えベクターが宿主に組み込まれたか否かを確認する場合、例えば、形質転換体からゲノムＤＮＡ又は発現カセット又は組換えベクターを分離・精製すればよい。
　発現カセット又は組換えベクターの分離・精製は、例えば、宿主が細菌の場合、細菌を溶菌して得られる溶菌物に基づいて行われる。溶菌の方法としては、例えば、リゾチーム等の溶菌酵素により処理が施され、必要に応じて、プロテアーゼ及び他の酵素、並びに、ラウリル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）等の界面活性剤が併用される。更に、凍結融解及びフレンチプレス処理のような物理的破砕方法を組み合わせてもよい。溶菌物からのＤＮＡの分離・精製は、例えば、フェノール処理及びプロテアーゼ処理による除蛋白処理、リボヌクレアーゼ処理、アルコール沈殿処理、並びに、市販のキットを適宜組み合わせることにより行うことができる。
　ＤＮＡの切断は、常法に従い、例えば、制限酵素処理を用いて行うことができる。制限酵素としては、例えば、特定のヌクレオチド配列に作用するＩＩ型制限酵素を用い得る。ＤＮＡと発現カセット又は発現ベクターとの結合は、例えば、ＤＮＡリガーゼを用いて行い得る。その後、分離・精製したＤＮＡを鋳型として、本技術に係るＤＮＡに特異的なプライマーを設計してＰＣＲを行う。ＰＣＲにより得られた増幅産物についてアガロースゲル電気泳動、ポリアクリルアミドゲル電気泳動、キャピラリー電気泳動等を行い、臭化エチジウム及びＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ液等により染色し、そして増幅産物をバンドとして検出することにより、形質転換されたことを確認することができる。
　また、予め蛍光色素等により標識したプライマーを用いてＰＣＲを行い、増幅産物を検出することもできる。更に、マイクロプレート等の固相に増幅産物を結合させ、蛍光及び酵素反応等により増幅産物を確認する方法も採用してもよい。
　更に、本技術は、上述した形質転換体を培養する工程を含む、ポリペプチドの製造方法を包含する。
　形質転換体を培養する工程の培養条件は、上記形質転換体の栄養生理的性質を考慮して、適宜設定すればよいが、好ましくは液体培養が挙げられる。また、工業的製造を行う場合であれば、通気撹拌培養を採用することが好ましい。培地の栄養源としては、形質転換体の生育に必要とされるものが使用される。炭素源としては、資化可能な炭素化合物であればよく、例えば、グルコース、スクロース、ラクトース、マルトース、糖蜜、ピルビン酸等が挙げられる。窒素源としては、資化可能な窒素化合物であればよく、例えば、ペプトン、肉エキス、酵母エキス、カゼイン加水分解物、大豆粕アルカリ抽出物等が挙げられる。また、炭素源及び窒素源の他にも、例えば、リン酸塩、炭酸塩、硫酸塩、マグネシウム、カルシウム、カリウム、鉄、マンガン、亜鉛等の塩類；特定のアミノ酸；特定のビタミン等を、必要に応じて、適宜使用してもよい。
　培養温度は、上述した形質転換体が生育可能であり、且つ、上記形質転換体が所定のポリペプチドを産生する範囲で、適宜設定する。例えば、培養温度は、１５℃～３７℃程度であることが好ましい。培養は、ポリペプチドが最高収量に達する時期を見計らって適当時期に完了すればよく、通常は培養時間が１２時間～４８時間程度となる。
　形質転換体を培養する工程の後には、培養液を遠心分離などの方法に供し、培養上清及び／又は菌体を回収する。菌体には、超音波やフレンチプレスといった機械的方法又はリゾチーム等の溶菌酵素による処理を施し、必要に応じて、プロテアーゼ等の酵素やラウリル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）等の界面活性剤を使用することにより可溶化し、所定のオキシゲナーゼを含む水溶性画分を得る。また、適当な発現カセット又は発現用ベクターと宿主を選択することにより、発現したポリペプチドを培養液中に分泌させることもできる。
　上記のようにして得られたポリペプチドを含む水溶性画分は、そのまま精製処理に供してもよいが、該水溶性画分中のポリペプチドを濃縮した後に精製処理に供してもよい。濃縮は、例えば、減圧濃縮、膜濃縮、塩析処理、親水性有機溶媒（例えば、メタノール、エタノール、アセトン等）による分別沈殿法等により行うことができる。また、精製処理は、例えば、ゲルろ過、吸着クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフィー等の方法を適宜組み合わせることによって行うことができる。精製された所定のポリペプチドは、必要に応じて、凍結乾燥、真空乾燥、スプレードライ等により粉末化してもよい。
　また、糖鎖及び／又は脂質の付加や、或いはＮ末端若しくはＣ末端のプロセッシングが生ずるような修飾を施してもよい。上記のような修飾により、組換えタンパク質の抽出、精製の簡便化、又は生物学的機能の付加等が可能である。
　なお、突然変異により、アサイア・クルングサペンシスが上記所定のポリペプチドで示されるＤ－アルロース－３－エピメラーゼを産生するようになった場合は、該アサイア・クルングサペンシスを培養し、培養液又は菌体から本発明のＤ－アルロース－３－エピメラーゼを回収し、精製することにより製造することができる。
