WO2025116554A1 - 인터페론 입실론의 신규한 용도 - Google Patents

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interferon
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interferon epsilon
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박희건
최준영
김나영
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    • C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • C07K14/555—Interferons [IFN]

Definitions

  • the present invention relates to a novel use of interferon epsilon, and more specifically, to a pharmaceutical composition comprising interferon epsilon as an active ingredient for the prevention or treatment of a disease, wherein the interferon epsilon is activated in a tissue whose pH is reduced due to a pathological state of the disease, a fusion protein comprising an antibody or a fragment thereof directly or indirectly bound to the interferon epsilon, and a pharmaceutical composition comprising the fusion protein.
  • Interferon is a protein belonging to the cytokine class known as a molecule used in cell-to-cell communication to trigger the body's immune system. Interferon is named for its ability to protect cells from viral infection and "interfere” with viral replication, and also has the function of increasing the host's defense by activating immune cells such as natural killer cells and macrophages and upregulating antigen presentation by increasing the expression of major histocompatibility complex (MHC) antigens.
  • MHC major histocompatibility complex
  • Interferons are classified into type I, which includes IFN- ⁇ , IFN- ⁇ , IFN- ⁇ , IFN- ⁇ , and IFN- ⁇ ; type II, which includes IFN- ⁇ ; and type III, which includes IFN- ⁇ .
  • type I in particular, and especially IFN- ⁇ and IFN- ⁇ , are widely used as therapeutic agents for various diseases.
  • IFN- ⁇ 2a, IFN- ⁇ 2b, and pegylated IFN- ⁇ 2b are used as therapeutic agents for hairy cell leukemia, melanoma, renal cell carcinoma, Kaposi sarcoma, multiple myeloma, follicular and non-Hodgkin lymphoma, and chronic myelogenous leukemia, and human IFN- ⁇ has also been approved in Japan as a therapeutic agent for glioma, medulloblastoma, astrocytoma, and melanoma.
  • IFN- ⁇ 1 has been approved by the FDA for use as a therapeutic agent for multiple sclerosis.
  • interferon Although interferon has been proven to be effective in many cancers, it causes side effects such as fever, chills, muscle pain, headache, nausea, and fatigue, similar to flu, and in particular, the anti-tumor effect of systemic interferon administration is often accompanied by serious side effects including inflammation and direct toxicity to tissues. In addition, because of the short half-life of interferon, the administration cycle must be shortened, which ultimately results in increased side effects.
  • interferon As methods for controlling systemic toxicity by interferon, methods such as a method of directly delivering interferon to a tumor site by using the tumor-targeting ability of a monoclonal antibody, a method of increasing the half-life of interferon by binding polyethylene glycol (PEG) to it, and a method of inhibiting (masking) the activity of interferon until it reaches the tumor are known in the art.
  • PEG polyethylene glycol
  • tumor-targeted interferon may still be recognized by interferon receptors expressed throughout the body, causing side effects, and there is virtually no difference in side effects between interferon with PEG attached and interferon without PEG attached.
  • masked interferon has the disadvantages of a complicated manufacturing process, interferon activity may vary depending on the activity of proteases in the tumor microenvironment, and additional protein structures used for masking may induce new immune responses.
  • the purpose of the present invention is to provide a pharmaceutical composition for the prevention or treatment of a disease, which comprises interferon epsilon as an active ingredient, wherein the interferon epsilon is activated in a tissue whose pH is reduced due to a pathological state of the disease.
  • Another object of the present invention is to provide a fusion protein comprising the interferon epsilon and an antibody or fragment thereof directly or indirectly bound to the interferon epsilon.
  • Another object of the present invention is to provide a pharmaceutical composition for preventing or treating a disease, comprising the fusion protein, wherein the fusion protein is activated in a tissue whose pH is reduced due to a pathological state of the disease.
  • Another object of the present invention is to provide a pharmaceutical composition comprising interferon epsilon for preventing or treating a disease.
  • the present invention provides a pharmaceutical composition for the prevention or treatment of a disease, which comprises interferon epsilon as an active ingredient, wherein the interferon epsilon is characterized in that it is activated in a tissue whose pH is reduced due to a pathological state of the disease.
  • the present invention provides a fusion protein comprising the interferon epsilon and an antibody or fragment thereof directly or indirectly bound to the interferon epsilon.
  • the present invention provides a pharmaceutical composition for preventing or treating a disease, comprising the fusion protein, wherein the fusion protein is characterized in that it is activated in a tissue whose pH is reduced due to a pathological state of the disease.
  • the present invention provides a pharmaceutical composition for preventing or treating a disease comprising interferon epsilon.
  • the present invention provides a pharmaceutical composition for preventing or treating a disease, which consists essentially of interferon epsilon.
  • the term “comprising” is used to have the same meaning as “including” or “characterized by”, and does not exclude additional components, etc. that are not specifically mentioned in the composition according to the present invention.
  • the term “consisting of” means excluding additional elements, components, etc. that are not separately described.
  • the term “essentially consisting of” means that, in the scope of the composition, it can include materials that do not substantially affect the basic properties thereof, in addition to the described materials.
  • treatment comprehensively refers to improving symptoms caused by a disease, and means temporarily or permanently alleviating symptoms, eliminating the cause of symptoms, or preventing or delaying the onset of symptoms of a disease or condition. This may include curing, substantially preventing, or improving a disease, and includes, but is not limited to, alleviating, curing, or preventing one or most symptoms resulting from a disease.
  • prevention means any act of suppressing symptoms or delaying their onset by administering a pharmaceutical composition according to the present invention.
  • improvement means any action that reduces a parameter associated with an abnormal condition, for example, the severity of a symptom.
  • the present invention provides a pharmaceutical composition for the prevention or treatment of a disease, comprising interferon epsilon as an active ingredient, wherein the interferon epsilon is activated in a tissue whose pH is reduced due to a pathological state of the disease.
  • the interferon epsilon refers to a cytokine belonging to type I interferon that is mediated through binding to IFNAR1 and IFNAR2, which are interferon alpha/beta receptors (IFN- ⁇ / ⁇ receptors), and plays a role in activating the JAK-STAT pathway through binding to the receptors.
  • interferon epsilon exists in various organisms including humans, mice, pigs, cows, dogs, horses, etc., and, unlike interferon alpha (hereinafter, IFN- ⁇ ) and beta (hereinafter, IFN- ⁇ ), it is known to be mainly expressed in various mucosal tissues such as the lungs, small intestine, and reproductive organs. Meanwhile, in the present invention, the interferon epsilon preferably refers to human interferon epsilon, but is not limited thereto.
  • interferon epsilon may be referred to as interferon epsilon, interferon- ⁇ , interferon-e, IFN- ⁇ , IFN-e, IFN ⁇ , or IFNe, but all of these refer to the interferon epsilon.
  • the activity of IFN- ⁇ and IFN- ⁇ decreased under slightly acidic conditions (pH 6.0) compared to neutral conditions (pH 7.4), and the activity of IFN- ⁇ along with IFN- ⁇ increased under slightly acidic conditions; however, in particular, the difference was remarkable for IFN- ⁇ . More specifically, IFN- ⁇ was enhanced 5.02-fold in a slightly acidic environment compared to a neutral environment, and was superior to the binding ability in a neutral environment even when treating a receptor at a concentration 43.76 times lower in a slightly acidic environment. In addition, it was confirmed that the pSTAT-1 signal was activated even at a concentration 1000 times lower than in a neutral environment in a slightly acidic environment.
  • the interferon epsilon according to the present invention is characterized in that its activity appears in a tissue having a pH of less than pH 7, that is, a tissue having a decreased pH compared to a normal tissue.
  • the pH of the above "pH-reduced tissue” may preferably be pH 5.0 to pH 6.9, pH 5.0 to pH 6.8, pH 5.0 to pH 6.7, pH 5.0 to pH 6.6, pH 5.0 to pH 6.5, pH 5.0 to pH 6.4, pH 5.0 to pH 6.3, pH 5.0 to pH 6.2, pH 5.0 to pH 6.1, pH 5.0 to pH 6.0, pH 5.0 to pH 5.9, pH 5.0 to pH 5.8, pH 5.0 to pH 5.7, pH 5.0 to pH 5.6, pH 5.0 to pH 5.5, pH 5.0 to pH 5.4, pH 5.0 to pH 5.3, pH 5.0 to pH 5.2, or pH 5.0 to pH 5.1.
  • the interferon epsilon is characterized in that its activity increases by 2-fold, 3-fold, 4-fold, 5-fold, 10-fold, 20-fold, 30-fold, 40-fold, 50-fold, 60-fold, 70-fold, 80-fold, 90-fold, 100-fold, 200-fold, 300-fold, 400-fold, 500-fold, 600-fold, 700-fold, 800-fold, 900-fold, 1000-fold, 1500-fold, 2000-fold, 3000-fold, 4000-fold, 5000-fold, 10000-fold, or more in tissues with decreased pH compared to normal tissues as described above, and preferably, its activity increases by 2-fold to 10-fold, 2-fold to 50-fold, 2-fold to 100-fold, 2-fold to 200-fold, 2 to 300 times, 2 to 400 times, 2 to 500 times, 2 to 600 times, 2 to 700 times, 2 to 800 times, 2 to 900 times, 2 to 1000 times, 2 to 1500 times, 2 to 2000 times, 2 to 3000 times, 2 to 4000 times
  • the interferon epsilon according to the present invention has the characteristic of being able to be administered systemically even without special treatment such as targeting or masking.
  • the pH of the tumor microenvironment is known to be approximately pH 5.6 to 6.8, when the interferon epsilon according to the present invention is used to treat cancer and/or tumors, there is an advantage of being able to reduce side effects even when systemic administration therapy is used.
  • interferon beta and epsilon were intraperitoneally administered to a tumor-induced mouse model using a B16F10 cell line constituting a low pH tumor microenvironment
  • the interferon epsilon-administered group showed a smaller decrease in the number of white blood cells and myeloid cells in the blood compared to the interferon beta-administered group, and while excessive pSTAT-1 activity did not occur, the level of increased T cell infiltration in the tumor and the level of decreased myeloid cells were similar to those of the interferon beta-administered group.
