WO2024202045A1 - 腸管へのウイルス特異的な抗体誘導が可能なノロウイルスワクチン - Google Patents

腸管へのウイルス特異的な抗体誘導が可能なノロウイルスワクチン Download PDF

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    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/04—Immunostimulants

Definitions

  • the present invention relates to a norovirus vaccine that can induce a virus-specific antibody response in the intestinal mucosa.
  • Norovirus is one of the viruses that causes acute gastroenteritis and epidemic diarrhea, and is known to be transmitted mainly through human hands or food, causing symptoms such as vomiting, diarrhea, and abdominal pain. Norovirus infection is prevalent mainly in the winter, affecting more than 680 million people worldwide annually, with 200,000 deaths, mainly in developing countries. Vaccines are an effective method of preventing infection, but there is no vaccine against norovirus, and treatment is limited to symptomatic treatment.
  • Noroviruses are classified into 10 genogroups, of which the noroviruses detected in humans that infect them belong to Genogroup I (GI), Genogroup II (GII), and Genogroup IV (GIV), with the majority of human infections occurring being GI and GII.
  • GI and GII genogroups there are 9 genotypes for GI and 27 genotypes for GII, and it is believed that different genotypes fundamentally have different antigenicities.
  • there are many genotypes of norovirus and as genes mutate during epidemics, if the epidemic strain shifts to a new mutant strain or a different genotype, it could cause a large-scale infection.
  • Norovirus is a positive-sense, single-stranded RNA virus belonging to the Norovirus genus of the Caliciviridae family.
  • the genomic RNA of norovirus contains regions that code for three proteins: nonstructural protein ORF1, structural protein 1 (VP1): ORF2, and structural protein 2 (VP2): ORF3, with VP1 and VP2 constituting the viral capsid.
  • VP1 nonstructural protein
  • VP1 structural protein 1
  • VP2 structural protein 2
  • VLP antigens that uses VLPs as vaccine antigens, but one of the issues is that intramuscular injection of VLP antigens is capable of inducing systemic virus-specific IgG antibodies, but is reported to be unable to induce mucosal immunity in the intestinal mucosa, the site of norovirus infection. It has also been reported that IgA antibodies that protect against viral infection are not induced even when monophosphoryl lipid (MPL), a Th1-inducing adjuvant used in approved vaccines, or aluminum salts, a Th2-inducing adjuvant, are added (Non-Patent Document 1).
  • MPL monophosphoryl lipid
  • Th1-inducing adjuvant used in approved vaccines
  • aluminum salts a Th2-inducing adjuvant
  • Non-Patent Document 2 a randomized, double-blind, placebo-controlled study in healthy adults aged 18 to 50 years reported that after two intramuscular injections of a bivalent VLP vaccine containing adjuvants (MPL and Alum), symptoms were milder than in controls, but norovirus infection was confirmed in 54% of vaccinated individuals (Non-Patent Document 2). Therefore, norovirus vaccines that use VLPs as vaccine antigens are still in the development stage, and the development of more effective vaccines is desired.
  • MPL and Alum bivalent VLP vaccine containing adjuvants
  • the present invention relates to providing a norovirus vaccine that uses VLPs as vaccine antigens and induces virus-specific IgG and IgA antibodies in the intestinal mucosa.
  • the inventors of the present application have found that the addition of a specific adjuvant to a VLP antigen that is a candidate for a norovirus vaccine increases the ability to induce virus-specific IgG and IgA antibodies in the blood and intestinal mucosa, and that the addition of the adjuvant increases the receptor binding inhibitory activity (PGM binding inhibitory activity) of the antibodies induced in the blood.
  • PGM binding inhibitory activity receptor binding inhibitory activity
  • the present invention relates to the following 1) to 5).
  • a norovirus vaccine composition that induces virus-specific antibodies in the intestinal mucosa, the composition comprising a norovirus virus-like particle and a squalene-containing emulsion.
  • the present invention can provide a norovirus vaccine that uses VLPs as vaccine antigens, which are highly effective in inducing virus-specific antibodies in the intestinal mucosa, which is the gateway to viral infection, and provide excellent protection against infection, making a significant contribution to the pharmaceutical industry.
  • Serum IgG titers against GI.4-Chiba strains IgG titers against GI.4-Chiba strains in intestinal washings IgA titers against GI.4-Chiba strains in intestinal washings Serum IgG titers against GI.4-Chiba strain 3 weeks after single administration of vaccine Serum IgG titers against GII.4-Aomori strain 3 weeks after a single dose of vaccine Serum IgG titers against GI.4-Chiba strain 3 weeks after two doses of vaccine Serum IgG titers against GII.4-Aomori strain 3 weeks after two doses of vaccine IgG titers against GI.4-Chiba strains in intestinal washings 3 weeks after two doses of vaccine IgG titers against GII.4-Aomori strain in intestinal washings 3 weeks after two doses of vaccine IgA titers against GI.
  • a "norovirus vaccine” is a vaccine against human norovirus, and uses norovirus virus-like particles (VLPs) as a vaccine antigen.
  • VLPs are recombinant proteins produced by expressing a viral capsid in cells, and are virus-like hollow particles that are morphologically similar to norovirus and do not contain internal genes.
  • the norovirus used to prepare the VLP includes all currently known genogroup I (GI) and genogroup II (GII) genotypes and genotypes to be isolated and identified in the future, and can be appropriately selected and used.
  • the norovirus vaccine of the present invention may be a monovalent vaccine containing only one of the GI or GII genotypes, or a multivalent vaccine containing multiple genotypes.
  • a multivalent vaccine containing multiple GI and GII genotypes is preferable, and a multivalent vaccine containing one or more GI genotypes and one or more GII genotypes is more preferable.
