WO2025005276A1 - グラム陰性菌の外膜透過性ポリペプチド、該ポリペプチドを含む抗菌性タンパク質、抗菌剤又は消毒剤、医薬組成物並びに抗菌剤組成物又は消毒剤組成物 - Google Patents

グラム陰性菌の外膜透過性ポリペプチド、該ポリペプチドを含む抗菌性タンパク質、抗菌剤又は消毒剤、医薬組成物並びに抗菌剤組成物又は消毒剤組成物 Download PDF

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淳平 内山
伊代 内山
憲 福田
健児 山城
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Kochi University NUC
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Kochi University NUC
Okayama University NUC
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    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/62—DNA sequences coding for fusion proteins

Definitions

  • the present invention relates to an outer membrane-permeable polypeptide of a gram-negative bacterium, an antibacterial protein containing the polypeptide, an antibacterial agent or disinfectant, a pharmaceutical composition, and an antibacterial agent composition or disinfectant composition.
  • polypeptides that have permeability to the lipopolysaccharide-containing outer membrane of gram-negative bacteria may be abbreviated as “outer membrane-permeable polypeptides.”
  • Pseudomonas aeruginosa is a pathogenic bacterium that is innately resistant to drugs and can also acquire drug resistance, causing difficult-to-treat infections in humans and animals (cattle, dogs, etc.). It is also included in the list of drug-resistant bacteria of high urgency published by the WHO. Today, there is a demand for the development of new antibacterial agents against Pseudomonas aeruginosa.
  • Patent Document 1 discloses an endolysin protein against staphylococci.
  • Non-patent documents 1 to 3 disclose endolysin proteins of gram-negative bacteria.
  • the cell walls of gram-negative bacteria have an outer membrane, and natural endolysins alone cannot kill them.
  • natural endolysins capable of killing such gram-negative bacteria do not have the bactericidal effect necessary and sufficient for use as a treatment for infectious diseases.
  • One object of the present invention is to provide an antibacterial agent or disinfectant that is effective against gram-negative bacteria, including multidrug-resistant bacteria, and in particular against Pseudomonas aeruginosa.
  • Another object of the present invention is to provide a polypeptide capable of increasing the permeability of endolysin through the outer membrane of Gram-negative bacteria, and a polynucleotide encoding the same.
  • a polypeptide having lipopolysaccharide-containing outer membrane permeability of Gram-negative bacteria which is one of the following (i) to (iii): (i) a polypeptide consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO:1; SEQ ID NO: 1: NSGTPKNVSRGTSSTKTTPKYKVKNGDNLTKIAKKHNTTVATLLKLNPGIKDPNMIRVGQTLNVTGSGGKTHKVKSGDTLSKIAVDNKTTVSKLMNLNPEITNPNHIKVGQTIRLSRKLRRLKRKIAHKVKKY (ii) a polypeptide having an amino acid sequence in which one or several amino acids are deleted, substituted, inserted and/or added in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO:
  • a pharmaceutical composition comprising the antibacterial protein according to [3].
  • An antibacterial composition or disinfectant composition comprising the antibacterial protein according to [3] and an outer membrane permeabilizing agent, the outer membrane permeabilizing agent being ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) or a salt thereof.
  • EDTA ethylenediaminetetraacetic acid
  • a method for preventing a disease caused by infection with gram-negative bacteria or for killing gram-negative bacteria comprising administering to a human a pharmaceutical composition containing the antibacterial protein according to [3].
  • a method for preventing a disease caused by infection with gram-negative bacteria or for killing gram-negative bacteria comprising administering to an animal a pharmaceutical composition containing the antibacterial protein according to [3].
  • the present invention provides an antibacterial agent, disinfectant, antibacterial composition, and disinfectant composition that are effective against gram-negative bacteria, including Pseudomonas aeruginosa, and in particular against multidrug-resistant gram-negative bacteria.
  • Viable bacteria count results Viable bacteria count results Morphological observation of bactericidal activity against Pseudomonas aeruginosa strain PAO1 Comparison of turbidity and morphological observations of Pseudomonas aeruginosa strain PAO1 Inhibitory effect on growth of Pseudomonas aeruginosa strain PAO1 Bactericidal activity against Pseudomonas aeruginosa Bactericidal effect against various bacteria Results of a two-day observation of survival in a mouse model of sepsis Methods and results of therapeutic experiments in mice infected with Pseudomonas aeruginosa Efficacy study results for keratitis mouse model
  • the antibacterial protein of the present invention comprises an outer membrane-permeable polypeptide and an endolysin.
  • the outer membrane-permeable polypeptide and the endolysin may be linked directly or via a suitable linker.
  • the linker may be a polypeptide containing one amino acid or two or more amino acids.
  • amino acid includes the 20 types of amino acids that make up proteins (Gly, Ala, Met, Ser, Thr, Cys, Met, Asp, Asn, Glu, Gln, Leu, Ile, Val, His, Lys, Arg, Phe, Tyr, and Trp).
  • the deletion of an amino acid refers to the selection and deletion of an arbitrary amino acid from the amino acid sequence of an outer membrane-permeable polypeptide or an endolysin.
  • the insertion of an amino acid refers to the insertion of one to several amino acids at a site other than the N-terminus or C-terminus of the amino acid sequence of an outer membrane-permeable polypeptide or an endolysin.
  • the addition of an amino acid refers to the addition of one to several amino acids at the N-terminus or C-terminus of the amino acid sequence of an outer membrane-permeable polypeptide or an endolysin. Examples of amino acid substitutions include conservative amino acid substitutions.
  • Conservative amino acid substitutions refer to the substitution of amino acids with similar properties such as polarity, electrical properties, and structural properties, such as hydrophobic amino acids, polar amino acids, acidic amino acids, basic amino acids, amino acids with branched side chains, and aromatic amino acids.
  • hydrophobic (non-polar) amino acids include glycine, alanine, valine, leucine, isoleucine, and proline; examples of polar amino acids include serine, threonine, cysteine, methionine, asparagine, and glutamine; examples of acidic amino acids include aspartic acid and glutamic acid; examples of basic amino acids include lysine, arginine, and histidine; examples of amino acids with branched side chains include valine, isoleucine, and leucine; examples of aromatic amino acids include phenylalanine, tyrosine, tryptophan, and histidine.
  • Preferred conservative amino acid substitutions include substitutions between amino acids selected from valine, leucine, and isoleucine, phenylalanine and tyrosine, lysine and arginine, alanine and valine, and asparagine and glutamine.
  • deletion, substitution, insertion and/or addition of amino acids can be achieved by modifying the gene encoding the antibacterial protein, outer membrane permeable polypeptide or endolysin by methods known in the art.
  • Mutations can be introduced into the gene by known methods such as the Kunkel method or the gapped duplex method or methods equivalent thereto, for example, by using a mutation introduction kit that utilizes site-directed mutagenesis (e.g. Mutant-K (manufactured by TAKARA Bio), Mutant-G (manufactured by TAKARA Bio)) or the like, or by using the LA PCR in vitro Mutagenesis series kit (manufactured by TAKARA Bio).
  • Mutant-K manufactured by TAKARA Bio
  • Mutant-G manufactured by TAKARA Bio
  • LA PCR in vitro Mutagenesis series kit manufactured by TAKARA Bio
  • the number of amino acids in the linker is preferably 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 or 10, more preferably 1, 2, 3, 4, 5 or 6, and even more preferably 1, 2, 3 or 4.
  • the outer membrane permeable polypeptide and the endolysin are preferably directly linked.
  • the outer membrane permeable polypeptide is preferably present on the C-terminal side of the endolysin.
  • Outer membrane-permeable polypeptides and polynucleotides encoding the same Outer membrane-permeable polypeptides are the following polypeptides (i) to (iii): (i) a polypeptide consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO:1 (ii) A polypeptide having an amino acid sequence in which one or several amino acids have been deleted, substituted, inserted and/or added in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 and having permeability to the lipopolysaccharide-containing outer membrane of Gram-negative bacteria.
  • the polypeptide represented by SEQ ID NO: 1 is a polypeptide in which the following D domain and S domain are linked, with the D domain located at the N-terminus and the S domain located at the C-terminus of the polypeptide (DS).
  • a polypeptide having an S domain at the N-terminus and a D domain at the C-terminus (SD) has a significantly weaker effect of enhancing the antibacterial activity of endolysin against gram-negative bacteria than DS.
  • Amino acid sequence of the D domain (SEQ ID NO: 3): NSGTPKNVSRGTSSTKTTPKYKVKNGDNLTKIAKKHNTTVATLLKLNPGIKDPNMIRVGQTLNVTGSGGKTHKVKSGDTLSKIAVDNKTTVSKLMNLNPEITNPNHIKVGQTIRLS
  • Amino acid sequence of S domain (SEQ ID NO: 4): RKLRRLKRKIAHKVKKY
  • a particularly preferred outer membrane permeable polypeptide is that set forth in SEQ ID NO:1.
  • one or several (e.g., 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2) amino acids of the polypeptide represented by SEQ ID NO:1 may be deleted, substituted, inserted, and/or added.
  • the outer membrane permeable polypeptide may have a sequence identity of 80% or more, 81% or more, 82% or more, 83% or more, 84% or more, 85% or more, 86% or more, 87% or more, 88% or more, 89% or more, 90% or more, 91% or more, 92% or more, 93% or more, 94% or more, 95% or more, 96% or more, 97% or more, 98% or more, or 99% or more with the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1.
  • the sequence identity value indicates a value calculated with default settings using software (e.g., FASTA, DANASYS, and BLAST) that calculates identity between multiple amino acid sequences.
  • the polynucleotide is a polynucleotide that encodes an outer membrane permeable polypeptide.