  • the 'systemic administration' means administering the composition according to the present invention into the circulatory system to affect the entire body, and preferably includes intravenous, intramuscular, intraarterial, intramedullary, intrathecal, intracardiac, transdermal, subcutaneous, intraperitoneal, intranasal, intestinal, topical, sublingual, intrarectal, or intratumoral administration, but is not limited thereto.
  • composition containing interferon epsilon according to the present invention as an active ingredient can be applied without limitation to any disease and/or pathological condition that can be treated using interferon epsilon known to date.
  • STAT-1 signaling following IFNAR1/IFNAR2 activation by interferons is known to promote the exposure of MHC class I molecules on the surface of cancer cells, which, combined with the upregulation of tumor-associated antigens, is known in the art to increase the overall antigenicity of tumors. Therefore, the above pathological state may mean cancer and/or tumor.
  • the cancer and/or tumor may preferably be at least one selected from ovarian cancer, papilloma, laryngeal papilloma, human papilloma, bladder cancer, and cervical cancer, but other cancers and/or tumors that can be treated with the composition according to the present invention are not particularly limited and include both solid cancers and blood cancers.
  • Non-limiting examples of the above cancers and/or tumors include, but are not limited to, hairy cell leukemia, chronic myelogenous leukemia, multiple myeloma, non-Hodgkin's lymphoma, skin cancer such as melanoma, Kaposi sarcoma, kidney cancer, lung cancer, brain tumors such as glioma, breast cancer, colon cancer, liver cancer, hepatocellular carcinoma, stomach cancer, bronchial cancer, nasopharyngeal cancer, laryngeal cancer, pancreatic cancer, colon cancer, pancreatic cancer, prostate cancer, bone cancer, thyroid cancer, parathyroid cancer, esophageal cancer, biliary tract cancer, testicular cancer, rectal cancer, head and neck cancer, cervical spine cancer, ureteral cancer, neuroblastoma, fibrosarcoma, rhabdomyosarcoma, astrocytoma, glioblastoma, neuroblastoma, and malignant mes
  • interferon activates interferon-stimulated genes (ISGs) via the JAK-STAT pathway
  • ISGs interferon-stimulated genes
  • composition according to the present invention comprises the interferon epsilon described above as an active ingredient, and may be formulated in a suitable form together with a pharmaceutically acceptable carrier, and may further contain an excipient or a diluent.
  • pharmaceutically acceptable refers to a non-toxic composition that is physiologically acceptable and does not typically cause allergic reactions such as gastrointestinal disorders, dizziness, or similar reactions when administered to humans.
  • the pharmaceutically acceptable carrier may further include, for example, a carrier for oral administration or a carrier for parenteral administration.
  • the carrier for oral administration may include lactose, starch, cellulose derivatives, magnesium stearate, stearic acid, and the like.
  • the carrier for parenteral administration may include water, a suitable oil, saline solution, aqueous glucose, glycol, and the like, and may further include a stabilizer and a preservative.
  • Suitable stabilizers include antioxidants such as sodium bisulfite, sodium sulfite, or ascorbic acid.
  • Suitable preservatives include benzalkonium chloride, methyl- or propyl-paraben, and chlorobutanol.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may further comprise, in addition to the above ingredients, a lubricant, a humectant, a sweetener, a flavoring agent, an emulsifier, a suspending agent, etc.
  • Other pharmaceutically acceptable carriers and preparations may be referred to as described in the following literature.
  • composition according to the present invention can be administered systemically as described above, it can be administered to mammals including humans by any method, for example, orally or parenterally. Accordingly, the composition according to the present invention can be formulated as a preparation for oral administration or parenteral administration depending on the route of administration as described above.
  • the composition of the present invention can be formulated into powders, granules, tablets, pills, dragees, capsules, liquids, gels, syrups, slurries, suspensions, etc. using methods known in the art.
  • oral preparations can be obtained by mixing an active ingredient with a solid excipient, grinding the mixture, adding a suitable auxiliary agent, and then processing the mixture into a granule to obtain a tablet or dragee.
  • excipients may include sugars including lactose, dextrose, sucrose, sorbitol, mannitol, xylitol, erythritol, and maltitol; starches including corn starch, wheat starch, rice starch, and potato starch; cellulosics including cellulose, methylcellulose, sodium carboxymethylcellulose, and hydroxypropylmethyl-cellulose; fillers such as gelatin and polyvinylpyrrolidone.
  • cross-linked polyvinylpyrrolidone, agar, alginic acid, or sodium alginate may be added as a disintegrating agent, depending on the case.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may additionally include an anticoagulant, a lubricant, a wetting agent, a flavoring agent, an emulsifier, and a preservative.
  • parenteral administration preparations they can be formulated in the form of injections, creams, lotions, ointments for external use, oils, moisturizers, gels, aerosols, and nasal inhalers using methods known in the art.
  • the total effective amount of the composition according to the present invention can be administered to a patient as a single dose, or can be administered by a fractionated treatment protocol in which multiple doses are administered for a long period of time.
  • the composition according to the present invention can vary the content of the effective ingredient depending on the degree of the disease.
  • the preferred total dose of the composition according to the present invention can be about 0.01 ⁇ g to 10,000 mg per 1 kg of the patient or subject's body weight per day, and most preferably 0.1 ⁇ g to 500 mg.
  • the dosage of the composition is determined by considering various factors such as the formulation method, administration route, and number of treatments, as well as the patient's age, weight, health condition, sex, severity of the disease, diet, and excretion rate, a person having ordinary knowledge in the art will be able to determine an appropriate effective dosage of the composition of the present invention considering these points.
  • the composition according to the present invention is not particularly limited in its formulation, administration route, and administration method as long as it exhibits the effect of the present invention.
  • the 'effective amount' of the present invention refers to an amount that, when administered to a subject, exhibits the effect of improving, treating, detecting, diagnosing, or inhibiting or reducing cancer or an infectious disease.
  • the 'subject' may be an animal, preferably a mammal, particularly an animal including a human, and may also be a cell, tissue, organ, etc. derived from an animal.
  • the subject may be a patient in need of the effect.
  • the content of the composition is not particularly limited depending on the intended use or aspect, and may be, for example, 0.01 to 99 wt%, preferably 0.5 to 50 wt%, and more preferably 1 to 30 wt%, based on the total weight of the composition.
  • the pharmaceutical composition according to the present invention may further include additives such as pharmaceutically acceptable carriers, excipients, or diluents in addition to the active ingredient.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may include 0.1 to 99.9 wt% of interferon epsilon prepared by the method of the present invention, and 99.9 to 0.1 wt% of the carrier.
  • the present invention provides a fusion protein comprising the interferon epsilon described above and an antibody or fragment thereof directly or indirectly bound to the interferon epsilon.
  • interferon epsilon is the same as described in the composition described above, and the composition unique to the fusion protein is described below.
  • the antibody includes a monoclonal antibody, a polyclonal antibody, a multispecific antibody (e.g., a bispecific antibody), and a fragment thereof.
  • a complete antibody has an overall Y shape and is composed of two long heavy chains (H) and two short light chains (L). Each heavy chain and light chain are connected to each other by a sulfur bond and are divided into a variable region (V), which is a site that reacts with an antigen, and a constant region (C), which is a site that expresses an effector function.
  • V variable region
  • C constant region
  • the variable region has a complementarity-determining region (CDR), which determines the structure of the variable region so that it can form a specific binding with an antigen and controls the antibody binding strength.
  • the fragment of the above antibody represents a specific site capable of reacting with an antigen and exhibiting antigen-binding activity, and examples thereof may include a Fab fragment (a fragment produced by papain digestion), a Fab' fragment (a fragment produced by pepsin digestion and partial reduction), an F(ab')2 fragment (a fragment produced by pepsin digestion), a Facb (a fragment produced by plasmin digestion), a Fd (a fragment produced by pepsin digestion, partial reduction and reaggregation), a scFv fragment (a fragment produced by molecular biology techniques), etc.
  • the antibody is an antibody or a fragment thereof that recognizes a tumor-specific antigen, and can be used as a targeted therapeutic agent for cancer, etc.
  • these may include Trastuzumab, an antibody treatment targeting human epidermal growth factor receptor (HER-2), Cetuximab, an antibody treatment targeting epidermal growth factor receptor (EGFR), Atezolizumab, an antibody treatment targeting PD-L1 expressed on the surface of cancer cells, and Sacituzumab, an antibody treatment targeting TROP2 expressed on the surface of cancer cells.
  • HER-2 human epidermal growth factor receptor
  • Cetuximab an antibody treatment targeting epidermal growth factor receptor (EGFR)
  • Atezolizumab an antibody treatment targeting PD-L1 expressed on the surface of cancer cells
  • Sacituzumab an antibody treatment targeting TROP2 expressed on the surface of cancer cells.
  • the fusion protein according to the present invention may be a fusion protein formed by linking interferon epsilon and an antibody or a fragment thereof by a linker, preferably a peptide linker.
  • the linker refers to a molecule that functions to link two or more separate substances to each other, such as a short fragment of an amino acid or an amino acid analogue in which two or more amino acids or amino acid-like substances are linked to each other by a peptide bond.
  • glycine, serine, alanine, etc. may be used as the main constituent amino acids
  • a glycine-serine linker, a glycine-serine-alanine linker, etc. may be used.
  • This linker may be linked to the C-terminus of the heavy chain of the antibody or the C-terminus of the light chain of the antibody, or the N-terminus of the linker may be linked to the C-terminus of the light chain and the C-terminus of the heavy chain of the antibody.
  • the N-terminus of the interferon epsilon may be linked to the C-terminus of the linker.
  • the present invention provides a tissue-specific treatment or prevention composition having a decreased pH due to a pathological condition including the fusion protein.
  • composition according to the present invention the meanings of all terms including the fusion protein, pathological condition, pH and tissue with decreased pH, etc. are the same as those described in the composition described above, and the contents described in the corresponding items can be applied as they are to the composition including the fusion protein according to the present invention.
  • Interferon epsilon according to the present invention has the characteristic that its activity is greatly enhanced in a slightly acidic environment compared to a neutral environment, and therefore has the advantage of being able to be administered systemically without separate treatment such as targeting or masking to control systemic toxicity, and thus can be usefully used in the treatment of related diseases.
