WO2024257725A1 - 分析デバイス - Google Patents

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晴信 前田
毅 山本
啓司 宮▲崎▼
慎 深津
淳 三浦
正典 田中
風花 榎戸
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Definitions

  • the present invention relates to an analytical device having a flow path region formed inside a porous substrate, an electrolyte concentration measurement system using the analytical device, and an electrolyte concentration measurement method.
  • ⁇ PADs microfluidic paper-based analytical devices
  • POC point of care
  • Electrolytes Na ions, K ions, Cl ions, etc.
  • An electrolyte test measures the concentration of electrolyte ions in the blood and urine to confirm the balance of ion concentrations in the body.
  • electrolyte tests are essential for screening for illnesses. They are also extremely important tests for checking the physiological functions (life support) of patients at disaster sites, etc. Research aimed at using ⁇ PADs to measure electrolytes is being conducted at various universities and companies.
  • Non-Patent Document 1 proposes an analytical device for measuring the concentrations of Na ions and K ions.
  • This analytical device has a dispensing section for dispensing a sample, and the dispensed sample permeates from the dispensing section into the working electrode and reference electrode regions, electrically connecting the two electrodes to measure the potential difference.
  • KCl ion crystals are deposited on the reference electrode to obtain a stable potential at the reference electrode, and when KCl dissolves in the sample during measurement, a high concentration of Cl ions is maintained in the reference electrode region, and a stable reference electrode potential can be obtained.
  • Patent Document 1 discloses a multi-ion sensor plate in which the sample liquid supplied to the working electrode section and the reference liquid supplied to the reference electrode section come into contact at the liquid junction to obtain a stable potential.
  • Non-Patent Document 1 when measuring samples that contain proteins as components, such as serum or plasma, when the sample permeates the electrolyte layer (KCl layer), the hydration water of the hydrated protein is easily taken away by the electrolyte, which makes it easy for salting out or aggregation of the protein to occur. As a result, the salting out and aggregated proteins inhibit the permeation of the sample in the flow path, which can cause the measurement potential to become unstable or the measurement time to be long.
  • KCl layer electrolyte layer
  • Patent Document 1 also discloses two configurations: one in which the sample contains a surfactant to maintain the dispersibility of hydrophobic substances (hematocrit or similar substances) contained in the sample liquid and prevent their settling (precipitation), and the other in which a surfactant coating is provided on the flow path leading to the sample liquid side electrode.
  • a surfactant coating is provided on the flow path leading to the sample liquid side electrode.
  • the present invention aims to provide an analytical device that has a layer that suppresses salting out and aggregation of proteins positioned at an appropriate position, shows an appropriate reference electrode potential, and enables simple and stable analysis.
  • the present invention provides an analytical device having a flow path region surrounded by a flow path wall provided inside a porous substrate,
  • the flow channel region includes a first flow channel chamber, a second flow channel chamber, and a flow path connecting the first flow path chamber and the second flow path chamber,
  • a reference electrode is disposed in the first flow chamber,
  • a working electrode is disposed in the second flow chamber,
  • An electrolyte is disposed upstream of the first flow chamber or on the surface of the reference electrode;
  • Component A is disposed upstream of the location where the electrolyte is disposed;
  • the present invention relates to an analytical device characterized in that the component A is a component that has an effect of changing the three-dimensional structure of a protein in a sample.
  • the present invention provides an analytical device that can perform simple analysis with stable measured potential.
  • the specimen and component A can be effectively mixed, suppressing salting out of the electrolyte placed near the reference electrode, and enabling testing with a small amount of specimen.
  • FIG. 2 is a diagram showing the configuration of a reference electrode.
  • FIG. 1B is a cross-sectional view of the reference electrode taken along the dashed line in FIG. 1A.
  • FIG. 2C is a cross-sectional view of the conventional configuration taken along the dashed line in FIG. 2B.
  • FIG. 1 is a configuration diagram of a conventional example.
  • FIG. 13 is a diagram showing the change in potential over time when a serum sample is measured using a conventional configuration.
  • FIG. 13 is a diagram showing the change in potential over time when an ultrafiltered serum sample is measured using a conventional configuration.
  • FIG. 1 is a configuration diagram of an analytical device according to a first embodiment.
  • FIG. 4 is a configuration diagram of a flow path pattern.
  • FIG. 1 is a graph showing the change in potential over time when a serum sample is measured using only the reference electrode of Example 1.
  • FIG. 1 is a graph showing the change in potential over time when a serum sample is measured using only the reference electrode of Example 1.
  • FIG. 1 is a graph showing the change in potential over time when a serum sample is measured using only the reference electrode of Example 1.
  • FIG. 2 is a graph showing the change in potential over time when a serum sample is measured using a combination of the reference electrode and working electrode of Example 1.
  • FIG. 13 is a diagram showing the change in potential over time when a serum sample is measured using the configuration of the comparative example of Example 1.
  • FIG. 13 is a graph showing the change in potential over time when a serum sample is measured using only the reference electrode of Example 2.
  • FIG. 13 is a graph showing the change in potential over time when a serum sample is measured using only the reference electrode of Example 2.
  • the role of the reference electrode in the electrolyte concentration measurement of the present invention is to provide a reference potential for the potential generated at the working electrode. Therefore, if the potential of the reference electrode is not stable, the potential difference between the reference electrode and the working electrode will be inaccurate.
  • an Ag/AgCl electrode is used as the base electrode of a reference electrode.
  • the following equilibrium reaction occurs at the interface with the sample, and the potential is determined by the Cl- concentration. Therefore, by keeping the Cl - concentration constant, the potential can be stabilized.
  • the Cl- concentration is constant in saturated sodium chloride (NaCl) or potassium chloride (KCl) solutions, the same interfacial potential will always be obtained by reacting a saturated NaCl or KCl solution with an Ag/AgCl electrode.
  • the specimen is a NaCl solution, once the concentration reaches the saturated concentration of 5.2 mol/L to 5.4 mol/L, it will not dissolve any more, so the Cl - concentration becomes constant, the above-mentioned equilibrium state is reached, and the potential will not change any more.
  • saturated KCl or NaCl is used as the internal liquid in internal liquid type reference electrodes.
  • this saturated liquid is directly dispensed into the Ag/AgCl electrode as the standard liquid, ensuring a stable potential.
  • Non-Patent Document 1 has a configuration in which an electrolyte layer 4 (KCl layer) is laminated on a supporting electrolyte membrane 7 (provided to further stabilize the contact potential at the interface between the specimen and the Ag/AgCl electrode) provided on a reference electrode 3 (Ag/AgCl electrode) as shown in Figures 2A and 2B.
  • the Cl -concentration is made constant by the specimen itself dissolving the electrolyte layer 4 during penetration. Then, the specimen with a constant Cl -concentration is supplied to the supporting electrolyte membrane 7 and the Ag/AgCl electrode, making it possible to perform measurement without using a reference solution.
