WO2024147331A1 - タンパク質発現増強用核酸 - Google Patents

タンパク質発現増強用核酸 Download PDF

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    • C12P21/02—Preparation of peptides or proteins having a known sequence of two or more amino acids, e.g. glutathione

Definitions

  • the present invention relates to nucleic acids, vectors, compositions, and cells for enhancing protein expression, and uses thereof, as well as methods for producing proteins and methods for enhancing protein expression.
  • adeno-associated virus (AAV) vector-producing cells that contain and express any one of the miRNAs hsa-miR-324, hsa-miR-196a1, and hsa-miR-342 and further contain a nucleic acid that expresses an element essential for the formation of virus particles of an adeno-associated virus (AAV) vector increase the productivity of the adeno-associated virus (AAV) vector, but there is no known method for increasing the productivity of vectors other than the adeno-associated virus (AAV) vector (see Patent Document 1).
  • AAV adeno-associated virus
  • a nucleic acid for enhancing protein expression comprising an RNA having the base sequence set forth in SEQ ID NO:1 or a DNA corresponding to the RNA.
  • a vector comprising the nucleic acid for enhancing protein expression according to ⁇ 1>.
  • a composition comprising the nucleic acid for enhancing protein expression according to ⁇ 1>.
  • ⁇ 4> A cell into which the nucleic acid for enhancing protein expression according to ⁇ 1> has been introduced.
  • a method for producing a protein comprising the step of culturing a cell into which a nucleic acid for enhancing protein expression, which comprises RNA having a base sequence set forth in SEQ ID NO:1 or DNA corresponding to the RNA, has been introduced.
  • a method for enhancing protein expression comprising the step of introducing into a cell a nucleic acid for enhancing protein expression, the nucleic acid comprising RNA having the base sequence set forth in SEQ ID NO:1 or DNA corresponding to the RNA.
  • FIG. 1 shows the results of evaluating AAV productivity of miRNA1185, miRNA3148, miRNA4657, and miRNA6823.
  • FIG. 2 shows the evaluation results of the pRC2-miRNA1185 expression plasmid using 293F cells.
  • FIG. 3 shows the evaluation results of the pRC2-miRNA1185 expression plasmid using VPCs2.0 cells.
  • FIG. 4 shows the evaluation results of the pRC2-miRNA1185 expression plasmid using HEK293T cells.
  • the RNA is a ribonucleic acid and can contain the bases adenine (A), guanine (G), cytosine (C), and uracil (U).
  • the DNA is a deoxyribonucleic acid and can contain the bases adenine (A), guanine (G), cytosine (C), and thymine (T).
  • the DNA corresponding to the RNA means a DNA having a base sequence in which uracil (U) in the base sequence of the RNA is replaced with thymine (T).
  • RNA consisting of the base sequence set forth in SEQ ID NO:1 the RNA consisting of the base sequence set forth in SEQ ID NO:1 and the DNA corresponding to the RNA consisting of the base sequence set forth in SEQ ID NO:1 (i.e., the DNA consisting of the base sequence set forth in SEQ ID NO:21) are as follows: [RNA consisting of the base sequence set forth in SEQ ID NO: 1] auauacagggggagacucuuau (SEQ ID NO: 1) [DNA corresponding to RNA consisting of the base sequence set forth in SEQ ID NO: 1] atatacagggggagactcttat (SEQ ID NO: 21)
  • the protein also referred to as a desired protein or target protein, is a protein whose expression is enhanced in a host (cell).
  • the expression of the protein can be enhanced by introducing the protein expression enhancing nucleic acid into the host (cell).
  • the expression enhancement of the protein is not particularly limited and can be appropriately selected depending on the purpose, but when the nucleic acid for enhancing protein expression is introduced into the host (cell), the expression level of the protein in the host (cell) is preferably increased by 1.1-fold or more, more preferably by 1.2-fold or more, even more preferably by 1.5-fold or more, and particularly preferably by 2-fold or more, compared to when the nucleic acid for enhancing protein expression is not introduced into the host (cell).
  • the method for confirming the expression level of the protein is not particularly limited and may be appropriately selected from known methods depending on the type of the protein, and examples of such methods include Western blotting and ELISA.
  • the protein is an enzyme
  • the enzyme activity when the nucleic acid for enhancing protein expression is introduced into the host (cell) and when the nucleic acid for enhancing protein expression is not introduced into the host (cell) may be compared by a known method using a substrate according to the type of enzyme, and the expression level of the protein may be determined to have increased if the enzyme activity is higher when the nucleic acid for enhancing protein expression is introduced into the host (cell).
  • the titer of the virus or the titer of the virus vector when the nucleic acid for enhancing protein expression is introduced into the host (cell) and when the nucleic acid for enhancing protein expression is not introduced into the host (cell) may be measured and compared by a known virus titer measurement method such as quantitative PCR, and the expression level of the protein may be determined to have increased if the titer of the virus or the titer of the virus vector when the nucleic acid for enhancing protein expression is introduced into the host (cell) is higher.
  • the protein is not particularly limited and can be appropriately selected depending on the purpose.
  • the protein may be a virus such as adeno-associated virus (AAV), adenovirus, parvovirus, coronavirus, retrovirus, lentivirus, herpes virus, poliovirus, papilloma virus, vaccinia virus, or poxvirus; a whole antibody, a single-chain antibody, a heavy-chain antibody, a multivalent antibody, Fab, F(ab'), F(ab') 2 , Fc, an Fc fusion protein, a bispecific antibody, a heavy chain (H chain), a light chain (L chain), a single-chain Fv (scFv), or sc(Fv) 2 .
  • AAV adeno-associated virus
  • adenovirus parvovirus
  • coronavirus retrovirus
  • lentivirus lentivirus
  • herpes virus poliovirus
  • papilloma virus vaccinia virus
  • Antibodies such as disulfide-linked Fv (sdFv), diabodies, and antibody-like molecular targeting peptides (microantibodies); enzymes such as phytase, amylase, glucosidase, cellulase, lipase, protease, glutaminase, peptidase, nuclease, oxidase, lactase, xylanase, trypsin, pectinase, isomerase, tissue plasminogen activator (TPA), and urokinase; antibody-binding proteins such as protein A, protein G, and protein L; and human serum albumin.
  • sdFv disulfide-linked Fv
  • microantibodies enzymes such as phytase, amylase, glucosidase, cellulase, lipase, protease, glutaminase, peptidase, nucle
  • proteins include serum albumin; epidermal growth factors such as human epidermal growth factor; hormones such as insulin, growth hormone, leptin, etc.; cytokines or growth factors such as erythropoietin, interferon, granulocyte colony-stimulating factor (G-CSF), granulocyte-macrophage colony-stimulating factor (GM-CSF), thrombopoietin, IL-1, IL-6, stem cell growth factor (SCF), etc.; blood coagulation and fibrinolysis system factors such as blood coagulation factor VIII; fibroin; fluorescent proteins; hepatitis B virus surface antigen; hirudin, etc.
  • the protein is preferably a virus or an antibody, more preferably a virus, and even more preferably an adeno-associated virus (AAV).
  • the virus may be a viral vector.
  • Adeno-associated virus is a virus belonging to the Parvoviridae family, which contains linear single-stranded DNA in capsid.
  • the serotype of the adeno-associated virus is not particularly limited and can be appropriately selected according to purpose, and can include, for example, AAV type 1 (AAV1), AAV type 2 (AAV2), AAV type 3 (AAV3), AAV type 4 (AAV4), AAV type 5 (AAV5), AAV type 6 (AAV6), AAV type 7 (AAV7), AAV type 8 (AAV8), AAV type 9 (AAV9), and AAV type 10 (AAV10).