  • Figures 1a to 1f show the results of evaluating the receptor binding ability in neutral and acidic environments by type of type I interferon (IFN- ⁇ 2b, IFN- ⁇ , IFN- ⁇ R27T, IFN- ⁇ C17S/R27T, IFN- ⁇ , and IFN- ⁇ ).
  • IFN- ⁇ 2b type of type I interferon
  • Figures 2a and 2b show the receptor binding capacity of each type of type 1 interferon in neutral and acidic environments, normalized to neutral conditions.
  • Figures 3a and 3b show the changes in binding capacity of interferon epsilon to receptors IFNAR1 and IFNAR2 under acidic conditions compared to neutral conditions.
  • Figures 4a to 4c show the results of calculating the binding kinetics and affinity of interferon epsilon to the receptors IFNAR1/2, IFNAR1, and IFNAR2 under acidic conditions compared to neutral conditions.
  • Figures 5a to 5c show the results of comparing the expression levels of pSTAT-1 in order to confirm the extent of cell signaling under acidic conditions compared to neutral conditions of interferon epsilon.
  • Figures 7a to 7g show the results of blood analysis of an in vivo mouse model experiment.
  • Figures 8a to 8c show the results of spleen analysis of an in vivo mouse model experiment.
  • Figures 9a to 9c show the tumor analysis results of in vivo mouse model experiments.
  • IFNAR1/2 fusion proteins were produced in Expi293F cells.
  • Human IFNAR1-Fc and IFNAR2-Fc proteins with Knob-into-hole technology were inserted into pOptiVec-TOPO plasmid (Invitrogen), and then transfected using ExpiFectamineTM 293 Transfection Kit (Gibco #A14524).
  • the transfected Expi293F cells were cultured for one week, and the supernatant was collected and purified using a Protein A column in an AKTA york (Cytiva) system.
  • Type I interferons used were Rebif (Merck), ABN101, ABN102 (Abion), IFN- ⁇ 2b (biolegend, #592704), IFN- ⁇ (PBL, #11395-1), and IFN- ⁇ (R&D systems, #9667-ME-025/CF).
  • Type I interferons were diluted to 100 nM in PBS buffer, treated with 100 ⁇ l each, and coated on a 96-well ELISA plate (Corning, #2592) for 16 h at 4°C. All buffers except the coating buffer were adjusted to pH 7.4 and pH 6.0 with 1 N HCl.
  • the coated plate was washed three times with washing buffer (0.05% PBS-T, pH 7.4, pH 6.0), and 300 ⁇ l of blocking buffer (50 mg/mL BSA in PBS, pH 7.4, pH 6.0) was treated and reacted at room temperature for 1 hour. After blocking, the plate was washed three times with washing buffer, and the IFNAR1/2 fusion protein was serially diluted 1/3 from 100 nM in Reagent Diluent (1 mg/mL BSA in 0.05% PBS-T, pH 7.4, pH 6.0), treated at 100 ⁇ l, and reacted at room temperature for 1 hour.
  • washing buffer 0.05% PBS-T, pH 7.4, pH 6.0
  • blocking buffer 50 mg/mL BSA in PBS, pH 7.4, pH 6.0
  • the binding capacity of type I interferon evaluated using ELISA experimental method, was standardized to neutral conditions and graphically represented (see Fig. 2a and Fig. 2b).
  • Rebif, ABN101, ABN102, and IFN- ⁇ showed better receptor binding capacity under acidic conditions than under neutral conditions, and the binding capacity of IFN- ⁇ at the highest concentration was enhanced 5.02-fold under acidic conditions compared to neutral conditions, and it was superior to the binding capacity under neutral conditions even when treating a receptor at a concentration 43.76 times lower.
  • IFN- ⁇ has better binding ability under acidic conditions than under neutral conditions.
  • Example 3 Changes in binding ability of interferon epsilon to IFNAR1 and IFNAR2 under acidic conditions compared to neutral conditions
  • human IFNAR1, IFNAR2 fusion proteins were produced in Expi293F cells.
  • Human IFNAR1-Fc, IFNAR2-Fc protein genes with Knob-into-hole technology were inserted into pOptiVec-TOPO plasmid (Invitrogen), and then transfected using ExpiFectamineTM 293 Transfection Kit (Gibco #A14524).
  • the transfected Expi293F cells were cultured for one week, and the supernatant was collected and purified using a Protein A column in an AKTA york (Cytiva) system.
  • Type I interferon was produced by inserting the human IFN- ⁇ gene into pOptiVec-TOPO plasmid (Invitrogen) and using ExpiFectamineTM 293 Transfection Kit (Gibco, #A14524). Interferon epsilon was diluted to 100 nM in PBS buffer, and 100 ⁇ l was treated in a 96-well ELISA plate (Corning, #2592), and coated for 16 hours at 4°C. All buffers except the coating buffer were adjusted to pH 7.4 and pH 6.0 using 1 N HCl.
  • the coated plate was washed three times with washing buffer (0.05% PBS-T, pH 7.4, pH 6.0), and 300 ⁇ l of blocking buffer (50 mg/mL BSA in PBS, pH 7.4, pH 6.0) was treated and reacted at room temperature for 1 hour. After blocking, the plate was washed three times with washing buffer, and the IFNAR1/2 fusion protein was serially diluted 1/3 from 100 nM in Reagent Diluent (1 mg/mL BSA in 0.05% PBS-T, pH 7.4, pH 6.0), treated at 100 ⁇ l, and reacted at room temperature for 1 hour.
  • washing buffer 0.05% PBS-T, pH 7.4, pH 6.0
  • blocking buffer 50 mg/mL BSA in PBS, pH 7.4, pH 6.0
  • Interferon epsilon receptor binding kinetics were analyzed under neutral and acidic conditions using an Octet R8 (Satorious) device.
  • hIFNAR1/2, hIFNAR1, and hIFNAR2 were coated on AHC biosensor (Satorious) at 20 nM each using 1x kinetics buffer.
  • 1x kinetics buffer was titrated with 1 N HCl according to neutral and acidic analysis conditions.
  • Interferon epsilon was diluted 1/2-fold from 200 nM and bound to the coated receptor in the AHC biosensor, and the kinetics were calculated through the dissociation process on an Octet R8 instrument.
  • interferon epsilon had a lower KD value under acidic conditions compared to neutral conditions, and had stronger binding affinity to AR2 than to AR1 under acidic conditions.
  • human B lymphoblast cells, Daudi cells, and CD3 T cells isolated from healthy donor human peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) were used.
  • CD3 T cells from human PBMCs were isolated using a human CD3 T cell isolation kit (Miltenyl biotec).
  • the cell culture medium was adjusted to pH 7.4 and pH 6.5 with 1N HCl in RPMI1640, and 20 mM HEPES was added. Daudi cells and CD3 T cells were seeded at 2x105 cells per 96-well tissue culture plate, and interferon epsilon was diluted 1/10-fold from 100 nM in pH 7.4 and pH 6.5 media and treated for 24 hours. After 24 hours, the cells were collected, and the cells were separated into single cells using a cell separation buffer, and then RIPA buffer (BIOSESANG), protease inhibitor, and phosphatase inhibitor were added and lysed by reaction at 200 rpm at 4°C for 1 hour.
  • DIOSESANG RIPA buffer
  • the membrane was treated with the secondary antibody anti-rabbit Fc HRP antibody (Invitrogeon) at a ratio of 1:5000 and incubated for 30 minutes. After washing three times with 0.05% TBS-T, ECL solution (Bio-rad) was added and detected using Chemidoc.
  • mice human hIFNAR1/2 knock-in mice were used. Tumor models were induced by subcutaneous injection of 5 ⁇ 10 5 cells of B16F10 cell line expressing human hIFNAR1/2 into hIFNAR1/2 KI mice. When the tumor size was 100–150 mm 3 , the mice were divided into control, IFN- ⁇ , and IFN- ⁇ administration groups and administered intraperitoneally at a dose of 0.5 mg/kg for 5 days.
  • the experimental schematic is as shown in Figure 6A. One hour after the last administration, blood, spleen, and tumor were collected and analyzed by flow cytometry.
  • the blood analysis results showed that interferon epsilon, whose activity increases in acidic conditions, showed a smaller decrease in the number of white blood cells corresponding to the neutropenia side effect index compared to interferon beta, and increased CD8 T cells through T cell activation while reducing immunosuppressive myeloid cells. In addition, it did not cause excessive activation of pSTAT-1 corresponding to downstream signaling in the blood.
  • Figs. 9a to 9c showed that interferon epsilon increased infiltration of intratumoral T cells and reduced immunosuppressive myeloid cells through antitumor immune activity to a degree similar to interferon beta.
  • interferon epsilon showed less non-specific immune activity in blood and spleen than interferon beta, and the degree of immune activity in tumors was similar. Based on this, it was confirmed that interferon epsilon has superior anticancer efficacy compared to other interferon subtypes due to increased activity in acidic conditions.
  • the interferon epsilon according to the present invention has the characteristic that its activity is greatly enhanced in a slightly acidic environment compared to a neutral environment, and therefore has the advantage of being able to be administered systemically without separate treatment such as targeting or masking to control systemic toxicity, and thus can be usefully used in the treatment of related diseases.

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Abstract

본 발명은 인터페론 입실론의 신규한 용도에 관한 것으로, 보다 상세하게는 인터페론 입실론을 유효성분으로 포함하는 질병의 예방 또는 치료용 약학적 조성물로서, 중성 환경 대비 약산성 환경에서 그 활성이 크게 향상된다는 특징이 있으며, 따라서 전신 독성을 제어하기 위한 표적화 또는 마스킹 등 별도의 처리 없이도 전신 투여가 가능하다는 장점이 있어 관련된 질환의 치료에 유용하게 이용될 수 있다.

Description

인터페론 입실론의 신규한 용도
본 출원은 2023년 11월 28일에 출원된 대한민국 특허출원 제10-2023-0168553호 및 2024년 11월 27일에 출원된 대한민국 특허출원 제10-2024-0172093호를 우선권으로 주장하고, 상기 명세서 전체는 본 출원의 참고문헌이다.
