WO2025013446A1 - ポリ（［Ｒ，Ｓ］β－ヒドロキシ酪酸）の反復単位を含むブロック共重合体及び当該共重合体からのナノ粒子、並びにそれらの製造及び用途 - Google Patents

ポリ（［Ｒ，Ｓ］β－ヒドロキシ酪酸）の反復単位を含むブロック共重合体及び当該共重合体からのナノ粒子、並びにそれらの製造及び用途 Download PDF

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University of Tsukuba NUC
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    • C08J3/12—Powdering or granulating

Definitions

  • the present invention relates to block copolymers containing repeating units of poly([R,S] ⁇ -hydroxybutyric acid), and more specifically to poly(ethylene glycol)-b-poly([R,S] ⁇ -hydroxybutyric acid) (PEG-b-PBHB) copolymers, as well as their production methods and uses.
  • PEG-b-PBHB poly(ethylene glycol)-b-poly([R,S] ⁇ -hydroxybutyric acid)
  • Beta-hydroxybutyrate one of the endogenous ketone bodies, is involved in various signaling pathways (e.g., energy metabolism, inflammatory responses), so that its supplementation is beneficial for the treatment of many diseases.
  • Non-Patent Document 1 reported that if continuous supply of BHB is effective, injection of BHB reduces renal ischemia-reperfusion injury.
  • BHB is a low molecular weight compound that is easily eliminated from the body after administration. Therefore, if it is possible to provide a sustained release (or sustained release) formulation of BHB, it would be even more advantageous to utilize the physiological activity of BHB in therapeutic applications.
  • Patent Document 1 discloses that sustained release nanoparticles of L-DOPA (Nano L-DOPA ) prepared from poly(ethylene glycol)-b-poly(L-DOPA) show advantageous therapeutic effects and reduce adverse effects due to the improved pharmacokinetic profile of L-DOPA.
  • diblock copolymers were synthesized by esterification between PEG derivatives and commercially available natural poly([R]- ⁇ -hydroxybutyrate) hydrolysates of bacteria with high molecular weight (MW 200,000-1,000,000 g/mol). This results in less flexibility in controlling the number of BHB units contained in the copolymer.
  • poly([R]- ⁇ -hydroxybutyrate) exhibits a high tendency to crystallize and forms crystals quickly, which makes spontaneous self-organization in water difficult and requires strict conditions for the preparation of nanoparticles (CA 2430442 A1, hereinafter sometimes referred to as Patent Document 2).
  • Patent Document 2 proposes the preparation of nanoparticles from such copolymers by a time-consuming evaporation method, in which the block copolymer is continuously stirred in the form of an O/W emulsion for a long period of time (i.e., 2 weeks) and the organic phase is slowly evaporated to prepare the desired nanoparticles.
  • the present invention aims to provide a means, including a formulation, that can sustained- or extended-release BHB, which has physiological activity involved in various signal transduction pathways, etc.
  • poly( ⁇ -hydroxybutyrate) (hereinafter sometimes referred to as "PBHB”) is a hydrophobic polyester that aggregates in an aqueous environment and is therefore not suitable for drug administration via injection. Therefore, the present invention further aims to provide a material that can be stably prepared and exists stably in an aqueous environment.
  • BHB has one carboxyl group and one hydroxyl group in its structure, it can bond with each other through ester bonds to form a polymer.
  • polymerized BHB i.e., poly( ⁇ -hydroxybutyrate) (PBHB)
  • PBHB poly( ⁇ -hydroxybutyrate)
  • PEGylation, coating e.g., PEGylation, coating
  • the diblock copolymers obtained by esterification reaction between PEG derivatives and natural poly([R]- ⁇ -hydroxybutyric acid) hydrolysis products disclosed in the prior art documents the latter in particular has a high tendency to crystallize as described above, so that it is difficult to prepare the self-assembly compositions thereof.
  • Nano BHB nano-sized polymer micelles
  • A represents a hydrogen atom, an unsubstituted or substituted C 1 -C 12 alkyl, an unsubstituted or substituted C 1 -C 12 alkoxy, or an unsubstituted or substituted aryl, and when substituted, the substituent is a C 1 -C 4 alkyl, a C 1 -C 4 alkoxy, an aryl, a formyl, a phenylamino, a phenethylamino, or a group represented by the formula R 1 R 2 CH- (wherein R 1 and R 2 are independently C 1 -C 4 alkoxy, or R 1 and R 2 together represent -OCH 2 CH 2 O-, -O(CH 2 ) 3 O-, or -O(CH 2 ) 4 O-); R represents an unsubstituted or substituted C 1-6 alkyl, C 1-4 alkylenecarbonyloxy-unsubstituted or substituted C
  • Aspect 2 Nano-sized polymeric micelles or nanoparticles comprising the block copolymer described in aspect 1.
  • variable groups or variable moieties in each formula in the reaction scheme are the same as defined for the copolymer represented by formula I in embodiment 1, and X represents a halogen.
  • a method for preparing nano-sized polymeric micelles or nanoparticles of a block copolymer represented by formula I comprising the steps of: adding water dropwise to a stirred solution of a plurality of molecules of a block copolymer represented by formula I dissolved in a water-miscible organic solvent; dialyzing the mixture against water through a dialysis membrane to form nano-sized polymeric micelles or nanoparticles; preparing an aqueous solution containing the nanoparticles; and then removing aggregates from the aqueous solution.
  • a pharmaceutical preparation comprising as an active ingredient the copolymer represented by formula I described in aspect 1 or the nano-sized polymeric micelle or nanoparticle described in aspect 2, and further comprising a physiologically acceptable diluent or excipient.
  • a method for preventing or treating one or more of acute kidney disease, inflammatory disease, brain disease, and cancer by administering an effective amount of the copolymer represented by formula I described in aspect 1 or the nanosized polymeric micelle or nanosized polymeric micelle described in aspect 2 to a subject or patient in need of treatment.
  • Aspect 8 Formula II: In the formula: A, R, m, n, and p are as defined for the copolymer represented by formula I in embodiment 1; Each ⁇ -hydroxyl butyric acid unit in the repeating unit marked with m is present in an equivalent amount of the [R] enantiomer and the [S] enantiomer at random relative to each other. or an alkali metal (Li, K, or Na) salt thereof.
  • the present invention provides a diblock copolymer that forms nano-sized polymer micelles or nanoparticles that are stable and well-dispersed in water and therefore suitable for pharmaceutical use, and that can sustainedly or slowly release ⁇ -hydroxybutyric acid in vitro or in vivo, which has physiological activity involved in various signal transduction pathways, etc.
  • the present invention provides a pharmaceutical preparation that can be used, for example, for the prevention or treatment of acute kidney disease, etc.
  • FIG. 1 is a conceptual diagram of the formation of nano-sized polymeric micelles or nanoparticles provided by the present invention.
  • 1 shows the 1 H-NMR spectrum (A) and the 1 C-NMR spectrum (B) of the ⁇ -end-modified copolymer produced in Production Example 1.
  • FIG. 2 is a graph showing the results of gel filtration chromatography of the ⁇ -terminal-modified copolymer.
  • 1 is a graph showing data relating to (2) polymerization (polymerization kinetics) in Production Example 1.
  • 1 is a graph showing data relating to copolymers having different degrees of polymerization in Preparation Example 1 (3).
  • FIG. 1A and 1B are diagrams showing the results of measurement of the hydrodynamic size of Nano BHB prepared in Production Example 2 by DLS method (in water) and (in saline), respectively, and a transmission electron microscope (TEM) image (C).
  • FIG. 2 is a diagram showing a comparison of 1 H NMR spectra of the ⁇ -terminal unmodified copolymer produced in Production Example 3 and the corresponding modified copolymer, and the results of their DSL measurements.
  • 1 is a graph showing the release characteristics of BHB from Nano BHB under the influence of esterase in vitro in Test Example 1.
  • FIG. 1 shows the in vivo release characteristics of BHB from Nano BHB after intraperitoneal injection in Test Example 2, with graph (A) showing the change in BHB level over time in plasma and graph (B) showing the area under the curve for BHB in plasma.
  • FIG. 1 shows the in vivo release characteristics of BHB from Nano BHB after subcutaneous injection in Test Example 3.
  • FIG. 1 shows the change in BHB level over time in plasma (A), the change in BHB level over time in the liver (B), and the change in BHB level over time in the kidney (C).
  • FIG. 1 shows the area under the curve for BHB in the kidney.
  • FIG. 1 shows a data graph relating to the therapeutic effect of subcutaneous injection of Nano BHB on cisplatin-induced acute kidney injury (AKI) in Test Example 4, together with a scheme of the animal experiment.
  • 1 shows a graph of data on the therapeutic effect of Nano BHB on AKI by forced oral administration in Test Example 5, together with a scheme of the animal experiment.
  • FIG. 1 shows a graph of data on the antidepressant effect of Nano BHB administered orally and ad libitum via the forced swimming test in healthy mice in Test Example 6, together with a scheme of the animal experiment.
  • 1 shows a graph of data regarding the effect of Nano BHB on survival of mice with ulcerative colitis in Test Example 7, together with a scheme of the animal experiment.
  • 1 is a graph showing the results of measuring the cytotoxicity of Nano BHB and BHB after incubating them with BAEC cells for 24 hours in Toxicity Test Example 1.
  • 1 is a graph showing data on the confirmation of toxicity of Nano BHB by subcutaneous injection of 2-1 in Toxicity Test Example 2.
  • 2 is a graph showing data on the confirmation of toxicity of Nano BHB by oral administration of 2-2 in Toxicity Test Example 2.
  • Nano-sized polymeric micelles and nanoparticles are used as interchangeable terms and refer to polymeric micelles or particles whose particle size distribution is in the nano-sized range when the particle size distribution of polymeric micelles is measured in an aqueous medium by dynamic light scattering (DLS). From the viewpoint of stability, typical examples include particles of 5 nm to 500 nm, preferably 5 nm to 100 nm, and more preferably 7 nm to 80 nm, although this is not limited thereto.
  • nano-sized polymeric micelles or nanoparticles will mainly be referred to as nanoparticles. A conceptual diagram of the formation of such nanoparticles is shown in Figure 1.
  • the nanoparticles are formed from a block copolymer containing a diblock of a poly(ethylene glycol) (PEG) segment and a poly([R,S] ⁇ -hydroxybutyrate) (PBHB) segment, in particular, a plurality of molecules of a block copolymer in which the COOH group at the ⁇ -terminus is protected by a suitable hydrophobic group, and that in an aqueous environment (aqueous solution or in vivo), they can exist as so-called core-shell polymeric micelles, with the (PBHB) segment as the core and the (PEG) segment as the shell.
  • PEG poly(ethylene glycol)
  • PBHB poly([R,S] ⁇ -hydroxybutyrate)
  • the copolymer is as defined in embodiment 1 above, and may be collectively referred to as poly(ethylene glycol)-b-poly([R,S]- ⁇ -hydroxybutyric acid) copolymer (hereinafter, sometimes referred to as "PEG-b-PBHB"; ⁇ -end modified).
  • PEG-b-PBHB poly(ethylene glycol)-b-poly([R,S]- ⁇ -hydroxybutyric acid) copolymer
  • the [R] and [S] isomers do not necessarily have to be present in strictly "equivalent amounts" or "50%" of each other.
  • one of the isomers may be present in excess to the extent that it does not adversely affect the intended use, or in the copolymer, depending on the raw materials used, etc., either isomer may be present in a slight excess of one type of isomeric unit depending on the production method, storage conditions, etc., and it is understood to be within the technical scope of the present invention as long as it meets the purpose of the present invention.
  • Variable groups or moieties defining the copolymer A corresponds to a protecting group for the ⁇ -terminal OH group of the PEG segment similar to that of the ⁇ -terminal of the PEG segment disclosed in Patent Document 1, and R corresponds to a protecting group or modifying group for the ⁇ -terminal COOH of PEG-b-PBHB.
