WO2024190850A1 - 酸化ストレスによる傷害を受けた神経細胞の製造方法およびその応用 - Google Patents

酸化ストレスによる傷害を受けた神経細胞の製造方法およびその応用 Download PDF

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    • G01N2500/10—Screening for compounds of potential therapeutic value involving cells

Definitions

  • the present invention relates to a method for producing nerve cells damaged by oxidative stress, and a method for culturing the cells.
  • the present invention further relates to nerve cells damaged by oxidative stress.
  • the present invention further relates to a method for evaluating a test substance, a method for screening a preventive and/or therapeutic agent for a neurodegenerative disease, a method for screening a necroptosis inhibitor, and a method for screening a ferroptosis inhibitor, using the above-mentioned nerve cells.
  • Non-Patent Documents 1 and 2 Neurodegenerative diseases such as Alzheimer's disease (AD) and amyotrophic lateral sclerosis (ALS) are diseases in which nerve cells are gradually damaged and lost (Non-Patent Documents 1 and 2), and it is known that oxidative stress plays a major role in the pathological mechanism (Non-Patent Documents 3 and 4).
  • rat or mouse cells were traditionally used because it was difficult to obtain human central nervous system cells.
  • iPS cells induced pluripotent stem cells
  • Non-Patent Document 8 The effects of oxidative stress on neurodegenerative diseases are being studied using iPS cell-derived nerve cells. For example, in a study by Feng-Lan Chiu et al., oxidative stress was applied to iPS cell-derived nerve cells by treating them with hydrogen peroxide for 6 hours, reproducing nerve cell damage in neurodegenerative diseases (Non-Patent Document 8).
  • Patent Document 1 describes that damage is induced in motor nerves created from iPS cells derived from familial ALS patients by treating them with arsenite for 16 hours.
  • Patent Document 2 describes that motor nerve cells created from human-derived iPS cells are damaged by transient treatment with hydrogen peroxide.
  • neurodegenerative diseases are diseases in which nerve cells gradually fall out over a long period of time
  • conditions using oxidizing agents such as hydrogen peroxide cause nerve damage by short-term oxidative stress stimulation, so there is a possibility that the pathology of neurodegenerative diseases that actually occur in living organisms cannot be reproduced.
  • Non-Patent Document 9 neuronal damage was induced only when weak oxidative stress was applied and the disease-related gene was knocked out, so it is thought that familial neurodegenerative diseases are reproduced.
  • Patent Document 3 and Non-Patent Document 10 describe that oxidative stress is enhanced in cerebral cortical neurons created from iPS cells derived from familial AD patients when they are cultured in a medium that does not contain antioxidants, causing neuronal damage.
  • Non-Patent Document 11 95% of neurodegenerative diseases, such as AD (Non-Patent Document 11), and 90% of ALS (Non-Patent Document 12), are sporadic, and the majority of patients have no mutations in disease-related genes. Therefore, there is a demand for an evaluation system that can easily reproduce the pathology of sporadic neurodegenerative diseases, but satisfactory results have not been obtained.
  • the present invention aims to provide a method for producing nerve cells damaged by oxidative stress from human-derived pluripotent stem cells, and a cell culture method capable of producing nerve cells damaged by oxidative stress from human-derived pluripotent stem cells.
  • a further object of the present invention is to provide nerve cells damaged by oxidative stress.
  • a further object of the present invention is to provide a method for evaluating a test substance, a method for screening a preventive and/or therapeutic agent for neurodegenerative disease, a method for screening a necroptosis inhibitor, and a method for screening a ferroptosis inhibitor, using the above-mentioned nerve cells.
  • nerve cells damaged by oxidative stress can be produced by seeding nerve cells induced to differentiate from human-derived pluripotent stem cells at a cell density of 20.0 x 104 cells/ cm2 or less in a culture medium substantially free of antioxidants and substantially free of oxidants, and further culturing the cells in a culture medium substantially free of antioxidants and substantially free of oxidants.
  • the present invention was completed based on these findings.
  • a method for producing nerve cells damaged by oxidative stress comprising: step a) seeding nerve cells, which have been induced to differentiate from human-derived pluripotent stem cells, at a cell density of 20.0 x 104 cells/ cm2 or less using a culture medium that is substantially free of antioxidants and substantially free of oxidants; and step b) culturing the nerve cells using a culture medium that is substantially free of antioxidants and substantially free of oxidants.
  • the cell density is 0.2 x 10 4 cells/cm 2 or more and 20.0 x 10 4 cells/cm 2 or less.
  • ⁇ 3> The method according to ⁇ 1> or ⁇ 2>, wherein the human-derived pluripotent stem cells are pluripotent stem cells that have no mutation in a disease-related gene.
  • ⁇ 4> The method according to any one of ⁇ 1> to ⁇ 3>, wherein the nerve cells are motor nerve cells, cerebral cortical excitatory nerve cells, or substantia nigra nerve cells.
  • Nerve cells damaged by oxidative stress exhibit the following (i) to (iv): (i) positive markers related to oxidative stress; (ii) neurites are retracted; (iii) necroptosis is induced; and (iv) ferroptosis is induced:
  • a method for culturing cells comprising: step a) seeding neural cells, which have been induced to differentiate from human-derived pluripotent stem cells, at a cell density of 20.0 x 104 cells/ cm2 or less using a culture medium that is substantially free of antioxidants and substantially free of oxidizing agents; and step b) culturing the neural cells using a culture medium that is substantially free of antioxidants and substantially free of oxidizing agents.
  • ⁇ 7> The culture method according to ⁇ 6>, wherein the cell density is 0.2 x 10 4 cells/cm 2 or more and 20.0 x 10 4 cells/cm 2 or less.
  • ⁇ 8> The culture method according to ⁇ 6> or ⁇ 7>, wherein the human-derived pluripotent stem cells are pluripotent stem cells that have no mutation in a disease-related gene.
  • ⁇ 9> The culture method according to any one of ⁇ 6> to ⁇ 8>, wherein the nerve cells are motor nerve cells, cerebral cortical excitatory nerve cells, or substantia nigra nerve cells.
  • ⁇ 10> The following (i) to (iv) obtained by the production method according to ⁇ 1>: (i) positive markers related to oxidative stress; (ii) neurite length is retracted; (iii) necroptosis is induced; and (iv) ferroptosis is induced: A neuron that satisfies at least one of the above criteria.
  • a method for evaluating a test substance comprising contacting the nerve cell according to ⁇ 10> with the test substance.
  • ⁇ 13> A method for evaluating a test substance according to ⁇ 12>, further comprising producing the neuronal cell according to ⁇ 10> by the method according to ⁇ 1>, and contacting the neuronal cell with a test substance.
  • ⁇ 14> A method for screening for a preventive and/or therapeutic agent for a neurodegenerative disease, comprising contacting the neuron according to ⁇ 10> with a test substance.
  • ⁇ 16> The method of screening according to ⁇ 14>, wherein the neurodegenerative disease is selected from the group consisting of Alzheimer's disease (AD), spinocerebellar degeneration, frontotemporal lobar degeneration (FTLD), Parkinson's disease, amyotrophic lateral sclerosis (ALS), Lewy body disease, Huntington's disease, and Niemann-Pick disease.
  • AD Alzheimer's disease
  • FTLD frontotemporal lobar degeneration
  • Parkinson's disease amyotrophic lateral sclerosis
  • Lewy body disease Huntington's disease
  • Niemann-Pick disease the neurodegenerative disease is selected from the group consisting of Alzheimer's disease (AD), spinocerebellar degeneration, frontotemporal lobar degeneration (FTLD), Parkinson's disease, amyotrophic lateral sclerosis (ALS), Lewy body disease, Huntington's disease, and Niemann-Pick disease.
  • AD Alzheimer's disease
  • FTLD frontotemporal lobar degeneration
  • ⁇ 17> After contacting the nerve cell according to ⁇ 10> with a test substance, (A) culturing the neuronal cells contacted with the test substance and control neuronal cells not contacted with the test substance; (B) measuring nerve damage in the nerve cells; and (C) selecting a test substance that suppresses the nerve damage as compared to a control that has not been contacted with the test substance, as a candidate for a preventive and/or therapeutic drug for a neurodegenerative disease.
  • the screening method according to ⁇ 14> comprising: ⁇ 18> The screening method according to ⁇ 17>, wherein the step (B) is a step of measuring the number of cells and/or the neurite length of the nerve cells obtained in the step (A).
  • step (C) is a step of selecting a test substance that causes a higher cell number and/or neurite length of nerve cells contacted with the test substance than a control, as a candidate for a preventive and/or therapeutic drug for a neurodegenerative disease.
  • a step of contacting the nerve cell according to ⁇ 10> with a test substance (2) culturing the nerve cells contacted with the test substance in the above step (1) and control nerve cells not contacted with the test substance; (3) measuring nerve damage in the nerve cells; and (4) selecting a test substance that suppresses the nerve damage as a candidate for a necroptosis inhibitor, as compared to a control that has not been contacted with the test substance.
  • a method for screening for a necroptosis inhibitor comprising: ⁇ 21> The screening method according to ⁇ 20>, further comprising producing the neuronal cell according to ⁇ 10> by the method according to ⁇ 1>, and contacting the neuronal cell with a test substance.
  • a step of contacting the nerve cell according to ⁇ 10> with a test substance (2) culturing the nerve cells contacted with the test substance in the above step (1) and control nerve cells not contacted with the test substance; (3) measuring nerve damage in the nerve cells; and (4) selecting a test substance that suppresses the nerve damage as a candidate for a ferroptosis inhibitor, as compared to a control that has not been contacted with the test substance.
  • a method for screening for a ferroptosis inhibitor comprising: ⁇ 23> The screening method according to ⁇ 22>, further comprising producing the neuronal cell according to ⁇ 10> by the method according to ⁇ 1>, and contacting the neuronal cell with a test substance.
  • nerve cells damaged by oxidative stress can be produced from human-derived pluripotent stem cells.
  • FIG. 1 shows the results of quantifying the neurite length over time in nerve cells whose medium was replaced after 48 hours of culture.
  • FIG. 2 shows the results of quantifying the neurite length over time in nerve cells whose medium was replaced after 72 hours of culture.
  • FIG. 3 shows the results of quantifying the neurite length over time in nerve cells whose medium was replaced after 96 hours of culture.
  • FIG. 4 shows the results of quantifying the neurite length of nerve cells over time when cells were seeded at a cell seeding density of 0.3 ⁇ 10 4 cells/cm 2 .
  • FIG. 5 shows the results of quantifying the neurite length of nerve cells over time when cells were seeded at a cell seeding density of 0.9 ⁇ 10 4 cells/cm 2 .
  • FIG. 1 shows the results of quantifying the neurite length over time in nerve cells whose medium was replaced after 48 hours of culture.
  • FIG. 2 shows the results of quantifying the neurite length over time in nerve cells whose medium was replaced after 72 hours of culture.
  • FIG. 3 shows the results
  • FIG. 6 shows the results of quantifying the neurite length of nerve cells over time when cells were seeded at a cell seeding density of 1.9 ⁇ 10 4 cells/cm 2 .
  • FIG. 7 shows the results of quantifying the neurite length of nerve cells over time when cells were seeded at a cell seeding density of 4.7 ⁇ 10 4 cells/cm 2 .
  • FIG. 8 shows the results of quantifying the neurite length of nerve cells over time when cells were seeded at a cell seeding density of 9.4 ⁇ 10 4 cells/cm 2 .
  • FIG. 9 shows the results of quantifying the neurite length of nerve cells over time when cells were seeded at a cell seeding density of 12.5 ⁇ 10 4 cells/cm 2 .
  • FIG. 10 shows the results of quantifying the neurite length over time of nerve cells cultured using BrainPhys medium as the basal medium.
  • FIG. 11 shows the results of quantifying the neurite length over time of nerve cells cultured using Neurobasal medium as the basal medium.
  • FIG. 12 shows the results of quantifying the amount of LDH in the medium from the third to sixth days of culture.
  • FIG. 13 shows the results of quantifying intracellular ROS in nerve cells after 6 days of culture.
  • Figure 14 shows the results of quantifying the neurite length over time in neurons treated with a necroptosis inhibitor (Necrostatin-1), and images of representative cells.
  • Necrostatin-1 necroptosis inhibitor
  • FIG. 15 shows the results of quantifying the neurite length over time in nerve cells treated with a ferroptosis inhibitor (ferrostatin-1).
  • FIG. 16 shows the results of quantifying the neurite length over time in nerve cells treated with a ferroptosis inhibitor (riproxistatin-1).
  • FIG. 17 shows the results of quantifying the neurite length over time in nerve cells treated with a ferroptosis inhibitor (UAMC-3203).
  • FIG. 18 shows the results of calculating the area under the curve (AUC) from the time-course curve of neurite length over 14 days of nerve cells treated with various compounds from a compound library.
  • FIG. 19 shows the results of quantifying the neurite length over time in nerve cells treated with an ALS therapeutic drug (edaravone).
  • the present invention relates to a method for producing nerve cells damaged by oxidative stress, comprising step a of seeding nerve cells, which have been induced to differentiate from human-derived pluripotent stem cells, at a cell density of 20.0 ⁇ 104 cells/ cm2 or less using a culture medium substantially free of antioxidants and substantially free of oxidants, and step b of culturing the nerve cells using a culture medium substantially free of antioxidants and substantially free of oxidants. That is, in the present invention, nerve cells damaged by oxidative stress can be produced by chronically applying weak oxidative stress to nerve cells produced from human-derived pluripotent stem cells.
  • the present invention further relates to a method for culturing cells, comprising step a) seeding neural cells, which have been induced to differentiate from human-derived pluripotent stem cells, at a cell density of 20.0 ⁇ 10 4 cells/cm 2 or less using a culture medium that is substantially free of antioxidants and substantially free of oxidants, and step b) culturing the neural cells using a culture medium that is substantially free of antioxidants and substantially free of oxidants. That is, in the present invention, by chronically applying weak oxidative stress to neural cells, which have been induced to differentiate from human-derived pluripotent stem cells, it is possible to culture neural cells that have been damaged by oxidative stress.
  • the cell density at the time of seeding may be 20.0 ⁇ 10 4 cells/cm 2 or less.
  • the cell density that enables induction of cell damage due to chronic oxidative stress has been found even in nerve cells produced from iPS cells derived from a specimen without a mutation in a disease-related gene.
  • the cell density at the time of seeding is preferably set to a range in which the presence or absence of cell damage due to chronic oxidative stress can be determined.
  • the lower limit of the cell density is not particularly limited, but is preferably, for example, 0.2 x 104 cells/ cm2 or more, more preferably 0.3 x 104 cells/ cm2 or more, even more preferably 1.0 x 104 cells/cm2 or more, even more preferably 2.0 x 104 cells/ cm2 or more, particularly preferably 3.0 x 104 cells/cm2 or more, and most preferably 4.0 x 104 cells/ cm2 or more.
  • the upper limit of the cell density may be, for example, 20.0 ⁇ 10 4 cells/cm 2 or less, preferably less than 20.0 ⁇ 10 4 cells/cm 2 , more preferably 12.5 ⁇ 10 4 cells/cm 2 or less, even more preferably 12.0 ⁇ 10 4 cells/cm 2 or less, even more preferably 11.0 ⁇ 10 4 cells/cm 2 or less, and particularly preferably 10.0 ⁇ 10 4 cells/cm 2 or less.
  • the cell density is preferably 0.2 x 10 4 cells/cm 2 or more and 20.0 x 10 4 cells/cm 2 or less, more preferably 0.3 x 10 4 cells/cm 2 or more and 20.0 x 10 4 cells/cm 2 or less, even more preferably 1.0 x 10 4 cells/cm 2 or more and 20.0 x 10 4 cells/cm 2 or less, still more preferably 3.0 x 10 4 cells/cm 2 or more and 12.5 x 10 4 cells/cm 2 or less, and particularly preferably 4.0 x 10 4 cells/cm 2 or more and 10.0 x 10 4 cells/cm 2 or less.
  • pluripotent stem cells derived from humans include human iPS cells (human induced pluripotent stem cells), human ES cells (human embryonic stem cells), and human mesenchymal stem cells.
  • Human iPS cells are preferred, but are not limited thereto.
  • Human iPS cells are iPS cells created from human cells.
  • Human-derived pluripotent stem cells are preferably pluripotent stem cells that have no mutations in disease-related genes.
  • No mutations in disease-related genes means that there are no mutations in disease-related genes that cause nervous system diseases. In other words, if there is a mutation in a gene, but the mutation does not cause a disease, it is interpreted as there being no mutation in the disease-related gene.
  • ES cells can be established, for example, by culturing early pre-implantation embryos, inner cell masses constituting the above-mentioned early embryos, single blastomeres, and the like (Manipulating the Mouse Embryo A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1994); Thomson, JA et al., Science, 282, 1145-1147 (1998)).
  • an early embryo produced by nuclear transfer of a nucleus from a somatic cell may be used (Wilmut et al. (Nature, 385, 810 (1997)), Cibelli et al. (Science, 280, 1256 (1998)), Akira Iritani et al.
  • ES cells are available from collection institutions, and some are commercially available.
  • human ES cells are available from the Institute for Frontier Medical Sciences, Kyoto University (e.g. KhES-1, KhES-2, and KhES-3), WiCell Research Institute, ESIBIO, etc.
  • iPS cells are cells that have pluripotency (multi-lineage potential) and the ability to proliferate, and are produced by reprogramming somatic cells through the introduction of reprogramming factors. iPS cells exhibit properties similar to ES cells. There are no particular limitations on the somatic cells used to produce iPS cells, and they may be differentiated somatic cells or undifferentiated stem cells. iPS cells can be produced by known methods, etc. It is also naturally expected that iPS cell production methods developed in the future will be applied.
