WO2024257801A1 - アジュバント及びその組成物 - Google Patents

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亮大郎 三股
卓摩 五反田
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Denka Co Ltd
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Definitions

  • the present invention relates to the use of cannabinoid receptor type 2 agonists as adjuvants and compositions thereof.
  • Cannabis derived from the cannabis plant and commonly known as marijuana, has long been used for pain, anxiety, anorexia, and the like. This effect is due to the active ingredients called cannabinoids contained in cannabis, and in the 1960s, the main active ingredient ⁇ 9 -tetrahydrocannabinol (THC) and cannabidiol, which does not cause mental symptoms such as euphoria, were discovered.
  • THC cannabinoids
  • cannabidiol cannabidiol
  • two types of G protein-coupled receptors were identified as in vivo target molecules of THC, and were named cannabinoid receptor type 1 (CBR1) and type 2 (CBR2).
  • CBR1 cannabinoid receptor type 1
  • CBR2 type 2
  • anandamide which is an endogenous ligand of these receptors, was discovered in 1992, and 2-arachidonoylglycerol was discovered in 1995, and cannabinoid receptors are considered to play an important physiological role.
  • cannabinoid receptors are widely distributed in the central nervous system, circulatory system, digestive system, liver, muscles, bones, and the spleen/immune system; CBR1 in particular is known to be primarily expressed in the central nervous system, including the brain, while CBR2 is primarily expressed in the spleen/immune system.
  • CBR1 suppresses the release of neurotransmitters when stimulated by an agonist, eliciting various pharmacological activities such as analgesic effects, orthostatic hypotension, and euphoria
  • CBR2 is responsible for the differentiation and regulation of inflammatory cells and immune cells.
  • cannabinoid receptors thus possess a variety of physiological activities, they have become targets for pharmaceutical development.
  • CBR1 agonists approved in Europe and the US from the 1990s to the early 2000s include dronabinol, a capsule containing the natural agonist THC dissolved in sesame oil as an appetite stimulant for AIDS patients and an antiemetic for cancer chemotherapy; nabilone, a synthetic derivative of THC, as an antiemetic for cancer chemotherapy; and nabiximols, an oral spray containing THC as the main ingredient for the treatment of spasticity and pain in multiple sclerosis and cancer pain.
  • these medicines have the risk of central nervous system side effects such as orthostatic hypotension and euphoria, as well as dependency, and are subject to regulations requiring restrictions on use and strict drug management.
  • CBR2 is mainly expressed in the peripheral immune system, and CBR2 selective agonists are expected to be safe drugs without the risk of central side effects like CBR1, and have been developed as treatments for systemic sclerosis, atopic dermatitis, osteoarthritis pain, and post-herpetic pain.
  • CBR2 selective agonists are expected to be safe drugs without the risk of central side effects like CBR1, and have been developed as treatments for systemic sclerosis, atopic dermatitis, osteoarthritis pain, and post-herpetic pain.
  • CBR2 selective agonists are expected to be safe drugs without the risk of central side effects like CBR1
  • CBR1 central side effects
  • CBR2 is related to vaccine-induced immunity. Dotsey et al. have reported that administering the CBR2 antagonist AM630 or the inverse agonist JTE907 immediately before vaccination enhances the specific antibody response to vaccine antigens (Non-Patent Document 1). In addition, such activity has not been confirmed with the CBR2 agonist AM1241, and the antibody response is said to be almost the same as that of the control group. Thus, CBR2 is known to be related to opposing pharmacological activities such as promoting and suppressing inflammation, and it is thought that inhibiting CBR2 activity is necessary to enhance the effectiveness of vaccines.
  • vaccines may require adjuvants to improve immunogenicity.
  • inactivated vaccines that have been deactivated and subunit vaccines such as recombinant proteins have low immunogenicity, and adjuvants may be used in combination with these vaccines to enhance the immune response to a level that can protect against infection.
  • Vaccines distributed in Japan also use aluminum gel, monophosphoryl lipid (MPL), and AS01B, a mixed adjuvant that combines MPL and QS-21 with liposomes, as adjuvants.
  • the present invention relates to the use of cannabinoid receptor type 2 (CBR2) agonists as adjuvants and to providing adjuvant compositions.
  • CBR2 cannabinoid receptor type 2
  • Non-Patent Document 1 Non-Patent Document 1
  • an antibody induction enhancer comprising one or more active ingredients selected from (2,3-dichlorophenyl)-[5-methoxy-2-methyl-3-(2-morpholin-4-ylethyl)indol-1-yl]methanone, (1R,4E,9S)-4,11,11-trimethyl-8-methylenebicyclo[7.2.0]undec-4-ene, and 4-[4-(1,1-dimethylheptyl)-2,6-dimethoxyphenyl]-6,6-dimethyl-bicyclo[3.1.1]hept-2-ene-2-methanol.
  • An adjuvant composition comprising one or more selected from (2,3-dichlorophenyl)-[5-methoxy-2-methyl-3-(2-morpholin-4-ylethyl)indol-1-yl]methanone, (1R,4E,9S)-4,11,11-trimethyl-8-methylenebicyclo[7.2.0]undec-4-ene, and 4-[4-(1,1-dimethylheptyl)-2,6-dimethoxyphenyl]-6,6-dimethyl-bicyclo[3.1.1]hept-2-ene-2-methanol, and a pharma- ceutically acceptable carrier.
  • a vaccine composition comprising one or more selected from (2,3-dichlorophenyl)-[5-methoxy-2-methyl-3-(2-morpholin-4-ylethyl)indol-1-yl]methanone, (1R,4E,9S)-4,11,11-trimethyl-8-methylenebicyclo[7.2.0]undec-4-ene, and 4-[4-(1,1-dimethylheptyl)-2,6-dimethoxyphenyl]-6,6-dimethyl-bicyclo[3.1.1]hept-2-ene-2-methanol, a pharma- ceutically acceptable carrier, and a vaccine antigen.
  • a vaccine therapy comprising administering to an animal one or more selected from (2,3-dichlorophenyl)-[5-methoxy-2-methyl-3-(2-morpholin-4-ylethyl)indol-1-yl]methanone, (1R,4E,9S)-4,11,11-trimethyl-8-methylenebicyclo[7.2.0]undec-4-ene, and 4-[4-(1,1-dimethylheptyl)-2,6-dimethoxyphenyl]-6,6-dimethyl-bicyclo[3.1.1]hept-2-ene-2-methanol together with a vaccine antigen.
  • the present invention makes it possible to increase the effectiveness of vaccines by using a highly safe CBR2 agonist, and can make a significant contribution to the pharmaceutical industry by creating high-quality prophylactic drugs.
  • IgG antibody titer against A/Victoria/1/2020 strain (A/H1N1) on Day 21 after a single dose.
  • IgG antibody titer against B/Phuket/3073/2013 strain (B/Yamagata lineage) on Day 21 after a single administration.
  • IgG subclass antibody titers against B/Phuket/3073/2013 strain (B/Yamagata lineage) on Day 21 after a single administration.
  • Assessment of NF- ⁇ B activity by SEAP reporter assay IgG antibody titer against the A/Victoria/1/2020 strain (A/H1N1) in evaluation of the adjuvant activity of HU-308.
