WO2024242007A1 - 酵素センサー - Google Patents

酵素センサー Download PDF

Info

Publication number
WO2024242007A1
WO2024242007A1 PCT/JP2024/018075 JP2024018075W WO2024242007A1 WO 2024242007 A1 WO2024242007 A1 WO 2024242007A1 JP 2024018075 W JP2024018075 W JP 2024018075W WO 2024242007 A1 WO2024242007 A1 WO 2024242007A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
electrode
substance
enzyme
working electrode
concentration
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Ceased
Application number
PCT/JP2024/018075
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
浅井光夫
一色信之
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Kao Corp
Original Assignee
Kao Corp
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Kao Corp filed Critical Kao Corp
Priority to CN202480033485.6A priority Critical patent/CN121152969A/zh
Priority to EP24811014.0A priority patent/EP4715378A1/en
Publication of WO2024242007A1 publication Critical patent/WO2024242007A1/ja
Anticipated expiration legal-status Critical
Ceased legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N27/00—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means
    • G01N27/26—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means by investigating electrochemical variables; by using electrolysis or electrophoresis
    • G01N27/28—Electrolytic cell components
    • G01N27/30—Electrodes, e.g. test electrodes; Half-cells
    • G01N27/327—Biochemical electrodes, e.g. electrical or mechanical details for in vitro measurements
    • G01N27/3271—Amperometric enzyme electrodes for analytes in body fluids, e.g. glucose in blood
    • G01N27/3272—Test elements therefor, i.e. disposable laminated substrates with electrodes, reagent and channels
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/001—Enzyme electrodes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/001—Enzyme electrodes
    • C12Q1/005—Enzyme electrodes involving specific analytes or enzymes
    • C12Q1/006—Enzyme electrodes involving specific analytes or enzymes for glucose