  • the recombinant protein that forms the VLP refers to the norovirus structural protein VP1 or VP1 and VP2, and this VLP is produced using a baculovirus expression system, a mammalian cell expression system, or a plant expression system.
  • the insect cells used in the "baculovirus expression system” are not particularly limited as long as they are cell lines established from Lepidoptera insects, and examples thereof include silkworm cells (BmN cells, BmN4 cells, BoMo cells, etc.), Antheraea persica cells (Anpe cells), Spodoptera frugiperda cells (Sf9 cells and Sf21 cells, etc.), Antheraea mulberry webworm cells (SpIm cells), and Antheraea gracilis cells (Tn-5 cells, HIGH FIVE cells, MG1 cells, etc.). Improved insect cell lines derived by modifying these cells are also included.
  • the norovirus vaccine antigen prepared using the above-mentioned insect cells is, for example, infected with a recombinant baculovirus, cultured at 26 to 28° C. for about 5 to 10 days, and after completion of the culture, the culture supernatant of the infected cells is collected and centrifuged and filtered for clarification. Then, ultrafiltration for concentration and purification can be performed using means such as density gradient centrifugation and chromatography.
  • the norovirus vaccine composition of the present invention contains the above-mentioned VLP, which is a vaccine antigen, and a squalene-containing emulsion.
  • the squalene-containing emulsion is known as an adjuvant that activates both Th1 and Th2.
  • the squalene-containing emulsion is an oil-in-water emulsion containing 3 to 15 mg, preferably 5 to 10 mg, of squalene per dose, and may contain, in addition to squalene, a surfactant (e.g., polyoxyethylene sorbitan monooleate, sorbitan trioleate, etc.), an antioxidant such as tocopherol, an immunostimulant, etc.
  • a surfactant e.g., polyoxyethylene sorbitan monooleate, sorbitan trioleate, etc.
  • an antioxidant such as tocopherol, an immunostimulant, etc.
  • the squalene-containing emulsion may be a nanoemulsion formulated to have particles of less than 1 micron.
  • examples of commercially available products include Addavax (trademark) (InvivoGen, Inc.; hereinafter, referred to as "Addavax”), Ribi (Sigma), and MF59 (trademark).
  • the norovirus vaccine composition of the present invention preferably uses a cell membrane-permeable peptide nucleic acid (CPP-PNA) in addition to the VLP and the squalene-containing emulsion from the viewpoint of improving the IgG antibody titer and the IgA antibody titer on the intestinal mucosa.
  • the cell membrane-permeable peptide nucleic acid means a molecule in which a peptide nucleic acid (PNA) is bound to the N- or C-terminus of a cell membrane-permeable peptide (CPP).
  • CPP-PNA examples include a substance represented by the following formula (1) in which a peptide (SEQ ID NO: 1) consisting of 13 amino acids derived from HIV TAT is covalently bound to C10PNA at its C-terminus.
  • CPP-PNA can be produced by covalently bonding the N-terminus of CPP and the N-terminus of PNA via a crosslinker having N-hydroxysuccinimide ester at both ends at the N- or C-terminus of CPP using a chemical method.
  • PNA can be synthesized using, for example, an Fmoc-type PNA monomer unit or the like by utilizing a solid-phase peptide synthesis method known in the art.
  • the norovirus vaccine composition of the present invention may further contain a medicamentously acceptable carrier.
  • a medicamentously acceptable carrier include carriers that are commonly used in the manufacture of vaccines, specifically, buffers, emulsifiers, preservatives (e.g., thimerosal), isotonicity agents, pH adjusters, inactivating agents (e.g., formalin), adjuvants other than squalene-containing emulsions, immunostimulants, etc.
  • the amount of antigen contained in the norovirus vaccine composition of the present invention is not particularly limited as long as it is an amount sufficient to induce a specific antibody response, for example, 15 ⁇ g VP1/strain or more, preferably 50 ⁇ g VP1/strain or more, and can be appropriately set taking into consideration the ratio with the squalene-containing emulsion used in combination. That is, the amount of antigen contained in the norovirus vaccine of the present invention can be prepared so that the dose per administration is, for example, 15 to 150 ⁇ g VP1 (in VP1 equivalent), preferably 50 to 100 ⁇ g VP1 (in VP1 equivalent).
  • the norovirus vaccine composition of the present invention may be administered once or twice or more, preferably multiple times, with intervals of 1 to 4 weeks between administrations.
  • the volume of the norovirus vaccine composition of the present invention administered at one time is determined by the administration site and administration device, but is usually about 0.05 to 1.0 mL, and preferably 0.2 to 0.5 mL.
  • the norovirus vaccine composition of the present invention is administered parenterally, preferably by injection.
  • injection include subcutaneous, intramuscular, intradermal, and intravenous administration.
  • Subjects to which the norovirus vaccine composition of the present invention is administered include humans and non-human mammals, with humans being preferred.
  • non-human mammals include pigs, orangutans, chimpanzees, etc.
  • a virus removal filter (0.1 ⁇ m). After this virus removal, a fraction containing VP1 was collected by cesium density gradient centrifugation, and again concentrated by ultrafiltration and replaced with 15 w / w% sucrose-containing phosphate buffered saline (pH 7.2). The purified VLPs were ultracentrifuged at 26,000 ⁇ g for 30 minutes, and the supernatant was filtered through a virus removal filter (0.1 ⁇ m) to prepare a vaccine antigen.
