WO2025005153A1

WO2025005153A1 - ４－（アミノメチル）シクロヘキサン－１－カルボン酸の製造方法

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Publication number: WO2025005153A1
Application number: PCT/JP2024/023249
Authority: WO
Inventors: 明日香合田; 誠山下; 健人纐纈; 山本 ▲祐▼梨子青木; 太郎渡邊
Original assignee: Kirin Holdings Co Ltd; Kyowa Hakko Bio Co Ltd
Current assignee: Kirin Holdings Co Ltd; Kyowa Hakko Bio Co Ltd
Priority date: 2023-06-29
Filing date: 2024-06-26
Publication date: 2025-01-02
Anticipated expiration: 2025-12-29
Also published as: JPWO2025005153A1; WO2025143144A1; CN121420067A; TW202509230A; EP4726047A1; TW202535347A

Abstract

一実施形態の製造方法は、一般式（１）で表される化合物を基質化合物または中間体化合物として、ヒドロキシ基をアルデヒド基に変換する活性を有するタンパク質、アルデヒド基をカルボキシ基に変換する活性を有するタンパク質、およびアルデヒド基とアミノ基を可逆的に変換する活性を有するタンパク質から選択される少なくとも一つの酵素の存在下で、シス体および／またはトランス体の４－（アミノメチル）シクロヘキサン－１－カルボン酸を製造する方法である。［式中、Ｒ１およびＲ２は、それぞれ独立してＣＨ２ＯＨ、ＣＨＯ、ＣＯＯＨ、またはＣＨ２ＮＨ２である（但し、Ｒ１とＲ２の一方がＣＯＯＨであり、他方がＣＨ２ＮＨ２である場合、およびＲ１とＲ２が共にＣＯＯＨである場合を除く）］具体的には、上記一般式（１）で表される化合物が化合物１，２，３，４，５，６，７，８のいずれか一つである。

Description

４－（アミノメチル）シクロヘキサン－１－カルボン酸の製造方法

　本発明は、４－（アミノメチル）シクロヘキサン－１－カルボン酸の製造において使用するタンパク質、および、該タンパク質を用いた４－（アミノメチル）シクロヘキサン－１－カルボン酸の製造方法に関する。また、本発明は、効率的なトランス－４－（アミノメチル）シクロヘキサン－１－カルボン酸の製造方法に関する。

　４－（アミノメチル）シクロヘキサン－１－カルボン酸（４－（ａｍｉｎｏｍｅｔｈｙｌ）ｃｙｃｌｏｈｅｘａｎｅｃａｒｂｏｘｙｌｉｃ　ａｃｉｄ；ＡＭＣＨＡ）は、抗プラスミン剤として開発された人工合成アミノ酸である（非特許文献１）。ＡＭＣＨＡにはシス型とトランス型の立体異性体が存在する。このうち、非特許文献２により、トランス型に抗プラスミン作用があることが確認された。トランス型の４－（アミノメチル）シクロヘキサン－１－カルボン酸であるトランス－４－アミノメチルシクロヘキサン－１－カルボン酸（ｔ－ＡＭＣＨＡ）は、トラネキサム酸（Ｔｒａｎｅｘａｍｉｃ　ａｃｉｄ；ＴＸＡ）とも呼ばれ、その抗プラスミン作用から、止血剤、抗炎症剤として出血の予防・治療に用いられる（非特許文献３～４）。

　４－（アミノメチル）シクロヘキサン－１－カルボン酸の製造法としては、主に化学合成法が知られている。例えば、特許文献１には、４－（クロロメチル）安息香酸を出発原料として、アミノ化反応および水素付加反応を経て４－（アミノメチル）シクロヘキサン－１－カルボン酸を生成し、続く異性化反応の３段の化学合成反応により、トランス体の４－（アミノメチル）シクロヘキサン－１－カルボン酸を製造する方法が開示されている。

　上記を含む化学合成法は高温および高圧での反応を必要としており、エネルギーコストが高く、環境負荷も大きいことが課題である。

　化学合成法の代替としては、微生物を利用した製造方法が挙げられる。特許文献２には、１，４－ビス（アミノメチル）シクロヘキサンのシス体およびトランス体混合物にコリネバクテリウム属またはノカルディア属に属する微生物を接触させ、トランス体の４－（アミノメチル）シクロヘキサン－１－カルボン酸を製造する方法が開示されている。しかしながら、該方法は自然界から分離した微生物自体を用いた変換反応であるため、４－（アミノメチル）シクロヘキサン－１－カルボン酸の生産性も低く、また活性本体の酵素の同定も行われていない。

ＣＮ１１４０１４７６８Ａ特開昭６３－１５２９９１号公報ＣＮ１１４２３１５０７ＡＣＮ１１５９６０８５４Ａ

Keio Journal of Medicine (1962)11, 8, 105-115 Keio Journal of Medicine (1964) 18, 4, 177-185 European Journal of Haematology (2020) 104, 2, 79-87 Journal of Trauma and Acute Care Surgery (2019) 86, 1, 101-107 Bioresources and Bioprocessing (2022) 9, 80

　本発明は、新規な酵素反応経路に基づき４－（アミノメチル）シクロヘキサン－１－カルボン酸を製造する方法、および、当該酵素反応に使用できるタンパク質を提供することを目的とする。

　本発明者らは、１，４－ビス（アミノメチル）シクロヘキサンから４－（アミノメチル）シクロヘキサン－１－カルボン酸を生成する反応経路として、アミノ基転移酵素およびアルデヒドデヒドロゲナーゼによる酵素反応経路を想定し、目的の活性を有する可能性のあるタンパク質を各々選定した。また、当該タンパク質を大腸菌株で発現、精製し、酵素反応を実施することで、１，４－ビス（アミノメチル）シクロヘキサンから４－（アミノメチル）シクロヘキサン－１－カルボン酸を生成できることを見出した。更なる研究の結果、本発明者らは、１，４－シクロヘキサンジメタノールから４－（アミノメチル）シクロヘキサン－１－カルボン酸を生成する反応経路として、コリンオキシダーゼ、アミノ基転移酵素およびアルデヒドデヒドロゲナーゼによる酵素反応経路を想定し、目的の活性を有する可能性のあるタンパク質を各々選定した。また、当該タンパク質を大腸菌株で発現させ、静止菌体反応を実施することで、１，４－シクロヘキサンジメタノールから４－（アミノメチル）シクロヘキサン－１－カルボン酸を生成できることを見出し、本発明の完成に至った。

　本発明は、例えば、以下の各発明に関する。
［Ａ１］
　下記一般式（１）で表される化合物を基質化合物または中間体化合物として、ヒドロキシ基をアルデヒド基に変換する活性を有するタンパク質、アルデヒド基をカルボキシ基に変換する活性を有するタンパク質、およびアルデヒド基とアミノ基を可逆的に変換する活性を有するタンパク質から選択される少なくとも一つの酵素の存在下で、シス体および／またはトランス体の４－（アミノメチル）シクロヘキサン－１－カルボン酸を製造する方法。

［式中、Ｒ_１およびＲ_２は、それぞれ独立してＣＨ_２ＯＨ、ＣＨＯ、ＣＯＯＨ、またはＣＨ_２ＮＨ_２である（但し、Ｒ_１とＲ_２の一方がＣＯＯＨであり、他方がＣＨ_２ＮＨ_２である場合、およびＲ_１とＲ_２が共にＣＯＯＨである場合を除く）］
具体的には、上記一般式（１）で表される化合物は化合物１，２，３，４，５，６，７または８のいずれか一つである。
［Ａ２］
　上記ヒドロキシ基をアルデヒド基に変換する活性を有するタンパク質、上記アルデヒド基をカルボキシ基に変換する活性を有するタンパク質、および上記アルデヒド基とアミノ基を可逆的に変換する活性を有するタンパク質の存在下で製造する、［Ａ１］に記載の方法。
［Ａ３］
　Ｒ_１とＲ_２の一方がＣＨ_２ＯＨであり、他方がＣＨ_２ＯＨ、ＣＨＯ、またはＣＨ_２ＮＨ_２である、上記一般式（１）で表される化合物を基質化合物または中間体化合物とする場合、上記ヒドロキシ基をアルデヒド基に変換する活性を有するタンパク質、上記アルデヒド基をカルボキシ基に変換する活性を有するタンパク質、および上記アルデヒド基とアミノ基を可逆的に変換する活性を有するタンパク質の存在下で製造する、［Ａ２］に記載の方法。
［Ａ４］
　Ｒ_１とＲ_２の一方がＣＨ_２ＮＨ_２であり、他方がＣＨＯである、一般式（１）で表される化合物を基質化合物または中間体化合物とする場合、上記アルデヒド基をカルボキシ基に変換する活性を有するタンパク質の存在下で製造する、［Ａ１］に記載の方法。
［Ａ５］
　Ｒ_１とＲ_２の一方がＣＨＯであり、他方がＣＯＯＨである、一般式（１）で表される化合物を基質化合物または中間体化合物とする場合、上記アルデヒド基とアミノ基を可逆的に変換する活性を有するタンパク質の存在下で製造する、［Ａ１］に記載の方法。
［Ａ６］
　Ｒ_１とＲ_２の一方がＣＨＯであり、他方がＣＨ_２ＮＨ_２、もしくはＣＨＯである、またはＲ_１とＲ_２が共にＣＨ_２ＮＨ_２である、一般式（１）で表される化合物を基質化合物または中間体化合物とする場合、上記アルデヒド基をカルボキシ基に変換する活性を有するタンパク質、および上記アルデヒド基とアミノ基を可逆的に変換する活性を有するタンパク質の存在下で製造する、［Ａ１］に記載の方法。
［Ａ７］
　Ｒ_１とＲ_２の一方がＣＨ_２ＯＨであり、他方がＣＨ_２ＮＨ_２である、一般式（１）で表される化合物を基質化合物または中間体化合物とする場合、上記ヒドロキシ基をアルデヒド基に変換する活性を有するタンパク質、および上記アルデヒド基をカルボキシ基に変換する活性を有するタンパク質の存在下で製造する、［Ａ１］に記載の方法。
［Ａ８］
　Ｒ_１とＲ_２の一方がＣＨ_２ＯＨであり、他方がＣＯＯＨである、一般式（１）で表される化合物を基質化合物または中間体化合物とする場合、上記ヒドロキシ基をアルデヒド基に変換する活性を有するタンパク質、および上記アルデヒド基とアミノ基を可逆的に変換する活性を有するタンパク質の存在下で製造する、［Ａ１］に記載の方法。
［Ａ９］
　上記ヒドロキシ基をアルデヒド基に変換する活性を有するタンパク質が、オキシダーゼ活性を有するタンパク質、デヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質およびアルデヒドレダクターゼ活性を有するタンパク質から選択される少なくとも１つであり、上記アルデヒド基をカルボキシ基に変換する活性を有するタンパク質が、アルデヒドデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質、および／またはアルデヒドオキシダーゼ活性を有するタンパク質であり、上記アルデヒド基とアミノ基を可逆的に変換する活性を有するタンパク質が、アミノ基転移酵素活性を有するタンパク質、アミンデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質およびアミンオキシダーゼ活性を有するタンパク質から選択される少なくとも１つである、［Ａ１］～［Ａ８］のいずれかに記載の方法。
［Ａ１０］
　上記ヒドロキシ基をアルデヒド基に変換する活性を有するタンパク質が、コリンオキシダーゼ活性を有するタンパク質であり、上記アルデヒド基をカルボキシ基に変換する活性を有するタンパク質が、アルデヒドデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質であり、上記アルデヒド基とアミノ基を可逆的に変換する活性を有するタンパク質が、アミノ基転移酵素活性を有するタンパク質である、［Ａ１］～［Ａ９］のいずれかに記載の方法。
［Ａ１１］
　上記コリンオキシダーゼ活性を有するタンパク質が、配列番号２０１で表されるアミノ酸配列と６０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるタンパク質であり、上記アルデヒドデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質が、配列番号１９～２２、３５～４６および１２７～１３９のいずれか１つで表されるアミノ酸配列と５０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるタンパク質であり、上記アミノ基転移酵素活性を有するタンパク質が、配列番号１～４および１０３～１０５のいずれか１つで表されるアミノ酸配列と６０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるタンパク質である、［Ａ１０］に記載の方法。
[Ａ１２]
　上記一般式（１）において、Ｒ_１とＲ_２の一方がＣＯＯＨであり、他方がＣＨＯで表される化合物（すなわち化合物５）が下記（ｉ）および（ｉｉ）のいずれか一つの基質化合物または中間体化合物から生じた化合物である、[Ａ５]に記載の方法。
（ｉ）Ｒ_１とＲ_２が共にＣＨＯである化合物（すなわち化合物３）
（ｉｉ）Ｒ_１とＲ_２の一方がＣＯＯＨであり、他方がＣＨ_２ＯＨである化合物（すなわち化合物４）
[Ａ１３]
　上記一般式（１）において、Ｒ_１とＲ_２の一方がＣＨ_２ＮＨ_２であり、他方がＣＨＯである、化合物（すなわち化合物７）が下記（ｉ）および（ｉｉ）のいずれか一つの基質化合物または中間体化合物から生じた化合物である、[Ａ４]に記載の方法。
（ｉ）Ｒ_１とＲ_２が共にＣＨＯである化合物（すなわち化合物３）
（ｉｉ）Ｒ_１とＲ_２の一方がＣＨ_２ＮＨ_２であり、他方がＣＨ_２ＯＨである化合物（すなわち化合物６）
[Ａ１４]
　上記一般式（１）において、Ｒ_１とＲ_２が共にＣＨＯである化合物（すなわち化合物３）、Ｒ_１とＲ_２の一方がＣＯＯＨであり、他方がＣＨ_２ＯＨである化合物（すなわち化合物４）または、Ｒ_１とＲ_２の一方がＣＨ_２ＮＨ_２であり、他方がＣＨ_２ＯＨである化合物（すなわち化合物６）のいずれか一つを基質化合物または中間体化合物とし、ヒドロキシ基をアルデヒド基に変換する活性を有するタンパク質、アルデヒド基をカルボキシ基に変換する活性を有するタンパク質、およびアルデヒド基とアミノ基を可逆的に変換する活性を有するタンパク質から選択される少なくとも一つの酵素の存在下で、シス体および／またはトランス体の４－（アミノメチル）シクロヘキサン－１－カルボン酸を製造する、［Ａ１］に記載の方法。
[Ａ１５]
　上記一般式（１）において、Ｒ_１とＲ_２が共にＣＨＯである化合物（すなわち化合物３）を基質化合物または中間体化合物とする場合、アルデヒド基をカルボキシ基に変換する活性を有するタンパク質、およびアルデヒド基とアミノ基を可逆的に変換する活性を有するタンパク質の存在下で、
　上記一般式（１）において、Ｒ_１とＲ_２の一方がＣＯＯＨであり、他方がＣＨ_２ＯＨである化合物（すなわち化合物４）を基質化合物または中間体化合物とする場合、ヒドロキシ基をアルデヒド基に変換する活性を有するタンパク質、およびアルデヒド基とアミノ基を可逆的に変換する活性を有するタンパク質の存在下で、または、
　上記一般式（１）において、Ｒ_１とＲ_２の一方がＣＨ_２ＮＨ_２であり、他方がＣＨ_２ＯＨである化合物（すなわち化合物６）を基質化合物または中間体化合物する場合、ヒドロキシ基をアルデヒド基に変換する活性を有するタンパク質、およびアルデヒド基をカルボキシ基に変換する活性を有するタンパク質の存在下で、シス体および／またはトランス体の４－（アミノメチル）シクロヘキサン－１－カルボン酸を製造する、［Ａ１４］に記載の方法。
[Ａ１６]
　下記一般式（１）で表される化合物を基質化合物または中間体化合物として、ヒドロキシ基をアルデヒド基に変換する活性を有するタンパク質、アルデヒド基をカルボキシ基に変換する活性を有するタンパク質、およびアルデヒド基とアミノ基を可逆的に変換する活性を有するタンパク質から選択される少なくとも一つの酵素の存在下で、シス体および／またはトランス体の４－（アミノメチル）シクロヘキサン－１－カルボン酸を製造する方法であって、上記アルデヒド基をカルボキシ基に変換する活性を有するタンパク質が配列番号１２７～１３９のいずれか１つで表されるアミノ酸配列、またはこれらのいずれか１つで表されるアミノ酸配列と５０％以上、６０％以上、７０％以上、７５％以上、８０％以上、９０％以上、９３％以上、９５％以上、または９８％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるタンパク質である、方法。

［式中、Ｒ_１およびＲ_２は、それぞれ独立してＣＨ_２ＯＨ、ＣＨＯ、ＣＯＯＨ、またはＣＨ_２ＮＨ_２である（但し、Ｒ_１とＲ_２の一方がＣＯＯＨであり、他方がＣＨ_２ＮＨ_２である場合、およびＲ_１とＲ_２が共にＣＯＯＨである場合を除く）］
具体的には、上記一般式（１）で表される化合物は化合物１，２，３，４，５，６，７または８のいずれか一つである。
[Ａ１７]
　上記ヒドロキシ基をアルデヒド基に変換する活性を有するタンパク質、上記アルデヒド基をカルボキシ基に変換する活性を有するタンパク質、および上記アルデヒド基とアミノ基を可逆的に変換する活性を有するタンパク質の存在下で製造する、［Ａ１６］に記載の方法。
[Ａ１８]
　アルデヒド基をカルボキシ基に変換する活性を有するタンパク質の存在下でシス体および／またはトランス体の４－（アミノメチル）シクロヘキサン－１－カルボン酸を製造する方法であって、
　上記一般式（１）において、Ｒ_１とＲ_２の一方がＣＨ_２ＮＨ_２であり、他方がＣＨＯである、化合物（すなわち化合物７）を基質化合物または中間体化合物とする、シス体および／またはトランス体の４－（アミノメチル）シクロヘキサン－１－カルボン酸を製造する、［Ａ１６］に記載の方法。
[Ａ１９]
　アルデヒド基をカルボキシ基に変換する活性を有するタンパク質およびアルデヒド基とアミノ基を可逆的に変換する活性を有するタンパク質の存在下でシス体および／またはトランス体の４－（アミノメチル）シクロヘキサン－１－カルボン酸を製造する方法であって、
　上記一般式（１）において、Ｒ_１とＲ_２が共にＣＨＯである化合物（すなわち化合物３）および／または上記一般式（１）において、Ｒ_１とＲ_２が共にＣＨ_２ＮＨ_２である、化合物（すなわち化合物８）を基質化合物または中間体化合物とする、シス体および／またはトランス体の４－（アミノメチル）シクロヘキサン－１－カルボン酸を製造する、［Ａ１６］に記載の方法。
[Ａ２０]
　アルデヒド基をカルボキシ基に変換する活性を有するタンパク質およびヒドロキシ基をアルデヒド基に変換する活性を有するタンパク質の存在下でシス体および／またはトランス体の４－（アミノメチル）シクロヘキサン－１－カルボン酸を製造する方法であって、
　上記一般式（１）において、Ｒ_１とＲ_２の一方がＣＨ_２ＮＨ_２であり、他方がＣＨ_２ＯＨである化合物（すなわち化合物６）を基質化合物または中間体化合物とする、シス体および／またはトランス体の４－（アミノメチル）シクロヘキサン－１－カルボン酸を製造する、［Ａ１６］に記載の方法。
[Ａ２１]
　ヒドロキシ基をアルデヒド基に変換する活性を有するタンパク質、アルデヒド基をカルボキシ基に変換する活性を有するタンパク質、およびアルデヒド基とアミノ基を可逆的に変換する活性を有するタンパク質の存在下でシス体および／またはトランス体の４－（アミノメチル）シクロヘキサン－１－カルボン酸を製造する方法であって、
　上記一般式（１）において、Ｒ_１とＲ_２の一方がＣＨ_２ＯＨであり、他方がＣＨ_２ＯＨまたはＣＨＯである化合物（すなわち化合物１または化合物２）を基質化合物または中間体化合物とする、シス体および／またはトランス体の４－（アミノメチル）シクロヘキサン－１－カルボン酸を製造する、［Ａ１６］に記載の方法。
[Ａ２２]
　上記アルデヒド基をカルボキシ基に変換する活性を有するタンパク質が、以下の１）から６）の少なくともいずれか１つである、［Ａ１６］～［Ａ２１］のいずれかに記載の方法。
　１）配列番号１９で表されるアミノ酸配列と７１％以上、７５％以上、８０％以上、９０％以上、９３％以上、９５％以上、または９８％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるタンパク質
　２）配列番号２０で表されるアミノ酸配列と６８％以上、７０％以上、７５％以上、８０％以上、９０％以上、９３％以上、９５％以上、または９８％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるタンパク質
　３）Ｐｓｕｄｏｍｏｎａｓ属由来アルデヒドデヒドロゲナーゼであり、かつ配列番号２０で表されるアミノ酸配列と５０％以上、６０％以上、７０％以上、７５％以上、８０％以上、９０％以上、９３％以上、９５％以上、または９８％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるタンパク質
　４）配列番号２１で表されるアミノ酸配列と６３％、７０％以上、７５％以上、８０％以上、９０％以上、９３％以上、９５％以上、または９８％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるタンパク質
　５）配列番号４０で表されるアミノ酸配列と５６．５％以上、６０％以上、７０％以上、７５％以上、８０％以上、９０％以上、９３％以上、９５％以上、または９８％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるタンパク質
　６）配列番号４１で表されるアミノ酸配列と６３．９％以上、７０％以上、７５％以上、８０％以上、９０％以上、９３％以上、９５％以上、または９８％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるタンパク質
[Ａ２３]
　上記アルデヒド基をカルボキシ基に変換する活性を有するタンパク質が、配列番号１２７～１３１、１３３～１３５、１３８、および１３９のいずれか１つで表されるアミノ酸配列からなるタンパク質である、［Ａ２２］に記載の方法。
[Ａ２４]
　上記アルデヒド基をカルボキシ基に変換する活性を有するタンパク質が、アルデヒド基を有する化合物のアルデヒド基を酸化させるアルデヒドデヒドロゲナーゼ活性を有し、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属細菌由来のアルデヒドデヒドロゲナーゼである、［Ａ２２］に記載の方法。
[Ａ２５]
　下記一般式（１）で表される化合物であって、下記（ｉ）の化合物を基質化合物または中間体化合物として、ヒドロキシ基をアルデヒド基に変換する活性を有するタンパク質、アルデヒド基をカルボキシ基に変換する活性を有するタンパク質、およびアルデヒド基とアミノ基を可逆的に変換する活性を有するタンパク質から選択される少なくとも一つの酵素の存在下で、シス体および／またはトランス体の４－（アミノメチル）シクロヘキサン－１－カルボン酸を製造する方法。
（ｉ）一般式（１）において、Ｒ_１およびＲ_２は、それぞれ独立してＣＨ_２ＯＨ、ＣＨＯ、ＣＯＯＨ、またはＣＨ_２ＮＨ_２である。但し、一般式（１）において、Ｒ_１とＲ_２の一方がＣＯＯＨであり、他方がＣＨ_２ＮＨ_２である場合、Ｒ_１とＲ_２が共にＣＯＯＨである場合、およびＲ_１とＲ_２の一方がＣＨ_２ＮＨ_２であり、他方がＣＨＯである場合（すなわち一般式（１）で表される化合物が化合物７である場合）を除く。すなわち、上記一般式（１）で表される化合物は化合物１，２，３，４，５または６のいずれか一つである。

[Ａ２６]
　下記一般式（１）で表される化合物を基質化合物または中間体化合物として、ヒドロキシ基をアルデヒド基に変換する活性を有するタンパク質、アルデヒド基をカルボキシ基に変換する活性を有するタンパク質、およびアルデヒド基とアミノ基を可逆的に変換する活性を有するタンパク質から選択される少なくとも一つの酵素の存在下で、シス体および／またはトランス体の４－（アミノメチル）シクロヘキサン－１－カルボン酸を製造する方法であって、上記アルデヒド基をカルボキシ基に変換する活性を有するタンパク質が配列番号２０７で表されるアミノ酸配列、または当該アミノ酸配列と５０％以上、６０％以上、７０％以上、７５％以上、８０％以上、９０％以上、９３％以上、９５％以上、または９８％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるタンパク質である、方法。

［式中、Ｒ_１およびＲ_２は、それぞれ独立してＣＨ_２ＯＨ、ＣＨＯ、ＣＯＯＨ、またはＣＨ_２ＮＨ_２である（但し、Ｒ_１とＲ_２の一方がＣＯＯＨであり、他方がＣＨ_２ＮＨ_２である場合、およびＲ_１とＲ_２が共にＣＯＯＨである場合を除く）］
具体的には、上記一般式（１）で表される化合物は化合物１，２，３，４，５，６，７または８のいずれか一つである。
［Ａ２７］
　上記ヒドロキシ基をアルデヒド基に変換する活性を有するタンパク質が、オキシダーゼ活性を有するタンパク質、デヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質およびアルデヒドレダクターゼ活性を有するタンパク質から選択される少なくとも１つであり、上記アルデヒド基とアミノ基を可逆的に変換する活性を有するタンパク質が、アミノ基転移酵素活性を有するタンパク質、アミンデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質およびアミンオキシダーゼ活性を有するタンパク質から選択される少なくとも１つである、［Ａ１６］に記載の方法。
［Ａ２８］
　上記ヒドロキシ基をアルデヒド基に変換する活性を有するタンパク質が、コリンオキシダーゼ活性を有するタンパク質であり、上記アルデヒド基とアミノ基を可逆的に変換する活性を有するタンパク質が、アミノ基転移酵素活性を有するタンパク質である、［Ａ１６］に記載の方法。
［Ａ２９］
　上記コリンオキシダーゼ活性を有するタンパク質が、配列番号２０１で表されるアミノ酸配列と６０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるタンパク質であり、上記アミノ基転移酵素活性を有するタンパク質が、配列番号１～４および１０３～１０５のいずれか１つで表されるアミノ酸配列と６０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるタンパク質である、［Ａ１６］に記載の方法。
［Ａ３０］
　上記一般式（１）において、Ｒ_１とＲ_２の一方がＣＨ_２ＮＨ_２であり、他方がＣＨＯである、化合物（すなわち化合物７）が下記（ｉ）および（ｉｉ）のいずれか一つの基質化合物または中間体化合物から生じた化合物である、[Ａ１８]に記載の方法。
（ｉ）Ｒ_１とＲ_２が共にＣＨＯである化合物（すなわち化合物３）
（ｉｉ）Ｒ_１とＲ_２の一方がＣＨ_２ＯＨであり、他方がＣＨ_２ＮＨ_２である化合物（すなわち化合物６）
[Ａ３１]
　上記一般式（１）において、Ｒ_１とＲ_２が共にＣＨＯである化合物（すなわち化合物３）、Ｒ_１とＲ_２の一方がＣＯＯＨであり、他方がＣＨ_２ＯＨである化合物（すなわち化合物４）または、Ｒ_１とＲ_２の一方がＣＨ_２ＮＨ_２であり、他方がＣＨ_２ＯＨである化合物（すなわち化合物６）のいずれか一つを基質化合物または中間体化合物とし、ヒドロキシ基をアルデヒド基に変換する活性を有するタンパク質、アルデヒド基をカルボキシ基に変換する活性を有するタンパク質、およびアルデヒド基とアミノ基を可逆的に変換する活性を有するタンパク質から選択される少なくとも一つの酵素の存在下で、シス体および／またはトランス体の４－（アミノメチル）シクロヘキサン－１－カルボン酸を製造する、［Ａ１６］に記載の方法。
[Ａ３２]
　上記一般式（１）において、Ｒ_１とＲ_２が共にＣＨＯである化合物（すなわち化合物３）を基質化合物または中間体化合物とする場合、アルデヒド基をカルボキシ基に変換する活性を有するタンパク質、およびアルデヒド基とアミノ基を可逆的に変換する活性を有するタンパク質の存在下で、
　上記一般式（１）において、Ｒ_１とＲ_２の一方がＣＯＯＨであり、他方がＣＨ_２ＯＨである化合物（すなわち化合物４）を基質化合物または中間体化合物とする場合、ヒドロキシ基をアルデヒド基に変換する活性を有するタンパク質、およびアルデヒド基とアミノ基を可逆的に変換する活性を有するタンパク質の存在下で、または、
　上記一般式（１）において、Ｒ_１とＲ_２の一方がＣＨ_２ＮＨ_２であり、他方がＣＨ_２ＯＨである化合物（すなわち化合物６）を基質化合物または中間体化合物する場合、ヒドロキシ基をアルデヒド基に変換する活性を有するタンパク質、およびアルデヒド基をカルボキシ基に変換する活性を有するタンパク質の存在下で、シス体および／またはトランス体の４－（アミノメチル）シクロヘキサン－１－カルボン酸を製造する、［Ａ３１］に記載の方法。

　本発明はまた、例えば、以下の各発明にも関する。
［１］
　１，４－ビス（アミノメチル）シクロヘキサンのアミノ基を他の化合物へ転移させ、４－（アミノメチル）シクロヘキサン－１－カルバルデヒドを産生させるアミノ基転移酵素活性を有し、かつ配列番号１～４および１０３～１０５のいずれか１つで表されるアミノ酸配列と６０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるタンパク質。
［２］
　［１］に記載のタンパク質をコードするＤＮＡ。
［３］
　［２］に記載のＤＮＡを含む組換え体ＤＮＡ。
［４］
　［２］に記載のＤＮＡを含むか、または、［３］に記載の組換え体ＤＮＡで宿主細胞を形質転換して得られる、組換え細胞。
［５］
　４－（アミノメチル）シクロヘキサン－１－カルバルデヒドのアルデヒド基を酸化させ、４－（アミノメチル）シクロヘキサン－１－カルボン酸を産生させるアルデヒドデヒドロゲナーゼ活性を有し、かつ配列番号１９～２２、３５～４６および１２７～１３９のいずれか１つで表されるアミノ酸配列と５０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるタンパク質。
［６］
　４－（アミノメチル）シクロヘキサン－１－カルバルデヒドのアルデヒド基を酸化させ、４－（アミノメチル）シクロヘキサン－１－カルボン酸を産生させるアルデヒドデヒドロゲナーゼ活性を有し、かつ配列番号１９～２２、３５～４６および１２７～１３９のいずれか１つで表されるアミノ酸配列と６０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるタンパク質。
［７］
　［５］または［６］に記載のタンパク質をコードするＤＮＡ。
［８］
　［７］に記載のＤＮＡを含む組換え体ＤＮＡ。
［９］
　［７］に記載のＤＮＡを含むか、または、［８］に記載の組換え体ＤＮＡで宿主細胞を形質転換して得られる、組換え細胞。
［１０］
　シス体および／またはトランス体の１，４－ビス（アミノメチル）シクロヘキサンから、シス体および／またはトランス体の４－（アミノメチル）シクロヘキサン－１－カルボン酸を製造するための製造方法であって、
（ｉ）アミノ基転移酵素の存在下、１，４－ビス（アミノメチル）シクロヘキサンから４－（アミノメチル）シクロヘキサン－１－カルバルデヒドを製造する工程と、
（ｉｉ）アルデヒドデヒドロゲナーゼの存在下、４－（アミノメチル）シクロヘキサン－１－カルバルデヒドから４－（アミノメチル）シクロヘキサン－１－カルボン酸を製造する工程と
を含む、製造方法。
［１１］
　上記アミノ基転移酵素が［１］に記載のタンパク質であり、上記アルデヒドデヒドロゲナーゼが［５］または［６］に記載のタンパク質である、［１０］に記載の製造方法。
［１２］
　上記方法の一部または全部において、アラニンデヒドロゲナーゼ、および／または、ＮＡＤＨオキシダーゼを共存させることを含む、［１０］または［１１］に記載の製造方法。
［１３］
　シス体および／またはトランス体の１，４－ビス（アミノメチル）シクロヘキサンから、トランス－４－（アミノメチル）シクロヘキサン－１－カルボン酸を製造する、［１０］～［１２］のいずれかに記載の製造方法。
［１４］
　シス体および／またはトランス体の１，４－ビス（アミノメチル）シクロヘキサンから、シス－４－（アミノメチル）シクロヘキサン－１－カルボン酸を製造する、［１０］～［１２］のいずれかに記載の製造方法。
［１５］
　上記方法の一部または全部が、中性または塩基性条件下で行われる、［１０］～［１３］のいずれに記載の製造方法。
［１６］
　上記方法の一部または全部が、２級アミンの存在下で行われる、［１５］に記載の製造方法。
［１７］
　アルデヒドデヒドロゲナーゼであって、４－（アミノメチル）シクロヘキサン－１－カルバルデヒドのアルデヒド基を酸化させて、４－（アミノメチル）シクロヘキサン－１－カルボン酸を産生させるアルデヒドデヒドロゲナーゼ活性を有する、タンパク質。
［１８］
　ベンズアルデヒドデヒドロゲナーゼであって、４－（アミノメチル）シクロヘキサン－１－カルバルデヒドのアルデヒド基を酸化させて、４－（アミノメチル）シクロヘキサン－１－カルボン酸を産生させるアルデヒドデヒドロゲナーゼ活性を有する、［１７］に記載のタンパク質。
［１９］
　上記アルデヒドデヒドロゲナーゼが、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属細菌由来のアルデヒドデヒドロゲナーゼである、［１７］または［１８］に記載のタンパク。
［２０］
　配列番号１９～２２、３５～４６および１２７～１３９のいずれか１つで表されるアミノ酸配列と５０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなる、［１７］または［１８］に記載のタンパク質。
［２１］
　４－（アミノメチル）シクロヘキサン－１－カルバルデヒドから、４－（アミノメチル）シクロヘキサン－１－カルボン酸を産生させるアルデヒドデヒドロゲナーゼ活性を有し、配列番号２０で表されるアミノ酸配列と５０％以上の同一性を有するアミノ酸配列であって、かつ、配列番号２０で表されるアミノ酸配列とアライメントしたとき、下記（１）～（２６）の少なくとも１つのアミノ酸基を含むアミノ酸配列からなる、タンパク質。
（１）３５位相当位置のアミノ酸残基がグリシン残基（Ｇ）である
（２）６５位相当位置のアミノ酸残基がアラニン残基（Ａ）である
（３）８２位相当位置のアミノ酸残基がロイシン残基（Ｌ）である
（４）１０４位相当位置のアミノ酸残基がグリシン残基（Ｇ）である
（５）１０９位相当位置のアミノ酸残基がグリシン残基（Ｇ）である
（６）１１０位相当位置のアミノ酸残基がイソロイシン残基（Ｉ）である
（７）１１７位相当位置のアミノ酸残基がグルタミン残基（Ｑ）である
（８）１２２位相当位置のアミノ酸残基がアラニン残基（Ａ）である
（９）１２４位相当位置のアミノ酸残基がロイシン残基（Ｌ）である
（１０）１３４位相当位置のアミノ酸残基がバリン残基（Ｖ）である
（１１）１４４位相当位置のアミノ酸残基がバリン残基（Ｖ）である
（１２）１６０位相当位置のアミノ酸残基がフェニルアラニン残基（Ｆ）である
（１３）２７１位相当位置のアミノ酸残基がグリシン残基（Ｇ）である
（１４）２９０位相当位置のアミノ酸残基がアラニン残基（Ａ）である
（１５）３１９位相当位置のアミノ酸残基がアスパラギン酸残基（Ｄ）である
（１６）３３３位相当位置のアミノ酸残基がアスパラギン酸残基（Ｄ）である
（１７）３６５位相当位置のアミノ酸残基がグルタミン残基（Ｑ）である
（１８）３９０位相当位置のアミノ酸残基がイソロイシン残基（Ｉ）である
（１９）４２０位相当位置のアミノ酸残基がアラニン残基（Ａ）である
（２０）４２３位相当位置のアミノ酸残基がロイシン残基（Ｌ）である
（２１）４３４位相当位置のアミノ酸残基がバリン残基（Ｖ）である
（２２）４４０位相当位置のアミノ酸残基がプロリン残基（Ｐ）である
（２３）４４３位相当位置のアミノ酸残基がシステイン残基（Ｃ）である
（２４）４４５位相当位置のアミノ酸残基がプロリン残基（Ｐ）である
（２５）４６６位相当位置のアミノ酸残基がセリン残基（Ｓ）である
（２６）４６７位相当位置のアミノ酸残基がイソロイシン残基（Ｉ）である
［２２］
　［１７］～［２１］のいずれかに記載のタンパク質をコードするＤＮＡ。
［２３］
　［２２］に記載のＤＮＡを含む組換え体ＤＮＡ。
［２４］
　［２２］に記載のＤＮＡを含むか、または、［２３］に記載の組換え体ＤＮＡで宿主細胞を形質転換して得られる、組換え細胞。
［２５］
　上記アミノ基転移酵素が［１］に記載のタンパク質であり、上記アルデヒドデヒドロゲナーゼが［１７］～［２１］のいずれかに記載のタンパク質である、［１０］に記載の製造方法。
［２６］
　上記方法の一部または全部において、アラニンデヒドロゲナーゼ、および／または、ＮＡＤＨオキシダーゼを共存させる、［２５］に記載の製造方法。
［２７］
　シス体および／またはトランス体の１，４－ビス（アミノメチル）シクロヘキサンから、トランス－４－（アミノメチル）シクロヘキサン－１－カルボン酸を製造する、［２５］または［２６］に記載の製造方法。
［２８］
　シス体および／またはトランス体の１，４－ビス（アミノメチル）シクロヘキサンから、シス－４－（アミノメチル）シクロヘキサン－１－カルボン酸を製造する、［２５］または［２６］に記載の製造方法。
［２９］
　上記方法の一部または全部が、中性または塩基性条件下で行われる、［２５］～［２８］のいずれかに記載の製造方法。
［３０］
　上記方法の一部または全部が、２級アミンの存在下で行われる、［２５］～［２８］のいずれかに記載の製造方法。
［３１］
　［２］並びに［７］もしくは［２２］に記載のＤＮＡ、および／または上記ヒドロキシ基を有する化合物のヒドロキシ基をアルデヒド基に変換する活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡを含む組換え体ＤＮＡ。
［３２］
　［２］並びに［７］もしくは［２２］に記載のＤＮＡ、および／または上記ヒドロキシ基を有する化合物のヒドロキシ基をアルデヒド基に変換する活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡを含むか、または、［３１］に記載の組換え体ＤＮＡで宿主細胞を形質転換して得られる、組換え細胞。
［３３］
　上記ヒドロキシ基を有する化合物のヒドロキシ基をアルデヒド基に変換する活性を有する酵素をコードするＤＮＡを更に含むか、上記ヒドロキシ基を有する化合物のヒドロキシ基をアルデヒド基に変換する活性を有する酵素をコードするＤＮＡを更に含む組換え体ＤＮＡで宿主細胞を形質転換して得られる、［３２］に記載の組換え細胞。

　本発明のヒドロキシ基を有する化合物のヒドロキシ基をアルデヒド基に変換する活性を有するタンパク質（例えば、オキシダーゼ活性を有するタンパク質）、本発明のアルデヒド基とアミノ基を可逆的に変換する活性を有するタンパク質（例えば、アミノ基転移酵素活性を有するタンパク質）、および／または本発明のアルデヒド基をカルボキシ基に変換する活性を有するタンパク質（例えば、アルデヒドデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質）によれば、新規な酵素反応経路に基づき４－（アミノメチル）シクロヘキサン－１－カルボン酸を製造することができる。また、目的とする４－（アミノメチル）シクロヘキサン－１－カルボン酸の立体構造に応じて、アルデヒドデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質の基質特異性を活用することで、シス体およびトランス体混合物を基質として用いた場合にも、目的の構造の化合物を選択的に多く生成させることができる。

