WO2024147556A1 - K-ras 돌연변이 다중 항원결정기 폴리펩타이드를 유효성분으로 포함하는 항암 백신용 조성물 - Google Patents
K-ras 돌연변이 다중 항원결정기 폴리펩타이드를 유효성분으로 포함하는 항암 백신용 조성물Info
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Abstract
본 발명은 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 K-ras 돌연변이 다중 항원결정기 폴리펩타이드를 유효성분으로 포함하는 항암 백신용 조성물에 관한 것으로, 본 발명의 항암 백신용 조성물을 이용하면 K-ras 단백질의 돌연변이를 발현하는 암세포에 대한 면역감시기능을 강화시키므로 면역반응작용을 통해 암세포를 초기에 발견하여 사멸시키며 이미 발생한 암세포에 대해서도 특이적으로 사멸시키므로 암을 예방하고 치료할 수 있는 장점이 있다.
Description
본 발명은 K-ras 돌연변이 다중 항원결정기 폴리펩타이드를 유효성분으로 포함하는 항암 백신용 조성물에 관한 것이다.
암세포는 인체내 면역반응을 억제하는 물질을 스스로 분비하거나 항체생성에 필수적인 항원을 제시하지 않기 때문에 적절한 면역반응을 일으키지 못할 뿐 아니라 정상적인 면역반응이 수행될 수 없는 복합적인 유전자 돌연변이들에 의해서 생성된 새로운 항원들을 제시하므로 정상적인 면역감시기능에 의해 제거되지 않는다.
상기 문제점을 해결하기 위하여 암세포를 특이적으로 파괴하는 T 세포의 활성을 인위적으로 조절할 수 있는 항암 백신(cancer vaccine)이 개발되고 있다. 항암 백신은 암세포가 지니는 암특이항원(tumor-specific antigen; TSA)을 암환자에게 투여하여 면역시스템을 활성화시킴으로써 생체 내 면역기능을 강화하여 암세포를 제거하는 능동적 면역치료법이다.
초기에는 면역보조제와 혼합된 불활성화시킨 암세포 전체 또는 암세포 용해물질들이 이용되었으나 싸이토카인(cytokine) 및 공동자극분자(costimulatory molecules)를 암호화하는 유전자, 항원, 항원결정기(epitope), in vitro에서 수지상세포(dendritic cell)와 암항원을 배양하여 암세포의 항원을 제시하는 방법등 많은 방법들이 개발되고 있다.
암 항원 중 K-ras 돌연변이는 고형암의 약 20%에서 발견되고 있는 발암유발변이로서, 췌장 및 대장의 선암, 폐암 등에서 발견되고 있다. K-ras 돌연변이 유전자에 의존성을 보이는 종양을 타겟으로 하는 치료법은 K-ras 돌연변이 유전자에 의해 발현되는 K-ras 돌연변이체들에 개별적으로 결합하는 항체를 만들기 어려운 이유로 K-ras의 기능을 억제하거나 비활성화 하는 간접적인 치료법에 국한되어 있어 효과가 제한적이었다. 이를 해결하기 위하여 상기 K-ras 돌연변이의 항원결정기를 펩타이드 수준으로 제조한 후 이를 항암 백신으로 사용하기 위한 연구가 진행되고 있다. 그러나 K-ras 돌연변이의 항원결정기 펩타이드 항암 백신은 암세포의 타겟 부위가 돌연변이를 일으키게 되는 경우 면역회피가 일어 날 수 있을 뿐 아니라 면역반응에서 CD4 T 세포의 도움을 받지 못하여 면역반응성이 낮을 수 있고 MHC class I 분자에 올려지는 펩타이드 형태로 디자인되었기 때문에 인간백혈구 항원(Human leukocyte antigen, HLA) 타입에 제한이 있는 단점이 있었다.
본 명세서에서 언급된 특허문헌 및 참고문헌은 각각의 문헌이 참조에 의해 개별적이고 명확하게 특정된 것과 동일한 정도로 본 명세서에 참조로 삽입된다.
본 발명은 상기 문제점을 해결하기 위하여 K-ras 돌연변이 단백질 중 면역원성이 높은 부분의 펩타이드를 중첩하여 설계하는 방법으로 K-ras 돌연변이 다중 항원결정기 폴리펩타이드를 제조하고 이를 유효성분으로 포함하는 항암 백신용 조성물을 제공하는 목적이 있다.
본 발명의 다른 목적 및 기술적 특징은 이하의 발명의 상세한 설명, 청구의 범위 및 도면에 의해 보다 구체적으로 제시된다.
본 발명은 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 K-ras 돌연변이 다중 항원결정기 폴리펩타이드를 유효성분으로 포함하는 항암 백신용 조성물을 제공한다.
상기 항암 백신용 조성물은 서열번호 2의 아미노산 서열을 가지는 K-ras 단백질의 G12D 돌연변이 항원결정기; 서열번호 2의 아미노산 서열을 가지는 K-ras 단백질의 G13D 돌연변이 항원결정기; 및 서열번호 2의 아미노산 서열을 가지는 K-ras 단백질의 G12V 돌연변이 항원결정기;로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나의 또는 둘 이상의 항원결정기를 가져 암에 대한 면역원성이 향상된 T 세포를 유도하는 것을 특징으로 한다.