  • the most basic method for generating iPS cells is to introduce the four transcription factors Oct3/4, Sox2, Klf4, and c-Myc into cells using a virus (Takahashi K, Yamanaka S: Cell 126 (4), 663-676, 2006; Takahashi K, et al: Cell 131 (5), 861-72, 2007).
  • a virus Teakahashi K, Yamanaka S: Cell 126 (4), 663-676, 2006; Takahashi K, et al: Cell 131 (5), 861-72, 2007.
  • There have been reports of human iPS cells being established by introducing the four factors Oct4, Sox2, Lin28, and Nonog (Yu J, et al: Science 318 (5858), 1917-1920, 2007).
  • the establishment of iPS cells by introduction of the three factors excluding c-Myc (Nakagawa M, et al: Nat. Biotechnol.
  • histone methyltransferase G9a inhibitor BIX-01294, or histone deacetylase inhibitors such as valproic acid (VPA) or BayK8644 can improve production efficiency and reduce the amount of factors introduced (Huangfu D, et al: Nat. Biotechnol. 26 (7), 795-797, 2008; Huangfu D, et al: Nat. Biotechnol. 26 (11), 1269-1275, 2008; Silva J, et al: PLoS.Biol. 6 (10), e253, 2008).
  • Cells that have been transformed into iPS cells, i.e., reprogrammed, can be selected using the expression of pluripotent stem cell markers (undifferentiated markers) such as Fbxo15, Nanog, Oct3/4, Fgf-4, Esg-1, and Cript as indicators.
  • pluripotent stem cell markers such as Fbxo15, Nanog, Oct3/4, Fgf-4, Esg-1, and Cript as indicators.
  • the selected cells can be recovered as iPS cells.
  • iPS cells can also be produced by inducing them from somatic cells through the addition of chemical compounds (Hou P et al: Science 341 (6146), 651-654, 2013).
  • iPS cells can also be obtained from, for example, FUJIFILM Cellular Dynamics, Inc. (FCDI), Kyoto University, or the RIKEN BioResource Center.
  • Neural cells induced to differentiate from human-derived pluripotent stem cells can be obtained, for example, by inducing them from somatic cells taken from healthy individuals (healthy subjects) who do not have any disease-related gene mutations that cause nervous system diseases or nervous system diseases, or from human iPS cells made from somatic cells taken from patients with nervous system diseases, or by inducing them from established human iPS cell lines.
  • the nerve cells induced to differentiate from human-derived pluripotent stem cells are not particularly limited, but are preferably motor nerve cells, cerebral cortical excitatory nerve cells, or substantia nigra nerve cells, and are particularly preferably motor nerve cells or cerebral cortical excitatory nerve cells.
  • Methods for inducing differentiation of human-derived pluripotent stem cells into neurons are not particularly limited, but include a method in which neural stem cells are produced from pluripotent stem cells using treatment with low molecular weight compounds, etc., and then the cells are induced to differentiate into neurons, and a method in which the cells are directly induced to differentiate into neurons through gene expression, etc.
  • Examples of methods for inducing differentiation of pluripotent stem cells into neural cells include: (1) A method of culturing in a serum-free medium to form embryoid bodies (cell masses containing neural precursor cells) and then differentiating them (SFEB method: Watanabe K., et al., Nat. Neurosci., 8: 288-296, 2005; SFEBq method: Wataya T., et al., Proc. Natl. Acad. Sci.
  • a method of differentiating pluripotent stem cells by introducing and expressing neural induction factors such as neurogenin2 (Ngn2)
  • neural induction factors such as neurogenin2 (Ngn2)
  • WO2014/148646 WO2014/148646; and Zhang Y., et al, Neuron, 78: 785-98, 2013
  • a method for differentiating pluripotent stem cells by introducing and expressing miR-9/9*-124 and combinations of these methods.
  • the method of introducing and expressing neurogenin 2 into pluripotent stem cells is preferred because it allows for the production of mature nerve cells in a short period of time with high efficiency.
  • cerebral cortical excitatory neurons induced to differentiate from human iPS cells it is preferable to use cells produced by forcibly expressing the Ngn2 gene from human iPS cells.
  • nerve cells may be used as the nerve cells induced to differentiate from human-derived pluripotent stem cells, such as iCell (trademark) motor nerve cells (FCDI, C1050, C1048).
  • iCell trademark
  • FCDI motor nerve cells
  • substantia nigra neurons induced to differentiate from human-derived pluripotent stem cells commercially available neurons may be used, such as iCell (trademark) dopamine neurons (FCDI, C1087, C1028).
  • the nerve cells are preferably cells that express at least one of the nerve cell-specific marker genes consisting of ⁇ -III tubulin, NeuN, N-CAM (neural cell adhesion molecule), and MAP2 (microtubule-associated protein 2), and have ⁇ -III tubulin-positive processes (hereinafter referred to as neurites).
  • nerve cell-specific marker genes consisting of ⁇ -III tubulin, NeuN, N-CAM (neural cell adhesion molecule), and MAP2 (microtubule-associated protein 2), and have ⁇ -III tubulin-positive processes (hereinafter referred to as neurites).
  • the culture of neurons in the present invention can be carried out by selecting the medium, temperature, and other conditions appropriate for the neurons used.
  • a culture medium that is substantially free of antioxidants and substantially free of oxidizing agents is used.
  • Antioxidants include vitamin A, glutathione, vitamin E or its derivatives, superoxide dismutase (SOD), and catalase.
  • Oxidizing agents include hydrogen peroxide, arsenite, and sodium nitroprusside.
  • Substantially free means that antioxidants or oxidants are not present in amounts that would allow them to perform their function.
  • the culture medium may contain any components or additives, such as factors, that are appropriate for the purpose of the culture, as long as they do not interfere with the culture of the neural cells.
  • the medium can be selected from known or commercially available media.
  • the medium used for culturing can be a basal medium to which additives have been added.
  • the basal medium can be, for example, DMEM, DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium)/F12, BrainPhys Neuronal Medium, Neurobasal Medium-A, Neurobasal Medium, Neural Progenitor Basal Medium, NS-A Basal Medium, Basal Medium Eagle (BME), BGJb Medium, CMRL 106
  • DMEM/F12 or BrainPhys Neuronal Medium is preferred, and DMEM/F12 is more preferred.
  • the medium may be a single medium or a combination of two or more types
  • Additives that do not substantially exhibit antioxidant effects or that are added at concentrations that do not substantially exhibit antioxidant effects may be added. Specific examples include, but are not limited to, serum, retinoic acid, Wnt, BMP, bFGF, EGF, HGF, Sonic hedgehog (Shh), interleukins, heparin, heparan sulfate, collagen, fibronectin, progesterone, selenite, B-27TM supplement (containing no antioxidants), and ITS supplement. A preferred additive is B-27TM supplement (containing no antioxidants).
  • the conditions for culturing nerve cells may be selected from those for general cell culture, such as conditions at 37°C and 5% CO2 .
  • the medium may be changed at appropriate intervals during the culture (preferably once every 1 to 7 days, more preferably once every 2 to 3 days), but it is preferable not to change the medium during the culture period.
  • Neuronal cells are preferably cultured in two dimensions.
  • Cell culture vessels such as plates, dishes, cell culture inserts, and cell culture flasks can be used for cell culture.
  • the nerve cells damaged by oxidative stress produced by the method for producing nerve cells according to the present invention preferably have the following characteristics (i) to (iv): (i) positive markers related to oxidative stress; (ii) neurites are retracted; (iii) necroptosis is induced; and (iv) ferroptosis is induced:
  • the present invention provides a neuron that satisfies at least one or more of the above (i) to (iv), which is produced by the method for producing a neuron according to the present invention.
  • the neuron of the present invention is not particularly limited, but is preferably a motor neuron, a cerebral cortical excitatory neuron, or a substantia nigra neuron, and more preferably a motor neuron or a cerebral cortical excitatory neuron.
  • Markers associated with oxidative stress include oxidative stress markers and secondary markers resulting from oxidative stress.
  • Oxidative stress markers include reactive oxygen species (ROS), biological products generated by reactive oxygen, antioxidant enzymes, and antioxidant substances.
  • ROS include superoxide anion radical (O 2 ⁇ ⁇ ), hydrogen peroxide (H 2 O 2 ), hydroxyl radical ( ⁇ OH), singlet oxygen ( 1 O 2 ), nitric oxide (NO ⁇ ), nitrogen dioxide (NO 2 ⁇ ), ozone (O 3 ), and lipid peroxide (LOOH).
  • Biological products generated by reactive oxygen include hydroxydeoxyguanosine (8-OHdG), 8-hydroxyguanosine (8-OHG), and lipid peroxide.
  • Antioxidant enzymes include SOD, catalase, and GPx.
  • Antioxidants include glutathione (GSH/GSSG), bilirubin, and vitamins.
  • Secondary markers resulting from oxidative stress include phosphorylation, accumulation, and aggregation of TAR DNA-binding protein 43 (TDP-43) protein, amyloid- ⁇ protein, tau protein, and ⁇ -synuclein.
  • the marker associated with oxidative stress is preferably ROS, 8-OHdG, 8-OHG, lipid peroxide, glutathione, TDP-43 protein, amyloid ⁇ protein, tau protein or ⁇ -synuclein, more preferably ROS.
  • ROS Positive reactive oxygen species
  • Quantification of intracellular ROS levels can be performed using commercially available reagents such as CellROXTM Green Reagent, for oxidative stress detection (Thermo Fisher Scientific, C10444).
  • Neurite retraction can be confirmed by measuring neurite length.
  • neurite length can be quantified using Neurotrack software (Sartorius, 9600-0010) on an IncuCyte S3.
  • necroptosis has been induced can be determined, for example, by assessing the degree of damage caused by oxidative stress when cells are treated with a necroptosis inhibitor (e.g., necrostatin-1) and when the cells are not treated with a necroptosis inhibitor (e.g., necrostatin-1), and if the degree of damage is reduced when the cells are treated with a necroptosis inhibitor (e.g., necrostatin-1), it can be determined that necroptosis has been induced.
  • a necroptosis inhibitor e.g., necrostatin-1
  • necrostatin-1 e.g., necrostatin-1
  • RIPK1 receptor interacting protein kinase 1
  • RIPK3 receptor interacting protein kinase 3
  • MLKL mixed lineage kinase domain-like protein
  • ferroptosis has been induced can be determined by, for example, evaluating the degree of damage caused by oxidative stress when cells are treated with a ferroptosis inhibitor (e.g., ferrostatin-1, liproxstatin-1, or UAMC-3203, etc.) and when cells are not treated with a ferroptosis inhibitor (e.g., ferrostatin-1, liproxstatin-1, or UAMC-3203, etc.), and determining that ferroptosis has been induced if the degree of damage is reduced when cells are treated with a ferroptosis inhibitor (e.g., ferrostatin-1, liproxstatin-1, or UAMC-3203, etc.).
  • a ferroptosis inhibitor e.g., ferrostatin-1, liproxstatin-1, or UAMC-3203, etc.
  • ferroptosis has been induced can also be determined by quantifying the amount of intracellular ferrous iron and lipid peroxides (4-hydroxynonenal and malondialdehyde), which are known as markers related to ferroptosis.
  • nerve cells that have been damaged by oxidative stress. Whether or not nerve damage has occurred due to oxidative stress can be evaluated by, but is not limited to, assessing cell death (neuron cell number), measuring a marker associated with oxidative stress, assessing cell damage, measuring a marker associated with nerve damage, or measuring neurite length. Among the above, it is preferable to assess cell death (neuron cell number) or measure neurite length.
  • Cell death can be detected using live cell detection reagents such as Cell Titer Glo (Promega) or Cell counting kit-8 (Dojindo), or cell death detection reagents such as PropidiumIodide or NucGreen Dead (ThermoFisher Scientific).
  • live cell detection reagents such as Cell Titer Glo (Promega) or Cell counting kit-8 (Dojindo), or cell death detection reagents such as PropidiumIodide or NucGreen Dead (ThermoFisher Scientific).
  • Cytotoxicity can be evaluated using an evaluation method such as an LDH assay, a WST assay, or an ATP assay.
  • an evaluation method such as an LDH assay, a WST assay, or an ATP assay.
  • a kit such as Cytotoxicity Detection Kit PLUS (LDH) (Sigma Aldrich) can be used for the LDH assay.
  • Markers for nerve damage include Enolase 2 (Neuron-Specific Enolase), which can be measured using the ELISA method.
  • the nerve cells damaged by oxidative stress according to the present invention can be used to screen new drugs useful for neurodegenerative diseases known to be closely related to the onset and progression of oxidative stress.
  • the nerve cells damaged by oxidative stress according to the present invention are particularly useful for the study of sporadic chronic neurodegenerative diseases, the development of therapeutic drugs, the identification of disease biomarkers, and the development of diagnostic drugs.
  • sporadic chronic neurodegenerative diseases can be evaluated by using nerve cells produced from pluripotent stem cells, preferably having no mutations in disease-related genes, and chronically applying weak oxidative stress to the cells using a culture medium substantially free of antioxidants and substantially free of oxidants.
  • cell death is observed two days or more after the start of culture, so that drugs can be evaluated within about two weeks. Furthermore, in the present invention, cell death due to necroptosis can be reproduced, so that necroptosis inhibitors can be screened. Furthermore, in the present invention, cell death due to ferroptosis can be reproduced, so that ferroptosis inhibitors can be screened.
  • a method for evaluating a test substance which comprises contacting a nerve cell damaged by oxidative stress according to the present invention with the test substance.
  • the present invention further provides a method for screening for a preventive and/or therapeutic agent for a neurodegenerative disease, which comprises contacting a neuronal cell according to the present invention with a test substance.
  • the present invention (1) contacting a neuronal cell according to the present invention with a test substance; (2) culturing the nerve cells contacted with the test substance in the above step (1) and control nerve cells not contacted with the test substance; (3) measuring nerve damage in the nerve cells; and (4) selecting a test substance that suppresses the nerve damage as a candidate for a necroptosis inhibitor, as compared to a control that has not been contacted with the test substance.
  • the present invention provides a method for screening for a necroptosis inhibitor, comprising:
  • contacting a neuronal cell according to the present invention with a test substance (2) culturing the nerve cells contacted with the test substance in the above step (1) and control nerve cells not contacted with the test substance; (3) measuring nerve damage in the nerve cells; and (4) selecting a test substance that suppresses the nerve damage as a candidate for a ferroptosis inhibitor, as compared to a control that has not been contacted with the test substance.
  • a method for screening for a ferroptosis inhibitor comprising:
  • the above-mentioned methods for evaluating a test substance, the methods for screening for a preventive and/or therapeutic drug for a neurodegenerative disease, the methods for screening for a necroptosis inhibitor, and the methods for screening for a ferroptosis inhibitor may further include producing the nerve cells of the present invention by the method for producing nerve cells damaged by oxidative stress according to the present invention.
  • Test substances include, for example, proteins, peptides, antibodies, nucleic acids (gene expression vectors, siRNA, antisense oligonucleotides, mRNA), viral vectors (AAV, lentivirus, adenovirus, etc.), non-peptide compounds, synthetic compounds, synthetic low molecular weight compounds, natural compounds, cell extracts, extracellular vesicles, plant extracts, animal tissue extracts, plasma, extracts derived from marine organisms, cell culture supernatants, and microbial fermentation products.
  • nucleic acids gene expression vectors, siRNA, antisense oligonucleotides, mRNA
  • viral vectors AAV, lentivirus, adenovirus, etc.
  • non-peptide compounds synthetic compounds, synthetic low molecular weight compounds, natural compounds, cell extracts, extracellular vesicles, plant extracts, animal tissue extracts, plasma, extracts derived from marine organisms, cell culture supernatants, and microbial fermentation products.
  • test substances can be obtained using any of the many approaches in combinatorial library methods known in the art, including (1) biological library methods, (2) synthetic library methods using deconvolution, (3) one-bead one-compound library methods, and (4) synthetic library methods using affinity chromatography selection. While the biological library method using affinity chromatography selection is limited to peptide libraries, the other approaches can be applied to small molecule libraries of peptides, non-peptide oligomers, or compounds (Lam (1997) Anticancer Drug Des. 12: 145-67). Examples of methods for the synthesis of molecular libraries can be found in the art (DeWitt et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6909-13; Erb et al.
  • the contact between the nerve cells and the test substance may be carried out by adding the test substance to the culture medium of the nerve cells.
  • the contact time is not particularly limited as long as it is a time during which a change in the indicator can be confirmed, but may be, for example, 1 day or more, 2 days or more, 3 days or more, 4 days or more, 5 days or more, 6 days or more, or 7 days or more.
  • the concentration of the test substance added can be adjusted as appropriate depending on the type of compound (solubility, toxicity, etc.).
  • the culture medium for neurons used when contacting the neurons with the test substance is not particularly limited, as long as it is a medium capable of culturing neurons.
  • the culture temperature when contacting the test substance with the nerve cells is not particularly limited, but is about 30 to 40°C, preferably about 37°C, and the culture is performed in an atmosphere of CO2- containing air, and the CO2 concentration is preferably about 2 to 5%.
  • Neurodegenerative diseases include Alzheimer's disease (AD), spinocerebellar degeneration, frontotemporal lobar degeneration (FTLD), Parkinson's disease, amyotrophic lateral sclerosis (ALS), Lewy body disease, Huntington's disease, and Niemann-Pick disease.