  • a polynucleotide encoding a preferred outer membrane permeable polypeptide of the present invention is (iv) a polynucleotide consisting of a DNA sequence encoding the amino acid sequence represented by SEQ ID NO:1; (v) a polynucleotide consisting of a DNA sequence represented by SEQ ID NO:2. (vi) A polynucleotide having a DNA sequence that has 80% or more sequence identity with a polynucleotide having the DNA sequence of (iv) or (v) and that encodes a polypeptide that has lipopolysaccharide-containing outer membrane permeability of Gram-negative bacteria.
  • the polynucleotide encoding the outer membrane permeable polypeptide may have sequence identity of 80% or more, 81% or more, 82% or more, 83% or more, 84% or more, 85% or more, 86% or more, 87% or more, 88% or more, 89% or more, 90% or more, 91% or more, 92% or more, 93% or more, 94% or more, 95% or more, 96% or more, 97% or more, 98% or more, or 99% or more with a polynucleotide consisting of a DNA sequence encoding the amino acid sequence represented by SEQ ID NO:1 or a polynucleotide represented by SEQ ID NO:2.
  • the sequence identity value indicates a value calculated with default settings using software (e.g., FASTA, DANASYS, and BLAST) that calculates identity between multiple amino acid sequences.
  • Endolysin Endolysin is a protein having peptidoglycan decomposition activity.
  • peptidoglycan decomposition activity refers to an activity of binding to or recognizing peptidoglycan in the cell wall of gram-negative bacteria including Pseudomonas aeruginosa, and cleaving the peptidoglycan to specifically cause bacteriolysis.
  • endolysin known endolysins are widely used, for example, endolysins derived from phages of Gram-negative bacteria.
  • Specific endolysins include a polypeptide ply_pitti26 isolated from the lytic phage pitti26 for use in staphylococcal infection symptoms (JP Patent Publication No. 2010-536354), an endolysin from S. aureus phage ⁇ 2638a (JP Patent Publication No. 6261086), an endolysin derived from phage phi MR11 (J Infect Dis.
  • Non-Patent Documents 1 to 3 the endolysin derived from the Bacillus amyloliquefaciens phage (FEBS Letter. 500(1-2), 56-59, 2001), and the Artilysins (mBio. 2014 Jul. 1;5(4):e01379-14. doi: 10.1128/mBio.01379-14.).
  • the endolysin contained in the antibacterial protein of the present invention may be a modified protein thereof, so long as it has the above-mentioned peptidoglycan decomposition activity.
  • Modified proteins include proteins consisting of an amino acid sequence in which one or several (e.g., 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2) amino acids have been deleted, substituted, inserted, and/or added to the amino acid sequence of a known endolysin, and have peptidoglycan decomposition activity, and proteins consisting of an amino acid sequence that has 80% or more, 81% or more, 82% or more, 83% or more, 84% or more, 85% or more, 86% or more, 87% or more, 88% or more, 89% or more, 90% or more, 91% or more, 92% or more, 93% or more, 94% or more, 95% or more, 96% or more, 97% or more, 98% or more, 99% or more sequence identity to the amino acid sequence of a known endolysin, and have peptid
  • the antibacterial protein of the present invention comprises an outer membrane permeable polypeptide and an endolysin.
  • a preferred antibacterial protein has an endolysin at the N-terminus and an outer membrane permeable polypeptide at the C-terminus.
  • the antibacterial protein can be linked to tags such as Strep tag, His tag, Flag tag, Xpress tag, Avi tag, calmodulin tag, polyglutamate tag, HA tag, Myc tag, Nus tag, S tag, X tag, SBP tag, Sof tag, V5 tag, CBP, GST, MBP, GFP, thioredoxin tag, or a combination thereof.
  • a 6xHis tag is preferred.
  • the antibacterial protein, antibacterial agent, disinfectant, antibacterial composition and disinfectant composition of the present invention are effective against gram-negative bacteria, particularly multidrug-resistant gram-negative bacteria.
  • gram-negative bacteria include Pseudomonas aeruginosa, Escherichia coli, enterohemorrhagic Escherichia coli (EHEC), Enterobacteriaceae, Vibrio, Campylobacter, Salmonella, Legionella, cholera, Haemophilus influenzae, Klebsiella, Enterobacter, Serratia, Pertussis, Yersinia, Pseudomonas, Helicobacter pylori, and more specifically, Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa, Enterobacter spp., Serratia marcescens, Acinetobacter spp., Proteus spp., Klebsiella oxytoca,
  • Multidrug-resistant gram-negative bacteria include multidrug-resistant Acinetobacter (MDRA), multidrug-resistant Pseudomonas aeruginosa (MDRP), and carbapenem-resistant Enterobacteriaceae.
  • MDRA multidrug-resistant Acinetobacter
  • MDRP multidrug-resistant Pseudomonas aeruginosa
  • Enterobacteriaceae carbapenem-resistant Enterobacteriaceae.
  • the antibacterial protein of the present invention can be produced by genetic engineering methods using a polynucleotide containing a gene that encodes it.
  • it can be produced by a method in which RNA is prepared by in vitro transcription from a recombinant vector having a polynucleotide containing a gene that encodes the antibacterial protein, and then this is used as a template for in vitro translation, or by a method in which a polynucleotide containing a gene that encodes the antibacterial protein is operably linked to and incorporated into a suitable vector, which is then introduced into a host cell to produce a transformed cell, and the desired antibacterial protein is expressed from the transformed cell.
  • expression includes any step involved in the production of a protein, including transcription, post-transcriptional modification, translation, post-translational modification, and secretion.
  • the vector can be appropriately selected and used from those suitable for the host cell into which it is introduced.
  • the vector also contains a polynucleotide containing a gene encoding the antibacterial protein of the present invention operably linked to an appropriate promoter, and preferably contains a transcription termination signal, i.e., a terminator region, downstream of the polynucleotide. It can also contain a selection marker gene (drug resistance gene, gene complementing auxotrophic mutation, etc.) for selecting transformants. It can also contain a sequence encoding a tag sequence useful for separating and purifying the expressed protein.
  • the vector can also be one that is incorporated into the genome of the host cell.
  • the vector can be introduced into the host cell by a transformation method known per se, such as the competent cell method, the protoplast method, or the calcium phosphate coprecipitation method.
  • the host cells into which the vector is introduced and used to express the recombinant protein may be any cells capable of expressing the vector, including commonly used known microorganisms such as bacteria, yeast, fungi, and mammalian cells. Examples of bacteria include gram-positive bacteria such as Bacillus or Streptomyces.
  • the recombinant cells can be cultured by a known method suitable for the host cells.
  • the expressed protein can be purified by collecting the cells from the culture supernatant of the host cells by centrifugation or the like, grinding them with ultrasound or glass beads, etc., removing solid matter such as cell debris by centrifugation or the like to prepare a crude enzyme solution, and then using one or more of the known methods used for purifying proteins or peptides, such as ammonium sulfate salting out, precipitation separation with organic solvents (ethanol, methanol, acetone, etc.), ion exchange chromatography, isoelectric focusing chromatography, gel filtration chromatography, hydrophobic chromatography, adsorption column chromatography, affinity chromatography using a substrate or antibody, etc., reverse phase column chromatography, chromatography such as HPLC, and filtration processes such as microfiltration, ultrafiltration, and reverse osmosis filtration, in combination.
  • the known methods used for purifying proteins or peptides such as ammonium sulfate salting out, precipitation separation with organic solvents (ethanol
  • the antibacterial protein of the present invention can also be produced by chemical synthesis based on its amino acid sequence.
  • chemically synthesizing an antibacterial protein it can be done by known chemical synthesis methods such as the Fmoc method (fluorenylmethyloxycarbonyl method) and the tBoc method (t-butyloxycarbonyl method).
  • the present invention also provides the antibacterial protein, antibacterial agent or disinfectant, pharmaceutical composition, and antibacterial agent composition or disinfectant composition of the present invention for use as a human medicine.
  • the antibacterial agent, disinfectant, antibacterial agent composition, and disinfectant composition of the present invention may contain a "pharmaceutical acceptable carrier.” Acceptable for use in mammals, including humans, include any adjuvant, carrier, excipient, glidant, sweetener, diluent, preservative, dye/colorant, flavoring, surfactant, wetting agent, dispersant, suspending agent, stabilizer, isotonic agent, solvent, surfactant, or emulsifier approved by the Japanese Pharmacopoeia, the U.S. Food and Drug Administration, etc.
  • Exemplary pharma- ceutically acceptable carriers include, but are not limited to, sugars such as lactose, glucose, and saccharose; starches such as corn starch and potato starch; cellulose and its derivatives such as sodium carboxymethylcellulose, ethylcellulose, and cellulose acetate; tragacanth; malt; gelatin; talc; cocoa butter, waxes, tallow and vegetable fats, paraffin, silicones, bentonite, silicic acid, zinc oxide; oils such as peanut oil, cottonseed oil, safflower oil, sesame oil, olive oil, corn oil, and soybean oil; glycols such as propylene glycol; polyols such as glycerin, sorbitol, mannitol, and polyethylene glycol; esters such as ethyl oleate and ethyl laurate; agar; buffers such as magnesium hydroxide and aluminum hydroxide, alginic acid, pyrogen-free water,
  • the antimicrobial agents, disinfectants, antimicrobial compositions and disinfectant compositions of the present invention are formulated for parenteral administration, e.g., intravascular (intravenous or intraarterial) administration.
  • parenteral administration e.g., intravascular (intravenous or intraarterial) administration.
  • the antimicrobial agents and antimicrobial compositions contemplated herein may be injected intravenously into a mammalian subject, such as a human, in a single dose.