　本技術に係るアルロース増量剤中のＤ－アルロース－３－エピメラーゼの含有量は、本技術の効果を損なわない限り自由に設定することができる。Ｄ－アルロース－３－エピメラーゼの下限値は、アルロース含有飲食品の製造に用いるフルクトース１ｇに対して、例えば、０．０００３Ｕ以上に設定することができ、アルロース増量効果をより一層高める観点から、好ましくは０．００１５Ｕ以上、より好ましくは０．００３Ｕ以上、０．０３Ｕ以上、０．３Ｕ以上、１Ｕ以上、１０Ｕ以上、２０Ｕ以上、３０Ｕ以上、４０Ｕ以上、５０Ｕ以上、６０Ｕ以上、７０Ｕ以上、更に好ましくは７０Ｕ以上、一層好ましくは１４０Ｕ以上に設定することができる。
　本技術に係るアルロース増量剤中のＤ－アルロース－３－エピメラーゼの含有量の上限値も、本技術の効果を損なわない限り特に限定されないが、アルロース含有飲食品の製造に用いるフルクトース１ｇに対して、例えば、１００００Ｕ以下、９０００Ｕ以下、８０００Ｕ以下、７０００Ｕ以下、６０００Ｕ以下、５０００Ｕ以下、４０００Ｕ以下、３０００Ｕ以下、２０００Ｕ以下、１０００Ｕ以下、９００Ｕ以下、８００Ｕ以下、７００Ｕ以下、６００Ｕ以下、５００Ｕ以下、４００Ｕ以下、３１５Ｕ以下、３００Ｕ以下、２５０Ｕ以下、２００Ｕ以下、又は１８０Ｕ以下に設定することができる。
　なお、本技術において、Ｄ－アルロース－３－エピメラーゼの活性は、１００ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌバッファー（1ｍＭ ＣｏＣｌ２）ｐＨ７．５と５０（ｖ／ｗ）％フルクトースを含んだ反応溶液に対して５０℃で１時間作用させた場合に、１分間に１ｍｍｏｌのアルロースを生成する酵素量を１単位（１Ｕ）と定義する。
　（２）グルコシルトランスフェラーゼ
　本技術に係るアルロース増量剤は、グルコシルトランスフェラーゼを更に含むことが好ましい。グルコシルトランスフェラーゼを更に含むことにより、アルロース増量効果が更に期待できる。
　本技術に用いることができるグルコシルトランスフェラーゼは、スクロースを加水分解し、α－１,３グルカン、及びロイクロースから選択される１以上の糖質を生成する酵素である。本技術に係るグルコシルトランスフェラーゼが生成可能なα－１，３グルカンには、不溶性α－１，３グルカン及び可溶性α－１，３グルカンを含む。また、本技術に係るグルコシルトランスフェラーゼが生成可能な不溶性α－１，３グルカンには、７糖以上の糖類を含む。本技術に係るグルコシルトランスフェラーゼが生成可能な可溶性α－１，３グルカンには、ニゲロース、ニゲロトリオース、ニゲロテトラオース、ニゲロペンタオース、ニゲロヘキサオース等のニゲロオリゴ糖を含む。なお、本技術に用いることができるグルコシルトランスフェラーゼは、グルコシルトランスフェラーゼ活性がある限り、他の作用を更に有する酵素であってもよい。
　本技術に用いることができるグルコシルトランスフェラーゼの由来としては、特に限定されないが、例えば、細菌（例えば、ストレプトコッカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）属）、糸状菌（例えば、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属）等由来のグルコシルトランスフェラーゼ等が挙げられる。好ましくは、ストレプトコッカス属微生物由来のグルコシルトランスフェラーゼが挙げられ、より好ましくはストレプトコッカス・サーモフィラス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）由来のグルコシルトランスフェラーゼが挙げられる。
　ここでの「ストレプトコッカス・サーモフィラス由来のグルコシルトランスフェラーゼ」とは、ストレプトコッカス・サーモフィラスに分類される微生物（野生株であっても変異株であってもよい）が生産するグルコシルトランスフェラーゼ、或いはグルコシルトランスフェラーゼ遺伝子を利用して遺伝子工学的手法によって得られたグルコシルトランスフェラーゼであることを意味する。したがって、ストレプトコッカス・サーモフィラスより取得したグルコシルトランスフェラーゼ遺伝子（又は当該遺伝子を改変した遺伝子）を導入した宿主微生物によって生産された組換え体も「ストレプトコッカス・サーモフィラス由来のグルコシルトランスフェラーゼ」に該当する。
　ストレプトコッカス・サーモフィラス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）の菌株は、本技術の作用や効果を損なわない限り特に限定されず、生物遺伝資源機関等から一般に入手可能な菌株を用いることができる。
　本技術では、必要に応じて、本技術に用いることができる酵素を産生する微生物を培養してもよい。グルコシルトランスフェラーゼを産生する微生物としては、例えば、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ属微生物等が挙げられ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ属微生物としては、例えば、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ等が挙げられる。用いることができる微生物としては、野生株であっても変異株（例えば、紫外線照射による変異株等）であってもよい。
