WO2024242174A1 - 一回感染性ロタウイルスおよびその利用 - Google Patents

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祐太 金井
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    • C12Q1/70—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving virus or bacteriophage

Definitions

  • the present invention relates to a single-infectious rotavirus, a rotavirus vaccine containing the single-infectious rotavirus, and a rotavirus neutralization test method using the single-infectious rotavirus.
  • the present invention includes the following inventions.
  • a monoinfectious rotavirus characterized by having a mutation in at least one viral protein selected from the group consisting of rotavirus VP1, VP2, VP3, VP4, VP6, VP7, NSP2, NSP3 and NSP4.
  • the mono-infectious rotavirus described in [1] above which has a mutation that induces dysfunction of a structural protein.
  • a vaccine comprising the monoinfectious rotavirus described in any one of [1] to [14].
  • the present invention can provide a single-infectious rotavirus.
  • the present invention can also provide a rotavirus vaccine containing a single-infectious rotavirus, and a rotavirus neutralization test method using a single-infectious rotavirus.
  • FIG. 1 shows the results of infecting cells that do not express VP6 with the artificial recombinant rotavirus ⁇ 169-174+linker and examining the proliferation ability of the virus after five repeated passages.
  • This figure shows the results of infecting cells persistently expressing VP6 with a green fluorescent protein-expressing single-infectious rotavirus, which was prepared by inserting a gene encoding green fluorescent protein (ZsG) into the segmented RNA genome encoding NSP1 in the single-infectious rotavirus ⁇ 169-174 + linker, and with a single-infectious rotavirus ⁇ 169-174 + linker that does not express green fluorescent protein, and observing the expression of ZsG and NSP4.
  • ZsG green fluorescent protein
  • This figure shows the results of infecting VP6 persistently expressing cells with a luciferase-expressing single-infectious rotavirus prepared by inserting a gene encoding luciferase (NLuc) into the segmented RNA genome encoding NSP1 in the single-infectious rotavirus ⁇ 169-174 + linker, and with a single-infectious rotavirus ⁇ 169-174 + linker that does not express luciferase, and measuring luciferase activity over time.
  • NLuc gene encoding luciferase
  • FIG. 1 shows the results of producing five types of single-infectious rotaviruses ⁇ 169-174+linker having a segmented RNA genome encoding human rotavirus VP7 and measuring the viral titer.
  • FIG. 1 shows the results of a neutralization test of single-infectious rotaviruses having segmented RNA genomes encoding four types of human rotavirus VP7, using mouse serum immunized with wild-type simian rotavirus SA11 strain.
  • FIG. 1 shows the results of examining the vaccine effect by orally administering single-infectious rotavirus ⁇ 169-174+linker to mice three times, and subjecting the blood samples collected two weeks after each administration to a neutralization test to obtain sera.
  • FIG. 1 shows the structure of rotavirus (A) and the structure of VP6 (B).
  • FIG. 1A is a diagram showing the structure of rotavirus VP7
  • FIG. 1B is a diagram showing the mutated region of the mutant VP7 used in Example 12.
  • FIG. 1A is a diagram showing the structure of rotavirus VP4, and FIG. 1B is a diagram showing the mutated region of the mutant VP4 used in Example 15.
  • FIG. 1 shows the results of infecting cells that do not express VP4 with an artificial recombinant rotavirus VP4-120bp, and examining the proliferation ability of the virus after five passages.
  • This figure shows the results of infecting cells that do not express VP4 with a green fluorescent protein-expressing single-infectious rotavirus, which was created by inserting a gene encoding green fluorescent protein (ZsG) into the segmented RNA genome of a single-infectious rotavirus VP4-120bp in which most of the VP4 gene had been deleted, and a single-infectious rotavirus (VP4-120bp) that does not express green fluorescent protein, and observing the expression of ZsG and NSP4.
  • ZsG green fluorescent protein
  • This figure shows the results of infecting cells that do not express VP4 with a luciferase-expressing single-infectious rotavirus prepared by inserting a gene encoding luciferase (NLuc) into the segmented RNA genome of the single-infectious rotavirus VP4-120bp in which most of the VP4 gene has been deleted, and a single-infectious rotavirus (VP4-120bp) that does not express luciferase, and measuring luciferase activity over time.
  • NLuc gene encoding luciferase
  • This figure shows the results of infecting cells that do not express VP4 with an RBD-expressing single-infectious rotavirus (VP4-120bp-RBD) created by inserting a gene encoding the receptor binding domain (RBD) of the spike protein of the novel coronavirus (SARS-CoV-2) into the segmented RNA genome of the single-infectious rotavirus VP4-120bp in which most of the VP4 gene has been deleted, and a single-infectious rotavirus that does not express RBD (VP4-120bp), and observing the expression of RBD and NSP3 by Western blotting.
  • RBD receptor binding domain
  • the present invention provides a mono-infectious rotavirus.
  • mono-infectious rotavirus means a rotavirus that is unable to form infectious virus particles after a single infection, or whose production amount of infectious virus particles is suppressed after a single infection.
  • mono-infectious rotavirus means a rotavirus whose viral titer decreases by subculture.
  • Rotavirus is a non-enveloped virus belonging to the Reoviridae family.
  • the virus particle has a triple structure consisting of an outer coat, an inner coat, and a core protein, and contains a double-stranded RNA genome consisting of 11 segments (see Figure 13 (A)). These 11 gene segments code for six structural proteins (VPs) and six non-structural proteins (NSPs) (Table 1).
  • VPs structural proteins
  • NSPs non-structural proteins
  • the single-infectious rotavirus of the present invention may have a mutation in at least one viral protein selected from the group consisting of rotavirus VP1, VP2, VP3, VP4, VP6, VP7, NSP2, NSP3, and NSP4.
  • VP1, VP2, VP3, VP4, VP6, and VP7 are structural proteins of rotavirus
  • NSP2, NSP3, and NSP4 are non-structural proteins.
  • the single-infectious rotavirus of the present invention may have a mutation in a structural protein of rotavirus, or may have a mutation that induces dysfunction of a structural protein.
  • the number of viral proteins having a mutation may be two or more, or may be one, but is preferably one.
  • the structural protein having a mutation may be VP6 (inner coat protein). If the structural protein having a mutation is VP6, it is preferable that the mutation is in a region that interacts with VP7 (outer coat protein).
  • the region that interacts with VP7 may be domain H of VP6. Domain H contains three loop structures (A'-A'' loop, D'-D'' loop, and ⁇ A-I loop), and any one of these loops may have a mutation.
  • the mutated structural protein may be VP4 (spike protein).
  • the mutated structural protein may be VP4 (spike protein).
  • the mutated VP4 may be a deletion of the lectin domain, a deletion of the ⁇ -barrel domain, or a deletion of both the lectin domain and the ⁇ -barrel domain.
  • a mutant VP4 having deletions of both the lectin domain and the ⁇ -barrel domain of VP4 may be a mutant VP4 in which at least 30 bp, 40 bp, 50 bp, 60 bp, 70 bp, 80 bp, 90 bp, 100 bp, 120 bp or more remain on the N-terminus and at least 30 bp, 40 bp, 50 bp, 60 bp, 70 bp, 80 bp, 90 bp, 100 bp, 120 bp or more remain on the C-terminus in the base sequence of the segmented genome encoding VP4.
  • the number of bases remaining on the N-terminus and C-terminus is not particularly limited, and the number of bases on both sides does not need to be the same.
  • the monoinfectious rotavirus of the present invention can be produced using a known method for producing an artificial recombinant rotavirus.
  • a known method for producing an artificial recombinant rotavirus for example, the method described in Patent Document 1 (WO2018/062199) or Non-Patent Document 1 (Kanai et al., Proc Natl Acad Sci USA. 2017 Feb 28; 114(9):2349-2354), or a method partially modified from these methods, can be suitably used. It is preferable to introduce a normal protein expression vector corresponding to the mutated viral protein into the host cell.
  • the single-infectious rotavirus of the present invention can be used in a rotavirus neutralization test. That is, the present invention provides a method for a rotavirus neutralization test using the single-infectious rotavirus of the present invention.
  • the rotavirus neutralization test can be carried out by mixing serially diluted test serum and the single-infectious rotavirus of the present invention to carry out an antigen-antibody reaction, inoculating the mixture into culture cells on a microplate and culturing the mixture, and then measuring the number of virus-infected cells.
  • VP6 persistent expression cells The rotavirus VP6 gene was introduced into the pLVSIN-CMV-Neo vector (Takara Bio) and co-transfected with psPAX2 (Addgene) and pCMV-VSV-G (Addgene) into 293T cells to produce lentivirus. The lentivirus was then infected into African green monkey MA104 cells (ATCC CRL-2378.1), and drug selection was performed with G418 (800 ⁇ g/mL) two days later. The cells expressing VP6 most strongly were cloned from the VP6-expressing MA104 cells obtained by drug selection using limiting dilution. Limiting dilution was performed four times to obtain MA104 cells that persistently express VP6.
  • transfection reagent 2 ⁇ L was used per ⁇ g of DNA.
  • BHK-T7/P5 cells were cultured in DMEM medium containing 5% FBS, 100 units/mL penicillin, and 100 ⁇ g/mL streptomycin at 37°C under 5% CO2 .
  • 24 hours after transfection the medium was replaced with FBS-free, trypsin-containing medium, and VP6-sustained MA104 cells were added at 2 ⁇ 105 cells/well. After co-culture for 5 days, the medium and cells were harvested. The harvested medium and cells were frozen and thawed three times to prepare a cell lysate.
  • Example 1 The nine types of viruses selected in Example 1 were infected at an MOI of 0.01, and 24 hours after infection, the medium and cells were frozen and thawed three times to prepare cell lysates, and the virus titer was measured. A wild-type virus without VP6 mutation was used as a control. The virus titer was measured in the same manner as in Example 1.
  • Example 3 Comparison of proliferation ability between normal MA104 cells and MA104 cells that continuously express VP6
  • the proliferation ability of the VP6 mutant rotavirus ⁇ 169-174+linker selected in Example 2 was compared between normal MA104 cells and MA104 cells that persistently express VP6.
  • Materials and Methods Normal MA104 cells and MA104 cells expressing VP6 were seeded in a 24-well culture plate at 7.5 x 104 cells/well and cultured overnight. ⁇ 169-174 + linker was infected at an MOI of 0.01, and the medium and cells were frozen and thawed three times at 0, 24, 48, and 72 hours after infection to prepare cell lysates and measure the virus titer.
  • a wild-type virus without VP6 mutation was used as a control. The virus titer was measured in the same manner as in Example 1.
  • Example 4 Examination of proliferation ability in normal MA104 cells To further confirm that the VP6 mutant rotavirus ⁇ 169-174 + linker was unable to grow in normal MA104 cells, it was subcultured in normal MA104 cells. Materials and Methods Normal MA104 cells were seeded at 3 x 105 cells/well in a 6-well culture plate and cultured overnight. ⁇ 169-174 + linker was infected at MOI 1.0, and after one week of culture, the medium and cells were collected and frozen and thawed to prepare a cell lysate. 10% of the obtained cell lysate was added to new normal MA104 cells and cultured for one week. The virus was passaged five times, and the virus titer was measured at each passage using the same method as in Example 1.
  • Example 5 Examination of viral protein expression in normal cells In order to use a single-infectious virus as a vaccine, it is necessary to express viral proteins, even though infectious viral particles are not formed in normal cells that do not express VP6. Therefore, we infected normal MA104 cells with ⁇ 169-174+linker, which was determined to be a single-infectious rotavirus in Example 3, and observed the expression of viral proteins.
  • MA104 cells were seeded at 7.5 ⁇ 104 cells/well in a 24-well culture plate containing a coverslip and cultured overnight.
  • ⁇ 169-174 + linker and wild-type simian rotavirus (SA11 strain) were infected at an MOI of 1.0, and the cells were fixed with formalin 8 hours later.
  • the cells were permeabilized with 0.5% Triton-X and immunostained with rabbit anti-NSP4 and mouse anti-VP6 antibodies as primary antibodies, and CF488-labeled anti-rabbit IgG antibodies (Biotum) and CF594-labeled anti-mouse IgG antibodies (Biotum) as secondary antibodies. Nuclei were stained with Hoechst and observed under a fluorescent microscope.
  • Example 6 Construction of a single-infectious rotavirus containing a reporter gene 6-1 Single-infectious rotavirus expressing green fluorescent protein ⁇ Materials and methods> (1) Green fluorescent protein gene-inserted NSP1 expression plasmid
  • the ZsGreen (hereinafter referred to as "ZsG") gene was used as the green fluorescent protein gene.
