WO2025014306A1 - Pfa 고정 또는 ffpe 처리된 생물학적 샘플의 고정액 교환용 조성물 및 이의 방법 - Google Patents

Pfa 고정 또는 ffpe 처리된 생물학적 샘플의 고정액 교환용 조성물 및 이의 방법 Download PDF

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fixative
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ffpe
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손창호
박한얼
이유탁
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    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
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    • C12Q1/6869—Methods for sequencing
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N1/00—Sampling; Preparing specimens for investigation
    • G01N1/28—Preparing specimens for investigation including physical details of (bio-)chemical methods covered elsewhere, e.g. G01N33/50, C12Q
    • G01N1/36—Embedding or analogous mounting of samples

Definitions

  • the present invention relates to a composition for exchanging a fixed solution comprising an organic catalyst and a platinum-based cross-linking agent, a kit and a method thereof.
  • FFPE formalin-fixed, paraffin-embedded
  • the inventors of the present invention have developed a fixative exchange method for high-quality single-cell or single-nucleus transcriptome analysis or multi-omics analysis, thereby completing the present invention.
  • An object of the present invention is to provide a composition for fixed liquid exchange comprising an organic catalyst and a platinum-based cross-linking agent.
  • Another object of the present invention is to provide a fixative exchange kit comprising the above-described fixative exchange composition.
  • Another object of the present invention is to provide a method for exchanging a fixative, comprising the steps of: (a) treating a homogenized biological sample with a solution containing a platinum-based cross-linker; (b) separating the pellet after step (a) and resuspending it in a solution containing an organic catalyst; and (c) heating the resuspended solution.
  • the present invention provides a composition for fixed liquid exchange comprising an organic catalyst and a platinum-based cross-linking agent.
  • the present invention provides a fixative exchange kit comprising the above-described fixative exchange composition.
  • the present invention provides a method for exchanging a fixative, comprising the steps of: (a) treating a homogenized biological sample with a solution containing a platinum-based cross-linker; (b) isolating a pellet after step (a) and resuspending the pellet in a solution containing an organic catalyst; and (c) heating the resuspended solution.
  • composition according to the present invention can maximize the efficiency of reverse transcription by selectively binding to a nucleic acid without interfering with Watson-Crick base pairing of the nucleic acid and restoring the nucleic acid reacted with the fixative to the state before reacting with the fixative, so that it can be usefully used in the field of target substance discovery for new drug development or disease diagnosis through transcriptome analysis or multi-omics analysis from a single cell or single nucleus.
  • Figure 1A is a schematic diagram showing the strategy of fixative exchange (FX)
  • 1B is the result of measuring the relative cDNA synthesis yield through qPCR after PFA fixation over time
  • 1C is the result of comparing the relative cDNA synthesis yield through qPCR after catalyst treatment
  • 1D and 1E are the results of comparing the cDNA synthesis yield and the leaked RNA concentration according to the addition of a cross-linker
  • 1F shows PVSA
  • an RNase inhibitor 1G is the result of automated gel electrophoresis analysis of total RNA extracted from fixed mouse brain tissues after treatment with various RNase inhibitors
  • 1H is an overall schematic diagram of the RNA sequencing method (FX-seq) after fixative exchange
  • 1I to IL are the results of untreated (Ctrl), Tris-buffer treated (Tris Ctrl), catalyst-treated Tris-buffer (Cat.
  • Figure 2 illustrates the overall process of FX-seq, where 2A is the FX-seq method applied to PFA-fixed blocks, 2B is the FX-seq method applied to FFPE block samples, 2C is the FX-seq method applied to FFPE section samples, and 2D is the FX-seq method applied to H&E-stained sections.
  • Figure 3A is an image of nuclei isolated from fresh mouse brain tissue
  • 3B is an image of nuclei isolated from heavily fixed mouse brain tissue
  • 3H to 3K are the results of independent clustering (H, I) and merged clustering (J, K) as UMAP analysis of each sample
  • 3L is a colormap result of the percentage of fractions mapped to exon regions in UMAP analysis of the merged gene expression matrix
  • 3M is the top 10 differentially expressed genes identified through analysis of fresh tissue-derived transcripts and FX-derived transcripts in the same cell type. The results show the distribution of exon read fraction
  • 4B to 4D show the results of comparing the number of identified genes (B), UMIs (C), and number of top genes (D) after performing untreated (Ctrl), Tris-buffer treatment (Tris Ctrl), Tris-buffer catalytic treatment (Cat. 2), and fixative exchange treatment containing cross-linker (FX) on FFPE mouse brain tissue
  • 4E to 4L show the results of standalone (E, F) and merged (G, H) UMAP clustering and cell type analysis (cell population distribution: I, J; and marker gene-specific visualization: K, L) for FFPE control samples and FX-seq treatment groups.
  • Figure 5A shows 10 ⁇ m FFPE sections or H&E-stained sections
  • Fig. 6A shows the process of processing surgically resected human GIST tissues by the FX-seq method
  • 6B is a dot plot result of marker genes specific to each cluster
  • 6C to 6F are the results of the number of genes (C), the number of UMIs per nucleus (D), the read ratio of mitochondrial genes (E), and the read ratio of rRNA (F) confirmed as the QC matrix of FX-seq
  • 6G is the result of UMAP analysis of transcript distribution and clustering
  • 6H and 6I are the results of cluster network constructed based on PAGA analysis (H) and diffusion pseudotime heatmap (I)
  • 6J and 6K are transcriptome path 1 (J) and the corresponding gene expression change per cluster (K)
  • 6L and 6M are transcriptome path 2 (L) and the corresponding gene expression change per cluster (M).
  • Figure 7A shows the process of applying the FX-seq method to the archived CRC FFPE sections
  • 7C is the representative marker gene for each cluster
  • 7D is the distribution of the cell population labeled by region origin
  • 7E is the proportion of the number of cells belonging to each cluster calculated from all cells identified in each region
  • 7F is the UMAP analysis result to identify the subclusters of the merged gene matrix of the epithelial progenitor cells and tumor population indicated in the green circle of 7B
  • 7G is the distribution result of the cell population labeled by the region origin of 7F
  • 7H is the representative marker genes of the cell types identified by the subclusters of 7F
  • 7I is the cluster-level CNV inference result using the inferCNV package to identify the gene expression of the tumor and epithelial progenitor cell
  • 7K is the result of population distribution of fibroblast sub-clusters labeled by the region origin of 7J
  • 7L is the result of cell number distribution of each cluster shown in 7J and 7K
  • 7M is a representative marker gene identified by the sub-cluster analysis of 7J.
  • the present invention provides a composition for fixed liquid exchange comprising an organocatalyst and a platinum-based crosslinker.
  • organic catalyst of the present invention is a type of catalyst composed of carbon, hydrogen, sulfur and other non-metallic elements, and increases the rate of chemical reaction.
  • the organic catalyst of the present invention may restore nucleic acid reacted with a fixative to the state before reacting with the fixative.
  • the organic catalyst may be 2-aminophenylboronic acid.
  • the novel platinum-based cross-linking agent was synthesized by adding dichloro(ethylenediamine)platinum(II) (Pt(en)Cl 2 ) and dimethylformamide (DMF) to a round-bottom flask with a magnetic stirring bar, then adding silver nitrate (AgNO 3 ) dissolved in DMF dropwise, removing silver chloride (AgCl), and then adding NH 3 -PEG 11 -NH 3 .
  • the platinum-based cross-linking agent may be capable of site-selectively binding without interfering with Watson-Crick base pairing of nucleic acids, and preferably may form a bond at an N7-guanine residue.
  • the bond may be a non-covalent bond.
  • the composition may additionally contain an RNase inhibitor, and preferably, the RNase inhibitor may be PVSA (polyvinyl sulfonic acid), but is not limited thereto.
  • RNase inhibitor may be PVSA (polyvinyl sulfonic acid), but is not limited thereto.
  • the composition may be for removing a fixative from a biological sample fixed with a fixative
  • the biological sample may be a block or section of paraformaldehyde (PFA)-fixed or formalin-fixed paraffin-embedded (FFPE) tissue.
  • PFA paraformaldehyde
  • FFPE formalin-fixed paraffin-embedded
  • the fixative exchange may be performed before isolating a single cell or a single nucleus.
  • the fixative exchange may be for performing one selected from the group consisting of single cell transcriptome analysis, single nucleus transcriptome analysis, multi-omics analysis, and combinations thereof, but is not limited thereto.
  • the present invention provides a fixative exchange kit comprising the above-described fixative exchange composition.
  • the kit may further include a buffer solution, and the buffer solution may be selected from the group consisting of PBS, Tris, MOPS, SSC, and HEPES, but is not limited thereto.
  • the heating may be performed at 50 to 60°C for 10 to 60 minutes, preferably at 50 to 60°C for 20 to 50 minutes, more preferably at 50 to 60°C for 25 to 40 minutes, and more preferably at 55°C for 30 minutes, but is not limited thereto.
  • the biological sample may be, but is not limited to, a block or section of paraformaldehyde (PFA)-fixed or formalin-fixed paraffin-embedded (FFPE) tissue.
  • PFA paraformaldehyde
  • FFPE formalin-fixed paraffin-embedded
  • the solution containing the platinum-based cross-linking agent and the solution containing the organic catalyst may additionally contain an RNase inhibitor, and the RNase inhibitor may be PVSA (polyvinyl sulfonic acid), but is not limited thereto.
  • RNase inhibitor may be PVSA (polyvinyl sulfonic acid), but is not limited thereto.
  • the fixative exchange may be performed before isolating a single cell or a single nucleus.
  • a fixative exchange method (FX) using an organocatalyst was developed to facilitate the removal of paraformaldehyde (PFA) adducts and enable efficient reverse transcription under mild conditions.
  • PFA fixation generates methylol adducts on primary amines, which inhibit Watson-Crick base pairing and subsequent enzymatic activity. Therefore, the present inventors developed a strategy to maintain RNA molecules through additional cross-linking and to facilitate the removal of methylol adducts under mild conditions through treatment with an organocatalyst.
  • the Pt-based chemical cross-linker was synthesized by coupling an N7-guanine-specific cisplatin derivative with a di-amino-undeca-polyethylene glycol (PEG) linker, which can form a bond at the N7-guanine residue in a regioselective manner without interfering with Watson–Crick base pairing. Additional cross-linking process by a novel Pt-based cross-linker was confirmed to optimize RNA retention and increase cDNA yield by minimizing RNA leakage during gradual removal of PFA ( Figures 1D and 1E).