본 발명은 인터페론 입실론의 신규한 용도에 관한 것으로, 보다 상세하게는 인터페론 입실론을 유효성분으로 포함하는 질병의 예방 또는 치료용 약학적 조성물로서, 상기 인터페론 입실론은 상기 질병의 병리 상태에 의해 pH가 감소된 조직에서 활성화되는 것을 특징으로 하는 약학적 조성물, 상기 인터페론 입실론에 직접 또는 간접적으로 결합된 항체 또는 이의 단편을 포함하는 융합 단백질 및 상기 융합 단백질을 포함하는 약학적 조성물에 관한 것이다.
인터페론(interferon, IFN)은 체내 면역 체계를 촉발하기 위해 세포 간 통신에 사용되는 분자로 알려진 사이토카인에 속하는 단백질이다. 인터페론은 세포를 바이러스 감염으로부터 보호하여 바이러스의 복제를 "방해"하는 능력 때문에 명명되었으며, 그 밖에도 자연 살해 세포 및 대식세포와 같은 면역 세포를 활성화하고 주조직적합복합체(MHC) 항원의 발현을 증가시켜 항원 제시를 상향 조절하여 숙주의 방어력을 증가시키는 기능을 갖는다.
인터페론은 IFN-α, IFN-β, IFN-ε, IFN-κ, 및 IFN-ω가 속하는 I형, IFN-γ가 속하는 II형 및 IFN-λ가 속하는 III형으로 구분되는데, 이 중 특히 I형, 그 중에서도 IFN-α 및 IFN-β는 다양한 질병의 치료제로서 널리 사용되고 있다. 예를 들어, IFN-α2a, IFN-α2b 및 페길화된 IFN-α2b는 모세포 백혈병, 흑색종, 신세포암, 카포시 육종, 다발성 골수종, 모낭성 및 비호지킨 림프종, 만성 골수성 백혈병 치료제로서 사용되며, 인간 IFN-β는 또한 일본에서 신경교종, 연수종, 성상세포종 및 흑색종 치료제로서 승인된 바 있다. 또한, 다발성 경화증에 대하여 IFN-β1이 FDA의 승인을 받아 치료제로서 사용되고 있다.
이처럼 인터페론은 다수의 암에서 그 효과가 입증되고 있으나, 부작용으로 발열, 오한, 근육통, 두통, 메스꺼움, 피로 등 독감과 유사한 증상이 발생하며, 특히, 인터페론 전신 투여 요법의 항-종양 효과는 종종 염증 및 조직에 대한 직접적인 독성을 포함한 심각한 부작용을 동반하기도 한다. 또한, 인터페론의 짧은 반감기로 인하여 투여 주기가 짧아질 수밖에 없는데, 이는 결국 그 부작용 또한 증가하게 되는 결과를 낳는다.
인터페론에 의한 전신 독성을 제어하기 위한 방법으로서, 모노클로날 항체의 종양-표적화 능력을 사용하여 인터페론을 종양 부위에 직접 운반하는 방법, 인터페론에 폴리에틸렌글리콜(PEG)를 결합하여 그 반감기를 증가시키는 방법, 및 인터페론이 종양에 도달할 때까지 그 활성을 억제(마스킹)하는 방법 등이 당업계에 알려져 있다. 그러나, 종양-표적화 된 인터페론은 여전히 신체 전반에 걸쳐 발현되는 인터페론 수용체에 의해 인식되어 부작용이 유발될 수 있고, PEG이 부착된 인터페론과 그렇지 않은 인터페론 사이의 부작용은 실질적으로 차이가 없다는 문제점이 있으며, 또한, 마스킹 된 인터페론은 제조 과정이 복잡하고, 종양 미세환경에서 프로테아제의 활성도에 따라 인터페론의 활성이 달라질 수 있으며, 마스킹에 사용된 추가적인 단백질 구조가 새로운 면역 반응을 유발할 가능성이 있다는 단점이 있다.
따라서, 인터페론의 전신 투여에 의한 전신 독성을 억제하면서도 병리 조직에 특이적으로 인터페론의 활성을 유도할 수 있는 신규한 전략이 필요하다.
이에 본 발명자들은 인터페론 입실론(IFN-ε)의 활성이 pH가 낮은 환경에서 급격하게 상승한다는 특성을 가지고 있음을 새롭게 확인하였으며, 이러한 특성으로 인하여 종양 마우스 모델에 인터페론 입실론을 전신 투여한 경우에도 인터페론 베타(IFN-β) 투여군 대비 혈액 및 비장 내 비특이적 면역 활성은 적은 반면, 종양 내에서 면역 활성 정도는 유사하게 나타남을 확인하고 본 발명을 완성하였다.
따라서, 본 발명의 목적은 인터페론 입실론을 유효성분으로 포함하는 질병의 예방 또는 치료용 약학적 조성물로서, 상기 인터페론 입실론은 상기 질병의 병리 상태에 의해 pH가 감소된 조직에서 활성화되는 것을 특징으로 하는 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 인터페론 입실론 및 상기 인터페론 입실론에 직접 또는 간접적으로 결합된 항체 또는 이의 단편을 포함하는 융합 단백질을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 융합 단백질을 포함하는 질병의 예방 또는 치료용 약학적 조성물로서, 상기 융합 단백질은 상기 질병의 병리 상태에 의해 pH가 감소된 조직에서 활성화되는 것을 특징으로 하는 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 인터페론 입실론으로 이루어진 질병의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 인터페론 입실론으로 필수적으로 이루어진 질병의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
상기와 같은 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 인터페론 입실론을 유효성분으로 포함하는 질병의 예방 또는 치료용 약학적 조성물로서, 상기 인터페론 입실론은 상기 질병의 병리 상태에 의해 pH가 감소된 조직에서 활성화는 것을 특징으로 하는 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 상기 인터페론 입실론 및 상기 인터페론 입실론에 직접 또는 간접적으로 결합된 항체 또는 이의 단편을 포함하는 융합 단백질을 제공한다.
본 발명의 또 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 상기 융합 단백질을 포함하는 질병의 예방 또는 치료용 약학적 조성물로서, 상기 융합 단백질은 상기 질병의 병리 상태에 의해 pH가 감소된 조직에서 활성화되는 것을 특징으로 하는 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명의 또 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 인터페론 입실론으로 이루어진 질병의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명의 또 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 인터페론 입실론으로 필수적으로 이루어진 질병의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
이하 본 발명을 상세히 설명한다.
한편, 본 발명에서 개시된 각각의 설명 및 실시 형태는 각각에 대한 다른 설명 및 실시 형태에도 적용될 수 있다. 즉, 본 발명에 개시된 다양한 요소들의 모든 조합이 본 발명의 범주에 속한다. 또한, 하기에 기술된 구체적인 서술에 의하여 본 발명의 범주가 제한된다고 볼 수 없다.
본 명세서에서 용어 "을 포함하는(comprising)"이란 "함유하는(including)" 또는 "특징으로 하는(characterized by)"과 동일한 의미로 사용되며, 본 발명에 따른 조성물에 있어서, 구체적으로 언급되지 않은 추가적인 구성 성분 등을 배제하지 않는다. 또한 용어 "로 이루어지는(consisting of)"이란 별도로 기재되지 않은 추가적인 요소, 성분 등을 제외하는 것을 의미한다. 용어 "필수적으로 이루어지는(essentially consisting of)"이란 조성물의 범위에 있어서, 기재된 물질과 더불어 이의 기본적인 특성에 실질적으로 영향을 미치지 않는 물질 등을 포함할 수 있는 것을 의미한다.
본 발명에서 사용된 용어, "치료"는 질환으로 인한 증상을 개선시키는 것을 포괄적으로 지칭하고, 일시적 또는 영구적으로 증상을 완화하거나, 증상의 원인을 제거하거나, 또는 질병이나 병태의 증상의 발현을 방지하거나 늦추는 것을 의미한다. 이는 질환을 치유하거나, 실질적으로 예방하거나, 또는 상태를 개선시키는 것을 포함할 수 있으며, 질환으로부터 비롯된 한 가지 증상 또는 대부분의 증상을 완화시키거나, 치유하거나 예방하는 것을 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 사용된 용어, "예방"은 본 발명에 따른 약학적 조성물의 투여에 의해 증상을 억제시키거나 발병을 지연시키는 모든 행위를 의미한다.
본 발명에서 사용된 용어, "개선"은 비정상적인 상태와 관련된 파라미터, 예를 들면 증상의 정도를 감소시키는 모든 행위를 의미한다.
본 발명의 설명 및 청구범위에서 사용된 용어나 단어는, 통상적이거나 사전적인 의미로 한정해서 해석되어서는 아니되며, 발명자는 그 자신의 발명을 가장 최선의 방법으로 설명하기 위해 용어의 개념을 적절하게 정의할 수 있다는 원칙에 입각하여, 본 발명의 기술적 사상에 부합하는 의미와 개념으로 해석되어야만 한다.