상기 항암 백신용 조성물은 항원제시세포(Antigen Presenting Cell)와 T 세포를 포함하는 말초 혈액 단핵세포 (peripheral blood mononuclear cell, PBMC)와 배양하면 서열번호 2를 가지는 K-ras 단백질의 G12D 돌연변이, 서열번호 2를 가지는 K-ras 단백질의 G13D 돌연변이 및 서열번호 2를 가지는 K-ras 단백질의 G12V 돌연변이로 구성된 단백질군으로부터 선택된 어느 하나 또는 둘 이상의 단백질을 발현하는 암세포에 대한 특이적 사멸능을 가지는 T 세포가 유도되며 상기 암세포는 서열번호 2를 가지는 K-ras 단백질의 G12D 돌연변이를 발현하는 폐암세포 또는 서열번호 2를 가지는 K-ras 단백질의 G13D 돌연변이를 발현하는 유방암세포인 것을 특징으로 한다.
본 발명의 항암 백신용 조성물을 이용하면 K-ras 단백질의 돌연변이를 발현하는 암세포에 대한 면역감시기능을 강화시키므로 면역반응작용을 통해 암세포를 초기에
발견하여 사멸시키며 이미 발생한 암세포에 대하서도 특이적으로 사멸시키므로 암을 예방하고 치료할 수 있는 장점이 있다.
도 1은 본 발명의 K-ras(M)-MEP의 항원결정기 구조를 보여준다.
도 2는 본 발명의 K-ras(M)-MEP에 대한 정상인 유래 PBMC의 면역원성을 ELISpot(IFN-γ) assay의 SFC(Spot Forming Cell) 그래프로 분석한 결과를 보여준다.
도 3은 본 발명의 K-ras(M)-MEP 농도에 따른 LP-1 PBMC의 K-ras(M)-MEP 특이적 CD3+ T 세포 비율을 분석한 결과를 보여준다.
도 4는 본 발명의 K-ras(M)-MEP 농도에 따른 암환자 PBMC의 면역원성을 ELISpot(IFN-γ) assay의 SFC(Spot Forming Cell) 그래프로 분석한 결과를 보여준다.
도 5는 본 발명의 K-ras(M)-MEP, K-ras1-24Wild-type, 및 K-ras1-24돌연변이에 대한 LP-1 PBMC의 항원 특이적 CD3+ T 세포 비율을 분석한 결과를 보여준다.
도 6은 본 발명의 본 발명의 MEP-T 세포와 T3M10 세포주 또는 MCF-7 세포주를 공배양하여 암세포의 사멸능을 분석한 결과를 보여준다.
본 발명은 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 K-ras 돌연변이 다중 항원결정기 폴리펩타이드를 유효성분으로 포함하는 항암 백신용 조성물을 제공한다.
본 발명의 항암백신용 조성물을 이용하면 K-ras 단백질의 돌연변이를 발현하는 암세포에 대한 면역감시기능을 강화시키므로 면역반응작용을 통해 암을 예방하고 치료할 수 있는 장점이 있다.
본 발명의 "예방"이란 본 발명의 항암 백신용 조성물 투여에 의해 암이 억제되거나 지연되는 모든 행위를 의미하며, 본 발명의 "치료"란 본 발명의 항암 백신용 조성물 투여에 의해 암의 증세가 호전되거나 이롭게 변경하는 모든 행위를 의미한다.
상기 K-ras 단백질의 유전자인 KRAS는 대표적인 원종양유전자(proto-oncogene)로서 척추동물에서 세포의 성장, 분화에 관여하며 점돌연변이(point mutation), 염색체전위(chromosomal translocation), 유전자 증폭(gene amplification)등에 의해 종양유전자(oncogene)로 바뀌는 경우 K-ras의 활성을 비정상적으로 증가시켜 암을 유발한다.
본 발명의 항암 백신용 조성물은 서열번호 2의 아미노산 서열을 가지는 K-ras 단백질의 G12D 돌연변이 항원결정기; 서열번호 2의 아미노산 서열을 가지는 K-ras 단백질의 G13D 돌연변이 항원결정기; 및 서열번호 2의 아미노산 서열을 가지는 K-ras 단백질의 G12V 돌연변이 항원결정기;로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나의 또는 둘 이상의 항원결정기를 가져 암에 대한 면역원성이 향상된 T 세포를 유도하는 것을 특징으로 한다.
상기 K-ras 단백질의 G12D 돌연변이, K-ras 단백질의 G12D 돌연변이, K-ras 단백질의 G12V 돌연변이는 다양한 암에서 발견되는 돌연변이로서 GTPase-activating proteins (GAPs)에 의한 GTP hydrolysis가 원활하게 일어나지 못하게 하여 GTP-bound RAS protein의 cellular level을 증가시키고 이로 인하여 하위 신호전달체계를 비정상적으로 활성화시키므로 암세포의 증식을 유도하는 것으로 알려져 있다. 상기 항원결정기(epitope)는 면역반응을 유도하고 형성된 항체와 특이적으로 결합하는 항원의 구분 구조를 의미한다.
본 발명의 항암 백신용 조성물은 항원제시세포(Antigen Presenting Cell)와 T 세포를 포함하는 말초 혈액 단핵세포 (peripheral blood mononuclear cell, PBMC)와 배양하면 서열번호 2를 가지는 K-ras 단백질의 G12D 돌연변이, 서열번호 2를 가지는 K-ras 단백질의 G13D 돌연변이 및 서열번호 2를 가지는 K-ras 단백질의 G12V 돌연변이로 구성된 단백질군으로부터 선택된 어느 하나 또는 둘 이상의 단백질을 발현하는 암세포에 대한 특이적 사멸능을 가지는 T 세포(세포독성 T 세포)가 유도되는 것을 특징으로 하며 상기 암세포는 서열번호 2를 가지는 K-ras 단백질의 G12D 돌연변이를 발현하는 폐암세포 또는 서열번호 2를 가지는 K-ras 단백질의 G13D 돌연변이를 발현하는 유방암세포인 것을 특징으로 한다.