　培養工程における培養条件は、培養する微生物の性質等を考慮して、適宜設定することができる。微生物の培養は、固形培地又は液体培地を用いることができる。また、工業的製造を行う場合は、通気撹拌培養を用いることもできる。
　培地の栄養源としては、微生物の生育に必要とされる物質を適宜使用することができる。炭素源としては、資化可能な炭素化合物であればよく、例えば、グルコース、スクロース、ラクトース、マルトース、糖蜜、ピルビン酸等が挙げられる。窒素源としては、資化可能な窒素化合物であればよく、例えば、ペプトン、肉エキス、酵母エキス、カゼイン加水分解物、大豆粕アルカリ抽出物等が挙げられる。また、炭素源及び窒素源の他にも、例えば、リン酸塩、炭酸塩、硫酸塩、マグネシウム、カルシウム、カリウム、鉄、マンガン、亜鉛等の塩類；特定のアミノ酸；特定のビタミン等を、必要に応じて、適宜使用してもよい。
　培養温度は、培養する微生物が生育可能であり、且つ、当該微生物が本技術に用いることができる酵素を産生し得る範囲で、適宜設定すればよい。培養温度は、例えば、１５℃～３７℃程度に設定することができる。培養時間は、例えば、１２時間～４８時間程度が挙げられる。培養工程を終了するタイミングは、例えば、本技術に用いることができる酵素が最高収量に達するタイミングを見計らって完了することができる。
　本技術に用いることができるグルコシルトランスフェラーゼは、上述したグルコシルトランスフェラーゼの由来元となる微生物の培養液より調製することができる。具体的な調製方法としては、上記の微生物の培養液又は菌体よりグルコシルトランスフェラーゼを回収する方法が挙げられる。例えば、グルコシルトランスフェラーゼ分泌型微生物を用いる場合は、培養液から、必要に応じて予めろ過、遠心処理等によって菌体を回収した後、酵素を分離及び／又は精製することができる。また、グルコシルトランスフェラーゼ非分泌型微生物を用いる場合は、必要に応じて予め培養液から菌体を回収した後、菌体を加圧処理、超音波処理等によって破砕して酵素を抽出させた後、酵素を分離及び／又は精製することができる。酵素の分離及び／又は精製法としては、公知のタンパク質分離及び／又は精製法を特に限定されることなく用いることができ、例えば、遠心分離法、ＵＦ濃縮法、塩析法、イオン交換樹脂等を用いた各種クロマトグラフィー法等が挙げられる。分離及び／又は精製された酵素は、凍結乾燥、減圧乾燥等の乾燥法により粉末化することができ、また、当該乾燥法において適当な賦形剤及び／又は乾燥助剤を用いて粉末化することもできる。また、分離及び／又は精製された酵素は、適当な添加剤を加え、ろ過滅菌することで液状化することもできる。
　本技術では、グルコシルトランスフェラーゼの具体例として、以下に示すストレプトコッカス・サーモフィラス由来のグルコシルトランスフェラーゼが挙げられる。例えば、ストレプトコッカス・サーモフィラス由来の配列番号２０に示すアミノ酸配列からなるポリペプチドを含むグルコシルトランスフェラーゼが挙げられる。シグナル配列やプロ配列を含むアミノ酸配列は、配列番号２１に示す。また、他の具体例として、ストレプトコッカス・サーモフィラス由来の配列番号２２に示すアミノ酸配列からなるポリペプチドを含むグルコシルトランスフェラーゼが挙げられる。シグナル配列やプロ配列を含むアミノ酸配列は、配列番号２３に示す。
　なお、本技術に用いることができるグルコシルトランスフェラーゼは、後述する（１）に示すポリペプチドのみならず、後述する（２）～（４）に示すポリペプチドを含むグルコシルトランスフェラーゼであってもよい。また、本技術に用いることができるグルコシルトランスフェラーゼは、後述する（１）～（４）のアミノ酸配列をもとに人工的に設計した人工タンパク質であってもよい。
（１）配列番号２０又は配列番号２２に示すアミノ酸配列からなるポリペプチド、
（２）配列番号２０又は配列番号２２に示すアミノ酸配列において、１個又は数個のアミノ酸残基が置換、付加、挿入、欠失、又は逆位されてなり、且つグルコシルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチド、
（３）配列番号２０に示すアミノ酸配列において、配列番号２０に示すアミノ酸配列に対する配列同一性が９３％以上であり、且つグルコシルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチド、及び
（４）配列番号２２に示すアミノ酸配列において、配列番号２２に示すアミノ酸配列に対する配列同一性が９０％以上であり、且つグルコシルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチド。