  • (2,3-dichlorophenyl)-[5-methoxy-2-methyl-3-(2-morpholin-4-ylethyl)indol-1-yl]methanone is also referred to as GW-405833
  • (1R,4E,9S)-4,11,11-trimethyl-8-methylenebicyclo[7.2.0]undec-4-ene is also referred to as ⁇ -caryophyllene
  • 4-[4-(1,1-dimethylheptyl)-2,6-dimethoxyphenyl]-6,6-dimethyl-bicyclo[3.1.1]hept-2-ene-2-methanol is also referred to as HU-308, all of which are compounds known as CBR2 agonists.
  • a CBR2 agonist refers to a substance that binds to CBR2 and transmits the signal into cells to exert a physiological activity via CBR2 activation, and in addition to these, compounds such as EHP-101, GW-842166X, and LY2828360 have also been found.
  • 2-arachidonoylglycerol (2-AG) is known as an endogenous cannabinoid that binds to CBR2.
  • GW-405833, ⁇ -caryophyllene and HU-308 (referred to as “the compounds of the present invention") have the chemical structures shown in Table 1 below, and all of them can be produced by known chemical synthesis methods, or they can be purchased and used as commercially available products.
  • the compounds of the present invention can be used alone or in combination of two or more types in the antibody induction enhancer, adjuvant composition, or vaccine composition of the present invention.
  • the titer of IgG specific to the antigen is significantly higher than that of a group administered only the vaccine.
  • GCT geometric mean antibody titers
  • the addition of these CBR2 agonists significantly increases antibody titers of IgG2a and IgG2b in addition to IgG1. That is, the compound of the present invention can be used as an antibody induction enhancer that enhances the strength of immunity specific to an antigen in a vaccine therapy in which an immunogen (antigen) is administered, and the compound can be used as an adjuvant.
  • a composition containing the compound of the present invention and a pharma- ceutically acceptable carrier can be an adjuvant composition.
  • the compound of the present invention can be used to produce an antibody induction enhancer or an adjuvant composition.
  • the promotion of antibody inducibility means the effect of increasing the strength of antigen-specific immunity, specifically, the effect of enhancing antigen-specific IgG antibody titer.
  • Such an antibody inducibility enhancer can be a pharmaceutical material or preparation for humans or animals that enhances the antibody inducibility of an antigen.
  • the adjuvant composition can be a pharmaceutical preparation for humans or animals that enhances the antibody inducibility of an antigen, i.e., has adjuvant activity.
  • Such pharmaceutical preparations can be prepared by appropriately combining the compound of the present invention with a pharma- ceutically acceptable carrier, such as an excipient, binder, bulking agent, disintegrant, lubricant, dispersant, buffer, flavoring agent, diluent, etc.
  • the antibody induction enhancer and adjuvant composition of the present invention can be administered in combination with an antigen, and administration may be simultaneous with administration of the antigen, or before or after administration of the antigen.
  • the dosage of the adjuvant composition of the present invention can be appropriately determined depending on the subject of administration, the administration method, the administration form, and the type of antigen.
  • the antibody induction enhancer and adjuvant composition of the present invention can be combined with an antigen to form a vaccine composition for administration to animals, including humans, and can be further made into an appropriate formulation by appropriately adding the above-mentioned pharma- ceutically acceptable carrier.
  • the compound of the present invention may be chemically bound to an antigen or other component, or may exist in a free molecular state.
  • Antigens include natural products purified from pathogens, or proteins or peptides artificially produced by techniques such as genetic recombination. Specific examples include virions, which are complete virus particles, incomplete virus particles, viral structural proteins, viral nonstructural proteins, whole pathogen cells, proteins derived from pathogens, glycoproteins, capsular polysaccharides, protective antigens, and neutralizing epitopes. Antigens include both infectious and inactivated antigens. Inactivated antigens include, but are not limited to, antigens inactivated by physical (X-ray irradiation, UV irradiation, heat, ultrasound) and chemical (formalin, beta-propiolactone, binary ethyleneimine, mercury, alcohol, chlorine) manipulations. From the viewpoint of safety, it is desirable for pathogen-derived antigens to be inactivated antigens derived from the above viruses or pathogens.
  • viruses examples include measles virus, rubella virus, mumps virus, poliovirus, rotavirus, norovirus, adenovirus, enterovirus, herpes virus, chickenpox virus, severe acute respiratory syndrome (SARS) virus, novel coronavirus (SARS-CoV-2), human immunodeficiency virus (HIV), human T-cell leukemia virus (HTLV-1), human papillomavirus, Japanese encephalitis virus, West Nile virus, yellow fever virus, dengue virus, Zika virus, hepatitis A virus, hepatitis B virus, hepatitis C virus, hepatitis E virus, respiratory syncytial virus, and influenza virus, with influenza virus being preferred.
  • SARS severe acute respiratory syndrome
  • SARS-CoV-2 novel coronavirus
  • HAV human immunodeficiency virus
  • HTLV-1 human T-cell leukemia virus
  • human papillomavirus Japanese encephalitis virus, West Nile virus, yellow fever virus
  • Pathogenic bacteria include Corynebacterium diphtheriae, Clostridium tetanus, Bordetella pertussis, Neisseria meningitidis, Haemophilus influenzae type b, Streptococcus pneumoniae, Vibrio cholera, Mycobacterium tuberculosis, and periodontal disease bacteria.
  • the dosage form of the vaccine composition may be, for example, a liquid, a suspension, a freeze-dried preparation, etc.
  • the liquid include those dissolved in purified water or a buffer solution, etc.
  • the suspension include those suspended in purified water, a buffer solution, etc. together with methylcellulose, hydroxymethylcellulose, polyvinylpyrrolidone, gelatin, casein, etc.
  • commonly used agents such as absorption enhancers, surfactants, preservatives, stabilizers, moisture-proofing agents, and solubilizing agents can be added as necessary.
  • the vaccine composition of the present invention may contain adjuvant substances other than the compound of the present invention, so long as they do not impair the immunogenicity and safety of the vaccine.
  • adjuvant substances include aluminum salts, squalene emulsion, 3-O-deacylated-4'-monophosphoryl lipid A (MPL), CpG-ODN, and QS-21, which are used in already approved vaccines.
  • the amount of antigen contained in the vaccine composition of the present invention is not particularly limited as long as it is an amount sufficient to induce a specific antibody response, and can be appropriately set taking into consideration the ratio with respect to the adjuvant composition used in combination.
  • an influenza virus split antigen is used as the antigen, it is sufficient that the antigen is contained within the range of 1 to 60 ⁇ g HA (HA equivalent), which is the dose administered per time, and 9 to 15 ⁇ g HA (HA equivalent) is more preferable.
  • the above concentration is a value obtained by measuring the concentration of HA protein using a test method established by WHO or national standards, such as a single radial immunodiffusion test method.
  • the amount of the compound of the present invention contained in the vaccine composition can be adjusted appropriately taking into account the antibody titer, but may be within the range of 150 to 1600 ⁇ g, which is the single dose, and 300 to 800 ⁇ g is more preferable.
  • the route of administration of the vaccine composition of the present invention is not particularly limited, and may be any of injection (subcutaneous administration, intramuscular administration, intradermal administration, intravenous administration), oral administration, and parenteral administration (e.g., nasal administration, ophthalmic administration, vaginal administration, sublingual administration, transdermal administration), and may be administered, for example, by dropping, spraying, or inhaling into the nasal cavity.
