WO2024155028A1 - 전립선암 특이적 마커 - Google Patents

전립선암 특이적 마커 Download PDF

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WO2024155028A1
WO2024155028A1 PCT/KR2024/000608 KR2024000608W WO2024155028A1 WO 2024155028 A1 WO2024155028 A1 WO 2024155028A1 KR 2024000608 W KR2024000608 W KR 2024000608W WO 2024155028 A1 WO2024155028 A1 WO 2024155028A1
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WO
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prostate cancer
composition
diagnosing
protein
metastatic
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PCT/KR2024/000608
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정재승
한기호
조형석
변석수
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인제대학교 산학협력단
서울대학교병원
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    • G01N2800/52—Predicting or monitoring the response to treatment, e.g. for selection of therapy based on assay results in personalised medicine; Prognosis

Definitions

  • the present invention relates to biomarkers specific for prostate cancer.
  • Cancer cells differ from normal cells in many ways. Normal cells proliferate according to their needs and where they are needed. Normal cells stick together and appear to be together. Additionally, normal cells self-destruct when they become too old or damaged. However, cancer cells lack all of these functions and ultimately continue to divide to form a tumor, a mass of cancer cells.
  • the prostate is a chestnut-sized male reproductive organ located just below the bladder and in front of the rectum. It produces and stores a portion of semen. Above, it is fixed to the bladder neck, that is, to the anterior puboprostatic ligament adjacent to the transition area from the bladder to the urethra, and below, it is fixed by the urogenital diaphragm. Most cancers that occur in the prostate are adenocarcinomas (cancers of glandular cells) that arise from prostate cells. Tumor types can be classified depending on the degree of differentiation of the tumor tissue and the characteristics of the cells. Prostate cancer is one of the most common urinary tract tumors worldwide and the third most frequently occurring tumor after breast cancer and lung cancer.
  • Prostate cancer is an uncommon disease before the age of 50, but increases rapidly after the age of 50. Recently, with the increase in average life expectancy, the number of elderly men is rapidly increasing in Korea, and prostate cancer needs to be diagnosed early and continuously managed to prevent it from getting worse. In particular, human prostate cancer appears to have a tendency to metastasize to bone, and is known to inevitably progress from an androgen-dependent state to an androgen-resistant state, increasing patient mortality. Most prostate cancers are initially androgen-dependent (AD). Prostate cancer cells initially require androgens for continued proliferation.
  • AD androgen-dependent
  • testosterone When testosterone is removed surgically (orchiectomy) or medically (GnRH agonists or estrogens) through androgen deprivation therapy (ADT), or when androgen action is blocked using anti-androgens, the number of susceptible prostate cancer cells increases. Rapid apoptosis is induced. The positive response rate is approximately 86% based on reduction of prostate-specific antigen (PSA) and stabilization or reduction of tumor volume. Cell death typically occurs during the first few days to a week. However, after a positive reaction, a period of proliferation arrest occurs during which the remaining cells do not tend to die. After 18-36 months of removal and blockade of hormones, hyperplasia recurs in 90% of cases.
  • PSA prostate-specific antigen
  • PSA Prostate Specific Antigen
  • biopsy biopsy
  • PSA measurement is a method of determining the risk of prostate cancer by measuring the level of specific antigens produced by prostate cells. The more malignant prostate cancer is, the higher the PSA level is.
  • PSA level For the purpose of early diagnosis, it is recommended for men with a PSA level of 3 or higher according to international recommendations.
  • a prostate biopsy is recommended. After PSA was discovered in seminal fluid in 1971 and prostate tissue in 1979, it was initially introduced for the purpose of follow-up after treatment, but was gradually used as a screening test.
  • the serum prostate-specific antigen test has been widely used clinically for screening purposes since the late 1980s, showing the highest sensitivity as a single test method and bringing about technological changes in the diagnosis and treatment of prostate cancer.
  • the biggest problem in using prostate-specific antigen as a screening test is the lack of specificity and the possibility of overdiagnosis and overtreatment.
  • the probability of prostate cancer being diagnosed in patients with a PSA level of less than 10 is less than 20%, and among patients with a PSA level of less than 4, the rate of prostate cancer reaches 15%, making it difficult to accurately diagnose prostate cancer using the PSA level alone.
  • the prostate-specific antigen test can predict prostate cancer, it has the problem of not being able to predict its course.
  • a biopsy is a method of diagnosing the presence or absence of malignant tumors such as cancer or sarcoma in the patient's organ through histopathological examination by taking tissue from an organ suspected of having cancer with a needle, but the examination involves considerable pain.
  • the method of diagnosing circulating tumor cells has low actual diagnostic utility because it is difficult to determine which type of cancer the tumor cells originate from, and when the prostate-specific antigen test is performed through tissue biopsy, It has the problem that repeated collection from patients is difficult and can place a physical burden on the patient. Therefore, there is a need for technology that can reduce the burden on patients while simultaneously increasing the sensitivity and specificity of prostate cancer prediction.
  • the purpose of the present invention is to provide a composition for diagnosing prostate cancer.
  • an object of the present invention is to provide a prostate cancer diagnostic kit.
  • an object of the present invention is to provide a method of providing information necessary for diagnosis or prognosis of prostate cancer.
  • the purpose of the present invention is to provide a biochip for diagnosing prostate cancer.
  • the present invention provides AR, AR-V7, KLK3, NKX3-1, HGF, PSCA, MET, VIM, EpCAM, CDH1, CDH2, DSG2, KRT8, KRT18, KRT19, DKK1, WNT5A, WNT5B, BRCA1, BRCA2, CDK12, FANCA, RAD51B, FOLH1, CXCL12, RB1, PIK3CA, PIK3CB, AURKA, SchLAP1, MSH2, SPINK1, TSPAN8, CCN2, EGFR, SOX2, SOX9, BMP7, TM2:ERG, MDK, CCND1, TP53,
  • a composition for diagnosing prostate cancer including an agent for measuring the expression level of FOXA1, MS4A1, or PTPRC genes at the mRNA or protein level.
  • the present invention provides a method of providing information necessary for diagnosis or prognosis of prostate cancer.
  • the present invention provides a biochip for diagnosing prostate cancer.
  • Figure 1 is a diagram showing the results of deriving markers that can distinguish between localized prostate cancer and metastatic hormone-positive prostate cancer through ROC analysis.
  • Figures 2 and 3 show the results of deriving markers that can distinguish between localized prostate cancer and metastatic castration-resistant prostate cancer through ROC analysis.
  • Figure 4 is a diagram showing the results of deriving markers that can distinguish between locally advanced prostate cancer and metastatic castration-resistant prostate cancer through ROC analysis.
  • the present invention provides AR (androgen receptor), AR-V7 (androgen receptor variant 7), ATM (ATM serine/threonine kinase), KLK3 (Kallikrein related peptidase 3), NKX3-1 (NK3 homeobox 1), HGF (hepatocyte growth factor), PSCA (prostate stem cell antigen), MET (MET proto-oncogene), VIM (vimentin), EpCAM (epithelial cell adhesion molecule), CDH1 (cadherin 1), CDH2 (cadherin 2), DSG2 (desmoglein) 2), KRT8 (keratin 8), KRT18 (keratin 18), KRT19 (keratin 19), DKK1 (dickkopf WNT signaling pathway inhibitor 1), WNT5A (Wnt family member 5A), WNT5B (Wnt family member 5B), BRCA1 (BRCA1) DNA repair associated), BRCA2 (BRCA2 DNA repair associated), CDK12 (cyclin dependent kina, C
  • the composition may be a biomarker composition for diagnosing prostate cancer.
  • the diagnosis may use one or more specimens of tissue, whole blood, serum, or plasma, and circulating tumor cells isolated from the specimen may be used, most preferably circulating cancer cells isolated from blood.
  • circulating tumor cells or circulating tumor cells refers to circulating cancer cells that are separated from primary tumor cells and circulate throughout the body through the blood.
  • the marker composition can distinguish or diagnose the stage of prostate cancer.
  • the prostate cancer may be prostate cancer in localized stages or metastatic stages, and the prostate cancer may be localized PCa (LPCa), locally advanced prostate cancer (Locally advanced PCa, Adv). -LPCa), hormone-positive prostate cancer (metastatic hormone-sensitive prostate cancer, mHSPC), or metastatic castrate-resistant prostate cancer (mCRPC).
  • LPCa localized PCa
  • mHSPC hormone-positive prostate cancer
  • mCRPC metastatic castrate-resistant prostate cancer
  • the entire low-risk group and high-risk group T2 patient group among localized stages of prostate cancer are divided into localized PCa (LPCa) group, and T3 and T4.
  • LPCa localized PCa
  • T3 and T4 Patients corresponding to are classified into the locally advanced prostate cancer (Locally advanced PCa, Adv-LPCa) group;
  • Metastatic stage was classified into metastatic hormone-sensitive prostate cancer (mHSPC) and metastatic castrate-resistant prostate cancer (mCRPC).