  • RNA quality could be seriously impaired by RNAase activity or RNA autodegradation during sample manipulation related to nuclear isolation and heating for PFA removal (Fig. 1G). Therefore, we searched for an effective RNase inhibitor that could replace expensive protein-based RNase inhibitors.
  • PVSA polyvinyl sulfonic acid
  • PVSA was confirmed to be most effective in preventing RNase degradation under appropriate heating conditions for catalytic treatment compared to diethyl pyrocarbonate (DEPC) or SUPERase-In TM (ThermoFisher) RNase inhibitors (Fig. 1F and 1G).
  • a novel Pt-based chemical cross-linker was synthesized by the following method. First, dichloro(ethylenediamine)platinum(II) (Pt(en)Cl 2 , 100 mg, 0.31 mmol, Sigma Aldrich) and dimethylformamide (DMF, 6 mL, Sigma Aldrich) were added to a round-bottom flask with a magnetic stir bar. Then, silver nitrate (AgNO 3 , 58 mg, 0.31 mmol, Sigma Aldrich) dissolved in DMF (6 mL) was added dropwise, and the mixture was stirred in the dark for 16 h.
  • dichloro(ethylenediamine)platinum(II) Pt(en)Cl 2 , 100 mg, 0.31 mmol, Sigma Aldrich
  • DMF dimethylformamide
  • the fixative exchange (FX) method of the present invention is as follows. First, the homogenized and washed tissue sample was permeabilized with a permeabilization solution (PBST3 solution: 1X PBS, 0.2% TritonX-100, 3% PVSA) at room temperature for 15 minutes. Thereafter, the pellet was collected, and a solution without a cross-linker (-CL solution: 1X MOPS, 3% PVSA, 0.025% Tween-20) and a solution containing a cross-linker (+CL solution: 1X MOPS, 3% PVSA, 0.025% Tween-20, 2X cross-linker) were added, and the mixture was incubated twice in a refrigerator for 5 minutes, followed by shaking at 25°C for 15 minutes.
  • PBST3 solution: 1X PBS, 0.2% TritonX-100, 3% PVSA permeabilization solution
  • a solution without a cross-linker a solution without a cross-linker
  • the pellet was collected, washed once in a solution without catalyst (-CT solution: 200 mM Tris pH 8.3, 3% PVSA), and the -CT solution in the supernatant was removed. Then, the pellet was resuspended in a solution containing catalyst (+CT solution: 200 mM Tris pH 8.3, 50 mM 2-aminophenylboronic acid HCl, 3% PVSA, 8% w/v PEG-8000) and shaken at 55 °C for 30 min to remove PFA cross-links.
  • -CT solution 200 mM Tris pH 8.3, 3% PVSA
  • the method for isolating nuclei of the present invention is as follows. First, the tissue subjected to fixative exchange (FX) was washed once with a solution that did not contain protease (-DS solution: 50 mM Tris pH 7.0, 10 mM EDTA pH 8.0, 10 mM NaCl, 1% PVSA, 0.2% Tween-20), and then the pellet was collected and resuspended in a solution containing protease (+DS solution: 50 mM Tris pH 7.0, 10 mM EDTA pH 8.0, 10 mM NaCl, 1% PVSA, 0.2% Tween-20, 0.01% Proteinase K) and shaken at 37°C for 20 minutes.
  • -DS solution 50 mM Tris pH 7.0, 10 mM EDTA pH 8.0, 10 mM NaCl, 1% PVSA, 0.2% Tween-20
  • the tissue digestion period was optimized for each tissue type.
  • the digested pellet was completely suspended in sucrose solution (1X PBS, 1% PVSA, 1.5 M sucrose) and centrifuged at 3,000 g for 20 min to isolate the nuclei.
  • the isolated nuclei were then further permeabilized with permeabilization solution (PBST1 solution: 1X PBS, 0.2% TritonX-100, 1% PVSA) at room temperature for 15 min.
  • PBST1 solution 1X PBS, 0.2% TritonX-100, 1% PVSA
  • the second permeabilization step was omitted in the sectioned samples because excessive Triton X-100 treatment resulted in severe RNA leakage from the nuclei.
  • the collected nuclei were then washed three times with SSC (saline-sodium citrate) buffer solution (BR solution: 5X SSC, 0.025% Tween-20, 0.1% SUPERase-In). Washed nuclei were resuspended in buffer solution (PBSRI solution: 1X PBS, 0.04% BSA, 1% SUPERase-In) for reverse transcription. Nuclei were stained with DAPI and counted using the EVOS imaging system (Invitrogen).
  • SSC saline-sodium citrate
  • PBSRI solution 1X PBS, 0.04% BSA, 1% SUPERase-In
  • mice 8-10 week-old mice were anesthetized with 3% isoflurane and 0.8 L/min oxygen and maintained with 2% isoflurane and 0.8 L/min oxygen.
  • the mice were transcardially perfused with cold 1X PBS, cold 4% PFA, and 1X PBS solutions, respectively.
  • the whole brains of the perfused mice were then isolated, and the isolated brains were fixed by shaking in 4% PFA, 1X PBS solution at 4°C for 48 h.
  • FX fixative exchange
  • the fixative exchange-RNA sequencing (FX-seq) method can obtain transcriptome information in fixed biological samples by increasing the cDNA synthesis yield.
  • the data quality with respect to unique molecular identifiers (UMIs) and gene counts was improved, and single nuclear transcriptome information was significantly recovered compared to the untreated group (Ctrl), the Tris-buffer treatment group (200 mM, Tris Ctrl), and the Tris buffer catalyst-treated group (Cat. 2), so that cell types could be clearly identified, and the impact on quality control indicators such as mitochondrial gene content was minimized (Figs. 1J to 1L).
  • the FX-seq method can significantly improve cell type identification by accurately classifying neurons, especially distinguishing medium spiny neurons (MSNs) from inhibitory neurons (Figs. 1M to 1T). Furthermore, we confirmed that the FX-seq method could more accurately classify specific cell types, including Purkinje cells, olfactory epithelial cells (OECs), and macrophages, according to classical molecular classification criteria in both standalone and merged UMAP clustering.
  • MSNs medium spiny neurons
  • OECs olfactory epithelial cells
  • macrophages according to classical molecular classification criteria in both standalone and merged UMAP clustering.
  • the snRNA-seq method using fresh tissues was performed using a slightly modified recent protocol from EasySci (A. Sziraki et al ., bioRxiv. 2022, p. 2022.09.28.509825), and nuclei extracted after a very short fixation treatment (0.1% PFA for 10 min) were used.
  • the FX treatment method of the present invention can restore cell resolution in strongly fixed tissues to a degree similar to that of nuclei extracted from fresh tissues.
  • the present inventors verified the applicability of the FX-seq method to FFPE samples.
  • experiments were performed using FFPE mouse brain tissue samples, and FFPE mouse brain tissue was prepared by the following method. 8-10 week-old mice were euthanized in a CO2 chamber, and the mouse brains were immediately isolated. The obtained tissues were placed in a 4% PFA, 1X PBS solution, placed at 4°C, and shaken for 48 hours. The fixative was changed once every 2-3 hours to ensure consistent brain quality.
  • FFPE blocks were removed from the embedding cassettes and placed in 150 ⁇ 20 mm petri dishes.
  • the outer paraffin wax was manually removed using a razor blade, taking care not to remove the tissue.
  • the blocks were then divided into four equal parts and placed into 2 mL eppendorf Safe-Lock tubes each with 5 mm stainless steel beads.
  • the tissues were homogenized at 30 Hz for 4 min using a Tissue Lyser II device (Qiagen) in a chemical fume hood.
  • the collected tissue solution was pelleted at 1,000 g for 3 min.
  • the supernatant was discarded and the pellet was resuspended in xylene and incubated at room temperature for 5 min, repeated once. Afterwards, the tissues were resuspended in cold 100% ethanol and incubated at room temperature for 5 minutes, repeated once. Single incubation steps were then performed in 90% and 70% ethanol.
  • the rehydrated tissues were suspended in BC solution (3X SSC, 3% PVSA, 0.025% Tween-20) and filtered through a 20 ⁇ m filter (if necessary, the tissues were first filtered through a 100 ⁇ m filter). The filtered tissues were washed twice more in BC solution before further cross-linking. FX treatment was performed on three FFPE mouse brain tissue samples (Fig. 4A).
  • the FX-seq method increased both the total cell number and the number of identified genes ( Figures 4B to 4D).
  • the standalone and merged UMAP clustering results confirmed that FX treatment could provide specific cell populations including cortex hippocampal progenitor cells (CTX/HP Proj.), subcortical neurons (Sub-CTX), and inhibitory interneurons (Int. Neurons) with clear resolution, thereby improving cell type annotation and providing additional information ( Figures 4E to 4L).
  • the sequence analysis results of the control sample without FX treatment confirmed that there was insufficient information to distinguish specific cell types, resulting in their classification as general neurons.
  • the FX processing method of the present invention enables RNA sequence analysis even in FFPE samples and has the effect of significantly improving the resolution of cell type classification.
  • FFPE sections and H&E-stained sections of mouse brain tissue were prepared using the following method. First, FFPE blocks were sectioned to 10 ⁇ m thickness. The sectioned FFPE slides were dried and stored in a refrigerator with silica gel to preserve sample quality. Then, H&E staining was performed on 10 ⁇ m sections.
  • H&E staining was performed using a Leica Autostainer XL, CV5030 according to the following protocol: 3 changes to xylene for 7 min each, 2 changes to 100% ethanol for 1 min each, 2 changes to 95% ethanol for 1 min each, washing with water for 1 min, staining with Harris hematoxylin solution for 5 min, washing with water for 1 min, differentiating with 1% HCl for 3 sec, washing with water for 30 sec, treating with 0.3% ammonia solution for 3 sec, staining with eosin Y for 20-60 sec, rinsing twice with 95% alcohol for 30 sec each, dehydrating three times with 100% ethanol for 1 min each, and changing to xylene for 2 min each. All sectioning and staining protocols were performed at the Department of Histopathology, Avison Biomedical Research Center, Yonsei University.