본 발명은 인터페론 입실론을 유효성분으로 포함하는 질병의 예방 또는 치료용 약학적 조성물로서, 상기 인터페론 입실론은 상기 질병의 병리 상태에 의해 pH가 감소된 조직에서 활성화되는 것을 특징으로 하는 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명에 있어서, 상기 인터페론 입실론(interferon epsilon, IFN-ε)은 인터페론 알파/베타 수용체(interferon alpha/beta receptor, IFN-α/β receptor)인 IFNAR1 및 IFNAR2와의 결합을 통해 매개되는 I형 인터페론에 속하는 사이토카인(cytokine)을 의미하는 것으로서, 상기 수용체와의 결합을 통해 JAK-STAT 경로를 활성화하는 역할을 한다. 상기 인터페론 입실론은 인간, 쥐, 돼지, 소, 개, 말 등을 포함한 여러 생물체에 존재하며, 인터페론 알파(이하, IFN-α) 및 베타(이하, IFN-β)와 달리 폐, 소장, 생식기 등 다양한 점막 조직에서 주로 발현되는 것으로 알려져 있다. 한편, 본 발명에 있어서, 상기 인터페론 입실론은 바람직하게는 인간 인터페론 입실론을 의미하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 또한, 본 명세서에서 상기 인터페론 입실론은 인터페론 엡실론, interferon-ε, interferon-e, IFN-ε, IFN-e, IFNε, 또는 IFNe 등으로 지칭될 수 있으나 이는 모두 동일하게 상기 인터페론 입실론을 의미한다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, IFN-α 및 IFN-ω는 중성 조건(pH 7.4) 대비 약산상 조건(pH 6.0)에서 활성이 감소하였으며, IFN-β와 함께 IFN-ε은 약산성 조건에서 그 활성이 증가하였으나, 특히, IFN-ε은 그 차이가 현저하였다. 보다 구체적으로, IFN-ε은 약산성 환경에서 중성 환경 대비 5.02배 향상되었으며, 약산성 환경에서 43.76배 적은 농도의 수용체를 처리하여도 중성 환경에서의 결합능 보다 우수하였다. 또한, 약산성 환경에서는 중성 환경 대비 1000배 이상 낮은 농도에서도 pSTAT-1 신호를 활성화시키는 것을 확인하였다. 따라서, 본 발명에 따른 상기 인터페론 입실론은 조직의 pH가 pH 7 미만인 조직, 즉 정상 조직과 비교하여 pH가 감소한 조직에서 그 활성이 나타나는 것을 특징으로 한다. 상기 "pH가 감소한 조직"의 pH는 바람직하게는 pH 5.0 내지 pH 6.9, pH 5.0 내지 pH 6.8, pH 5.0 내지 pH 6.7, pH 5.0 내지 pH 6.6, pH 5.0 내지 pH 6.5, pH 5.0 내지 pH 6.4, pH 5.0 내지 pH 6.3, pH 5.0 내지 pH 6.2, pH 5.0 내지 pH 6.1, pH 5.0 내지 pH 6.0, pH 5.0 내지 pH 5.9, pH 5.0 내지 pH 5.8, pH 5.0 내지 pH 5.7, pH 5.0 내지 pH 5.6, pH 5.0 내지 pH 5.5, pH 5.0 내지 pH 5.4, pH 5.0 내지 pH 5.3, pH 5.0 내지 pH 5.2, 또는 pH 5.0 내지 pH 5.1일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 또한, 상기 인터페론 입실론은 상술한 바와 같이 정상 조직 대비 pH가 감소한 조직에서 그 활성이 2배, 3배, 4배, 5배, 10배, 20배, 30배, 40배, 50배, 60배, 70배, 80배, 90배, 100배, 200배, 300배, 400배, 500배, 600배, 700배, 800배, 900배, 1000배, 1500배, 2000배, 3000배, 4000배, 5000배, 10000배, 또는 그 이상 증가하는 것을 특징으로 하며, 바람직하게는 그 활성이 2배 내지 10배, 2배 내지 50배, 2배 내지 100배, 2배 내지 200배, 2배 내지 300배, 2배 내지 400배, 2배 내지 500배, 2배 내지 600배, 2배 내지 700배, 2배 내지 800배, 2배 내지 900배, 2배 내지 1000배, 2배 내지 1500배, 2배 내지 2000배, 2배 내지 3000배, 2배 내지 4000배, 2배 내지 5000배, 2배 내지 10000배, 또는 그 이상; 또는, 3배 내지 10배, 3배 내지 50배, 3배 내지 100배, 3배 내지 200배, 3배 내지 300배, 3배 내지 400배, 3배 내지 500배, 3배 내지 600배, 3배 내지 700배, 3배 내지 800배, 3배 내지 900배, 3배 내지 1000배, 3배 내지 1500배, 3배 내지 2000배, 3배 내지 3000배, 3배 내지 4000배, 3배 내지 5000배, 3배 내지 10000배, 또는 그 이상; 또는, 4배 내지 10배, 4배 내지 50배, 4배 내지 100배, 4배 내지 200배, 4배 내지 300배, 4배 내지 400배, 4배 내지 500배, 4배 내지 600배, 4배 내지 700배, 4배 내지 800배, 4배 내지 900배, 4배 내지 1000배, 4배 내지 1500배, 4배 내지 2000배, 4배 내지 3000배, 4배 내지 4000배, 4배 내지 5000배, 4배 내지 10000배, 또는 그 이상; 또는 5배 내지 10배, 5배 내지 50배, 5배 내지 100배, 5배 내지 200배, 5배 내지 300배, 5배 내지 400배, 5배 내지 500배, 5배 내지 600배, 5배 내지 700배, 5배 내지 800배, 5배 내지 900배, 5배 내지 1000배, 5배 내지 1500배, 5배 내지 2000배, 5배 내지 3000배, 5배 내지 4000배, 5배 내지 5000배, 5배 내지 10000배, 또는 그 이상 증가하는 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
이에 따라, 본 발명에 따른 인터페론 입실론은 표적화 또는 마스킹 등 특별한 처리 없이도 전신 투여가 가능하다는 특징을 갖는다. 특히, 종양 미세환경의 pH는 pH 5.6 내지 6.8 정도로 알려져 있어, 암 및/또는 종양을 치료하는데 있어서 본 발명에 따른 인터페론 입실론을 사용하는 경우에는 전신 투여 요법을 사용하더라도 부작용을 줄일 수 있다는 장점이 있다. 실제로 본 발명의 일 실시예에 따르면, 낮은 pH의 종양 미세환경을 구성하는 B16F10 세포주를 이용한 종양 유도 마우스 모델에 인터페론 베타 및 입실론을 복강내 투여한 결과, 인터페론 입실론 투여군은 인터페론 베타 투여군 대비 혈액 내에서 백혈구 수 감소 및 myeloid 세포를 감소가 적었고, 과도한 pSTAT-1 활성은 일어나지 않은 반면, 종양 내에서 T 세포 침윤이 증가하는 수준 및 myeloid 세포를 감소시키는 수준은 인터페론 베타 투여군과 유사한 것으로 확인되었다.
한편, 본 발명에 있어서, 상기 '전신 투여(systemic administration)'는 본 발명에 따른 조성물을 전신에 영향을 미치도록 순환계로 투여하는 것을 의미하며, 바람직하게는 정맥 내, 근육 내, 동맥 내, 골수 내, 경막 내, 심장 내, 경피, 피하, 복강 내, 비강 내, 장관, 국소, 설하, 직장 내, 또는 종양 내 투여를 포함하는 것을 의미할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 따른 인터페론 입실론을 유효성분으로 포함하는 조성물은 현재까지 알려진 인터페론 입실론을 이용하여 치료할 수 있는 질병 및/또는 병리 상태라면 제한 없이 적용할 수 있다.
일반적으로 인터페론에 의한 IFNAR1/IFNAR2 활성화에 따른 STAT-1 신호 전달은 암 세포 표면에서 MHC class I 분자의 노출을 촉진하는 것으로 알려져 있으며, 종양 관련 항원의 상향 조절과 결합하여 전체적으로 종양의 항원성을 증가시킨다고 당업계에 알려져 있다. 따라서, 상기 병리 상태는 암 및/또는 종양을 의미할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 암 및/또는 종양은 바람직하게는 난소암, 유두종, 후두유두종, 인간유두종, 방광암 및 자궁경부암에서 선택된 어느 하나 이상일 수 있으나, 그 밖에도 본 발명에 따른 조성물로 치료할 수 있는 상기 암 및/또는 종양은 특별히 제한되지 않으며, 고형암 및 혈액암을 모두 포함한다. 상기 암 및/또는 종양의 비제한적인 예로는 모발상세포 백혈병, 만성골수성 백혈병, 다발성 골수종, 비호지킨 림프종, 흑색종 등의 피부암, 카포시 육종, 신장암, 폐암, 신경교종 등의 뇌종양, 유방암, 대장암, 간암, 간세포암, 위암, 기관지암, 비인두암, 후두암, 췌장암, 결장암, 이자암, 전립선암, 골암, 갑상선암, 부갑상선암, 식도암, 담도암, 고환암, 직장암, 두경부암, 경추암, 요관암, 신경아세포종, 섬유육종, 횡문근육종, 성상세포종, 아교모세포종, 신경모세포종 및 악성중피종 등이 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
또한, 인터페론은 JAK-STAT 경로를 통해 인터페론 자극 유전자(interferon- stimulated gene, ISG)를 활성화시키며, 많은 ISG는 병원체의 수명 주기 동안 필요한 경로와 기능을 직접 표적으로 삼아 바이러스, 박테리아 및 기생충 감염을 제어하는 것으로 당업계에 알려져 있다. 따라서, 상기 병리 상태는 감염성 질환을 의미할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 감염성 질환은 바람직하게는 바이러스 감염증을 의미할 수 있다. 상기 바이러스 감염증의 비제한적인 예로는 HIV에 의한 에이즈, B형 및 C형 간염 바이러스 감염증일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니며, 그 밖에 인플루엔자 바이러스(influenza virus) 감염증, 호흡기 세포융합 바이러스(respiratory syncytial virus) 감염증, 헤르페스 바이러스(herpes virus) 감염증, 인유두종 바이러스(human papilloma virus) 감염증, 코로나 바이러스(corona virus) 감염증 및 기타 바이러스 감염증으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 따른 조성물은 상술한 인터페론 입실론을 유효성분으로서 포함하며, 그 밖에 약학적으로 허용되는 담체와 함께 적합한 형태로 제형화 될 수 있고, 부형제 또는 희석제를 추가로 함유할 수 있다. 상기 '약학적으로 허용되는'이란 생리학적으로 허용되고 인간에게 투여될 때, 통상적으로 위장 장애, 현기증 등과 같은 알레르기 반응 또는 이와 유사한 반응을 일으키지 않는 비독성의 조성물을 말한다. 약학적으로 허용되는 담체로는 예컨대, 경구 투여용 담체 또는 비경구 투여용 담체를 추가로 포함할 수 있다. 경구 투여용 담체는 락토스, 전분, 셀룰로스 유도체, 마그네슘 스테아레이트, 스테아르산 등을 포함할 수 있다. 또한, 비경구 투여용 담체는 물, 적합한 오일, 식염수, 수성 글루코오스 및 글리콜 등을 포함할 수 있으며, 안정화제 및 보존제를 추가로 포함할 수 있다. 적합한 안정화제로는 아황산수소나트륨, 아황산나트륨 또는 아스코르브산과 같은 항산화제가 있다. 적합한 보존제로는 벤즈알코늄 클로라이드, 메틸-또는 프로필-파라벤 및 클로로부탄올이 있다. 본 발명의 약학적 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현택제 등을 추가로 포함할 수 있다. 그 밖의 약학적으로 허용되는 담체 및 제제는 다음의 문헌에 기재되어 있는 것을 참고로 할 수 있다.