  • the stage of prostate cancer can be classified according to the clinical TNM-stage of the prostate cancer, T according to the size and degree of progression of the tumor, and regional lymph nodes near the prostate. It can be divided into N according to invasion and M according to whether it has metastasized to other organs, and the stage can be expressed mainly as T-stage according to the size of the tumor, and the level of serum prostate-specific antigen (serum-PSA) and Gleason score. Risk groups can be distinguished based on the Gleason score.
  • the stage of prostate cancer is specifically defined as a T2 condition in the low-risk group where a very small size of cancer occurs in the prostate, a PSA level of 10 ng/mL or less and a Gleason score of 6 or less, and cancer in more than half of one or both of the prostates.
  • LPCa Localized prostate cancer
  • Adv-LPCa Longer advanced prostate cancer
  • mHSPC metalstatic hormone-sensitive prostate cancer
  • mCRPC metal castration-resistant prostate cancer
  • the expression level of the gene is measured in circulating tumor cells in the blood isolated from the subject, and the ROC analysis value can be used as a diagnostic marker for prostate cancer, and the 'gene expression level' refers to the mRNA of the gene. It can be measured using an agent that measures the expression level of a gene that specifically binds, and the agent that measures the expression level of a gene includes the nucleic acid sequence of the gene, the nucleic acid sequence complementary to the nucleic acid sequence, the nucleic acid sequence, and It may be a primer pair, a probe, or a primer pair and probe that specifically recognizes a fragment of a complementary sequence, and measurement may be performed using polymerase chain reaction, real-time RT-PCR, or reverse transcription polymerase chain reaction.
  • reaction competitive polymerase chain reaction
  • Repetitive RT-PCR competitive polymerase chain reaction
  • RNase nuclease protection assay
  • S1 nuclease assay in situ hybridization
  • nucleic acid microarray Northern blot
  • DNA chip multiplex PCR or ddPCR (Droplet digital PCR). It may be performed by one or more methods selected from the group consisting of, and ddPCR is more preferable.
  • the agent for measuring the protein expression level of the marker gene is an antibody that specifically recognizes the full-length protein of the marker or a fragment thereof, an immunologically active fragment of an antibody, an aptamer, or an avimer. It may include (avidity multimer) or peptidomimetics, and its measurement can be performed using Western blot, ELISA (enzyme linked immunosorbent assay), RIA (Radioimmunoassay), radioimmunodiffusion, and immunoelectrophoresis. It may be performed by a method selected from the group consisting of electrophoresis, tissue immunostaining, immunoprecipitation assay, complement fixation assay, FACS, mass spectrometry, or protein microarray.
  • the immunologically active fragment of the antibody of the present invention includes Fab, Fd, Fab', dAb, F(ab'), F(ab')2, scFv (single chain fragment variable), Fv, single It may be any one selected from the group consisting of chain antibodies, Fv dimers, complementarity determining region fragments, humanized antibodies, chimeric antibodies, and diabodies.
  • the term “detection” or “measurement” means quantifying the concentration of a detected or measured object.
  • the term "primer” is a nucleic acid sequence with a short free 3-terminal hydroxyl group that can form a base pair with a complementary template and serves as a starting point for copying the template strand. It refers to a short nucleic acid sequence that performs a function. Primers can initiate DNA synthesis in the presence of four different nucleoside triphosphates and reagents for polymerization (i.e., DNA polymerase or reverse transcriptase) in an appropriate buffer solution and temperature.
  • probe refers to a nucleic acid fragment such as RNA or DNA that is as short as a few bases or as long as several hundred bases, capable of forming a specific binding to mRNA, and is labeled to confirm the presence or absence of a specific mRNA.
  • Probes may be manufactured in the form of oligonucleotide probes, single stranded DNA probes, double stranded DNA probes, RNA probes, etc.
  • hybridization is performed using a probe complementary to the gene, and the level of gene expression can be diagnosed based on hybridization. Selection of appropriate probes and hybridization conditions can be modified based on those known in the art, so the present invention is not particularly limited thereto.
  • Primers or probes of the present invention can be chemically synthesized using the phosphoramidite solid support method or other well-known methods. These nucleic acid sequences can also be modified using many means known in the art. Non-limiting examples of such modifications include methylation, capping, substitution of a native nucleotide with one or more homologues, and modifications between nucleotides, such as uncharged linkages (e.g., methyl phosphonate, phosphotriester, phosphoronucleotide). amidate, carbamate, etc.) or charged linkages (e.g. phosphorothioate, phosphorodithioate, etc.).
  • uncharged linkages e.g., methyl phosphonate, phosphotriester, phosphoronucleotide
  • charged linkages e.g. phosphorothioate, phosphorodithioate, etc.
  • suitable conditions for hybridizing a probe to a cDNA molecule can be determined through a series of processes through an optimization procedure. These procedures are performed as a series by those skilled in the art to establish protocols for use in the laboratory. For example, conditions such as temperature, concentration of components, hybridization and washing time, buffer components and their pH and ionic strength depend on various factors such as the length of the probe, the amount of GC, and the target nucleotide sequence.
  • the high stringency conditions are hybridization at 65°C in 0.5 M NaHPO4, 7% SDS (sodium dodecyl sulfate), and 1mM EDTA, and 68°C in 0.1 x standard saline citrate (SSC)/0.1% SDS.
  • SSC standard saline citrate
  • high stringency means washing at 48°C in 6 x SSC/0.05% sodium pyrophosphate.
  • Low stringency conditions mean, for example, washing at 42°C in 0.2 x SSC/0.1% SDS.
  • the term “antibody” is a term known in the art and refers to a specific protein molecule directed to an antigenic site.
  • an antibody refers to an antibody that specifically binds to a protein expressed in the marker gene of the present invention, and the antibody can be produced using a well-known method. This also includes partial peptides that can be made from the above proteins.
  • the form of the antibody of the present invention is not particularly limited, and as long as it is a polyclonal antibody, monoclonal antibody, or has antigen binding ability, a portion thereof is also included in the antibody of the present invention, and all immunoglobulin antibodies are included.
  • the antibodies of the present invention also include special antibodies such as humanized antibodies.
  • the term "diagnosis” refers to determining the susceptibility of an object to a specific disease or disorder, determining whether an object currently has a specific disease or condition, and determining whether an object currently has a specific disease or condition. Includes determining the prognosis of a subject, or therametrics (e.g., monitoring the condition of a subject to provide information about treatment efficacy).
  • the present invention relates to a prostate cancer diagnostic kit comprising the composition of the present invention.
  • the kit may further include tools and/or reagents for collecting a biological sample from a subject or patient, as well as tools and/or reagents for preparing genomic DNA, cDNA, RNA or protein from the sample. there is.
  • it may include PCR primers to amplify relevant regions of genomic DNA.
  • the kit may contain probes of genetic factors useful for pharmacogenomic profiling. Additionally, in the use of these kits, labeled oligonucleotides can be used for easy identification during analysis.
  • composition for diagnosing prostate cancer or composition for diagnosing/classifying prostate cancer stages refers to a substance that can predict/diagnose the risk of developing prostate cancer, diagnose a specific stage of prostate cancer, or distinguish between stages of prostate cancer. , polypeptides or nucleic acids (e.g. mRNA, etc.), lipids, glycolipids, glycoproteins, sugars (monosaccharides, disaccharides, oligosaccharides) that have a significant correlation with the likelihood of developing prostate cancer and its stage and show an increase or decrease in expression. etc.) and organic biomolecules.
  • the biomarkers for diagnosing prostate cancer include genes AR, AR-V7, KLK3, NKX3-1, HGF, PSCA, MET, VIM, EpCAM, CDH1, CDH2, DSG2, KRT8, KRT18, KRT19, DKK1, WNT5A, WNT5B, BRCA1, BRCA2, CDK12, FANCA, RAD51B, FOLH1(PSMA), CXCL12, RB1, PIK3CA, PIK3CB, AURKA, SchLAP1, MSH2, SPINK1, TSPAN8, CCN2, EGFR, SOX2, SOX9, BMP7, TM2:ERG , MDK, CCND1, TP53, FOXA1, MS4A1, and PTPRC, and is a gene whose mRNA or protein expression level increases or decreases specifically in the development of prostate cancer.
  • markers include not only genes but also DNA or mRNA complementary to one marker, and it is preferable that they are composite markers
  • the present invention includes the steps of isolating circulating tumor cells (CTC) from a sample isolated from a subject; and AR, AR-V7, KLK3, NKX3-1, HGF, PSCA, MET, VIM, EpCAM, CDH1, CDH2, DSG2, KRT8, KRT18, KRT19, DKK1, WNT5A, WNT5B, BRCA1, BRCA2 in isolated circulating tumor cells.
  • CTC circulating tumor cells
  • the prostate cancer may be prostate cancer in localized stages or metastatic stages, and the prostate cancer may be localized PCa (LPCa), locally advanced prostate cancer (Locally advanced PCa, Adv). -LPCa), hormone-positive prostate cancer (metastatic hormone-sensitive prostate cancer, mHSPC), or metastatic castrate-resistant prostate cancer (mCRPC).