  • FFPE sections were manually removed from glass slides by scraping the tissue with a razor blade. Tissues collected from FFPE sections were then deparaffinized and rehydrated as in FFPE blocks. In addition, H&E-stained sections were also manually removed from the slides. Since H&E-stained sections were already deparaffinized, only rehydration was performed. Prior to each experiment, 1-2 slides were run through the FX-seq protocol to preliminarily assess the yield of nuclei. FX processing and nuclei isolation were then performed (Fig. 2).
  • FFPE blocks were then sectioned into 4- or 10- ⁇ m-thick sections, and H&E staining was performed (Fig. 5L). Samples were then homogenized, deparaffinized, and rehydrated, followed by FX treatment and nuclear isolation (Fig. 2).
  • the FX-seq method of the present invention is a scalable snRNA-seq method that was confirmed to be capable of recovering single-nucleus level transcriptomes from FFPE sections and H&E-stained sections prepared from human surgical specimens (Fig. 5U).
  • the transcriptome showed transient increased expression of DNA methylation-related genes including PCNA , DNMT1, and UHRF1 , and sustained upregulation of histone methylation enzymes encoded by EZH2 (Fig. 6J). Upregulation of these genes is associated with epigenetic modifications and is thought to be associated with transient expression of several genes including ALK, ATAD2 , and MYO3A (Fig. 6K). This altered gene expression pattern was supported by the proliferating KIT low / PDGFRA high transcriptome changes that are manifested by overexpression of DNMT3B, CIT , and DIAPH3 .
  • EZH2 overexpression along Path 2 was associated with aberrant expression of multiple genes, but no changes in DNA methylation genes (Fig. 6L).
  • enhanced gene expression GDF15, PURPL, PLEKHG1, GFRA1, and SYNDIG1
  • Fig. 6M genes with proliferation markers
  • the FX-seq method of the present invention has demonstrated high scalability and data quality for clinical FFPE samples, and has been confirmed to provide an opportunity to discover novel molecular markers that can help understand the dynamic characteristics of integrated cellular processes associated with human diseases.
  • Sequence analysis confirmed the presence of canonical cell types present in CRC, including immune cells, endothelial cells, enteric glia, and connective cells with a predominance of epithelial lineage cells (Figs. 7B and 7C).
  • Region barcoding which encodes the spatial origin of individual nuclei, allowed identification of the region distribution within each cluster (Figs. 7D and 7E).
  • a large epithelial lineage cluster distinct from normal epithelial cells was identified as epithelial progenitor cells and tumor cells based on their region origin (Figs. 7F and 7G).
  • Subcluster analysis of the cluster in Fig. 7G identified distinct transcriptome profiles for each cell population assigned to progenitor cells and tumor (Fig. 7H).
  • the identified tumor population corresponds to the MSS (microsatellite-stable) intrinsic consensus molecular subtype 2 (iCMS2) derived from LGR5 + crypt-bottom stem cells (I. Joanito et al ., Nat. Genet. 54, 963-975 (2022)).
  • MSS microsatellite-stable intrinsic consensus molecular subtype 2
  • LGR5 + crypt-bottom stem cells I. Joanito et al ., Nat. Genet. 54, 963-975 (2022)
  • the FX-seq method can provide insights into the complex tumor microenvironment (TME) of CRC tissues.
  • TME tumor microenvironment
  • CAFs cancer-associated fibroblasts
  • Fig. 7J normal fibroblasts
  • Figs. 7K and 7L CAF-A and CAF-B populations were identified based on their transcriptome states, and specific genes enriched in each population were identified (Fig. 4M).
  • the FX-seq method of the present invention can be usefully used in the field of disease diagnosis by identifying cancer subtypes from single-cell or single-nucleus level resolution information from FFPE sections through FX-seq without an additional surgical procedure to obtain a new sample.

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Abstract

본 발명은 유기촉매 및 백금 기반의 가교제를 포함하는 고정액 교환용 조성물에 관한 것으로서, 본 발명의 조성물은 핵산의 Watson-Crick 염기쌍을 방해하지 않으면서 위치선택적으로 결합하고 고정액과 반응한 핵산을 고정액과 반응하기 전의 상태로 회복시켜 역전사의 효율을 극대화할 수 있어, 단일세포 또는 단일핵으로부터의 전사체 분석 또는 다중 오믹스 분석을 통해 신약 개발을 위한 타겟 물질 발굴 또는 질환의 진단 분야에 유용하게 사용될 수 있다.

Description

PFA 고정 또는 FFPE 처리된 생물학적 샘플의 고정액 교환용 조성물 및 이의 방법
본 발명은 유기촉매 및 백금 기반의 가교제를 포함하는 고정액 교환용 조성물, 키트 및 이의 방법에 관한 것이다.
차세대 염기서열 분석기를 이용한 단일세포, 단일핵 전사체 분석은 신선한 조직이거나 신선한 조직을 아무런 처리없이 냉각(-80℃)한 형태에서 가능하나, 매번 신선한 조직을 얻기 어렵다는 문제가 있었다. 이에 다양한 연구 및 임상 분야에서는 조직 또는 샘플을 화학적으로 고정 처리를 하여 보관하거나 분석에 사용하였다. 이러한 화학적 고정 처리는 조직의 생물학적 상태를 급속으로 정지시킬 수 있어 샘플의 장기보관 및 절편화를 통한 구조적 분석도 가능하게 한다. 특히, 임상 환경에서 포르말린 고정 파라핀 포매(FFPE) 조직은 병리학적 진단 및 장기 보관을 위한 주요 자원 역할을 하며 전 세계 아카이브의 수는 수십억 개가 넘는 것으로 추정된다 (N. Blow, Tissue issues. Nature. 448, 959-960 (2007); 및 S. Sah et al., Genome Med. 5, 77 (2013)).
그러나, FFPE 조직과 같이 고정 처리된 샘플들은 핵산과 고정액의 반응, 핵산과 단백질의 고정반응으로 인해 단일세포에서 충분한 양의 역전사를 통한 cDNA를 얻지 못한다는 문제가 있다. 이로 인해 고정 처리된 조직 또는 세포의 전사체 분석은 매우 비효율적인 과정으로 여겨졌다. 따라서, 파라포름알데히드(PFA) 고정 또는 FFPE 샘플에 대한 고품질의 확장 가능한 단일핵-RNA 염기서열 방법에 대한 요구가 높은 실정이다.
이에 본 발명자들은 고품질의 단일세포 또는 단일핵 전사체 분석 또는 다중 오믹스 분석을 위한 고정액 교환 방법을 개발하여 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 유기촉매 및 백금 기반의 가교제를 포함하는 고정액 교환용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 고정액 교환용 조성물을 포함하는 고정액 교환용 키트를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 (a) 균질화된 생물학적 샘플에 백금 기반의 가교제가 포함된 용액을 처리하는 단계; (b) 상기 (a) 단계 후 펠릿을 분리한 후 유기촉매가 포함된 용액으로 재현탁하는 단계; 및 (c) 상기 재현탁된 용액을 가열하는 단계를 포함하는 고정액 교환 방법을 제공하는 것이다.
본 발명은 유기촉매 및 백금 기반의 가교제를 포함하는 고정액 교환용 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 고정액 교환용 조성물을 포함하는 고정액 교환용 키트를 제공한다.
또한, 본 발명은 (a) 균질화된 생물학적 샘플에 백금 기반의 가교제가 포함된 용액을 처리하는 단계; (b) 상기 (a) 단계 후 펠릿을 분리한 후 유기촉매가 포함된 용액으로 재현탁하는 단계; 및 (c) 상기 재현탁된 용액을 가열하는 단계를 포함하는 고정액 교환 방법을 제공한다.
본 발명에 따른 조성물은 핵산의 Watson-Crick 염기쌍을 방해하지 않으면서 위치선택적으로 결합하고 고정액과 반응한 핵산을 고정액과 반응하기 전의 상태로 회복시켜 역전사의 효율을 극대화할 수 있어, 단일세포 또는 단일핵으로부터의 전사체 분석 또는 다중 오믹스 분석을 통해 신약 개발을 위한 타겟 물질 발굴 또는 질환의 진단 분야에 유용하게 사용될 수 있다.
도 1A는 고정액 교환(FX)의 전략을 제시한 개략도이고, 1B는 시간에 따른 PFA 고정 후 qPCR을 통해 상대적 cDNA 합성 수율을 측정한 결과이며, 1C는 촉매를 처리한 후 qPCR을 통해 상대적 cDNA 합성 수율을 비교한 결과이고, 1D 및 1E는 가교제의 추가 여부에 따른 cDNA 합성 수율 및 누출된 RNA 농도를 비교한 결과이며, 1F는 RNase 억제제인 PVSA를 나타낸 것이고, 1G는 다양한 RNase 억제제를 처리한 후 고정된 마우스 뇌 조직에서 추출된 전체 RNA의 자동 겔 전기영동 분석 결과이며, 1H는 고정액 교환 후 RNA 서열분석 방법(FX-seq)에 대한 전체 개략도이고, 1I 내지 IL은 PFA로 고정된 마우스 뇌 조직(n=3)에 대하여 미처리(Ctrl), 트리스-버퍼 처리(Tris Ctrl), 트리스-버퍼에 촉매-처리(Cat. 2) 및 가교제가 포함된 고정액 교환 처리(FX)를 수행한 후, 확인된 유전자 수(J), UMIs(K) 및 상위 유전자 수(L)를 비교한 결과이며, 1M 내지 1T는 PFA-고정된 대조군 샘플(n = 7497) 및 FX-seq 처리군(n = 8654)에 대한 독립형(M,N) 및 병합형(O,P) UMAP 클러스터링 및 세포 유형 분석 결과(세포군 분포: Q,R; 및 마커 유전자 특이적 가시화: S,T)를 나타낸 것이다.
도 2는 FX-seq의 전체 과정을 나타낸 것으로서, 2A는 PFA 고정된 블록에 적용하는 FX-seq 방법이고, 2B는 FFPE 블록 샘플에 적용하는 FX-seq 방법이며, 2C는 FFPE 절편 샘플에 적용하는 FX-seq 방법이고, 2D는 H&E 염색된 절편에 적용하는 FX-seq 방법이다.