  • R is not limited as long as it is a hydrophobic group that acts to promote the formation of nanoparticles by increasing the hydrophobicity of the PBHB segment of PEG-b-PBHB, particularly a group containing a hydrocarbon group.
  • R represents, without being limited thereto, unsubstituted C 1-3 alkyl, C 1-2 alkylenecarbonyloxy-unsubstituted or substituted C 1-21 alkyl, C 1-2 alkylenecarbonyloxy-unsubstituted or substituted C 3-7 cycloalkyl, C 1-2 alkylenecarbonyloxy-unsubstituted or substituted aryl, C 1-2 alkylenecarbonyloxy-unsubstituted or substituted adamantyl, C 1-2 alkylene-unsubstituted or substituted aryl, C 1-2 alkylene-unsubstituted or substituted adamantyl, or a C 1-2 alkylene-unsubstituted or substituted cholesterol residue, wherein the substituent when substituted is preferably a group representing C 1-4 alkyl , C 1-4 alkyloxy or aryl, and when referred to as C 1-4 alkylenecarbonyl
  • m is an integer from 20 to 200, preferably an integer from 30 to 180, more preferably an integer from 45 to 80, and n is an integer from 3 to 300, preferably an integer from 10 to 100, more preferably an integer from 20 to 100.
  • p is an integer that varies correspondingly to, for example, the oxidation of the other terminal moiety of ⁇ -terminal protected PEG, --CH 2 CH 2 OH, to --CH 2 COOH by a method known in the art in the preparation of a PEG macroinitiator, or the reaction of the OH at the terminal moiety with a halo-C 1-6 alkyl carboxylate to form an ether bond, followed by hydrolysis of the ester moiety to convert it to a carboxyl group (-COOH).
  • p is preferably an integer of 1 to 3.
  • the alkyl or alkylene groups or moieties mentioned above can be linear or branched.
  • Specific examples of C 1 -C 12 alkyl include, but are not limited to, methyl, ethyl, propyl, isopropyl, butyl, sec-butyl, tert-butyl, pentyl, hexyl, heptyl, nonyl, undecyl, tridecyl, heptadecyl, nonadecyl, etc.
  • Preferred are C 1-6 alkyls.
  • the recited alkylenes correspond to the recited alkyls with the recited carbon atoms.
  • C 3-7 cycloalkyl can be cyclopropyl, cyclobutyl, cyclopentyl, cyclohexyl, cycloheptyl, and aryl can be phenyl, biphenyl, naphthyl.
  • the copolymer may be produced by any method as long as it has a structure represented by formula I and is known per se in the art. However, it may be conveniently produced based on the reaction scheme 1 described in embodiment 3.
  • the organic solvent that does not adversely affect the reaction may be an aprotic solvent, particularly a dipolar aprotic solvent, such as tetrahydrofuran (THF), dioxane, glyme, or dimethylformamide (DMF).
  • the anionic polymerization catalyst that generates the metal cation represented by M + may be an alkali metal aromatic adduct, such as K-naphthalene, Na-naphthalene, Na-biphenyl, K-biphenyl, or K-benzophenone.
  • reaction scheme 1 a slight molar excess of the alkali metal aromatic adduct is added to the PEG derivative represented by formula (1) to prepare a PEG initiator represented by formula (2), and then, via the thus prepared initiator, [R,S]- ⁇ -lactone is subjected to ring-opening polymerization in the presence of a crown ether, for example, 18-crown-6-ether, if necessary.
  • a crown ether for example, 18-crown-6-ether
  • These reactions are preferably carried out under a nitrogen atmosphere.
  • the amount of ⁇ -lactone used can be selected according to the number m of the repeating unit of [R,S]- ⁇ -hydroxybutyric acid in the copolymer represented by formula I to be targeted.
  • the ring-opening polymerization reaction may be carried out by determining the amount of ⁇ -lactone in consideration of the growing end growing in a living manner, or by appropriately terminating the polymerization reaction using a halogen substitution agent to be described later, thereby controlling the molecular weight or the number m of the repeating unit.
  • the number n of the repeating unit of ethylene glycol in the copolymer represented by formula I can be controlled by appropriately selecting the number of the corresponding ethylene glycol units in the prepared PEG derivative.
  • the polymerization reaction can usually be carried out for one or two days to several days.
  • the halogen substitution agent used for terminating the reaction or protecting the ⁇ -terminus represented by RX, has R selected from the groups defined for R above, and X can be a halogen atom, particularly a bromine atom or an iodine atom.
  • the copolymer represented by formula I ( ⁇ -terminus modified) thus obtained can be separated and obtained from the reaction mixture by precipitation in a poor or non-solvent for the copolymer (e.g., a mixture of isopropyl alcohol and n-hexane).
  • the preparation or production of nanoparticles from the copolymer represented by formula I ( ⁇ -terminal modified) can be carried out according to the preparation method described in aspect 4.
  • the copolymer represented by formula II may be contained as an ⁇ -terminal unprotected form, for example, up to 25 mol % of the previous copolymer, so long as it is not contrary to the object of the present invention.
  • the water-miscible organic solvent may be a good solvent that can easily dissolve the copolymer of formula I ( ⁇ -terminal modified), such as DMF.
  • the solution thus dissolved is stirred as vigorously as possible while an amount of water approximately equal to that of the solution is added dropwise to prepare a mixture.
  • the mixture is dialyzed against 20 to 40 times the amount of water of the untreated solution through an RC dialysis membrane with an appropriate molecular weight cutoff (e.g., 3.5 kDa) for 1 to 3 days (if necessary, the water is replaced twice a day).
  • the nanoparticle-containing solution thus obtained from which the organic solvent and unreacted raw materials have been removed may be used to remove aggregates coexisting in the solution using a filter with an appropriate pore size.
  • the nanoparticles (Nano BHB ) present in the aqueous solution or aqueous suspension usually have a dynamic mean diameter of 7 or 10 nm to 800 nm as measured by DLS, and among these, those having a more stable diameter of 7 nm to 80 nm may be mentioned.
  • Nano BHB can thus be provided as a formulation for oral administration or parenteral administration (intraperitoneal administration, intravenous injection, subcutaneous injection, etc.) containing a physiologically acceptable diluent or excipient, if necessary.
  • Such diluents can be sterile water, saline, solutions containing physiologically acceptable buffers, etc., and further additives can be, for example, sorbitol, dextrin, glucose, mannitol, amino acids (e.g., glycine, isoleucine, valine, methionine, glutamic acid, etc.), etc.
  • Nano BHB when Nano BHB is injected into a living body, they accumulate in the damaged area due to the enhanced vascular permeability and retention (EPR) effect, followed by the disintegration of the nanoparticles and the sustained release of BHB due to enzymatic hydrolysis of PBHB.
  • EPR enhanced vascular permeability and retention
  • the use of Nano BHB improves the pharmacokinetics of low molecular weight BHB and enhances its bioactivity.
  • poly(ethylene glycol)-b-poly([R,S]- ⁇ -hydroxybutyrate) shows a protective effect against acute kidney injury using experimental animals.
  • dosage forms of pharmaceutical preparations include liquids (including oral solutions, suspensions, emulsions, and syrups), solids (including tablets, pills, sublingual tablets, capsules, drops, and lozenges), granules, powders, and other powders.
  • Solids can also be made into dosage forms with coatings known in the art, such as sugar-coated tablets, gelatin-encapsulated tablets, enteric-coated tablets, film-coated tablets, double-layered tablets, and multi-layered tablets, as necessary.
  • each dosage form may be within the range of dosage forms known in the art, and additives such as solubilizers, pH adjusters, carriers, excipients, diluents, binders, disintegrants, lubricants, emulsifiers, bulking agents, colorants, flavorings, sweeteners, stabilizers, and preservatives can be included.
  • additives such as solubilizers, pH adjusters, carriers, excipients, diluents, binders, disintegrants, lubricants, emulsifiers, bulking agents, colorants, flavorings, sweeteners, stabilizers, and preservatives can be included.
  • Nano BHB the active ingredient in these preparations
  • the dosage and frequency of administration of Nano BHB is applied within an optimal concentration range depending on the age, sex, condition, severity of the disease, etc. of the patient, but it is preferable that the amount of Nano BHB administered per day is about 10 ⁇ mg to 1 g per kg of body weight, more preferably 0.1 mg to 100 mg, and this may be administered in 1 to 3 separate doses, but since this pharmaceutical preparation has high bioavailability, it can be expected to be effective even with a single administration per day.
  • the specific dosage, administration method, and frequency of administration can be determined by those skilled in the art through animal experiments or experimental administration to humans, with reference to various literature, etc.
  • Step 2 Under N2 flow, CH3O- ( CH2CH2O ) n - CH2COOH (2 g, 1 mmol) prepared as above was dissolved in THF (15 mL), followed by the addition of potassium naphthalene 0.9 M/hexane (1.5 mL, 1.35 mmol). Then, 18-crown-6 ether 1 M/THF (2 mL, 2 mmol) was introduced into the mixture obtained above, followed by the addition of [R,S]- ⁇ -butyrolactone (obtained from Tokyo Chemical Industry Co., Ltd., 4 mL, 49 mmol).
  • reaction was stopped by adding ethyl bromide (4 mL, 33 mmol).
  • ethyl bromide 4 mL, 33 mmol.
  • the reaction mixture was precipitated in IPA/n-hexane (20/80), and the product was collected by centrifugation (9000 rpm, 10 min) and dried under reduced pressure.
  • Preparation Example 2 Preparation of Nano BHB Nanoparticles (1) Poly(ethylene glycol)-b-poly([R,S]- ⁇ -hydroxybutyrate) (PEG-b-PBHB) copolymer ( ⁇ -end modified) (5.6 g) prepared as described in step 2 of Preparation Example 1 was dissolved in 40 mL of DMF. Then, 40 mL of MiLiQ water was added dropwise to this solution under vigorous stirring. The whole mixture obtained was dialyzed against 2 L of MiLiQ water through a 3.5 kDa RC dialysis membrane for 3 days (water was changed twice a day).
  • PEG-b-PBHB Poly(ethylene glycol)-b-poly([R,S]- ⁇ -hydroxybutyrate) copolymer ( ⁇ -end modified) (5.6 g) prepared as described in step 2 of Preparation Example 1 was dissolved in 40 mL of DMF. Then, 40 mL of MiLiQ water was added dropwise to this solution under vigorous
  • the nanoparticle solution was filtered through a 0.2 ⁇ m-pore size filter to remove aggregates and then sterilized.
  • nanoparticles in saline were prepared by mixing the nanoparticle solution with 9% NaCl (9:1). All of the nanoparticles were stored at 4° C. for further use.
  • (C) is the result of a transmission electron microscope.
  • the characteristics of each copolymer having a different polymerization degree are summarized in Table 1 below.
  • Production Example 3 Poly(ethylene glycol)-b-poly([R,S]- ⁇ -hydroxybutyric acid) (PEG-b-PBHB) copolymer ( ⁇ -end unmodified) CH 3 O-(CH 2 CH 2 O) n -CH 2 CO-(OCH(CH 3 )CH 2 CO) m OH
  • steps 1 and 2 of Production Example 1 were repeated, except that in the polymerization in step 2 of Production Example 1, instead of "adding ethyl bromide acetate (4 mL, 33 mmol) to terminate the reaction," water or acetic acid was added to terminate the reaction. In this manner, an ⁇ -terminal unmodified copolymer and the like were produced.
  • Nano BHB can release free BHB under the influence of esterase in vitro, providing evidence for our strategy of using Nano BHB as a BHB source (see (A)).
  • Nano BHB also releases BHB slower but is more stable than homogeneous PBHB polymer (see (B)).