　本発明の製造方法によれば、高温高圧を必要とせず、製造コストを低減しながら、効率的に４－（アミノメチル）シクロヘキサン－１－カルボン酸を製造することができる。また、オキシダーゼ活性を有するタンパク質を用いる場合には、酸素および／または補酵素、アミノ基転移酵素活性を有するタンパク質を用いる場合には、アミノ基を受容する化合物（例えばケト酸）もしくはアミノ基を供与する化合物（例えばアミノ酸）、デヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質やアルデヒドレダクターゼ活性を有するタンパク質を用いる場合には、補酵素、および／またはそれらの再生系を反応系に導入することで、酵素反応をより効率化させ４－（アミノメチル）シクロヘキサン－１－カルボン酸の生産性を向上させることができる。さらに、１，４－ビス（アミノメチル）シクロヘキサンのシス体およびトランス体混合物を基質として用いた場合に、トランス体の４－（アミノメチル）シクロヘキサン－１－カルバルデヒドに選択的に作用する本発明のアルデヒド基をカルボキシ基に変換する活性を有するタンパク質（例えば、アルデヒドデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質）を用い、かつ、反応を中性または塩基性で行うことで、中間体化合物の一つである４－（アミノメチル）シクロヘキサン－１－カルバルデヒドのシス体からトランス体への異性化反応が促進されるため、動的速度論分割により高収率かつ高選択的にトランス体の４－（アミノメチル）シクロヘキサン－カルボン酸（トラネキサム酸）を製造することができる。加えて、１，４－シクロヘキサンジメタノールを基質として用いた場合、１，４－ビス（アミノメチル）シクロヘキサンを基質として用いた場合と比較してもより安価に４－（アミノメチル）シクロヘキサン－１－カルボン酸を製造することができる。

一実施形態における、シス体またはトランス体の１，４－ビス（アミノメチル）シクロヘキサンからシス体またはトランス体の４－（アミノメチル）シクロヘキサン－１－カルバルデヒド、および、シス体またはトランス体の４－（アミノメチル）シクロヘキサン－１－カルボン酸を製造するスキームを示す。実施例１のアミノ基転移酵素活性を有するタンパク質（ＡＴ）発現プラスミド（ｐＱＥ８０Ｌ－ＰｐＡＴ８）の構築方法を示す模式図である。実施例１における、ＰａｔＡ酵素反応液のＬＣ－ＭＳクロマトグラム（ＥＩＣ：１４２．１０ｍ／ｚ）を示す。実施例７における、ＡＴおよびアルデヒドデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質（ＡＬＤＨ）共発現プラスミド（ｐＥＴ２８ａ－ＰａｔＡ－ＸｙｌＣ）の構築方法を示す模式図である。図５Ａおよび図５Ｂは、実施例１１における、アルデヒドデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質（ＡＬＤＨ）のアミノ酸配列を、アライメントした結果を示す図である。図５Ａおよび図５Ｂは、実施例１１における、アルデヒドデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質（ＡＬＤＨ）のアミノ酸配列を、アライメントした結果を示す図である。一実施形態における、一般式（１）で表される化合物から４－（アミノメチル）シクロヘキサン－１－カルボン酸を製造するスキームを示す。一般式（１）で表される各化合物の置換基、当該各化合物を基質化合物または中間体化合物として用いた場合の４－（アミノメチル）シクロヘキサン－１－カルボン酸への予想合成ルート、およびその際に使用する酵素を示す表である。実施例１５における酵素反応液のｏ－フタルアルデヒド（ＯＰＡ）誘導体化分析クロマトグラムである。実施例１５における酵素反応液のジニトロフェニルヒドラジン（ＤＮＰＨ）誘導体化分析クロマトグラムである。

１．化合物および酵素反応
　本発明における目的化合物である４－（アミノメチル）シクロヘキサン－１－カルボン酸（４－（ａｍｉｎｏｍｅｔｈｙｌ）ｃｙｃｌｏｈｅｘａｎｅ－１－ｃａｒｂｏｘｙｌｉｃ　ａｃｉｄ；以下、場合によって「ＡＭＣＨＡ」という）は非天然型のアミノ酸である（以下、本発明において目的化合物という場合がある）。４－（アミノメチル）シクロヘキサン－１－カルボン酸にはシス体であるシス－４－（アミノメチル）シクロヘキサン－１－カルボン酸（ｃｉｓ－４－（ａｍｉｎｏｍｅｔｈｙｌ）ｃｙｃｌｏｈｅｘａｎｅ－１－ｃａｒｂｏｘｙｌｉｃ　ａｃｉｄ）と、トランス体であるトランス－４－（アミノメチル）シクロヘキサン－１－カルボン酸（ｔｒａｎｓ－４－（ａｍｉｎｏｍｅｔｈｙｌ）ｃｙｃｌｏｈｅｘａｎｅ－１－ｃａｒｂｏｘｙｌｉｃ　ａｃｉｄ）が存在する。このうちトランス－４－（アミノメチル）シクロヘキサン－１－カルボン酸は、トラネキサム酸（Ｔｒａｎｅｘａｍｉｃ　ａｃｉｄ；以下、場合によって「ＴＸＡ」という）とも呼ばれる。本明細書において特に示さない限り、「トラネキサム酸」または「ＴＸＡ」はトランス－４－（アミノメチル）シクロヘキサン－１－カルボン酸を意味し、シス－４－（アミノメチル）シクロヘキサン－１－カルボン酸は、シス－トラネキサム酸またはシス－ＴＸＡ（ｃｉｓ－ＴＸＡ）という。

　本発明における目的化合物を製造するための基質化合物（単に「基質」と呼ぶ場合がある）または中間体化合物（単に「中間体」と呼ぶ場合がある）は、下記一般式（１）で表される化合物である。なお、本発明における基質化合物とは、４－（アミノメチル）シクロヘキサン－１－カルボン酸の生産において、酵素によって触媒作用を受ける化合物を意味する。また、中間体化合物とは、基質化合物のうち、４－（アミノメチル）シクロヘキサン－１－カルボン酸の生産過程において、酵素による触媒作用を受けて生じた目的化合物以外の化合物であって、更に同一または他の酵素によって触媒作用を受ける化合物を意味する。各化合物（化合物１～８）の置換基は図７に示しており、各化合物の化学名は図６に示す。すべての化合物は、シスおよびトランスであり得る場合は、特に明記しない限り、シス体およびトランス体の両方を含む。

［式中、Ｒ_１およびＲ_２は、それぞれ独立してＣＨ_２ＯＨ、ＣＨＯ、ＣＯＯＨ、またはＣＨ_２ＮＨ_２である（但し、Ｒ_１とＲ_２の一方がＣＯＯＨであり、他方がＣＨ_２ＮＨ_２である場合、およびＲ_１とＲ_２が共にＣＯＯＨである場合を除く）］
具体的には、上記一般式（１）で表される化合物は化合物１，２，３，４，５，６，７または８のいずれか一つである。

　また、本発明における基質化合物または中間体化合物である化合物１～８の化合物名は、以下のとおりである。これらの化合物のうち、市販で容易に入手できる化合物もしくは容易に合成できる化合物（例えば化合物１、化合物８）は、出発原料の基質化合物として好ましく用いられる。一方で、市販品がなく、合成・精製が困難で、または、安定性が悪い化合物は、中間体化合物として好ましく用いられる。

化合物１：１，４－シクロヘキサンジメタノール（１，４－Ｃｙｃｌｏｈｅｘａｎｅｄｉｍｅｔｈａｎｏｌ）
化合物２：４－（ヒドロキシメチル）シクロヘキサン－１－カルバルデヒド（４－（ｈｙｄｒｏｘｙｍｅｔｈｙｌ）ｃｙｃｌｏｈｅｘａｎｅ－１－ｃａｒｂａｌｄｅｈｙｄｅ）
化合物３：１，４－シクロヘキサンジカルバルデヒド（１，４－ｃｙｃｌｏｈｅｘａｎｅｄｉｃａｒｂｏｘｙｌｉｃ　ａｃｉｄ）
化合物４：４－（ヒドロキシメチル）シクロヘキサン－１－カルボン酸（４－（ｈｙｄｒｏｘｙｍｅｔｈｙｌ）ｃｙｃｌｏｈｅｘａｎｅ－１－ｃａｒｂｏｘｙｌｉｃ　ａｃｉｄ）
化合物５：４－ホルミルシクロヘキサン－１－カルボン酸（４－Ｆｏｒｍｙｌｃｙｃｌｏｈｅｘａｎｅ－１－ｃａｒｂｏｘｙｌｉｃ　ａｃｉｄ）
化合物６：［４－（アミノメチル）シクロへキシル］メタノール（［４－（ａｍｉｎｏｍｅｔｈｙｌ）ｃｙｃｌｏｈｅｘｙｌ］ｍｅｔｈａｎｏｌ）
化合物７：４－（アミノメチル）シクロヘキサン－１－カルバルデヒド（４－（ａｍｉｎｏｍｅｔｈｙｌ）ｃｙｃｌｏｈｅｘａｎｅ－１－ｃａｒｂａｌｄｅｈｙｄｅ）
化合物８：１，４－ビス（アミノメチル）シクロヘキサン（１，４－ｂｉｓ（ａｍｉｎｏｍｅｔｈｙｌ）ｃｙｃｌｏｈｅｘａｎｅ）

　本発明における、目的化合物を製造するための酵素反応は、下記の（１）～（３）の少なくとも１つを含む。
（１）ヒドロキシ基を有する化合物のヒドロキシ基をアルデヒド基に変換する酵素反応
（２）アルデヒド基とアミノ基を可逆的に変換する酵素反応、すなわち、アルデヒド基を有する化合物のアルデヒド基をアミノ基に変換する酵素反応と、その逆反応の、アミノ基を有する化合物のアミノ基をアルデヒド基に変換する酵素反応の両方
（３）アルデヒド基を有する化合物のアルデヒド基をカルボキシ基に変換する酵素反応

　本発明の酵素反応は、酵素の存在下で行われる。（１）の酵素反応に使われる酵素は、ヒドロキシ基をアルデヒド基に変換する活性を有するタンパク質であり、本明細書において「酵素Ａ」と呼ぶ場合があり、酵素Ａとしては、例えばオキシダーゼ活性を有するタンパク質（ＯＸ）、デヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質およびアルデヒドレダクターゼ活性を有するタンパク質が挙げられる。（２）の酵素反応に使われる酵素は、アルデヒド基とアミノ基を可逆的に変換する活性を有するタンパク質であり、本明細書において「酵素Ｂ」と呼ぶ場合があり、酵素Ｂとしては、例えばアミノ基転移酵素活性を有するタンパク質（ＡＴ）、アミンデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質およびアミンオキシダーゼ活性を有するタンパク質が挙げられる。（３）の酵素反応に使われる酵素は、アルデヒド基をカルボキシ基に変換する活性を有するタンパク質であり、本明細書において「酵素Ｃ」と呼ぶ場合があり、酵素Ｃとしては、例えばアルデヒドデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質（ＡＬＤＨ）およびアルデヒドオキシダーゼ活性を有するタンパク質が挙げられる。これらの酵素は、後述の「２．本発明のタンパク質およびＤＮＡ」にて詳細に説明する。

　本発明の酵素反応において、酵素Ｂとしてアミノ基転移酵素活性を有するタンパク質を用いる場合には、アミノ基を供与する化合物またはアミノ基を受容する化合物を用いてもよい。本発明の酵素反応において、酵素Ａとしてデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質またはアルデヒドレダクターゼ活性を有するタンパク質を用いる場合、酵素Ｂとしてアミンデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質を用いる場合、および／または、酵素Ｃとしてアルデヒドデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質を用いる場合には、電子受容体としての補酵素を用いてもよい。本発明の酵素反応において、酵素Ａとしてオキシダーゼ活性を有するタンパク質を用いる場合、酵素Ｂとしてアミンオキシダーゼ活性を有するタンパク質を用いる場合、および／または、酵素Ｃとしてアルデヒドオキシダーゼ活性を有するタンパク質を用いる場合には、電子受容体としての酸素または／および補酵素を用いてもよい。アミノ基を供与する化合物としては、例えば、アミノ酸（例えば、アラニン、グルタミン酸、α－アミノ酪酸）等が挙げられ、アミノ基を受容する化合物としては、例えば、ケト酸（例えば、ピルビン酸、α－ケトグルタル酸、α－ケト酪酸）等が挙げられる。補酵素としては、ＮＡＤ（Ｐ）^＋、ＦＡＤ等が挙げられる。

　一実施形態の酵素反応では、化合物１は、ヒドロキシ基をアルデヒド基に変換する活性を有するタンパク質（酵素Ａ）の存在下において、化合物１のヒドロキシ基がアルデヒド基に変換されることにより、化合物２に変換され得る。

　一実施形態の酵素反応では、化合物２は、アルデヒド基をカルボキシ基に変換する活性を有するタンパク質（酵素Ｃ）の存在下において、化合物２におけるアルデヒド基がカルボキシ基に変換されることにより化合物４に変換され得る。また、化合物２は、酵素Ａの存在下において、化合物２のヒドロキシ基がアルデヒド基に変換されることにより、化合物３に変換され得る。さらに、化合物２は、アルデヒド基とアミノ基を可逆的に変換する活性を有するタンパク質（酵素Ｂ）の存在下において、化合物２のアルデヒド基がアミノ基に変換されることにより、化合物６に変換され得る。

　一実施形態の酵素反応では、化合物３は、酵素Ｃの存在下において、化合物３の一方のアルデヒド基がカルボキシ基に変換されることにより、化合物５に変換され得る。また、化合物３は、酵素Ｂの存在下において、化合物３のアルデヒド基がアミノ基に変換されることにより、化合物７に変換され得る。

　一実施形態の酵素反応では、化合物４は、酵素Ａの存在下において、化合物４のヒドロキシ基がアルデヒド基に変換されることにより、化合物５に変換され得る。

　一実施形態の酵素反応では、化合物５は、酵素Ｂの存在下において、化合物５のアルデヒド基がアミノ基に変換されることにより、４－（アミノメチル）シクロヘキサン－１－カルボン酸（目的化合物）に変換され得る。

　一実施形態の酵素反応では、化合物６は、酵素Ａの存在下において、化合物６のヒドロキシ基がアルデヒド基に変換されることにより、化合物７に変換され得る。また、化合物６は、酵素Ｂの存在下において、化合物６のアミノ基がアルデヒド基に変換されることにより、化合物２に変換され得る。

　一実施形態の酵素反応では、化合物７は、酵素Ｃの存在下において、化合物７のアルデヒド基がカルボキシ基に変換されることにより、目的化合物に変換され得る。また、化合物７は、酵素Ｂの存在下において、化合物７のアミノ基がアルデヒド基に変換されることにより、化合物３に変換され得る。

　一実施形態の酵素反応では、化合物８は、酵素Ｂの存在下において、化合物８のアミノ基がアルデヒド基に変換されることにより、化合物７に変換され得る。

　一実施形態の酵素反応において、１，４－ビス（アミノメチル）シクロヘキサン（化合物８）を基質として用いる。該酵素反応は、化合物８から中間体である化合物７を経由して、目的化合物を生成する酵素反応である。該酵素反応は、以下に示すように、２ステップの反応を含む。第１のステップにおいては、基質化合物の１，４－ビス（アミノメチル）シクロヘキサン（１，４－ｂｉｓ（ａｍｉｎｏｍｅｔｈｙｌ）ｃｙｃｌｏｈｅｘａｎｅ、化合物８）は、アミノ基を受容できる化合物であるケト酸（例えば、ピルビン酸）と反応し、酵素Ｂとしてのアミノ基転移酵素活性を有するタンパク質（ＡＴ）によって、中間体である４－（アミノメチル）シクロヘキサン－１－カルバルデヒド（４－（ａｍｉｎｏｍｅｔｈｙｌ）ｃｙｃｌｏｈｅｘａｎｅ－１－ｃａｒｂａｌｄｅｈｙｄｅ、化合物７）、およびアミノ基を受容した化合物（ケト酸としてピルビン酸を用いた場合にはアラニン）に変換される。第２のステップにおいては、中間体の４－（アミノメチル）シクロヘキサン－１－カルバルデヒド（化合物７）は、酵素Ｃとしてのアルデヒドデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質（ＡＬＤＨ）によって、ＮＡＤ（Ｐ）^＋を補酵素とし、４－（アミノメチル）シクロヘキサン－１－カルボン酸およびＮＡＤ（Ｐ）Ｈに変換される（図１、図６および図７）。第１のステップの酵素反応と第２のステップの酵素反応は、別々の反応系に分けて順番に行われていてもよいが、一つの反応系において行われるのが望ましい。

　また、第１のステップで、アミノ基を受容するための化合物としてピルビン酸を使用する場合、産生されたアラニンはアラニンデヒドロゲナーゼによって、ピルビン酸に変換（再生）されることが可能であり、第２のステップで、産生されたＮＡＤ（Ｐ）Ｈは、ＮＡＤ（Ｐ）ＨオキシダーゼによってＮＡＤ（Ｐ）^＋に変換（再生）されることが可能である。他にも、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈを電気的に酸化することによってもＮＡＤ（Ｐ）^＋を再生することが可能である（図１）。

　基質化合物または中間体化合物の１，４－ビス（アミノメチル）シクロヘキサン（化合物８）は、シス体およびトランス体混合物であっても、トランス体であってもシス体であってもよい。また、４－（アミノメチル）シクロヘキサン－１－カルバルデヒド（化合物７）も、シス体およびトランス体混合物であっても、トランス体であってもシス体であってもよい。

　別の実施形態の酵素反応において、１，４－シクロヘキサンジメタノール（化合物１）を基質として用いる。該酵素反応は、図６および図７に示すように、化合物１から目的化合物を生成する複数の酵素反応を含む。該酵素反応は、以下に示す酵素反応を含んでもよい。まず、基質化合物の１，４－シクロヘキサンジメタノール（化合物１）は、ヒドロキシ基を有する化合物のヒドロキシ基をアルデヒド基に変換する活性を有する酵素（酵素Ａ）によって、４－（ヒドロキシメチル）シクロヘキサン－１－カルバルデヒド（化合物２）に変換され、次に様々な酵素反応を経て、最終的に目的化合物の４－（アミノメチル）シクロヘキサン－１－カルボン酸に変換される。これらの酵素反応は、複数の反応系に分けて順番に行われていてもよいが、一つの反応系において行われるのが望ましい。

　具体的には、上記４－（ヒドロキシメチル）シクロヘキサン－１－カルバルデヒド（化合物２）は、ヒドロキシ基を有する化合物のヒドロキシ基をアルデヒド基に変換する活性を有する酵素（酵素Ａ；例えば、オキシダーゼ活性を有するタンパク質）、アルデヒド基とアミノ基を可逆的に変換する活性を有する酵素（酵素Ｂ；例えば、アミノ基転移酵素活性を有するタンパク質）、およびアルデヒド基をカルボキシ基に変換する活性を有する酵素（酵素Ｃ；例えば、アルデヒドデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質）の存在下で、目的化合物の４－（アミノメチル）シクロヘキサン－１－カルボン酸に変換され得る。これらの酵素の存在下での酵素反応は、４－（ヒドロキシメチル）シクロヘキサン－１－カルバルデヒド（化合物２）が、様々な化合物（化合物３、化合物４、化合物６）に変換され、更に４－ホルミルシクロヘキサン－１－カルボン酸（化合物５）および／または４－（アミノメチル）シクロヘキサン－１－カルバルデヒド（化合物７）に変換されたのち、最終的に目的化合物の４－（アミノメチル）シクロヘキサン－１－カルボン酸に変換される反応経路があり得る（図６）。なお、化合物３と化合物７、および、化合物２と化合物６は、アルデヒド基とアミノ基を可逆的に変換する活性を有する酵素（酵素Ｂ）の存在下で、それぞれ相互に変換され得る。

　上記の酵素反応において、アルデヒド基とアミノ基を可逆的に変換する活性を有するタンパク質（酵素Ｂ）のうち、アミノ基転移酵素活性を有するタンパク質は、アミノ基を供与できる化合物であるアミノ酸（例えば、アラニンまたはグルタミン酸）から、アルデヒド基を有する基質および／または中間体にアミノ基を供与し、アミノ基を受容した生成物とケト酸（アミノ酸としてアラニンを用いた場合はピルビン酸、グルタミン酸を用いた場合はα－ケトグルタル酸）を生成する。また、上記の逆反応においては、同様にアミノ基を有する基質および／または中間体とケト酸から、アルデヒド基を有する生成物とアミノ酸を生成する。

　アミノ基を供与するための化合物としてアラニンまたはグルタミン酸を使用する場合、産生されたピルビン酸またはα－ケトグルタル酸は、後述のアラニンデヒドロゲナーゼまたはグルタミン酸デヒドロゲナーゼによって、アラニンまたはグルタミン酸に変換（再生）されることが可能である。また、逆反応においても同様に再生が可能である。

　上記の酵素反応において、酵素Ａ、Ｂおよび／またはＣとして、デヒドロゲナーゼ（例えば、酵素Ａとしてアルコールデヒドロゲナーゼ、酵素Ｂとしてアミンデヒドロゲナーゼ、酵素Ｃとしてアルデヒドデヒドロゲナーゼ等）を用いる場合、基質および／または中間体が補酵素ＮＡＤ（Ｐ）^＋によって酸化され、生成物とＮＡＤ（Ｐ）Ｈを生成する。同様に、酵素Ａとしてアルデヒドレダクターゼを用いる場合、基質および／または中間体が補酵素ＮＡＤ（Ｐ）^＋によって酸化され、生成物とＮＡＤ（Ｐ）Ｈを生成する。

　上記反応において、産生されたＮＡＤ（Ｐ）Ｈは、後述のＮＡＤ（Ｐ）ＨオキシダーゼによってＮＡＤ（Ｐ）^＋に変換（再生）されることが可能である。

　上記の酵素反応において、基質化合物の１，４－シクロヘキサンジメタノール（化合物１）は、シス体およびトランス体混合物であっても、トランス体であってもシス体であってもよい。４－（アミノメチル）シクロヘキサン－１－カルバルデヒド（化合物７）、および４－ホルミルシクロヘキサン－１－カルボン酸（化合物５）もシス体およびトランス体混合物であっても、トランス体であってもシス体であってもよい。

　なお、特許文献３および非特許文献５には、１，４－シクロヘキサンジメタノールから１，４－シクロヘキサンジカルバルデヒドを生成するＡｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ　ｃｈｌｏｒｏｐｈｅｎｏｌｉｃｕｓ由来コリンオキシダーゼ変異体が開示されており、特許文献４には、１，４－シクロヘキサンジカルバルデヒドから１，４－ビス（アミノメチル）シクロヘキサンを生成するＥｓｈｃｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ由来プトレシンアミノトランスフェラーゼ（ＰａｔＡ）変異体が開示されている。しかしながら、本発明の酵素反応経路に基づいて１，４－シクロヘキサンジメタノールから４－（アミノメチル）シクロヘキサン－１－カルボン酸を製造できることは知られていない。

２．本発明のタンパク質およびＤＮＡ
（１）本発明のアルデヒド基とアミノ基を可逆的に変換する活性を有するタンパク質（酵素Ｂ）およびそれをコードするＤＮＡ
　本明細書において、「アルデヒド基とアミノ基を可逆的に変換する活性」とは、アルデヒド基を有する化合物のアルデヒド基をアミノ基に変換する酵素反応と、その逆反応の、アミノ基を有する化合物のアミノ基をアルデヒド基に変換する酵素反応の両方を触媒する活性を意味する。本明細書において、これらのタンパク質は併せて「酵素Ｂ」という。アルデヒド基とアミノ基を可逆的に変換する活性を有するタンパク質は、「アルデヒド基とアミノ基を可逆的に変換する酵素」ともいう。

　本発明のアルデヒド基とアミノ基を可逆的に変換する活性を有するタンパク質（酵素Ｂ）は、具体的に、図６および図７に示すアミノ基を有する化合物である［４－（アミノメチル）シクロへキシル］メタノール（化合物６）、４－（アミノメチル）シクロヘキサン－１－カルバルデヒド（化合物７）、または１，４－ビス（アミノメチル）シクロヘキサン（化合物８）のアミノ基をアルデヒド基に変換する、または図６および図７に示すアルデヒド基を有する化合物である４－（ヒドロキシメチル）シクロヘキサン－１－カルバルデヒド（化合物２）、１，４－シクロヘキサンジカルバルデヒド（化合物３）、または４－ホルミルシクロヘキサン－１－カルボン酸（化合物５）のアルデヒド基をアミノ基に変換する活性を有するタンパク質である。

　アルデヒド基とアミノ基を可逆的に変換する活性を有するタンパク質（酵素Ｂ）としては、例えば、アミノ基転移酵素活性を有するタンパク質、アミン脱水素酵素（アミンデヒドロゲナーゼ）活性を有するタンパク質、およびアミン酸化酵素（アミンオキシダーゼ）活性を有するタンパク質等が挙げられ、好ましくはアミノ基転移酵素活性を有するタンパク質である。

　アミノ基転移酵素（アミノトランスフェラーゼ；ａｍｉｎｏｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ；ＡＴ、もしくは、トランスアミナーゼ；ｔｒａｎｓａｍｉｎａｓｅと表現される）とは、生化学においてアミノ酸とα－ケト酸の間の反応を触媒する酵素の総称である。本明細書において、アミノ基転移酵素活性を有することとは、アミノ基を有する化合物からアミノ基を別の化合物に転移し、カルボニル基に変換する可逆反応を触媒する活性をいう。本明細書において、アミノ基転移酵素活性を有するタンパク質とは、アミノ基を有する化合物からアミノ基を別の化合物に転移し、カルボニル基に変換する可逆反応を触媒する活性を有するタンパク質をいい、「ＡＴ」と呼ぶ場合がある。

　一実施形態のＡＴは、例えば、配列番号１～４および１０３～１０５のいずれか１つで表されるアミノ酸配列と６０％以上（好ましくは、７０％以上、７５％以上、８０％以上、９０％以上、９３％以上、９５％以上、または９８％以上）の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、アミノ基転移酵素活性を有する、タンパク質である。

　本実施形態のＡＴは、配列番号１～４および１０３～１０５のいずれか１つで表されるアミノ酸配列からなるタンパク質であってもよい。配列番号１で表されるアミノ酸配列を有するタンパク質はＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｐｕｔｉｄａ　ＫＴ２４４０由来アミノ基転移酵素ＰｐＡＴ８であり、配列番号２で表されるアミノ酸配列を有するタンパク質はＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｐｕｔｉｄａ　ＫＴ２４４０由来アミノ基転移酵素ＰｐＡＴ２であり、配列番号３で表されるアミノ酸配列を有するタンパク質はＡｅｒｏｍｏｎａｓ　ｓａｌｍｏｎｉｃｉｄａ　ｓｕｂｓｐ．　Ｓａｌｍｏｎｉｃｉｄａ由来アミノ基転移酵素ＡｓＡＴ５であり、配列番号４で表されるアミノ酸配列を有するタンパク質はＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　Ｋ１２　ＭＧ１６５５由来アミノ基転移酵素ＰａｔＡである。配列番号１０３～１０５で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質は、表３に記載の微生物由来の、配列番号１または４で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質（ＰｐＡＴ８またはＰａｔＡ）のホモログタンパク質（相同タンパク質）である。これらのタンパク質は、これまで、上述の図６に示すアミノ基を有する化合物のアミノ基を他の化合物へ転移させる活性または上述の図６に示すアルデヒド基を有する化合物にアミノ基を転移させる活性を有することは知られていない。

　別の実施形態のＡＴは、上記アミノ基転移酵素活性を有するタンパク質の変異タンパク質または相同タンパク質であってよく、例えば、上記配列番号１～４および１０３～１０５のいずれか１つで表されるアミノ酸配列からなるタンパク質の変異タンパク質または相同タンパク質であって、配列番号１～４および１０３～１０５のいずれか１つで表されるアミノ酸配列と６０％以上（好ましくは、７０％以上、７５％以上、８０％以上、９０％以上、９３％以上、９５％以上、または９８％以上）の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、アミノ基転移酵素活性を有する、タンパク質である。

　本明細書において、変異タンパク質とは、元となるタンパク質中のアミノ酸残基を人為的に欠失若しくは置換、または該タンパク質中に人為的にアミノ酸残基を挿入若しくは付加して得られるタンパク質をいう。本明細書において、相同タンパク質とは、自然界に存在する生物が有するタンパク質であって、進化上の起源が同一のタンパク質に由来する一群のタンパク質をいう。相同タンパク質は、互いに構造および機能が類似している。

　変異タンパク質において、アミノ酸が欠失、置換、挿入または付加されたとは、アミノ酸配列中の任意の位置において、１～２０個のアミノ酸が欠失、置換、挿入または付加されていてもよく、例えば、１～１５個、１～１０個、１～５個、１～４個、１～３個、１～２個、または１個のアミノ酸が欠失、置換、挿入または付加されていてもよい。

　置換、挿入または付加されるアミノ酸は天然型と非天然型を問わない。天然型アミノ酸としては、Ｌ－アラニン、Ｌ－アスパラギン、Ｌ－アスパラギン酸、Ｌ－グルタミン、Ｌ－グルタミン酸、グリシン、Ｌ－ヒスチジン、Ｌ－イソロイシン、Ｌ－ロイシン、Ｌ－リジン、Ｌ－アルギニン、Ｌ－メチオニン、Ｌ－フェニルアラニン、Ｌ－プロリン、Ｌ－セリン、Ｌ－スレオニン、Ｌ－トリプトファン、Ｌ－チロシン、Ｌ－バリン、Ｌ－システイン等が挙げられる。

　以下に、相互に置換可能なアミノ酸の例を示す。同一群に含まれるアミノ酸は相互に置換可能である。
Ａ群：ロイシン、イソロイシン、ノルロイシン、バリン、ノルバリン、アラニン、２－アミノブタン酸、メチオニン、ｏ－メチルセリン、ｔ－ブチルグリシン、ｔ－ブチルアラニン、シクロヘキシルアラニン
Ｂ群：アスパラギン酸、グルタミン酸、イソアスパラギン酸、イソグルタミン酸、２－アミノアジピン酸、２－アミノスベリン酸
Ｃ群：アスパラギン、グルタミン
Ｄ群：リジン、アルギニン、オルニチン、２，４－ジアミノブタン酸、２，３－ジアミノプロピオン酸
Ｅ群：プロリン、３－ヒドロキシプロリン、４－ヒドロキシプロリン
Ｆ群：セリン、スレオニン、ホモセリン
Ｇ群：フェニルアラニン、チロシン

　配列番号１～４および１０３～１０５のいずれか１つで表されるアミノ酸配列からなるタンパク質の変異タンパク質または相同タンパク質のアミノ酸配列は、配列番号１～４および１０３～１０５のいずれか１つで表されるアミノ酸配列に対し、少なくとも６０％以上、好ましくは７０％以上、７５％以上、８０％以上、９０％以上、または９３％以上、さらに好ましくは９５％以上、最も好ましくは９８％以上の同一性を有する。

　アミノ酸配列や塩基配列の同一性（相同性ともいう）は、Ｋａｒｌｉｎ　ａｎｄ　ＡｌｔｓｃｈｕｌによるアルゴリズムＢＬＡＳＴ［Ｐｒｏ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０，５８７３（１９９３）］やＦＡＳＴＡ［Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｅｎｚｙｍｏｌ．，１８３，６３（１９９０）］を用いて決定することができる。このアルゴリズムＢＬＡＳＴに基づいて、ＢＬＡＳＴＮやＢＬＡＳＴＸとよばれるプログラムが開発されている［Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２１５，４０３（１９９０）］。ＢＬＡＳＴに基づいてＢＬＡＳＴＮを使用して塩基配列を解析する場合には、パラメータは、例えばＳｃｏｒｅ＝１００、ｗｏｒｄｌｅｎｇｔｈ＝１２とする。また、ＢＬＡＳＴに基づいてＢＬＡＳＴＸを使用してアミノ酸配列を解析する場合には、パラメータは、例えばｓｃｏｒｅ＝５０、ｗｏｒｄｌｅｎｇｔｈ＝３とする。ＢＬＡＳＴとＧａｐ　ｐｅｄ　ＢＬＡＳＴプログラムを用いる場合には、各プログラムのデフォルトパラメータを用いる。これらの解析方法の具体的な手法は公知である。

　アミン脱水素酵素（アミンデヒドロゲナーゼ；ａｍｉｎｅ　ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ）とは、生化学においてＮＡＤ（Ｐ）^＋を補酵素としてアミノ基を有する化合物とアルデヒド基を有する化合物との間の酸化還元反応を触媒する酵素群の総称である。本明細書において、アミンデヒドロゲナーゼ活性を有することとは、アミノ基を有する化合物のアミノ基を酸化する反応を介して、アルデヒド基に変換する反応と、アルデヒド基を有する化合物のアルデヒド基を還元する反応を介して、アミノ基に変換する反応と、の可逆反応を触媒する活性をいう。本明細書において、アミンデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質とは、上記アミンデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質をいう。

　一実施形態のアミンデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質は、図６に示す化合物のアミノ基とアルデヒド基を可逆的に変換する活性を有しているものであれば特に限定されないが、公知のアミンデヒドロゲナーゼであってもよい。公知のアミンデヒドロゲナーゼとして、例えば、Ｂａｃｉｌｌｕｓ属細菌由来アミンデヒドロゲナーゼ（例えば、Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｂａｄｉｕｓ由来アミンデヒドロゲナーゼ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ由来アミンデヒドロゲナーゼ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｖｉｒｇｉｎｉａｅ由来アミンデヒドロゲナーゼ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｐｕｔｉｄａ由来アミンデヒドロゲナーゼ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ由来アミンデヒドロゲナーゼ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ　ｅｎｔｅｒｉｃａ由来アミンデヒドロゲナーゼ等）が挙げられる。

　一実施形態のアミンデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質は、アミンデヒドロゲナーゼの変異タンパク質または相同タンパク質であって、図６に示す化合物（例えば、化合物２、化合物３、化合物５、化合物６、化合物７、化合物８）のアミノ基とアルデヒド基を可逆的に変換する活性を有するタンパク質であってもよい。このようなタンパク質としては、例えば、上記の公知のアミンデヒドロゲナーゼのアミノ酸配列と６０％以上（好ましくは、７０％以上、７５％以上、８０％以上、９０％以上、９３％以上、９５％以上、または９８％以上）の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、アミンデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質であってよい。

　アミン酸化酵素（アミンオキシダーゼ；ａｍｉｎｅ　ｏｘｉｄａｓｅ）とは、生化学において酸素を電子受容体としてアミノ基を有する化合物とアルデヒド基を有する化合物の間の酸化還元反応を触媒する酵素の総称である。本明細書において、アミンオキシダーゼ活性を有することとは、アミノ基を有する化合物のアミノ基を酸化する反応を介して、アルデヒド基に変換する可逆反応を触媒する活性をいう。本明細書において、アミンオキシダーゼ活性を有するタンパク質とは、アミノ基を有する化合物のアミノ基を酸化する反応を介して、アルデヒド基に変換する可逆反応を触媒する活性を有するタンパク質をいう。

　一実施形態のアミンオキシダーゼ活性を有するタンパク質は、図６に示す化合物のアミノ基とアルデヒド基を可逆的に変換する活性を有しているものであれば特に限定されないが、公知のアミンオキシダーゼであってもよい。公知のアミンオキシダーゼとしては、一級アミンオキシダーゼ、ジアミンオキシダーゼまたはプトレシンオキシダーゼであってよい。

　一実施形態のプトレシンオキシダーゼは、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ属真菌由来プトレシンオキシダーゼ（例えば、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｎｉｄｕｌａｎｓ由来プトレシンオキシダーゼ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｌｕｃｈｕｅｎｓｉｓ由来プトレシンオキシダーゼ等）、Ｂｏｓ　ｔａｕｒｕｓ由来プトレシンオキシダーゼ、Ｃａｎｄｉｄａ属真菌由来プトレシンオキシダーゼ（例えば、Ｃａｎｄｉｄａ　ａｌｂｉｃａｎｓ由来プトレシンオキシダーゼ、Ｃａｎｄｉｄａ　ｐａｒａｐｓｉｌｏｓｉｓ由来プトレシンオキシダーゼ、Ｃａｎｄｉｄａ　ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ由来プトレシンオキシダーゼ等）、Ｋｏｃｕｒｉａ属細菌由来プトレシンオキシダーゼ（例えば、Ｋｏｃｕｒｉａ　ｒｏｓｅａ由来プトレシンオキシダーゼ等）、Ｍｅｙｅｒｏｚｙｍａ　ｇｕｉｌｌｉｅｒｍｏｎｄｉｉ由来プトレシンオキシダーゼ、Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ　ｌｕｔｅｕｓ由来プトレシンオキシダーゼ、Ｐａｅｎａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ属細菌由来プトレシンオキシダーゼ（例えば、Ｐａｅｎａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ　ａｕｒｅｓｃｅｎｓ由来プトレシンオキシダーゼ等）、Ｐｉｃｈｉａ　ｋｕｄｒｉａｖｚｅｖｉｉ由来プトレシンオキシダーゼ、Ｐｉｓｕｍ　ｓａｔｉｖｕｍ由来プトレシンオキシダーゼ、Ｐｓｅｕｄｍｏｎａｓ属細菌由来プトレシンオキシダーゼ（例えば、Ｐｓｅｕｄｍｏｎａｓ　ｐｕｔｉｄａ由来プトレシンオキシダーゼ等）、Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ属細菌由来プトレシンオキシダーゼ（例えば、Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ　ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓ由来プトレシンオキシダーゼ、Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ　ｏｐａｃｕｓ由来プトレシンオキシダーゼ等）である。

　一実施形態の一級アミンオキシダーゼは、Ｐａｅｎａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ　ａｕｒｅｓｃｅｎｓ由来一級アミンオキシダーゼ、Ｔｒｉｆｏｌｉｕｍ　ｐｒａｔｅｎｓｅ由来一級アミンオキシダーゼ、Ｈｕｐｅｒｚｉａ　ｓｅｒｒａｔａ由来一級アミンオキシダーゼ、Ｈｏｍｏ　ｓａｐｉｅｎｓ由来一級アミンオキシダーゼ、Ｍａｌｕｓ　ｄｏｍｅｓｔｉｃａ由来一級アミンオキシダーゼ、Ｐｉｓｕｍ　ｓａｔｉｖｕｍ由来一級アミンオキシダーゼ、Ｎｉｃｏｔｉａｎａ　ｔａｂａｃｕｍ由来一級アミンオキシダーゼ、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ　ｔｈａｌｉａｎａ由来一級アミンオキシダーゼ、Ｅｕｐｈｏｒｂｉａ　ｃｈａｒａｃｉａｓ由来一級アミンオキシダーゼ、Ｈｕｐｅｒｚｉａ　ｓｅｒｒａｔａ由来一級アミンオキシダーゼ、Ｌｅｎｓ　ｃｕｌｉｎａｒｉｓ由来一級アミンオキシダーゼ、Ｔｒｉｆｏｌｉｕｍ　ｐｒａｔｅｎｓｅ由来一級アミンオキシダーゼ、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ　ｔｈａｌｉａｎａ由来一級アミンオキシダーゼ、Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ　ｇｌｏｂｉｆｏｒｍｉｓ由来一級アミンオキシダーゼ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ属真菌由来一級アミンオキシダーゼ（例えば、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｃａｒｂｏｎａｒｉｕｓ由来一級アミンオキシダーゼ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｎｉｄｕｌａｎｓ由来一級アミンオキシダーゼ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｎｉｇｅｒ由来一級アミンオキシダーゼ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｌｕｃｈｕｅｎｓｉｓ由来一級アミンオキシダーゼ等）、Ｂｏｓ　ｔａｕｒｕｓ由来一級アミンオキシダーゼ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ由来一級アミンオキシダーゼ、Ｌａｔｈｙｒｕｓ　ｓａｔｉｖｕｓ由来一級アミンオキシダーゼ、Ｍｕｓ　ｍｕｓｃｕｌｕｓ由来一級アミンオキシダーゼ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｓｐ．由来一級アミンオキシダーゼ、Ｏｇａｔａｅａ　ａｎｇｕｓｔａ由来一級アミンオキシダーゼ、Ｏｎｏｂｒｙｃｈｉｓ　ｖｉｃｉｉｆｏｌｉａ由来一級アミンオキシダーゼ、Ｒａｔｔｕｓ　ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ由来一級アミンオキシダーゼ、Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ　ｏｐａｃｕｓ由来一級アミンオキシダーゼ、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｐｏｍｂｅ由来一級アミンオキシダーゼ、Ｓｕｓ　ｓｃｒｏｆａ由来一級アミンオキシダーゼ、Ｔｒｉｆｏｌｉｕｍ　ｐｒａｔｅｎｓｅ由来一級アミンオキシダーゼ、Ｖｉｃｉａ　ｆａｂａ由来一級アミンオキシダーゼである。