  • Preferred embodiments of the antibacterial agent, disinfectant, antibacterial composition, and disinfectant composition of the present invention include use for diseases such as pneumonia, bacteremia, septicemia, tetanus, Salmonella infection, meningitis, scarlet fever, grassland fever, sexually transmitted bacterial diseases, surgical site infections, necrotizing fasciitis, Escherichia coli infection, bacterial skin diseases, Campylobacter infection, cholera, gastritis, peptic ulcer, diarrhea, dysentery, food poisoning, typhoid fever, Legionnaires' disease, opportunistic infections, urinary tract infections, and whooping cough, or use for disinfecting hands, medical instruments, or medical materials.
  • they can be used for the purpose of disinfecting medical instruments and peripherals in the eyes, urinary system, or respiratory system where Pseudomonas aeruginosa may occur.
  • Another preferred embodiment of the present invention is for ophthalmic diseases, and can be used in the form of eye drops, eye ointments, etc. to treat keratitis, corneal ulcers, blepharitis, conjunctivitis, styes, blepharitis, dacryocystitis, prevent bacterial infections before and after ophthalmic surgery including cataract surgery, and as a contact lens preservative.
  • the antibacterial protein of the present invention can also be used for animals (veterinary).
  • the antibacterial protein, antibacterial agent or disinfectant, pharmaceutical composition and antibacterial agent or disinfectant composition of the present invention will typically be administered in an acceptable formulation according to normal veterinary practice, and a veterinarian can determine the dosage regimen and route of administration that is most suitable for a particular animal.
  • they may contain the aforementioned "pharmaceutical acceptable carriers,” use the aforementioned routes of administration, and be used for the aforementioned purposes of disinfection or for the prevention or treatment of disease against ophthalmic diseases.
  • the term "animal” includes mammals, non-mammals, birds, etc., and preferably, the animals of the present invention are livestock, pet animals, laboratory animals, farm animals, etc. More specifically, the animals of the present invention include, but are not limited to, cows, horses, donkeys, camels, alpacas, pigs, goats, sheep, dogs, cats, chinchillas, rabbits, minks, ferrets, guinea pigs, mice, rats, hedgehogs, weasels, kangaroos, chimpanzees, gorillas, orangutans, cynomolgus monkeys, baboons, chickens, pigeons, turkeys, pheasants, ostriches, guinea fowl, ducks, and the like.
  • the antibacterial protein of the present invention when used in veterinary medicine, it can also be used for the purpose of preventing or treating typical infectious diseases in animals.
  • typical infectious diseases in animals include those described in Journal of the Japanese Society of Veterinary Medicine 29, 429-433 (1976).
  • infectious diseases in animals that are the target of the antibacterial protein of the present invention include, but are not limited to, acute or chronic mastitis, genital infection, septicemia, and sole ulcers (foot disease) in cattle; endometritis, genital infection, and pulmonary suppuration in horses; bronchopneumonia, fibrous pleurisy, and hemorrhagic enteritis in pigs; otitis externa, genital infection, urethritis, endocarditis, pneumonia, septicemia, and eye inflammation in dogs; and otitis externa, genital infection, urethritis, endocarditis, pneumonia, septicemia, and eye inflammation in cats.
  • the present invention provides the use of an antimicrobial protein of the present invention in the manufacture of a human or veterinary medicament for the prevention or treatment of a medical condition caused by a Gram-negative bacterial infection in a human or animal.
  • Example 1 We created a protein by fusing endolysin from Pseudomonas aeruginosa phage PAJU2 (YP_002284408; 138 aa; sequence number 5), a partial sequence of endolysin [Bacillus amyloliquefaciens phage Morita2001] (143-258 aa of AAK40280; sequence number 6), and the peptide SMAP17 (RKLRRLKRKIAHKVKKY), which is a mutated peptide with a partial sequence of ovine antibacterial peptide SMAP29 (1-17 aa of AAA85470; sequence number 7).
  • the base sequence used is as follows:
  • the fusion genes DS and SD were cloned, and 27 was cloned, and the cloning was carried out so that a protein fused with 27 and DS or SD could be expressed. There is a restriction enzyme site at each end.
  • SalI-DS-XbaI, SalI-SD-XbaI, SacI-DS-XhoI, and SacI-SD-XhoI were introduced into pColdII XhoI-27-EcoRI to create the following fusion protein expression plasmids.
  • Expression method 1 One colony was picked from LB medium containing 100 ⁇ g/ml ampicillin, inoculated into an LB medium solution containing 100 ⁇ g/ml ampicillin, and cultured overnight at 37° C. with shaking. 2. Add the bacteria that have been cultured overnight to the culture medium (LB + 100 ⁇ g/ml ampicillin), and when the OD600 reaches 1.0, cool the culture medium on ice and leave it for 30 minutes. *It takes time to reach OD1.0, so for 1L culture, about 40ml of overnight cultured bacteria is needed. *In Takara's protocol, the OD600 is 0.4 to 0.5, but when the expression of this protein was examined, the highest expression level was found at OD1.0. 3. IPTG was added to a final concentration of 1.0 mM, and the mixture was cultured with shaking at 15°C for 24 hours.
  • HIGH Density COBALT (Protenova, Kagawa, Japan) equilibrated with 100 mM phosphate buffer (300 mM NaCl, pH 7.8) was added to the resulting supernatant and allowed to bind overnight at 4°C with rotation. 4. The protein-bound HIGH Density COBALT was allowed to fall by gravity, and the excess turbid liquid (supernatant) was discarded. 5. 25 ml of 100 mM phosphate buffer (300 mM NaCl, pH 7.8) was added, and the HIGH Density COBALT was washed for 10 minutes with rotation at 4°C. 6.
  • HMELGTLEMRTSQRGIDLIKSFEGLRLSAYQDSVGVWTIGYGTTRGVTRYMTITVEQAERMLSNDIQRFEPELDRLAKVPLNQNQWDALMSFVYNLGAANLASSTLLKLLNKGDYQGAADQFPRWVNAGGKRLDGLVKRRAAERALFLEPLSKL VDNSGTPKNVSRGTSSTKTTPKYKVKNGDNLTKIAKKHNTTVATLLKLNPGIKDPNMIRVGQTLNVTGSGGKTHKVKSGDTLSKIAVDNKTTVSKLMNLNPEITNPNHIKVGQTIRLSRKLRRLKRKIAHKVKKYSRHHHHHH (54+62 116) >27DS (SEQ ID NO:9) HMMRTSQRGIDLIKSFEGLRLSAYQDSVGVWTIGYGTTRGVTRYMTITVEQAERMLSNDIQRFEPELDRLAK
  • Example 2 Examination of the in vitro bactericidal effect of "27DS" [Preparation of bacteria] 0.25 ml of P. aeruginosa PAO1 strain cultured overnight was added to 7 ml LB broth (18 mm test tube) and incubated with shaking at 37°C. ⁇ After 2-3 hours, use a Taitec digital colorimeter and simple OD monitor miniphoto518R, and when the OD 660 reaches around 0.6, collect it. ⁇ Wash once with PBS (centrifuge, discard supernatant, resuspend in PBS, centrifuge, add PBS). ⁇ Using a 96-well spectrophotometer (Multi-scan FC, ThermoFisher Scientific), the bacterial turbidity was adjusted with PBS to an OD 595 of 0.5 to 1.0.
  • the cells were incubated with shaking at 37°C for 30 min, and gluteraldehyde (2%) was added to stop the reaction. After centrifugation, the cells were coated with 1% agarose and washed with PBS containing 5% sucrose. They were fixed with 1.5% osmium tetroxide in 0.1 mol/l phosphate buffer containing 5% sucrose for 1 h at 4°C, and then dehydrated using graded ethanol solutions. The fixative was replaced with propylene oxide, and the samples were embedded in epoxy resin. Ultrathin sections were prepared, stained with uranyl acetate and lead citrate, and observed under a transmission electron microscope (Figure 3).
  • Bacterial proportion (%) bacterial concentration (treatment group; cfu/mL)/ bacterial concentration (PBS group; cfu/mL) 27DS alone can kill Pseudomonas aeruginosa, including multidrug-resistant Pseudomonas aeruginosa. 27DS+EDTA shows a very high bactericidal effect.
  • 27DS and 27DS+EDTA treatments showed weak bactericidal activity against Klebsiella pneumoniae (Klebsiella pneumoniae NDM3, Klebsiella pneumoniae IID5209).
  • Example 3 Efficacy of "27DS" in an infected mouse model 3.1. Efficacy study in a septic mouse model Pseudomonas aeruginosa PAO1 was cultured in LB medium, raised to mid-log phase, and washed three times with saline. 6.8 x 10 6 bacteria/mL of P. aeruginosa PAO1 suspended in saline was prepared.
  • Example 4 Resistant bacteria of 27DS are unlikely to occur 27DS was subcultured and the minimum inhibitory concentration (MIC) was measured before and after the culture. The measurement method was in accordance with the CLSI (Clinical & Laboratory Standards Institute) Guidelines. Even after 20 subcultures, no change was observed in the MIC value of the bacterial strain, suggesting that resistant bacteria of 27DS are unlikely to occur.