도 3A는 신선한 마우스 뇌 조직에서 분리된 핵의 이미지이고, 3B는 심하게 고정된 마우스 뇌 조직에서 분리된 핵의 이미지이며, 3C 내지 3G는 신선한 마우스 뇌 조직에서 분리된 핵(fresh, n=11807) 및 FX-처리된 심하게 고정된 마우스 뇌 조직에서 분리된 핵(FX, n=-7569)의 QC 매트릭스로서, 각각 확인된 유전자 수의 분포(C), UMIs(D), 미토콘드리아 유전자 판독 비율(E), 리보좀 RNA 판독 비율(F) 및 엑손 판독 비율(G)을 나타낸 결과이고, 3H 내지 3K는 각 샘플의 UMAP 분석 결과로서 독립형 클러스터링(H, I) 및 병합형 클러스터링(J, K) 결과이며, 3L은 병합형 유전자 발현 매트릭스의 UMAP 분석에서 엑손 영역에 매핑된 분획의 백분율 컬러맵 결과이고, 3M은 동일한 세포 유형에서 신선한 조직 유래 전사체 및 FX 유래 전사체 사이의 차별적으로 발현된 유전자 분석을 통해 확인된 상위 10개 유전자에 대한 엑손 판독 분획 분포를 나타낸 결과이다.
도 4A는 마우스 뇌 조직의 FFPE 블록(n=3)을 나타낸 것이고, 4B 내지 4D는 FFPE 마우스 뇌 조직에 미처리(Ctrl), 트리스-버퍼 처리(Tris Ctrl), 트리스-버퍼에 촉매-처리(Cat. 2) 및 가교제가 포함된 고정액 교환 처리(FX)를 수행한 후, 확인된 유전자 수(B), UMIs(C) 및 상위 유전자 수(D)를 비교한 결과이며, 4E 내지 4L은 FFPE 대조군 샘플 및 FX-seq 처리군에 대한 독립형(E,F) 및 병합형(G,H) UMAP 클러스터링 및 세포 유형 분석 결과(세포군 분포: I,J; 및 마커 유전자 특이적 가시화: K,L)를 나타낸 것이다.
도 5A는 10 μm FFPE 절편 또는 H&E 염색된 절편을 나타낸 것이고, 5B 내지 5E는 FFPE 절편(n = 11334) 또는 H&E 염색된 절편(n = 8648)의 QC 매트릭스로서, 확인된 유전자 수(B), UMIs(C), 미토콘드리아 판독 비율(D) 및 리보솜 RNA 판독 비율(E)를 비교한 결과이며, 5F 내지 5K는 FFPE 절편 또는 H&E 염색된 절편의 FX-seq 처리군에 대한 병합형(F,G) UMAP 클러스터링 및 세포 유형 분석 결과(세포군 분포: H,I; 및 마커 유전자 특이적 가시화: J,K)이고, 5L은 대망 전이암(omental metastasis cancer) 샘플에서 4μm 및 10μm FFPE 절편 및 H&E 염색된 절편을 준비한 것이고 (각각 4F (n = 8590), 10F (n = 10395), 4H (n = 14658) 및 10H (n = 11206)로 표시함), 5M은 4가지 조건의 병합형 유전자 발현 매트릭스의 UMAP 분석 결과이며, 5N은 UMAP의 개별 핵 분포를 나타낸 결과이고, 5O 내지 5R은 4가지 조건에 대한 FX-seq의 QC 매트릭스로서, 확인된 유전자 수(O), UMIs(P), 미토콘드리아 판독 비율(Q) 및 상위 유전자 수(R)를 비교한 결과이며, 5S는 각 세포 유형에서의 UMIs 분포 결과이고, 5T는 각 세포 유형에 대한 세포수의 분포 결과이며, 5U는 각 클러스터에 특이적인 마커 유전자의 도트 플롯 결과이다.
도 6A는 수술적으로 절제된 인간 GIST 조직을 FX-seq 방법으로 처리한 과정을 나타낸 것이고, 6B는 각 클러스터에 특이적인 마커 유전자의 도트 플롯 결과이며, 6C 내지 6F는 FX-seq의 QC 매트릭스로서 확인된 유전자 수(C), 핵당 UMIs의 수(D), 미토콘드리아 유전자의 판독 비율(E) 및 rRNA 판독 비율(F) 결과이고, 6G는 전사체 분포 및 클러스터링의 UMAP 분석 결과이며, 6H 및 6I는 PAGA 분석(H) 및 확산 슈도타임 히트맵(I)을 기반으로 구축된 클러스터 네트워크 결과이고, 6J 및 6K는 전사체 경로(Path) 1(J) 및 클러스터당 해당 유전자 발현 변화(K)이고, 6L 및 6M은 전사체 경로(Path) 2(L) 및 클러스터당 해당 유전자 발현 변화(M)이다.
도 7A는 보관된 CRC FFPE 절편에 대한 FX-seq 방법을 적용한 과정을 나타낸 것이고, 7B는 FFPE 절편(T, n = 47966; 및 NT, n = 13559)으로부터 영역 기원으로 표지된 전사체의 UMAP 분석 결과이며, 7C는 각 클러스터에 대한 대표적인 마커 유전자이고, 7D는 영역 기원으로 표지된 세포군의 분포이며, 7E는 각 영역에서 식별된 모든 세포로부터 계산된 각 클러스터에 속한 세포수의 비율이고, 7F는 7B의 녹색 원에 표시된 상피 전구 세포와 종양 집단의 병합된 유전자 매트릭스의 하위 클러스터를 식별하기 위한 UMAP 분석 결과이며, 7G는 7F의 영역 기원에서 표직된 세포군의 분포 결과이고, 7H는 7F의 하위 클러스터에 의해 식별된 세포 유형의 대표적인 마커 유전자이며, 7I는 inferCNV 패키지를 사용하여 종양 및 상피 전구 세포군의 유전자 발현을 확인한 클러스터-수준의 CNV 추론 결과이고, 7J는 7B의 주황색 원에 나타난 섬유아세포 클러스터의 하위 클러스터를 식별하기 위한 UMAP 분석 결과이며, 7K는 7J의 영역 기원에 의해 표지된 섬유아세포 하위 클러스터의 집단 분포 결과이고, 7L은 7J 및 7K에 나타낸 각 클러스터의 세포수 분포 결과이며, 7M은 7J의 하위 클러스터 분석에 의해 식별된 대표적인 마커 유전자이다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명에 사용되는 용어는 본 발명의 기능을 고려하면서 가능한 현재 널리 사용되는 일반적인 용어들을 선택하였으나, 이는 당 기술분야에 종사하는 기술자의 의도 또는 새로운 기술의 출현 등에 따라 달라질 수 있다. 또한, 특정한 경우는 임의로 선정된 용어도 있으며, 이 경우 해당 실시예의 설명 부분에서 상세히 그 의미를 기재할 것이다. 따라서, 본 발명에서 사용되는 용어는 단순한 용어의 명칭이 아닌, 그 용어가 가지는 의미와 본 발명의 전반에 걸친 내용을 토대로 정의되어야 한다.
본 발명에서 어느 구성요소 또는 어느 단계를 "포함한다"고 할 때, 이는 특별히 반대되는 기재가 없는 한 다른 구성요소 또는 다른 단계를 제외하는 것이 아니라 다른 구성요소 또는 다른 단계를 더 포함할 수 있는 것을 의미한다.
본 발명은 유기촉매(organocatalyst) 및 백금 기반의 가교제(Pt-based crosslinker)를 포함하는 고정액 교환용 조성물을 제공한다.
본 발명의 용어, "유기촉매"는 탄소, 수소, 황 및 기타 비금속 원소로 구성되며, 화학 반응 속도를 증가시키는 촉매의 한 형태이다. 본 발명의 유기촉매는 고정액과 반응한 핵산을 고정액과 반응하기 전의 상태로 회복시키는 것일 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 유기촉매는 2-아미노페닐보론산(2-aminophenylboronic acid)인 것일 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 신규한 백금 기반의 가교제는 디클로로(에틸렌디아민)백금(II)(Pt(en)Cl2) 및 디메틸포름아미드(DMF)를 자석 교반 막대가 있는 둥근 바닥 플라스크에 첨가한 후, DMF에 용해된 질산은(AgNO3)을 적가하고 염화은(AgCl)을 제거한 후 NH3-PEG11-NH3을 첨가하여 합성하였다.
본 발명에 있어서, 상기 백금 기반의 가교제는 핵산의 Watson-Crick 염기쌍을 방해하지 않으면서 위치선택적으로 결합하는 것일 수 있고, 바람직하게는 N7-구아닌 잔기에서 결합을 형성하는 것일 수 있다. 상기 결합은 비공유결합인 것일 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 백금 기반의 가교제는 하기 화학식 1로 표시되는 화합물인 것일 수 있다.
[화학식 1]
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.
본 발명에 있어서, 상기 조성물은 RNase 억제제를 추가적으로 더 포함하는 것일 수 있고, 바람직하게는, 상기 RNase 억제제는 PVSA(polyvinyl sulfonic acid)인 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 상기 조성물은 고정액으로 고정된 생물학적 샘플로부터 고정액을 제거하기 위한 것일 수 있고, 상기 생물학적 샘플은 파라포름알데히드(PFA) 고정 또는 포르말린 고정 파라핀 포매(FFPE) 조직의 블록 또는 절편인 것일 수 있다. 상기에서, 상기 절편은 4μm 내지 10μm인 것일 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 고정액 교환은 단일세포 또는 단일핵을 분리하기 전에 수행하는 것일 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 고정액 교환은 단일세포 전사체 분석, 단일핵 전사체 분석, 다중 오믹스 분석 및 이의 조합으로 이루어진 군에서 선택되는 것을 수행하기 위한 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
또한, 본 발명은 상기 고정액 교환용 조성물을 포함하는 고정액 교환용 키트를 제공한다.
본 발명에 있어서, 상기 키트는 완충액을 추가로 더 포함하는 것일 수 있고, 상기 완충액은 PBS, Tris, MOPS, SSC 및 HEPES로 이루어진 군에서 선택되는 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
또한, 본 발명은 (a) 균질화된 생물학적 샘플에 백금 기반의 가교제가 포함된 용액을 처리하는 단계; (b) 상기 (a) 단계 후 펠릿을 분리한 후 유기촉매가 포함된 용액으로 재현탁하는 단계; 및 (c) 상기 재현탁된 용액을 가열하는 단계를 포함하는 고정액 교환 방법을 제공한다.