　一実施形態のジアミンオキシダーゼは、Ｂｒｕｇｍａｎｓｉａ　ｘｃａｎｄｉｄａ由来ジアミンオキシダーゼ、Ｇｌｙｃｉｎｅ　ｍａｘ由来ジアミンオキシダーゼ、Ｈｏｍｏ　ｓａｐｉｅｎｓ由来ジアミンオキシダーゼ、Ｈｙｏｓｃｙａｍｕｓ　ｎｉｇｅｒ由来ジアミンオキシダーゼ、Ｌａｔｈｙｒｕｓ属植物由来ジアミンオキシダーゼ（例えば、Ｌａｔｈｙｒｕｓ　ｓａｔｉｖｕｓ由来ジアミンオキシダーゼ、Ｌａｔｈｙｒｕｓ　ｃｉｃｅｒａ由来ジアミンオキシダーゼ等）、Ｎｉｃｏｔｉａｎａ　ｔａｂａｃｕｍ由来ジアミンオキシダーゼ、Ｐｉｓｕｍ属植物由来ジアミンオキシダーゼ（例えば、Ｐｉｓｕｍ　ｓａｔｉｖｕｍ由来ジアミンオキシダーゼ、Ｐｉｎｕｓ　ｓｙｌｖｅｓｔｒｉｓ由来ジアミンオキシダーゼ等）、Ｓｕｓ　ｓｃｒｏｆａ由来ジアミンオキシダーゼ、Ｔｒｉｆｏｌｉｕｍ　ｓｕｂｔｅｒｒａｎｅｕｍ由来ジアミンオキシダーゼ、Ｙａｒｒｏｗｉａ　ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ由来ジアミンオキシダーゼ、Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ属細菌由来ジアミンオキシダーゼ（例えば、Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ　ｓｐ．由来ジアミンオキシダーゼ、Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ　ｇｌｏｂｉｆｏｒｍｉｓ由来ジアミンオキシダーゼ等）、Ｐａｐａｖｅｒ　ｓｏｍｎｉｆｅｒｕｍ由来ジアミンオキシダーゼ、Ａｒａｃｈｉｓ　ｈｙｐｏｇａｅａ由来ジアミンオキシダーゼ、Ｅｕｐｈｏｒｂｉａ　ｃｈａｒａｃｉａｓ由来ジアミンオキシダーゼ、Ｌｅｎｓ　ｃｕｌｉｎａｒｉｓ由来ジアミンオキシダーゼ、Ｖｉｃｉａ　ｆａｂａ由来ジアミンオキシダーゼ、Ｒａｔｔｕｓ　ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ由来ジアミンオキシダーゼ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ属真菌由来ジアミンオキシダーゼ（例えば、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｎｉｇｅｒ由来ジアミンオキシダーゼ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｌｕｃｈｕｅｎｓｉｓ由来ジアミンオキシダーゼ等）である。

　一実施形態のアミンオキシダーゼ活性を有するタンパク質は、アミンオキシダーゼの変異タンパク質または相同タンパク質であって、アミノ基を有する化合物のアミノ基とアルデヒド基を可逆的に変換する活性を有するタンパク質であってよい。このようなタンパク質としては、例えば、上記のアミンオキシダーゼのアミノ酸配列と６０％以上（好ましくは、７０％以上、７５％以上、８０％以上、９０％以上、９３％以上、９５％以上、または９８％以上）の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、アミンオキシダーゼ活性を有するタンパク質であってよい。

　アルデヒド基とアミノ基を可逆的に変換する活性を有することは、例えば以下の方法により確認することができる。まず、後述の方法により、上記活性を確認しようとするタンパク質をコードするＤＮＡを含む組換え体ＤＮＡを作製する。次に、該組換え体ＤＮＡで、大腸菌などの微生物を形質転換して得られる微生物を培養し、該培地に図６のアミノ基を有する化合物（例えば、化合物６、化合物７または化合物８）、図６のアルデヒド基を有する化合物（例えば、化合物２、化合物３、化合物５または化合物７）、またはピルビン酸等のケト酸またはアラニン等のアミノ酸、あるいはＮＡＤ（Ｐ）^＋等の補酵素を添加し、対応するアミノ基がアルデヒド基に変換された化合物、またはアルデヒド基がアミノ基に変換された化合物を生成させる。最後に、ＨＰＬＣなどを用いる一般的な分析方法を用いて菌体内や培養上清中の上記生成化合物を検出することにより、対象タンパク質がアルデヒド基とアミノ基を可逆的に変換する活性を有していることを確認することができる。

　一実施形態の酵素ＢをコードするＤＮＡは、例えば、配列番号１～４および１０３～１０５のいずれか１つで表されるアミノ酸配列と６０％以上（好ましくは、７０％以上、７５％以上、８０％以上、９０％以上、９３％以上、９５％以上、または９８％以上）の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、アミノ基転移酵素活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡである。本明細書において、ＤＮＡは遺伝子であってよく、遺伝子の一部であってもよく、人工合成したＤＮＡ（例えば変異タンパク質をコードするＤＮＡ、またはコドン最適化したＤＮＡ）であってよい。

　本実施形態の酵素ＢをコードするＤＮＡは、例えば、配列番号１～４および１０３～１０５のいずれか１つで表されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする塩基配列であり、その一例として、配列番号５～８および１０８～１１０のいずれか１つで表される塩基配列からなるＤＮＡを挙げられる。

　別の実施形態の酵素ＢをコードするＤＮＡは、例えば、配列番号１～４および１０３～１０５のいずれか１つで表されるアミノ酸配列からなるタンパク質の変異タンパク質または相同タンパク質をコードするＤＮＡである。変異タンパク質または相同タンパク質をコードするＤＮＡは、配列番号５～８および１０８～１１０のいずれか１つで表された塩基配列の任意の位置において、１～５０個の塩基が欠失、置換、挿入または付加されていてもよく、例えば、１～４０個、１～３０個、１～２５個、１～２０個、１～１５個、１～１０個、１～５個、１～４個、１～３個、１～２個、または１個の塩基が欠失、置換、挿入または付加されていてもよい。また、変異タンパク質または相同タンパク質をコードするＤＮＡは、好ましくは、配列番号５～８および１０８～１１０のいずれか１つで表される塩基配列と少なくとも６０％以上、好ましくは７０％以上、７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、または９３％以上、さらに好ましくは９５％以上、最も好ましくは９８％以上の同一性を有する塩基配列からなり、より好ましくは配列番号５～８および１０８～１１０のいずれか１つで表される塩基配列からなる。

　配列番号５～８および１０８～１１０のいずれか１つで表される塩基配列からなるＤＮＡ、または配列が分かっている相同タンパク質をコードするＤＮＡは、ゲノムＤＮＡを鋳型に適切なプライマーを用いてＰＣＲにて増幅してもよい。その際に、プライマーの末端に制限酵素サイトなどの発現ベクターへのクローニングのためのＤＮＡ配列を含ませてもよい。相同タンパク質はまた、検索に基づきプローブまたはプライマーを設計し、当該ＤＮＡを有する微生物を用いた相同タンパク質をコードするＤＮＡを取得することができる。変異タンパク質をコードするＤＮＡは、エラープローンＰＣＲ、ＰＣＲによる部分特異的変異導入法、または市販の部分特異的変異導入キット等によって取得することができる。さらに、一実施形態のＡＴをコードするＤＮＡは、決定されたＤＮＡの塩基配列に基づいて、日本テクノサービス社製ＮＴＳ　ＭシリーズＤＮＡ合成装置等を用いて化学合成することにより、目的とするＤＮＡを調製することもできる。

　ここで、一実施形態のＤＮＡを宿主細胞の発現に最適なコドンとなるように塩基を置換することにより、該ＤＮＡがコードするタンパク質の発現量を向上させることもできる。宿主細胞におけるコドン使用頻度の情報は、公共のデータベースを通じて入手することができる。

　一実施形態の酵素ＢをコードするＤＮＡは、また、例えば、配列番号５～８および１０８～１１０のいずれか１つで表される塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェンドな条件下でハイブリダイズするＤＮＡであってよい。ハイブリダイズするとは、特定の塩基配列を有するＤＮＡまたは該ＤＮＡの一部にＤＮＡがハイブリダイズする工程である。従って、該特定の塩基配列を有するＤＮＡまたは該ＤＮＡの一部にハイブリダイズするＤＮＡの塩基配列は、ノーザンまたはサザンブロット解析のプローブとして有用であるか、またはＰＣＲ解析のオリゴヌクレオチドプライマーとして使用できる長さのＤＮＡであってもよい。

　プローブとして用いるＤＮＡとしては、少なくとも１００塩基以上、好ましくは２００塩基以上、より好ましくは５００塩基以上のＤＮＡを挙げることができ、プライマーとして用いられるＤＮＡとしては、少なくとも１０塩基以上、好ましくは１５塩基以上のＤＮＡを挙げることができる。

　ＤＮＡのハイブリダイゼーション実験の方法はよく知られており、例えばモレキュラー・クローニング第４版（Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ（２０１２））、Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｆｏｒ　Ｇｅｎｅｒａｌ　ａｎｄ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ（ＡＳＭ　Ｐｒｅｓｓ（１９９４））、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ　ｍｅｔｈｏｄｓ　ｍａｎｕａｌ（Ａｃａｄｅｍｉｃ　ｐｒｅｓｓ（１９９７））の他、多数の他の標準的な教科書に従ってハイブリダイゼーションの条件を決定し、実験を行うことができる。

　また、市販のハイブリダイゼーションキットに付属した説明書に従うことによっても、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡを取得することができる。市販のハイブリダイゼーションキットとしては、例えばランダムプライム法によりプローブを作製し、ストリンジェントな条件でハイブリダイゼーションを行うランダムプライムドＤＮＡラベリングキット（ロシュ・ダイアグノスティックス社製）を挙げることができる。

　上記のストリンジェントな条件とは、例えばＤＮＡを固定化したフィルターとプローブＤＮＡとを５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ（７５０ｍＭの塩化ナトリウム、７５ｍＭのクエン酸ナトリウム）、５０ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ７．６）、５×デンハルト溶液、１０％の硫酸デキストラン、および２０μｇ／Ｌの変性させたサケ精子ＤＮＡを含む溶液中にて４２℃で一晩インキュベートした後、例えば約６５℃の０．２×ＳＳＣ溶液中で該フィルターを洗浄する条件を挙げることができる。

　上記した様々な条件は、ハイブリダイゼーション実験のバックグラウンドを抑えるために用いるブロッキング試薬を添加または変更することにより設定することもできる。上記したブロッキング試薬の添加は、条件を適合させるために、ハイブリダイゼーション条件の変更を伴ってもよい。

　上記したストリンジェントな条件下でハイブリダイズ可能なＤＮＡとしては、例えば上記ＢＬＡＳＴやＦＡＳＴＡ等のプログラムを用いて計算した時に、配列番号５～８および１０８～１１０のいずれか１つで表される塩基配列と少なくとも６０％以上、好ましくは７０％以上、７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、または９３％以上、さらに好ましくは９５％以上、最も好ましくは９８％以上の同一性を有する塩基配列からなるＤＮＡを挙げることができる。

　一実施形態の酵素ＢをコードするＤＮＡは、また、上記アミノ基転移酵素活性を有するタンパク質、アミンデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質、またはアミンオキシダーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡであってもよい。

（２）本発明のアルデヒド基をカルボキシ基に変換する活性を有するタンパク質（酵素Ｃ）およびそれをコードするＤＮＡ
　本明細書において、「アルデヒド基をカルボキシ基に変換する活性」とは、アルデヒド基を有する化合物のアルデヒド基をカルボキシ基に変換する酵素反応を触媒する活性を意味する。本明細書において、これらのタンパク質は併せて「酵素Ｃ」という。アルデヒド基をカルボキシ基に変換する活性を有するタンパク質は、「アルデヒド基をカルボキシ基に変換する酵素」ともいう。

　本発明のアルデヒド基をカルボキシ基に変換する活性を有するタンパク質（酵素Ｃ）は、具体的に、図６および図７に示すアルデヒド基を有する化合物である、４－（ヒドロキシメチル）シクロヘキサン－１－カルバルデヒド（化合物２）、１，４－シクロヘキサンジカルバルデヒド（化合物３）、または４－（アミノメチル）シクロヘキサン－１－カルバルデヒド（化合物７）をそれぞれ図６および図７に示すカルボン酸である、４－（ヒドロキシメチル）シクロヘキサン－１－カルボン酸（化合物４）、４－ホルミルシクロヘキサン－１－カルボン酸（化合物５）、または４－（アミノメチル）シクロヘキサン－１－カルボン酸（目的化合物）に変換する反応を触媒する活性を有するタンパク質である。

　アルデヒド基をカルボキシ基に変換する活性を有するタンパク質としては、例えば、アルデヒドデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質、アルデヒドオキシダーゼ活性を有するタンパク質等が挙げられる。

　アルデヒドデヒドロゲナーゼ（Ａｌｄｅｈｙｄｅ　ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅｓ；ＡＬＤＨ）とは、生化学においてＮＡＤ（Ｐ）^＋を補酵素としてアルデヒドからカルボン酸への酸化反応を触媒する酵素群の総称である。本明細書において、アルデヒドデヒドロゲナーゼ活性を有することとは、アルデヒド基を有する化合物のアルデヒド基を酸化させ、カルボキシ基に変換する反応を触媒する活性をいう。本明細書において、アルデヒドデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質とは、アルデヒド基を有する化合物のアルデヒド基を酸化させ、カルボキシ基に変換する反応を触媒する活性を有するタンパク質をいい、「ＡＬＤＨ」と呼ぶ場合がある。

　一実施形態のＡＬＤＨは、例えば、配列番号１９～２２、３５～４６１２７～１３９、および２０７のいずれか１つで表されるアミノ酸配列と５０％以上、または６０％以上（好ましくは、７０％以上、７５％以上、８０％以上、９０％以上、９３％以上、９５％以上、または９８％以上）の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、アルデヒドデヒドロゲナーゼ活性を有する、タンパク質である。

　本実施形態のＡＬＤＨは、配列番号１９～２２、３５～４６、１２７～１３９、および２０７のいずれか１つで表されるアミノ酸配列からなるタンパク質であってもよい。配列番号１９で表されるアミノ酸配列を有するタンパク質はＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　Ｋ１２　ＭＧ１６５５由来ガンマ－アミノブチルアルデヒドデヒドロゲナーゼＰａｔＤであり、配列番号２０で表されるアミノ酸配列を有するタンパク質はＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｐｕｔｉｄａ　ＣＳＶ８６由来ベンズアルデヒドデヒドロゲナーゼＸｙｌＣであり、配列番号２１で表されるアミノ酸配列を有するタンパク質はＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｐｕｔｉｄａ　Ｓ１２由来フェニルアセトアルデヒドデヒドロゲナーゼＳｔｙＤであり、配列番号２２で表されるアミノ酸配列を有するタンパク質はＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｐｕｔｉｄａ　ＮＣＩＭＢ　９８６６由来４－ヒドロキシベンズアルデヒドデヒドロゲナーゼＰｃｈＡである。配列番号３５～４６および１２７～１３９で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質は、表１３および表２０に記載の微生物由来の、配列番号１９、２０または２１で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質（ＰａｔＤ、ＸｙｌＣまたはＳｔｙＤ）のホモログタンパク質（相同タンパク質）である。配列番号２０７で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質は、Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ　ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ由来ベンズアルデヒドデヒドロゲナーゼである。これらのタンパク質は、これまで上述の図６に示すアルデヒド基を有する化合物のアルデヒド基をカルボキシ基に変換する活性を有することは知られていない。

　別の実施形態のＡＬＤＨは、アルデヒドデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質の変異タンパク質または相同タンパク質であってよく、例えば、上記配列番号１９～２２、３５～４６、１２７～１３９、および２０７のいずれか１つで表されるアミノ酸配列からなるタンパク質の変異タンパク質または相同タンパク質であって、配列番号１９～２２、３５～４６、１２７～１３９、および２０７のいずれか１つで表されるアミノ酸配列と５０％以上、または６０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、アルデヒドデヒドロゲナーゼ活性を有する、タンパク質である。変異タンパク質または相同タンパク質のアミノ酸配列は、配列番号１９～２２、３５～４６、１２７～１３９、および２０７のいずれか１つで表されるアミノ酸配列に対し、少なくとも５０％以上、または６０％以上、好ましくは７０％以上、７５％以上、８０％以上または８５％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９３％以上または９５％以上、最も好ましくは９８％以上の同一性を有する。

　アルデヒド基をカルボキシ基に変換する活性を有することは、例えば以下の方法により確認することができる。まず、後述の方法により、上記活性を確認しようとするタンパク質をコードするＤＮＡを含む組換え体ＤＮＡを作製する。次に、該組換え体ＤＮＡで、大腸菌などの微生物を形質転換して得られる微生物を培養し、該培地に化合物２、３または７およびＮＡＤ（Ｐ）^＋またはＦＡＤ等の補酵素を添加し、目的のカルボン酸を生成させる。最後に、ＨＰＬＣなどを用いる一般的な分析方法を用いて菌体内や培養上清中の目的のカルボン酸を検出することにより、対象タンパク質がアルデヒドデヒドロゲナーゼ活性を有していることを確認することができる。

　別のさらなる実施形態のＡＬＤＨは、アルデヒド基を有する化合物のアルデヒド基を酸化させるアルデヒドデヒドロゲナーゼ活性を有し、以下の１）から６）のいずれか１つ以上に分類されるタンパク質であってもよい。
１）配列番号１９で表されるアミノ酸配列と７１％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるタンパク質
２）配列番号２０で表されるアミノ酸配列と６８％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるタンパク質
３）Ｐｓｕｄｏｍｏｎａｓ属由来アルデヒドデヒドロゲナーゼであり、かつ配列番号２０で表されるアミノ酸配列と５０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるタンパク質
４）配列番号２１で表されるアミノ酸配列と６３％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるタンパク質
５）配列番号４０で表されるアミノ酸配列と５６．５％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるタンパク質
６）配列番号４１で表されるアミノ酸配列と６３．９％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるタンパク質

　このようなＡＬＤＨとしては、例えば配列番号１９～２１、３５～４１、４４～４６、１２７～１３１、１３３～１３５、１３８、および１３９のいずれか１つで表されるアミノ酸配列からなるタンパク質が挙げられる。

　さらなる別の実施形態のアルデヒドデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質（ＡＬＤＨ）は、好ましくはＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属細菌由来のアルデヒドデヒドロゲナーゼである。

　Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属細菌としては、例えば、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｐｕｔｉｄａ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｓｐ．、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｓｐ．　ＭＡＰ１２、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｓｙｒｉｎｇａｅ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ａｍｙｇｄａｌｉ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｏｒｙｚｉｈａｂｉｔａｎｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｍａｌｔｏｐｈｉｌｉａ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｔｒｉｖｉａｌｉｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｓａｖａｓｔａｎｏｉ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｓｔｕｔｚｅｒｉ等が挙げられる。

　他の実施形態のＡＬＤＨは、ベンズアルデヒドデヒドロゲナーゼであって、アルデヒド基を有する化合物のアルデヒド基を酸化させるアルデヒドデヒドロゲナーゼ活性を有する、タンパク質であってもよい。

　本実施形態のベンズアルデヒドデヒドロゲナーゼは、アルデヒド基を有する化合物のアルデヒド基を酸化させるアルデヒドデヒドロゲナーゼ活性を有する。ベンズアルデヒドデヒドロゲナーゼは、アルデヒドデヒドロゲナーゼの１種であり、特にベンズアルデヒドから安息香酸への酸化反応を触媒する酵素群の総称である。

　本実施形態のベンズアルデヒドデヒドロゲナーゼは、上記のＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属細菌のほか、ベンズアルデヒドデヒドロゲナーゼを発現する微生物由来のベンズアルデヒドデヒドロゲナーゼであってもよく、ベンズアルデヒドデヒドロゲナーゼを発現する微生物としては、Ｈｙｄｒｏｇｅｎｏｐｈａｇａ　ａｒｏｍａｔｉｃｉｖｏｒａｎｓ、Ａｌｔｅｒｏｍｏｎａｓ、Ｔｅｐｉｄｉｐｈｉｌｕｓ　ｓｕｃｃｉｎａｔｉｍａｎｄｅｎｓ、Ｈａｌｏｍｏｎａｓ　ｃｕｐｉｄａ、Ｇｌａｃｉｉｍｏｎａｓ　ｉｍｍｏｂｉｌｉｓ、Ｐａｒａｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ　ｕｎａｍａｅ、Ｍａｒｉｎｏｂａｃｔｅｒ　ｓａｌｓｕｇｉｎｉｓ、Ａｒｏｍａｔｏｌｅｕｍ　ｔｏｌｕｃｌａｓｔｉｃｕｍ、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ＿ｓｐ．、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ＿ｓｐ．＿Ｄ７、Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ　ｇｕｉｌｌｏｕｉａｅ、Ｐｏｌａｒｏｍｏｎａｓ　ｓｐ．、Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｐ．、Ｃｈｌｏｒｏｆｌｅｘｉ　ｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｈａｌｉｏｘｅｎｏｐｈｉｌｕｓ　ａｒｏｍａｔｉｃｉｖｏｒａｎｓ、Ｎｏｖｏｓｐｈｉｎｇｏｂｉｕｍ　ａｒｏｍａｔｉｃｉｖｏｒａｎｓ、Ｏｃｅａｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ　ｉｈｅｙｅｎｓｉｓ、Ｓｐｈｉｎｇｏｂｉｕｍ　ｃｈｕｎｇｂｕｋｅｎｓｅ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｖｉｏｌａｃｅｏｒｕｂｅｒ、Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ　ａｅｔｈｅｒｉｖｏｒａｎｓ、Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ　ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｃａｌｖｕｓ、Ｐｒａｕｓｅｒｅｌｌａ　ｍｕｒａｌｉｓ、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ　ｃａｌｃｏａｃｅｔｉｃｕｓ、Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ　ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ、Ａｃｉｄｏｖｏｒａｘ　ｓｐ．、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｓｐ．等が挙げられる。

　一実施形態のベンズアルデヒドデヒドロゲナーゼは、配列番号２０、４０、４１、４３、１２７～１３７、１３９、および２０７のいずれか１つで表されるアミノ酸配列からなるタンパク質であってもよい。また、別の実施形態のベンズアルデヒドデヒドロゲナーゼは、上記配列番号２０、４０、４１、４３、１２７～１３７、１３９、および２０７のいずれか１つで表されるアミノ酸配列からなるタンパク質の変異タンパク質または相同タンパク質であって、配列番号２０、４０、４１、４３、１２７～１３７、１３９、および２０７のいずれか１つで表されるアミノ酸配列と５０％以上、または６０％以上（好ましくは６５％以上、７０％以上、７５％以上、８０％以上、９０％以上、９３％以上、９５％以上、または９８％以上）の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、アルデヒドデヒドロゲナーゼ活性を有する、タンパク質であってもよい。

　別のさらなる実施形態のベンズアルデヒドデヒドロゲナーゼは、アルデヒド基を有する化合物のアルデヒド基を酸化するアルデヒドデヒドロゲナーゼ活性を有し、以下の７）から１２）のいずれか１つ以上に分類されるタンパク質であってもよい。
７）配列番号１９で表されるアミノ酸配列と７１％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるタンパク質
８）配列番号２０で表されるアミノ酸配列と６８％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるタンパク質
９）Ｐｓｕｄｏｍｏｎａｓ属由来アルデヒドデヒドロゲナーゼであり、かつ配列番号２０で表されるアミノ酸配列と５０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるタンパク質
１０）配列番号２１で表されるアミノ酸配列と６３％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるタンパク質
１１）配列番号４０で表されるアミノ酸配列と５６．５％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるタンパク質
１２）配列番号４１で表されるアミノ酸配列と６３．９％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるタンパク質
　このようなベンズアルデヒドデヒドロゲナーゼとしては、例えば配列番号２０、４０、４１、１２７～１３１、１３３～１３５、および１３９のいずれか１つで表されるアミノ酸配列からなるタンパク質が挙げられる。

　別のさらなる実施形態のＡＬＤＨは、上記ベンズアルデヒドデヒドロゲナーゼの変異タンパク質または相同タンパク質であってよく、例えば、アルデヒド基を有する化合物のアルデヒド基を酸化するアルデヒドデヒドロゲナーゼ活性を有し、配列番号２０で表されるアミノ酸配列と５０％以上（好ましくは５５％以上、６０％以上、６５％以上、７０％以上、７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９３％以上、９５％以上、または９８％以上）の同一性を有するアミノ酸配列であって、かつ、配列番号２０で表されるアミノ酸配列とアライメントしたとき、下記（１）～（２６）の少なくとも１つのアミノ酸基を含むアミノ酸配列からなる、タンパク質である。
（１）３５位相当位置のアミノ酸残基がグリシン残基（Ｇ）である
（２）６５位相当位置のアミノ酸残基がアラニン残基（Ａ）である
（３）８２位相当位置のアミノ酸残基がロイシン残基（Ｌ）である
（４）１０４位相当位置のアミノ酸残基がグリシン残基（Ｇ）である
（５）１０９位相当位置のアミノ酸残基がグリシン残基（Ｇ）である
（６）１１０位相当位置のアミノ酸残基がイソロイシン残基（Ｉ）である
（７）１１７位相当位置のアミノ酸残基がグルタミン残基（Ｑ）である
（８）１２２位相当位置のアミノ酸残基がアラニン残基（Ａ）である
（９）１２４位相当位置のアミノ酸残基がロイシン残基（Ｌ）である
（１０）１３４位相当位置のアミノ酸残基がバリン残基（Ｖ）である
（１１）１４４位相当位置のアミノ酸残基がバリン残基（Ｖ）である
（１２）１６０位相当位置のアミノ酸残基がフェニルアラニン残基（Ｆ）である
（１３）２７１位相当位置のアミノ酸残基がグリシン残基（Ｇ）である
（１４）２９０位相当位置のアミノ酸残基がアラニン残基（Ａ）である
（１５）３１９位相当位置のアミノ酸残基がアスパラギン酸残基（Ｄ）である
（１６）３３３位相当位置のアミノ酸残基がアスパラギン酸残基（Ｄ）である
（１７）３６５位相当位置のアミノ酸残基がグルタミン残基（Ｑ）である
（１８）３９０位相当位置のアミノ酸残基がイソロイシン残基（Ｉ）である
（１９）４２０位相当位置のアミノ酸残基がアラニン残基（Ａ）である
（２０）４２３位相当位置のアミノ酸残基がロイシン残基（Ｌ）である
（２１）４３４位相当位置のアミノ酸残基がバリン残基（Ｖ）である
（２２）４４０位相当位置のアミノ酸残基がプロリン残基（Ｐ）である
（２３）４４３位相当位置のアミノ酸残基がシステイン残基（Ｃ）である
（２４）４４５位相当位置のアミノ酸残基がプロリン残基（Ｐ）である
（２５）４６６位相当位置のアミノ酸残基がセリン残基（Ｓ）である
（２６）４６７位相当位置のアミノ酸残基がイソロイシン残基（Ｉ）である

　ここで、例えば、「３５位相当位置のアミノ酸残基」とは、対象のタンパク質のアミノ酸配列と配列番号２０で表されるアミノ酸配列とをアライメントした際に、配列番号２０の第３５番目のアミノ酸残基の位置に対応する位置にある、対象タンパク質のアミノ酸配列におけるアミノ酸残基を意味する。

　後述の実施例に示すとおり、上記（１）～（２６）に示すアミノ酸残基は、トランス－４－（アミノメチル）シクロヘキサン－１－カルバルデヒドに対する特異性が特に高いＡＬＤＨで保存されているアミノ酸残基であることが示唆された。そのため、本実施形態のアルデヒドデヒドロゲナーゼのアミノ酸配列が上記（１）～（２６）の少なくとも１つのアミノ酸基を含むことで、トランス－４－（アミノメチル）シクロヘキサン－１－カルバルデヒドに対する特異性を有すると考えられる。すなわち、本実施形態のＡＬＤＨは、トランス選択性（トランス特異性、ともいう）の高いアルデヒドデヒドロゲナーゼ活性を有し得る。ここで、トランス選択性が高いこととは、ＡＬＤＨを用いて４－（アミノメチル）シクロヘキサン－１－カルボン酸を製造する場合、生成される、トラネキサム酸（ＴＸＡ）および／またはシス－ＴＸＡを含む４－（アミノメチル）シクロヘキサン－１－カルボン酸において、後述の数２で示される計算式を用いて算出された４－（アミノメチル）シクロヘキサン－１－カルボン酸のトランス比率が５０％超、特にトランス特異性が高いこととは、上記トランス比率が７０％以上であることを意味する。なお、本出願における「選択性」は「特異性」と同義として扱い、また、「選択的」であることは、「特異的」であることと同義として扱う。

　本実施形態のアルデヒドデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質のアミノ酸配列は、上記（１）～（２６）の少なくとも１つのアミノ酸基を含んでいればよく、例えば、２以上、３以上、４以上、５以上、６以上、７以上、８以上、９以上、１０以上、１１以上、１２以上、１３以上、１４以上、１５以上、１６以上、１７以上、１８以上、１９以上、２０以上、２１以上、２２以上、２３以上、２４以上、２５以上、または２６全てを含んでいてもよい。

　アミノ酸配列のアライメントは、例えば、公知のアライメントプログラムＣｌｕｓｔａｌ　Ｏｍｅｇａを用いて作成することができる。Ｃｌｕｓｔａｌ　Ｏｍｅｇａは、例えば、ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／Ｔｏｏｌｓ／ｍｓａ／ｃｌｕｓｔａｌｏ／より利用することができる。Ｃｌｕｓｔａｌ　Ｏｍｅｇａを用いてアライメントを作成する際のパラメータは、例えばデフォルトの値を用いることができる。

　本実施形態のアルデヒドデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質は、配列番号２０、４０、４１、１２７、１２８、１３０、１３１、および１３３のいずれか１つで表されるアミノ酸配列と５０％以上（好ましくは５５％以上、６０％以上、６５％以上、７０％以上、７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９３％以上、９５％以上、または９８％以上）の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、アルデヒドデヒドロゲナーゼ活性を有する、タンパク質であってもよい。

　アルデヒドオキシダーゼ（Ａｌｄｅｈｙｄｅ　ｏｘｉｄａｓｅｓ）とは、生化学においてＦＡＤを補酵素として、酸素を用いてアルデヒドからカルボン酸への酸化反応を触媒する酵素群の総称である。本明細書において、アルデヒドオキシダーゼ活性を有することとは、アルデヒド基を有する化合物のアルデヒド基を酸化させ、カルボキシ基に変換する反応を触媒する活性をいう。本明細書において、アルデヒドオキシダーゼ活性を有するタンパク質とは、アルデヒド基を有する化合物のアルデヒド基を酸化させ、カルボキシ基に変換する反応を触媒する活性を有するタンパク質をいう。

　一実施形態のアルデヒドオキシダーゼ活性を有するタンパク質は、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ来アルデヒドオキシダーゼ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属細菌由来由来アルデヒドオキシダーゼ（例えば、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｐｕｔｉｄａ由来アルデヒドオキシダーゼ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｓｔｕｔｚｅｒｉ由来アルデヒドオキシダーゼ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｓｐ．　由来アルデヒドオキシダーゼ等）、Ｃａｖｉａ　ｐｏｒｃｅｌｌｕｓ由来アルデヒドオキシダーゼ、Ｏｒｙｃｔｏｌａｇｕｓ　ｃｕｎｉｃｕｌｕｓ由来アルデヒドオキシダーゼ、Ｍｕｓ　ｍｕｓｃｕｌｕｓ由来アルデヒドオキシダーゼ、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ　ｔｈａｌｉａｎａ由来アルデヒドオキシダーゼ、Ｓｏｌａｎｕｍ　ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｕｍ由来アルデヒドオキシダーゼ、Ｒａｔｔｕｓ　ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ由来アルデヒドオキシダーゼ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｍｏｄｅｒａｔｕｓ由来アルデヒドオキシダーゼ、Ｈｏｍｏ　ｓａｐｉｅｎｓ由来アルデヒドオキシダーゼ、Ｃｕｌｅｘ　ｑｕｉｎｑｕｅｆａｓｃｉａｔｕｓ由来アルデヒドオキシダーゼ、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ　ｓｐ．由来アルデヒドオキシダーゼ、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ　ｔｈａｌｉａｎａ由来アルデヒドオキシダーゼ、Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ　ｔｈａｉｌａｎｄｉｃｕｓ由来アルデヒドオキシダーゼである。本実施形態のアルデヒドオキシダーゼ活性を有するタンパク質は、これらのアルデヒドオキシダーゼの変異タンパク質または相同タンパク質であって、アルデヒドオキシダーゼ活性を有するタンパク質であってもよい。また、これらのアルデヒドオキシダーゼのアミノ酸配列と６０％以上（好ましくは、７０％以上、７５％以上、８０％以上、９０％以上、９３％以上、９５％以上、または９８％以上）の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、アルデヒドオキシダーゼ活性を有する、タンパク質であってよい。

　本実施形態の酵素ＣをコードするＤＮＡは、上記アルデヒドデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡである。一実施形態のＡＬＤＨをコードするＤＮＡは、配列番号１９～２２、３５～４６、１２７～１３９、および２０７のいずれか１つで表されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする塩基配列であり、その一例として、配列番号２３～２６、４７～５８、１４０～１５２および２０８のいずれか１つで表される塩基配列からなるＤＮＡを挙げられる。

　別の実施形態の酵素ＣをコードするＤＮＡは、アルデヒドデヒドロゲナーゼをコードするＤＮＡであってもよく、例えば、配列番号１９～２２、３５～４６、１２７～１３９および２０７のいずれか１つで表されるアミノ酸配列からなるタンパク質の変異タンパク質または相同タンパク質をコードするＤＮＡである。変異タンパク質または相同タンパク質をコードするＤＮＡは、配列番号２３～２６、４７～５８、１４０～１５２、および２０８のいずれか１つで表された塩基配列の任意の位置において、１～５０個の塩基が欠失、置換、挿入または付加されていてもよく、例えば、１～４０個、１～３０個、１～２５個、１～２０個、１～１５個、１～１０個、１～５個、１～４個、１～３個、１～２個、または１個の塩基が欠失、置換、挿入または付加されていてもよい。一実施形態のＡＬＤＨをコードするＤＮＡは、好ましくは、配列番号２３～２６、４７～５８、１４０～１５２および２０８のいずれか１つで表される塩基配列と少なくとも５０％以上または６０％以上、好ましくは７０％以上、７５％以上、８０％以上、８５％以上、または９０％以上、さらに好ましくは９３％以上または９５％以上、最も好ましくは９８％以上の同一性を有する塩基配列からなり、より好ましくは配列番号２３～２６、４７～５８、１４０～１５２および２０８のいずれか１つで表される塩基配列からなる。

　一実施形態の酵素ＣをコードするＤＮＡは、アルデヒドデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡであってもよく、例えば、配列番号２３～２６、４７～５８、１４０～１５２および２０８のいずれか１つで表される塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェンドな条件下でハイブリダイズするＤＮＡであってよい。ストリンジェントな条件下でハイブリダイズ可能なＤＮＡとしては、例えばＢＬＡＳＴやＦＡＳＴＡ等のプログラムを用いて計算した時に、配列番号２３～２６、４７～５８、１４０～１５２および２０８のいずれか１つで表される塩基配列と少なくとも５０％以上または６０％以上、好ましくは７０％以上、７５％以上、８０％以上、８５％以上、または９０％以上、さらに好ましくは９３％以上または９５％以上、最も好ましくは９８％以上の同一性を有する塩基配列からなるＤＮＡを挙げることができる。

　本実施形態の酵素ＣをコードするＤＮＡは、例えば、上記アルデヒドオキシダーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡであってもよい。

（３）本発明のヒドロキシ基をアルデヒド基に変換する活性を有するタンパク質（酵素Ａ）およびそれをコードするＤＮＡ
　本明細書において、「ヒドロキシ基をアルデヒド基に変換する活性」とは、ヒドロキシ基を有する化合物のヒドロキシ基を酸化し、当該ヒドロキシ基をアルデヒド基に変換する活性を意味する。本明細書において、これらのタンパク質は併せて「酵素Ａ」という。ヒドロキシ基をアルデヒド基に変換する活性を有するタンパク質は、「ヒドロキシ基をアルデヒド基に変換する酵素」ともいう。

　本発明のヒドロキシ基をアルデヒド基に変換する活性を有するタンパク質は、図６および図７に示すヒドロキシ基を有する化合物である、１，４－シクロヘキサンジメタノール（化合物１）、４－（ヒドロキシメチル）シクロヘキサン－１－カルバルデヒド（化合物２）、［４－（アミノメチル）シクロヘキシル］メタノール（化合物６）、４－（ヒドロキシメチル）シクロヘキサン－１－カルボン酸（化合物４）から、それぞれ図６に示すアルデヒド基を有する化合物である、４－（ヒドロキシメチル）シクロヘキサン－１－カルバルデヒド（化合物２）、１，４－シクロヘキサンジカルバルデヒド（化合物３）、４－（アミノメチル）シクロヘキサン－１－カルバルデヒド（化合物７）、または４－ホルミルシクロヘキサン－１－カルボン酸（化合物５）への反応を触媒する活性を有するタンパク質である。

　本発明のヒドロキシ基をアルデヒド基に変換する活性を有する酵素（酵素Ａ）としては、例えば、オキシダーゼ（酸化酵素）活性を有するタンパク質、デヒドロゲナーゼ（脱水素酵素）活性を有するタンパク質、アルデヒドレダクターゼ活性を有するタンパク質等が挙げられる。

　オキシダーゼ（ｏｘｉｄａｓｅ）とは、分子状酸素を電子受容体として基質を酸化する酵素の総称である。本明細書において、酵素Ａとしてオキシダーゼ活性を有することとは、ヒドロキシ基を有する化合物のヒドロキシ基を酸化させ、アルデヒド基に変換する反応を触媒する活性をいう。本明細書において、酵素Ａとしてのオキシダーゼ活性を有するタンパク質とは、ヒドロキシ基を有する化合物のヒドロキシ基を酸化させ、アルデヒド基に変換する反応を触媒する活性を有するタンパク質をいい、本明細書において「ＯＸ」という場合がある。

　一実施形態のＯＸは、例えば、フラビンアデニンジヌクレオチド（ＦＡＤ）結合オキシダーゼ、フェノールオキシダーゼであってよく、ＦＡＤ結合オキシダーゼであることが好ましい。なお、ＦＡＤ結合オキシダーゼとは、ＦＡＤが酵素の活性部位に結合し、ＦＡＤを補酵素として使用するオキシダーゼの総称であり、フェノールオキシダーゼとは、フェノール類を基質とするオキシダーゼの総称である。

　本明細書において、ＦＡＤ結合オキシダーゼは、上記ヒドロキシ基を有する化合物を基質にして、分子状酸素を電子受容体とし、基質のヒドロキシ基をアルデヒド基に変換する活性を有する酵素を意味する。本明細書において、ＦＡＤ結合オキシダーゼには、例えば、アルコールオキシダーゼ、コリンオキシダーゼ、グルコースオキシダーゼ、コレステロールオキシダーゼ、サルコシンオキシダーゼ、Ｌ－α－グリセロリン酸オキシダーゼ等も含み得る。ＦＡＤ結合オキシダーゼとしては、コリンオキシダーゼが好ましい。フェノールオキシダーゼとしては、例えば、ラッカーゼ等が挙げられる。

　一実施形態の酵素ＡとしてのＯＸは、アルコールオキシダーゼであってもよく、例えば、Ｐｉｃｈｉａ属真菌由来アルコールオキシダーゼ（例えば、Ｐｉｃｈｉａ　ｐａｓｔｏｒｉｓ由来アルコールオキシダーゼ、Ｐｉｃｈｉａ　ｓｐ．由来アルコールオキシダーゼ等）、Ｋｏｍａｇａｔａｅｌｌａ　ｐａｓｔｏｒｉｓ由来アルコールオキシダーゼ、Ｏｇａｔａｅａ属真菌由来アルコールオキシダーゼ（例えば、Ｏｇａｔａｅａ　ａｎｇｕｓｔａ由来アルコールオキシダーゼ、Ｏｇａｔａｅａ　ｔｈｅｒｍｏｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａ由来アルコールオキシダーゼ、Ｏｇａｔａｅａ　ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａ由来アルコールオキシダーゼ等）、Ｐｈａｎｅｒｏｄｏｎｔｉａ　ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ由来アルコールオキシダーゼ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ属真菌由来アルコールオキシダーゼ（例えば、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｔｅｒｒｅｕｓ由来アルコールオキシダーゼ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｏｃｈｒａｃｅｕｓ由来アルコールオキシダーゼ）、Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ　ｓｐ．由来アルコールオキシダーゼ、Ｔｈｅｒｍｏａｓｃｕｓ　ａｕｒａｎｔｉａｃｕｓ由来アルコールオキシダーゼ、Ｇｌｏｅｏｐｈｙｌｌｕｍ　ｔｒａｂｅｕｍ由来アルコールオキシダーゼ、Ｃｏｌｌｅｔｏｔｒｉｃｈｕｍ　ｇｒａｍｉｎｉｃｏｌａ由来アルコールオキシダーゼ、Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ　ｇｌｏｂｉｆｏｒｍｉｓ由来アルコールオキシダーゼ、Ｃｏｍａｍｏｎａｓ　ｓｐ．由来アルコールオキシダーゼ、Ｃｏｒｎｕ　ａｓｐｅｒｓｕｍ由来アルコールオキシダーゼ、Ｃａｎｄｉｄａ属真菌由来アルコールオキシダーゼ（例えば、Ｃａｎｄｉｄａ　ｍｅｔｈａｎｏｓｏｒｂｏｓａ由来アルコールオキシダーゼ、Ｃａｎｄｉｄａ　ｓｐ．由来アルコールオキシダーゼ等）、またはＲｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ　ｔｒｉａｔｏｍａｅ由来アルコールオキシダーゼ等である。