Definitions

  • the present disclosure relates to an enzyme-based sensor for a specific substance (substance to be measured) and a method for measuring the concentration of the specific substance using the same.
  • JP 64-88244 A Patent Document 1
  • the steady-state potential ⁇ V ⁇ generated when protons generated by an enzyme reaction are captured by a proton-sensitive membrane on a working electrode is estimated from the rate of change of the initial potential to measure the substrate concentration.
  • JP 2019-158650 A Patent Document 2 discloses providing an external resistor between the working electrode and the reference electrode in order to make the redox reaction of the redox substance reversible.
  • JP 2023-553889 A Patent Document 3 discloses a method for measuring the substrate concentration from the time change in the potential between the working electrode and the reference electrode.
  • the present disclosure provides, in one aspect, a method for producing a method for manufacturing a semiconductor device comprising: An enzyme sensor for measuring a concentration of a substance to be measured in a solution containing the substance, a working electrode and a reference electrode each of which is accessible to the solution; an enzyme and a redox substance that can be reversibly oxidized and reduced, each of which is immobilized on the working electrode; a dV/dt output mechanism capable of outputting a time differential value dV/dt of a potential difference between the reference electrode and the working electrode, which is generated by a change in concentration of an oxidant and a reductant in the redox substance caused by a reaction between the substance to be measured and the enzyme,
  • the potential difference in this enzyme sensor shifts to the noble side when the redox substance is oxidized by the reaction between the analyte and the enzyme, and shifts to the negative side when the redox substance is reduced.
  • the "concentration of the substance to be measured” includes not only the absolute value of the concentration of the substance to be measured but also the relative value, and is a concept that also includes, for example, the time derivative value dV/dt that is in a linear relationship with the absolute value of the substrate concentration and can be used to calculate the absolute value of the concentration of the substance to be measured.
  • the present disclosure provides a method for measuring a substance to be measured using the enzyme sensor of the present disclosure, bringing a solution containing the substance to be measured into contact with both the working electrode and the reference electrode; obtaining a time differential value dV/dt of a potential difference between the reference electrode and the working electrode over time in a state in which the working electrode and the reference electrode are electrically connected and no voltage is applied between the working electrode and the reference electrode; and calculating the concentration of the substance to be measured using the acquired time differential value dV/dt and the following linear function (i).
  • V is the potential difference between the reference electrode and the working electrode
  • t time
  • C M is the concentration of the analyte
  • A is a proportionality constant.
  • the present disclosure provides a method for measuring another target substance using the enzyme sensor of the present disclosure,
  • the electrode system of the enzyme sensor is a two-electrode system
  • the working electrode and the counter electrode reference electrode
  • the electrode system is a three-electrode system
  • the working electrode, the counter electrode, and the reference electrode are brought into contact with a solution containing the substance to be measured.
  • the electrode system of the enzyme sensor is the two-electrode system
  • the working electrode and the counter electrode are electrically connected
  • the electrode system is the three-electrode system
  • the working electrode, the counter electrode and the reference electrode are electrically connected
  • the potential of the working electrode reaches a predetermined potential set in advance, in either the two-electrode system or the three-electrode system, a predetermined voltage is applied between the counter electrode and the working electrode to allow a current to flow between the working electrode and the counter electrode, thereby returning the potential of the working electrode to a value before the start of measurement;
  • the present disclosure provides a measurement system for measuring a concentration of a target substance in a solution containing the target substance, the system comprising:
  • the measurement system includes an enzyme sensor, a signal processing mechanism, and a display unit.
  • the enzyme sensor comprises: a working electrode and a reference electrode each of which is accessible to the solution; an enzyme and a redox substance that can be reversibly oxidized and reduced, each of which is immobilized on the working electrode; a measuring unit capable of measuring a potential difference between the reference electrode and the working electrode over time, the potential difference being generated by a change in concentration of an oxidant and a reductant in the redox substance caused by a reaction between the substance to be measured and the enzyme;
  • the potential difference shifts to the noble side when the redox substance is oxidized by the reaction between the analyte and the enzyme, and shifts to the negative side when the redox substance is reduced.
  • the signal processing mechanism calculates the concentration of the substance to be measured from the potential difference using the following linear function (i):
  • the display unit relates to a measurement system capable of displaying the concentration of the substance to be measured calculated by the signal processing mechanism.
  • V is the potential difference between the reference electrode and the working electrode
  • t is time
  • C M is the concentration of the analyte
  • A is a proportionality constant.
  • FIG. 1 is a schematic diagram of an enzyme sensor according to one embodiment of the present disclosure.
  • FIG. 2 is a schematic diagram of an enzyme sensor according to another embodiment of the present disclosure.
  • FIG. 3 is a schematic diagram of an enzyme sensor according to another embodiment of the present disclosure.
  • FIG. 4 is a schematic diagram of an enzyme sensor according to another embodiment of the present disclosure.
  • FIG. 5 is a schematic diagram of an enzyme sensor according to another embodiment of the present disclosure.
  • FIG. 6 is a schematic diagram of an enzyme sensor according to another embodiment of the present disclosure.
  • FIG. 7 is a plan view of a working electrode formed on a substrate and used in Examples 1 to 7.
  • FIG. 8 is a schematic diagram illustrating a substrate concentration measurement system used in Examples 1 and 4 to 7.
  • FIG. 9 is a schematic diagram illustrating the substrate concentration measurement system used in Example 2.
  • FIG. 10 is a schematic diagram illustrating the substrate concentration measurement system used in Example 3.
  • FIG. 11 is a graph showing the time differential value of the working electrode potential that changes with time obtained in the experimental procedure of Example 1.
  • FIG. 12 is a graph showing the relationship between the time differential value of the working electrode potential obtained in FIG. 11 and the glucose concentration.
  • FIG. 13 is a graph showing the change in potential of the working electrode over time obtained in the experimental procedure of Example 2.
  • FIG. 14 is a graph showing the relationship between the time derivative of the working electrode potential obtained in the experimental procedure of Example 2 and time.
  • FIG. 15 is a graph showing the time differential value of the working electrode potential that changes with time obtained in the experimental procedure of Example 3.
  • FIG. 16 is a graph showing the relationship between the time differential value of the working electrode potential obtained in FIG. 15 and the glucose concentration.
  • the enzyme sensor disclosed in Patent Document 1 includes a working electrode on which an enzyme is immobilized on a pH-sensitive membrane, and utilizes the fact that the potential settles to a stationary potential (constant potential) over time.
  • the enzyme sensor disclosed in Patent Document 1 avoids the problem of it taking time to settle to a stationary potential, which results in a long measurement time, and specifically, calculates ⁇ V ⁇ as an estimated value from a specific linear function to shorten the measurement time.
  • this method has a problem in that it is not possible to measure the change in concentration of the measured substance in the measurement solution over time.
  • ISFET ion-sensitive field effect transistor
  • an enzyme sensor capable of measuring the change in concentration of a substance to be measured over time is produced by immobilizing a reversibly oxidizable and reducible redox substance and an enzyme on a working electrode, mediating the enzyme reaction with the redox substance, and measuring a signal obtained by amplifying the redox potential of the redox substance with an amplifier such as a field effect transistor.
  • the reaction of the redox substance caused by the enzyme reaction is only in one direction, either oxidation or reduction, and as long as the enzyme reaction continues, the potential of the working electrode continues to rise or fall and does not settle at a constant potential, which is an irreversible problem.
  • the working electrode and the reference electrode are connected by an external resistor to promote a spontaneous regeneration reaction (oxidation or reduction reaction) of the redox substance, which is an electron transfer mediator, thereby solving the above-mentioned irreversibility problem.
  • the measurement accuracy is reduced because the reference electrode potential is changed by passing a current through the reference electrode, and there is also a problem that the reference electrode may be damaged by passing a current through the reference electrode.
  • Patent Document 3 a potential is applied between the working electrode and the reference electrode, which serves as a standard electrode, for a short period of time before measuring the potential between the working electrode and the reference electrode, which complicates the relationship between the change in potential over time and the substrate concentration to be measured, making it difficult to incorporate a mechanism for determining the substrate concentration into the sensor.
  • An object of the present disclosure in one aspect, is to provide an enzyme sensor capable of selectively measuring the concentration of a substance to be measured in a solution containing the substance, including changes over time, with high accuracy.
  • the enzyme sensor of the present disclosure is an enzyme sensor for measuring the concentration of a substance to be measured (hereinafter also referred to as a "substrate") in a solution containing the substance.
  • the enzyme sensor of the present disclosure includes a working electrode and a reference electrode, each of which can be in contact with the solution, an enzyme and a redox substance, each of which is immobilized on the working electrode, and a dV/dt output mechanism electrically connected to the working electrode and the reference electrode.
  • the dV/dt output mechanism is capable of outputting a time differential value dV/dt of the potential difference between the reference electrode and the working electrode, which is generated by a change in concentration of the oxidant and the reductant in the redox substance caused by the reaction between the measured substance and the enzyme, over time.
  • a time differential value dV/dt of the potential difference between the reference electrode and the working electrode which is generated by a change in concentration of the oxidant and the reductant in the redox substance caused by the reaction between the measured substance and the enzyme, over time.
  • the charge generated by the reaction between the substrate and the enzyme can be transferred quickly and efficiently to the electrode via the oxidation-reduction substance, so that even when the substrate concentration is low and the product of the enzyme reaction is small, a sufficient signal (voltage) strength can be obtained in a short time in the enzyme sensor, and it is considered that the time-dependent change in the concentration of the substrate can be measured with high accuracy by calculating the differential value dV/dt of this signal with respect to time.
  • the present disclosure provides an enzyme sensor that can selectively measure the concentration of the substance to be measured with high accuracy, including changes over time.
  • the measurement target is glucose in Fig. 1 to Fig. 6, but the sensing target of the enzyme sensor of the present disclosure is not limited thereto.
  • the enzyme sensor 1 of the present disclosure shown in FIG. 1 is a device for measuring the glucose concentration contained in a solution 6.
  • the enzyme sensor 1 of the present disclosure includes a working electrode 2 to which an enzyme and a redox substance are immobilized, a sensing portion 8 including a counter electrode (reference electrode) 3, and a dV/dt output mechanism 9 electrically connected to the working electrode 2 and the counter electrode 3.
  • the working electrode 2 and the counter electrode 3 can each be in contact with a solution 6 containing a substance to be measured, but the counter electrode 3 and the working electrode 2 are arranged so as not to be in electrical contact with each other.
  • the enzyme is not dissolved in the solution 6, and the redox substance is insoluble in the solution 6.
  • the enzyme is "not dissolved” in the solution 6 means that the enzyme is bound to the working electrode by adsorption or chemical bonding, so that even if the working electrode is brought into contact with the solution 6, the enzyme does not substantially migrate into the solution.
  • the redox substance is "insoluble” in the solution 6 means that the solubility of the redox substance in the solution is low, and when the working electrode is brought into contact with the solution, the amount of reduction due to dissolution of the redox substance immobilized on the working electrode into the solution is substantially zero.
  • the fact that the amount of reduction in the immobilized redox substance due to dissolution in the solution is substantially zero means that the solubility of the redox substance in the solution is 100 mg/L or less.
  • the measurement of glucose concentration by the enzyme sensor 1 of the present disclosure is performed in a state where the working electrode 2 and the counter electrode 3 are in contact with the solution 6, the working electrode 2 and the counter electrode (reference electrode) 3 are electrically connected, and no voltage is applied to the working electrode 2 and the counter electrode 3, so that substantially no current flows.
  • a state where substantially no current flows means a state where no current flows other than unintended leakage of current such as a leak current.
  • the dV/dt output mechanism 9 outputs the rate of change with time of the potential difference generated between the counter electrode 3 and the working electrode 2 (hereinafter, the "rate of change with time of the potential difference” may also be referred to as the “time differential value dV/dt of the potential difference between the reference electrode and the working electrode” or simply as the “time differential value dV/dt”).
  • the “potential difference between the reference electrode and the working electrode” is also called “OCV” (Open Circuit Voltage) or "natural potential”, and may also be called “potential of the working electrode” in this application.
  • the "fixation" of the redox substance and the enzyme to the working electrode 2 means that the redox substance and the enzyme are in a state where they do not move relative to the working electrode 2.
  • the redox substance is preferably directly fixed to the working electrode 2.
  • the enzyme may be directly fixed to the working electrode 2 or indirectly fixed via the redox substance.
  • the redox substance constitutes the redox layer 5 arranged in contact with the working electrode 2
  • the enzyme constitutes the enzyme immobilized layer 4 arranged in contact with the redox layer.
  • a mixture layer of the enzyme and the redox substance may be formed on the working electrode 2.
  • the operation at the sensing site 8 will be described, taking as an example a case where the substance to be measured (substrate) is glucose.
  • the enzyme glucose oxidase
  • the working electrode 2 reacts with glucose in the presence of water and oxygen, glucose becomes gluconic acid and hydrogen peroxide is generated.
  • the hydrogen peroxide oxidizes the reductant of the redox substance serving as the electron transfer mediator to an oxidant. This causes a change in the ratio of oxidant to reductant in the electron transfer mediator, and the potential difference between the counter electrode 3 and the working electrode 2 changes in response to this change.
  • the enzyme sensor 1 of the present disclosure since the redox substance and the enzyme are immobilized on the working electrode 2, the charge generated by the reaction between the substrate and the enzyme can be transferred quickly and efficiently to the working electrode 2 via the redox substance. Therefore, even when the substrate concentration is low and the product of the enzyme reaction is small, the enzyme sensor 1 can obtain a sufficient signal (potential of the working electrode) strength in a short time, and by calculating the time differential value dV/dt of this signal, the change in the substrate concentration over time can be measured with high accuracy. For example, the signal can be measured even when the substrate concentration is several tens of ⁇ M (mol/L) or less. In addition, since the enzyme sensor 1 of the present disclosure utilizes an enzyme reaction, the substrate concentration can be measured selectively.
  • the time derivative dV/dt of the potential difference between the reference electrode and the working electrode and the substrate concentration are in a linear relationship (first-order correlation), so the absolute value of the substrate concentration can be easily calculated from the measurement data of dV/dt.
  • the enzyme sensor 1 of the present disclosure is equipped with a dV/dt output mechanism 9 that can output the dV/dt over time, so that the absolute value of the substrate concentration can be monitored over time.
  • the enzyme does not dissolve in the solution 6, and the redox substance is insoluble in the solution 6, and each is fixed to the working electrode 2. Therefore, by applying a predetermined voltage between the working electrode 2 and the counter electrode 3 and passing a current between the working electrode 2 and the counter electrode 3, the ratio of oxidized and reduced substances can be appropriately controlled to a desired ratio. For example, when the oxidized form of the redox substance increases due to an enzyme reaction, the ratio of oxidized and reduced substances at the start of measurement can be restored by passing a current in the direction in which the oxidized form is reduced, thereby reducing the oxidized form. That is, in one embodiment, the enzyme sensor 1 of the present disclosure can be used repeatedly. Therefore, as shown in FIG. 2, in one embodiment, the enzyme sensor 1 of the present disclosure preferably further includes a circuit 10a that allows a current to flow between the working electrode 2 and the counter electrode 3 by applying a predetermined voltage between the counter electrode 3 and the working electrode 2 as necessary.
  • the dV/dt output mechanism 9 capable of outputting the time differential value dV/dt may be, for example, one that can directly output dV/dt as a signal using an electric circuit such as a differential circuit (see Figures 8 to 10), or it may be one that is composed of a measuring device that measures the change in potential difference that occurs between the reference electrode 3 and the working electrode 2 due to the change in concentration of the oxidant and reductant in the redox substance resulting from the reaction between the substrate and the enzyme, an A/D converter that A/D converts the potential difference, and a central processing unit (CPU) that includes a calculation unit that calculates dV/dt from the obtained digital signal.
  • the dV/dt output mechanism 9 may be any type that can output the time differential value dV/dt.
  • the enzyme reaction oxidizes the substrate to generate an oxidizing agent such as hydrogen peroxide, which then oxidizes the redox substance in the electrode.
  • the rate at which the redox substance is oxidized is expressed by the following formula based on chemical reaction kinetics:
  • C o is the concentration of the oxidized form of the redox substance
  • C R is the concentration of the reduced form of the redox substance
  • k is the reaction rate constant
  • C is the concentration of the oxidant
  • t time.
  • the meanings of these symbols are the same for the following formulas (2) to (9) and the following linear functions (i) to (ii).
  • the concentrations of the oxidized and reduced forms of the redox substance can be obtained as shown in equation (2).
  • C 0 O is the initial concentration of the oxidized form of the redox substance
  • C 0 R is the initial concentration of the reduced form of the redox substance.
  • the meanings of these symbols are the same in the following formulas (3) to (9).
  • the potential difference between the working electrode 2 and the reference electrode 3 is expressed by the Nernst equation, which gives the potential of an electrode on which an oxidation-reduction substance is immobilized, as shown in equation (3).
  • R is the gas constant
  • T is temperature (K)
  • F is the Faraday constant
  • n is the number of electrons transferred in the redox reaction of one molecule of oxidant
  • V0 is the standard redox potential of the redox substance.
  • V is the potential of the working electrode 2 that changes with the change in the concentrations of the oxidant and reductant of the redox substance.
  • the meanings of these symbols are the same for the following formulas (4) to (9) and the following linear functions (i) to (ii).
  • equation (6) the time differential value dV/dt of the potential difference between the working electrode 2 and the reference electrode 3 is linearly related to the oxidant concentration. Furthermore, since the oxidant is generated by the enzyme reaction, the oxidant concentration can be considered to be a constant value corresponding to the substrate concentration if the oxidant is in a steady state where it diffuses into the solution and does not remain on the electrode surface.
  • the reaction rate of the enzyme is accurately described by the Michaelis-Menten equation, but the reaction rate of the enzyme can be considered to be proportional to the concentration of the analyte (substrate) as long as the concentration of the analyte (substrate) is not high. Therefore, the concentration of the oxidant generated by the enzyme reaction can be considered to be proportional to the substrate concentration, so that the time differential value dV/dt of the potential difference between the working electrode 2 and the reference electrode 3 can be considered to be proportional to the substrate concentration, as shown in equation (7).
  • C M is the concentration of the analyte (substrate).
  • a is a proportional constant between the oxidant concentration and the substrate concentration.
  • the meaning of this symbol is the same for the following formulas (8) and (9) and the following linear functions (i) and (ii).
  • the enzyme reaction rate is slower than the diffusion rate of the substrate in the solution.
  • the diffusion rate of the substrate is proportional to the substrate concentration, so the oxidant concentration is also proportional to the substrate concentration, and the rate of change over time of the potential difference generated between the counter electrode (reference electrode) 3 and the working electrode 2 is still proportional to the substrate concentration.
  • the proportionality constant A in equation (8) is as shown in equation (9) below.
  • the value of A may be determined experimentally.
  • the time derivative (dV/dt) of the potential difference between the working electrode 2 and the reference electrode 3 is proportional to the substrate concentration.
  • the redox substance is not oxidized or reduced directly by the enzyme, but is oxidized or reduced by the product generated by the enzyme reaction.
  • the enzyme sensor 1 of the present disclosure includes a circuit 10a as a mechanism for applying a predetermined voltage between the working electrode 2 and the counter electrode (reference electrode) 3 as necessary to pass a current between the working electrode 2 and the counter electrode 3.
  • This embodiment can be achieved, for example, by adding a circuit 10a as a switch, which is adjusted so that when a redox substance is oxidized due to a reaction between a substrate and an enzyme (enzyme reaction), the working electrode 2 and the counter electrode 3 are in a conductive state when the potential of the working electrode 2 exceeds a value slightly smaller than the potential at which the following linear function (ii) holds, and is in a non-conductive state when the potential of the working electrode 2 becomes equal to that of the counter electrode 3.
  • a redox substance is reduced due to a reaction between a substrate and an enzyme (enzyme reaction)
  • the same can be achieved by using a value for the potential of the working electrode 2 slightly larger than the potential at which the following linear function (ii) holds.
  • the “slightly smaller value” is, for example, preferably 5 to 10% smaller than the potential at which the linear function (ii) above holds, and the “slightly larger value” is, for example, more preferably 5 to 10% larger than the potential at which the linear function (ii) above holds.
  • the time for which the current is passed is preferably 1 second or more, more preferably 10 seconds or more, and even more preferably 20 seconds or more, from the viewpoint of sufficiently reducing or oxidizing the redox substance, and is preferably 300 seconds or less, more preferably 200 seconds or less, and even more preferably 100 seconds or less, in order to reduce the influence of interruption of the measurement time due to the current passing.
  • the electrode system of the sensing site 8 may be a two-electrode system consisting of a working electrode 2 and a counter electrode (reference electrode) 3 as shown in Figures 1 and 2, but may also be a three-electrode system as shown in Figure 3.
  • the electrode system of the enzyme sensor 1 of the present disclosure may be a three-electrode system further including a reference electrode 11 that can come into contact with a solution containing the substance to be measured, independent of the working electrode 2 and counter electrode 3.
  • the reference electrode 11 functions as the reference electrode.
  • the enzyme sensor 1 of the present disclosure may have the above-mentioned three-electrode system as the electrode system, and may further include, for example, a circuit 10b as a means for applying a predetermined voltage between the working electrode 2 and the counter electrode 3 to pass a current as necessary.
  • the redox substance fixed to the working electrode 2 can be oxidized or reduced by applying a voltage between the working electrode 2 and the counter electrode 3 as necessary to pass a current through the circuit 10b.
  • the potential of the working electrode 2 can be shifted to the negative side before the start of measurement to reduce the ratio of the oxidant at the start of measurement, thereby making it possible to measure the change in the concentration of the substrate over a longer period of time.
  • the electrode system is the three-electrode system
  • This embodiment can be implemented, for example, by adding a circuit 10b as a switch, which is adjusted so that when the redox substance is oxidized due to the reaction between the substrate and the enzyme (enzyme reaction), the circuit becomes conductive when the potential of the working electrode 2 exceeds a value slightly smaller than the potential at which the above linear function (ii) is established, and becomes non-conductive when the potential of the working electrode 2 becomes equal to the potential of the working electrode 2 at the start of measurement.
  • the same implementation can be implemented by using a value slightly larger than the potential at which the above linear function (ii) is established.
  • the “slightly smaller value” is, for example, preferably 5 to 10% smaller than the potential at which the linear function (ii) above holds, and the “slightly larger value” is, for example, preferably 5 to 10% larger than the potential at which the linear function (ii) above holds.
  • the enzyme sensor 1 of the present disclosure may include a calculator 13 including a dV/dt output mechanism 9, a signal processing mechanism 16, and a display unit 12.
  • the signal processing mechanism 16 is preferably a mechanism that calculates the absolute value of the concentration of the substrate corresponding to the time differential value dV/dt over time using the following linear function (i), but may also be a mechanism that displays the relative value of the concentration of the substrate.
  • the display unit 12 may be an analog display unit or a digital display unit.
  • the signal processing mechanism 16 includes a storage unit 15 and a central processing unit 14.
  • the storage unit 15 includes a main storage unit (memory) 15a and an auxiliary storage unit (storage) 15b.
  • the main storage unit 15a stores the following linear function (i) for calculating the absolute value of the concentration of the substrate from the time differential value dV/dt.
  • a program for calculating the absolute value stored in the main storage unit 15a is executed by the central processing unit 14 such as a CPU including a calculation unit and a control unit, and the absolute value of the concentration of the substrate corresponding to the time differential value dV/dt is calculated over time from the following linear function (i).
  • the calculated absolute value of the concentration of the substrate is recorded in the auxiliary storage unit 15b.