본 발명에 따른 조성물은 상술한 바와 같이 전신 투여가 가능하므로, 인간을 비롯한 포유동물에 대해 어떠한 방법으로도 투여할 수 있으며, 예를 들어, 경구 또는 비경구적으로 투여할 수 있다. 따라서, 본 발명에 따른 조성물은 상술한 바와 같은 투여 경로에 따라 경구 투여용 또는 비경구 투여용 제제로 제형화할 수 있다.
경구 투여용 제제의 경우에 본 발명의 조성물은 분말, 과립, 정제, 환제, 당의정제, 캡슐제, 액제, 겔제, 시럽제, 슬러리제, 현탁액 등으로 당업계에 공지된 방법을 이용하여 제형화될 수 있다. 예를 들어, 경구용 제제는 활성성분을 고체 부형제와 배합한 다음 이를 분쇄하고 적합한 보조제를 첨가한 후 과립 혼합물로 가공함으로써 정제 또는 당의정제를 수득할 수 있다. 적합한 부형제의 예로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨 및 말티톨 등을 포함하는 당류와 옥수수 전분, 밀 전분, 쌀 전분 및 감자 전분 등을 포함하는 전분류, 셀룰로즈, 메틸셀룰로즈, 나트륨 카르복시메틸셀룰로오즈 및 하이드록시프로필메틸-셀룰로즈 등을 포함하는 셀룰로즈류, 젤라틴, 폴리비닐피롤리돈 등과 같은 충전제가 포함될 수 있다. 또한, 경우에 따라 가교결합 폴리비닐피롤리돈, 한천, 알긴산 또는 나트륨 알기네이트 등을 붕해제로 첨가할 수 있다. 나아가, 본 발명의 약학적 조성물은 항응집제, 윤활제, 습윤제, 향료, 유화제 및 방부제 등을 추가로 포함할 수 있다.
비경구 투여용 제제의 경우에는 주사제, 크림제, 로션제, 외용연고제, 오일제, 보습제, 겔제, 에어로졸 및 비강흡입제의 형태로 당업계에 공지된 방법으로 제형화할 수 있다..
본 발명에 따른 조성물의 총 유효량은 단일 투여량(single dose)으로 환자에게 투여될 수 있으며, 다중 투여량(multiple dose)으로 장기간 투여되는 분할 치료 방법(fractionated treatment protocol)에 의해 투여될 수 있다. 본 발명에 따른 조성물은 질환의 정도에 따라 유효성분의 함량을 달리할 수 있다. 바람직하게 본 발명에 따른 조성물의 바람직한 전체 용량은 1일당 환자 또는 대상체의 체중 1 ㎏ 당 약 0.01 ㎍ 내지 10,000 mg, 가장 바람직하게는 0.1 ㎍ 내지 500 mg일 수 있다. 그러나 상기 조성물의 용량은 제제화 방법, 투여 경로 및 치료 횟수 뿐만 아니라 환자의 연령, 체중, 건강 상태, 성별, 질환의 중증도, 식이 및 배설율 등 다양한 요인들을 고려하여 환자에 대한 유효 투여량이 결정되는 것이므로, 이러한 점을 고려할 때 당 분야의 통상적인 지식을 가진 자라면 본 발명의 조성물의 적절한 유효 투여량을 결정할 수 있을 것이다. 본 발명에 따른 조성물은 본 발명의 효과를 보이는 한 그 제형, 투여 경로 및 투여 방법은 특별히 제한되지 아니한다.
본 발명의 상기 '유효량'이란 개체에게 투여하였을 때, 암 또는 감염성 질환의 개선, 치료, 검출, 진단 또는 상기 질환의 억제 또는 감소 효과를 나타내는 양을 말하며, 상기 '개체'란 동물, 바람직하게는 포유동물, 특히 인간을 포함하는 동물일 수 있으며, 동물에서 유래한 세포, 조직, 기관 등일 수도 있다. 상기 개체는 상기 효과가 필요한 환자(patient) 일 수 있다.
본 발명에서 상기 조성물은 사용목적 내지 양상에 따라 함량은 크게 제한되지 않으며, 예를 들면 조성물 총 중량을 기준으로 0.01~99 중량%, 바람직하게는 0.5~50 중량%, 더 바람직하게는 1~30 중량%일 수 있다. 또한, 본 발명에 따른 약학적 조성물은 유효성분 외에 약학적으로 허용가능한 담체, 부형제 또는 희석제와 같은 첨가제를 더 포함할 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물은 본 발명의 방법으로 제조된 인터페론 입실론을 0.1 내지 99.9 중량%로 포함하고, 담체를 99.9% 내지 0.1 중량%로 포함할 수 있다.
또한, 본 발명은 상술한 인터페론 입실론 및 상기 인터페론 입실론에 직접 또는 간접적으로 결합된 항체 또는 이의 단편을 포함하는 융합 단백질을 제공한다.
본 발명에 따른 융합 단백질에 있어서, 상기 인터페론 입실론의 의미는 상술한 조성물에서 설명된 바와 동일하며, 이하에서는 상기 융합 단백질에 특유한 구성을 설명한다.
본 발명에 있어서, 상기 항체는 단클론성 항체, 다클론성 항체, 다중특이성 항체 (예를 들면, 이중특이성 항체) 및 이의 단편을 포함한다. 완전한 항체는 전체적으로 Y 모양을 하며, 2개의 긴 중쇄(heavy chain, H)과 2개의 짧은 경쇄(light chain, L)로 구성된다. 각 중쇄와 경쇄는 서로 황화결합으로 연결되며, 항원과 반응하는 부위인 가변영역(variable region, V)와 효과기능을 발현하는 부위인 불변영역(constant region, C)로 구분된다. 가변영역에는 항원과 특이적인 결합을 형성할 수 있도록 가변영역의 구조를 결정하며 항체결합세기를 조절하는 상보성 결정 부위(complementarity-determining region, CDR)가 존재한다. 상기 항체의 단편은 항원과 반응하여 항원-결합 활성을 나타낼 수 있는 특정 부위를 나타내며, 일례로 Fab 단편(파파인 소화에 의한 단편), Fab' 단편 (펩신 소화 및 부분적 환원에 의한 단편), F(ab')2 단편 (펩신 소화에 의한 단편), Facb (플라스민 소화에 의한 단편), Fd (펩신 소화, 부분적 환원 및 재응집에 의한 단편), scFv 단편 (분자생물학 기법에 의한 단편) 등일 수 있다. 바람직하게는, 상기 항체는 종양 특이 항원을 인지하는 항체 또는 이의 단편인 것으로, 암 등의 표적 치료제로 사용 가능할 수 있다. 일례로, 사람 표피성장인자수용체(HER-2)를 표적으로 하는 항체 치료제인 트라스투주맙(Trastuzumab), 표피성장인자수용체(EGFR)를 표적으로 하는 항체 치료제인 세툭시맙(Cetuximab), 암세포의 표면에 발현되는 PD-L1을 표적으로 하는 항체 치료제인 아테졸리주맙(Atezolizumab), 암세포의 표면에 발현되는 TROP2를 표적으로 하는 항체 치료제인 사시투주맙(Sacituzumab) 등일 수 있다.
본 발명에 따른 융합 단백질은 인터페론 입실론과 항체 또는 이의 단편이 링커, 바람직하게는 펩티드 링커에 의해 연결되어 형성된 융합 단백질일 수 있다. 상기 링커는 아미노산 또는 아미노산과 유사한 물질이 서로 펩티드 결합에 의해 둘 이상이 연결된 짧은 단편의 아미노산 또는 아미노산 유사체로 둘 이상의 별개의 물질을 서로 연결시켜주는 역할을 하는 분자를 말한다. 이때, 글리신, 세린, 알라닌 등이 주요 구성 아미노산으로 이용되어 글리신-세린 링커, 글리신-세린-알라닌 링커 등을 사용할 수 있다. 이러한 링커는 항체의 중쇄 C-말단 또는 항체의 경쇄 C-말단에 연결되거나, 또는 항체의 경쇄 C-말단과 중쇄 C-말단에 링커의 N-말단이 연결될 수도 있다. 이때, 링커의 C-말단에는 상기 인터페론 입실론의 N-말단이 연결될 수 있다.
본 발명에 따른 상기 융합 단백질에 있어서 상기 항체는 상술한 바와 같이 종양 특이적 항원을 인지하여 암 등에 대한 표적 치료를 위한 것이므로, 상기 융합 단백질의 약리학적 효과는 상술한 인터페론 입실론과 실질적으로 동일할 것이 자명하다. 따라서, 본 발명은 상기 융합 단백질을 포함하는 병리 상태에 의해 pH가 감소한 조직 특이적 치료 또는 예방용 조성물을 제공한다.
본 발명에 따른 조성물에 있어서, 상기 융합 단백질, 병리 상태, pH 및 pH가 감소한 조직 등을 포함하는 모든 용어의 의미는 상술한 조성물에서 설명된 바와 동일하며, 해당 항목에서 서술된 내용은 본 발명에 따른 융합 단백질을 포함하는 조성물에 그대로 적용될 수 있다.
본 발명에 따른 인터페론 입실론은 중성 환경 대비 약산성 환경에서 그 활성이 크게 향상된다는 특징이 있으며, 따라서 전신 독성을 제어하기 위한 표적화 또는 마스킹 등 별도의 처리 없이도 전신 투여가 가능하다는 장점이 있어 관련된 질환의 치료에 유용하게 이용될 수 있다.
도 1a 내지 도 1f은 제1형 인터페론의 종류별로(IFN-α2b, IFN-β, IFN-β R27T, IFN-β C17S/R27T, IFN-ω 및 IFN-ε) 중성, 산성 환경에서의 수용체 결합능을 평가한 결과를 나타낸 것이다.