본 발명에 있어서, 상기 가열은 50 내지 60℃에서 10분 내지 60분 동안 수행되는 것일 수 있고, 바람직하게는 50 내지 60℃에서 20분 내지 50분 동안, 50 내지 60℃에서 25분 내지 40분 동안 수행되는 것일 수 있고, 더욱 바람직하게는 55℃에서 30분 동안 수행되는 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 상기 생물학적 샘플은 파라포름알데히드(PFA) 고정 또는 포르말린 고정 파라핀 포매(FFPE) 조직의 블록 또는 절편인 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 상기 백금 기반의 가교제가 포함된 용액 및 유기촉매가 포함된 용액에는 RNase 억제제를 추가적으로 더 포함하는 것일 수 있고, 상기 RNase 억제제는 PVSA(polyvinyl sulfonic acid)인 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 상기 고정액 교환은 단일세포 또는 단일핵을 분리하기 전에 수행하는 것일 수 있다.
이하, 본 발명을 실시예를 통하여 더욱 상세히 설명하기로 한다. 이들 실시예는 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. 촉매, 가교제 및 RNase 억제제의 선별
본 발명에서는 온화한 조건 하에서 파라포름알데히드(PFA) 부가물의 제거를 촉진하고 효율적인 역전사를 가능하게 하기 위해 유기촉매를 사용한 고정액 교환 방법(FX)을 개발하였다. 도 1A에 나타낸 바와 같이, PFA 고정은 1차 아민에 메틸올(methylol) 부가물을 생성하여 Watson-Crick 염기쌍을 억제하고 후속 효소 활성을 억제한다. 이에 본 발명자들은 추가 가교를 통해 RNA 분자를 유지시키고, 유기촉매의 처리를 통해 온화한 조건에서 메틸올 부가물을 제거하는데 촉진하는 전략을 개발하였다.
우선, PFA 가교가 역전사를 억제하는지 확인을 실험을 수행하였다. 상대적 cDNA 합성 수율은 qPCR을 통해 동일한 양의 신선한 RNA로 정규화하여 평가하였다. 그 결과, PFA 고정은 분리된 RNA의 cDNA 합성 수율을 억제함을 확인하였다 (도 1B). 이후, 뛰어난 촉매 활성을 가진 촉매 후보를 스크리닝하였다. 그 결과, 촉매 중 2-아미노페닐보론산 HCl (2-aminophenylboronic acid HCl, "Cat. 2")은 (2-아미노-5-메틸페닐)포스폰산 (2-amino-5 methylphenyl phosphonic acid, "Cat. 1")에 비해 더 나은 촉매 활성을 나타내었다 (도 1C).
상기와 같이, 유기촉매인 2-아미노페닐보론산 HCl의 처리는 cDNA 수율을 향상시켰으므로, 연장된 촉매 처리가 in situ 역전사 수율을 증가시킬 수 있을 것으로 예상하였다. 그러나, 촉매를 처리하더라도, 고정된 세포로부터 RNA 누출을 의미하는 비-세포질 RNA과 주변 RNA 농도가 증가하였다. 이에 따라, RNA 손실을 피하기 위해 신규한 위치특이적 Pt-기반의 화학적 가교제를 고정된 세포에 처리하였다. 상기 Pt-기반의 화학적 가교는 N7-구아닌 특이적 시스플라틴 유도체를 디-아미노-운데카-폴리에틸렌 글리콜(PEG) 링커와 커플링하여 합성한 것으로서, Watson-Crick 염기쌍을 방해하지 않으면서 위치선택성 방식으로 N7-구아닌 잔기에서 결합을 형성할 수 있다. 신규한 Pt-기반의 가교제에 의한 추가 가교 공정은 PFA의 점진적 제거 시 RNA 누출을 최소화하여 RNA 보유을 최적화하고 cDNA 수율을 증가시킬 수 있음을 확인하였다 (도 1D 및 1E).
추가적으로, 핵 분리와 관련된 샘플 조작 및 PFA 제거를 위한 가열 시 RNAase 활성 또는 RNA 자가분해에 의해 RNA 품질이 심각하게 손상될 수 있음을 확인하였다 (도 1G). 이에 따라, 고비용의 단백질-기반 RNase 억제제를 대체할 수 있는 효율적인 RNase 억제제를 검색하였다. 그 결과, PVSA (polyvinyl sulfonic acid)는 내열성이 있고 하류 효소 반응과 호환될 수 있으며, 비-반응성 경쟁자로서 활성 부위 차단에 의해 RNase 활성을 억제할 수 있었다. 특히, PVSA는 디에틸피로카보네이트(DEPC, diethyl pyrocarbonate) 또는 SUPERase-InTM (ThermoFisher) RNase 억제제에 비해 촉매 처리를 위한 적당한 가열 조건 하에서 RNase 분해를 막는데 가장 효과가 뛰어남을 확인하였다 (도 1F 및 1G).
실시예 2. 신규한 Pt-기반의 화학적 가교제의 합성
신규한 Pt-기반의 화학적 가교제는 다음의 방법으로 합성하였다. 우선, 디클로로(에틸렌디아민)백금(II)(Pt(en)Cl2, 100mg, 0.31mmol, Sigma Aldrich) 및 디메틸포름아미드(DMF, 6mL, Sigma Aldrich)를 자석 교반 막대가 있는 둥근 바닥 플라스크에 첨가하였다. 이후, DMF(6 mL)에 용해된 질산은(AgNO3, 58mg, 0.31mmol, Sigma Aldrich)을 적가하고, 혼합물을 암조건 하에 16시간 동안 교반하였다. 이후, 혼합물을 Millex-GV 멤브레인 필터(기공 크기: 0.22 μm, Merck Millipore)를 통해 여과하여 염화은(AgCl)을 제거하였다. 이후, NH3-PEG11-NH3(65mg, 0.12mmol, Broadpharm)을 첨가하고 암조건 하에 50℃에서 밤새 교반하였다. 완료 후, 혼합물을 감압 농축하였다.
신규한 Pt-기반의 화학적 가교제의 합성은 다음의 반응식 1과 같다.
[반응식 1]
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이후, 잔류물을 3mL의 Milli-Q water에 용해시키고 암조건에서 4℃에서 밤새 보관하였다. 혼합물을 Millex-GV 멤브레인 필터(기공 크기: 0.22 μm, Merck Millipore)를 통해 여과하여 불용성 황색 입자 [Pt(en)Cl(NO3)]를 제거하였다. 이후, 여과된 용액을 감압 농축하고 C18 플래쉬 컬럼 크로마토그래피(물 중 0.1% 포름산 및 아세토니트릴 중 0.1% 포름산, 10분 내에 아세토니트릴을 0에서 100%로 구배 증가)로 정제하였다. 분리된 분획으로부터 용매를 감압 하에 제거하고 생성된 잔류물을 3 mL의 MeOH에 용해시켰다. 용액을 Millex-GV 멤브레인 필터(기공 크기: 0.22 μm, Merck Millipore)를 통해 여과하여 잔류 [Pt(en)Cl(NO3)]를 제거하여 노란색 오일(119 mg, 88.2%)을 얻었다. 1H-NMR(300MHz, MeOD-d4): d = 3.97-3.68(m, 52H), 2.98-2.56(m, 14H). LC-MS(ESI+) m/z (C28H66Cl2N6O11Pt2 [M-2H]2+에 대해 계산됨: 562.68, 실측치: 562.4.
실시예 3. 고정액 교환(FX, Fixative eXchnge) 전략
3.1. 고정액 교환(FX) 방법
본 발명의 고정액 교환(FX) 방법은 다음과 같다. 우선, 균질화되고 세척된 조직 샘플을 투과 용액 (PBST3 solution: 1X PBS, 0.2% TritonX-100, 3% PVSA)으로 실온에서 15분 동안 투과시켰다. 이후, 펠렛을 수집하고, 가교제가 없는 용액(-CL solution: 1X MOPS, 3% PVSA, 0.025% Tween-20)과 가교제가 포함된 용액(+CL solution: 1X MOPS, 3% PVSA, 0.025% Tween-20, 2X 가교제)을 넣고 5분 동안 냉장실에서 2회 인큐베이션한 후, 25℃에서 15분 동안 진탕하였다. 이후, 펠렛을 수집하고, 촉매가 없는 용액 (-CT solution: 200 mM Tris pH 8.3, 3% PVSA)에서 1회 세척하고, 상청액에 있는 -CT solution을 제거하였다. 이후, 펠릿을 촉매가 포함된 용액 (+CT solution: 200 mM Tris pH 8.3, 50 mM 2-aminophenylboronic acid HCl, 3% PVSA, 8% w/v PEG-8000)으로 재현탁하고, PFA 가교 결합을 제거하기 위해 55℃에서 30분 동안 진탕하였다.
3.2. 핵 분리 방법
본 발명의 핵 분리 방법은 다음과 같다. 우선, 고정액 교환(FX) 처리된 조직을 단백질분해효소가 포함되지 않은 용액 (-DS solution: 50 mM Tris pH 7.0, 10 mM EDTA pH 8.0, 10 mM NaCl, 1% PVSA, 0.2% Tween-20)으로 한번 세척한 후, 펠릿을 수집하고 단백질분해효소가 포함된 용액(+DS solution: 50 mM Tris pH 7.0, 10 mM EDTA pH 8.0, 10 mM NaCl, 1% PVSA, 0.2% Tween-20, 0.01% Proteinase K)에 재현탁하여 37℃에서 20분 동안 진탕하였다. 일부 샘플의 ECM은 더 단단하고 덜 소화되기 쉽기 때문에 조직 소화 기간은 각 조직 유형에 따라 최적화되었다. 소화된 펠릿은 수크로스 용액(1X PBS, 1% PVSA, 1.5 M sucrose)에 완전히 현탁하고, 3,000 g에서 20분 동안 원심분리하여 핵을 분리하였다. 이후, 분리된 핵은 투과 용액(PBST1 solution: 1X PBS, 0.2% TritonX-100, 1% PVSA)으로 실온에서 15분 동안 추가 투과시켰다. 절편된 샘플에서는 과도한 Triton X-100 처리로 인해 핵에서 심각한 RNA 누출이 발생하였기 때문에 두 번째 투과 단계를 생략하였다. 이후, 수집된 핵은 SSC(Saline-sodium citrate) 버퍼 용액 (BR solution: 5X SSC, 0.025% Tween-20, 0.1% SUPERase-In)으로 3회 세척하였다. 세척된 핵은 역전사를 위해 버퍼 용액(PBSRI solution: 1X PBS, 0.04% BSA, 1% SUPERase-In)으로 재현탁하였다. 핵은 DAPI로 염색하였고, EVOS imaging system (Invitrogen)을 이용하여 카운팅하였다.