  • the calculated absolute value of the concentration of the substrate may be digitally processed so that it can be displayed on the display unit 12 under the control of the control unit.
  • the signal processing mechanism 16 may be configured to convert the voltage output by the dV/dt output mechanism 9, for example by resistive division, and display the converted voltage on a voltmeter (not shown) as an absolute or relative value of the concentration of the substrate calculated from the following linear function (i):
  • the signal processing mechanism 16 may be configured in an analog manner in which the voltmeter (not shown) is an analog voltmeter whose scale indicates the concentration of the substrate calculated from the linear function (i).
  • the dV/dt output mechanism 9 may include a measuring unit in the enzyme sensor 1 of the present disclosure shown in FIGS.
  • the enzyme sensor 1 shown in Figures 1 to 5 includes a dV/dt output mechanism 9, but as shown in Figure 6, the enzyme sensor 100 of the present disclosure may be configured to include, instead of the dV/dt output mechanism 9, a measurement unit 101 that can measure the potential difference (OCV) between the reference electrode and the working electrode 2 over time, and a communications interface for transmitting digital information of the obtained potential difference to an external information processing terminal 102.
  • a measurement unit 101 that can measure the potential difference (OCV) between the reference electrode and the working electrode 2 over time
  • a communications interface for transmitting digital information of the obtained potential difference to an external information processing terminal 102.
  • the measuring unit 101 is capable of measuring the potential difference (OCV) between the reference electrode 3 and the working electrode 2 over time, which is generated by the change in concentration of the oxidant and reductant in the redox substance resulting from the reaction between the substrate and the enzyme, when the working electrode 2 and the reference electrode 3 are electrically connected and no voltage is applied to the working electrode 2 and the counter electrode (reference electrode) 3, and no current is actually flowing.
  • the potential difference (OCV) measured by the measuring unit 101 shifts to the noble side when the redox substance is oxidized by the reaction between the substrate and the enzyme, and shifts to the negative side when the redox substance is reduced.
  • a potentiostat can be used as the measuring unit 101.
  • the communication interface may be either wireless or wired.
  • the communication interface refers to a means for transferring data from the enzyme sensor of the present disclosure to another device or system, and examples of wireless communication interfaces include Wi-Fi and Bluetooth (registered trademark) technology.
  • the information processing terminal 102 is, for example, a digital electronic calculator capable of calculating the time differential value dV/dt of the potential difference, and includes, for example, a signal processing mechanism including a CPU (central processing unit) including a calculation unit and a control unit, a memory unit including memory and storage, an input unit, and a display unit.
  • a signal processing mechanism including a CPU (central processing unit) including a calculation unit and a control unit, a memory unit including memory and storage, an input unit, and a display unit.
  • the memory stores the linear function (i) for converting the time derivative dV/dt into the absolute value of the concentration of the substrate, and the CPU executes a program for calculating the absolute value of the substrate concentration stored in the memory, outputting the change over time in the absolute value of the substrate concentration corresponding to the time derivative dV/dt.
  • the present disclosure provides in one aspect a method for producing a method for treating a cancer cell comprising: An enzyme sensor for measuring a concentration of a substance to be measured in a solution containing the substance, a working electrode and a reference electrode each of which is accessible to the solution; an enzyme and a redox substance that can be reversibly oxidized and reduced, each of which is immobilized on the working electrode; a measuring unit capable of measuring a potential difference between the reference electrode and the working electrode over time, the potential difference being generated by a change in concentration of an oxidant and a reductant in the redox substance caused by a reaction between the substance to be measured and the enzyme; a communication interface for transmitting the time differential value dV/dt of the potential difference to an external information processing terminal capable of calculating the time differential value dV/dt;
  • the potential difference in this enzyme sensor shifts to the noble side when the redox substance is oxidized by the reaction between the analyte and the enzyme, and shifts to the negative side when the
  • the present disclosure also provides, in one aspect, A measurement system for measuring a concentration of a substance to be measured in a solution containing the substance
  • the measurement system includes an enzyme sensor, a signal processing mechanism, and a display unit.
  • the enzyme sensor comprises: a working electrode and a reference electrode each of which is accessible to the solution; an enzyme and a redox substance that can be reversibly oxidized and reduced, each of which is immobilized on the working electrode; a measuring unit capable of measuring a potential difference between the reference electrode and the working electrode over time, the potential difference being generated by a change in concentration of an oxidant and a reductant in the redox substance caused by a reaction between the substance to be measured and the enzyme; The potential difference shifts to the noble side when the redox substance is oxidized by the reaction between the analyte and the enzyme, and shifts to the negative side when the redox substance is reduced.
  • the signal processing mechanism calculates the concentration of the substance to be measured from the potential difference using the following linear function (i):
  • the display unit relates to a measurement system capable of displaying the concentration of the substance to be measured calculated by the signal processing mechanism.
  • V is the potential difference between the reference electrode and the working electrode
  • t is time
  • C M is the concentration of the analyte
  • A is a proportionality constant.
  • the dV/dt output mechanism 9 and the measuring unit 101 have a finite input impedance as long as they measure a potential difference, so a small current (leak current) flows through the working electrode 2 connected to them due to the load effect of the dV/dt output mechanism 9 or the measuring unit 101.
  • a redox substance is oxidized by the reaction between the substrate and the enzyme (enzyme reaction)
  • the oxidant is reduced by this small current
  • a redox substance is reduced by the reaction between the substrate and the enzyme (enzyme reaction)
  • the reductant is oxidized.
  • the input impedance of the dV/dt output mechanism 9 or the measurement unit 101 is necessary to make the input impedance of the dV/dt output mechanism 9 or the measurement unit 101 sufficiently high in accordance with conventional methods and to make the microcurrent flowing through the working electrode 2 sufficiently small.
  • the input impedance of the dV/dt output mechanism 9 or the measurement unit 101 can be easily set to a value large enough to ignore the load effect.
  • the input impedance is preferably set, for example, so that the amount of redox substance reduced or oxidized by the current due to the load effect is 50% or less, preferably 10% or less, of the amount of redox substance oxidized or reduced by the enzyme reaction.
  • the redox substance constituting the enzyme sensor 1 of the present disclosure is not particularly limited as long as it is a redox substance capable of transferring electrons to an electrode, and any conventionally known substance can be used.
  • the redox substance include Prussian blue, Meldola blue, tetrathiafulvalene, quinones such as hydroquinone and 1,4-naphthoquinone, ferrocene, ferrocene derivatives, potassium ferrocyanide, ferricyanide, osmium complexes, p-aminophenol, and the like.
  • the redox layer 5 can be formed by dropping or coating a solution containing a redox substance onto the working electrode 2 and then drying it.
  • the solution is, for example, a dispersion liquid in which the redox substance is dispersed in a dispersion medium. Unfixed redox substances are preferably removed by washing, and pure water or a buffer solution can be used as the washing liquid.
  • the total amount of redox substances fixed on the working electrode 2 is appropriately determined, for example, so that the above linear function (ii) holds during the desired measurement time, depending on the application (type of substrate) of the enzyme sensor 1 of the present disclosure.
  • mixing a conductive material into the solution is preferable because it increases the conductivity of the redox layer 5.
  • the type of reducing agent is not particularly limited as long as it can reduce the redox substance, and any known reducing agent can be used.
  • reducing agents include thiol compounds such as mercaptopropanediol, mercaptoethanol, mercaptomethanol, and thiophenol, thiourea, ascorbic acid, oxalic acid, formic acid, gallic acid, uric acid, lithium aluminum hydride, sodium borohydride, and hydrazine.
  • oxidizing agent there are no particular limitations on the type of oxidizing agent, so long as it can oxidize the redox substance, and any conventionally known oxidizing agent can be used.
  • oxidizing agents include peroxides such as hydrogen peroxide, potassium nitrate, and chromic acid.
  • the enzyme constituting the sensing portion 8 is not particularly limited as long as it is an enzyme that can donate and receive electrons through a reaction, and is appropriately applied depending on the sensing target (substrate), but an enzyme that selectively reacts with the substrate is preferable.
  • the sensing target is glucose contained in blood, urine, etc.
  • examples of the enzyme include glucose oxidase (GOD) and glucose dehydrogenase (GDH).
  • an enzyme-modified electrode in which an enzyme and a redox substance are immobilized on the working electrode 2.
  • the total amount of the redox substance and the total amount of the enzyme immobilized on the working electrode 2 are appropriately determined depending on the application (type of substrate) of the enzyme sensor of the present disclosure, for example, so that the above linear function (ii) holds true during the desired measurement time.
  • the working electrode 2, the counter electrode 3, and the reference electrode 11, which is included as necessary, constituting the enzyme sensor 1 of the present disclosure each consist of, for example, a conductive layer formed on a substrate 7.
  • the material of these conductive layers is selected taking into consideration the reaction products with the enzyme. Typically, metals such as gold, palladium, platinum, rhodium, indium, or iridium, carbon materials, etc. are mentioned. Gold or platinum is preferable, but a conductive material that does not react with the solution containing the measured substance may be used.
  • the counter electrode 3 is platinum
  • the working electrode 2 is gold
  • the reference electrode 11 is a gold-Ag/AgCl electrode.
  • the conductive layer is formed, for example, by evaporating these metals at any position on the substrate 7.
  • a separately prepared metal thin film may be attached to the substrate 7 to form various electrodes.
  • the conductive layer (electrode) may be formed by a conventionally known method such as vacuum deposition, electron beam, sputtering, plating, CVD, ion plating coating, inkjet, or printing, depending on the material.
  • the counter electrode 3 may be formed using a metal wire or a metal plate without using the substrate and conductive layer.
  • the reference electrode may also be formed by sealing a reference electrode material such as Ag/AgCl in a glass tube without using the substrate and conductive layer.
  • an electrode that serves as a reference potential such as Ag/AgCl may be used as the counter electrode 3 in order to clarify the reference for the potential of the working electrode 2.
  • the material of the substrate may be, for example, a sheet made of polyimide (PI) resin, polyester resin, polyamide resin, epoxy resin, polysulfone resin, or the like, or a film-like flexible material made of these.
  • PI polyimide
  • the measurement method of the present disclosure is a method for measuring the concentration of a substance to be measured (e.g., a biological substance) over time, and in one embodiment, includes at least the following steps (A) and (B).
  • the measurement method of the present disclosure may further include step (C) in addition to steps (A) and (B).
  • the time differential value dV/dt is acquired over time, so that the following steps (A) to (C) proceed almost simultaneously.
  • a solution 6 containing the substance to be measured is brought into contact with both the working electrode and the reference electrode.
  • step (B) The time derivative values dV/dt obtained in step (B) are converted to absolute values of the substrate concentration in step (C). Therefore, according to the measurement method disclosed herein, which includes steps (A) to (C), it is possible to measure the change over time in the absolute value of the substrate concentration.
  • step (C) If you want to measure only the relative change in substrate concentration, you can skip step (C) and just use the time derivative value dV/dt obtained in step (B) as is.
  • the above (C) may be performed by the enzyme sensor of the present disclosure or by an external information processing terminal.
  • the above (B) includes obtaining the time differential value dV/dt and then transmitting the time differential value dV/dt to the external information processing terminal.
  • step (D) When the potential of the working electrode reaches a predetermined potential, a predetermined voltage is applied between the working electrode and the counter electrode to pass a current between the working electrode and the counter electrode, thereby returning the potential of the working electrode to the value before the start of measurement.
  • the above (D) can be performed whether the electrode system of the enzyme sensor is a two-electrode system consisting of a working electrode and a counter electrode, or a three-electrode system consisting of a working electrode, a counter electrode, and a reference electrode.
  • the above (D) can be performed by the enzyme sensor including, as a switch, circuits 10a and 10b adjusted so that the working electrode and the counter electrode are in a conductive or non-conductive state depending on the potential of the working electrode.
  • the continuous measurement time of the concentration of the analyte by the enzyme sensor of the present disclosure is, for example, the time at which the linear function (i) is established at most.
  • the "predetermined potential” is a value slightly smaller than the potential of the working electrode 2 at which the linear function (i) holds when the redox substance is oxidized by the enzymatic reaction between the substrate and the enzyme, and a value slightly larger than the potential of the working electrode 2 at which the linear function (i) holds when the redox substance is reduced by the enzymatic reaction between the substrate and the enzyme.
  • the "slightly smaller value” is, for example, a value that is preferably 5 to 10% smaller than the potential of the working electrode 2 at which the above linear function (i) holds
  • the "slightly larger value” is, for example, a value that is preferably 5 to 10% larger than the potential of the working electrode 2 at which the above linear function (i) holds.
  • the reference electrode is a reference electrode that constitutes a three-electrode system. That is, in this embodiment, the enzyme sensor includes a working electrode, a counter electrode, and a reference electrode (reference electrode).
  • the enzyme sensor includes a working electrode, a counter electrode, and a reference electrode (reference electrode).
  • the potential of the working electrode can be shifted to the negative side before the start of measurement to lower the ratio of oxidized form at the start of measurement, and the change in the concentration of the substrate over time can be measured for a longer period of time.
  • the enzyme sensor disclosed herein can be used in any application that can utilize the substrate specificity of oxidoreductases, and examples of such applications include biosensors that sense organic substances or body fluids in biological samples, and biosensors that sense viruses or antibodies in environmental samples. More specifically, examples of such applications include blood glucose level sensors that measure the sugar concentration in blood, urine glucose level sensors that measure the sugar concentration in urine, lactate sensors that measure the lactate concentration in sweat, and virus sensors that exist in food, sewage, etc.
  • Example 1 [Working electrode] Au was vacuum-deposited through a metal mask onto a substrate (polyimide film, 125 ⁇ m thick) 70 to a thickness of 50 nm, forming a working electrode 21 having the pattern shown in Fig. 7. Next, 5 ⁇ l of a mixed solution obtained by mixing a 0.2 wt % carbon nanotube aqueous dispersion (manufactured by TUBALL) and an aqueous solution containing 1 wt % Prussian blue (a redox material, manufactured by Aldrich) at a volume ratio of 10:1 was dropped onto a circular portion 21a of the working electrode 21 having a diameter of 3 mm, and the mixture was dried in a thermostatic chamber at 80°C for 10 minutes to form a carbon nanotube layer containing Prussian blue as a redox layer.
  • a mixed solution obtained by mixing a 0.2 wt % carbon nanotube aqueous dispersion (manufactured by TUBALL) and an aque
  • Counter electrode (reference electrode) A silver/silver chloride electrode was used as the counter electrode.
  • the concentration of the substance to be measured was measured as follows. As shown in FIG. 8, an enzyme-modified electrode in which an enzyme and an oxidizing/reducing substance were immobilized on a working electrode 21 was connected to a non-inverting input terminal of a non-inverting amplifier circuit 27. The counter electrode 22 was connected to a ground potential. The enzyme-modified electrode and the counter electrode 22 were immersed in 10 mL of PBS solution (measurement solution), and the measurement solution was stirred at 500 rpm using a stirrer 24. First, measurement of the time differential value dV/dt of the potential of the working electrode 21 output by the differentiation circuit 28 was started.
  • Example 2 [Working electrode] The working electrode 21 (see FIG. 9) and the enzyme-modified electrode including it were prepared in the same manner as in Example 1. [Counter electrode (reference electrode)] A copper electrode was used as the counter electrode 22 .
  • the concentration of a substance to be measured was measured as follows. 9, an enzyme-modified electrode in which an enzyme and an oxidizing/reducing substance were immobilized on a working electrode 21 was connected to a counter electrode 22 by a switch 25 for controlling current flow and a power source 26 for applying a predetermined potential, and the enzyme-modified electrode was then connected to a non-inverting input terminal of a non-inverting amplifier circuit 27.
  • the enzyme-modified electrode and counter electrode 22 were immersed in 10 mL of a PBS solution of 30 ⁇ M glucose (measurement solution), and the measurement solution was stirred at 500 rpm using a stirrer 24. Then, the following steps (1) to (3) were performed.
  • the above steps (2) and (3) were repeated six times to obtain a graph showing the change in the potential of the working electrode 21 over time, as shown in Fig. 13. Furthermore, the time differential value of the potential of the working electrode 21 was measured by the differentiation circuit 28 connected to the non-inverting amplifier circuit 27, to obtain a graph showing a constant time differential value dV/dt with respect to the change in the potential of the working electrode 21 over time, as shown in Fig. 14. While a current is flowing between the working electrode 21 and the counter electrode 22, the measurement of the time differential value dV/dt of the potential of the working electrode 21 in Fig. 14 is stopped. The input impedance of the non-inverting input terminal of the non-inverting amplifier circuit 27 was 1 M ⁇ or more.
  • Example 3 [Working electrode] The working electrode 29 (see FIG. 10) and the enzyme-modified electrode including it were prepared in the same manner as in Example 1. [Counter electrode] The counter electrode 30 was a platinum electrode. [Reference electrode (standard electrode)] The reference electrode 31 used was a silver/silver chloride electrode.
  • FIG. 10 shows another embodiment of a system for measuring the concentration of a substance to be measured (substrate).
  • a circuit 34 was used to control the potential of the counter electrode 30 so that the reference electrode 31 was at ground potential.
  • An enzyme-modified electrode in which an enzyme and an oxidizing/reducing substance were immobilized on the working electrode 29 was connected to a switch 35 that applies a predetermined voltage to control the current flow between the working electrode 29 and the counter electrode 30 and a non-inverting input terminal of a non-inverting amplifier circuit 37.
  • the enzyme-modified electrode, the counter electrode 30, and the reference electrode 31 were immersed in 10 mL of PBS solution.
  • the PBS solution was stirred at 500 rpm using a stirrer 33, and then the switch 35 was closed for 100 seconds to first energize the working electrode 29 and the counter electrode 30.
  • the potential of the working electrode 29 relative to the reference electrode 31 at this time was set to 0.015 V.
  • the switch 35 was opened so that the working electrode 29 and the counter electrode 30 were not energized, and then the measurement of the time differential value dV/dt of the potential of the working electrode 29 output by the differentiation circuit 38 was started.
  • Example 4 [Working electrode] The working electrode 21 (see FIG. 8) and the enzyme-modified electrode including it were prepared in the same manner as in Example 1. [Counter electrode (reference electrode)] The counter electrode 22 was a silver/silver chloride electrode. [Measurement of electrode potential and continuous measurement time] Using a measurement system as shown in FIG. 8, an enzyme-modified electrode in which an enzyme and an oxidizing/reducing substance were immobilized on a working electrode 21 was connected to a non-inverting input terminal of a non-inverting amplifier circuit 27. The counter electrode 22 was connected to a ground potential.
  • the enzyme-modified electrode and the counter electrode 22 were immersed in 10 mL of a PBS solution (measurement solution), and the measurement solution was stirred at 500 rpm using a stirrer 24.
  • the potential of the working electrode 21 output by the non-inverting amplifier circuit 27 was measured, and it was 0.015 V.
  • the glucose concentration in the measurement solution was adjusted to 10 ⁇ M by adding 10 ⁇ L of a 100 mM D-glucose solution to the stirred PBS solution. After that, the time during which the time differential value dV/dt of the potential at which the linear function (i) holds could be continuously measured was measured, and it was 70 seconds.
  • Example 5 [Working electrode]
  • the working electrode 21 was prepared in the same manner as in Example 4.
  • An enzyme-modified electrode was prepared in the same manner as in Example 1, except that 5 ⁇ l of a mixed solution obtained by mixing a 0.2 wt % carbon nanotube aqueous dispersion (manufactured by TUBALL) and an aqueous solution (Prussian blue content: 1 mass %) obtained by adding Prussian blue (redox material, manufactured by Aldrich) to an aqueous solution of ascorbic acid (reducing agent, manufactured by Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.) adjusted to 100 mM was dropped onto a circular portion 21a having a diameter of 3 mm of the working electrode 21 (see FIG.
  • the counter electrode 22 was a silver/silver chloride electrode. [Measurement of electrode potential and continuous measurement time] Using a measurement system as shown in FIG. 8, an enzyme-modified electrode in which an enzyme and an oxidizing/reducing substance were immobilized on a working electrode 21 was connected to a non-inverting input terminal of a non-inverting amplifier circuit 27. The counter electrode 22 was connected to a ground potential.
  • the enzyme-modified electrode and the counter electrode 22 were immersed in 10 mL of PBS solution (measurement solution), and the measurement solution was stirred at 500 rpm using a stirrer 24.
  • the potential of the working electrode 21 output by the non-inverting amplifier circuit 27 was measured, and it was ⁇ 0.05 V.
  • the glucose concentration in the measurement solution was adjusted to 100 ⁇ M by adding 10 ⁇ L of 100 mM D-glucose solution to the stirred PBS solution. After that, the time during which the time differential value dV/dt of the potential at which the linear function (i) holds could be continuously measured was measured, and it was 200 seconds.
  • Example 6 [Working electrode]
  • the working electrode 21 was prepared in the same manner as in Example 4.
  • An enzyme-modified electrode including the working electrode 21 was prepared in the same manner as in Example 4, except that 5 ⁇ l of a mixed solution obtained by mixing a 0.2 wt % carbon nanotube aqueous dispersion (manufactured by TUBALL) and an aqueous solution (Prussian blue content: 1 mass %) obtained by adding Prussian blue (redox material, manufactured by Aldrich) to an aqueous solution of 3-mercapto-1,2-propanediol (reducing agent, manufactured by Fuji Film Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) adjusted to 50 mM in a volume ratio of 10:1 was dropped onto the circular portion 21a having a diameter of 3 mm of the working electrode 21.
  • a mixed solution obtained by mixing a 0.2 wt % carbon nanotube aqueous dispersion (manufactured by TUBALL) and an aqueous solution (Prussian blue
  • the molar ratio (reducing agent/redox material) of 3-mercapto-1,2-propanediol to Prussian blue was set to 5.0.
  • the counter electrode 22 was a silver/silver chloride electrode. [Measurement of electrode potential and continuous measurement time] Using a measurement system as shown in FIG. 8, an enzyme-modified electrode in which an enzyme and an oxidizing/reducing substance were immobilized on a working electrode 21 was connected to a non-inverting input terminal of a non-inverting amplifier circuit 27. The counter electrode 22 was connected to a ground potential.
  • the enzyme-modified electrode and the counter electrode 22 were immersed in 10 mL of a PBS solution (measurement solution), and the measurement solution was stirred at 500 rpm using a stirrer 24.
  • the potential of the working electrode 21 output by the circuit 27 was measured, and found to be ⁇ 0.04 V.
  • the glucose concentration in the measurement solution was adjusted to 100 ⁇ M by adding 10 ⁇ L of a 100 mM D-glucose solution to the stirred PBS solution. After that, the time during which the time differential value dV/dt of the potential at which the linear function (i) holds could be continuously measured was measured, and found to be 150 seconds.
  • Example 7 [Working electrode]
  • the working electrode 21 (see FIG. 8) was prepared in the same manner as in Example 4.
  • An enzyme-modified electrode including the working electrode 21 was prepared in the same manner as in Example 4, except that 5 ⁇ l of a mixed solution obtained by mixing a 0.2 wt % carbon nanotube aqueous dispersion solution (manufactured by TUBALL) and an aqueous solution (Prussian blue content: 1 mass %) obtained by adding Prussian blue (redox material, manufactured by Aldrich) to an aqueous solution of thiourea (reducing agent, manufactured by Fuji Film Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) adjusted to 10 mM in a volume ratio of 10:1 was dropped onto the circular portion 21a having a diameter of 3 mm of the working electrode 21.
  • a mixed solution obtained by mixing a 0.2 wt % carbon nanotube aqueous dispersion solution (manufactured by TUBALL) and an aqueous solution (Prussian blue content
  • the molar ratio of thiourea to Prussian blue (reducing agent/redox material) was 3.0.
  • the counter electrode 22 was a silver/silver chloride electrode. [Measurement of electrode potential and continuous measurement time] Using a measurement system as shown in FIG. 8, an enzyme-modified electrode in which an enzyme and an oxidizing/reducing substance were immobilized on a working electrode 21 was connected to a non-inverting input terminal of a non-inverting amplifier circuit 27. The counter electrode 22 was connected to a ground potential. The enzyme-modified electrode and the counter electrode 22 were immersed in 10 mL of PBS solution (measurement solution), and the measurement solution was stirred at 500 rpm using a stirrer 24.
  • the potential of the working electrode 21 output by the circuit 27 was measured, and it was ⁇ 0.02 V.
  • the glucose concentration in the measurement solution was adjusted to 100 ⁇ M by adding 10 ⁇ L of 100 mM D-glucose solution to the stirred PBS solution. After that, the time during which the time differential value dV/dt of the potential at which the linear function (i) holds could be continuously measured was measured, and it was 100 seconds.
  • Example 4 As can be seen from a comparison between Example 4 and Examples 5 to 7, by including a reducing agent in the redox layer in advance, the time period during which the time derivative dV/dt of the potential for which the linear function (i) is valid can be continuously measured can be extended.
  • the measurement of substrate concentration using the enzyme sensor disclosed herein uses the potential of the working electrode, and does not require current to be passed through the working electrode or the solution containing the substance to be measured. This is useful, for example, when the substrate concentration is low (e.g., several tens of ⁇ M) or when the concentrations of multiple substrates are to be measured simultaneously.