  • the administration solution (Table 1) was administered subcutaneously to BALB/c mice at 0.3 mL per mouse once or twice at 3-week intervals. 21 and 42 days after the first administration, whole blood was collected (from 8 mice per time point) and intestinal lavage fluid was collected. Serum was prepared from the collected blood by centrifugation. In addition, intestinal lavage fluid was prepared by removing approximately 10 cm of the small intestine, inserting a pipette into the lumen of the removed small intestine, and pouring in 1 mL of D-PBS containing 0.175% BSA and protease inhibitor (Thermo Fisher Scientific), and the collected solution was used as intestinal lavage fluid. The serum was used to measure the IgG titer binding to GI.4 (Chiba strain), and the intestinal lavage fluid was used to measure the IgG and IgA titers binding to GI.4 (Chiba strain).
  • the virus-specific IgG titer of the serum is shown in FIG. 1, and it was confirmed that the IgG antibody titer was increased dose-dependently at 15 ⁇ g to 150 ⁇ g in a comparison of the single-administration group. On the other hand, the IgG titer was similar at 15 ⁇ g to 150 ⁇ g in a double-administration.
  • the virus-specific IgG titer in the intestinal mucosa, which is the site of infection with norovirus, is shown in FIG. 2A, and the IgA titer is shown in FIG. 2B.
  • the IgG antibody titer of the intestinal lavage solution was confirmed to be increased dose-dependently at 15 ⁇ g to 150 ⁇ g in a comparison of the single-administration group.
  • no clear antibody induction was confirmed for the IgA antibody titer at any dose or number of administrations.
  • Example 1 Adjuvant Evaluation Test VLPs of GI.4 (Chiba strain) and GII.4 (Aomori strain) were mixed with an adjuvant so that VP1 protein was 50 ⁇ g VP1 per 0.4 mL.
  • the adjuvants used here were Alum, which has a proven track record as an adjuvant for norovirus vaccines, Addavax, a squalene-containing emulsion, ODN1826, a TLR9 agonist, and CPP-PNA of the formula (1) in which C10PNA is covalently bonded to a peptide consisting of 13 amino acids derived from HIV TAT.
  • a control solution containing only the antigen without the addition of an adjuvant was also prepared.
  • the dosing solution (Table 2) prepared as described above was administered subcutaneously to BALB/c mice at 0.4 mL per mouse once or twice at 3-week intervals. 21 days after the first administration, 120 ⁇ L of blood was collected from the jugular vein, and 42 days after the first administration (21 days after the second administration), whole blood was collected (from 8 mice per time point) and intestinal lavage fluid was collected. The collected blood was centrifuged to prepare serum, and the IgG titer binding to GI.4 (Chiba strain) or GII.4 (Aomori strain) and the PGM binding inhibitory activity of the serum were measured. In addition, the IgG titer and IgA titer binding to GI.4 (Chiba strain) or GII.4 (Aomori strain) were measured for the intestinal lavage fluid.
  • the serum IgG titers after a single administration are shown in Figures 3A and 3B.
  • GI. 4 Choba strain
  • GII. 4 Aomori strain
  • antibody induction was confirmed to be significantly improved in all adjuvant-administered groups compared to the non-adjuvant-administered group.
  • Alum which has a proven track record as an adjuvant for norovirus vaccines
  • antibody induction was confirmed to be significantly improved in the Addavax-administered group for GI.
  • the IgG titers of serum after two doses are shown in Figures 4A and 4B.
  • As with one dose it was confirmed that antibody induction was significantly improved in all adjuvant-administered groups after two doses compared to the non-adjuvant-administered groups for both GI. 4 (Chiba strain) and GII. 4 (Aomori strain).
  • As compared with the Alum-administered groups it was confirmed that antibody induction was significantly improved in the Addavax-administered group for GI. 4 (Chiba strain), and in the Addavax-administered group and the Adavax and CPP-PNA co-administered group for GII. 4 (Aomori strain).
  • the ODN1826 and CPP-PNA co-administered group showed antibody induction at the same level as Alum.
  • the IgG titers in the intestinal lavage fluid after two doses are shown in Figures 5A and 5B.
  • the IgA titers of the intestinal lavage fluid administered twice are shown in Figures 6A and 6B.
  • GI.4 Choba strain
  • GII.4 Himori strain
  • the non-adjuvant-administered groups did not induce IgA antibodies in the intestinal tract, or induced them at a very low level.
  • the induction of IgA antibodies was significantly improved in all adjuvant-administered groups compared to the non-adjuvant-administered groups, and among them, it was found that the antibody induction was significantly improved in the Addavax-administered group and the Addavax and CPP-PNA co-administered group.
  • the ODN1826 and CPP-PNA co-administered group showed a higher antibody titer than the non-adjuvant-administered group and Alum, but the antibody titers were inferior to those of Addavax and the Addavax and CPP-PNA co-administered group.
  • the PGM binding inhibitory activity of the serum administered twice is shown in Figures 7A and 7B. It was confirmed that the PGM binding inhibitory activity of both GI.4 (Chiba strain) and GII.4 (Aomori strain) was significantly improved in all adjuvant-administered groups compared to the non-adjuvant-administered group. In addition, in comparison with Alum, it was confirmed that antibody induction was significantly improved in the Addavax-administered group and the Addavax and CPP-PNA co-administered group in GII.4 (Aomori strain). However, the ODN1826 and CPP-PNA co-administered group had the same level of antibody induction as Alum.
  • the norovirus vaccine in which the squalene-containing emulsion Addavax or a mixed adjuvant of Addavax and cell membrane-permeable peptide nucleic acid (CPP-PNA) was added to the antigen not only improved the serum IgG antibody titer and PGM binding inhibitory activity, but also improved the IgG antibody titer and IgA antibody titer on the intestinal mucosa, which is the site of norovirus infection. Therefore, it was suggested that the norovirus vaccine of the present invention may be an excellent vaccine for preventing norovirus infection in the intestinal tract.