실시예 4. PFA-고정 마우스 뇌 조직을 이용한 고정액 교환-RNA 서열분석(FX-seq) 방법의 검증
고정액 교환(FX) 처리된 핵의 확장성이 뛰어난 서열분석을 달성하기 위해, 본 발명자들은 업데이트된 sci-RNA-seq3 프로토콜에 따른 조합 세포 바코딩을 약간 수정하여 사용하였다 (J. Cao et al., Nature. 566, 496-502 (2019)). 고정액 교환(FX) 방법의 재현성 및 성능을 검증하기 위해, PFA-고정 마우스 뇌 조직을 준비하여 실험을 수행하였다. 모든 동물 취급 및 실험은 연세대학교의 실험동물운영위원회 지침에 따라 수행하였다. 8주령의 C57BL/6N 야생형 마우스는 한국 코아텍에서 구입하여 연세첨단과학원 동물시설에서 엄격한 SPF 조건으로 유지하였다.
PFA-고정된 마우스 뇌 조직을 준비하기 위해, 8-10주령 마우스를 3% 이소플루란과 0.8 L/min 산소로 마취하고 2% 이소플루란과 0.8 L/min 산소로 유지한 후, 마우스를 차가운 1X PBS, 차가운 4% PFA 및 1X PBS 용액으로 차례로 경심 관류시켰다. 이후, 관류된 마우스의 뇌 전체를 분리하고, 분리된 뇌는 4% PFA, 1X PBS 용액에 넣고 4℃에서 48시간 동안 진탕하여 고정하였다. 이후, 고정된 뇌 조직은 고정액 교환(FX) 공정을 수행하였으며 (도 2), 분리된 핵을 조합적으로 바코드화하고 서열분석을 수행하였다 (도 1H 및 1I, n=3).
그 결과, 고정액 교환-RNA 서열분석(FX-seq) 방법을 통해 cDNA 합성 수율을 증가시킴으로써 고정된 생물학적 샘플에 있는 전사체 정보를 획득할 수 있음을 확인하였다. 특히, FX-seq 처리군에서는 UMIs (unique molecular identifiers) 및 유전자 수(gene counts)에 관한 데이터 품질을 개선시킴으로써, 미처리군(Ctrl), 트리스-버퍼 처리군(200 mM, Tris Ctrl) 및 트리스 버퍼에 촉매-처리군(Cat. 2)에 비해 단일핵 전사체 정보가 현저하게 회복시켜 명확하게 세포 유형을 확인할 수 있었고, 미토콘드리아 유전자 함량과 같은 품질 관리 지표에 미치는 영향을 최소화하였음을 확인하였다 (도 1J 내지 1L). 또한, FX-seq 방법은 뉴런의 정확한 분류, 특히 중간 가시 뉴런(MSNs, medium spiny neurons)과 억제 뉴런(inhibitory neurons)을 구별하게 할 수 있어 세포 유형 식별을 현저히 향상시킬 수 있음을 확인하였다 (도 1M 내지 1T). 또한, FX-seq 방법은 독립형 및 병합형 UMAP 클러스터링 모두에서 고전적인 분자 분류 기준에 따라 Purkinje 세포, 후각 외피 세포(OECs) 및 대식세포를 포함하는 특정 세포 유형을 더 정확하게 분류할 수 있음을 확인하였다.
실시예 5. 신선한 조직을 이용한 snRNA-seq 방법과 PFA-고정 마우스 뇌 조직을 이용한 FX-seq 방법의 비교
본 발명자들은 신선한 조직을 이용한 snRNA-seq 방법과 PFA 고정 마우스 뇌 조직을 이용한 FX-seq 방법을 비교하는 실험을 수행하였다. 신선한 조직을 이용한 snRNA-seq 방법은 EasySci의 최근 프로토콜을 약간 수정하여 이용하였고(A. Sziraki et al., bioRxiv. 2022, p. 2022.09.28.509825), 매우 짧은 고정 처리(0.1% PFA 10분)를 수행한 후 추출된 핵을 이용하여 수행하였다.
그 결과, 신선한 조직에서 추출된 핵은 높은 전사 범위를 나타냈으며, 강하게 고정된 핵에서의 FX-seq 방법 역시 신선한 조직을 이용한 방법과 유사한 UMIs와 유전자 수를 가진 데이터세트를 생산하였다 (도 3C 및 3D). 다만, 신선한 조직에서 추출된 핵에서의 효소 소화의 부족은 더 높은 세포질 분획과 핵의 불완전한 분리를 야기하였으며 (도 3A 및 3B), 이는 더 높은 미토콘드리아 및 리보좀 RNA와 더 높은 엑손 판독 비율에 의해 확증되었다 (도 3E 내지 3G). 그럼에도, 각 데이터세트에 독립적으로 주석이 달린 동일한 세포 유형(도 3H 및 3I)은 병합된 유전자 매트릭스를 사용하여 감독되지 않은 클러스터링에서 공동 클러스터링되었다 (도 3J 및 3K). 신선한 조직 대 고정된 조직에 FX 처리된 샘플 사이에서의 클러스터 내 세포 분포는 엑손 판독 비율에 기인되며 (도 3L), 이는 동일한 클러스터 내의 각 샘플로부터 차별적으로 발현되는 유전자의 엑손 판독 비율을 대조하여 추가 뒷받됨되었다 (도 3M).
상기 결과로부터, 본 발명의 FX 처리 방법은 강하게 고정된 조직에서의 세포 해상도를 신선한 조직에서 추출된 핵과 유사한 정도로 복원할 수 있음을 확인하였다.
실시예 6. FFPE(formalin-fixed paraffin-embedded) 마우스 뇌 조직을 이용한 FX-seq 방법의 검증
본 발명자들은 FFPE 샘플에 대한 FX-seq 방법의 적용 가능성을 확인하였다. 이를 위해, FFPE 마우스 뇌 조직 샘플을 이용하여 실험을 수행하였으며, FFPE 마우스 뇌 조직은 다음의 방법으로 준비하였다. 8-10주령 마우스를 CO2 챔버에서 안락사시킨 후 즉시 마우스 뇌를 분리하였다. 수득된 조직은 4% PFA, 1X PBS 용액에 넣어 4℃에 넣고 48시간 동안 진탕하였다. 고정액은 일관된 뇌 품질을 보장하기 위해 2-3시간 마다 한번씩 교체하였다. 48시간 후, 강하게 고정된 뇌를 임베딩 카세트에 놓고 다음의 프로토콜에 따라 FFPE 블록에 임베딩시켰다: 1시간 동안 70% 에탄올로 1회 변경, 1시간 동안 80% 에탄올로 1회 변경, 각각 1시간 동안 95% 에탄올 2회 변경, 각각 1시간 동안 100% 에탄올 3회 변경으로 탈수, 각각 1시간 동안 자일렌으로 3회 변경, 각각 1시간 동안 56-58℃로 가열된 파라핀 왁스로 3회 변경, 및 마지막으로 파라핀 블록에 임베딩시켰다. 조직 가공은 Leica ASP 300S 장비를 사용하였고, 파라핀 임베딩은 Leica Arcadia C/H 장비를 사용하였다. 모든 FFPE 임베딩 프로토콜은 연세대학교 에비슨 의생명연구센터 조직병리학과에서 수행하였다.
이후, FX 처리를 수행하기 전에 FFPE 샘플의 균질화, 탈파라핀화 및 재수화를 수행하였다 (도 2). 우선, FFPE 블록을 임베딩 카세트에서 제거하고 150 x 20mm 페트리 접시에 놓았다. 외부 파라핀 왁스는 조직을 제거하지 않도록 주의하면서 면도날을 사용하여 수동으로 제거하였다. 이후, 블록을 4등분하여 5 mm 스테인리스 스틸 비드가 있는 2 mL eppendorf Safe-Lock 튜브에 각각 넣었다. 조직은 화학 흄 후드에서 Tissue Lyser II 장치(Qiagen)를 사용하여 30 Hz에서 4분 동안 균질화하였다. 수집된 조직 용액은 1,000g에서 3분 동안 펠렛화하였다. 상청액을 버리고 펠렛을 자일렌에 재현탁하고 실온에서 5분 동안 인큐베이션하고 1회 반복하였다. 이후, 조직을 차가운 100% 에탄올에 재현탁시키고, 실온에서 5분 동안 인큐베이션하고, 1회 반복하였다. 이후, 90% 및 70% 에탄올에 단일 배양 단계를 수행하였다. 재수화된 조직은 BC 용액(3X SSC, 3% PVSA, 0.025% Tween-20)에 현탁시키고 20 μm 필터(필요한 경우 조직을 먼저 100 μm 필터로 처리)로 여과시켰다. 여과된 조직은 추가적인 가교 처리 전에 BC 용액에서 2회 더 세척하였다. FX 처리는 3개의 FFPE 마우스 뇌 조직 샘플에서 수행하였다 (도 4A).
그 결과, FFPE 프로세싱에 의해 샘플 품질이 감소되었더라도, FX-seq 방법은 전체 세포수 및 확인된 유전자 수를 모두 증가시켰다 (도 4B 내지 4D). 특히, 독립형 및 병합형 UMAP 클러스터링 결과에서는 FX 처리가 피질 해마 전구세포(cortex hippocampal progenitor cells, CTX/HP Proj.), 피질하 뉴런(subcortical neurons, Sub-CTX) 및 억제성 개재뉴런(inhibitory interneurons, Int. Neurons)를 포함하는 특정 세포집단을 명확한 해상도로 제공할 수 있어 세포 유형 주석을 개선하여 추가 정보를 제공할 수 있음을 확인하였다 (도 4E 내지 4L). 반면, FX가 처리되지 않은 대조군 샘플의 서열분석 결과는 특정 세포 유형을 구별하는 정보가 충분하지 않아 일반 뉴런으로 분류되는 것을 확인하였다.
상기 결과로부터, 본 발명의 FX 처리 방법은 FFPE 샘플에서도 RNA 서열분석을 가능하게 하며, 세포 유형 분류의 분해능을 현저하게 향상시키는 효과가 있음을 확인하였다.