  • Patent Document 1 which also has a configuration with a solid electrode type reference electrode, a method is used in which a reference liquid is dispensed separately from the sample to perform the measurement. This method can obtain a stable measurement potential, but the use of a reference liquid can easily pose problems in terms of ease of measurement and cost.
  • Patent Document 1 also discloses two configurations to prevent protein aggregation, which will be described later: a configuration in which a surfactant is contained in the sample, and a configuration in which a surfactant coating is provided on the flow path leading to the sample liquid side electrode.
  • Patent Document 1 in order to contain the surfactant in a sufficiently mixed state in advance in the sample liquid, a sample volume of about several mL is required to stir the mixed liquid, which may be a heavy burden on the patient.
  • a surfactant coating is provided in the flow path, coating the flow path wall surface is a constraint, and the surfactant cannot be uniformly contacted with the sample flowing through the flow path, which may result in insufficient mixing with the sample liquid.
  • the configuration having an electrolyte layer has the following problems. This is because, in the measurement of samples that contain proteins, such as serum and plasma, when the sample penetrates the electrolyte layer (KCl layer), the hydration water of the hydrated protein is easily taken away by the electrolyte, which can easily cause salting out or aggregation of the protein.As a result of salting out or aggregation of the protein, it can inhibit the penetration of the sample in the flow path, making the measurement potential unstable and lengthening the measurement time.
  • KCl layer electrolyte layer
  • the measured potential fluctuates less over time, but it was not possible to maintain a stable potential, and it was confirmed that a difference of about ⁇ 0.9 mV occurred after 200 seconds.
  • the penetration of the sample in the electrolyte layer was unstable and slow, and something like a clump was confirmed on the flow path.
  • the analytical device of the present invention is capable of stably contacting the reference electrode even when measuring samples containing proteins as components, such as serum or plasma, without slowing down the permeation of the sample and when the Cl- concentration of the sample is saturated.
  • the analytical device of the present invention has a configuration in which, based on the direction of sample flow in the flow path region, a layer that suppresses salting out and aggregation of proteins is located upstream of the position at which the electrolyte layer is located.
  • the analytical device of the present invention may have a plurality of third flow chambers in which a working electrode is arranged, in addition to the first flow chamber and the second flow chamber, and these may be connected by flow channels.
  • a working electrode is arranged, in addition to the first flow chamber and the second flow chamber, and these may be connected by flow channels.
  • Example 1 The first embodiment will be described with reference to FIGS.
  • FIG. 5 shows the analytical device of Example 1. It has a flow region surrounded by a flow wall 2 provided inside the porous substrate.
  • the flow region has a first flow chamber 9, a second flow chamber 10, and a flow channel 1 connecting the first flow chamber 9 and the second flow chamber 10, and a dispensing section 8 is present in the flow channel 1.
  • the flow region may have a third flow chamber 11 and a fourth flow chamber 12 of the electrode, or may not have these.
  • a reference electrode 3 is arranged in the first flow chamber 9, and an electrolyte layer 4 is arranged upstream of the reference electrode 3 based on the traveling direction of the sample (i.e., the dispensing section side is upstream).
  • a component A layer 5 having an effect of changing the three-dimensional structure of the protein in the sample is arranged upstream of the electrolyte layer 4.
  • a working electrode 6 is arranged in the second flow chamber 10, and the working electrode 6 is composed of a base electrode 6b of the working electrode and an ion selective membrane 6a provided to cover it.
  • the flow paths were formed using the method described in (JP Patent Publication 2021-37612 A). Specifically, the desired flow path pattern was formed on filter paper in an unfixed state using electrophotography with flow path forming particles (toner) that have characteristic melting properties, and then the flow path pattern was permeated into the inside of the paper using an oven or heater to form the flow path pattern.
  • the formed flow path pattern is as shown in FIG. 6, where reference numeral 1 denotes a flow path, and reference numeral 2 denotes a flow path wall formed by the penetration of flow path forming particles.
  • reference electrode 3 and the working electrode 6 are formed on the flow path pattern by screen printing, an inkjet device (IJ), a dispenser, etc. Since this patent is an invention related to the reference electrode, the configuration will be explained mainly with respect to the reference electrode.
  • an Ag/AgCl electrode was printed as a reference electrode on the flow path pattern by screen printing, and further, as shown in FIG. 1A and FIG. 1B, an electrolyte (NaCl or KCl) was printed by an ink jet or a dispenser at a position on the flow path and upstream of the Ag/AgCl electrode with respect to the direction of movement of the sample.
  • an electrolyte layer NaCl or KCl
  • the concentration of the electrolyte (Cl -concentration ) in the sample becomes saturated, and the sample reaches the reference electrode (Ag/AgCl electrode) in that state.
  • the potential of the reference electrode (Ag/AgCl electrode) is stabilized.
  • the electrolyte is preferably a chloride, and in particular, sodium chloride (NaCl) or potassium chloride (KCl), which are easy to handle.
  • NaCl sodium chloride
  • KCl potassium chloride
  • the electrolyte (NaCl) was arranged in a layer on the flow path in front of the reference electrode so that the concentration was 3.0 ⁇ 10 2 g/L or more, preferably 3.4 ⁇ 10 2 g/L or more per 1 L of sample volume supplied to the reference electrode 3. This is a value obtained by dividing the amount of NaCl required for saturation by the amount of sample supplied to the reference electrode 3, since the saturated concentration of the electrolyte also depends on the amount of sample. If 3.0 ⁇ 10 2 g/L or more of NaCl is arranged per 1 L of sample volume supplied to the reference electrode 3, the concentration of the sample that has passed through the NaCl layer will be 4.6 mol/L or more, which is close to saturation, and stable measurement will be possible.
  • the concentration of the sample that has passed through the NaCl layer will be 5.2 mol/L or more, which is a concentration sufficient to maintain the Cl - concentration saturated.
  • the amount of sample supplied to the dispensing unit 8 varies depending on the size and performance of each device, and is generally about 10 ⁇ L to 50 ⁇ L.
  • the reference electrode is 3 mm ⁇ 3 mm in size
  • the working electrode 6 is 3 mm ⁇ 3 mm in size
  • the paper is 200 ⁇ m thick
  • the volume of the entire flow path, including the volume of the flow path between them is about 3.6 ⁇ 10 ⁇ 9 m 3 (3.6 ⁇ L) (1.8 ⁇ L each for the reference electrode and working electrode). Therefore, about 10 ⁇ L of sample is sufficient to supply the sample to the reference electrode and working electrode.
  • the present invention does not depend on the size of the device or the required sample volume, but for the reasons stated above, the present invention will be explained using a sample volume range of approximately 10 ⁇ L to 50 ⁇ L.