  • CLSI Circal & Laboratory Standards Institute

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Abstract

以下の(i)～(iii)のポリペプチド、該ポリペプチドを含む抗菌性タンパク質、抗菌剤、消毒剤、医薬組成物、抗菌剤組成物及び消毒剤組成物を提供する。 (i) 配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド (ii) 配列番号１で表されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入及び／又は付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチド、又は、 (iii) 配列番号１で表されるアミノ酸配列と80％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチド

Description

グラム陰性菌の外膜透過性ポリペプチド、該ポリペプチドを含む抗菌性タンパク質、抗菌剤又は消毒剤、医薬組成物並びに抗菌剤組成物又は消毒剤組成物
　本発明は、グラム陰性菌の外膜透過性ポリペプチド、該ポリペプチドを含む抗菌性タンパク質、抗菌剤又は消毒剤、医薬組成物並びに抗菌剤組成物又は消毒剤組成物に関する。
　本明細書において、「グラム陰性菌のリポ多糖含有外膜に対する透過性を有するポリペプチド」を「外膜透過性ポリペプチド」と略すことがある。
　緑膿菌は、生来薬剤耐性を有していることに加えて、薬剤耐性を獲得し、ヒト及び動物（牛、イヌなど）に対して難治性の感染症を引き起こす病原細菌である。WHO が発表している緊急性が高い薬剤耐性菌のリストの中にも入っている細菌である。今日、緑膿菌に対する新規抗菌剤の開発が求められている。
　従来の抗菌薬である低分子化合物は、開発系があるため、研究は継続的に行われている。
しかしながら、低分子化合物ライブラリーには限りがあり、新規の作用機序を有する感染症薬の発見が極めて、難しい状況にある。このような状況があるため、今日、抗菌ペプチド、ファージ、エンドライシンが全く異なる感染症薬の新規モダリティとして研究されている。
　エンドライシンは、これまでファージの天然型エンドライシンを中心に研究が行われてきた。
　特許文献１は、ブドウ球菌に対するエンドライシンタンパク質を開示する。
　非特許文献１～３は、グラム陰性菌のエンドライシンタンパク質を開示する。
　基本的に、グラム陰性菌の細胞壁には外膜があり、天然型エンドライシン単体では殺菌できなかった。しかしながら、このようなグラム陰性菌を殺菌可能な天然型エンドライシンでは、感染症治療薬に必要十分な殺菌効果を有しない状況があった。
特開2021-112152号公報
Lai WCB, Chen X, Ho MKY, Xia J, Leung SSY. Bacteriophage-derived endolysins to target gram-negative bacteria. Int J Pharm. 589, 119833, 2020. De Maesschalck V, Gutierrez D, Paeshuyse J, Lavigne R, Briers Y. Advanced engineering of third-generation lysins and formulation strategies for clinical applications.Crit Rev Microbiol. 46(5), 548-564, 2020. Gontijo MTP, Jorge GP, Brocchi M. Current Status of Endolysin-Based Treatments against Gram-Negative Bacteria. Antibiotics (Basel). 10(10), 1143, 2021.
　本発明の１つの目的は、多剤耐性菌を含むグラム陰性菌、特に緑膿菌に有効な抗菌剤又は消毒剤を提供することである。
　本発明の他の目的は、エンドライシンのグラム陰性菌の外膜透過性を高めることができるポリペプチド、それをコードするポリヌクレオチドを提供することである。
　本発明は、以下の外膜透過性ポリペプチド、抗菌性タンパク質及びそれらをコードするポリヌクレオチド、抗菌剤又は消毒剤、医薬組成物並びに抗菌剤組成物又は消毒剤組成物を提供するものである。
〔１〕
　以下の(i)～(iii)のグラム陰性菌のリポ多糖含有外膜透過性を有するポリペプチド：
(i) 配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、
配列番号1：NSGTPKNVSRGTSSTKTTPKYKVKNGDNLTKIAKKHNTTVATLLKLNPGIKDPNMIRVGQTLNVTGSGGKTHKVKSGDTLSKIAVDNKTTVSKLMNLNPEITNPNHIKVGQTIRLSRKLRRLKRKIAHKVKKY
(ii) 配列番号１で表されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、グラム陰性菌のリポ多糖含有外膜透過性を有するポリペプチド、
(iii) 配列番号１で表されるアミノ酸配列と80％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、グラム陰性菌のリポ多糖含有外膜透過性を有するポリペプチド。
〔２〕
　以下の(iv)～(vi)のポリヌクレオチド：
(iv) 〔１〕に記載のポリペプチドをコードするDNA配列からなるポリヌクレオチド、
(v) 配列番号２で表されるDNA配列からなるポリヌクレオチド、
配列番号２：AATTCTGGCACGCCTAAGAACGTATCGCGCGGCACGTCATCCACGAAGACGACGCCTAAGTACAAGGTAAAGAACGGCGATAATCTCACCAAAATTGCCAAGAAACACAATACGACAGTGGCTACTTTATTAAAACTCAATCCAGGCATTAAAGATCCGAACATGATTCGTGTCGGTCAAACATTAAATGTGACAGGGAGCGGCGGTAAGACACACAAAGTAAAGAGTGGTGATACCTTGAGCAAGATTGCCGTGGATAATAAGACTACAGTTAGTAAGTTGATGAATTTGAATCCTGAGATCACAAATCCTAATCATATCAAAGTAGGGCAGACCATTCGCTTAAGCCGGAAGCTCCGTCGGCTTAAACGTAAGATCGCTCACAAGGTAAAAAAATAT
(vi) (iv)又は(v)のDNA配列からなるポリヌクレオチドと配列同一性が80％以上のDNA配列からなり、かつ、グラム陰性菌のリポ多糖含有外膜透過性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
〔３〕
　エンドライシンと〔１〕に記載のポリペプチドを含み、前記エンドライシンのN末端側またはC末端側に請求項１に記載のポリペプチドを含む抗菌性タンパク質。
〔４〕
　〔３〕に記載の抗菌性タンパク質をコードするポリヌクレオチド。
〔５〕
　〔３〕に記載の抗菌性タンパク質を含むグラム陰性菌に対する抗菌剤又は消毒剤。
〔６〕
　グラム陰性菌が多剤耐性菌または緑膿菌である、〔５〕に記載の抗菌剤又は消毒剤。
〔７〕
　〔３〕に記載の抗菌性タンパク質を含む医薬組成物。
〔８〕
　前記緑膿菌の対象となる疾患が、角膜炎、涙嚢炎、眼内炎、蜂窩織炎による眼感染症、敗血症、肺炎、多剤耐性グラム陰性菌感染症、日和見感染症、又はその他、緑膿菌が起因する疾患から選択される1種又は複数種の疾患である〔７〕に記載の医薬組成物。
〔９〕
　〔３〕に記載の抗菌性タンパク質と外膜透過剤と含み、前記外膜透過剤がエチレンジアミン四酢酸（EDTA）又はその塩である、抗菌剤組成物又は消毒剤組成物。
〔１０〕
　グラム陰性菌が多剤耐性菌または緑膿菌である、〔９〕に記載の抗菌剤組成物又は消毒剤組成物。
〔１１〕
　〔３〕に記載の抗菌性タンパク質を含む医薬組成物をヒトに投与することを含む、グラム陰性菌の感染に起因する疾患を予防またはグラム陰性菌を殺菌する方法。
〔１２〕
　〔３〕に記載の抗菌性タンパク質を含む医薬組成物を動物に投与することを含む、グラム陰性菌の感染に起因する疾患を予防またはグラム陰性菌を殺菌する方法。
　本発明によれば、緑膿菌を含むグラム陰性菌、特に、多剤耐性のグラム陰性菌に有効な抗菌剤、消毒剤、抗菌剤組成物及び消毒剤組成物を提供することができる。
生菌数の測定結果 生菌数の測定結果 緑膿菌PAO1株に対する殺菌作用の形態学的観察 緑膿菌PAO1株の濁度と形態学的観察の比較 緑膿菌PAO1株に対する増殖の阻害効果 緑膿菌に対する殺菌作用 各種細菌に対する殺菌作用 敗血症マウスモデルの生存についての2日間観察の結果 緑膿菌感染マウスにおける治療実験の方法および結果 角膜炎マウスモデルに対する有効性検討結果
　本明細書において、単数形（ａ, ａｎ, ｔｈｅ等）は、本明細書で別途明示がある場合又は文脈上明らかに矛盾する場合を除き、単数と複数を含むものとする。 
　本明細書において、「含有する（comprise）」は、「実質的にのみからなる（consist essentially of）」、及び「のみからなる（consist of）」も包含する概念である。
　本発明の抗菌性タンパク質は、外膜透過性ポリペプチドとエンドライシンを含む。外膜透過性ポリペプチドとエンドライシンは、直接連結してもよく、好適なリンカーを介して結合してもよい。リンカーは1個のアミノ酸又は２以上の任意のアミノ酸を含むポリペプチドであってもよい。
　本明細書において、「アミノ酸」は、タンパク質を構成する２０種のアミノ酸（Gly、Ala、Met、Ser、Thr、Cys、Met、Asp、Asn、Glu、Gln、Leu、Ile、Val、His、Lys、Arg、Phe、Tyr、Trp）を包含する。