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Abstract

腸管粘膜にウイルス特異的なＩｇＧ抗体やＩｇＡ抗体を誘導する、ＶＬＰをワクチン抗原とするノロウイルスワクチンを提供する。　腸管粘膜にウイルス特異的抗体を誘導するノロウイルスワクチン組成物であって、ノロウイルスウイルス様粒子及びスクワレン含有エマルジョンを含む組成物。

Description

腸管へのウイルス特異的な抗体誘導が可能なノロウイルスワクチン
　本発明は、腸管粘膜にウイルス特異的な抗体応答を誘導可能なノロウイルスワクチンに関する。
　ノロウイルスは急性胃腸炎や流行性下痢症の原因ウイルスの１つであり、主にヒトの手指や食品などを介して感染し、嘔吐、下痢、腹痛などの症状を引き起こすことが知られている。ノロウイルス感染症は主に冬季で流行し、世界では年間６．８億人以上が罹患して発展途上国を中心に２０万人が死亡している。感染症の有効な予防法はワクチンであるが、ノロウイルスに対するワクチンはなく、治療法も対症療法に限られている。
　ノロウイルスは１０つの遺伝子群に分類されており、そのうちヒトに感染して検出されるノロウイルスはＧｅｎｏｇｒｏｕｐＩ（ＧＩ）、ＧｅｎｏｇｒｏｕｐＩＩ（ＧＩＩ）及びＧｅｎｏｇｒｏｕｐＩＶ（ＧＩＶ）に属しており、そのなかでもヒトの感染例の大半はＧＩとＧＩＩである。このＧＩ及びＧＩＩの各遺伝子群には、ＧＩで９種類、ＧＩＩで２７種類の遺伝子型に分類されており、異なる遺伝子型では基本的には抗原性も異なると考えられている。このようにノロウイルスには多くの遺伝子型が存在しているうえ、流行の中で遺伝子の変異を起こしているため、流行株が新たな変異株や別の遺伝子型にシフトした場合、大規模な感染を引き起こす可能性がある。
　ノロウイルスはカリシウイルス科ノロウイルス属に属するプラス鎖の一本鎖ＲＮＡウイルスである。ノロウイルスのゲノムＲＮＡは非構造タンパク質：ＯＲＦ１、構造タンパク質１（ＶＰ１）：ＯＲＦ２、構造タンパク質２（ＶＰ２）：ＯＲＦ３の３つのタンパク質をコードする領域が存在し、ＶＰ１及びＶＰ２はウイルスのカプシドを構成する。ＶＰ１遺伝子を導入した細胞では、感染性を有するウイルスと形態学的に類似したウイルス様中空粒子（ＶＬＰ：Ｖｉｒｕｓ　Ｌｉｋｅ　Ｐａｒｔｉｃｌｅ）を形成することが知られており、このＶＬＰは内部に遺伝子を持たないため感染性はないが、抗原性を有するためノロウイルスに対するワクチン抗原として期待されている（特許文献１及び特許文献２）。　
　ＶＬＰをワクチン抗原としたノロウイルスワクチンの実用化するにあたり研究開発が進んでいるが、その課題の１つとして、ＶＬＰ抗原の筋肉内注射では、全身性のウイルス特異的なＩｇＧ抗体を誘導することが可能だが、ノロウイルスの感染部位である腸管粘膜において粘膜免疫を誘導できないことが報告されている。また、ウイルス感染を防御するＩｇＡ抗体は、既承認のワクチンで使用されるＴｈ１誘導型アジュバントであるＭＰＬ（ｍｏｎｏｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌ　ｌｉｐｉｄ）やＴｈ２誘導型アジュバントであるアルミニウム塩を加えた場合においても、誘導されないことが報告されている（非特許文献１）。　
　さらに、１８～５０歳の健常成人によるランダム化二重盲検プラセボ対照試験では、アジュバント（ＭＰＬ及びＡｌｕｍ）を加えた２価ＶＬＰワクチンの２回の筋肉内注射において、対照に比べて症状が軽症であったものの、ワクチン接種者で５４％のノロウイルス感染が確認されたことが報告されている（非特許文献２）。
　したがって、ＶＬＰをワクチン抗原とするノロウイルスワクチンは未だ開発段階であり、より有効性の高いワクチンの開発が望まれている。
特開２０１３－２３４１８８号公報 特表２０１４－５２０８５２号公報
Suvi Heinimaki, Maria Malm, Timo Vesikari, and Vesna Blazevic. Parenterally Administered Norovirus GII.4 Virus-Like Particle Vaccine Formulated with Aluminum Hydroxide or Monophosphoryl Lipid A Adjuvants Induces Systemic but Not Mucosal Immune Responses in Mice. J Immunol Res. 2018 Feb 28;2018:3487095. Bernstein DI, Atmar RL, Lyon GM, Toreador JJ, Chen WH, Jiang X, Vinje J, Gregarious N, Franck RW Jr, Moe CL, Al-Ibrahim MS, Barrett J, Ferreira J, Estes MK, Graham DY, Goodwin R, Borkowskia, Clemens R, Mendel man PM. Norovirus Vaccine Against Experimental Human GII.４ Virus Illness: A Challenge Study in Healthy Adults. J Infect Dis. 2015 Mar 15;211(6):870-8.