　本技術に係るアルロース増量剤中のグルコシルトランスフェラーゼの含有量の下限値は、本技術の効果を損なわない限り自由に設定することができる。グルコシルトランスフェラーゼの含有量は、アルロース含有飲食品の製造に用いるフルクトース１ｇに対して、例えば、０．０００１Ｕ以上に設定することができ、アルロース増量効果をより一層高める観点から、好ましくは０．００１Ｕ以上、より好ましくは０．０１Ｕ以上、０．０３Ｕ以上、０．０５Ｕ以上、０．１Ｕ以上、０．５Ｕ以上、１Ｕ以上、５Ｕ以上、更に好ましくは７．５Ｕ以上、一層好ましくは１０Ｕ以上に設定することができる。
　本技術に係るアルロース増量剤中のグルコシルトランスフェラーゼの含有量の上限値も、本技術の効果を損なわない限り特に限定されないが、アルロース含有飲食品の製造に用いるフルクトース１ｇに対して、例えば、５００Ｕ以下、４００Ｕ以下、３００Ｕ以下、２００Ｕ以下、１００Ｕ以下、又は５０Ｕ以下に設定することができる。
　なお、本技術において、グルコシルトランスフェラーゼの活性は、５０ｍＭ スクロース溶液（５０ｍＭリン酸カリウムバッファー、ｐＨ７．０）を基質とし、３０℃で処理した場合に、１分間に１μｍｏｌのスクロースを加水分解する酵素量を１単位（１Ｕ）と定義する。
　（３）その他の成分
　本技術に係るアルロース増量剤は、本技術の作用や効果を損なわない限り、その他の成分を併用することができる。その他の成分としては、例えば、通常、製剤化に用いられている賦形剤、ｐＨ調整剤、着色剤、矯味剤、崩壊剤、滑沢剤、安定剤、酵素等の成分を用いることができる。更に、公知の又は将来的に見出される機能を有する成分を、適宜目的に応じて併用することも可能である。
２．アルロース含有飲食品
　以下、本技術に係るアルロース含有飲食品について、詳細に説明する。
　（１）原料
　本技術に係るアルロース含有飲食品、又はフルクトース含有飲食品に用いることができる原料は、本技術の効果を損なわない限り、原料の起源、種類等は特に限定されず、目的の飲食品に応じて、自由に選択することができるが、フルクトースを含んだ原料（フルクトース含有原料）が好ましい。
　具体的には、例えば、ブドウ、桃、バナナ、リンゴ、イチゴ、メロン、マンゴー、梅、サクランボ、オレンジ、温州ミカン、レモン、グレープフルーツ、ライム、マンダリン、ユズ、タンジェリン、テンプルオレンジ、タンジェロ、カラマンシー、柿、ブルーベリー、パイナップル、パパイヤ、ライチ、アセロラ、梨、洋梨、アンズ、グアバ、プルーン、アプリコット等の果汁が挙げられる。また、ニンジン、トマト、ピーマン、パプリカ、小松菜、ケール、ブロッコリー、ほうれん草、アスパラガス、だいこん、はくさい、セロリ、キャベツ、ビート、たまねぎ、レタス、パセリ、クレソン、カボチャ、スイカ、コーン等の野菜汁が挙げられる。なお、果汁及び／又は野菜汁は１種単独で用いてもよく、２種以上を組み合わせて用いてもよい。
　（２）フルクトース含有飲食品
　本技術において、フルクトース含有飲食品とは、上述した原料を用いて加工又は調理して製造されたフルクトース含有飲食品等が挙げられる。フルクトース含有飲食品としては、例えば、果汁飲料、野菜汁飲料、及びミックスジュース飲料からなる群より選択される１種又は２種以上が挙げられる。好ましくは果汁飲料、野菜汁飲料が挙げられ、より好ましくはリンゴ果汁飲料、ニンジン汁飲料が挙げられる。
　本技術において、原料又はフルクトース含有飲食品はアルロース増量剤の対象であり、後述するように、本技術に係るアルロース増量剤により、原料又はフルクトース含有飲食品中のフルクトースの量が減少し、アルロースが増量する。
　（３）アルロース含有飲食品
　本技術に係るアルロース含有飲食品は、上述した原料又はフルクトース含有飲食品にアルロース増量剤を用いて製造された飲食品である。
　本技術に係るアルロース含有飲食品に含まれる糖類の量としては、特に限定されないが、原料又はフルクトース含有飲食品の原料におけるフルクトースの量が減少し、アルロースが増量されていることが好ましい。本技術に用いることができる原料又はフルクトース含有飲食品に含まれるフルクトース（「果糖」とも称される）の含有量は、本技術の作用や効果を行わない限り自由に設定することができる。フルクトースの含有量としては、例えば、１重量％以上、２重量％以上、３重量％以上、４重量％以上、５重量％以上、又は６重量％以上である。
　本技術に係るアルロース含有飲食品に含まれるアルロースの糖組成としては、例えば、１％以上、好ましくは１．５％以上、より好ましくは５％以上、更に好ましくは７．５％以上である。本技術に係るアルロース含有飲食品に含まれるアルロースの糖組成としての上限は、特に限定されず、例えば、３０％以下、２５％以下、２０％以下、又は１５％以下である。
　本技術に係るアルロース含有飲食品に含まれるフルクトースの糖組成としては、例えば、８０％以下、好ましくは７０％以下、より好ましくは６５％以下、更に好ましくは５０％以下である。本技術に係るアルロース含有飲食品に含まれるフルクトースの糖組成としての下限は、特に限定されず、例えば２０％以上、３０％以上、又は４０％以上である。
　本技術に係るアルロース含有飲食品の具体例としては、例えば、果汁飲料、野菜汁飲料、及びミックスジュース飲料からなる群より選択される１種又は２種以上が挙げられる。好ましくは果汁飲料、野菜汁飲料が挙げられ、より好ましくはリンゴ果汁飲料、ニンジン汁飲料が挙げられる。