  • the virus may be a part of a polypeptide constituting the virus.
  • the polypeptides constituting the adeno-associated virus include VP1 derived from adeno-associated virus, VP2 derived from adeno-associated virus, VP3 derived from adeno-associated virus, Rep derived from adeno-associated virus, Cap derived from adeno-associated virus, AAP derived from adeno-associated virus, and MAAP derived from adeno-associated virus.
  • the host (cell) is not particularly limited and can be appropriately selected depending on the purpose. Examples include bacteria such as E. coli, fungi such as yeast, animal cells, insect cells, and plant cells. Bacteria such as E. coli or animal cells are preferred, and animal cells are more preferred.
  • the animal cells are not particularly limited and can be appropriately selected depending on the purpose. Examples include 293F cells, VPCs2.0 cells, HEK293 cells, HEK293T cells, HeLa cells, CHO cells, iPS cells, mesenchymal stem cells, etc.
  • RNA consisting of the base sequence set forth in SEQ ID NO: 1 The RNA consisting of the base sequence of SEQ ID NO: 1 is a miRNA (micro-RNA). The RNA consisting of the base sequence of SEQ ID NO: 1 is hsa-miR-1185-1-3p, as described in Analysis 3 of the Examples below.
  • the DNA corresponding to the RNA consisting of the base sequence set forth in SEQ ID NO:1 is a DNA having a base sequence in which uracil (U) in the base sequence of the RNA consisting of the base sequence set forth in SEQ ID NO:1 is replaced with thymine (T).
  • the DNA corresponding to the RNA consisting of the base sequence set forth in SEQ ID NO:1 is a DNA consisting of the base sequence set forth in SEQ ID NO:21.
  • the DNA consisting of the base sequence set forth in SEQ ID NO:21 can be synthesized, for example, from the RNA consisting of the base sequence set forth in SEQ ID NO:1 by a known complementary DNA (cDNA) synthesis method using reverse transcriptase.
  • RNA having 90% or more sequence identity with RNA consisting of the base sequence set forth in SEQ ID NO: 1 and having a protein expression enhancing effect The RNA having 90% or more sequence identity to the RNA consisting of the base sequence set forth in SEQ ID NO: 1 is not particularly limited and can be appropriately selected depending on the purpose, and is an RNA in which one or more bases in the base sequence set forth in SEQ ID NO: 1 have been substituted, added, and/or deleted within a range that results in 90% or more sequence identity to the RNA consisting of the base sequence set forth in SEQ ID NO: 1. However, from the viewpoint of enhancing protein expression with high efficiency, an RNA having 95% or more sequence identity to the RNA consisting of the base sequence set forth in SEQ ID NO: 1 is preferred.
  • the DNA corresponding to the RNA having 90% or more sequence identity with the RNA consisting of the base sequence set forth in SEQ ID NO:1 and having the effect of enhancing protein expression is a DNA having 90% or more sequence identity with the DNA consisting of the base sequence set forth in SEQ ID NO:21.
  • the DNA having 90% or more sequence identity with the DNA consisting of the base sequence set forth in SEQ ID NO:21 can be synthesized from the RNA having 90% or more sequence identity with the RNA consisting of the base sequence set forth in SEQ ID NO:1 and having the effect of enhancing protein expression by a known complementary DNA (cDNA) synthesis method using reverse transcriptase.
  • RNA having the effect of enhancing protein expression refers to RNA that, when the RNA and the protein are expressed in a host (cell), can increase the expression level of the protein compared to when the RNA is not expressed.
  • the increase in the expression level of the protein is not particularly limited and can be appropriately selected depending on the purpose, but it is preferable that the expression of the protein in the host (cell) is increased by 1.1-fold or more, more preferably by 1.2-fold or more, even more preferably by 1.5-fold or more, and particularly preferably by 2-fold or more, compared to the case where the RNA is not introduced into the host (cell).
  • the increase in the expression level of the protein by the RNA having the protein expression enhancing effect can be confirmed by a method similar to the method described in the description of the enhancement of protein expression.
  • RNA having substitution, addition, and/or deletion of 2 or less bases with respect to the RNA consisting of the base sequence set forth in SEQ ID NO: 1 and having an effect of enhancing protein expression
  • the RNA having a substitution, addition, and/or deletion of up to 2 bases relative to the RNA having the base sequence set forth in SEQ ID NO: 1 is RNA in which up to 2 bases have been substituted, added, and/or deleted relative to the RNA having the base sequence set forth in SEQ ID NO: 1.
  • RNA having a substitution, addition, and/or deletion of up to two bases with respect to the RNA consisting of the base sequence set forth in SEQ ID NO:1 is not particularly limited and can be appropriately selected depending on the purpose, but from the viewpoint of enhancing protein expression with high efficiency, an RNA having a substitution, addition, and/or deletion of one base with respect to the RNA consisting of the base sequence set forth in SEQ ID NO:1 is preferred.
  • substitution, addition, and/or deletion of 2 or less bases in the DNA having a substitution, addition, and/or deletion of 2 or less bases relative to the DNA consisting of the base sequence set forth in SEQ ID NO: 21 is the substitution, addition, and/or deletion of bases corresponding to the substitution, addition, and/or deletion of 2 or less bases in the RNA having a substitution, addition, and/or deletion of 2 or less bases relative to the RNA consisting of the base sequence set forth in SEQ ID NO: 1 and having a protein expression enhancing effect.
  • the DNA having a substitution, addition, and/or deletion of up to 2 bases from the DNA having the base sequence described in SEQ ID NO:21 can be synthesized from the RNA having a substitution, addition, and/or deletion of up to 2 bases from the RNA having the base sequence described in SEQ ID NO:1, which has a protein expression enhancing effect, by a known complementary DNA (cDNA) synthesis method using reverse transcriptase.
  • cDNA complementary DNA
  • the increase in the expression level of the protein is not particularly limited and can be appropriately selected depending on the purpose, but it is preferable that the expression of the protein in the host (cell) is increased by 1.1-fold or more, more preferably by 1.2-fold or more, even more preferably by 1.5-fold or more, and particularly preferably by 2-fold or more, compared to the case where the RNA is not introduced into the host (cell).
  • the vector is not particularly limited and can be selected appropriately depending on the purpose, and examples include the pRC2 vector.
  • the other elements include a nucleic acid encoding the protein (a target protein), a nucleic acid having a promoter sequence, and a nucleic acid having a poly A addition signal sequence.
  • the protein is as described above in the section (Nucleic acid for enhancing protein expression).
  • the protein preferably contains a nucleic acid encoding a virus or an antibody, more preferably contains a nucleic acid encoding a virus, and even more preferably contains a nucleic acid encoding an adeno-associated virus (AAV).
  • AAV adeno-associated virus
  • the method for producing the protein includes a step of culturing a cell into which a nucleic acid for enhancing protein expression, which includes any one of RNAs (i) to (iii) below or DNA corresponding to the RNA, has been introduced, and may further include other steps.
  • Example 2-2 Plasmid introduction (transfection) into VPCs2.0 cells>>>
  • the pRC2-miRNA1185 expression plasmid (1 ⁇ g/ ⁇ L, 5 ⁇ L), pAAV-Venus (1 ⁇ g/ ⁇ L, 1.25 ⁇ L), pHelper (1 ⁇ g/ ⁇ L, 1.25 ⁇ L), and PEI MAX (1 ⁇ g/ ⁇ L, 15 ⁇ L) prepared in Test Example 1-1 were mixed in Opti-MEM and allowed to stand.