　本発明は、腸管粘膜にウイルス特異的なＩｇＧ抗体やＩｇＡ抗体を誘導する、ＶＬＰをワクチン抗原とするノロウイルスワクチンを提供することに関する。
　本願発明者らは、鋭意研究の結果、ノロウイルスワクチンの候補となるＶＬＰ抗原に特定のアジュバントを加えると、血中及び腸管粘膜のウイルス特異的なＩｇＧ及びＩｇＡ抗体誘導能が高くなること、また、当該アジュバントの添加により血中に誘導される抗体のレセプター結合阻害活性（ＰＧＭ結合阻害活性）が高まることを見いだした。
　すなわち、本発明は以下の１）～５）に係るものである。
　１）腸管粘膜にウイルス特異的抗体を誘導するノロウイルスワクチン組成物であって、ノロウイルスウイルス様粒子及びスクワレン含有エマルジョンを含む組成物。
　２）ノロウイルスウイルス様粒子がＧｅｎｏｇｒｏｕｐＩ又はＧｅｎｏｇｒｏｕｐＩＩのいずれか又は両方のノロウイルスから作製されたものである、１）の組成物。
　３）さらに、細胞膜透過ペプチド核酸を含有する、１）又は２）の組成物。
　４）ノロウイルスウイルス様粒子をＶＰ１タンパク質含量として１株あたり１５μｇ以上含有する、１）～３）のいずれかの組成物。
　５）非経口投与によって投与される、１）～４）のいずれかの組成物。
　本発明によれば、ウイルス感染の門戸である腸管粘膜におけるウイルス特異的な抗体誘導が高く、感染防御に優れたＶＬＰをワクチン抗原とするノロウイルスワクチンを提供でき、医薬品業界に大きく貢献できる。
血清のＧＩ．４－Ｃｈｉｂａ株に対するＩｇＧ力価 腸洗浄液のＧＩ．４－Ｃｈｉｂａ株に対するＩｇＧ力価 腸洗浄液のＧＩ．４－Ｃｈｉｂａ株に対するＩｇＡ力価 ワクチンの１回投与３週間後の血清のＧＩ．４－Ｃｈｉｂａ株に対するＩｇＧ力価 ワクチンの１回投与３週間後の血清のＧＩＩ．４－Ａｏｍｏｒｉ株に対するＩｇＧ力価 ワクチンの２回投与３週間後の血清のＧＩ．４－Ｃｈｉｂａ株に対するＩｇＧ力価 ワクチンの２回投与３週間後の血清のＧＩＩ．４－Ａｏｍｏｒｉ株に対するＩｇＧ力価 ワクチンの２回投与３週間後の腸洗浄液のＧＩ．４－Ｃｈｉｂａ株に対するＩｇＧ力価 ワクチンの２回投与３週間後の腸洗浄液のＧＩＩ．４－Ａｏｍｏｒｉ株に対するＩｇＧ力価 ワクチンの２回投与３週間後の腸洗浄液のＧＩ．４－Ｃｈｉｂａ株に対するＩｇＡ力価 ワクチンの２回投与３週間後の腸洗浄液のＧＩＩ．４－Ａｏｍｏｒｉ株に対するＩｇＡ力価 ワクチンの２回投与３週間後の血清のＧＩ．４－Ｃｈｉｂａ株に対するＰＧＭ結合阻害活性 ワクチンの２回投与３週間後の血清のＧＩＩ．４－Ａｏｍｏｒｉ株に対するＰＧＭ結合阻害活性
　以下に本発明の好適な実施形態について詳細に説明する。ただし、本発明は以下の実施形態に限定されるものではない。
　本発明において、「ノロウイルスワクチン」とは、ヒトノロウイルスのワクチンであり、ノロウイルスウイルス様粒子（ＶＬＰ）をワクチン抗原とする。
　ＶＬＰは、ウイルスのカプシドを細胞中で発現させた組換えタンパク質であり、ノロウイルスに形態的に類似し、内部に遺伝子を持たないウイルス様中空粒子である。
　ＶＬＰの作製に用いられるノロウイルスとしては、現在知られているすべてのＧｅｎｏｇｒｏｕｐＩ（ＧＩ）及びＧｅｎｏｇｒｏｕｐＩＩ（ＧＩＩ）の遺伝子型及び将来単離、同定される遺伝子型を包含し、適宜選択して使用することができる。すなわち、本発明のノロウイルスワクチンは、ＧＩ又はＧＩＩの一方のみの遺伝子型を含む単価ワクチンでもよく、複数の遺伝子型を含む多価ワクチンであっても良い。好ましくはＧＩ及びＧＩＩの複数の遺伝子型を含む多価ワクチンであり、より好ましくはＧＩから１種類以上の遺伝子型及びＧＩＩから１種類以上の遺伝子型を含む多価ワクチンである。
　ＶＬＰを形成する組換えタンパク質は、ノロウイルスの構造タンパク質であるＶＰ１又は、ＶＰ１及びＶＰ２を指し、このＶＬＰはバキュロウイルス発現システム、哺乳類細胞発現システム又は植物発現システムを用いて生産される。
　「バキュロウイルス発現システム」で使用する昆虫細胞はチョウ目昆虫から樹立した細胞株であれば特に限定されず、例えば、カイコ細胞（ＢｍＮ細胞、ＢｍＮ４細胞、ＢｏＭｏ細胞等）、サクサン細胞（Ａｎｐｅ細胞）、スポドプテラ・フルギペルーダ細胞（Ｓｆ９細胞及びＳｆ２１細胞等）、クワゴマダラヒトリ細胞（ＳｐＩｍ細胞）、イラクサキンウワバ細胞（Ｔｎ－５細胞、ＨＩＧＨ　ＦＩＶＥ細胞、ＭＧ１細胞等）等が挙げられる。また、これらの細胞に改変を加え派生した改良型の昆虫細胞株も包含される。
　上記昆虫細胞を使用して調製されるノロウイルスワクチン抗原は、例えば、組換えバキュロウイルス感染後、２６～２８℃で５～１０日間程度の培養が行われ、培養終了後、感染細胞の培養上清が回収され、清澄化のため遠心分離及び濾過が行われる。次いで、濃縮のための限外濾過、並びに精製は密度勾配遠心分離やクロマトグラフィー等の手段を用いて行うことができる。