  • Neurodegenerative diseases are preferably Alzheimer's disease (AD), Parkinson's disease, amyotrophic lateral sclerosis (ALS), Huntington's disease, or Niemann-Pick disease, and more preferably amyotrophic lateral sclerosis (ALS).
  • necroptosis diseases involving necroptosis include neurodegenerative diseases, acute kidney injury, alcoholic liver disease, nonalcoholic fatty liver disease, nonalcoholic steatohepatitis, acute lung injury, acute respiratory distress syndrome, systemic inflammatory response syndrome, chronic obstructive pulmonary disease, idiopathic pulmonary fibrosis, heart failure, arteriosclerosis, aortic aneurysm, psoriasis, rheumatoid arthritis, acute myeloid leukemia, chronic lymphocytic leukemia, head and neck squamous cell carcinoma, non-small cell lung cancer, ovarian cancer, colon cancer, cervical cancer, malignant melanoma, glioblastoma, lung cancer, breast cancer, pancreatic cancer, etc.
  • Diseases involving necroptosis are preferably neurodegenerative diseases, more preferably multiple sclerosis (MS), amyotrophic lateral sclerosis (ALS), Alzheimer's disease (AD), and Parkinson's disease (PD), and more preferably amyotrophic lateral sclerosis (ALS).
  • MS multiple sclerosis
  • ALS amyotrophic lateral sclerosis
  • AD Alzheimer's disease
  • PD Parkinson's disease
  • ALS amyotrophic lateral sclerosis
  • ferroptosis diseases in which ferroptosis is involved include neurodegenerative diseases, age-related macular degeneration, Fuchs' intracorneal dystrophy, chronic obstructive pulmonary disease, radiation lung injury, acute lung injury, asthma, pulmonary fibrosis, tuberculosis, Pseudomonas aeruginosa infection, paraquat poisoning, ischemia-reperfusion injury, alcoholic liver disease, autoimmune hepatitis, nonalcoholic steatohepatitis, acetaminophen-induced liver injury, liver fibrosis, liver transplantation, acute pancreatitis, diabetes, islet transplantation, hemochromatosis, transfusion-associated immune modification, hemolytic anemia, and radiation-induced hematopoietic disorders.
  • periventricular leukomalacia hemorrhagic/ischemic stroke, hemorrhagic dementia, traumatic brain injury, epilepsy, ischemia-reperfusion injury, doxorubicin cardiomyopathy, iron overload cardiomyopathy, myocardial infarction/fibrosis, atherosclerosis, heart transplantation, acute kidney injury, polycystic kidney disease, kidney transplantation, Crohn's disease, ulcerative colitis, preeclampsia, endometriosis, infertility, neuroblastoma, glioblastoma, colon cancer, lung cancer, head and neck cancer, gastric cancer, pancreatic ductal adenocarcinoma, breast cancer, ovarian cancer, hepatocellular carcinoma, renal cell carcinoma, Burkitt's lymphoma, etc.
  • diseases involving ferroptosis include neurodegenerative diseases, preferably Alzheimer's disease (AD), Parkinson's disease (PD), amyotrophic lateral sclerosis (ALS), Huntington's disease, or Niemann-Pick disease, and more preferably amyotrophic lateral sclerosis (ALS).
  • AD Alzheimer's disease
  • PD Parkinson's disease
  • ALS amyotrophic lateral sclerosis
  • ALS Huntington's disease
  • Niemann-Pick disease preferably amyotrophic lateral sclerosis
  • the neuronal cells After contacting the neuronal cells according to the present invention with a test substance, (A) culturing a neuronal cell contacted with a test substance and a control neuronal cell not contacted with the test substance; (B) measuring nerve damage in the nerve cells; and (C) selecting a test substance that suppresses the nerve damage as compared to a control that has not been contacted with the test substance, as a candidate for a preventive and/or therapeutic drug for a neurodegenerative disease. This can be done.
  • step (B) is a step of measuring the cell number and/or neurite length of the nerve cells obtained in step (A).
  • step (C) is a step of selecting a test substance that causes the cell number and/or neurite length of nerve cells contacted with the test substance to be higher than that of a control, as a candidate for a preventive and/or therapeutic agent for a neurodegenerative disease.
  • the present invention will be specifically described with reference to the following examples, but the present invention is not limited to the scope of the examples.
  • Test Example 1 Evaluation of neurite length of nerve cells cultured in a medium containing no antioxidants from the time of cell seeding, and of nerve cells cultured in a medium that was replaced with a medium containing no antioxidants by medium exchange after cell seeding ⁇ Plate coating> iMatrix-511 silk (Matrixome, 892021) was diluted 16.7-fold with PBS (phosphate buffered saline) and added to a PDL (poly-D-lysine)-coated 96-well plate (Corning, 356461) at 70 ⁇ L/well, and incubated at 37° C. for 3 to 72 hours.
  • PBS phosphate buffered saline
  • PDL poly-D-lysine
  • the medium containing an antioxidant was +AO medium to which DMSO (dimethyl sulfoxide) was added so as to have a concentration of 0.1% by volume (v/v) (Stress (-)), and the medium not containing an antioxidant was -AO medium to which DMSO was added so as to have a concentration of 0.1% by volume (v/v) (Stress (+)).
  • Neurons (thought to be cerebral cortical excitatory neurons) generated by forced expression of Ngn2 gene (Neurogenin2 gene) from iPS cells (Chao Wang., et al, Stem Cell Reports., 9: 1221-1233, 2017) were thawed in a 37°C warm bath. After thawing, the cells were added to the medium and centrifuged at 600 ⁇ g for 5 minutes at room temperature. After centrifugation, the supernatant was removed, the cells were suspended in the medium, and the number of cells was counted.
  • Ngn2 gene Neurogenin2 gene
  • the cells were diluted with the medium, seeded at 200 ⁇ L/well (9.4 ⁇ 10 4 cells/cm 2 ), and cultured under 37°C and 5% CO 2 conditions. Images were taken every 6 hours using IncuCyte S3 (Sartorius, Incucyte S3) to obtain images. After culturing, the medium was exchanged after 48, 72, or 96 hours.
  • Neurite length was quantified using Neurotrack software (Sartorius, 9600-0010) on an IncuCyte S3. If the neurite length (total neurite length per area) at any time after process retraction under Stress (+) conditions cultured in a medium containing no antioxidants was less than half the maximum neurite length of the Stress (-) group cultured in a medium containing antioxidants by 14 days of culture, the process was judged to have retracted. The results of quantifying the neurite length are shown in Figures 1 to 3.
  • Figure 1 shows the results of quantifying neurite length in neurons whose medium was changed after 48 hours of culture.
  • the vertical axis shows the total neurite length per area, and the horizontal axis shows the number of days of culture.
  • Test Example 2 Evaluation of the effect of cell seeding density on oxidative stress-induced neuronal injury ⁇ Plate coating> iMatrix-511 silk (Matrixome, 892021) was diluted 16.7-fold with PBS and added to a PDL-coated 96-well plate (Corning, 356461) at 70 ⁇ L/well, followed by incubation at 37° C. for 3 to 72 hours.
  • the medium containing an antioxidant was +AO medium to which DMSO was added so as to have a concentration of 0.1% by volume (v/v) (Stress (-)), and the medium not containing an antioxidant was -AO medium to which DMSO was added so as to have a concentration of 0.1% by volume (v/v) (Stress (+)).
  • Neurons (thought to be cerebral cortical excitatory neurons) prepared by forced expression of the Ngn2 gene from iPS cells in the same manner as in Test Example 1 were thawed in a 37°C warm bath. After thawing, the cells were added to the medium and centrifuged at 600 ⁇ g and room temperature for 5 minutes. After centrifugation, the supernatant was removed, the cells were suspended in the medium, and the number of cells was counted. Thereafter, the cells were diluted with the medium, seeded at 200 ⁇ L/well (0.3-37.5 ⁇ 10 4 cells/cm 2 ), and cultured under conditions of 37°C and 5% CO 2. After culture, images were taken every 6 hours using IncuCyte S3 (Sartorius, Incucyte S3) to obtain images.
  • IncuCyte S3 Sartorius, Incucyte S3
  • the time course of the neurite length when cells were seeded at a cell seeding density of 0.3, 0.9, 1.9, 4.7, 9.4, or 12.5 ⁇ 10 4 cells/cm 2 is shown in FIG. 4 to FIG. 9.
  • the vertical axis indicates the total neurite length per area, and the horizontal axis indicates the number of days of culture.
  • the cell seeding density was 0.3 to 12.5 cells/cm 2
  • neurite retraction was confirmed in the Stress (+) group ( ⁇ ) cultured in a medium containing no antioxidant.
  • the experimental results of seeding at a seeding density of 0.3 to 37.5 ⁇ 10 4 cells/cm 2 are shown in Table 3.
  • the seeding density was 25.0 ⁇ 10 4 cells/cm 2 or more, the cell density was too high to detect neurite retraction (nerve damage). This makes it clear that it is important to seed and culture the cells at a cell density of 20.0 ⁇ 10 4 cells/cm 2 or less.
  • the medium containing an antioxidant was +AO medium to which DMSO was added so as to have a concentration of 0.1% by volume (v/v) (Stress (-)), and the medium not containing an antioxidant was -AO medium to which DMSO was added so as to have a concentration of 0.1% by volume (v/v) (Stress (+)).
  • Neurons (presumably cerebral cortical excitatory neurons) prepared by forced expression of the Ngn2 gene from iPS cells in the same manner as in Test Example 1 were thawed in a warm bath at 37°C. After thawing, the cells were added to the medium and centrifuged at 600 x g and room temperature for 5 minutes. After centrifugation, the supernatant was removed, the cells were suspended in the medium, and the number of cells was counted. Thereafter, the cells were diluted with the medium, seeded at 200 ⁇ L/well (4.7 x 10 4 cells/cm 2 ), and cultured under conditions of 37°C and 5% CO 2. After culture, images were taken every 6 hours using IncuCyte S3 (Sartorius, Incucyte S3) to obtain images.
  • IncuCyte S3 Sartorius, Incucyte S3
  • the vertical axis indicates the total neurite length per area, and the horizontal axis indicates the number of days of culture.
  • neurite retraction neuronal injury was confirmed in the Stress (+) group ( ⁇ ) cultured in a medium that did not contain antioxidants, while no neurite retraction was confirmed in the Stress (-) group ( ⁇ ) cultured in a medium that contained antioxidants. This demonstrated that neuronal injury can be induced by culturing in BrainPhys medium or Neurobasal medium that does not contain antioxidants.
  • Test Example 4 Quantitative evaluation of oxidative stress-induced neuronal injury ⁇ Plate coating> iMatrix-511 silk (Matrixome, 892021) was diluted 16.7-fold with PBS and added to PDL-coated flasks (Greiner Bio-one, 661940) at 20 mL/flask, followed by incubation at 37° C. for 3 to 72 hours.
  • the medium containing an antioxidant was +AO medium to which DMSO was added so as to have a concentration of 0.1% by volume (v/v) (Stress (-)), and the medium not containing an antioxidant was -AO medium to which DMSO was added so as to have a concentration of 0.1% by volume (v/v) (Stress (+)).
  • Neurons (presumably cerebral cortical excitatory neurons) prepared by forced expression of the Ngn2 gene from iPS cells in the same manner as in Test Example 1 were thawed in a warm bath at 37°C. After thawing, the cells were added to the medium and centrifuged at 600 x g for 5 minutes at room temperature. After centrifugation, the supernatant was removed, the cells were suspended in 1 mL of medium, and the number of cells was counted. Thereafter, the cells were diluted with medium, seeded to a density of 6.9 x 104 cells/ cm2 , and cultured under 37°C and 5% CO2 conditions. The medium was collected on the 3rd, 4th, 5th, and 6th days after culture.
  • LDH Assay Cytotoxicity Detection Kit PLUS (LDH) (Sigma Aldrich, 4744934001) was used for quantifying LDH. The measurement was carried out according to the attached instructions, and LDH in the medium was quantified from day 3 to day 6 of culture. The quantitative results are shown in FIG.
  • the culture medium ( ⁇ ) of nerve cells from the Stress (+) group which were cultured in a medium that did not contain antioxidants, had higher LDH levels on the fifth and sixth days of culture than the culture medium ( ⁇ ) of nerve cells from the Stress (-) group, which were cultured in a medium that contained antioxidants, confirming that cell damage had occurred in the Stress (+) group.
  • Test Example 5 Quantification of ROS signal ⁇ Plate coating> iMatrix-511 silk (Matrixome, 892021) was diluted 16.7-fold with PBS and added to a PDL-coated 96-well plate (Corning, 356640) at 70 ⁇ L/well, followed by incubation at 37° C. for 3 to 72 hours.
  • the medium containing an antioxidant was +AO medium to which DMSO was added so as to have a concentration of 0.1% by volume (v/v) (Stress (-)), and the medium not containing an antioxidant was -AO medium to which DMSO was added so as to have a concentration of 0.1% by volume (v/v) (Stress (+)).
  • Frozen cells iCell motor neurons, FCDI, C1048
  • FCDI iCell motor neurons
  • C1048 Frozen cells
  • the cells were added to the medium and centrifuged at 600 ⁇ g for 5 minutes at room temperature. After centrifugation, the supernatant was removed, the cells were suspended in 1 mL of medium, and the number of cells was counted. The cells were then diluted with medium, seeded at 200 ⁇ L/well (4.7 ⁇ 10 4 cells/cm 2 ), and cultured at 37°C and 5% CO 2 for 6 days.
  • the ROS signal was quantified using CellROXTM Green Reagent for oxidative stress detection (Thermo Fisher Scientific, C10444). The procedure was carried out according to the attached instructions, and the intracellular ROS signal of the neurons after 6 days of culture was quantified using a confocal quantitative image cytometer (CQ1, Yokogawa Electric). The results of quantifying the average fluorescence intensity in the nuclear region are shown in FIG. 13.
  • Test Example 6 Evaluation of compounds against oxidative stress-induced neuronal injury (necroptosis inhibitors) ⁇ Plate coating> iMatrix-511 silk (Matrixome, 892021) was diluted 16.7-fold with PBS and added to a PDL-coated 96-well plate (Corning, 356461) at 70 ⁇ L/well, followed by incubation at 37° C. for 3 to 72 hours.
  • the medium containing antioxidants was +AO medium to which DMSO had been added at 0.1% by volume (v/v) (Stress (-)).
  • the medium not containing antioxidants was -AO medium to which DMSO had been added at 0.1% by volume (v/v) (Stress (+)).
  • the medium for drug evaluation was -AO medium to which a compound dissolved in DMSO had been added at a concentration of 0.1% by volume (v/v) (0.01 to 20 ⁇ M).
  • ⁇ Cell seeding> Frozen cells iCell motor neurons, FCDI, C1048, were thawed in a 37°C warm bath. After thawing, the cells were added to the medium and centrifuged at 600 ⁇ g for 5 minutes at room temperature. After centrifugation, the supernatant was removed, the cells were suspended in 1 mL of medium, and the number of cells was counted. The cells were then diluted with medium, seeded at 200 ⁇ L/well (4.7 ⁇ 10 4 cells/cm 2 ), and cultured at 37°C and 5% CO 2 conditions. After culture, images were taken every 6 hours using IncuCyte S3 (Sartorius, Incucyte S3) to obtain images.
  • IncuCyte S3 Sartorius, Incucyte S3
  • Neurite length was quantified using Neurotrack software (Sartorius, 9600-0010) on an IncuCyte S3. The quantification results of neurite length and representative cell images are shown in FIG.
  • the group treated with necrostatin-1 known as a necroptosis inhibitor ( ⁇ ) suppressed the decrease in the total neurite length in a concentration-dependent manner. This indicates that the nerve damage in this evaluation system is caused by necroptosis.
  • Test Example 7 Evaluation of compounds against oxidative stress-induced neuronal injury (ferroptosis inhibitors) ⁇ Plate coating> iMatrix-511 silk (Matrixome, 892021) was diluted 16.7-fold with PBS and added to a PDL-coated 96-well plate (Corning, 356461) at 70 ⁇ L/well, followed by incubation at 37° C. for 3 to 72 hours.
  • the medium containing antioxidants was +AO medium to which DMSO had been added at 0.1% by volume (v/v) (Stress (-)).
  • the medium not containing antioxidants was -AO medium to which DMSO had been added at 0.1% by volume (v/v) (Stress (+)).
  • the medium for drug evaluation was -AO medium to which a compound dissolved in DMSO had been added at a concentration of 0.1% by volume (v/v) (0.004 to 20 ⁇ M).
  • IncuCyte S3 Sartorius, Incucyte S3
  • Neurite length was quantified using Neurotrack software (Sartorius, 9600-0010) on an IncuCyte S3. The results of quantification of neurite length are shown in Figures 15 to 17. Neurons cultured in a medium that did not contain antioxidants (Stress (+) group) ( ⁇ ) were damaged after about one day of culture, resulting in a decrease in the total neurite length. On the other hand, in the group treated with a ferroptosis inhibitor ( ⁇ ), both compounds suppressed the decrease in the total neurite length in a concentration-dependent manner. These results indicate that the neuronal damage in this evaluation system is caused by ferroptosis.
  • Test Example 8 Compound screening using an oxidative stress-induced nerve cell injury evaluation system ⁇ Plate coating> iMatrix-511 silk (Matrixome, 892021) was diluted 16.7-fold with PBS and added to a PDL-coated 96-well plate (Corning, 356461) at 70 ⁇ L/well, followed by incubation at 37° C. for 3 to 72 hours.
  • the compound library used was StemSelect Library compounds (Merck, 569774).