  • LPCa localized PCa
  • mHSPC hormone-positive prostate cancer
  • mCRPC metastatic castrate-resistant prostate cancer
  • the sample isolated from the test subject may be a blood sample.
  • the present invention includes a fine particle separation unit using magnetophoresis to separate circulating tumor cells from blood separated from a test subject; And AR, AR-V7, KLK3, NKX3-1, HGF, PSCA, MET, VIM, EpCAM, CDH1, CDH2, DSG2, KRT8, KRT18, KRT19, DKK1, WNT5A, WNT5B, BRCA1, BRCA2, CDK12, FANCA, RAD51B, FOLH1(PSMA), CXCL12, RB1, PIK3CA, PIK3CB, AURKA, SchLAP1, MSH2, SPINK1, TSPAN8, CCN2, EGFR, SOX2, SOX9, BMP7, TM2 :Relates to a biochip for diagnosing prostate cancer, including an analysis unit that performs ROC statistical analysis on RNA transcript expression data of ERG, MDK, CCND1, TP53, FOXA1, MS4A1 or PTPRC genes.
  • the sample isolated from the test subject may be a blood sample.
  • Clinical TNM of prostate cancer which divides prostate cancer patients into T according to the size and progression of the tumor, N according to the invasion of regional lymph nodes near the prostate, and M according to the presence of metastasis to other organs.
  • stage Clinical TNM-stage
  • T2, T3, and T4 localized stages
  • metastatic stages which are progressive diseases due to distant metastases
  • level of PSA in the serum Patients were classified into risk groups based on the Gleason score.
  • Red blood cells were removed from the peripheral blood of each patient classified above using a density gradient, treated with Ficoll solution (1.119 g/mL), and then centrifuged at 700g for 30 minutes. After centrifugation, the white blood cells and circulating tumor cell (CTC) (i.e., circulating tumor cell) layers were separated, washed with 10 mL of PBS buffer, and centrifuged at 200g for 10 minutes. After washing once more with 200uL of PBS buffer, the mixture was centrifuged at 200g for 5 minutes to obtain white blood cells and blood cancer cell layers.
  • CTC circulating tumor cell
  • EpCAM cocktail solution antioxidant and Dextran, not anti-EpCAM antibody antigen
  • -Bind EpCAM treat with 20uL of nanometer-sized immunomagnetic beads (magnetic nanobeads with a diameter of several tens of nm coated with anti-dextran antibody) that can specifically bind to EpCAM, and incubate under ice conditions for 1 hour and 30 minutes.
  • the dextran and anti-dextran of the cocktail combined to ultimately induce a combination in the form of 'cancer cell-anti-EpCAM antibody-dextran-magnetic nanobeads'.
  • lateral magnetophoretic separation was performed using a fine particle separation device using magnetophoresis described in Korean Patent No. 10-1622342. 0.2% BSA PBS buffer and the blood sample prepared above were each flowed into the device at a rate of 2 mL/h, and the separated sample was collected in a 1.5 mL e-tube.
  • Example 2 the sample prepared in Example 2 was centrifuged at 200g for 5 minutes, treated with 300uL of cell disruption solution, and total RNA was isolated using the Dynabeads mRNA Direct Kit (Invitrogen), followed by SMARTer PCR cDNA synthesis kit (CloneTech ) cDNA (10uL) was synthesized. Afterwards, the final 100uL of amplified cDNA template was secured using the Advantage 2 PCR kit (CloneTech), and the amplified cDNA template was diluted 1/10.
  • ROC receiver operating characteristic
  • CDK12, BRCA2, and PIK3CB genes were found to be able to distinguish between localized prostate cancer and metastatic hormone-positive prostate cancer (Table 4 and Figure 1).
  • a marker was derived to distinguish between locally advanced prostate cancer (Adv-LPCa) and metastatic castrate-resistant prostate cancer (mCRPC) patients. , its cut-off value was set.
  • Adv-LPCa locally advanced prostate cancer
  • mCRPC metastatic castrate-resistant prostate cancer
  • MET, VIM, KRT18, PIK3CB, MDK, BRCA2, ATM, CDK12, and FOLH (PSMA) genes can distinguish between localized prostate cancer and metastatic castration-resistant prostate cancer (Table 5, Figures 2 and 3 ), especially in the case of BRCA2, ATM, CDK12, and FOLH (PSMA) genes, the AUC value was higher than that of PSA in serum, showing that the diagnostic effect was higher than that of existing markers.
  • the ROC (receiver operating characteristic) curve was analyzed to compare the locally advanced PCa (Adv-LPCa) patient group and the metastatic castration-resistant prostate.
  • a marker that can distinguish between cancer (metastatic castrate-resistant prostate cancer, mCRPC) patient groups was derived, and its cut-off value was set.

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Abstract

본 발명은 전립선암에 특이적인 바이오 마커들에 관한 것으로, 본 발명의 혈액 내 순환종양세포에서의 AR, AR-V7, KLK3, NKX3-1, HGF, PSCA, MET, VIM, EpCAM, CDH1, CDH2, DSG2, KRT8, KRT18, KRT19, DKK1, WNT5A, WNT5B, BRCA1, BRCA2, CDK12, FANCA, RAD51B, FOLH1, CXCL12, RB1, PIK3CA, PIK3CB, AURKA, SchLAP1, MSH2, SPINK1, TSPAN8, CCN2, EGFR, SOX2, SOX9, BMP7, TM2:ERG, MDK, CCND1, TP53, FOXA1, MS4A1 또는 PTPRC 유전자의 발현량이 전립선암에 특이적으로 변화하며, 특히, 이들의 병기에 특이적이므로, 이들을 전립선암의 진단 및 예후 예측용 마커로 이용할 수 있다.

Description

전립선암 특이적 마커
본 발명은 전립선암에 특이적인 바이오 마커들에 관한 것이다.
암세포는 정상세포와 여러 가지 면에서 다르다. 정상세포는 자신들의 필요에 의해서 그리고 필요한 장소에서 증식한다. 정상세포는 서로 붙어서 함께하는 모습을 보인다. 또한, 정상세포는 너무 오래되거나 손상되면 자기 스스로 파괴한다. 그러나, 암세포는 이들 기능이 모두 결여되어 있어서 궁극적으로 계속 분열을 함으로써 암세포 덩어리인 종양을 형성한다.
전립선(prostate)은 방광 바로 밑, 직장 앞쪽에 있는 밤톨만 한 크기의 남성생식기관으로, 정액의 일부를 만들어내고 저장하는 역할을 한다. 위로는 방광경부, 즉 방광에서 요도로 이행하는 부위와 인접해 앞쪽의 치골전립선인대에 고정되어 있고, 아래로는 비뇨생식격막에 의해 고정되어 있다. 전립선에서 발생하는 암의 대부분은 전립선 세포에서 발생하는 선암(샘세포의 암)이다. 종양 조직의 분화 정도와 세포의 특성 등에 따라 유형을 구분할 수 있다. 전립선암은 전세계적으로 가장 흔한 비뇨기계 종양 중 하나로서, 유방암과 폐암에 이어 세 번째로 빈번하게 발병이 되는 종양이다. 전립선암은 50세 이전에는 흔하지 않은 질환이나 50세를 넘게 되면 급격히 증가하는 양상을 보인다. 최근 평균 수명의 연장으로 국내에서도 노인 남성의 수가 급증하고 전립선암을 조기에 진단하여 악화되지 않도록 지속적인 관리를 필요로 한다. 특히 사람 전립선암은 뼈로 전이되는 성향을 가지는 것으로 보이며, 안드로겐 의존성 상태로부터 안드로겐 내성 상태로 불가피하게 진행되어 환자의 사망률을 증가 시킨다고 알려져 있다. 대부분의 전립선암은 처음에는 안드로겐 의존형(AD)이다. 전립선암 세포는 처음에는 계속적인 증식을 하기 위해서 안드로겐을 필요로 한다. 안드로겐 차단 요법(ADT)을 통한 테스토스테론의 외과적(고환 절제술) 또는 내과적 (GnRH 작용제 또는 에스트로겐) 제거시, 또는 항-안드로겐제를 사용한 안드로겐 작용 차단시, 이에 대한 반응으로 감수성의 전립선암 세포의 급속한 세포자살이 유도된다. 양성 반응률은 전립선 특이 항원(PSA)의 감소, 및 종양 체적의 안정화 또는 감소를 기준으로 약 86%이다. 일반적으로 발생되는 세포 사멸은 처음 수일 내지 일주일 동안 이루어진다. 그러나, 양성 반응 이후에 남아있는 세포는 사멸하지 않는 경향을 보이는 증식 정지 기간이 진행된다. 호르몬을 제거 및 차단한 지 18-36개월 이후에, 사례의 90%에서 증식이 재발한다. 생존하는 암세포는 일관되게 안드로겐 비의존형 또는 무반응형이 되고, 안드로겐-비의존적인(AI) 세포 증식이 뒤이어 이루어져 호르몬 불응성 전립선암(hormone-refractory prostate cancer, HRPC) 또는 거세 저항성 전립선암(castration resistant prostate cancer, CRPC)으로 발전한다. 이러한 CRPC에는 현재 개발된 치료약이 없어서 환자가 결국 죽음에 이르게 된다. CRPC로의 전환을 가져오는 안드로겐 비의존성은 다양한 메카니즘에 의해 이루어지는 것으로 보인다. 더욱이, 전립선암 치료를 받은 남성의 약 25%는 병이 재발하여 추가적인 치료를 필요로 하는 질병으로서, 현재 미국에서 남자의 암 사망 원인 중 제2의 원인을 차지하고 있는바, 이에 대한 조기진단 및 치료가 필요한 실정이다.