　（４）その他
　また、本技術に係るアルロース増量剤は、植物由来の糖蜜にも使用することができる。植物由来の糖蜜の原料としては、例えば、ハチミツ、アガベシロップ、メープルシロップ等が挙げられる。
　本技術において、各種酵素処理に供される際の原料又はフルクトース含有飲食品の性状も、本技術の効果を損なわない限り、特に限定されないが、好ましくは液状、ペースト状が挙げられ、より好ましくは液状が挙げられる。また、皮を有する原料を用いる場合、皮を剥皮したもの、或いは剥皮していないもののいずれも用いることができる。
３．アルロース含有飲食品の製造方法、及びフルクトース含有飲食品のアルロース増量方法
　本技術に係るアルロース含有飲食品の製造方法、及びフルクトース含有飲食品のアルロース増量方法は、原料又はフルクトース含有飲食品に、Ｄ－アルロース－３－エピメラーゼを作用させる工程（「酵素作用工程（Ｉ）」とも称する）を含む方法である。また、本技術に係るアルロース含有飲食品の製造方法、及びフルクトース含有飲食品のアルロース増量方法は、原料又はフルクトース含有飲食品にグルコシルトランスフェラーゼを作用させる工程（「酵素作用工程（ＩＩ）」とも称する）を更に含んでいてもよい。更に、その他にも、原料又はフルクトース含有飲食品の種類等に応じて、各工程の前後や各工程と同時に、本技術の効果を損なわない範囲において、一般的な飲食品の製造工程や回収工程を行うことも可能である。以下、各工程等について詳細に説明する。
　（１）酵素作用工程（Ｉ）
　酵素作用工程（Ｉ）は、原料又はフルクトース含有飲食品に、Ｄ－アルロース－３－エピメラーゼを作用させる工程である（フルクトースに、上述した（１）から（３）のいずれかに示すポリペプチドを作用させる工程を含む）。また、必要に応じて、他の酵素を作用させてもよい。これらの酵素は１種単独で用いてもよく、２種以上を組み合わせて用いてもよい。２種以上組み合わせて用いる場合、原料又はフルクトース含有飲食品に、２種以上の酵素を同時に添加してもよいし、別々に添加してもよい。なお、２種以上の酵素を別々に添加する場合の順番は特に限定されない。また、酵素の詳細や添加量については、前述した「１．アルロース増量剤」で用いる酵素と同一であるため、ここでは説明を割愛する。
　各酵素の具体的な添加方法は特に限定されず、原料又はフルクトース含有飲食品に酵素を添加することができれば、自由な方法及びタイミングで添加することができる。また、各酵素は、それぞれ２回以上に分けて添加することも可能である。
　酵素作用工程（Ｉ）の各種条件は、本技術の効果を損なわない限り、自由に設定することができる。例えば、用いる酵素の至適ｐＨ、安定ｐＨ範囲、至適温度、温度安定性などの理化学的性質に応じて、ｐＨ、温度、作用時間等を設定することができる。なお、最適な反応条件は予備実験を通して決定することができる。以下、酵素を作用させる場合の条件を例示する。
　原料又はフルクトース含有飲食品に酵素として、Ｄ－アルロース－３－エピメラーゼを添加する場合のｐＨは、例えば、ｐＨ２．０～１３．０、好ましくはｐＨ２．５～１２．０、より好ましくはｐＨ３．０～８．０に設定することができる。温度は、例えば、２０℃～９０℃、好ましくは３０℃～８０℃、より好ましくは４０℃～７０℃に設定することができる。作用時間は、例えば、１０分～６時間、好ましくは３０分～４時間、より好ましくは１時間～３時間に設定することができる。
　（２）酵素作用工程（ＩＩ）
　酵素作用工程（ＩＩ）は、原料又はフルクトース含有飲食品に、グルコシルトランスフェラーゼを作用させる工程である。酵素の詳細や添加量については、前述した「１．アルロース増量剤」で用いる酵素と同一であるため、ここでは説明を割愛する。
　グルコシルトランスフェラーゼの具体的な添加方法は特に限定されず、原料又はフルクトース含有飲食品に酵素を添加することができれば、自由な方法及びタイミングで添加することができる。また、グルコシルトランスフェラーゼは、それぞれ２回以上に分けて添加することも可能である。
　酵素作用工程（ＩＩ）の各種条件は、本技術の効果を損なわない限り、自由に設定することができる。例えば、用いる酵素の至適ｐＨ、安定ｐＨ範囲、至適温度、温度安定性などの理化学的性質に応じて、ｐＨ、温度、作用時間等を設定することができる。なお、最適な反応条件は予備実験を通して決定することができる。以下、グルコシルトランスフェラーゼを作用させる場合の条件を例示する。
　原料又はフルクトース含有飲食品に酵素として、グルコシルトランスフェラーゼを添加する場合のｐＨは、例えば、ｐＨ２．０～９．０、好ましくはｐＨ２．５～８．０、より好ましくはｐＨ３．０～６．０に設定することができる。温度は、例えば、１０℃～７０℃、好ましくは２０℃～５０℃、より好ましくは２５℃～４５℃に設定することができる。作用時間は、例えば１５分～１２０時間、好ましくは３０分～７２時間、より好ましくは２時間～４８時間に設定することができる。
　（３）原料準備工程