도 2a 및 도 2b는 제1형 인터페론의 종류별 중성, 산성 환경에서의 수용체 결합능을 중성 조건으로 표준화하여 나타낸 것이다.
도 3a 및 도 3b은 인터페론 입실론의 중성 조건 대비 산성 조건에서 수용체 IFNAR1 및 IFNAR2에 대한 결합능 변화를 나타낸 것이다.
도 4a 내지 도 4c는 인터페론 입실론의 중성 조건 대비 산성 조건에서 수용체 IFNAR1/2, IFNAR1 및 IFNAR2에 대한 결합 kinetics 및 affinity를 계산한 결과를 나타낸 것이다.
도 5a 내지 도 5c는 인터페론 입실론의 중성 조건 대비 산성 조건에서 세포 신호전달 정도를 확인하기 위해, pSTAT-1의 발현량을 비교한 결과를 나타낸 것이다.
도 6는 in vivo 마우스 모델에서 인터페론 입실론의 부작용 및 효능을 평가하기 위한 실험 모식도를 도시한 것이다.
도 7a 내지 도 7g는 in vivo 마우스 모델 실험의 혈액 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 8a 내지 도 8c는 in vivo 마우스 모델 실험의 비장 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 9a 내지 9c는 in vivo 마우스 모델 실험의 종양 분석 결과를 나타낸 것이다.
이하 본 발명을 상세히 설명한다.
단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. 제1형 인터페론 종류별 중성 및 산성 조건에서의 수용체 결합능 평가
제1형 인터페론의 수용체 결합능을 평가하기 위하여 IFNAR1/2 융합 단백질을 Expi293F 세포에서 생산하였다. pOptiVec-TOPO plasmid (Invitrogen)에 Knob-into-hole 기술이 적용된 인간 IFNAR1-Fc, IFNAR2-Fc 단백질을 삽입한 뒤, ExpiFectamine™ 293 Transfection Kit (Gibco #A14524)를 이용하여 형질주입하였다. 형질주입한 Expi293F 세포는 일주일동안 세포배양한 뒤 상층액을 수거하여 Protein A 컬럼을 이용하여 AKTA avant (Cytiva) 시스템에서 정제하였다.
제1형 인터페론의 중성, 산성 조건에서의 수용체 결합능은 ELISA 실험을 이용하여 평가하였다. 제1형 인터페론은 Rebif (Merck), ABN101, ABN102 (Abion), IFN-α2b (biolegend, #592704), IFN-ω (PBL, #11395-1), IFN-ε (R&D systems, #9667-ME-025/CF)을 사용하였다. 96 well ELISA plate (Corning, #2592)에 제1형 인터페론을 PBS 버퍼에 100nM로 희석하여 100ul씩 처리하고, 16시간동안 4℃에서 코팅하였다. Coating buffer를 제외한 모든 버퍼는 1N HCl을 이용하여 pH 7.4, pH 6.0으로 적정하였다. 코팅한 플레이트를 washing buffer (0.05% PBS-T, pH 7.4, pH 6.0)를 이용하여 3번 워싱한 뒤, blocking buffer (50mg/mL BSA in PBS, pH 7.4, pH 6.0)를 300ul씩 처리하고 상온에서 1시간 동안 반응시켰다. Blocking 후 washing buffer를 이용하여 3번 워싱한 뒤, IFNAR1/2 융합 단백질을 Reagent diluent (1mg/mL BSA in 0.05% PBS-T, pH 7.4, pH 6.0)에 100nM 부터 1/3씩 serial dilution 하고 100ul씩 처리하고 상온에서 1시간 동안 반응시켰다. Bashing buffer를 이용하여 3번 워싱한 뒤, Anti-human IgG-HRP (Jackson lab, # 109-035-003)을 1:5000으로 희석하여 100ul씩 처리하고 상온에서 1시간 동안 반응시켰다. Washing buffer를 이용하여 3번 워싱한 뒤, TMB solution (Surmodics, #TMBW 1000-01)를 100ul씩 처리하고 상온에서 20분 동안 반응시켰다. 반응 후 450nm 파장에서 흡광도를 측정하였다.
실험한 제1형 인터페론의 pH에 따른 수용체 결합능을 평가한 결과, 도 1a 내지 도 1f에서 확인할 수 있는 바와 같이, Rebif, ABN101, ABN102 및 IFN-ε가 중성 조건보다 산성 조건에서 우수한 수용체 결합능을 보였으며, IFN-ε가 가장 뛰어난 산성 조건 결합능을 보였다.
실시예 2. 제1형 인터페론 종류별 중성 조건대비 산성 조건에서의 결합능 변화
ELISA 실험법을 이용하여 평가한 제1형 인터페론의 결합능을 중성 조건으로 표준화하여 도식화하였다(도 2a 및 도 2b 참고). Rebif, ABN101, ABN102 및 IFN-ω가 중성 조건보다 산성 조건에서 우수한 수용체 결합능을 보였으며, IFN-ε는 최고 농도에서의 결합능이 산성조건에서 중성조건 대비 5.02배 향상되었으며, 43.76배 적은 농도의 수용체를 처리하여도 중성조건 결합능보다 우수하였다.
이를 통해 IFN-ε는 산성조건에서 중성조건보다 우수한 결합능을 가지는 것으로 확인되었다.
실시예 3. 인터페론 입실론의 중성 조건대비 산성 조건에서의 IFNAR1, IFNAR2와의 결합능 변화
제1형 인터페론의 수용체 결합능을 평가하기 위하여, 인간 IFNAR1, IFNAR2 융합 단백질을 Expi293F세포에서 생산하였다. pOptiVec-TOPO plasmid (Invitrogen)에 Knob-into-hole 기술이 적용된 인간 IFNAR1-Fc, IFNAR2-Fc 단백질 유전자를 삽입한 뒤, ExpiFectamine™ 293 Transfection Kit (Gibco #A14524)를 이용하여 형질주입하였다. 형질주입한 Expi293F 세포는 일주일동안 세포배양한 뒤 상층액을 수거하고 Protein A 컬럼을 이용하여 AKTA avant (Cytiva) 시스템에서 정제하였다.
제1형 인터페론의 중성, 산성 조건에서의 수용체 결합능은 ELISA 실험법을 이용하여 평가하였다. 제1형 인터페론은 인간 IFN-ε 유전자를 pOptiVec-TOPO plasmid (Invitrogen)에 삽입한 뒤, ExpiFectamine™ 293 Transfection Kit (Gibco, #A14524)를 이용하여 제작하였다. 96 well ELISA plate (Corning, #2592)에 인터페론 입실론을 PBS 버퍼에 100nM로 희석하여 100ul씩 처리하고, 16시간동안 4℃에서 코팅하였다. Coating buffer를 제외한 모든 버퍼는 1N HCl을 이용하여 pH 7.4, pH 6.0으로 적정하였다. 코팅한 플레이트를 washing buffer (0.05% PBS-T, pH 7.4, pH 6.0)를 이용하여 3번 워싱한 뒤, blocking buffer (50mg/mL BSA in PBS, pH 7.4, pH 6.0)를 300ul씩 처리하고 상온에서 1시간 동안 반응시켰다. Blocking 후 washing buffer를 이용하여 3번 워싱한 뒤, IFNAR1/2 융합 단백질을 Reagent diluent (1mg/mL BSA in 0.05% PBS-T, pH 7.4, pH 6.0)에 100nM 부터 1/3 씩 serial dilution 하고 100ul씩 처리하고 상온에서 1시간 동안 반응시켰다. Washing buffer를 이용하여 3번 워싱한 뒤, Anti-human IgG-HRP (Jackson lab, #109-035-003)을 1:5000으로 희석하여 100ul씩 처리하고 상온에서 1시간 동안 반응시켰다. Washing buffer를 이용하여 3번 워싱한 뒤, TMB solution (Surmodics, #TMBW 1000-01)를 100ul씩 처리하고 상온에서 20분 동안 반응시켰다. 반응 후 450nm 파장에서 흡광도를 측정하였다.
실험한 인터페론 입실론의 pH에 따른 IFNAR1, IFNAR2와의 결합능을 평가한 결과, 도 3a 및 도 3b에서 확인할 수 있는 바와 같이, 인터페론 입실론이 IFNAR2에 의해 산성 의존적으로 수용체 결합이 강해짐을 확인하였다.
실시예 4. 인터페론 입실론의 중성 조건대비 산성 조건에서의 수용체 결합 Kinetics 및 affinity
인터페론 입실론의 수용체 결합 Kinetics를 중성, 산성조건에서 확인하기 위해 Octet R8 (Satorious) 장비를 이용하여 분석하였다. AHC biosensor (Satorious)에 hIFNAR1/2, hIFNAR1 및 hIFNAR2를 각각 20nM씩 1x kinetics buffer를 통해 coating 하였다. 중성 및 산성 분석 조건에 따라 1x kinetics buffer를 1N HCl로 적정하여 사용하였다.
인터페론 입실론을 200nM 부터 1/2 fold로 희석하여 AHC biosensor 내 코팅된 수용체와 결합시키고, Dissociation 과정을 통해 Octet R8 장비에서 Kinetics를 계산하였다.
그 결과, 이전 실험결과와 마찬가지로 인터페론 입실론이 중성 대비 산성 조건에서 더 낮은 KD value를 가지고, AR1 보다 AR2에서 산성 조건에서 강한 결합력을 가짐을 확인하였다.
실시예 5. 인터페론 입실론의 중성 조건대비 산성 조건에서의 Daudi 세포 및 인간 CD3 T 세포 신호전달 활성화 확인
인터페론 입실론의 수용체 결합을 통한 중성 및 산성 환경에서의 세포 신호전달 정도의 차이를 확인하기 위해 Human B lymphoblast 세포인 Daudi 세포와 healthy donor human peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) 에서 분리한 CD3 T 세포를 이용하였다. Human PBMCs에서 CD3 T 세포는 human CD3 T cell isolation kit (Miltenyl biotec) 를 사용하였다.