전립선암은 전립선에 국한된 경우 완치가 가능하기 때문에 조기에 이를 발견하려는 노력이 지속되어 왔다. 전립선암 진단을 위한 종래기술로는 현재 국제적인 임상 가이드라인에 따른 PSA(Prostate Specific Antigen) 측정 및 조직 검사(바이옵시)가 있다. PSA 측정은 전립선 세포에서 만들어지는 특이 항원 수치를 측정해 전립선암 위험도를 결정짓는 방법이며, 악성 전립선암일수록 PSA 수치는 높으며, 조기 진단적인 목적에 따라 국제 권고안에 따라 PSA 수치가 3 이상인 남성들에 대해서는 전립선 조직 검사를 권고하고 있다. PSA는 1971년 정장액과 1979년 전립선 조직에서 발견된 이후, 처음에는 치료 후의 추적관찰을 위한 목적으로 도입되었으나 점차 선별검사로 활용되었다. 혈청 전립선특이항원 검사는 1980년대 후반부터 선별검사를 위한 목적으로 광범위하게 임상에 이용되면서 단일 검사법으로는 가장 우수한 민감도를 보이며 전립선암의 진단과 치료에 있어서 획기적인 변화를 가져왔다. 종양표지자로서의 이러한 성과에도 불구하고 전립선특이항원을 선별검사로 사용하는데 있어서 가장 큰 문제점은 특이도가 부족하다는 점과 과잉진단 및 과잉치료의 가능성이 있다는 것이다. 특히 PSA 10 미만의 환자에게서 전립선암이 진단될 확률은 20%가 되지 않고, PSA 수치가 4 미만인 환자 중 전립선암일 경우도 15%에 달하기 때문에 PSA 수치 만으로는 전립선암을 정확히 진단하기에는 어려운 실정이다. 또한, 전립선특이항원 검사는 전립선암을 예측할 수 있지만 그 경과는 예측하지 못한다는 문제점이 있다. 조직 검사는 암이 의심되는 장기 부분의 조직을 바늘로 취해 병리조직학적 검사를 통해 환자의 해당 장기에 암, 육종 등의 악성 종양유무를 진단하는 방법인데, 검사에 상당한 고통이 수반된다.
한편, 기존의 전립선암을 진단하는 방법 중 순환종양세포를 진단하는 방식은 어떤 암종에서 유래된 종양세포인지를 판별하기 어려워서 실제 진단의 효용성이 낮았으며, 전립선특이항원 검사를 조직생검으로 하는 경우, 환자로부터의 반복적인 채취가 어렵고, 환자에게 육체적 부담을 줄 수 있다는 문제점을 가지고 있다. 따라서, 환자의 부담을 줄여주면서도 동시에 전립선암 예측의 민감도 및 특이도를 높일 수 있는 기술이 필요한 실정이다.
본 발명의 목적은 전립선암 진단용 조성물을 제공하는 것이다.
또한, 본 발명의 목적은 전립선암 진단 키트를 제공하는 것이다.
또한, 본 발명의 목적은 전립선암의 진단 또는 예후에 필요한 정보를 제공하는 방법을 제공하는 것이다.
아울러, 본 발명의 목적은 전립선암 진단용 바이오칩을 제공하는 것이다.
상기 과제를 해결하기 위하여, 본 발명은 AR, AR-V7, KLK3, NKX3-1, HGF, PSCA, MET, VIM, EpCAM, CDH1, CDH2, DSG2, KRT8, KRT18, KRT19, DKK1, WNT5A, WNT5B, BRCA1, BRCA2, CDK12, FANCA, RAD51B, FOLH1, CXCL12, RB1, PIK3CA, PIK3CB, AURKA, SchLAP1, MSH2, SPINK1, TSPAN8, CCN2, EGFR, SOX2, SOX9, BMP7, TM2:ERG, MDK, CCND1, TP53, FOXA1, MS4A1 또는 PTPRC 유전자의 발현량을 mRNA 또는 단백질 수준에서 측정하는 제제를 포함하는 전립선암 진단용 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 조성물을 포함하는 전립선암 진단 키트를 제공한다.
또한, 본 발명은 전립선암의 진단 또는 예후에 필요한 정보를 제공하는 방법을 제공한다.
아울러, 본 발명은 전립선암 진단용 바이오칩을 제공한다.
본 발명의 혈액 내 순환종양세포에서의 AR, AR-V7, KLK3, NKX3-1, HGF, PSCA, MET, VIM, EpCAM, CDH1, CDH2, DSG2, KRT8, KRT18, KRT19, DKK1, WNT5A, WNT5B, BRCA1, BRCA2, CDK12, FANCA, RAD51B, FOLH1, CXCL12, RB1, PIK3CA, PIK3CB, AURKA, SchLAP1, MSH2, SPINK1, TSPAN8, CCN2, EGFR, SOX2, SOX9, BMP7, TM2:ERG, MDK, CCND1, TP53, FOXA1, MS4A1 또는 PTPRC 유전자의 발현량은 전립선암에 특이적으로 변화하며, 특히, 이들의 병기에 특이적이므로, 이들을 전립선암의 진단 및 예후 예측용 마커로 이용할 수 있다.
도 1은 ROC 분석으로 국소 전립선암과 전이성 호르몬 양성 전립선암을 구분할 수 있는 마커를 도출한 결과를 나타낸 도이다.
도 2 및 3은 ROC 분석으로 국소 전립선암과 전이성 거세저항성 전립선암을 구분할 수 있는 마커를 도출한 결과를 나타낸 도이다.
도 4는 ROC 분석으로 국소 진행성 전립선암과 전이성 거세저항성 전립선암을 구분할 수 있는 마커를 도출한 결과를 나타낸 도이다.
이하, 첨부된 도면을 참조하여 본 발명의 구현예로 본 발명을 상세히 설명하기로 한다. 다만, 하기 구현예는 본 발명에 대한 예시로 제시되는 것으로, 당업자에게 주지 저명한 기술 또는 구성에 대한 구체적인 설명이 본 발명의 요지를 불필요하게 흐릴 수 있다고 판단되는 경우에는 그 상세한 설명을 생략할 수 있고, 이에 의해 본 발명이 제한되지는 않는다. 본 발명은 후술하는 특허청구범위의 기재 및 그로부터 해석되는 균등 범주 내에서 다양한 변형 및 응용이 가능하다.
또한, 본 명세서에서 사용되는 용어(terminology)들은 본 발명의 바람직한 실시예를 적절히 표현하기 위해 사용된 용어들로서, 이는 사용자, 운용자의 의도 또는 본 발명이 속하는 분야의 관례 등에 따라 달라질 수 있다. 따라서, 본 용어들에 대한 정의는 본 명세서 전반에 걸친 내용을 토대로 내려져야 할 것이다. 명세서 전체에서, 어떤 부분이 어떤 구성요소를 "포함"한다고 할 때, 이는 특별히 반대되는 기재가 없는 한 다른 구성요소를 제외하는 것이 아니라 다른 구성 요소를 더 포함할 수 있는 것을 의미한다.
본 발명에서 사용되는 모든 기술용어는, 달리 정의되지 않는 이상, 본 발명의 관련 분야에서 통상의 당업자가 일반적으로 이해하는 바와 같은 의미로 사용된다. 또한 본 명세서에는 바람직한 방법이나 시료가 기재되나, 이와 유사하거나 동등한 것들도 본 발명의 범주에 포함된다. 본 명세서에 참고문헌으로 기재되는 모든 간행물의 내용은 본 발명에 도입된다.