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Emergency Medicine (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Electrochemistry (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本開示は、一態様において、被測定物質を含む溶液中の前記被測定物質の濃度を測定するための酵素センサー１である。酵素センサー１は、前記溶液に各々接しうる作用電極２および基準電極３と、作用電極２に各々固定された酵素および可逆的に酸化還元可能な酸化還元物質と、被測定物質と酵素との反応に起因する酸化還元物質における酸化体と還元体の濃度変化によって生じる基準電極３と作用電極２との間の電位差の時間微分値ｄＶ／ｄｔを経時的に出力可能とするｄＶ／ｄｔ出力機構９とを含む。前記電位差は、酸化還元物質が被測定物質と酵素との反応により、酸化される場合には貴側にシフトし、還元される場合には卑側にシフトする、酵素センサーに関する。

Description

酵素センサー
本開示は、酵素を用いた特定物質（被測定物質）用のセンサーおよびそれを用いた特定物質の濃度の測定方法に関する。
近年、健康志向の高まりに伴い、身体の状態をモニターするために、汗、唾液、尿、涙、血液等の生体液中の有機物質を選択的に検出するセンサーのニーズが高まっており、中でも血液採取を行わないような被験者の身体を傷つけない非侵襲的な測定が注目されている。非侵襲測定可能な生体液中では血液中よりも有機物質濃度が低い傾向にあり、そのため、より高感度なセンサーが求められている。この種のセンサーとしては、酵素の高い選択性を利用し、選択的に高感度の有機物質の検出が可能な酵素センサーが有力候補とされている。
特開昭６４－８８２４４号公報（特許文献１）では、酵素反応によって発生するプロトンを、作用電極上のプロトン感応膜で捕捉したときに発生する定常電位ΔＶ∞を、初期の電位の変化速度から推定して、基質濃度を測定している。特開２０１９－１５８６５０号公報（特許文献２）には、酸化還元物質の酸化還元反応を可逆にするために、作用電極と参照電極の間に外部抵抗を設けることが開示されている。特表２０２３－５５３８８９号公報（特許文献３）では、作用電極と参照電極との間の電位の時間変化から、基質濃度を測定する方法が開示されている。
本開示は、一態様において、
　被測定物質を含む溶液中の前記被測定物質の濃度を測定するための酵素センサーであり、
　前記溶液に各々接しうる作用電極および基準電極と、
　前記作用電極に各々固定された酵素および可逆的に酸化還元可能な酸化還元物質と、
　前記被測定物質と前記酵素との反応に起因する前記酸化還元物質における酸化体と還元体の濃度変化によって生じる前記基準電極と前記作用電極との間の電位差の時間微分値ｄＶ／ｄｔを経時的に出力可能とするｄＶ／ｄｔ出力機構とを含み、
　前記電位差は、前記酸化還元物質が前記被測定物質と前記酵素との反応により、酸化される場合には貴側にシフトし、還元される場合には卑側にシフトする、酵素センサーに関する。