　本明細書において、アミノ酸の欠失とは、外膜透過性ポリペプチド又はエンドライシンのアミノ酸配列の中から、任意のアミノ酸を選択して欠失させることをいう。また、アミノ酸の挿入とは、外膜透過性ポリペプチド又はエンドライシンのアミノ酸配列のＮ末端又はＣ末端側以外の部位に、１から数個のアミノを挿入させることをいう。アミノ酸の付加とは、外膜透過性ポリペプチド又はエンドライシンのアミノ酸配列のＮ末端又はＣ末端側に、１から数個のアミノを付加させることをいう。アミノ酸の置換としては、例えば保存的アミノ酸置換が挙げられる。保存的アミノ酸置換とは、疎水性アミノ酸、極性アミノ酸、酸性アミノ酸、塩基性アミノ酸、分枝状側鎖を有するアミノ酸、芳香族アミノ酸のように極性、電気的性質、構造的性質などの性質が類似したアミノ酸同士の置換を指す。疎水性（非極性）アミノ酸の例は、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリンなど、極性アミノ酸の例は、セリン、トレオニン、システイン、メチオニン、アスパラギン、グルタミンなど、酸性アミノ酸の例は、アスパラギン酸とグルタミン酸、塩基性アミノ酸の例は、リジン、アルギニン及びヒスチジン、分枝状側鎖を有するアミノ酸の例は、バリン、イソロイシン及びロイシン、芳香族アミノ酸の例は、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン及びヒスチジンである。好ましい保存的アミノ酸置換としては、バリンとロイシンとイソロイシン、フェニルアラニンとチロシン、リシンとアルギニン、アラニンとバリン、及びアスパラギンとグルタミンから選ばれるアミノ酸相互間の置換が挙げられる。
　上記のアミノ酸の欠失、置換、挿入及び／又は付加は、抗菌性タンパク質、外膜透過性ポリペプチド又はエンドライシンをコードする遺伝子を、当該技術分野で公知の手法によって改変することによって行うことができる。遺伝子に変異を導入するには、Kunkel法又は Gapped duplex法等の公知手法又はこれに準ずる方法により行うことができ、例えば部位特異的突然変異誘発法を利用した変異導入用キット（例えばMutant-K(TAKARA Bio社製）、Mutant-G(TAKARA Bio社製))などを用いて、LA PCR in vitro Mutagenesis シリーズキット(TAKARA Bio社製)を用いて変異が導入される。
　リンカーのアミノ酸数は好ましくは１、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０個、より好ましくは１、２、３、４、５又は６個、さらに好ましくは１、２、３又は４個である。外膜透過性ポリペプチドとエンドライシンは、直接連結することが好ましい。また、外膜透過性ポリペプチドはエンドライシンのＣ末端側に存在することが好ましい。
（１）外膜透過性ポリペプチド及びそれをコードするポリヌクレオチド
　外膜透過性ポリペプチドは、以下の(i)～(iii)のポリペプチドである。
(i) 配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド
(ii) 配列番号１で表されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、グラム陰性菌のリポ多糖含有外膜透過性を有するポリペプチド
(iii) 配列番号１で表されるアミノ酸配列と80％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、グラム陰性菌のリポ多糖含有外膜透過性を有するポリペプチド
　配列番号１で表されるポリペプチドは、下記のＤドメインとＳドメインを連結したものであり、ポリペプチドのＮ末端側にＤドメイン、Ｃ末端側にＳドメインを配置する（ＤＳ）。Ｎ末端側にＳドメイン、Ｃ末端側にＤドメインを有するポリペプチド（ＳＤ）は、グラム陰性菌に対するエンドライシンの抗菌作用を高める作用がＤＳに対して著しく弱い。Ｄドメインのアミノ酸配列（配列番号３）：NSGTPKNVSRGTSSTKTTPKYKVKNGDNLTKIAKKHNTTVATLLKLNPGIKDPNMIRVGQTLNVTGSGGKTHKVKSGDTLSKIAVDNKTTVSKLMNLNPEITNPNHIKVGQTIRLS
Ｓドメインのアミノ酸配列（配列番号４）：RKLRRLKRKIAHKVKKY
　特に好ましい外膜透過性ポリペプチドは、配列番号１で表されるものである。
　外膜透過性ポリペプチドは、グラム陰性菌のリポ多糖含有外膜透過性を有する限り、配列番号１で表されるポリペプチド１若しくは数個（例えば９個、８個、７個、６個、５個、４個、３個、２個）のアミノ酸が欠失、置換、挿入及び／又は付加されていてもよい。
　また、外膜透過性ポリペプチドは、配列番号１で表されるアミノ酸配列と80％以上、81％以上、82％以上、83％以上、84％以上、85％以上、86％以上、87％以上、88％以上、89％以上、90％以上、91％以上、92％以上、93％以上、94％以上、95％以上、96％以上、97％以上、98％以上、99％以上の配列同一性を有するものであってもよい。配列同一性の値は、複数のアミノ酸配列間の同一性を演算するソフトウェア（例えば、FASTA、DANASYS、及びBLAST）を用いてデフォルトの設定で算出した値を示す。
　本発明の好ましい１つの実施形態のポリヌクレオチドは、外膜透過性ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドである。
　本発明の好ましい外膜透過性ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、
(iv) 配列番号１で表されるアミノ酸配列をコードするDNA配列からなるポリヌクレオチド(v) 配列番号２で表されるDNA配列からなるポリヌクレオチド
(vi) (iv)又は(v)のDNA配列からなるポリヌクレオチドと配列同一性が80％以上のDNA配列からなり、かつ、グラム陰性菌のリポ多糖含有外膜透過性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド
である。
　外膜透過性ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、配列番号１で表されるアミノ酸配列をコードするDNA配列からなるポリヌクレオチド又は配列番号２で表されるポリヌクレオチドと80％以上、81％以上、82％以上、83％以上、84％以上、85％以上、86％以上、87％以上、88％以上、89％以上、90％以上、91％以上、92％以上、93％以上、94％以上、95％以上、96％以上、97％以上、98％以上、99％以上の配列同一性を有するものであってもよい。配列同一性の値は、複数のアミノ酸配列間の同一性を演算するソフトウェア（例えば、FASTA、DANASYS、及びBLAST）を用いてデフォルトの設定で算出した値を示す。
（２）エンドライシン
　エンドライシンは、ペプチドグリカン分解活性を有するタンパク質である。本明細書において、「ペプチドグリカン分解活性」とは、緑膿菌を含むグラム陰性菌の細胞壁のペプチドグリカンに結合若しくはペプチドグリカンを認識し、これを切断して特異的に溶菌を起こす活性をいう。
　エンドライシンとしては、公知のエンドライシンが広く用いられ、例えばグラム陰性菌のファージ由来のエンドライシンが挙げられる。具体的なエンドライシンとしては、溶菌性ファージpitti26から単離されたply_pitti26と称するブドウ球菌感染症状に使用するためのポリペプチドply_pitti26 (特表2010-536354号公報）、S.aureusファージφ2638aのエンドライシン（特許第6261086号公報）、ファージphi MR11由来のエンドライシン（J Infect Dis. 196(8):1237-47, (2007)）、緑膿菌ファージPAJU2由来のエンドライシン（Virus Research. 139(1), 131-134, 2009）、ファージ S25-3由来のエンドライシン（Viruses, 11(9):769, 2019）、バクテリオファージS6から分離した２種のエンドライシン（特開2021-112152号公報）、非特許文献１～３に記載のエンドライシンに開示されるもの、Bacillus amyloliquefaciens ファージ由来のエンドライシン（FEBS Letter. 500(1-2), 56-59, 2001.）、Artilysins（mBio. 2014 Jul 1;5(4):e01379-14. doi: 10.1128/mBio.01379-14.）などが挙げられるが、これらに限定されない。
　本発明の抗菌性タンパク質に含まれるエンドライシンは、上記のペプチドグリカン分解活性を有する限り、その改変タンパク質であってもよい。改変タンパク質としては、公知のエンドライシンのアミノ酸配列において、１若しくは数個（例えば９個、８個、７個、６個、５個、４個、３個、２個）のアミノ酸が欠失、置換、挿入及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつペプチドグリカン分解活性を有するタンパク質、公知のエンドライシンのアミノ酸配列と80％以上、81％以上、82％以上、83％以上、84％以上、85％以上、86％以上、87％以上、88％以上、89％以上、90％以上、91％以上、92％以上、93％以上、94％以上、95％以上、96％以上、97％以上、98％以上、99％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつペプチドグリカン分解活性を有するタンパク質が包含される。配列同一性の値は、複数のアミノ酸配列間の同一性を演算するソフトウェア（例えば、FASTA、DANASYS、及びBLAST）を用いてデフォルトの設定で算出した値を示す。
（３）抗菌性タンパク質及びその製造方法
　本発明の抗菌性タンパク質は、外膜透過性ポリペプチドとエンドライシンを含むものである。好ましい抗菌性タンパク質は、エンドライシンがN末端側、外膜透過性ポリペプチドがC末端側にあるのが好ましい。抗菌性タンパク質は、Ｓｔｒｅｐタグ、Ｈｉｓタグ、Ｆｌａｇタグ、Ｘｐｒｅｓｓタグ、Ａｖｉタグ、カルモジュリンタグ、ポリグルタミン酸塩タグ、ＨＡタグ、Ｍｙｃタグ、Ｎｕｓタグ、Ｓタグ、Ｘタグ、ＳＢＰタグ、Ｓｏｆタグ、Ｖ５タグ、ＣＢＰ、ＧＳＴ、ＭＢＰ、ＧＦＰ、チオレドキシンタグ、またはそれらの組み合わせなどのタグを結合させることができる。6xHisタグが好ましい。