일 측면에서, 본 발명은 AR(androgen receptor), AR-V7(androgen receptor variant 7), ATM(ATM serine/threonine kinase), KLK3(Kallikrein related peptidase 3), NKX3-1(NK3 homeobox 1), HGF(hepatocyte growth factor), PSCA(prostate stem cell antigen), MET(MET proto-oncogene), VIM(vimentin), EpCAM(epithelial cell adhesion molecule), CDH1(cadherin 1), CDH2(cadherin 2), DSG2(desmoglein 2), KRT8(keratin 8), KRT18(keratin 18), KRT19(keratin 19), DKK1(dickkopf WNT signaling pathway inhibitor 1), WNT5A(Wnt family member 5A), WNT5B(Wnt family member 5B), BRCA1(BRCA1 DNA repair associated), BRCA2(BRCA2 DNA repair associated), CDK12(cyclin dependent kinase 12), FANCA(FA complementation group A), RAD51B(RAD51 paralog B), FOLH1(folate hydrolase 1, PSMA), CXCL12(C-X-C motif chemokine ligand 12), RB1(RB transcriptional corepressor 1), PIK3CA(phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate 3 -kinase catalytic subunit alpha), PIK3CB(phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate 3 -kinase catalytic subunit beta), AURKA(aurora kinase A), SchLAP1(SWI/SNF complex antagonist associated with prostate cancer 1), MSH2(mutS homolog 2), SPINK1(serine peptidase inhibitor), TSPAN8(tetraspanin 8), CCN2(cellular communication network factor 2), EGFR(epidermal growth factor receptor), SOX2(SRY-box 2), SOX9(SRY-box-9), BMP7(bone morphogenetic protein 7), TM2:ERG(Fusion of TMPRSS2 and ERG), MDK(midkine), CCND1(cyclin D1), TP53(tumor protein p53), FOXA1(forkhead box A1), MS4A1 (membrane spanning 4-domains A1) 또는 PTPRC(protein tyrosine phosphatase, receptor type C) 유전자의 발현량을 mRNA 또는 단백질 수준에서 측정하는 제제를 포함하는, 전립선암 진단용 조성물에 관한 것이다.
일 구현예에서, 상기 조성물은 전립선암 진단용 바이오 마커 조성물일 수 있다.
일 구현예에서, 상기 진단은 조직, 전혈, 혈청 또는 혈장 중 하나 이상의 검체를 이용할 수 있으며, 상기 검체로부터 분리된 순환종양세포를 이용할 수 있고, 혈액으로부터 분리된 혈중암세포인 것이 가장 바람직하다.
본 발명에서, 용어, "순환종양세포(circulating tumor cells, CTCs)"또는 순환종양세포는 일차 종양(primary tumor cells)으로부터 분리되어 혈액을 따라 신체를 순환하는 혈중암세포를 의미하는 것이다.
일 구현예에서, 상기 마커 조성물은 전립선암의 병기를 구분 또는 진단할 수 있다.
일 구현예에서, 전립선암은 국한 병기(Localized stages) 또는 전이 병기(Metastatic stages)의 전립선암일 수 있으며, 전립선암은 국소 전립선암(Localized PCa, LPCa), 국소 진행성 전립선암(Locally advanced PCa, Adv-LPCa), 호르몬 양성 전립선암(metastatic hormone-sensitive prostate cancer, mHSPC) 또는 전이성 거세저항성 전립선암(metastatic castrate-resistant prostate cancer, mCRPC)일 수 있다.
본 발명에서, 혈청 내 PSA의 수치 및 글리슨 점수와 임상학적 병기를 기반으로 전립선암의 국한 병기 중 저위험군 및 고위험군 T2 환자 그룹 전체를 국소 전립선암(Localized PCa, LPCa) 그룹으로, 및 T3 및 T4에 해당하는 환자를 국소 진행성 전립선암(Locally advanced PCa, Adv-LPCa) 그룹으로 분류하고; 전이 병기를 전이성 호르몬 양성 전립선암(metastatic hormone-sensitive prostate cancer, mHSPC) 및 전이성 거세저항성 전립선암(metastatic castrate-resistant prostate cancer, mCRPC)으로 분류하였다.
일반적으로, 전립선암의 병기는 전립선암의 임상학적 TNM-stage(Clinical TNM-stage)에 따라 구분될 수 있으며, 종양의 크기 및 진행 정도에 따른 T, 전립선 근처의 림프 노드(Regional lymph nodes)의 침범 여부에 따른 N 및 다른 장기로의 전이 여부에 따른 M으로 나눌 수 있고, 주로 종양의 크기에 따른 T-stage로 기수를 나타낼 수 있으며, 혈청 전립선특이항원(serum-PSA)의 수치와 글리슨 점수(Gleason score)를 기준으로 위험군(risk group)을 구분 지을 수 있다.
본 발명에서는 전립선암의 병기를 구체적으로 전립선에서 매우 작은 크기의 암이 발생하고 PSA 수치 10 ng/mL 이하 및 Gleason score 6 이하인 저위험군의 T2 상태, 및 전립선 하나의 절반 이상이거나 두개에 모두 암이 발생하고 PSA 수치 10 - 20 ng/mL 및 Gleason score 7인 고위험군의 T2 상태를 포함하는 LPCa(Localized prostate cancer) 그룹; PSA 수치 20 ng/mL 이상 및 Gleason score 8-10이고 암이 전립선을 넘어 주위 저정낭까지 침투한 T3 상태 및 암이 방광으로 침투한 T4 상태를 포함하는 Adv-LPCa(Locally advanced prostate cancer) 그룹; T4 상태에서 더 나아가 다른 장기까지 전이되고 호르몬 요법에 반응하여 치료가 가능한 mHSPC(metastatic hormone-sensitive prostate cancer) 그룹; 및 2차성 호르몬 약물에 저항성을 나타내는 mCRPC(metastatic castration-resistant prostate cancer) 그룹으로 구분하였다.
일 구현예에서, 대상으로부터 분리된 혈액 내 순환종양세포에서 상기 유전자의 발현량을 측정한 뒤 ROC 분석한 값이 전립선암 진단 마커로 이용될 수 있으며, '유전자의 발현량'은 유전자의 mRNA에 특이적으로 결합하는 유전자의 발현량을 측정하는 제제를 이용하여 측정할 수 있으며, 유전자의 발현량을 측정하는 제제는, 상기 유전자의 핵산서열, 상기 핵산서열에 상보적인 핵산서열, 상기 핵산서열 및 상보적인 서열의 단편을 특이적으로 인식하는 프라미어 쌍, 프로브, 또는 프라이머 쌍 및 프로브일 수 있고, 측정은 중합효소연쇄반응, 실시간 RT-PCR (Real-time RT-PCR), 역전사 중합효소연쇄반응, 경쟁적 중합효소연쇄반응(Competitive RT-PCR), Nuclease 보호 분석(RNase, S1 nuclease assay), in situ 교잡법, 핵산 마이크로어레이, 노던블랏, DNA 칩, multiplex PCR 또는 ddPCR(Droplet digital PCR)로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 방법으로 수행될 수 있으며, ddPCR인 것이 더욱 바람직하다.
일 구현예에서, 마커 유전자의 단백질의 발현 수준을 측정하는 제제는 상기 마커의 단백질 전장 또는 그 단편을 특이적으로 인식하는 항체, 항체의 면역학적 활성을 가진 단편, 앱타머(aptamer), 아비머(avidity multimer) 또는 펩티도모방체(peptidomimetics)를 포함할 수 있으며, 이의 측정은 웨스턴블랏, ELISA(enzyme linked immunosorbent assay), 방사선면역분석(RIA: Radioimmunoassay), 방사면역확산법(radioimmunodiffusion), 면역 전기영동, 조직면역염색, 면역침전 분석법(Immunoprecipitation assay), 보체 고정 분석법(Complement Fixation Assay), FACS, 질량분석 또는 단백질 마이크로어레이로 이루어진 군으로부터 선택되는 방법으로 수행될 수 있다.
일 구현예에서, 본 발명의 항체의 면역학적 활성을 가진 단편은 Fab, Fd, Fab', dAb, F(ab'), F(ab')2, scFv(single chain fragment variable), Fv, 단일쇄 항체, Fv 이량체, 상보성 결정 영역 단편, 인간화 항체, 키메라 항체 및 디아바디(diabody)로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나일 수 있다.
본 발명에서 사용된 용어 "검출" 또는 "측정"은 검출 또는 측정된 대상의 농도를 정량하는 것을 의미한다.
본 발명에서 용어, "프라이머"는 짧은 자유 3말단 수산화기 (free 3 hydroxyl group)를 가지는 핵산 서열로 상보적인 템플레이트(template)와 염기쌍 (base pair)를 형성할 수 있고 템플레이트 가닥 복사를 위한 시작 지점으로 기능을 하는 짧은 핵산 서열을 의미한다. 프라이머는 적절한 완충용액 및 온도에서 중합반응 (즉, DNA 폴리머레이트 또는 역전사효소)을 위한 시약 및 상이한 4가지 뉴클레오사이드 트리포스페이트의 존재하에서 DNA 합성이 개시할 수 있다.