  • Subjects to which the adjuvant composition or vaccine composition of the present invention is administered include humans and non-human mammals, with humans being preferred.
  • non-human mammals include mice, rats, hamsters, guinea pigs, rabbits, pigs, cows, horses, goats, sheep, dogs, cats, rhesus monkeys, cynomolgus monkeys, orangutans, chimpanzees, etc.
  • test compounds In the following examples, the test compounds used are shown below.
  • ⁇ GW-405833 Chemical name: (2,3-dichlorophenyl)-[5-methoxy-2-methyl-3-(2-morpholin-4-ylethyl)indol-1-yl]methanone Sold by: Tokyo Chemical Industry Co., Ltd., ⁇ -Caryophyllene Chemical name: (1R,1E,9S)-4,11,11-trimethyl-8-methylene-bicyclo[7.2.0]undec-4-ene Sold by: MedChemExpress LLC ⁇ HU-308 Chemical name: 4-[4-(1,1-dimethylheptyl)-2,6-dimethoxyphenyl]-6,6-dimethyl-bicyclo[3.
  • Example 1 Evaluation of adjuvant activity of CBR2 ligands EHP-101, GW-405833, ⁇ -caryophyllene, GW-842166X, LY2828360 and the endogenous cannabinoid 2-arachidonoylglycerol (2-AG) were dissolved in dimethyl sulfoxide (DMSO) to a concentration of 30 mg/mL, and LY2828360 was similarly dissolved in DMSO to a concentration of 20 mg/mL. The DMSO solutions of these CBR2 ligands were used as adjuvant solutions.
  • DMSO dimethyl sulfoxide
  • influenza HA vaccine of A/H1N1 (A/Victoria/1/2020 strain) and B/Yamagata lineage (B/Phuket/3073/2013 strain) was used as the antigen solution.
  • a test substance not containing an adjuvant was also prepared by further adding phosphate buffered saline containing 0.1% polysorbate 80 instead of the adjuvant solution, and this was used as a control.
  • influenza vaccines containing each CBR2 ligand and control vaccine were administered subcutaneously to the back of BALB/c mice (female, 4 weeks old) (8 mice per group), and whole blood was collected 3 weeks after administration. Serum was prepared from the collected blood by centrifugation, and the IgG (total IgG) titers that specifically bind to the A/Victoria/1/2020 strain and the B/Phuket/3073/2013 strain were measured. The titers of IgG subclasses specific to each influenza antigen were also measured.
  • the IgG titer of the A/Victoria/1/2020 strain (A/H1N1) is shown in FIG. 1. Compared to the control group without adjuvant, the IgG titer tended to be higher in the group administered the vaccine containing EHP-101, GW-405833, and ⁇ -Caryophyllene, and a significant increase was confirmed especially in the vaccine containing GW-405833 (Mann-Whitney U test, p ⁇ 0.05).
  • the IgG titer against the B/Phuket/3073/2013 strain (B/Yamagata lineage) was confirmed to be higher in the group administered the vaccine containing EHP-101, GW-405833, and ⁇ -Caryophyllene, as in the case of A/H1N1, as shown in FIG. 2.
  • the vaccine containing ⁇ -caryophyllene showed significantly higher IgG titers than the control (Mann-Whitney U test, p ⁇ 0.05). Therefore, it was considered that the addition of GW-405833 and ⁇ -caryophyllene to the vaccine enhances the immunity induced by the vaccine.
  • Example 2 Evaluation of NF- ⁇ B activation by CBR2 ligand GW-405833 or ⁇ -Caryophylline was added to 1 ⁇ 10 6 cells/mL Raw264.7 Reporter Cell Line (Novus biologicals, NBP2-26261) at final concentrations of 1, 10, 100, and 1000 ⁇ M, and the cells were cultured at 5% CO 2 and 37° C. for 24 hours, after which the culture medium was collected. The collected culture medium was centrifuged at 12,000 ⁇ g for 30 seconds, and the alkaline phosphatase activity of the supernatant was measured.
  • alkaline phosphatase measurements are shown in Figure 4.
  • alkaline phosphatase was detected at levels equal to or less than that of NC, and was extremely small compared to the Imiquimod-added PC group.
  • a gene for secretory alkaline phosphatase was inserted downstream of the NF- ⁇ B transcription response sequence, and the fact that the amount of alkaline phosphatase in the culture supernatant was comparable to that of NC suggests that these CBR2 ligands do not have the ability to activate NF- ⁇ B.
  • Example 3 Evaluation of the adjuvant activity of CBR2 ligand HU-308
  • a CBR2 ligand, and O-1602 a ligand of GPR55, which is considered to be one of the cannabinoid receptors
  • DMSO dimethyl sulfoxide
  • influenza HA vaccine of A/H1N1 (A/Victoria/1/2020 strain) and phosphate buffered saline containing 0.1% polysorbate 80
  • the CBR2 ligand or O-1602 was adjusted to contain 25, 100, or 400 ⁇ g per 0.3 mL, and the influenza vaccine was adjusted to contain 1 ⁇ g HA.
  • test substances were administered subcutaneously to the back of BALB/c mice (female, 4 weeks old) at 0.3 mL (8 mice per group), and whole blood was collected 3 weeks after administration. Serum was prepared from the obtained blood by centrifugation, and the serum IgG titer (total IgG) that specifically binds to the A/Victoria/1/2020 strain was measured.
  • the measurement results of IgG titer are shown in FIG. 5.
  • a ligand of GPR55 the IgG titer was comparable to the control at any addition amount of 25 to 400 ⁇ g, and no adjuvant activity to enhance antibody induction of the vaccine was confirmed. Therefore, it was thought that a ligand of CBR2, which is expressed low in the central nervous system and highly expressed in peripheral immune tissues, is suitable as an adjuvant targeting the cannabinoid receptor.