  • the ZsG gene-inserted NSP1 gene expression plasmid was pT7-NSP1-ZsG- ⁇ 722 described in Kanai et al. (J Virol. 2019 Feb 15; 93(4): e01774-18.).
  • pT7-NSP1-ZsG- ⁇ 722 is a plasmid in which the ZsG gene is inserted between positions 111 and 112 of the NSP1 gene of pT7-NSP1SA11, and 722 nt (positions 134 to 855) are deleted from the NSP1 gene.
  • capping enzyme expression vectors pCAGD1R and pCAG-D12L
  • rotavirus NSP2 expression vector pCAG-NSP2SA11
  • rotavirus NSP5 expression vector pCAG-NSP5SA11
  • rotavirus VP6 expression vector pcDNA3-VP6 expression vector
  • Luciferase-expressing single-infectious rotavirus ⁇ Materials and methods>
  • luciferase gene-inserted NSP1 expression plasmid As the luciferase gene, the NanoLuc (hereinafter referred to as "NLuc") gene, which is a luciferase gene derived from Oplophorus gracilirostris, was used.
  • NLuc the NanoLuc gene-inserted NSP1 gene expression plasmid
  • pT7-NSP1-NLuc- ⁇ 722 described in Kanai et al. J Virol. 2019 Feb 15; 93(4): e01774-18.
  • pT7-NSP1-NLuc- ⁇ 722 is a plasmid in which the NLuc gene is inserted between positions 111 and 112 of the NSP1 gene of pT7-NSP1SA11, and 722 nt (positions 134 to 855) are deleted from the NSP1 gene.
  • capping enzyme expression vectors pCAGD1R and pCAG-D12L
  • rotavirus NSP2 and NSP5 expression vectors pCAG-NSP2SA11 and pCAG-NSP5SA11
  • rotavirus VP6 expression vector pcDNA3-VP6
  • Luciferase activity measurement MA104 cells expressing VP6 were seeded in a 96-well culture plate at 1 ⁇ 104 cells/well and cultured overnight. The cells were infected with the NLuc-expressing single-infective rotavirus prepared in (2) at an MOI of 0.01, and the medium and cells were collected over time and frozen and thawed to prepare cell lysates. The luciferase activity of the cell lysates was measured using the Nano-Glo Luciferase Assay System (trade name, Promega).
  • Example 7 Neutralization test using luciferase-expressing single-infectious rotavirus Materials and Methods (1) Luciferase-expressing, single-infectious rotavirus The NLuc-expressing, single-infectious rotavirus prepared in Example 6-2 was used. As a control, a NLuc-expressing, self-replicating rotavirus was used, which was prepared by replacing pT7-VP6SA11/ ⁇ 169-174+linker with pT7-VP6SA11, in which no mutation was introduced into VP6, in the NLuc-expressing, single-infectious rotavirus prepared in Example 6-2. The viral titers of both viruses were measured, and viruses with a titer of 100 FFU were prepared for each.
  • Serum Anti-rSA11 as described by Kanai et al. (J Virol. 2020 Dec 22;95(2):e01374-20.), was used. Anti-rSA11 was obtained by orally administering wild-type SA11 strain at 1.0 ⁇ 10 6 FFU/mouse to BALB/c mice (male, 3 weeks old) and repeating the administration 7 times at 2-week intervals, followed by blood sampling.
  • Example 8 Preparation of a single-infectious rotavirus having a human rotavirus coat protein
  • SA11 strain is a simian rotavirus
  • a single-infectious rotavirus is actually used as a vaccine or an antigen for neutralization tests, it is desirable to have the human rotavirus envelope protein. Therefore, Kanai et al. (J Virol. 2020 Dec 22;95(2):e01374-20.) attempted to create a single-infectious rotavirus carrying a segmented RNA genome encoding VP7 of human rotavirus isolated from the stool of nine children with acute gastroenteritis in Japan.
  • VP7 is an envelope protein located in the outermost layer of the virus particle and is a protein that determines the antigenicity and immunogenicity of the virus (see Figure 13 (A)).
  • pT7-VP6 ⁇ 169-174+linker encoding a mutated VP6 was used instead of pT7-VP6SA11
  • pT7-hVP7 a segmented RNA genome expression vector encoding VP7 of human rotavirus
  • capping enzyme expression vectors pCAGD1R and pCAG-D12L
  • rotavirus NSP2 rotavirus NSP2 expression vectors
  • pCAG-NSP2SA11 rotavirus NSP5 expression vectors
  • pcDNA3-VP6 expression vector rotavirus VP6 expression vector
  • the virus titers were calculated for the five types of single-infectious rotaviruses ( ⁇ 169-174 + linker/G1, ⁇ 169-174 + linker/G2, ⁇ 169-174 + linker/G3, ⁇ 169-174 + linker/G8, ⁇ 169-174 + linker/G9) with segmented RNA genomes encoding VP7 of the human rotaviruses produced, and the single-infectious rotavirus SA11 strain ( ⁇ 169-174 + linker) using the same method as in "Materials and Methods" (10) of Example 1.
  • Example 9 Neutralization test using single-infectious rotavirus expressing VP7 of human rotavirus To analyze whether single-infectious rotaviruses expressing VP7 from human rotaviruses of different genotypes (serotypes) have different antigenicities, neutralization tests were performed.
  • Single-episode infectious rotaviruses having human rotavirus VP7 As single-episode infectious rotaviruses expressing human rotavirus VP7, ⁇ 169-174+linker/G1, ⁇ 169-174+linker/G3, ⁇ 169-174+linker/G8, and ⁇ 169-174+linker/G9, which have different VP7 genotypes (serotypes) prepared in Example 8, were used.
  • ⁇ 169-174+linker which is a single-episode infectious rotavirus of the SA11 strain, and wild-type SA11 strain were used. The viral titer of each virus was measured, and a virus with a titer of 100 FFU was prepared for each virus.
  • Serum Anti-rSA11 described in Kanai et al. (J Virol. 2020 Dec 22;95(2):e01374-20.) was used. Anti-rSA11 was obtained by orally administering wild-type SA11 strain to BALB/c mice (male, 3 weeks old) at 1.0 ⁇ 10 6 FFU/mouse, repeating the administration 7 times at 2-week intervals, and then collecting blood serum.
  • the VP7 genotype (serotype) of the wild-type SA11 strain is G3.
  • the primary antibody for the immunofluorescence antibody technique was rabbit-derived anti-rotavirus NSP4 antibody, and the secondary antibody was CF488-labeled anti-rabbit IgG antibody (Biotum).
  • the reduction rate of the number of infected cells compared to the number of infected cells in the control without serum was calculated as the neutralization rate.
  • results are shown in FIG. 11.
  • the wild-type SA11 strain (genotype G3), the single-infectious rotavirus ⁇ 169-174+linker (genotype G3) expressing VP7 of the SA11 strain, and the single-infectious rotavirus ⁇ 169-174+linker/G3 expressing human VP7 of genotype G3 were efficiently neutralized by serum immunized with the wild-type SA11 strain (genotype G3).
  • the single-infectious rotavirus expressing human VP7 of a genotype other than G3 had low neutralizing activity.
  • Trizol reagent Invitrogen
  • a Thunderbird probe One-step qRT-PCR kit (Toyobo) was used. The following primer-probe set was used to detect the VP1 segment of rotavirus. Forward: AGGCAAACCATTGGAGGCAGAC (SEQ ID NO: 14) Reverse: CCAACCAGAACATGACTGCATT (SEQ ID NO: 15) Probe: FAM-TCCAACAGCGGAGGAATATACGGAC-TAMRA (SEQ ID NO: 16)
  • cecal samples were added to the culture medium of VP6-expressing MA104 cells to infect them with the virus, and viral titers were measured.
  • a t-test was performed for the number of viral RNA copies, and a Mann-Whitney U test was performed for the viral titers.
  • a P value of 0.05 or less was considered to indicate a significant difference.
  • Example 12 Creation of a single-infectious rotavirus by VP7 mutation introduction Materials and Methods In the method for producing a single-infectious rotavirus in Example 1, the mutated gene was changed from VP6 to VP7, and the VP6 expression vector was changed to a VP7 expression vector to produce a single-infectious rotavirus. The materials not used in Example 1 are shown below.
  • Rotavirus VP7 expression vector The VP7 expression vector was prepared by inserting the protein coding region DNA of the VP7 gene (SEQ ID NO: 9) of SA11 strain into the BamHI and EcoRI cleavage sites of the pcDNA3.1(+) plasmid to prepare pcDNA3-VP7.
  • the coding region DNA was synthesized by an artificial gene synthesis service (GenScript).
  • VP7 persistent expression cells The rotavirus VP7 gene was introduced into the pLVSIN-CMV-Neo vector (Takara Bio) and co-transfected with psPAX2 (Addgene) and pCMV-VSV-G (Addgene) into 293T cells to produce lentivirus. The lentivirus was then infected into African green monkey MA104 cells (ATCC CRL-2378.1), and after 2 days, drug selection was performed with G418 (800 ⁇ g/mL). From the VP7-expressing MA104 cells obtained by drug selection, cells that persistently and strongly expressed VP7 were cloned by limiting dilution.
  • Example 13 Comparison of proliferation ability between normal MA104 cells and MA104 cells continuously expressing VP7
  • the VP7 mutant rotavirus VP7- ⁇ Domain II prepared in Example 12 was compared for its proliferation ability in normal MA104 cells and in MA104 cells that persistently express VP7.
  • Materials and Methods Normal MA104 cells and MA104 cells expressing VP7 were seeded at 7.5 x 104 cells/well in a 24-well culture plate and cultured overnight.
  • VP7- ⁇ Domain II was infected at an MOI of 0.01, and the medium and cells were frozen and thawed three times at 0, 24, 48, and 72 hours after infection to prepare cell lysates and measure the virus titer.
  • a wild-type virus without VP7 mutation was used as a control.
  • the virus titer was measured in the same manner as in Example 1.
  • Example 19 Construction of VP4-deleted, single-infectious rotavirus having human rotavirus coat protein
  • Kanai et al. J Virol. 2020 Dec 22;95(2):e01374-20.
  • Kanai et al. produced a single-infectious rotavirus having a segmented RNA genome encoding VP7 of human rotavirus isolated from the stool of nine children with acute gastroenteritis in Japan.
  • pT7-VP4SA11-120bp encoding the mutated VP4 was used instead of pT4-VP6SA11
  • pT7-hVP7 a segmented RNA genome expression vector encoding VP7 of human rotavirus
  • the viral titers were calculated in the same manner as in Example 1 for the four types of VP4-deleted single-infectious rotaviruses (VP4-120bp/G1, VP4-120bp/G2, VP4-120bp/G8, VP4-120bp/G9) having segmented RNA genomes encoding the VP7 of the human rotaviruses produced.
  • Example 20 Preparation of a single-infectious rotavirus carrying the spike protein gene of the new coronavirus in the VP4 segment
  • Materials and Methods (1) Preparation of a single-infectious rotavirus expressing the spike protein of the new coronavirus
  • a gene encoding the receptor binding domain (RBD) of the spike protein of the new coronavirus (SARS-CoV-2) was used as a foreign gene.
  • the new coronavirus RBD gene was amplified from the spike protein expression plasmid described in Minami et al. (Microbiol Spectr. 2024 Apr 2;12(4):e0285923.).