  • Test Example 2 In vivo release of BHB by intraperitoneal injection of Nano BHB (1)
  • ICR male mice (6 weeks old) were administered Nano BHB or sodium ⁇ -hydroxybutyrate by intraperitoneal injection at a dose of 345 mg equivalent of BHB/kg, respectively.
  • mice were sacrificed and plasma was collected. Plasma samples were immediately frozen in liquid nitrogen and stored at -80°C for further analysis. BHB levels in plasma samples were measured by LC-MS/MS system.
  • Test Example 3 In vivo release of BHB by subcutaneous injection of Nano BHB (1)
  • ICR male mice (6 weeks old) were administered Nano BHB or sodium ⁇ -hydroxybutyrate by subcutaneous injection at a dose of 345 mg equivalent of BHB/kg, respectively.
  • mice were sacrificed and plasma, kidney, and liver were collected.
  • Plasma and tissue samples were immediately frozen in liquid nitrogen and stored at -80°C for further analysis.
  • BHB levels in plasma, kidney, and liver were measured by LC-MS/MS system.
  • Nano BHB did not significantly increase the levels of BHB in the blood, but did increase the levels of BHB in the kidney and liver.
  • Test Example 4 Protective effect of Nano BHB against acute kidney injury caused by subcutaneous injection (1)
  • C57BL/6J male mice (8 weeks old) were divided into 4 groups for different treatments.
  • Acute kidney injury was induced by intraperitoneal injection of cisplatin (20 mg/kg).
  • mice Seventy-two hours after cisplatin challenge, mice were sacrificed to collect plasma and kidneys. Renal function was assessed by measuring the levels of blood urea nitrogen (BUN), creatinine (CRE), and aspartate transaminase (AST).
  • BUN blood urea nitrogen
  • CRE creatinine
  • AST aspartate transaminase
  • Test Example 5 Therapeutic effect of Nano BHB on acute kidney injury caused by oral gavage (1)
  • Male C57BL/6J mice (8 weeks old) were divided into four groups and were given different treatments.
  • Acute kidney injury was induced by intraperitoneal administration of cisplatin (20 mg/kg).
  • BUN blood urea nitrogen
  • CRE creatinine
  • AST aspartate transaminase
  • Nano BHB shows a superior therapeutic effect to sodium BHB when administered by oral gavage every two days, as seen from the lower values of BUN, CRE, ALT, and AST. This suggests that the effect of oral gavage of Nano BHB is sustained, and it can be seen that the use of Nano BHB allows for a reduction in the frequency of drug administration compared to conventional low molecular weight BHB.
  • Test Example 6 Antidepressant effect of Nano BHB by free intake (1)
  • Male C57BL/6 mice (9 weeks old) were given either water, Nano BHB (20 mM BHB equivalent), or sodium ⁇ -hydroxybutyrate (20 mM BHB equivalent) via a free drinking bottle for 3 days.
  • the forced swimming test described in Nature 1977, 266:730-732 was performed with some modifications.
  • each mouse was placed in a 2 L plastic beaker filled with water at 25°C at a water level where the mouse's tail did not touch the bottom, and behavior for 6 minutes was recorded with a video recorder, and the time of swimming behavior (mobility) and floating behavior (immobility) were measured.
  • Test Example 7 Effect of Nano BHB on survival of mice with ulcerative colitis (1)
  • Male C57BL/6J mice (7 weeks old) were allowed to freely consume water (healthy mice) or 2.5% dextran sodium sulfate (DSS). Mice drinking DSS were forcefully orally administered 0.2 mL/mouse of either water, sodium ⁇ -hydroxybutyrate, or Nano BHB (dosage: 70 mg/day in terms of BHB/kg) every 2 days. The survival rate of the mice was observed for 16 days.
  • Nano BHB tends to improve the survival rate of mice with DSS-induced colitis.
  • Toxicity Test Example 1 Cytotoxicity of Nano BHB (1)
  • Bovine aortic endothelial cells (BAEC) (obtained from RIKEN, Tsukuba, Japan) were pre-seeded on 96-well plates and incubated with either Nano BHB or BHB at different concentrations ranging from 0 to 25.4 mM BHB in the medium. After 24 hours, the medium was discarded, followed by addition of 100 ⁇ L of medium containing 10 ⁇ L of WST agent and incubation for 4 hours. In the final step, cell viability was measured based on the ratio of optical signals at 450 nm between the test wells and the water-treated wells in each well.
  • BUN blood urea nitrogen
  • CRE creatinine
  • AST aspartate transaminase
  • FIG. 17 The results are shown in Figure 17 and Table 3.
  • the figure shows data on toxicity when Nano BHB was orally administered to mice every 2 days, with (A) showing the change in body weight of the test animals and (B) showing the weight of the spleen, liver and pancreas 6 days after the first administration.
  • Nano BHB did not affect body weight, organ weight, or overall blood components, suggesting the safety of oral administration of Nano BHB .
  • AST, CRE, etc. a decrease in functional biomarkers

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Abstract