본 발명에서 용어, "프로브"란 mRNA와 특이적 결합을 이룰 수 있는 짧게는 수 염기 내지 길게는 수백 염기에 해당하는 RNA 또는 DNA 등의 핵산 단편을 의미하며 라벨링 되어 있어서 특정 mRNA의 존재 유무를 확인할 수 있다. 프로브는 올리고 뉴클레오타이드(oligonucleotide) 프로브, 단쇄 DNA(single stranded DNA) 프로브, 이중쇄 DNA(double stranded DNA) 프로브, RNA 프로브 등의 형태로 제작될 수 있다. 본 발명에서는 상기 유전자와 상보적인 프로브를 이용하여 혼성화를 실시하여, 혼성화 여부를 통해 상기 유전자 발현 정도를 진단할 수 있다. 적당한 프로브의 선택 및 혼성화 조건은 통상의 기술분야에 공지된 것을 기초로 변형할 수 있으므로 본 발명에서는 이에 대해 특별히 한정하지 않는다.
본 발명의 프라이머 또는 프로브는 포스포르아미다이트 고체 지지체 방법, 또는 기타 널리 공지된 방법을 사용하여 화학적으로 합성할 수 있다. 이러한 핵산 서열은 또한 당해 분야에 공지된 많은 수단을 이용하여 변형시킬 수 있다. 이러한 변형의 비-제한적인 예로는 메틸화, 캡화, 천연 뉴클레오타이드 하나 이상의 동족체로의 치환및 뉴클레오타이드 간의 변형, 예를 들면, 하전되지 않은 연결체 (예: 메틸 포스포네이트, 포스소트리에스테르, 포스포로아미데이트, 카바메이트 등) 또는 하전된 연결체 (예: 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트 등)로의 변형이 있다.
본 발명에서, 프로브를 cDNA 분자와 혼성화시키는 적합한 조건은 최적화 절차에 의하여 일련의 과정으로 결정될 수 있다. 이런 절차는 연구실에서 사용을 위한 프로토콜을 수립하기 위하여 당업자에 의하여 일련의 과정으로 실시된다. 예를 들어, 온도, 성분의 농도, 혼성화 및 세척 시간, 완충액 성분 및 이들의 pH 및 이온세기 등의 조건은 프로브의 길이 및 GC 양 및 타깃 뉴클레오타이드 서열 등의 다양한 인자에 의존한다. 예를 들어, 엄격조건 중에서 고 엄격조건은 0.5 M NaHPO4, 7% SDS(sodium dodecyl sulfate),1mM EDTA에서 65℃ 조건으로 혼성화하고, 0.1 x SSC(standard saline citrate)/0.1% SDS에서 68℃ 조건으로 세척하는 것을 의미한다. 또는, 고 엄격조건은 6 x SSC/0.05% 소듐 파이로포스페이트에서 48℃ 조건으로 세척하는 것을 의미한다. 저 엄격조건은 예를 들어, 0.2 x SSC/0.1% SDS에서 42℃ 조건으로 세척하는 것을 의미한다.
본 발명에서 용어, "항체"란 당해 분야에서 공지된 용어로서 항원성 부위에 대해서 지시되는 특이적인 단백질 분자를 의미한다. 본 발명의 목적상, 항체는 본 발명의 마커 유전자에서 발현되는 단백질에 대해 특이적으로 결합하는 항체를 의미하며, 상기 항체의 제조방법은 널리 공지된 방법을 사용하여 제조할 수 있다. 여기에는 상기 단백질에서 만들어질 수 있는 부분 펩티드도 포함된다. 본발명의 항체의 형태는 특별히 제한되지 않으며 폴리클로날 항체, 모노클로날 항체 또는 항원 결합성을 갖는 것이면 그것의 일부도 본 발명의 항체에 포함되고 모든 면역 글로불린 항체가 포함된다. 나아가, 본 발명의 항체에는 인간화 항체 등의 특수 항체도 포함된다.
본 발명에서 용어, "진단"은 특정 질병 또는 질환에 대한 한 객체의 감수성(susceptibility)을 판정하는 것, 한 객체가 특정 질병 또는 질환을 현재 가지고 있는지 여부를 판정하는 것, 특정 질병 또는 질환에 걸린한 객체의 예후(prognosis)를 판정하는 것, 또는 테라메트릭스(therametrics)(예컨대, 치료 효능에 대한 정보를 제공하기 위하여 객체의 상태를 모니터링 하는 것)을 포함한다.
일 측면에서, 본 발명은 본 발명의 조성물을 포함하는, 전립선암 진단 키트에 관한 것이다.
일 구현예에서, 상기 키트는 대상체 또는 환자로부터 생체 시료를 수집하기 위한 도구 및/또는 시약 뿐 아니라 그 시료로부터 게놈 DNA, cDNA, RNA 또는 단백질을 준비하기 위한 도구 및/또는 시약을 더 포함할 수 있다. 예를 들면, 게놈 DNA의 관련 영역을 증폭하기 위한 PCR 프라이머를 포함할 수 있다. 상기 키트는 약리게놈학적 프로파일링에 유용한 유전 인자의 프로브를 포함할 수 있다. 또한, 이러한 키트의 사용에 있어서, 표지화된 올리고뉴클레오티드를 사용하여 분석 중 용이하게 동정할 수 있다.
본 발명에서 용어 "전립선암 진단용 조성물 또는 전립선암 병기 진단/구분용 조성물"이란 전립선암의 발생 위험도를 예측/진단하거나, 특정 병기의 전립선암을 진단하거나, 전립선암의 병기들을 구분할 수 있는 물질로, 전립선암의 발생 가능성 및 이의 병기와 유의미한 상관관계를 가지고 발현이 증가 또는 감소하는 양상을 보이는 폴리펩타이드 또는 핵산(예: mRNA 등), 지질 , 당지질, 당단백질, 당(단당류, 이당류, 올리고당류 등) 등과 같은 유기 생체 분자 등을 포함한다. 본 발명의 목적상, 상기 전립선암 진단용 바이오 마커는 유전자 AR, AR-V7, KLK3, NKX3-1, HGF, PSCA, MET, VIM, EpCAM, CDH1, CDH2, DSG2, KRT8, KRT18, KRT19, DKK1, WNT5A, WNT5B, BRCA1, BRCA2, CDK12, FANCA, RAD51B, FOLH1(PSMA), CXCL12, RB1, PIK3CA, PIK3CB, AURKA, SchLAP1, MSH2, SPINK1, TSPAN8, CCN2, EGFR, SOX2, SOX9, BMP7, TM2:ERG, MDK, CCND1, TP53, FOXA1, MS4A1 및 PTPRC로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상으로서, 전립선암 발생에 특이적으로 mRNA 발현 또는 단백질 발현 정도가 증가 또는 감소하는 유전자이다. 이러한 마커들은 유전자뿐만 아니라 어느 하나의 마커와 상보적인 DNA 또는 mRNA을 포함하며, 이들 마커들이 둘 이상 포함된 복합 마커인 것이 바람직하다.
일 측면에서, 본 발명은 대상으로부터 분리된 시료로부터 순환종양세포(circulating tumor cell, CTC)를 분리하는 단계; 및 분리된 순환종양세포에서 AR, AR-V7, KLK3, NKX3-1, HGF, PSCA, MET, VIM, EpCAM, CDH1, CDH2, DSG2, KRT8, KRT18, KRT19, DKK1, WNT5A, WNT5B, BRCA1, BRCA2, CDK12, FANCA, RAD51B, FOLH1(PSMA), CXCL12, RB1, PIK3CA, PIK3CB, AURKA, SchLAP1, MSH2, SPINK1, TSPAN8, CCN2, EGFR, SOX2, SOX9, BMP7, TM2:ERG, MDK, CCND1, TP53, FOXA1, MS4A1 또는 PTPRC 유전자의 RNA 전사체 발현 데이터를 분석하는 단계를 포함하는, 전립선암의 진단 또는 예후에 필요한 정보를 제공하는 방법에 관한 것이다.
일 구현예에서, 전립선암은 국한 병기(Localized stages) 또는 전이 병기(Metastatic stages)의 전립선암일 수 있으며, 전립선암은 국소 전립선암(Localized PCa, LPCa), 국소 진행성 전립선암(Locally advanced PCa, Adv-LPCa), 호르몬 양성 전립선암(metastatic hormone-sensitive prostate cancer, mHSPC) 또는 전이성 거세저항성 전립선암(metastatic castrate-resistant prostate cancer, mCRPC)일 수 있다.
일 구현예에서, 검사 대상체로부터 분리된 시료는 혈액 시료일 수 있다.
일 구현예에서, 혈액 시료로부터 분리된 순환종양세포에서 AR, AR-V7, KLK3, NKX3-1, HGF, PSCA, MET, VIM, EpCAM, CDH1, CDH2, DSG2, KRT8, KRT18, KRT19, DKK1, WNT5A, WNT5B, BRCA1, BRCA2, CDK12, FANCA, RAD51B, FOLH1(PSMA), CXCL12, RB1, PIK3CA, PIK3CB, AURKA, SchLAP1, MSH2, SPINK1, TSPAN8, CCN2, EGFR, SOX2, SOX9, BMP7, TM2:ERG, MDK, CCND1, TP53, FOXA1, MS4A1 또는 PTPRC 유전자의 RNA 전사체 발현 데이터를 ROC 통계 분석할 수 있다.