　一実施形態の酵素ＡとしてのＯＸは、コリンオキシダーゼであってもよく、例えば、Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ属細菌由来コリンオキシダーゼ（例えば、Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ　ｃｈｌｏｒｏｐｈｅｎｏｌｉｃｕｓ由来コリンオキシダーゼ、Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ　ｇｌｏｂｉｆｏｒｍｉｓ由来コリンオキシダーゼ等）、Ａｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒ　ｃｈｏｌｉｎｏｐｈａｇｕｍ由来コリンオキシダーゼ、Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ　ｐａｓｃｅｎｓ由来コリンオキシダーゼ、Ｆｕｓａｒｉｕｍ　ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ由来コリンオキシダーゼ、Ｃｙｌｉｎｄｒｏｃａｒｐｏｎ　ｄｉｄｙｍｕｍ由来コリンオキシダーゼ、Ｇｌｕｔａｍｉｃｉｂａｃｔｅｒ　ｎｉｃｏｔｉａｎａｅ由来コリンオキシダーゼ、Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ　ｓｐ．由来コリンオキシダーゼ、Ｒａｔｔｕｓ　ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ由来コリンオキシダーゼ、Ｓｉｎｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ　ｍｅｌｉｌｏｔｉ由来コリンオキシダーゼ、またはＳｏｌａｎｕｍ　ｔｕｂｅｒｏｓｕｍ由来コリンオキシダーゼ等である。一実施形態のＯＸは好ましくはＡｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ属細菌由来コリンオキシダーゼであり、より好ましくはＡｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ　ｃｈｌｏｒｏｐｈｅｎｏｌｉｃｕｓ由来コリンオキシダーゼである。

　一実施形態の酵素ＡとしてのＯＸは、グルコオキシダーゼであってもよく、例えば、Ｆｕｓａｒｉｕｍ属菌由来グルコースオキシダーゼ（例えば、Ｆｕｓａｒｉｕｍ　ｇｒａｍｉｎｅａｒｕｍ由来グルコースオキシダーゼ、Ｆｕｓａｒｉｕｍ　ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ由来グルコースオキシダーゼ等）、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ属真菌由来グルコースオキシダーゼ（例えば、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｎｉｇｅｒ由来グルコースオキシダーゼ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｓｐ．由来グルコースオキシダーゼ等）、Ｃｌａｄｏｓｐｏｒｉｕｍ　ｎｅｏｐｓｙｃｈｒｏｔｏｌｅｒａｎｓ由来グルコースオキシダーゼ、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ属菌由来グルコースオキシダーゼ（例えば、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ　ａｄａｍｅｔｚｉｉ由来グルコースオキシダーゼ、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ　ａｍａｇａｓａｋｉｅｎｓｅ由来グルコースオキシダーゼ、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ　ｊａｎｔｈｉｎｅｌｌｕｍ由来グルコースオキシダーゼ、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ　ｓｐ．由来グルコースオキシダーゼ等）、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ由来グルコースオキシダーゼ、またはＴａｌａｒｏｍｙｃｅｓ属菌由来グルコースオキシダーゼ（例えば、Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ　ｆｕｎｉｃｕｌｏｓｕｓ由来グルコースオキシダーゼ、Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ　ｐｕｒｐｕｒｅｏｇｅｎｕｓ由来グルコースオキシダーゼ等）等である。

　一実施形態の酵素ＡとしてのＯＸは、ラッカーゼであってもよく、例えば、Ｔｒａｍｅｔｅｓ属細菌由来ラッカーゼ（例えば、Ｔｒａｍｅｔｅｓ　ｖｅｒｓｉｃｏｌｏｒ由来ラッカーゼ、Ｔｒａｍｅｔｅｓ　ｖｉｌｌｏｓａ由来ラッカーゼ等）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ属細菌由来ラッカーゼ（例えば、Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｕｂｔｉｌｉｓ由来ラッカーゼ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｐｕｍｉｌｕｓ由来ラッカーゼ等）、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ由来ラッカーゼ、またはＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｐｕｔｉｄａ由来ラッカーゼ等である。

　一実施形態の酵素ＡとしてのＯＸは、例えば、ヒドロキシ基をアルデヒド基に変換する活性を有し、かつ配列番号２０１で表されるアミノ酸配列と６０％以上（好ましくは、７０％以上、７５％以上、８０％以上、９０％以上、９３％以上、９５％以上、または９８％以上）の同一性を有するアミノ酸配列からなるタンパク質である。

　本実施形態の酵素ＡとしてのＯＸは、配列番号２０１で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質であってよい。配列番号２０１で表されるアミノ酸配列を有するタンパク質はＡｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ　ｃｈｌｏｒｏｐｈｅｎｏｌｉｃｕｓ由来コリンオキシダーゼである。

　本明細書において、デヒドロゲナーゼ（ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ）は、、ＮＡＤ（Ｐ）^＋などの補酵素を電子受容体として上記基質を酸化する酵素の総称である。本明細書において、酵素Ａとしてデヒドロゲナーゼ活性を有することとは、ヒドロキシ基を有する化合物を基質にして、ＮＡＤ（Ｐ）^＋などの補酵素を電子受容体として基質を酸化する反応を触媒する活性をいう。本明細書において、酵素Ａとしてデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質とは、デヒドロゲナーゼ活性を有することとは、ヒドロキシ基を有する化合物を基質にして、ＮＡＤ（Ｐ）^＋などの補酵素を電子受容体として上記基質を酸化する反応を触媒する活性を有するタンパク質をいう。

　一実施形態の酵素Ａとしてデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質は、アルコールデヒドロゲナーゼであってもよく、例えば、Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ　ｓｏｌｆａｔａｒｉｃｕｓ由来アルコールデヒドロゲナーゼ、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｓｐ．由来アルコールデヒドロゲナーゼ、Ｈｏｒｓｅ肝臓由来アルコールデヒドロゲナーゼ、またはＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｐｕｔｉｄａ由来アルコールデヒドロゲナーゼ等である。

　本明細書において、アルデヒドレダクターゼ（aldehyde reductase）とは、生化学において、ＮＡＤ（Ｐ）^＋などの補酵素を電子受容体として、ヒドロキシ基を有する基質のヒドロキシ基をアルデヒド基に酸化する酵素を意味する。本明細書において、アルデヒドレダクターゼ活性を有することとは、ＮＡＤ（Ｐ）^＋などの補酵素を電子受容体として、ヒドロキシ基を有する基質のヒドロキシ基をアルデヒド基に酸化する反応を触媒する活性をいう。本明細書において、アルデヒドレダクターゼ活性を有するタンパク質とは、ＮＡＤ（Ｐ）^＋などの補酵素を電子受容体として、ヒドロキシ基を有する基質のヒドロキシ基をアルデヒド基に酸化する反応を触媒する活性を有するタンパク質をいう。

　一実施形態のアルデヒドレダクターゼ活性を有するタンパク質は、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ由来アルデヒドレダクターゼ、Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ　ｒｕｂｅｒ由来アルデヒドレダクターゼ、Ｍａｇｎｕｓｉｏｍｙｃｅｓ　ｃａｐｉｔａｔｕｓアルデヒドレダクターゼ、Ｓａｃｃｈａｒｏｌｏｂｕｓ　ｓｏｌｆａｔａｒｉｃｕｓ由来アルデヒドレダクターゼ、Ｔｈｅｒｍｕｓ　ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ由来アルデヒドレダクターゼ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ由来アルデヒドレダクターゼ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ由来アルデヒドレダクターゼ、Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ属細菌由来アルデヒドレダクターゼ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｐｕｔｉｄａ由来アルデヒドレダクターゼ等である。

　ヒドロキシ基をアルデヒド基に変換する活性を有することは、例えば以下の方法により確認することができる。まず、後述の方法により、上記活性を確認しようとするタンパク質をコードするＤＮＡを含む組換え体ＤＮＡを作製する。次に、該組換え体ＤＮＡで、大腸菌などの微生物を形質転換して得られる微生物を培養し、該培地に化合物１、化合物２、化合物６、または化合物４を添加し目的のアルデヒドを生成させる。最後に、ＨＰＬＣなどを用いる一般的な分析方法を用いて菌体内や培養上清中の目的のアルデヒドを検出することにより、対象タンパク質がヒドロキシ基をアルデヒド基に変換する活性を有していることを確認することができる。

　一実施形態の酵素ＡをコードするＤＮＡは、コリンオキシダーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡであってもよく、例えば、配列番号２０１で表されるアミノ酸配列と６０％以上（好ましくは、７０％以上、７５％以上、８０％以上、９０％以上、９３％以上、９５％以上、または９８％以上）の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、コリンオキシダーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡである。本明細書において、ＤＮＡは遺伝子であってよく、遺伝子の一部であってもよい。

　本実施形態の酵素ＡをコードするＤＮＡは、コリンオキシダーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡであってもよく、例えば、配列番号２０１で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする塩基配列であり、その一例として、配列番号２０２で表される塩基配列からなるＤＮＡを挙げられる。

　別の実施形態の酵素ＡをコードするＤＮＡは、コリンオキシダーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡであってもよく、例えば、配列番号２０１で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質の変異タンパク質または相同タンパク質をコードするＤＮＡである。変異タンパク質または相同タンパク質をコードするＤＮＡは、配列番号２０２で表された塩基配列の任意の位置において、１～５０個の塩基が欠失、置換、挿入または付加されていてもよく、例えば、１～４０個、１～３０個、１～２５個、１～２０個、１～１５個、１～１０個、１～５個、１～４個、１～３個、１～２個、または１個の塩基が欠失、置換、挿入または付加されていてもよい。また、変異タンパク質または相同タンパク質をコードするＤＮＡは、好ましくは、配列番号２０２で表される塩基配列と少なくとも６０％以上、好ましくは７０％以上、７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、または９３％以上、さらに好ましくは９５％以上、最も好ましくは９８％以上の同一性を有する塩基配列からなり、より好ましくは配列番号２０２で表される塩基配列からなる。

　配列番号２０２で表される塩基配列からなるＤＮＡ、または配列が分かっている相同タンパク質をコードするＤＮＡは、ゲノムＤＮＡを鋳型に適切なプライマーを用いてＰＣＲにて増幅してもよい。その際に、プライマーの末端に制限酵素サイトなどの発現ベクターへのクローニングのためのＤＮＡ配列を含ませてもよい。相同タンパク質はまた、検索に基づきプローブまたはプライマーを設計し、当該ＤＮＡを有する微生物を用いた相同タンパク質をコードするＤＮＡを取得することができる。変異タンパク質をコードするＤＮＡは、エラープローンＰＣＲ、ＰＣＲによる部分特異的変異導入法、または市販の部分特異的変異導入キット等によって取得することができる。さらに、一実施形態のＡＴをコードするＤＮＡは、決定されたＤＮＡの塩基配列に基づいて、日本テクノサービス社製ＮＴＳ　ＭシリーズＤＮＡ合成装置等を用いて化学合成することにより、目的とするＤＮＡを調製することもできる。

　一実施形態の酵素ＡをコードするＤＮＡは、また、コリンオキシダーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡであってもよく、例えば、配列番号２０２で表される塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェンドな条件下でハイブリダイズするＤＮＡであってよい。ストリンジェントな条件下でハイブリダイズ可能なＤＮＡとしては、例えばＢＬＡＳＴやＦＡＳＴＡ等のプログラムを用いて計算した時に、配列番号２０２で表される塩基配列と少なくとも５０％以上または６０％以上、好ましくは７０％以上、７５％以上、８０％以上、８５％以上、または９０％以上、さらに好ましくは９３％以上または９５％以上、最も好ましくは９８％以上の同一性を有する塩基配列からなるＤＮＡを挙げることができる。

　一実施形態の酵素ＡをコードするＤＮＡは、例えば、酵素Ａとしてのオキシダーゼ活性を有するタンパク質、デヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質およびアルデヒドレダクターゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡであってもよい。

３．本発明の組換え体ＤＮＡ
　本発明の組換え体ＤＮＡは、本発明のヒドロキシ基を有する化合物のヒドロキシ基をアルデヒド基に変換する活性を有するタンパク質（酵素Ａ）をコードするＤＮＡ、本発明のアルデヒド基とアミノ基を可逆的に変換する活性を有するタンパク質（酵素Ｂ）をコードするＤＮＡ、および／または、本発明のアルデヒド基をカルボキシ基に変換する活性を有するタンパク質（酵素Ｃ）をコードするＤＮＡを含み、これらの酵素のうち、同じ酵素活性を有する１種の酵素をコードするＤＮＡを含んでもよく、異なる酵素活性を有する複数種の酵素をコードするＤＮＡを含んでもよい。複数種の酵素をコードするＤＮＡを含む場合は、酵素Ａと酵素Ｂ、酵素Ａと酵素Ｃ、酵素Ｂと酵素Ｃ、酵素Ａと酵素Ｂと酵素Ｃ等の組み合わせをコードするＤＮＡを含んでもよい。ここで、同じ酵素活性を有する酵素（例えば、酵素Ａ）としては、複数の異なる酵素を含んでもよい。

　本発明の組換え体ＤＮＡはまた、後述するアラニンデヒドロゲナーゼまたはグルタミン酸デヒドロゲナーゼをコードするＤＮＡ、および／または、ＮＡＤＨオキシダーゼをコードするＤＮＡをさらに含んでもよい。本発明の組換え体ＤＮＡは、一つの組換え体ＤＮＡに１種類のみの酵素をコードするＤＮＡを含んでもよく、複数種類の酵素をコードするＤＮＡを含んでもよい。複数種類の場合は、それぞれの酵素は一つのプロモーターによって制御されていてもよく、別々のプロモーターによって制御されていてもよい。

　本発明の組換え体ＤＮＡは、宿主細胞において自律複製可能なベクターおよび／または宿主細胞の染色体への組込が可能なベクターであって、上記ＤＮＡを転写できるベクターである。

　細菌等の原核生物を宿主細胞として用いる場合は、本発明の組換え体ＤＮＡは、上記各種酵素をコードするＤＮＡのほかに、プロモーター、リボソーム結合配列、および転写終結配列をさらに含むことが好ましく、さらに、プロモーターを制御する遺伝子が含まれていてもよい。ここで、リボソーム結合配列であるシャイン－ダルガノ（Ｓｈｉｎｅ－Ｄａｌｇａｒｎｏ）配列と開始コドンの間は、適当な距離、例えば６～１８塩基に調節することが好ましい。本発明の組換え体ＤＮＡにおいては、上記各種酵素をコードするＤＮＡの発現には転写終結配列は必ずしも必要ではないが、構造遺伝子の直下に転写終結配列を配置することが好ましい。

　ベクターとしては、目的のＤＮＡを宿主に導入し、増殖、発現させるための適当なＤＮＡ分子であれば特に限定されず、プラスミドのみならず、例えば、人工染色体、トランスポゾンを用いたベクター、コスミドを用いてもよい。

　本発明の組換え体ＤＮＡを導入する宿主細胞としてエシェリヒア属に属する微生物を用いる場合、ベクターとしては、例えば、ｐＣｏｌｄＩ、ｐＳＴＶ２８、ｐＳＴＶ２９、ｐＵＣ１１８（いずれもタカラバイオ社製）、ｐＭＷ１１８、ｐＭＷ１１９、ｐＭＷ２１８（いずれもニッポンジーン社製）、ｐＥＴ２１ａ、ｐＥＴ２８ａ、ｐＣＤＦ－１ｂ、ｐＲＳＦ－１ｂ（いずれもメルクミリポア社製）、ｐＭＡＬ－ｃ５ｘ（ニューイングランドバイオラブス社製）、ｐＧＥＸ－４Ｔ－１、ｐＴｒｃ９９Ａ（いずれもＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製）、ｐＴｒｃＨｉｓ、ｐＳＥ２８０（いずれもサーモフィッシャー・サイエンティフィック社製）、ｐＧＥＭＥＸ－１（プロメガ社製）、ｐＱＥ－３０、ｐＱＥ－６０、ｐＱＥ８０Ｌ（いずれもキアゲン社製）、ｐＥＴ－３、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ　ＳＫ（＋）、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ　ＫＳ（－）（いずれもアジレント・テクノロジー社製）、ｐＫＹＰ１０（特開昭５８－１１０６００号公報）、ｐＫＹＰ２００［Ａｇｒｉｃ．　Ｂｉｏｌ．　Ｃｈｅｍ．，　４８，　６６９　（１９８４）］、ｐＬＳＡ１［Ａｇｒｉｃ．　Ｂｉｏｌ．　Ｃｈｅｍ．，　５３，　２７７　（１９８９）］、ｐＧＥＬ１［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．，　ＵＳＡ，　８２，　４３０６　（１９８５）］、ｐＴｒＳ３０　［Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＪＭ１０９／ｐＴｒＳ３０（ＦＥＲＭ　ＢＰ－５４０７）より調製］、ｐＴｒＳ３２　［Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＪＭ１０９／ｐＴｒＳ３２（ＦＥＲＭ　ＢＰ－５４０８）より調製］、ｐＴＫ３１［ＡＰＰＬＩＥＤ　ＡＮＤ　ＥＮＶＩＲＯＮＭＥＮＴＡＬ　ＭＩＣＲＯＢＩＯＬＯＧＹ，２００７，　Ｖｏｌ．７３，　Ｎｏ．２０，　ｐ６３７８－６３８５］、ｐＰＥ１６７（Ａｐｐｌ．　Ｅｎｖｉｒｏｎ．　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．　２００７，　７３：６３７８－６３８５）、ｐＰＡＣ３１（ＷＯ９８／１２３４３）、ｐＵＣ１９［Ｇｅｎｅ，３３，　１０３（１９８５）］、ｐＰＡ１（特開昭６３－２３３７９８号公報）等を挙げることができる。

　上記のベクターを用いる場合のプロモーターとしては、エシェリヒア属に属する微生物の細胞中で機能するものであればいかなるものでもよいが、例えば、ｔｒｐプロモーター、ｇａｐＡプロモーター、ｌａｃプロモーター、ＰＬプロモーター、ＰＲプロモーター、ＰＳＥプロモーター等の、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉやファージ等に由来するプロモーターを用いることができる。また、ｔｒｐプロモーターを２つ直列させたプロモーター、ｔａｃプロモーター、ｔｒｃプロモーター、ｌａｃＴ５プロモーター、ｌａｃＴ７プロモーター、ｌｅｔ　Ｉプロモーターのように人為的に設計改変されたプロモーターも用いることもできる。

　本発明の組換え体ＤＮＡを導入する宿主細胞としてコリネ型細菌を用いる場合、ベクターとしては、例えば、ｐＣＧ１（特開昭５７－１３４５００号公報）、ｐＣＧ２（特開昭５８－３５１９７号公報）、ｐＣＧ４（特開昭５７－１８３７９９号公報）、ｐＣＧ１１（特開昭５７－１３４５００号公報）、ｐＣＧ１１６、ｐＣＥ５４、ｐＣＢ１０１（いずれも特開昭５８－１０５９９９号公報）、ｐＣＥ５１、ｐＣＥ５２、ｐＣＥ５３［いずれもＭｏｌｅｃｕｌａｒ　ａｎｄ　Ｇｅｎｅｒａｌ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，１９６，１７５（１９８４）］等を挙げることができる。

　上記のベクターを用いる場合のプロモーターとしては、コリネ型細菌の細胞中で機能するものであればいかなるものでもよいが、例えば、Ｐ５４－６プロモーター［Ａｐｐｌ．　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，　５３，　ｐ６７４－６７９（２０００）］を用いることができる。

　本発明の組換え体ＤＮＡを導入する宿主細胞として酵母菌株を用いる場合、ベクターとしては、例えば、ＹＥｐ１３（ＡＴＣＣ３７１１５）、ＹＥｐ２４（ＡＴＣＣ３７０５１）、ＹＣｐ５０（ＡＴＣＣ３７４１９）、ｐＨＳ１９、ｐＨＳ１５などを挙げることができる。

　上記のベクターを用いる場合のプロモーターとしては、酵母菌株の細胞中で機能するものであればいかなるものでもよいが、例えば、ＰＨＯ５プロモーター、ＰＧＫプロモーター、ＧＡＰプロモーター、ＡＤＨプロモーター、ｇａｌ１プロモーター、ｇａｌ１０プロモーター、ヒートショックポリペプチドプロモーター、ＭＦα１プロモーター、ＣＵＰ１プロモーター等のプロモーターを挙げることができる。

　本発明の組換え体ＤＮＡは、例えば、Ｉｎ－Ｆｕｓｉｏｎ（商標）ＨＤ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　Ｋｉｔ（タカラバイオ社）を用いる、または、所望の酵素をコードするＤＮＡ断片を制限酵素処理する等して、上記の適当な発現ベクターのプロモーターの下流に挿入することによって作製することができる。

４．本発明の組換え細胞
　本発明の組換え細胞は、本発明のＤＮＡを含むか、または、本発明の組換え体ＤＮＡで宿主細胞を形質転換して得られる組換え細胞である。また、後述するアラニンデヒドロゲナーゼまたはグルタミン酸デヒドロゲナーゼをコードするＤＮＡ、および／または、ＮＡＤＨオキシダーゼをコードするＤＮＡをさらに含んでもよい。組換え細胞において、本発明のＤＮＡまたは組換え体ＤＮＡはゲノムに組み込まれていてもよく、自律複製可能なプラスミドとして存在していてもよいが、本発明のＤＮＡが転写可能な状態で含まれている。１つの宿主細胞を１種類のみのＤＮＡを含んでいてもよく、２種類以上のＤＮＡを含んでよい。

　宿主細胞は、原核生物、酵母、動物細胞、昆虫細胞、植物細胞等のいずれであってもよいが、好ましくは、原核生物または酵母菌株を、より好ましくは、エシェリヒア属、セラチア属、バチルス属、ブレビバクテリウム属、コリネバクテリウム属、ミクロバクテリウム属、若しくはシュードモナス属等に属する原核生物、またはサッカロマイセス属、シゾサッカロマイセス属、クルイベロミセス属、トリコスポロン属、シワニオミセス属、ピチア属、若しくはキャンディダ属等に属する酵母菌株を、最も好ましくは、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＢＬ２１　ｃｏｄｏｎ　ｐｌｕｓ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＸＬ１－Ｂｌｕｅ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＸＬ２－Ｂｌｕｅ（いずれもアジレント・テクノロジー社製）、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＢＬ２１（ＤＥ３）（ノバジェン社製）、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ（メルクミリポア社製）、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＤＨ５α、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＨＳＴ０８Ｐｒｅｍｉｕｍ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＨＳＴ０２、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＨＳＴ０４　ｄａｍ－／ｄｃｍ―、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＪＭ１０９、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＨＢ１０１、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉＣＪ２３６、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＢＭＨ７１－１８　ｍｕｔＳ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＭＶ１１８４、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＴＨ２（いずれもタカラバイオ社製）、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　Ｗ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＪＭ１０１、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　Ｗ３１１０、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＭＧ１６５５、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＤＨ１、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＭＣ１０００、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　Ｗ１４８５、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＭＰ３４７、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＮＭ５２２、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＡＴＣＣ９６３７、Ｓｅｒｒａｔｉａ　ｆｉｃａｒｉａ、Ｓｅｒｒａｔｉａ　ｆｏｎｔｉｃｏｌａ、Ｓｅｒｒａｔｉａ　ｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ、Ｓｅｒｒａｔｉａ　ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｉｍｍａｒｉｏｐｈｉｌｕｍ　ＡＴＣＣ１４０６８、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃｕｍ　ＡＴＣＣ１４０６６、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ａｍｍｏｎｉａｇｅｎｅｓ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ　ＡＴＣＣ１３０３２、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ　ＡＴＣＣ１４０６７、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ　ＡＴＣＣ１３８６９、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ａｃｅｔｏａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｍ　ＡＴＣＣ１３８７０、Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ａｍｍｏｎｉａｐｈｉｌｕｍ　ＡＴＣＣ１５３５４、若しくはＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｓｐ．Ｄ－０１１０等の原核生物、またはＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｐｏｍｂｅ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ　ｌａｃｔｉｓ、Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ　ｐｕｌｌｕｌａｎｓ、Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ　ａｌｌｕｖｉｕｓ、Ｐｉｃｈｉａ　ｐａｓｔｏｒｉｓ、若しくはＣａｎｄｉｄａ　ｕｔｉｌｉｓ等の酵母菌株を挙げることができる。

　本発明の組換え体ＤＮＡを宿主細胞において自律複製可能なプラスミドとして導入する方法としては、例えば、カルシウムイオンを用いる方法［Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．，　ＵＳＡ，　６９，　２１１０　（１９７２）］、プロトプラスト法（日本国特開昭６３－２４８３９４号公報）、エレクトロポレーション法［Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．，　１６，　６１２７　（１９８８）］、並びに、スフェロプラスト法［Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．，　ＵＳＡ，　８１，４８８９（１９８４）］、酢酸リチウム法［Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，　１５３，　１６３（１９８３）］等の方法を挙げることができる。

　本発明の組換え体ＤＮＡを宿主細胞の染色体中に導入する方法としては、例えば、相同組換え法を挙げることができる。相同組換え法としては、例えば、導入したい宿主細胞内では自律複製できない薬剤耐性遺伝子を有するプラスミドＤＮＡと連結して作製できる相同組換え用プラスミドを用いる方法を挙げることができる。Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉで頻用される相同組換えを利用した方法としては、例えば、ラムダファージの相同組換え系を利用して、組換え体ＤＮＡを導入する方法［Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　ＵＳＡ，　９７，　６６４１－６６４５（２０００）］を挙げることができる。

　さらに、組換え体ＤＮＡと共に染色体上に組み込まれた枯草菌レバンシュークラーゼによって大腸菌がスクロース感受性となることを利用した選択法や、ストレプトマイシン耐性の変異ｒｐｓＬ遺伝子を有する大腸菌に野生型ｒｐｓＬ遺伝子を組み込むことによって大腸菌がストレプトマイシン感受性となることを利用した選択法［Ｍｏｌ．　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，　５５，　１３７（２００５）、Ｂｉｏｓｃｉ．　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．　Ｂｉｏｃｈｅｍ．，　７１，　２９０５（２００７）］等を用いて、宿主細胞の染色体ＤＮＡ上の目的の領域が本発明のＤＮＡまたは組換え体ＤＮＡに置換された大腸菌を取得することができる。

５．本発明の製造方法
　本発明の製造方法は、下記一般式（１）で表される化合物を基質化合物または中間体化合物として、ヒドロキシ基をアルデヒド基に変換する活性を有するタンパク質、アルデヒド基をカルボキシ基に変換する活性を有するタンパク質、およびアルデヒド基とアミノ基を可逆的に変換する活性を有するタンパク質から選択される少なくとも一つの酵素の存在下で、シス体および／またはトランス体の４－（アミノメチル）シクロヘキサン－１－カルボン酸を製造する方法である。

　本発明の製造方法における、ヒドロキシ基をアルデヒド基に変換する活性を有するタンパク質、アルデヒド基をカルボキシ基に変換する活性を有するタンパク質、およびアルデヒド基とアミノ基を可逆的に変換する活性を有するタンパク質は、それぞれ酵素Ａ、酵素Ｃおよび酵素Ｂであり、本発明の製造方法において、これらの酵素の１種（酵素Ａのみ、酵素Ｂのみ、または酵素Ｃのみ）の存在下であっても、２種（酵素Ａ＋酵素Ｂ、酵素Ａ＋酵素Ｃ、または、酵素Ｂ＋酵素Ｃ）または３種全部（酵素Ａ＋酵素Ｂ＋酵素Ｃ）の存在下で製造してもよい。本発明の製造方法において、基質化合物または中間体化合物として、化合物１～８を用い得る。その場合、各酵素反応（合成経路）および各酵素反応に使用される酵素は、図６および図７に示す。ここで、本発明の製造方法における、各化合物、酵素、酵素反応は上記「１．化合物および酵素反応」、および「２．本発明のタンパク質およびＤＮＡ」で記載のとおりである。

　化合物１～８の少なくとも１つを中間体化合物とする場合、酵素Ａ、酵素Ｂおよび酵素Ｃの少なくとも１種に加え、化合物１～８の生成に必要な任意の酵素および任意の基質化合物の存在下で、化合物１～８の少なくとも１つを生成させてもよい。

　一実施形態の製造方法は、ヒドロキシ基をアルデヒド基に変換する活性を有するタンパク質（酵素Ａ）、アルデヒド基をカルボキシ基に変換する活性を有するタンパク質（酵素Ｃ）、およびアルデヒド基とアミノ基を可逆的に変換する活性を有するタンパク質（酵素Ｂ）の存在下で行われる。例えば、Ｒ_１とＲ_２の一方がＣＨ_２ＯＨであり、他方がＣＨ_２ＯＨ、ＣＨＯ、またはＣＨ_２ＮＨ_２である、一般式（１）で表される化合物（化合物１、２または６）を基質化合物または中間体化合物とする場合、ヒドロキシ基をアルデヒド基に変換する活性を有するタンパク質（酵素Ａ）、アルデヒド基をカルボキシ基に変換する活性を有するタンパク質（酵素Ｃ）、およびアルデヒド基とアミノ基を可逆的に変換する活性を有するタンパク質（酵素Ｂ）の存在下で行うことが好ましい。

　また、Ｒ_１とＲ_２の一方がＣＨ_２ＮＨ_２であり、他方がＣＨＯである、一般式（１）で表される化合物（化合物７）を基質化合物または中間体化合物とする場合、アルデヒド基をカルボキシ基に変換する活性を有するタンパク質（酵素Ｃ）の存在下で行うことが好ましい。

　この場合、上記一般式（１）において、Ｒ_１とＲ_２の一方がＣＨ_２ＮＨ_２であり、他方がＣＨＯである、化合物（すなわち化合物７）が下記（ｉ）および（ｉｉ）のいずれか一つの基質化合物または中間体化合物から生じた化合物であることがより好ましい。
（ｉ）Ｒ_１とＲ_２が共にＣＨＯである化合物（すなわち化合物３）
（ｉｉ）Ｒ_１とＲ_２の一方がＣＨ_２ＮＨ_２であり、他方がＣＨ_２ＯＨである化合物（すなわち化合物６）

　Ｒ_１とＲ_２の一方がＣＨＯであり、他方がＣＯＯＨである、一般式（１）で表される化合物（化合物５）を基質化合物または中間体化合物とする場合、アルデヒド基とアミノ基を可逆的に変換する活性を有するタンパク質（酵素Ｂ）の存在下で行うことが好ましい。

　この場合、上記一般式（１）において、Ｒ_１とＲ_２の一方がＣＯＯＨであり、他方がＣＨＯで表される化合物（すなわち化合物５）が下記（ｉ）および（ｉｉ）のいずれか一つの基質化合物または中間体化合物から生じた化合物であることがより好ましい。
（ｉ）Ｒ_１とＲ_２が共にＣＨＯである化合物（すなわち化合物３）
（ｉｉ）Ｒ_１とＲ_２の一方がＣＯＯＨであり、他方がＣＨ_２ＯＨである化合物（すなわち化合物４）

　Ｒ_１とＲ_２の一方がＣＨＯであり、他方がＣＨ_２ＮＨ_２、もしくはＣＨＯである、またはＲ_１とＲ_２が共にＣＨ_２ＮＨ_２である、一般式（１）で表される化合物（化合物７、３または８）を基質化合物または中間体化合物とする場合、アルデヒド基をカルボキシ基に変換する活性を有するタンパク質（酵素Ｃ）、およびアルデヒド基とアミノ基を可逆的に変換する活性を有するタンパク質（酵素Ｂ）の存在下で行うことが好ましい。

　Ｒ_１とＲ_２の一方がＣＨ_２ＯＨであり、他方がＣＨ_２ＮＨ_２である、一般式（１）で表される化合物（化合物６）を基質化合物または中間体化合物とする場合、ヒドロキシ基をアルデヒド基に変換する活性を有するタンパク質（酵素Ａ）、およびアルデヒド基をカルボキシ基に変換する活性を有するタンパク質（酵素Ｃ）の存在下で行うことが好ましい。

　Ｒ_１とＲ_２の一方がＣＨ_２ＯＨであり、他方がＣＯＯＨである、一般式（１）で表される化合物（化合物４）を基質化合物または中間体化合物とする場合、ヒドロキシ基をアルデヒド基に変換する活性を有するタンパク質（酵素Ａ）、およびアルデヒド基とアミノ基を可逆的に変換する活性を有するタンパク質（酵素Ｂ）の存在下で行うことが好ましい。

　ヒドロキシ基をアルデヒド基に変換する活性を有するタンパク質（酵素Ａ）が、コリンオキシダーゼであることが好ましく、コリンオキシダーゼが、配列番号２０１で示されるアミノ酸配列と６０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるタンパク質であることが好ましい。アルデヒド基をカルボキシ基に変換する活性を有するタンパク質（酵素Ｃ）が、アルデヒドデヒドロゲナーゼであることが好ましく、アルデヒドデヒドロゲナーゼが、配列番号１９～２２、３５～４６および１２７～１３９のいずれか１つで表されるアミノ酸配列と５０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるタンパク質であることが好ましい。アルデヒド基とアミノ基を可逆的に変換する活性を有するタンパク質（酵素Ｂ）が、アミノ基転移酵素であるあることが好ましく、アミノ基転移酵素が、配列番号１～４および１０３～１０５のいずれか１つで表されるアミノ酸配列と６０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるタンパク質であることが好ましい。

　基質化合物として、化合物１または化合物８が好ましく用いられ、化合物１がより好ましく用いられる。

　酵素Ａ、酵素Ｂ、および／または酵素Ｃの存在下とは、反応系において、反応を触媒できるように、活性のある酵素Ａ、酵素Ｂ、および／または酵素Ｃが存在していることを意味する。例えば、本発明の酵素Ａ、酵素Ｂ、および／または酵素Ｃを反応系に添加するか、あるいは、本発明の酵素Ａ、酵素Ｂ、および／または酵素ＣをコードするＤＮＡを含み、当該酵素を発現できる細胞、または本発明の酵素Ａ、酵素Ｂ、および／または酵素ＣをコードするＤＮＡを含む組換え体ＤＮＡで宿主細胞を形質転換して得られる組換え細胞であって当該酵素を発現できる細胞を作用させる工程を含む。ここで、細胞を作用させることとは、細胞を培養する系に、基質物質を添加し、細胞が発現するタンパク質と作用させることである。

　一実施形態の製造方法は、１，４－ビス（アミノメチル）シクロヘキサン（化合物８）を基質化合物とする製造方法であって、
（ｉ）アルデヒド基とアミノ基を可逆的に変換する活性を有するタンパク質（酵素Ｂ）の存在下、１，４－ビス（アミノメチル）シクロヘキサン（化合物８）から４－（アミノメチル）シクロヘキサン－１－カルバルデヒド（化合物７）を製造する工程と、
（ｉｉ）アルデヒド基をカルボキシ基に変換する活性を有するタンパク質（酵素Ｃ）の存在下、４－（アミノメチル）シクロヘキサン－１－カルバルデヒド（化合物７）から４－（アミノメチル）シクロヘキサン－１－カルボン酸（目的化合物）を製造する工程と
を含む。

　別の実施形態の製造方法は、１，４－シクロヘキサンジメタノール（化合物１）を基質化合物とする製造方法であって、
（ｉｉｉ）ヒドロキシ基をアルデヒド基に変換する活性を有するタンパク質（酵素Ａ）の存在下において、１，４－シクロヘキサンジメタノール（化合物１）のヒドロキシ基をアルデヒド基に変換し、４－（ヒドロキシメチル）シクロヘキサン－１－カルバルデヒド（化合物２）を製造する工程（工程（ｉｉｉ））を含む。

　４－（ヒドロキシメチル）シクロヘキサン－１－カルバルデヒド（化合物２）を基質化合物または中間体化合物として、目的化合物の４－（アミノメチル）シクロヘキサン－１－カルボン酸を製造する方法は、図６および図７に示すように、複数の経路を経由する可能性があり、所望の反応経路に応じて、基質化合物または中間体化合物、および酵素を選択すればよい。それぞれの酵素を用いて変換できる化合物は、以下のとおりである。
酵素Ａ：化合物１から化合物２、化合物２から化合物３、化合物４から化合物５、化合物６から化合物７（工程（ｉｉｉ）と同様に行うことができる）
酵素Ｂ：化合物８から化合物７、化合物７から化合物３（可逆的）、化合物５から目的化合物（可逆的）、化合物２から化合物６（可逆的）（工程（ｉ）と同様に行うことができる）
酵素Ｃ：化合物２から化合物４、化合物３から化合物５、化合物７から目的化合物（工程（ｉｉ）と同様に行うことができる）

　別の実施形態の製造方法は、下記一般式（１）で表される化合物を基質化合物として、ヒドロキシ基をアルデヒド基に変換する活性を有するタンパク質、アルデヒド基をカルボキシ基に変換する活性を有するタンパク質、およびアルデヒド基とアミノ基を可逆的に変換する活性を有するタンパク質から選択される少なくとも一つの酵素の存在下で、シス体および／またはトランス体の４－（アミノメチル）シクロヘキサン－１－カルボン酸を製造する方法である。

［式中、Ｒ_１およびＲ_２は、それぞれ独立してＣＨ_２ＯＨ、ＣＨＯ、ＣＯＯＨ、またはＣＨ_２ＮＨ_２である（但し、Ｒ_１とＲ_２の一方がＣＯＯＨであり、他方がＣＨ_２ＮＨ_２である場合、Ｒ_１とＲ_２が共にＣＯＯＨである場合、および一般式（１）で表される化合物がＲ_１とＲ_２の一方がＣＨ_２ＮＨ_２であって、他方がＣＨＯまたはＣＨ_２ＮＨ_２である場合を除く）］
具体的には、上記一般式（１）で表される化合物は、化合物１、２、３、４、５および６のいずれか一つである。

　別の実施形態の製造方法は、下記一般式（１）で表される化合物を中間体化合物として、ヒドロキシ基をアルデヒド基に変換する活性を有するタンパク質、アルデヒド基をカルボキシ基に変換する活性を有するタンパク質、およびアルデヒド基とアミノ基を可逆的に変換する活性を有するタンパク質から選択される少なくとも一つの酵素の存在下で、シス体および／またはトランス体の４－（アミノメチル）シクロヘキサン－１－カルボン酸を製造する方法である。

［式中、Ｒ_１およびＲ_２は、それぞれ独立してＣＨ_２ＯＨ、ＣＨＯ、ＣＯＯＨ、またはＣＨ_２ＮＨ_２である（但し、Ｒ_１とＲ_２の一方がＣＯＯＨであり、他方がＣＨ_２ＮＨ_２である場合、Ｒ_１とＲ_２が共にＣＯＯＨである場合、一般式（１）で表される化合物がＲ_１とＲ_２の一方がＣＨ_２ＮＨ_２であって、他方がＣＨ_２ＮＨ_２である場合および、
Ｒ_１とＲ_２の一方がＣＨ_２ＮＨ_２であり、他方がＣＨＯであって、化合物８から生じた中間体化合物である場合、を除く）］
具体的には、上記一般式（１）で表される化合物は、化合物１、２、３、４、５、６および７のいずれか一つであって、化合物７が化合物８から生じた中間体化合物である場合を除く。