  • HRP-labeled anti-rabbit IgG antibody Nacalai Tesque
  • HRP-labeled anti-mouse antibody Nacalai Tesque
  • Chemi-Lumi-One Ultra trade name, Nacalai Tesque

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Abstract

本発明は、ロタウイルスのＶＰ１、ＶＰ２、ＶＰ３、ＶＰ４、ＶＰ６、ＶＰ７、ＮＳＰ２、ＮＳＰ３およびＮＳＰ４からなる群から選択される少なくとも１つのウイルスタンパク質に変異を有することを特徴とする一回感染性ロタウイルスを提供する。本発明の一回感染性ロタウイルスは、ロタウイルスワクチン、ロタウイルスの中和試験方法等に用いることができる。

Description

一回感染性ロタウイルスおよびその利用
　本発明は、一回感染性ロタウイルス、一回感染性ロタウイルスを含有するロタウイルスワクチン、および一回感染性ロタウイルスを用いるロタウイルスの中和試験方法に関するものである。
　レオウイルス科に属するロタウイルスは、乳幼児の下痢症の原因ウイルスとして知られている。ロタウイルスが感染、発症しやすいのは生後６か月から２歳の乳幼児であり、５歳までにほぼ１００％が感染する。ロタウイルスに対するワクチンは弱毒生ワクチンが実用化されており、我が国においても予防接種法に基づく定期接種のワクチンに指定されている。ロタウイルスの弱毒生ワクチンはその予防効果が確認されているが、環境中へのウイルスの拡散や、ウイルスの病原性復帰が報告されている。
　一回感染性ウイルスは、ウイルス生活環の解明などの基礎研究に有用であるばかりでなく、より安全な次世代ワクチン開発への応用に用いられることが期待されている。本発明者らは、ロタウイルスの実用的な人工合成法（リバースジェネティクス系）を開発し（特許文献１、非特許文献１）、この技術により、任意の変異を有する人工組換えロタウイルスや、外来遺伝子を搭載した人工組換えロタウイルスを作製することが可能になった。しかしながら、ロタウイルスに関しては、未だ一回感染性ウイルスの報告例がない。
国際公開WO2018/062199
Kanai et al., Proc Natl Acad Sci U S A. 2017 Feb 28; 114(9):2349-2354
　本発明は、一回感染性ロタウイルスを提供することを課題とする。さらに本発明は、一回感染性ロタウイルスを含有するロタウイルスワクチンおよび一回感染性ロタウイルスを用いるロタウイルスの中和試験方法を提供することを課題とする。
　本発明は、上記の課題を解決するために以下の各発明を包含する。
［１］ロタウイルスのＶＰ１、ＶＰ２、ＶＰ３、ＶＰ４、ＶＰ６、ＶＰ７、ＮＳＰ２、ＮＳＰ３およびＮＳＰ４からなる群から選択される少なくとも１つのウイルスタンパク質に変異を有することを特徴とする一回感染性ロタウイルス。
［２］構造タンパク質の機能不全を誘導する変異を有する、前記［１］に記載の一回感染性ロタウイルス。
［３］ＶＰ６に変異を有する、前記［１］または［２］に記載の一回感染性ロタウイルス。
［４］ＶＰ６のドメインＨに変異を有する、前記［３］に記載の一回感染性ロタウイルス。
［５］ＶＰ６のドメインＨのＡ’－Ａ’’ループ、Ｄ’－Ｄ’’ループまたはαＡ－Ｉループに変異を有する、前記［４］に記載の一回感染性ロタウイルス。
［６］ＶＰ４に変異を有する、前記［１］または［２］に記載の一回感染性ロタウイルス。
［７］ＶＰ４のレクチンドメインおよび／またはβバレルドメインを欠失する変異を有する、前記［６］に記載の一回感染性ロタウイルス。
［８］ＶＰ７に変異を有する、前記［１］または［２］に記載の一回感染性ロタウイルス。
［９］ＶＰ７のドメインＩＩを欠失する変異を有する、前記［８］に記載の一回感染性ロタウイルス。
［１０］リアソータントである、前記［１］～［９］のいずれかに記載の一回感染性ロタウイルス。
［１１］親株と異なる遺伝子型の構造タンパク質または親株と異なる株の構造タンパク質をコードする分節ＲＮＡゲノムを有するリアソータントである、前記［１］～［９］のいずれかに記載の一回感染性ロタウイルス。
［１２］ヒトロタウイルスの構造タンパク質をコードする分節ＲＮＡゲノムを有するリアソータントである、前記［１］～［９］のいずれかに記載の一回感染性ロタウイルス。
［１３］外来遺伝子を発現する、前記［１］～［１２］のいずれかに記載の一回感染性ロタウイルス。
［１４］外来遺伝子がロタウイルス以外のウイルスまたは病原微生物の抗原タンパク質をコードする遺伝子である、前記［１３］に記載の一回感染性ロタウイルス。
［１５］外来遺伝子がレポーター遺伝子である、前記［１３］に記載の一回感染性ロタウイルス。
［１６］レポーター遺伝子が蛍光タンパク質または化学発光タンパク質をコードする遺伝子である、前記［１５］に記載の一回感染性ロタウイルス。
［１７］前記［１］～［１４］のいずれかに記載の一回感染性ロタウイルスを含有するワクチン。
［１８］ロタウイルスワクチンである、前記［１７］に記載のワクチン。
［１９］前記［１］～［１６］のいずれかに記載の一回感染性ロタウイルスを用いることを特徴とする、ロタウイルスの中和試験方法。
　本発明により、一回感染性ロタウイルスを提供することができる。また、本発明により、一回感染性ロタウイルスを含有するロタウイルスワクチン、および一回感染性ロタウイルスを用いるロタウイルスの中和試験方法を提供することができる。
ＶＰ６のドメイン構造と実施例１で使用した変異ＶＰ６の変異領域を示す図である。 ＶＰ６に変異を導入した１８種類の人工組換えロタウイルスのウイルス力価を測定した結果を示す図である。 実施例１で高力価を示した９種類の人工組換えロタウイルスをＶＰ６持続発現細胞とＶＰ６を発現しない細胞に感染させ増殖力を比較した結果を示す図である。 実施例２で選択した人工組換えロタウイルスΔ169-174＋linkerをＶＰ６持続発現細胞とＶＰ６を発現しない細胞に感染させ増殖力を比較した結果を示す図であり、（Ａ）はＶＰ６を発現しない細胞の結果、（Ｂ）はＶＰ６持続発現細胞の結果である。 人工組換えロタウイルスΔ169-174＋linkerを、ＶＰ６を発現しない細胞に感染させ、ウイルスの継代を5回繰り返して増殖力を検討した結果を示す図である。 一回感染性ロタウイルスΔ169-174＋linkerと野生型サルロタウイルスを、それぞれＶＰ６を発現しない細胞に感染させ、ＮＳＰ４およびＶＰ６の発現を免疫蛍光抗体法で観察した結果を示す図である。 一回感染性ロタウイルスΔ169-174＋linkerにおいて、ＮＳＰ１をコードする分節ＲＮＡゲノムに緑色蛍光タンパク質（ＺｓＧ）をコードする遺伝子を挿入して作製した緑色蛍光タンパク質発現一回感染性ロタウイルスと、緑色蛍光タンパク質を発現しない一回感染性ロタウイルスΔ169-174＋linkerを、それぞれＶＰ６持続発現細胞に感染させ、ＺｓＧの発現とＮＳＰ４の発現を観察した結果を示す図である。 一回感染性ロタウイルスΔ169-174＋linkerにおいて、ＮＳＰ１をコードする分節ＲＮＡゲノムにルシフェラーゼ（ＮＬｕｃ）をコードする遺伝子を挿入して作製したルシフェラーゼ発現一回感染性ロタウイルスと、ルシフェラーゼを発現しない一回感染性ロタウイルスΔ169-174＋linkerを、それぞれＶＰ６持続発現細胞に感染させ、経時的にルシフェラーゼ活性を測定した結果を示す図である。 野生型サルロタウイルスＳＡ１１株で免疫したマウス血清を用いて、ルシフェラーゼ発現一回感染性ロタウイルスの中和試験およびＶＰ６に変異を導入していないルシフェラーゼ発現自己増殖型ロタウイルスの中和試験を行った結果を示す図である。 ヒトロタウイルスのＶＰ７をコードする分節ＲＮＡゲノムを有する５種類の一回感染性ロタウイルスΔ169-174＋linkerを作製し、ウイルス力価を測定した結果を示す図である。 野生型サルロタウイルスＳＡ１１株で免疫したマウス血清を用いて、４種類のヒトロタウイルスＶＰ７をコードする分節ＲＮＡゲノムを有する一回感染性ロタウイルスの中和試験を行った結果を示す図である。 一回感染性ロタウイルスΔ169-174＋linkerをマウスに３回経口投与し、各投与の２週間後に採血して得られた血清を中和試験に供し、ワクチン効果を検討した結果を示す図である。 ロタウイルスの構造（Ａ）とＶＰ６の構造（Ｂ）を示す図である。
一回感染性ロタウイルスΔ169-174＋linkerまたは野生型ロタウイルスをマウスに経口投与して2日後に腸管を回収し、ウイルスコピー数と感染性ウイルスの有無を検討した結果を示す図であり、（Ａ）は盲腸におけるウイルスコピー数を測定した結果、（Ｂ）は盲腸のホモジネートをVP6発現MA104細胞に感染させ、ウイルス力価を測定した結果を示す図である。 （Ａ）はロタウイルスＶＰ７の構造を示す図であり、（Ｂ）は実施例１２で使用した変異ＶＰ７の変異領域を示す図である。 実施例１２で作製した人工組換えロタウイルスVP7-ΔDomain IIをＶＰ７持続発現細胞とＶＰ７を発現しない細胞に感染させ増殖力を比較した結果を示す図であり、（Ａ）はＶＰ７を発現しない細胞の結果、（Ｂ）はＶＰ７持続発現細胞の結果である。 人工組換えロタウイルスVP7-ΔDomain IIを、ＶＰ７を発現しない細胞に感染させ、ウイルスの継代を5回繰り返して増殖力を検討した結果を示す図である。 （Ａ）はロタウイルスＶＰ４の構造を示す図であり、（Ｂ）は実施例１５で使用した変異ＶＰ４の変異領域を示す図である。 実施例１５で作製した人工組換えロタウイルスVP4-120bpをＶＰ４持続発現細胞とＶＰ４を発現しない細胞に感染させ増殖力を比較した結果を示す図であり、（Ａ）はＶＰ４を発現しない細胞の結果、（Ｂ）はＶＰ４持続発現細胞の結果である。 人工組換えロタウイルスVP4-120bpを、ＶＰ４を発現しない細胞に感染させ、ウイルスの継代を5回繰り返して増殖力を検討した結果を示す図である。 一回感染性ロタウイルスVP4-120bpにおいて、ＶＰ４遺伝子の大部分を欠失した分節ＲＮＡゲノムに緑色蛍光タンパク質（ＺｓＧ）をコードする遺伝子を挿入して作製した緑色蛍光タンパク質発現一回感染性ロタウイルスと、緑色蛍光タンパク質を発現しない一回感染性ロタウイルス（VP4-120bp）を、それぞれＶＰ４を発現しない細胞に感染させ、ＺｓＧの発現とＮＳＰ４の発現を観察した結果を示す図である。 一回感染性ロタウイルスVP4-120bpにおいて、ＶＰ４遺伝子の大部分を欠失した分節ＲＮＡゲノムにルシフェラーゼ（ＮＬｕｃ）をコードする遺伝子を挿入して作製したルシフェラーゼ発現一回感染性ロタウイルスと、ルシフェラーゼを発現しない一回感染性ロタウイルス（VP4-120bp）を、それぞれＶＰ４を発現しない細胞に感染させ、経時的にルシフェラーゼ活性を測定した結果を示す図である。 一回感染性ロタウイルスVP4-120bpにおいて、ＶＰ４遺伝子の大部分を欠失した分節ＲＮＡゲノムに新型コロナウイルス（SARS-CoV-2）のスパイクタンパク質のレセプター結合領域（ＲＢＤ）をコードする遺伝子を挿入して作製したＲＢＤ発現一回感染性ロタウイルス（VP4-120bp-RBD）と、ＲＢＤを発現しない一回感染性ロタウイルス（VP4-120bp）を、それぞれＶＰ４を発現しない細胞に感染させ、ウエスタンブロッティングによりＲＢＤの発現とＮＳＰ３の発現を観察した結果を示す図である。
　本発明は一回感染性ロタウイルスを提供する。本明細書において「一回感染性ロタウイルス」は、一回感染後に感染性ウイルス粒子を形成できない、または一回感染後に感染性ウイルス粒子の産生量が抑制されているロタウイルスを意味する。また、「一回感染性ロタウイルス」は、継代培養することによりウイルス力価が低下するロタウイルスを意味する。一回感染性ロタウイルスは、変異が導入されたウイルスタンパク質に対応する正常ウイルスタンパク質を発現する細胞に感染した場合には感染性ウイルス粒子を形成して増殖可能となるが、通常の細胞に感染しても増殖できないため安全であり、環境中に拡散されない。