  • the plasmid DNA-PEI mixture was added to the VPCs2.0 cell culture medium prepared in Example 2-1 to introduce the plasmid into the cells.
  • Example 3 Evaluation of pRC2-miRNA1185 expression plasmid using HEK293T cells The improvement of AAV productivity by miRNA1185 was verified using adherent cells, HEK293T cells (ATCC).
  • pRC2-mi342 was digested with SnaBI (New England) and SmaI (New England) to prepare the plasmid pRC2, which does not contain a miRNA expression cassette. Transfection and culture were also performed.

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Abstract

配列番号１に記載の塩基配列からなるＲＮＡ又は前記ＲＮＡに対応するＤＮＡを含むタンパク質発現増強用核酸である。

Description

タンパク質発現増強用核酸
　本発明は、タンパク質発現増強用核酸、ベクター、組成物、細胞、及びこれらの使用、並びに、タンパク質の製造方法、及びタンパク質の発現増強方法に関する。
　近年、抗体医薬などのタンパク質医薬や、ウイルスベクターなどを用いた遺伝子治療薬が、多く開発されている。
　上記の医薬品に使用される、抗体や、ウイルスベクターなどのタンパク質は、細胞などに当該タンパク質を発現させることにより製造されるが、これらの生産性が低いことを一因として、上記の医薬品の薬価が極めて高額となっている。
　例えば、ｈｓａ－ｍｉＲ－３２４、ｈｓａ－ｍｉＲ－１９６ａ１、及びｈｓａ－ｍｉＲ－３４２のいずれかのｍｉＲＮＡを含み、かつ、発現しており、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターのウイルス粒子形成に必須な要素を発現する核酸をさらに含む、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター産生細胞は、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターの生産性を増加させることが知られているが、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター以外の生産性を増加させる方法は知られていない（特許文献１参照）。
　したがって、高効率にタンパク質の発現を増強できる、タンパク質発現増強用核酸が求められていた。
特許第６０９３３５８号公報
　本発明は、従来における前記諸問題を解決し、以下の目的を達成することを課題とする。即ち、本発明は、高効率にタンパク質の発現を増強できる、タンパク質発現増強用核酸、前記タンパク質発現増強用核酸を含むベクター及び組成物、前記タンパク質発現増強用核酸が導入された細胞、及びこれらの使用、並びに、前記タンパク質発現増強用核酸を用いたタンパク質の製造方法及びタンパク質の発現増強方法を提供する。
　本発明者らが、前記目的を達成すべく鋭意研究を重ねた結果、配列番号１に記載の塩基配列からなるＲＮＡ又は前記ＲＮＡに対応するＤＮＡを含むタンパク質発現増強用核酸により、高効率にタンパク質の発現を増強できる、タンパク質発現増強用核酸、前記タンパク質発現増強用核酸を含むベクター及び組成物、前記タンパク質発現増強用核酸が導入された細胞、及びこれらの使用、並びに、前記タンパク質発現増強用核酸を用いたタンパク質の製造方法及びタンパク質の発現増強方法が提供できることを知見した。
　本発明は、本発明者らによる前記知見に基づくものであり、前記課題を解決するための手段としては以下のとおりである。即ち、
　＜１＞　配列番号１に記載の塩基配列からなるＲＮＡ又は前記ＲＮＡに対応するＤＮＡを含むことを特徴とするタンパク質発現増強用核酸である。
　＜２＞　前記＜１＞に記載のタンパク質発現増強用核酸を含むベクターである。
　＜３＞　前記＜１＞に記載のタンパク質発現増強用核酸を含む組成物である。
　＜４＞　前記＜１＞に記載のタンパク質発現増強用核酸が導入された細胞である。
　＜５＞　配列番号１に記載の塩基配列からなるＲＮＡ又は前記ＲＮＡに対応するＤＮＡを含むタンパク質発現増強用核酸が導入された細胞を培養する工程を含むことを特徴とするタンパク質の製造方法である。
　＜６＞　配列番号１に記載の塩基配列からなるＲＮＡ又は前記ＲＮＡに対応するＤＮＡを含むタンパク質発現増強用核酸を細胞に導入する工程を含むことを特徴とするタンパク質の発現増強方法である。
　＜７＞　（ａ）配列番号１に記載の塩基配列からなるＲＮＡ又は前記ＲＮＡに対応するＤＮＡを含む核酸、
　（ｂ）配列番号１に記載の塩基配列からなるＲＮＡ又は前記ＲＮＡに対応するＤＮＡを含む核酸を含むベクター、
　（ｃ）配列番号１に記載の塩基配列からなるＲＮＡ又は前記ＲＮＡに対応するＤＮＡを含む核酸を含む組成物、及び
　（ｄ）配列番号１に記載の塩基配列からなるＲＮＡ又は前記ＲＮＡに対応するＤＮＡを含む核酸が導入された細胞、
のいずれかのタンパク質発現増強のための使用である。
　本発明によると、従来における前記諸問題を解決し、前記目的を達成することができ、高効率にタンパク質の発現を増強できる、タンパク質発現増強用核酸、前記タンパク質発現増強用核酸を含むベクター及び組成物、前記タンパク質発現増強用核酸が導入された細胞、これらの使用、並びに、前記タンパク質発現増強用核酸を用いたタンパク質の製造方法及びタンパク質の発現増強方法を提供することができる。
図１は、ｍｉＲＮＡ１１８５、ｍｉＲＮＡ３１４８、ｍｉＲＮＡ４６５７、及びｍｉＲＮＡ６８２３のＡＡＶ生産性評価結果を示す図である。 図２は、２９３Ｆ細胞を用いたｐＲＣ２－ｍｉＲＮＡ１１８５発現用プラスミドの評価結果を示す図である。 図３は、ＶＰＣｓ２．０細胞を用いたｐＲＣ２－ｍｉＲＮＡ１１８５発現用プラスミドの評価結果を示す図である。 図４は、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を用いたｐＲＣ２－ｍｉＲＮＡ１１８５発現用プラスミドの評価結果を示す図である。
　（タンパク質発現増強用核酸）
　前記タンパク質発現増強用核酸は、以下の（ｉ）から（ｉｉｉ）のいずれかのＲＮＡ又は前記ＲＮＡに対応するＤＮＡを含み、さらにその他の配列を含むことができる。
（ｉ）配列番号１に記載の塩基配列からなるＲＮＡ
（ｉｉ）配列番号１に記載の塩基配列からなるＲＮＡと９０％以上の配列同一性を有し、タンパク質発現増強作用を有するＲＮＡ
（ｉｉｉ）配列番号１に記載の塩基配列からなるＲＮＡに対して、２塩基以内の塩基の、置換、付加、及び／又は欠失を有し、タンパク質発現増強作用を有するＲＮＡ