　原料準備工程は、各酵素（Ｄ－アルロース－３－エピメラーゼ、及び／又はグルコシルトランスフェラーゼ）、飲食品の製造に用いられる各原料（フルクトースを含む）等を準備する工程である。原料は、本技術の作用や効果を損なわない限り、他の成分と混合した組成物の状態として準備されてもよい。
　（４）酵素失活工程
　酵素失活工程は、少なくとも前述した酵素作用工程（Ｉ）を経た後に、酵素を失活させる工程である。酵素作用工程（ＩＩ）を経た場合は、当該酵素作用工程（ＩＩ）を経た後に、酵素を失活させることもできる。
　なお、酵素失活工程は、必須の工程ではなく、必要に応じて行うことが可能である。また、前述した酵素作用工程（Ｉ）又は酵素作用工程（ＩＩ）にて、複数の酵素を用いる場合、酵素と酵素との作用間に酵素失活工程を行うこともできる。また、例えば、酵素作用工程（Ｉ）又は酵素作用工程（ＩＩ）において、複数の酵素を作用させる場合、酵素作用工程（Ｉ）又は酵素作用工程（ＩＩ）の途中で酵素失活工程を行うことも可能である。更に、酵素作用工程（Ｉ）と酵素作用工程（ＩＩ）との間で、酵素失活工程を行ってもよい。
　酵素を失活させる方法は、特に限定されず、失活させる対象となる酵素の性質に応じて、一般的な失活方法を１種単独で用いてもよく、２種以上を組み合わせて用いてもよい。例えば、酵素失活温度以上に加熱することにより、酵素を失活させる方法等が挙げられる。
　（５）回収工程
　回収工程は、酵素作用工程（Ｉ）、必要に応じて、その他の工程を経て得られたアルロース含有飲食品を回収する工程である。具体的な回収方法は、得られたアルロース含有飲食品の状態や種類に応じて、一般的なアルロース含有飲食品の製造における回収方法を１種単独で用いてもよく、２種以上を組み合わせて用いてもよい。
　以上説明した本技術に係る方法は、以下のＡ～Ｄの工程を含む態様とすることができる。
Ａ：原料又はフルクトース含有飲食品を用意する工程
Ｂ：用意した原料又はフルクトース含有飲食品にＤ－アルロース－３－エピメラーゼを作用させる工程
Ｃ：グルコシルトランスフェラーゼを更に作用させる工程
Ｄ：酵素を失活させる工程
Ｅ：製造されたアルロース含有飲食品を回収する工程
　工程Ｃ及び工程Ｄは必須でなく、必要に応じて行うことができる。また、工程Ｄは、工程Ｂの後、工程Ｂの途中、工程Ｃの後、工程Ｃの途中、工程Ｅの途中、又は工程Ｅの後に、必要に応じて、複数回行うことができる。更に、工程Ｄは、アルロース含有飲食品の製造工程における加熱等で酵素を失活させることもできる。加えて、複数の酵素を用いる場合、酵素と酵素との作用間（例えば、工程Ｂと工程Ｃとの間等）に酵素失活を行うこともできる。例えば、工程Ｂ及び／又は工程Ｃにおいて複数の酵素を作用させる場合、工程Ｂ及び／又は工程Ｃの途中で工程Ｄを適宜行うことも可能である。また、工程Ｂ及び工程Ｃは、同時に行ってもよく、工程Ｂの後に工程Ｃを行ってもよく、工程Ｃの後に工程Ｂを行ってもよい。
　本技術では、以下の構成を採用することができる。
〔１〕
　Ｄ－アルロース－３－エピメラーゼを含む、アルロース増量剤。
〔２〕
　前記Ｄ－アルロース－３－エピメラーゼは、アサイア・クルングサペンシス（Ａｓａｉａ ｋｒｕｎｇｔｈｅｐｅｎｓｉｓ）由来である、〔１〕に記載のアルロース増量剤。
〔３〕
　グルコシルトランスフェラーゼを更に含む、〔１〕又は〔２〕に記載のアルロース増量剤。
〔４〕
　〔１〕から〔３〕のいずれかに記載のアルロース増量剤が用いられた、飲食品。
〔５〕
　原料又はフルクトース含有飲食品にＤ－アルロース－３－エピメラーゼを作用させる工程を含む、アルロース含有飲食品の製造方法。
〔６〕
　原料又はフルクトース含有飲食品にグルコシルトランスフェラーゼを作用させる工程を更に含む、〔５〕に記載のアルロース含有飲食品の製造方法。
〔７〕
　原料又はフルクトース含有飲食品にＤ－アルロース－３－エピメラーゼを作用させる工程を含む、フルクトース含有飲食品のアルロース増量方法。
〔８〕
　原料又はフルクトース含有飲食品にグルコシルトランスフェラーゼを作用させる工程を更に含む、〔７〕に記載のフルクトース含有飲食品のアルロース増量方法。
〔９〕
　以下の（１）から（３）のいずれかに示すポリペプチド：
（１）配列番号１に示すアミノ酸配列において、Ｇ１４Ｒ及び／又はＭ２２Ｋのアミノ酸置換を含むアミノ酸配列からなるポリペプチド、
（２）上記（１）に記載のアミノ酸配列において、１個又は数個のアミノ酸残基が置換、付加、挿入又は欠失されてなり、Ｄ－アルロース－３－エピメラーゼ活性を有し、且つ、Ｇ１４Ｒ及び／又はＭ２２Ｋのアミノ酸置換が保持されているポリペプチド、及び
（３）上記（１）に記載のアミノ酸配列に対する配列同一性が９０％以上であり、Ｄ－アルロース－３－エピメラーゼ活性を有し、且つ、Ｇ１４Ｒ及び／又はＭ２２Ｋのアミノ酸置換が保持されているポリペプチド。
〔１０〕
　更に、Ａ５６Ｅ、Ｎ５７Ｈ、Ｒ５８Ｇ、及びＦ１１１Ｗからなる群より選択される１又は２以上のアミノ酸置換を含む、〔９〕に記載のポリペプチド。
〔１１〕
　以下の（１）から（３）のいずれかに示すＤＮＡ：
（１）〔９〕に記載のポリペプチドをコードするＤＮＡ、
（２）配列番号１８又は１９のいずれかに示す塩基配列からなるポリヌクレオチド、