　尚、本開示において「被測定物質の濃度」は、被測定物質の濃度の絶対値のみならず相対値も含み、例えば、被測定物質の濃度の絶対値の算出に使用できる、基質濃度の絶対値と線形関係にある前記時間微分値ｄＶ／ｄｔも含む概念である。
本開示は、一態様において、本開示の酵素センサーを用いた、被測定物質の測定方法であり、
　前記作用電極と前記基準電極の両方に前記被測定物質を含む溶液を接触させること、
　前記作用電極と前記基準電極とが電気接続され、且つ、前記作用電極と前記基準電極との間に電圧を印可していない状態で、前記基準電極と前記作用電極の電位差の時間微分値ｄＶ／ｄｔを経時的に得ること、
　取得された前記時間微分値ｄＶ／ｄｔと下記線形関数（ｉ）を用いて前記被測定物質の濃度を算出すること、を含む被測定物質の測定方法に関する。
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000005
 　上記線形関数（ｉ）中、Ｖは前記基準電極と前記作用電極との間の前記電位差、tは時間、ＣＭは被測定物質の濃度、Ａは比例定数である。
　本開示は、一態様において、本開示の酵素センサーを用いた、別の被測定物質の測定方法であり、
　前記酵素センサーの電極系が、二電極系である場合、前記作用電極と前記対電極（基準電極）を、前記被測定物質を含む溶液を接触させ、三電極系である場合、前記作用電極と前記対電極と参照電極（基準電極）を、前記被測定物質を含む溶液を接触させること、
　前記酵素センサーの電極系が、前記二電極系である場合は前記作用電極と前記対電極（基準電極）が電気接続され、前記三電極系である場合は前記作用電極と前記対電極と前記参照電極（基準電極）が電気接続され、前記作用電極の電位が予め設定された所定の電位に達すると、前記二電極系、前記三電極系のいずれにおいても、前記対電極と前記作用電極との間に所定の電圧を印可して、前記作用電極と前記対電極の間に電流を流し、前記作用電極の電位を測定開始前の値にもどすこと、
　前記基準電極と前記作用電極の電位差の時間微分値ｄＶ／ｄｔを経時的に得ること、
　取得された前記時間微分値ｄＶ／ｄｔと下記線形関数（ｉ）を用いて前記被測定物質の濃度を算出すること、を含む被測定物質の測定方法に関する。
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000006
 　上記線形関数（ｉ）中、Ｖは前記基準電極と前記作用電極との間の前記電位差、tは時間、ＣＭは被測定物質の濃度、Ａは比例定数である。
　本開示は、一態様において、被測定物質を含む溶液中の前記被測定物質の濃度を測定するための測定システムであり、
　前記測定システムは、酵素センサーと信号処理機構と表示部とを含み、
　前記酵素センサーは、
　前記溶液に各々接しうる作用電極および基準電極と、
　前記作用電極に各々固定された酵素および可逆的に酸化還元可能な酸化還元物質と、
　前記被測定物質と前記酵素との反応に起因する前記酸化還元物質における酸化体と還元体の濃度変化によって生じる前記基準電極と前記作用電極との間の電位差を経時的に計測可能とする、計測部とを含み、
　前記電位差は、前記酸化還元物質が前記被測定物質と前記酵素との反応により、酸化される場合には貴側にシフトし、還元される場合には卑側にシフトし、
　前記信号処理機構は前記電位差から下記線形関数（ｉ）を用いて前記被測定物質の濃度を算出し、
　前記表示部は前記信号処理機構が算出した前記被測定物質の濃度を表示し得る、測定システムに関する。
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000007
 　上記線形関数（ｉ）中、Ｖは前記基準電極と前記作用電極との間の前記電位差、tは時間、ＣＭは被測定物質の濃度、Ａは比例定数である。
図１は、本開示の一態様の酵素センサーの模式図である。 図２は、本開示の別の一態様の酵素センサーの模式図である。 図３は、本開示の別の一態様の酵素センサーの模式図である。 図４は、本開示の別の一態様の酵素センサーの模式図である。 図５は、本開示の別の一態様の酵素センサーの模式図である。 図６は、本開示の別の一態様の酵素センサーの模式図である。 図７は、実施例１から実施例７において使用され、基材上に形成された作用電極の平面図である。 図８は、実施例１、実施例４から実施例７で使用した、基質濃度の測定系を説明する模式図である。 図９は、実施例２で使用した基質濃度の測定系を説明する模式図である。 図１０は、実施例３で使用した基質濃度の測定系を説明する模式図である。 図１１は、実施例１の実験操作で得られた経時で変化する作用電極電位の時間微分値を示したグラフである。 図１２は、図１１で得られた作用電極電位の時間微分値と、グルコース濃度との関係を示したグラフである。 図１３は、実施例２の実験操作で得られた経時で変化する作用電極の電位を示したグラフである。 図１４は、実施例２の実験操作で得られた作用電極電位の時間微分値と、時間との関係を示したグラフである。 図１５は、実施例３の実験操作で得られた経時で変化する作用電極電位の時間微分値を示したグラフである。 図１６は、図１５で得られた作用電極電位の時間微分値と、グルコース濃度との関係を示したグラフである。
　特許文献１に開示の酵素センサーでは、ｐＨ感応膜上に酵素が固定化された作用電極を含み、電位が経時で定常電位（一定電位）に落ち着くことを利用している。特許文献１に開示の酵素センサーでは、定常電位に落ち着くまでに時間がかかり、測定時間が長くなる問題を回避しており、具体的には、特定の線形関数からΔＶ∞を推定値として計算し、測定時間を短縮している。しかし、この方法では、測定溶液中の被測定物質の濃度の経時変化を計測することができないという問題点があった。また、イオン感応性電界効果トランジスタ(ＩＳＦＥＴ)を用いた検出では、酵素反応で発生したプロトンが被測定溶液で緩衝され電位変化が小さくなりやすいために、検出精度が低いといった課題があった。
特許文献２では、作用電極上に可逆的に酸化還元可能な酸化還元物質と酵素とを固定化することで酵素の反応を酸化還元物質で媒介し、酸化還元物質の酸化還元電位を電界効果トランジスタなどの増幅器で増幅した信号を測定することにより、被測定物質の濃度の経時変化を測定可能な酵素センサーを作製している。酵素反応に起因して生じる酸化還元物質の反応は、酸化または還元の一方向のみであり、酵素反応が継続する限り、作用電極の電位は上昇または下降をつづけ、一定の電位に落ち着くことがないという不可逆性の問題がある。そこで、この酵素センサーでは、作用電極と参照電極とを外部抵抗で接続することで、電子伝達メディエータである酸化還元物質の自発的な再生反応（酸化あるいは還元反応）を促すことで、上記不可逆性の問題を解決している。しかし、参照電極に電流を流すことで参照電極電位を変化させるので測定精度が低下するという問題、さらには参照電極に電流を流すことにより参照電極が破損する恐れがあるという問題があった。
　特許文献３では、作用電極と基準電極となる参照電極との間の電位を測定する前に、作用電極と参照電極との間に短時間電位を印加しているために、電位の時間変化と測定する基質濃度の関係が複雑になり、基質濃度を求めるための機構をセンサーに組み込むことが困難であった。
本開示は、一様態において、被測定物質を含む溶液中の前記被測定物質の濃度を経時変化も含めて選択的に高精度で測定可能な酵素センサーを提供することを目的とする。
本開示の酵素センサーは、一様態において、被測定物質（以下「基質」と称する場合もある。）を含む溶液中の前記被測定物質の濃度を測定するための酵素センサーである。
　本開示の酵素センサーは、前記溶液に各々接しうる作用電極および基準電極と、前記作用電極に各々固定された酵素および酸化還元物質と、前記作用電極および前記基準電極に電気的に接続されたｄＶ／ｄｔ出力機構と、を含む。
　前記ｄＶ／ｄｔ出力機構は、前記被測定物質と前記酵素との反応に起因する前記酸化還元物質における酸化体と還元体の濃度変化によって生じる前記基準電極と前記作用電極との間の電位差の時間微分値ｄＶ／ｄｔを経時的に出力可能とする。そして、本開示の酵素センサーでは、前記酸化還元物質が前記被測定物質と前記酵素との反応により、酸化される場合には前記電位差が貴側にシフトし、還元される場合には前記電位差が卑側にシフトする。このような構成であることにより、本開示の酵素センサーは、下記の理由により、被測定物質の濃度を、経時変化も含めて選択的に高精度で測定できる。
上記の通り、特許文献１に開示されているようなｐＨ感応膜上に酵素を固定化するような測定系では、酵素電極の電位は経時で一定電位に落ち着くことが知られている。
　しかし、電極上に酸化還元物質と酵素を固定化した測定系では、基質と酵素との反応（酵素反応）によって酸化還元物質が酸化もしくは還元されるが、作用電極電位は上昇または下降しつづけ、一定電位に落ち着くことがない。そのため、基質の濃度の経時的変化をモニタリングすることができない。しかし、酵素と酸化還元物質が電極に固定されていると、基質と酵素の反応により生じた電荷が酸化還元物質を介して電極に速やかに効率よく移動できるようになるため、基質濃度が低く酵素反応による生成物が少ない場合でも、酵素センサーにおいて短時間で十分な信号（電圧）強度が得られ、この信号の時間に対する微分値ｄＶ／ｄｔを求めることにより、基質の濃度の経時変化を高精度で測定することができたと考えられる。
上記の通り、本開示によれば、前記被測定物質の濃度を経時変化も含めて選択的に高精度で測定可能な酵素センサーを提供できる。
　以下、本開示の酵素センサーの例について図面を用いて説明する。尚、図１～図６では、説明の便宜のため、被測定対象（基質）をグルコースとしているが、本開示の酵素センサーのセンシング対象はこれに限定されない。
図１に示す本開示の酵素センサー１は、溶液６中に含まれるグルコース濃度を測定する装置である。本開示の酵素センサー１は、酵素および酸化還元物質が固定された作用電極２と、対電極（基準電極）３を含むセンシング部位８と、作用電極２および対電極３に電気的に接続されたｄＶ／ｄｔ出力機構９とを含む。作用電極２と対電極３は、各々、被測定物質を含む溶液６と接触し得るが、対電極３と作用電極２は互いに電気的に接触しない配置となっている。酵素は溶液６中に溶出せず、酸化還元物質は溶液６に不溶である。酵素が溶液６中において「溶出せず」とは、酵素が吸着や化学結合により作用電極と結合しているために、作用電極を溶液６に接触させても、実質的に酵素が溶液中に移行しないことを意味する。酸化還元物質が溶液６に「不溶」であるとは、酸化還元物質の溶液に対する溶解度が小さく、作用電極を溶液に接触させたときに、作用電極に固定された酸化還元物質の溶液への溶解による減少量が実質的にゼロであることを意味する。固定された酸化還元物質の溶液への溶解による減少量が実質的にゼロとは、酸化還元物質の溶液への溶解度が１００ｍｇ／Ｌ以下であることを意味する。図１～図６において、７は基材である。
本開示の酵素センサー１によるグルコース濃度の測定は、作用電極２及び対電極３が溶液６に接しており、作用電極２と対電極（基準電極）３とが電気接続され、且つ、作用電極２及び対電極３に電圧を印加せず、実質的に電流が流れていない状態で行われる。ここで、実質的に電流が流れていない状態とは、リーク電流等の意図しない電流の漏れ出し以外の電流が流れていない状態を意味する。ｄＶ／ｄｔ出力機構９は、当該状態で、対電極３と作用電極２の間に発生する電位差の時間に対する変化率（以下、前記「電位差の時間に対する変化率」を、「基準電極と作用電極との間の電位差の時間微分値ｄＶ／ｄｔ」または単に「時間微分値ｄＶ／ｄｔ」とも言う場合がある。）を出力する。「基準電極と作用電極との間の電位差」は、「ＯＣＶ」（Open Circuit Voltage）や「自然電位」とも呼ばれ、本願において「作用電極の電位」と呼ぶ場合もある。
　作用電極２への酸化還元物質および酵素の「固定」は、酸化還元物質および酵素が作用電極２に対して移動しない状態にあることを意味する。酸化還元物質は、好ましくは、作用電極２に対して直接固定される。酵素は作用電極２に対して直接固定されていても良いし、酸化還元物質を介して間接的に固定されていても良い。好ましい態様においては、酸化還元物質は、作用電極２に接して配置された酸化還元層５を構成し、酵素は、酸化還元層に接して配置された酵素固定層４を構成する。また、酵素と酸化還元物質の混合物層を作用電極２上に形成しても良い。
　次に、例えば、被測定物質（基質）がグルコースである場合を例に挙げて、センシング部位８での動作を説明する。
　作用電極２に固定された酵素（グルコースオキシターゼ）が水および酸素の存在下でグルコースと反応することで、グルコースはグルコン酸となり、過酸化水素が生成される。同時に、当該過酸化水素により、電子伝達メディエータとしての酸化還元物質のうち、還元体が酸化体に酸化される。これにより電子伝達メディエータにおける酸化体と還元体の比率に変化が生じ、この変化に応じて対電極３と作用電極２の間の電位差が変化する。
本開示の酵素センサー１では、作用電極２上に酸化還元物質と酵素とが固定されているので、基質と酵素の反応により生じた電荷が、酸化還元物質を介して作用電極２に速やかに効率よく移動できる。そのため、基質濃度が低く酵素反応による生成物が少ない場合でも、酵素センサー１において短時間で十分な信号（作用電極の電位）強度が得られ、この信号の時間微分値ｄＶ／ｄｔを求めることにより、基質濃度の経時変化を高精度で測定することができる。例えば、基質濃度が数十μＭ(ｍｏｌ／Ｌ)以下でも前記信号を測定することができる。また本開示の酵素センサー１は酵素反応を利用しているので、基質濃度の測定が選択的に行える。
後述の通り、本開示の酵素センサーでは基準電極と作用電極との間の電位差の時間微分値ｄＶ／ｄｔと基質濃度とが線形関係（一次相関）にあるので、ｄＶ／ｄｔの計測データから基質濃度の絶対値を容易に算出することが可能である。本開示の酵素センサー１は、前記ｄＶ／ｄｔを経時的に出力できるｄＶ／ｄｔ出力機構９を備えるので、基質濃度の絶対値を経時的にモニタリングすることができる。
　本開示の酵素センサー１では、酵素が溶液６中に溶出せず、酸化還元物質は溶液６に不溶であり、各々、作用電極２に固定されている。そのため、作用電極２と対電極３の間に所定の電圧を印加して作用電極２と対電極３の間に電流を流すことで、適宜、酸化体と還元体の比率を所望の比率にコントロールすることができる。たとえば、酵素反応によって酸化還元物質の酸化体が増加した場合に、酸化体が還元される方向に電流を流すことにより、酸化体を還元して酸化体を減少させることにより、測定開始時の酸化体と還元体の比に戻すことができる。すなわち、本開示の酵素センサー１は、一態様において、繰り返し使用することができる。故に、図２に示されるように、本開示の酵素センサー１は、一態様において、必要に応じて対電極３と作用電極２の間に所定の電圧を印加して作用電極２と対電極３の間に電流を流すことを可能とする回路１０ａをさらに含んでいると好ましい。
　前記時間微分値ｄＶ／ｄｔを出力可能とするｄＶ／ｄｔ出力機構９は、例えば、微分回路のような電気回路によってｄＶ／ｄｔを信号として直接出力できるものであっても良いし（図８～図１０参照）、あるいは、基質と酵素との反応に起因する酸化還元物質における酸化体と還元体の濃度変化によって生じる基準電極３と作用電極２の間に発生する電位差の変化を計測する計測器と、当該電位差をＡ／Ｄ変換するＡ／Ｄ変換器と、得られたデジタル信号からｄＶ／ｄｔを演算する演算部を含んだ中央処理部（ＣＰＵ）等とから構成されたものであってもよい。ｄＶ／ｄｔ出力機構９は、前記時間微分値ｄＶ／ｄｔを出力できるものであれば、どのようなものでもよい。
　次に、前記時間微分値ｄＶ／ｄｔと基質濃度の絶対値とが、比例関係（線形関係）にあることについて説明する。
　ここでは、主として、基質と酵素との反応（酵素反応）により酸化還元物質が酸化される場合について説明するが、酸化還元物質が基質と酵素との反応（酵素反応）により還元される場合でも同様に説明される。
　酵素反応によって基質が酸化されて過酸化水素等の酸化剤が生成し、この酸化剤によって電極中の酸化還元物質が酸化される。このとき酸化還元物質が酸化される速度は、化学反応速度論より、以下の式で表される。　
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000008
 　式（１）中、Coは酸化還元物質の酸化体濃度、CRは酸化還元物質の還元体濃度、ｋは反応速度定数、Cは酸化剤濃度、tは時間である。これらの記号の意味は、下記式（２）～（９）及び下記線形関数(ｉ)～（ii）についても同様である。
　上記式（１）を解くと、式（２）のように酸化還元物質の酸化体および還元体の濃度が得られる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000009
 　式（２）中、C0 Oは初期の酸化還元物質の酸化体濃度、C0 Rは初期の酸化還元物質の還元体濃度である。これらの記号の意味は、下記式（３）～（９）についても同様である。
　作用電極２と基準電極３との電位差は酸化還元物質を固定化した電極の電位を与えるネルンスト式により式（３）のように表される。
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000010
 　式（３）中、Ｒは気体定数、Ｔは温度（Ｋ）、Ｆはファラデー定数、ｎは酸化体１分子の酸化還元反応で移動する電子の数、Ｖ0は酸化還元物質の標準酸化還元電位である。Ｖは、酸化還元物質の酸化体および還元体の濃度変化にともない変化した作用電極２の電位である。これらの記号の意味は、下記式（４）～（９）及び下記線形関数(ｉ)～（ii）についても同様である。
　式（３）に式（２）を代入することにより、作用電極２と基準電極３との電位差は式（４）のように求められる。　
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000011
　式（４）の両辺を時間で微分すると以下の式（５）が得られる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000012
　式（５）は初期の酸化還元物質の酸化体濃度が還元体濃度よりも十分に大きい場合は右辺の第２項が無視できて下記式（６）のように近似できる。式（６）において作用電極２と基準電極３との電位差の時間微分値ｄＶ/ｄｔは酸化剤濃度と線形関係にある。さらに酸化剤は酵素反応によって生成するため、酸化剤が溶液に拡散し電極表面に滞留しないような定常状態にあれば、酸化剤濃度は基質濃度に応じた一定値とみなすことができる。酵素の反応速度は正確にはミカエリスメンテン式で記述されるが、被測定物質（基質）の濃度が高くない範囲では、酵素の反応速度は、被測定物質（基質）の濃度に比例するとみなせる。したがって酵素反応で発生した酸化剤濃度は基質濃度に比例するとみなせるため、式（７）に示すように、作用電極２と基準電極３の電位差の時間微分値ｄＶ/ｄｔは基質濃度に比例するとみなせる。ここでCMは被測定物質(基質)の濃度である。
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000013
 　式（７）において、aは酸化剤濃度と基質濃度の比例定数である。この記号の意味は、下記式（８）～（９）及び下記線形関数(ｉ)～（ii）についても同様である。
　以上の説明では、溶液中の基質の拡散速度よりも酵素反応速度が遅いことを仮定としている。しかし、基質の拡散速度が酵素反応速度よりも遅い場合にも、基質の拡散速度は基質濃度に比例するので、酸化剤濃度も基質濃度に比例することになり、対電極（基準電極）３と作用電極２の間に発生する電位差の時間に対する変化率が基質の濃度に比例することは同じである。
　以上の説明から作用電極２と基準電極３との電位差の時間微分値ｄＶ/ｄｔが基質濃度に比例することがわかるが、基質濃度をｄＶ/ｄｔから算出する場合は、比例定数Ａを用いて式（８）のようにあらわすことができる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000014
 　式（７）に鑑みると式（８）の比例定数Ａは下記式（９）に記載の通りであるが、酸化還元物質の反応速度定数ｋおよび酸化剤濃度と基質濃度の比例定数ａを正確に求めることは困難であるため、Ａの値は実験的に求めてもよい。
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000015
　このように、酵素反応によって酸化還元物質が還元される場合には、式（１）～（９）において、cは酸化還元物質を還元させる物質の濃度となり、酵素反応により還元体濃度が増加することにより作用電極電位２は卑側にシフトする。酵素反応によって酸化還元物質が還元される場合においても酵素反応によって酸化還元物質が酸化される場合と同様の議論により、基準電極３と作用電極２の間に発生する電位差の時間に対する変化率（ｄＶ／ｄｔ）が基質の濃度に比例することがわかる。
　本開示の酵素センサーでは、酵素反応によって酸化還元物質が酸化もしくは還元される場合に、基質濃度と作用電極２と基準電極３との電位差の時間微分値（ｄＶ/ｄｔ）が比例するが、高精度な測定の観点から、酸化還元物質は酵素により直接酸化もしくは還元されるのではなく、酵素反応によって生成した生成物によって酸化もしくは還元される方が好ましい。
　本開示の酵素センサー１を用いて長時間測定を行うと、例えば、酵素反応により酸化還元物質が酸化される場合には、酵素反応の進行に伴って還元体濃度が非常に少なくなる。その状況下では、電極中の酸化還元物質以外の物質のわずかな酸化の影響が無視できなくなり、電位差の時間微分値ｄＶ/ｄｔと基質濃度との比例関係が徐々に損なわれてくる。図２に示されるように、本開示の酵素センサー１が、必要に応じて作用電極２と対電極（基準電極）３の間に所定の電圧を印加して作用電極２と対電極３の間に電流を流す機構として回路１０ａを備えていると好ましい。回路１０ａにおいて酸化体が還元される方向に当該電流を流すことにより酸化体が減少して還元体が増加し、酵素センサー１の繰り返し使用が可能となるからである。一方、酵素反応により酸化還元物質が還元される場合には、還元体が酸化される方向に電流を流せばよい。
　かかる態様は、例えば、基質と酵素との反応（酵素反応）に起因して酸化還元物質が酸化される場合には、作用電極２の電位が、下記線形関数（ii）が成立する電位よりも少し小さい値を越えると作用電極２と対電極３とが導通状態となり、例えば作用電極２の電位が対電極３のそれと等しくなると非導通状態になるように調整した回路１０ａをスイッチとして追加することにより行える。基質と酵素との反応（酵素反応）に起因して酸化還元物質が還元される場合には、作用電極２の電位が、下記線形関数（ii）が成立する電位よりも少し大きな値を用いて、同様に行える。
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000016
　尚、前記の「少し小さい値」は、例えば、上記線形関数（ii）が成立する電位よりも好ましくは５～１０％小さい値であり、前記の「少し大きな値」は、例えば、上記線形関数（ii）が成立する電位よりもより好ましくは５～１０％大きい値である。
　電極表面には電気二重層が存在する。そのため、電流を流して酸化還元物質を還元または酸化する場合に電流を流す時間が短すぎると、上記電気二重層を充電するのみで酸化還元物質が酸化または還元されない。さらには、電気二重層に充電された電荷がその後の作用電極２と基準電極３との電位差の測定に悪影響を及ぼし、特許文献３のように、電位差の時間微分値ｄＶ/ｄｔと基質濃度とが比例関係を示さなくなる。
　電流を流す時間は、酸化還元物質を十分に還元または酸化する観点から、好ましくは１秒以上、より好ましくは１０秒以上、さらに好ましくは２０秒以上であり、電流を流すことによる測定時間中断の影響を少なくするために、好ましくは３００秒以下、より好ましくは２００秒以下、さらに好ましくは１００秒以下である。
　センシング部位８の電極系は、図１および図２に示されるように、作用電極２と対電極（基準電極）３とからなる二電極系であってもよいが、図３に示されるように、三電極系としてもよい。すなわち、本開示の酵素センサー１の電極系は、作用電極２および対電極３とは独立に、被測定物質を含む溶液に接し得る参照電極１１をさらに備えた、三電極系としてもよい。この場合、参照電極１１が基準電極として機能する。
　図４に示されるように、本開示の酵素センサー１は、電極系を上記三電極系とし、更に、必要に応じて作用電極２と対電極３の間に所定電圧を印加して電流を流すことができる手段として、例えば回路１０ｂを備えていてもよい。本態様では、必要に応じて作用電極２と対電極３の間に電圧を印加して回路１０ｂに電流を流すことにより、作用電極２に固定された酸化還元物質を酸化または還元できる。そのため、例えば、基質と酵素との反応（酵素反応）によって酸化体が生成される場合には、測定開始前に作用電極２の電位を卑側に偏位させることにより測定開始時の酸化体の比率を下げる等すれば、より長時間の基質の濃度の経時変化を測定することができる。
　また、電極系を上記三電極系とした場合にも、必要に応じて、例えば、間歇的に、作用電極２と対電極３の間に所定時間、電圧が印加され、作用電極２と対電極３の間に電流が流れるように制御されていると、酵素センサー１の繰り返し使用が可能となり、好ましい。かかる態様は、例えば、基質と酵素との反応（酵素反応）に起因して酸化還元物質が酸化される場合には、作用電極２の電位が、上記線形関数（ii）が成立する電位よりも少し小さい値を越えると導通状態になり、例えば作用電極２の電位が測定開始時の作用電極２の電位と等しくなると非導通状態になるように調整した回路１０ｂをスイッチとして追加することにより実行できる。基質と酵素との反応（酵素反応）に起因して酸化還元物質が還元される場合には、上記線形関数（ii）が成立する電位よりも少し大きな値を用いて、同様に実行できる。
　尚、前記の「少し小さい値」は、例えば、上記線形関数（ii）が成立する電位よりも好ましくは５～１０％小さい値であり、前記の「少し大きな値」は、例えば、上記線形関数（ii）が成立する電位より好ましくは５～１０％大きい値である。
　図５に示すように、本開示の酵素センサー１は、ｄＶ／ｄｔ出力機構９と信号処理機構１６と表示部１２とを含む、演算器１３を含んでいてもよい。信号処理機構１６は、好ましくは、前記時間微分値ｄＶ／ｄｔに対応する前記基質の濃度の絶対値を下記線形関数(i)を用いて経時的に算出する機構であるが、前記基質の濃度の相対値を表示する機構であってもよい。表示部１２はアナログ表示部でもデジタル表示部でもよい。
　前記信号処理機構１６は、一態様において、記憶部１５と中央処理部１４を含む。記憶部１５は、主記憶部（メモリー）１５aと補助記憶部（ストレージ）１５ｂとを含む。主記憶部１５aには、時間微分値ｄＶ／ｄｔから前記基質の濃度の絶対値を算出するための下記線形関数（i）が格納される。かかる態様では、演算部及び制御部を含むＣＰＵ等の中央処理部１４により主記憶部１５aに格納された上記絶対値を算出するためのプログラムが実行されて、下記線形関数（i）から前記時間微分値ｄＶ／ｄｔに対応する基質の濃度の絶対値が経時的に算出される。算出された基質の濃度の絶対値は補助記憶部１５ｂに記録される。また、算出された基質の濃度の絶対値は、制御部による制御により表示部１２に表示可能なように、デジタル処理が行われていてもよい。
　前記信号処理機構１６は、別の一態様において、ｄＶ／ｄｔ出力機構９が出力した電圧を、例えば抵抗分割等により電圧変換し、それを電圧計（図示せず。）に下記線形関数(i)から算出される前記基質の濃度の絶対値もしくは相対値として表示する構成であってもよい。
　前記信号処理機構１６は、さらに別の一態様において、前記電圧計（図示せず。）がアナログ電圧計であり、当該アナログ電圧計の目盛を、前記線形関数(i)から算出される基質の濃度で表示した、アナログ的な構成であってもよい。
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000017
　尚、図１～５において、計測部は明記されていないが、図１～５に示された本開示の酵素センサー１において、ｄＶ／ｄｔ出力機構９に計測部が含まれていてもよい。