本明細書では、ポリ（エチレングリコール）－ｂ－ポリ（［Ｒ，Ｓ］－β－ヒドロキシ酪酸）（ＰＥＧ－ｂ－ＰＢＨＢ）共重合体（ω－末端修飾済）及び生体内で低分子β－ヒドロキシ酪酸を持続放出又は徐放できる、当該共重合体から形成されたナノサイズの高分子ミセル又はナノ粒子、並びにこれらの製造又は調製方法又はナノ粒子の医薬用途が開示される。前記ナノ粒子は、β－ヒドロキシ酪酸を生体内で持続放出又は徐放できるので、β－ヒドロキシ酪酸が本来有している生理活性を生体内で発揮することができる。

Description

ポリ（［Ｒ，Ｓ］β－ヒドロキシ酪酸）の反復単位を含むブロック共重合体及び当該共重合体からのナノ粒子、並びにそれらの製造及び用途
　本発明は、ポリ（［Ｒ，Ｓ］β－ヒドロキシ酪酸）の反復単位を含むブロック共重合体に関し、より具体的には、ポリ（エチレングリコール）－ｂ－ポリ（［Ｒ，Ｓ］β－ヒドロキシ酪酸）（ＰＥＧ－ｂ－ＰＢＨＢ）共重合体、並びにそれらの製造方法及び用途に関する。
　体内ケトン体の一つであるβ－ヒドロキシ酪酸（ＢＨＢ）は、種々のシグナル伝達経路（例えば、エネルギー代謝、炎症反応）に関与するので、そのサプリメントは多くの疾患の処置に利益をもたらす。例えば、Ｔａｊｉｍａ　Ｔ．ｅｔ．ａｌ．，Ｋｉｄｎｅｙ　ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，２０１９，９５（５），１１２０－１１３７（以下、非特許文献１と称する場合がある。）は、ＢＨＢの連続供給に効果があるなら、ＢＨＢの注入が腎虚血再灌流障害を低下すると報告している。しかしながら、ＢＨＢは、投与後に身体から容易に排除される低分子化合物である。そのため、ＢＨＢの徐放性（又は持続放出性）製剤を提供することが可能であるなら、治療用途においてＢＨＢの生理活性を利用することにとってより一層有利であろう。
　現在の徐放性製剤に関する戦略の一つは、ナノ粒子及び両親媒性共重合体の崩壊を介して低分子化合物を放出できる低分子化合物の高分子量化を目差し、ＰＥＧ化により両親媒性共重合体を製造し、次いで当該共重合体からナノ粒子を調製することにある。例えば、ＷＯ　２０２０／１６６４７３（以下、特許文献１と称する場合がある。）には、ポリ（エチレングリコール）－ｂ－ポリ（Ｌ－ＤＯＰＡ）から調製されたＬ－ＤＯＰＡの徐放性ナノ粒子（ＮａｎｏＬ－ＤＯＰＡ）は、Ｌ－ＤＯＰＡの薬動力学的プロファイルが改善されることにより、有利な治療効果を示すとともに、不利益な効果を低下することを開示している。
　実際に、数々の従来の研究論文が、ナノ粒子調製の試みと共にポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）とポリ（β－ヒドロキシ酪酸）（ＰＢＨＢ）のジブロック共重合体の合成について報告している（例えば、Ｊｅｏｎｇ，Ｋ．Ｈ．ｅｔ．ａｌ．，Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２００８，１６，４１８－４２３、Ｒａｖｅｎｅｌｌｅ，Ｆ．ｅｔ．ａｌ．，Ｂｉｏｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ，２００３，４（３），８５６－８５８、参照）。
　これらの研究では、ＰＥＧ誘導体と、市販の細菌由来で高分子量（ＭＷ２００，０００～１，０００，０００ｇ／ｍｏｌ）を持つ天然ポリ（［Ｒ］－β－ヒドロキシ酪酸）加水分解産物の間のエステル化反応によるジブロック共重合体が合成されている。そのため、共重合体に含まれるＢＨＢ単位の数を制御するための柔軟性が乏しくなる。くわえて、ポリ（［Ｒ］－β－ヒドロキシ酪酸）は、高い結晶化傾向を示し、迅速に結晶を形成するので、水中で自然に起こる自己組織化を困難にし、ナノ粒子の調製に厳格な条件を要求する（ＣＡ　２４３０４４２　Ａ１、以下、特許文献２と称する場合がある。）。例えば、特許文献２には、前記のような共重合体から時間のかかる蒸発方法によるナノ粒子の調製について提案されており、そこでは、ブロック共重合体をＯ／Ｗエマルションの形態において長時間（すなわち、２週間）かけて連続的に攪拌して有機相がゆっくり蒸発されることにより目的とするナノ粒子が調製されている。
　したがって、上述した従来技術における問題点又は難点がなく、目的とする生理活性を有するβ－ヒドロキシ酪酸を持続放出又は徐放することのできる手段を入手できれば、当該技術分野の進歩に寄与することができるであろう。
　薬理学の観点に立てば、低分子ＢＨＢ薬（β－ヒドロキシ酪酸ナトリウム）は、投与（特に、注入経路での）後にイン・ビボ（ｉｎ　ｖｉｖｏ）で非常に短い半減期を示すので、その生理活性は低下する。したがって、本発明は、種々のシグナル伝達経路等に関与する生理活性を有するＢＨＢを持続放出又は徐放できる製剤をはじめとする手段を提供することを目的とする。
　材料設計の観点に立てば、ポリ（β－ヒドロキシ酪酸）（以下、“ＰＢＨＢ”と称する場合がある。）は疎水性のポリエステルであり、水性環境下で凝集をもたらすため、注入経路による薬物投与には好適といえない。したがって、本発明は、さらに、水性環境下で安定に調製でき、かつ安定に存在し得る材料を提供することを目的とする。
　本発明者が知る限り、天然の又は微生物若しくは植物由来のポリ（［Ｒ］－β－ヒドロキシ酪酸）とは異なり、化学合成されたＰＢＨＢが医薬用途等に向けられる天然のＢＨＢと同様の生理活性を示すことは文献未載である。
　一方で、ＢＨＢは、構造中に一つのカルボキシル基と一つのヒドロキシル基が同時に存在することにより、エステル結合を介して相互に結合して重合体を形成することができる。実際に、重合形態のＢＨＢ、すなわち、ポリ（β－ヒドロキシ酪酸）（ＰＢＨＢ）は、β－ブチロラクトンを重合させることにより安価に製造することができ、化学修飾（例えば、ＰＥＧ化、コーティング）することも容易である。したがって、仮に、化学合成されたＰＢＨＢ、特に、ポリ（［Ｒ，Ｓ］β－ヒドロキシ酪酸）が、ｉｎ　ｖｉｖｏでＢＨＢが本来有しているのと同様な生理活性を発揮できる材料を提供できるのであれば、前記課題を解決するための可能性のあるアプローチの一つになるであろう。
　従来技術文献に開示されたＰＥＧ誘導体と天然ポリ（［Ｒ］－β－ヒドロキシ酪酸）加水分解生成物の間のエステル化反応によるジブロック共重合体は、特に、後者が前述したように結晶化する傾向が高いため、そもそも、それらの自己組織化組成物を調製すること自体が困難であった。これに対し、都合よくは、ＰＥＧマクロイニシエーターの存在下で「Ｒ，Ｓ」－β－ブチロラクトンを開環アニオン重合し、さらに、成長末端（ω－末端）に特定の末端基を導入すると、ＢＨＢ単位の数を制御することが容易になり、しかも当該単位に起因する高い結晶化傾向を抑制することのできる、ω－末端の修飾されたジブロック共重合体（ポリ（エチレングリコール）－ｂ－ポリ（［Ｒ，Ｓ］－β－ヒドロキシ酪酸）（ＰＥＧ－ｂ－ＰＢＨＢ）共重合体（ω－末端修飾済））が提供できることが見出された。こうして製造された共重合体の複数分子は、水中で容易に自己組織化又は自己会合して、安定なナノ粒子（又はナノサイズの高分子ミセル）（以下、“ＮａｎｏＢＨＢ”と称する場合がある。）を形成するとともに、当該ナノ粒子は、イン・ビトロ（ｉｎ　ｖｉｔｒｏ）でエステラーゼの存在下でＢＨＢを持続放出し、ｉｎ　ｖｉｖｏでは、特定の臓器中のＢＨＢレベルを高め、例えば、急性腎障害を誘発したモデル動物を保護する効果を示すことが確認された。
　したがって、本明細書で開示される主たる主題又は態様として、次のものを挙げることができる。
態様１：
式Ｉ：
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000004
　式中、
　Ａは、水素原子、非置換若しくは置換Ｃ１－Ｃ１２アルキル、非置換若しくは置換Ｃ１－Ｃ１２アルコキシ、又は非置換若しくは置換アリールを表し、置換されている場合の置換基は、Ｃ１－Ｃ４アルキル、Ｃ１－Ｃ４アルコキシ、アリール、ホルミル、フェニルアミノ、フェネチルアミノ又は式Ｒ１Ｒ２ＣＨ－（ここで、Ｒ１及びＲ２は独立して、Ｃ１－Ｃ４アルコキシ若しくはＲ１とＲ２は一緒になって－ＯＣＨ２ＣＨ２Ｏ－、－Ｏ（ＣＨ２）３Ｏ－若しくは－Ｏ（ＣＨ２）４Ｏ－を表す。）で表される基を表し、
　Ｒは、非置換若しくは置換Ｃ１－６アルキル、Ｃ１－４アルキレンカルボニルオキシ－非置換若しくは置換Ｃ１－２１アルキル、Ｃ１－４アルキレンカルボニルオキシ－非置換若しくは置換Ｃ３－７シクロアルキル、Ｃ１－４アルキレンカルボニルオキシ－非置換若しくは置換アリール、Ｃ１－４アルキレンカルボニルオキシ－非置換若しくは置換アダマンチル、Ｃ１－４アルキレン－非置換若しくは置換アリール、Ｃ１－４アルキレン－非置換若しくは置換アダマンチル、又はＣ１－４アルキレン－非置換もしくは置換コレステロール残基を表し、ここで、置換されている場合の置換基は、Ｃ１－４アルキル、Ｃ１－４アルキルオキシ又はアリールを表し、
　ｍは２０～２００の整数を表し、
　ｎは３～３００の整数を表し、
　ｐは１～６の整数を表し、ｐの付されたアルキレンの水素原子は一つのＣ１－４アルキルにより置換されていてもよく、
　ｍの付された反復単位中の各β－ヒドロキシル酪酸単位は、［Ｒ］型のエナンチオマーと［Ｓ］型のエナンチマーの等価量が相互にランダムに存在する、
で表されるブロック共重合体。
態様２：態様１に記載のブロック共重合体を含むナノサイズの高分子ミセル又はナノ粒子。
態様３：下記の反応スキーム１に従う式Ｉで表されるブロック共重重合体の製造方法であって、反応に悪影響を及ぼさない有機溶媒中で、溶解した式（１）で表される化合物を、Ｍ＋で表される金属カチオンを生じるアニオン重合触媒と接触させて式（２）で表されるマクロイニシエーターを調製するステップ、前記ステップで得られた反応混合物に式（３）で表される［Ｒ，Ｓ］－β－ラクトンを反応させ、続いて、式（４）で表されるハロゲン置換剤を用いて重合反応を停止されるとともに共重合体のω－末端を修飾して、式Ｉで表されるブロック共重合体を生成し、生成した当該ブロック共重合体を取得するステップを含む、前記製造方法。
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000005
　当該反応スキーム中の各式中の可変基又は変動可能な部分等の略号の中、Ａ、Ｒ、ｍ、ｎ、ｐは、態様１において式Ｉで表される共重合体について定義したのと同義であり、Ｘはハロゲンを表す。
態様４：攪拌下にある、水混和性の有機溶媒に溶解した式Ｉで表されるブロック共重合体の複数分子の溶液に水を滴下して調製した混合物を、透析膜を介して水に対して透析することによりナノサイズの高分子ミセル又はナノ粒子を形成し、当該ナノ粒子を含む水溶液を調製するステップ、次いで当該水溶液から凝集物を除去するステップを含む、式Ｉで表されるブロック共重合体のナノサイズの高分子ミセル又はナノ粒子の調製方法。
態様５：態様１に記載の式Ｉで表される共重合体又は態様２に記載のナノサイズの高分子ミセル又はナノ粒子を有効成分として含み、さらに生理学的に許容され得る希釈剤又は賦形剤を含む製薬学的製剤。
態様６：急性腎臓疾患、潰瘍性大腸炎を含む炎症性疾患、抑うつ病を含む脳疾患の処置に使用するための、態様５に記載の製薬学的製剤。
態様７：処置を必要とする被験者又は患者に有効量の態様１に記載の式Ｉで表される共重合体又は態様２に記載されたナノサイズの高分子ミセル又はナノサイズの高分子ミセルを投与し、急性腎臓疾患、炎症性疾患、脳疾患、ガンのいずれか１種又は２種以上の疾患を予防又は治療する方法。
態様８：
式ＩＩ：