실시예 7. FFPE 절편 및 H&E 염색된 절편을 이용한 FX-seq 방법의 검증
본 발명자들은 FFPE 절편 및 H&E(hematoxylin and eosin) 염색된 절편으로 FX-seq 방법의 적용 가능성을 실험하였다. 마우스 뇌 조직의 FFPE 절편 및 H&E 염색된 절편은 다음의 방법으로 준비하였다. 우선, FFPE 블록을 10μm 두께로 절단하였다. 절편화된 FFPE 슬라이드는 샘플 품질을 보존하기 위해 건조시킨 후 실리카겔이 있는 냉장실에 보관하였다. 이후, 10 μm 절편으로 H&E 염색을 수행하였다. H&E 염색은 다음의 프로토콜에 따라 Leica Autostainer XL, CV5030을 사용하여 수행하였다: 각각 7분 동안 자일렌으로 3회 변경, 각각 1분 동안 100% 에탄올로 2회 변경, 각각 1분 동안 95% 에탄올로 2회 변경, 1분 동안 물로 세척, 5분 동안 해리스 헤마톡실린 용액으로 염색, 1분 동안 물로 세척, 3초 동안 1% HCl로 분화, 30초 동안 물로 세척, 3초 동안 0.3% 암모니아 용액 처리, 20-60초 동안 에오신 Y로 염색, 각각 30초 동안 95 % 알코올로 2회 헹굼, 각각 1 분 동안 100 % 에탄올로 3회 탈수, 각각 2분 동안 자일렌으로 3회 교체한다. 모든 절편화 및 염색 프로토콜은 연세대학교 에비슨 의생명연구센터 조직병리학과에서 수행하였다.
이후, FX 처리를 수행하기 전에 FFPE 샘플의 균질화, 탈파라핀화 및 재수화를 수행하였다 (도 2). FFPE 절편은 조직을 면도날로 긁어내어 유리 슬라이드에서 수동으로 제거하였다. 이후, FFPE 절편으로부터 수집된 조직을 FFPE 블록에서와 같이 탈파라핀화하고 재수화하였다. 또한, H&E 염색된 절편 역시 슬라이들에서 수동으로 제거하였다. H&E 염색된 절편은 이미 탈파라핀화되었기 때문에 재수화만 수행하였다. 각 실험 전에는 핵의 수율을 예비적으로 평가하기 위해 FX-seq 프로토콜을 통해 1-2개의 슬라이드를 실행하였다. 이후, FX 처리 및 핵 분리를 수행하였다 (도 2).
그 결과, 하나의 FFPE 절편 또는 H&E 염색된 절편에서 200,000개의 핵이 성공적으로 분리되었다 (도 5A). 다만, 절편화된 FFPE 샘플에서는 전체 UMIs 및 유전자 수가 감소되었다. 그러나, FFPE 절편 역시 FFPE 블록 실험에서와 유사한 클러스터 결과가 관찰됨으로써, FFPE 절편에 대한 FX 처리는 전사체 정보를 보존 또는 회복시킬 수 있음을 확인하였다 (도 5B 및 5C). 또한, H&E 염색된 절편에 대하여 FX-seq 방법을 적용시킨 경우에는 UMIs 및 유전자 수가 감소하고, 미토콘드리아 및 리보좀 RNA 판독이 증가하였다 (도 5B 내지 5E). 이는 제한된 효소 소화 효율 및 가혹한 염색 조건의 영향으로 인해 세포 잔해가 축적되었기 때문일 수 있다. 그럼에도, FFPE 및 H&E 절편의 병합된 전사체 분석 결과에서는 동일한 세포 유형의 공동-클러스터링을 나타냈으며 (도 5F 내지 5K), 이는 FFPE 또는 H&E 절편에 처리된 FX-seq 방법을 통해 일관된 전사체 프로파일을 제공할 수 있음을 의미한다.
다음으로, 절편의 두께와 H&E 염색이 인간 임상 샘플의 서열분석 데이터 품질에 영향을 주는지 확인하는 실험을 수행하였다. 본 발명에 이용된 모든 인간 환자의 샘플은 연세대학교 세브란스병원 기관검토위원회가 정한 범위 내에서 수술 전 서면 동의를 통해 승인되었다. 인간 임상 샘플의 FFPE 임베딩을 위해, 인간 종양 샘플은 연세브란스병원에서 원발성 방광암(=요로상피암(urothelial carcinoma))에서 유래된 전이성 대망 덩어리(metastatic omental mass)로부터 절제된 수술 표본(슬라이드당 대략 2.5 cm x 1.2 cm)을 입수하였다. 모든 수득된 샘플은 즉시 4% PFA, 1X PBS 용액에 넣고 4℃에서 48시간 동안 진탕하여 고정하였다. 강하게 고정된 인간 임상 샘플은 마우스 뇌 조직의 FFPE 임베딩에 사용된 프로토콜과 동일한 방법으로 임베딩하였다. 이후, FFPE 블록을 4μm 또는 10μm 두께로 절단하였고, H&E 염색을 수행하였다 (도 5L). 이후, 샘플의 균질화, 탈파라핀화 및 재수화를 수행하였고, FX 처리 및 핵 분리를 수행하였다 (도 2).
그 결과, 인간 수술 표본의 FFPE 절편 및 H&E 염색된 절편으로부터 수득된 단일핵 전사체는 세포 유형에 따라 일관되게 공동 식별되었다 (도 5M 및 5N). 다만, 4μm FFPE 절편에서는 10μm FFPE 절편에 비해 더 적은 유전자수 및 UMIs가 확인되었고, H&E 염색된 절편에서는 FFPE 절편에 비해 더 적은 유전자수 및 UMIs가 확인되었으며, 미토콘드리아 판독수가 증가하였다 (도 5O 내지 5R). 즉, 절편의 두께와 H&E 염색으로 인해 유전자수, UMIs 및 미토콘드리아 수에 영향을 주었다. 그럼에도, 각 실험군의 회복된 UMIs의 수와 각 세포군당 세포수는 하나의 통합된 그룹으로서의 유사한 특징을 공유함을 확인하였다 (도 5S 및 5T). 상기와 같이, 본 발명의 FX-seq 방법은 확장 가능한 snRNA-seq 방법으로서, 인간 수술 표본에서 준비된 FFPE 절편 및 H&E 염색된 절편으로부터 단일핵 수준의 전사체를 회복시킬 수 있음을 확인하였다 (도 5U).
실시예 8. GIST(gastrointestinal stromal tumor) FFPE 블록을 이용한 FX-seq 방법의 확장성 검증
더 큰 규모의 전사체 프로파일링은 세포 유형에 대한 더 나은 적용 범위를 제공하여 생물학적 과정과 세포 이질성에 대한 더 나은 이해를 향한 다양하고 희귀한 세포 유형의 식별로 이어진다 (J. Cao et al., Nature. 566, 496-502 (2019); J. Cao et al., Science. 370, eaba7721 (2020); 및 C. Qiu et al., bioRxiv. 2023 Apr 5;2023.04.05.535726). 이에 5년 간의 티로신 키나제 억제제(imatinib) 치료에 대한 부분 반응을 보인 후 최근 종양이 진행되어 외과적으로 절제된 GIST (gastrointestinal stromal tumor) 표본에서 얻은 FFPE 블록을 통해 FX-seq 방법의 확장성 및 다양성을 평가하기 위한 실험을 수행하였다. 종양 조직은 소장에서 유래하였으며, 대략 1.5cm x 0.8cm x 1cm로 측정되었다 (도 3A). 수술적으로 절제된 인간 GIST 조직은 즉시 4% PFA로 4℃에서 48시간 동안 고정하였다.
본 발명자들은 단일 실험에서 균질화된 GIST FFPE 블록의 10분의 1에서 약 400만개의 핵을 분리하였고, 핵당 평균 5,000개의 리드로 199,293개 핵의 하위 집합을 프로파일링하였다. 이후, 생성된 서열분석에 대한 로우 데이터는 품질 관리 및 이중선 제거를 위해 추가 처리되어 169,787개의 단일핵 전사체에서 평균 UMIs가 1543.7로 확인되었다 (도 6B 내지 6F). 또한, 분석된 데이터세트는 cDC(conventional dendritic cells) 및 pDC(plasmacytoid dendritic cells)과 같은 희귀 면역세포군을 포함하여 다양한 세포유형의 포괄적인 분류를 나타내었다 (도 6G).
특히, GIST FFPE 블록의 FX-seq 방법으로 관찰된 발현 패턴에 대한 심층 분석을 통해 특정 세포군과 장기간 이마티닙(imatinib) 치료 효과 간의 전환을 밝힐 수 있었다. 구체적으로, 가장 큰 클러스터에서 위장관의 ICC 세포(interstitial cells of Cajal)의 특이적 마커 유전자이자 ICC 유래의 GIST 종양 세포에 대한 마커인 ANO1의 현저한 상향 조절을 확인하였다. 종양 클러스터의 퀘적추론(trajectory inference) 및 PAGA(partition-based graph abstraction) 분석을 통해 정상 ICC (마커: MYH11, MYLK 및 TPM1)에서 증식하는 세포군(마커: CENPF, TOP2A 및 MKI67)으로의 전환을 나타내는 전사체에서의 순차적 변화의 두 가지 뚜렷한 경로를 확인하였다 (도 6H 및 6I). 이후, 증식하는 세포군에 대한 두 가지 경로가 장기간의 이마티닙(imatinib) 치료 후 나타나는 획득된 내성과 관련된 2차 돌연변이로 보고된 KIT exon 17 mutation (p.N822K)을 가진 GIST에서 이마티닙(imatinib)에 대한 내성 메커니즘이 나타나는지 추가로 조사하였다 (B. Liegl et al., J. Pathol. 216, 64-74 (2008); 및 M. C. Heinrich et al., J. Clin. Oncol. 24, 4764-4774 (2006)). 두 경로 모두는 돌연변이 활성화에 의해 GIST의 종양 유발 유전자인 KIT 및 PDGFRA의 순차적으로 과발현되는 것으로 밝혀졌다 (S. Hirota et al., Science. 279, 577-580 (1998); 및 M. C. Heinrich et al., Science. 299, 708-710 (2003)).