　後述する参考例１に示すとおり、ＶＬＰワクチン抗原としてＶＰ１タンパク質を１株あたり１５μｇ～１５０μｇで皮下投与した場合、１回投与においては１５μｇから１５０μｇまで用量依存的にＩｇＧ抗体誘導が向上したが、２回投与においては、いずれの用量でも同程度のＩｇＧ抗体誘導を示した（図１）。したがって、投与回数が２回では、ＶＰ１タンパク質１株あたり１５μｇ以上はＩｇＧ抗体誘導に大きな差はなく、いずれも高いＩｇＧ抗体誘導能を有している。
　本発明のノロウイルスワクチン組成物は、ワクチン抗原である上記のＶＬＰとスクワレン含有エマルジョンを含有する。スクワレン含有エマルジョンは、Ｔｈ１及びＴｈ２のいずれも活性化するアジュバントとして知られている。
　スクワレン含有エマルジョンは、スクワレンを投与当りに３～１５ｍｇ、好ましくは５～１０ｍｇ含有する水中油型乳濁液であり、スクワレンの他に界面活性剤（例えば、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート、ソルビタントリオレエート等）、トコフェロール等の抗酸化剤、免疫賦活剤等を含有することもできる。スクワレン含有エマルジョンは１ミクロン未満の粒子になるように処方されたナノ乳剤であり得る。
　市販品としては、例えばＡｄｄａｖａｘ（商標）（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ社；以下、「Ａｄｄａｖａｘ」と称する）、Ｒｉｂｉ（Ｓｉｇｍａ社）、ＭＦ５９（商標）等が挙げられる。
　本発明のノロウイルスワクチン組成物は、ＶＬＰとスクワレン含有エマルジョンに加えて、細胞膜透過ペプチド核酸（ＣＰＰ－ＰＮＡ）を用いるのが、腸管粘膜上のＩｇＧ抗体価及びＩｇＡ抗体価の向上の点から好ましい。ここで、細胞膜透過ペプチド核酸とは、細胞膜透過性ペプチド（Ｃｅｌｌ　Ｐｅｎｅｔｒａｔｉｎｇ　Ｐｅｐｔｉｄｅ：ＣＰＰ）のＮ若しくはＣ末端にペプチド核酸（Ｐｅｐｔｉｄｅ－ｎｕｃｌｅｉｃ　ａｃｉｄ：ＰＮＡ）が結合した分子を意味する。ＣＰＰ－ＰＮＡとしては、例えば、ＨＩＶのＴＡＴ由来の１３アミノ酸からなるペプチド（配列番号１）がそのＣ末端で、Ｃ１０ＰＮＡと共有結合した下記式（１）で示される物質等が挙げられる。
　ＣＰＰ－ＰＮＡは、ＣＰＰのＮ若しくはＣ末端に、化学的手法、例えば、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミドエステルを両末端に有する架橋剤を介してＣＰＰとＰＮＡのＮ末端間を共有結合させることにより製造することができる。なお、ＰＮＡは、例えばＦｍｏｃ型ＰＮＡモノマーユニット等を用い、当技術分野で公知の固相ペプチド合成法を利用して合成することができる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000001
　本発明のノロウイルスワクチン組成物は、さらに医薬として許容され得る担体を含んでいてもよい。当該担体としては、ワクチンの製造に通常用いられる担体が挙げられ、具体的には、緩衝剤、乳化剤、保存剤（例えば、チメロサール）、等張化剤、ｐＨ調整剤、不活化剤（例えば、ホルマリン）、スクワレン含有エマルジョンを除くアジュバント、免疫刺激剤等が例示される。
　本発明のノロウイルスワクチン組成物に含まれる抗原の量は、特異的抗体応答を誘導するのに十分な量、例えば１５μｇＶＰ１／株以上、好ましくは５０μｇＶＰ１／株以上であれば特に限定されるものではなく、併用するスクワレン含有エマルジョンとの比率も勘案して適宜設定することができる。すなわち、本発明のノロウイルスワクチン中に含まれる抗原量は、例えば、１回の投与用量が１５～１５０μｇＶＰ１（ＶＰ１換算）、好ましくは５０～１００μｇＶＰ１（ＶＰ１換算）となるように調製することが挙げられる。
　また、本発明のノロウイルスワクチン組成物の投与回数は、１回又は２回以上の投与が挙げられ、好ましくは複数回の投与である。この場合、１～４週間の間隔をあけて投与することが好ましい。
　本発明のノロウイルスワクチン組成物の１回の投与容量としては、投与部位や投与デバイスによって決定されるが、通常、０．０５～１．０ｍＬ程度であり、好ましくは０．２～０．５ｍＬである。
　本発明のノロウイルスワクチン組成物は非経口投与によって投与され、好ましくは注射投与である。注射投与としては、例えば皮下投与、筋肉内投与、皮内投与、静脈内投与が挙げられる。
　本発明のノロウイルスワクチン組成物の投与対象は、ヒト及びヒトを除く哺乳動物が挙げられるが、ヒトが好ましい。ヒトを除く哺乳動物としては、例えば、ブタ、オランウータン、チンパンジー等が挙げられる。
　以下、本発明を実施例により具体的に説明するが、本発明はこれらに何ら限定されるものではない。