  • the amount of specimen supplied to the reference electrode is 5 ⁇ L
  • a NaCl concentration of 4.6 mol/L or more can be obtained. Therefore, when NaCl is placed in a 3 mm ⁇ 3 mm area with a thickness of 200 ⁇ m, if 8.3 ⁇ 10 5 g/m 3 or more of NaCl is placed per unit volume of the NaCl placement area, the NaCl concentration of the specimen that has passed through the NaCl layer will be 4.6 mol/L or more, which is close to saturation.
  • the concentration of the specimen that has passed through the NaCl layer will be 5.2 mol/L, which is a sufficient concentration to bring the Ag/AgCl electrode into equilibrium.
  • the analyte When the analyte reaches the electrolyte (NaCl) layer, it dissolves the electrolyte (NaCl) and moves toward the reference electrode (Ag/AgCl electrode). At this time, the Cl- concentration of the analyte that has passed through the electrolyte (NaCl) layer is always kept saturated or close to saturated, and this saturated analyte is continuously supplied to the reference electrode (Ag/AgCl electrode), so a stable potential is obtained.
  • the reference electrode and the electrolyte layer are not in contact, but the electrolyte layer may be in contact with the reference electrode or may overlap the reference electrode.
  • the important point is that the sample reaches the reference electrode after the concentration of the electrolyte in the sample becomes saturated.
  • aqueous solution containing a surfactant (Tween 20, chemical formula: C 58 H 114 O 26 ) was printed as the component A layer 5 on the upstream side of the electrolyte layer 4, preferably adjacent to the electrolyte layer 4, using an inkjet or dispenser.
  • a surfactant Teween 20, chemical formula: C 58 H 114 O 26
  • These methods allow the surfactant to be uniformly arranged in the desired flow path region on the porous substrate.
  • the size of the surface area of the porous structure can be utilized, so the contact area between the sample and the surfactant can be increased (compared to the case of a non-porous substrate).
  • the surface area can be increased by about 1000 times or more compared to the configuration of Patent Document 1, which works favorably for mixing the surfactant and the sample.
  • the sample is stirred between the fibers while penetrating the flow path by capillary action, so that even a small amount of sample on the order of ⁇ L can be sufficiently mixed with the surfactant.
  • Any porous substrate (filter paper, glass filter paper, etc.) can be used as long as it has a porous structure. The important thing is to uniformly arrange a predetermined amount of surfactant in the desired flow path region.
  • the flow channel can be filled with half the amount of sample compared to a hollow flow channel with the same cross section (such as a flow channel in Patent Document 1).
  • the principle of the potential development of the reference electrode depends on the concentration of Cl - , so as long as there is a liquid junction with the working electrode, the same effect can be obtained even with half the amount of sample.
  • any substance that can change the three-dimensional structure of the protein can be used, such as a salt (e.g., guanidine hydrochloride as a chaotropic salt), an acid (e.g., citric acid), an organic solvent (e.g., ethanol), or a water-soluble polymer (e.g., polyethylene glycol).
  • a salt e.g., guanidine hydrochloride as a chaotropic salt
  • an acid e.g., citric acid
  • an organic solvent e.g., ethanol
  • a water-soluble polymer e.g., polyethylene glycol
  • the formation of the surfactant layer also depends on the amount of sample supplied to the reference electrode.
  • the amount of sample supplied to the reference electrode is 5 ⁇ L, the following experiment was conducted to confirm the appropriate amount of surfactant that can suppress protein aggregation while saturating the NaCl concentration in the electrolyte layer.
  • the results are shown in Figure 10.
  • the results of a configuration without a surfactant layer are shown in Figure 11.
  • the measured potential was stable from about 60 seconds after dispensing, but it was confirmed that the potential was unstable in the configuration of the comparative example in Figure 11.
  • the working electrode (ion selective electrode) used was a solid contact type ion selective electrode in which an ion selective membrane 6a having selectivity for the target ion was laminated on a base electrode 6b.
  • a base electrode As for the base electrode of the working electrode, efforts using Ag/AgCl, carbon, and PEDOT (poly(3,4-ethylenedioxyphene))/PSS (poly(4-styrenesulfonate)) have been proposed, and these can be used without any particular limitations in the present invention.
  • a base electrode can be selected according to the required characteristics of the device, such as cost and performance, and in this embodiment, an Ag/AgCl electrode was used as the base electrode.
  • the ion-selective membrane may be any commonly used membrane that is sensitive to the target ion and has sufficient selectivity to interfering ions.
  • Materials used in the ion-selective membrane include ionophores such as valinomycin, anion removers such as potassium tetraphenylborate (KTPB), plasticizers such as NPOE (o-nitrophenyl octyl ether) and DOS (di(2-ethylhexyl) sebacate), and polymers such as PVC (polyvinyl chloride) alone or copolymers of polyvinyl chloride and polyvinyl acetate.
  • ionophores such as valinomycin
  • anion removers such as potassium tetraphenylborate (KTPB)
  • plasticizers such as NPOE (o-nitrophenyl octyl ether) and DOS (di(2-ethylhexyl) sebacate)
  • each component is mixed, dissolved or dispersed in a solvent such as THF (tetrahydrofuran) or cyclohexanone, and the resulting liquid is applied by inkjet printing to a base electrode (Ag/AgCl electrode) on which an intermediate layer such as NaCl is laminated.
  • a solvent such as THF (tetrahydrofuran) or cyclohexanone
  • the application method does not have to be the inkjet method, and the ion-selective membrane can be laminated on the base electrode after adjusting the viscosity of the solution to suit each printing method, such as dispenser or screen printing.
  • the present invention is not limited to an analytical device using a single Ag/AgCl electrode as a reference electrode.
  • the reference electrode may have a base electrode of Ag/AgCl, and a supporting electrolyte layer may be provided on the surface of the base electrode to stabilize the interfacial potential with the sample and reduce the influence of interfering ions.
  • a supporting electrolyte layer can be formed by mixing appropriate amounts of TBA-TBB (tetrabutylammonium tetrabutylborate) or TDMACl (tridodecylmethylammonium chloride) with a plasticizer and PVC, mixing them with a solvent such as THF or cyclohexanone, and applying and drying the resulting solution.
  • a laminate layer may be provided on the front and back surfaces of the reference electrode to prevent the electrolyte layer and component A layer from flowing out or becoming contaminated when handling the analytical device.
  • the specimen and component A can be effectively mixed, thereby suppressing salting out of the electrolyte disposed near the reference electrode, and thus enabling testing with a small amount of specimen.
  • L-(+)-arginine hydrochloride (chemical formula: C 6 H 14 N 4 O 2.HCl ) was used for the component A layer.
  • L-(+)-arginine hydrochloride is not a surfactant and does not form micelles with proteins in the specimen, but it has the effect of solubilizing proteins by hydrophobic interaction with specific hydrophobic residues (aromatic amino acid residues, etc.) of proteins in the specimen. Therefore, it is possible to suppress protein aggregation when the specimen permeates through the electrolyte layer.