본 발명의 항암 백신용 조성물은 세포독성 T 세포의 활성을 증가시키는 것이 바람직하나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 항암 백신용 조성물은 약제학적으로 허용 가능한 담체를 포함한다. 상기 약제학적으로 허용가능한 담체는 생리식염수, 폴리에틸렌글리콜, 에탄올, 식물성 오일 및 이소프로필미리스테이트 등을 포함할 수 있으며, 이에 한정되지는 않는다.
또한, 본 발명의 항암 백신용 조성물은 목적 조직에 도달할 수 있는 한 투여방법에는 제한이 없다. 예를 들면, 경구 투여, 동맥 주사, 정맥 주사, 경피 주사, 비강 내 투여, 경기관지 투여 또는 근육 내 투여 등이 포함된다. 일일 투여량은 약 0.0001 내지 100 mg/kg이고, 바람직하게는 0.001 내지 10 mg/kg이며, 하루 일회 내지 수회 나누어 투여하는 것이 바람직하다. 본 발명의 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 K-ras 돌연변이 다중 항원결정기 폴리펩타이드를 제조하여 항원제시세포(Antigen Presenting Cell)와 T 세포를 포함하는 말초 혈액 단핵세포 (peripheral blood mononuclear cell, PBMC)와 배양하면 교차항원이 제시된 후, 단백질전달도메인에 융합되었던 T 세포 항원결정기가 MHC class I 분자에 제시되고, 결국 세포표면의 MHC class I-T 세포 항원결정기 복합체가 세포독성 T 세포 활성화하여 암세포를 사멸시킴으로써 항암 백신으로서 성능을 보이는 것이다. 이때 상기 항원제시세포는 외부환경으로부터 유입된 단백질 항원이라 할지라도, MHC class I 항원 제시 경로를 통하여, 세포독성 T 세포를 활성화시킬 수 있는데, 이를 교차항원제시(Antigen Cross Presentation)라 한다. 상기 교차항원제시를 할 수 있는 단백질은 암세포 및 바이러스 감염세포 사멸에 중추적인 역할을 하는 세포독성 T 세포를 활성화시킬 수 있기 때문에, 항암 백신용 조성물로 이용될 수 있는 것이다.
본 발명의 항암 백신용 조성물은 개체에 투여하여 암의 예방 또는 치료에 이용될 수 있다. 상기 "개체"란 질병의 치료를 필요로 하는 대상을 의미하고, 보다 구체적으로는 인간 또는 비-인간인 영장류, 생쥐 (mouse), 쥐 (rat), 개, 고양이, 말 및 소 등의 포유류를 의미한다. 또한 본 발명에서 "약제학적 유효량"은 투여되는 질환 종류 및 중증도, 환자의 체중, 연령, 성별, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료 기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정되며 상기 요소를 모두 고려하여 부작용 없이 최대 효과를 얻을 수 있는 양으로, 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.
하기에서 실시예를 통해 본 발명을 상세히 설명한다.
실시예
1. K-ras(WT)의 제조
먼저 K-ras 아미노산 서열(서열번호 2)을 발현벡터에 삽입하였다. K-ras(WT)는 189개의 아미노산으로 이루어져 있으며 아미노산 서열은 하기 표 1과 같다.
| 이름 | 아미노산 서열(189aa) |
| K-ras(WT) (서열번호 2) |
MTEYKLVVVG10 AGGVGKSALT20 IQLIQNHFVD30 EYDPTIEDSY40 RKQVVIDGET50 CLLDILDTAG60 QEEYSAMRDQ70 YMRTGEGFLC80 VFAINNTKSF90 EDIHHYREQI100 KRVKDSEDVP110 MVLVGNKCDL120 PSRTVDTKQA130 QDLARSYGIP140 FIETSAKTRQ150 RVEDAFYTLV160 REIRQYRLKK170 ISKEEKTPGC180 VKIKKCIIM189 |
상기 K-ras-WT를 제한효소로 처리한 후 pET30a 벡터에 넣어 발현벡터를 제조 하였으며 상기 발현벡터는 E.coli에 형질전환하여 단백질을 발현시켰다.
2. K-ras(M)-MEP의 제조
K-ras Mutant Multi-Epitope Polypeptide(K-ras(M)-MEP)의 항원을 디자인하고 K-ras(WT)와 동일한 방법으로 발현벡터를 제조하였다. 상기 K-ras(M)-MEP는 K-ras 아미노산 12번째 위치의 G(Glycine)가 D(Asapartic acid)로 변이한 G12D, K-ras 아미노산 12번째 위치의 G(Glycine)가 V(Valine)로 변이한 G12V, 또는 K-ras 아미노산 13번째 위치의 G(Glycine)가 D(Asapartic acid)로 변이한 G13D를 포함한다.
상기 K-ras(M)-MEP은 500개의 아미노산 서열을 가지는 것을 특징으로 하며 아미노산이 순차적으로 30개씩 구분되되 하나의 에피토프(epitope)는 15개의 아미노산 서열이 서로 중복되도록 디자인되었다. 표 2는 K-ras(M)-MEP의 아미노산 서열(서열번호 1) 및 K-ras(M)-MEP 에피토프의 아미노산 서열을 보여준다.