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000006
　式中：Ａ、Ｒ、ｍ、ｎ、ｐは、態様１において式Ｉで表される共重合体について定義したのと同義であり、
　ｍの付された反復単位中の各β－ヒドロキシル酪酸単位は、［Ｒ］型のエナンチオマーと［Ｓ］型のエナンチマーの等価量が相互にランダムに存在する、
で表されるブロック共重合体又はそのアルカリ金属（Ｌｉ、Ｋ、又はＮａ）塩。
　本発明によれば、水中で安定かつ十分に分散した形態にあることで医薬としての使用目的に適し、くわえて、種々のシグナル伝達経路等に関与する生理活性を有するβ－ヒドロキシ酪酸をｉｎ　ｖｉｔｒｏ又はｉｎ　ｖｉｖｏで持続放出又は徐放できる、ナノサイズの高分子ミセル又はナノ粒子を形成するジブロック共重合体が提供される。したがって、本発明によれば、例えば、急性腎疾患等の予防又は治療に使用できる医薬製剤が提供される。
本発明で提供されるナノサイズの高分子ミセル又はナノ粒子の形成に関する概念図である。 製造例１で製造されたω－末端修飾済み共重合体の１Ｈ－ＮＭＲのスペクトル（Ａ）及び１Ｃ－ＮＭＲスペクトルである。 前記ω－末端修飾済み共重合体のゲル濾過クロマトグラフィーの測定結果を表す図である。 製造例１における（２）重合（重合の速度論）に関するデータのグラフである。 製造例１における（３）異なる重合度を有する共重合体に関するデータのグラフである。 製造例２で調製されたＮａｎｏＢＨＢの流体力学的サイズのＤＬＳ法による測定結果を表す図（Ａ）（水中）及び（Ｂ）（生理食塩水中）、並びに透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）画像（Ｃ）である。 及び 製造例３で製造したω－末端未修飾共重合体と対応する修飾済共重合体の１Ｈ　ＮＭＲスペクトルとそれらのＤＳＬの測定結果を、それぞれ、対比して示す図である。 試験例１におけるｉｎ　ｖｉｔｒｏのエステラーゼの影響下でのＮａｎｏＢＨＢからＢＨＢの放出特性を示すグラフである。 試験例２における腹腔内注射後のＮａｎｏＢＨＢからＢＨＢのｉｎ　ｖｉｖｏ放出特性であり、血漿中の経時的ＢＨＢのレベルの変化を示すグラフ（Ａ）及び血漿中のＢＨＢの曲線下の面積を表すグラフ（Ｂ）である。 試験例３における皮下注射後のＮａｎｏＢＨＢからＢＨＢのｉｎ　ｖｉｖｏ放出特性であり、血漿中の経時的ＢＨＢのレベルの変化を示すグラフ（Ａ）、肝臓中の経時的ＢＨＢのレベルの変化を示すグラフ（Ｂ）、腎臓中の経時的ＢＨＢのレベルの変化を示すグラフ（Ｃ）であり、（Ｄ）は、腎臓中のＢＨＢの曲線下の面積を表すグラフである。 試験例４における、シスプラチン誘発急性腎障害（ＡＫＩ）に対するＮａｎｏＢＨＢの皮下注射の投与による治療効果に関するデータグラフを動物実験のスキームとともに示す。 試験例５におけるＡＫＩに対するＮａｎｏＢＨＢの強制経口投与による治療効果に関するデータのグラフを動物実験のスキームとともに示す。 試験例６における健常マウスの強制水泳試験を介する経口自由飲用によるＮａｎｏＢＨＢの抗うつ効果に関するデータのグラフを動物実験のスキームと共に示す。 試験例７における潰瘍性大腸炎マウスの生存におけるＮａｎｏＢＨＢの効果に関するデータのグラフを動物実験のスキームと共に示す。 毒性試験例１における、ＮａｎｏＢＨＢ及びＢＨＢを、ＢＡＥＣ細胞と２４時間インキュベーションした後の細胞毒性について測定した結果を表すグラフである。 毒性試験例２における２－１の皮下注射によるＮａｎｏＢＨＢの毒性の確認に関するデータのグラフである。 毒性試験例２における２－２の経口投与によるＮａｎｏＢＨＢの毒性の確認に関するデータのグラフである。
発明の詳細な説明又は発明を実施するための最良の形態
　本明細書で使用する用語、特に、技術用語は、別に定義しない限り、当該技術分野で常用されている意味内容を有する。
　ナノサイズの高分子ミセルとナノ粒子とは互換可能な用語として使用されており、水性媒体中で高分子ミセルの動的光散乱法（ＤＬＳ）による粒子の粒度分布測定を行った場合に、粒度分布がナノサイズの範囲内にある高分子ミセル又は粒子を意味する。限定されるものでないが、安定性の観点からは、典型的なものとして、５ｎｍ～５００ｎｍ、好ましくは５ｎｍ～１００ｎｍ、より好ましくは７ｎｍ～８０ｎｍにある粒子を挙げることができる。以下、説明を簡略化する目的で、ナノサイズの高分子ミセル又はナノ粒子は、主としてナノ粒子と称する。このようナノ粒子の形成に関する概念図を図１に示す。理論に拘束されるものでないが、当該ナノ粒子は、ポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）セグメントとポリ（［Ｒ，Ｓ］β－ヒドロキシ酪酸）（ＰＢＨＢ）セグメントのジブロックを含むブロック共重合体、特に、ω－末端のＣＯＯＨ基が適当な疎水性基によって保護されているブロック共重合体の複数分子から形成され、水性環境下（水溶液又は生体内）では、（ＰＢＨＢ）セグメントをコアとし、（ＰＥＧ）セグメントをシェルとする、所謂、コア－シェル型の高分子ミセルとして存在し得るものと確認され又は理解されている。
　当該共重合体は、先述の態様１に定義されているとおりのものであり、ポリ（エチレングリコール）－ｂ－ポリ（［Ｒ，Ｓ］－β－ヒドロキシ酪酸）共重合体（以下、“ＰＥＧ－ｂ－ＰＢＨＢ”と称する場合がある。ω－末端修飾済）と総称することもある。記載されている［Ｒ］及び［Ｓ］は、互いにエナンチマーとして存在し得る２つの異性体の絶対配置を区別するためのＲ／Ｓ表記に従って使用されている。［Ｒ，Ｓ］と記載する場合、Ｒ型のエナンチオマーとＳ型のエナンチオマーが互いに等価量で、換言すれば、互いに５０％ずつ存在し得ることを意味する。本発明に関連して［Ｒ，Ｓ］表記が使用される場合、［Ｒ］体及び［Ｓ］体は互いに必ずしも、厳密に「等価量」又は「５０％」ずつ存在していなくてもよく、例えば、当該共重合体を製造するための原料として市販された［Ｒ，Ｓ］－β－ヒドロキシ酪酸にいずれか一方の異性体が使用目的に悪影響を及ぼさない程度に過剰に存在するか、また当該共重合体にあっては、使用原料等に応じていずれかの異性体がそれらの製造方法や貯蔵条件等に応じていずれか一方の型の異性体単位が若干過剰である場合であっても、本発明の目的に沿う限り許容され得る、本発明の技術的範囲内にあるものと理解されている。
当該共重合体を定義する可変基又は変動可能な部分等について：
　Ａは特許文献１に開示されたＰＥＧセグメントのα－末端のものと同様なＰＥＧセグメントのα－末端ＯＨ基の保護基に相当するものであり、ＲはＰＥＧ－ｂ－ＰＢＨＢのω－末端ＣＯＯＨの保護基又は修飾基に相当する。Ｒは、ＰＥＧ－ｂ－ＰＢＨＢのＰＢＨＢセグメントの疎水性を高めることからのナノ粒子の形成が促進されるように作用する疎水性基、特に、炭化水素基を含む基であれば限定されない。しかし、本発明の目的の一つである、ＰＥＧ－ｂ－ＰＢＨＢ共重合体（ω－末端修飾済）の製造、さらには、これらの共重合体からナノ粒子の形成を容易にし、形成されたナノ粒子が水性媒体中で安定化するとの観点に立てば、態様１に定義されている各基を具体的なものとして挙げることができる。
　限定されるものでないが、反応スキーム１に従う製造方法による場合、Ｒは、非置換Ｃ１－３アルキル、Ｃ１－２アルキレンカルボニルオキシ－非置換若しくは置換Ｃ１－２１アルキル、Ｃ１－２アルキレンカルボニルオキシ－非置換若しくは置換Ｃ３－７シクロアルキル、Ｃ１－２アルキレンカルボニルオキシ－非置換若しくは置換アリール、Ｃ１－２アルキレンカルボニルオキシ－非置換若しくは置換アダマンチル、Ｃ１－２アルキレン－非置換若しくは置換アリール、Ｃ１－２アルキレン－非置換若しくは置換アダマンチル、又はＣ１－２アルキレン－非置換もしくは置換コレステロール残基を表し、ここで、置換されている場合の置換基は、Ｃ１－４アルキル、Ｃ１－４アルキルオキシ又はアリールを表す基が好ましく、Ｃ１－４アルキレンカルボニルオキシと称すときは、Ｃ１アルキレン（メチレン）カルボニルオキシであることがより好ましい。この場合、反応スキーム１中のＲＸにおけるＲは上述した基に相当する炭化水素の酢酸エステル残基であることができる。
　ｍ及びｎは、ナノ粒子が水性環境下で式Ｉのブロック共重重合体から容易、かつ確実に形成され、しかも一定のサイズのものとして安定に存在するためには、それぞれ、ｍが２０～２００の整数．好ましくは３０～１８０の整数、より好ましくは４５～８０の整数であり、ｎが３～３００の整数、好ましくは１０～１００の整数、より好ましくは２０～１００の整数であることができる。
　ｐは、例えば、ＰＥＧのマクロイニシエーターの調製において、α－末端保護ＰＥＧの他末端部分である－ＣＨ２ＣＨ２ＯＨを当該技術分野で既知の方法により酸化して－ＣＨ２ＣＯＯＨとするか、又は当該末端部分のＯＨとハロＣ１－６アルキルカルボン酸エステルとの反応によりエーテル結合を生成した後、当該エステル部分を加水分解してカルボキシル基（－ＣＯＯＨ）に転化する、ことに対応して変動する整数である。調製の容易さを考慮すれば、ｐは１～３の整数であることが好ましい。
　上記各基若しくは各部分としてのアルキル若しくはアルキレンは、直鎖もしくは分岐鎖であることができる。限定されるものでないが、Ｃ１－Ｃ１２アルキルと称する場合の具体的な基としては、メチル、エチル、プロピル、ｉｓｏ－プロピル、ブチル、ｓｅｃ－ブチル、ｔｅｒｔ－ブチル、ぺンチル、ヘキシル、ヘプチル、ノニル、ウンデシル、トリデシル、ヘプタデシル、ノナデシル等に該当するものを挙げることができる。好ましいものはＣ１－６アルキルから選ばれる。記載されているアルキレンは、記載されている炭素原子を有する上記アルキルに対応するものである。Ｃ３－７シクロアルキルは、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロヘプチルであることができ、アリールはフェニル、ビフェニル、ナフチルであることができる。
当該共重合体の製造について：
　当該共重合体は、当該技術分野でそれ自体既知の方法を利用して式Ｉで表される構造を持つものを製造できるものであればいかなる方法によるものであるかに限定されない。しかし、都合よくは、態様３に記載されるとおりの反応スキーム１に基づいて製造することができる。ここで、反応に悪影響を及ぼさない有機溶媒は、非プロトン性溶媒、特に、双極性非プロトン溶媒であることができ、例えば、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）、ジオキサン、グライム、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）であることができる。Ｍ＋で表される金属カチオンを生じるアニオン重合触媒としては、アルカリ金属芳香族付加体、例えば、Ｋ－ナフタレン、Ｎａ－ナフタレン、Ｎａ－ビフェニル、Ｋ－ビフェニル、Ｋ－ベンゾフェノンであることができる。