　これらの中でも、前記タンパク質発現増強用核酸は、前記（ｉ）配列番号１に記載の塩基配列からなるＲＮＡ又は前記ＲＮＡに対応するＤＮＡを含むことが好ましい。
　前記ＲＮＡはリボ核酸であり、塩基として、アデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）、シトシン（Ｃ）、及びウラシル（Ｕ）を含むことができる。
　前記ＤＮＡはデオキシリボ核酸であり、塩基として、アデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）、シトシン（Ｃ）、及びチミン（Ｔ）を含むことができる。
　前記ＲＮＡに対応するＤＮＡとは、前記ＲＮＡの塩基配列中のウラシル（Ｕ）をチミン（Ｔ）に置き換えた塩基配列を有するＤＮＡを意味する。
　配列表の配列番号１において、記号「ｔ」はウラシルを示す。また、配列表の配列番号２１において、記号「ｔ」はチミンを示す。したがって、前記配列番号１に記載の塩基配列からなるＲＮＡ及び前記配列番号１に記載の塩基配列からなるＲＮＡに対応するＤＮＡ（即ち、配列番号２１に記載の塩基配列からなるＤＮＡ）は、以下の通りである。
［配列番号１に記載の塩基配列からなるＲＮＡ］
　ａｕａｕａｃａｇｇｇｇｇａｇａｃｕｃｕｕａｕ（配列番号１）
［配列番号１に記載の塩基配列からなるＲＮＡに対応するＤＮＡ］
　ａｔａｔａｃａｇｇｇｇｇａｇａｃｔｃｔｔａｔ（配列番号２１）
　前記タンパク質は、目的タンパク質又は標的タンパク質とも言い、宿主（細胞）において、発現を増強させるタンパク質である。
　前記タンパク質は、前記タンパク質発現増強用核酸を前記宿主（細胞）に導入することで、発現を増強することができる。
　前記タンパク質の発現増強としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、宿主（細胞）における前記タンパク質の発現量が、前記タンパク質発現増強用核酸を前記宿主（細胞）に導入しない場合と比較して、前記タンパク質発現増強用核酸を前記宿主（細胞）に導入した場合に、１．１倍以上増加することが好ましく、１．２倍以上増加することがより好ましく、１．５倍以上増加することがさらに好ましく、２倍以上増加することが特に好ましい。
　前記タンパク質の発現量を確認する方法としては、特に制限はなく、前記タンパク質の種類に応じて、公知の方法の中から適宜選択することができ、ウエスタンブロット法、ＥＬＩＳＡ法などが挙げられる。前記タンパク質が酵素である場合は、前記タンパク質発現増強用核酸を前記宿主（細胞）に導入した場合と、前記タンパク質発現増強用核酸を前記宿主（細胞）に導入しない場合との酵素活性を、該酵素の種類に応じた基質を使用して公知の方法で比較し、前記タンパク質発現増強用核酸を前記宿主（細胞）に導入した場合の酵素活性の方が高い場合に、前記タンパク質の発現量が増加したと判断してもよい。また、前記タンパク質がウイルスである場合は、前記タンパク質発現増強用核酸を前記宿主（細胞）に導入した場合と、前記タンパク質発現増強用核酸を前記宿主（細胞）に導入しない場合とのウイルスの力価又はウイルスベクターの力価を、定量ＰＣＲ法等の公知のウイルス力価測定方法で測定して比較し、前記タンパク質発現増強用核酸を前記宿主（細胞）に導入した場合のウイルスの力価又はウイルスベクターの力価が高い場合に、前記タンパク質の発現量が増加したと判断してもよい。
　前記タンパク質としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、アデノウイルス、パルボウイルス、コロナウイルス、レトロウイルス、レンチウイルス、ヘルペスウイルス、ポリオウイルス、パピローマウイルス、ワクシニアウイルス、ポックスウイルス等のウイルス；全抗体、一本鎖抗体、重鎖抗体、多価抗体、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｃ、Ｆｃ融合タンパク質、バイスペシフィック抗体、重鎖（Ｈ鎖）、軽鎖（Ｌ鎖）、単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、ｓｃ（Ｆｖ）２、ジスルフィド結合Ｆｖ（ｓｄＦｖ）、Ｄｉａｂｏｄｙ、抗体様分子標的ペプチド（マイクロ抗体）等の抗体；フィターゼ、アミラーゼ、グルコシダーゼ、セルラーゼ、リパーゼ、プロテアーゼ、グルタミナーゼ、ペプチダーゼ、ヌクレアーゼ、オキシダーゼ、ラクターゼ、キシラナーゼ、トリプシン、ペクチナーゼ、イソメラーゼ、組織プラスミノーゲン活性化因子（ＴＰＡ）、ウロキナーゼ等の酵素；プロテインＡ、プロテインＧ、プロテインＬ等の抗体結合性タンパク質；ヒト血清アルブミン等の血清アルブミン；ヒト上皮成長因子等の上皮成長因子；インシュリン、成長ホルモン、レプチン等のホルモン類；エリスロポエチン、インターフェロン、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ－ＣＳＦ）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ）、トロンボポエチン、ＩＬ－１、ＩＬ－６、幹細胞成長因子（ＳＣＦ）等のサイトカイン又は増殖因子類；血液凝固第ＶＩＩＩ因子等の血液凝固線溶系因子；フィブロイン；蛍光タンパク質；Ｂ型肝炎ウイルス表面抗原；ヒルジンなどが挙げられる。
　これらの中でも、前記タンパク質は、ウイルス又は抗体が好ましく、ウイルスがより好ましく、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）がさらに好ましい。
　前記ウイルスは、ウイルスベクターであってもよい。
　－アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）－
　前記アデノ随伴ウイルスは、カプシド中に直鎖状一本鎖ＤＮＡを含むパルボウイルス科に属するウイルスである。前記アデノ随伴ウイルスの血清型としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、１型ＡＡＶ（ＡＡＶ１）、２型ＡＡＶ（ＡＡＶ２）、３型ＡＡＶ（ＡＡＶ３）、４型ＡＡＶ（ＡＡＶ４）、５型ＡＡＶ（ＡＡＶ５）、６型ＡＡＶ（ＡＡＶ６）、７型ＡＡＶ（ＡＡＶ７）、８型ＡＡＶ（ＡＡＶ８）、９型ＡＡＶ（ＡＡＶ９）、及び１０型ＡＡＶ（ＡＡＶ１０）などが挙げられる。
　前記ウイルスは、ウイルスを構成する一部のポリペプチドであってもよい。
　前記アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）を構成する一部のポリペプチドとしては、例えば、アデノ随伴ウイルス由来のＶＰ１、アデノ随伴ウイルス由来のＶＰ２、アデノ随伴ウイルス由来のＶＰ３、アデノ随伴ウイルス由来のＲｅｐ、アデノ随伴ウイルス由来のＣａｐ、アデノ随伴ウイルス由来のＡＡＰ、アデノ随伴ウイルス由来のＭＡＡＰなどが挙げられる。
　前記宿主（細胞）としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、大腸菌等の細菌、酵母等の真菌、動物細胞、昆虫細胞、植物細胞などが挙げられるが、大腸菌等の細菌、又は動物細胞が好ましく、動物細胞がより好ましい。