  • the antioxidant-containing medium was +AO medium to which DMSO was added at 0.1% by volume (v/v) (Stress (-))
  • the antioxidant-free medium was -AO medium to which DMSO was added at 0.1% by volume (v/v) (Stress (+))
  • the medium for the drug evaluation group was -AO medium to which a DMSO-dissolved compound was added at a concentration of 0.1% by volume (v/v).
  • ⁇ Cell seeding> Frozen cells iCell motor neurons, FCDI, C1048, were thawed in a 37°C warm bath. After thawing, the cells were added to the medium and centrifuged at 600 ⁇ g for 5 minutes at room temperature. After centrifugation, the supernatant was removed, the cells were suspended in 1 mL of medium, and the number of cells was counted. The cells were then diluted with medium, seeded at 200 ⁇ L/well (4.7 ⁇ 10 4 cells/cm 2 ), and cultured at 37°C and 5% CO 2 conditions. After culture, images were taken every 6 hours using IncuCyte S3 (Sartorius, Incucyte S3) to obtain images.
  • IncuCyte S3 Sartorius, Incucyte S3
  • Neurite length was quantified using Neurotrack software (Sartorius, 9600-0010) on an IncuCyte S3.
  • the area under the curve (AUC) was calculated from the time course of neurite length over 14 days, and the effects of the drugs were compared. In other words, a larger AUC indicates inhibition of neurite retraction (inhibition of nerve injury).
  • the values of each compound and AUC are shown in Figure 18.
  • the AUC was reduced in neurons cultured in a medium containing no antioxidant (Stress (+) group) ( ⁇ ) compared to neurons cultured in a medium containing an antioxidant (Stress (-) group) ( ⁇ ).
  • Test Example 9 Evaluation of ALS Treatment Drug (Edaravone) on Oxidative Stress-Induced Neuronal Damage Using the same method as Test Example 7, the effect of edaravone, which is used as a treatment drug for ALS, on oxidative stress-induced neuronal damage was evaluated. The results of quantifying neurite length are shown in Figure 19. Neurons (Stress (+) group) ( ⁇ ) cultured in a medium containing no antioxidants were damaged after about 4 days of culture, and the total neurite length decreased. In the group treated with edaravone ( ⁇ ), the decrease in the total neurite length was inhibited in a concentration-dependent manner. This demonstrated that this evaluation system can be used to screen candidates for ALS treatment drugs.

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Abstract

本発明は、ヒト由来の多能性幹細胞から酸化ストレスによる傷害を受けた神経細胞を製造する方法；ヒト由来の多能性幹細胞から酸化ストレスによる傷害を受けた神経細胞を製造することができる細胞の培養方法；酸化ストレスによる傷害を受けた神経細胞；上記神経細胞を用いた、被験物質の評価方法、神経変性疾患の予防および／または治療薬のスクリーニング方法、ネクロトーシス阻害剤のスクリーニング方法、およびフェロトーシス阻害剤のスクリーニング方法；を提供することを課題とする。 本発明によれば、ヒト由来の多能性幹細胞から分化誘導した神経細胞を、抗酸化剤を実質的に含まず、かつ酸化剤を実質的に含まない培養培地を用いて２０．０×１０４細胞／ｃｍ２以下の細胞密度で播種する工程ａと、抗酸化剤を実質的に含まず、かつ酸化剤を実質的に含まない培養培地を用いて培養する工程ｂとを含む、酸化ストレスによる傷害を受けた神経細胞の製造方法が提供される。

Description

酸化ストレスによる傷害を受けた神経細胞の製造方法およびその応用
　本発明は、酸化ストレスによる傷害を受けた神経細胞の製造方法、および細胞の培養方法に関する。本発明はさらに、酸化ストレスによる傷害を受けた神経細胞に関する。本発明はさらに、上記神経細胞を用いた、被験物質の評価方法、神経変性疾患の予防および／または治療薬のスクリーニング方法、ネクロトーシス阻害剤のスクリーニング方法、およびフェロトーシス阻害剤のスクリーニング方法に関する。
　アルツハイマー病（ＡＤ）や筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）などの神経変性疾患は神経細胞が徐々に傷害を受けて脱落する疾患であり（非特許文献１および２）、その病態メカニズムには酸化ストレスが大きく関与することが知られている（非特許文献３および４）。ヒト神経変性疾患のｉｎ　ｖｉｔｒｏ研究は、ヒトの中枢神経系細胞の取得が難しかったことから、従来はラットやマウスの細胞が使われていた。しかし近年は人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）の発明以降、神経細胞を含めたヒトの中枢神経系細胞を比較的容易に取得できるようになり、ヒト神経変性疾患の研究に大きく役立っている（非特許文献５～７）。
　ｉＰＳ細胞由来の神経細胞を用いて、神経変性疾患への酸化ストレスの影響が研究されている。例えばＦｅｎｇ－Ｌａｎ　Ｃｈｉｕらの研究では、ｉＰＳ細胞由来の神経細胞に過酸化水素を６時間処理することで酸化ストレスを与え、神経変性疾患の神経細胞傷害を再現している（非特許文献８）。また、特許文献１には、家族性ＡＬＳ患者由来のｉＰＳ細胞から作製した運動神経をアルセナイトにて１６時間処理することで傷害が惹起されることが記載されている。特許文献２には、ヒト由来ｉＰＳ細胞から作製した運動神経細胞が、過酸化水素の一過性処理により細胞傷害を起こすことが記載されている。しかし、神経変性疾患は長い時間をかけて徐々に神経細胞が脱落する疾患であるのに対し、過酸化水素などの酸化剤を使用する条件では短時間の酸化ストレス刺激により神経傷害が惹起されることから、生体で実際に生じる神経変性疾患の病態を再現できていない可能性がある。
　そこで、弱い酸化ストレスを慢性的に与えることで神経変性疾患の神経細胞傷害を再現した研究がある（非特許文献９）。この研究では、弱い酸化ストレスを与え、かつ疾患に関連する遺伝子をノックアウトした場合にのみ神経傷害が惹起されることから、家族性の神経変性疾患を再現していると考えられる。また、特許文献３および非特許文献１０においては、家族性ＡＤ患者由来のｉＰＳ細胞から作製した大脳皮質神経細胞は、抗酸化剤を含まない培地で培養することで酸化ストレスが亢進し、神経細胞傷害が惹起されることが記載されている。
　しかしながら神経変性疾患は、例えばＡＤは９５％が孤発性（非特許文献１１）、ＡＬＳでは９０％が孤発性であることが知られており（非特許文献１２）、疾患関連遺伝子に変異の無い患者が大部分である。そのため、孤発性の神経変性疾患の病態を簡便に再現可能な評価系が求められているが、十分な成果は得られていない。
特表２０１５－５０６９０５号公報 特開２０１９－０３７２４５号公報 国際公開ＷＯ２０１３／１４０３２７号公報
Ｂｒｉｔｔａｎｙ　Ｎ　Ｄｕｇｇｅｒら、Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅｓ　ｉｎ　Ｂｉｏｌｏｇｙ、９巻、Ａｒｔｉｃｌｅ　番号ａ０２８０３５、２０１７年 Ｈａｏ　Ｃｈｉら、Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、１９巻、Ａｒｔｉｃｌｅ番号３０８２、２０１８年 Ｇｉｏｖａｎｎａ　Ｃｅｎｉｎｉら、Ｏｘｉｄａｔｉｖｅ　Ｍｅｄｉｃｉｎｅ　ａｎｄ　Ｃｅｌｌｕｌａｒ　Ｌｏｎｇｅｖｉｔｙ、２０１９巻、Ａｒｔｉｃｌｅ　番号２１０５６０７、２０１９年 Ｖａｎｅｓｓａ　Ｃａｓｔｅｌｌｉら、Ｆｒｏｎｔｉｅｒｓ　ｉｎ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ、１２巻、Ａｒｔｉｃｌｅ番号１３２、２０１９年 Ｏｋａｎｏら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｒａｉｎ、７巻、２２号、１～１２頁、２０１４年 Ｖａｌａｄｅｚ－Ｂａｒｂａら、Ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｖｅ　Ｔｈｅｒａｐｙ、１５巻、３３２～３３９頁、２０２０年 Ｚｅｎｇら、ＳＴＥＭ　ＣＥＬＬＳ　ＴＲＡＮＳＬＡＴＩＯＮＡＬ　ＭＥＤＩＣＩＮＥ、３巻、１４１８～１４２８頁、２０１４年 Ｆｅｎｇ－Ｌａｎ　Ｃｈｉｕら、Ｈｕｍａｎ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、２４巻、６０６６～６０７９頁、２０１５年 Ｒｕｉｌｉｎ　Ｔｉａｎら、Ｎａｔｕｒｅ　Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ、２４巻、１０２０～１０３４頁、２０２１年 Ｋｏｎｄｏら、Ｃｅｌｌ　Ｓｔｅｍ　Ｃｅｌｌ、１２巻、４８７～４９６頁、２０１３年 Ｊｉｔｉｎ　Ｂａｌｉら、Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ａｃａｄｅｍｙ　ｏｆ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｕｎｉｔｅｄ　Ｓｔａｔｅｓ　ｏｆ　Ａｍｅｒｉｃａ、１０９巻、１５３０７～１５３１１頁、２０１２年 Ｆｒａｎｃｏｉｓ　Ｇｒｏｓ－Ｌｏｕｉｓら、Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ　ｅｔ　Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ　Ａｃｔａ、１７６２巻、９５６～９７２頁、２００６年
　本発明は、ヒト由来の多能性幹細胞から酸化ストレスによる傷害を受けた神経細胞を製造する方法、並びにヒト由来の多能性幹細胞から酸化ストレスによる傷害を受けた神経細胞を製造することができる、細胞の培養方法を提供することを解決すべき課題とする。本発明はさらに、酸化ストレスによる傷害を受けた神経細胞を提供することを解決すべき課題とする。本発明はさらに、上記神経細胞を用いた、被験物質の評価方法、神経変性疾患の予防および／または治療薬のスクリーニング方法、ネクロトーシス阻害剤のスクリーニング方法、およびフェロトーシス阻害剤のスクリーニング方法を提供することを解決すべき課題とする。
　本発明者らは上記課題を解決するために鋭意検討した結果、ヒト由来の多能性幹細胞から分化誘導した神経細胞を、抗酸化剤を実質的に含まず、かつ酸化剤を実質的に含まない培養培地を用いて２０．０×１０４細胞／ｃｍ２以下の細胞密度で播種し、さらに抗酸化剤を実質的に含まず、かつ酸化剤を実質的に含まない培養培地を用いて培養することによって、酸化ストレスによる傷害を受けた神経細胞を製造できることを見出した。本発明はこれらの知見に基づいて完成したものである。
　即ち、本発明によれば、以下の発明が提供される。
＜１＞　ヒト由来の多能性幹細胞から分化誘導した神経細胞を、抗酸化剤を実質的に含まず、かつ酸化剤を実質的に含まない培養培地を用いて２０．０×１０４細胞／ｃｍ２以下の細胞密度で播種する工程ａと、抗酸化剤を実質的に含まず、かつ酸化剤を実質的に含まない培養培地を用いて培養する工程ｂとを含む、酸化ストレスによる傷害を受けた神経細胞の製造方法。
＜２＞　細胞密度が、０．２×１０４細胞／ｃｍ２以上２０．０×１０４細胞／ｃｍ２以下である、＜１＞に記載の製造方法。
＜３＞　ヒト由来の多能性幹細胞が、疾患関連遺伝子に変異がない多能性幹細胞である、＜１＞または＜２＞に記載の製造方法。
＜４＞　上記神経細胞が、運動神経細胞、大脳皮質興奮神経細胞または黒質神経細胞である、＜１＞～＜３＞のいずれか１つに記載の製造方法。
＜５＞　酸化ストレスによる傷害を受けた神経細胞が、以下の（i）～（iv）：
（i）酸化ストレスに関連するマーカーが陽性である；
（ii）神経突起が退縮している；
（iii）ネクロトーシスが誘導されている；および
（iv）フェロトーシスが誘導されている：
のうちの少なくとも一以上を満たす、＜１＞～＜４＞のいずれか１つに記載の製造方法。
＜６＞　ヒト由来の多能性幹細胞から分化誘導した神経細胞を、抗酸化剤を実質的に含まず、かつ酸化剤を実質的に含まない培養培地を用いて２０．０×１０４細胞／ｃｍ２以下の細胞密度で播種する工程ａと、抗酸化剤を実質的に含まず、かつ酸化剤を実質的に含まない培養培地を用いて培養する工程ｂとを含む、細胞の培養方法。
＜７＞　上記細胞密度が、０．２×１０４細胞／ｃｍ２以上２０．０×１０４細胞／ｃｍ２以下である、＜６＞に記載の培養方法。
＜８＞　ヒト由来の多能性幹細胞が、疾患関連遺伝子に変異がない多能性幹細胞である、＜６＞または＜７＞に記載の培養方法。
＜９＞　上記神経細胞が、運動神経細胞、大脳皮質興奮神経細胞または黒質神経細胞である、＜６＞～＜８＞のいずれか１つに記載の培養方法。
＜１０＞　＜１＞に記載の製造方法により得られる、以下の（i）～（iv）：
（i）酸化ストレスに関連するマーカーが陽性である；
（ii）神経突起の長さが退縮している；
（iii）ネクロトーシスが誘導されている；および
（iv）フェロトーシスが誘導されている：
のうちの少なくとも一以上を満たす、神経細胞。
＜１１＞　上記神経細胞が、運動神経細胞、大脳皮質興奮神経細胞または黒質神経細胞である、＜１０＞に記載の細胞。
＜１２＞　＜１０＞に記載の神経細胞と被験物質とを接触させることを含む、被験物質の評価方法。
＜１３＞　＜１＞に記載の方法により＜１０＞に記載の神経細胞を製造することをさらに含み、上記神経細胞と被験物質とを接触させる、＜１２＞に記載の被験物質の評価方法。
＜１４＞　＜１０＞に記載の神経細胞と被験物質とを接触させることを含む、神経変性疾患の予防および／または治療薬のスクリーニング方法。
＜１５＞　＜１＞に記載の方法により＜１０＞に記載の神経細胞を製造することをさらに含み、上記神経細胞と被験物質とを接触させる、＜１４＞に記載のスクリーニング方法。
＜１６＞　上記神経変性疾患が、アルツハイマー病（ＡＤ）、脊髄小脳変性症、前頭側頭葉変性症（ＦＴＬＤ）、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、レビー小体病、ハンチントン病、ニーマンピック病からなる群から選択される、＜１４＞に記載のスクリーニング方法。
＜１７＞　＜１０＞に記載の神経細胞と被験物質とを接触させた後に、
（Ａ）上記被験物質と接触させた神経細胞、および上記被験物質を接触させなかった対照の神経細胞とを培養する工程、
（Ｂ）上記神経細胞における神経傷害を測定する工程、および
（Ｃ）被験物質と接触させなかった対照と比較して、上記神経傷害を抑制する被験物質を、神経変性疾患の予防および／または治療薬の候補として選択する工程、
を含む、＜１４＞に記載のスクリーニング方法。
＜１８＞　上記工程（Ｂ）が、上記工程（Ａ）で得られた神経細胞の細胞数および／または神経突起長を測定する工程である、＜１７＞に記載のスクリーニング方法。
＜１９＞　上記工程（Ｃ）が、上記被験物質と接触させた神経細胞の細胞数および／または神経突起長が、対照よりも高値であった被験物質を、神経変性疾患の予防および／または治療薬の候補として選択する工程である、＜１７＞または＜１８＞に記載の方法。
＜２０＞　（１）＜１０＞に記載の神経細胞と被験物質とを接触させる工程、