　反応スキーム１を参照すれば、式（１）で表されるＰＥＧ誘導体に対し若干過剰モル量の前記アルカリ金属芳香族付加体を加えて、式（２）で表されるＰＥＧイニシエーターを調製し、こうして調製したイニシエーターを介して、必要により、クラウンエーテル、例えば、１８－クラウン－６－エーテルの存在下で、［Ｒ，Ｓ］－β－ラクトンを開環重合させる。これらの反応は、窒素雰囲気下で行うことが好ましい。使用するβ－ラクトンの量は、目的とする式Ｉで表される共重合体の［Ｒ，Ｓ］－β－ヒドロキシ酪酸の反復単位のｍの数に応じて、選ぶことができる。当該開環重合反応は、具体的には、成長末端がリビング的に成長することを考慮して、β－ラクトンの量を決定するか、後述するハロゲン置換剤を使用して、適宜、重合反応を停止して、前記の反復単位の分子量又はｍの数を制御すればよい。他方、式Ｉで表される共重合体のエチレングリコールの反復単位のｎの数は、用意するＰＥＧ誘導体における対応するエチレングリコールの単位の数を適宜選択することにより制御できる。重合反応は、通常、１日若しくは２日～数日間実施することができる。ＲＸとして表示されている反応停止又はω－末端の保護に使用するハロゲン置換剤は、Ｒとして、上述した、Ｒについて定義する基から選ばれ、Ｘとしては、ハロゲン原子、特に、臭素原子、沃素原子であることができる。こうして得られる、式Ｉで表される共重合体（ω－末端修飾済）は、反応混合物から、当該共重合体の貧又は非溶媒（例えば、イソプロピルアルコールとｎ－ヘキサンの混合物）中での沈殿させることにより分離、取得できる。また、このようなハロゲン置換剤による反応停止及びω－末端の保護を行う前にプロトンを提供できる化合物、例えば、水を重合反応混合物に添加することにより、ω－末端の－ＣＯＯＨが遊離の状態にある前記式ＩＩで表される共重合体を提供することができる。このような共重合体も、本発明者の知る限り、従来技術文献未載であり、本願では、式Ｉで表される共重合体の前駆体ともいえる。
　式Ｉで表される共重合体（ω－末端修飾済）からナノ粒子の調製又は作製は、態様４に記載の調製方法に従って実施することができる。当該調製に際し、本発明の目的に反しない限り、前記式ＩＩで表される共重合体をω－末端未保護体として、例えば、前共重合体の２５モル％まで含んでいてもよい。
　当該調製方法において、水混和性の有機溶媒としては、式Ｉの共重合体（ω－末端修飾済）を容易に溶解できる良溶媒、例えば、ＤＭＦを使用することができる。こうして溶解した溶液を、可能な限り激しく攪拌しながら、当該溶液にほぼ等しい用量の水を滴下して混合物を調製する。混合物を１～３日間、適当なカットオフ分子量（例えば、３．５ｋＤａ）のＲＣ透析膜を介して、非処理溶液の２０～４０倍用量の水に対して透析する（必要により、水は１日に２度交換する。）。こうして得られる有機溶媒や未反応原料が除去されたナノ粒子含有溶液は、必要により、溶液中に共存する凝集物を適度な孔サイズのフィルターを利用して除去する。こうして、水溶液又は水懸濁液中に存在するナノ粒子（ＮａｎｏＢＨＢ）は、ＤＬＳ測定による動態力学的平均径として、通常、７又は１０ｎｍ～８００ｎｍを有し、これらの中、より安定なものとしては７ｎｍ～８０ｎｍを有するものを挙げることができる。
　当該ナノ粒子は、遠心又は濾過処理等の分離手段により分離でき、また、凍結乾燥することにより、乾燥組成物として保存できるし、さらに、必要に応じて、水性媒体中で再構成できる。こうして、ＮａｎｏＢＨＢは、必要により、生理学的に許容され得る希釈剤または賦形剤を含む、経口投与製剤、非経口投与（腹腔内投与、静注、皮下注射等）用の製剤として提供できる。このような希釈剤は、滅菌水、生理食塩水、生理学的に許容される緩衝剤を含む溶液等であることができ、さらに添加剤として、例えば、ソルビトール、デキストリン、ブドウ糖、マンニトール、アミノ酸（例えば、グリシン、イソロイシン、バリン、メチオニン、グルタミン酸等）等であることができる。
　理論により本発明の技術的な範囲が限定されるものでないが、ＮａｎｏＢＨＢが生体内に注入されると、血管透過性・滞留性亢進（ＥＰＲ）効果により傷害を受けた領域にそれらが蓄積し、次いでナノ粒子の崩壊、ＰＢＨＢの酵素加水分解によるＢＨＢの持続的な放出が起こる。その結果として、ＮａｎｏＢＨＢの使用は低分子ＢＨＢの薬物動態性を改善し、生理活性を高めるものと、理解される。後述の試験例４において確認されるとおり、ポリ（エチレングリコール）－ｂ－ポリ（［Ｒ，Ｓ］－β－ヒドロキシ酪酸）は、実験動物を用いる急性腎障害に対する保護効果を示す。
　医薬製剤は、剤形の例としては、液剤（内用水剤、懸濁剤、乳剤、シロップ剤を含む）、固形剤（錠剤、丸剤、舌下剤、カプセル剤、ドロップ剤、トローチ剤を含む）、顆粒剤、粉剤、散剤、等が挙げられる。固形剤は、さらに、必要に応じて当該技術分野で公知の剤皮を施した剤形、例えば、糖衣錠、ゼラチン被包錠、腸溶錠、フィルムコーティング錠、二重錠、多層錠にすることができる。各剤形の形状、大きさについては、いずれも当該分野で公知の剤型の範囲内にあればよく、溶解剤、ｐＨ調整剤、担体、賦形剤、希釈剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、乳化剤、増量剤、着色剤、香味剤、甘味料、安定化剤、保存料、等の添加剤を含有させることができる。
　また、これらの製剤中の有効成分たる、ＮａｎｏＢＨＢの投与量、投与回数は、患者の年齢、性別、状態、疾患の程度等により、最適な濃度範囲で適用されるが、一日あたりに投与されるＮａｎｏＢＨＢ換算量が体重１Ｋｇあたり１０μｍｇから１ｇ程度、より好ましくは０．１ｍｇから１００ｍｇとなる量であることが好ましく、これを１～３回程度に分けて投与してもよいが、本医薬製剤は、バイオアベイラビリティが高いため、１日１回の投与でも効果が期待できる。なお、具体的な投与量、投与方法、投与回数は、各種文献等を参考とし、当業者が、動物実験あるいは、ヒトに対する実験的投与を通じて、最適な方法を決めることができる。
製造例１：　ポリ（エチレングリコール）－ｂ－ポリ（［Ｒ，Ｓ］－β－ヒドロキシ酪酸）（ＰＥＧ－ｂ－ＰＢＨＢ）共重合体（ω－末端修飾済）：
ＣＨ３Ｏ－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ－ＣＨ２ＣＯ－（ＯＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ２ＣＯ）ｍＯＣＨ２ＣＯＯＣＨ２ＣＨ３
の製造
工程１．ＰＥＧ－マクロイニシエーター：ＣＨ３Ｏ－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ－ＣＨ２ＣＯＯＨの製造
（ａ）ＣＨ３Ｏ－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ－ＣＨ２ＣＯＯＣ２Ｈ３の合成
Ｎ２流下、ブチルリチウム１．６Ｍ－ヘキサン（ＢｕＬｉ，１０ｍＬ，１６ｍｍｏｌ）をテトラヒドロフラン（ＴＨＦ，５０ｍＬ）に溶解したＣＨ３Ｏ－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ－Ｈ（ｍＰＥＧ－ＯＨ，ＭＷ＝２０００，２０ｇ，１０ｍｍｏｌ）の溶液に加え、続けて臭化酢酸エチル（３．６ｍＬ，３０ｍｍｏｌ）を加えた。１日反応させた後、生成物を－３０℃に保管した２－プロパノール（冷ＩＰＡ）中で沈殿させ、遠心分離（９０００ｒｐｍ，３０分）により収集した。この生成物を減圧下で乾燥した（収量：１８ｇ）。
（ｂ）ＣＨ３Ｏ－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ－ＣＨ２ＣＯＯＨの合成
室温でＣＨ３Ｏ－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ－ＣＨ２ＣＯＯＣ２Ｈ３（１８ｇ、９ｍｍｏｌ）
にＭｉｌｉＱ水（５０ｍＬ）を加え、続けてＮａＯＨ１．５Ｍ（１０ｍＬ，１５ｍｍｏｌ）を加えた。１日攪拌した後、塩酸を用いて反応系のｐＨを１～２に調節した。次いで、生成物をジクロロメタン（ＤＣＭ，３度、各６０ｍＬ）で抽出した。ＤＣＭ層を減圧下の回転エバポレーターで濃縮し、冷ＩＰＡ中で沈殿させた。生成物を遠心分離（９０００ｒｐｍ，５分）により収集し、減圧下で乾燥した（収量：１６ｇ）。
工程２．
（１）重合（典型例）
方法：
　Ｎ２流下、上記のように用意したＣＨ３Ｏ－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ－ＣＨ２ＣＯＯＨ（２ｇ、１ｍｍｏｌ）をＴＨＦ（１５ｍＬ）に溶解し、続けてナフタレンカリウム０．９Ｍ／ヘキサン（１．５ｍＬ，１．３５ｍｍｏｌ）を加えた。次いで、１８－ｃｒｏｗｎ－６エーテル　１Ｍ／ＴＨＦ（２ｍＬ，２ｍｍｏｌ）を上記で得た混合物に導入し、続けて［Ｒ，Ｓ］－β－ブチロラクトン（東京化学工業株式会社から入手、４ｍＬ，４９ｍｍｏｌ）を加えた。２日間反応させた後、臭化酢酸エチル（４ｍＬ，３３ｍｍｏｌ）を加えて反応を停止した。反応混合物をＩＰＡ／ｎ－ヘキサン（２０／８０）中で沈殿させ、生成物を遠心分離（９０００ｒｐｍ，１０分）により収集し、減圧下で乾燥した。
生成物：ＣＨ３Ｏ－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ－ＣＨ２ＣＯ－（ＯＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ２ＣＯ）ｍ・の収量は５．６ｇであった。この生成物の１Ｈ－ＮＭＲスペクトル及び１３Ｃ－ＮＭＲスペクトルを図２の（Ａ）及び（Ｂ）にそれぞれ示す。１Ｈ－ＮＭＲスペクトルの結果から換算された分子量Ｍは６，３００であり、５２個のＢＨＢ単位を含む。拡大スペクトル図において、Ｓ－単位（ｅＳ，ｇＳ）及びＲ－単位（ｅＲ，ｇＲ）が観察でき、得られた共重合体の構成は、ポリ（エチレングリコール）－ｂ－ポリ（［Ｒ，Ｓ］－β－ヒドロキシ酪酸）（ＰＥＧ－ｂ－ＰＢＨＢ）共重合体（ω－末端修飾済）であることが確認できる。当該共重合体のゲル濾過クロマトグラフィー（ＧＰＣ）の測定結果を図３に示す。図３から、Ｍｎ＝４８８４であり、Ｍｗ／Ｍｎ＝１．０８３であることが解る。
（２）重合（重合の速度論）
　方法：
　上記（１）重合に記載された処理に準じ、［Ｒ，Ｓ］－β－ブチロラクトンを加えた後、ＮＭＲスペクトルの基準として０．５ｍＬのテトラリンを加えた。　選定した時点（例えば、３０分、１８時間、２１時間、４０．５時間）の後、反応混合物の２液滴を集め、液体窒素中で凍結させた。その後、サンプルをＮＭＲ測定用にＣＤＣｌ３と、ＧＰＣ測定用にＴＨＦと混合した。
　結果：
　１Ｈ－ＮＭＲから、［Ｒ，Ｓ］－ブチロラクトンの残存量を相対的に測定し、基準ピークとしてテトラリンを用いて正規化した。当該重合の速度論に関する実験の結果を図４に示す。ここで、（Ａ）は経時的な残存モノマーの変化についてグラフ表示であり、（Ｂ）は、ＣＤＣｌ３中の１Ｈ－ＮＭＲによる、モノマーからポリマーへの変換率をモニターした結果のグラフ表示であり、（Ｃ）は、生成物のＴＨＦ中におけるＧＰＣ測定結果のグラフ表示である。それぞれ、［Ｒ，Ｓ］－ブチロラクトンの８０％以上が４０．５時間後に消費され、ポリ（ＢＨＢ）のシグナルの増加も反応時間と共に観察され、最初のピークは反応時間の増加とともに高分子量領域にシフトしていることから、ＰＥＧマクロマー上での重合が示唆される。
（３）異なる重合度を有する共重合体
上記（１）重合に記載された方法に準じ、１８－ｃｒｏｗｎ－６－エーテルの導入に続け、異なる量の［Ｒ，Ｓ］－β－ブチロラクトン（すなわち、２ｍＬ、４ｍＬ、６ｍＬ）を加えた。２日間反応させた後、酢酸を加えて重合反応を停止した。３．５ｋＤａ　ＲＣ透析膜中で生成物をメタノール、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、次いでＭｉｌｉＱ水に対して透析することにより生成物を集め、続けて、減圧下で凍結乾燥することにより乾燥した。得られた各生成物の１Ｈ－ＮＭＲスペクトルを図５　に示す。これらのスペクトルから換算される各生成物におけるＰＢＨＢセグメントの重合度（ＤＰ）は、それぞれ、Ｐ１（ＤＰ＝３０）、Ｐ２（ＤＰ＝４９）、Ｐ３（ＤＰ＝７１）である。なお、各生成物中のＰＥＧセグメントについては、上記（１）を参照されたい。