（３）配列番号１８又は１９のいずれかに示す塩基配列と等価の配列からなり、Ｄ－アルロース－３－エピメラーゼ活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ。
〔１２〕
　〔１１〕に記載のＤＮＡを含む、発現カセット又は組換えベクター。
〔１３〕
　〔１２〕に記載の発現カセット又は組換えベクターにより宿主を形質転換して得られる形質転換体。
〔１４〕
　〔１３〕に記載の形質転換体を培養する工程を含む、〔９〕に記載のポリペプチドの製造方法。
〔１５〕
　フルクトースに、〔９〕に記載のポリペプチドを作用させる工程を含む、アルロースの製造方法。
　以下、実施例に基づいて本技術を更に詳細に説明する。なお、以下に説明する実施例は、本技術の代表的な実施例の一例を示したものであり、これにより本技術の範囲が狭く解釈されることはない。
＜実験例１＞
　（１）原料
　実験例１で使用した原料及び酵素を下記表１に示す。
　（２）Ｄ－アルロース－３－エピメラーゼ活性測定方法
　５０（ｖ／ｗ）％フルクトースを含む、１１１ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌバッファー（１．１１ｍＭ ＣｏＣｌ２、ｐＨ７．５）９０ｍＬに、ＤＡＥを含む試料溶液 １０ｍＬを添加して、反応溶液を５０℃、１時間処理した後に、１００℃、５分間煮沸処理を行った。放冷後、フルクトースとアルロースをＨＰＬＣにて検出し、１分間に１ｍｍｏｌ アルロースを生成する酵素量を１Ｕと定義して酵素の活性を求めた。
　（３）実験例
　（３－１）方法
　リンゴ果汁飲料（Ｂｒｉｘ１１、ｐＨ３．７５、カゴメ社製、以下同様である）をベースとして、各種ｐＨ値のリンゴ果汁飲料を調製するために、該リンゴ果汁飲料に１Ｎ 水酸化ナトリウム水溶液を加えることにより、各種ｐＨのリンゴ果汁飲料（ｐＨ４．０、５．０、６．０、及び７．０）を調製した。各リンゴ果汁（ｐＨ４．０、５．０、６．０、及び７．０）にＤ－アルロース－３－エピメラーゼ（配列番号１に示すアミノ酸配列を有するＤ－アルロース－３－エピメラーゼ）をフルクトース１ｇに対して１５６Ｕ添加し、５０℃、２時間、酵素反応を行った。酵素反応後のリンゴ果汁飲料を１００℃、１０分間加熱して酵素を失活させることにより、各酵素処理リンゴ果汁飲料を調製した。
　（３－２）糖組成の分析
　上記（３－１）で調製した各酵素処理リンゴ果汁飲料及び酵素未処理のリンゴ果汁飲料（コントロール；対照例１）の各種糖類の含有率を以下の手順で測定した。反応液（遠心上清）１ｍＬをメンブラン濾過後、その糖質の組成を高速液体クロマトグラフィー法（以下、「ＨＰＬＣ」とも称する）で、以下の表２に示す条件で分析を行った。得られた糖組成から全糖類含有量に対するアルロース、フルクトース、及びグルコースの比率（糖組成）を算出した。
　（３－３）結果
　結果を下記表３に示す。
　（３－４）考察
　上記表３に示す通り、酵素未処理（対照例１）、酵素処理（実施例１～４）を比較して、ｐＨ５．０以上の時にアルロースが生成された。すなわち、アルロースが増量されたリンゴ果汁飲料を得られることが確認できた。
＜実験例２＞
　（１）原料
　実験例２で使用した原料及び各酵素を下記表４に示す。
　（２）Ｄ－アルロース－３－エピメラーゼ活性測定方法
　上述した実験例１と同様の方法にて、酵素の活性を求めた。
　（３）グルコシルトランスフェラーゼ活性測定方法
　基質として、試験管に５０ｍＭ リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）１７００μＬ、１Ｍ スクロース溶液（５０ｍＭ（１．７１％）（１７．１ｇ／Ｌ））１００μＬ、酵素液 ２００μＬを添加し混合し、３０℃で１時間反応させた。反応後、Ｅ－キットＬｉｑｕｉｄ Ｄ－グルコース／果糖（株式会社ジェイ・ケイ・インターナショナル製）を用いて遊離フルクトース量を測定し、相対値で活性を算出した。５０ｍＭ スクロース溶液（５０ｍＭ リン酸緩衝液（ｐＨ７．０））を基質とし、３０℃で処理した場合に、１分間に１ μｍｏｌのスクロースを加水分解する酵素量を１Ｕと定義して酵素の活性を求めた。
　（４）実験例
　（４－１）方法
　ニンジン汁飲料（ｐＨ５．１２、カゴメ社製、以下同様である）をベースとして、ニンジン汁飲料にＤ－アルロース－３－エピメラーゼ（配列番号１に示すアミノ酸配列を有するＤ－アルロース－３－エピメラーゼ）をスクロース１ｇに対して、３５．３Ｕ、グルコシルトランスフェラーゼ１（配列番号２０に示すアミノ酸配列を有するグルコシルトランスフェラーゼ）、又はグルコシルトランスフェラーゼ２（配列番号２２に示すアミノ酸配列を有するグルコシルトランスフェラーゼ）をスクロース１ｇに対して、１２．８Ｕ添加し、転倒撹拌後、３０℃、２４時間反応させた。
　（４－２）糖組成の分析
　上記（４－１）で調製した各酵素処理ニンジン汁飲料及び酵素未処理のニンジン汁飲料（コントロール；対照例２及び３）の各種糖類の含有率を以下の手順で測定した。反応液（遠心上清）１ｍＬをメンブラン濾過後、その糖質の組成をＨＰＬＣで、以下の表５に示す条件で分析を行った。得られた糖組成から全糖類含有量に対するアルロース、フルクトース、及びグルコースの比率（糖組成）を算出した。