（２）上記工程（１）で上記被験物質と接触させた神経細胞、および上記被験物質を接触させなかった対照の神経細胞を培養する工程、
（３）上記神経細胞における神経傷害を測定する工程、および
（４）被験物質と接触させなかった対照と比較して、上記神経傷害を抑制する被験物質を、ネクロトーシス阻害剤の候補として選択する工程、
を含む、ネクロトーシス阻害剤のスクリーニング方法。
＜２１＞　＜１＞に記載の方法により＜１０＞に記載の神経細胞を製造することをさらに含み、上記神経細胞と被験物質とを接触させる、＜２０＞に記載のスクリーニング方法。
＜２２＞　（１）＜１０＞に記載の神経細胞と被験物質とを接触させる工程、
（２）上記工程（１）で上記被験物質と接触させた神経細胞、および上記被験物質を接触させなかった対照の神経細胞を培養する工程、
（３）上記神経細胞における神経傷害を測定する工程、および
（４）被験物質と接触させなかった対照と比較して、上記神経傷害を抑制する被験物質を、フェロトーシス阻害剤の候補として選択する工程、
を含む、フェロトーシス阻害剤のスクリーニング方法。
＜２３＞　＜１＞に記載の方法により＜１０＞に記載の神経細胞を製造することをさらに含み、上記神経細胞と被験物質とを接触させる、＜２２＞に記載のスクリーニング方法。
　本発明によれば、ヒト由来の多能性幹細胞から酸化ストレスによる傷害を受けた神経細胞を製造することができる。
図１は、培養４８時間後に培地交換した神経細胞の神経突起長を経時的に定量した結果を示す。 図２は、培養７２時間後に培地交換した神経細胞の神経突起長を経時的に定量した結果を示す。 図３は、培養９６時間後に培地交換した神経細胞の神経突起長を経時的に定量した結果を示す。 図４は、細胞播種密度を０．３×１０４ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２にて播種した際の神経細胞の神経突起長を経時的に定量した結果を示す。 図５は、細胞播種密度を０．９×１０４ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２にて播種した際の神経細胞の神経突起長を経時的に定量した結果を示す。 図６は、細胞播種密度を１．９×１０４ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２にて播種した際の神経細胞の神経突起長を経時的に定量した結果を示す。 図７は、細胞播種密度を４．７×１０４ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２にて播種した際の神経細胞の神経突起長を経時的に定量した結果を示す。 図８は、細胞播種密度を９．４×１０４ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２にて播種した際の神経細胞の神経突起長を経時的に定量した結果を示す。 図９は、細胞播種密度を１２．５×１０４ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２にて播種した際の神経細胞の神経突起長を経時的に定量した結果を示す。 図１０は、基礎培地としてＢｒａｉｎＰｈｙｓ培地を使用して培養した神経細胞の神経突起長を経時的に定量した結果を示す。 図１１は、基礎培地としてＮｅｕｒｏｂａｓａｌ培地を使用して培養した神経細胞の神経突起長を経時的に定量した結果を示す。 図１２は、培養３日目から６日目までの培地中のＬＤＨ量を定量した結果を示す。 図１３は、培養６日後の神経細胞の細胞内のＲＯＳを定量した結果を示す。 図１４は、ネクロトーシス阻害剤（ネクロスタチン－1）を処理した神経細胞の神経突起長を経時的に定量した結果、および代表的な細胞の画像を示す。（Ａ）神経突起長の経時変化、（Ｂ～Ｄ）培養６日目の画像、（Ｂ）Ｓｔｒｅｓｓ（－）、（Ｃ）Ｓｔｒｅｓｓ（＋）、（Ｄ）２０μＭ　Ｎｅｃｒｏｓｔａｔｉｎ－１ 図１５は、フェロトーシス阻害剤（フェロスタチン－1）を処理した神経細胞の神経突起長を経時的に定量した結果を示す。 図１６は、フェロトーシス阻害剤（リプロキシスタチン－1）を処理した神経細胞の神経突起長を経時的に定量した結果を示す。 図１７は、フェロトーシス阻害剤（ＵＡＭＣ－３２０３）を処理した神経細胞の神経突起長を経時的に定量した結果を示す。 図１８は、化合物ライブラリーの各種化合物を処理した神経細胞の神経突起長の１４日間の経時的な曲線から曲線下面積（ＡＵＣ）を算出した結果を示す。 図１９は、ＡＬＳ治療薬（エダラボン）を処理した神経細胞の神経突起長を経時的に定量した結果を示す。
　以下、本発明の実施の形態について詳細に説明する。
　本発明は、ヒト由来の多能性幹細胞から分化誘導した神経細胞を、抗酸化剤を実質的に含まず、かつ酸化剤を実質的に含まない培養培地を用いて２０．０×１０４細胞／ｃｍ２以下の細胞密度で播種する工程ａと、抗酸化剤を実質的に含まず、かつ酸化剤を実質的に含まない培養培地を用いて培養する工程ｂとを含む、酸化ストレスによる傷害を受けた神経細胞の製造方法に関する。即ち、本発明においては、ヒト由来の多能性幹細胞から製造した神経細胞に弱い酸化ストレスを慢性的に与えることにより、酸化ストレスによる傷害を受けた神経細胞を製造することができる。
　本発明はさらに、ヒト由来の多能性幹細胞から分化誘導した神経細胞を、抗酸化剤を実質的に含まず、かつ酸化剤を実質的に含まない培養培地を用いて２０．０×１０４細胞／ｃｍ２以下の細胞密度で播種する工程ａと、抗酸化剤を実質的に含まず、かつ酸化剤を実質的に含まない培養培地を用いて培養する工程ｂとを含む、細胞の培養方法に関する。即ち、本発明においては、ヒト由来の多能性幹細胞から分化誘導した神経細胞に弱い酸化ストレスを慢性的に与えることにより、酸化ストレスによる傷害を受けた神経細胞を培養することができる。
　本発明による神経細胞の製造方法および細胞の培養方法において、播種時の細胞密度は、２０．０×１０４細胞／ｃｍ２以下であればよい。従来においては、酸化ストレスによる神経傷害を惹起するために、外因性の酸化剤を添加したり、疾患関連遺伝子に変異の入った患者由来の神経細胞を使用する必要があった。本発明においては、疾患関連遺伝子に変異のない検体由来のｉＰＳ細胞から作製した神経細胞であっても、慢性的な酸化ストレスによる細胞傷害を誘導することを可能とする細胞密度を見出した。
　播種時の細胞密度は、本発明の製造方法および細胞の培養方法により得られた細胞を被験物質の評価に用いる観点で、慢性的な酸化ストレスによる細胞傷害の有無が判定できる範囲に設定することが好ましい。細胞密度の下限値は、特に制限されないが、例えば、０．２×１０４細胞／ｃｍ２以上であることが好ましく、０．３×１０４細胞／ｃｍ２以上であることがより好ましく、１．０×１０４細胞／ｃｍ２以上であることがさらに好ましく、２．０×１０４細胞／ｃｍ２以上であることがよりさらに好ましく、３．０×１０４細胞／ｃｍ２以上であることが特に好ましく、４．０×１０４細胞／ｃｍ２以上であることが最も好ましい。細胞密度の上限値は、例えば、２０．０×１０４細胞／ｃｍ２以下であってもよく、２０．０×１０４細胞／ｃｍ２未満が好ましく、１２．５×１０４細胞／ｃｍ２以下がより好ましく、１２．０×１０４細胞／ｃｍ２以下がさらに好ましく、１１．０×１０４細胞／ｃｍ２以下がよりさらに好ましく、１０．０×１０４細胞／ｃｍ２以下が特に好ましい。細胞密度は、好ましくは０．２×１０４細胞／ｃｍ２以上２０．０×１０４細胞／ｃｍ２以下であり、より好ましくは０．３×１０４細胞／ｃｍ２以上２０．０×１０４細胞／ｃｍ２以下であり、さらに好ましくは１．０×１０４細胞／ｃｍ２以上２０．０×１０４細胞／ｃｍ２以下であり、よりさらに好ましくは３．０×１０４細胞／ｃｍ２以上１２．５×１０４細胞／ｃｍ２以下であり、特に好ましくは４．０×１０４細胞／ｃｍ２以上１０．０×１０４細胞／ｃｍ２以下である。
　ヒト由来の多能性幹細胞としては、ヒトｉＰＳ細胞（human induced pluripotent stem cells）、ヒトＥＳ細胞（human embryonic stem cells）、ヒト間葉系幹細胞などを挙げることができる。ヒトｉＰＳ細胞が好ましいが、特に限定されない。ヒトｉＰＳ細胞とは、ヒト細胞から作製されたｉＰＳ細胞である。
　ヒト由来の多能性幹細胞としては、疾患関連遺伝子に変異がない多能性幹細胞であることが好ましい。「疾患関連遺伝子に変異がない」とは、神経系疾患の原因となるような疾患関連遺伝子の変異を有しないことを意味する。即ち、遺伝子に変異があっても、疾患の原因とならないような変異である場合には、疾患関連遺伝子に変異がないと解釈するものとする。
　ＥＳ細胞は、例えば、着床以前の初期胚、上記の初期胚を構成する内部細胞塊、単一割球などを培養することによって樹立することができる（Manipulating the Mouse Embryo A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1994); Thomson, J.A. et al., Science, 282, 1145-1147 (1998)）。初期胚として、体細胞の核を核移植することによって作製された初期胚を用いてもよい（Wilmut et al. (Nature, 385, 810 (1997))、Cibelli et al. (Science, 280, 1256 (1998)）、入谷明ら（蛋白質核酸酵素，44, 892 (1999)）、Baguisi et al.（Nature Biotechnology, 17, 456 (1999)）、Wakayama et al.（Nature, 394, 369 (1998); Nature Genetics, 22, 127 (1999); Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 96, 14984 (1999)）、Rideout III et al.（Nature Genetics, 24, 109 (2000）、Tachibana et al.（Human Embryonic Stem Cells Derived by Somatic Cell Nuclear Transfer, Cell (2013) in press）。初期胚として、単為発生胚を用いてもよい（Kim et al. (Science, 315, 482-486 (2007)）、Nakajima et al.（Stem Cells, 25, 983-985 (2007)）、Kim et al. （Cell Stem Cell, 1, 346-352 (2007)）、Revazova et al.（Cloning Stem Cells, 9, 432-449 (2007)）、Revazova et al.（Cloning Stem Cells, 10, 11-24 (2008)）。上掲の論文の他、ＥＳ細胞の作製についてはStrelchenko N., et al. Reprod Biomed Online.9: 623-629, 2004; KlimanskayaI., et al. Nature 444: 481-485, 2006; Chung Y., et al. Cell Stem Cell 2: 113-117, 2008; Zhang X., et al. Stem Cells 24: 2669-2676, 2006; Wassarman, P.M. et al. Methods in Enzymology, Vol.365, 2003などが参考になる。
なお、ＥＳ細胞と体細胞の細胞融合によって得られる融合ＥＳ細胞も、本発明の方法に用いられる胚性幹細胞に含まれる。
　ＥＳ細胞の中には、保存機関から入手可能なもの、或いは市販されているものもある。例えば、ヒトＥＳ細胞については京都大学再生医科学研究所（例えばＫｈＥＳ－１、ＫｈＥＳ－２およびＫｈＥＳ－３）、ＷｉＣｅｌｌＲｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ、ＥＳＩＢＩＯなどから入手可能である。
　ｉＰＳ細胞は、初期化因子の導入により体細胞を初期化（リプログラミング）することによって作製される、多能性（多分化能）と増殖能を有する細胞を意味する。ｉＰＳ細胞はＥＳ細胞に近い性質を示す。ｉＰＳ細胞の作製に使用する体細胞は特に限定されず、分化した体細胞でもよいし、未分化の幹細胞でもよい。ｉＰＳ細胞は、公知の方法などにより作製することができる。また、今後開発されるｉＰＳ細胞作製法を適用することも当然に想定される。
  ｉＰＳ細胞の作製法の最も基本的な手法は、転写因子であるＯｃｔ３／４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４およびｃ－Ｍｙｃの４因子を、ウイルスを利用して細胞へ導入する方法である（Takahashi K, Yamanaka S: Cell 126 (4), 663-676, 2006; Takahashi K,  et al: Cell 131 (5), 861-72, 2007）。ヒトｉＰＳ細胞についてはＯｃｔ４、Ｓｏｘ２、Ｌｉｎ２８およびＮｏｎｏｇの４因子の導入による樹立の報告がある（Yu J, et al: Science 318 (5858), 1917-1920, 2007）。ｃ－Ｍｙｃを除く３因子（Nakagawa M, et al: Nat.Biotechnol. 26 (1), 101-106, 2008）、Ｏｃｔ３／４およびＫｌｆ４の２因子（Kim J B, et al: Nature 454 (7204), 646-650, 2008）、或いはＯｃｔ３／４のみ（Kim J B, et al: Cell 136 (3), 411-419, 2009）の導入によるｉＰＳ細胞の樹立も報告されている。また、遺伝子の発現産物であるタンパク質を細胞に導入する手法（Zhou H, Wu S, Joo JY, et al: Cell Stem Cell 4, 381-384, 2009; Kim D, Kim CH, Moon JI, et al: Cell Stem Cell 4, 472-476, 2009）も報告されている。一方、ヒストンメチル基転移酵素Ｇ９ａに対する阻害剤ＢＩＸ－０１２９４やヒストン脱アセチル化酵素阻害剤バルプロ酸（ＶＰＡ）或いはＢａｙＫ８６４４などを使用することによって作製効率の向上や導入する因子の低減などが可能であるとの報告もある（Huangfu D, et al: Nat.Biotechnol. 26 (7), 795-797, 2008; Huangfu D, et al: Nat.Biotechnol. 26 (11), 1269-1275, 2008; Silva J, et al: PLoS.Biol. 6 (10), e253, 2008）。遺伝子導入法についても検討が進められ、レトロウイルスの他、レンチウイルス（Yu J, et al: Science 318 (5858), 1917-1920, 2007）、アデノウイルス（Stadtfeld M, et al: Science 322 (5903), 945-949, 2008）、プラスミド（Okita K, et al: Science322 (5903), 949-953, 2008）、トランスポゾンベクター（Woltjen K, Michael IP, Mohseni P, et al: Nature 458, 766-770, 2009; Kaji K, Norrby K, Pac a A, et al: Nature 458, 771-775, 2009; Yusa K, Rad R, Takeda J, et al: Nat.Methods 6, 363-369, 2009）、或いはエピソーマルベクター（Yu J, Hu K, Smuga-Otto K, Tian S, et al: Science 324, 797-801, 2009）を遺伝子導入に利用した技術が開発されている。
  ｉＰＳ細胞への形質転換、即ち初期化（リプログラミング）が生じた細胞はＦｂｘｏ１５、Ｎａｎｏｇ、Ｏｃｔ３／４、Ｆｇｆ－４、Ｅｓｇ－１およびＣｒｉｐｔなどの多能性幹細胞マーカー（未分化マーカー）の発現などを指標として選択することができる。選択された細胞をｉＰＳ細胞として回収することができる。
　ｉＰＳ細胞の作製法として、遺伝子発現による直接初期化で製造する方法以外に、化合物の添加などにより体細胞からｉＰＳ細胞を誘導することもできる（Hou P et al: Science 341 (6146), 651-654, 2013）。
  ｉＰＳ細胞は、例えば、ＦＵＪＩＦＩＬＭ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｄｙｎａｍｉｃｓ，Ｉｎｃ．（ＦＣＤＩ）、国立大学法人京都大学、または独立行政法人理化学研究所バイオリソースセンターから提供を受けることもできる。
　ヒト由来の多能性幹細胞から分化誘導した神経細胞の入手方法としては、例えば、神経系疾患の原因となる疾患関連遺伝子の変異や神経系疾患を有しない健康なヒト（健常者）から採取した体細胞、または神経系疾患を有する患者から採取した体細胞より作製したヒトｉＰＳ細胞から誘導すること、株化されたヒトｉＰＳ細胞から誘導することなどにより入手することが挙げられる。
　ヒト由来の多能性幹細胞から分化誘導した神経細胞は、特に限定されないが、好ましくは、運動神経細胞、大脳皮質興奮神経細胞または黒質神経細胞であり、特に好ましくは、運動神経細胞または大脳皮質興奮神経細胞である。
　ヒト由来の多能性幹細胞から神経細胞を分化誘導するための方法としては、特に限定されないが、低分子化合物処置などを用いて多能性幹細胞から神経幹細胞を作製後、神経細胞へ誘導する方法と、遺伝子発現などにより神経細胞へ直接誘導する方法がある。
　 多能性幹細胞から神経細胞を分化誘導方法としては、例えば、
（１）無血清培地中で培養して胚様体（神経前駆細胞を含む細胞塊）を形成させて分化させる方法（ＳＦＥＢ法：Watanabe K., et al, Nat.Neurosci., 8: 288-296, 2005；ＳＦＥＢｑ法：Wataya T., et al Proc.Natl.Acad.Sci.USA., 105: 11796-11801, 2008）；