도 1은 본 발명의 K-ras(M)-MEP의 에피토프 구조를 보여준다.
| 이름 | 아미노산 서열(500aa) |
| K-ras(M)-MEP (서열번호 1) |
MTEYKLVVVG10 ADGVGKSALT20 IQLIQNHFVD30 LRMK34 MTEYKLVVVG44 AVGVGKSALT54 IQLIQNHFVD64 LRMK68 KSALTIQLIQ78 NHFVDEYDPT88 IEDSYRKQVV98 LRMK102 EYDPTIEDSY112 RKQVVIDGET122 CLLDILDTAG132 LRMK136 IDGETCLLDI146 LDTAGQEEYS156 AMRDQYMRTG166 LRMK170 QEEYSAMRDQ180 YMRTGEGFLC190 VFAINNTKSF200 LRMK204 EGFLCVFAIN214 NTKSFEDIHH224 YREQIKRVKD234 LRMK238 EDIHHYREQI248 KRVKDSEDVP258 MVLVGNKCDL268 LRMK272 SEDVPMVLVG282 NKCDLPSRTV292 DTKQAQDLAR302 LRMK306 PSRTVDTKQA316 QDLARSYGIP326 FIETSAKTRQ336 LRMK340 SYGIPFIETS350 AKTRQRVEDA360 FYTLVREIRQ370 LRMK374 RVEDAFYTLV384 REIRQYRLKK394 ISKEEKTPGC404 LRMK408 YRLKKISKEE418 KTPGCVKIKK428 CIIM432 LRMK436 MTEYKLVVVG446 AGDVGKSALT456 IQLIQNHFVD466 LRMK470 MTEYKLVVVG480 AGGVGKSALT490 IQLIQNHFVD500 |
| 에피토프 이름 | 아미노산 서열 (서열번호는 K-rasWT을 기준으로 부여하였음) |
| 에피토프1(E1, n=1) | MTEYKLVVVG10 AGGVGKSALT20 IQLIQNHFVD30 |
| 에피토프2(E2, n=2) | KSALT20 IQLIQNHFVD30 EYDPTIEDSY40 RKQVV45 |
| 에피토프3(E3, n=3) | EYDPTIEDSY40 RKQVVIDGET50 CLLDILDTAG60 |
| 에피토프4(E4, n=4) | IDGET50 CLLDILDTAG60 QEEYSAMRDQ70 YMRTG75 |
| 에피토프5(E5, n=5) | QEEYSAMRDQ70 YMRTGEGFLC80 VFAINNTKSF90 |
| 에피토프6(E6, n=6) | EGFLC80 VFAINNTKSF90 EDIHHYREQI100 KRVKD105 |
| 에피토프7(E7, n=7) | EDIHHYREQI100 KRVKDSEDVP110 MVLVGNKCDL120 |
| 에피토프8(E8, n=8) | SEDVP110 MVLVGNKCDL120 PSRTVDTKQA130 QDLAR135 |
| 에피토프9(E9, n=8) | PSRTVDTKQA130 QDLARSYGIP140 FIETSAKTRQ150 |
| 에피토프10(E10, n=10) | SYGIP140 FIETSAKTRQ150 RVEDAFYTLV160 REIRQ165 |
| 에피토프11(E11, n=11) | RVEDAFYTLV160 REIRQYRLKK170 ISKEEKTPGC180 |
| 에피토프12(E12, n=12) | YRLKK170 ISKEEKTPGC180 VKIKKCIIM189 |
| 에피토프1-G12D(E1-G12D) | MTEYKLVVVG10 ADGVGKSALT20 IQLIQNHFVD30 |
| 에피토프1-G12V(E1-G12V) | MTEYKLVVVG10 AVGVGKSALT20 IQLIQNHFVD30 |
| 에피토프1-G13D(E1-G13D) | MTEYKLVVVG10 AGDVGKSALT20 IQLIQNHFVD30 |
상기 K-ras(M)-MEP는 합성한 후(Genescript Co. Ltd.) pET30a 벡터에 클로닝(cloning)하였으며 E.coli에 형질전환하여 발현시켰다. 발현된 단백질은 APC(Activated protein C)를 이용하여 절단하는 방법으로 K-ras(M)-MEP로 제조하였다.
3. 정상인 PBMC를 이용한 K-ras(M)-MEP 면역원성 분석
정상인으로부터 유래한 말초 혈액 단핵세포 (peripheral blood mononuclear cell, PBMC)에서 K-ras(M)-MEP에 의한 면역원성(Immunogenicity)을 분석하였다. 상기 분석은 고착화 효소 항체법(enzyme-linked immune absorbent spot assay, ELISpot assay)을 이용하였다.
도 2는 본 발명의 K-ras(M)-MEP에 대한 정상인 유래 PBMC의 면역원성을 ELISpot(IFN-γ) assay의 SFC(Spot Forming Cell) 그래프로 분석한 결과를 보여준다. 패널의 흰색 막대(a)는 항원처리한지 않은 샘플의 결과이며 붉은색 막대(b)는 K-ras(M)-MEP 5.0㎍/㎖을 처리한 샘플의 결과이다.
정상인 자원자의 혈액으로부터 백혈구 분반술로 수득한 PBMC(LP-1 PBMC, LP-4 PBMC, 및 LP-6 PBMC) 1x105cell을 파종(seeding)하여 세포배양한 후 항원을 처리하였다. 상기 항원으로 K-ras(M)-MEP 5㎍/㎖, 1.0㎍/㎖, 0.1㎍/㎖을 사용하였으며 양성대조군(positive control)로서 anti-CD3을 사용하였다. 세포배양은 37℃, CO2 5%, overnight(O/N)의 조건으로 수행하였으며 배양한 세포는 IFN-γ로 염색하여 SFC(Spot Forming Cell)를 읽어 분석하였다. 실험결과 K-ras(M)-MEP에 의해 PBMC의 면역반응이 증가한 것으로 확인되었으며 정상인 PBMC중 LP-1에서 K-ras(M)-MEP에 대한 반응성이 가장 우수한 것으로 확인되었다.