  • the surfactant when a surfactant is used in the component A layer, depending on the combination of the surfactant and the material of the ion-selective membrane, the surfactant may destroy the membrane structure of the ion-selective membrane and affect the measured potential. Therefore, it was necessary to pay attention to factors that cause the surfactant to diffuse and come into contact with the ion-selective membrane (such as the distance between the reference electrode and the working electrode and the measurement time).
  • L-(+)-arginine hydrochloride the effect of solubilization is due to hydrophobic interaction with specific hydrophobic residues (such as aromatic amino acid residues), so the effect on the ion-selective membrane is small and the degree of freedom in the selection of membrane materials can be increased.
  • Two types of analytical devices were prepared, with the amount of L-(+)-arginine hydrochloride being 0.13 mg and 0.65 mg, and the potential of the reference electrode was measured.

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Abstract

簡便で測定電位の安定した分析を行うことができる分析デバイスを提供することを目的とする。　多孔質基材の内部に設けられた流路壁で囲まれた流路領域を有する分析デバイスであって、前記流路領域は、第一流路室、第二流路室、及び前記第一流路室と前記第二流路室とを繋ぐ流路を有し、前記第一流路室には、参照電極が配置されており、前記第二流路室には、作用電極が配置されており、前記流路領域における検体の進行方向を基準としたとき、前記第一流路室の上流に、又は前記参照電極の表面に電解質が配置されており、前記電解質が配置された位置の上流に、成分Ａが配置されており、前記成分Ａが、検体中の蛋白質の立体構造を変化させる作用を及ぼす成分であることを特徴とする。

Description

分析デバイス
　本発明は、多孔質基材の内部に流路領域を形成した分析デバイス、該分析デバイスを用いた電解質濃度測定システム及び電解質濃度測定方法に関するものである。
　近年、微細流路を利用して１つのチップ内で効率的（微量、迅速、簡便）に化学分析を行うデバイスが、生化学の研究、医療、創薬、ヘルスケア、環境、食品、等の幅広い分野で注目されている。
　分析デバイスの中でも、紙を基材としたデバイスは『μＰＡＤｓ』（microfluidic paper-based analytical devices）と呼ばれ、紙の毛細管現象を利用して検体や検査液を浸透させることで化学分析を行うことができる。このデバイスのメリットとしては、小型、低コスト、持ち運びが容易、廃棄性が高い（燃やすだけで廃棄完了）、大掛かりな装置がいらない、等が挙げられる。この新しい分析デバイスが実用化されることにより、誰でも、簡単に、低コストで、ＰＯＣ（point of care）による検査診断が可能になると言われている。
　そのほかにも、上述のμＰＡＤｓのメリットから、医療設備が十分に整っていない途上国や過疎地、迅速な救急活動が必要な災害現場、感染症の広がりを水際で食い止めなければならない空港等での活用が期待されている。また、日常の健康状態を管理・モニタリングするヘルスケアデバイスや、通常の医療現場における様々な病理診断デバイスとしても注目を集めており、その用途は多岐にわたる。
　上記病理診断における生化学検査の一つとして電解質検査がある。電解質（Ｎａイオン、Ｋイオン、Ｃｌイオン等）は、体内の水分量やｐＨを一定に保つことや、神経の伝達や筋肉を正常に働かすこと等、生命維持に必要不可欠であり、電解質検査は、血中や尿中の電解質イオン濃度を測定し、体内のイオン濃度バランスを確認する検査である。
　一般的に体内の電解質濃度に変化が生じた場合、腎機能やホルモンのはたらきに異常が発生している可能性が高い。そのため、電解質検査は病気のスクリーニングに不可欠な検査である。またそのほかにも、災害現場等で患者の生理機能（生命維持）を確認する上でも大変重要な検査である。この電解質測定をμＰＡＤｓで行うことを目指す研究が様々な大学や企業で行われている。
　非特許文献１では、Ｎａイオン及びＫイオンの濃度測定のための分析デバイスが提案されている。この分析デバイスは、検体を分注するための分注部を持ち、分注された検体が分注部から作用電極及び参照電極それぞれの領域へと浸透することによって、両電極を電気的に接続させて電位差測定を行う。またこの分析デバイスでは、参照電極において安定した電位を得るためにＫＣｌのイオン結晶を参照電極上に堆積させており、測定時においてＫＣｌが検体へ溶解することで、参照電極領域のＣｌイオンを高濃度に保持し、安定した参照電極の電位を得ることができる。また、μＰＡＤｓではないが（使用する基材が多孔質基材ではない）、特許文献１には、作用電極部に供給される検体液と、参照電極部に供給される基準液が液絡部で接触することで、安定した電位を得るマルチイオンセンサプレートが開示されている。
特開平１１－１９４１０９号公報
Nipapan Ruecha, Orawon Chailapakul, Koji Suzuki and Daniel Citterio,"Fully Inkjet-Printed Paper-Based Potentiometric Ion-Sensing Devices",　Analytical chemistry，August 29, 2017 Published, 89, pp.10608-10616