　ロタウイルスはレオウイルス科に属するエンベロープを持たないウイルスである。ウイルス粒子は外殻、内殻、コアタンパクからなる三重構造を有し、その内部に１１分節からなる２本鎖ＲＮＡのゲノムを有している（図１３（Ａ）参照）。この１１本の遺伝子分節には６種の構造タンパク（ＶＰ）と６種の非構造タンパク（ＮＳＰ）がコードされている（表１）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　本発明の一回感染性ロタウイルスは、ロタウイルスのＶＰ１、ＶＰ２、ＶＰ３、ＶＰ４、ＶＰ６、ＶＰ７、ＮＳＰ２、ＮＳＰ３およびＮＳＰ４からなる群から選択される少なくとも１つのウイルスタンパク質に変異を有するものであればよい。表１に示すように、ＶＰ１、ＶＰ２、ＶＰ３、ＶＰ４、ＶＰ６およびＶＰ７はロタウイルスの構造タンパク質であり、ＮＳＰ２、ＮＳＰ３およびＮＳＰ４は非構造タンパク質である。本発明の一回感染性ロタウイルスは、ロタウイルスの構造タンパク質に変異を有するものであってもよく、構造タンパク質の機能不全を誘導する変異を有するものであってもよい。
　変異を有するウイルスタンパク質は２つ以上であってもよく、１つであってもよいが、１つであることが好ましい。変異を有する構造タンパク質はＶＰ６（内殻タンパク質）であってもよい。変異を有する構造タンパク質がＶＰ６である場合、ＶＰ７（外殻タンパク質）と相互作用する領域に変異を有することが好ましい。ＶＰ７と相互作用する領域はＶＰ６のドメインＨであってもよい。ドメインＨには３つのループ構造（Ａ’－Ａ’’ループ、Ｄ’－Ｄ’’ループ、αＡ－Ｉループ）が含まれており、これらのループのいずれか１つに変異を有していてもよい。
　変異を有する構造タンパク質はＶＰ４（スパイクタンパク質）であってもよい。変異を有する構造タンパク質がＶＰ４である場合、変異ＶＰ４はレクチンドメインの欠失であってもよく、βバレルドメインの欠失であってもよく、レクチンドメインとβバレルドメインの両方の欠失であってもよい。欠失領域が大きいほど復帰変異が起こり難く、外来遺伝子の導入が容易になるため、変異ＶＰ４はレクチンドメインとβバレルドメインの両方の欠失であることが好ましい。ＶＰ４のレクチンドメインとβバレルドメインの両方の欠失を有する変異ＶＰ４は、ＶＰ４をコードする分節ゲノムの塩基配列において、Ｎ末端側に少なくとも３０ｂｐ、４０ｂｐ、５０ｂｐ、６０ｂｐ、７０ｂｐ、８０ｂｐ、９０ｂｐ、１００ｂｐ、１２０ｂｐ以上が残っており、Ｃ末端側に少なくとも３０ｂｐ、４０ｂｐ、５０ｂｐ、６０ｂｐ、７０ｂｐ、８０ｂｐ、９０ｂｐ、１００ｂｐ、１２０ｂｐ以上が残っている変異ＶＰ４であってもよい。Ｎ末端側およびＣ末端側に残っている塩基数は特に限定されず、両側の塩基数は同数であることを要しない。
　変異を有する構造タンパク質はＶＰ７（外殻タンパク質）であってもよい。変異を有する構造タンパク質がＶＰ７である場合、ドメインIIの欠失であってもよい。ＶＰ７のドメインIIの欠失を有する変異ＶＰ７は、Ｎ末端側に少なくとも２００ｂｐ、２１０ｂｐ、２２０ｂｐ、２３０ｂｐ、２４０ｂｐ、２５０ｂｐ以上が残っており、Ｃ末端側に少なくとも２００ｂｐ、２１０ｂｐ、２２０ｂｐ、２３０ｂｐ、２４０ｂｐ、２５０ｂｐ以上が残っている変異ＶＰ７であってもよい。Ｎ末端側およびＣ末端側に残っている塩基数特に限定されず、両側の塩基数は同数であることを要しない。
　変異の内容は特に限定されず、アミノ酸欠失、アミノ酸置換等が挙げられる。欠失または置換するアミノ酸数は特に限定されず、１００個以下、５０個以下、４０個以下、３０個以下、２０個以下、１０個以下であってもよい。アミノ酸置換は、アラニン置換であってもよく、任意のアミノ酸リンカーであってもよい。構造遺伝子への変異導入は、公知の遺伝子組換え技術を用いて行うことができる。
　本発明の一回感染性ロタウイルスは、公知の人工組換えロタウイルスの作製方法を用いて作製することができる。例えば、特許文献１（WO2018/062199）、非特許文献１（Kanai et al., Proc Natl Acad Sci U S A. 2017 Feb 28; 114(9):2349-2354）に記載の方法、またはこれらの方法を一部改変した方法を好適に用いることができる。宿主細胞には、変異を有するウイルスタンパク質に対応する正常タンパク質発現ベクターを導入することが好ましい。宿主細胞には、さらに、キャッピング酵素発現ベクター、ＦＡＳＴ（fusion-associated small transmembrane）タンパク質発現ベクター、ロタウイルスＮＳＰ２発現ベクター、ロタウイルスＮＳＰ５発現ベクター等を適宜選択して導入してもよい。例えば、本願の実施例１に記載の人工組換えロタウイルスの作製方法を用いてもよい。
　キャッピング酵素としては、例えばワクシニアウイルスのキャッピング酵素を用いることができる。ＦＡＳＴタンパク質としては、ネルソンベイレオウイルスのｐ１０、トリレオウイルスのｐ１０などを用いることができる。宿主細胞は、ロタウイルスに対する感受性が高く、かつ遺伝子導入効率が高い細胞を好適に用いることができる。例えば、ＢＨＫ細胞、ＭＡ１０４細胞、ＣＯＳ７細胞、ＣＶ１細胞、Ｖｅｒｏ細胞、Ｌ９２９細胞、２９３Ｔ細胞、Ａ５４９細胞などが挙げられる。
　作製された人工組換えロタウイルスが一回感染性ロタウイルスであることは、作製された人工組換えロタウイルスを、変異が導入された構造タンパク質に対応する正常構造タンパク質を発現する細胞および当該構造タンパク質を発現しない細胞に感染させ、前者に感染させた場合はウイルスが増殖し、後者に感染させた場合はウイルスが増殖しないことを確認することにより判定することができる。
　本発明の一回感染性ロタウイルスは、リアソータント（遺伝子再集合体）であってもよい。ロタウイルスのリアソータントとは、異種または異株のロタウイルス間で分節ＲＮＡゲノムの組換えが生じた新しい遺伝子型構成を持つロタウイルスである。リアソータントは、分節ゲノムの機能解析に有用であると共に、ワクチン候補の人工組換えロタウイルスとして極めて有用である。組換えられる分節ＲＮＡゲノムは、親株と異なる遺伝子型の構造タンパク質をコードする分節ＲＮＡゲノムであってもよい。ロタウイルスの１１本の各遺伝子分節には多数の遺伝子型が存在し、例として、Ｇ型（ＶＰ７）が４２種類、Ｐ型（ＶＰ４）は５８種類が報告されている。これらの遺伝子型は今後も増えていくものである。組換えられる分節ＲＮＡゲノムは、親株と異なる株の構造タンパク質をコードする分節ＲＮＡゲノムであってもよい。親株と異なる株の構造タンパク質の遺伝子型は親株と同じでもよく、異なっていてもよい。また、組換えられる分節ＲＮＡゲノムはヒトまたはヒト以外の哺乳動物または鳥類のロタウイルスの構造タンパク質をコードする分節ＲＮＡゲノムであってもよくヒトまたはヒト以外の哺乳動物または鳥類のロタウイルスの親株と異なる遺伝子型の構造タンパク質をコードする分節ＲＮＡゲノムであってもよい。
　リアソータント作製に用いる異種または異株のロタウイルスの構造タンパク質は、親株の変異を有する構造タンパク質以外の構造タンパク質であればよい。例えばＶＰ６（内殻タンパク質）に変異を有する一回感染性ロタウイルスの場合、異種または異株のロタウイルスのＶＰ７（外殻タンパク質）および／またはＶＰ４（スパイクタンパク質）をコードする分節ＲＮＡゲノムを有するリアソータントとすることが好ましく、ＶＰ４に変異を有する一回感染性ロタウイルスの場合、異種または異株のロタウイルスのＶＰ７および／またはＶＰ６をコードする分節ＲＮＡゲノムを有するリアソータントとすることが好ましく、ＶＰ７に変異を有する一回感染性ロタウイルスの場合、異種または異株のロタウイルスのＶＰ４および／またはＶＰ６をコードする分節ＲＮＡゲノムを有するリアソータントとすることが好ましい。異種ロタウイルスはヒトロタウイルスであることが好ましい。ヒトロタウイルスの構造タンパク質をコードする分節ＲＮＡゲノムに組み換えることにより、ヒトロタウイルスの各種遺伝子型（血清型）の抗原性を有する一回感染性ロタウイルスを作製することができる。このようなヒトロタウイルスの各種遺伝子型（血清型）の抗原性を有する一回感染性ロタウイルスは、ロタウイルスワクチンのワクチン抗原として非常に有用である。また、中和試験用の抗原として非常に有用である。
　本発明の一回感染性ロタウイルスは、外来遺伝子を発現する一回感染性ロタウイルスであってもよい。外来遺伝子を発現する一回感染性ロタウイルスは、分節ＲＮＡゲノムの少なくとも１つに外来遺伝子を発現可能に導入することにより作製することができる。外来遺伝子は特に限定されず、任意の外来遺伝子を発現する一回感染性ロタウイルスを作製することができる。例えば、ロタウイルス以外のウイルスや病原微生物の抗原タンパク質をコードする外来遺伝子を発現させることにより、作製された一回感染性ロタウイルスをワクチンとして使用することができる。ロタウイルス以外のウイルスや病原微生物としては、例えばノロウイルス、アデノウイルス、Ａ型肝炎ウイルス、サポウイルス、手足口病ウイルス、エンテロウイルス、ＨＩＶ、コロナウイルス、新型コロナウイルス（SARS-CoV-2）、サルモネラ菌、カンピロバクター、腸炎ビブリオ菌、大腸菌Ｏ１５７、コレラ菌、腸チフス菌、赤痢菌等が挙げられる。これらのワクチン抗原は、エピトープペプチドであってもよい。異なる外来ワクチン抗原を発現する人工組換えロタウイルスを複数組み合わせて、ワクチンを構成してもよい。
　外来遺伝子は異種または異株のロタウイルスの抗原タンパク質（例えばＶＰ４、ＶＰ７等）であってもよい。異種または異株のロタウイルスの抗原タンパク質を１つ以上発現させることにより、ロタウイルスの多価ワクチンとして使用可能な一回感染性ロタウイルスを提供することができる。抗原タンパク質は、エピトープペプチドであってもよい。
　外来遺伝子はレポーター遺伝子であってもよい。レポーター遺伝子は、一般に用いられているものであれば特に限定されない。例えば、蛍光タンパク質、化学発光タンパク質、β－ガラクトシダーゼ、β－グルクロニダーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ、アルカリホスファターゼ、ペルオキシダーゼ等をコードする遺伝子が挙げられる。レポーター遺伝子は蛍光タンパク質または化学発光タンパク質をコードする遺伝子であってもよい。
　蛍光タンパク質としては、例えば緑色蛍光タンパク質、青色蛍光タンパク質、シアン蛍光タンパク質、黄緑色蛍光タンパク質、黄色蛍光タンパク質、橙色蛍光タンパク質、赤色蛍光タンパク質などが挙げられるが特に限定されず、公知の蛍光タンパク質を好適に用いることができる。化学発光タンパク質としては、例えばルシフェラーゼ、イクオリン、オベリンなどが挙げられるが特に限定されず、公知の化学発光タンパク質を好適に用いることができる。
　レポーター遺伝子を発現する一回感染性ロタウイルスは、ウイルス量を容易に可視化できるので、ロタウイルスの中和試験、抗ロタウイルス薬のスクリーニング等に利用することができ、自己増殖型ロタウイルスを用いるより安全かつ簡便に行うことができる。
〔ワクチン〕
　本発明の一回感染性ロタウイルスは、ワクチンとして使用することができる。すなわち、本発明は上記本発明の一回感染性ロタウイルスを用いるワクチンを提供する。上述のように、本発明の一回感染性ロタウイルス、ヒトロタウイルスの構造タンパク質をコードする分節ＲＮＡゲノムを有する一回感染性ロタウイルス（リアソータント）、異種または異株のロタウイルスの抗原タンパク質をコードする外来遺伝子を発現する一回感染性ロタウイルスは、ロタウイルスワクチンとして好適に使用することができる。また、遺伝子型（血清型）が異なるロタウイルスの抗原タンパク質を発現する一回感染性ロタウイルスを複数混合することにより多価ロタウイルスワクチンを構成することができる。
　上述のように、ロタウイルス以外のウイルスや病原微生物の抗原タンパク質をコードする外来遺伝子を発現する一回感染性ロタウイルスは、各種ウイルス・病原微生物に対するワクチンとして好適に使用することができる。異なる外来抗原タンパク質を発現する一回感染性ロタウイルスを複数組み合わせて、ワクチンを構成してもよい。
〔中和試験方法〕
　本発明の一回感染性ロタウイルスは、ロタウイルスの中和試験に使用することができる。すなわち、本発明は上記本発明の一回感染性ロタウイルスを用いるロタウイルスの中和試験方法を提供する。ロタウイルスの中和試験は、段階希釈した被験血清と本発明の一回感染性ロタウイルスを混合し抗原抗体反応を行わせた後、マイクロプレート上の培養細胞に接種して培養を行い、ウイルス感染細胞数の測定により実施することができる。
　本発明の中和試験方法は、レポーター遺伝子を発現する一回感染性ロタウイルスを用いることが好ましい。レポーター遺伝子を発現する一回感染性ロタウイルスを用いることにより、レポータータンパク質の発現量によりウイルス感染細胞数を測定することができるので、簡便でブレが少ない中和試験を安全に実施することができる。