4. 정상인 PBMC를 이용한 K-ras(M)-MEP 농도별 특이적 CD3+ T 세포 비율 분석
상기 LP-1 PBMC에 대하여 K-ras(M)-MEP 농도에 따른 K-ras(M)-MEP 특이적 CD3+ T세포 비율을 분석하였다. 이를 위하여 LP-1 PBMC에 항원을 처리한 후 IFN-γ capture staining을 수행하고 이를 분석하였다.
도 3은 본 발명의 K-ras(M)-MEP 농도에 따른 LP-1 PBMC의 K-ras(M)-MEP 특이적 CD3+ T 세포 비율을 분석한 결과를 보여준다. 패널 A는 ELISpot(IFN-γ) assay의 조건별 SFC 그래프를 보여준다. 막대그래프 a는 항원을 처리하지 않은 것이며; 막대그래프 b는 TTX 1.0㎍/㎖을 처리한 것이며; 막대그래프 c는 TTX 5.0㎍/㎖을 처리한 것이며; 막대그래프 d는 K-ras(M)-MEP 0.1㎍/㎖을 처리한 것이며; 막대그래프 e는 K-ras(M)-MEP 1.0㎍/㎖을 처리한 것이며; 막대그래프 f는 K-ras(M)-MEP 5.0㎍/㎖을 처리한 것이다. 패널 B는 IFN-γ 분비 CD3+ T 세포 비율(%) 그래프를 보여준다. 막대그래프 a는 항원을 처리하지 않은 것이며; 막대그래프 b는 K-ras(M)-MEP 0.1㎍/㎖을 처리한 것이며; 막대그래프 c는 K-ras(M)-MEP 1.0㎍/㎖을 처리한 것이며; 막대그래프 d는 K-ras(M)-MEP 5.0㎍/㎖을 처리한 것이다.
LP-1 PBMC 1x106cell을 파종(seeding)하여 세포배양한 후 농도를 달리하여 항원(K-ras(M)-MEP 5㎍/㎖, K-ras(M)-MEP 1.0㎍/㎖, K-ras(M)-MEP 0.1㎍/㎖)을 처리하였다. 파상풍 백신(Tetanus toxoid vaccine, TTX)을 5㎍/㎖, 1.0㎍/㎖으로 처리한 LP-1 PBMC과 anti-CD3를 양성대조군(positive control)으로 사용하였다. 세포배양은 37℃, CO2 5%, overnight(O/N)의 조건으로 수행하였다. IFN-γ capture staining은 항원이 처리된 LP-1 PBMC에 1차 포획 항체(1st capture antibody)를 처리한 후 37℃에서 45분간 배양하고 2차 검출 항체(2nd detection antibody)와 CD3, CD4, CD8, 및 CD137을 처리하는 방법으로 수행하였다. 상기 IFN-γ capture staining이 수행된 LP-1 PBMC는 세포자동해석분리장치(Fluorescence activated cell sorter, FACS)를 이용하여 세포특성을 분석하였다.
실험결과 LP-1 PBMC에 농도에 따라 항원을 처리하게 되면 K-ras(M)-MEP 특이적 CD2+ T 세포 비율이 증가하는 것이 확인되었으며 이는 상기 ELISpot(IFN-γ) 결과와 잘 일치하였다. 따라서 LP-1 PBMC의 반응성(면역원성)은 K-ras(M)-MEP에 농도 의존적으로 증가하는 것으로 판단된다. 또한 LP-1 PBMC에 K-ras(M)-MEP에 대한 반응성을 정량적으로 평가한 결과 K-ras(M)-MEP 5㎍/㎖을 처리하는 경우 K-ras(M)-MEP 특이 CD3+ T 세포의 비율이 2.4% 수준인 것으로 확인되었다.
5. 암환자 PBMC를 이용한 K-ras(M)-MEP 면역원성 분석
암환자로부터 유래한 말초 혈액 단핵세포 (peripheral blood mononuclear cell, PBMC)에서 K-ras(M)-MEP에 의한 면역원성(Immunogenicity)을 분석하였다. 상기 분석은 고착화 효소 항체법(enzyme-linked immune absorbent spot assay, ELISpot assay)을 이용하였다.
도 4는 본 발명의 K-ras(M)-MEP 농도에 따른 암환자 PBMC의 면역원성을 ELISpot(IFN-γ) assay의 SFC(Spot Forming Cell) 그래프로 분석한 결과를 보여준다. 패널 A는 SFC 그래프(No Ag와 K-ras(M)-MEP(KRAS(m)-MEP)(**)의 p value=0.0010; Pep-WT 와 Pep G12D(ns)의 p value=0.0736)를 보여주며, 패널 B는 활성 그래프(No Ag와 K-ras(M)-MEP(KRAS(m)-MEP)(**)의 p value=0.0217; Pep-WT와 Pep G12D(ns)의 p value=0.1236)를 보여준다. No Ag은 항원을 처리하지 않은 것을 의미하며; KRAS(m)-MEP, Pep. WT, Pep. G12D, Pep. G12V, Pep. G13D는 1.0㎍/㎖을 처리하였다. Pep. WT는 K-ras1-24Wild-type을 의미하며; Pep. G12D는 K-ras1-24 G12D를 의미하며; Pep. G12V는 K-ras1-24 G12V를 의미하며; Pep. G13D는 K-ras1-24 G13D를 의미한다.