　本発明の抗菌性タンパク質、抗菌剤、消毒剤、抗菌剤組成物並びに消毒剤組成物は、グラム陰性菌、特に多剤耐性のグラム陰性菌に有効である。グラム陰性菌としては、緑膿菌、大腸菌、腸管出血性大腸菌(EHEC)、腸内細菌科菌群、ビブリオ、カンピロバクター、サルモネラ、レジオネラ、コレラ、インフルエンザ菌、クレブシエラ、エンテロバクター、セラチア、百日ぜき、エルシニア、シュードモナス、ピロリ菌などが挙げられ、より具体的には、Escherichia coli（大腸菌）、Klebsiella pneumoniae（肺炎桿菌）、Pseudomonas aeruginosa（緑膿菌）Enterobacter spp.、Serratia marcescens、Acinetobacter spp.、Proteus spp.、Klebsiella oxytoca、Bacteroides fragilisを含むBacteroides spp.、Citrobacter spp.、Haemophilus influenzae、Burkholderia cepacia、Stenotrophomonas maltophilia、Chryseobacterium spp.、Salmonella entericaなどが挙げられる。
　多剤耐性のグラム陰性菌としては、多剤耐性アシネトバクター（MDRA）、多剤耐性緑膿菌（MDRP）、カルバペネム耐性腸内細菌目細菌などが挙げられる。
　本発明の抗菌性タンパク質は、それをコードする遺伝子を含むポリヌクレオチドを用いて遺伝子工学的方法によって製造することができる。例えば、抗菌性タンパク質をコードする遺伝子を含むポリヌクレオチドを有する組換えベクターからインビトロ転写によってRNAを調製し、これを鋳型としてインビトロ翻訳を行う方法、あるいは抗菌性タンパク質をコードする遺伝子を含むポリヌクレオチドを好適なベクターに作動可能に連結して組込み、これを宿主細胞に導入して形質転換細胞を作製し、当該形質転換細胞より目的とする抗菌性タンパク質を発現させる方法により製造できる。ここで、「発現」とは、転写、転写後修飾、翻訳、翻訳後修飾、及び分泌を含むタンパク質の産生に関わる任意のステップを含む。
　上記ベクターとしては、それを導入する宿主細胞に適したものを適宜選択し、使用することができる。また、ベクターには、適切なプロモーターに作動可能に連結された本発明の抗菌性タンパク質をコードする遺伝子を含むポリヌクレオチドを含み、好ましくは上記ポリヌクレオチドの下流に転写終結シグナル、すなわちターミネーター領域を含む。さらに、形質転換体を選択するための選択マーカー遺伝子（薬剤耐性遺伝子、栄養要求性変異を相補する遺伝子等）も含むこともできる。また、発現したタンパク質の分離・精製に有用なタグ配列をコードする配列等を含んでもよい。また、ベクターは、宿主細胞のゲノムに組み込まれるものであってもよい。
　ベクターの宿主細胞への導入は、コンピテント細胞法、プロトプラスト法、リン酸カルシウム共沈法等、自体公知の形質転換法で行うことができる。
　ベクターを導入し、組換えタンパク質の発現に用いる宿主細胞としては、上記ベクターを発現できれば任意の細胞でよく、通常使用される公知の微生物、例えば、細菌、酵母、真菌、及び哺乳類細胞等が挙げられる。細菌の例としては、バチルス又はストレプトマイセス等のグラム陽性菌が挙げられる。組換え細胞は、宿主細胞に適した自体公知の方法により培養することができる。
　発現させたタンパク質は、宿主細胞の培養上清から、遠心分離等で集菌した菌体を、超音波又はガラスビーズ等で摩砕した後、遠心分離等により細胞片等の固形物を除き、粗酵素液を調製した後、タンパク質又はペプチドの精製に用いられる公知の方法、例えば、硫安塩析、有機溶媒（エタノール、メタノール、アセトン等）による沈殿分離、イオン交換クロマトグラフィー、等電点クロマトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー、吸着カラムクロマトグラフィー、基質又は抗体等を利用したアフィニティークロマトグラフィー、逆相カラムクロマトグラフィー、HPLC等のクロマトグラフィー、精密ろ過、限外ろ過、逆浸透ろ過等の濾過処理等を1以上組み合わせて用いて精製することが可能である。
　本発明の抗菌性タンパク質はまた、そのアミノ酸配列に基づいて化学合成する方法により製造することもできる。抗菌性タンパク質を化学合成する場合は、Fmoc法(フルオレニルメチルオキシカルボニル法)、tBoc法(t-ブチルオキシカルボニル法)等の公知の化学合成法により行うことができる。
　本発明はまた、ヒト用医薬品として用いるための、本発明の抗菌性タンパク質、抗菌剤又は消毒剤、医薬組成物並びに抗菌剤組成物又は消毒剤組成物を提供する。本発明の抗菌剤、消毒剤、抗菌剤組成物及び消毒剤組成物は、「薬学的に許容される担体」を含んでいてもよい。ヒトを含む哺乳動物に使用するために許容されているものとして、日本薬局方、米国食品医薬品局などによって認可されている任意の補助剤、担体、賦形剤、流動促進剤、甘味料、希釈剤、保存料、染料／着色料、調味料、界面活性剤、湿潤剤、分散剤、懸濁剤、安定剤、等張剤、溶媒、界面活性剤、または乳化剤などが挙げられる。例示的な薬学的に許容される担体としては、これらに限定されないが、糖類、例えば、ラクトース、グルコース、およびサッカロース；でんぷん、例えば、コーンスターチおよびジャガイモでんぷん；セルロースおよびそれの誘導体、例えば、カルボキシルメチルセルロースナトリウム、エチルセルロース、およびセルロースアセテート；トラガカント；モルト；ゼラチン；タルク；ココアバター、ワックス、獣脂および植物性脂肪、パラフィン、シリコーン、ベントナイト、ケイ酸、酸化亜鉛；油、例えば、ピーナッツ油、綿実油、サフラワー油、ごま油、オリーブ油、コーン油、および大豆油；グリコール、例えば、プロピレングリコール；ポリオール、例えば、グリセリン、ソルビトール、マンニトール、およびポリエチレングリコール；エステル、例えば、エチルオレエートおよびエチルラウレート；寒天；緩衝剤、例えば、水酸化マグネシウムおよび水酸化アルミニウム、アルギン酸、パイロジェンフリー水、注射用の水、食塩水、好ましくは、生理食塩水、リンゲル溶液、エチルアルコール、リン酸緩衝液などが挙げられる。
　本発明の抗菌剤、消毒剤、抗菌剤組成物及び消毒剤組成物は、非経口投与、例えば、血管内（静脈内または動脈内）投与のために配合される。好ましい実施形態では、本明細書で意図される抗菌剤及び抗菌剤組成物は、単一用量で対象となるヒトなどの哺乳動物の静脈内に注入され得る。
　本発明の抗菌剤、消毒剤、抗菌剤組成物及び消毒剤組成物の好ましい実施形態としては、肺炎、菌血症、敗血症、破傷風、サルモネラ感染症、髄膜炎、猩紅熱、草原熱、性的伝染細菌疾患、手術部位感染症、壊死性筋膜炎、大腸菌感染症、細菌性皮膚疾患、カンピロバクター感染症、コレラ、胃炎、消化性潰瘍、下痢、赤痢、食中毒、腸チフス、レジオネラ症、日和見感染症、尿路感染症、百日咳などの疾患に対する使用、あるいは、手指、医療器具、もしくは医療材料の消毒に対する使用が挙げられる。例えば、眼、泌尿器、あるいは呼吸器系などの緑膿菌の発生が考えられる医療機器、周辺器具などの消毒を目的として使用できる。
　本発明の他の1つの好ましい実施形態は眼科領域における疾患であり、点眼薬、眼軟膏剤などの剤形で、角膜炎、角膜潰瘍、眼瞼炎、結膜炎、麦粒腫、瞼板腺炎、涙嚢炎、白内障手術を含む眼科手術前後の細菌感染予防、コンタクトレンズ保存剤などに使用することができる。
　本発明の抗菌性タンパク質は、動物用（獣医学的）に使用することもできる。獣医学的使用には、本発明の抗菌性タンパク質、抗菌剤又は消毒剤、医薬組成物並びに抗菌剤組成物又は消毒剤組成物は、典型的に、通常の獣医学的慣例による許容しうる製剤として投与され、そして獣医が、具体的な動物に最も適している投薬計画および投与経路を決定することができる。しかしながら、獣医学的な使用であっても、前述した「薬学的に許容される担体」を含み、前述した投与経路を使用し、前述した目的の消毒もしくは眼科疾患に対する疾患の予防または治療のために使用してもよい。
　本明細書中で使用される場合、「動物」という用語は、哺乳動物、非哺乳動物、鳥類などを含み、好ましくは、本発明の動物は、家畜、愛玩用動物、、実験用動物、飼育動物などである。より具体的には、本発明の動物には、ウシ、ウマ、ロバ、ラクダ、アルパカ、ブタ、ヤギ、ヒツジ、イヌ、ネコ、チンチラ、ウサギ、ミンク、フェレット、モルモット、マウス、ラット、ハリネズミ、イタチ、カンガルー、チンパンジー、ゴリラ、オランウータン、カニクイザル、ヒヒ、ニワトリ、ハト、シチメンチョウ、キジ、ダチョウ、ホロホロチョウ、アヒル、カモなどが含まれるがこれらに限定されない。
　また、本発明の抗菌性タンパク質は、獣医学的に使用する場合、動物に典型的な感染症を予防又は治療を目的として使用することもできる。このような動物に典型的な感染症としては、例えば、日獣会誌29 429-433 (1976) に記載されているものなどが挙げられる。より具体的には、本発明の抗菌性タンパク質の対象となる動物の感染症としては、ウシの急性または慢性乳房炎、生殖器感染、敗血症、蹄底潰瘍（てい病）；ウマの子宮内膜炎、生殖器感染、肺臓の化膿；ブタの気管支肺炎、線維性肋膜炎、出血性腸炎；イヌの外耳炎、生殖器感染、尿道炎、心内膜炎、肺炎、敗血症、眼の炎症；ネコの外耳炎、生殖器感染、尿道炎、心内膜炎、肺炎、敗血症、眼の炎症などが挙げられるがこれらに限定されない。
　なおもう一つの態様において、本発明は、ヒトまたは動物に対するグラム陰性菌の感染によって生じた医学的状態を予防または治療するためヒト用または動物用の医薬の製造における、本発明の抗菌性タンパク質の使用を提供する。
　以下、実施例により本発明をより詳細に説明する。
実施例１
緑膿菌ファージPAJU2のエンドライシン（YP_002284408；138aa；配列番号５）、endolysin [Bacillus amyloliquefaciens phage Morita2001]の部分配列（AAK40280の143-258aa；配列番号６）、羊の抗菌ぺプチドSMAP29の部分配列（AAA85470の1-17aa；配列番号７）に変異を加えたペプチドＳＭＡＰ１７（RKLRRLKRKIAHKVKKY）を融合させたタンパク質を創出した。