（２）ストローマ細胞上で培養して分化させる方法（ＳＤＩＡ法：Kawasaki H., et al, Neuron, 28: 31-40, 2000）；
（３）薬剤を添加したマトリゲル上で培養して分化させる方法（Chambers S.M., et al, Nat.Biotechnol., 27: 275-280, 2009）；
（４）サイトカインの代替物として低分子化合物を含む培地中で培養して分化する方法（米国特許第5,843,780号）；
（５）多能性幹細胞に神経誘導因子（neurogenin2（Ｎｇｎ２）など）を導入し発現させることで分化させる方法（WO2014/148646；およびZhang Y., et al, Neuron, 78: 785-98, 2013）；
（６）多能性幹細胞にｍｉＲ－９／９＊－１２４を導入し発現させることで分化させる方法；
およびこれらの方法の組み合わせなどが挙げられる。
　上記のうち、（５）多能性幹細胞にｎｅｕｒｏｇｅｎｉｎ２を導入して発現させる方法は、短期間かつ高効率で成熟した神経細胞が得られることから好ましい。
　 Ｎｅｕｒｏｇｅｎｉｎ２タンパク質は発生期において神経細胞への分化を促進することが知られる転写因子であり、そのアミノ酸配列はヒトではＮＰ＿０７６９２４、マウスではＮＰ＿０３３８４８で例示される。ｎｅｕｒｏｇｅｎｉｎ２遺伝子（Official full name: ｎｅｕｒｏｇｅｎｉｎ２、Official symbol: ＮＥＵＲＯＧ２、Ｎｇｎ２遺伝子とも呼ばれる）はＮｅｕｒｏｇｅｎｉｎ２タンパク質をコードするＤＮＡのことであり、例えば、標準配列として登録されているＮＭ＿００９７１８（マウス）もしくはＮＭ＿０２４０１９（ヒト）、またはそれらの転写派生体（transcript variant）のヌクレオチド配列を有するＤＮＡが挙げられる。
また、上記標準配列および転写派生体の配列を有する核酸に、ストリンジェントな条件でハイブリダイズすることができる程度の相補性を有するＤＮＡであってもよい。
　ヒトｉＰＳ細胞から分化誘導した大脳皮質興奮神経細胞としては、ヒトｉＰＳ細胞からＮｇｎ２遺伝子を強制発現することにより作製した細胞を使用することが好ましい。
　ヒト由来の多能性幹細胞から分化誘導した神経細胞としては、市販の神経細胞を使用してもよく、例えば、ｉＣｅｌｌ（商標）運動神経細胞（ＦＣＤＩ，Ｃ１０５０、Ｃ１０４８）などを使用してもよい。
　ヒト由来の多能性幹細胞から分化誘導した黒質神経細胞としては、市販の神経細胞を使用してもよく、例えば、ｉＣｅｌｌ（商標）ドーパミン神経細胞（ＦＣＤＩ，Ｃ１０８７、Ｃ１０２８）などを使用してもよい。
　神経細胞は、好ましくは、β－ＩＩＩ　ｔｕｂｕｌｉｎ、ＮｅｕＮ、Ｎ－ＣＡＭ（neural cell adhesion molecule）、ＭＡＰ２（microtubule-associated protein 2）からなる神経細胞に特異的なマーカー遺伝子を少なくとも１以上発現し、かつ、β－ＩＩＩ　ｔｕｂｕｌｉｎ陽性の突起（以降、神経突起と呼ぶ）を有する細胞である。
　マーカー遺伝子の発現レベルは、通常、遺伝子に対応する転写産物の産生量、またはその翻訳産物の産生量、活性などにより解析することができる。発現レベルの測定は、遺伝子の転写産物であるｍＲＮＡや遺伝子の翻訳産物であるタンパク質の測定により行うことができるが、ｍＲＮＡまたはその逆転写産物であるｃＤＮＡの測定により行うことが好ましい。翻訳産物（タンパク質）の発現の検出または測定は、抗体を用いて細胞内のタンパク質を検出する免疫細胞染色により行うことができる。
　本発明における神経細胞の培養は、使用する神経細胞に応じた培地、温度、その他の条件を選択して実施すればよい。
　本発明においては、抗酸化剤を実質的に含まず、かつ酸化剤を実質的に含まない培養培地を使用する。
　抗酸化剤としては、ビタミンＡ、グルタチオン、ビタミンＥまたはその誘導体、スーパーオキシドジスムターゼ（Super Oxide Dismutase、ＳＯＤ）、およびカタラーゼなどが挙げられる。
　酸化剤としては、過酸化水素、アルセナイト、およびニトロプルシドナトリウムなどが挙げられる。
　「実質的に含まない」とは、抗酸化剤または酸化剤が、その機能を発揮する量では含まれていないことを意味する。
　神経細胞の培養を妨害しない限り、培養培地中には培養の目的に合った因子などの任意の成分や添加剤が含まれていてもよい。
　培地は、公知の培地または市販の培地から選択することができる。培養に用いる培地は、基礎培地へ添加剤を加えて用いることができる。ここで、基礎培地は、例えば、ＤＭＥＭ、ＤＭＥＭ（ダルベッコ改変イーグル培地）／Ｆ１２、ＢｒａｉｎＰｈｙｓ　Ｎｅｕｒｏｎａｌ　Ｍｅｄｉｕｍ、Ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ　Ｍｅｄｉｕｍ－Ａ、Ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ　Ｍｅｄｉｕｍ、Ｎｅｕｒａｌ　Ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ　Ｂａｓａｌ　Ｍｅｄｉｕｍ、ＮＳ－Ａ　Ｂａｓａｌ　Ｍｅｄｉｕｍ、Ｂａｓａｌ　Ｍｅｄｉｕｍ　Ｅａｇｌｅ　（ＢＭＥ）、ＢＧＪｂ　Ｍｅｄｉｕｍ、ＣＭＲＬ　１０６６　Ｍｅｄｉｕｍ、Ｇｌａｓｇｏｗ　Ｍｉｎｉｍｕｍ　Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ　Ｍｅｄｉｕｍ（ＭＥＭ）、Ｉｍｐｒｏｖｅｄ　ＭＥＭ　Ｚｉｎｃ　Ｏｐｔｉｏｎ、Ｉｓｃｏｖｅ’ｓ　Ｍｏｄｉｆｉｅｄ　Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ　Ｍｅｄｉｕｍ（ＩＭＤＭ）、Ｍｅｄｉｕｍ　１９９、Ｅａｇｌｅ　ＭＥＭ、αＭＥＭ、Ｈａｍ’ｓ　Ｆ１２　Ｍｅｄｉｕｍ、ＲＰＭＩ　１６４０　Ｍｅｄｉｕｍ、およびＦｉｓｃｈｅｒ’ｓ　Ｍｅｄｉｕｍなどが挙げられる。ＤＭＥＭ／Ｆ１２またはＢｒａｉｎＰｈｙｓ　Ｎｅｕｒｏｎａｌ　Ｍｅｄｉｕｍが好ましく、ＤＭＥＭ／Ｆ１２がより好ましい。また、培地は、単一の培地を用いてもよく、２種以上の培地を組み合わせて用いてもよい。
　添加剤は、実質的に抗酸化作用を示さないもの、および実質的に抗酸化作用を示さない濃度ならば添加してもよい。具体的には血清、レチノイン酸、Ｗｎｔ、ＢＭＰ、ｂＦＧＦ、ＥＧＦ、ＨＧＦ、Sonic hedgehog（Ｓｈｈ）、インターロイキン類、ヘパリン、ヘパラン硫酸、コラーゲン、フィブロネクチン、プロゲステロン、セレナイト、Ｂ－２７（商標）サプリメント（酸化防止剤不含）、ＩＴＳ－サプリメントなどが挙げられるが、特に限定されない。好ましい添加剤は、Ｂ－２７（商標）サプリメント（酸化防止剤不含）である。
　神経細胞の培養条件としては、一般的な細胞培養の条件を選択すればよい。３７℃、５％ＣＯ２の条件などが例示される。培養中は適切な間隔（好ましくは１日から７日に１回、より好ましくは２日から３日に１回）で培地交換をしてもよいが、培養期間中に培地交換をしないことが好ましい。
　神経細胞は、二次元培養することが好ましい。細胞の培養には、プレート、ディッシュ、セルカルチャーインサート、細胞培養用フラスコなどの細胞培養容器を使用することができる。
　本発明による神経細胞の製造方法により製造される、酸化ストレスによる傷害を受けた神経細胞は、好ましくは以下の（i）～（iv）：
（i）酸化ストレスに関連するマーカーが陽性である；
（ii）神経突起が退縮している；
（iii）ネクロトーシスが誘導されている；および
（iv）フェロトーシスが誘導されている：
のうちの少なくとも一以上（好ましくは二つ、より好ましくは三つ全て）を満たす。本発明によれば、本発明による神経細胞の製造方法により製造される上記の（i）～（iv）のうちの少なくとも一以上を満たす、神経細胞が提供される。本発明の神経細胞は、特には限定されないが、好ましくは、運動神経細胞、大脳皮質興奮神経細胞または黒質神経細胞であり、より好ましくは、運動神経細胞または大脳皮質興奮神経細胞である。
　酸化ストレスに関連するマーカーとしては、酸化ストレスマーカー、および酸化ストレスに起因する二次的なマーカーが挙げられる。
　酸化ストレスマーカーとしては、活性酸素種（Reactive Oxygen Species、ＲＯＳ）、活性酸素によって生じた生体内産物、抗酸化酵素、および抗酸化物質などが挙げられる。ＲＯＳとしては、スーパーオキシドアニオンラジカル（Ｏ２・－）、過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）、ヒドロキシラジカル（・ＯＨ）、一重項酸素（１Ｏ２）、一酸化窒素（ＮＯ・）、二酸化窒素（ＮＯ２・）、オゾン（Ｏ３）、および過酸化脂質（ＬＯＯＨ）などが挙げられる。活性酸素によって生じた生体内産物としては、hydroxydeoxyguanosine（８－ＯＨｄＧ）、8-hydroxyguanosine（８－ＯＨＧ）、および過酸化脂質などが挙げられる。抗酸化酵素としては、ＳＯＤ、カタラーゼ、およびＧＰｘなどが挙げられる。抗酸化物質としては、グルタチオン（ＧＳＨ／ＧＳＳＧ）、ビリルビン、およびビタミン類などが挙げられる。
　酸化ストレスに起因する二次的なマーカーとしては、ＴＡＲ　ＤＮＡ結合タンパク質４３（ＴＤＰ－４３）タンパク質、アミロイドβタンパク質、タウタンパク質、およびαシヌクレインのリン酸化、蓄積、凝集などが挙げられる。
　酸化ストレスに関連するマーカーとしては、ＲＯＳ、８－ＯＨｄＧ、８－ＯＨＧ、過酸化脂質、グルタチオン、ＴＤＰ－４３タンパク質、アミロイドβタンパク質、タウタンパク質またはαシヌクレインが好ましく、ＲＯＳがより好ましい。
　活性酸素種（ＲＯＳ）が陽性であるとは、抗酸化剤を含む培養培地を用いて培養した細胞におけるＲＯＳのレベルと比較して、ＲＯＳのレベルが高いことを示す。細胞内のＲＯＳのレベルの定量は、ＣｅｌｌＲＯＸ（商標）Ｇｒｅｅｎ　Ｒｅａｇｅｎｔ，ｆｏｒ　ｏｘｉｄａｔｉｖｅ　ｓｔｒｅｓｓ　ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｃ１０４４４）などの市販試薬を用いて行うことができる。
　神経突起が退縮していることは、神経突起長を測定することにより確認することができる。例えば、神経突起長はＩｎｃｕＣｙｔｅ　Ｓ３のＮｅｕｒｏｔｒａｃｋソフトウェア（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ，９６００－００１０）を用いて定量することができる。
　ネクロトーシスが誘導されているかどうかは、例えば、ネクロトーシス阻害剤（例えば、ネクロスタチン－１）で細胞を処理した場合と、ネクロトーシス阻害剤（例えば、ネクロスタチン－１）で細胞を処理しない場合とについて、酸化ストレスによる傷害の程度を評価し、ネクロトーシス阻害剤（例えば、ネクロスタチン－１）で細胞を処理した場合に傷害の程度が減少した場合には、ネクロトーシスが誘導されていると判定することができる。また、ネクロトーシスに関連するマーカーとして知られているreceptor interacting protein kinase 1（ＲＩＰＫ１）、receptor interacting protein kinase 3（ＲＩＰＫ３）、およびMixed lineage kinase domain-like protein（ＭＬＫＬ）などのリン酸化を定量することでもネクロトーシスが誘導されているかどうか判定することができる。
　フェロトーシスが誘導されているかどうかは、例えば、フェロトーシス阻害剤（例えば、フェロスタチン－１、リプロキスタチン－１、または、ＵＡＭＣ－３２０３など）で細胞を処理した場合と、フェロトーシス阻害剤（例えば、フェロスタチン－１、リプロキスタチン－１、または、ＵＡＭＣ－３２０３など）で細胞を処理しない場合とについて、酸化ストレスによる傷害の程度を評価し、フェロトーシス阻害剤（例えば、フェロスタチン－１、リプロキスタチン－１、または、ＵＡＭＣ－３２０３など）で細胞を処理した場合に傷害の程度が減少した場合には、フェロトーシスが誘導されていると判定することができる。また、フェロトーシスに関連するマーカーとして知られている細胞内の二価鉄量や、脂質過酸化物（４－ヒドロキシノネナールやマロンジアルデヒド）を定量することでもフェロトーシスが誘導されているかどうか判定することができる。
　本発明によれば、酸化ストレスによる傷害を受けた神経細胞を製造することができる。酸化ストレスによる神経傷害を受けているかどうかの評価は、細胞死（神経細胞の細胞数）を評価すること、酸化ストレスに関連するマーカーを測定すること、細胞傷害を評価すること、神経傷害に関連するマーカーを測定すること、または神経突起長を測定することにより行うことができるが、特に限定されない。上記の中でも、細胞死（神経細胞の細胞数）を評価すること、または神経突起長を測定することが好ましい。
　細胞死は、Ｃｅｌｌ　Ｔｉｔｅｒ　Ｇｌｏ（プロメガ）やＣｅｌｌ ｃｏｕｎｔｉｎｇ  ｋｉｔ－８（同仁堂）などの生細胞検出試薬を使用するか、ＰｒｏｐｉｄｉｕｍＩｏｄｉｄｅやＮｕｃＧｒｅｅｎ Ｄｅａｄ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）などの細胞死検出試薬を使用して検出することができる。
　細胞傷害は、ＬＤＨアッセイ、ＷＳＴアッセイ、またはＡＴＰアッセイなどの評価方法を利用して評価することができる。例えば、ＬＤＨアッセイにはＣｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ　Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　ＫｉｔＰＬＵＳ（ＬＤＨ）（Ｓｉｇｍａ　ａｌｄｒｉｃｈ）などのキットを使用することができる。
　神経傷害に関するマーカーとしては、Ｅｎｏｌａｓｅ　２（Neuron-Specific Enolase）などが挙げられ、ＥＬＩＳＡ法を利用して測定することができる。
　本発明による酸化ストレスによる傷害を受けた神経細胞は、酸化ストレスが発症および進行に大きく関与することが知られている神経変性疾患に有用な新たな薬剤のスクリーニングに利用可能である。本発明による酸化ストレスによる傷害を受けた神経細胞は、特に、孤発性の慢性神経変性疾患の研究や、その治療薬開発、疾患バイオマーカー同定や診断薬開発に有用である。本発明においては、好ましくは疾患関連遺伝子に変異がない多能性幹細胞から製造した神経細胞を用いること、そして抗酸化剤を実質的に含まず、かつ酸化剤を実質的に含まない培養培地を使用して弱い酸化ストレスを慢性的に細胞に付与することにより、孤発性の慢性神経変性疾患を評価することが可能である。
　本発明においては、培養開始後２日以降に細胞死がみられるため、２週間程度までに薬剤の評価が可能である。さらに、本発明においては、ネクロトーシスによる細胞死が再現可能であることから、ネクロトーシス阻害剤のスクリーニングが可能である。さらに、本発明においては、フェロトーシスによる細胞死が再現可能であることから、フェロトーシス阻害剤のスクリーニングが可能である。
　即ち、本発明によれば、本発明による酸化ストレスによる傷害を受けた神経細胞と被験物質とを接触させることを含む、被験物質の評価方法が提供される。
　本発明によればさらに、本発明による神経細胞と被験物質とを接触させることを含む、神経変性疾患の予防および／または治療薬のスクリーニング方法が提供される。
　本発明によればさらに、
（１）本発明による神経細胞と被験物質とを接触させる工程、
（２）上記工程（１）で上記被験物質と接触させた神経細胞、および上記被験物質を接触させなかった対照の神経細胞を培養する工程、
（３）上記神経細胞における神経傷害を測定する工程、および
（４）被験物質と接触させなかった対照と比較して、上記神経傷害を抑制する被験物質を、ネクロトーシス阻害剤の候補として選択する工程、
を含む、ネクロトーシス阻害剤のスクリーニング方法が提供される。
　本発明によればさらに、
（１）本発明による神経細胞と被験物質とを接触させる工程、
（２）上記工程（１）で上記被験物質と接触させた神経細胞、および上記被験物質を接触させなかった対照の神経細胞を培養する工程、
（３）上記神経細胞における神経傷害を測定する工程、および
（４）被験物質と接触させなかった対照と比較して、上記神経傷害を抑制する被験物質を、フェロトーシス阻害剤の候補として選択する工程、
を含む、フェロトーシス阻害剤のスクリーニング方法が提供される。
　上記の被験物質の評価方法、神経変性疾患の予防および／または治療薬のスクリーニング方法、ネクロトーシス阻害剤のスクリーニング方法、およびフェロトーシス阻害剤のスクリーニング方法においては、本発明による酸化ストレスによる傷害を受けた神経細胞の製造方法により、本発明の神経細胞を製造することをさらに含んでいてもよい。
　被験物質としては、例えば、タンパク質、ペプチド、抗体、核酸（遺伝子発現ベクター、ｓｉＲＮＡ、アンチセンスオリゴヌクレオチド、ｍＲＮＡ）、ウイルスベクター（ＡＡＶ、レンチウイルス、アデノウイルスなど）、非ペプチド性化合物、合成化合物、合成低分子化合物、天然化合物、細胞抽出物、細胞外小胞、植物抽出物、動物組織抽出物、血漿、海洋生物由来の抽出物、細胞培養上清、および微生物発酵産物などが挙げられる。