　以下、実施例により本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
〔実施例１：VP6変異導入による一回感染性ロタウイルスの作製〕
＜材料および方法＞
（１）ウイルス
　サルロタウイルスSA11株（以下「SA11株」と記す）を使用した（表１参照）。
（２）SA11株の各分節RNAゲノム発現カセットを含むプラスミド（分節RNAゲノム発現ベクター）
　WO2018/062199（特許文献１）に記載の方法に従い、SA11株の11個の分節RNAゲノムのcDNAを含むプラスミドを作製した。ウイルスから抽出した二本鎖RNAを鋳型とし、各分節RNAゲノムの塩基配列に基づく特異的プライマーを用いてRT-PCRを行った。得られたRT-PCR産物（各分節RNAゲノムのcDNA）をp3E5プラスミドのT7プロモーター配列とD型肝炎ウイルス（HDV）リボザイム配列の間に挿入し、各分節RNAゲノムの発現カセットを含むプラスミドを得た。各分節RNAゲノムの発現カセットは、各分節RNAゲノムのcDNAの5'側にT7プロモーター配列、3'側にHDVリボザイム配列が隣接し、その下流にT7ターミネーター配列が配置された構造を有する。作製したプラスミド（分節RNAゲノム発現ベクター）を、それぞれpT7-VP1SA11、pT7-VP2SA11、pT7-VP3SA11、pT7-VP4SA11、pT7-VP6SA11、pT7-VP7SA11、pT7-NSP1SA11、pT7-NSP2SA11、pT7-NSP3SA11、pT7-NSP4SA11およびpT7-NSP5SA11と称する。
（３）キャッピング酵素発現ベクター
　キャッピング酵素発現ベクターとしては、Kanaiら（Proc Natl Acad Sci USA 2017 Feb 28;114(9):2349-2354）に記載のように、ワクシニアウイルスD1R遺伝子のタンパク質コード領域DNA（GenBank ACCESSION No.: NC006998の93948位～96482位）およびワクシニアウイルスD12L遺伝子のタンパク質コード領域DNA（GenBank ACCESSION No.: NC006998の107332位～108195位）を、それぞれpCAGGSプラスミドのBg1II切断部位に挿入し、pCAG-D1R（ワクシニアウイルスmRNAキャッピング酵素ラージサブユニット発現ベクター）およびpCAG-D12L（ワクシニアウイルスmRNAキャッピング酵素スモールサブユニット発現ベクター）を作製した。
（４）ロタウイルスVP6発現ベクター
　VP6発現ベクターは、SA11株のVP6遺伝子（配列番号６）のタンパク質コード領域DNAをpcDNA3.1(+)プラスミドのBamHIおよびEcoRI切断部位に挿入し、pcDNA3-VP6を作製した。コード領域DNAは、人工遺伝子合成サービス（GenScript）にて合成した。
（５）ロタウイルスNSP2、NSP5発現ベクター
　NSP2発現ベクターおよびNSP5発現ベクターは、SA11株のNSP2遺伝子（配列番号８）のタンパク質コード領域DNAおよびNSP5遺伝子（配列番号１１）のタンパク質コード領域DNAを、それぞれpCAGGSプラスミドのEcoRI切断部位に挿入し、pCAG-NSP2、pCAG-NSP5を作製した。各コード領域DNAは、人工遺伝子合成サービス（Eurofins Genomics）にて合成した。各合成DNAをそれぞれpCAGGSプラスミドのEcoRI切断部位に挿入し、pCAG-NSP2、pCAG-NSP5を作製した。
（６）VP6変異導入プラスミド
　pT7-VP6SA11に含まれるロタウイルスVP6のRNAゲノムのcDNAに各種変異を導入した18種類のプラスミドを、公知の遺伝子組換え技術を用いて作製した。ロタウイルスVP6のドメイン構造と各種変異領域を図１に示す。具体的な変異の内容を表２に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
（７）T7RNAポリメラーゼ持続発現細胞
　T7RNAポリメラーゼを持続発現するBHK-T7/P5細胞を使用した。BHK-T7/P5細胞は、CAGプロモーターの下流にT7RNAポリメラーゼをコードするDNAを挿入したpCAGGSプラスミドをBHK細胞（Baby Hamster Kidney Cells）にトランスフェクションし、抗生物質含有培地で培養して選択することにより作製した。
（８）VP6持続発現細胞
　ロタウイルスVP6遺伝子をpLVSIN-CMV-Neoベクター（Takara Bio）に導入し、psPAX2（Addgene）、pCMV-VSV-G（Addgene）と一緒に293T細胞に共導入してレンチウイルスを作製した。作製したレンチウイルスをアフリカミドリザルMA104細胞（ATCC CRL-2378.1）に感染させ、2日後にG418（800μg/mL）で薬剤選択を行った。薬剤選択により得られたVP6発現MA104細胞の中から限界希釈法によりVP6を最も強く発現する細胞をクローニングした。４回限界希釈法を行い、持続的にVP6を発現するMA104細胞を得た。
（９）人工組換えウイルスの作製
　トランスフェクションの前日に、BHK-T7/P5細胞を5×104細胞/ウェルで12穴培養プレートに播種した。翌日、10種類の分節RNAゲノム発現ベクター（pT7-VP1SA11、pT7-VP2SA11、pT7-VP3SA11、pT7-VP4SA11、pT7-VP7SA11、pT7-NSP1SA11、pT7-NSP2SA11、pT7-NSP3SA11、pT7-NSP4SA11、およびpT7-NSP5SA11）、変異導入pT7-VP6SA11、キャッピング酵素発現ベクター（pCAGD1RおよびpCAG-D12L）、ロタウイルスNSP2発現ベクター（pCAG-NSP2SA11）、ロタウイルスNSP5発現ベクター（pCAG-NSP5SA11）、ロタウイルスVP6発現ベクター（pcDNA3-VP6）の計16種類のプラスミドを0.125μgずつ（合計2μg）、トランスフェクション試薬（TransIT-LT1（商品名）、Mirus）を用いてBHK-T7/P5細胞に導入した。DNA 1μgあたり2μLのトランスフェクション試薬を使用した。BHK-T7/P5細胞の培養には、5% FBS、100units/mLペニシリンおよび100μg/mLストレプトマイシンを含有するDMEM培地を用い、37℃5%CO2環境下で培養した。トランスフェクションの24時間後に培地をFBS不含有、トリプシン含有培地に交換し、VP6持続発現MA104細胞を2×105細胞/ウェルで添加し、5日間共培養して培地および細胞を回収した。回収した培地および細胞を3回凍結融解して細胞溶解液を調製した。得られた細胞溶解液の10％を新しく調製したVP6持続発現MA104細胞（2×105細胞/ウェル、12穴培養プレート）に添加し、さらに5日間培養し培地および細胞を回収した。回収した培地および細胞を3回凍結融解して細胞溶解液を調製し、VP6持続発現MA104細胞（1×104細胞/ウェル、96穴培養プレート）に添加し、18時間後に細胞をホルマリンで固定した。0.5% Triton-Xで膜透過処理を行い、免疫蛍光抗体法にて感染細胞を可視化した。免疫蛍光抗体法の一次抗体にはウサギ由来抗ロタウイルスNSP4抗体（J Virol. 2023 Jan 31;97(1):e0186122.）を、二次抗体にはCF488標識抗ウサギIgG抗体（Biotum社）を用いた。感染細胞が確認された場合、組換えウイルスができていると判断した。
（１０）ウイルス力価の測定
　VP6持続発現MA104細胞を1×104細胞/ウェルで96穴培養プレートに播種し、一夜培養した。細胞溶解液15μLを生理食塩水135μLに添加して攪拌し、10倍希釈液を調製した。この手順を繰り返して、段階希釈ウイルス試料を調製した。VP6持続発現MA104細胞に段階希釈ウイルス試料50μL/ウェルを添加し、18時間後に細胞をホルマリンで固定した。0.5％ Triton-Xで膜透過処理を行い、免疫蛍光抗体法にて感染細胞を可視化した。免疫蛍光抗体法の一次抗体には、上記（９）と同じウサギ由来抗ロタウイルスNSP4抗体を、二次抗体にはCF488標識抗ウサギIgG抗体を用いた。感染細胞数をカウントしてウイルス力価を算出した。
＜結果＞
　結果を図２に示す。VP6に変異導入した18種類のVP6変異導入プラスミドを用いて人工組換えウイルスを作製することができた。ロタウイルスVP6の3種類のループ構造に部分欠失変異、アラニン置換変異またはリンカー配列との置換変異を導入した中にウイルス力価が他と比較して高いウイルスが存在した。
〔実施例２：VP6変異ロタウイルスの増殖力の検討〕
　実施例１で高力価を示した9種類のVP6変異ロタウイルスについて、VP6持続発現MA104細胞およびVP6を発現しないMA104細胞（以下「通常のMA104細胞」と記す）における増殖力を比較検討した。
＜材料および方法＞
　VP6持続発現MA104細胞および通常のMA104細胞を、それぞれ7.5×104細胞/ウェルで24穴培養プレートに播種し、一夜培養した。実施例１で選択した9種類のウイルスをそれぞれMOI 0.01で感染させ、感染後24時間で培地および細胞を3回凍結融解して細胞溶解液を調製し、ウイルス力価を測定した。対照にはVP6変異を有しない野生型ウイルスを使用した。ウイルス力価の測定は、実施例１と同じ方法で行った。
＜結果＞
　結果を図３に示す。使用した9種類のウイルスは、いずれも通常のMA104細胞と比較してVP6持続発現MA104細胞で高いウイルス力価を示した。その中でも、通常のMA104細胞で増殖力が低く、VP6持続発現MA104細胞で効率よく増殖するウイルス（Δ169-174＋linker）を以後の実験に使用した。
〔実施例３：通常のMA104細胞とVP6持続発現MA104細胞における増殖力の比較〕
　実施例２で選択したVP6変異ロタウイルスΔ169-174＋linkerについて、通常のMA104細胞とVP6持続発現MA104細胞における増殖力を比較した。
＜材料および方法＞
　通常のMA104細胞とVP6持続発現MA104細胞を、それぞれ7.5×104細胞/ウェルで24穴培養プレートに播種し、一夜培養した。Δ169-174＋linkerをMOI 0.01で感染させ、感染後0時間、24時間、48時間、72時間で培地および細胞を3回凍結融解して細胞溶解液を調製し、ウイルス力価を測定した。対照にはVP6変異を有しない野生型ウイルスを使用した。ウイルス力価の測定は、実施例１と同じ方法で行った。
＜結果＞
　結果を図４に示す。（A）は通常のMA104細胞の結果、（B）はVP6持続発現MA104細胞の結果である。Δ169-174＋linkerは通常のMA104細胞ではほとんど増殖しないが、MA104-VP6細胞では効率的に増殖した。
〔実施例４：通常のMA104細胞における増殖力の検討〕
　VP6変異ロタウイルスΔ169-174＋linkerが通常のMA104細胞で増殖できないことをさらに確認するために、通常のMA104細胞で継代培養を行った。
＜材料および方法＞
　通常のMA104細胞を3×105細胞/ウェルで6穴培養プレートに播種し、一夜培養した。Δ169-174＋linkerをMOI 1.0で感染させ、1週間培養後に培地および細胞を回収して凍結融解し、細胞溶解液を調製した。得られた細胞溶解液の10％を新たな通常のMA104細胞に添加し、1週間培養した。ウイルスの継代を5回繰り返し、各継代時に実施例１と同じ方法でウイルス力価を測定した。
＜結果＞
　結果を図５に示す。Δ169-174＋linkerは継代により力価が低下し、3回目の継代以降はウイルスが検出されなかった。この結果から、Δ169-174＋linkerは、VP6を発現しない通常の細胞では増殖できない一回感染性ロタウイルスであると判断した。
〔実施例５：通常の細胞におけるウイルスタンパク質発現の検討〕
　一回感染性ウイルスをワクチンとして使用するためには、VP6を発現しない通常の細胞では感染性ウイルス粒子を形成しないものの、ウイルスタンパク質を発現することが要求される。そこで、実施例３で一回感染性ロタウイルスと判断したΔ169-174＋linkerを通常のMA104細胞に感染させて、ウイルスタンパク質の発現を観察した。
＜材料および方法＞