　（４－３）結果
　結果を下記表６及び表７に示す。
　（４－４）考察
　上記表６及び表７に示す通り、酵素未処理（対照例２及び３）と、酵素処理とを比較すると、Ｄ－アルロース－３－エピメラーゼのみで酵素処理した実施例５及び７では、アルロースが増量されたニンジン汁飲料を得られた。一方で、グルコシルトランスフェラーゼ１のみで酵素処理した参考例１及びグルコシルトランスフェラーゼ２のみで酵素処理した参考例２のいずれにおいても、アルロースの増量は確認されなかったにもかかわらず、Ｄ－アルロース－３－エピメラーゼとともに酵素処理した実施例６及び８においては、いずれにおいてもアルロースの顕著な増量が確認できた。
＜実験例３＞
　（１）原料
　実験例３で使用した原料及び各酵素を下記表８に示す。
　（２）酵素の取得と特定
　ｐＥＴ２４ベクターに導入したＤ－アルロース－３－エピメラーゼ全長配列（配列番号２）を鋳型にして、常法にてＰＣＲを実施して変異導入を実施した。
　得られた増幅産物でＥ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０９を形質転換して、遺伝子発現ベクターを取得した。遺伝子発現ベクターに導入したＤ－アルロース－３－エピメラーゼ配列を確認した。遺伝子発現ベクターをＥ．ｃｏｌｉ FＢＬ２１（ＤＥ３）に導入した。形質転換体をＬＢ培地で３７℃３時間振とう培養した。その後、２５℃で２０分間振とう培養後にＩＰＴＧ（終濃度１ｍＭ）を添加し、２５℃で２４時間振とう培養した。培養液から菌体を回収し、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌバッファー（ｐＨ７．５）に懸濁後、ビーズショッカーで細胞破砕した。１５０００ｒｐｍで１０分間遠心分離した。回収した遠心上清を酵素サンプルとした。
　（２）Ｄ－アルロース－３－エピメラーゼ活性測定
方法
　上述した実験例１と同様の方法にて、酵素の活性を求めた。
　（３）実験例
　（３－１）方法
　リンゴ果汁飲料（Ｂｒｉｘ１１、ｐＨ３．７５、カゴメ社製、以下同様である）をベースとして、各種ｐＨ値のリンゴ果汁飲料を調製するために、該リンゴ果汁飲料に１Ｎ 水酸化ナトリウム水溶液を加えることにより、各種ｐＨのリンゴ果汁飲料（ｐＨ４．０、５．０、６．０、及び７．０）を調製した。各リンゴ果汁飲料（ｐＨ４．０、５．０、６．０、及び７．０）にＤ－アルロース－３－エピメラーゼ（変異体１（Ｍ２２Ｋ）：配列番号１６に示すアミノ酸配列を有するＤ－アルロース－３－エピメラーゼ、変異体２（Ｇ１４Ｒ）：配列番号１７に示すアミノ酸配列を有するＤ－アルロース－３－エピメラーゼ、変異体３（Ｆ１１１Ｗ）：配列番号６に示すアミノ酸配列を有するＤ－アルロース－３－エピメラーゼ）をフルクトース１ｇに対して１５６Ｕ添加し、５０℃、２時間、酵素反応を行った。酵素反応後のリンゴ果汁飲料を１５０００Ｇで５分間遠心した後、各酵素処理リンゴ果汁飲料を調製した。
　（３－２）糖組成の分析
　上記（３－１）で調製した各酵素処理リンゴ果汁飲料の各糖類の含有率を以下の手順で測定した。反応液（遠心上清）１ｍＬをメンブラン濾過後、その糖質の組成をＨＰＬＣで、以下の表９に示す条件で分析を行った。得られた糖組成から全糖類含有量に対するアルロース、フルクトース、及びグルコースの比率（糖組成）を算出した。
　（３－３）結果
　結果を下記表１０及び表１１に示す。
　（３－４）考察
　上記表１０及び表１１に示す通り、酵素処理（実施例７～１０）を比較すると、Ｄ－アルロース－３－エピメラーゼの変異体１～３においても、ｐＨ５．０以上の時にアルロースが生成された。また、特に、Ｄ－アルロース－３－エピメラーゼの変異体１及び２において、ｐＨ５．０以上の時にアルロースがより多く生成されていた。すなわち、アルロースが増量されたリンゴ果汁飲料を得られることが確認できた。

Claims (8)

  1. 　Ｄ－アルロース－３－エピメラーゼを含む、アルロース増量剤。
  2. 　前記Ｄ－アルロース－３－エピメラーゼは、アサイア・クルングサペンシス（Ａｓａｉａ ｋｒｕｎｇｔｈｅｐｅｎｓｉｓ）由来である、請求項１に記載のアルロース増量剤。
  3. 　グルコシルトランスフェラーゼを更に含む、請求項１に記載のアルロース増量剤。
  4. 　請求項１から３のいずれかに記載のアルロース増量剤が用いられた、アルロース含有飲食品。
  5. 　原料又はフルクトース含有飲食品にＤ－アルロース－３－エピメラーゼを作用させる工程を含む、アルロース含有飲食品の製造方法。
  6. 　原料又はフルクトース含有飲食品にグルコシルトランスフェラーゼを作用させる工程を更に含む、請求項５に記載のアルロース含有飲食品の製造方法。
  7. 　原料又はフルクトース含有飲食品にＤ－アルロース－３－エピメラーゼを作用させる工程を含む、フルクトース含有飲食品のアルロース増量方法。
  8. 　原料又はフルクトース含有飲食品にグルコシルトランスフェラーゼを作用させる工程を更に含む、請求項７に記載のフルクトース含有飲食品のアルロース増量方法。
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