　また、被験物質は、（１）生物学的ライブラリー法、（２）デコンヴォルーションを用いる合成ライブラリー法、（３）１ビーズ１化合物（ｏｎｅ－ｂｅａｄ  ｏｎｅ－ｃｏｍｐｏｕｎｄ）ライブラリー法、および（４）アフィニティクロマトグラフィー選別を使用する合成ライブラリー法を含む当技術分野で公知のコンビナトリアルライブラリー法における多くのアプローチのいずれかを使用して得ることができる。アフィニティクロマトグラフィー選別を使用する生物学的ライブラリー法はペプチドライブラリーに限定されるが、その他のアプローチはペプチド、非ペプチドオリゴマー、または化合物の低分子化合物ライブラリーに適用できる（Lam (1997) Anticancer Drug Des. 12: 145-67）。分子ライブラリーの合成方法の例は、当技術分野において見出され得る（DeWitt et  al. (1993) Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90: 6909-13; Erb et al. (1994) Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91: 11422-6; Zuckermann et al. (1994) J.Med.Chem. 37: 2678-85; Cho et al. (1993) Science 261: 1303-5; Carell et al. (1994) Angew.Chem.Int.Ed.Engl. 33: 2059; Carell et.al. (1994) Angew.Chem.Int.Ed.Engl. 33: 2061; Gallop et al. (1994) J.Med.Chem. 37: 1233-51）。化合物ライブラリーは、溶液（Houghten(1992)Bio/Techniques 13: 412-21を参照のこと）またはビーズ（Lam (1991) Nature 354: 82-4）、チップ（Fodor (1993) Nature 364: 555-6）、細菌（米国特許第5,223,409号）、胞子（米国特許第5,571,698号、同第5,403,484号、および同第5,223,409号）、プラスミド（Cull et al. (1992) Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89: 1865-9）もしくはファージ（Scott and Smith (1990) Science 249: 386-90; Devlin (1990) Science  249: 404-6; Cwirla et al. (1990) Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87: 6378-82; Felici (1991) J.Mol.Biol. 222: 301-10; 米国特許出願公開第2002/0103360号）として作製され得る。
　神経細胞と被験物質とを接触させることは、神経細胞の培養液へ被験物質を添加することで行ってもよい。接触は、指標の変化が確認できる時間であれば、特に限定されないが、例えば、１日以上、２日以上、３日以上、４日以上、５日以上、６日以上、７日以上である。添加される被験物質の濃度は化合物の種類（溶解性、毒性など）によって適宜調節可能である。
　神経細胞と被験物質とを接触させる際に用いる、神経細胞の培養液は、神経細胞を培養できる培地であれば、特に限定されない。
 被験物質と神経細胞を接触させる際の培養温度は、特に限定されないが、約３０～４０℃、好ましくは約３７℃であり、ＣＯ２含有空気の雰囲気下で培養が行われ、ＣＯ２濃度は、好ましくは約２～５％である。
　神経変性疾患としては、アルツハイマー病（ＡＤ）、脊髄小脳変性症、前頭側頭葉変性症（ＦＴＬＤ）、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、レビー小体病、ハンチントン病、およびニーマンピック病などを挙げることができる。神経変性疾患としては、アルツハイマー病（ＡＤ）、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、ハンチントン病またはニーマンピック病が好ましく、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）がより好ましい。
　ネクロトーシスが関与する疾患としては、神経変性疾患、急性腎障害、アルコール性肝障害、非アルコール性脂肪性肝疾患、非アルコール性脂肪肝炎、急性肺障害、急性呼吸促迫症候群、全身性炎症反応症候群、慢性閉塞性肺疾患、特発性肺線維症、心不全、動脈硬化症、大動脈瘤、乾癬、関節リウマチ、急性骨髄性白血病、慢性リンパ性白血病、頭頸部扁平上皮癌、非小細胞肺癌、卵巣がん、結腸がん、子宮頸癌、悪性黒色腫、膠芽腫、肺癌、乳癌、膵癌などを挙げることができる。ネクロトーシスが関与する疾患としては、神経変性疾患が好ましく、多発性硬化症（MS）、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、アルツハイマー病（ＡＤ）、パーキンソン病（ＰＤ）が好ましく、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）がより好ましい。
　フェロトーシスが関与する疾患としては、神経変性疾患、加齢黄斑変性、フックス角膜内日ジストロフィー、慢性閉塞性肺疾患、放射線肺障害、急性肺障害、喘息、肺線維症、結核、緑膿菌感染、パラコート中毒、虚血性再灌流障害、アルコール性肝障害、自己免疫性肝炎、非アルコール性脂肪肝炎、アセトアミノフェン誘導性肝障害、肝線維症、肝移植、急性膵炎、糖尿病、膵島移植、ヘモクロマトーシス、輸血関連免疫修飾、溶血性貧血、放射線誘発造血障害、脳室周囲白質軟化症、出血性／虚血性脳卒中、出血性認知症、外傷性脳損傷、てんかん、虚血再灌流障害、ドキソルビシン心筋症、鉄過負荷心筋症、心筋梗塞／線維症、アテローム性動脈硬化症、心移植、急性腎障害、多発性嚢胞腎、腎移植、クローン病、潰瘍性大腸炎、妊娠高血圧腎症、子宮内膜症、不妊症、神経芽腫、膠芽腫、大腸癌、肺癌、頭頸部癌、胃癌、膵管腺癌、乳癌、卵巣がん、肝細胞癌、腎細胞癌、バーキットリンパ腫などを挙げることができる。フェロトーシスが関与する疾患としては、神経変性疾患が好ましく、アルツハイマー病（ＡＤ）、パーキンソン病（ＰＤ）、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、ハンチントン病またはニーマンピック病が好ましく、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）がより好ましい。
　本発明の一態様においては、
　本発明による神経細胞と被験物質とを接触させた後に、
（Ａ）被験物質と接触させた神経細胞、および上記被験物質を接触させなかった対照の神経細胞とを培養する工程、
（Ｂ）上記神経細胞における神経傷害を測定する工程、および
（Ｃ）被験物質と接触させなかった対照と比較して、上記神経傷害を抑制する被験物質を、神経変性疾患の予防および／または治療薬の候補として選択する工程、
を行うことができる。
　好ましくは、工程（Ｂ）は、工程（Ａ）で得られた神経細胞の細胞数および／または神経突起長を測定する工程である。
　好ましくは、工程（Ｃ）は、上記被験物質と接触させた神経細胞の細胞数および／または神経突起長が、対照よりも高値であった被験物質を、神経変性疾患の予防および／または治療薬の候補として選択する工程である。
　以下の実施例により本発明を具体的に説明するが、本発明は実施例の範囲に限定されるものではない。
試験例１：細胞播種時から抗酸化剤を含まない培地にて培養した神経細胞、および細胞播種後に培地交換により抗酸化剤を含まない培地に置換して培養した神経細胞の神経突起長評価
＜プレートコーティング＞
　ｉＭａｔｒｉｘ－５１１　ｓｉｌｋ（Ｍａｔｒｉｘｏｍｅ，８９２０２１）をＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）にて１６．７倍希釈したものを、ＰＤＬ（ポリ－Ｄ－リジン）コーティングされた９６ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ，３５６４６１）に７０μＬ／ｗｅｌｌ加え、３時間から７２時間３７℃にてインキュベートした。
＜培地の準備＞
　抗酸化剤を含む培地には、＋ＡＯ培地にＤＭＳＯ（ジメチルスルホキシド）が０．１容量％（ｖ／ｖ）となるように加えたもの（Ｓｔｒｅｓｓ（－））、抗酸化剤を含まない培地には－ＡＯ培地にＤＭＳＯが０．１容量％（ｖ／ｖ）となるように加えたもの（Ｓｔｒｅｓｓ（＋））を使用した。
＜細胞播種＞
　ｉＰＳ細胞からＮｇｎ２遺伝子（Neurogenin2遺伝子）を強制発現（Chao Wang., et al, Stem Cell Reports., 9: 1221-1233, 2017）することにより作製した神経細胞（大脳皮質興奮神経細胞であると考えられる）を３７℃の温浴で解凍した。融解後、細胞を培地に添加し、６００×ｇ、室温で５分間遠心した。遠心後、上清を除去し、細胞を培地にて懸濁し、細胞数を計数した。その後、細胞を培地にて希釈し、２００μＬ／ｗｅｌｌ（９．４×１０４ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２）にて播種し、３７℃、５％ＣＯ２条件下にて培養した。６時間ごとにＩｎｃｕＣｙｔｅ　Ｓ３（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ，Ｉｎｃｕｃｙｔｅ　Ｓ３）にて撮影し、画像を取得した。培養後、４８、７２、または９６時間後に培地交換を実施した。
＜突起長の評価＞
　神経突起長はＩｎｃｕＣｙｔｅ　Ｓ３のＮｅｕｒｏｔｒａｃｋソフトウェア（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ，９６００－００１０）を用いて定量した。培養１４日後までに、抗酸化剤を含まない培地で培養したＳｔｒｅｓｓ（＋）の条件にて、突起退縮後のいずれかの時間の神経突起長（面積当たりの神経突起長の総和）が、抗酸化剤を含む培地で培養したＳｔｒｅｓｓ（－）群の神経突起長の最大値の半分以下になっている場合、突起が退縮していると判断した。神経突起長を定量した結果を図１～図３に示す。
　図１は培養４８時間後に培地交換した神経細胞の神経突起長を定量した結果である。縦軸は面積当たりの神経突起長の総和、横軸は培養日数を示す。その結果、初めから抗酸化剤を含まない培地で培養したＳｔｒｅｓｓ（＋）群（▲）では培養４日後以降に神経突起の退縮（神経傷害）が確認できた。一方で、初めから抗酸化剤を含む培地で培養したＳｔｒｅｓｓ（－）群（■）、初めは抗酸化剤を含む培地で培養し、４８時間後に同じ抗酸化剤を含む培地で培地交換した群（◆）、および初めは抗酸化剤を含む培地で培養し、４８時間後に抗酸化剤を含まない培地で培地交換した群（▼）では神経突起の退縮（神経傷害）は確認されなかった。培養７２時間後（図２）、または９６時間後に培地交換した細胞（図３）のいずれにおいても、初めから抗酸化剤を含まない培地で培養したＳｔｒｅｓｓ（＋）群（▲）でのみ培養４日後以降に神経突起の退縮（神経傷害）が確認できたが、初めから抗酸化剤を含む培地で培養したＳｔｒｅｓｓ（－）群（■）、初めは抗酸化剤を含む培地で培養し、同じ培地で培地交換した群（◆）、および初めは抗酸化剤を含む培地で培養し、抗酸化剤を含まない培地で培地交換した群（▼）では神経突起の退縮（神経傷害）は確認されなかった。これらのことから、弱い酸化ストレス（抗酸化剤を含まない培地にて培養すること）で神経傷害を誘導するためには、細胞播種時から抗酸化剤を含まない培地にて培養することが重要であることが示された。
試験例２：酸化ストレス誘発神経細胞傷害に対する細胞播種密度の影響評価
＜プレートコーティング＞
　ｉＭａｔｒｉｘ－５１１　ｓｉｌｋ（Ｍａｔｒｉｘｏｍｅ，８９２０２１）をＰＢＳにて１６．７倍希釈したものを、ＰＤＬコーティングされた９６ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ，３５６４６１）に７０μＬ／ｗｅｌｌ加え、３時間から７２時間３７℃にてインキュベートした。
＜培地の準備＞
　抗酸化剤を含む培地には、＋ＡＯ培地にＤＭＳＯが０．１容量％（ｖ／ｖ）となるように加えたもの（Ｓｔｒｅｓｓ（－））、抗酸化剤を含まない培地には－ＡＯ培地にＤＭＳＯが０．１容量％（ｖ／ｖ）となるように加えたもの（Ｓｔｒｅｓｓ（＋））を使用した。
＜細胞播種＞
　試験例１と同様の方法でｉＰＳ細胞からＮｇｎ２遺伝子を強制発現することにより作製した神経細胞（大脳皮質興奮神経細胞であると考えられる）を３７℃の温浴で解凍した。融解後、細胞を培地に添加し、６００×ｇ、室温で５分間遠心した。遠心後、上清を除去し、細胞を培地にて懸濁し、細胞数を計数した。その後、細胞を培地にて希釈し、２００μＬ／ｗｅｌｌ（０．３～３７．５×１０４ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２）にて播種し、３７℃、５％ＣＯ２条件下にて培養した。培養後、６時間ごとにＩｎｃｕＣｙｔｅ　Ｓ３（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ，Ｉｎｃｕｃｙｔｅ　Ｓ３）にて撮影し、画像を取得した。
＜突起長の評価＞
　神経突起長はＩｎｃｕＣｙｔｅ　Ｓ３のＮｅｕｒｏｔｒａｃｋソフトウェア（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ，９６００－００１０）を用いて定量した。神経突起長を定量した結果を図４～図９に、および細胞播種密度と神経細胞の傷害検出の可否をまとめたものを表３に示す。なお、神経細胞の傷害検出の可否は、試験例１と同様の判断基準で神経突起長が退縮しているかどうかを評価し、退縮していると判断できた場合を傷害検出可とした。
　細胞播種密度を０．３、０．９、１．９、４．７、９．４、または１２．５×１０４ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２にて播種した際の神経突起長の経時変化を図４から図９に示す。縦軸は面積当たりの神経突起長の総和、横軸は培養日数を示す。その結果、細胞播種密度が０．３～１２．５ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２では抗酸化剤を含まない培地にて培養したＳｔｒｅｓｓ（＋）群（▲）で神経突起の退縮（神経傷害）が確認できた。０．３～３７．５×１０４ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２の播種密度で播種した実験結果は表３に示す。播種密度が２５．０×１０４ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２以上になると、細胞密度が濃すぎるため神経突起の退縮（神経傷害）を検出できなかった。このことから２０．０×１０４ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２以下の細胞密度で細胞を播種し、培養することが重要であることが明らかとなった。
試験例３：酸化ストレス誘発神経細胞傷害に対する基礎培地の影響評価
＜プレートコーティング＞
　ｉＭａｔｒｉｘ－５１１　ｓｉｌｋ（Ｍａｔｒｉｘｏｍｅ，８９２０２１）をＰＢＳにて１６．７倍希釈したものを、ＰＤＬコーティングされた９６ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ，３５６４６１）に７０μＬ／ｗｅｌｌ加え、３時間から７２時間３７℃にてインキュベートした。
＜培地の準備＞
　抗酸化剤を含む培地には、＋ＡＯ培地にＤＭＳＯが０．１容量％（ｖ／ｖ）となるように加えたもの（Ｓｔｒｅｓｓ（－））、抗酸化剤を含まない培地には－ＡＯ培地にＤＭＳＯが０．１容量％（ｖ／ｖ）となるように加えたもの（Ｓｔｒｅｓｓ（＋））を使用した。
＜細胞播種＞
　試験例１と同様の方法でｉＰＳ細胞からＮｇｎ２遺伝子を強制発現することにより作製した神経細胞（大脳皮質興奮神経細胞であると考えられる）を３７℃の温浴で解凍した。融解後、細胞を培地に添加し、６００×ｇ、室温で５分間遠心した。遠心後、上清を除去し、細胞を培地にて懸濁し、細胞数を計数した。その後、細胞を培地にて希釈し、２００μＬ／ｗｅｌｌ（４．７×１０４ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２）にて播種し、３７℃、５％ＣＯ２条件下にて培養した。培養後、６時間ごとにＩｎｃｕＣｙｔｅ　Ｓ３（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ，Ｉｎｃｕｃｙｔｅ　Ｓ３）にて撮影し、画像を取得した。
＜突起長の評価＞
　神経突起長はＩｎｃｕＣｙｔｅ　Ｓ３のＮｅｕｒｏｔｒａｃｋソフトウェア（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ，９６００－００１０）を用いて定量した。神経突起長を定量した結果を図１０および図１１に示す。神経突起の退縮は、試験例１と同様の判断基準で評価した。
　縦軸は面積当たりの神経突起長の総和、横軸は培養日数を示す。その結果、ＢｒａｉｎＰｈｙｓ培地（図１０）、およびＮｅｕｒｏｂａｓａｌ培地（図１１）のいずれの培地においても抗酸化剤を含まない培地にて培養したＳｔｒｅｓｓ（＋）群（▲）で神経突起の退縮（神経傷害）が確認でき、抗酸化剤を含む培地にて培養したＳｔｒｅｓｓ（－）群（■）では神経突起の退縮は確認されなかった。このことからＢｒａｉｎＰｈｙｓ培地やＮｅｕｒｏｂａｓａｌ培地においても抗酸化剤を含まない培地にて培養することで神経傷害を誘導できることが示された。
試験例４：酸化ストレス誘発神経細胞傷害の定量評価
＜プレートコーティング＞
　ｉＭａｔｒｉｘ－５１１　ｓｉｌｋ（Ｍａｔｒｉｘｏｍｅ，８９２０２１）をＰＢＳにて１６．７倍希釈したものを、ＰＤＬコーティングされたフラスコ（Ｇｒｅｉｎｅｒ　Ｂｉｏ－ｏｎｅ，６６１９４０）に２０ｍＬ／ｆｌａｓｋ加え、３時間から７２時間３７℃にてインキュベートした。
＜培地の準備＞
　抗酸化剤を含む培地には、＋ＡＯ培地にＤＭＳＯが０．１容量％（ｖ／ｖ）となるように加えたもの（Ｓｔｒｅｓｓ（－））、抗酸化剤を含まない培地には－ＡＯ培地にＤＭＳＯが０．１容量％（ｖ／ｖ）となるように加えたもの（Ｓｔｒｅｓｓ（＋））を使用した。
＜細胞播種＞