　また、図１～図５に示された酵素センサー１は、ｄＶ／ｄｔ出力機構９を含んでいるが、図６に示されるように、本開示の酵素センサー１００は、ｄＶ／ｄｔ出力機構９に代えて、基準電極と作用電極２の間の電位差（ＯＣＶ）を経時的に計測可能とする計測部１０１と、得られた電位差のデジタル情報を外部の情報処理端末１０２に送信するための通信用インターフェースを含む構成としてもよい。　
　計測部１０１は、前記作用電極２と前記基準電極３とが電気接続され、且つ、作用電極２及び対電極（基準電極）３に電圧を印加せず、実質的に電流も流していない状態で、基質と酵素との反応に起因する酸化還元物質における酸化体と還元体の濃度変化によって生じる基準電極３と作用電極２の間の電位差（ＯＣＶ）を経時的に計測可能とする。計測部１０１により測定される電位差（ＯＣＶ）は、前記酸化還元物質が基質と酵素との反応により、酸化される場合には貴側にシフトし、還元される場合には卑側にシフトする。計測部１０１としては、例えば、ポテンショスタットが使用できる。
　通信用インターフェースは、無線用又は有線用のいずれであってもよい。通信用インターフェースは、本開示の酵素センサーから他のデバイスまたはシステムにデータを転送するための手段を意味し、例えば、無線通信インターフェースの例としては、ｗｉ－ｆｉ、Ｂｌｕｔｏｏｔｈ（登録商標）の技術等が挙げられる。
　情報処理端末１０２は、前記電位差の時間微分値ｄＶ／ｄｔを算出可能とする、例えば、デジタル式電子計算機であり、例えば、演算部及び制御部を含むＣＰＵ（中央処理部）とメモリーとストレージとを含む記憶部とを含む信号処理機構と、入力部と、表示部とを含む。
　前記メモリーには、時間微分値ｄＶ／ｄｔを前記基質の濃度の絶対値に換算するための上記線形関数（i）が格納されており、ＣＰＵにより、メモリーに格納された基質濃度の絶対値を算出するためのプログラムが実行されて前記時間微分値ｄＶ／ｄｔに対応する基質の濃度の絶対値の経時変化が出力される。
　したがって、本開示は、一態様において、
　被測定物質を含む溶液中の前記被測定物質の濃度を測定するための酵素センサーであり、
　前記溶液に各々接しうる作用電極および基準電極と、
　前記作用電極に各々固定された酵素および可逆的に酸化還元可能な酸化還元物質と、
　前記被測定物質と前記酵素との反応に起因する前記酸化還元物質における酸化体と還元体の濃度変化によって生じる前記基準電極と前記作用電極との間の電位差を経時的に計測可能とする、計測部と、
　前記電位差の時間微分値ｄＶ／ｄｔを算出可能とする外部の情報処理端末に送信するための通信用インターフェースと、を含み、
　前記電位差は、前記酸化還元物質が前記被測定物質と前記酵素との反応により、酸化される場合には貴側にシフトし、還元される場合には卑側にシフトする、酵素センサーに関する。
　また、本開示は、一態様において、
　被測定物質を含む溶液中の前記被測定物質の濃度を測定するための測定システムであり、
　前記測定システムは、酵素センサーと信号処理機構と表示部とを含み、
　前記酵素センサーは、
　前記溶液に各々接しうる作用電極および基準電極と、
　前記作用電極に各々固定された酵素および可逆的に酸化還元可能な酸化還元物質と、
　前記被測定物質と前記酵素との反応に起因する前記酸化還元物質における酸化体と還元体の濃度変化によって生じる前記基準電極と前記作用電極との間の電位差を経時的に計測可能とする、計測部とを含み、
　前記電位差は、前記酸化還元物質が前記被測定物質と前記酵素との反応により、酸化される場合には貴側にシフトし、還元される場合には卑側にシフトし、
　前記信号処理機構は前記電位差から下記線形関数（ｉ）を用いて前記被測定物質濃度の濃度を算出し、
　前記表示部は前記信号処理機構が算出した前記被測定物質の濃度を表示し得る、測定システムに関する。
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000018
 　上記線形関数（ｉ）中、Ｖは前記基準電極と前記作用電極との間の前記電位差、tは時間、ＣＭは被測定物質の濃度、Ａは比例定数である。
　ｄＶ／ｄｔ出力機構９および計測部１０１は、どのような方法で構成しても、電位差を計測する限り有限の入力インピーダンスを持つため、ｄＶ／ｄｔ出力機構９または計測部１０１による負荷効果よって、これらに接続された作用電極２に微小電流（リーク電流）が流れてしまう。基質と酵素との反応（酵素反応）よって酸化還元物質が酸化される場合には、この微小電流により酸化体が還元されてしまい、基質と酵素との反応（酵素反応）によって酸化還元物質が還元される場合には、還元体が酸化されてしまう。この微小電流による酸化体の還元または還元体の酸化が、基質と酵素との反応（酵素反応）によって生成される酸化体または還元体の量に比べて無視できなくなると、測定される作用電極２と基準電極３との電位差について、前記式（１）（化学反応速度論式）および線形関数（i）が成立しなくなる。
　上記微小電流による酸化体の還元または還元体の酸化が実質的に酵素センサーに影響を与えないためには、ｄＶ／ｄｔ出力機構９または計測部１０１の入力インピーダンスを常法に従って十分に高くし、作用電極２に流れる微小電流を十分小さくする必要がある。例えば、オペアンプを用いれば、容易に、ｄＶ／ｄｔ出力機構９または計測部１０１の入力インピーダンスを、負荷効果を無視できる程度の大きい値とすることができる。前記入力インピーダンスは、例えば、負荷効果による電流により還元または酸化された酸化還元物質の量が酵素反応により酸化または還元された酸化還元物質の５０％以下、好ましくは１０％以下となるように設定されるのが好ましい。
　ｄＶ／ｄｔ出力機構９または計測部１０１の入力インピーダンスが十分高いかどうかは、測定中の作用電極の電位が、基質と酵素との反応に起因して酸化還元物質が酸化される場合には貴側にシフトし、基質と酵素との反応に起因して酸化還元物質が還元される場合には卑側にシフトする状況になることで確認できる。
　以下に、本開示の酵素センサーの各構成について、より詳細に例示する。
　＜センシング部位＞
　［酸化還元物質］
　本開示の酵素センサー１を構成する酸化還元物質としては、電極に電子を伝達できる酸化還元物質であれば特に制限はなく、従来公知のものを使用できる。酸化還元物質としては、例えば、プルシアンブルー、メルドラブルー、テトラチアフルバレン、ハイドロキノンや１，４－ナフトキノン等のキノン類、フェロセン、フェロセン誘導体、フェロシアン化カリウム、フェリシアン化物、オスミウム錯体、ｐ－アミノフェノール等が挙げられる。
　酸化還元層５は、作用電極２上に酸化還元物質を含む溶液を滴下または塗工した後、乾燥することにより形成できる。前記溶液は、例えば、酸化還元物質が分散媒に分散された分散液である。未固定の酸化還元物質は洗浄により除去されると好ましく、洗浄液としては、例えば、純水や緩衝液を用いることができる。作用電極２上に固定される酸化還元物質の総量は、本開示の酵素センサー１の用途（基質の種類）等に応じて、例えば、所望の測定時間中に、上記線形関数(ii)が成り立つように、適宜決定される。また、溶液に導電材を混合すると酸化還元層５の導電性が高くなり好ましい。酸化還元層５に含まれる前記導電材としては、例えば、導電性炭素材料が挙げられ、なかでも、導電性が良好で、比表面積が大きく作用電極２上への酵素および酸化還元物質の固定が良好に行えるという理由から、好ましくは、カーボンナノチューブ（ＣＮＴ）である。カーボンナノチューブは、単層カーボンナノチューブ、多層カーボンナノチューブのいずれであってもよい。
　［還元剤］
　酵素反応によって酸化還元物質が酸化される場合、酸化還元物質層５には、酸化還元物質に加えて還元剤が予め含まれていると好ましい。酸化還元物質層に還元剤が予め含まれていると、測定開始時の作用電極の電位をより卑側に設定することができるため、上記線形関数(i)が成り立つ電位の時間微分値ｄＶ/ｄｔをより長時間測定することできる。
　還元剤の種類としては前記酸化還元物質を還元できるものであれば特に制限はなく、従来公知のものを使用できる。還元剤としては、メルカプトプロパンジオール、メルカプトエタノール、メルカプトメタノール、チオフェノールなどのチオール化合物、チオ尿素、アスコルビン酸、シュウ酸、ギ酸、没食子酸、尿酸、水素化アルミニウムリチウム、水素化ホウ素ナトリウム、ヒドラジン等が挙げられる。
　酸化還元物質層に含まれる還元剤と酸化還元物質のモル比（還元剤/酸化還元物質）は、上記線形関数（i）が成り立つ電位の時間微分値ｄＶ/ｄｔを長時間測定できる観点から、好ましくは０．１以上であり、より好ましくは、０．５以上であり、さらに好ましくは０．８以上であり、酸化還元物質の酸化体濃度を還元体濃度より大きくして電位差の時間微分値ｄＶ／ｄｔと基質濃度の比例関係を維持する観点から、好ましくは３０以下、より好ましくは２０以下、さらに好ましくは１０以下である。
　［酸化剤］
　酵素反応によって酸化還元物質が還元される場合、酸化還元物質層５には、酸化還元物質に加えて酸化剤が予め含まれていると好ましい。酸化還元物質層に酸化剤が予め含まれていると、測定開始時の作用電極の電位をより貴側に設定することができるため、上記線形関数(i)が成り立つ電位の時間微分値ｄＶ/ｄｔをより長時間測定することできる。
　酸化剤の種類としては前記酸化還元物質を酸化できるものであれば特に制限はなく、従来公知のものを使用できる。酸化剤としては、過酸化水素などの過酸化物や硝酸カリウム、クロム酸等が挙げられる。
　酸化還元物質層に含まれる酸化剤と酸化還元物質のモル比（酸化剤/酸化還元物質）は、上記線形関数（i）が成り立つ電位の時間微分値ｄＶ/ｄｔを長時間測定できる観点から、好ましくは０．１以上であり、より好ましくは０．５以上であり、さらに好ましくは０．８以上であり、酸化還元物質の還元体濃度を酸化体濃度より大きくして電位差の時間微分値ｄＶ／ｄｔと基質濃度の比例関係を維持する観点から、好ましくは３０以下、より好ましくは２０以下、さらに好ましくは１０以下である。
　［酵素］
　センシング部位８を構成する酵素としては、反応により電子を授受できる酵素であれば特に制限はなく、センシング対象（基質）に応じて適宜適用されるが、基質と選択的に反応する酵素が好ましい。例えば、血液や尿等にふくまれるグルコースがセンシング対象である場合、酵素としては、グルコースオキシターゼ（ＧＯＤ）やグルコースデヒドロゲナーゼ（ＧＤＨ）等が挙げられる。そのほかにも生体液中に含まれるセンシング対象に応じて使用できる酵素として、乳酸オキシダーゼ、乳酸デヒドロゲナーゼ、ウレアーゼ、ウリカーゼ、アミノ酸オキシダーゼ、ビリルビンオキシダーゼ、コレステロールオキシダーゼ、アルコールオキシダーゼ、アルコールデヒドロゲナーゼ等が挙げられる。
　酵素固定化層４は、例えば、酸化還元層５上に酵素とキトサン等の結着剤とを含む溶液を滴下または塗工した後、乾燥することにより形成できる。上記溶液は、例えば、酵素が溶解された溶液と、結着剤が溶解された溶液との混合液である。未固定の酵素は洗浄により除去されると好ましく、洗浄液としては、例えば、純水や緩衝液を用いることができる。結着剤としては、キトサンの他に、ポリビニルブチラール、セルロースアセテート、ポリビニルアルコール、ポリ－Ｌ－リジン、2-メタクリロイルオキシエチルホスホコリン重合体、フィブロイン等を用いることができる。またグルタルアルデヒドなどの架橋剤を用いて酵素同士を共有結合で架橋することで酵素固定層を形成できる。
　このようにして、作用電極２上に酵素と酸化還元物質とが固定された酵素修飾電極が得られる。作用電極２に固定される酸化還元物質の総量および酵素の総量は、本開示の酵素センサーの用途（基質の種類）等に応じて、例えば、所望の測定時間中に、上記線形関数(ii)が成り立つように、適宜決定される。
　［作用電極、参照電極、対電極］
　本開示の酵素センサー１を構成する作用電極２、対電極３、必要に応じて含まれる参照電極１１は、各々、例えば、基材７上に形成された導電層からなる。これらの導電層の材料は、酵素との反応生成物に配慮して選択される。典型的には、金、パラジウム、白金、ロジウム、インジウム又はイリジウム等の金属、炭素材料等が挙げられる。好ましくは金または白金であるが、被測定物質を含む溶液と反応を起こさない導電材料であってもよい。好ましくは、対電極３は白金、作用電極２は金、参照電極１１は金にＡｇ/ＡｇＣｌ電極を構成したものである。前記導電層は、例えば、基材７上の任意の位置にこれらの金属を蒸着等して形成される。または、別個に準備した金属薄膜を、基材７に貼り付けて、各種電極としてもよい。また、導電層（電極）は、材料に応じて、真空蒸着、電子線ビーム、スパッタリング、メッキ、ＣＶＤ、イオンプレーティングコーティング、インクジェット、印刷などの、従来から公知の方法により形成されてもよい。対電極３は、前記基材および導電層を用いずに、金属ワイヤ―や金属板を用いて形成されたものであってもよい。参照電極も、前記基板および導電層を用いずに、ガラス管にＡｇ/ＡｇＣｌ等の基準電極物質を封入したものでもよい。さらに、対電極３とは別に参照電極１１を含まない二電極系では、作用電極２の電位の基準を明確化するために、対電極３にＡｇ/ＡｇＣｌ等の基準電位となる電極を用いてもよい。

　［基材］
　上記基材の材料としては、例えば、ポリイミド（ＰＩ）樹脂、ポリエステル樹脂、ポリアミド樹脂、エポキシ樹脂、ポリサルフォン樹脂等から構成されるシートであってもよいし、これらからなるフィルム状のフレキシブル材料であってもよい。
［被測定物質（基質）の濃度の測定方法］

　次に、本開示の酵素センサーを用いた、本開示の被測定物質（センシング対象）の濃度の測定方法（以下「本開示の測定方法」と略称する場合もある。）について説明する。
　本開示の測定方法は、被測定物質（例えば、生体物質）の濃度を経時的に測定する方法であり、一態様において、少なくとも下記工程（Ａ）および（Ｂ）を含む。
　本開示の測定方法は、工程（Ａ）および（Ｂ）に加えて、さらに工程（Ｃ）を含んでいてもよい。
　本開示の測定方法では、一態様において、経時的に時間微分値ｄＶ／ｄｔを取得するので、下記（Ａ）～（Ｃ）はほぼ同時進行する。
（Ａ）作用電極と基準電極の両方に前記被測定物質を含む溶液６を接触させること。
（Ｂ）前記作用電極と前記基準電極とが電気接続され、且つ、作用電極及び基準電極に電圧を印加せず、実質的に電流が流れていない状態で、基準電極と作用電極との間の電位差の時間微分値ｄＶ／ｄｔを経時的に得ること。
（Ｃ）前記時間微分値ｄＶ／ｄｔを用いて、下記線形関数（i）から、前記時間微分値ｄＶ／ｄｔに対応する前記基質の濃度の絶対値を得ること。
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000019
　上記工程（Ｂ）で得られた前記時間微分値ｄＶ／ｄｔが、上記工程（Ｃ）において、各々、基質濃度の絶対値に換算される。ゆえに上記工程（Ａ）～（Ｃ）を含む本開示の測定方法によれば、基質濃度の絶対値の経時変化を計測できる。
　基質濃度の相対変化のみを計測したい場合は、上記工程（Ｃ）は行わず、上記工程（Ｂ）で得られた時間微分値ｄＶ／ｄｔをそのまま使用すればよい。
　上記（Ｃ）は、本開示の酵素センサーによって行ってもよいし、外部の情報処理端末にて行ってもよい。上記（Ｃ）が外部の情報処理端末で行われる場合、上記（Ｂ）は、当該時間微分値ｄＶ／ｄｔを得た後、当該時間微分値ｄＶ／ｄｔを外部の情報処理端末に送信することを含む。
本開示の測定方法は、所定時間、上記（Ａ）～（Ｃ）を実行した後、下記（Ｄ）を更に行ってもよい。