　前記動物細胞としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、２９３Ｆ細胞、ＶＰＣｓ２．０細胞、ＨＥＫ２９３細胞、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞、Ｈｅｌａ細胞、ＣＨＯ細胞、ｉＰＳ細胞、間葉系幹細胞などが挙げられる。
　これらの中でも、前記宿主（細胞）は、前記動物細胞が好ましく、２９３Ｆ細胞、ＶＰＣｓ２．０細胞、又はＨＥＫ２９３Ｔ細胞がより好ましく、２９３Ｆ細胞がさらに好ましい。
　＜（ｉ）配列番号１に記載の塩基配列からなるＲＮＡ＞
　前記配列番号１に記載の塩基配列からなるＲＮＡは、ｍｉＲＮＡ（ｍｉｃｒｏ－ＲＮＡ）である。前記配列番号１に記載の塩基配列からなるＲＮＡは、後述する実施例の解析３に記載の通り、ｈｓａ－ｍｉＲ－１１８５－１－３ｐである。
　前記配列番号１に記載の塩基配列からなるＲＮＡに対応するＤＮＡは、上述の通り、前記配列番号１に記載の塩基配列からなるＲＮＡの塩基配列中のウラシル（Ｕ）をチミン（Ｔ）に置き換えた塩基配列を有するＤＮＡである。具体的には、前記配列番号１に記載の塩基配列からなるＲＮＡに対応するＤＮＡは、配列番号２１に記載の塩基配列からなるＤＮＡである。配列番号２１に記載の塩基配列からなるＤＮＡは、例えば、前記配列番号１に記載の塩基配列からなるＲＮＡから、逆転写酵素を用いた公知の相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）合成法により合成することができる。
　＜（ｉｉ）配列番号１に記載の塩基配列からなるＲＮＡと９０％以上の配列同一性を有し、タンパク質発現増強作用を有するＲＮＡ＞
　前記配列番号１に記載の塩基配列からなるＲＮＡと９０％以上の配列同一性を有するＲＮＡとしては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、前記配列番号１に記載の塩基配列からなるＲＮＡに対して、配列同一性が９０％以上となる範囲で、前記配列番号１に記載の塩基配列中の１以上の塩基が、置換、付加、及び／又は欠失したＲＮＡであるが、高効率にタンパク質の発現を増強する点から、配列番号１に記載の塩基配列からなるＲＮＡと９５％以上の配列同一性を有するＲＮＡが好ましい。
　前記配列番号１に記載の塩基配列からなるＲＮＡと９０％以上の配列同一性を有し、タンパク質発現増強作用を有するＲＮＡに対応するＤＮＡは、前記配列番号２１に記載の塩基配列からなるＤＮＡと９０％以上の配列同一性を有するＤＮＡである。前記配列番号２１に記載の塩基配列からなるＤＮＡと９０％以上の配列同一性を有するＤＮＡは、前記配列番号１に記載の塩基配列からなるＲＮＡと９０％以上の配列同一性を有し、タンパク質発現増強作用を有するＲＮＡから、逆転写酵素を用いた公知の相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）合成法により合成することができる。
　前記タンパク質発現増強作用を有するＲＮＡとは、前記ＲＮＡ及び前記タンパク質を宿主（細胞）に発現させたときに、前記ＲＮＡを発現させない場合と比較して、前記タンパク質の発現量を増加させることのできるＲＮＡを言う。
　前記タンパク質の発現量の増加としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、宿主（細胞）における前記タンパク質の発現が、前記ＲＮＡを前記宿主（細胞）に導入しない場合と比較して、１．１倍以上増加することが好ましく、１．２倍以上増加することがより好ましく、１．５倍以上増加することがさらに好ましく、２倍以上増加することが特に好ましい。
　前記タンパク質発現増強作用を有するＲＮＡによる前記タンパク質の発現量の増加は、前記タンパク質の発現増強の説明に記載の方法と同様の方法で確認することができる。
　＜（ｉｉｉ）配列番号１に記載の塩基配列からなるＲＮＡに対して、２塩基以内の塩基の、置換、付加、及び／又は欠失を有し、タンパク質発現増強作用を有するＲＮＡ＞
　前記配列番号１に記載の塩基配列からなるＲＮＡに対して、２塩基以内の塩基の、置換、付加、及び／又は欠失を有するＲＮＡは、配列番号１に記載の塩基配列からなるＲＮＡに対して、２塩基以内の塩基が、置換、付加、及び／又は欠失したＲＮＡである。
　前記配列番号１に記載の塩基配列からなるＲＮＡに対して、２塩基以内の塩基の、置換、付加、及び／又は欠失を有するＲＮＡとしては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、高効率にタンパク質の発現を増強する点から、前記配列番号１に記載の塩基配列からなるＲＮＡに対して、１塩基の、置換、付加、及び／又は欠失を有するＲＮＡが好ましい。
　前記配列番号１に記載の塩基配列からなるＲＮＡに対して、２塩基以内の塩基の、置換、付加、及び／又は欠失を有し、タンパク質発現増強作用を有するＲＮＡに対応するＤＮＡは、前記配列番号２１に記載の塩基配列からなるＤＮＡに対して、２塩基以内の塩基の、置換、付加、及び／又は欠失を有するＤＮＡである。なお、前記配列番号２１に記載の塩基配列からなるＤＮＡに対して、２塩基以内の塩基の、置換、付加、及び／又は欠失を有するＤＮＡにおける、２塩基以内の塩基の、置換、付加、及び／又は欠失は、前記配列番号１に記載の塩基配列からなるＲＮＡに対して、２塩基以内の塩基の、置換、付加、及び／又は欠失を有し、タンパク質発現増強作用を有するＲＮＡにおける、２塩基以内の塩基の、置換、付加、及び／又は欠失に対応した塩基の置換、付加、及び／又は欠失である。前記配列番号２１に記載の塩基配列からなるＤＮＡに対して、２塩基以内の塩基の、置換、付加、及び／又は欠失を有するＤＮＡは、前記配列番号１に記載の塩基配列からなるＲＮＡに対して、２塩基以内の塩基の、置換、付加、及び／又は欠失を有し、タンパク質発現増強作用を有するＲＮＡから、逆転写酵素を用いた公知の相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）合成法により合成することができる。
　前記タンパク質発現増強作用を有するＲＮＡとは、前記ＲＮＡ及び前記タンパク質を宿主（細胞）に発現させたときに、前記ＲＮＡを発現させない場合と比較して、前記タンパク質の発現量を増加させることのできるＲＮＡを言う。
　前記タンパク質の発現量の増加としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、宿主（細胞）における前記タンパク質の発現が、前記ＲＮＡを前記宿主（細胞）に導入しない場合と比較して、１．１倍以上増加することが好ましく、１．２倍以上増加することがより好ましく、１．５倍以上増加することがさらに好ましく、２倍以上増加することが特に好ましい。
　前記タンパク質発現増強作用を有するＲＮＡによる前記タンパク質の発現量の増加は、前記タンパク質の発現増強の説明に記載の方法と同様の方法で確認することができる。
　＜その他の配列＞
　前記その他の配列としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
　（ベクター）
　前記ベクターは、前記タンパク質発現増強用核酸を含み、さらにその他の要素を含むことができる。