일 측면에서, 본 발명은 검사 대상체로부터 분리된 혈액으로부터 순환종양세포를 분리하는 자기 영동을 이용한 미세 입자 분리부; 및 본 발명의 전립선암 진단용 조성물을 이용하여 상기 순환종양세포에서 AR, AR-V7, KLK3, NKX3-1, HGF, PSCA, MET, VIM, EpCAM, CDH1, CDH2, DSG2, KRT8, KRT18, KRT19, DKK1, WNT5A, WNT5B, BRCA1, BRCA2, CDK12, FANCA, RAD51B, FOLH1(PSMA), CXCL12, RB1, PIK3CA, PIK3CB, AURKA, SchLAP1, MSH2, SPINK1, TSPAN8, CCN2, EGFR, SOX2, SOX9, BMP7, TM2:ERG, MDK, CCND1, TP53, FOXA1, MS4A1 또는 PTPRC 유전자의 RNA 전사체 발현 데이터를 ROC 통계 분석하는 분석부를 포함하는, 전립선암 진단용 바이오칩에 관한 것이다.
일 구현예에서, 검사 대상체로부터 분리된 시료는 혈액 시료일 수 있다.
하기의 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세하게 설명한다. 그러나 하기 실시예는 본 발명의 내용을 구체화하기 위한 것일 뿐 이에 의해 본 발명이 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. 환자 분류 및 시료 수집
전립선암 환자를 종양의 크기 및 진행 정도에 따른 T, 전립선 근처의 림프 노드(Regional lymph nodes)의 침범 여부에 따른 N, 및 다른 장기로의 전이 여부에 따른 M으로 나누는 전립선암의 임상학적 TNM-stage(Clinical TNM-stage)에 따라, 국소질환에 속하는 국한 병기(Localized stages) (T2, T3 및 T4) 및 원격전이로 인한 진행성 질환에 속하는 전이 병기(Metastatic stages)로 분류하고 혈청 내 PSA의 수치 및 글리슨 점수(Gleason score)를 기준으로 위험군(Risk group)을 구분하여 환자들을 분류하였다. 구체적으로, 하기 표 1에 나타낸 바와 같이, 혈청 내 PSA의 수치 및 글리슨 점수와 임상학적 병기를 기반으로 국한 병기 중 T2에 해당하는 환자를 국소 전립선암(Localized PCa, LPCa) (n=34) 및 T3 및 T4에 해당하는 환자를 국소 진행성 전립선암(Locally advanced PCa, Adv-LPCa) (n=33)으로 분류하고, 전이 병기를 전이성 호르몬 양성 전립선암(metastatic hormone-sensitive prostate cancer, mHSPC) (n=32) 및 전이성 거세저항성 전립선암(metastatic castrateresistant prostate cancer, mCRPC) (n=97)으로 분류하였다. 상기 분류된 각 환자의 말초혈액 10mL를 진공채혈튜브에 확보하였다.
Figure PCTKR2024000608-appb-img-000001
실시예 2. 혈중암세포 분리
상기 분류된 각 환자의 말초혈액에서 농도구배방식(Density gradient)으로 적혈구를 제거하고, Ficoll solution (1.119g/mL)를 처리한 뒤 700g로 30분 동안 원심분리하였다. 원심분리 후 백혈구 및 순환종양세포(circulating tumor cell, CTC) (즉, 혈중암세포) 층을 분리하고 PBS 버퍼 10mL로 세척한 뒤 200g로 10분 동안 원심분리하였다. PBS 버퍼 200uL로 한 번 더 세척한 뒤 200g로 5분 동안 원심분리하여 백혈구 및 혈중암세포층을 수득하였다. 이 후, 혈중암세포 특이 항원인 EpCAM에 부착 가능한 20uL의 EpCAM cocktail solution (Anti-EpCAM 항체항원이 아닌 항체 및 Dextran)을 처리한 후 아이스 조건에서 1시간 동안 인큐베이션하여 혈중암세포의 EpCAM 항원에 cocktail의 anti-EpCAM을 결합시키고, EpCAM에 특이적으로 결합 가능한 나노미터 크기의 면역자성비드 (Anti-dextran 항체가 코팅된 수십 nm 지름의 자성 나노비드)를 20uL 처리하여 아이스 조건에서 1시간 30분 동안 인큐베이션함으로써 cocktail 의 dextran과 anti-dextran이 결합하여 최종적으로 '암세포-항 EpCAM 항체-dextran-자성나노비드' 형태의 결합을 유도하였다. 이 후, 한국등록특허 제10-1622342호에 기재된 자기 영동을 이용한 미세 입자 분리 장치를 이용하여 측면방향 자기영동분리를 수행하였다. 상기 장치에 0.2% BSA PBS 버퍼와 상기에서 준비한 혈액 시료를 각각 2mL/h의 속도로 흘리고 분리된 시료를 1.5mL e-튜브에 수집하였다.
실시예 3. 유전자 분석
상기 실시예 2에서 분리한 혈중암세포 시료에서 유전자 AR, AR-V7, KLK3, NKX3-1, HGF, PSCA, MET, VIM, EpCAM, CDH1, CDH2, DSG2, KRT8, KRT18, KRT19, DKK1, WNT5A, WNT5B, BRCA1, BRCA2, CDK12, FANCA, RAD51B, FOLH1(PSMA), CXCL12, RB1, PIK3CA, PIK3CB, AURKA, SchLAP1, MSH2, SPINK1, TSPAN8, CCN2, EGFR, SOX2, SOX9, BMP7, TM2:ERG, MDK, CCND1, TP53, FOXA1, MS4A1 및 PTPRC의 발현을 ddPCR(Droplet digital PCR) 방법으로 분석하였다. 구체적으로, 상기 실시예 2에서 준비한 시료를 200g로 5분 동안 원심분리한 후 세포 파쇄 용액 300uL를 처리하고, Dynabeads mRNA Direct Kit (Invitrogen)로 총 RNA를 분리한 뒤, SMARTer PCR cDNA synthesis kit (CloneTech)로 cDNA (10uL)를 합성하였다. 이 후, Advantage 2 PCR kit (CloneTech)를 이용하여 최종 100uL의 증폭된 cDNA 주형(template)을 확보하고 증폭된 cDNA 주형을 1/10으로 희석하였다. 상기 cDNA 주형이 포함된 PCR mixture를 droplet-generating cartridge (DG8 Cartridges for QX100/QX200 droplet generator, Bio-RAD)의 샘플 주입구에 20uL 주입하고, droplet generation oil(Droplet generation oil for EvaGreen, Bio-RAD)을 오일 주입구에 70uL 주입하였다. 그 뒤, droplet을 형성하기 위해 Droplet generating cartridge를 droplet generator (QX200 Droplet generator, Bio-Rad)에 장착하여 2분간 droplet을 형성하였다. 형성된 droplet을 96 PCR 웰 플레이트로 옮기고, 실러(Sealer)로 실링하였다. PCR cycler (GeneAmp PcR System 9700, Applied Biosystems)를 이용하여 95℃ 5분 (Enzyme activation), 95℃ 30초 (denaturation) + 56℃ 1분(Annealing and extension)을 40 사이클, 및 4℃ 5분 + 90℃ 5분 (signal stabilization)의 조건으로 PCR을 수행하고, droplet reader (QX200 Droplet reader, Bio-RAD)로 분석하였다.
실시예 4. 전립선암 병기 구분용 마커 도출
4-1. LPCa 및 mHSPC 구분 마커
LPCa와 전이 병기인 mHSPC 및 mCRPC를 구분할 수 있는 마커들을 도출하기 위해, ROC(receiver operating characteristic) 통계 분석을 수행하여 결과 변수를 예측하기 위한 각 유전자의 민감도, 특이도 및 PSA 점수를 평가하였다. 구체적으로, 상기 실시예 3에서 확인한 유전자 데이터를 이용하여 로지스틱 회귀 분석 모델(logistic regression classification model)을 구축하여 결과 변수를 예측하였으며, 데이터 시각화를 위해 로그 변환된 데이터를 z-스코어로 변환하여 히트맵을 생성하였다. 유전자 값의 양성 및 음성 예측값을 결과 변수(outcome variable)를 기반으로 계산하였다. 모든 통계 분석은 SPSS 26.0 및 R 3.6.2 를 이용하여 수행하였고, p 값이 미만인 경우 통계적으로 유의한 것으로 간주하였다 (표 2 및 표 3).
Figure PCTKR2024000608-appb-img-000002
Figure PCTKR2024000608-appb-img-000003
4-2. LPCa 및 mHSPC 구분 마커
ROC(receiver operating characteristic) 커브를 분석하여, 국소 전립선암(Localized PCa, LPCa) 환자군과 전이성 호르몬 양성 전립선암(metastatic hormone-sensitive prostate cancer, mHSPC) 환자군을 높은 민감도와 특이도로 구분할 수 있는 마커를 도출하고, 이의 Cut-off 값을 설정하였다.