　（Ｄ）作用電極の電位が予め設定された所定の電位に達すると、作用電極と対電極との間に所定の電圧を印加して作用電極と対電極との間に電流を流し、作用電極の電位を測定開始前の値に戻すこと。
　上記（Ｄ）は、酵素センサーの電極系が、作用電極と対電極とからなる二電極系、又は、作用電極と対電極と参照電極とからなる三電極系のいずれであっても行える。上記（Ｄ）は、酵素センサーが、作用電極の電位に応じて作用電極と対電極とが導通状態または非導通状態になるように調整した回路１０ａ，１０ｂをスイッチとして含むことにより実行できる。
　上記の通り、酵素反応に起因して測定系における還元体の量または酸化体の量が少なくなりすぎると、前記時間微分値ｄＶ／ｄｔと基質濃度の相関が悪くなる。本開示の酵素センサーによる前記被測定物質の濃度の連続測定時間は、例えば、最大で上記線形関数(i)が成立する時間である。
　前記「予め設定された所定の電位」とは、基質と酵素との酵素反応により酸化還元物質が酸化される場合には、上記線形関数(i)が成立する作用電極２の電位より少し小さい値である。基質と酵素との酵素反応により酸化還元物質が還元される場合には、上記線形関数(i)が成立する作用電極２の電位より少し大きい値である。
　前記の「少し小さい値」は、例えば、上記線形関数(i)が成立する作用電極２の電位よりも好ましくは５～１０％小さい値であり、前記の「少し大きい値」は、例えば上記線形関数(i)が成立する作用電極２の電位より好ましくは５～１０％大きい値である。
　本開示の測定方法に使用される本開示の酵素センサーは、一態様において、基準電極が、三電極系を構成する参照電極である。即ち、本態様では、酵素センサーは、作用電極と対電極と参照電極（基準電極）を含む。作用電極の参照電極（基準電極）に対する電位が所望する酸化体と還元体の比に対応する電位になるように、作用電極と対電極の間に印加する電圧を調整することにより、測定開始前に、酸化還元物質の酸化体と還元体の比を所望の値に設定することができる。これにより、例えば、基質と酵素との反応（酵素反応）によって酸化体が生成される場合には、測定開始前に作用電極の電位を卑側に偏位させることにより測定開始時の酸化体の比率を下げる等すれば、より長時間の基質の濃度の経時変化を測定することができる。
　本開示の酵素センサーの用途としては、酸化還元酵素の基質特異性という性質を利用できる用途であれば特に制限はなく、例えば、生体試料中の有機物質や体液をセンシング対象とした生体センサーや、環境試料中のウイルスや抗体などをセンシングするバイオセンサーが挙げられる。より具体的には、血液中の糖濃度を計測する血糖値センサーや、尿中の糖濃度を測定する尿糖値センサー、汗中の乳酸濃度を測定する乳酸センサー、食品や下水などに存在するウイルスセンサー等が挙げられる。
　以下、実施例により本開示をさらに詳細に説明するが、これらは例示的なものであって、本開示はこれら実施例に制限されるものではない。
　（実施例１）　
　 [作用電極]
　メタルマスクを通して、基材（ポリイミドフィルム、厚さ１２５μｍ）７０の上に、Ａｕを厚さが５０ｎｍとなるように真空蒸着して、図７に示されたパターンの作用電極２１を形成した。次に、作用電極２１のうちの直径が３ｍｍの円形状部分２１ａの上に、０．２ｗｔ％のカーボンナノチューブ水分散溶液(ＴＵＢＡＬＬ製)と１ｗｔ％プルシアンブルー(酸化還元物質、Ａｌｄｒｉｃｈ製)を含む水溶液とを、体積比率１０：１で混合した混合溶液を５μｌ滴下し、８０℃の恒温槽内で１０分間乾燥させて、プルシアンブルー含有のカーボンナノチューブ層を、酸化還元層として形成した。
次に、１ｗｔ％グルコースオキシダーゼ(酵素、Ａｌｄｒｉｃｈ製)を含むＰＢＳ溶液（リン酸緩衝生理食塩水、ｐＨ＝７．２、ライフテクノロジー製）と１ｗｔ％のキトサン(Ａｌｄｒｉｃｈ製)を含む２ｗｔ％酢酸(富士フイルム和光純薬製)溶液を体積比率１：２で混合した混合溶液１０μｌを、プルシアンブルー含有のカーボンナノチューブ層（酸化還元層）の上に滴下し、２５℃で２０時間乾燥した。その後、未固定の酵素をＰＢＳ溶液で洗浄して除去し、常温で乾燥することで酵素固定層を形成し、酵素と酸化還元物質が作用電極２１に固定化された酵素修飾電極を得た。
　作製した作用電極をグルコース溶液に浸漬した場合には、酵素反応によって生成した過酸化水素によって酸化還元物質（プルシアンブルー）は酸化される。
　［対電極（基準電極）］

　対電極には、銀／塩化銀電極を使用した。
[基質濃度の測定方法]
　図８の測定系を用いて、下記の通り被測定物質（基質）の濃度の測定を行った。図８に示されるように、酵素と酸化還元物質が作用電極２１に固定化された酵素修飾電極を非反転増幅回路２７の非反転入力端子に接続した。対電極２２はグランド電位になるように接続した。前記酵素修飾電極と対電極２２を１０ｍＬのＰＢＳ溶液（被測定溶液）に浸漬させ、被測定溶液は撹拌子２４を用いて５００ｒｐｍで攪拌させた。まず、初めに微分回路２８によって出力された作用電極２１の電位の時間微分値ｄＶ/ｄｔの計測を開始した。２０秒後に攪拌しているＰＢＳ溶液に１００ｍＭのＤ－グルコース溶液を１μＬ添加することで測定溶液中のグルコース濃度を、１０μＭに調整した。その後、連続的にグルコース濃度を２０μＭ、４０μＭ、６０μＭ、１００μＭと変化させたところ、図１１に示すような、各グルコース濃度に対する作用電極２１の電位の時間微分値ｄＶ/ｄｔを連続的に計測したグラフを得た。
[被測定物質の定量] 
　図１１に示された、各グルコース濃度に対する時間微分値ｄＶ/ｄｔから、図１２に示されるように、グルコース濃度と時間微分値ｄＶ/ｄｔとが比例関係となるプロット（検量線データ）を得た。このプロットは下記線形関数（i）と整合していた。そして、上記の外部の情報処理端末（デジタル式電子計算機）のメモリーに下記線形関数（i）を格納しておき、同じくメモリーに格納され当該線形関数（i）を用いて基質濃度の絶対値を算出するためのプログラムを実行することで、前記時間微分値ｄＶ／ｄｔに対応するグルコース濃度を出力できた。
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000020
（実施例２）
　[作用電極]
　作用電極２１（図９参照）およびそれを含む酵素修飾電極は実施例１と同様にして作製した。
　[対電極（基準電極）]
　対電極２２には銅電極を使用した。
[基質濃度の測定方法]
　図９の測定系を用いて、下記の通り、被測定物質（基質）の濃度の測定を行った。
　図９に示されるように、酵素と酸化還元物質が作用電極２１に固定化された酵素修飾電極と対電極２２とを、通電を制御するスイッチ２５と所定の電位を与える電源２６で接続した後、前記酵素修飾電極を非反転増幅回路２７の非反転入力端子に接続した。前記酵素修飾電極と対電極２２を１０ｍＬの３０μＭのグルコースのＰＢＳ溶液（被測定溶液）に浸漬させ、被測定溶液は攪拌子２４を用いて５００ｒｐｍで攪拌させた。その後、下記（１）～（３）を行った。
　（１）作用電極２１と対電極２２が通電しないようにスイッチ２５を開放した状態で、非反転増幅回路２７により作用電極２１の電位変化を計測し、経時で電位が貴側に増加する結果を得た。
　（２）非反転増幅回路２７で計測された作用電極２１の電位が０．１８０Ｖに到達したら、スイッチ２５を閉じて作用電極２１と対電極２２の間に０．１１５Ｖの電圧を１０秒間印加して、作用電極２１と対電極２２を通電し、作用電極２１の電位を０．１１５Ｖに戻した。
　（３）作用電極２１の電位が所定の値（０．１１５Ｖ）に戻ったら、直ちに作用電極２１と対電極２２が通電しないようにスイッチ２５を開放した後、再び、非反転増幅回路２７により作用電極２１の電位変化を計測した。
その後上記（２）と（３）を６回繰り返すことで、図１３に示すように、経時で変化する作用電極２１の電位を表すグラフを得た。さらに、非反転増幅回路２７に接続された微分回路２８で作用電極２１の電位の時間微分値を計測することで、図１４に示す、経時で変化する作用電極２１の電位に対して一定の時間微分値ｄＶ／ｄｔを表すグラフを得た。作用電極２１と対電極２２の間を通電している間は、図１４において、作用電極２１の電位の時間微分値ｄＶ／ｄｔの計測は停止している。
　なお、非反転増幅回路２７の非反転入力端子の入力インピーダンスは１ＭΩ以上であった。
（実施例３）
　[作用電極]
　作用電極２９（図１０参照）およびそれを含む酵素修飾電極は実施例１と同様にして作製した。
　[対電極]
　対電極３０には白金電極を使用した。
　[参照電極（基準電極）]
　参照電極３１には銀／塩化銀電極を使用した。
[基質濃度の測定方法]
　図１０は、被測定物質（基質）の濃度の測定系の別の一態様である。
　図１０に示されるように、参照電極３１がグランド電位になるように対電極３０の電位を制御する回路３４を用いた。所定の電圧を印加して作用電極２９と対電極３０との通電を制御するスイッチ３５と非反転増幅回路３７の非反転入力端子に、酵素と酸化還元物質が作用電極２９に固定化された酵素修飾電極を接続した。前記酵素修飾電極と対電極３０と参照電極３１を１０ｍＬのＰＢＳ溶液に浸漬させた。ＰＢＳ溶液は攪拌子３３を用いて５００ｒｐｍで攪拌させた後、まず、初めに作用電極２９と対電極３０とを通電するようにスイッチ３５を１００秒間閉じた。この時の参照電極３１に対する作用電極２９の電位を０．０１５Ｖとした。次に、作用電極２９と対電極３０とが通電しないようにスイッチ３５を開放した後、微分回路３８によって出力された作用電極２９の電位の時間微分値ｄＶ／ｄｔの計測を開始した。４０秒後に攪拌しているＰＢＳ溶液に１００ｍＭのＤ－グルコース溶液を１μＬ添加することで測定溶液中のグルコース濃度を、１０μＭに調整した後に、連続的にグルコース濃度を３０μＭ、５０μＭ、７５μＭ、１００μＭ、２００μＭと変化させた。グルコース濃度が１００μＭのＰＢＳ溶液の計測中に作用電極電位が０．０８Ｖに達したために、微分回路３８による作用電極電位の時間微分の測定を停止し、作用電極２９と対電極３０とが通電するようにスイッチ３５を８０秒間閉じて、作用電極２９の電位を０．０１５Ｖに戻した。作用電極２９の電位が０．０１５Ｖに戻ったら、直ちに作用電極２９と対電極３０とが通電しないようにスイッチ３５が開放され、微分回路３８による作用電極２９の電位の時間微分値ｄＶ／ｄｔの計測が再開された。図１５に示すように、各グルコース濃度に対する作用電極２９の電位の時間微分値ｄＶ／ｄｔが連続的に計測されたグラフを得た。さらにリアルタイムでグルコース濃度が計測可能であることが確認できた。
[被測定物質の定量]
　図１５に示された、各グルコース濃度に対する時間微分値ｄＶ/ｄｔから、図１６に示されるように、グルコース濃度と時間微分値ｄＶ/ｄｔとが比例関係となるプロット（検量線データ）を得た。このプロットは上記線形関数（i）と整合していた。そして、上記の外部の情報処理端末（デジタル式電子計算機）のメモリーに上記線形関数（i）を格納しておき、同じくメモリーに格納され上記線形関数（i）を用いて基質濃度の絶対値を算出するためのプログラムを実行することで、前記時間微分値ｄＶ／ｄｔに対応するグルコース濃度を出力できた。
（実施例４）
　[作用電極]
　作用電極２１（図８参照）およびそれを含む酵素修飾電極は実施例１と同様にして作製した。
　[対電極（基準電極）]

　対電極２２には、銀／塩化銀電極を使用した。　
　[電極電位の計測と連続測定可能時間の計測]
　図８に示されるような測定系を用いて、酵素と酸化還元物質が作用電極２１に固定化された酵素修飾電極を非反転増幅回路２７の非反転入力端子に接続した。対電極２２はグランド電位になるように接続した。前記酵素修飾電極と対電極２２を１０ｍＬのＰＢＳ溶液（被測定溶液）に浸漬させ、被測定溶液は撹拌子２４を用いて５００ｒｐｍで攪拌させた。まず、初めに非反転増幅回路２７によって出力された作用電極２１の電位を計測したところ、０．０１５Ｖであった。次に攪拌しているＰＢＳ溶液に１００ｍＭのＤ－グルコース溶液を１０μＬ添加することで測定溶液中のグルコース濃度を、１０μＭに調整した。その後、前記線形関数（i）が成り立つ電位の時間微分値ｄＶ/ｄｔが連続的に測定可能な時間を計測したところ７０秒であった。
（実施例５）
　[作用電極]
　作用電極２１（図８参照）は実施例４と同様にして作製した。
　作用電極２１（図７参照）のうちの直径が３ｍｍの円形状部分２１ａの上に、０．２ｗｔ％のカーボンナノチューブ水分散溶液(ＴＵＢＡＬＬ製)と、１００ｍＭに調整したアスコルビン酸（還元剤、東京化成工業社製）水溶液にプルシアンブルー(酸化還元物質、Ａｌｄｒｉｃｈ製)を添加して得た水溶液（プルシアンブルーの含有量：１質量％）とを、体積比率１０：１で混合した混合溶液を５μｌ滴下したこと以外は、実施例１と同様にして、酵素修飾電極を作製した。アスコルビン酸とプルシアンブルーのモル比（還元剤/酸化還元物質）は８．６とした。
　[対電極（基準電極）]

　対電極２２には、銀／塩化銀電極を使用した。
　[電極電位の計測と連続測定可能時間の計測]
　図８に示されるような測定系を用いて、酵素と酸化還元物質が作用電極２１に固定化された酵素修飾電極を非反転増幅回路２７の非反転入力端子に接続した。対電極２２はグランド電位になるように接続した。前記酵素修飾電極と対電極２２を１０ｍＬのＰＢＳ溶液（被測定溶液）に浸漬させ、被測定溶液は撹拌子２４を用いて５００ｒｐｍで攪拌させた。まず、初めに非反転増幅回路２７によって出力された作用電極２１の電位を計測したところ、―０．０５Ｖであった。次に攪拌しているＰＢＳ溶液に１００ｍＭのＤ－グルコース溶液を１０μＬ添加することで測定溶液中のグルコース濃度を、１００μＭに調整した。その後、前記線形関数（i）が成り立つ電位の時間微分値ｄＶ/ｄｔが連続的に測定可能な時間を計測したところ２００秒であった。
（実施例６）
　[作用電極]
　作用電極２１（図８参照）は実施例４と同様にして作製した。
　作用電極２１のうちの直径が３ｍｍの円形状部分２１ａの上に、０．２ｗｔ％のカーボンナノチューブ水分散溶液(ＴＵＢＡＬＬ製)と、５０ｍＭに調整した3-メルカプト-1,2-プロパンジオール（還元剤、富士フィルム和光純薬社製）水溶液にプルシアンブルー(酸化還元物質、Ａｌｄｒｉｃｈ製)を添加して得た水溶液（プルシアンブルーの含有量：１質量％）とを、体積比率１０：１で混合した混合溶液を５μｌ滴下したこと以外は、実施例４と同様にして、作用電極２１を含む酵素修飾電極を作製した。3-メルカプト-1,2-プロパンジオールとプルシアンブルーのモル比（還元剤/酸化還元物質）は５．０とした。
　[対電極（基準電極）]

　対電極２２には、銀／塩化銀電極を使用した。　
　[電極電位の計測と連続測定可能時間の計測]
　図８に示されるような測定系を用いて、酵素と酸化還元物質が作用電極２１に固定化された酵素修飾電極を非反転増幅回路２７の非反転入力端子に接続した。対電極２２はグランド電位になるように接続した。前記酵素修飾電極と対電極２２を１０ｍＬのＰＢＳ溶液（被測定溶液）に浸漬させ、被測定溶液は撹拌子２４を用いて５００ｒｐｍで攪拌させた。まず、初めに回路２７によって出力された作用電極２１の電位を計測したところ、―０．０４Ｖであった。次に攪拌しているＰＢＳ溶液に１００ｍＭのＤ－グルコース溶液を１０μＬ添加することで測定溶液中のグルコース濃度を、１００μＭに調整した。その後、前記線形関数（i）が成り立つ電位の時間微分値ｄＶ/ｄｔが連続的に測定可能な時間を計測したところ１５０秒であった。
（実施例７）
　[作用電極]
　作用電極２１（図８参照）は実施例４と同様にして作製した。
　作用電極２１のうちの直径が３ｍｍの円形状部分２１ａの上に、０．２ｗｔ％のカーボンナノチューブ水分散溶液(ＴＵＢＡＬＬ製)と、１０ｍＭに調整したチオ尿素（還元剤、富士フィルム和光純薬社製）水溶液にプルシアンブルー(酸化還元物質、Ａｌｄｒｉｃｈ製)を添加して得た水溶液（プルシアンブルーの含有量：１質量％）とを、体積比率１０：１で混合した混合溶液を５μｌ滴下したこと以外は、実施例４と同様にして、作用電極２１を含む酵素修飾電極を作製した。チオ尿素とプルシアンブルーのモル比（還元剤/酸化還元物質）は３．０とした。
　[対電極（基準電極）]