　しかしながら、非特許文献１のような構成では、血清や血漿等、成分中に蛋白質を含む検体の測定においては、検体が電解質層（ＫＣｌ層）を浸透する時に、水和している蛋白質の水和水が電解質に奪われやすく、蛋白質の塩析や凝集が発生しやすい。その結果、塩析・凝集した蛋白質が流路内の検体の浸透を阻害し、測定電位が不安定になることや測定時間が長くなることがあった。
　また、特許文献１では、検体液中に含まれる疎水性物質（ヘマトクリット又はその類似物質）の分散性を維持し、その沈降（沈殿）を防止するための界面活性剤を検体に含有させる構成と、検体液側電極に至る流路に界面活性剤塗膜を設ける構成の２つの構成が開示されている。しかしながら特許文献１の構成では、あらかじめ検体液に界面活性剤を十分に混合された状態で含有させるためには、混合液を攪拌するために数ｍＬ程度の検体量が必要となり、患者の負担が大きくなる場合がある。また、流路中に界面活性剤の塗膜を設ける場合には、流路壁面に塗膜することが制約となり、流路を流れる検体に均一に接触することができず、検体液との混合が不十分になり得る。
　本発明では、蛋白質の塩析・凝集を抑制する層が適切な位置に配置されており、適切な参照電極の電位を示し、簡便で安定した分析を行うことができる分析デバイスを提供することを目的とする。
　本発明は、多孔質基材の内部に設けられた流路壁で囲まれた流路領域を有する分析デバイスであって、
　前記流路領域は、第一流路室、第二流路室、
　及び前記第一流路室と前記第二流路室とを繋ぐ流路を有し、
　前記第一流路室には、参照電極が配置されており、
　前記第二流路室には、作用電極が配置されており、
　前記流路領域における検体の進行方向を基準としたとき、
　前記第一流路室の上流に、又は前記参照電極の表面に電解質が配置されており、
　前記電解質が配置された位置の上流に、成分Ａが配置されており、
　前記成分Ａが、検体中の蛋白質の立体構造を変化させる作用を及ぼす成分であることを特徴とする分析デバイスに関する。
　本発明により、簡便で測定電位の安定した分析を行うことができる分析デバイスを提供することができる。多孔質流路に成分Aを配置することによって検体と成分Aを効果的に混合することができるので参照電極付近に配置した電解質の塩析を抑制することができ、少量の検体で検査できる効果が得られる。
参照電極の構成図である。 参照電極の図１Ａの破線部の断面図である。 従来例の構成の図２Ｂの破線部の断面図である。 従来例の構成図である。 従来例の構成で、血清検体を測定した際の電位の時間変化を示す図である。 従来例の構成で、限外濾過した血清検体を測定した際の電位の時間変化を示す図である。 実施例１の分析デバイスの構成図である。 流路パターンの構成図である。 実施例１の参照電極のみの構成で、血清検体を測定した際の電位の時間変化を示す図である。 実施例１の参照電極のみの構成で、血清検体を測定した際の電位の時間変化を示す図である。 実施例１の参照電極のみの構成で、血清検体を測定した際の電位の時間変化を示す図である。 実施例１の参照電極と作用電極を組み合わせた構成で、血清検体を測定した際の電位の時間変化を示す図である。 実施例１の比較例の構成で、血清検体を測定した際の電位の時間変化を示す図である。 実施例２の参照電極のみの構成で、血清検体を測定した際の電位の時間変化を示す図である。 実施例２の参照電極のみの構成で、血清検体を測定した際の電位の時間変化を示す図である。
　本発明の作用を詳しく説明する。
　本発明の電解質濃度測定における参照電極の役割は、作用電極で生じる電位に対し、基準電位となるものである。そのため、参照電極の電位が安定しなければ、参照電極と作用電極との電位差は不正確になる。
　一般的に参照電極のベース電極にはＡｇ／ＡｇＣｌ電極が用いられることが多い。Ａｇ／ＡｇＣｌ電極では、検体との界面で下記の平衡反応が起こっており、Ｃｌ－の濃度によって電位が決まっている。
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　よって、Ｃｌ－濃度を一定にすることで、電位を安定させることができる。
　したがって、飽和した塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）溶液や塩化カリウム（ＫＣｌ）溶液においては、Ｃｌ－濃度が一定なので、飽和したＮａＣｌ溶液やＫＣｌ溶液をＡｇ／ＡｇＣｌ電極と反応させていれば、常に同じ界面電位が得られることになる。
　検体がＮａＣｌ溶液の場合、濃度が飽和濃度である５．２ｍｏｌ／Ｌ～５．４ｍｏｌ／Ｌに到達すると、それ以上溶けることはないので、Ｃｌ－濃度が一定となり、上記平衡状態に達し、電位もそれ以上変化することはなくなる。
　この原理を元に、内部液タイプの参照電極では、飽和したＫＣｌやＮａＣｌが内部液として使用されている。一方、固体電極タイプの参照電極においては、基準液としてこの飽和液をＡｇ／ＡｇＣｌ電極に直接分注し、安定した電位を確保する手法がとられている。
　固体電極タイプの参照電極を有する例として、非特許文献１では、図２Ａ及び図２Ｂに示すように、参照電極３（Ａｇ／ＡｇＣｌ電極）上に設けられた支持電解質膜７（検体とＡｇ／ＡｇＣｌ電極との界面における接触電位をより安定させるために設けられる）上に電解質層４（ＫＣｌ層）を積層した構成である。この構成においては、検体自体が浸透中に電解質層４を溶かすことでＣｌ－濃度を一定にする。そしてＣｌ－濃度が一定になった検体が支持電解質膜７やＡｇ／ＡｇＣｌ電極に供給されることで、基準液を用いることなく測定することが可能となる。
　同じく固体電極タイプの参照電極を有する構成である特許文献１では、検体とは別に基準液を分注して測定を行う手法がとられている。この手法により、安定した測定電位を得ることができるが、基準液を用いる分だけ測定の簡便さとコストが課題となりやすい。また、特許文献１では後述する蛋白質の凝集を防ぐために、界面活性剤を検体に含有させる構成と、検体液側電極に至る流路に界面活性剤塗膜を設ける構成の２つの構成が開示されている。しかしながら特許文献１の構成では、あらかじめ検体液に界面活性剤を十分に混合された状態で含有させるためには、混合液を攪拌するために数ｍＬ程度の検体量が必要となり、患者の負担が大きくなる場合がある。また、流路中に界面活性剤の塗膜を設ける場合には、流路壁面に塗膜することが制約となり、流路を流れる検体に均一に接触することができず、検体液との混合が不十分になり得る。
　電解質層を有する構成である非特許文献１のような構成においては以下に説明する課題がある。
　それは、血清や血漿等、成分中に蛋白質を含む検体の測定においては、検体が電解質層（ＫＣｌ層）を浸透する時に、水和している蛋白質の水和水が電解質に奪われやすく、蛋白質の塩析や凝集が発生しやすい、という点である。蛋白質が塩析・凝集した結果、流路内での検体の浸透を阻害し、測定電位が不安定になることや測定時間が長くなることがあった。