　前記タンパク質発現増強用核酸は、前述の（タンパク質発現増強用核酸）の項目に記載のとおりである。
　前記ベクターとしては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ｐＲＣ２ベクターなどが挙げられる。
　＜その他の要素＞
　前記その他の要素としては、前記タンパク質（目的タンパク質又は標的タンパク質）をコードする核酸、プロモーター配列を有する核酸、ポリＡ付加シグナル配列を有する核酸などが挙げられる。
　前記タンパク質は、前述の（タンパク質発現増強用核酸）の項目に記載のとおりである。
　これらの中でも、前記タンパク質は、ウイルス又は抗体をコードする核酸を含むものが好ましく、ウイルスをコードする核酸を含むものがより好ましく、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）をコードする核酸を含むものがさらに好ましい。
　（組成物）
　前記組成物は、前記タンパク質発現増強用核酸を含み、さらにその他の要素を含むことができる。
　前記タンパク質発現増強用核酸は、前述の（タンパク質発現増強用核酸）の項目に記載のとおりである。
　前記その他の要素としては、前述の（ベクター）に記載のとおりである。また、前記組成物をトランスフェクションに用いるために、トランスフェクション試薬、エンハンサーなどを含んでいてもよい。
　（細胞）
　前記細胞は、前記タンパク質発現増強用核酸が導入された細胞である。
　前記タンパク質発現増強用核酸は、前述の（タンパク質発現増強用核酸）の項目に記載のとおりである。
　前記導入としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、カチオン性脂質による導入、リン酸カルシウム共沈殿法による導入、ＤＥＡＥデキストランによる導入、カチオン性ポリマーによる導入、ウイルスによる導入、エレクトロポレーション法による導入、ナノ粒子による導入、マイクロインジェクション法による導入、レーザーによる導入などが挙げられる。
　前記細胞としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、大腸菌等の細菌、酵母等の真菌、動物細胞、昆虫細胞、植物細胞などが挙げられるが、大腸菌等の細菌、又は動物細胞が好ましく、動物細胞がより好ましい。
　前記動物細胞としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、２９３Ｆ細胞、ＶＰＣｓ２．０細胞、ＨＥＫ２９３細胞、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞、Ｈｅｌａ細胞、ＣＨＯ細胞、ｉＰＳ細胞、間葉系幹細胞などが挙げられる。
　これらの中でも、前記細胞は、２９３Ｆ細胞、ＶＰＣｓ２．０細胞、又はＨＥＫ２９３Ｔ細胞が好ましく、２９３Ｆ細胞がより好ましい。
　（タンパク質の製造方法）
　前記タンパク質の製造方法は、以下の（ｉ）から（ｉｉｉ）のいずれかのＲＮＡ又は前記ＲＮＡに対応するＤＮＡを含むタンパク質発現増強用核酸が導入された細胞を培養する工程を含み、さらにその他の工程を含むことができる。
（ｉ）配列番号１に記載の塩基配列からなるＲＮＡ
（ｉｉ）配列番号１に記載の塩基配列からなるＲＮＡと９０％以上の配列同一性を有し、タンパク質発現増強作用を有するＲＮＡ
（ｉｉｉ）配列番号１に記載の塩基配列からなるＲＮＡに対して、２塩基以内の塩基の、置換、付加、及び／又は欠失を有し、タンパク質発現増強作用を有するＲＮＡ
　前記タンパク質発現増強用核酸は、前述の（タンパク質発現増強用核酸）の項目に記載のとおりである。
　前記細胞は、前述の（細胞）の項目に記載のとおりである。
　前記培養としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、前記細胞を培養培地に播種し、静置、撹拌又は振盪する方法などが挙げられる。
　前記培養培地に、細胞増殖阻害剤を加えることができる。
　＜その他の工程＞
　前記その他の工程としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、前記タンパク質発現増強用核酸を前記細胞に導入する工程、前記培養する工程の後に前記タンパクを精製する工程などが挙げられる。
　前記（ｉ）から（ｉｉｉ）のいずれかのＲＮＡ又は前記ＲＮＡに対応するＤＮＡを含むタンパク質発現増強用核酸が導入された細胞は、前記タンパク質発現増強用核酸を前記細胞に導入する工程により好適に得ることができる。前記導入は、前述の（細胞）の項目に記載のとおりである。
　（タンパク質の発現増強方法）
　前記タンパク質の発現増強方法は、以下の（ｉ）から（ｉｉｉ）のいずれかのＲＮＡ又は前記ＲＮＡに対応するＤＮＡを含むタンパク質発現増強用核酸を細胞に導入する工程を含み、さらにその他の工程を含むことができる。
　前記タンパク質発現増強用核酸は、前述の（タンパク質発現増強用核酸）の項目に記載のとおりである。
　前記細胞及び導入は、前述の（細胞）の項目に記載のとおりである。
　前記その他の工程は、例えば、前記細胞を培養する工程、前記培養する工程の後に前記タンパクを精製する工程などが挙げられる。これらのその他の工程は、前述の（タンパク質の製造方法）の項目に記載のとおりである。
　（タンパク質発現増強のための使用）
　前記タンパク質発現増強のための使用は、（ａ）以下の（ｉ）から（ｉｉｉ）のいずれかのＲＮＡ又は前記ＲＮＡに対応するＤＮＡを含む核酸、（ｂ）以下の（ｉ）から（ｉｉｉ）のいずれかのＲＮＡ又は前記ＲＮＡに対応するＤＮＡを含む核酸を含むベクター、（ｃ）以下の（ｉ）から（ｉｉｉ）のいずれかのＲＮＡ又は前記ＲＮＡに対応するＤＮＡを含む核酸を含む組成物、及び（ｄ）以下の（ｉ）から（ｉｉｉ）のいずれかのＲＮＡ又は前記ＲＮＡに対応するＤＮＡを含む核酸が導入された細胞、のいずれかのタンパク質発現増強のための使用である。
（ｉ）配列番号１に記載の塩基配列からなるＲＮＡ
（ｉｉ）配列番号１に記載の塩基配列からなるＲＮＡと９０％以上の配列同一性を有し、タンパク質発現増強作用を有するＲＮＡ
（ｉｉｉ）配列番号１に記載の塩基配列からなるＲＮＡに対して、２塩基以内の塩基の、置換、付加、及び／又は欠失を有し、タンパク質発現増強作用を有するＲＮＡ
　これらの中でも、前記タンパク質発現増強のための使用は、（ａ）前記配列番号１に記載の塩基配列からなるＲＮＡ又は前記ＲＮＡに対応するＤＮＡを含む核酸、（ｂ）前記配列番号１に記載の塩基配列からなるＲＮＡ又は前記ＲＮＡに対応するＤＮＡを含む核酸を含むベクター、（ｃ）前記配列番号１に記載の塩基配列からなるＲＮＡ又は前記ＲＮＡに対応するＤＮＡを含む核酸を含む組成物、及び（ｄ）前記配列番号１に記載の塩基配列からなるＲＮＡ又は前記ＲＮＡに対応するＤＮＡを含む核酸が導入された細胞、のいずれかのタンパク質発現増強のための使用であることが好ましい。
　前記（ａ）核酸は、前述の（タンパク質発現増強用核酸）の項目に記載のとおりである。
　前記（ｂ）ベクターは、前述の（ベクター）の項目に記載のとおりである。
　前記（ｃ）組成物は、前述の（組成物）の項目に記載のとおりである。
　前記（ｄ）細胞は、前述の（細胞）の項目に記載のとおりである。
　以下、本発明の実施例を説明するが、本発明は、これらの実施例に何ら限定されるものではない。