표 3은 본 발명의 K-ras(M)-MEP 농도에 따른 암환자 PBMC의 면역원성을 ELISpot(IFN-γ) assay결과를 보여준다.
| 항원 | 암환자 ID | 처리양 | Spots | Activity |
| 음성대조군(No Ag) | A | 0.0 ㎍/㎖ | 14개 | 189 |
| 음성대조군(No Ag) | B | 0.0 ㎍/㎖ | 13개 | 228 |
| 양성대조군(OKT3) | A | 1.0 ㎍/㎖ | 565개 | 9071 |
| 양성대조군(OKT3) | B | 1.0 ㎍/㎖ | 616개 | 9706 |
| K-ras(M)-MEP | C | 1.0 ㎍/㎖ | 35개 | 660 |
| K-ras(M)-MEP | D | 1.0 ㎍/㎖ | 36개 | 548 |
| Pep. G12D | C | 1.0 ㎍/㎖ | 15개 | 184 |
| Pep. G12D | D | 1.0 ㎍/㎖ | 21개 | 286 |
| Pep. G12V | E | 1.0 ㎍/㎖ | 10개 | 157 |
| Pep. G12V | F | 1.0 ㎍/㎖ | 9개 | 172 |
| Pep. G13D | E | 1.0 ㎍/㎖ | 10개 | 83 |
| Pep. G13D | F | 1.0 ㎍/㎖ | 10개 | 196 |
| Pep. W | G | 1.0 ㎍/㎖ | 6개 | 75 |
| Pep. W | H | 1.0 ㎍/㎖ | 8개 | 114 |
실험결과 K-ras(M)-MEP에 의해 암환자 PBMC의 면역원성이 증가한 것으로 확인되었으며 다른 돌연변이 합성 펩타이드(Pep.G12D, Pep.G12V, Pep.G13D)보다 높은 면역원성 활성을 가지는 것으로 확인되었다.
6. 항원의 종류에 따른 항원 특이적 CD3+ T 세포 비율 비교 분석
LP-1 PBMC에 K-ras(M)-MEP(500aa), K-ras1-24Wild-type(Pep.WT, 24aa), 또는 K-ras1-24돌연변이(24aa)를 처리 한 후 항원 특이적 CD3+ T 세포 비율을 비교 분석하였다.
도 5는 본 발명의 K-ras(M)-MEP, K-ras1-24Wild-type, 및 K-ras1-24돌연변이에 대한 LP-1 PBMC의 항원 특이적 CD3+ T-세포 비율을 분석한 결과를 보여준다.
K-ras(M)-MEP, K-ras1-24Wild-type, 및 K-ras1-24돌연변이가 처리된 LP-1 PBMC의 IFN-γ capture FACS를 분석하고 이를 IFN-γ 분비 CD3+ T 세포 비율(%) 그래프로 나타내었다.
표 4는 본 발명의 항원 특이 CD3+ T 세포 비율(%) 그래프를 No Ag의 값으로 일반화하여 정리한 결과이다.
| No Ag | KRAS(m)-MEP | Pep. WT | Pep. G12D | Pep, G12V | Pep. G13D | |
| LP-1 PBMC | 1 | 2.41 | -0.19 | 0.31 | 0.11 | 0.25 |
상기 K-ras1-24돌연변이는 K-ras1-24Wild-type에서 12번째 아미노산인 G가 D, 또는 V로 치환되거나 13번째 아미노산인 G가 D로 치환 된 것(Pep.G12D, Pep.G12V, Pep.G13D)을 의미한다. 항원 특이적 CD3+ T-세포 비율은 상기와 동일한 방법으로 분석하였으며 항원으로 K-ras(M)-MEP(500aa), Pep.Wt, Pep.G12D, Pep.G12V, 및 Pep.G13D를 사용하였다.
표 4의 결과에 따르면 Peptide Wt에 반응한 CD+ T세포는 확인되지 않았으며 Pep.G12D, Pep.G12V, 및 Pep.G13D에 반응한 CD3+ T 세포 역시 0.31(Pep.G12D), 0.11(Pep.G12V) 및 0.25(Pep.G13D)로 현저히 낮은 것을 확인되었다. 상기 결과는 K-ras(M)-MEP에 반응하여 유도된 CD3+ T 세포의 값이 2.41임을 감안할 때 24개의 아미노산으로 구성된 펩타이드인 에피토프만으로는 항원 특이 CD3+ T 세포의 유도가 미미하다는 것을 의미한다.
7. K-ras(M)-MEP 및 Fast-IVS를 이용한 MEP-T 세포의 제조
상기 실험결과를 바탕으로 K-ras(M)-MEP에 반응하는 CD3+ T 세포(MEP-T 세포)를 제조하였다. 본 발명에서는 Fast-IVS(Fast-In vitro Stimulation)을 적용하여 MEP-T 세포를 제조하였다. 상기 Fast-IVS 공정은 항원을 이용하여 항원 특이적 CD3+ T 세포를 유도하는 것과 싸이토카인을 처리하여 세포 증폭(Cell Expansion)을 수행하는 공정을 동시에 수행하는 것을 특징으로 한다. 이에 반하여 상기 No-Cytokine 공정은 항원에 의해 유도된 항원 특이적 CD3+ T 세포에 대하여 싸이토카인을 처리하지 않고 세포 증폭을 수행하는 것을 특징으로 한다. 상기 Fast-IVS 공정의 세포 증폭에 사용한 싸이토카인(cytokine)은 인터루킨-4(Interleukin-4, IL-4), 과립구 대식세포 콜로니 자극 인자(Granulocyte-Macrophage Colony-Stimulating Factor, GM-CSF), 종양괴사인자-α(Tumor Necrosis Factor-α, TNF-α), 인터루킨-1b(Interleukin-1β, IL-1β) 및 프로스타글란딘 E2(Prostaglandin E2, PGE2)이다.