　図２Ｂに示す従来構成のように参照電極側に電解質層を有する構成で、血清検体を測定した結果について説明する。同構成の２つのデバイスを用意し、検体として血清を用いたときデバイスにおける参照電極の電位差の測定結果を図３に示す。なお本実験では、参照電極３の性能だけに注目する為、本来、分析デバイスに作用電極６が形成される側には、作用電極６の代わりに市販の参照電極（ＲＥ―1ＢＰ、ＢＡＳ株式会社）を置き、市販電極と参照電極３を検体で繋ぎ、両極間の電位差を測定した。測定結果からは分注後から１００秒（ｓ）程度までは測定電位が大きく変動していることがわかる。その後、時間経過で測定電位は変動が小さくなる方へ向かうが、安定した電位を維持することができず、２００秒後にはΔ０．９ｍＶ程度の差が生じていることが確認できた。またこの構成においては、電解質層内での検体の浸透が不安定で遅く、流路上には凝集塊のようなものも確認された。
　この測定の比較として、上記と同じ構成で血清検体を市販のフィルター（アミコンウルトラ－０．５デバイス（ＮＭＷＬ：３０Ｋ）、Ｍｅｒｃｋ）で限外濾過し、蛋白質等の分子を除去した上で測定した結果を図４に示す。この検体では電解質層内での浸透がスムーズであり、電位も安定していることが確認できた。
　以上の実験から、参照電極の電位を速く安定させるためには、検体が流路内で凝集しないことが必要であると確認できた。
　本発明の分析デバイスは、血清や血漿等、成分内に蛋白質を含む検体の測定においても、検体の浸透が遅くならず、かつ検体のＣｌ－濃度が飽和となった状態で安定して参照電極に接触することが可能なものである。
　すなわち、本発明の分析デバイスは、流路領域における検体の進行方向を基準としたとき、前記電解質層が配置された位置の上流に蛋白質の塩析・凝集を抑制する層が配置されている構成を有する。
　また、本発明の分析デバイスは、第一流路室及び第二流路室以外に、作用電極が配された第三流路室などを複数有し、それらが流路で繋がっている構成であってもよい。尚、分析デバイス上に配する流路室の数は、特に制限はされない。
　以下、本発明の例示的な実施形態について図面を参照して説明する。なお、以下の実施形態は例示であり、本発明を実施形態の内容に限定するものではない。また、以下の各図においては、実施形態の説明に必要ではない構成要素については図から省略する。
＜実施例１＞
　実施例１について、図５～図８を用いて説明する。
　図５に実施例１の分析デバイスを示す。多孔質基材の内部に設けられた流路壁２で囲まれた流路領域を有する。流路領域は第一流路室９、第二流路室１０、及び第一流路室９と第二流路室１０とを繋ぐ流路１を有し、流路１には分注部８が存在する。流路領域は電極の第三流路室１１と第四流路室１２を有してもよいし、これらはなくてもよい。第一流路室９には参照電極３が配置されており、検体の進行方向を基準（すなわち、分注部側が上流となる）として、参照電極３の上流側には、電解質層４が配置されている。電解質層４を参照電極３の上流側に配置することによって、検体中の電解質濃度が飽和になった状態で安定して参照電極３に到達する。電解質層４の上流側には、検体中の蛋白質の立体構造を変化させる作用を有する成分Ａ層５が配置されている。第二流路室１０には作用電極６が配置されており、作用電極６は、作用電極のベース電極６ｂとそれを覆うように設けられたイオン選択膜６ａで構成される。
　流路形成については、（特開２０２１－３７６１２号公報）に記載された方法で行った。具体的には、溶融性に特徴を持つ流路形成用粒子（トナー）を用いて、濾紙上に所望の流路パターンを電子写真方式で未定着の状態で形成し、その後、オーブンもしくはヒーターにより、流路パターンを紙の内部に浸透させることで、流路パターンを形成した。
　形成された流路パターンは図６に示すとおりであり、符号１が流路、符号２が、流路形成用粒子が浸透することで形成された流路壁である。
　次いで、流路パターンに、参照電極３並びに作用電極６を、スクリーン印刷やインクジェット装置（ＩＪ）、もしくは、ディスペンサー等により形成する。本特許は参照電極に関する発明である為、参照電極中心にその構成を説明する。
　図１Ａに示すように、流路パターン上に、参照電極として、Ａｇ／ＡｇＣｌ電極をスクリーン印刷により印字し、さらに、図１Ａ及び図１Ｂに示すように、流路上で且つ検体の進行方向に対し、Ａｇ／ＡｇＣｌ電極の上流側となる位置に、電解質（ＮａＣｌもしくはＫＣｌ）をＩＪやディスペンサーにより印字した。このような位置に電解質層（ＮａＣｌもしくはＫＣｌ）を配置することで、進んできた検体は必ず、電解質層を通過することになる。その際、電解質を溶かすことで、検体中の電解質の濃度（Ｃｌ－濃度）が飽和となり、その状態で検体が参照電極（Ａｇ／ＡｇＣｌ電極）に到達する。その結果、参照電極（Ａｇ／ＡｇＣｌ電極）の電位が安定化される。
　電解質としては、塩化物が好ましく、特に、取り扱いが容易な塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）もしくは塩化カリウム（ＫＣｌ）が好ましい。以下、溶解度の温度依存性がより安定しているＮａＣｌで説明する。
　電解質（ＮａＣｌ）は参照電極手前の流路上に、参照電極３に供給される検体量１Ｌ当たり、３．０×１０２ｇ／Ｌ以上、好ましくは３．４×１０２ｇ／Ｌ以上となるように、層状に配置した。これは、電解質の飽和濃度が検体量にも依存するため、飽和に必要なＮａＣｌ量を参照電極３に供給される検体量で割った値となっている。参照電極３に供給される検体量１Ｌ当たり、３．０×１０２ｇ／Ｌ以上のＮａＣｌを配置すれば、ＮａＣｌ層を通過した検体の濃度は４．６ｍｏｌ／Ｌ以上となり、飽和に近い濃度となるため、安定した測定が可能となる。好ましくは、３．４×１０２ｇ／Ｌ以上のＮａＣｌを配置することであり、この場合、ＮａＣｌ層を通過した検体の濃度は５．２ｍｏｌ／Ｌ以上となり、Ｃｌ－の濃度が飽和した状態を保つのに十分な濃度となる。
　尚、分注部８に供給される検体量は、各デバイスの大きさや性能に伴い適正な量があり、一般的には、約１０μＬ～５０μＬである。例えば、小さいデバイスの一例として、参照電極の大きさが３ｍｍ×３ｍｍ、作用電極６の大きさが３ｍｍ×３ｍｍで、紙の厚みが２００μｍの場合、その間の流路の体積も含めて、流路全体の体積は３．６×１０－９ｍ３（３．６μＬ）程度である（参照電極、作用電極　各１．８μＬずつ）。そのため、約１０μＬの検体があれば十分に参照電極と作用電極に検体を供給できる。
　デバイスの大きさを大きくすれば、必要検体量は多くなるが、検体は人の血液や尿がベースになるので、少ない方が好ましく、一般的には５０μＬ以下である。本発明は、デバイスの大きさや必要検体量に依存するものではないが、上記の理由から、検体量の範囲として約１０μＬ～５０μＬでその説明を行うものとする。