参考例１　ノロウイルスワクチンによるウイルス特異的ＩｇＧ及びＩｇＡの誘導
　ＧＩ．４（Ｃｈｉｂａ株）のＶＬＰを抗原とし、０．３ｍＬ当りにＶＰ１タンパク質が１５μｇ、５０μｇ、１００μｇ、又は１５０μｇとなるように１５ｗ／ｗ％しょ糖含有リン酸緩衝生理食塩液（ｐＨ７．２）で調製し、これをノロウイルスワクチンとした。
　本参考例で使用したＶＬＰの調製は以下に示す通りである。
　Ｈｉｇｈ　Ｆｉｖｅ細胞にウイルスシードをＭＯＩ＝１で感染させ、回収の前日にベンゾナーゼを添加し、２７℃で合計６日間撹拌培養した。培養終了後、回収した感染細胞の培養上清は遠心分離及びフィルター濾過にて清澄化させ、限外濾過により濃縮及び２ｗ／ｗ％しょ糖含有リン酸緩衝生理食塩液（ｐＨ７．２）へ置換した。バキュロウイルスの感染性を不活化するため、終濃度０．０５％となるように不活化剤であるベータプロピオラクトンを添加して、４℃、１２時間で反応させ、さらにウイルス除去フィルター（０．１μｍ）でバキュロウイルス粒子を除去した。このウイルス除去後に、セシウム密度勾配遠心でＶＰ１を含む画分を回収し、再度、限外濾過により濃縮及び１５ｗ／ｗ％しょ糖含有リン酸緩衝生理食塩液（ｐＨ７．２）へ置換した。この精製ＶＬＰを２６，０００×ｇで３０分間の超遠心後、さらに、上清をウイルス除去フィルター（０．１μｍ）で濾過して、これをワクチン抗原とした。
　上記の通りに投与液（表１）を、ＢＡＬＢ／ｃマウスの皮下へ１匹当り０．３ｍＬを１回若しくは３週間隔で２回皮下投与した。１回目投与から２１及び４２日後に全採血（各時点当り８匹より採血）及び腸洗浄液の回収を行った。採取した血液は、遠心分離により血清を調製した。また、腸洗浄液は小腸部位を約１０ｃｍ摘出し、摘出した小腸の管腔内にピペットマンを挿し込み、０．１７５％ＢＳＡ及びプロテアーゼインヒビター（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）を含有するＤ－ＰＢＳを１ｍＬ流し込み、回収した溶液を腸洗浄液とした。血清は、ＧＩ．４（Ｃｈｉｂａ株）に結合するＩｇＧ力価測定、腸洗浄液はＧＩ．４（Ｃｈｉｂａ株）に結合するＩｇＧ及びＩｇＡ力価測定に供した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　血清のウイルス特異的なＩｇＧ力価は図１に示す通りであり、１回投与群の比較では１５μｇから１５０μｇにおいてＩｇＧ抗体価が用量依存的に向上することが確認された。一方で、２回投与においては１５μｇから１５０μｇでＩｇＧ力価は同程度であった。また、ノロウイルスの感染局所である腸管粘膜におけるウイルス特異的なＩｇＧ力価は図２Ａ、ＩｇＡ力価は図２Ｂに示す通りである。腸洗浄液のＩｇＧ抗体価は血清と同様に、１回投与群の比較では１５μｇから１５０μｇにおいてＩｇＧ抗体価が用量依存的に向上することが確認された。しかし、ＩｇＡ抗体価はいずれの用量及び投与回数においても明確な抗体誘導は確認されなかった。
　この結果より、ＶＰ１タンパク質１株あたり１５μｇ以上においては、複数回の投与を行うことでＩｇＧ抗体誘導に大きな差はなく、いずれも高いＩｇＧ抗体誘導能を示したが、ノロウイルス抗原（ＶＬＰ）のみでは腸管粘膜に特異的なＩｇＡ抗体を誘導することが難しいと考えられた。
　実施例１　アジュバント評価試験
　ＧＩ．４（Ｃｈｉｂａ株）及びＧＩＩ．４（Ａｏｍｏｒｉ株）のＶＬＰを、それぞれ０．４ｍＬ当りにＶＰ１タンパク質が５０μｇＶＰ１となるようアジュバントを混合した。ここで用いたアジュバントは、ノロウイルスワクチンのアジュバントとして実績のあるＡｌｕｍ、スクワレン含有エマルジョンであるＡｄｄａｖａｘ、ＴＬＲ９アゴニストであるＯＤＮ１８２６、ＨＩＶのＴＡＴ由来の１３アミノ酸からなるペプチドにＣ１０ＰＮＡを共有結合した前記式（１）のＣＰＰ－ＰＮＡである。また、対照としてアジュバントを添加しない抗原のみの投与液も併せて調製した。
　上記の通りに調製した投与液（表２）を、ＢＡＬＢ／ｃマウスに１匹当り０．４ｍＬを１回若しくは３週間隔で２回皮下投与した。１回目投与から２１日後に頸静脈より１２０μＬの血液を採取し、１回目投与から４２日後（２回目投与から２１日後）に全採血（各時点当り８匹より採血）及び腸洗浄液を回収した。採取した血液は、遠心分離により血清を調製し、血清のＧＩ．４（Ｃｈｉｂａ株）又はＧＩＩ．４（Ａｏｍｏｒｉ株）に結合するＩｇＧ力価及びＰＧＭ結合阻害活性を測定した。また、腸洗浄液については、ＧＩ．４（Ｃｈｉｂａ株）又はＧＩＩ．４（Ａｏｍｏｒｉ株）に結合するＩｇＧ力価及びＩｇＡ力価を測定した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