하기 표 5는 본 발명의 Fast-IVS 공정과 No-Cytokine 공정을 보여준다.
| Fast-IVS 공정 | No-Cytokine 공정 | |
| Day-0 | LP-1 PBMC Seeding with Ag, IL-4, and GM-CSF | LP-1 PBMC Seeding Without Cytokine |
| Day-1 | Adding TNF-α, IL-1β and PGE2 | No Cytokine Adding |
| Day 3 | Expansion | Expansion |
| Day 5, 7, 9, 11, 12 | Media Adding | Media Adding |
| Day 13 | Harvest | Harvest |
| T cell only | DC_NoAg + T cell | DC_WT + T cell |
DC_G12D + T cell | DC_K-ras(M)-MEP + T cell |
|
| CIK | 0.72% | 11.35% | 10.19% | 12.63% | 12.8% |
| MEP-T | 1.8% | 35.42% | 41.15% | 47.47% | 50.74% |
| Endogenous antigen + T | WT specific T | G12D specific T | K-ras(M)-MEP specific T | |
| CIK | 10.63% | - | 1.28% | 1.45% |
| MEP-T | 33.62% | 5.73% | 12.05% | 15.32% |
| Fold change(CIK/MEP-T) | 3.16 | - | 9.41 | 10.56 |
암세포주에 대한 사멸능을 평가하였다. 암세포주는 폐암환자로부터 유래하였으며 K-ras G12D 돌연변이를 가지며 HLA type이 일치하는 T3M10 세포주와 유방암 환자로부터 유래하였으며 K-ras G13F 돌연변이를 가지며 HLA type이 일치하는 MCF-7 세포주를 사용하였다. 이를 위하여 본 발명의 K-ras(M)-MEP 및 Fast-IVS를 이용하여 제조한 MEP-T 세포와 상기 T3M10 세포주 또는 상기 MCF-7 세포주를 공배양하여 암세포의 사멸능을 분석하였다. 사멸능은 red fluorescent protein (RFP) 발현하도록 형질 전환된 타겟 세포의 Red 이미지 값을 실시간으로 측정하는 Incucyte (사토리우스사) 장비를 활용하여 공배양 후 2시간마다 살아 있는 타겟 세포를 정량하였다.
도 6은 본 발명의 본 발명의 MEP-T 세포와 T3M10 세포주 또는 MCF-7 세포주를 공배양하여 암세포의 사멸능을 분석한 결과를 보여준다. 패널 A는 본 발명의 MEP-T 세포와 T3M10 세포주를 공배양하여 암세포가 사멸한 정도를 보여주며 패널 B는 본 발명의 MEP-T 세포와 MCF-7 세포주를 공배양하여 암세포가 사멸한 정도를 보여준다. (△)은 MEP-T 세포와 T3M10 세포주 또는 MCF-7 세포주를 공배양한 결과를 보여주며, (□)는 CIK와 T3M10 세포주 또는 MCF-7 세포주를 공배양한 결과를 보여주며, (·은 T3M10 세포주 또는 MCF-7 세포주만을 배양한 결과를 보여준다.
분석결과 상기 T3M10 세포주에 대한 사멸능은 CIK에 대비하여 본 발명의 MEP-T 세포가 보다 우수한 사멸능을 보이는 것으로 판단되며 상기 MCF-7 세포주에 대한 사멸능 또한 CIK에 대비하여 본 발명의 MEP-T 세포가 보다 우수한 사멸능을 보이는 것으로 확인되었다.
암백신은 암항원에 대한 면역반응을 활성화해야 하며, 특히 암항원에 특이적인 T세포를 유도하여 암세포를 사멸하는 것이 중요 작용기전이다. 생체내에서는 APC (antigen presenting cell)에 의해 암백신이 processing 되어 항원결정기를 제시하고 이에 특이적인 T세포가 유도되어 면역반응 및 암세포 사멸이 유도된다.
본 발명의 K-ras(M)-MEP 항원은 K-ras의 G12D 돌연변이, K-ras의 G13D 돌연변이, K-ras의 G12V 돌연변이의 항원 결정기(Epitope)를 포함하고 있다. 이에 본 발명에서는 본 발명의 K-ras(M)-MEP 항원이 암백신 및 암치료제용 항원으로 사용할 수 있다는 것을 실험적으로 증명하기 위해 실험을 수행하였다.
암환자의 PBMC에 K-ras(M)-MEP, K-ras, Pep.G12D, Pep.G12V, 또는 Pep.G13D를 처리하고 IFN-γ(IFNg) 활성을 측정한 결과, K-ras, Pep.G12D, Pep.G12V, 또는 Pep.G13D보다 우수한 면역원성을 보이는 것으로 확인되었다.
항원을 처리하지 않고 유도한 T 세포, 싸이토카인(CIK)을 처리하여 유도한 T 세포, 및 본 발명의 K-ras(M)-MEP을 처리하여 유도한 T 세포의 항원 특이성을 분석한 결과 본 발명의 K-ras(M)-MEP을 처리하여 배양한 T 세포가 싸이토카인을 처리하여 배양한 T 세포보다 K-ras G12D 돌연변이에 대한 특이도가 높은 것으로 확인되었다.
상기 본 발명의 K-ras(M)-MEP을 처리하여 유도한 T 세포와 싸이토카인(CIK)을 처리하여 유도한 T 세포를 K-ras G12D 돌연변이를 가진 폐암 유래 세포주(T3M10) 또는 K-ras G13D 돌연변이를 가진 유방암 유래 세포주(MCF-7)에 처리한 결과 본 발명의 K-ras(M)-MEP을 처리하여 유도한 T 세포가 모든 세포주에서 싸이토카인(CIK)을 처리하여 유도한 T 세포 보다 우수한 암세포 사멸능을 보이는 것으로 확인되었다. 특히, 본 발명의 K-ras(M)-MEP을 처리하여 유도한 T 세포는 K-ras G13D 돌연변이를 가진 유방암 유래 세포주(MCF-7)보다 K-ras G12D 돌연변이를 가진 폐암 유래 세포주(T3M10)에 대한 암세포 사멸능이 보다 우수한 것으로 확인되었다.