　実施例１の分析デバイスの場合、１０μＬの検体を流路領域中央にある分注部８に分注供給し、その約半分が参照電極側に供給され、残り半分が作用電極側に供給されるので、参照電極に供給される検体量は約５μＬとなる。尚、本実施例では図１Ａの第一流路室の上流に飽和濃度になる電解質を配置した。
　例えば、参照電極に供給される検体量が５μＬの場合、１．５ｍｇのＮａＣｌを配置すれば、４．６ｍｏｌ／Ｌ以上のＮａＣｌ濃度が得られる。そのため、ＮａＣｌを３ｍｍ×３ｍｍの領域に厚さ２００μｍで配置する場合には、ＮａＣｌ配置領域の単位体積あたり８．３×１０５ｇ／ｍ３以上のＮａＣｌを配置すれば、ＮａＣｌ層を通過した検体のＮａＣｌ濃度は４．６ｍｏｌ／Ｌ以上となり、飽和に近い値となる。さらに、ＮａＣｌ配置領域の単位体積当たり９．４×１０５ｇ／ｍ３以上のＮａＣｌを配置すれば、ＮａＣｌ層を通過した検体の濃度は５．２ｍｏｌ／Ｌとなり、Ａｇ／ＡｇＣｌ電極を平衡状態にするには十分な濃度となる。
　検体が、配置された電解質（ＮａＣｌ）層に届くと、配置された電解質（ＮａＣｌ）を溶かしながら参照電極（Ａｇ／ＡｇＣｌ電極）の方向に進む。このとき、電解質（ＮａＣｌ）層を通った検体のＣｌ－の濃度は、常に飽和あるいは飽和に近い状態が保たれ、この飽和検体が、継続的に参照電極（Ａｇ／ＡｇＣｌ電極）に供給されるため、安定した電位が得られることになる。
　本構成では、参照電極と電解質層とが接していないが、電解質層は参照電極と接していても良いし、参照電極の上に重なっていても良い。重要な点は、検体中の電解質の濃度が飽和になった後に、検体が参照電極に到達することである。
　電解質層４の上流側、好ましくは隣接する位置に成分Ａ層５として界面活性剤（Ｔｗｅｅｎ２０、化学式：Ｃ５８Ｈ１１４Ｏ２６）を含んだ水溶液をＩＪやディスペンサーにより印字した。これらの手法により、多孔質基材上の所望の流路領域に界面活性剤を均一に配置することができる。加えて、多孔質構造の表面積の大きさを利用することができるため、検体と界面活性剤の接触面積を（多孔質基材でない場合と比較して）大きくすることができる。紙のBET比表面積から推定すると、特許文献１の構成に対して約１０００倍以上も表面積を増加させることができ、それが界面活性剤と検体の混合に有利に作用する。この流路内を検体が毛細管現象で浸透しながら繊維間で攪拌されることで、μＬオーダーの少量の検体でも界面活性剤と十分に混合することができる。この時使用する多孔質基材については多孔質構造を有していれば何でも良い（濾紙、ガラス濾紙等）。重要なことは所望の流路領域に所定量の界面活性剤を均一に配置することである。また、検体使用量の観点で多孔質流路の断面に注目すると、例えば空隙率５０％の基材を用いた場合、同じ断面積の空洞の流路（特許文献１のような流路）と比較して、半分の検体量で流路を満たすことができる。参照電極の電位発現の原理は上述の通り、Ｃｌ－の濃度に依存するため、作用電極と液絡さえすれば、半分の検体量でも同等の効果が得られる。よって以上の配置により、μＬオーダーの少量の検体においても、界面活性剤と混合してミセルを形成すること（蛋白質の立体構造を変化させること）で、電解質層内を浸透する際の凝集を抑制することができ、安定した測定電位を得ることが期待できる。界面活性剤の種類については、陽イオン性、陰イオン性、両性、非イオン性等の種類があるが、電解質測定チップに関しては、Ａｇ／ＡｇＣｌ電極上やイオン選択膜上での電位発現を阻害しにくい非イオン性のものが好ましい。また、本実施例では界面活性剤を用いたが、蛋白質の立体構造を変化させられるものであれば何でも良く、塩（例えば、カオトロピック塩としてグアニジン塩酸塩）や酸（例えば、クエン酸）や有機溶媒（例えば、エタノール）や水溶性高分子（例えば、ポリエチレングリコール）でも良い。
　界面活性剤の層の形成においても電解質層の形成時と同様、参照電極に供給される検体量に依存する。参照電極に供給される検体量が５μＬの場合、電解質層のＮａＣｌを飽和濃度にしつつ、蛋白質の凝集を抑制することのできる、界面活性剤の適正量を確認するため、以下の実験を行った。
　非イオン性界面活性剤Ｔｗｅｅｎ２０の量を０．０１２ｍｇ、０．０５８ｍｇ、０．１１５ｇとした３種類の分析デバイスを用意し、参照電極の電位を測定した。本実験では、参照電極の性能だけに注目する為、本来、分析デバイスに作用電極が形成される側には、作用電極の代わりに市販の参照電極をおき、市販電極と参照電極を検体で繋ぎ、両極間の電位差を測定した。
　０．０１２ｍｇの結果を図７に示し、０．０５８ｍｇの結果を図８に示し、０．１１５ｍｇの結果を図９に示す。従来構成が２００秒後の電位差Δ０．９ｍＶであるのに対して０．０１２ｍｇ、０．０５８ｍｇの量で改善していることがわかる。また、０．１１５ｍｇでは電位が不安定であることがわかる。これは多量の界面活性剤を塗布したことで検体の浸透が速くなりすぎてしまい、電解質層でＣｌ－の飽和濃度に達することなくＡｇ／ＡｇＣｌ電極に到達したためであると考えられる。以上から、Ｔｗｅｅｎ２０は過不足なく配置した方がよいことがわかる。
　さらに、図５に示すように、イオン選択電極である作用電極６を片側に配置し、両電極が配置された状態にて検体を分注し、参照電極との間の電位差を測定した。結果を図１０に示す。また、比較例として界面活性剤層が無い構成の結果を図１１に示す。図１０の実施例１の構成では分注後６０秒程度から測定電位が安定しているが、図１１の比較例の構成では電位が不安定であることが確認できた。
　作用電極（イオン選択電極）には、ベース電極６ｂ上に、目的イオンについての選択性を持つイオン選択膜６ａを積層した固体接触型のイオン選択電極を用いた。本実施例では、Ｋ＋を目的イオンとするイオン選択電極とした。
　作用電極のベース電極については、Ａｇ／ＡｇＣｌやカーボン、並びにＰＥＤＯＴ（ポリ（３，４－エチレンジオキシフエン））／ＰＳＳ（ポリ（４－スチレンサルフオネート））を使った取り組みが提案されており、本発明では特に限定されることなく用いることができる。コストや性能等、デバイスの必要特性に合わせたベース電極を選択すればよく、本実施例ではＡｇ／ＡｇＣｌ電極をベース電極とした。
　イオン選択膜としては、一般的に用いられるものであればよく、目的のイオンに対して感度を持ち、且つ妨害イオンに対し十分な選択性を持つ膜を用いればよい。イオン選択膜に使われる材料は、イオノフォアとしては、バリノマイシンが例示され、アニオン除剤としては、テトラフェニルホウ酸カリウム（ＫＴＰＢ）が例示され、可塑剤としては、ＮＰＯＥ（ｏ－ニトロフエニルオクチルエーテル）やＤＯＳ（セバシン酸ジ（２－エチルヘキシル））が例示され、高分子剤としてＰＶＣ（ポリ塩化ビニル）単体や、ポリ塩化ビニルとポリ酢酸ビニルとの共重合体が例示される。