　１回投与後の血清のＩｇＧ力価は図３Ａ及び図３Ｂに示す通りである。ＧＩ．４（Ｃｈｉｂａ株）及びＧＩＩ．４（Ａｏｍｏｒｉ株）のいずれも、アジュバント非投与群に比べて全てのアジュバント投与群において抗体誘導が有意に向上することを確認した。また、ノロウイルスワクチンのアジュバントとして実績のあるＡｌｕｍと比べて、ＧＩ．４（Ｃｈｉｂａ株）においては、Ａｄｄａｖａｘ投与群にて抗体誘導が有意に向上することを確認し、ＧＩＩ．４（Ａｏｍｏｒｉ株）においてはＡｄｄａｖａｘ投与群及びＡｄｄａｖａｘとＣＰＰ－ＰＮＡの共投与群において抗体誘導が有意に向上することを確認した。しかし、ＴＬＲ９のリガンドであるＯＤＮ１８２６とＣＰＰ－ＰＮＡの共投与群は、Ａｌｕｍと同程度の抗体誘導であった。
　２回投与の血清のＩｇＧ力価は図４Ａ及び図４Ｂに示す通りである。２回投与においても１回投与と同様に、ＧＩ．４（Ｃｈｉｂａ株）及びＧＩＩ．４（Ａｏｍｏｒｉ株）のいずれも、アジュバント非投与群に比べて全てのアジュバント投与群において抗体誘導が有意に向上することを確認した。また、Ａｌｕｍ投与群との比較においても、ＧＩ．４（Ｃｈｉｂａ株）ではＡｄｄａｖａｘ投与群、ＧＩＩ．４（Ａｏｍｏｒｉ株）ではＡｄｄａｖａｘ投与群及びＡｄｄａｖａｘとＣＰＰ－ＰＮＡの共投与群にて抗体誘導が有意に向上することを確認した。しかし、ＯＤＮ１８２６とＣＰＰ－ＰＮＡの共投与群は、Ａｌｕｍと同程度の抗体誘導であった。
　２回投与後の腸洗浄液のＩｇＧ力価は図５Ａ及び図５Ｂに示す通りである。血清と同様に、ＧＩ．４（Ｃｈｉｂａ株）及びＧＩＩ．４（Ａｏｍｏｒｉ株）のいずれも、アジュバント非投与群に比べて全てのアジュバント投与群において抗体誘導が有意に向上することを確認した。また、Ａｌｕｍに比べて、ＧＩ．４（Ｃｈｉｂａ株）においてはＡｄｄａｖａｘ投与群、又はＡｄｄａｖａｘ及びＣＰＰ－ＰＮＡ投与群、ＧＩＩ．４（Ａｏｍｏｒｉ株）においてはＡｄｄａｖａｘ投与群にて抗体誘導が有意に向上することを確認した。しかし、ＯＤＮ１８２６とＣＰＰ－ＰＮＡの共投与群は、Ａｌｕｍと同程度の抗体誘導であった。
　２回投与の腸洗浄液のＩｇＡ力価は図６Ａ及び図６Ｂに示す通りである。ＧＩ．４（Ｃｈｉｂａ株）及びＧＩＩ．４（Ａｏｍｏｒｉ株）のいずれも、アジュバント非投与群は腸管へＩｇＡ抗体を誘導しない、若しくは誘導が非常に低いことが確認された。しかし、アジュバント非投与群に比べて、全てのアジュバント投与群においてＩｇＡ抗体の誘導が有意に向上することを確認し、その中でも、Ａｄｄａｖａｘ投与群及びＡｄｄａｖａｘとＣＰＰ－ＰＮＡの共投与群では抗体誘導が有意に向上することがわかった。ＯＤＮ１８２６とＣＰＰ－ＰＮＡの共投与群については、アジュバント非投与群やＡｌｕｍに比べて高い抗体価を示したが、Ａｄｄａｖａｘ及びＡｄｄａｖａｘとＣＰＰ－ＰＮＡの共投与群の抗体価には劣る結果となった。
　２回投与の血清のＰＧＭ結合阻害活性は図７Ａ及び図７Ｂに示す通りである。ＧＩ．４（Ｃｈｉｂａ株）及びＧＩＩ．４（Ａｏｍｏｒｉ株）のいずれも、アジュバント非投与群に比べて全てのアジュバント投与群においてＰＧＭ結合阻害活性が有意に向上することを確認した。また、Ａｌｕｍとの比較においても、ＧＩＩ．４（Ａｏｍｏｒｉ株）ではＡｄｄａｖａｘ投与群及びＡｄｄａｖａｘとＣＰＰ－ＰＮＡの共投与群にて有意に抗体誘導が向上することが確認された。しかし、ＯＤＮ１８２６とＣＰＰ－ＰＮＡの共投与群は、Ａｌｕｍと同程度の抗体誘導であった。
　上記の結果より、抗原にスクワレン含有エマルジョンであるＡｄｄａｖａｘ又はＡｄｄａｖａｘと細胞膜透過ペプチド核酸（ＣＰＰ－ＰＮＡ）の混合アジュバントを添加したノロウイルスワクチンは、血清のＩｇＧ抗体価やＰＧＭ結合阻害活性が向上するだけでなく、ノロウイルスの感染局所である腸管粘膜上のＩｇＧ抗体価及びＩｇＡ抗体価も向上させることを確認した。したがって、本発明のノロウイルスワクチンは腸管におけるノロウイルスの感染防御に優れたワクチンとなる可能性が示唆された。

Claims (5)

  1. 　腸管粘膜にウイルス特異的抗体を誘導するノロウイルスワクチン組成物であって、ノロウイルスウイルス様粒子及びスクワレン含有エマルジョンを含む組成物。
  2. 　ノロウイルスウイルス様粒子がＧｅｎｏｇｒｏｕｐＩ又はＧｅｎｏｇｒｏｕｐＩＩのいずれか又は両方のノロウイルスから作製されたものである、請求項１記載の組成物。
  3. 　さらに、細胞膜透過ペプチド核酸を含有する、請求項１又は２記載の組成物。
  4. 　ノロウイルスウイルス様粒子をＶＰ１タンパク質含量として１株あたり１５μｇ以上含有する、請求項１～３のいずれか１項記載の組成物。
  5. 　非経口投与によって投与される、請求項１～４のいずれか１項記載の組成物。
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