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Abstract

ＣＢＲ２アゴニストのアジュバントとしての使用及びアジュバント組成物を提供する。　（２，３－ジクロロフェニル）－［５－メトキシ－２－メチル－３－（２－モルホリン－４－イルエチル）インドール－１－イル］メタノン、（１Ｒ，４Ｅ，９Ｓ）－４，１１，１１－トリメチル－８－メチレンビシクロ［７．２．０］ウンデカ－４－エン、及び４－［４－（１，１－ジメチルヘプチル）－２，６－ジメトキシフェニル］－６，６－ジメチル－ビシクロ［３．１．１］ヘプト－２－エン－２－メタノールから選ばれる１種以上を有効成分とする抗体誘導能促進剤。

Description

アジュバント及びその組成物
　本発明は、カンナビノイド受容体タイプ２アゴニストのアジュバントとしての使用及びその組成物に関する。
　大麻草に由来し、一般的にマリファナとして知られている大麻は、古くから痛み、不安及び食欲不振などに対して使用されてきた。これは、大麻が含むカンナビノイドと呼ばれる活性成分に起因する効果であり、１９６０年代には、主な活性成分であるΔ９－テトラヒロドカンナビノール（ＴＨＣ）や多幸感などの精神症状を呈さないカンナビジオールが発見された。また、１９９０年代には、ＴＨＣの生体内標的分子として、２種類のＧタンパク質共役型受容体が同定され、カンナビノイド受容体タイプ１（ＣＢＲ１）及びタイプ２（ＣＢＲ２）と命名された。更に、これらの受容体の内因性リガンドであるアナンダミドが１９９２年、２－アラキドノイルグリセロールが１９９５年に発見され、カンナビノイド受容体は生理的に重要な役割を担っていると考えられている。
　このカンナビノイド受容体は、中枢、循環器、消化器、肝臓、筋肉、骨及び脾臓・免疫系に広く分布しており、特にＣＢＲ１は脳をはじめとする中枢系、ＣＢＲ２は脾臓・免疫系に主に発現していることが知られている。そのため、ＣＢＲ１はアゴニストの刺激によって神経伝達物質の放出が抑制され、鎮痛作用、起立性低血圧及び多幸感などの種々の薬理活性が惹起され、ＣＢＲ２は炎症細胞や免疫細胞の分化・調整を担うことが報告されている。このようにカンナビノイド受容体は様々な生理活性を有するため、医薬品開発の標的となっている。
　ＣＢＲ１アゴニストとしては、エイズ患者の食欲増進薬及び癌化学療法に対する制吐薬として天然のアゴニストであるＴＨＣをゴマ油に溶解したカプセル剤であるドロナビノール、癌化学療法に対する制吐薬としてＴＨＣの合成誘導体であるナビロン、多発性硬化症の痙縮や痛み及び癌性疼痛に対してＴＨＣを主成分とする口腔内スプレー剤ナビキシモルスが１９９０年代から２０００年代初頭にかけて欧米で承認されている。しかし、これらの医薬品は、起立性低血圧、多幸感などの中枢性の副作用及び依存性のリスクを有しており、使用の制限や厳格な薬剤管理が必要な規制の対象となっている。
　一方で、ＣＢＲ２は主に末梢の免疫系に発現しており、ＣＢＲ２選択的アゴニストはＣＢＲ１のような中枢性の副反応のリスクが無い安全な薬剤であることが期待され、全身性強皮症、アトピー性皮膚炎、変形性関節症痛及び帯状疱疹後疼痛などに対する治療薬として開発を進められた。しかし、炎症性疼痛モデルなどの非臨床試験では明確な鎮痛効果を示し、中枢性の副反応との乖離も確認されているが、種差に起因する薬効の違いから臨床に進んでいるＣＢＲ２アゴニストは、ＧＷ８４２１６６Ｘ、Ｓ－７７７４６９及びＪＢＴ－１０１などに限られている。
　このＣＢＲ２は、ワクチンが誘導する免疫に関連することが報告されている。Ｄｏｔｓｅｙらは、ＣＢＲ２アンタゴニストであるＡＭ６３０やインバースアゴニストであるＪＴＥ９０７をワクチン接種直前に投与しておくことによりワクチン抗原に対する特異的な抗体応答が増強することを報告している（非特許文献１）。併せて、ＣＢＲ２アゴニストであるＡＭ１２４１では、このような活性は確認されておらず、コントロール群とほとんど同程度の抗体応答であるとされている。斯様に、ＣＢＲ２は炎症の促進と抑制といった相反する薬理活性に関連することが知られているが、ワクチンの効果を増強するためにはＣＢＲ２の活性を阻害することが必要であると考えられている。
　一般に、ワクチンでは免疫原性を向上させるためのアジュバントが必要となる場合がある。特に、感染性を消失させた不活化ワクチンや組換えタンパク質のようなサブユニットワクチンは免疫原性が低く、感染防御が可能なレベルまで免疫反応を増強する目的でアジュバントを併用することがある。日本国内で流通するワクチンでも、アルミニウムゲル、Ｍｏｎｏｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌ　ｌｉｐｉｄ（ＭＰＬ）、ＭＰＬ及びＱＳ－２１をリポソームと組み合わせた混合アジュバントであるＡＳ０１Ｂ等がアジュバントとして使われている。
Dotsey E, Ushach I, Pone E, Nakajima R, Jasinskas A, Argueta DA, Dillon A, DiPatrizio N, Davies H, Zlotnik A, Crompton PD, Felgner PL. Transient Cannabinoid Receptor 2 Blockade during Immunization Heightens Intensity and Breadth of Antigen-specific Antibody Responses in Young and Aged mice. Sci Rep.2017 Feb 17;7:42584.
　本発明は、カンナビノイド受容体タイプ２（ＣＢＲ２）アゴニストのアジュバントとしての使用及びアジュバント組成物を提供することに関する。
　本発明者らは、ワクチン効果を高める物質について鋭意研究したところ、特定のＣＢＲ２アゴニストに抗体誘導能を高める免疫賦活化効果があり、ワクチンとの併用によりワクチン抗原に特異的な免疫の強度を高められることを見出した。これは、ＣＢＲ２の活性を阻害すると、ワクチンに対してアジュバント様の効果が発揮されるとの既報告（前記非特許文献１）からすると全く意外なことである。
　すなわち、本発明は、以下の１）～８）に係るものである。
　１）（２，３－ジクロロフェニル）－［５－メトキシ－２－メチル－３－（２－モルホリン－４－イルエチル）インドール－１－イル］メタノン、（１Ｒ，４Ｅ，９Ｓ）－４，１１，１１－トリメチル－８－メチレンビシクロ［７．２．０］ウンデカ－４－エン、及び４－［４－（１，１－ジメチルヘプチル）－２，６－ジメトキシフェニル］－６，６－ジメチル－ビシクロ［３．１．１］ヘプト－２－エン－２－メタノールから選ばれる１種以上を有効成分とする抗体誘導能促進剤。