　そして、各成分をそれぞれ適量混合し、それらを溶媒であるＴＨＦ（テトラヒドロフラン）やシクロヘキサノンに溶解あるいは分散させ、得られた液をＮａＣｌ等の中間層を積層したベース電極（Ａｇ／ＡｇＣｌ電極）上にインクジェット方式で塗布することにより作製できる。また、塗布方法も、インクジェット方式にこだわるものではなく、ディスペンサーやスクリーン印刷等、各印刷方法に合わせて、溶液の粘度を調整した上でベース電極上にイオン選択膜を積層すればよい。
　尚、本発明は、参照電極としてＡｇ／ＡｇＣｌ電極を単体で用いた分析デバイスに限るものではない。非特許文献１にあるように、Ａｇ／ＡｇＣｌを参照電極のベース電極とし、その表面に、検体との界面電位を安定させたり、妨害イオンの影響を低減させたりするための支持電解質層を設けた構成を有してもよい。例えば非特許文献１にあるようにＴＢＡ－ＴＢＢ（テトラブチルアンモニウムテトラブチルホウ酸塩）やＴＤＭＡＣｌ（トリドデシルメチルアンモニウムクロリド）と可塑剤、並びにＰＶＣを其々適量混合し、これらを溶媒であるＴＨＦやシクロヘキサノンに混ぜて作製された溶液を塗布乾燥させて、支持電解質層を形成することができる。また、本発明において、分析デバイスの取り扱いの際に電解質層及び成分A層の流出やコンタミネーションを防止するために、参照電極の表面及び裏面にラミネート層を設けてもよい。
　以上説明したように本発明によれば、多孔質流路に成分Aを配置することによって検体と成分Aを効果的に混合することができるので参照電極付近に配置した電解質の塩析を抑制することができ、少量の検体で検査できる効果が得られる。
＜実施例２＞
　本実施例では成分Ａ層にＬ－（＋）－アルギニン－塩酸塩（化学式：Ｃ６Ｈ１４Ｎ４Ｏ２・ＨＣｌ）を用いた。Ｌ－（＋）－アルギニン－塩酸塩は界面活性剤ではないため検体中の蛋白質等とミセルを形成しないが、検体中の蛋白質の特定の疎水性残基（芳香族アミノ酸残基等）と疎水性相互作用することで、可溶化させる効果がある。そのため、検体が電解質層内を浸透する際の蛋白質の凝集を抑制することができる。
　加えて、成分Ａ層に界面活性剤を用いた場合には、界面活性剤とイオン選択膜の材料の組み合わせによっては、界面活性剤がイオン選択膜の膜構造を破壊して測定電位に影響を及ぼす可能性がある。したがって、界面活性剤が拡散してイオン選択膜と接触するような状況を引き起こす要因（参照電極-作用電極間距離や測定時間等）に注意する必要があった。一方、Ｌ－（＋）－アルギニン－塩酸塩の場合は特定の疎水性残基（芳香族アミノ酸残基等）と疎水性相互作用することで可溶化させる効果であるため、イオン選択膜への影響は小さく、膜材料の選択の自由度を大きくできる効果を有する。
　このＬ－（＋）－アルギニン－塩酸塩の量を０．１３ｍｇ、０．６５ｍｇとした２種類の分析デバイスを用意し、参照電極の電位を測定した。本実験では、参照電極の性能だけに注目する為、本来、分析デバイスに作用電極が形成される側には、作用電極の代わりに市販の参照電極をおき、市販電極と参照電極を検体で繋ぎ、両極間の電位差を測定した。
　０．１３ｍｇの結果を図１２、０．６５ｍｇの結果を図１３に示す。従来構成が２００秒後の電位差Δ０．９ｍＶであるのに対して０．１３ｍｇの量で電位の時間安定性が改善していることがわかる。０．６５ｍｇに関しては、電位差がΔ１．２ｍＶとやや大きい。よって、より良い精度の測定を行う際にはＬ－（＋）－アルギニン－塩酸塩量の量は０．１３ｍｇ程度であることが好ましい。よって本実験により、成分Ａ層として配置するＬ－（＋）－アルギニン－塩酸塩量を適正化することで電位の時間安定性が改善し、かつ短時間で測定可能であることが確認できた。
　本発明は上記実施の形態に制限されるものではなく、本発明の精神及び範囲から離脱することなく、様々な変更及び変形が可能である。従って、本発明の範囲を公にするために以下の請求項を添付する。
　本願は、２０２３年６月１３日提出の日本国特許出願特願２０２３－０９７１７２、及び２０２４年４月１７日提出の日本国特許出願特願２０２４－０６７０１４を基礎として優先権を主張するものであり、その記載内容の全てをここに援用する。
１・・・流路
２・・・流路壁
３・・・参照電極
４・・・電解質層
５・・・成分Ａ層
６・・・作用電極
６ａ・・・イオン選択膜
６ｂ・・・作用電極のベース電極
７・・・支持電解質膜
８・・・分注部
９・・・第一流路室
１０・・・第二流路室
１１・・・第三流路室
１２・・・第四流路室

Claims (16)

  1. 　多孔質基材の内部に設けられた流路壁で囲まれた流路領域を有する分析デバイスであって、
    　前記流路領域は、第一流路室、第二流路室、及び前記第一流路室と前記第二流路室とを繋ぐ流路を有し、
    　前記第一流路室には、参照電極が配置されており、
    　前記第二流路室には、作用電極が配置されており、
    　前記流路領域における検体の進行方向を基準としたとき、前記第一流路室の上流に、又は前記参照電極の表面に電解質が配置されており、
    　前記電解質が配置された位置の上流に、成分Ａが配置されており、
    　前記成分Ａが、検体中の蛋白質の立体構造を変化させる作用を及ぼす成分であることを特徴とする分析デバイス。
  2. 　前記成分Ａと前記電解質が、隣接している又は混合している領域を有する請求項１に記載の分析デバイス。
  3. 　前記成分Ａが、蛋白質とミセルを形成する作用を有する成分である請求項１に記載の分析デバイス。
  4. 　前記成分Ａが、界面活性剤である請求項３に記載の分析デバイス。
  5. 　前記成分Ａが、非イオン性界面活性剤である請求項４に記載の分析デバイス。
  6. 　前記成分Ａが、Ｔｗｅｅｎ２０である請求項５に記載の分析デバイス。
  7. 　前記成分Ａが、水溶性高分子である請求項１に記載の分析デバイス。
  8. 　前記成分Ａが、塩である請求項１に記載の分析デバイス。
  9. 　前記成分Ａが、カオトロピック塩である請求項８に記載の分析デバイス。
  10. 　前記成分Ａが、Ｌ－（＋）－アルギニン－塩酸塩である請求項８に記載の分析デバイス。
  11. 　前記成分Ａが、酸である請求項１に記載の分析デバイス。
  12. 　前記成分Ａが、有機溶媒である請求項１に記載の分析デバイス。
  13. 　前記参照電極のベース電極が、Ａｇ／ＡｇＣｌ電極である請求項１～１２のいずれか１項に記載の分析デバイス。
  14. 　前記参照電極が、前記参照電極の表面にラミネート層を有する請求項１～１３のいずれか１項に記載の分析デバイス。
  15. 　前記参照電極が、ベース電極の上に、支持電解質膜を積層した参照電極である請求項１～１４のいずれか１項に記載の分析デバイス。
  16. 　前記作用電極が、前記作用電極のベース電極の上に、イオン選択膜を積層したイオン選択電極である請求項１～１５のいずれか１項に記載の分析デバイス。
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