＜製造例１　抗体発現ＣＨＯ細胞の調製＞
　ＣＨＯ細胞（ＣＨＯ－Ｋ１株由来）に対して、ヒト化モノクローナル抗体発現遺伝子を導入し、ＩｇＧ１抗体を安定発現するＣＨＯ細胞株を構築した。具体的には以下のようにして行った。
　ＩｇＧ１の軽鎖及び重鎖配列を含むプラスミドＤＮＡを鋳型にしてＰＣＲ増幅を行い、軽鎖配列（０．７ｋｂ断片）及び重鎖配列（１．４ｋｂ断片）を得た。得られた断片をＭａｍｍａｌｉａｎ　ＰｏｗｅｒＥｘｐｒｅｓｓ　Ｓｙｓｔｅｍ発現ベクター（東洋紡株式会社）に挿入し、ＩｇＧ１抗体発現プラスミドを構築した。
　前記ＩｇＧ１抗体発現プラスミドを制限酵素ＳｓｐＩで処理し直鎖化したＤＮＡを、遺伝子導入試薬Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）を用いてＣＨＯ細胞（ＣＨＯ－Ｋ１株由来）に遺伝子導入し、１２５－ｍＬ　Ｅｒｌｅｎｍｅｙｅｒ　ｆｌａｓｋ（コーニング社）で培養した。抗生物質ピューロマイシン（ナカライテスク株式会社）を終濃度２０μｇ／ｍＬで添加し、細胞増殖が安定するまで繰り返し継代培養を実施した。得られたプール細胞の中から、ＣｌｏｎｅＰｉｘ２システム（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｄｅｖｉｃｅｓ社）を用いて、シングルコロニーを単離し、９６－ウェルマルチプレートに播種した。Ｃｌｏｎｅ　Ｓｅｌｅｃｔ　Ｉｍａｇｅｒ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｄｅｖｉｃｅｓ社）を用いて、良好な細胞増殖性を示すクローン細胞を選別し、拡大培養した。
　複数のクローン細胞の培養上清の分泌生産抗体濃度をＯｃｔｅｔＱＫｅ（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ社）によるバイオレイヤー干渉法により測定した。標準ＩｇＧ１サンプルにはＣＨＯ細胞で発現させたＩｇＧ１抗体（アフィニティークロマトグラフィー・サイズ排除クロマトグラフィー精製済、ＳＤＳ－ＰＡＧＥによる純度９９％以上）を使用した。
　以上により、良好な細胞増殖性、抗体生産性を示すＩｇＧ１抗体を安定発現するＣＨＯ細胞株を樹立した。
　ＩｇＧ１抗体を安定発現するＣＨＯ細胞株を親細胞とし、細胞クローニングを実施した。親細胞をＢａｌａｎＣＤ　ＣＨＯ　ＧｒｏｗｔｈＡ（富士フィルム和光純薬株式会社）を主成分とする半固形培地に播種し、２週間程度培養することでクローン細胞コロニーを形成させた。その後、動物細胞コロニーピッキングシステムＣｌｏｎｅＰｉｘ２システム（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｄｅｖｉｃｅｓ社）を用いて、シングルコロニーを単離した。単離した複数のクローン細胞コロニーを９６－ウェルプレートに播種した。プレートへの播種後、静置培養しながら細胞増殖プレートイメージャーＣｌｏｎｅ　Ｓｅｌｅｃｔ　Ｉｍａｇｅｒ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｄｅｖｉｃｅｓ社）を利用して細胞増殖性の優れたクローン細胞を２４－ウェルプレートに拡大培養した。以降、同様に６－ウェルプレートに拡大培養した。最終的に１２５－ｍＬ　Ｅｒｌｅｎｍｅｙｅｒ　ｆｌａｓｋ（コーニング社）を用いて５％ＣＯ２、３７℃条件下で振盪培養を行い、良好な細胞増殖性を示すＣＨＯ細胞株を複数株樹立した。樹立した細胞のうち、ＩｇＧ１－Ａ細胞及びＩｇＧ１－Ｂ細胞について、以下のとおり、細胞増殖及び抗体生産量を解析した。
＜＜解析１　ＩｇＧ１－Ａ細胞及びＩｇＧ１－Ｂ細胞における細胞増殖解析＞＞
　ＩｇＧ１－Ａ細胞及びＩｇＧ１－Ｂ細胞を１２５－ｍＬ　Ｅｒｌｅｎｍｅｙｅｒ　ｆｌａｓｋ（コーニング社）を用いて振盪培養を実施した。Ｃｌｉｍｏｓｈａｋｅｒ　ＩＳＦ１－Ｘ　（Ｋｕｈｎｅｒ社）を用いて温度３７℃、湿度８０％、炭酸ガス濃度５％、回転数８０ｒｐｍの条件下で振盪培養を行った。ＣＨＯ細胞用無血清培地としてＢａｌａｎＣＤ　ＣＨＯ　ＧｒｏｗｔｈＡ（富士フィルム和光純薬株式会社、４ｍＭ　Ｌ－グルタミン含有）を用いてバッチ培養を実施した。細胞密度０．３×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬで播種し、播種後から２１４時間後まで、適宜、セルカウンターＣｏｕｎｔｅｓｓＩＩ（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）を用いて細胞数測定を実施した。培養は各細胞３フラスコ（ｎ＝３）で実施した。
　その結果、ＩｇＧ１－Ａ細胞及びＩｇＧ１－Ｂ細胞における細胞増殖率は同等であった。
＜＜解析２　ＩｇＧ１－Ａ細胞及びＩｇＧ１－Ｂ細胞における抗体生産量解析＞＞
　培養４日目以降、培養液をサンプリングし除細胞した上清液を用いて培養液中の抗体濃度をバイオレイヤー干渉法により実施した。測定にはＯｃｔｅｔＱＫｅ（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ社）を使用した。標準ＩｇＧ１サンプルにはＣＨＯ細胞で発現させたＩｇＧ１抗体（アフィニティークロマトグラフィー・サイズ排除クロマトグラフィー精製済、ＳＤＳ－ＰＡＧＥによる純度９９％以上）を使用した。
　その結果、ＩｇＧ１－Ｂ細胞は、ＩｇＧ１－Ａ細胞と比較して、２１４時間後のＩｇＧ１の生産量が約１．４倍であった。
＜＜解析３　ＩｇＧ１－Ａ細胞及びＩｇＧ１－Ｂ細胞におけるｍｉＲＮＡ発現解析＞＞
　培養６日目のサンプルを一部採取し、セルカウンターＣｏｕｎｔｅｓｓＩＩ（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）による細胞数測定後、１×１０７ｃｅｌｌｓ程度の細胞を遠心分離により調製し細胞ペレットを－８０℃で凍結保存した。
　フィルジェン株式会社に委託し、次の解析を行った。ＲＮＡ抽出キットｍｉＲＮｅａｓｙ　Ｍｉｎｉ　ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社）を用いて、前記凍結保存したＩｇＧ１－Ａ細胞及びＩｇＧ１－Ｂ細胞からｓｍａｌｌ　ＲＮＡを含むｔｏｔａｌ　ＲＮＡを抽出した。次に、ＦｌａｓｈＴａｇ　Ｂｉｏｔｉｎ　ＨＳＲ　ＲＮＡ　Ｌａｂｅｌｉｎｇ　Ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）を用いて前記ｔｏｔａｌ　ＲＮＡをビオチン標識した。その後、ＧｅｎｅＣｈｉｐ（登録商標）　Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ　Ｏｖｅｎ（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）を用いてビオチン標識ＲＮＡとＧｅｎｅＣｈｉｐ（登録商標）　ｍｉＲＮＡ　４．０　Ａｒｒａｙ（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）をハイブリダイゼーションさせ、ＧｅｎｅＣｈｉｐ（登録商標）　Ｆｌｕｉｄｉｃｓ　ｓｔａｔｉｏｎ（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）を用いてアレイの洗浄を行った。アレイ調製後、ＧｅｎｅＣｈｉｐ（登録商標）　Ｓｃａｎｎｅｒ３０００　７Ｇ（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）を用いてスキャニングを実施し、ＩｇＧ１－Ａ細胞－ＩｇＧ１－Ｂ細胞間の発現比較を行った。