　試験例１と同様の方法でｉＰＳ細胞からＮｇｎ２遺伝子を強制発現することにより作製した神経細胞（大脳皮質興奮神経細胞であると考えられる）を３７℃の温浴で解凍した。融解後、細胞を培地に添加し、６００×ｇ、室温で５分間遠心した。遠心後、上清を除去し、細胞を１ｍＬの培地にて懸濁し、細胞数を計数した。その後、細胞を培地にて希釈し、６．９×１０４ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２の密度になるように播種し、３７℃、５％ＣＯ２条件下にて培養した。培養後３日目、４日目、５日目、６日目に培地を回収した。
＜ＬＤＨアッセイ＞
　ＬＤＨの定量にはＣｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ　Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　ＫｉｔＰＬＵＳ（ＬＤＨ）（Ｓｉｇｍａ　ａｌｄｒｉｃｈ，４７４４９３４００１）を使用した。添付文書に従い実施し、培養３日目から６日目までの培地中のＬＤＨの定量を行った。定量の結果を図１２に示す。
　抗酸化剤を含まない培地で培養したＳｔｒｅｓｓ（＋）群の神経細胞の培地（▲）では、抗酸化剤を含む培地で培養したＳｔｒｅｓｓ（－）群の神経細胞の培地（■）に比べ培養５日目、および６日目にてＬＤＨ量が多く、Ｓｔｒｅｓｓ（＋）群にて細胞傷害が起きていることが確認できた。
試験例５：ＲＯＳシグナルの定量
＜プレートコーティング＞
　ｉＭａｔｒｉｘ－５１１　ｓｉｌｋ（Ｍａｔｒｉｘｏｍｅ，８９２０２１）をＰＢＳにて１６．７倍希釈したものを、ＰＤＬコーティングされた９６ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ，３５６６４０）に７０μＬ／ｗｅｌｌ加え、３時間から７２時間３７℃にてインキュベートした。
＜培地の準備＞
　抗酸化剤を含む培地には、＋ＡＯ培地にＤＭＳＯが０．１容量％（ｖ／ｖ）となるように加えたもの（Ｓｔｒｅｓｓ（－））、抗酸化剤を含まない培地には－ＡＯ培地にＤＭＳＯが０．１容量％（ｖ／ｖ）となるように加えたもの（Ｓｔｒｅｓｓ（＋））を使用した。
＜細胞播種＞
　凍結細胞（ｉＣｅｌｌ運動神経細胞，ＦＣＤＩ，Ｃ１０４８）を３７℃の温浴で解凍した。融解後、細胞を培地に添加し、６００×ｇ、室温で５分間遠心した。遠心後、上清を除去し、細胞を１ｍＬの培地にて懸濁し、細胞数を計数した。その後、細胞を培地にて希釈し、２００μＬ／ｗｅｌｌ（４．７×１０４ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２）にて播種し、３７℃、５％ＣＯ２条件下にて６日間培養した。
＜ＲＯＳシグナルの定量＞
　ＲＯＳシグナルの定量にはＣｅｌｌＲＯＸ（商標）Ｇｒｅｅｎ　Ｒｅａｇｅｎｔ，ｆｏｒ　ｏｘｉｄａｔｉｖｅ　ｓｔｒｅｓｓ　ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｃ１０４４４）を使用した。添付文書に従い実施し、培養６日後の神経細胞の細胞内のＲＯＳシグナルを、共焦点定量イメージサイトメーター（ＣＱ１，横河電機）を用いて定量した。核領域の蛍光強度の平均を定量した結果を図１３に示す。
　抗酸化剤を含まない培地で培養した神経細胞（Ｓｔｒｅｓｓ（＋）群）では、抗酸化剤を含む培地で培養した神経細胞（Ｓｔｒｅｓｓ（－）群）に比べ強いシグナルのＲＯＳを検出した。
試験例６：酸化ストレス誘発神経細胞傷害に対する化合物評価（ネクロトーシス阻害剤）
＜プレートコーティング＞
　ｉＭａｔｒｉｘ－５１１　ｓｉｌｋ（Ｍａｔｒｉｘｏｍｅ，８９２０２１）をＰＢＳにて１６．７倍希釈したものを、ＰＤＬコーティングされた９６ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ，３５６４６１）に７０μＬ／ｗｅｌｌ加え、３時間から７２時間３７℃にてインキュベートした。
＜アッセイプレートの準備＞
　抗酸化剤を含む培地には、＋ＡＯ培地にＤＭＳＯが０．１容量％（ｖ／ｖ）となるように加えたもの（Ｓｔｒｅｓｓ（－））、抗酸化剤を含まない培地には－ＡＯ培地にＤＭＳＯが０．１容量％（ｖ／ｖ）となるように加えたもの（Ｓｔｒｅｓｓ（＋））、薬剤評価の群の培地には－ＡＯ培地にＤＭＳＯ溶解化合物を０．１容量％（ｖ／ｖ）の濃度で添加したもの（０．０１～２０μＭ）を使用した。
＜細胞播種＞
　凍結細胞（ｉＣｅｌｌ運動神経細胞，ＦＣＤＩ，Ｃ１０４８）を３７℃の温浴で解凍した。融解後、細胞を培地に添加し、６００×ｇ、室温で５分間遠心した。遠心後、上清を除去し、細胞を１ｍＬの培地にて懸濁し、細胞数を計数した。その後、細胞を培地にて希釈し、２００μＬ／ｗｅｌｌ（４．７×１０４ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２）にて播種し、３７℃、５％ＣＯ２条件下にて培養した。培養後、６時間ごとにＩｎｃｕＣｙｔｅ　Ｓ３（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ，Ｉｎｃｕｃｙｔｅ　Ｓ３）にて撮影し、画像を取得した。
＜突起長評価＞
　神経突起長はＩｎｃｕＣｙｔｅ　Ｓ３のＮｅｕｒｏｔｒａｃｋソフトウェア（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ，９６００－００１０）を用いて定量した。神経突起長を定量した結果、および代表的な細胞の画像を図１４に示す。
　抗酸化剤を含まない培地で培養した神経細胞（Ｓｔｒｅｓｓ（＋）群）（▲）は培養４日を過ぎたあたりから傷害を受け神経突起長の総和が減少した。一方で、ネクロトーシス阻害剤として知られるネクロスタチン－１を処理した群（●）は、神経突起長の総和の減少を濃度依存的に抑制した。このことから本評価系の神経傷害はネクロトーシスにより起きていることが示された。
試験例７：酸化ストレス誘発神経細胞傷害に対する化合物評価（フェロトーシス阻害剤）
＜プレートコーティング＞
　ｉＭａｔｒｉｘ－５１１　ｓｉｌｋ（Ｍａｔｒｉｘｏｍｅ，８９２０２１）をＰＢＳにて１６．７倍希釈したものを、ＰＤＬコーティングされた９６ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ，３５６４６１）に７０μＬ／ｗｅｌｌ加え、３時間から７２時間３７℃にてインキュベートした。
＜アッセイプレートの準備＞
　抗酸化剤を含む培地には、＋ＡＯ培地にＤＭＳＯが０．１容量％（ｖ／ｖ）となるように加えたもの（Ｓｔｒｅｓｓ（－））、抗酸化剤を含まない培地には－ＡＯ培地にＤＭＳＯが０．１容量％（ｖ／ｖ）となるように加えたもの（Ｓｔｒｅｓｓ（＋））、薬剤評価の群の培地には－ＡＯ培地にＤＭＳＯ溶解化合物を０．１容量％（ｖ／ｖ）の濃度で添加したもの（０．００４～２０μＭ）を使用した。
＜細胞播種＞
　ｉＰＳ細胞からＮｇｎ２遺伝子を強制発現することにより作製した神経細胞（大脳皮質興奮神経細胞であると考えられる）を３７℃の温浴で解凍した。融解後、細胞を培地に添加し、６００×ｇ、室温で５分間遠心した。遠心後、上清を除去し、細胞を１ｍＬの培地にて懸濁し、細胞数を計数した。その後、細胞を培地にて希釈し、２００μＬ／ｗｅｌｌ（４．７×１０４ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２）にて播種し、３７℃、５％ＣＯ２条件下にて培養した。培養後、６時間ごとにＩｎｃｕＣｙｔｅ　Ｓ３（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ，Ｉｎｃｕｃｙｔｅ　Ｓ３）にて撮影し、画像を取得した。
＜突起長評価＞
　神経突起長はＩｎｃｕＣｙｔｅ　Ｓ３のＮｅｕｒｏｔｒａｃｋソフトウェア（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ，９６００－００１０）を用いて定量した。神経突起長を定量した結果を図１５～１７に示す。
　抗酸化剤を含まない培地で培養した神経細胞（Ｓｔｒｅｓｓ（＋）群）（▲）は培養１日を過ぎたあたりから傷害を受け神経突起長の総和が減少した。一方で、フェロトーシス阻害剤を処理した群（●）は、いずれの化合物も神経突起長の総和の減少を濃度依存的に抑制した。これらのことから本評価系の神経傷害はフェロトーシスにより起きていることが示された。
試験例８：酸化ストレス誘発神経細胞傷害評価系を用いた化合物スクリーニング
＜プレートコーティング＞
　ｉＭａｔｒｉｘ－５１１　ｓｉｌｋ（Ｍａｔｒｉｘｏｍｅ，８９２０２１）をＰＢＳにて１６．７倍希釈したものを、ＰＤＬコーティングされた９６ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ，３５６４６１）に７０μＬ／ｗｅｌｌ加え、３時間から７２時間３７℃にてインキュベートした。
＜アッセイプレートの準備＞
　化合物ライブラリーはＳｔｅｍＳｅｌｅｃｔ　Ｌｉｂｒａｒｙ　ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ（Ｍｅｒｃｋ、５６９７７４）を使用した。抗酸化剤を含む培地には、＋ＡＯ培地にＤＭＳＯが０．１容量％（ｖ／ｖ）となるように加えたもの（Ｓｔｒｅｓｓ（－））、抗酸化剤を含まない培地には－ＡＯ培地にＤＭＳＯが０．１容量％（ｖ／ｖ）となるように加えたもの（Ｓｔｒｅｓｓ（＋））、薬剤評価の群の培地には－ＡＯ培地にＤＭＳＯ溶解化合物を０．１容量％（ｖ／ｖ）の濃度で添加したものを使用した。
＜細胞播種＞
　凍結細胞（ｉＣｅｌｌ運動神経細胞，ＦＣＤＩ，Ｃ１０４８）を３７℃の温浴で解凍した。融解後、細胞を培地に添加し、６００×ｇ、室温で５分間遠心した。遠心後、上清を除去し、細胞を１ｍＬの培地にて懸濁し、細胞数を計数した。その後、細胞を培地にて希釈し、２００μＬ／ｗｅｌｌ（４．７×１０４ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２）にて播種し、３７℃、５％ＣＯ２条件下にて培養した。培養後、６時間ごとにＩｎｃｕＣｙｔｅ　Ｓ３（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ，Ｉｎｃｕｃｙｔｅ　Ｓ３）にて撮影し、画像を取得した。
＜突起長評価＞
　神経突起長はＩｎｃｕＣｙｔｅ　Ｓ３のＮｅｕｒｏｔｒａｃｋソフトウェア（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ，９６００－００１０）を用いて定量した。１４日間の突起長の経時的な曲線から曲線下面積（ＡＵＣ）を算出し、薬剤の効果を比較した。すなわち、ＡＵＣが大きいものは突起の退縮を抑制（神経傷害を抑制）していることを示す。各化合物とＡＵＣの値を図１８に示す。抗酸化剤を含まない培地で培養した神経細胞（Ｓｔｒｅｓｓ（＋）群）（▲）は抗酸化剤を含む培地で培養した神経細胞（Ｓｔｒｅｓｓ（－）群）（■）と比較してＡＵＣが減少した。化合物を処理した群（〇）は、ＣＤ４３７／ＡＨＰＮ、Ｓｉｍｖａｓｔａｔｉｎ、Ｍｅｖａｓｔａｔｉｎ、Ｒｅｖｅｒｓｉｎｅ、ＫＢ－Ｒ７９４３、Ｌｉｃｏｃｈａｌｃｏｎｅ－Ａ、Ｔｅｌｏｍｅｒａｓｅ　Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ　ＩＸ 、Ｐｕｒｍｏｒｐｈａｍｉｎｅ、ＬＸＲα／β　Ａｇｏｎｉｓｔ、Ｍｉｆｅｐｒｉｓｔｏｎｅ、ＡＹ　９９４４、γ－Ｓｅｃｒｅｔａｓｅ　Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ　ＸＸＩ、ＡＴＲＡ－ＢＡ　Ｈｙｂｒｉｄ、及びＭｎ－ｃｐｘ　３が強くＡＵＣの減少を抑制した。
試験例９：酸化ストレス誘発神経細胞傷害に対するＡＬＳ治療薬（エダラボン）の評価
　試験例７と同様の方法にて、ＡＬＳの治療薬として使用されているエダラボンの酸化ストレス誘発神経細胞傷害に対する効果を評価した。神経突起長を定量した結果を図１９に示す。抗酸化剤を含まない培地で培養した神経細胞（Ｓｔｒｅｓｓ（＋）群）（▲）は培養４日を過ぎたあたりから傷害を受け神経突起長の総和が減少した。エダラボンを処理した群（●）では、神経突起長の総和の減少を濃度依存的に抑制した。このことから、本評価系にてＡＬＳの治療薬候補をスクリーニングできることが示された。

Claims (23)

  1. ヒト由来の多能性幹細胞から分化誘導した神経細胞を、抗酸化剤を実質的に含まず、かつ酸化剤を実質的に含まない培養培地を用いて２０．０×１０４細胞／ｃｍ２以下の細胞密度で播種する工程ａと、抗酸化剤を実質的に含まず、かつ酸化剤を実質的に含まない培養培地を用いて培養する工程ｂとを含む、酸化ストレスによる傷害を受けた神経細胞の製造方法。
  2. 細胞密度が、０．２×１０４細胞／ｃｍ２以上２０．０×１０４細胞／ｃｍ２以下である、請求項１に記載の製造方法。
  3. ヒト由来の多能性幹細胞が、疾患関連遺伝子に変異がない多能性幹細胞である、請求項１または２に記載の製造方法。
  4. 前記神経細胞が、運動神経細胞、大脳皮質興奮神経細胞または黒質神経細胞である、請求項１または２に記載の製造方法。
  5. 酸化ストレスによる傷害を受けた神経細胞が、以下の（i）～（iv）：
    （i）酸化ストレスに関連するマーカーが陽性である；
    （ii）神経突起が退縮している；
    （iii）ネクロトーシスが誘導されている；および
    （iv）フェロトーシスが誘導されている：
    のうちの少なくとも一以上を満たす、請求項１または２に記載の製造方法。
  6. ヒト由来の多能性幹細胞から分化誘導した神経細胞を、抗酸化剤を実質的に含まず、かつ酸化剤を実質的に含まない培養培地を用いて２０．０×１０４細胞／ｃｍ２以下の細胞密度で播種する工程ａと、抗酸化剤を実質的に含まず、かつ酸化剤を実質的に含まない培養培地を用いて培養する工程ｂとを含む、細胞の培養方法。
  7. 前記細胞密度が、０．２×１０４細胞／ｃｍ２以上２０．０×１０４細胞／ｃｍ２以下である、請求項６に記載の培養方法。
  8. ヒト由来の多能性幹細胞が、疾患関連遺伝子に変異がない多能性幹細胞である、請求項６または７に記載の培養方法。
  9. 前記神経細胞が、運動神経細胞、大脳皮質興奮神経細胞または黒質神経細胞である、請求項６または７に記載の培養方法。
  10. 請求項１に記載の製造方法により得られる、以下の（i）～（iv）：
    （i）酸化ストレスに関連するマーカーが陽性である；
    （ii）神経突起の長さが退縮している；
    （iii）ネクロトーシスが誘導されている；および
    （iv）フェロトーシスが誘導されている：
    のうちの少なくとも一以上を満たす、神経細胞。
  11. 前記神経細胞が、運動神経細胞、大脳皮質興奮神経細胞または黒質神経細胞である、請求項１０に記載の細胞。
  12. 請求項１０に記載の神経細胞と被験物質とを接触させることを含む、被験物質の評価方法。
  13. 請求項１に記載の方法により請求項１０に記載の神経細胞を製造することをさらに含み、前記神経細胞と被験物質とを接触させる、請求項１２に記載の被験物質の評価方法。
  14. 請求項１０に記載の神経細胞と被験物質とを接触させることを含む、神経変性疾患の予防および／または治療薬のスクリーニング方法。
  15. 請求項１に記載の方法により請求項１０に記載の神経細胞を製造することをさらに含み、前記神経細胞と被験物質とを接触させる、請求項１４に記載のスクリーニング方法。
  16. 前記神経変性疾患が、アルツハイマー病（ＡＤ）、脊髄小脳変性症、前頭側頭葉変性症（ＦＴＬＤ）、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、レビー小体病、ハンチントン病、ニーマンピック病からなる群から選択される、請求項１４に記載のスクリーニング方法。
  17. 請求項１０に記載の神経細胞と被験物質とを接触させた後に、
    （Ａ）前記被験物質と接触させた神経細胞、および前記被験物質を接触させなかった対照の神経細胞とを培養する工程、
    （Ｂ）前記神経細胞における神経傷害を測定する工程、および
    （Ｃ）被験物質と接触させなかった対照と比較して、前記神経傷害を抑制する被験物質を、神経変性疾患の予防および／または治療薬の候補として選択する工程、
    を含む、請求項１４に記載のスクリーニング方法。
  18. 前記工程（Ｂ）が、前記工程（Ａ）で得られた神経細胞の細胞数および／または神経突起長を測定する工程である、請求項１７に記載のスクリーニング方法。
  19. 前記工程（Ｃ）が、前記被験物質と接触させた神経細胞の細胞数および／または神経突起長が、対照よりも高値であった被験物質を、神経変性疾患の予防および／または治療薬の候補として選択する工程である、請求項１７または１８に記載の方法。
  20. （１）請求項１０に記載の神経細胞と被験物質とを接触させる工程、
    （２）前記工程（１）で前記被験物質と接触させた神経細胞、および前記被験物質を接触させなかった対照の神経細胞を培養する工程、
    （３）前記神経細胞における神経傷害を測定する工程、および
    （４）被験物質と接触させなかった対照と比較して、前記神経傷害を抑制する被験物質を、ネクロトーシス阻害剤の候補として選択する工程、
    を含む、ネクロトーシス阻害剤のスクリーニング方法。
  21. 請求項１に記載の方法により請求項１０に記載の神経細胞を製造することをさらに含み、前記神経細胞と被験物質とを接触させる、請求項２０に記載のスクリーニング方法。
  22. （１）請求項１０に記載の神経細胞と被験物質とを接触させる工程、
    （２）前記工程（１）で前記被験物質と接触させた神経細胞、および前記被験物質を接触させなかった対照の神経細胞を培養する工程、
    （３）前記神経細胞における神経傷害を測定する工程、および
    （４）被験物質と接触させなかった対照と比較して、前記神経傷害を抑制する被験物質を、フェロトーシス阻害剤の候補として選択する工程、
    を含む、フェロトーシス阻害剤のスクリーニング方法。
  23. 請求項１に記載の方法により請求項１０に記載の神経細胞を製造することをさらに含み、前記神経細胞と被験物質とを接触させる、請求項２２に記載のスクリーニング方法。
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