Path 1에 따라 전사체는 PCNA, DNMT1 및 UHRF1를 포함하는 DNA 메틸화 관련 유전자의 일시적인 증가된 발현을 보였고, EZH2에 의해 인코딩되는 히스톤 메틸화 효소의 지속적인 상향 조절을 보였다 (도 6J). 이러한 유전자의 상향 조절은 후생적 변형과 관련되며, ALK, ATAD2 및 MYO3A를 포함하는 여러 유전자의 일시적 발현과 관련이 있는 것으로 추측된다 (도 6K). 이러한 변경된 유전자 발현 패턴은 DNMT3B, CIT 및 DIAPH3의 과발현으로 나타나는 전사체 변화를 통해 증식하는 KIT low/PDGFRA high 세포에서 이마티닙(imatinib) 내성을 초래할 수 있다고 추측되었다. 또한, Path 2에 따라 EZH2의 유사한 과발현은 다수 유전자의 비정상적인 발현으로 관찰되지만 DNA 메틸화 유전자에 대한 변화가 없음을 확인하였다 (도 6L). 특히, 종양 집단(도 6L의 클러스터 9)에서 향상된 유전자 발현(GDF15, PURPL, PLEKHG1, GFRA1 및 SYNDIG1)은 증식 집단에서 감소하였고 증식 마커와 함께 유전자의 비정상적인 발현이 수반되었다 (도 6M). 상기 결과로부터, GIST 종양 세포의 증식 집단에서 후생적 변형과 관련된 유전자를 포함하는 두 가지 경로가 이마티닙(imatinib)에 대한 세포 반응과 내성 획득에 대하여 새로운 통찰력을 제공할 수 있음을 확인하였다.
상기와 같이, 본 발명의 FX-seq 방법은 임상 FFPE 샘플에 대한 높은 확장성과 데이터 품질을 입증하였으며, 인간 질병과 관련된 통합 세포 과정의 동적 특성을 이해하는데 도움이 되는 새로운 분자 마커를 발견할 수 있는 기회를 제공할 수 있음을 확인하였다.
실시예 9. CRC(human colorectal cancer) FFPE 절편을 이용한 FX-seq 방법의 추가 검증
본 발명자들은 FX-seq 방법을 사용하여 약 2개월 동안 보관된 CRC(human colorectal cancer) FFPE 슬라이드 절편으로부터 단일핵 전사체를 분석하였다. 병리학자의 주석에 기초하여 확인된 종양(T) 영역은 FFPE 절편의 비종양(NT) 영역과 물리적으로 분리하였다. 각 샘플에 대해 FX 처리 및 핵 분리를 수행하였고, 영역 기원을 근거로 첫 번째 역전사 프라이머를 사용하여 바코드를 표시하였으며, 순차적으로 조합 라벨링과 서열분석을 수행하였다 (도 7A). 이러한 접근 방식을 통해 공간적으로 상황에 맞는 병리학적 주석을 사용하여 FX-seq을 수행할 수 있었다.
서열분석 결과는 면역세포(immune cells), 내피세포(endothelial cells), 장 신경교(enteric glia) 및 상피 계통 세포가 우세한 결합세포(connective cells)를 포함하는 CRC에 존재하는 표준 세포 유형의 존재를 확인하였다 (도 7B 및 7C). 개별 핵의 공간적 기원을 인코딩하는 영역 바코드를 통해 각 클러스터 내의 영역 분포를 식별할 수 있었다 (도 7D 및 7E). 흥미롭게도, 정상 상피 세포와 상이한 큰 상피 계통 클러스터는 영역 기원을 근거로 상피 전구 세포 및 종양 세포로 식별되었다 (도 7F 및 7G). 도 7G의 클러스터에 대한 하위 클러스터 분석에서는 전구세포와 종양에 할당된 각 세포군의 뚜렷한 전사체 프로파일을 확인하였다 (도 7H). 데이터세트에 대해 inferCNV 패키지(broadinstitute/infercnv (2023))를 이용한 각 분석 결과는 정상 상피 세포군과 비교하여 상피 전구 세포와 종양 모두에서 CNV(copy number variation) 상태의 변화를 추론하였다. 기존에 보고된 CRC 샘플의 scRNA-seq과 유사하게, 종양에서는 Chr7p, Chr8q, Chr13q 및 Chr 20p의 식별가능한 증가가 관찰된 반면, 상피 전구세포에는 CNV 상태에서 최소 변경을 나타내었다 (도 7I). 추론된 CNV 결과는 scRNA-seq을 사용한 기존 보고된 CNV 추론의 하위 집합인 것으로 밝혀졌다 (I. Joanito et al., Nat. Genet. 54, 963-975 (2022)). 이를 근거로 확인된 종양 집단은 LGR5+ crypt-bottom stem cell에서 유래된 MSS(microsatellite-stable) iCMS2(intrinsic consensus molecular subtype 2)에 해당한다 (I. Joanito et al., Nat. Genet. 54, 963-975 (2022)). 상기와 같이, FX-seq 방법에 의해 얻은 단일핵 전사체 프로파일은 상행 결장에서 MSS- 및 KRAS-야생형을 갖는 환자의 조직학적 및 분자적 소견과 일치하였다.
또한, FX-seq 방법은 CRC 조직의 복잡한 종양 미세환경(TME)에 대한 통찰력을 제공할 수 있음을 확인하였다. 구체적으로, 섬유아세포 집단에 대한 추가 하위 클러스터링 분석 결과에서는 TME에서 주요 조절자로서 역할을 하는 활성화된 섬유아세포의 하위 집합인 두 개의 CAFs(cancer-associated fibroblasts)를 확인하였다 (도 7J). CAF 집단이 종양 영역으로 편향된 반면, 정상 섬유아세포(NMF)와 그 전구세포는 종양 및 비종양 영역 모두에서 고른 분포를 보였다 (도 7K 및 7L). CAF-A 및 CAF-B 집단이 전사체 상태를 기반으로 확인되었으며, 각 집단에 풍부한 특정 유전자가 확인되었다 (도 4M). CAF-A에 대하여 FAP, PDPN, COL1A2 및 MMP2, CAF-B에 대하여 ACTA2, TAGLN 및 PDGFRA를 포함한 클러스터 특정 유전자의 분석은 이전 연구와 강한 상관관계를 보여준다 (H. Li et al., Nat. Genet. 49, 708-718 (2017)). 결과적으로, 상기 FX-seq 방법을 통해 각 클러스터에 더욱 특이적인 추가 마커 유전자를 밝힐 수 있어 CAF 집단의 이질성에 대한 통찰력을 제공할 수 있음을 확인하였다.
이로써, 본 발명의 FX-seq 방법은 새로운 표본을 얻기 위한 추가 수술 절차 없이, FX-seq를 통해 FFPE 절편으로부터 단일세포 또는 단일핵 수준 분해능의 정보로부터 암 하위 유형을 식별할 수 있어 질병의 진단 분야에서 유용하게 사용될 수 있음을 확인하였다.
전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다. 예를 들어, 단일형으로 설명되어 있는 각 구성 요소는 분산되어 실시될 수도 있으며, 마찬가지로 분산된 것으로 설명되어 있는 구성 요소들도 결합된 형태로 실시될 수 있다.
본 발명의 범위는 후술하는 청구범위에 의하여 나타내어지며, 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 균등 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

Claims (19)

  1. 유기촉매(organocatalyst) 및 백금 기반의 가교제(Pt-based crosslinker)를 포함하는 고정액 교환용 조성물.
  2. 제 1 항에 있어서,
    상기 유기촉매는 2-아미노페닐보론산(2-aminophenylboronic acid)인 것인, 조성물.
  3. 제 1 항에 있어서,
    상기 백금 기반의 가교제는 핵산의 Watson-Crick 염기쌍을 방해하지 않으면서 위치선택적으로 결합하는 것인, 조성물.
  4. 제 1 항에 있어서,
    상기 백금 기반의 가교제는 N7-구아닌 잔기에서 결합을 형성하는 것인, 조성물.
  5. 제 1 항에 있어서,
    상기 백금 기반의 가교제는 하기 화학식 1로 표시되는 화합물인 것인, 조성물:
    [화학식 1]
    Figure PCTKR2024009958-appb-img-000003
    .
  6. 제 1 항에 있어서,
    상기 조성물은 RNase 억제제를 추가적으로 더 포함하는 것인, 조성물.
  7. 제 6 항에 있어서,
    상기 RNase 억제제는 PVSA(polyvinyl sulfonic acid)인 것인, 조성물.
  8. 제 1 항에 있어서,
    상기 조성물은 고정액으로 고정된 생물학적 샘플로부터 고정액을 제거하기 위한 것인, 조성물.
  9. 제 8 항에 있어서,
    상기 생물학적 샘플은 파라포름알데히드(PFA) 고정 또는 포르말린 고정 파라핀 포매(FFPE) 조직의 블록 또는 이의 절편인 것인, 조성물.
  10. 제 1 항에 있어서,
    상기 고정액 교환은 단일세포 또는 단일핵을 분리하기 전에 수행하는 것인, 조성물.
  11. 제 1 항에 있어서,
    상기 고정액 교환은 단일세포 전사체 분석, 단일핵 전사체 분석, 다중 오믹스 분석 및 이의 조합으로 이루어진 군에서 선택되는 것을 수행하기 위한 것인, 조성물.
  12. 제 1 항 내지 제 11 항 중 어느 한 항에 따른 고정액 교환용 조성물을 포함하는 고정액 교환용 키트.
  13. 제 12 항에 있어서,
    상기 키트는 완충액을 추가로 더 포함하는 것인, 키트.
  14. (a) 균질화된 생물학적 샘플에 백금 기반의 가교제가 포함된 용액을 처리하는 단계;
    (b) 상기 (a) 단계 후 펠릿을 분리한 후 유기촉매가 포함된 용액으로 재현탁하는 단계; 및
    (c) 상기 재현탁된 용액을 가열하는 단계를 포함하는 고정액 교환 방법.
  15. 제 14 항에 있어서,
    상기 가열은 50 내지 60℃에서 10분 내지 60분 동안 수행되는 것인, 방법.
  16. 제 14 항에 있어서,
    상기 생물학적 샘플은 파라포름알데히드(PFA) 고정 또는 포르말린 고정 파라핀 포매(FFPE) 조직의 블록 또는 절편인 것인, 방법.
  17. 제 14 항에 있어서,
    상기 백금 기반의 가교제가 포함된 용액 및 유기촉매가 포함된 용액에는 RNase 억제제를 추가적으로 더 포함하는 것인, 방법.
  18. 제 17 항에 있어서,
    상기 RNase 억제제는 PVSA(polyvinyl sulfonic acid)인 것인, 방법.
  19. 제 14 항에 있어서,
    상기 고정액 교환은 단일세포 또는 단일핵을 분리하기 전에 수행하는 것인, 방법.
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