　通常のMA104細胞を、7.5×104細胞/ウェルでカバースリップを含む24穴培養プレートに播種し、一夜培養した。Δ169-174＋linkerおよび野生型サルロタウイルス（SA11株）をそれぞれMOI 1.0で感染させ、8時間後に細胞をホルマリンで固定した。0.5％ Triton-Xで膜透過処理を行い、一次抗体にはウサギ由来抗NSP4抗体およびマウス由来抗VP6抗体を、二次抗体にはCF488標識抗ウサギIgG抗体（Biotum社）およびCF594標識抗マウスIgG抗体（Biotum社）を用いて免疫染色した。核はHoechstを用いて染色を行い、蛍光顕微鏡で観察した。
＜結果＞
　結果を図６に示す。Δ169-174＋linkerは、通常のMA104細胞に感染させた場合もウイルスタンパク質の発現が確認された。この結果から、Δ169-174＋linkerは、ワクチンとしての使用が期待できることが示された。
〔実施例６：レポーター遺伝子を含む一回感染性ロタウイルスの作製〕
６－１　緑色蛍光タンパク質発現一回感染性ロタウイルス
＜材料および方法＞
（１）緑色蛍光タンパク質遺伝子挿入NSP1発現プラスミド
　緑色蛍光タンパク質遺伝子として、ZsGreen（以下「ZsG」と記す）遺伝子を用いた。ZsG遺伝子挿入NSP1遺伝子発現プラスミドとして、Kanaiら（J Virol. 2019 Feb 15; 93(4): e01774-18.）に記載のpT7-NSP1-ZsG-Δ722を使用した。pT7-NSP1-ZsG-Δ722は、pT7-NSP1SA11のNSP1遺伝子の111位と112位の間にZsG遺伝子が挿入され、さらにNSP1遺伝子から722 nt（134位～855位）が削除された構造を有するプラスミドである。
（２）緑色蛍光タンパク質発現一回感染性ロタウイルスの作製
　実施例１で作製した11種類の分節RNAゲノム発現ベクターにおいて、pT7-VP6SA11に代えてpT7-VP6SA11/Δ169-174＋linkerを、pT7-NSP1SA11に代えてpT7-NSP1-ZsG-Δ722を使用し、これら以外にキャッピング酵素発現ベクター（pCAGD1RおよびpCAG-D12L）、ロタウイルスNSP2発現ベクター（pCAG-NSP2SA11）、ロタウイルスNSP5発現ベクター（pCAG-NSP5SA11）、ロタウイルスVP6発現ベクター（pcDNA3-VP6）をBHK-T7/P5細胞に導入して、実施例１の「材料および方法」（９）と同様の手順で緑色蛍光タンパク質発現一回感染性ロタウイルスを作製した。対照として、pT7-NSP1-ZsG-Δ722に代えてZsG含まないpT7-NSP1SA11を使用し、緑色蛍光タンパク質発現しない一回感染性ロタウイルスを作製した。
（３）ZsG発現の確認
　作製した2種類のウイルスをVP6持続発現MA104細胞にMOI 1.0で感染させ、8時間培養した。緑色蛍光を発する細胞がウイルス感染細胞であることを確認するために、ウイルス由来のNSP4の発現を確認した。すなわち、8時間培養後に細胞をホルマリンで固定した。0.5％ Triton-Xで膜透過処理を行い、一次抗体としてウサギ由来抗NSP4抗体、二次抗体としてCF594標識抗ウサギIgG抗体（Biotum社）を用いて染色した。核はHoechstを用いて染色を行い、蛍光顕微鏡で観察した。
＜結果＞
　結果を図７に示す。ZsGを導入した一回感染性ロタウイルス（Δ169-174＋linker）が感染した細胞は緑色蛍光を発することが確認された。
６－２　ルシフェラーゼ発現一回感染性ロタウイルス
＜材料および方法＞
（１）ルシフェラーゼ遺伝子挿入NSP1発現プラスミド
　ルシフェラーゼ遺伝子として、トゲオキヒオドシエビ（Oplophorus gracilirostris）由来のルシフェラーゼ遺伝子であるNanoLuc（以下「NLuc」と記す）遺伝子を用いた。NLuc遺伝子挿入NSP1遺伝子発現プラスミドとして、Kanaiら（J Virol. 2019 Feb 15; 93(4): e01774-18.）に記載のpT7-NSP1-NLuc-Δ722を使用した。pT7-NSP1-NLuc-Δ722は、pT7-NSP1SA11のNSP1遺伝子の111位と112位の間にNLuc遺伝子が挿入され、さらにNSP1遺伝子から722 nt（134位～855位）が削除された構造を有するプラスミドである。
（２）ルシフェラーゼ発現一回感染性ロタウイルスの作製
　実施例１で作製した11種類の分節RNAゲノム発現ベクターにおいて、pT7-VP6SA11に代えてpT7-VP6SA11/Δ169-174＋linkerを、pT7-NSP1SA11に代えてpT7-NSP1-NLuc-Δ722を使用し、これら以外にキャッピング酵素発現ベクター（pCAGD1RおよびpCAG-D12L）、ロタウイルスNSP2、NSP5発現ベクター（pCAG-NSP2SA11およびpCAG-NSP5SA11）、ロタウイルスVP6発現ベクター（pcDNA3-VP6）をBHK-T7/P5細胞に導入して、実施例１の「材料および方法」（９）と同様の手順でNLuc発現一回感染性ロタウイルスを作製した。対照には、pT7-NSP1-NLuc-Δ722を使用せずに、NLuc含まないpT7-NSP1SA11を使用した。
（３）ルシフェラーゼ活性測定
　VP6持続発現MA104細胞を1×104細胞/ウェルで96穴培養プレートに播種し、一夜培養した。（２）で作製したNLuc発現一回感染性ロタウイルスをMOI 0.01で感染させ、経時的に培地および細胞を回収して凍結融解し、細胞溶解液を調製した。Nano-Glo Luciferase Assay System（商品名、Promega）を用いて細胞溶解液のルシフェラーゼ活性を測定した。
＜結果＞
　結果を図８に示す。NLuc発現一回感染性ロタウイルスは、感染後経時的にルシフェラーゼ活性が増加することが示された。
〔実施例７：ルシフェラーゼ発現一回感染性ロタウイルスを用いた中和試験〕
＜材料および方法＞
（１）ルシフェラーゼ発現一回感染性ロタウイルス
　実施例６－２で作製したNLuc発現一回感染性ロタウイルスを使用した。対照として、実施例６－２で作製したNLuc発現一回感染性ロタウイルスにおいて、pT7-VP6SA11/Δ169-174＋linkerに代えてVP6に変異を導入していないpT7-VP6SA11を用いて作製したNLuc発現自己増殖型ロタウイルスを使用した。両ウイルスのウイルス力価を測定し、それぞれ力価100FFUのウイルスを調製した。
（２）血清
　Kanaiら（J Virol. 2020 Dec 22;95(2):e01374-20.）に記載のanti-rSA11を使用した。anti-rSA11は、BALB/cマウス（雄、3週齢）に野生型SA11株を1.0×106 FFU/匹で経口投与し、2週間の間隔をあけて投与を7回繰り返した後に採血して得られた血清である。
（３）中和試験法
　VP6持続発現MA104細胞を1×104細胞/ウェルで96穴培養プレートに播種し、一夜培養した。（２）の血清を段階希釈し（１）で調製した100FFUのウイルスと混合して37℃で1時間保温した後、各ウイルス血清混合液を細胞に添加し、24時間培養した。培地および細胞を回収して凍結融解し、調製した細胞溶解液のルシフェラーゼ活性をNano-Glo Luciferase Assay Systemを用いて測定した。血清を加えないコントロールのルシフェラーゼ活性と比較したルシフェラーゼ活性の減少率を中和率として算出した。
＜結果＞
　結果を図９に示す。ルシフェラーゼ発現一回感染性ロタウイルスの中和試験の結果は、ルシフェラーゼ発現自己増殖型ロタウイルスの結果と同等であった。
　従来の中和試験は、一般にウイルス感染細胞数の測定は顕微鏡下で目視で行うため、操作が煩雑で手間と時間がかかり、測定者によるぶれが大きいという問題がある。また、感染性ウイルスを使用するため、P2レベルの施設が必要である。本実施例の結果から、レポーター遺伝子を発現する一回感染性ロタウイルスを中和試験に用いれば、簡便でブレが少ない中和試験を安全に実施することができる。
〔実施例８：ヒトロタウイルスの外殻タンパク質を有する一回感染性ロタウイルスの作製〕
　SA11株はサルロタウイルスであるが、一回感染性ロタウイルスを実際にワクチンや中和試験の抗原として応用する場合、ヒトロタウイルスの外殻タンパク質を持つことが望ましい。そこで、Kanaiら（J Virol. 2020 Dec 22;95(2):e01374-20.）により、日本で急性胃腸炎を起こした9例の小児の便から分離されたヒトロタウイルスのVP7をコードする分節RNAゲノムを有する一回感染性ロタウイルスの作製を試みた。VP7はウイルス粒子の最外層に位置する外殻タンパク質であり、ウイルスの抗原性、免疫原性を決定するタンパク質である（図１３（Ａ）参照）。
＜材料および方法＞
　実施例１で作製した11種類の分節RNAゲノム発現ベクターにおいて、pT7-VP6SA11に代えて変異導入VP6をコードするpT7-VP6Δ169-174＋linkerを、pT7-VP7SA11に代えてヒトロタウイルスのVP7をコードする分節RNAゲノム発現ベクターであるpT7-hVP7を使用し、これら以外にキャッピング酵素発現ベクター（pCAGD1RおよびpCAG-D12L）、ロタウイルスNSP2、NSP5発現ベクター（pCAG-NSP2SA11およびpCAG-NSP5SA11）、ロタウイルスVP6発現ベクター（pcDNA3-VP6）をBHK-T7/P5細胞に導入して、実施例１の「材料および方法」（９）と同様の手順でヒトロタウイルスのVP7を有する一回感染性ロタウイルスを作製した。ヒトロタウイルスとしてはVP7の遺伝子型（血清型）がG1、G2、G3、G8およびG9の5種類のヒトロタウイルスを用い、これら5種類のヒトロタウイルスからそれぞれ得られたVP7をコードする分節RNAゲノムを使用した（Kanaiら、J Virol. 2020 Dec 22;95(2):e01374-20.）。
　作製されたヒトロタウイルスのVP7をコードする分節RNAゲノムを有する5種類の一回感染性ロタウイルス（Δ169-174＋linker/G1、Δ169-174＋linker/G2、Δ169-174＋linker/G3、Δ169-174＋linker/G8、Δ169-174＋linker/G9）およびSA11株の一回感染性ロタウイルス（Δ169-174＋linker）について、実施例１の「材料および方法」（１０）と同じ方法で、ウイルス力価を算出した。
＜結果＞
　結果を図１０に示す。各遺伝子型のヒトロタウイルスのVP7を有するプラスミドを用いて、一回感染性ロタウイルスを作製することができることが示された。
〔実施例９：ヒトロタウイルスのVP7を発現する一回感染性ロタウイルスを用いた中和試験〕
　遺伝子型（血清型）が異なるヒトロタウイルスのVP7を発現する一回感染性ロタウイルスの抗原性が異なるかを解析するために、中和試験を行った。
＜材料および方法＞
（１）ヒトロタウイルスのVP7を有する一回感染性ロタウイルス
　ヒトロタウイルスのVP7を発現する一回感染性ロタウイルスとして、実施例８で作製したVP7の遺伝子型（血清型）が異なるΔ169-174＋linker/G1、Δ169-174＋linker/G3、Δ169-174＋linker/G8およびΔ169-174＋linker/G9を使用した。対照として、SA11株の一回感染性ロタウイルスであるΔ169-174＋linkerおよび野生型SA11株を使用した。各ウイルスのウイルス力価を測定し、それぞれ力価100FFUのウイルスを調製した。
（２）血清
　Kanaiら（J Virol. 2020 Dec 22;95(2):e01374-20.）に記載のanti-rSA11を使用した。anti-rSA11は、BALB/cマウス（雄、3週齢）に野生型SA11株を1.0×106 FFU/匹で経口投与し、2週間の間隔をあけて投与を7回繰り返した後に採血して得られた血清である。なお、野生型SA11株のVP7の遺伝子型（血清型）はG3である。
（３）中和試験法
　VP6持続発現MA104細胞を1×104細胞/ウェルで96穴培養プレートに播種し、一夜培養した。（２）の血清を段階希釈し（１）で調製した100FFUのウイルスと混合して37℃で1時間保温した後、各ウイルス血清混合液を細胞に添加して培養を開始した。18時間後に細胞をホルマリンで固定し、0.5％ Triton-Xで膜透過処理を行い、免疫蛍光抗体法にて感染細胞を可視化し感染細胞数をカウントした。免疫蛍光抗体法の一次抗体にはウサギ由来抗ロタウイルスNSP4抗体を、二次抗体にはCF488標識抗ウサギIgG抗体（Biotum社）を用いた。血清を加えないコントロールの感染細胞数と比較した感染細胞数の減少率を中和率として算出した。