製造例２：ＮａｎｏＢＨＢナノ粒子の調製
（１）製造例１の工程２に記載したように製造したポリ（エチレングリコール）－ｂ－ポリ（［Ｒ，Ｓ］－β－ヒドロキシ酪酸）（ＰＥＧ－ｂ－ＰＢＨＢ）共重合体（ω－末端修飾済）（５．６ｇ）をＤＭＦ４０ｍＬに溶解した。その後、激しい攪拌下、この溶液に４０ｍＬのＭｉｌｉＱ水を滴下した。得られた全混合物を２ＬのＭｉｌｉＱ水に対して、３．５ｋＤａ　ＲＣ透析膜を介して３日間透析した（一日に２回水を交換）。最後の工程において、ナノ粒子溶液を０．２μｍ－孔サイズのフィルターにより濾過して凝集物を除去し、次いで滅菌した。注入目的で、生理食塩水中のナノ粒子を、ナノ粒子溶液と９％のＮａＣｌ（９：１）を混合することにより調製した。ナノ粒子のすべてをさらなる使用のために４℃で貯蔵した。
　生成物について動的光散乱法（ＤＬＳ）による測定結果及び透過型電子顕微鏡の測定結果を図６に示す。ここで、（Ａ）はＭｉｌｉＱ水中のＮａｎｏＢＨＢ溶液（３２ｍｇ／ｍＬ，ｄ＝１４ｎｍ，Ｖ＝１７０ｍＬ，収率：９７％）の測定結果であり（Ｂ）は生理食塩水中のＮａｎｏＢＨＢ溶液（２８．８ｍｇ／ｍＬ，ｄ＝３０ｎｍ）の測定結果であり、（Ｃ）は透過型電子顕微鏡の測定結果である。
（２）製造例１における工程２の（３）異なる重合度を有する共重合体の製造において取得したＰＢＨＢセグメントとして、それぞれ、Ｐ１（ＤＰ＝３０）、Ｐ２（ＤＰ＝４９）、Ｐ３（ＤＰ＝７１）を有するＰＥＧ－ｂ－ＰＢＨＢ共重合体（以下、それぞれ、Ｐ１共重合体、Ｐ２共重合体、Ｐ３共重合体と称する）を用意し、製造例２の（１）に記載した方法に準じて、各共重合体の自己組織化、凝集物の除去、滅菌を行った。異なる重合度を有する各共重合体の特徴を下記表１にまとめる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000007
製造例３：ポリ（エチレングリコール）－ｂ－ポリ（［Ｒ，Ｓ］－β－ヒドロキシ酪酸）（ＰＥＧ－ｂ－ＰＢＨＢ）共重合体（ω－末端未修飾）
ＣＨ３Ｏ－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ－ＣＨ２ＣＯ－（ＯＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ２ＣＯ）ｍＯＨ
の製造
　製造例１における工程２の重合において、「臭化酢酸エチル（４ｍＬ，３３ｍｍｏｌ）を加えて反応を停止」させることに代え、水又は酢酸を加えて反応を停止させたこと以外、製造例１の工程１及び工程２に記載の処理を繰り返した。こうしてω－末端未修飾の共重合体等を製造した。
　ω－末端基の修飾効果を検討するために、水を用いて反応を停止し、当該末端基が未修飾（ＣＯＯ－）である場合の共重合体、酢酸を用いて反応を停止し、当該末端基が（ＣＯＯＨ）である場合の共重合体、及び修飾済（当該末端基：ＣＯＯＣＨ２ＣＨ３）である共重合体（製造例１参照）を、それぞれ製造例２のナノ粒子の調製法にしたがってナノ粒子化した。前記各共重合体の１Ｈ－ＮＭＲスペクトルと、各ナノ粒子についてのＤＬＳの測定結果を、それぞれ、図７ａ及び図７ｂに対比して示す。図から、前記の末端基が未修飾（ＣＯＯ－）であり、ＤＰが４５である共重合体は大きな粒子を形成することが解る。このような性質は疎水性コアの形成においてはあまり望ましくない。前記の末端基（ＣＯＯＨ）を有し、ＤＰが４９である共重合体は、小さなナノ粒子を形成するが、ろ過後ですら一定の凝集が観察される。これは、ある程度の末端基（ＣＯＯＨ）が水中でプロトン化されることに起因するものと思われる。前記の末端基がエステル基により修飾され、ＤＰが５２である共重合体は、疎水性が高まり、小さく、安定なナノ粒子を形成することが解る。
試験例１：酵素によるｉｎ　ｖｉｔｒｏでのＮａｎｏＢＨＢからＢＨＢの放出
（１）実験：ＮａｎｏＢＨＢの１９ｍｇ／ｍＬ（１ｍＬ，０．１５ｍｍｏｌのＢＨＢ含有量）をブタの肝臓エステラーゼ水溶液（０．３３ｍｇ／ｍＬ）の３ｍＬ中に分散させ、３７℃でインキュベーションした。選定された時点（すなわち、５分、２時間、６時間、１２時間、２４時間、４８時間）の後、反応混合物の１００μＬを収集し（ｎ＝３）、液体窒素中で即座に凍結した。ｔ＝４８時間の時点でサンプルを採取した後、ＫＯＨの１Ｍ（１ｍＬ，１ｍｍｏｌ）を加え、４日間インキュベーションして加水分解を完全に進行させ、その時点をｔ＝∞（無限大）と想定した。ＢＨＢの蓄積放出量をＬＣ－ＭＳ／ＭＳシステムで測定した。同様の実験をＰＢＨＢ（１９ｍｇ／ｍＬ）でも行った。蓄積されたＢＨＢは、ＢＨＢ（％）＝［ＢＨＢ］ｔ×１００％／［ＢＨＢ］ｔ＝∞（無限大）として計算した。
（２）結果：
　上記実験の結果を図８に示す。（Ａ）は経時的なＮａｎｏＢＨＢとエステラーゼの混合物のＢＨＢ検出ＬＣ－ＭＳ／ＭＳクロマトグラフであり、（Ｂ）は経時的なインキュベーション液中のＢＨＢレベルの定量分析（＊＊＊＊ｐ＜０．０００１対ＮａｎｏＢＨＢ＋エステラーズ（Ｅｓｔｅｒａｓｅ）群）の結果である。
　図から次のことが解る：
　ＮａｎｏＢＨＢは、イン・ビトロ（ｉｎ　ｖｉｔｒｏ）でエステラーゼの影響下で遊離のＢＨＢを放出でき、ＢＨＢ供給源としてＮａｎｏＢＨＢを使用することについての本発明者らの戦略に関する証拠を提供する（（Ａ）参照。）。
また、ＮａｎｏＢＨＢは、均質なＰＢＨＢポリマーと比較して、ＢＨＢの放出は遅いが、より安定である（（Ｂ）参照。）。
試験例２：ＮａｎｏＢＨＢの腹腔内注入によるＢＨＢのｉｎ　ｖｉｖｏ放出
（１）実験：
ＩＣＲ雄マウス（６週齢）にＮａｎｏＢＨＢ又はβ－ヒドロキシ酪酸ナトリウムを、それぞれ、ＢＨＢ／ｋｇの換算量３４５ｍｇの用量にて腹腔内注射により投与した。選定された時点（すなわち、２０分、４５分、１．５時間、３時間、６時間、１２時間）後、マウスを犠牲として屠り、血漿を収集した。血漿試料は液体窒素中で即座に凍結し、さらなる分析用として－８０℃で貯蔵した。血漿試料中のＢＨＢレベルはＬＣ－ＭＳ／ＭＳシステムで測定した。
（２）上記実験の結果を、図９に示す。図中、（Ａ）は腹腔内注入後の血漿中のＢＨＢのレベルであり、（Ｂ）は０～１２時間における血漿中のＢＨＢレベルを示す曲線下の面積である。図から、ＮａｎｏＢＨＢの腹腔内注入は、血漿中のＢＨＢのレベルを有意に高め、通常の外因性ＢＨＢより良好な薬動力学的プロファイルを示す。
試験例３：ＮａｎｏＢＨＢの皮下注入によるＢＨＢのｉｎ　ｖｉｖｏ放出
（１）実験：
　ＩＣＲ雄マウス（６週齢）にＮａｎｏＢＨＢ又はβ－ヒドロキシ酪酸ナトリウムを、それぞれ、ＢＨＢ／ｋｇの換算量３４５ｍｇの用量にて皮下注射により投与した。選定された時点（すなわち、２０分、４５分、１．５時間、３時間、６時間、１２時間）後、マウスを犠牲として屠り、血漿、腎臓、肝臓を収集した。血漿及び組織試料は液体窒素中で即座に凍結し、さらなる分析用として－８０℃で貯蔵した。血漿、腎臓、肝臓中のＢＨＢレベルはＬＣ－ＭＳ／ＭＳシステムで測定した。
（２）上記実験の結果を、図１０に示す。図中、それぞれ皮下注入後のデータであった、（Ａ）は血漿中のＢＨＢレベルであり、（Ｂ）は肝臓組織中のＢＨＢレベルであり、（Ｃ）は腎臓組織中のＢＨＢレベルであり、（Ｄ）は腎臓組織中のＢＨＢレベル曲線下の面積を表す。
　図から、ＮａｎｏＢＨＢの皮下注入は、血液中のＢＨＢのレベルを有意には高めなかった。しかし、腎臓及び肝臓中のＢＨＢレベルを高めることが解る。
　試験例４：皮下注射による急性腎障害に対するＮａｎｏＢＨＢの保護効果
（１）実験：
　Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ雄マウス（８週齢）を異なる処置で用いるため４群に分割した。急性腎障害は、シスプラチンの腹腔内注射（２０ｍｇ／ｋｇ）により誘導した。シスプラチンに暴露する６時間前に、マウスを生理食塩水（ｎ＝１１）又はβ－ヒドロキシ酪酸ナトリウム（ＢＨＢ／ｋｇの換算用量約２５０ｍｇ、ｎ＝１）又はＮａｎｏＢＨＢ（ＢＨＢ／ｋｇの換算用量約２５０ｍｇ、ｎ＝１０）にて皮下注射で事前処置した。健常な群（ｎ＝８）は、シスプラチンの代わりに生理食塩水を注入した。シスプラチンのチャレンジから７２時間後、マウスを犠牲として屠り血漿、腎臓を収集した。腎機能は、血中尿素窒素（ＢＵＮ）、クレアチニン（ＣＲＥ）、アスパラギン酸トランスアミナーゼ（ＡＳＴ）のレベルを測定することにより評価した。
（２）結果：
　シスプラチン誘発急性腎障害（ＡＫＩ）に対するＮａｎｏＢＨＢの皮下注射の投与による治療効果を図１１に動物実験のスキームとともに示す。図中、（Ａ）は動物実験のスキームを表し、（Ｂ）はシスプラチン注射３日後のＡＫＩマウスの血漿中の、血中尿素窒素に関するデータのグラフ表示であり、（Ｃ）はクレアチニンに関するデータのグラフ表示であり、（Ｄ）はアスパラギン酸トランスアミナーゼ関するデータのグラフ表示であり、（Ｅ）は腎臓組織の２０倍拡大における過ヨウ素酸シッフ（ＰＡＳ）染色の提示画像であり、（Ｆ）は染色画像からの腎臓の損傷領域の定量的測定結果のデータをまとめたグラフである。（データは平均値±ＳＤ、ｎ＝８‐９、＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１、一元配置分散分析）で表示される。
　これらの図から、シスプラチンは、腎機能バイオマーカー（ＢＵＮ、ＣＲＥ）およびＡＳＴの増加によって確認されるように、腎臓に顕著な障害を誘発したことが確認される。生理食塩水とβ－ヒドロキシ酪酸ナトリウムの皮下注射では腎機能の低下は何ら認められないが、ＮａｎｏＢＨＢの投与はシスプラチン誘発急性腎障害に対して顕著な保護効果を示すことが解る。また、ＮａｎｏＢＨＢは低分子量ＢＨＢよりも有利に作用することを示している。
試験例５：強制経口投与（ｏｒａｌ　ｇａｖａｇｅ）による急性腎障害に対するＮａｎｏＢＨＢの治療効果
（１）実験：
　Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ雄性マウス（８週齢）を４群に分け、それぞれ異なる処置を施した。急性腎傷害は、シスプラチン（２０ｍｇ／ｋｇ）の腹腔内投与により誘発した。生理食塩水（ｎ＝１０）、β－ヒドロキシ酪酸ナトリウム（ＢＨＢ／ｋｇの換算用量約２５０ｍｇ、ｎ＝１０）またはＮａｎｏＢＨＢ（ＢＨＢ／ｋｇの換算用量約２５０ｍｇ、ｎ＝１０）を２日ごとに強制経口投与した（－３日目、－１日目）。健常群（ｎ＝１０）にはシスプラチンの代わりに生理食塩水を注射した。シスプラチンのチャレンジから７２時間後、マウスを犠牲にして血漿と腎臓を採取した。腎臓の機能は、血中尿素窒素（ＢＵＮ）、クレアチニン（ＣＲＥ）、アスパラギン酸トランスアミナーゼ（ＡＳＴ）の値を測定することによって評価した。すべてのシスプラチン注射群において、血漿クレアチニンレベルが０．２ｍｇ／ｄＬ未満のマウスはシスプラチン抵抗性とみなし、データ解析から除外した。
（２）結果：
　ＡＫＩに対するＮａｎｏＢＨＢの強制経口投与による治療効果を図１２に動物実験のスキームとともに示す。図中、（Ａ）は動物実験のスキームであり、（Ｂ）はシスプラチン注射３日後のＡＫＩマウスの血漿中の血中尿素窒素の測定値であり、（Ｃ）はクレアチニンの測定値であり、（Ｄ）はアラニントランスアミナーゼの測定値であり、（Ｅ）はアスパラギン酸トランスアミナーゼの測定値である。データは平均値±ＳＤで表示されており、ｎ＝８－１０、一元配置分散分析法に基づく。