　２）（２，３－ジクロロフェニル）－［５－メトキシ－２－メチル－３－（２－モルホリン－４－イルエチル）インドール－１－イル］メタノン、（１Ｒ，４Ｅ，９Ｓ）－４，１１，１１－トリメチル－８－メチレンビシクロ［７．２．０］ウンデカ－４－エン、及び４－［４－（１，１－ジメチルヘプチル）－２，６－ジメトキシフェニル］－６，６－ジメチル－ビシクロ［３．１．１］ヘプト－２－エン－２－メタノールから選ばれる１種以上、及び薬学的に許容される担体を含有するアジュバンド組成物。
　３）（２，３－ジクロロフェニル）－［５－メトキシ－２－メチル－３－（２－モルホリン－４－イルエチル）インドール－１－イル］メタノン、（１Ｒ，４Ｅ，９Ｓ）－４，１１，１１－トリメチル－８－メチレンビシクロ［７．２．０］ウンデカ－４－エン、及び４－［４－（１，１－ジメチルヘプチル）－２，６－ジメトキシフェニル］－６，６－ジメチル－ビシクロ［３．１．１］ヘプト－２－エン－２－メタノールから選ばれる１種以上、薬学的に許容される担体、及びワクチン抗原を含有するワクチン組成物。
　４）ワクチン抗原がインフルエンザウイルスである、３）のワクチン組成物。
　５）抗体誘導能促進剤を製造するための、（２，３－ジクロロフェニル）－［５－メトキシ－２－メチル－３－（２－モルホリン－４－イルエチル）インドール－１－イル］メタノン、（１Ｒ，４Ｅ，９Ｓ）－４，１１，１１－トリメチル－８－メチレンビシクロ［７．２．０］ウンデカ－４－エン、及び４－［４－（１，１－ジメチルヘプチル）－２，６－ジメトキシフェニル］－６，６－ジメチル－ビシクロ［３．１．１］ヘプト－２－エン－２－メタノールから選ばれる１種以上の使用。
　６）アジュバンドを製造するための、（２，３－ジクロロフェニル）－［５－メトキシ－２－メチル－３－（２－モルホリン－４－イルエチル）インドール－１－イル］メタノン、（１Ｒ，４Ｅ，９Ｓ）－４，１１，１１－トリメチル－８－メチレンビシクロ［７．２．０］ウンデカ－４－エン、及び４－［４－（１，１－ジメチルヘプチル）－２，６－ジメトキシフェニル］－６，６－ジメチル－ビシクロ［３．１．１］ヘプト－２－エン－２－メタノールから選ばれる１種以上の使用。
　７）抗体誘導能を促進するための、（２，３－ジクロロフェニル）－［５－メトキシ－２－メチル－３－（２－モルホリン－４－イルエチル）インドール－１－イル］メタノン、（１Ｒ，４Ｅ，９Ｓ）－４，１１，１１－トリメチル－８－メチレンビシクロ［７．２．０］ウンデカ－４－エン、及び４－［４－（１，１－ジメチルヘプチル）－２，６－ジメトキシフェニル］－６，６－ジメチル－ビシクロ［３．１．１］ヘプト－２－エン－２－メタノールから選ばれる１種以上。
　８）（２，３－ジクロロフェニル）－［５－メトキシ－２－メチル－３－（２－モルホリン－４－イルエチル）インドール－１－イル］メタノン、（１Ｒ，４Ｅ，９Ｓ）－４，１１，１１－トリメチル－８－メチレンビシクロ［７．２．０］ウンデカ－４－エン、及び４－［４－（１，１－ジメチルヘプチル）－２，６－ジメトキシフェニル］－６，６－ジメチル－ビシクロ［３．１．１］ヘプト－２－エン－２－メタノールから選ばれる１種以上をワクチン抗原と共に動物に投与する、ワクチン療法。
　本発明によれば、安全性の高いＣＢＲ２アゴニストを用いてワクチンの有効性を高めることが可能となり、品質の高い予防薬の創出として医薬品産業に大きく貢献できる。
単回投与、Ｄａｙ２１のＡ／Ｖｉｃｔｏｒｉａ／１／２０２０株（Ａ／Ｈ１Ｎ１）に対するＩｇＧ抗体価。 単回投与、Ｄａｙ２１のＢ／Ｐｈｕｋｅｔ／３０７３／２０１３株（Ｂ／Ｙａｍａｇａｔａ系統）に対するＩｇＧ抗体価。 単回投与、Ｄａｙ２１のＡ／Ｖｉｃｔｏｒｉａ／１／２０２０株（Ａ／Ｈ１Ｎ１）に対する各ＩｇＧサブクラスの抗体価。 単回投与、Ｄａｙ２１のＢ／Ｐｈｕｋｅｔ／３０７３／２０１３株（Ｂ／Ｙａｍａｇａｔａ系統）に対するＩｇＧサブクラスの抗体価。 ＳＥＡＰレポーターアッセイによるＮＦ－κＢの活性評価。 ＨＵ-３０８のアジュバント活性評価におけるＡ／Ｖｉｃｔｏｒｉａ／１／２０２０株（Ａ／Ｈ１Ｎ１）に対するＩｇＧ抗体価。
　以下に本発明の好適な実施形態について詳細に説明する。ただし、本発明は以下の実施形態に限定されるものではない。
　本発明において、（２，３－ジクロロフェニル）－［５－メトキシ－２－メチル－３－（２－モルホリン－４－イルエチル）インドール－１－イル］メタノンはＧＷ－４０５８３３とも称され、（１Ｒ，４Ｅ，９Ｓ）－４，１１，１１－トリメチル－８－メチレンビシクロ［７．２．０］ウンデカ－４－エンはβ－カリオフィレンとも称され、４－［４－（１，１－ジメチルヘプチル）－２，６－ジメトキシフェニル］－６，６－ジメチル－ビシクロ［３．１．１］ヘプト－２－エン－２－メタノールはＨＵ－３０８とも称され、何れもＣＢＲ２アゴニストとして知られている化合物である。
　ＣＢＲ２アゴニストとは、ＣＢＲ２に結合することでその情報を細胞内へ伝達してＣＢＲ２活性化を介した生理活性を発揮させる物質を指し、これらの他に、ＥＨＰ－１０１、ＧＷ－８４２１６６Ｘ、ＬＹ２８２８３６０等の化合物も見出されている。また、ＣＢＲ２に結合する内因性カンナビノイドとして、２－アラキドノイルグリセロール（２－ＡＧ）が知られている。
　斯かるＧＷ－４０５８３３、β－カリオフィレン及びＨＵ－３０８（「本発明の化合物」と称する）は下記表１に示す化学構造を有し、何れも公知の化学合成法により製造でき、また市販品を購入して使用することもできる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　斯かる本発明の化合物は、本発明の抗体誘導能促進剤、アジュバンド組成物又はワクチン組成物において、それぞれを単独で使用することができ、また２種以上を組み合わせて使用することもできる。
　後述実施例に示すように、日本国内で流通するインフルエンザウイルスのスプリットワクチンに本発明の化合物を添加して調製したワクチン組成物をマウスに皮下注射した際に誘導される、当該抗原に特異的ＩｇＧの力価は、ワクチンのみを投与した群に対して有意に高くなる。また、ＩｇＧサブクラスの幾何平均抗体価（ＧＭＴ）の比較においても、これらのＣＢＲ２アゴニストの添加により、ＩｇＧ１に加えてＩｇＧ２ａ及びＩｇＧ２ｂの抗体価も顕著に上昇する。
　すなわち、本発明の化合物は、免疫原（抗原）を投与するワクチン療法において、当該抗原に特異的な免疫の強度を高める、抗体誘導能促進剤となり、当該化合物はアジュバントとして使用できる。また本発明の化合物と薬学上許容される担体を含む組成物はアジュバント組成物になり得る。また、本発明の化合物は、抗体誘導能促進剤を製造するため、又はアジュバント組成物を製造するために使用できる。