세포배양용 배지는 RPMI1640에 1N HCl을 이용하여 pH 7.4 및 pH 6.5로 적정한 뒤, 20mM HEPES를 넣어주었다. Daudi 세포 및 CD3 T 세포를 96 well tissue culture plate에 2x105 cells 씩 seeding 한 뒤, 인터페론 입실론을 pH 7.4 및 pH 6.5 media에 100nM 부터 1/10 fold 로 희석하여 24시간 동안 처리하였다. 24시간 후, 세포를 모아 먼저 세포 분리 버퍼를 이용하여 세포를 단일 세포로 분리한 후 RIPA 버퍼 (BIOSESANG)와 protease 저해제, phosphatase 저해제를 넣고 200rpm, 4℃, 1시간 반응시켜 용해한다. 그 후 15,000rpm, 4℃, 15분 원심분리하여 상층액만 모아서 용해된 단백질을 BCA assay (ThermoFisher Scientific)로 정량하였다. 정량한 단백질에 DTT가 포함된 5X 샘플 로딩 버퍼(BIOSESANG)를 넣고 10분간 끓여주어 모든 단백질을 환원시켰다. 이를 SDS-PAGE를 통해 동량의 단백질을 로딩하여 크기에 따라 분리한 뒤 PVDF 멤브레인에 옮긴 후, 5% BSA in TBS-T로 4℃, 1시간 동안 블로킹 하고 anti―human pSTAT-1 (Cell signaling technology)을 1차 항체로 사용하여 1:1000의 비율로 PVDF 멤브레인에 오버나이트로 붙여주었다. 그 후 0.05% TBS-T로 3번 워싱한 뒤 2차 항체인 anti-rabbit Fc HRP 항체(Invitrogeon)를 1:5000으로 처리하고 30분간 인큐베이션 하였다. 0.05% TBS-T로 3번 워싱한 뒤 ECL 용액(Bio-rad)을 넣어주고 Chemidoc을 이용해 detection 하였다.
실험한 제1형 인터페론의 pH에 따른 세포 신호전달 활성화를 평가한 결과, 도 5a 내지 도 5c에서 확인할 수 있는 바와 같이, 인터페론 입실론이 Daudi 세포 및 인간 CD3 T 세포를 산성 환경에서 중성 환경 대비 1000배 이상 낮은 농도에서도 pSTAT-1 신호를 활성화시킴을 확인하였다.
실시예 6. 인터페론 입실론의 in vivo mouse model에서 부작용 및 효능 평가
인터페론 입실론의 in vivo mouse model에서 부작용 및 효능을 평가하기 위해, 인간 hIFNAR1/2 knock-in (hIFNAR1/2 KI) 마우스를 사용하였다. hIFNAR1/2 KI 마우스에 인간 hIFNAR1/2를 발현시킨 B16F10 세포주를 5x105 cells 만큼 subcutaneous injection 하여 종양모델을 유도하였다. 종양의 크기가 100~150mm3 되었을 때, Control, IFN-β, IFN-ε 투여군으로 나누어 0.5mg/kg 용량으로 5일 동안 복강투여 하였다. 실험 모식도는 도6A와 같다. 마지막 투여 이후 1시간 뒤, 혈액, 비장 및 종양을 떼어내어 유세포 분석기로 분석하였다.
혈액 분석 결과, 도 7a 내지 도 7g에서 확인할 수 있는 바와 같이, 산성에서 활성이 증가하는 인터페론 입실론이 인터페론 베타 대비 Neutropenia 부작용 지표에 해당하는 백혈구 수 감소가 적었으며 T 세포 활성화를 통한 CD8 T 세포는 증가시키면서 면역 억제성 myeloid 세포를 감소시킴을 확인하였다. 또한 하위 신호전달에 해당하는 pSTAT-1의 과도한 활성을 혈액에서 일으키지 않았다.
비장 분석 결과, 도 8a 내지 도 8c에서 확인할 수 있는 바와 같이, 인터페론 입실론이 인터페론 베타 대비 T 세포의 비율을 더욱 증가시키고, 과도한 pSTAT-1 활성을 일으키지 않음을 확인하였다.
종양 분석 결과, 도 9a 내지 도 9c, 인터페론 입실론은 인터페론 베타와 유사한 정도로 항종양면역활성을 통해 종양 내 T 세포의 침윤을 증가시키고, 면역 억제성 myeloid 세포를 감소시킴을 확인하였다.
In vivo mouse model에서 인터페론 입실론은 인터페론 베타 대비 혈액 및 비장내 비특이적 면역 활성이 적었으며 종양 내 면역 활성 정도는 유사했다. 이를 바탕으로 인터페론 입실론이 산성에서 활성 증가를 다른 인터페론 아형 대비 우수한 항암효능이 가능함을 확인하였다.
이상 살펴본 바와 같이, 본 발명에 따른 인터페론 입실론은 중성 환경 대비 약산성 환경에서 그 활성이 크게 향상된다는 특징이 있으며, 따라서 전신 독성을 제어하기 위한 표적화 또는 마스킹 등 별도의 처리 없이도 전신 투여가 가능하다는 장점이 있어 관련된 질환의 치료에 유용하게 이용될 수 있다.

Claims (18)

  1. 인터페론 입실론을 유효성분으로 포함하는 질병의 예방 또는 치료용 약학적 조성물로서, 상기 인터페론 입실론은 상기 질병의 병리 상태에 의해 pH가 감소된 조직에서 활성화되는 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 상기 조성물은 전신 투여용인 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
  3. 제1항에 있어서, 상기 질병은 암 또는 감염성 질환인 것을 특징으로 하는 조성물.
  4. 제1항에 있어서, 상기 pH가 감소한 조직의 pH는 5.0 내지 6.8인 것을 특징으로 하는 조성물.
  5. 제1항에 있어서, 상기 인터페론 입실론은 pH 7.4 대비 pH 6.0에서 그 활성이 2배 내지 1000배 증가하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  6. 제2항에 있어서, 상기 전신 투여는 정맥 내, 근육 내, 동맥 내, 골수 내, 경막 내, 심장 내, 경피, 피하, 복강 내, 비강 내, 장관, 국소, 설하, 직장 내, 또는 종양 내 투여인 것을 특징으로 하는 조성물.
  7. 제3항에 있어서, 상기 암은 난소암, 유두종, 후두유두종, 인간유두종, 방광암, 자궁경부암, 모발상세포 백혈병, 만성골수성 백혈병, 다발성 골수종, 비호지킨 림프종, 흑색종 등의 피부암, 카포시 육종, 신장암, 폐암, 신경교종 등의 뇌종양, 유방암, 대장암, 간암, 간세포암, 위암, 기관지암, 비인두암, 후두암, 췌장암, 결장암, 이자암, 전립선암, 골암, 갑상선암, 부갑상선암, 식도암, 담도암, 고환암, 직장암, 두경부암, 경추암, 요관암, 신경아세포종, 섬유육종, 횡문근육종, 성상세포종, 아교모세포종, 신경모세포종 및 악성중피종으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는 조성물.
  8. 제3항에 있어서, 상기 감염성 질환은 HIV에 의한 에이즈, B형 및 C형 간염 바이러스 감염증, 인플루엔자 바이러스(influenza virus) 감염증, 호흡기 세포융합 바이러스(respiratory syncytial virus) 감염증, 헤르페스 바이러스(herpes virus) 감염증, 인유두종 바이러스(human papilloma virus) 감염증 및 코로나 바이러스(corona virus) 감염증으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는 조성물.
  9. 인터페론 입실론 및 상기 인터페론 입실론에 직접 또는 간접적으로 결합된 항체 또는 이의 단편을 포함하는 융합 단백질.
  10. 제9항에 있어서, 상기 융합 단백질은 인터페론 입실론과 항체 또는 이의 단편이 링커에 의해 연결된 것을 특징으로 하는 융합 단백질.
  11. 제9항 또는 제10항에 따른 융합 단백질을 포함하는 질병의 예방 또는 치료용 약학적 조성물로서, 상기 융합 단백질은 상기 질병의 병리 상태에 의해 pH가 감소된 조직에서 활성화되는 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
  12. 제11항에 있어서, 상기 조성물은 전신 투여용인 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
  13. 제11항에 있어서, 상기 질병은 암 또는 감염성 질환인 것을 특징으로 하는 조성물.
  14. 제11항에 있어서, 상기 pH가 감소한 조직의 pH는 5.0 내지 6.8인 것을 특징으로 하는 조성물.
  15. 제11항에 있어서, 상기 인터페론 입실론은 pH 7.4 대비 pH 6.0에서 그 활성이 2배 내지 1000배 증가하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  16. 제12항에 있어서, 상기 전신 투여는 정맥 내, 근육 내, 동맥 내, 골수 내, 경막 내, 심장 내, 경피, 피하, 복강 내, 비강 내, 장관, 국소, 설하, 직장 내, 또는 종양 내 투여인 것을 특징으로 하는 조성물.
  17. 제13항에 있어서, 상기 암은 난소암, 유두종, 후두유두종, 인간유두종, 방광암, 자궁경부암, 모발상세포 백혈병, 만성골수성 백혈병, 다발성 골수종, 비호지킨 림프종, 흑색종 등의 피부암, 카포시 육종, 신장암, 폐암, 신경교종 등의 뇌종양, 유방암, 대장암, 간암, 간세포암, 위암, 기관지암, 비인두암, 후두암, 췌장암, 결장암, 이자암, 전립선암, 골암, 갑상선암, 부갑상선암, 식도암, 담도암, 고환암, 직장암, 두경부암, 경추암, 요관암, 신경아세포종, 섬유육종, 횡문근육종, 성상세포종, 아교모세포종, 신경모세포종, 및 악성중피종으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는 조성물.
  18. 제13항에 있어서, 상기 감염성 질환은 HIV에 의한 에이즈, B형 및 C형 간염 바이러스 감염증, 인플루엔자 바이러스(influenza virus) 감염증, 호흡기 세포융합 바이러스(respiratory syncytial virus) 감염증, 헤르페스 바이러스(herpes virus) 감염증, 인유두종 바이러스(human papilloma virus) 감염증 및 코로나 바이러스(corona virus) 감염증으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는 조성물.
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