Figure PCTKR2024000608-appb-img-000004
그 결과, CDK12, BRCA2 및 PIK3CB 유전자가 국소 전립선암과 전이성 호르몬 양성 전립선암을 구분할 수 있는 것으로 나타났다 (표 4 및 도 1).
4-3. LPCa 및 mCRPC 구분 마커
ROC(receiver operating characteristic) 커브를 분석하여, 국소 진행성 전립선암(Locally advanced PCa, Adv-LPCa) 환자군과 전이성 거세저항성 전립선암(metastatic castrate-resistant prostate cancer, mCRPC) 환자군을 구분할 수 있는 마커를 도출하고, 이의 Cut-off 값을 설정하였다.
Figure PCTKR2024000608-appb-img-000005
그 결과, MET,　VIM,　KRT18,　PIK3CB,　MDK, BRCA2,　ATM,　CDK12 및　FOLH(PSMA) 유전자가 국소 전립선암과 전이성 거세저항성 전립선암을 구분할 수 있는 것으로 나타났으며 (표 5, 도 2 및 3), 특히, BRCA2,　ATM,　CDK12 및　FOLH(PSMA) 유전자의 경우 혈청 내 PSA　보다도　AUC 값이　높아,　기존　마커보다도　진단　효과가　높은 것으로 나타났다.
4-4. Adv-LPCa　및　mCRPC　구분　마커
Adv-LPCa와 전이 병기인 mHSPC 및 mCRPC를 구분할 수 있는 마커들을 도출하기 위해, ROC(receiver operating characteristic) 커브를 분석하여, 국소 진행성 전립선암(Locally advanced PCa, Adv-LPCa) 환자군과 전이성 거세저항성 전립선암(metastatic castrate-resistant prostate cancer, mCRPC) 환자군을 구분할 수 있는 마커를 도출하고, 이의 Cut-off 값을 설정하였다.
Figure PCTKR2024000608-appb-img-000006
Figure PCTKR2024000608-appb-img-000007
Figure PCTKR2024000608-appb-img-000008
그 결과, MET 및 MS4A1 유전자가 국소 진행성 전립선암과 전이성 거세저항성 전립선암을 구분할 수 있는 것으로 나타났다 (표 6 내지 8 및 도 4).

Claims (11)

  1. AR(androgen receptor), AR-V7(androgen receptor variant 7), ATM(ATM serine/threonine kinase), KLK3(Kallikrein related peptidase 3), NKX3-1(NK3 homeobox 1), HGF(hepatocyte growth factor), PSCA(prostate stem cell antigen), MET(MET proto-oncogene), VIM(vimentin), EpCAM(epithelial cell adhesion molecule), CDH1(cadherin 1), CDH2(cadherin 2), DSG2(desmoglein 2), KRT8(keratin 8), KRT18(keratin 18), KRT19(keratin 19), DKK1(dickkopf WNT signaling pathway inhibitor 1), WNT5A(Wnt family member 5A), WNT5B(Wnt family member 5B), BRCA1(BRCA1 DNA repair associated), BRCA2(BRCA2 DNA repair associated), CDK12(cyclin dependent kinase 12), FANCA(FA complementation group A), RAD51B(RAD51 paralog B), FOLH1(folate hydrolase 1, PSMA), CXCL12(C-X-C motif chemokine ligand 12), RB1(RB transcriptional corepressor 1), PIK3CA(phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate 3 -kinase catalytic subunit alpha), PIK3CB(phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate 3 -kinase catalytic subunit beta), AURKA(aurora kinase A), SchLAP1(SWI/SNF complex antagonist associated with prostate cancer 1), MSH2(mutS homolog 2), SPINK1(serine peptidase inhibitor), TSPAN8(tetraspanin 8), CCN2(cellular communication network factor 2), EGFR(epidermal growth factor receptor), SOX2(SRY-box 2), SOX9(SRY-box-9), BMP7(bone morphogenetic protein 7), TM2:ERG(Fusion of TMPRSS2 and ERG), MDK(midkine), CCND1(cyclin D1), TP53(tumor protein p53), FOXA1(forkhead box A1), MS4A1 (membrane spanning 4-domains A1) 또는 PTPRC(protein tyrosine phosphatase, receptor type C) 유전자의 발현량을 mRNA 또는 단백질 수준에서 측정하는 제제를 포함하는, 전립선암 진단용 조성물.
  2. 제 1항에 있어서, 전립선암은 국한 병기(Localized stages) 또는 전이 병기(Metastatic stages)의 전립선암인, 전립선암 진단용 조성물.
  3. 제 1항에 있어서, 전립선암은 국소 전립선암(Localized PCa, LPCa), 국소 진행성 전립선암(Locally advanced PCa, Adv-LPCa), 호르몬 양성 전립선암(metastatic hormone-sensitive prostate cancer, mHSPC) 또는 전이성 거세저항성 전립선암(metastatic castrate-resistant prostate cancer, mCRPC)인, 전립선암 진단용 조성물.
  4. 제 1항에 있어서, mRNA 수준에서 측정하는 제제는, 상기 유전자의 핵산서열, 상기 핵산서열에 상보적인 핵산서열, 상기 핵산서열 및 상보적인 서열의 단편을 특이적으로 인식하는 프라미어 쌍, 프로브, 또는 프라이머 쌍 및 프로브인, 전립선암 진단용 조성물.
  5. 제 4항에 있어서, 측정은 중합효소연쇄반응, 실시간 RT-PCR (Real-time RT-PCR), 역전사 중합효소연쇄반응, 경쟁적 중합효소연쇄반응(Competitive RT-PCR), ddPCR(Droplet digital PCR), Nuclease 보호 분석(RNase, S1 nuclease assay), in situ 교잡법, 핵산 마이크로어레이, 노던블랏, DNA 칩, multiplex PCR 또는 ddPCR로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 방법으로 수행되는, 전립선암 진단용 조성물.
  6. 제 1항에 있어서, 단백질 수준에서 측정하는 제제는, 상기 유전자의 단백질 전장 또는 그 단편을 특이적으로 인식하는 항체, 항체의 면역학적 활성을 가진 단편, 앱타머(aptamer), 아비머(avidity multimer) 또는 펩티도모방체(peptidomimetics)인, 전립선암 진단용 조성물.
  7. 제 6항에 있어서, 측정은 웨스턴블랏, ELISA(enzyme linked immunosorbent assay), 방사선면역분석(RIA: Radioimmunoassay), 방사면역확산법(radioimmunodiffusion), 면역 전기영동, 조직면역염색, 면역침전 분석법(Immunoprecipitation assay), 보체 고정 분석법(Complement Fixation Assay), FACS, 질량분석 또는 단백질 마이크로어레이로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 방법으로 수행되는, 전립선암 진단용 조성물.
  8. 제 1항의 조성물을 포함하는, 전립선암 진단 키트.
  9. 1) 대상으로부터 분리된 시료로부터 순환종양세포(circulating tumor cell, CTC)를 분리하는 단계; 및
    2) 분리된 순환종양세포에서 AR, AR-V7, KLK3, NKX3-1, HGF, PSCA, MET, VIM, EpCAM, CDH1, CDH2, DSG2, KRT8, KRT18, KRT19, DKK1, WNT5A, WNT5B, BRCA1, BRCA2, CDK12, FANCA, RAD51B, FOLH1(PSMA), CXCL12, RB1, PIK3CA, PIK3CB, AURKA, SchLAP1, MSH2, SPINK1, TSPAN8, CCN2, EGFR, SOX2, SOX9, BMP7, TM2:ERG, MDK, CCND1, TP53, FOXA1, MS4A1 또는 PTPRC 유전자의 RNA 전사체 발현 데이터를 분석하는 단계를 포함하는, 전립선암의 진단 또는 예후에 필요한 정보를 제공하는 방법.
  10. 제 9항에 있어서, 검사 대상체로부터 분리된 시료는 혈액 시료인, 전립선암의 진단 또는 예후에 필요한 정보를 제공하는 방법.
  11. 1) 검사 대상체로부터 분리된 혈액으로부터 순환종양세포를 분리하는 자기 영동을 이용한 미세 입자 분리부; 및
    2) 제 1항의 전립선암 진단용 조성물을 이용하여 상기 순환종양세포에서 AR, AR-V7, KLK3, NKX3-1, HGF, PSCA, MET, VIM, EpCAM, CDH1, CDH2, DSG2, KRT8, KRT18, KRT19, DKK1, WNT5A, WNT5B, BRCA1, BRCA2, CDK12, FANCA, RAD51B, FOLH1(PSMA), CXCL12, RB1, PIK3CA, PIK3CB, AURKA, SchLAP1, MSH2, SPINK1, TSPAN8, CCN2, EGFR, SOX2, SOX9, BMP7, TM2:ERG, MDK, CCND1, TP53, FOXA1, MS4A1 또는 PTPRC 유전자의 RNA 전사체 발현 데이터를 ROC 통계 분석하는 분석부를 포함하는, 전립선암 진단용 바이오칩.
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