　対電極２２には、銀／塩化銀電極を使用した。
　[電極電位の計測と連続測定可能時間の計測]
　図８に示されるような測定系を用いて、酵素と酸化還元物質が作用電極２１に固定化された酵素修飾電極を非反転増幅回路２７の非反転入力端子に接続した。対電極２２はグランド電位になるように接続した。前記酵素修飾電極と対電極２２を１０ｍＬのＰＢＳ溶液（被測定溶液）に浸漬させ、被測定溶液は撹拌子２４を用いて５００ｒｐｍで攪拌させた。まず、初めに回路２７によって出力された作用電極２１の電位を計測したところ、―０．０２Ｖであった。次に攪拌しているＰＢＳ溶液に１００ｍＭのＤ－グルコース溶液を１０μＬ添加することで測定溶液中のグルコース濃度を、１００μＭに調整した。その後、前記線形関数（i）が成り立つ電位の時間微分値ｄＶ/ｄｔが連続的に測定可能な時間を計測したところ１００秒であった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000021
実施例４と実施例５～７との比較から分かるように、酸化還元層に予め還元剤が含まれることで、前記線形関数（i）が成り立つ電位の時間微分値ｄＶ/ｄｔの連続的測定可能時間を長期化できる。
　本開示の酵素センサーによる基質濃度の測定は、作用電極の電位を利用した基質濃度の測定であり、作用電極や被測定物質を含む溶液に電流を流す必要がないため、例えば、基質濃度が低濃度（例えば数十μＭ）である場合や同時に複数の基質の濃度を測定する場合に有用である。
　１　　酵素センサー
　２、２１、２９　　作用電極
　３、１７、２２、３０　　対電極
　４　　酵素固定化層
　５　　酸化還元物質層
　６、１９、２３、３２　　測定溶液
　７　　基材
　８　　センシング部位
　９　　ｄＶ／ｄｔ出力機構
　１０１　計測部
　１０ａ、１０ｂ　　回路
　１１、３１　参照電極
　１２　　表示部
　１３　　演算器
　１４　中央処理部
　１５　記録部
　１５ａ　主記録部
　１５ｂ　補助記憶部
　１６　信号処理機構
　２０、２４、３３　攪拌子
　２５、３５　作用極―対電極通電スイッチ
　２６、３６　電源
　２７、３７　非反転増幅回路
　２８、３８　微分回路
　３４　回路 

Claims (15)

  1. 　被測定物質を含む溶液中の前記被測定物質の濃度を測定するための酵素センサーであり、
    　前記溶液に各々接しうる作用電極および基準電極と、
    　前記作用電極に各々固定化された酵素および可逆的に酸化還元可能な酸化還元物質と、
    　前記被測定物質と前記酵素との反応に起因する前記酸化還元物質における酸化体と還元体の濃度変化によって生じる前記基準電極と前記作用電極との間の電位差の時間微分値ｄＶ／ｄｔを経時的に出力可能とするｄＶ／ｄｔ出力機構とを含み、
    　前記電位差は、前記酸化還元物質が前記被測定物質と前記酵素との反応により、酸化される場合には貴側にシフトし、還元される場合には卑側にシフトする酵素センサー。
  2. 　前記被測定物質と前記酵素との反応によって生成した生成物によって、前記酸化還元物質が酸化又は還元される、請求項１に記載の酵素センサー。
  3. 　前記酵素が、前記反応により電子を授受できる酵素である、請求項１又は２に記載の酵素センサー。
  4. 　前記時間微分値ｄＶ／ｄｔから前記被測定物質の濃度の絶対値を算出するための下記線形関数（ｉ）により、前記時間微分値ｄＶ／ｄｔに対応する前記被測定物質の濃度の絶対値を経時的に算出する機構と、を含む、請求項１から３のいずれかの項に記載の酵素センサー。
    Figure JPOXMLDOC01-appb-M000001
     　上記線形関数（ｉ）中、Ｖは前記基準電極と前記作用電極との間の前記電位差、tは時間、ＣＭは被測定物質の濃度、Ａは比例定数である。
  5. 　前記作用電極上に前記酵素と前記酸化還元物質とが固定された酵素修飾電極は、
    　前記被測定物質と前記酵素との反応により前記酸化還元物質が酸化される場合は還元剤をさらに含み、
    　前記被測定物質と前記酵素との反応により前記酸化還元物質が還元される場合は酸化剤をさらに含む、請求項１から４のいずれかの項に記載の酵素センサー。
  6. 　前記電位差は、前記酸化還元物質が前被測定物質と前記酵素との反応により酸化されて貴側にシフトする、請求項１から５のいずれかの項に記載の酵素センサー。
  7. 　前記酵素センサーの電極系は、前記作用電極と対電極からなる二電極系、または、前記作用電極と対電極と参照電極からなる三電極系であり、
    　前記基準電極は、前記二電極系を構成する前記対電極、または前記三電極系を構成する前記参照電極である、請求項１から６のいずれかの項に記載の酵素センサー。
  8. 　前記酸化還元物質は、前記作用電極に接して配置された酸化還元層を構成し、前記酵素は、前記酸化還元層に接して配置された酵素固定化層を構成している、請求項１から７のいずれかの項に記載の酵素センサー。
  9. 　前記酸化還元層が導電性炭素材料を含む、請求項１から８のいずれかの項に記載の酵素センサー。
  10. 　前記導電性炭素材料がカーボンナノチューブを含む、請求項９に記載の酵素センサー。
  11. 　さらに、前記二電極系、前記三電極系のいずれにおいても、前記対電極と前記作用電極との間に所定の電圧を印可して、前記作用電極と前記対電極の間に電流を流すことを可能とする回路を含む、請求項７に記載の酵素センサー。
  12. 　算出された前記被測定物質の濃度の絶対値を表示する表示部をさらに含む、請求項４に記載の酵素センサー。
  13. 　請求項１から１２のいずれかに記載の酵素センサーを用いた被測定物質の測定方法であり、
    　前記作用電極と前記基準電極の両方に前記被測定物質を含む溶液を接触させること、
    　前記作用電極と前記基準電極とが電気接続され、且つ、前記作用電極と前記基準電極との間に電圧を印可していない状態で、前記基準電極と前記作用電極の電位差の時間微分値ｄＶ／ｄｔを経時的に得ること、
    　取得された前記時間微分値ｄＶ／ｄｔと下記線形関数（ｉ）を用いて前記被測定物質の濃度を算出すること、を含む被測定物質の測定方法。
    Figure JPOXMLDOC01-appb-M000002
     　上記線形関数（ｉ）中、Ｖは前記基準電極と前記作用電極との間の前記電位差、tは時間、ＣＭは被測定物質の濃度、Ａは比例定数である。
  14. 　請求項１１に記載の酵素センサーを用いた被測定物質の測定方法であり、
    　前記酵素センサーの電極系が、前記二電極系である場合は前記作用電極と前記対電極、前記被測定物質を含む溶液を接触させ、前記三電極系である場合は前記作用電極と前記対電極と前記参照電極を、前記被測定物質を含む溶液を接触させること、
    　前記酵素センサーの電極系が、前記二電極系である場合は前記作用電極と前記対電極が電気接続され、前記三電極系である場合は前記作用電極と前記対電極と前記参照電極が電気接続され、前記作用電極の電位が予め設定された所定の電位に達すると、前記二電極系、前記三電極系のいずれにおいても、前記対電極と前記作用電極との間に所定の電圧を印可して、前記作用電極と前記対電極の間に電流を流し、前記作用電極の電位を測定開始前の値にもどすこと、
    　前記基準電極と前記作用電極の電位差の時間微分値ｄＶ／ｄｔを経時的に得ること、
    　取得された前記時間微分値ｄＶ／ｄｔと下記線形関数（ｉ）を用いて前記被測定物質の濃度を算出すること、を含む被測定物質の測定方法。
    Figure JPOXMLDOC01-appb-M000003
     　上記線形関数（ｉ）中、Ｖは前記基準電極と前記作用電極との間の前記電位差、tは時間、ＣＭは被測定物質の濃度、Ａは比例定数である。
  15. 　被測定物質を含む溶液中の前記被測定物質の濃度を測定するための測定システムであり、
    　前記測定システムは、酵素センサーと信号処理機構と表示部とを含み、
    　前記酵素センサーは、
    　前記溶液に各々接しうる作用電極および基準電極と、
    　前記作用電極に各々固定された酵素および可逆的に酸化還元可能な酸化還元物質と、
    　前記被測定物質と前記酵素との反応に起因する前記酸化還元物質における酸化体と還元体の濃度変化によって生じる前記基準電極と前記作用電極との間の電位差を経時的に計測可能とする、計測部とを含み、
    　前記電位差は、前記酸化還元物質が前記被測定物質と前記酵素との反応により、酸化される場合には貴側にシフトし、還元される場合には卑側にシフトし、
    　前記信号処理機構は、前記電位差から下記線形関数(i)を用いて前記被測定物質の濃度を算出し、
    　前記表示部は前記信号処理機構が算出した前記被測定物質の濃度を表示し得る、測定システム。
    Figure JPOXMLDOC01-appb-M000004
     　上記線形関数（ｉ）中、Ｖは前記基準電極と前記作用電極との間の前記電位差、tは時間、ＣＭは被測定物質の濃度、Ａは比例定数である。
     
PCT/JP2024/018075 2023-05-19 2024-05-16 酵素センサー Ceased WO2024242007A1 (ja)

Priority Applications (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202480033485.6A CN121152969A (zh) 2023-05-19 2024-05-16 酶传感器
EP24811014.0A EP4715378A1 (en) 2023-05-19 2024-05-16 Enzyme sensor

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2023083361 2023-05-19
JP2023-083361 2023-05-19

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2024242007A1 true WO2024242007A1 (ja) 2024-11-28

Family

ID=93589421

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/JP2024/018075 Ceased WO2024242007A1 (ja) 2023-05-19 2024-05-16 酵素センサー

Country Status (4)

Country Link
EP (1) EP4715378A1 (ja)
JP (1) JP2024167067A (ja)
CN (1) CN121152969A (ja)
WO (1) WO2024242007A1 (ja)

Citations (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS62235557A (ja) * 1986-04-05 1987-10-15 Omron Tateisi Electronics Co 酵素電極
JPS62240849A (ja) * 1986-04-11 1987-10-21 Omron Tateisi Electronics Co 酵素電極
JPS6488244A (en) 1987-09-30 1989-04-03 Toshiba Corp Measuring apparatus of fet enzyme sensor
JP2008128803A (ja) * 2006-11-21 2008-06-05 Hitachi Ltd 電位差式センサ及び分析用素子
JP2010054378A (ja) * 2008-08-28 2010-03-11 Tanita Corp バイオセンサ、その製造方法、その使用方法
JP2015079004A (ja) * 2010-04-22 2015-04-23 アークレイ株式会社 バイオセンサ
JP2019132705A (ja) * 2018-01-31 2019-08-08 旭化成株式会社 電気化学測定方法、電気化学測定装置、プログラムおよびコンピュータ可読記録媒体
JP2019158650A (ja) 2018-03-14 2019-09-19 国立大学法人山形大学 トランジスタ型酵素センサ
JP2019203893A (ja) * 2018-05-22 2019-11-28 アークレイ株式会社 新規バイオセンシング法
JP2021113821A (ja) * 2016-08-29 2021-08-05 国立研究開発法人産業技術総合研究所 グルコースセンサ用試薬、グルコースセンサ、グルコースセンサの製造方法、および、グルコース測定装置
JP2023553889A (ja) 2020-12-07 2023-12-26 ザ ユニバーシティ オブ ノース カロライナ アット チャペル ヒル バイオセンサーにおける測定方法

Patent Citations (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS62235557A (ja) * 1986-04-05 1987-10-15 Omron Tateisi Electronics Co 酵素電極
JPS62240849A (ja) * 1986-04-11 1987-10-21 Omron Tateisi Electronics Co 酵素電極
JPS6488244A (en) 1987-09-30 1989-04-03 Toshiba Corp Measuring apparatus of fet enzyme sensor
JP2008128803A (ja) * 2006-11-21 2008-06-05 Hitachi Ltd 電位差式センサ及び分析用素子
JP2010054378A (ja) * 2008-08-28 2010-03-11 Tanita Corp バイオセンサ、その製造方法、その使用方法
JP2015079004A (ja) * 2010-04-22 2015-04-23 アークレイ株式会社 バイオセンサ
JP2021113821A (ja) * 2016-08-29 2021-08-05 国立研究開発法人産業技術総合研究所 グルコースセンサ用試薬、グルコースセンサ、グルコースセンサの製造方法、および、グルコース測定装置
JP2019132705A (ja) * 2018-01-31 2019-08-08 旭化成株式会社 電気化学測定方法、電気化学測定装置、プログラムおよびコンピュータ可読記録媒体
JP2019158650A (ja) 2018-03-14 2019-09-19 国立大学法人山形大学 トランジスタ型酵素センサ
JP2019203893A (ja) * 2018-05-22 2019-11-28 アークレイ株式会社 新規バイオセンシング法
JP2023553889A (ja) 2020-12-07 2023-12-26 ザ ユニバーシティ オブ ノース カロライナ アット チャペル ヒル バイオセンサーにおける測定方法

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
SONG, Y. ET AL.: "Design and preparation of open circuit potential biosensor for in vitro and in vivo glucose monitoring", ANAL BIOANAL CHEM, vol. 409, 2017, pages 161 - 168, XP036122925, DOI: doi.org/10.1007/ s 00216-016 -9982-1 *

Also Published As

Publication number Publication date
EP4715378A1 (en) 2026-03-25
CN121152969A (zh) 2025-12-16
JP2024167067A (ja) 2024-11-29

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Strakosas et al. A non-enzymatic glucose sensor enabled by bioelectronic pH control
JP7003103B2 (ja) 干渉補償型の２電極テストストリップ
Liu et al. An AgNP-deposited commercial electrochemistry test strip as a platform for urea detection
Cheng et al. A mediator‐free electroenzymatic sensing methodology to mitigate ionic and electroactive interferents' effects for reliable wearable metabolite and nutrient monitoring
Chaubey et al. Mediated biosensors
JP6435264B2 (ja) 電気化学式バイオセンサを用いた物質の測定方法及び測定装置
US11608515B2 (en) Biosensing method
Huang et al. A sensitive H2O2 biosensor based on carbon nanotubes/tetrathiafulvalene and its application in detecting NADH
JP6817111B2 (ja) 電気化学式バイオセンサを用いた物質の測定方法及び測定装置
EP3415634A1 (en) Biosensor and measuring method using the same
KR20060131836A (ko) 바이오센서에 대한 내부 참조물질로서의 산화성 화학종 및이의 사용방법
EP3447483B1 (en) Novel biosensing technology based on enzymatic electrochemical impedance measurement
Fang et al. An electrochemical biosensor of the ketone 3-β-hydroxybutyrate for potential diabetic patient management
JP2021156877A (ja) バイオセンサおよびそれを用いた測定方法
JP2024167067A (ja) 酵素センサー
US20150275389A1 (en) A Method For Forming An Optical Test Sensor
Hsu et al. Fabrication of a glucose biosensor based on inserted barrel plating gold electrodes
JP2025100045A (ja) トランジスタ型酵素センサー
US7794778B2 (en) Amperometric sensor for uric acid and method for the same
KR101109857B1 (ko) 더블 펄스 방식을 이용한 바이오센서
JP2026047825A (ja) 酵素センサー
KR20220098525A (ko) 바이오센서
TWI406940B (zh) 矩陣列奈米生物感測器
min Lee AMPEROMETRIC GLUCOSE BIOSENSORS: PAST, PRESENT AND FUTURE
Gupta et al. Molecular Nanomaterials Based Glucose Biosensor: An Overview

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 24811014

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2024811014

Country of ref document: EP

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 2024811014

Country of ref document: EP

Effective date: 20251219

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 2024811014

Country of ref document: EP

Effective date: 20251219

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 2024811014

Country of ref document: EP

Effective date: 20251219

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 2024811014

Country of ref document: EP

Effective date: 20251219

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 2024811014

Country of ref document: EP

Effective date: 20251219

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 2024811014

Country of ref document: EP

Effective date: 20251219

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 2024811014

Country of ref document: EP

Effective date: 20251219

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 2024811014

Country of ref document: EP

Effective date: 20251219

WWP Wipo information: published in national office

Ref document number: 2024811014

Country of ref document: EP