使用した塩基配列は以下のとおりである。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
融合遺伝子DS、SDをクローニング、２７をクローニングし、２７とDSあるいはSDが融合したタンパク質の発現できるようにクローニングを行った。それぞれの末端部分には、制限酵素サイトが入っている。
クローニングした遺伝子
pBluescript SK(-) SalI-DS-XbaI
pBluescript SK(-) SalI-SD-XbaI
pBluescript SK(-) SacI-DS-XhoI
pBluescript SK(-) SacI-SD-XhoI
pColdII XhoI-27-EcoRI
pColdII XhoI-27-EcoRIに、SalI-DS-XbaI、SalI-SD-XbaI、SacI-DS-XhoI、SacI-SD-XhoIを導入し、以下の融合タンパク質発現用プラスミドを作製した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
〔タンパク質の発現〕
上記のプラスミドをBL21株へ導入した。
タンパク質の発現のプロトコルは、以下のとおりである。
発現方法
１． 100 μg/mlアンピシリンを含むLB培地上の１コロニーをひろい、100 μg/mlアンピシリンを含むLB培地溶液に植菌し、37℃で振とうさせながら一晩培養した。
２．培養液（LB＋100μg/mlアンピシリン）に一晩培養した菌をいれ、OD600が1.0となった時点で培養液を氷冷させ、30分間放置する。
※OD1.0になるまで時間がかかるため、1L培養液の場合、一晩培養菌は約40ml
※takaraのプロトコルでは、OD600が0.4～0.5であるが、このタンパク質の発現の検討をした結果、OD1.0で発現量が最も高い。
３． 1.0 mMとなるようにIPTGを添加し、15℃で24時間振とう培養した。
精製方法
１．培養終了後、遠心分離（10,000 × g, 10分, 4 ℃）し、ペレットを取得した。
２．菌ペレットに100 mMリン酸緩衝液（300 mM NaCl, pH 7.8）を25 ｍLいれ、Q700 超音波ホモジナイザー（ワケンビーテック株式会社、京都、日本）を使用して、氷上で5分間(5secON/5secOFF)を行った。（培養液250 mLに対して、25 mLのリン酸緩衝液）
３．超音波処理後、遠心（8,000 × g, 20分, 4 ℃）し、上清を回収した。得られた上清に、100 mMリン酸緩衝液（300 mM NaCl, pH 7.8）で平衡化したHIGH Density COBALT（プロテノバ株式会社、香川、日本）を加え、4℃一晩回転させながら結合させた。
４．タンパクと結合したHIGH Density COBALTを自然落下させ、余分な混濁液（上清）を捨てた。
５．100 mMリン酸緩衝液（300 mM NaCl, pH 7.8）を25ｍｌ加え、HIGH Density COBALT を4℃で回転させながら10分間洗浄した。
６．そのあと、タンパクと結合したHIGH Density COBALTを自然落下させ、余分なリン酸緩衝液（上清）を捨てた。
７．5-6を2回繰り返した。
８．終濃度500mMイミダゾールを加えたリン酸緩衝液を500μｌ加え、溶出したタンパクを収集した。
PBSで透析後、タンパク質の濃度を測定し、以下の手順で酵素活性の測定を実施した。
〔菌の調製〕
7 ml LB broth（18 mm試験管）に一晩培養した緑膿菌PAO1株0.25 mlを添加し、37℃で振盪培養。
↓2～3時間
タイテック　デジタル比色計 簡易ODモニター miniphoto518Rを使用して、OD660　0.6付近になったら、回収。
↓
PBSで1回wash（遠心、上清捨てる、PBSに懸濁、遠心、PBSを加える）。
↓
タイテック　デジタル比色計 簡易ODモニター miniphoto518Rを使用して、OD660　0.2付近になるようにPBSで菌濁度を調整。
〔生菌数の測定プロトコル〕
96ウエルプレートのウエルの中で以下を混和し、30分、37℃で振盪培養し、原液と段階希釈したものを角型シャーレに10μL滴下させた。培養した。
タンパク質のみの殺菌効果の検討（図１）
タンパク質処置：菌液50μL＋タンパク質 25μL（final 0.1 mg/ml）＋PBS 25μLコントロール：菌液50μL＋PBS 50μL
EDTA添加したときのタンパク質の殺菌効果の検討（図１）
タンパク質処置：菌液50μL＋タンパク質 25μL（final 0.025mg/ml）＋EDTA 25μL（final 0.5 mM）
コントロール：菌液50μL＋PBS 25μL＋EDTA 25μL（final 0.5 mM）この結果から、最も活性の高い「27xDS」を選択した。
次に、27ｘＤＳの27とＤＳの間のリンカーがあり、このリンカーの有無の影響を検討した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
方法は上記と同じ方法で行った。
結果は図２に示す。
以上から、「27DS」を候補分子として選抜した。
27xDSと27DSの発現タンパク質配列
>27xDS（配列番号８）
HMELGTLEMRTSQRGIDLIKSFEGLRLSAYQDSVGVWTIGYGTTRGVTRYMTITVEQAERMLSNDIQRFEPELDRLAKVPLNQNQWDALMSFVYNLGAANLASSTLLKLLNKGDYQGAADQFPRWVNAGGKRLDGLVKRRAAERALFLEPLSKLVDNSGTPKNVSRGTSSTKTTPKYKVKNGDNLTKIAKKHNTTVATLLKLNPGIKDPNMIRVGQTLNVTGSGGKTHKVKSGDTLSKIAVDNKTTVSKLMNLNPEITNPNHIKVGQTIRLSRKLRRLKRKIAHKVKKYSRHHHHHH（54＋62＝116）
>27DS（配列番号９）
HMMRTSQRGIDLIKSFEGLRLSAYQDSVGVWTIGYGTTRGVTRYMTITVEQAERMLSNDIQRFEPELDRLAKVPLNQNQWDALMSFVYNLGAANLASSTLLKLLNKGDYQGAADQFPRWVNAGGKRLDGLVKRRAAERALFLEPLSNSGTPKNVSRGTSSTKTTPKYKVKNGDNLTKIAKKHNTTVATLLKLNPGIKDPNMIRVGQTLNVTGSGGKTHKVKSGDTLSKIAVDNKTTVSKLMNLNPEITNPNHIKVGQTIRLSRKLRRLKRKIAHKVKKYHHHHHH
27DSの遺伝子配列
>27DS（配列番号１０）
ATGATGCGTACATCCCAACGAGGCATCGACCTCATCAAATCCTTCGAGGGCCTGCGCCTGTCCGCTTACCAGGACTCGGTGGGTGTCTGGACCATAGGTTACGGCACCACTCGGGGCGTCACCCGCTACATGACGATCACCGTCGAGCAGGCCGAGCGGATGCTGTCGAACGACATTCAGCGCTTCGAGCCAGAGCTAGACAGGCTGGCGAAGGTGCCACTGAACCAGAACCAGTGGGATGCCCTGATGAGCTTCGTGTACAACCTGGGCGCGGCCAATCTGGCGTCGTCCACGCTGCTCAAGCTGCTGAACAAGGGTGACTACCAGGGAGCAGCGGACCAGTTCCCGCGCTGGGTGAATGCGGGCGGTAAGCGCTTGGATGGTCTGGTTAAGCGTCGAGCAGCCGAGCGTGCGCTGTTCCTGGAGCCACTATCGAATTCTGGCACGCCTAAGAACGTATCGCGCGGCACGTCATCCACGAAGACGACGCCTAAGTACAAGGTAAAGAACGGCGATAATCTCACCAAAATTGCCAAGAAACACAATACGACAGTGGCTACTTTATTAAAACTCAATCCAGGCATTAAAGATCCGAACATGATTCGTGTCGGTCAAACATTAAATGTGACAGGGAGCGGCGGTAAGACACACAAAGTAAAGAGTGGTGATACCTTGAGCAAGATTGCCGTGGATAATAAGACTACAGTTAGTAAGTTGATGAATTTGAATCCTGAGATCACAAATCCTAATCATATCAAAGTAGGGCAGACCATTCGCTTAAGCCGGAAGCTCCGTCGGCTTAAACGTAAGATCGCTCACAAGGTAAAAAAATATCATCATCATCATCATCATTAG
実施例２：「27DS」のin vitroでの殺菌作用の検討
〔菌の調製〕
7 ml LB broth（18 mm試験管）に一晩培養した緑膿菌PAO1株0.25 mlを添加し、37℃で振盪培養。
↓2～3時間
タイテック　デジタル比色計 簡易ODモニター miniphoto518Rを使用して、OD660　0.6付近になったら、回収。
↓
PBSで1回wash（遠心、上清捨てる、PBSに懸濁、遠心、PBSを加える）。
↓
96wellの吸光度測定機(ThermoFisher Scientific社Multi-scan FC)で、OD595  0.5～1.0になるようにPBSで菌濁度を調整。
２．１．緑膿菌PAO1株に対する殺菌作用の形態学的観察
96ウエルプレートのウエルの中に、以下をそれぞれミックスした。
27DSのみの殺菌効果の検討
27DS処置：菌液50μL＋27DS 25μL（final 0.1 mg/ml）＋PBS 25μLコントロール：菌液50μL＋PBS 50μL
EDTA添加したときの27DSの殺菌効果の検討
27DS処置：菌液50μL＋27DS 25μL（final 0.025 mg/ml）＋EDTA 25μL（final 0.5 mM）コントロール：菌液50μL＋PBS 25μL＋EDTA 25μL（final 0.5 mM）