　各図から、２日ごとの強制経口投与で、ＮａｎｏＢＨＢはＢＨＢナトリウムより優れた治療効果を示すことが、ＢＵＮ、ＣＲＥ、ＡＬＴ、ＡＳＴの低値から理解できる。このことは、ＮａｎｏＢＨＢの強制経口投与による効果の持続性を示唆しており、ＮａｎｏＢＨＢを使用することにより、従来の低分子量ＢＨＢ　と比較して薬剤の投与頻度を減らすことができることが解る。
試験例６：自由飲用によるＮａｎｏＢＨＢの抗抑うつ効果
（１）実験：
　雄性Ｃ５７ＢＬ／６マウス（９週齢）に水、ＮａｎｏＢＨＢ（ＢＨＢ換算：２０ｍＭ）、β－ヒドロキシ酪酸ナトリウム（ＢＨＢ換算：２０ｍＭ）のいずれかを自由飲用ボトルを介して３日間投与した。（Ｎａｔｕｒｅ　１９７７，２６６：７３０－７３２）に記載されている強制水泳試験を、若干の修正を加えながら行った。ここでは、各マウスを２５℃の水で満たした２Ｌのプラスチックビーカーに、マウスの尾が底に触れない水位で入れ、６分間の行動をビデオレコーダーで記録し、水泳行動（移動性）と浮遊行動（不動性）の時間を測定した。
（２）結果：
　健常マウスの強制水泳試験を介する経口自由飲用によるＮａｎｏＢＨＢの抗抑うつ効果を図１３に動物実験のスキームと共に示す。図中のデータは、平均値±ＳＤ、ｎ＝７‐８、一元配置分散分析に基づく。図から、ＮａｎｏＢＨＢの自由飲用により強制水泳試験中の抑うつ様挙動が減少し、抗抑うつ様作用が認められた。また、ＮａｎｏＢＨＢは従来のβ－ヒドロキシ酪酸ナトリウムと同程度のＢＨＢ濃度２０ｍＭで投与した場合と比較して、統計学的に有意に優れた抗うつ様作用を示すことが解る。
 
試験例７：　潰瘍性大腸炎マウスの生存におけるＮａｎｏＢＨＢの効果
（１）実験：
　雄性Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウス（７週齢）に水（健常マウス）またはデキストラン硫酸ナトリウム２．５％（ＤＳＳ）を自由摂取させた。ＤＳＳ飲用マウスには、水、β－ヒドロキシ酪酸ナトリウム、ＮａｎｏＢＨＢ（投与量：ＢＨＢ／ｋｇ換算で１日当たり７０ｍｇ）のいずれかを２日ごとに０．２ｍＬ／匹ずつ強制経口投与した。マウスの生存率を１６日間観察した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000008
（２）結果：
　ＤＳＳ誘発潰瘍性大腸炎マウスの生存に対するＮａｎｏＢＨＢの強制経口投与（ｏｒａｌ　ｇａｖａｇｅ）による効果を図１４に動物実験のスキームと共に示す。
　図より、ＮａｎｏＢＨＢの投与により、ＤＳＳ誘発大腸炎マウスの生存率が改善する傾向が認められる。
毒性試験例１：ＮａｎｏＢＨＢの細胞毒性
（１）実験：
　９６ウエル（穴）プレート上にウシ大動脈内皮細胞（ＢＡＥＣ）（理研（ＲＩＫＥＮ，Ｔｓｕｋｕｂａ，Ｊａｐａｎ）から入手）を予め播種しておき、培地中ＢＨＢの含有量０～２５．４ｍＭの異なる濃度でＮａｎｏＢＨＢ又はＢＨＢのいずれかとインキュベーションした。２４時間後、培地を捨て、続いて１０μＬのＷＳＴ剤含有培地１００μＬを加え、４時間インキュベーションした。最後の工程で、細胞の生存能を各ウエル中の波長４５０ｎｍにおける被検体ウエルと水処理群ウエルの光学シグナルの比に基づいて測定した。
（２）結果：
結果を図１５に示す。図中、（Ａ）はウシ大動脈内皮細胞（ＢＡＥＣ）の生存率（平均±ＳＤ、ｎ＝４）を表し、（Ｂ）は２４時間培養後のＢＡＥＣ細胞の代表的な顕微鏡写真画像（スケールバー５０μｍ）である。図から、ＮａｎｏＢＨＢもＢＨＢも、ＢＡＥＣ細胞の生存率及び形態に影響を及ぼさず、正常細胞に対してｉｎ　ｖｉｔｒｏで低い毒性を示すことが解る。
毒性試験例２：健常マウスにおけるＮａｎｏＢＨＢのｉｎ　ｖｉｖｏ毒性
２－１　皮下注射によるＮａｎｏＢＨＢの毒性の確認：
（１）実験：
　Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ雄性マウス（８週齢）を処置の異なる２群に分けた。生理食塩水（ｎ＝５）またはＮａｎｏＢＨＢ（ＢＨＢ／ｋｇ換算で約２５０ｍｇ，ｎ＝５）を皮下注射した。７５時間後、マウスを犠牲にして血漿と腎臓を採取した。腎臓の機能は、血中尿素窒素（ＢＵＮ）、クレアチニン（ＣＲＥ）、アスパラギン酸トランスアミナーゼ（ＡＳＴ）のレベルを測定することにより評価した。
（２）結果
　結果を図１６及び表２に示す。図はマウスへのワンショット皮下注射（ｓ．ｃ．）によるｉｎ　ｖｉｖｏ毒性実験の結果を示し、（Ａ）は被検動物の体重の変化を表し、（Ｂ）は注射から３日後の脾臓、肝臓、腎臓の重量を表す。
　表２は注射から３日後に採取した血液サンプルの全血球数および血漿生化学分析（データは平均値±ＳＤ、ｎ＝５で表示）の結果のデータをまとめたものである。
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000009
　図１６及び表２から、ＮａｎｏＢＨＢのｓ．ｃ．投与による顕著な毒性は認められず、体重および臓器重量（脾臓、腎臓、肝臓）は群間で統計的に有意な差は認められなかった。また、腎臓と肝臓の障害バイオマーカーも同様に生理食塩水投与群と比較して差はなく、このモデルにおいてＮａｎｏＢＨＢのｓ．ｃ．注射は安全であることが示唆される。
２－２　経口投与によるＮａｎｏＢＨＢの毒性の確認：
（１）実験：
　Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ雄性マウス（８週齢）を２群に分け、それぞれ異なる処置を施した。生理食塩水（ｎ＝５）またはＮａｎｏＢＨＢ（約２５０ｍｇ－ＢＨＢ／ｋｇ，ｎ＝５）を２日おきに経口投与した（０，２日目，４日目）。６日目にマウスを犠牲にし、血漿と腎臓を採取した。腎臓の機能は、血中尿素窒素（ＢＵＮ）、クレアチニン（ＣＲＥ）、およびアスパラギン酸トランスアミナーゼ（ＡＳＴ）のレベルを測定することによって評価した。
（２）結果
　結果を図１７及び表３に示す。図は２日おきにマウスにＮａｎｏＢＨＢを経口投与したときの毒性を表すデータであり、図の（Ａ）は被検動物の体重の変化を表し、（Ｂ）は最初の投与から６日後の脾臓、肝臓、膵臓の重量である。表３は、最初の投与から６日後に採取した血液サンプルの全血球数および血漿生化学分析（データは平均値±ＳＤ、ｎ＝５で表示）の結果のデータをまとめたものである。
 
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000010
　図１７及び表３から、ＮａｎｏＢＨＢの経口投与は、体重、臓器重量、全体的な血液成分に影響を与えず、ＮａｎｏＢＨＢ経口投与による安全性が示唆される。また、機能障害バイオマーカー（ＡＳＴ、ＣＲＥなど）の低下作用が認められ、健常マウスにおいても有効であることが解る。

Claims (8)

  1. 　式Ｉ：
    Figure JPOXMLDOC01-appb-I000001
    式中、
    　Ａは、水素原子、非置換若しくは置換Ｃ１－Ｃ１２アルキル、非置換若しくは置換Ｃ１－Ｃ１２アルコキシ、非置換若しくは置換アリールを表し、置換されている場合の置換基は、Ｃ１－Ｃ４アルキル、Ｃ１－Ｃ４アルコキシ、アリール、ホルミル、フェニルアミノ、フェネチルアミノ又は式Ｒ１Ｒ２ＣＨ－（ここで、Ｒ１及びＲ２は独立して、Ｃ１－Ｃ４アルコキシ若しくはＲ１とＲ２は一緒になって－ＯＣＨ２ＣＨ２Ｏ－、－Ｏ（ＣＨ２）３Ｏ－もしくは－Ｏ（ＣＨ２）４Ｏ－を表す。）で表される基を表し、
    　Ｒは、非置換若しくは置換Ｃ１－６アルキル、Ｃ１－４アルキレンカルボニルオキシ－非置換若しくは置換Ｃ１－２１アルキル、Ｃ１－４アルキレンカルボニルオキシ－非置換若しくは置換Ｃ３－７シクロアルキル、Ｃ１－４アルキレンカルボニルオキシ－非置換若しくは置換アリール、Ｃ１－４アルキレンカルボニルオキシ－非置換若しくは置換アダマンチル、Ｃ１－４アルキレン－非置換若しくは置換アリール、Ｃ１－４アルキレン－非置換若しくは置換アダマンチル、又はＣ１－４アルキレン－非置換もしくは置換コレステロール残基を表し、ここで、置換されている場合の置換基は、Ｃ１－４アルキル、Ｃ１－４アルキルオキシ又はアリールを表し、
    　ｍは２０～２００の整数を表し、
    　ｎは３～３００の整数を表し、
    　ｐは１～６の整数を表し、ｐの付されたアルキレンの水素原子は一つのＣ１－４アルキルにより置換されていてもよく、
    　ｍの付された反復単位中の各β－ヒドロキシル酪酸単位は、［Ｒ］型のエナンチオマーと［Ｓ］型のエナンチマーの等価量が相互にランダムに存在する、
    で表されるブロック共重合体。
  2. 　請求項１に記載のブロック共重合体を含むナノサイズの高分子ミセル又はナノ粒子。
  3. 　下記の反応スキーム１に従う式Ｉで表されるブロック共重重合体の製造方法であって、反応に悪影響を及ぼさない有機溶媒中で、溶解した式（１）で表される化合物を、Ｍ＋で表される金属カチオンを生じるアニオン重合触媒と接触させて式（２）で表されるマクロイニシエーターを調製するステップ、前記ステップで得られた反応混合物に式（３）で表される［Ｒ，Ｓ］－β－ラクトンを反応させ、続いて、式（４）で表されるハロゲン置換剤を用いて重合反応を停止されるとともに共重合体のω－末端を修飾して、式Ｉで表されるブロック共重合体を生成し、生成した当該ブロック共重合体を取得するステップを含む、前記製造方法。
    Figure JPOXMLDOC01-appb-I000002
    　当該反応スキーム中の各式中の可変基又は変動可能な部分等の略号の中、Ａ、Ｒ、ｍ、ｎ、ｐは、請求項１において式Ｉで表される共重合体について定義したのと同義であり、Ｘはハロゲンを表す。
  4. 　攪拌下にある、水混和性の有機溶媒に溶解した請求項１に記載された式Ｉで表されるブロック共重合体の溶液に水を滴下して調製した混合物を、透析膜を介して水に対して透析することによりナノサイズの高分子ミセル又はナノ粒子を形成し、当該ナノ粒子を含む水溶液を調製するステップ、次いで当該水溶液から凝集物を除去するステップを含む、式Ｉで表されるブロック共重合体のナノサイズの高分子ミセル又はナノ粒子の調製方法。
  5. 　請求項１に記載の式Ｉで表される共重合体又は請求項２に記載されたナノサイズの高分子ミセル又はナノ粒子を有効成分とする製薬学的製剤。
  6. 　急性腎臓疾患、炎症性疾患、脳疾患、ガンのいずれか１種以上の疾患の処置に使用するための、請求項５に記載の製薬学的製剤。
  7. 　処置の必要な被験者又は患者に有効量の請求項１に記載の式Ｉで表される共重合体又は請求項２に記載されたナノサイズの高分子ミセルを投与し、急性腎臓疾患、炎症性疾患、脳疾患のいずれか１種以上の疾患を予防又は治療する方法。
  8. 　式ＩＩ
    Figure JPOXMLDOC01-appb-I000003
    　式中：Ａ、Ｒ、ｍ、ｎ、ｐは、請求項１において式Ｉで表される共重合体について定義したのと同義であり、Ｒは水素原子を表し、
    　ｍの付された反復単位中の各β－ヒドロキシル酪酸単位は、［Ｒ］型のエナンチオマーと［Ｓ］型のエナンチマーの等価量が相互にランダムに存在する、
    で表されるブロック共重合体又はそのアルカリ金属塩。
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