　別の実施形態の製造方法は、下記一般式（１）で表される化合物を基質化合物または中間体化合物として、ヒドロキシ基をアルデヒド基に変換する活性を有するタンパク質、アルデヒド基をカルボキシ基に変換する活性を有するタンパク質、およびアルデヒド基とアミノ基を可逆的に変換する活性を有するタンパク質から選択される少なくとも一つの酵素の存在下で、シス体および／またはトランス体の４－（アミノメチル）シクロヘキサン－１－カルボン酸を製造する方法である。

［式中、Ｒ_１およびＲ_２は、それぞれ独立してＣＨ_２ＯＨ、ＣＨＯ、ＣＯＯＨ、またはＣＨ_２ＮＨ_２であり、かつ、上記一般式（１）で表される化合物が、
（ｉ）Ｒ_１とＲ_２の一方がＣＯＯＨであり、他方はＣＨ_２ＯＨまたはＣＨＯである、基質化合物または中間体化合物（すなわち化合物４または化合物５）、
（ｉｉ）Ｒ_１とＲ_２の一方がＣＨ_２ＮＨ_２であり、他方はＣＨ_２ＯＨである、基質化合物または中間体化合物（すなわち化合物６）、
および、
（ｉｉｉ）Ｒ_１とＲ_２が共にＣＨＯであるか、またはＲ_１とＲ_２の一方がＣＨ_２ＯＨであり他方がＣＨ_２ＮＨ_２である一般式（１）で表される化合物（すなわち化合物３または６）から生じた化合物であって、Ｒ_１とＲ_２の一方がＣＨ_２ＮＨ_２であり、他方がＣＨＯである中間体化合物（すなわち化合物７）、
の少なくともいずれか一つである。］
具体的には、上記一般式（１）で表される化合物は、基質化合物としての化合物１、２、３、４、５および６の少なくともいずれか一つであり、あるいは、中間体化合物としての化合物１、２、３、４、５および６、ならびに、化合物３もしくは６から生じた化合物７の少なくともいずれか一つである。

　一実施形態の製造方法は、上記一般式（１）において、Ｒ_１とＲ_２が共にＣＨＯである化合物（すなわち化合物３）、Ｒ_１とＲ_２の一方がＣＯＯＨであり、他方がＣＨ_２ＯＨである化合物（すなわち化合物４）または、Ｒ_１とＲ_２の一方がＣＨ_２ＮＨ_２であり、他方がＣＨ_２ＯＨである化合物（すなわち化合物６）のいずれか一つを基質化合物または中間体化合物とし、ヒドロキシ基をアルデヒド基に変換する活性を有するタンパク質、アルデヒド基をカルボキシ基に変換する活性を有するタンパク質、およびアルデヒド基とアミノ基を可逆的に変換する活性を有するタンパク質から選択される少なくとも一つの酵素の存在下で、シス体および／またはトランス体の４－（アミノメチル）シクロヘキサン－１－カルボン酸を製造する方法であることが好ましい。

　当該実施形態の製造方法は、上記一般式（１）において、Ｒ_１とＲ_２が共にＣＨＯである化合物（すなわち化合物３）を基質化合物または中間体化合物とする場合、アルデヒド基をカルボキシ基に変換する活性を有するタンパク質、およびアルデヒド基とアミノ基を可逆的に変換する活性を有するタンパク質の存在下で、
　上記一般式（１）において、Ｒ_１とＲ_２の一方がＣＯＯＨであり、他方がＣＨ_２ＯＨである化合物（すなわち化合物４）を基質化合物または中間体化合物とする場合、ヒドロキシ基をアルデヒド基に変換する活性を有するタンパク質、およびアルデヒド基とアミノ基を可逆的に変換する活性を有するタンパク質の存在下で、または、
　上記一般式（１）において、Ｒ_１とＲ_２の一方がＣＨ_２ＮＨ_２であり、他方がＣＨ_２ＯＨである化合物（すなわち化合物６）を基質化合物または中間体化合物する場合、ヒドロキシ基をアルデヒド基に変換する活性を有するタンパク質、およびアルデヒド基をカルボキシ基に変換する活性を有するタンパク質の存在下で、シス体および／またはトランス体の４－（アミノメチル）シクロヘキサン－１－カルボン酸を製造する方法であることがより好ましい。

　一実施形態の製造方法（以下、「実施形態Ａの製造方法」とも記載する。）は、下記一般式（１）で表される化合物を基質化合物または中間体化合物として、ヒドロキシ基をアルデヒド基に変換する活性を有するタンパク質、アルデヒド基をカルボキシ基に変換する活性を有するタンパク質、およびアルデヒド基とアミノ基を可逆的に変換する活性を有するタンパク質から選択される少なくとも一つの酵素の存在下で、シス体および／またはトランス体の４－（アミノメチル）シクロヘキサン－１－カルボン酸を製造する方法であって、上記アルデヒド基をカルボキシ基に変換する活性を有するタンパク質が配列番号１２７～１３９のいずれか１つで表されるアミノ酸配列、またはこれらのいずれか１つで表されるアミノ酸配列と５０％以上、６０％以上、７０％以上、７５％以上、８０％以上、９０％以上、９３％以上、９５％以上、または９８％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるタンパク質である方法であってもよい。

　実施形態Ａの製造方法は、上記ヒドロキシ基をアルデヒド基に変換する活性を有するタンパク質、上記アルデヒド基をカルボキシ基に変換する活性を有するタンパク質、および上記アルデヒド基とアミノ基を可逆的に変換する活性を有するタンパク質の存在下で製造する方法であることが好ましい。

　実施形態Ａの製造方法は、アルデヒド基をカルボキシ基に変換する活性を有するタンパク質の存在下でシス体および／またはトランス体の４－（アミノメチル）シクロヘキサン－１－カルボン酸を製造する方法であって、
　上記一般式（１）において、Ｒ_１とＲ_２の一方がＣＨ_２ＮＨ_２であり、他方がＣＨＯである、化合物（すなわち化合物７）を基質化合物または中間体化合物とする、シス体および／またはトランス体の４－（アミノメチル）シクロヘキサン－１－カルボン酸を製造する方法であることが好ましい。

　実施形態Ａの製造方法は、アルデヒド基をカルボキシ基に変換する活性を有するタンパク質およびアルデヒド基とアミノ基を可逆的に変換する活性を有するタンパク質の存在下でシス体および／またはトランス体の４－（アミノメチル）シクロヘキサン－１－カルボン酸を製造する方法であって、
　上記一般式（１）において、Ｒ_１とＲ_２が共にＣＨＯである化合物（すなわち化合物３）および／または上記一般式（１）において、Ｒ_１とＲ_２が共にＣＨ_２ＮＨ_２である、化合物（すなわち化合物８）を基質化合物または中間体化合物とする、シス体および／またはトランス体の４－（アミノメチル）シクロヘキサン－１－カルボン酸を製造する方法であることが好ましい。

　実施形態Ａの製造方法は、アルデヒド基をカルボキシ基に変換する活性を有するタンパク質およびヒドロキシ基をアルデヒド基に変換する活性を有するタンパク質の存在下でシス体および／またはトランス体の４－（アミノメチル）シクロヘキサン－１－カルボン酸を製造する方法であって、
　上記一般式（１）において、Ｒ_１とＲ_２の一方がＣＨ_２ＮＨ_２であり、他方がＣＨ_２ＯＨである化合物（すなわち化合物６）を基質化合物または中間体化合物とする、シス体および／またはトランス体の４－（アミノメチル）シクロヘキサン－１－カルボン酸を製造する方法であることが好ましい。

　実施形態Ａの製造方法は、ヒドロキシ基をアルデヒド基に変換する活性を有するタンパク質、アルデヒド基をカルボキシ基に変換する活性を有するタンパク質、およびアルデヒド基とアミノ基を可逆的に変換する活性を有するタンパク質の存在下でシス体および／またはトランス体の４－（アミノメチル）シクロヘキサン－１－カルボン酸を製造する方法であって、
　上記一般式（１）において、Ｒ_１とＲ_２の一方がＣＨ_２ＯＨであり、他方がＣＨ_２ＯＨまたはＣＨＯである化合物（すなわち化合物１または化合物２）を基質化合物または中間体化合物とする、シス体および／またはトランス体の４－（アミノメチル）シクロヘキサン－１－カルボン酸を製造する方法であることが好ましい。

　実施形態Ａの製造方法において、上記アルデヒド基をカルボキシ基に変換する活性を有するタンパク質が、以下の１）から６）の少なくともいずれか１つであることが好ましい。
　１）配列番号１９で表されるアミノ酸配列と７１％以上、７５％以上、８０％以上、９０％以上、９３％以上、９５％以上、または９８％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるタンパク質
　２）配列番号２０で表されるアミノ酸配列と６８％以上、７０％以上、７５％以上、８０％以上、９０％以上、９３％以上、９５％以上、または９８％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるタンパク質
　３）Ｐｓｕｄｏｍｏｎａｓ属由来アルデヒドデヒドロゲナーゼであり、かつ配列番号２０で表されるアミノ酸配列と５０％以上、６０％以上、７０％以上、７５％以上、８０％以上、９０％以上、９３％以上、９５％以上、または９８％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるタンパク質
　４）配列番号２１で表されるアミノ酸配列と６３％、７０％以上、７５％以上、８０％以上、９０％以上、９３％以上、９５％以上、または９８％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるタンパク質
　５）配列番号４０で表されるアミノ酸配列と５６．５％以上、６０％以上、７０％以上、７５％以上、８０％以上、９０％以上、９３％以上、９５％以上、または９８％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるタンパク質
　６）配列番号４１で表されるアミノ酸配列と６３．９％以上、７０％以上、７５％以上、８０％以上、９０％以上、９３％以上、９５％以上、または９８％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるタンパク質

　実施形態Ａの製造方法において、上記アルデヒド基をカルボキシ基に変換する活性を有するタンパク質が、以下の１）から６）の少なくともいずれか１つである場合、上記アルデヒド基をカルボキシ基に変換する活性を有するタンパク質が、配列番号１２７～１３１、１３３～１３５、１３８、および１３９のいずれか１つで表されるアミノ酸配列からなるタンパク質であることが好ましい。

　実施形態Ａの製造方法において、上記アルデヒド基をカルボキシ基に変換する活性を有するタンパク質が、以下の１）から６）の少なくともいずれか１つである場合、上記アルデヒド基をカルボキシ基に変換する活性を有するタンパク質が、アルデヒド基を有する化合物のアルデヒド基を酸化させるアルデヒドデヒドロゲナーゼ活性を有し、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属細菌由来のアルデヒドデヒドロゲナーゼであることが好ましい。

　実施形態Ａの製造方法において、上記ヒドロキシ基をアルデヒド基に変換する活性を有するタンパク質が、オキシダーゼ活性を有するタンパク質、デヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質およびアルデヒドレダクターゼ活性を有するタンパク質から選択される少なくとも１つであり、上記アルデヒド基とアミノ基を可逆的に変換する活性を有するタンパク質が、アミノ基転移酵素活性を有するタンパク質、アミンデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質およびアミンオキシダーゼ活性を有するタンパク質から選択される少なくとも１つであることが好ましい。

　実施形態Ａの製造方法において、上記ヒドロキシ基をアルデヒド基に変換する活性を有するタンパク質が、コリンオキシダーゼ活性を有するタンパク質であり、上記アルデヒド基とアミノ基を可逆的に変換する活性を有するタンパク質が、アミノ基転移酵素活性を有するタンパク質であることが好ましい。

　実施形態Ａの製造方法において、上記コリンオキシダーゼ活性を有するタンパク質が、配列番号２０１で表されるアミノ酸配列と６０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるタンパク質であり、上記アミノ基転移酵素活性を有するタンパク質が、配列番号１～４および１０３～１０５のいずれか１つで表されるアミノ酸配列と６０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるタンパク質であることが好ましい。

　実施形態Ａの製造方法は、上記一般式（１）において、Ｒ_１とＲ_２が共にＣＨＯである化合物（すなわち化合物３）、Ｒ_１とＲ_２の一方がＣＯＯＨであり、他方がＣＨ_２ＯＨである化合物（すなわち化合物４）または、Ｒ_１とＲ_２の一方がＣＨ_２ＮＨ_２であり、他方がＣＨ_２ＯＨである化合物（すなわち化合物６）のいずれか一つを基質化合物または中間体化合物とし、ヒドロキシ基をアルデヒド基に変換する活性を有するタンパク質、アルデヒド基をカルボキシ基に変換する活性を有するタンパク質、およびアルデヒド基とアミノ基を可逆的に変換する活性を有するタンパク質から選択される少なくとも一つの酵素の存在下で、シス体および／またはトランス体の４－（アミノメチル）シクロヘキサン－１－カルボン酸を製造する方法であることが好ましい。

　実施形態Ａの製造方法は、上記一般式（１）において、Ｒ_１とＲ_２が共にＣＨＯである化合物（すなわち化合物３）を基質化合物または中間体化合物とする場合、アルデヒド基をカルボキシ基に変換する活性を有するタンパク質、およびアルデヒド基とアミノ基を可逆的に変換する活性を有するタンパク質の存在下で、
　上記一般式（１）において、Ｒ_１とＲ_２の一方がＣＯＯＨであり、他方がＣＨ_２ＯＨである化合物（すなわち化合物４）を基質化合物または中間体化合物とする場合、ヒドロキシ基をアルデヒド基に変換する活性を有するタンパク質、およびアルデヒド基とアミノ基を可逆的に変換する活性を有するタンパク質の存在下で、または、
　上記一般式（１）において、Ｒ_１とＲ_２の一方がＣＨ_２ＮＨ_２であり、他方がＣＨ_２ＯＨである化合物（すなわち化合物６）を基質化合物または中間体化合物する場合、ヒドロキシ基をアルデヒド基に変換する活性を有するタンパク質、およびアルデヒド基をカルボキシ基に変換する活性を有するタンパク質の存在下で、シス体および／またはトランス体の４－（アミノメチル）シクロヘキサン－１－カルボン酸を製造する方法であることが好ましい。

　別の実施形態の製造方法は、下記一般式（１）で表される化合物であって、下記（ｉ）の化合物を基質化合物または中間体化合物として、ヒドロキシ基をアルデヒド基に変換する活性を有するタンパク質、アルデヒド基をカルボキシ基に変換する活性を有するタンパク質、およびアルデヒド基とアミノ基を可逆的に変換する活性を有するタンパク質から選択される少なくとも一つの酵素の存在下で、シス体および／またはトランス体の４－（アミノメチル）シクロヘキサン－１－カルボン酸を製造する方法であってもよい。
（ｉ）一般式（１）において、Ｒ_１およびＲ_２は、それぞれ独立してＣＨ_２ＯＨ、ＣＨＯ、ＣＯＯＨ、またはＣＨ_２ＮＨ_２である。但し、一般式（１）において、Ｒ_１とＲ_２の一方がＣＯＯＨであり、他方がＣＨ_２ＮＨ_２である場合、Ｒ_１とＲ_２が共にＣＯＯＨである場合、およびＲ_１とＲ_２の一方がＣＨ_２ＮＨ_２であり、他方がＣＨＯである場合（すなわち一般式（１）で表される化合物が化合物７である場合）を除く。すなわち、上記一般式（１）で表される化合物は化合物１，２，３，４，５または６のいずれか一つである。

　別の実施形態の製造方法は、下記一般式（１）で表される化合物を基質化合物または中間体化合物として、ヒドロキシ基をアルデヒド基に変換する活性を有するタンパク質、アルデヒド基をカルボキシ基に変換する活性を有するタンパク質、およびアルデヒド基とアミノ基を可逆的に変換する活性を有するタンパク質から選択される少なくとも一つの酵素の存在下で、シス体および／またはトランス体の４－（アミノメチル）シクロヘキサン－１－カルボン酸を製造する方法であって、上記アルデヒド基をカルボキシ基に変換する活性を有するタンパク質が配列番号２０７で表されるアミノ酸配列、または当該アミノ酸配列と５０％以上、６０％以上、７０％以上、７５％以上、８０％以上、９０％以上、９３％以上、９５％以上、または９８％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるタンパク質である、方法であってもよい。

［式中、Ｒ_１およびＲ_２は、それぞれ独立してＣＨ_２ＯＨ、ＣＨＯ、ＣＯＯＨ、またはＣＨ_２ＮＨ_２である（但し、Ｒ_１とＲ_２の一方がＣＯＯＨの場合、他方はＣＨ_２ＯＨまたはＣＨＯに限る）］
具体的には、上記一般式（１）で表される化合物は、化合物１、２、３、４、５、６、７および８のいずれか１つの化合物である。

　本発明の製造方法における各酵素反応工程において、基質化合物または中間体化合物（例えば、工程（ｉ）の１，４－ビス（アミノメチル）シクロヘキサン（化合物８）や工程（ｉｉｉ）の１，４－シクロヘキサンジメタノール（化合物１））はトランス体、シス体またはそれらの混合物のいずれであってもよく、原料の入手しやすさからトランス体とシス体の混合物であることが好ましい。また、各工程の中間体化合物（例えば、工程（ｉ）の４－（アミノメチル）シクロヘキサン－１－カルバルデヒド（化合物７）、工程（ｉｉｉ）の４－（ヒドロキシメチル）シクロヘキサン－１－カルバルデヒド（化合物２）または４－ホルミルシクロヘキサン－１－カルボン酸（化合物５））は、トランス体、シス体またはそれらの混合物のいずれであってもよい。生成する各工程の中間体化合物は、トラネキサム酸の製造に供給される場合、トランス体であることが好ましい。トランス体およびシス体混合物において、トランス体およびシス体の比率は問わないが、トランス体の比率は５０％超であることが好ましい。

　本発明の製造方法において、各酵素反応工程の基質化合物、例えば、工程（ｉ）の１，４－ビス（アミノメチル）シクロヘキサン（化合物８）、または、工程（ｉｉ）の４－（アミノメチル）シクロヘキサン－１－カルバルデヒド（化合物７）が、各工程で、例えば、工程（ｉ）の４－（アミノメチル）シクロヘキサン－１－カルバルデヒド（化合物７）、または、工程（ｉｉ）の４－（アミノメチル）シクロヘキサン－１－カルボン酸（目的化合物）と立体構造が異なる場合、本実施形態の製造方法の一部または全部が、中性または塩基性条件下で行われることが好ましく、たとえば工程（ｉ）の工程の一部または全部、および／または、工程（ｉｉ）の工程の一部または全部が、中性または塩基性条件下で行われることが好ましい。反応を中性または塩基性条件下で行うと、反応中間体である４－（アミノメチル）シクロヘキサン－１－カルバルデヒド（化合物７）のシス体からトランス体、または、トランス体からシス体への異性化が促進される。ｐＨ９以上の塩基性条件下では特に異性化しやすく、４－（アミノメチル）シクロヘキサン－１－カルバルデヒド（化合物７）の異性化はトランス比率およそ６０％で平衡化する。これにより、例えばトランス体の４－（アミノメチル）シクロヘキサン－１－カルボン酸（トラネキサム酸）を最終目的産物とする場合に、基質としてシス体、またはシス体およびトランス体混合物を用いる場合であっても、後述のトランス選択性の高いアルデヒドデヒドロゲナーゼを用いることで、トランス体の４－（アミノメチル）シクロヘキサン－１－カルボン酸をより多く得ることができ、すなわち、産物混合物におけるより高いトランス比率を得ることができる。これによって、高収率でトラネキサム酸を製造することができる。一方で、トランス体を基質とした場合、酸性（たとえば、ｐＨ４～６）とすることで、異性化を防止することで、トランス体の産物をより多く得ることができる。

　中性とは、反応液のｐＨが７前後であり、塩基性とは、反応液のｐＨが７超～１２であればよく、中性または塩基性とは、反応液のｐＨが好ましくは７～１２であり、より好ましくは７～１０である。塩基性にする手法としては特に限定されず、アルカリ溶液、尿素、炭酸カルシウム、アンモニア等を添加することで達成することができる。工程の一部が中性または塩基性で行われるとは、該工程の始めから途中までを中性または塩基性とするか、途中から終わりまでを中性または塩基性とすることを意味する。ここで、工程の始めとは反応液に酵素を含ませる前であり、工程の終わりとは酵素反応終了後である（以下同じ）。中性または塩基性によって、シス体をトランス体に異性化させる場合、２０％以上、例えば、４０％以上または５０％以上、６０％以上の異性化率を得ることができる。また、トランス体をシス体に異性化させる場合、２０%以上、例えば、３０％以上または３５％以上の異性化率を得ることができる。

　本発明の製造方法の各酵素反応工程の基質化合物と、中間体化合物または目的化合物の立体構造が異なる場合、反応工程の一部または全部が２級アミンの存在下で行われることが好ましい。２級アミンの存在によって４－（アミノメチル）シクロヘキサン－１－カルバルデヒドの異性化が促進される。２級アミンとしては、例えばＬ－プロリン、ピロリジン、ピロリジン誘導体、トランス－４－ヒドロキシ－Ｌ－プロリン等が挙げられる。２級アミンの反応液へ添加量としては、０．０１～５００ｍＭであればよく、０．１～２００ｍＭであることが好ましい。２級アミンの添加によって、２０％以上、例えば、６０％以上のシス体からトランス体への異性化率を得ることができ、または２０％以上、例えば、３０％以上または３５％以上のトランス体からシス体への異性化率を得ることができる。

　本発明の製造方法の各酵素反応工程は、当該工程の酵素反応を触媒する酵素（本発明の酵素Ａ、酵素Ｂ、および／または酵素Ｃ）を酵素源として用い、該酵素源および基質化合物を水性媒体中に存在せしめ、中間体化合物または目的化合物を水性媒体中に生成、蓄積させてもよいし、当該工程の酵素反応を触媒する酵素（本発明の酵素Ａ、酵素Ｂ、および／または酵素Ｃ）を生産する能力を有する細胞を培地に培養し、該培養物中に中間体化合物または目的化合物を生成、蓄積させてもよい。

　酵素源を用いる方法において、酵素源としては、精製したタンパク質であってもよく、または、目的の活性を有するタンパク質を生産する能力を有する細胞を培地に培養して得られる培養物若しくは該培養物の処理物であってもよい。

　上記培養物若しくは培養物の処理物は、酵素源としての目的の活性を有するタンパク質を含む。培養物の処理物としては、培養物の濃縮物、培養物の乾燥物、培養物を遠心分離して得られる菌体、該菌体の乾燥物、該菌体の凍結乾燥物、該菌体の界面活性剤処理物、該菌体の超音波処理物、該菌体の機械的摩砕処理物、該菌体の溶媒処理物、該菌体の酵素処理物、該菌体のタンパク質分画物、該菌体の固定化物あるいは該菌体より抽出して得られる酵素標品などが挙げられる。

　各工程において、酵素源として精製したタンパク質を用いる場合、当該工程の酵素反応を触媒する酵素（本発明の酵素Ａ、酵素Ｂ、および／または酵素Ｃ）の量としては、基質化合物または中間体化合物に対して、０．０１～１００重量％であればよく、０．１～５０重量％であることが好ましい。酵素源として培養物または該培養物の処理物を酵素源として用いる場合、該酵素源の量は当該酵素源の比活性等により異なるが、例えば、基質化合物または中間体化合物に対して、湿菌体重量として５～１０００重量％であればよく、１０～４００重量％であることが好ましい。

　水性媒体としては、水、リン酸塩、炭酸塩、酢酸塩、ホウ酸塩、クエン酸塩、トリス、２－モルホリノエタンスルホン酸（以下、ＭＥＳと表記）、３－モルホリノプロパンスルホン酸（以下、ＭＯＰＳと表記）、Ｎ－シクロヘキシル－２－アミノエタンスルホン酸（以下、ＣＨＥＳと表記）、４－（２－ヒドロキシエチル）－１－ピペラジンエタンスルフォン酸（以下、ＨＥＰＥＳと表記）などの緩衝液、メタノールやエタノールなどのアルコール類、酢酸エチルなどのエステル類、アセトンなどのケトン類、アセトアミドなどのアミド類などを挙げることができる。また、酵素源として用いた微生物の培養液を水性媒体として用いることもできる。

　酵素Ｂを触媒とする酵素反応工程（例えば、工程（ｉ））において、上記１．で述べたとおり、酵素Ｂの一つであるアミノ基移転酵素活性を有するタンパク質の存在下でアミノ基を有する化合物からアルデヒド基を有する化合物へ変換する酵素反応、例えば、１，４－ビス（アミノメチル）シクロヘキサン（化合物８）等のアミノ基を有する化合物を４－（アミノメチル）シクロヘキサン－１－カルバルデヒド（化合物７）等のアルデヒド基を有する化合物に変換する酵素反応は、アミノ基を受容できる化合物を共存させることが望ましい。また、上記１．で述べたとおり、酵素Ｂの存在下におけるアルデヒド基を有する化合物からアミノ基を有する化合物へ変換する酵素反応、例えば、化合物３を化合物７に変換する反応は、アミノ基を供与できる化合物を共存させることが望ましい。

　アミノ基を受容できる化合物としては、ケト酸が挙げられ、好ましくはピルビン酸、α－ケトグルタル酸、α－ケト酪酸等が挙げられる。アミノ基を供与できる化合物としては、アミノ酸が挙げられ、好ましくはアラニン、グルタミン酸、α－アミノ酪酸等が挙げられる。

　ケト酸は、アミノ基を受容できるものであればその由来は問わないが、ケト酸を生産する能力を有する微生物の培養物または該培養物の処理物をそのまま、あるいは該培養物または該培養物の処理物から回収したケト酸を用いてもよい。アミノ酸は、アミノ基を供与できるものであればその由来は問わないが、アミノ酸を生産する能力を有する微生物の培養物または該培養物の処理物をそのまま、あるいは該培養物または該培養物の処理物から回収したアミノ酸を用いてもよい。

　また、ケト酸は添加するのではなく、反応系において産生させてもよい。例えば、微生物を培地に培養し、中間体化合物または目的化合物を生成、蓄積させる場合（例えば化合物８から化合物７を生成、蓄積させる場合）、該微生物にケト酸を生産する能力を有する微生物を用いてもよい。ケト酸を生産する能力を有する微生物とは、例えば、生体内でのピルビン酸分解に関与するピルビン酸デヒドロゲナーゼ複合体の遺伝子を欠失あるいは弱化させた微生物、乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子を欠失あるいは弱化させた微生物、ピルビン酸オキシダーゼ遺伝子を欠失あるいは弱化させた微生物などが挙げられる。ここで、「弱化させる」こととは、対象遺伝子（例えば、ピルビン酸デヒドロゲナーゼ複合体の遺伝子）の発現量または酵素の活性を低減させることを意味する。

　また、アミノ酸は添加するのではなく、反応系において産生させてもよい。例えば、微生物を培地で培養し、中間体化合物または目的化合物を生成、蓄積させる場合（例えば化合物２から化合物６を生成、蓄積させる場合）、該微生物にアミノ酸を生産する能力を有する微生物を用いてもよい。アミノ酸を生産する能力を有する微生物とは、例えば、生体内でのグルタミン酸分解に関与するグルタミン酸脱炭酸酵素の遺伝子を欠失あるいは弱化させた微生物、グルタミン酸生合成に関与する遺伝子を強化させた微生物などが挙げられる。ここで、「弱化させる」こととは、対象遺伝子の発現量または酵素の活性を低減させることを意味し、「強化させる」こととは、対象遺伝子の発現量または酵素の活性を増大させることを意味する。

　酵素Ｂを触媒とする酵素反応工程において、ケト酸またはアミノ酸を添加する場合、添加量としては、例えば、基質化合物（例えば、化合物８または化合物２）に対してモル比０．０１～１００であればよく、０．０１～６０であることが好ましい。

　本実施形態の製造方法は、方法の一部または全部において、アラニンデヒドロゲナーゼもしくはグルタミン酸デヒドロゲナーゼ、および／または、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈオキシダーゼを共存させることを含む。特に、酵素Ｂとしてアミノ基転移酵素の存在下で製造する場合（例えば、第１のステップ（工程（ｉ））や４－（ヒドロキシメチル）シクロヘキサン－１－カルバルデヒド（化合物２）から目的化合物である４－アミノメチルシクロヘキサン－１－カルボン酸を製造する工程）において、アラニンデヒドロゲナーゼもしくはグルタミン酸デヒドロゲナーゼ、および／または、ＮＡＤＨオキシダーゼを共存させることが好ましく、酵素Ｃとしてアルデヒドデヒドロゲナーゼの存在下で製造する場合（例えば、第２のステップ（工程（ｉｉ））や４－（ヒドロキシメチル）シクロヘキサン－１－カルバルデヒド（化合物２）から目的化合物（４－アミノメチルシクロヘキサン－１－カルボン酸）を製造する工程）、酵素Ｂとしてアミンデヒドロゲナーゼの存在下で製造する場合（例えば、第１のステップ（工程（ｉ））や４－（ヒドロキシメチル）シクロヘキサン－１－カルバルデヒド（化合物２）から目的化合物（４－アミノメチルシクロヘキサン－１－カルボン酸）を製造する工程）、および／または、酵素Ａとしてデヒドロゲナーゼおよび／またはアルデヒドレダクターゼの存在下で製造する場合（例えば、工程（ｉｉｉ）や４－（ヒドロキシメチル）シクロヘキサン－１－カルバルデヒド（化合物２）から目的化合物（４－アミノメチルシクロヘキサン－１－カルボン酸）を製造する工程）において、ＮＡＤＨオキシダーゼを共存させることが好ましい。

　酵素Ｂとしてアミノ基転移酵素活性を有するタンパク質を触媒とする酵素反応工程において、ケト酸としてピルビン酸またはアミノ酸としてアラニンを用いる場合には、アラニンデヒドロゲナーゼ（ａｌａｎｉｎｅ　ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ；ＡｌａＤＨ）を共存させることが好ましい。上記１．で説明したとおり、ＡｌａＤＨはＮＡＤ^＋を補酵素として利用し、産生されたアラニンをピルビン酸に変換（再生）すること、または、産生されたピルビン酸をアラニンに変換（再生）することを触媒できる酵素である。したがって、ＡｌａＤＨを共存させることによって、ピルビン酸またはアラニンが再利用され、少ない原料で効率よくアミノ基転移反応を進行させることができる。また、ＡｌａＤＨを共存させる場合には、反応で要するＮＡＤ^＋を添加することが望ましい。同様に、アミノ酸としてグルタミン酸を用いる場合には、グルタミン酸デヒドロゲナーゼ（ｇｌｕｔａｍａｔｅ　ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ；ＧＤＨ）を共存させることが好ましい。ＧＤＨはＮＡＤ^＋を補酵素として利用し、産生されたα－ケトグルタル酸をグルタミン酸に変換（再生）することまたは産生されたグルタミン酸をα－ケトグルタル酸に変換（再生）することを触媒できる酵素である。

　ＡｌａＤＨは、アラニン・アスパラギン酸・グルタミン酸代謝酵素の一つであり、（アラニン＋水＋ＮＡＤ^＋）と（ピルビン酸＋ＮＨ_３＋ＮＡＤＨ＋Ｈ^＋）との間の可逆反応を触媒する酸化還元酵素である。本発明の４－（アミノメチル）シクロヘキサン－１－カルボン酸の製造方法において、ケト酸としてピルビン酸を用いた場合に産生されるアラニンをピルビン酸に変換させることができる。また、本発明の４－（アミノメチル）シクロヘキサン－１－カルボン酸の製造方法において、アミノ酸としてアラニンを用いた場合に産生されるピルビン酸をアラニンに変換させることができる。同様に、ＧＤＨは（グルタミン酸＋水＋ＮＡＤ^＋）と（α－ケトグルタル酸＋ＮＨ_３＋ＮＡＤＨ＋Ｈ^＋）との間の可逆反応を触媒する酸化還元酵素である。

　ＡｌａＤＨとしては特に限定されず、例えば、Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ａｌｋａｌｉｈａｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ　ｐｓｅｕｄｏｆｉｒｍｕｓ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ　ａｕｒｅｕｓ由来のＡｌａＤＨであってよく、具体的には、Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｕｂｔｉｌｉｓ　１６８由来アラニンデヒドロゲナーゼＢｓＡｌａＤＨ（アクセッション番号：ＷＰ＿００３２４３２８０．１）、Ａｌｋａｌｉｈａｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ　ｐｓｅｕｄｏｆｉｒｍｕｓ由来アラニンデヒドロゲナーゼＡｐＡｌａＤＨ（アクセッション番号：ＷＰ＿０１２９５７３７６．１）、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ　ａｕｒｅｕｓ由来アラニンデヒドロゲナーゼＳａＡｌａＤＨ（アクセッション番号：ＷＰ＿０００６８９９９８．１）が挙げられる。

　ＧＤＨとしては特に限定されず、例えば、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ由来グルタミン酸デヒドロゲナーゼ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ属細菌由来グルタミン酸デヒドロゲナーゼ（例えば、Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｕｂｔｉｌｉｓ由来グルタミン酸デヒドロゲナーゼ等）、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属細菌由来グルタミン酸デヒドロゲナーゼ（例えば、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ由来グルタミン酸デヒドロゲナーゼ）、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ属細菌由来グルタミン酸デヒドロゲナーゼＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ属真菌由来グルタミン酸デヒドロゲナーゼ、Ｐｅｐｔｏｎｉｐｈｉｌｕｓ　ａｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃｕｓ由来グルタミン酸デヒドロゲナーゼ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ由来グルタミン酸デヒドロゲナーゼ等が挙げられる。

　ＡｌａＤＨまたはＧＤＨを共存させることとは、酵素Ｂとしてアミノ基転移酵素を用いる反応において、ＡｌａＤＨまたはＧＤＨを発現する細胞の培養物または該培養物の処理物を添加してもよく、ＡｌａＤＨまたはＧＤＨを発現する細胞を共培養してもよく、あるいは、ＡｌａＤＨまたはＧＤＨをコードするＤＮＡを上記組換え細胞に含ませてもよい。

　ＡｌａＤＨまたはＧＤＨの量としては、アミノ基転移反応にて産生されるアラニン、ピルビン酸、グルタミン酸またはα－ケトグルタル酸に対して、０．０１～１００重量％であればよく、０．１～５０重量％であることが好ましい。培養物または該培養物の処理物を酵素源として用いる場合、該酵素源の量は当該酵素源の比活性等により異なるが、例えば、基質化合物または中間体化合物（例えば、１，４－ビス（アミノメチル）シクロヘキサン（化合物８））に対して、湿菌体重量として５～１０００重量％であればよく、１０～４００重量％であることが好ましい。また、ＮＡＤ^＋を添加することが望ましい。ＮＡＤ^＋の添加量は、アミノ基転移反応にて産生されるアラニン、ピルビン酸、グルタミン酸またはα－ケトグルタル酸に対してモル比０．０１～１００であればよく、０．０１～６０であることが好ましい。

　酵素Ｃを触媒とする酵素反応工程（例えば、工程（ｉｉ））、酵素Ｂを触媒とする酵素反応工程（例えば、工程（ｉ））、または、酵素Ａを触媒とする酵素反応工程（例えば、工程（ｉｉｉ））において、上記１．で述べたとおり、酵素Ｃの一つであるアルデヒドデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質の存在下で、アルデヒド基を有する化合物（例えば、４－（アミノメチル）シクロヘキサン－１－カルバルデヒド（化合物７））を、カルボキシ基を有する化合物（例えば、４－（アミノメチル）シクロヘキサン－１－カルボン酸（目的化合物））に変換する酵素反応、酵素Ａの一つであるデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質および／またはアルデヒドレダクターゼ活性を有するタンパク質の存在下で、ヒドロキシ基を有する化合物（例えば、化合物１）を、アルデヒド基を有する化合物（例えば、化合物２））に変換する酵素反応、および／または酵素Ｂの一つであるアミンデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質の存在下で、アミノ基を有する化合物（例えば、化合物８）を、アルデヒド基を有する化合物（例えば、化合物７）に変換する酵素反応では、例えば、補酵素であるＮＡＤ（Ｐ）^＋を共存させるのが望ましい。酵素Ｃのうちアルデヒドデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質、酵素Ａのうちデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質およびアルデヒドレダクターゼ活性を有するタンパク質、酵素Ｂのうちアミンデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質は、補酵素としてＮＡＤ^＋を好むＮＡＤ^＋型、ＮＡＤＰ^＋を好むＮＡＤＰ^＋型、ＮＡＤ^＋とＮＡＤＰ^＋の両方を利用できるものが存在する。したがって、本発明の製造方法において、酵素Ｃのうちアルデヒドデヒドロゲナーゼを有するタンパク質、酵素Ａのうちデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質およびアルデヒドレダクターゼ活性を有するタンパク質、酵素Ｂのうちアミンデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質のいずれかを使用する場合、当該タンパク質の利用性が高い補酵素を共存させることが好ましい。

　ＮＡＤ（Ｐ）^＋の量としては、基質化合物または中間体化合物（例えば、化合物１、７または８）に対してモル比０．０１～１００であればよく、好ましくは０．０１～６０であることが好ましい。

　また、本発明の製造方法において、酵素Ｃとしてアルデヒドデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質、酵素Ａとしてデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質若しくはアルデヒドレダクターゼ活性を有するタンパク質、および／または、酵素Ｂとしてアミンデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質を使用する場合、補酵素を供給する方法として、上記タンパク質を発現させる宿主に補酵素を生産する能力を有する微生物を用いることができる。これにより、さらなる所望の４－（アミノメチル）シクロヘキサン－１－カルボン酸の生産量の向上が見込まれる。補酵素を生産する能力を有する微生物とは、例えば、生体内でのＮＡＤ（Ｐ）^＋分解に関与する遺伝子（例えば、ｍａｚＧ、ｎｕｄＣ）を欠失、欠損あるいは弱化させた微生物、ＮＡＤ（Ｐ）^＋生成に関与する遺伝子（例えば、ｐｎｃＢ、ｎａｄＡ、ｎａｄＢ）を増強あるいは導入した微生物、上記ＮＡＤ（Ｐ）^＋生成に関与する遺伝子産物の発現若しくは機能を抑制する遺伝子（例えば、ｎａｄＲ）を欠失、欠損あるいは弱化させた微生物などが挙げられる。

　酵素Ｃのうちアルデヒドデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質、酵素Ａのうちデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質、アルデヒドレダクターゼ活性を有するタンパク質、および／または酵素Ｂのうちアミンデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質の量としては、基質化合物または中間体化合物（例えば、化合物１、７または８）に対して、０．０１～１００重量％であればよく、０．１～５０重量％であることが好ましい。培養物または該培養物の処理物を酵素源として用いる場合、該酵素源の量は当該酵素源の比活性等により異なるが、例えば、基質化合物または中間体化合物（例えば、化合物１、７または８）に対して、湿菌体重量として５～１０００重量％であればよく、１０～４００重量％であることが好ましい。

　酵素Ａの一つであるデヒドロゲナーゼまたはアルデヒドレダクターゼ活性を有するタンパク質、酵素Ｂの一つであるアミンデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質、酵素Ｃの一つであるアルデヒドデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質、または／および、酵素Ｂとしてアミノ基転移酵素活性を有するタンパク質を用いる場合にアラニンデヒドロゲナーゼまたはグルタミン酸デヒドロゲナーゼの存在下で行う工程においてＮＡＤ（Ｐ）Ｈオキシダーゼ（ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ　Ｏｘｉｄａｓｅ；ＮＯＸ）を共存させることが好ましい。

　ＮＡＤ（Ｐ）Ｈオキシダーゼは、代謝酵素の一つであり、（ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ＋Ｈ^＋＋Ｏ_２）を（ＮＡＤ（Ｐ）^＋＋Ｈ_２Ｏ_２またはＨ_２Ｏ）に変換する反応を触媒する酸化還元酵素である。本発明の製造方法における、酵素Ａの一つであるデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質またはアルデヒドレダクターゼ活性を有するタンパク質、酵素Ｂの一つであるアミンデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質、酵素Ｃの一つであるアルデヒドデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質、または／および、酵素Ｂとしてアミノ基転移酵素活性を有するタンパク質を用いる場合にアラニンデヒドロゲナーゼまたはグルタミン酸デヒドロゲナーゼの存在下で行う工程において産生されるＮＡＤ（Ｐ）ＨをＮＡＤ（Ｐ）^＋に変換することができる。したがって、本工程においてＮＡＤ（Ｐ）Ｈオキシダーゼを共存させることによって、ＮＡＤ（Ｐ）^＋が再利用され、少ない原料で効率よく４－（アミノメチル）シクロヘキサン－１－カルボン酸を製造することができる。