　ここで、抗体誘導能促進とは、抗原に特異的な免疫の強度を高める作用、具体的には抗原特異的なＩｇＧ抗体価を増強する作用を意味する。
　斯かる抗体誘導能促進剤は、抗原の抗体誘導能を促進する、ヒト若しくは動物用の医薬品素材又は製剤となり得る。アジュバント組成物は、抗原の抗体誘導能を促進する、すなわちアジュバント活性を有するヒト若しくは動物用の医薬品製剤となり得る。
　斯かる医薬品製剤は、本発明の化合物を薬学的に許容される担体、例えば賦形剤、結合剤、増量剤、崩壊剤、滑沢剤、分散剤、緩衝剤、嬌味剤、希釈剤等を適宜組み合わせて調製することができる。
　本発明の抗体誘導能促進剤及びアジュバント組成物は、抗原と組み合わせて投与することができ、投与は抗原の投与と同時であっても、抗原の投与の前又は後であっても良い。
　本発明のアジュバント組成物の投与量は、投与対象、投与方法、投与形態、抗原の種類に応じて適宜決定することができる。
　本発明の抗体誘導能促進剤及びアジュバント組成物は、抗原と組み合わせてヒトを含む動物に投与するためのワクチン組成物とすることができ、さらに上述の薬学的に許容される担体を適宜添加して適当な製剤にすることができる。本発明のワクチン組成物において、本発明の化合物は抗原若しくはその他成分と化学的結合状態にあっても良く、遊離の分子状態で存在しても良い。
　抗原としては、病原体から精製された天然の生産物、又は遺伝子組換え等の手法により人為的に作製されたタンパク質若しくはペプチドが該当し、具体的には完全なウイルス粒子であるビリオン、不完全ウイルス粒子、ウイルス構造タンパク質、ウイルス非構造タンパク質、病原菌の全菌体、病原菌由来のタンパク質、糖タンパク質、莢膜多糖体、感染防御抗原、中和エピトープ等が挙げられ、感染性を有するものと感染性を消失させたもの（不活化抗原）とが含まれる。不活化抗原としては、例えば、物理的（Ｘ線照射、ＵＶ照射、熱、超音波）、化学的（ホルマリン、ベータプロピオラクトン、バイナリーエチレンイミン、水銀、アルコール、塩素）等の操作により不活化されたものが挙げられるが、それらに限定されない。病原体由来の抗原は、安全性の観点から、上記ウイルス又は病原菌由来の不活化抗原であることが望ましい。
　ウイルスとしては、例えば麻疹ウイルス、風疹ウイルス、ムンプスウイルス、ポリオウイルス、ロタウイルス、ノロウイルス、アデノウイルス、エンテロウイルス、ヘルペスウイルス、水痘ウイルス、重症急性呼吸器感染症候群（ＳＡＲＳ）ウイルス、新型コロナウイルス（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、ヒトＴ細胞白血病ウイルス（ＨＴＬＶ－１）、ヒトパピローマウイルス、日本脳炎ウイルス、ウエストナイルウイルス、黄熱ウイルス、デングウイルス、ジカウイルス、Ａ型肝炎ウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、Ｅ型肝炎ウイルス、ＲＳウイルス、インフルエンザウイルス等が挙げられ、好ましくはインフルエンザウイルスである。
　病原菌としては、ジフテリア菌、破傷風菌、百日咳菌、髄膜炎菌、インフルエンザｂ型菌、肺炎球菌、コレラ菌、結核菌、歯周病菌等が挙げられる。
　ワクチン組成物の剤形としては、例えば、液剤、懸濁剤、凍結乾燥製剤等が挙げられる。液剤としては、精製水、緩衝液に溶解したもの等が挙げられる。懸濁剤としては、メチルセルロース、ヒドロキシメチルセルロース、ポリビニルビロリドン、ゼラチン、カゼイン等と共に精製水、緩衝液等に懸濁させたもの等が挙げられる。
　これらの製剤には、通常使用されている吸収促進剤、界面活性剤、保存剤、安定化剤、防湿剤、溶解補助剤等を必要に応じて添加することができる。
　なお、本発明のワクチン組成物には、当該ワクチンの免疫原性及び安全性を害さない限りにおいて、本発明の化合物以外のアジュバント物質を含有することもでき、例えば、既承認のワクチンで使用されているアルミニウム塩、スクワレンエマルジョン、３－Ｏ－脱アシル化－４′－モノホスホリルリピドＡ（ＭＰＬ）、ＣｐＧ－ＯＤＮ若しくはＱＳ－２１等が挙げられる。
　本発明のワクチン組成物に含まれる抗原の量は、特異的抗体応答を誘導するのに十分な量であれば特に限定されるものではなく、併用するアジュバント組成物との比率も勘案して適宜設定することができる。例えば、抗原としてインフルエンザウイルスのスプリット抗原を用いた場合、１回の投与用量である１～６０μｇ　ＨＡ（ＨＡ換算）の範囲内で含有すればよく、９～１５μｇＨＡ（ＨＡ換算）がより好ましい。前記濃度は、ＨＡタンパク質の濃度を一元放射免疫拡散試験法等の、ＷＨＯや国の基準で定められた試験法で測定することによって得られる値である。
　また、ワクチン組成物における本発明の化合物の含有量は、抗体力価を考慮して適宜調整可能であるが、例えば１回の投与用量である１５０～１６００μｇの範囲内で含有すればよく、３００～８００μｇがより好ましい。
　本発明のワクチン組成物の投与経路は特に限定されず、注射による投与（皮下投与、筋肉内投与、皮内投与、静脈内投与）、経口投与、非経口投与（例えば、鼻腔投与、点眼投与、経膣投与、舌下投与、経皮投与）のいずれでもよく、例えば、鼻腔内に滴下、噴霧又はスプレーすることにより投与される。
　本発明のアジュバント組成物又はワクチン組成物の投与対象は、ヒト及びヒトを除く哺乳動物が挙げられるが、ヒトが好ましい。ヒトを除く哺乳動物としては、例えば、マウス、ラット、ハムスター、モルモット、ウサギ、ブタ、ウシ、ウマ、ヤギ、ヒツジ、イヌ、ネコ、アカゲザル、カニクイザル、オランウータン、チンパンジー等が挙げられる。
　以下、本発明を実施例により具体的に説明するが、本発明はこれらに何ら限定されるものではない。
＜試験化合物＞
　下記実施例において、用いた試験化合物を以下に示す。
・ＧＷ-４０５８３３
　化学名：（2,3-dichlorophenyl)-[5-methoxy-2-methyl-3-(2-morpholin-4-ylethyl)indol-1-yl]methanone
　　販売元：東京化成工業株式会社
・β－Ｃａｒｙｏｐｈｙｌｌｅｎｅ
　化学名：(1R,1E,9S)-4,11,11-trimethyl-8-methylene-bicyclo[7.2.0]undec-4-ene
　　販売元：ＭｅｄＣｈｅｍＥｘｐｒｅｓｓ　ＬＬＣ
・ＨＵ－３０８