30分、37℃で振盪培養し、グルテアルデヒド（2%）を加え、反応を止めた。遠心後、菌体を1%アガロースでコーティングし、5%スクロースを含むPBSで洗浄した。5%スクロースを含む0.1mol/l リン酸緩衝液中1.5%四酸化オスミウムで4℃、1時間　固定し、エタノール濃度を段階的に上げて脱水後、固定剤をプロピレンオキシドと交換し、サンプルをエポキシ樹脂に包埋した。超薄切片を作成し、酢酸ウラニルおよびクエン酸鉛で染色し、透過型電子顕微鏡で観察した（図３）。
その結果、27DＳ処置により細菌の膨満が見られた。この結果から、27DSは細胞壁を破壊する効果があることが明らかになった。また、EDTAの処置によりこの細菌の形態の変化が大きくなる傾向にあった。ＥＤＴＡはＬＰＳの構造を変化させる効果があり、27DSの殺菌作用を向上させる効果があると考えられる。この結果は、27DSの殺菌効果のin vitro試験の結果と同じである。
２．２．in vitroでの検証結果１　PBS中のＰＡＯ１株の濁度と形態の観察
96ウエルプレートのウエルの中に、以下をそれぞれミックスした。
27DS処置：菌液50μL＋27DS 25μL（final 0.1 mg/ml）
PBS 25μLコントロール：菌液50μL＋PBS 50μL
０～180分間、37℃で振盪培養し、一定時間経過後、各時点のサンプルを595nmにて濁度測定し、その経時的変化をコントロールと比較した。コントロールでは実験期間の間で濁度がほぼ一定であったのに対し、27DSを添加したサンプルでは、0～60分間で濁度が上昇し、その後は濁度が減少することが観察され、ＰＡＯ１株の増殖が阻害されていることが示唆された。また、このときの菌体を、２．１．に記載されたように処理して透過型電子顕微鏡で観察したところ、27DS処理に伴って菌体の形態変化を起こすことが示唆された（図４）。
２．３．in vitroでの検証結果２　培養中のＰＡＯ１株に対する27DSの影響
10 ml LB broth（18 mm試験管）に一晩培養した緑膿菌PAO1株0.15 mlを添加し、37℃で振盪培養した。対数増殖期にある培養液（培養60分、OD600＝0.2）において、片方にはコントロールとしてのPBS 0.1 ml、もう一方には27DS　0.1 ml（5 mg/ml）を加えた。その後培養開始から320分間まで培養を行った。その結果、培養320分間経過後のOD600の値はPBS添加コントロールでは約1.0であったのに対し、27DSを添加したサンプルではOD600の値は0.6程度にとどまっており、ＰＡＯ１の増殖を阻害することが明らかとなった（図５）。
２．４．各種細菌に対する殺菌作用の検討
〔生菌数の測定プロトコル〕
96ウエルプレートのウエルの中に、以下をそれぞれミックスした。
27DSのみの殺菌効果の検討
27DS処置：菌液50μL＋27DS 25μL（final 0.1 mg/ml）＋PBS 25μLコントロール：菌液50μL＋PBS 50μL
EDTA添加したときの27DSの殺菌効果の検討
27DS処置：菌液50μL＋27DS 25μL（final 0.1 mg/ml）＋EDTA 25μL（final 0.5 mM）コントロール：菌液50μL＋PBS 25μL＋EDTA 25μL（final 0.5 mM）30分、37℃で振盪培養し、原液と段階希釈したものを角型シャーレに10μL滴下させた。培養した。
細菌の数を比率で表示した（図６、図７）。
Bacterial proportion (%) = 細菌の濃度（処置群; cfu/mL）/ 細菌の濃度（PBS群; cfu/mL）
多剤耐性緑膿菌を含む緑膿菌に対して２７DSのみでも殺菌可能である。
27DS+EDTAの場合、非常に高い殺菌効果を示す。
Enterobacter cloacae complex NDM1
Escherichia coli NDM2
Escherichia coli NDM4
Salmonella Typhimurium IID1000
Citrobacter freundii NIH10018-68
Escherichia coli DH5α
Acinetobacter calcoaceticus IAM1517
へは、27DS処置殺菌作用を示した。
27DS+EDTA処置では、高い殺菌作用を示した。
Klebsiella pneumonia（Klebsiella pneumoniae NDM3、Klebsiella pnumoniae IID5209）へは27DS処置、27DS+EDTA処置で弱い殺菌作用を示した。
Enterococcus faecalis EF24、Staphylococcus aureus SA27へは殺菌作用を示さない。
実施例３：「27DS」の感染マウスモデルにおける有効性
３．１．敗血症マウスモデルに対する有効性検討
緑膿菌PAO1をLB培地で培養し、mid-log phaseで引き上げ、3回 salineでwashした。Salineに懸濁した緑膿菌PAO1　6.8 × 106 bacteria/mLを調製した。
0.2 mL 緑膿菌＋0.2 mL PBS
0.2 mL 緑膿菌＋0.2 mL EDTA（2 ｍM）
0.2 mL 緑膿菌＋0.2 mL 27DS（0.2 mg/mL）
0.2 mL 緑膿菌＋0.2 mL 27DS（0.2 mg/mL）+EDTA（2 ｍM）を混和し、0.4 mLを各郡6匹に腹腔投与した。
（この時の27DS 0.1 mg/mL, EDTA 1 mM）
マウスの生存に関して、2日間観察を行った。結果を図８に示す。
次に、緑膿菌感染マウスにおける治療実験を行った。
接種後、0 h, 2 h 6 h後に0.2mLのPBSあるいは以下の薬剤を投与した。方法および結果を図９に示す。
27DS (0.2 mg/mL)
EDTA (2 mM)
27DS (0.2 mg/mL) + EDTA (2 mM)
３．２．角膜炎マウスモデルに対する有効性検討
緑膿菌PAO1をLB培地で培養し、mid-log phaseで引き上げ、3回 salineでwashした。
全身麻酔（3種混合）
5 × 104 cells/5μl
3本線の傷をつけて、菌を5 μl点眼
点眼後アンチセダンですぐ起こす
30分後、マウスを保持して抗菌酵素27DS(0.58mg/ml)+EDTA（10ｍM）を10μl点眼（1回のみ）
24時間後Sacrificed
眼球ごと採取、500μlのPBSで破砕、希釈後15μlの菌液を角型の選択培地へ滴下し、２４時間培養した。
好中球のMyeloperoxidase（MPO）の測定用に125μl採取し、希釈せず測定した。結果を図１０に示す。
27DS+EDTAが角膜炎に有効であることが明らかになった。
実施例４：27DSの耐性菌は生じにくいことについて
　27DSを継代培養し、培養前と後での最小発育阻止濃度（MIC）の測定を行った。測定方法は、CLSI （Clinical & Laboratory Standards Institute）Guidelinesに準拠した。20回継代培養した後でも、菌体株のMICの値には変化が見られず、27DSの耐性菌は生じにくいことが示唆された。 

Claims (12)

  1. 以下の(i)～(iii)のグラム陰性菌のリポ多糖含有外膜透過性を有するポリペプチド：
    (i) 配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、
    (ii) 配列番号１で表されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入及び／又は付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチド、又は、
    (iii) 配列番号１で表されるアミノ酸配列と80％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチド。
  2. 以下の(iv)～(vi)のポリヌクレオチド：
    (iv)請求項１に記載のポリペプチドをコードするDNA配列からなるポリヌクレオチド、
    (v) 配列番号２で表されるDNA配列からなるポリヌクレオチド、又は、
    (vi) (iv)若しくは(v)のDNA配列からなるポリヌクレオチドと配列同一性が80％以上のDNA配列からなり、かつ、グラム陰性菌のリポ多糖含有外膜透過性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
  3. エンドライシンと請求項１に記載のポリペプチドを含み、前記エンドライシンのN末端側またはC末端側に請求項１に記載のポリペプチドを含む抗菌性タンパク質。
  4. 請求項３に記載の抗菌性タンパク質をコードするポリヌクレオチド。
  5. 請求項３に記載の抗菌性タンパク質を含むグラム陰性菌に対する抗菌剤又は消毒剤。
  6. グラム陰性菌が多剤耐性菌または緑膿菌である、請求項５に記載の抗菌剤又は消毒剤。
  7. 請求項３に記載の抗菌性タンパク質を含む医薬組成物。
  8. 前記緑膿菌の対象となる疾患が、角膜炎、涙嚢炎、眼内炎、蜂窩織炎による眼感染症、敗血症、肺炎、多剤耐性グラム陰性菌感染症、日和見感染症、又はその他、緑膿菌が起因する疾患から選択される1種又は複数種の疾患である請求項７に記載の医薬組成物。
  9. 請求項３に記載の抗菌性タンパク質と外膜透過剤と含み、前記外膜透過剤がエチレンジアミン四酢酸（EDTA）又はその塩である、抗菌剤組成物又は消毒剤組成物。
  10. グラム陰性菌が多剤耐性菌または緑膿菌である、請求項９に記載の抗菌剤組成物又は消毒剤組成物。
  11. 　請求項３に記載の抗菌性タンパク質を含む医薬組成物をヒトに投与することを含む、グラム陰性菌の感染に起因する疾患を予防またはグラム陰性菌を殺菌する方法。
  12. 　請求項３に記載の抗菌性タンパク質を含む医薬組成物を動物に投与することを含む、グラム陰性菌の感染に起因する疾患を予防またはグラム陰性菌を殺菌する方法。 
PCT/JP2024/023622 2023-06-30 2024-06-28 グラム陰性菌の外膜透過性ポリペプチド、該ポリペプチドを含む抗菌性タンパク質、抗菌剤又は消毒剤、医薬組成物並びに抗菌剤組成物又は消毒剤組成物 Ceased WO2025005276A1 (ja)

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