　ＮＯＸとしては特に限定されず、例えば、Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔоｃоｃｃｕｓ　ｍｕｔａｎｓ、Ｌａｃｔоｃоｃｃｕｓ　ｌａｃｔｉｓ、Ｅｎｔｅｒоｃоｃｃｕｓ　ｆｅａｃａｌｉｓ由来のＮＯＸであってよく、具体的には、Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｕｂｔｉｌｉｓ　１６８由来ＮＡＤＨオキシダーゼＢｓＮＯＸ（アクセッション番号：ＮＰ＿３８９８３６．１）、Ｓｔｒｅｐｔоｃоｃｃｕｓ　ｍｕｔａｎｓ由来ＮＡＤＨオキシダーゼＳｍＮＯＸ（アクセッション番号：ＷＰ＿００２２６８０４４．１）、Ｌａｃｔоｃоｃｃｕｓ　ｌａｃｔｉｓ由来ＮＡＤＨオキシダーゼＬｌＮＯＸ（アクセッション番号：ＣＡＬ９７０１２．１）、Ｅｎｔｅｒоｃоｃｃｕｓ　ｆｅａｃａｌｉｓ由来ＮＡＤＨオキシダーゼＥｆＮＯＸ（アクセッション番号：ＷＰ＿００２３６１８３３．１）が挙げられる。

　ＮＡＤ（Ｐ）Ｈオキシダーゼを共存させることとは、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈオキシダーゼを発現する細胞の培養物または該培養物の処理物を添加してもよく、あるいは、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈオキシダーゼを発現する細胞を共培養してもよく、あるいは、ＮＡＤ（Ｐ）ＨオキシダーゼをコードするＤＮＡを上記組換え細胞に含ませてもよい。

　ＮＡＤ（Ｐ）Ｈオキシダーゼの量としては、アラニンデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質、グルタミン酸デヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質、酵素Ａのうちデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質、酵素Ｂのうちアミンデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質、または酵素Ｃのうちアルデヒドデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質を使用する場合に生成されるＮＡＤ（Ｐ）Ｈの合計量に対して、０．００１～１００重量％であればよく、０．０１～５０重量％であることが好ましい。培養物または該培養物の処理物を酵素源として用いる場合、該酵素源の量は当該酵素源の比活性等により異なるが、例えば、基質化合物または中間体化合物（例えば、化合物１または８）に対して、湿菌体重量として０．５～１０００重量％であればよく、１～４００重量％であることが好ましい。

　ＮＡＤ（Ｐ）Ｈオキシダーゼを共存させる代わりに、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈを電気的に酸化してＮＡＤ（Ｐ）^＋に再生させることもできる。

　基質化合物と、中間体化合物または目的化合物の立体構造が異なる場合には、方法の一部または全部が中性または塩基性で行われることが好ましく、さらに、方法の一部または全部が２級アミンの存在下で行われることが好ましい。基質化合物と、中間体化合物または目的化合物の立体構造が同一の場合には、方法の一部または全部が酸性で行われることが望ましい。

　上記の目的化合物の４－（アミノメチル）シクロヘキサン－１－カルボン酸はシス体、トランス体またはその混合物のいずれであってもよい。シス体（すなわち、シス－トラネキサム酸）を目的とする場合には、アルデヒドデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質として、一実施形態のシス体基質を受け入れることのできる酵素、配列番号１９、２１、２２、３５～３７、３９、４４～４６、１３２、１３４、１３５および１３８のいずれか、あるいはこれらの変異あるいは相同タンパク質を用いることが好ましい。トランス体（すなわち、トラネキサム酸）を目的とする場合には、アルデヒドデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質として、一実施形態のトランス選択性の高い酵素、配列番号２０、３８、４０、４１、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３３、１３９、および２０７のいずれか、あるいはこれらの変異あるいは相同タンパク質を用いることが好ましい。中でも、特にトランス特異性が高い酵素、配列番号２０、４０、４１、１２７、１２８、１３０、１３１、１３３、および２０７のいずれか、あるいはこれらの変異あるいは相同タンパク質を用いることがより好ましい。シス体およびトランス体混合物を目的とするには、本発明の任意のアルデヒドデヒドロゲナーゼを用いればよい。シス体およびトランス体混合物のトランス体の比率は３０％以上、例えば４０％以上、５０％以上、６０％以上、または７０％以上であることが好ましい。

　本明細書において、トランス選択性の高い酵素（ＡＬＤＨ）とは、後述の実施例において算出される、１，４－ビス（アミノメチル）シクロヘキサン（化合物８）のシス体およびトランス体混合物を用いて行われる二段階の反応によって生成する、４－（アミノメチル）シクロヘキサン－１－カルボン酸（ＡＭＣＨＡ；目的化合物）のトランス体比率が５０％超（例えば５１％以上、５５％以上、６０％以上、６５％以上、７０％以上）の酵素を指し、中でもトランス体比率が７０％以上の酵素は、特にトランス選択性の高い酵素とする。ＡＭＣＨＡのトランス比率は、より具体的には例えば、ＡＭＣＨＡのトランス体生成量とＡＭＣＨＡのシス体生成量の合計量に対するＡＭＣＨＡのトランス体生成量の比率に１００を乗じることで算出することができる。これらのトランス特異性が高い酵素（アルデヒドデヒドロゲナーゼ）は高収率でトラネキサム酸を製造することができるため、トラネキサム酸の製造において有益であるといえる。

　各工程は別々に行ってもよく、同じ系において、同時進行に行ってもよい。その場合、各種酵素は、細胞に含まれていても、精製したタンパク質であってもよく、また、一部が細胞に含まれて、一部が精製したタンパク質であってもよい。

　上記細胞の培養は、通常の方法に従って実施できる。該細胞を培養する培地としては、該細胞が資化し得る炭素源、窒素源および無機塩類等を含有し、該細胞の培養を効率的に行える培地であれば天然培地、合成培地のいずれを用いてもよい。

　発酵法による４－（アミノメチル）シクロヘキサン－１－カルボン酸の製造方法においては、培地中に基質化合物または中間体化合物（例えば、１，４－ビス（アミノメチル）シクロヘキサン（化合物８）または１，４－シクロヘキサンジメタノール（化合物１））を添加することが望ましい。基質化合物または中間体化合物（例えば、１，４－ビス（アミノメチル）シクロヘキサン（化合物８）または１，４－シクロヘキサンジメタノール（化合物１））は、培養前の培地中に添加してもよいし、培養の途中に培養液に添加してもよい。

　また、基質化合物または中間体化合物（例えば、１，４－ビス（アミノメチル）シクロヘキサン（化合物８）または１，４－シクロヘキサンジメタノール（化合物１））を培地に添加する代わりに、基質化合物または中間体化合物（例えば、１，４－ビス（アミノメチル）シクロヘキサン（化合物８）または１，４－シクロヘキサンジメタノール（化合物１））を生成する能力を有する微生物を、上記細胞と共培養することにより、基質化合物または中間体化合物（例えば、１，４－ビス（アミノメチル）シクロヘキサン（化合物８）または１，４－シクロヘキサンジメタノール（化合物１））を供給してもよい。

　炭素源としては、該細胞が資化し得るものであればよく、例えば、グルコース、フラクトース、シュクロース、これらを含有する糖蜜、グリセロール、デンプンおよびデンプン加水分解物等の炭水化物、酢酸およびプロピオン酸等の有機酸、並びにエタノールおよびプロパノール等のアルコール類等が挙げられる。

　窒素源としては、例えば、アンモニア、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、酢酸アンモニウムおよびリン酸アンモニウム等の無機酸もしくは有機酸のアンモニウム塩、その他の含窒素化合物、並びに、ペプトン、肉エキス、酵母エキス、コーンスチープリカー、カゼイン加水分解物、大豆粕および大豆粕加水分解物、各種発酵菌体、およびその消化物等が挙げられる。

　無機塩としては、例えば、リン酸第一カリウム、リン酸第二カリウム、リン酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、硫酸銅および炭酸カルシウム等が挙げられる。

　発酵法による４－（アミノメチル）シクロヘキサン－１－カルボン酸の製造法において、酵素Ａの一つであるデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質またはアルデヒドレダクターゼ活性を有するタンパク質、酵素Ｂの一つであるアミノ基転移酵素活性を有するタンパク質またはアミンデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質、または酵素Ｃの一つであるアルデヒドデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質の基質となるピルビン酸、α－ケトグルタル酸、α－ケト酪酸、アラニン、グルタミン酸、α－アミノ酪酸、ＮＡＤ^＋、ＮＡＤＰ^＋等を培地に添加してもよい。また、４－（アミノメチル）シクロヘキサン－１－カルバルデヒドの異性化を誘導するために、２級アミン、好ましくはＬ－プロリン、ピロリジン誘導体等を培地に添加してもよい。

　また、上記の化合物を添加する代わりに、これらを生産する能力を有する微生物を、上記細胞と共培養することや、上記酵素と共発現させることにより、これらの化合物を供給してもよい。

　培養は、通常振盪培養または深部通気攪拌培養等の好気的条件下で行うことが好ましい。培養温度は１５～４０℃が好ましく、培養時間は、通常５時間～７日間である。培養中のｐＨは３．０～９．０に保持することが好ましい。ｐＨの調整は、無機または有機の酸、アルカリ溶液、尿素、炭酸カルシウム、アンモニア等を用いて行う。

　また、培養中必要に応じて、アンピシリンやカナマイシン等の抗生物質を培地に添加してもよい。プロモーターとして誘導性のプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した組換え細胞を培養するときには、必要に応じてインデューサーを培地に添加してもよい。

　例えば、ｌａｃプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養するときにはイソプロピル－β－Ｄ－チオガラクトピラノシド等を、ｔｒｐプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養するときにはインドールアクリル酸等を培地に添加してもよい。

　上記の培養により、培養物中または菌体内に中間体化合物または目的化合物（例えば、４－（アミノメチル）シクロヘキサン－１－カルボン酸）を生成させることにより、中間体化合物または目的化合物（例えば、４－（アミノメチル）シクロヘキサン－１－カルボン酸））、好ましくはトラネキサム酸を製造できる。４－（アミノメチル）シクロヘキサン－１－カルボン酸の定量は、ＬＣＭＳ（例えば、島津製作所社製の分析装置ＬＣＭＳ－８０４０）を用いて実施できる。

　該培養物中からの中間体化合物または目的化合物（例えば、４－（アミノメチル）シクロヘキサン－１－カルボン酸）の採取は通常イオン交換樹脂法、沈殿法その他の公知の方法を組み合わせることにより実施できる。なお、菌体内に中間体化合物または目的化合物（例えば、４－（アミノメチル）シクロヘキサン－１－カルボン酸））が蓄積する場合には、例えば菌体を超音波などにより破砕し、遠心分離によって菌体を除去して得られる上清からイオン交換樹脂法などによって、中間体化合物または目的化合物（例えば、４－（アミノメチル）シクロヘキサン－１－カルボン酸）を採取できる。

　［分析例］１，４－ビス（アミノメチル）シクロヘキサン、４－（アミノメチル）シクロヘキサン－１－カルバルデヒドまたは４－（アミノメチル）シクロヘキサン－１－カルボン酸の分析、定量
　実施例において、１，４－ビス（アミノメチル）シクロヘキサン、４－（アミノメチル）シクロヘキサン－１－カルバルデヒドまたは４－（アミノメチル）シクロヘキサン－１－カルボン酸の分析、定量は以下に示す手順で行った。

　酵素反応後の酵素を含む反応液、静止菌体反応後の微生物を含む反応液または培養後の微生物を含む培養液を遠心分離し、上清を回収した。該上清に含まれる１，４－ビス（アミノメチル）シクロヘキサン、４－（アミノメチル）シクロヘキサン－１－カルバルデヒドまたは４－（アミノメチル）シクロヘキサン－１－カルボン酸をＬＣＭＳ－８０４０（島津製作所製）にて分析した。下記分析条件では４－（アミノメチル）シクロヘキサン－１－カルバルデヒドおよび４－（アミノメチル）シクロヘキサン－１－カルボン酸におけるシス－トランス異性体を分離することができる。

［分析条件］
カラム：Ｄｅｖｅｌｏｓｉｌ（商標）ＯＤＳ－ＨＧ　５μｍ　２．０×１５０ｍｍ（野村化学社）
カラム温度：４０℃
移動相：
　　（移動相Ａ）５ｍｍｏｌ／Ｌヘプタフルオロ酪酸水
　　（移動相Ｂ）５ｍｍｏｌ／Ｌヘプタフルオロ酪酸アセトニトリル
移動相ＡおよびＢ混合比
　　（０～５分）１００：０
　　（５～２５分）１００：０から５０：５０
　　（２５～３０分）５０：５０
　　（３０～３１分）５０：５０から１００：０
　　（３１～３５分）１００：０
流速：０．２５ｍＬ／ｍｉｎ
検出：ポジティブモード
検出イオン：
　　（１，４－ビス（アミノメチル）シクロヘキサン）１４３．１＞６７．０ｍ／ｚ
　　（４－（アミノメチル）シクロヘキサン－１－カルバルデヒド）１４２．１ｍ／ｚ
　　（４－（アミノメチル）シクロヘキサン－１－カルボン酸）１５８．２＞９５．０ｍ／ｚ

　以下に実施例の詳細を示すが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。

［実施例１］１，４－ビス（アミノメチル）シクロヘキサンのアミノ基転移酵素活性を有するタンパク質（ＡＴ）の探索
（１）評価するＡＴの選定
　これまで、１，４－ビス（アミノメチル）シクロヘキサンのアミノ基を転移させ、４－（アミノメチル）シクロヘキサン－１－カルバルデヒドを生成させる、アミノ基転移酵素活性を有する酵素は知られていなかった。本発明者らは、非天然化合物である１，４－ビス（アミノメチル）シクロヘキサンに対するアミノ基転移酵素活性を有する酵素を探索するため、過酷な環境中で生育することのできるＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｐｕｔｉｄａ（ＡｐｐｌｉｅｄＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙａｎｄＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２０２０，１０４：７７４５－７７６６）のうち、ゲノム情報が開示されているＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｐｕｔｉｄａ　ＫＴ２４４０のゲノムにおいて、アミノトランスフェラーゼとしてアノテーションされている３３個の酵素を対象とし、アミノ基転移酵素活性を指標とした予備試験によって目的の活性を有する可能性のある酵素としてＰｐＡＴ８（配列番号１）およびＰｐＡＴ２（配列番号２）を選定した。さらに、ＰｐＡＴ８と６５％の同一性を有するホモログ酵素であるＡｅｒｏｍｏｎａｓ　ｓａｌｍｏｎｉｃｉｄａ　ｓｕｂｓｐ．　ｓａｌｍｏｎｉｃｉｄａ由来アミノトランスフェラーゼＡｓＡＴ５（配列番号３）も評価対象とした。加えて、１，４－ビス（アミノメチル）シクロヘキサンと同じく、一分子内に二つのアミノ基を有するプトレシンおよびカダベリンに対するアミノ基転移酵素活性が報告されているＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　Ｋ１２　ＭＧ１６５５由来プトレシンアミノトランスフェラーゼＰａｔＡ（ＪｏｕｒｎａｌｏｆＢａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ，２０１２，１９４，１５：４０８０－４０８８）（配列番号４）を評価対象とした。

（２）ＡＴ発現株の造成
　表１の「プライマーセット」で表される塩基配列からなるＤＮＡをプライマーセットとして、表１の「鋳型」に記載されたＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行い、各増幅ＤＮＡ断片を得た。各種染色体ＤＮＡは常法により調製した。なお、本実施例で使用した遺伝子配列はすべてＮａｔｉｏｎａｌ　Ｃｅｎｔｅｒ　ｆｏｒ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎのデータベース（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/）から取得した。また、本実施例のＰＣＲにはすべてＰｒｉｍｅＳＴＡＲ（商標）ＭＡＸ　ＤＮＡ　Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（タカラバイオ社）を用いて、説明書に従い反応を行った。

　配列番号９および１０で表される塩基配列からなるＤＮＡをプライマーセットとして、Ｔ５プロモーターおよびＮ末端Ｈｉｓタグ配列を含むプラスミドｐＱＥ８０Ｌ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を鋳型にＰＣＲを行い、約７ｋｂのベクター断片を得た。なお、配列番号９で表される塩基配列の５’末端は、配列番号１１、１３、１５および１７で表される塩基配列の５’末端に相補的な配列を含み、配列番号１０で表される塩基配列の５’末端は配列番号１２、１４、１６および１８で表される塩基配列の５’末端に相補的な配列を含む。

　上記で得られた各種増幅ＤＮＡ断片とベクター断片をＩｎ－Ｆｕｓｉｏｎ　ＨＤ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　Ｋｉｔ（タカラバイオ社製）を用いて連結することにより、各種ＡＴを発現するプラスミド、ｐＱＥ８０Ｌ－ＰｐＡＴ８（図２）、ｐＱＥ８０Ｌ－ＰｐＡＴ２、ｐＱＥ８０Ｌ－ＡｓＡＴ５およびｐＱＥ８０Ｌ－ＰａｔＡを造成した。得られたＡＴ発現プラスミドｐＱＥ８０Ｌ－ＰｐＡＴ８、ｐＱＥ８０Ｌ－ＰｐＡＴ２、ｐＱＥ８０Ｌ－ＡｓＡＴ５およびｐＱＥ８０Ｌ－ＰａｔＡを用い、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＢＬ２１（ＤＥ３）を形質転換することで、各種プラスミドを有する組換え大腸菌を造成した。

（３）ＡＴの発現および酵素精製
　上記（２）で得られた各種組換え大腸菌を、１００ｍｇ／Ｌのアンピシリンを含む２ｍＬのＬＢ培地の入った試験管に接種し３０℃で１６時間、振盪培養した。培養液を１００ｍｇ／Ｌのアンピシリンを含む４０ｍＬのＬＢ培地の入った２５０ｍＬ容三角フラスコに接種し３０℃で２時間振盪培養した後、終濃度が１ｍＭとなるようにＩｓｏｐｒｏｐｙｌ－β－Ｄ－ｔｈｉｏｇａｌａｃｔｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ（ＩＰＴＧ）を添加し、さらに３０℃で５時間振盪培養した。培養液を遠心分離して湿菌体を取得した。該湿菌体から、ＴＡＬＯＮ（商標）Ｍｅｔａｌ　Ａｆｆｉｎｉｔｙ　Ｒｅｓｉｎ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社）を用いて酵素精製を行い、Ｈｉｓタグ付加組換え型の精製酵素ＰｐＡＴ８、ＰｐＡＴ２、ＡｓＡＴ５およびＰａｔＡを取得した。

（４）１，４－ビス（アミノメチル）シクロヘキサンに対するアミノ基転移酵素活性の評価
（３）で精製した各精製酵素について、４－（アミノメチル）シクロヘキサン－１－カルバルデヒドの生成量を指標とし、各種ＡＴの酵素活性を評価した。
　上記（３）で取得した精製酵素（ＰｐＡＴ８、ＰｐＡＴ２、ＡｓＡＴ５またはＰａｔＡ）０．０７ｍｇ、５０ｍＭのＭＯＰＳ（ｐＨ７．８）、１０ｍＭの塩化マグネシウム、１ｍＭのＤｉｔｈｉｏｔｈｒｅｉｔｏｌ（ＤＴＴ）、１０ｍＭのピルビン酸、０．１ｍＭのＰｙｒｉｄｏｘａｌ　ｐｈｏｓｐｈａｔｅ（ＰＬＰ）、並びに、１０ｍＭの１，４－ビス（アミノメチル）シクロヘキサンのシス体およびトランス体混合物（トランス比率４５．７％）を含む０．１ｍＬの反応液（ｐＨ７．８）を調製し、３０℃、４００ｒｐｍの条件で２４時間反応を行った。また、ネガティブコントロールとして精製酵素液の代わりに等量のＭＯＰＳ緩衝液を添加したもの反応液についても同様に反応を行った。

　反応終了後、反応液を希釈した後、遠心分離し、上清に含まれる反応生成物および残存基質をＬＣＭＳ－８０４０にて分析した（図３）。生成物である４－（アミノメチル）シクロヘキサン－１－カルバルデヒドのトランス体またはシス体の各ピークは、その溶出位置とｍ／ｚ値より総合的に判断し、それぞれの生成量はピーク面積（Ａｒｅａ値）で示した。結果を表２に示す。

　ＰｐＡＴ８、ＰｐＡＴ２、ＡｓＡＴ５またはＰａｔＡを添加し反応させた場合にのみ、４－（アミノメチル）シクロヘキサン－１－カルバルデヒドが生成蓄積されることを確認した。このうち、ＰａｔＡは残存基質が少なく、かつ４－（アミノメチル）シクロヘキサン－１－カルバルデヒドの生成量が最も多かった。このことから、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　Ｋ１２　ＭＧ１６５５由来プトレシンアミノトランスフェラーゼＰａｔＡは、１，４－ビス（アミノメチル）シクロヘキサンに対して高いアミノ基転移酵素活性を有することが分かった。

＜ＡＴホモログの１，４－ビス（アミノメチル）シクロヘキサンに対するアミノ基転移酵素活性の評価＞
（５）データベース上でのＡＴホモログ酵素の探索
　実施例１で１，４－ビス（アミノメチル）シクロヘキサンに対する活性を有するＡＴとして得られたＰｐＡＴ８およびＰａｔＡのアミノ酸配列（配列番号５および８）をクエリーとして、Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｃｅｎｔｅｒ　ｆｏｒ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎのタンパク質配列データベースであるＢＬＡＳＴ（ｈｔｔｐｓ：／／ｂｌａｓｔ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／Ｂｌａｓｔ．ｃｇｉ）のホモロジー検索機能を用いて、各クエリー酵素と同一性４０～８５％の酵素を探索した。上記操作によって抽出された酵素のアミノ酸配列（配列番号１０３～１０７）および各酵素をコードする塩基配列（配列番号１０８～１１２）を表３に示す。

（６）ＡＴホモログ発現株の造成
　上記表３に記載の各ＡＴホモログ酵素の遺伝子断片を得るため、表４に示した鋳型、プライマー１および２を用いて、ＰＣＲ反応を行った。各種染色体ＤＮＡは常法により調製した。このとき、配列番号９で表される塩基配列の５’末端は表４の各プライマー１で表される塩基配列の５’末端に相補な塩基配列を含み、配列番号１０で表される塩基配列の５’末端は表４の各プライマー２で表される塩基配列の５’末端に相補な塩基配列を含む。

　上記ＰＣＲによって得られた増幅ＤＮＡ断片と実施例１で調製したｐＱＥ８０Ｌのベクター断片をそれぞれＩｎ－Ｆｕｓｉｏｎ（商標）ＨＤ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　Ｋｉｔ（タカラバイオ社）を用いて連結することにより、各ＡＴ発現プラスミドを造成した。得られた各発現プラスミドを用い、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＢＬ２１（ＤＥ３）を形質転換することで、各ＡＴ発現プラスミドを有する組換え大腸菌を造成した。

（７）ＡＴホモログの１，４－ビス（アミノメチル）シクロヘキサンに対するアミノ基転移酵素活性評価
　上記（６）で得た各ＡＴ発現プラスミドを有する組換え大腸菌を用いて、（３）と同様の方法でＨｉｓタグ付加組換え型の各ＡＴ精製酵素を取得した。

　取得した各精製酵素０．０７ｍｇ、５０ｍＭのＭＯＰＳ（ｐＨ７．８）、１ｍＭの塩化マグネシウム、１ｍＭのＤＴＴ、１ｍＭのピルビン酸、０．１ｍＭのＰＬＰ、および、１ｍＭの１，４－ビス（アミノメチル）シクロヘキサンのシス体およびトランス体混合物（トランス比率４５．７％）を含む０．１ｍＬの反応液（ｐＨ７．８）を調製し、３０℃、４００ｒｐｍの条件で２４時間反応を行った。また、ネガティブコントロールとして精製酵素の代わりに等量のＭＯＰＳ緩衝液を添加した反応液、ポジティブコントロールとして精製酵素ＰａｔＡを用いた反応液についても同様に反応を行った。

　反応終了後、（４）と同様の方法により反応生成物を分析した。結果を表５に示す。

　ＰｃＡＴ、ＰａＡＴおよびＨｅＡＴ１は、１，４－ビス（アミノメチル）シクロヘキサンに対するアミノ基転移酵素活性を有し、４－（アミノメチル）シクロヘキサン－１－カルバルデヒドを生成蓄積することを確認した。このうち、ＰａＡＴはＰａｔＡに匹敵する活性を有することが分かった。また、ＰｐＡＴ８のホモログについてはＰｐＡＴ８との同一性６０％以上で目的の活性を有することが示唆された。

［実施例２］４－（アミノメチル）シクロヘキサン－１－カルバルデヒドの産生工程におけるｐＨの影響
（１）アミノ基転移反応における溶液ｐＨの影響評価
　４－（アミノメチル）シクロヘキサン－１－カルボン酸の中間体である４－（アミノメチル）シクロヘキサン－１－カルバルデヒドの供給における、ｐＨ条件（ｐＨ７．０またはｐＨ９．０）の影響を評価した。

　実施例１（３）で取得したＰａｔＡ精製酵素０．０７ｍｇ、５０ｍＭのＭＯＰＳ（ｐＨ７．０）または５０ｍＭのＣＨＥＳ（ｐＨ９．０）、１ｍＭの塩化マグネシウム、１ｍＭのＤＴＴ、１ｍＭのピルビン酸、０．１ｍＭのＰＬＰ、および、反応基質として１ｍＭのシス体またはトランス体の１，４－ビス（アミノメチル）シクロヘキサンを含む０．１ｍＬの反応液を調製し、３０℃、４００ｒｐｍの条件で２４時間反応を行った。

　反応終了後、反応液の上清中に含まれる４－（アミノメチル）シクロヘキサン－１－カルバルデヒドを、ＬＣＭＳ－８０４０（島津製作所製）を用いて分析した。４－（アミノメチル）シクロヘキサン－１－カルバルデヒドのトランス比率（中間体トランス比率）は、生成された４－（アミノメチル）シクロヘキサン－１－カルバルデヒドのＡｒｅａ値に基づき、数１で示される計算式を用いて算出した。式中のトランス体はｔｒａｎｓ－４－（アミノメチル）シクロヘキサン－１－カルバルデヒドを意味し、シス体は、ｃｉｓ－４－（アミノメチル）シクロヘキサン－１－カルバルデヒドを意味する。結果を表６に示す。

　シス体またはトランス体のいずれの基質を用いた場合にも、ｐＨ７．０においては、生成される４－（アミノメチル）シクロヘキサン－１－カルバルデヒドのおよそ９５％以上が、添加した基質と同じ立体構造をとることが示された。他方、ｐＨ９．０においては、添加した基質の異性体構造をとる４－（アミノメチル）シクロヘキサン－１－カルバルデヒドが３０％以上生成された。

　この結果から、１，４－ビス（アミノメチル）シクロヘキサンのアミノ基転移反応において、反応溶液のｐＨによって生成される４－（アミノメチル）シクロヘキサン－１－カルバルデヒドの立体構造が変化することが示唆された。

　上記立体構造の変化は、（ｉ）アミノ基転移酵素の働きによるもの、（ｉｉ）アルデヒド基のケト－エノール互変異性によるもの、が考えられた。（ｉｉ）について、４－（アミノメチル）シクロヘキサン－１－カルバルデヒドはアルデヒド基を有しており、一般に、アルデヒド基は酸性あるいは塩基性触媒存在下において、ケト型とエノール型との間で相互変換することが知られている（ケト－エノール互変異性）。４－（アミノメチル）シクロヘキサン－１－カルバルデヒドのアルデヒド基がケト型からエノール型に変換されることにより、α位炭素上の水素が転移し、シクロヘキサンとの間に炭素－炭素二重結合が生成することによって、シス体とトランス体の区別がなくなると考えられる。したがって、酸あるいは塩基の存在下では、アミノ基転移酵素による反応とは独立して、４－（アミノメチル）シクロヘキサン－１－カルバルデヒドの異性化反応が起こることが予想された。そこで、上記立体構造の変化が、アミノ基転移酵素に依存するかを確認するため、以下の試験を行った。

（２）４－（アミノメチル）シクロヘキサン－１－カルバルデヒドのｐＨ依存的な異性化の評価
　上記（１）に従い、（ｉ）ｐＨ７．０の条件でＰａｔＡ精製酵素とシス体の基質を反応させることにより中間体トランス比率が２．１％となった反応液、（ｉｉ）ｐＨ７．０の条件でＰａｔＡ精製酵素とトランス体基質を反応させることにより中間体トランス比率が９５．３％となった反応液を、それぞれ調製した。Ａｍｉｃｏｎ（商標）Ｕｌｔｒａ　０．５ｍＬ，３Ｋ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製）を用いて各反応液中の酵素を除去し、フロースルー画分を回収した。各フロースルー画分１０μＬに対し、５０ｍＭの酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ０またはｐＨ５．０）、５０ｍＭのＭＥＳ緩衝液（ｐＨ６．０）、５０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．０またはｐＨ７．０）、５０ｍＭのＭＯＰＳ緩衝液（ｐＨ７．０）、５０ｍＭのＣＨＥＳ緩衝液（ｐＨ９．０または１０．０）、若しくは５０ｍＭの炭酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ９．０または１０．０）のいずれかの緩衝液を９０μＬ添加し、３０℃、４００ｒｐｍの条件で２０時間反応させた。

　また、二級アミン添加による異性化への影響を評価するため、上記組成に５０ｍＭのＬ－プロリンを添加した条件でも同様に反応を行った。反応終了後、上記（１）と同様の方法により反応生成物を分析し、中間体トランス比率を算出した。結果を表７に示す。

　表７より、シス体またはトランス体のいずれの基質を用いた場合にも、ｐＨ４～６の酸性条件下では中間体の異性化はほとんど起こらなかったが、ｐＨ７以上では中間体トランス比率に変化が見られた。特に、ｐＨ９～１０の塩基性条件下では中間体の異性化が顕著に進行した。さらに、４－（アミノメチル）シクロヘキサン－１－カルバルデヒドの異性化はトランス比率およそ６０％で平衡化することがみてとれた。

　また、プロリン添加条件においては、ｐＨ４～６ではほとんど変化が見られなかったものの、ｐＨ７では中間体の異性化が進む傾向がみられ、ｐＨ９では中間体の異性化がさらに促進されることが分かった。

　以上より、酵素の有無に関わらず、中性または塩基性条件下において４－（アミノメチル）シクロヘキサン－１－カルバルデヒドの異性化が起こることが明らかとなった。また、中性または塩基性条件下における異性化反応は、Ｌ－プロリンなどの二級アミンの共存下で促進されることが分かった。

　上記結果から、使用する基質の立体構造に合わせてｐＨ条件を変更することにより、反応生成物の立体構造パターンをコントロールできることが示唆された。

［実施例３］アルデヒドデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質（ＡＬＤＨ）の活性評価
（１）評価するＡＬＤＨの選定
　これまで、４－（アミノメチル）シクロヘキサン－１－カルバルデヒドのアルデヒド基を酸化させ、４－（アミノメチル）シクロヘキサンカルボン酸を生成させる、アルデヒドデヒドロゲナーゼ活性を有する酵素は知られていなかった。

　本発明では、実施例１の結果を踏まえ、ＰａｔＡと同じくプトレシンおよびカダベリンの代謝に関わるＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　Ｋ１２　ＭＧ１６５５由来ＮＡＤ^＋依存型ガンマ－アミノブチルアルデヒドデヒドロゲナーゼＰａｔＤ（ＦＥＢＳ　Ｌｅｔｔｅｒｓ，２００５，５７９：４１０７－４１１２）を評価対象のＡＬＤＨとして選定した。加えて、基質である４－（アミノメチル）シクロヘキサン－１－カルバルデヒドは、カサ高く極性が低いシクロヘキサン環構造を有することを踏まえ、立体構造は異なるもののカサ高く極性が低いベンゼン環構造を有する基質に対するＡＬＤＨ活性が報告されている、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｐｕｔｉｄａ　ＣＳＶ８６由来ＮＡＤ^＋依存型ベンズアルデヒドデヒドロゲナーゼＸｙｌＣ（Ａｒｃｈ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，２０１１，１９３：５５３－５６３）、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｐｕｔｉｄａ　Ｓ１２由来ＮＡＤ^＋依存型フェニルアセトアルデヒドデヒドロゲナーゼＳｔｙＤ（Ａｒｃｈｉｖｅｓ　ｏｆ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　ａｎｄ　Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃｓ，２０１７，６１６：４７－５８）およびＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｐｕｔｉｄａ　ＮＣＩＭＢ　９８６６由来ＮＡＤＰ^＋依存型４－ヒドロキシベンズアルデヒドデヒドロゲナーゼＰｃｈＡ（Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，２０１４，９８：１３４９－１３５６）を、評価対象のＡＬＤＨとして選定した。

（２）ＡＬＤＨ発現株の造成
　（１）で選定したＡＬＤＨ（ＰａｔＤ、ＸｙｌＣ、ＳｔｙＤおよびＰｃｈＡ）のアミノ酸配列を配列番号１９～２２に示す。これらの酵素をコードする塩基配列をそれぞれ配列番号２３～２６に示す。これらの酵素を発現する株は以下のように造成した。

　表８の「鋳型」に記載されたＤＮＡを鋳型として、表８の「プライマーセット」で表される塩基配列からなるＤＮＡをプライマーセットとしてＰＣＲを行い、各ＤＮＡ断片を増幅した。

　Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　Ｋ１２　ＭＧ１６５５の染色体ＤＮＡは常法により調製した。配列番号２４で表されるＤＮＡは、配列番号２０で表されるＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｐｕｔｉｄａ　ＣＳＶ８６由来ＸｙｌＣをコードする遺伝子の塩基配列であり、人工合成により調製した。配列番号２５で表されるＤＮＡは、配列番号２１で表されるＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｐｕｔｉｄａ　Ｓ１２由来のＳｔｙＤをコードする遺伝子の塩基配列であり、人工合成により調製した。配列番号２６で表されるＤＮＡは、配列番号２２で表されるＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｐｕｔｉｄａ　ＮＣＩＭＢ　９８６６由来ＰｃｈＡをコードする遺伝子の塩基配列であり、人工合成により調製した。

　配列番号９で表される塩基配列の５’末端は、配列番号２７、２９、３１および３３の５’末端に相補的な配列を含み、配列番号１０で表される塩基配列の５’末端は、配列番号２８、３０、３２および３４で表される塩基配列の５’末端に相補的な配列を含む。

　上記で得られた各種増幅ＤＮＡ断片と、実施例１で調整したｐＱＥ８０Ｌベクター断片をＩｎ－Ｆｕｓｉｏｎ　ＨＤ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　Ｋｉｔ（タカラバイオ社製）を用いて連結することにより、各種ＡＬＤＨを発現するプラスミド、ｐＱＥ８０Ｌ－ＰａｔＤ、ｐＱＥ８０Ｌ－ＸｙｌＣ、ｐＱＥ８０Ｌ－ＳｔｙＤおよびｐＱＥ８０Ｌ－ＰｃｈＡを造成した。

　上記で得られたＡＬＤＨ発現するプラスミド、ｐＱＥ８０Ｌ－ＰａｔＤ、ｐＱＥ８０Ｌ－ＸｙｌＣ、ｐＱＥ８０Ｌ－ＳｔｙＤおよびｐＱＥ８０Ｌ－ＰｃｈＡを用い、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＢＬ２１（ＤＥ３）を形質転換することで、各種プラスミドを有する大腸菌を造成した。

（３）ＡＬＤＨの発現および酵素精製
　上記（２）で得られた菌株を用いて、実施例１と同様の方法により湿菌体を取得し酵素精製を行うことで、Ｈｉｓタグ付加組換え型の精製酵素ＰａｔＤ、ＸｙｌＣ、ＳｔｙＤおよびＰｃｈＡを取得した。

（４）ＡＴとの組み合わせ反応によるＡＬＤＨの４－（アミノメチル）シクロヘキサン－１－カルボン酸の生産性評価
＜ＡＬＤＨの補酵素としてＮＡＤ^＋を用いた場合＞
　上記（３）で取得した精製酵素（ＰａｔＤ、ＸｙｌＣ、ＳｔｙＤおよびＰｃｈＡ）０．０７ｍｇ、実施例１（３）で取得したＰａｔＡ　０．０７ｍｇ、５０ｍＭのＭＯＰＳ（ｐＨ７．８）、１ｍＭの塩化マグネシウム、１ｍＭのＤＴＴ、１ｍＭのピルビン酸、０．１ｍＭのＰＬＰ、２ｍＭのニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ^＋）、および、１ｍＭの１，４－ビス（アミノメチル）シクロヘキサンのシス体およびトランス体混合物（トランス比率４５．７％）を含む０．１ｍＬの反応液（ｐＨ７．８）を調製し、３０℃、４００ｒｐｍの条件で２４時間反応を行った。また、ネガティブコントロールとして精製酵素の代わりに等量のＭＯＰＳ緩衝液を添加した反応液についても同様に反応を行った。

　反応終了後、実施例１と同様の方法により反応生成物を分析した。また、生成される４－（アミノメチル）シクロヘキサン－１－カルボン酸について、トラネキサム酸（ＴＸＡ）またはシス－ＴＸＡを選択的に生成可能か確認するため、ＴＸＡおよびｃｉｓ－ＴＸＡの生成量に基づき、下記の数２で示される計算式を用いて４－（アミノメチル）シクロヘキサン－１－カルボン酸のトランス比率（ＡＭＣＨＡトランス比率、ＡＭＣＨＡトランス率ともいう）を算出した。なお、各化合物の濃度（ｍＭ）は、濃度既知の標品のＡｒｅａ値との比較により算出した。

　まず、基質として１，４－ビス（アミノメチル）シクロヘキサンのシス体およびトランス体混合物（トランス比率４５．７％）を用いた場合の結果を表９に示す。

　表９より、ＰａｔＡおよび、ＰａｔＤ、ＸｙｌＣまたはＳｔｙＤを組合せることで、１，４－ビス（アミノメチル）シクロヘキサンを基質として４－（アミノメチル）シクロヘキサン－１－カルボン酸を生成蓄積できることが分かった。

　また、基質はシス体およびトランス体混合物を用いたため、生成物である４－（アミノメチル）シクロヘキサン－１－カルボン酸もシス体とトランス体の混合物となることが予想されたが、実際には、ＡＬＤＨの種類によって生成される４－（アミノメチル）シクロヘキサンカルボン酸のトランス比率が異なる結果となった。この結果から、ＡＬＤＨには基質選択性があることが示唆された。特に、ＸｙｌＣを用いた場合に４－（アミノメチル）シクロヘキサンカルボン酸のトランス比率が大きく、トランス体の４－（アミノメチル）シクロヘキサン－１－カルバルデヒドに対し選択的に反応できることが示された。したがって、シス体およびトランス体混合物の基質からＴＸＡを効率的に生成しようとした場合には、ＸｙｌＣが有用なＡＬＤＨであるといえる。

　次に、基質として１，４－ビス（アミノメチル）シクロヘキサンのトランス体のみを用いた場合の結果を表１０に示す。

　表１０の結果より、トランス体を基質として用いた場合、いずれのＡＬＤＨにおいてもＴＸＡの生成は確認できたものの、シス－ＴＸＡはほとんど検出されなかった。したがって、トランス体の基質を用いた場合には、ここで見出したいずれのＡＬＤＨにおいても高収率でＴＸＡを生成できることから、ＴＸＡ生産においては基質としてトランス体またはトランス体を多く含む基質の使用が望ましいことが示された。また、これらのＡＬＤＨはトランス体の基質を受け入れることができることがわかった。

　続いて、１，４－ビス（アミノメチル）シクロヘキサンのシス体のみを基質として用いた場合の４－（アミノメチル）シクロヘキサンカルボン酸の生成量を評価した。

　上述と同様に取得した精製酵素ＰａｔＡおよび各種ＡＬＤＨ（ＰａｔＤ、ＸｙｌＣまたはＳｔｙＤ）をそれぞれ０．０７ｍｇ、５０ｍＭのＭＯＰＳ（ｐＨ７．８）、１０ｍＭの塩化マグネシウム、１ｍＭのＤＴＴ、１０ｍＭのピルビン酸、０．１ｍＭのＰＬＰ、２ｍＭのＮＡＤ^＋、および、１０ｍＭのシス体の１，４－ビス（アミノメチル）シクロヘキサンを含む０．１ｍＬの反応液を調製し、３０℃、４００ｒｐｍの条件で２４時間反応を行った。結果を表１１に示す。