　化学名：4-[4-(1,1-dimethylheptyl)-2,6-dimethoxyphenyl]-6,6-dimethyl-bicyclo[3. 1.1]hept-2-ene-2-methanol
　　販売元：ａｂｃａｍ
・ＥＨＰ-１０１：
　化学名：(1’R,6’R)-3-(Benzylamine)-6-hydroxy-3’-methyl-4-pentyl-6’-(prop-1-en-2-yl)[1,1’-bi(cyclohexane)]-2',3,6-triene-2,5-dione
　　販売元：ＭｅｄＣｈｅｍＥｘｐｒｅｓｓ　ＬＬＣ
　・ＧＷ－８４２１６６Ｘ
　化学名：2-(2,4-dichloroanilino)-N-(tetrahydropyran-4-ylmethyl)-4-(trifluoromethyl)pyrimidine-5-carboxamide
　　販売元：富士フイルム和光純薬株式会社
　・ＬＹ２８２８３６０
　化学名：8-(2-chlorophenyl)-2-methyl-6-(4-methylpiperazin-1-yl)-9-tetrahydropyran-4-yl-purine
　販売元：ＭｅｄＣｈｅｍＥｘｐｒｅｓｓ　ＬＬＣ
　・２－ＡＧ
　化学名：2-arachidonoyl glycerol
　販売元：Ｔｏｃｒｉｓ　Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ
　・Ｏ－１６０２（ＧＰＲ５５　アゴニスト）
　化学名：5-Methyl-4-[(1R,6R)-3-methyl-6-(1-methylethenyl)-2-cyclohexen-1-yl]-1, 3-benzenediol
　販売元：ａｂｃａｍ
実施例１　ＣＢＲ２リガンドのアジュバント活性評価
　ＥＨＰ－１０１、ＧＷ－４０５８３３、β－Ｃａｒｙｏｐｈｙｌｌｅｎｅ、ＧＷ－８４２１６６Ｘ、ＬＹ２８２８３６０及び内因性カンナビノイドである２－ａｒａｃｈｉｄｏｎｏｙｌｇｌｙｃｅｒｏｌ（２－ＡＧ）を３０ｍｇ／ｍＬとなるようにジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）に溶解し、同様にＬＹ２８２８３６０は２０ｍｇ／ｍＬとなるようにＤＭＳＯに溶解した。これらＣＢＲ２リガンドのＤＭＳＯ溶解液をアジュバント溶液とした。
　また、Ａ／Ｈ１Ｎ１（Ａ／Ｖｉｃｔｏｒｉａ／１／２０２０株）及びＢ／Ｙａｍａｇａｔａ系統（Ｂ／Ｐｈｕｋｅｔ／３０７３／２０１３株）のインフルエンザＨＡワクチンの原液を抗原溶液とした。アジュバント溶液、抗原溶液及び０．１％ポリソルベート８０含有リン酸緩衝生理食塩液を混合し、０．３ｍＬ当たり各ＣＢＲ２リガンドが０．４ｍｇ、抗原は各株１μｇＨＡに調整した。なお、アジュバント溶液の代わりに０．１％ポリソルベート８０含有リン酸緩衝生理食塩液を更に加えたアジュバント非含有の被験物質も調製し、これを対照とした。
　各ＣＢＲ２リガンドを含むインフルエンザワクチン及び対照のワクチンを、ＢＡＬＢ／ｃマウス（雌、４週齢）の後背部皮下に０．３ｍＬを投与し（各群８匹）、投与から３週間後に全採血した。得られた血液より遠心分離によって血清を調製し、血清のＡ／Ｖｉｃｔｏｒｉａ／１／２０２０株及びＢ／Ｐｈｕｋｅｔ／３０７３／２０１３株に特異的に結合するＩｇＧ（Ｔｏｔａｌ　ＩｇＧ）力価を測定した。また、併せて各インフルエンザ抗原に特異的なＩｇＧサブクラスの力価についても測定した。
　Ａ／Ｖｉｃｔｏｒｉａ／１／２０２０株（Ａ／Ｈ１Ｎ１）のＩｇＧ力価は、図１に示す通りである。対照であるアジュバント非添加群に比べて、ＥＨＰ－１０１、ＧＷ－４０５８３３、β－Ｃａｒｙｏｐｈｙｌｌｅｎｅを加えたワクチンの投与群ではＩｇＧ力価が高い傾向が確認され、特にＧＷ－４０５８３３を加えたワクチンでは、有意な上昇が確認された（Ｍａｎｎ－Ｗｈｉｔｎｅｙ　Ｕ　ｔｅｓｔ、ｐ＜０．０５）。また、Ｂ／Ｐｈｕｋｅｔ／３０７３／２０１３株（Ｂ／Ｙａｍａｇａｔａ系統）に対するＩｇＧ力価は、図２に示すようにＡ／Ｈ１Ｎ１と同様にＥＨＰ－１０１、ＧＷ－４０５８３３、β－Ｃａｒｙｏｐｈｙｌｌｅｎｅを加えたワクチンの投与群でＩｇＧ力価が高い傾向が確認された。更に、Ｂ／Ｙａｍａｇａｔａ系統では、β－Ｃａｒｙｏｐｈｙｌｌｅｎｅを加えたワクチンが、対照に対して有意に高いＩｇＧ力価を示した（Ｍａｎｎ－Ｗｈｉｔｎｅｙ　Ｕ　ｔｅｓｔ、ｐ＜０．０５）。したがって、ＧＷ－４０５８３３及びβ－Ｃａｒｙｏｐｈｙｌｌｅｎｅをワクチンに加えることで、ワクチンが誘導する免疫が増強すると考えられた。
　インフルエンザ抗原に特異的な各ＩｇＧサブクラスの結果を図３Ａ（Ａ／Ｖｉｃｔｏｒｉａ／１／２０２０株（Ａ／Ｈ１Ｎ１））及び図３Ｂ（Ｂ／Ｐｈｕｋｅｔ／３０７３／２０１３株（Ｂ／Ｙａｍａｇａｔａ系統））に示す。図３Ａ及びＢに示す通り、ワクチンへのＧＷ－４０５８３３若しくはβ－Ｃａｒｙｏｐｈｙｌｌｅｎｅの添加により、主に誘導されるＩｇＧ１だけでなく、ＩｇＧ２ａ及びＩｇＧ２ｂの誘導も上昇することが確認され、これらＣＢＲ２アゴニストにより様々なサブクラスの誘導が高まることが示唆された。インフルエンザウイルスに対する感染防御では、Ｔｈ１の誘導が重要であると考えられているため、Ｔｈ１拘束性のサブクラスであるＩｇＧ２ａの誘導が高まることでワクチンによる感染防御効果の向上が期待される。
実施例２　ＣＢＲ２リガンドによるＮＦ－κＢ活性化の評価
　１×１０６ｃｅｌｌｓ/ｍＬのＲａｗ２６４．７　Ｒｅｐｏｒｔｅｒ　Ｃｅｌｌ　Ｌｉｎｅ（Ｎｏｖｕｓ　ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ，　ＮＢＰ２－２６２６１）へ終濃度として１，１０、１００及び１０００μＭとなるようＧＷ－４０５８３３若しくはβ－Ｃａｒｙｏｐｈｙｌｌｅｎｅを添加し、５％　ＣＯ２、３７℃で２４時間培養した後、培養液を回収した。回収した培養液は、１２，０００×ｇで３０秒間遠心分離して、その上清のアルカリフォスファターゼを測定した。アルカリフォスファターゼの測定には、Ｓｅｃｒｅｔｅｄ　Ａｌｋａｌｉｎｅ　Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ　Ｒｅｐｏｒｔｅｒ　Ｇｅｎｅ　Ａｓｓａｙ　Ｋｉｔ，　Ｌｕｍｉｎｏｍｅｔｒｉｃ，　ＳｅｎｓｏＬｙｔｅ（ＡｎａＳｐｅｃ，　Ｉｎｃ．）を使用した。また、陰性対照（ＮＣ）として培地である１０％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ、陽性対照（ＰＣ）としてＴｏｌｌ－ｌｉｋｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ７のアゴニストであるＩｍｉｑｕｉｍｏｄ（終濃度：５μｇ／ｍＬ）を添加して、これらと比較評価した。