따라서 본 발명의 K-ras(M)-MEP은 K-ras 돌연연변이 암항원에 대한 특이적인 면역반응을 활성화시켜 이를 가지고 있는 암을 예방하거나 치료할 수 있는 암백신용 조성물로서 사용 가능한 것으로 판단된다. 바람직하게는 본 발명의 K-ras(M)-MEP은 K-ras G12D 또는 G13D 돌연연변이 암항원에 대한 특이적인 면역반응을 활성화시켜 이를 가지고 있는 암을 예방하거나 치료할 수 있는 암백신용 조성물로서 사용 가능한 것으로 판단되며 보다 바람직하게는 본 발명의 K-ras(M)-MEP은 K-ras G12D 돌연변이를 가지는 폐암 또는 K-ras G13D 돌연연변이를 가지는 유방암에 대한 특이적인 면역반응을 활성화시켜 상기 암을 예방하거나 치료할 수 있는 K-ras G12D 돌연변이를 가지는 폐암용 암백신 조성물 또는 K-ras G13D 돌연연변이를 가지는 유방암 암백신 조성물로서 사용 가능한 것으로 판단된다.
본 명세서에서 설명된 구체적인 실시예는 본 발명의 바람직한 구현예 또는 예시를 대표하는 의미이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 한정되지는 않는다. 본 발명의 변형과 다른 용도가 본 명세서 특허청구범위에 기재된 발명의 범위로부터 벗어나지 않는다는 것은 당업자에게 명백하다.
본 발명의 항암 백신용 조성물을 이용하면 K-ras 단백질의 돌연변이를 발현하는 암세포에 대한 면역감시기능을 강화시키므로 면역반응작용을 통해 암세포를 초기에
발견하여 사멸시키며 이미 발생한 암세포에 대하서도 특이적으로 사멸시키므로 암을 예방하고 치료할 수 있는 장점이 있다.
1. 서열번호 1
MTEYKLVVVG ADGVGKSALT IQLIQNHFVD LRMKMTEYKL VVVGAVGVGK SALTIQLIQN
HFVDLRMKKS ALTIQLIQNH FVDEYDPTIE DSYRKQVVLR MKEYDPTIED SYRKQVVIDG
ETCLLDILDT AGLRMKIDGE TCLLDILDTA GQEEYSAMRD QYMRTGLRMK QEEYSAMRDQ
YMRTGEGFLC VFAINNTKSF LRMKEGFLCV FAINNTKSFE DIHHYREQIK RVKDLRMKED
IHHYREQIKR VKDSEDVPMV LVGNKCDLLR MKSEDVPMVL VGNKCDLPSR TVDTKQAQDL
ARLRMKPSRT VDTKQAQDLA RSYGIPFIET SAKTRQLRMK SYGIPFIETS AKTRQRVEDA
FYTLVREIRQ LRMKRVEDAF YTLVREIRQY RLKKISKEEK TPGCLRMKYR LKKISKEEKT
PGCVKIKKCI IMLRMKMTEY KLVVVGAGDV GKSALTIQLI QNHFVDLRMK MTEYKLVVVG
AGGVGKSALT IQLIQNHFVD
2. 서열번호 2
MTEYKLVVVG AGGVGKSALT IQLIQNHFVD EYDPTIEDSY RKQVVIDGET CLLDILDTAG
QEEYSAMRDQ YMRTGEGFLC VFAINNTKSF EDIHHYREQI KRVKDSEDVP MVLVGNKCDL
PSRTVDTKQA QDLARSYGIP FIETSAKTRQ RVEDAFYTLV REIRQYRLKK ISKEEKTPGC
VKIKKCIIM
Claims (4)
- 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 K-ras 돌연변이 다중 항원결정기 폴리펩타이드를 유효성분으로 포함하는 항암 백신용 조성물.
- 제 1 항에 있어서, 상기 항암 백신용 조성물은 서열번호 2의 아미노산 서열을 가지는 K-ras 단백질의 G12D 돌연변이 항원결정기; 서열번호 2의 아미노산 서열을 가지는 K-ras 단백질의 G13D 돌연변이 항원결정기; 및 서열번호 2의 아미노산 서열을 가지는 K-ras 단백질의 G12V 돌연변이 항원결정기;로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나의 또는 둘 이상의 항원결정기를 가져 암에 대한 면역원성이 향상된 T 세포를 유도하는 것을 특징으로 하는 항암 백신용 조성물.
- 제 1 항에 있어서, 상기 항암 백신용 조성물은 항원제시세포(Antigen Presenting Cell)와 T 세포를 포함하는 말초 혈액 단핵세포 (peripheral blood mononuclear cell, PBMC)와 배양하면 서열번호 2를 가지는 K-ras 단백질의 G12D 돌연변이, 서열번호 2를 가지는 K-ras 단백질의 G13D 돌연변이 및 서열번호 2를 가지는 K-ras 단백질의 G12V 돌연변이로 구성된 단백질군으로부터 선택된 어느 하나 또는 둘 이상의 단백질을 발현하는 암세포에 대한 특이적 사멸능을 가지는 T 세포가 유도되는 것을 특징으로 하는 항암 백신용 조성물.
- 제 3 항에 있어서, 상기 암세포는 서열번호 2를 가지는 K-ras 단백질의 G12D 돌연변이를 발현하는 폐암세포 또는 서열번호 2를 가지는 K-ras 단백질의 G13D 돌연변이를 발현하는 유방암세포인 것을 특징으로 하는 항암 백신용 조성물.
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR10-2023-0001787 | 2023-01-05 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| WO2024147556A1 true WO2024147556A1 (ko) | 2024-07-11 |
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