　表１１より、シス体を基質として用いた場合は、いずれのＡＬＤＨにおいても生成されるシス－ＴＸＡの割合が高くなることが分かった。また、ＸｙｌＣではシス－ＴＸＡの生産量が少ないことから、ＸｙｌＣはシス体基質を受け入れにくいことがわかった。

　このうち、ＸｙｌＣを用いた場合のみ比較的高い割合でＴＸＡが生成された。これは、本反応をｐＨ７．８の弱塩基性条件で実施したため、実施例２で示した塩基性条件下での中間体の異性化が生じ、シス体の基質を添加した場合であってもトランス体の中間体が生成され、結果としてＴＸＡが多く蓄積されたものと推察される。このことから、ＴＸＡの生産を目的とする場合、ＡＬＤＨとしてＸｙｌＣを用いることでトランス体の中間体を選択的に酸化しＴＸＡを生成すると同時に、残存しているシス体の中間体を中性または塩基性条件下で動的にトランス体へ異性化することにより、シス体およびトランス体混合物の基質を用いた場合であっても、理論上１００％のＴＸＡを生成可能であることが示唆された。

＜ＡＬＤＨの補酵素としてＮＡＤＰ^＋を用いた場合＞
　上記表６の結果においてＡＬＤＨ活性が確認できなかったＰｃｈＡは、補酵素としてＮＡＤＰ^＋を利用することが知られている（Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，２０１４，９８：１３４９－１３５６）。そこで、上記（３）で取得した精製酵素ＰｃｈＡ、また比較対象としてＸｙｌＣを用い、補酵素としてＮＡＤＰ^＋を用いた場合の４－（アミノメチル）シクロヘキサン－１－カルバルデヒドのアルデヒド酸化活性を評価した。

　上記の反応液組成のうちＮＡＤ^＋に代替して１ｍＭのＮＡＤＰ^＋を添加した反応液を調製し、上記と同様の反応を行った。基質としてはシス体およびトランス体混合物（トランス比率４５．７％）を使用した。また、ネガティブコントロールとして精製酵素の代わりに等量のＭＯＰＳ緩衝液を添加した反応液についても同様に反応を行った。

　反応終了後、上述と同様の方法により反応生成物を分析した。結果を表１２に示す。

　表１２より、ＰｃｈＡは補酵素としてＮＡＤＰ^＋を添加することで４－（アミノメチル）シクロヘキサン－１－カルボン酸を生成することが可能であることを確認した。また、ＸｙｌＣはＮＡＤ^＋依存的な酵素として知られているが、４－（アミノメチル）シクロヘキサン－１－カルボン酸生産においてはＮＡＤＰ^＋も補酵素として利用可能であることがわかった。

［実施例４］ＡＬＤＨホモログを用いた４－（アミノメチル）シクロヘキサンカルボン酸の生産
（１）データベース上でのＡＬＤＨホモログ酵素の探索
　実施例３で４－（アミノメチル）シクロヘキサン－１－カルボン酸生成が可能なＡＬＤＨとして取得したＰａｔＤ、ＸｙｌＣおよびＳｔｙＤのアミノ酸配列（配列番号１９～２１）をクエリーとして、Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｃｅｎｔｅｒ　ｆｏｒ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎのタンパク質配列データベースであるＢＬＡＳＴ（ｈｔｔｐｓ：／／ｂｌａｓｔ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／Ｂｌａｓｔ．ｃｇｉ）のホモロジー検索機能を用いて、各酵素と同一性５０～８０％の酵素を探索した。上記操作によって抽出された酵素のアミノ酸配列（配列番号３５～４６）および各酵素をコードする塩基配列（配列番号４７～５８）を表１３に示す。表１３中、ＣｋｐａｔＤ、ＳｅｐａｔＤ、ＣｓｐａｔＤおよびＰｐｐａｔＤはいずれもガンマ－アミノブチルアルデヒドデヒドロゲナーゼとアノテーションされているタンパク質である。ＳｓＢＤ、ＨａＢＤおよびＲｒＡＤはベンズアルデヒドデヒドロゲナーゼとアノテーションされているタンパク質である。ＰｍｓＬＡＤはフェニルアセトアルデヒドデヒドロゲナーゼとアノテーションされているタンパク質である。その他はアルデヒドデヒドロゲナーゼまたはそのファミリータンパク質とアノテーションされているタンパク質である。

（２）ＡＬＤＨホモログ発現株の造成
　上記表１３に記載の各ＡＬＤＨホモログ酵素の遺伝子断片を得るため、表１４に示した鋳型、プライマー１および２を用いて、ＰＣＲ反応を行った。

　各種染色体ＤＮＡは常法により調製した。配列番号４７で表されるＤＮＡは、配列番号３５で表されるＣｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ　ｋｏｓｅｒｉ　ＡＴＣＣ　ＢＡＡ－８９５株由来ＡＬＤＨをコードする遺伝子の塩基配列を、大腸菌で発現させるためにコドン最適化したＤＮＡであり、人工合成により調製した。配列番号４８で表されるＤＮＡは、配列番号３６で表されるＳａｌｍｏｎｅｌｌａ　ｅｎｔｅｒｉｃａ　ｓｕｂｓｐ．ｅｎｔｅｒｉｃａ　ｓｅｒｏｖａｒ　Ｃｈｏｌｅｒａｅｓｕｉｓ　ｓｔｒ．ＳＣ－Ｂ６７株由来ＡＬＤＨをコードする遺伝子の塩基配列を、大腸菌で発現させるためにコドン最適化したＤＮＡであり、人工合成により調製した。配列番号４９で表されるＤＮＡは、配列番号３７で表されるＰｅｃｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ａｔｒｏｓｅｐｔｉｃｕｍ　ＳＣＲＩ１０４３株由来ＡＬＤＨをコードする遺伝子の塩基配列を、大腸菌で発現させるためにコドン最適化したＤＮＡであり、人工合成により調製した。配列番号５２で表されるＤＮＡは、配列番号４０で表されるＨａｌｉｏｘｅｎｏｐｈｉｌｕｓ　ａｒｏｍａｔｉｃｉｖｏｒａｎｓ株由来ＡＬＤＨをコードする遺伝子の塩基配列を、大腸菌で発現させるためにコドン最適化したＤＮＡであり、人工合成により調製した。配列番号５３で表されるＤＮＡは、配列番号４１で表されるＳｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ　ｓｐ．ＴＦ３株由来ＡＬＤＨをコードする遺伝子の塩基配列を、大腸菌で発現させるためにコドン最適化したＤＮＡであり、人工合成により調製した。配列番号５６で表されるＤＮＡは、配列番号４４で表されるＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｓｐ．ＬＱ２６株由来ＡＬＤＨをコードする遺伝子の塩基配列を、大腸菌で発現させるためにコドン最適化したＤＮＡであり、人工合成により調製した。配列番号５７で表されるＤＮＡは、配列番号４５で表されるＢｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ　ｌａｔａ株由来ＡＬＤＨをコードする遺伝子の塩基配列を、大腸菌で発現させるためにコドン最適化したＤＮＡであり、人工合成により調製した。配列番号５８で表されるＤＮＡは、配列番号４６で表されるＰａｒａｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ　ｓｐ．５Ｎ株由来ＡＬＤＨをコードする遺伝子の塩基配列を、大腸菌で発現させるためにコドン最適化したＤＮＡであり、人工合成により調製した。

　このとき、配列番号９および表１４の各プライマー１で表される塩基配列、配列番号１０および表１４の各プライマー２で表される塩基配列は、それぞれの５’末端に相補な塩基配列を含む。すなわち、配列番号９で表される塩基配列の５’末端は表１４の各プライマー１で表される塩基配列の５’末端に相補な塩基配列を含み、配列番号１０で表される塩基配列の５’末端は表１４の各プライマー２で表される塩基配列の５’末端に相補な塩基配列を含む。

　上記ＰＣＲによって得られた増幅ＤＮＡ断片と実施例１で調製したｐＱＥ８０Ｌのベクター断片をそれぞれＩｎ－Ｆｕｓｉｏｎ（商標）ＨＤ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　Ｋｉｔ（タカラバイオ社）を用いて連結することにより、各ＡＬＤＨ発現プラスミドを造成した。

　上記で得られた各発現プラスミドを用い、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＢＬ２１（ＤＥ３）を形質転換することで、各ＡＬＤＨ発現プラスミドを有する大腸菌を造成した。

（３）ＡＬＤＨホモログの４－（アミノメチル）シクロヘキサンカルボン酸の生産性評価
　上記（２）で得た各ＡＬＤＨ発現プラスミドを有する大腸菌を用いて、実施例１と同様の方法でＨｉｓタグ付加組換え型の各ＡＬＤＨ精製酵素を取得した。

　取得した精製酵素０．０７ｍｇ、実施例１で取得したＰａｔＡ　０．０７ｍｇ、５０ｍＭのＭＯＰＳ（ｐＨ７．８）、１ｍＭの塩化マグネシウム、１ｍＭのＤＴＴ、１ｍＭのピルビン酸、０．１ｍＭのＰＬＰ、１ｍＭのＮＡＤ^＋、および、１ｍＭの１，４－ビス（アミノメチル）シクロヘキサンのシス体およびトランス体混合物（トランス比率４５．７％）を含む０．１ｍＬの反応液（ｐＨ７．８）を調製し、３０℃、４００ｒｐｍの条件で２４時間反応を行った。また、ネガティブコントロールとして精製酵素の代わりに等量のＭＯＰＳ緩衝液を添加した反応液、ポジティブコントロールとして精製酵素ＸｙｌＣを用いた反応液についても同様に反応を行った。

　反応終了後、実施例１と同様の方法により反応生成物を分析した。結果を表１５に示す。

　表１５より、ＰａｔＤ、ＸｙｌＣまたはＳｔｙＤとの同一性が約６０％以上のＡＬＤＨを使用した場合も、４－（アミノメチル）シクロヘキサン－１－カルボン酸を生成可能であることが分かった。また、ＣｓｐａｔＤ、ＨａＢＤ、またはＳｓＢＤを用いた場合は、生成した４－（アミノメチル）シクロヘキサン－１－カルボン酸のトランス比率が５０％よりも大きく、これらの酵素はトランス特異性が高い酵素であることが分かった。特に、ＸｙｌＣとの同一性が７０％以上のＨａＢＤまたはＳｓＢＤを用いた場合は、生成した４－（アミノメチル）シクロヘキサン－１－カルボン酸のトランス比率が７０％以上であり、これらの酵素はＸｙｌＣと同様に特にトランス選択的に反応する、すなわち、高いトランスを有することが分かった。

［実施例５］補酵素再生系の導入によるＴＸＡ生産性評価
（１）アラニンデヒドロゲナーゼ（ＡｌａＤＨ）発現株の造成
　配列番号１２３で表されるＢａｃｉｌｌｕｓ　ｓｕｂｔｉｌｉｓ　１６８由来アラニンデヒドロゲナーゼをコードするＢｓＡｌａＤＨの遺伝子断片を得るため、常法により調製したＢａｃｉｌｌｕｓ　ｓｕｂｔｉｌｉｓ　１６８の染色体ＤＮＡを鋳型として、配列番号８３および８４で表される塩基配列であるオリゴヌクレオチドをプライマーセットとして用いてＰＣＲ反応を行い、配列番号１２４で表されるＢｓＡｌａＤＨ遺伝子断片を得た。配列番号９で表される塩基配列の５’末端は配列番号８３で表される塩基配列の５’末端に相補的な配列を含み、配列番号１０で表される塩基配列の５’末端は配列番号８４で表される塩基配列の５’末端に相補的な配列を含む。

　上記ＰＣＲによって得られたＢｓＡｌａＤＨ断片と実施例１で調製したｐＱＥ８０Ｌのベクター断片をそれぞれＩｎ－Ｆｕｓｉｏｎ（商標）ＨＤ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　Ｋｉｔ（タカラバイオ社）を用いて連結することにより、発現プラスミドｐＱＥ８０Ｌ－ＢｓＡｌａＤＨを得た。

　上記で得られた発現プラスミドを用いてＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＢＬ２１（ＤＥ３）を形質転換し、ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＱＥ８０Ｌ－ＢｓＡｌａＤＨを得た。

（２）ＮＡＤＨオキシダーゼ（ＮＯＸ）発現株の造成
　配列番号１２５で表されるＢａｃｉｌｌｕｓ　ｓｕｂｔｉｌｉｓ　１６８由来ＮＡＤＨオキシダーゼをコードする、ＢｓＮＯＸの遺伝子断片を得るため、Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｕｂｔｉｌｉｓ　１６８の染色体ＤＮＡを鋳型として、配列番号８５および８６で表される塩基配列であるオリゴヌクレオチドをプライマーセットとして用いて、ＰＣＲ反応を行い、配列番号１２６で表されるＢｓＮＯＸ遺伝子断片を得た。配列番号９で表される塩基配列の５’末端は配列番号８５で表される塩基配列の５’末端に相補的な配列を含み、配列番号１０で表される塩基配列の５’末端は配列番号８６で表される塩基配列の５’末端に相補的な配列を含む。

　上記ＰＣＲによって得られたＢｓＮＯＸ遺伝子断片と実施例１で調製したｐＱＥ８０Ｌのベクター断片をそれぞれＩｎ－Ｆｕｓｉｏｎ（商標）ＨＤ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　Ｋｉｔ（タカラバイオ社）を用いて５連結することにより、発現プラスミドｐＱＥ８０Ｌ－ＢｓＮＯＸを得た。

　上記で得られた発現プラスミドを用いてＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＢＬ２１（ＤＥ３）を形質転換し、ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＱＥ８０Ｌ－ＢｓＮＯＸを得た。

（３）ＢｓＡｌａＤＨおよびＢｓＮＯＸの発現および酵素精製
　上記で得られたＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＱＥ８０Ｌ－ＢｓＡｌａＤＨおよびＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＱＥ８０Ｌ－ＢｓＮＯＸを用いて、実施例１と同様の方法でＨｉｓタグ付加組換え型の酵素精製ＢｓＡｌａＤＨおよびＢｓＮＯＸを取得した。

（４）ＡｌａＤＨおよびＮＯＸを導入したＴＸＡ生成活性評価
　実施例１で取得したＰａｔＡ　０．０７ｍｇ、実施例２で取得したＸｙｌＣ　０．０７ｍｇ、上記（３）で取得したＢｓＡｌａＤＨ　０．０７ｍｇ、ＢｓＮＯＸ　０．０７ｍｇ、５０ｍＭのＭＯＰＳ（ｐＨ７．８）、１ｍＭの塩化マグネシウム、１ｍＭのＤＴＴ、１ｍＭのピルビン酸、０．１ｍＭのＰＬＰ、２ｍＭ　ＮＡＤ^＋、並びに、１ｍＭの１，４－ビス（アミノメチル）シクロヘキサンのシス体およびトランス体混合物（トランス比率４５．７％）を含む０．１ｍＬの反応液（ｐＨ７．８）を調製し、３０℃で４００ｒｐｍの条件で２４時間反応を行った。

　反応終了後、実施例１と同様の方法により反応生成物および残存基質を分析した。結果を表１６に示す。

　表１６より、補酵素再生系のＢｓＡｌａＤＨとＢｓＮＯＸを導入した場合に、基質消費が進み、４－（アミノメチル）シクロヘキサン－１－カルボン酸の生産性が向上した。

［実施例６］ＡＴ発現株およびＡＬＤＨ発現株を用いた静止菌体反応による４－（アミノメチル）シクロヘキサン－１－カルボン酸生産
　実施例１で造成したＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＱＥ８０Ｌ－ＰａｔＡ株およびＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＱＥ８０Ｌ－ＸｙｌＣ株について、実施例１（２）と同様の方法で湿菌体を取得した。該湿菌体に終濃度１０ｍＬ／Ｌとなるようキシレンを添加し、３０℃で８５０ｒｐｍのもと３０分間の膜処理を行った。

　５０ｇ／Ｌの各膜処理後湿菌体、５０ｍＭ　ＭＯＰＳ（ｐＨ７．８）、３５０ｍＭのグルコース、５０ｍＭの１，４－ビス（アミノメチル）シクロヘキサンのシス体およびトランス体混合物（トランス比率４５．７％）、５０ｍＭの塩化マグネシウム、並びに、５０ｍＭのＮＡＤ^＋を含有する０．４ｍＬの反応液を調製し、３０℃、８５０ｒｐｍの条件下で２４時間反応を行った。

　反応終了後、実施例１と同様の方法により反応生成物を分析した。その結果、３．９ｍＭのＴＸＡおよび２．８ｍＭのｃｉｓ－ＴＸＡの生成蓄積を確認した。したがって、ＡＴとＡＬＤＨをそれぞれ発現する微生物菌体を用いた静止菌体反応によっても、４－（アミノメチル）シクロヘキサンカルボン酸を生成できることを確認した。

［実施例７］ＡＴおよびＡＬＤＨ共発現株を用いた静止菌体反応による４－（アミノメチル）シクロヘキサン－１－カルボン酸生産
（１）ＡＴおよびＡＬＤＨの共発現株の造成
ア）ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＥＴ２８ａ－ＰａｔＡ－ＸｙｌＣ株の造成
　Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　Ｋ１２　ＭＧ１６５５の染色体ＤＮＡを鋳型として、配列番号８９および９０で表される塩基配列であるオリゴヌクレオチドをプライマーセットとして用いてＰＣＲ反応を行い、ＰａｔＡ断片を得た。続いて、配列番号２４で表される塩基配列を鋳型として、配列番号９１および９２で表される塩基配列であるオリゴヌクレオチドをプライマーセットとして用いてＰＣＲ反応を行い、ＸｙｌＣ断片を得た。なお、配列番号９０で表される塩基配列の５’末端は、配列番号９１で表される塩基配列の５’末端に相補的な配列を含む。

　上記得られたＰａｔＡ断片およびＸｙｌＣ断片を混合したものを鋳型として、配列番号８９および９２で表される塩基配列であるオリゴヌクレオチドをプライマーセットとして用いてＰＣＲ反応を行い、２断片を連結したＤＮＡ（以下、ＰａｔＡ－ＸｙｌＣという。）断片を得た。

　さらに、配列番号８７および８８で表される塩基配列からなるＤＮＡをプライマーセットとして、発現ベクターｐＥＴ２８ａ（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）を鋳型にＰＣＲ反応を行い、約５．２ｋｂのベクター断片を得た。なお、配列番号８７で表される塩基配列の５’末端は配列番号８９で表される塩基配列の５’末端に相補的な配列を含み、配列番号８８で表される塩基配列の５’末端は配列番号９２で表される塩基配列の５’末端に相補的な配列を含む。

　上記で得られたＰａｔＡ－ＸｙｌＣ断片とベクター断片を、をＩｎ－Ｆｕｓｉｏｎ（商標）ＨＤ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　Ｋｉｔ（タカラバイオ社）を用いて連結することにより、発現プラスミドｐＥＴ２８ａ－ＰａｔＡ－ＸｙｌＣを得た（図４）。

　上記で得られた発現プラスミドでＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＢＬ２１（ＤＥ３）を形質転換し、ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＥＴ２８ａ－ＰａｔＡ－ＸｙｌＣ株を得た。

イ）ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＥＴ２８ａ－ＸｙｌＣ－ＰａｔＡの造成
　配列番号２４で表される塩基配列を鋳型として、配列番号９３および９４で表される塩基配列であるオリゴヌクレオチドをプライマーセットとして用いてＰＣＲ反応を行い、ＸｙｌＣ断片を得た。Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　Ｋ１２　ＭＧ１６５５の染色体ＤＮＡを鋳型として、配列番号９５および９６で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドをプライマーセットとして用いてＰＣＲ反応を行い、ＰａｔＡ断片を得た。なお、配列番号９４で表される塩基配列の５’末端は配列番号９５で表される塩基配列の５’末端に相補的な配列を含む。

　上記で得られたＸｙｌＣ断片およびＰａｔＡ断片を混合したものを鋳型として、配列番号９３および９６で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドをプライマーセットとして用いてＰＣＲ反応を行い、２断片を連結したＤＮＡ（以下、ＸｙｌＣ－ＰａｔＡという。）断片を得た。なお、配列番号８７で表される塩基配列の５’末端は配列番号９３の５’末端に相補的な配列を含み、配列番号８８で表される塩基配列の５’末端は配列番号９６で表される塩基配列の５’末端に相補的な配列を含む。

　上記で得られたＸｙｌＣ－ＰａｔＡ断片と、上記ア）で得たベクター断片を、Ｉｎ－Ｆｕｓｉｏｎ（商標）ＨＤ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　Ｋｉｔ（タカラバイオ社）を用いて連結することにより、発現プラスミドｐＥＴ２８ａ－ＸｙｌＣ－ＰａｔＡを得た。

　上記で得られた発現プラスミドを用いてＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＢＬ２１（ＤＥ３）を形質転換し、ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＥＴ２８ａ－ＸｙｌＣ－ＰａｔＡ株を得た。

ウ）ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＵＣ１９－ＰａｔＡ－ＸｙｌＣ株の造成
　Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　Ｋ１２　ＭＧ１６５５の染色体ＤＮＡを鋳型として、配列番号９９および９０で表される塩基配列であるオリゴヌクレオチドをプライマーセットとして用いて、ＰＣＲ反応を行い、ＰａｔＡ断片を得た。続いて、配列番号２４で表される塩基配列を鋳型として、配列番号９１および１００で表される塩基配列であるオリゴヌクレオチドをプライマーセットとして用いてＰＣＲ反応を行い、ＸｙｌＣ断片を得た。なお、配列番号９０で表される塩基配列の５’末端は配列番号９１で表される塩基配列の５’末端に相補的な配列を含む。

　上記で得られたＰａｔＡ断片およびＸｙｌＣ断片を混合したものを鋳型として、配列番号９９および１００で表される塩基配列からなるＤＮＡをプライマーセットとして用いてＰＣＲ反応を行い、２断片を連結したＤＮＡ（以下、ＰａｔＡ－ＸｙｌＣという。）断片を得た。

　配列番号９７および９８で表される塩基配列からなるＤＮＡをプライマーセットとして、発現ベクターｐＵＣ１９（ニッポンジーン社製）を鋳型にＰＣＲ反応を行い、約２．６ｋｂのベクター断片を得た。なお、配列番号９７で表される塩基配列の５’末端は配列番号９９で表される塩基配列の５’末端に相補的な配列を含み、配列番号９８で表される塩基配列の５’末端は配列番号１００で表される塩基配列の５’末端に相補的な配列を含む。

　上記で得られたＰａｔＡ－ＸｙｌＣ断片とベクター断片を、Ｉｎ－Ｆｕｓｉｏｎ（商標）ＨＤ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　Ｋｉｔ（タカラバイオ社）を用いて連結することにより、発現プラスミドｐＵＣ１９－ＰａｔＡ－ＸｙｌＣを得た。

　上記で得られた発現プラスミドでＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＢＬ２１（ＤＥ３）を形質転換し、ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＵＣ１９－ＰａｔＡ－ＸｙｌＣ株を得た。

エ）ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＵＣ１９－ＸｙｌＣ－ＰａｔＡ株の造成
　配列番号２４で表されるＤＮＡを鋳型として、配列番号１０１および９４で表される塩基配列であるオリゴヌクレオチドをプライマーセットとして用いてＰＣＲ反応を行い、ＸｙｌＣ断片を得た。続いてＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　Ｋ１２　ＭＧ１６５５の染色体ＤＮＡを鋳型として、配列番号９５および１０２で表される塩基配列であるオリゴヌクレオチドをプライマーセットとして用いてＰＣＲ反応を行い、ＰａｔＡ断片を得た。なお、配列番号９４で表される塩基配列の５’末端は配列番号９５で表される塩基配列の５’末端に相補的な配列を含む。

　上記で得られたＸｙｌＣ断片およびＰａｔＡ遺伝子断片を混合したものを鋳型として、配列番号１０１および１０２で表される塩基配列であるオリゴヌクレオチドをプライマーセットとして用いてＰＣＲ反応を行い、２断片を連結したＤＮＡ（以下、ＸｙｌＣ－ＰａｔＡという。）断片を得た。なお、配列番号９７で表される塩基配列の５’末端は配列番号１０１で表される塩基配列の５’末端に相補的な配列を含み、配列番号９８で表される塩基配列の５’末端は配列番号１０２で表される塩基配列の５’末端に相補的な配列を含む。

　上記で得られたＸｙｌＣ－ＰａｔＡ断片と、上記ウ）で得たｐＵＣ１９のベクター断片を、Ｉｎ－Ｆｕｓｉｏｎ（商標）ＨＤ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　Ｋｉｔ（タカラバイオ社）にて連結することにより、発現プラスミドｐＵＣ１９－ＸｙｌＣ－ＰａｔＡを得た。

　上記で得られた発現プラスミドを用いてＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＢＬ２１（ＤＥ３）を形質転換し、ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＵＣ１９－ＸｙｌＣ－ＰａｔＡ株を得た。

（２）ＡＴおよびＡＬＤＨの共発現株を用いた菌体反応
　上記（１）で造成したＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＥＴ２８ａ－ＰａｔＡ－ＸｙｌＣ株、ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＥＴ２８ａ－ＸｙｌＣ－ＰａｔＡ株、ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＵＣ１９－ＰａｔＡ－ＸｙｌＣ株およびＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＵＣ１９－ＸｙｌＣ－ＰａｔＡ株、および、ネガティブコントロールとしてＢＬ２１（ＤＥ３）株を用い、静止菌体反応による４－（アミノメチル）シクロヘキサン－１－カルボン酸の生産性を評価した。

　各菌株を３０ｍｇ／Ｌのカナマイシンまたは１００ｍｇ／Ｌのアンピシリンを含む２ｍＬのＬＢ培地の入った試験管に接種し、３０℃で１６時間、振盪培養した。該培養液を３０ｍｇ／Ｌのカナマイシンまたは１００ｍｇ／Ｌのアンピシリンを含む４０ｍＬのＬＢ培地の入った２５０ｍＬ容三角フラスコに接種し３０℃で２時間振盪培養した後、終濃度が１ｍＭとなるようにＩＰＴＧを添加し、さらに３７℃で５時間振盪培養した。またコントロールとしてＢＬ２１（ＤＥ３）をカナマイシンおよびアンピシリンを含まない培地で同様に培養した。

　培養後の該培養液を遠心分離して湿菌体を取得した。該湿菌体に終濃度１０ｍＬ／Ｌとなるようキシレンを添加し、３０℃で８５０ｒｐｍのもと３０分間の膜処理を行った。

　１００ｇ／Ｌの上記膜処理後湿菌体、５０ｍＭ　ＭＯＰＳ（ｐＨ７．８）、３５０ｍＭのグルコース、５０ｍＭの１，４－ビス（アミノメチル）シクロヘキサンのシス体およびトランス体混合物（トランス比率４５．７％）、５０ｍＭの塩化マグネシウム、並びに、５０ｍＭのＮＡＤ^＋を含有する０．４ｍＬの反応液を調製し、３０℃、８５０ｒｐｍの条件下で２４時間反応を行った。

　反応終了後、実施例１と同様の方法により反応生成物を分析した。結果を表１７示す。

　表１７より、ＰａｔＡおよびＸｙｌＣを共発現させた菌株を用いた静止菌体反応によっても、４－（アミノメチル）シクロヘキサン－１－カルボン酸を生成できることを確認した。

　いて、上記反応液からＮＡＤ^＋を除いた場合の４－（アミノメチル）シクロヘキサン－１－カルボン酸の生産性を評価した。反応条件は上記に従った。結果を表１８に示す。

　反応液からＮＡＤ^＋を除いた場合、４－（アミノメチル）シクロヘキサン－１－カルボン酸の生成量が減少した。このことから、静止菌体反応による４－（アミノメチル）シクロヘキサン－１－カルボン酸の生産において、補酵素の供給が重要であることが示唆された。

［実施例８］ＡＴおよびＡＬＤＨの共発現株を用いた添加培養による４－（アミノメチル）シクロヘキサン－１－カルボン酸生産
　実施例７で造成したＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＵＣ１９－ＰａｔＡ－ＸｙｌＣ株、ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＵＣ１９－ＸｙｌＣ－ＰａｔＡ株、および、ネガティブコントロールとしてＢＬ２１（ＤＥ３）株を用い、添加培養法による４－（アミノメチル）シクロヘキサン－１－カルボン酸の生産性を評価した。

　各菌株を１００ｍｇ／Ｌのアンピシリンを含む２ｍＬのＬＢ培地の入った試験管に接種し、３０℃で１６時間、振盪培養した。ＢＬ２１（ＤＥ３）株はアンピシリンを含まない培地で同様に培養した。該培養液を３０ｍｇ／Ｌの１００ｍｇ／Ｌのアンピシリンを含む４ｍＬのＬＢ培地の入った大試験管に接種し、３０℃で５時間培養した後、終濃度が１ｍＭのＩＰＴＧおよび１ｇ／Ｌの１，４－ビス（アミノメチル）シクロヘキサンのシス体およびトランス体混合物（トランス比率４５．７％）を添加し、さらに３７℃で２４時間培養した。

　培養終了後、実施例１と同様の方法により反応生成物を分析した。結果を表１９に示す。

　表１９より、添加培養法によっても、ＴＸＡを生成できることを確認した。

［実施例９］ＡＬＤＨホモログを用いた４－（アミノメチル）シクロヘキサンカルボン酸の生産
（１）ＡＬＤＨホモログ酵素の探索
　実施例３でトランス体基質に高い選択性を有するＡＬＤＨであるＸｙｌＣのアミノ酸配列（配列番号２０）をクエリーとして、Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｃｅｎｔｅｒ　ｆｏｒ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎのタンパク質配列データベースであるＢＬＡＳＴ（ｈｔｔｐｓ：／／ｂｌａｓｔ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／Ｂｌａｓｔ．ｃｇｉ）のホモロジー検索機能を用いて、ＸｙｌＣと同一性５０％以上であり、かつ検索結果におけるホモログ酵素同士の同一性が９０％未満のものを選択した。上記操作によって抽出された酵素のアミノ酸配列（配列番号１２７～１３９）を表２０に示す。

　表２０のＡＬＤＨホモログ１～１１および１３はいずれもベンズアルデヒドデヒドロゲナーゼ、ＡＬＤＨホモログ１２はアルデヒドデヒドロゲナーゼファミリータンパク質とアノテーションされているタンパク質である。

（２）ＡＬＤＨホモログ発現株の造成
　上記表２０に記載の各ＡＬＤＨホモログ酵素の遺伝子断片を得るため、表２１に示した鋳型、プライマー１および２を用いて、ＰＣＲ反応を行った。このとき、配列番号９で表される塩基配列の５’末端は表２１の各プライマー１で表される塩基配列の５’末端に相補な塩基配列を含み、配列番号１０で表される塩基配列の５’末端は表２１の各プライマー２で表される塩基配列の５’末端に相補な塩基配列を含む。

　配列番号１４０～１５２で表されるＤＮＡは、配列番号１２７～１３９で表されるＡＬＤＨホモログ酵素をコードする遺伝子の塩基配列を、大腸菌で発現させるためにコドン最適化したＤＮＡであり、人工合成により調製した。

　上記ＰＣＲによって得られた増幅ＤＮＡ断片と実施例１で調製したｐＱＥ８０Ｌのベクター断片をそれぞれＩｎ－Ｆｕｓｉｏｎ（商標）ＨＤ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　Ｋｉｔ（タカラバイオ社）を用いて連結することにより、各ＡＬＤＨ発現プラスミドを造成した。上記で得られた各発現プラスミドを用い、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＢＬ２１（ＤＥ３）を形質転換することで、各ＡＬＤＨ発現プラスミドを有する大腸菌を造成した。

　取得した精製酵素０．０７ｍｇ、実施例１で取得したＰａｔＡ０．０７ｍｇ、５０ｍＭのＣＨＥＳ（ｐＨ９．０）、１０ｍＭの塩化マグネシウム、１ｍＭのＤＴＴ、１ｍＭのピルビン酸、０．１ｍＭのＰＬＰ、１ｍＭのＮＡＤ^＋、および、１ｍＭの１，４－ビス（アミノメチル）シクロヘキサンのシス体およびトランス体混合物（トランス比率４５．７％）を含む０．１ｍＬの反応液（ｐＨ７．８）を調製し、３０℃、４００ｒｐｍの条件で２４時間反応を行った。また、ポジティブコントロールとして精製酵素ＸｙｌＣを用いた反応液についても同様に反応を行った。

　反応終了後、実施例１と同様の方法により反応生成物を分析した。結果を表２２に示す。

　表２２より、評価したすべてのＡＬＤＨホモログ１～１３において、４－（アミノメチル）シクロヘキサン－１－カルボン酸の生成が確認できた。特にＡＬＤＨホモログ１～５、７～９、１３を用いた場合に、４－（アミノメチル）シクロヘキサン－１－カルボン酸の顕著な生成が確認できた。また、ＡＬＤＨホモログ１～５、７、１３を用いた場合に生成した４－（アミノメチル）シクロヘキサン－１－カルボン酸のトランス比率が５０％よりも大きく、トランス体基質に対する高い特異性を有していた。その中でも特に、ＡＬＤＨホモログ１、２、４、５、７は４－（アミノメチル）シクロヘキサン－１－カルボン酸のトランス比率が７０％以上であり、ＸｙｌＣに匹敵するトランス体基質に対する特に高い選択性を有することがわかった。中でも、ＡＬＤＨホモログ４および５はＸｙｌＣと同等量のトランス－４－（アミノメチル）シクロヘキサン－１－カルボン酸を生成した。

［実施例１０］ケト酸および補酵素供給強化によるＴＸＡ生産性評価
（１）評価株の造成
ア）ＭＧ１６５５／ｐＱＥ８０Ｌ－ＸｙｌＣ－ＰａｔＡの造成
　配列番号２４で表される塩基配列を鋳型として、配列番号１７９および９４で表される塩基配列であるオリゴヌクレオチドをプライマーセットとして用いてＰＣＲ反応を行い、ＸｙｌＣ断片を得た。続いて、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　Ｋ１２　ＭＧ１６５５の染色体ＤＮＡを鋳型として、配列番号９５および１８０で表される塩基配列であるオリゴヌクレオチドをプライマーセットとして用いてＰＣＲ反応を行い、ＰａｔＡ断片を得た。なお、配列番号９４で表される塩基配列の５’末端は、配列番号９５で表される塩基配列の５’末端に相補的な配列を含む。

　上記得られたＸｙｌＣ断片およびＰａｔＡ断片を混合したものを鋳型として、配列番号１７９および１８０で表される塩基配列であるオリゴヌクレオチドをプライマーセットとして用いてＰＣＲ反応を行い、２断片を連結したＤＮＡ（以下、ＸｙｌＣ－ＰａｔＡという。）断片を得た。

　さらに、配列番号１８１および１８２で表される塩基配列からなるＤＮＡをプライマーセットとして、発現ベクターｐＱＥ８０Ｌ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を鋳型にＰＣＲ反応を行い、約７ｋｂのベクター断片を得た。なお、配列番号１８１で表される塩基配列の５’末端は配列番号１７９で表される塩基配列の５’末端に相補的な配列を含み、配列番号１８２で表される塩基配列の５’末端は配列番号１８０で表される塩基配列の５’末端に相補的な配列を含む。

　上記で得られたＸｙｌＣ－ＰａｔＡ断片とベクター断片を、Ｉｎ－Ｆｕｓｉｏｎ（商標）ＨＤ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　Ｋｉｔ（タカラバイオ社）を用いて連結することにより、発現プラスミドｐＱＥ８０Ｌ－ＸｙｌＣ－ＰａｔＡを得た。上記で得られた発現プラスミドでＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＭＧ１６５５を形質転換し、ＭＧ１６５５／ｐＱＥ８０Ｌ－ＸｙｌＣ－ＰａｔＡ株を得た。

イ）ＭＧ１６５５／ｐＱＥ８０Ｌ－ＰａｔＡ－ＢｓＡｌａＤＨ－ＸｙｌＣ－ＢｓＮＯＸの造成
　Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　Ｋ１２　ＭＧ１６５５の染色体ＤＮＡを鋳型として、配列番号１８３および９０で表される塩基配列であるオリゴヌクレオチドをプライマーセットとして用いてＰＣＲ反応を行い、ＰａｔＡ断片を得た。続いて、配列番号２４で表される塩基配列を鋳型として、配列番号９１および３０で表される塩基配列であるオリゴヌクレオチドをプライマーセットとして用いてＰＣＲ反応を行い、ＸｙｌＣ断片を得た。なお、配列番号９０で表される塩基配列の５’末端は、配列番号９１で表される塩基配列の５’末端に相補的な配列を含む。

　上記得られたＰａｔＡ断片およびＸｙｌＣ断片を混合したものを鋳型として、配列番号１８３および３０で表される塩基配列であるオリゴヌクレオチドをプライマーセットとして用いてＰＣＲ反応を行い、２断片を連結したＤＮＡ（以下、ＰａｔＡ－ＸｙｌＣという。）断片を得た。

　さらに、配列番号１８１および１８２で表される塩基配列からなるＤＮＡをプライマーセットとして、発現ベクターｐＱＥ８０Ｌ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を鋳型にＰＣＲ反応を行い、約７ｋｂのベクター断片を得た。なお、配列番号１８１で表される塩基配列の５’末端は配列番号１８３で表される塩基配列の５’末端に相補的な配列を含み、配列番号１８２で表される塩基配列の５’末端は配列番号３０で表される塩基配列の５’末端に相補的な配列を含む。

　上記で得られたＰａｔＡ断片とベクター断片を、をＩｎ－Ｆｕｓｉｏｎ（商標）ＨＤ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　Ｋｉｔ（タカラバイオ社）を用いて連結することにより、プラスミドｐＱＥ８０Ｌ－ＰａｔＡ－ＸｙｌＣを得た。上記で得られたプラスミドを鋳型として、配列番号１８４および１８２で表される塩基配列からなるＤＮＡをプライマーセットとしてＰＣＲ反応を行い、ＤＮＡ（以下、ｐＱＥ８０Ｌ－ＰａｔＡという。）断片を得た。

　Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｕｂｔｉｌｉｓ　１６８の染色体ＤＮＡを鋳型として、配列番号１８５および１８６で表される塩基配列であるオリゴヌクレオチドをプライマーセットとして用いてＰＣＲ反応を行い、ＢｓＡｌａＤＨ遺伝子断片を得た。Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｕｂｔｉｌｉｓ　１６８の染色体ＤＮＡを鋳型として、配列番号１８７および８６で表される塩基配列であるオリゴヌクレオチドをプライマーセットとして用いてＰＣＲ反応を行い、ＢｓＮＯＸ遺伝子断片を得た。なお、配列番号１８６で表される塩基配列の５’末端は、配列番号１８７で表される塩基配列の５’末端に相補的な配列を含む。

　上記得られたＢｓＡｌａＤＨ遺伝子断片およびＮＯＸ遺伝子断片を混合したものを鋳型として、配列番号１８５および８６で表される塩基配列であるオリゴヌクレオチドをプライマーセットとして用いてＰＣＲ反応を行い、２断片を連結したＤＮＡ（以下、ＢｓＡｌａＤＨ－ＢｓＮＯＸという。）断片を得た。

　なお、配列番号１８５で表される塩基配列の５’末端は配列番号１８４で表される塩基配列の５’末端に相補的な配列を含み、配列番号８６で表される塩基配列の５’末端は配列番号１８２で表される塩基配列の５’末端に相補的な配列を含む。

　上記で得られたｐＱＥ８０Ｌ－ＰａｔＡ断片とＢｓＡｌａＤＨ－ＢｓＮＯＸ断片を、をＩｎ－Ｆｕｓｉｏｎ（商標）ＨＤ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　Ｋｉｔ（タカラバイオ社）を用いて連結することにより、プラスミドｐＱＥ８０Ｌ－ＰａｔＡ－ＢｓＡｌａＤＨ－ＢｓＮＯＸを得た。

　上記で得られたプラスミドを鋳型として、配列番号１８８および１８９で表される塩基配列からなるＤＮＡをプライマーセットとしてＰＣＲ反応を行い、ＤＮＡ（以下、ｐＱＥ８０Ｌ－ＰａｔＡ－ＢｓＡｌａＤＨ－ＢｓＮＯＸという。）断片を得た。

　配列番号２４で表される塩基配列を鋳型として、配列番号１９０および９４で表される塩基配列であるオリゴヌクレオチドをプライマーセットとして用いてＰＣＲ反応を行い、ＸｙｌＣ断片を得た。