　アルカリフォスファターゼの測定結果は図４に示す通りであるが、１～１０００μＭのＧＷ－４０５８３３若しくはβ－Ｃａｒｙｏｐｈｙｌｌｅｎｅの添加群では、いずれもＮＣと同等以下のアルカリフォスファターゼが検出されたのみであり、ＰＣのＩｍｉｑｕｉｍｏｄ添加群と比べると極めて少量であることがわかる。Ｒａｗ２６４．７　Ｒｅｐｏｒｔｅｒ　Ｃｅｌｌ　Ｌｉｎｅでは、ＮＦ－κＢの転写応答配列の下流に分泌型アルカリフォスファターゼの遺伝子を組み込んでいるため、培養上清のアルカリフォスファターゼの量がＮＣと同程度ということは、これらＣＢＲ２リガンドはＮＦ－κＢの活性化能を有していないと考えられた。したがって、ＧＷ－４０５８３３やβ－Ｃａｒｙｏｐｈｙｌｌｅｎｅのアジュバント活性の機序は明確にはできていないが、少なくともＴＬＲ等のＮＦ－κＢの活性化を促す自然免疫系の受容体に交叉反応しているわけではないと推察する。
実施例３　ＣＢＲ２リガンドＨＵ－３０８のアジュバント活性評価
　実施例１と同様に、ＣＢＲ２リガンドであるＨＵ－３０８及びカンナビノイド受容体の１つとして考えられているＧＰＲ５５のリガンドであるＯ－１６０２をそれぞれＤＭＳＯに３０ｍｇ／ｍＬとなるように溶解し、これをＡ／Ｈ１Ｎ１（Ａ／Ｖｉｃｔｏｒｉａ／１／２０２０株）のインフルエンザＨＡワクチンの原液及び０．１％ポリソルベート８０含有リン酸緩衝生理食塩液と混合し、０．３ｍＬ当たりＣＢＲ２リガンド若しくはＯ－１６０２が２５、１００若しくは４００μｇ、インフルエンザワクチンが１μｇＨＡ含有するよう調整した。これら被験物質を、ＢＡＬＢ／ｃマウス（雌、４週齢）の後背部皮下に０．３ｍＬを投与し（各群８匹）、投与から３週間後に全採血した。得られた血液より遠心分離によって血清を調製し、血清のＡ／Ｖｉｃｔｏｒｉａ／１／２０２０株に特異的に結合するＩｇＧ（Ｔｏｔａｌ　ＩｇＧ）力価を測定した。
　ＩｇＧ力価の測定結果を図５に示すが、ＣＢＲ２リガンドであるＨＵ－３０８を添加することで用量依存的なＩｇＧ力価の上昇が確認され、４００μｇの添加では対照であるインフルエンザワクチン抗原のみと比較して、有意に上昇していることが確認された（Ｍａｎｎ－Ｗｈｉｔｎｅｙ　Ｕ　ｔｅｓｔ、ｐ＜０．０１）。一方で、ＧＰＲ５５のリガンドであるＯ－１６０２では、２５～４００μｇのいずれの添加量においてもＩｇＧ力価は対照と同程度であり、ワクチンの抗体誘導を増強するアジュバント活性は確認されなかった。したがって、カンナビノイド受容体を標的としたアジュバントとしては、中枢での発現が低く、末梢の免疫組織で発現が多いＣＢＲ２のリガンドがターゲットとして適していると考えられた。
 
 

Claims (8)

  1. 　（２，３－ジクロロフェニル）－［５－メトキシ－２－メチル－３－（２－モルホリン－４－イルエチル）インドール－１－イル］メタノン、（１Ｒ，４Ｅ，９Ｓ）－４，１１，１１－トリメチル－８－メチレンビシクロ［７．２．０］ウンデカ－４－エン、及び４－［４－（１，１－ジメチルヘプチル）－２，６－ジメトキシフェニル］－６，６－ジメチル－ビシクロ［３．１．１］ヘプト－２－エン－２－メタノールから選ばれる１種以上を有効成分とする抗体誘導能促進剤。
  2. 　（２，３－ジクロロフェニル）－［５－メトキシ－２－メチル－３－（２－モルホリン－４－イルエチル）インドール－１－イル］メタノン、（１Ｒ，４Ｅ，９Ｓ）－４，１１，１１－トリメチル－８－メチレンビシクロ［７．２．０］ウンデカ－４－エン、及び４－［４－（１，１－ジメチルヘプチル）－２，６－ジメトキシフェニル］－６，６－ジメチル－ビシクロ［３．１．１］ヘプト－２－エン－２－メタノールから選ばれる１種以上、及び薬学的に許容される担体を含有するアジュバンド組成物。
  3. 　（２，３－ジクロロフェニル）－［５－メトキシ－２－メチル－３－（２－モルホリン－４－イルエチル）インドール－１－イル］メタノン、（１Ｒ，４Ｅ，９Ｓ）－４，１１，１１－トリメチル－８－メチレンビシクロ［７．２．０］ウンデカ－４－エン、及び４－［４－（１，１－ジメチルヘプチル）－２，６－ジメトキシフェニル］－６，６－ジメチル－ビシクロ［３．１．１］ヘプト－２－エン－２－メタノールから選ばれる１種以上、薬学的に許容される担体、及びワクチン抗原を含有するワクチン組成物。
  4. 　ワクチン抗原がインフルエンザウイルスである、請求項３記載のワクチン組成物。
  5. 　抗体誘導能促進剤を製造するための、（２，３－ジクロロフェニル）－［５－メトキシ－２－メチル－３－（２－モルホリン－４－イルエチル）インドール－１－イル］メタノン、（１Ｒ，４Ｅ，９Ｓ）－４，１１，１１－トリメチル－８－メチレンビシクロ［７．２．０］ウンデカ－４－エン、及び４－［４－（１，１－ジメチルヘプチル）－２，６－ジメトキシフェニル］－６，６－ジメチル－ビシクロ［３．１．１］ヘプト－２－エン－２－メタノールから選ばれる１種以上の使用。
  6. 　アジュバンドを製造するための、（２，３－ジクロロフェニル）－［５－メトキシ－２－メチル－３－（２－モルホリン－４－イルエチル）インドール－１－イル］メタノン、（１Ｒ，４Ｅ，９Ｓ）－４，１１，１１－トリメチル－８－メチレンビシクロ［７．２．０］ウンデカ－４－エン、及び４－［４－（１，１－ジメチルヘプチル）－２，６－ジメトキシフェニル］－６，６－ジメチル－ビシクロ［３．１．１］ヘプト－２－エン－２－メタノールから選ばれる１種以上の使用。
  7. 　抗体誘導能を促進するための、（２，３－ジクロロフェニル）－［５－メトキシ－２－メチル－３－（２－モルホリン－４－イルエチル）インドール－１－イル］メタノン、（１Ｒ，４Ｅ，９Ｓ）－４，１１，１１－トリメチル－８－メチレンビシクロ［７．２．０］ウンデカ－４－エン、及び４－［４－（１，１－ジメチルヘプチル）－２，６－ジメトキシフェニル］－６，６－ジメチル－ビシクロ［３．１．１］ヘプト－２－エン－２－メタノールから選ばれる１種以上。
  8. 　（２，３－ジクロロフェニル）－［５－メトキシ－２－メチル－３－（２－モルホリン－４－イルエチル）インドール－１－イル］メタノン、（１Ｒ，４Ｅ，９Ｓ）－４，１１，１１－トリメチル－８－メチレンビシクロ［７．２．０］ウンデカ－４－エン、及び４－［４－（１，１－ジメチルヘプチル）－２，６－ジメトキシフェニル］－６，６－ジメチル－ビシクロ［３．１．１］ヘプト－２－エン－２－メタノールから選ばれる１種以上をワクチン抗原と共に動物に投与する、ワクチン療法。
     
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