＜結果＞
　結果を図１１に示す。野生型SA11株（遺伝子型G3）、SA11株のVP7を発現する一回感染性ロタウイルスΔ169-174＋linker（遺伝子型G3）および遺伝子型G3のヒトVP7を発現する一回感染性ロタウイルスΔ169-174＋linker/G3は、野生型SA11株（遺伝子型G3）で免疫した血清により効率よく中和された。一方、遺伝子型がG3以外のヒトVP7を発現する一回感染性ロタウイルスは、中和活性が低かった。この結果は、遺伝子型が異なるヒトロタウイルスのVP7を発現する一回感染性ロタウイルスは、抗原性が異なることを示すものである。したがって、抗原性が異なる一回感染性ロタウイルスを作製できることが確認された。
〔実施例１０：一回感染性ロタウイルスのワクチン効果〕
＜材料および方法＞
（１）マウスへのワクチン投与
　SA11株の一回感染性ロタウイルスであるΔ169-174＋linker投与群、野生型SA11株投与群（陽性対照）、PBS投与群（陰性対照）の3群を設けた。BALB/cマウス（雌、4週齢、n=5-6/群）に濃縮したウイルス（1.0×107 FFU/匹）またはPBSを経口投与した。3週間間隔で3回免疫し、各免疫の2週間後に採血して血清を中和試験に供した。
（２）中和試験法
　通常のMA104細胞を1×104細胞/ウェルで96穴培養プレートに播種し、一夜培養した。段階希釈したマウス血清と、100FFUのNLuc発現自己増殖型ロタウイルス（実施例７参照）を混合して37℃で1時間保温した後、ウイルス血清混合液を細胞に添加し、24時間培養した。培地および細胞を回収して凍結融解し、調製した細胞溶解液のルシフェラーゼ活性をNano-Glo Luciferase Assay Systemを用いて測定した。血清を加えないコントロールのルシフェラーゼ活性と比較したルシフェラーゼ活性の減少率を中和率として算出した。また、50％中和を示す血清希釈度（NT50）を算出した。NT50は数値が大きいほど中和活性が高いことを示す。統計解析にはMann-Whitney U検定を実施した。P値が0.05以下を有意差有りと判定した。
＜結果＞
　結果を図１２に示す。（A）は1回免疫後の血清のNT50、（B）は2回免疫後の血清のNT50、（C）は3回免疫後の血清のNT50を示す図である。いずれの時点においても、一回感染性ロタウイルス群と野生型SA11株群との間に有意差は無く、一回感染性ロタウイルスは、野生型ロタウイルスと同等のワクチン効果を発現することが明らかになった。
〔実施例１１：マウスに感染した一回感染性ロタウイルスの増殖〕
＜材料および方法＞
　SA11株の一回感染性ロタウイルスであるΔ169-174＋linker投与群（一回感染性ウイルス群）および野生型SA11株投与群（野生型ウイルス群）の2群を設けた。BALB/cマウス（雌、3週齢、n=18-19/群）に濃縮したウイルス（1×107 FFU/匹）を経口投与した。2日後に腸管を回収し、盲腸を切り取ってビーズ式ホモジナイザーで処理した。得られた盲腸サンプルからTrizol reagent（Invitrogen）を用いてRNAを抽出し、qRT-PCRにてウイルスのRNAコピー数を測定した。qRT-PCRには、Thunderbird probe One-step qRT-PCR kit（東洋紡）を使用した。ロタウイルスのVP1分節を検出する以下のプライマー・プローブセットを用いた。
Forward: AGGCAAACCATTGGAGGCAGAC（配列番号１４）
Reverse: CCAACCAGAACATGACTGCATT（配列番号１５）
Probe: FAM-TCCAACAGCGGAGGAATATACGGAC-TAMRA（配列番号１６）
　また、VP6発現MA104細胞の培地に盲腸サンプルを添加してウイルスを感染させ、ウイルス力価測定を行った。ウイルスのRNAコピー数についてはt検定を行い、ウイルス力価についてはMann-Whitney U検定を行った。P値が0.05以下を有意差有りと判定した。
＜結果＞
　結果を図１４に示す。（A）はウイルスのRNAコピー数、（B）は感染性ウイルス検出の結果である。野生型ウイルス群（WT）と一回感染性ウイルス群（Δ169-174＋linker）を比較すると、コピー数では統計的有意差はなかったが、野生型ウイルスの方が高コピー数である傾向が認められ、ウイルスが増殖していることが示唆された。感染性ウイルスの検出では、野生型ウイルスは一回感染性ウイルスより有意にウイルス力価が高かった。詳細には、感染性ウイルスが検出された個体数は、野生型ウイルス群が7/19匹、一回感染性ウイルス群は0/18匹であった。この結果から、一回感染性ウイルスはマウス内で増殖できないことが示唆された。
〔実施例１２：VP7変異導入による一回感染性ロタウイルスの作製〕
＜材料および方法＞
　実施例１の一回感染性ロタウイルスの作製方法において、変異導入遺伝子をVP6からVP7に変更し、VP6発現ベクターをVP7発現ベクターに変更して一回感染性ロタウイルスを作製した。実施例１で使用していない材料を以下に示す。
（１）ロタウイルスVP7発現ベクター
　VP7発現ベクターは、SA11株のVP7遺伝子（配列番号９）のタンパク質コード領域DNAをpcDNA3.1(+)プラスミドのBamHIおよびEcoRI切断部位に挿入し、pcDNA3-VP7を作製した。コード領域DNAは、人工遺伝子合成サービス（GenScript）にて合成した。
（２）VP7変異導入プラスミド
　pT7-VP7SA11に含まれるロタウイルスVP7のRNAゲノムのcDNAに欠失変異を導入した5種類のプラスミドを、公知の遺伝子組換え技術を用いて作製した。ロタウイルスVP7の構造と各種変異領域を図１５に示す。
（３）VP7持続発現細胞
　ロタウイルスVP7遺伝子をpLVSIN-CMV-Neoベクター（Takara Bio）に導入し、psPAX2（Addgene）、pCMV-VSV-G（Addgene）と一緒に293T細胞に共導入してレンチウイルスを作製した。作製したレンチウイルスをアフリカミドリザルMA104細胞（ATCC CRL-2378.1）に感染させ、2日後にG418（800μg/mL）で薬剤選択を行った。薬剤選択により得られたVP7発現MA104細胞の中から限界希釈法によりVP7を持続的に強く発現する細胞をクローニングした。
＜結果＞
　結果を表３に示す。VP7のドメインIIを欠失したVP7変異導入プラスミド（pT7-VP7SA11-Δdomain II）およびVP7遺伝子の両末端の250bpずつを残したVP7変異導入プラスミド（pT7-VP7SA11-250bp）を用いて人工組換えウイルスを作製することができた。ウイルス力価はVP7のドメインIIを欠失した人工組換えウイルス（VP7-ΔDomain II）のほうが高かった。以後の実験にはVP7-ΔDomain IIを使用した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
〔実施例１３：通常のMA104細胞とVP7持続発現MA104細胞における増殖力の比較〕
　実施例１２で作製したVP7変異ロタウイルスVP7-ΔDomain IIについて、通常のMA104細胞とVP7持続発現MA104細胞における増殖力を比較した。
＜材料および方法＞
　通常のMA104細胞とVP7持続発現MA104細胞を、それぞれ7.5×104細胞/ウェルで24穴培養プレートに播種し、一夜培養した。VP7-ΔDomain IIをMOI 0.01で感染させ、感染後0時間、24時間、48時間、72時間で培地および細胞を3回凍結融解して細胞溶解液を調製し、ウイルス力価を測定した。対照にはVP7変異を有しない野生型ウイルスを使用した。ウイルス力価の測定は、実施例１と同じ方法で行った。
＜結果＞
　結果を図１６に示す。（A）は通常のMA104細胞の結果、（B）はVP7持続発現MA104細胞の結果である。VP7-ΔDomain IIは通常のMA104細胞ではほとんど増殖しないが、MA104-VP7細胞では効率的に増殖した。
〔実施例１４：通常のMA104細胞における増殖力の検討〕
　VP7変異ロタウイルスVP7-ΔDomain IIが通常のMA104細胞で増殖できないことをさらに確認するために、通常のMA104細胞で継代培養を行った。
＜材料および方法＞
　通常のMA104細胞を1.5×105細胞/ウェルで12穴培養プレートに播種し、一夜培養した。VP7-ΔDomain IIをMOI 1.0で感染させ、1週間培養後に培地および細胞を回収して凍結融解し、細胞溶解液を調製した。得られた細胞溶解液の10％を新たな通常のMA104細胞に添加し、1週間培養した。ウイルスの継代を5回繰り返し、各継代時に実施例１と同じ方法でウイルス力価を測定した。
＜結果＞
　結果を図１７に示す。VP7-ΔDomain IIは継代により力価が低下し、2回目の継代以降はウイルスが検出されなかった。この結果から、VP7-ΔDomain IIは、VP7を発現しない通常の細胞では増殖できない一回感染性ロタウイルスであると判断した。
〔実施例１５：VP4変異導入による一回感染性ロタウイルスの作製〕
＜材料および方法＞
　実施例１の一回感染性ロタウイルスの作製方法において、変異導入遺伝子をVP6からVP4に変更し、VP6発現ベクターをVP4発現ベクターに変更して一回感染性ロタウイルスを作製した。実施例１で使用していない材料を以下に示す。
（１）ロタウイルスVP4発現ベクター
　VP4発現ベクターは、SA11株のVP4遺伝子（配列番号４）のタンパク質コード領域DNAをpcDNA3.1(+)プラスミドのBamHIおよびEcoRI切断部位に挿入し、pcDNA3-VP4を作製した。コード領域DNAは、人工遺伝子合成サービス（GenScript）にて合成した。
（２）VP4変異導入プラスミド
　pT7-VP4SA11に含まれるロタウイルスVP4のRNAゲノムのcDNAに欠失変異を導入した3種類のプラスミドを、公知の遺伝子組換え技術を用いて作製した。ロタウイルスVP4の構造と各種変異領域を図１８に示す。
（３）VP4持続発現細胞
　ロタウイルスVP4遺伝子をpLVSIN-CMV-Neoベクター（Takara Bio）に導入し、psPAX2（Addgene）、pCMV-VSV-G（Addgene）と一緒に293T細胞に共導入してレンチウイルスを作製した。作製したレンチウイルスをアフリカミドリザルMA104細胞（ATCC CRL-2378.1）に感染させ、２日後にG418（800μg/mL）で薬剤選択を行った。薬剤選択により得られたVP4発現MA104細胞の中から限界希釈法によりVP4を持続的に強く発現する細胞をクローニングした。
＜結果＞
　結果を表４に示す。VP4のレクチン（Lectin）ドメインを欠失したVP4変異導入プラスミド（pT7-VP4SA11-ΔLectin）、VP4のβ-バレル（β-Barrel）ドメインを欠失したVP4変異導入プラスミド（pT7-VP4SA11-Δβ-Barrel）およびVP4遺伝子の両末端の120bpずつを残したVP4変異導入プラスミド（pT7-VP4SA11-120bp）を用いて、いずれも人工組換えウイルスを作製することができた。欠失領域が大きいほど復帰変異が起こり難く、外来遺伝子の導入が容易になるため、以後の実験にはVP4-120bpを使用した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
〔実施例１６：通常のMA104細胞とVP4持続発現MA104細胞における増殖力の比較〕
　実施例１５で作製したVP4変異ロタウイルスVP4-120bpについて、通常のMA104細胞とVP4持続発現MA104細胞における増殖力を比較した。
＜材料および方法＞
　通常のMA104細胞とVP4持続発現MA104細胞を、それぞれ7.5×104細胞/ウェルで24穴培養プレートに播種し、一夜培養した。VP4-120bpをMOI 0.01で感染させ、感染後0時間、24時間、48時間、72時間で培地および細胞を3回凍結融解して細胞溶解液を調製し、ウイルス力価を測定した。対照にはVP4変異を有しない野生型ウイルスを使用した。ウイルス力価の測定は、実施例１と同じ方法で行った。
＜結果＞