　なお、配列番号１８８で表される塩基配列の５’末端は配列番号１９０で表される塩基配列の５’末端に相補的な配列を含み、配列番号１８９で表される塩基配列の５’末端は配列番号９４で表される塩基配列の５’末端に相補的な配列を含む。

　上記で得られたｐＱＥ８０Ｌ－ＰａｔＡ－ＢｓＡｌａＤＨ－ＢｓＮＯＸ断片とＸｙｌＣ断片を、Ｉｎ－Ｆｕｓｉｏｎ（商標）ＨＤ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　Ｋｉｔ（タカラバイオ社）を用いて連結することにより、発現プラスミドｐＱＥ８０Ｌ－ＰａｔＡ－ＢｓＡｌａＤＨ－ＸｙｌＣ－ＢｓＮＯＸを得た。

　上記で得られた発現プラスミドでＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＭＧ１６５５を形質転換し、ＭＧ１６５５／ｐＱＥ８０Ｌ－ＰａｔＡ－ＢｓＡｌａＤＨ－ＸｙｌＣ－ＢｓＮＯＸ株を得た。

ウ）ＭＧ１６５５ΔａｃｅＥ／ｐＱＥ８０Ｌ－ｐａｔＡ－ｘｙｌＣ－ａｌｄ－ｎｏｘ株の造成
＜遺伝子欠損の際にマーカーとして用いるＤＮＡ断片の取得＞
　配列番号１９１および１９２で表される塩基配列からなるＤＮＡをプライマーセットとして、ｐＣａｔＳａｃ（Ａｐｐｌ　Ｅｎｖｉｒｏｎ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ（２０１３）７９，３０３３－３０３９）を鋳型としてＰＣＲを行い、クロラムフェニコール耐性ｃａｔ遺伝子およびスクロース感受性ｓａｃＢ遺伝子を含む、ｃａｔ－ｓａｃＢ断片を得た。

＜ピルビン酸デヒドロゲナーゼ活性が喪失した大腸菌の造成＞
　ピルビン酸デヒドロゲナーゼをコードするＤＮＡ（以下、ａｃｅＥ遺伝子という。）を欠損した大腸菌を、以下の方法で造成した。常法により調製したＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＭＧ１６５５株のゲノムＤＮＡを鋳型として、表２３の「プライマーセット」で表される塩基配列からなるＤＮＡをプライマーセットとしてＰＣＲを行い、各ＤＮＡ断片を増幅した。

　ａｃｅＥ上流１およびａｃｅＥ上流２は、ａｃｅＥ遺伝子の開始コドンから開始コドンの上流約１０００ｂｐまでの領域を含む。ａｃｅＥ下流１およびａｃｅＥ下流２は、ａｃｅＥ遺伝子の終止コドン下流約５０ｂｐから約１０００ｂｐまでの領域を含む。

　ａｃｅＥ上流１、ａｃｅＥ下流１、およびｃａｔ－ｓａｃＢ断片を等モルの比率で混合したものを鋳型とし、配列番号１９３および１９６で表される塩基配列からなるＤＮＡをプライマーセットに用いてＰＣＲを行い、ａｃｅＥ遺伝子周辺領域の配列にｃａｔ－ｓａｃＢ断片が挿入された配列からなるＤＮＡ（以下、ａｃｅＥ：：ｃａｔ－ｓａｃＢという。）断片を得た。

　ａｃｅＥ上流２およびａｃｅＥ下流２を等モルの比率で混合したものを鋳型とし、配列番号１９３および１９６で表される塩基配列からなるＤＮＡをプライマーセットに用いてＰＣＲを行い、ａｃｅＥを含まず、ａｃｅＥ上流とａｃｅＥ下流が直接連結した配列からなるＤＮＡ（以下、ΔａｃｅＥという。）断片を得た。

　ａｃｅＥ：：ｃａｔ－ｓａｃＢ断片を、λリコンビナーゼをコードする遺伝子を含むプラスミドｐＫＤ４６［Ｄａｔｓｅｎｋｏ，Ｋ．Ａ．，Ｗａｒｎｅｒ，Ｂ．Ｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，Ｖｏｌ．９７，６６４０－６６４５（２０００）］を保持するＭＧ１６５５株に、エレクトロポレーション法により導入し、クロラムフェニコール耐性かつシュクロース感受性を示した形質転換体（ａｃｅＥ遺伝子がａｃｅＥ：：ｃａｔ－ｓａｃＢに置換した形質転換体）を得た。

　ΔａｃｅＥ断片を、当該形質転換体にエレクトロポレーション法により導入し、クロラムフェニコール感受性かつシュクロース耐性を示す形質転換体（ａｃｅＥ：：ｃａｔ－ｓａｃＢがΔａｃｅＥに置換した形質転換体）を得た。それらのうちからさらに、アンピシリン感受性を示す形質転換体（ｐＫＤ４６が脱落した形質転換体）を得た。当該形質転換体をＭＧ１６５５ΔａｃｅＥと命名した。

＜発現プラスミドの取得＞
　イ）で得たプラスミドｐＱＥ８０Ｌ－ＰａｔＡ－ＸｙｌＣを鋳型として、配列番号１９９および１８２で表される塩基配列からなるＤＮＡをプライマーセットに用いてＰＣＲを行い、ＤＮＡ（以下、ｐＱＥ８０Ｌ－ＰａｔＡ－ＸｙｌＣという。）断片を得た。

　イ）で得たＢｓＡｌａＤＨ－ＢｓＮＯＸ断片を鋳型として、配列番号２００および８６表される塩基配列からなるＤＮＡをプライマーセットに用いてＰＣＲを行い、ＤＮＡ（以下、ＢｓＡｌａＤＨ－ＢｓＮＯＸ２という。）断片を得た。

　なお、配列番号２００で表される塩基配列の５’末端は配列番号１９９で表される塩基配列の５’末端に相補的な配列を含み、配列番号８６で表される塩基配列の５’末端は配列番号１８２で表される塩基配列の５’末端に相補的な配列を含む。

　上記で得られたｐＱＥ８０Ｌ－ＰａｔＡ－ＸｙｌＣ断片とＢｓＡｌａＤＨ－ＢｓＮＯＸ２断片を、Ｉｎ－Ｆｕｓｉｏｎ（商標）ＨＤ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　Ｋｉｔ（タカラバイオ社）を用いて連結することにより、発現プラスミドｐＱＥ８０Ｌ－ＰａｔＡ－ＸｙｌＣ－ＢｓＡｌａＤＨ－ＢｓＮＯＸを得た。上記で得られた発現プラスミドでＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＭＧ１６５５ΔａｃｅＥを形質転換し、ＭＧ１６５５ΔａｃｅＥ／ｐＱＥ８０Ｌ－ＰａｔＡ－ＸｙｌＣ－ＢｓＡｌａＤＨ－ＢｓＮＯＸ株を得た。

（２）補酵素再生系導入株を用いた静止菌体反応
　上記（１）で造成したＭＧ１６５５／ｐＱＥ８０Ｌ－ＸｙｌＣ－ＰａｔＡ株、ＭＧ１６５５／ｐＱＥ８０Ｌ－ＰａｔＡ－ＢｓＡｌａＤＨ－ＸｙｌＣ－ＢｓＮＯＸ株およびＭＧ１６５５ΔａｃｅＥ／ｐＱＥ８０Ｌ－ＰａｔＡ－ＸｙｌＣ－ＢｓＡｌａＤＨ－ＢｓＮＯＸ株、を用い、静止菌体反応による４－（アミノメチル）シクロヘキサン－１－カルボン酸の生産性を評価した。

　各菌株を１００ｍｇ／Ｌのアンピシリンを含む２ｍＬのＬＢ培地の入った試験管に接種し、３０℃で１６時間、振盪培養した。該培養液を１００ｍｇ／Ｌのアンピシリンを含む４０ｍＬのＬＢ培地の入った２５０ｍＬ容三角フラスコに接種し２８℃で２時間振盪培養した後、終濃度が１ｍＭとなるようにＩＰＴＧを添加し、さらに２８℃で２４時間振盪培養した。ただし、ＭＧ１６５５ΔａｃｅＥ／ｐＱＥ８０Ｌ－ＰａｔＡ－ＸｙｌＣ－ＢｓＡｌａＤＨ－ＢｓＮＯＸ株のみ、ＩＴＰＧ添加までの培養時間を３時間半とした。

　１００ｇ／Ｌの上記膜処理後湿菌体、１４０ｍＭのグルコース、５０ｍＭの１，４－ビス（アミノメチル）シクロヘキサンのシス体およびトランス体混合物（トランス比率４５．７％）、５０ｍＭの塩化マグネシウム、１０ｍＭのピルビン酸、並びに、１０ｍＭのＮＡＤ^＋を含有する０．２ｍＬの反応液を調製し、３０℃、８５０ｒｐｍの条件下で２４時間反応を行った。

　反応終了後、実施例１と同様の方法により反応生成物および残存基質を分析した。結果を表２４示す。

　表２４より、ピルビン酸およびＮＡＤ^＋の再生遺伝子の導入により、４－（アミノメチル）シクロヘキサン－１－カルボン酸の生産量と基質である１，４－ビス（アミノメチル）シクロヘキサンの消費量が向上した。さらに、宿主大腸菌のピルビン酸分解遺伝子の破壊によっても目的物生産と基質消費が向上し、特に、基質消費の向上が顕著であった。このことから、ピルビン酸分解遺伝子の破壊により、基質のアミノ基転移反応が促進されたことが推察される。

　以上より、静止菌体反応による４－（アミノメチル）シクロヘキサン－１－カルボン酸の生産において、ケト酸および補酵素を再生する酵素の遺伝子の導入または宿主におけるケト酸の分解系の遮断によって、ケト酸および補酵素の供給を強化することが有効であることが示された。

［実施例１１］トランス－４－（アミノメチル）シクロヘキサン－１－カルバルデヒドに対して高い特異性を有するＡＬＤＨに共通するアミノ酸残基の抽出
　実施例３、実施例４および実施例９において、シス－トランス体混合基質を用いた反応により、生成するＡＭＣＨＡのトランス体比率が高かったＡＬＤＨは、ＡＭＣＨＡの製造のうち、特にＴＸＡの製造において有用であるといえる。これらのＡＬＤＨに特徴的なアミノ酸残基を見出すため、アミノ酸配列の比較を行った。

　実施例３、実施例４および実施例９において、シス－トランス体混合基質を用いた反応により、生成するＡＭＣＨＡのトランス体比率が７０％以上であったＡＬＤＨ（配列番号２０、４０、４１、１２７、１２８、１３０および１３１）を、４－（アミノメチル）シクロヘキサン－１－カルバルデヒドのトランス体に対する特異性が特に高いＡＬＤＨとして抽出した。その結果、いずれもベンズアルデヒドデヒドロゲナーゼとしてアノテーションされている酵素であった。そこで、実施例３、実施例４および実施例９において用いたベンズアルデヒドデヒドロゲナーゼとアノテーションされているＡＬＤＨのうち、シス－トランス体混合基質を用いた反応により、生成するＡＭＣＨＡのトランス体比率が５０％未満であったＡＬＤＨ（配列番号１３４および１３５）を４－（アミノメチル）シクロヘキサン－１－カルバルデヒドのトランス体に対する特異性をもたないＡＬＤＨとして抽出した。

　なお、酵素活性の強さによる影響を排除するため、実施例３、実施例４および実施例９のシス－トランス体混合基質を用いた反応により、生成するＡＭＣＨＡが０．２ｍＭ未満であったＡＬＤＨは除外した。

　上記操作で抽出されたＡＬＤＨのアミノ酸配列を、Ｃｌｕｓｔａｌ　Ｏｍｅｇａを用いてアライメントした（図５Ａおよび図５Ｂ）。さらに、トランス－４－（アミノメチル）シクロヘキサン－１－カルバルデヒドに対する特異性が高いＡＬＤＨで保存されており、かつ、トランス－４－（アミノメチル）シクロヘキサン－１－カルバルデヒドに対する特異性をもたないＡＬＤＨでは保存されていないアミノ酸残基を抽出した。抽出されたアミノ酸残基は、ＸｙｌＣ（配列番号２０）に対応するアミノ酸残基番号で表２５に示した。

　表２５に示したアミノ酸残基は、ＡＬＤＨがトランス－４－（アミノメチル）シクロヘキサン－１－カルバルデヒドに対する特に高い特異性をもつために重要であることが示唆される。

［実施例１２］１，４－シクロヘキサンジメタノールを基質化合物とした４－（アミノメチル）シクロヘキサン－１－カルボン酸の生産

　実施例１２では、図６に示す反応経路を想定し、１，４－シクロヘキサンジメタノールを基質化合物として４－（アミノメチル）シクロヘキサン－１－カルボン酸の生産を試みた。

（１）ＯＸ、ＡＴおよびＡＬＤＨ共発現株の造成
　配列番号２０１で表されるＡｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ　ｃｈｌｏｒｏｐｈｅｎｏｌｉｃｕｓ由来コリンオキシダーゼをコードするＡｃＣＯｘ遺伝子断片を得るため、配列番号２０２で表される塩基配列を鋳型として、配列番号２０３および２０４で表される塩基配列であるオリゴヌクレオチドをプライマーセットに用いてＰＣＲ反応を行い、ＡｃＣＯｘ断片を得た。なお、配列番号２０２で表される塩基配列は、ＡｃＣＯｘ遺伝子の塩基配列を、大腸菌で発現させるためにコドン最適化したＤＮＡであり、人工合成により調製した。上記で得たＡｃＣＯｘ遺伝子断片を鋳型として、配列番号２０３および配列番号２０５で表される塩基配列をプライマーセットに用いてＰＣＲ反応を行い、ＡｃＣＯｘ２断片を得た。

　［実施例１０］の（１）イ）で得たプラスミドｐＱＥ８０Ｌ－ＰａｔＡ－ＸｙｌＣを鋳型として、配列番号１８１および２０６で表される塩基配列をプライマーセットに用いてＰＣＲ反応を行い、ＤＮＡ（以下、ｐＱＥ８０Ｌ－ＰａｔＡ－ＸｙｌＣ２という。）断片を得た。なお、配列番号１８１で表される塩基配列の５’末端は、配列番号２０３で表される塩基配列の５’末端に相補的な配列を含み、配列番号２０６で表される塩基配列の５’末端は、配列番号２０５で表される塩基配列の５’末端に相補的な配列を含む。

　上記で得られたＡｃＣＯｘ２断片とｐＱＥ８０Ｌ－ＰａｔＡ－ＸｙｌＣ２断片を、Ｉｎ－Ｆｕｓｉｏｎ（商標）ＨＤ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　Ｋｉｔ（タカラバイオ社）を用いて連結することにより、発現プラスミドｐＱＥ８０Ｌ－ＡｃＣＯｘ－ＰａｔＡ－ＸｙｌＣを得た。上記で得られた発現プラスミドでＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＭＧ１６５５を形質転換し、ＭＧ１６５５／ｐＱＥ８０Ｌ－ＡｃＣＯｘ－ＰａｔＡ－ＸｙｌＣ株を得た。また、ネガティブコントロールとして、市販ベクターｐＱＥ８０Ｌ（キアゲン社製）でＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＭＧ１６５５を形質転換し、ＭＧ１６５５／ｐＱＥ８０Ｌ株を得た。

（２）ＯＸ、ＡＴおよびＡＬＤＨ共発現株の静止菌体反応による、１，４－シクロヘキサンジメタノールからの４－（アミノメチル）シクロヘキサン－１－カルボン酸の生産
　上記で造成したＭＧ１６５５／ｐＱＥ８０Ｌ－ＡｃＣＯｘ－ＰａｔＡ－ＸｙｌＣ株、および、ネガティブコントロールとしてＭＧ１６５５／ｐＱＥ８０Ｌ株を用い、静止菌体反応による１，４－シクロヘキサンジメタノールからの４－（アミノメチル）シクロヘキサン－１－カルボン酸の生産性を評価した。

　各菌株を１００ｍｇ／Ｌのアンピシリンを含む２ｍＬのＬＢ培地の入った試験管に接種し、３０℃で１６時間、振盪培養した。該培養液を１００ｍｇ／Ｌのアンピシリンを含む４０ｍＬのＬＢ培地の入った２５０ｍＬ容三角フラスコに接種し３０℃で２時間振盪培養した後、終濃度が１ｍＭとなるようにＩＰＴＧを添加し、さらに３０℃で５時間振盪培養した。培養後の該培養液を遠心分離して湿菌体を取得した。該湿菌体に終濃度１０ｍＬ／Ｌとなるようキシレンを添加し、３０℃で８５０ｒｐｍのもと３０分間の膜処理を行った。

　１００ｇ／Ｌの上記膜処理後湿菌体、５０ｍＭ　ＨＥＰＥＳ（ｐＨ８．０）、５０ｍＭの１，４－シクロヘキサンジメタノールのシス体およびトランス体混合物（トランス比率７３.２％）、５０ｍＭの塩化マグネシウム、５０ｍＭのグルタミン酸、並びに、２５ｍＭのＮＡＤ^＋を含有する０．２ｍＬの反応液を調製し、３０℃、８５０ｒｐｍの条件下で１６時間反応を行った。

　反応終了後、実施例１と同様の方法により反応生成物を分析した。その結果、ネガティブコントロール株では０．８μＭのトランス－４－（アミノメチル）シクロヘキサン－１－カルボン酸（ＴＸＡ）および１．２μＭのシス－４－（アミノメチル）シクロヘキサン－１－カルボン酸（ｃｉｓ－ＴＸＡ）が検出されたが、ＯＸ、ＡＴおよびＡＬＤＨの共発現株においては１９．３μＭのトランス－４－（アミノメチル）シクロヘキサン－１－カルボン酸（ＴＸＡ）および４０．８μＭのシス－４－（アミノメチル）シクロヘキサン－１－カルボン酸（ｃｉｓ－ＴＸＡ）が生成した。したがって、ＯＸ、ＡＴおよびＡＬＤＨを共発現する微生物菌体を用いた静止菌体反応によって、１，４－シクロヘキサンジメタノールを基質化合物として４－（アミノメチル）シクロヘキサン－１－カルボン酸を生成できることが分かった。

　また、本実施例にて使用したアミノ基転移酵素は、１，４－ビス（アミノメチル）シクロヘキサンのアミノ基を転移させ、４－（アミノメチル）シクロヘキサン－１－カルバルデヒドを生成させるのみならず、アミノ基を有する化合物のアミノ基を他の化合物へ転移させる活性を有するタンパク質として、図６に示す反応経路による１，４－シクロヘキサンジメタノールからの４－（アミノメチル）シクロヘキサン－１－カルボン酸の生産に使用できることが示された。また、本実施例にて使用したアルデヒドデヒドロゲナーゼも同様に、図６に示す反応経路による１，４－シクロヘキサンジメタノールからの４－（アミノメチル）シクロヘキサン－１－カルボン酸の生産に使用できることが示された。

［実施例１４］１，４－ビス（アミノメチル）シクロヘキサンから４－（アミノメチル）シクロヘキサン－１－カルボン酸生成経路の推定
（１）精製酵素反応およびＬＣ－ＭＳ／ＭＳによる分析
　実施例１と同様の方法により取得した精製ＰａｔＡ、実施例３と同様の方法により取得した精製ＸｙｌＣを用い、ＰａｔＡおよびＸｙｌＣ各０．０７ｍｇ、５０ｍＭのＭＯＰＳ（ｐＨ７．８）、１０ｍＭの塩化マグネシウム、１ｍＭのピルビン酸、０．１ｍＭのＰＬＰ、１ｍＭのＮＡＤ^＋および１ｍＭの１，４－ビス（アミノメチル）シクロヘキサンのシス体およびトランス体混合物（トランス比率４５．７％）を含む０．１ｍＬの反応液を調製し、３０℃、４００ｒｐｍの条件で２４時間反応を行った。また、精製酵素として、ＰａｔＡのみ、またはＸｙｌＣのみを添加したものも同様に反応させた。

　反応終了後、反応液を希釈した後、遠心分離し、上清に含まれる反応生成物および残存基質を実施例３と同様の方法でＬＣＭＳ－８０４０にて分析した。結果を表２６に示す。

　表２６より、１，４－ビス（アミノメチル）シクロヘキサンとＰａｔＡおよびＸｙｌＣを反応させた場合、１，４－ビス（アミノメチル）シクロヘキサンが消費され、４－（アミノメチル）シクロヘキサン－１－カルボン酸が生成し、溶出時間１４．５８分および１５．１６分において質量電荷比１４２．１の化合物のピークが生成した。また、１，４－ビス（アミノメチル）シクロヘキサンとＰａｔＡのみを反応させた場合には、１，４－ビス（アミノメチル）シクロヘキサンが消費されたものの、４－（アミノメチル）シクロヘキサン－１－カルボン酸は生成せず、溶出時間１４．５８分および１５．１６分において質量電荷比１４２．１の化合物のピークが生成した。また、１，４－ビス（アミノメチル）シクロヘキサンとＸｙｌＣのみを反応させた場合には、１，４－ビス（アミノメチル）シクロヘキサンが消費されず、４－（アミノメチル）シクロヘキサン－１－カルボン酸および質量電荷比１４２．１の化合物のピークは生成しなかった。

　以上のことから、１，４－ビス（アミノメチル）シクロヘキサンとＰａｔＡおよびＸｙｌＣが反応液中に共存することで初めて４－（アミノメチル）シクロヘキサン－１－カルボン酸が生成することがわかった。ＰａｔＡおよびＸｙｌＣの反応では、質量電荷比１４２．１の化合物のピークのエリア値がＰａｔＡのみの反応よりも小さくなり、４－（アミノメチル）シクロヘキサン－１－カルボン酸が生成している。したがって、１，４－ビス（アミノメチル）シクロヘキサンとＰａｔＡおよびＸｙｌＣの反応においては、まず１，４－ビス（アミノメチル）シクロヘキサン（すなわち化合物８）がＰａｔＡによって質量電荷比１４２．１の化合物に変換され、続いて、質量電荷比１４２．１の化合物がＸｙｌＣによって４－（アミノメチル）シクロヘキサン－１－カルボン酸に変換されていると考えられる。すなわち、ＸｙｌＣは質量電荷比１４２．１の化合物を４－（アミノメチル）シクロヘキサン－１－カルボン酸に変換する活性を有すると考えられる。また、質量電荷比１４２．１の化合物はＰａｔＡおよびＸｙｌＣの性質に基づき、４－（アミノメチル）シクロヘキサン－１－カルバルデヒド（すなわち化合物７）と推定される。

［実施例１５］４－（アミノメチル）シクロヘキサン－１－カルバルデヒドの生成確認
（１）精製酵素反応
　実施例１と同様の方法により取得したＰａｔＡ、実施例３と同様の方法により取得したＸｙｌＣを用い、ＰａｔＡおよびＸｙｌＣ各０．０５ｍｇ、５０ｍＭのＭＯＰＳ（ｐＨ７．０）、１０ｍＭの塩化マグネシウム、１ｍＭのピルビン酸、０．１ｍＭのＰＬＰおよび１ｍＭのＮＡＤ^＋に対し、１ｍＭの１，４－ビス（アミノメチル）シクロヘキサンのシス体、トランス体、または、シス体およびトランス体混合物（トランス比率４５．７％）を含む０．１ｍＬの反応液を調製し、３０℃、４００ｒｐｍの条件で２４時間反応を行った。反応終了後、反応液を希釈した後、遠心分離し、上清に含まれる反応生成物および残存基質を実施例３と同様の方法でＬＣＭＳ－８０４０にて分析した（以下の（２））。また、以下の（３）、（４）の分析に供した。

（２）ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ分析
　ＰａｔＡおよびＸｙｌＣと１，４－ビス（アミノメチル）シクロヘキサンのトランス体を反応させた場合には溶出時間１４．５０分に、シス体を反応させた場合には溶出時間１５．０７分において、質量電荷比１４２．１の特徴的なピークが検出された。これらは、ＰａｔＡおよびＸｙｌＣと１，４－ビス（アミノメチル）シクロヘキサンのシス体およびトランス体混合物を反応させた場合においても検出された。このことから、溶出時間１４．５０分の化合物はトランス体基質と、溶出時間１５．０７分の化合物はシス体基質と酵素とが反応して生じた化合物であると考えられ、これらは分子量１４１の化合物である。これは、１，４－ビス（アミノメチル）シクロヘキサンのひとつのアミノ基が転移された生成物として考えられる４－（アミノメチル）シクロヘキサン－１－カルバルデヒドの分子量１４１．２と一致する。したがって、溶出時間１４．５０の化合物はトランス－４－（アミノメチル）シクロヘキサン－１－カルバルデヒドであり、溶出時間溶出時間１５．０７分の化合物はシス－４－（アミノメチル）シクロヘキサン－１－カルバルデヒドであると推察される。

（３）ｏ－フタルアルデヒド（ＯＰＡ）によるポストカラム誘導体化分析
　酵素反応液に含まれるアミノ基を有する化合物を検出するため、第一級アミンを検出可能であるＯＰＡ誘導体化を行った。

　ＨＰＬＣにおいてカラム分離後に、誘導体化のための反応液を合流させることで、カラムオーブン内で誘導体化し、誘導体化された化合物を検出器へ導入するポストカラム誘導体化システムを用い、サンプル中のアミノ基を有する化合物の検出を試みた。分析条件は以下のとおりである。
［分析条件］
・カラム：ＳＵＭＩＰＡＸ　ＯＤＳ　Ｚ－ＣＬＵＥ　３μｍ　４．６×２５０ｍｍ（住化分析センター社）
・カラムオーブン温度：５０℃
・移動相：１０ｍＭクエン酸三ナトリウム二水和物、１０ｍＭ無水硫酸ナトリウムおよび１０ｍＭドデシル硫酸ナトリウムを精製水に溶解し、希硫酸でｐＨ３．２に調整したもの
・移動相流速：０．７ｍＬ／ｍｉｎ
・反応液：１８．５ｇ／Ｌホウ酸、１１．０ｇ／Ｌ水酸化ナトリウム、３０％　Ｂｒｉｊ－３５　３．０ｍＬ／Ｌ、０．６ｇ／Ｌ　ｏ－フタルアルデヒドおよび４．６６ｇ／Ｌ　Ｎ－アセチル－Ｌ－システインを精製水に溶解したもの
・反応液流速：０．３ｍＬ／ｍｉｎ
・分析時間：７０分
・検出器：ＲＦ－２０Ａ（島津製作所製）
・励起／蛍光波長：３５０ｎｍ／４５０ｎｍ

　分析の結果、各化合物の標品の溶出時間は表２７に示す通りとなった。また、各サンプルのクロマトグラムを重ねて表示すると図８のようになった。

　図８より、ＰａｔＡおよびＸｙｌＣと１，４－ビス（アミノメチル）シクロヘキサンのトランス体を反応させた場合、溶出時間１２．６６分に、シス体を反応させた場合、溶出時間１３．３７分に特徴的なピークが検出された。これらは、ＰａｔＡおよびＸｙｌＣと１，４－ビス（アミノメチル）シクロヘキサンのシス体およびトランス体混合物を反応させた場合においても検出された。このことから、溶出時間１２．６６分の化合物はトランス体基質と、溶出時間１３．３７分の化合物はシス体基質と酵素とが反応して生じた化合物であると考えられ、いずれもアミノ基を有する化合物である。１，４－ビス（アミノメチル）シクロヘキサンのひとつのアミノ基が転移された生成物として考えられる４－（アミノメチル）シクロヘキサン－１－カルバルデヒドはアミノ基を有する。したがって、溶出時間１２．６６分の化合物はトランス－４－（アミノメチル）シクロヘキサン－１－カルバルデヒド（すなわち化合物７のトランス体）であり、溶出時間溶出時間１３．３７分の化合物はシス－４－（アミノメチル）シクロヘキサン－１－カルバルデヒド（すなわち化合物７のシス体）であると推察される。

（４）ジニトロフェニルヒドラジン（ＤＮＰＨ）によるプレカラム誘導体化分析
　酵素反応液に含まれるアルデヒド基を有する化合物を検出するため、アルデヒドを検出可能であるＤＮＰＨ誘導体化を行った。

　酵素反応後の反応液を精製水にて１０倍希釈およびフィルターろ過した。ろ液１００μＬに対し、２０％リン酸水溶液を２μＬ添加して混和し、さらに０．１％　ＤＮＰＨアセトニトリル溶液を５μＬ添加して混和後、室温で２０分間静置し、誘導体化した。

　誘導体化後の試料を、ＰＤＡ検出器（ＳＰＤ－Ｍ２０Ａ）とＭＳ検出器（ＬＣＭＳ８０４０）を順に接続したＨＰＬＣシステムを用いて測定し、ＤＮＰＨ誘導体の紫外吸収と質量電荷比を測定した。また、未反応ＤＮＰＨによるＭＳイオン源の汚染を防ぐため、ＭＳには分析開始８分後から試料を導入した。分析条件は以下のとおりである。
［分析条件］
・カラム：ＹＭＣ－Ｔｒｉａｒｔ　Ｂｉｏ　Ｃ４　３μｍ　４．６×１５０ｍｍ（ワイエムシィ社）
・カラム温度：４０℃
・移動相：水７０％アセトニトリル３０％
・分析時間：３０分
・流速：０．５ｍＬ／ｍｉｎ
・ＰＤＡ検出波長：３６０ｎｍ
・ＭＳ検出イオン：
　ポジティブモード：［Ｍ＋Ｈ］^＋＝３２２．１０　ｍ／ｚ
　ネガティブモード：［Ｍ－Ｈ］^－＝３２０．１０　ｍ／ｚ

　分析の結果、いずれの酵素反応液においても、ＤＮＰＨ誘導体に特徴的な３６０ｎｍの吸収と、ポジティブイオンモードにおける質量電荷比３２２．１０およびネガティブイオンモードにおける質量電荷比３２０．１０のピークが同じ溶出時間（ＰＤＡでは１０．５８分、ＭＳでは１０．９８分）で検出された（図９）。

　このことから、酵素反応液のＤＮＰＨ誘導体化により、分子量３２１のＤＮＰＨ誘導体が生成しているといえる。分子量３２１からＤＮＰＨ誘導体化前の分子量は１４１と推定され、これは４－（アミノメチル）シクロヘキサン－１－カルバルデヒドの分子量１４１．２と一致する。

　上記の（２）～（４）の結果から、１，４－ビス（アミノメチル）シクロヘキサンとＰａｔＡおよびＸｙｌＣの酵素反応において、分子量１４１であり、かつ、アミノ基およびアルデヒド基を有する化合物が生じていることが示された。これは４－（アミノメチル）シクロヘキサン－１－カルバルデヒドと一致する。したがって、１，４－ビス（アミノメチル）シクロヘキサンとＰａｔＡおよびＸｙｌＣの酵素反応においては、まずＰａｔＡにより４－（アミノメチル）シクロヘキサン－１－カルバルデヒドが生成し、４－（アミノメチル）シクロヘキサン－１－カルバルデヒドに対してＸｙｌＣが作用することで、４－（アミノメチル）シクロヘキサン－１－カルボン酸が生成していることを示唆している。すなわち、ＸｙｌＣは４－（アミノメチル）シクロヘキサン－１－カルバルデヒド（すなわち化合物７）を４－（アミノメチル）シクロヘキサン－１－カルボン酸に変換する活性を有すると考えられる。

［実施例１６］ベンズアルデヒドデヒドロゲナーゼ（ＢＺＤＨ）を用いた４－（アミノメチル）シクロヘキサンカルボン酸の生産
（１）評価株の造成
　配列番号２０７に示すＸａｎｔｈｏｍｏｎａｓ　ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ由来の公知のベンズアルデヒドデヒドロゲナーゼＸｃＢＺＤＨを評価した。ＸｃＢＺＤＨをコードする塩基配列を配列番号２０８に示す。配列番号２０８で表されるＤＮＡを鋳型とし、配列番号２０９および２１０で表される塩基配列からなるＤＮＡをプライマーセットとして、ＰＣＲ反応を行い、ＤＮＡ断片を増幅した。なお、鋳型としてＸａｎｔｈｏｍｏｎａｓ　ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓの染色体ＤＮＡを用い、染色体ＤＮＡは常法により調製した。

　このとき、配列番号９および配列番号２０９で表される塩基配列、配列番号１０および配列番号２１０で表される塩基配列は、それぞれの５’末端に相補な塩基配列を含む。すなわち、配列番号９で表される塩基配列の５’末端は配列番号２０９で表される塩基配列の５’末端に相補な塩基配列を含み、配列番号１０で表される塩基配列の５’末端は配列番号２１０で表される塩基配列の５’末端に相補な塩基配列を含む。

　上記ＰＣＲによって得られた増幅ＤＮＡ断片と実施例１で調製したｐＱＥ８０Ｌのベクター断片をそれぞれＩｎ－Ｆｕｓｉｏｎ（商標）ＨＤ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　Ｋｉｔ（タカラバイオ社）を用いて連結することにより、ＸｃＢＺＤＨ発現プラスミドを造成した。

　上記で得られた各発現プラスミドを用い、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＢＬ２１（ＤＥ３）を形質転換することで、ＸｃＢＺＤＨ発現プラスミドを有する大腸菌を造成した。

（２）ＸｃＢＺＤＨの４－（アミノメチル）シクロヘキサンカルボン酸の生産性評価
　上記（１）で得たＸｃＢＺＤＨ発現プラスミドを有する大腸菌を用いて、実施例１と同様の方法でＨｉｓタグ付加組換え型のＸｃＢＺＤＨ精製酵素を取得した。

　取得したＸｃＢＺＤＨ０．０７ｍｇ、実施例１で取得したＰａｔＡ０．０７ｍｇ、５０ｍＭのＭＯＰＳ（ｐＨ７．８）、１０ｍＭの塩化マグネシウム、１ｍＭのピルビン酸、０．１ｍＭのＰＬＰ、１ｍＭのＮＡＤ^＋、および、１ｍＭの１，４－ビス（アミノメチル）シクロヘキサンのシス体およびトランス体混合物（トランス比率４５．７％）を含む０．１ｍＬの反応液を調製し、３０℃、４００ｒｐｍの条件で２４時間反応を行った。また、ポジティブコントロールとして精製酵素ＸｙｌＣを用いた反応液についても同様に反応を行った。

　反応終了後、実施例１と同様の方法により反応生成物を分析した。結果を表２８に示す。

　表２８より、公知のベンズアルデヒドデヒドロゲナーゼのひとつであるＸｃＢＺＤＨおよびＰａｔＡを組み合わせることで、１，４－ビス（アミノメチル）シクロヘキサン（すなわち化合物８）を基質として４－（アミノメチル）シクロヘキサン－１－カルボン酸を生成蓄積できることが分かった。

　また、ＸｃＢＺＤＨを用いた場合に生成した４－（アミノメチル）シクロヘキサン－１－カルボン酸のトランス比率が５０％を大きく上回っており、本酵素（ＸｃＢＺＤＨ）は、ＸｙｌＣと同様にトランス体の４－（アミノメチル）シクロヘキサン－１－カルバルデヒドに対する特異性（トランス選択性）が高い酵素であることが分かった。

Claims

　下記一般式（１）で表される化合物を基質化合物または中間体化合物として、ヒドロキシ基をアルデヒド基に変換する活性を有するタンパク質、アルデヒド基をカルボキシ基に変換する活性を有するタンパク質、およびアルデヒド基とアミノ基を可逆的に変換する活性を有するタンパク質から選択される少なくとも一つの酵素の存在下で、シス体および／またはトランス体の４－（アミノメチル）シクロヘキサン－１－カルボン酸を製造する方法。

［式中、Ｒ_１およびＲ_２は、それぞれ独立してＣＨ_２ＯＨ、ＣＨＯ、ＣＯＯＨ、またはＣＨ_２ＮＨ_２である（但し、Ｒ_１とＲ_２の一方がＣＯＯＨであり、他方がＣＨ_２ＮＨ_２である場合、およびＲ_１とＲ_２が共にＣＯＯＨである場合を除く）］
　前記ヒドロキシ基をアルデヒド基に変換する活性を有するタンパク質、前記アルデヒド基をカルボキシ基に変換する活性を有するタンパク質、および前記アルデヒド基とアミノ基を可逆的に変換する活性を有するタンパク質の存在下で製造する、請求項１に記載の方法。
　Ｒ_１とＲ_２の一方がＣＨ_２ＯＨであり、他方がＣＨ_２ＯＨ、ＣＨＯ、またはＣＨ_２ＮＨ_２である、前記一般式（１）で表される化合物を基質化合物または中間体化合物とする場合、前記ヒドロキシ基をアルデヒド基に変換する活性を有するタンパク質、前記アルデヒド基をカルボキシ基に変換する活性を有するタンパク質、および前記アルデヒド基とアミノ基を可逆的に変換する活性を有するタンパク質の存在下で製造する、請求項２に記載の方法。
　Ｒ_１とＲ_２の一方がＣＨ_２ＮＨ_２であり、他方がＣＨＯである、一般式（１）で表される化合物を基質化合物または中間体化合物とする場合、前記アルデヒド基をカルボキシ基に変換する活性を有するタンパク質の存在下で製造する、請求項１に記載の方法。
　Ｒ_１とＲ_２の一方がＣＨＯであり、他方がＣＯＯＨである、一般式（１）で表される化合物を基質化合物または中間体化合物とする場合、前記アルデヒド基とアミノ基を可逆的に変換する活性を有するタンパク質の存在下で製造する、請求項１に記載の方法。
　Ｒ_１とＲ_２の一方がＣＨＯであり、他方がＣＨ_２ＮＨ_２、もしくはＣＨＯである、またはＲ_１とＲ_２が共にＣＨ_２ＮＨ_２である、一般式（１）で表される化合物を基質化合物または中間体化合物とする場合、前記アルデヒド基をカルボキシ基に変換する活性を有するタンパク質、および前記アルデヒド基とアミノ基を可逆的に変換する活性を有するタンパク質の存在下で製造する、請求項１に記載の方法。
　Ｒ_１とＲ_２の一方がＣＨ_２ＯＨであり、他方がＣＨ_２ＮＨ_２である、一般式（１）で表される化合物を基質化合物または中間体化合物とする場合、前記ヒドロキシ基をアルデヒド基に変換する活性を有するタンパク質、および前記アルデヒド基をカルボキシ基に変換する活性を有するタンパク質の存在下で製造する、請求項１に記載の方法。
　Ｒ_１とＲ_２の一方がＣＨ_２ＯＨであり、他方がＣＯＯＨである、一般式（１）で表される化合物を基質化合物または中間体化合物とする場合、前記ヒドロキシ基をアルデヒド基に変換する活性を有するタンパク質、および前記アルデヒド基とアミノ基を可逆的に変換する活性を有するタンパク質の存在下で製造する、請求項１に記載の方法。
　前記ヒドロキシ基をアルデヒド基に変換する活性を有するタンパク質が、オキシダーゼ活性を有するタンパク質、デヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質およびアルデヒドレダクターゼ活性を有するタンパク質から選択される少なくとも１つであり、前記アルデヒド基をカルボキシ基に変換する活性を有するタンパク質が、アルデヒドデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質、および／またはアルデヒドオキシダーゼ活性を有するタンパク質であり、前記アルデヒド基とアミノ基を可逆的に変換する活性を有するタンパク質が、アミノ基転移酵素活性を有するタンパク質、アミンデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質およびアミンオキシダーゼ活性を有するタンパク質から選択される少なくとも１つである、請求項１～８のいずれか一項に記載の方法。
　前記ヒドロキシ基をアルデヒド基に変換する活性を有するタンパク質が、コリンオキシダーゼ活性を有するタンパク質であり、前記アルデヒド基をカルボキシ基に変換する活性を有するタンパク質が、アルデヒドデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質であり、前記アルデヒド基とアミノ基を可逆的に変換する活性を有するタンパク質が、アミノ基転移酵素活性を有するタンパク質である、請求項１～８のいずれか一項に記載の方法。
　前記コリンオキシダーゼ活性を有するタンパク質が、配列番号２０１で示されるアミノ酸配列と６０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるタンパク質であり、前記アルデヒドデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質が、配列番号１９～２２、３５～４６および１２７～１３９のいずれか１つで表されるアミノ酸配列と５０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるタンパク質であり、前記アミノ基転移酵素活性を有するタンパク質が、配列番号１～４および１０３～１０５のいずれか１つで表されるアミノ酸配列と６０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるタンパク質である、請求項１０に記載の方法。