　結果を図１９に示す。（A）は通常のMA104細胞の結果、（B）はVP4持続発現MA104細胞の結果である。VP4-120bpは通常のMA104細胞ではほとんど増殖しないが、MA104-VP4細胞では効率的に増殖した。
〔実施例１７：通常のMA104細胞における増殖力の検討〕
　VP4変異ロタウイルスVP4-120bpが通常のMA104細胞で増殖できないことをさらに確認するために、通常のMA104細胞で継代培養を行った。
＜材料および方法＞
　通常のMA104細胞を1.5×105細胞/ウェルで12穴培養プレートに播種し、一夜培養した。VP4-120bpをMOI 1.0で感染させ、1週間培養後に培地および細胞を回収して凍結融解し、細胞溶解液を調製した。得られた細胞溶解液の10％を新たな通常のMA104細胞に添加し、1週間培養した。ウイルスの継代を5回繰り返し、各継代時に実施例１と同じ方法でウイルス力価を測定した。
＜結果＞
　結果を図２０に示す。VP4-120bpは継代により力価が低下し、2回目の継代以降はウイルスが検出されなかった。この結果から、VP4-120bpは、VP4を発現しない通常の細胞では増殖できない一回感染性ロタウイルスであると判断した。
〔実施例１８：VP4分節に外来遺伝子を搭載した一回感染性ロタウイルスの作製〕
１８－１　緑色蛍光タンパク質発現一回感染性ロタウイルス
＜材料および方法＞
（１）緑色蛍光タンパク質発現一回感染性ロタウイルスの作製
　緑色蛍光タンパク質遺伝子としてZsG遺伝子を用いた。pT7-VP4SA11-120bpプラスミドの5'末端120bpの直後に口蹄疫ウイルス FMDV 2A配列（自己切断配列）とZsG遺伝子を挿入したZsG発現プラスミドを作製した。実施例１５と同じ方法でZsG発現一回感染性ロタウイルスを作製した。対照として、野生型VP4分節をコードするプラスミド（pT7-VP4SA11）を用いて野生型人工組換えロタウイルスと、ZsG遺伝子を挿入していないpT7-VP4SA11-120bpを用いて、VP4欠失人工組換えロタウイルス（一回感染性ロタウイルス）を作製した。
（２）ZsG発現の確認
　作製したウイルスを通常のMA104細胞にMOI 1.0で感染させ、8時間培養した。緑色蛍光を発する細胞がウイルス感染細胞であることを確認するために、ウイルス由来のNSP4の発現を確認した。すなわち、8時間培養後に細胞をホルマリンで固定した。0.5％ Triton-Xで膜透過処理を行い、一次抗体としてウサギ由来抗NSP4抗体、二次抗体としてCF594標識抗ウサギIgG抗体（Biotum社）を用いて染色した。核はHoechstを用いて染色を行い、蛍光顕微鏡で観察した。
＜結果＞
　結果を図２１に示す。ZsGを導入した一回感染性ロタウイルス（VP4-120-ZsG）が感染した細胞は緑色蛍光を発することが確認された。
１８－２　ルシフェラーゼ発現一回感染性ロタウイルス
＜材料および方法＞
（１）ルシフェラーゼ遺伝子挿入NSP1発現プラスミド
　ルシフェラーゼ遺伝子としてNLuc遺伝子を用いた。pT7-VP4SA11-120bpプラスミドの5'末端120bpの直後に口蹄疫ウイルス FMDV 2A配列（自己切断配列）とNLuc遺伝子を挿入したNLuc発現プラスミドを作製した。実施例１５と同じ方法でNLuc発現一回感染性ロタウイルスを作製した。コントロールとして、NLuc遺伝子を挿入していないpT7-VP4SA11-120bpを用いて、VP4欠失一回感染性ロタウイルスを作製した。
（２）ルシフェラーゼ活性測定
　通常のMA104細胞を1×104細胞/ウェルで96穴培養プレートに播種し、一夜培養した。作製したNLuc発現一回感染性ロタウイルスおよびVP4欠失一回感染性ロタウイルスを、それぞれMOI 0.1で感染させ、経時的に培地および細胞を回収して凍結融解し、細胞溶解液を調製した。なお、NLuc発現一回感染性ロタウイルスを感染させるMA104細胞として、トリプシンを添加した培地で培養したもの（VP4-120-NLuc+Trypsin）を加えた。Nano-Glo Luciferase Assay System（商品名、Promega）を用いて細胞溶解液のルシフェラーゼ活性を測定した。
＜結果＞
　結果を図２２に示す。NLuc発現一回感染性ロタウイルスは、感染後経時的にルシフェラーゼ活性が増加することが示された。また、トリプシン存在化と非存在下のルシフェラーゼ活性に差がなかった。トリプシンはロタウイルスに感染性を持たせるために必要な酵素であるため、増殖型のウイルスの場合、トリプシン存在化では二次感染、三次感染が起こり、感染後24時間以降ではトリプシン存在化ではトリプシン非存在化よりルシフェラーゼ活性が上昇するが、本実験では24時間以降も差がなかったことから、感染性ウイルスは産生されておらず、一回感染性ウイルスであると認められる。
〔実施例１９：ヒトロタウイルスの外殻タンパク質を有するVP4欠失一回感染性ロタウイルスの作製〕
　実施例８と同様に、Kanaiら（J Virol. 2020 Dec 22;95(2):e01374-20.）により、日本で急性胃腸炎を起こした9例の小児の便から分離されたヒトロタウイルスのVP7をコードする分節RNAゲノムを有する一回感染性ロタウイルスを作製した。
＜材料および方法＞
　実施例１で作製した11種類の分節RNAゲノム発現ベクターにおいて、pT4-VP6SA11に代えて変異導入VP4をコードするpT7-VP4SA11-120bpを、pT7-VP7SA11に代えてヒトロタウイルスのVP7をコードする分節RNAゲノム発現ベクターであるpT7-hVP7を使用し、これら以外にキャッピング酵素発現ベクター（pCAGD1RおよびpCAG-D12L）、ロタウイルスNSP2、NSP5発現ベクター（pCAG-NSP2SA11およびpCAG-NSP5SA11）、ロタウイルスVP4発現ベクター（pcDNA3-VP4）をBHK-T7/P5細胞に導入して、実施例１の「材料および方法」（９）と同様の手順でヒトロタウイルスのVP7を有するVP4欠失一回感染性ロタウイルスを作製した。ヒトロタウイルスとしてはVP7の遺伝子型（血清型）がG1、G2、G8およびG9の4種類のヒトロタウイルスを用い、これら4種類のヒトロタウイルスからそれぞれ得られたVP7をコードする分節RNAゲノムを使用した（Kanaiら、J Virol. 2020 Dec 22;95(2):e01374-20.）。作製されたヒトロタウイルスのVP7をコードする分節RNAゲノムを有する4種類のVP4欠失一回感染性ロタウイルス（VP4-120bp/G1、VP4-120bp/G2、VP4-120bp/G8、VP4-120bp/G9）について、実施例１と同じ方法でウイルス力価を算出した。
＜結果＞
　結果を表５に示す。各遺伝子型のヒトロタウイルスのVP7を有するプラスミドを用いて、ヒトロタウイルスの外殻タンパク質を有するVP4欠失一回感染性ロタウイルスを作製することができた。これらの遺伝子型が異なるヒトロタウイルスのVP7を発現する一回感染性ロタウイルスは、抗原性が異なる一回感染性ロタウイルスである（実施例９参照）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
〔実施例２０：VP4分節に新型コロナウイルスのスパイクタンパク質遺伝子を搭載した一回感染性ロタウイルスの作製〕
＜材料および方法＞
（１）新型コロナウイルスのスパイクタンパク質発現一回感染性ロタウイルスの作製
　外来遺伝子として、新型コロナウイルス（SARS-CoV-2）のスパイクタンパク質のレセプター結合領域（RBD）をコードする遺伝子を用いた。新型コロナウイルスRBD遺伝子はMinamiら（Microbiol Spectr. 2024 Apr 2;12(4):e0285923.）に記載のスパイクタンパク質発現プラスミドより増幅した。pT7-VP4SA11-120bpプラスミドの5'末端120bpの直後に口蹄疫ウイルス FMDV 2A配列（自己切断配列）と新型コロナウイルスRBD遺伝子を挿入したプラスミドを作製した。実施例１５と同じ方法で新型コロナウイルスRBD発現一回感染性ロタウイルスを作製した。コントロールとして、RBD遺伝子を挿入していないpT7-VP4SA11-120bpを用いて、VP4欠失一回感染性ロタウイルスを作製した。
（２）RBD発現の確認
　作製したウイルスを通常のMA104細胞にMOI 1.0で感染させ、16時間培養した。培養後、RIPAバッファーを用いて細胞溶解液を調製し、ウエスタンブロットにてタンパク質発現を確認した。10%ポリアクリルアミドゲルを用いたSDS-PAGEでタンパク質を分離後、PVDFメンブレンに転写した。3%スキムミルクでブロッキング後、一次抗体としてウサギ由来抗SARS-CoV-2 RBD抗体（Sino Biological社）、ウサギ由来抗ロタウイルスNSP3抗体、あるいはマウス由来抗β-アクチン抗体（Sigma Aldrich社）を反応させた。二次抗体としてHRP標識抗ウサギIgG抗体（ナカライテスク社）あるいはHRP標識抗マウス抗体（ナカライテスク社）を反応させた。発色にはChemi-Lumi-One Ultra（商品名、ナカライテスク）を用いた。化学発光撮影装置を用いて撮影した。
　＜結果＞
　結果を図２３に示す。新型コロナウイルス（SARS-CoV-2）のスパイクタンパク質のレセプター結合領域（RBD）を導入した一回感染性ロタウイルス（VP4-single-RBD）が感染した細胞はRBDを発現することが確認された。
　なお本発明は上述した各実施形態および実施例に限定されるものではなく、請求項に示した範囲で種々の変更が可能であり、異なる実施形態にそれぞれ開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施形態についても本発明の技術的範囲に含まれる。また、本明細書中に記載された学術文献および特許文献の全てが、本明細書中において参考として援用される。

Claims (19)

  1. 　ロタウイルスのＶＰ１、ＶＰ２、ＶＰ３、ＶＰ４、ＶＰ６、ＶＰ７、ＮＳＰ２、ＮＳＰ３およびＮＳＰ４からなる群から選択される少なくとも１つのウイルスタンパク質に変異を有することを特徴とする一回感染性ロタウイルス。
  2. 　構造タンパク質の機能不全を誘導する変異を有する、請求項１に記載の一回感染性ロタウイルス。
  3. 　ＶＰ６に変異を有する、請求項１に記載の一回感染性ロタウイルス。
  4. 　ＶＰ６のドメインＨに変異を有する、請求項３に記載の一回感染性ロタウイルス。
  5. 　ＶＰ６のドメインＨのＡ’－Ａ’’ループ、Ｄ’－Ｄ’’ループまたはαＡ－Ｉループに変異を有する、請求項４に記載の一回感染性ロタウイルス。
  6. 　ＶＰ４に変異を有する、請求項１に記載の一回感染性ロタウイルス。
  7. 　ＶＰ４のレクチンドメインおよび／またはβバレルドメインを欠失する変異を有する、請求項６に記載の一回感染性ロタウイルス。
  8. 　ＶＰ７に変異を有する、請求項１に記載の一回感染性ロタウイルス。
  9. 　ＶＰ７のドメインＩＩを欠失する変異を有する、請求項８に記載の一回感染性ロタウイルス。
  10. 　リアソータントである、請求項１に記載の一回感染性ロタウイルス。
  11. 　親株と異なる遺伝子型の構造タンパク質または親株と異なる株の構造タンパク質をコードする分節ＲＮＡゲノムを有するリアソータントである、請求項１に記載の一回感染性ロタウイルス。
  12. 　ヒトロタウイルスの構造タンパク質をコードする分節ＲＮＡゲノムを有するリアソータントである、請求項１に記載の一回感染性ロタウイルス。
  13. 　外来遺伝子を発現する、請求項１に記載の一回感染性ロタウイルス。
  14. 　外来遺伝子がロタウイルス以外のウイルスまたは病原微生物の抗原タンパク質をコードする遺伝子である、請求項１３に記載の一回感染性ロタウイルス。
  15. 　外来遺伝子がレポーター遺伝子である、請求項１３に記載の一回感染性ロタウイルス。
  16. 　レポーター遺伝子が蛍光タンパク質または化学発光タンパク質をコードする遺伝子である、請求項１５に記載の一回感染性ロタウイルス。
  17. 　請求項１～１４のいずれか一項に記載の一回感染性ロタウイルスを含有するワクチン。
  18. 　ロタウイルスワクチンである、請求項１７に記載のワクチン。
  19. 　請求項１～１６のいずれか一項に記載の一回感染性ロタウイルスを用いることを特徴とする、ロタウイルスの中和試験方法。
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