　ＩｇＧ１－Ａ細胞及びＩｇＧ１－Ｂ細胞におけるｍｉＲＮＡ発現解析結果の一部を表１に示した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　表１の結果より、ＩｇＧ１－Ｂ細胞におけるｈｓａ－ｍｉＲ－１１８５－１－３ｐ（以下、「ｍｉＲＮＡ１１８５」と称することがある）の発現は、ＩｇＧ１－Ａ細胞の約８．０倍であり、ＩｇＧ１－Ｂ細胞におけるｈｓａ－ｍｉＲ－３１４８（以下、「ｍｉＲＮＡ３１４８」と称することがある）の発現は、ＩｇＧ１－Ａ細胞の約３．２倍であり、ＩｇＧ１－Ｂ細胞におけるｈｓａ－ｍｉＲ－４６５７（以下、「ｍｉＲＮＡ４６５７」と称することがある）の発現は、ＩｇＧ１－Ａ細胞の約２．９倍であり、ＩｇＧ１－Ｂ細胞におけるｈｓａ－ｍｉＲ－６８２３－３ｐ（以下、「ｍｉＲＮＡ６８２３」と称することがある）の発現は、ＩｇＧ１－Ａ細胞の約４．５倍であった。
＜製造例２　ｍｉＲＮＡ発現用プラスミドの構築＞
　以下のとおり、ｐＲＣ２－ｍｉ３４２（タカラバイオ株式会社）を改変して、各ｍｉＲＮＡ発現用プラスミド（ｐＲＣ２－ｍｉＲＮＡ１１８５発現用プラスミド、ｐＲＣ２－ｍｉＲＮＡ３１４８発現用プラスミド、ｐＲＣ２－ｍｉＲＮＡ４６５７発現用プラスミド、及びｐＲＣ２－ｍｉＲＮＡ６８２３発現用プラスミド）を構築した。
＜＜製造例２－１　バックボーンプラスミドＤＮＡ断片の調製＞＞
　ｐＲＣ２－ｍｉ３４２をＳｎａＢＩ（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ社）とＳｍａＩ（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ社）で消化し、ｈｓａ－ｍｉＲ－３４２発現カセットを含む約０．６ｋｂの配列（配列番号２）が欠落したバックボーンプラスミドＤＮＡ断片を得た。
　前記約０．６ｋｂの配列（配列番号２）は、ＳｎａＢＩサイト、ＣＭＶプロモーター配列、ｈｓａ－ｍｉＲ－３４２の配列を含むｈｓａ－ｍｉＲ－３４２発現カセット、ポリＡシグナル、及びＳｍａＩサイトを含む。
＜＜製造例２－２　ＣＭＶプロモーター領域、及びポリＡ付加シグナル領域の調製＞＞
　ｐＲＣ２－ｍｉ３４２を鋳型として、ＣＭＶプロモーター領域とポリＡ付加シグナル領域をＰＣＲによりそれぞれ増幅した。ＣＭＶプロモーター領域の増幅にはプライマーとして、配列番号３に記載の塩基配列からなるＣＭＶプロモーター用フォワードプライマー及び配列番号４に記載の塩基配列からなるＣＭＶプロモーター用リバースプライマーを用い、ポリＡ付加シグナル領域の増幅にはプライマーとして、配列番号５に記載の塩基配列からなるポリＡシグナル用フォワードプライマー及び配列番号６に記載の塩基配列からなるポリＡシグナル用リバースプライマーを用いた。これらのプライマーには、ＰＣＲ断片及びバックボーンプラスミドＤＮＡ断片を連結するための、バックボーンプラスミドＤＮＡ及び各ｍｉＲＮＡ発現カセットに対する相同領域を約２０ｂｐ程度付加した。
　配列番号４及び配列番号５において、３’末端の１７塩基が、バックボーンプラスミドＤＮＡに対する相同領域であり、５’末端の２３塩基が各ｍｉＲＮＡに対する相同領域である。
　ＰＣＲは、Ｐｒｉｍｅ　ＳＴＡＲ　ＭＡＸ　ＤＮＡ　Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（タカラバイオ株式会社）を用い、反応条件は添付のマニュアルに記載の方法で行った。以下、プラスミド作製のための全てのＰＣＲに同様の酵素を用いた。
＜＜製造例２－３　各ｍｉＲＮＡの調製＞＞
　各ｍｉＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ１１８５、ｍｉＲＮＡ３１４８、ｍｉＲＮＡ４６５７、及びｍｉＲＮＡ６８２３）の配列は、ｍｉＲＮＡのデータベースであるｍｉＲＢａｓｅ（ｈｔｔｐｓ：／／ｍｉｒｂａｓｅ．ｏｒｇ／）から取得した。ｍｉＲＮＡ１１８５のｍｉＲＢａｓｅにおけるＡｃｃｅｓｓｉｏｎはＭＩＭＡＴ００２２８３８であり、ｍｉＲＮＡ３１４８のｍｉＲＢａｓｅにおけるＡｃｃｅｓｓｉｏｎはＭＩＭＡＴ００１５０２１であり、ｍｉＲＮＡ４６５７のｍｉＲＢａｓｅにおけるＡｃｃｅｓｓｉｏｎはＭＩＭＡＴ００１９７２４であり、ｍｉＲＮＡ６８２３のｍｉＲＢａｓｅにおけるＡｃｃｅｓｓｉｏｎはＭＩＭＡＴ００２７５４７である。ヒトゲノム情報を参照して、各ｍｉＲＮＡの上流及び下流の約５０ｂｐから１００ｂｐ付近にプライマーを設計した。ｍｉＲＮＡ１１８５はプライマーとして、配列番号７に記載の塩基配列からなるｈｓａ－ｍｉＲ－１１８５用フォワードプライマー及び配列番号８に記載の塩基配列からなるｈｓａ－ｍｉＲ－１１８５用リバースプライマーを用いた。ｍｉＲＮＡ３１４８はプライマーとして、配列番号９に記載の塩基配列からなるｈｓａ－ｍｉＲ－３１４８用フォワードプライマー及び配列番号１０に記載の塩基配列からなるｈｓａ－ｍｉＲ－３１４８用リバースプライマーを用いた。ｍｉＲＮＡ４６５７はプライマーとして、配列番号１１に記載の塩基配列からなるｈｓａ－ｍｉＲ－４６５７用フォワードプライマー及び配列番号１２に記載の塩基配列からなるｈｓａ－ｍｉＲ－４６５７用リバースプライマーを用いた。ｍｉＲＮＡ６８２３はプライマーとして、配列番号１３に記載の塩基配列からなるｈｓａ－ｍｉＲ－６８２３用フォワードプライマー及び配列番号１４に記載の塩基配列からなるｈｓａ－ｍｉＲ－６８２３用リバースプライマーを用いた。これらのプライマーには、ＰＣＲ断片やバックボーンプラスミドＤＮＡ断片と連結するための、バックボーンプラスミドＤＮＡに対する相同領域を約２０ｂｐ程度挿入した。
　配列番号７、配列番号９、配列番号１１、及び配列番号１３において、５’末端の１７塩基が、バックボーンプラスミドＤＮＡに対する相同領域であり、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、及び配列番号１４において、５’末端の１８塩基が、バックボーンプラスミドＤＮＡに対する相同領域である。
　鋳型には、ＨＥＫ２９３細胞（ＡＴＣＣ）から抽出したゲノムを用いた。ゲノム抽出にはＤＮｅａｓｙ　Ｂｌｏｏｄ　＆　Ｔｉｓｓｕｅ　Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社）を用いた。反応条件は添付のマニュアルに記載の方法で行った。
　前記各プライマーと前記ＨＥＫ２９３細胞から抽出したゲノムを用いて、各ｍｉＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ１１８５、ｍｉＲＮＡ３１４８、ｍｉＲＮＡ４６５７、及びｍｉＲＮＡ６８２３）の発現カセットを含むＤＮＡ断片をＰＣＲ増幅した。
＜＜製造例２－４　ｐＲＣ２－ｍｉＲＮＡ１１８５発現用プラスミド、ｐＲＣ２－ｍｉＲＮＡ３１４８発現用プラスミド、ｐＲＣ２－ｍｉＲＮＡ４６５７発現用プラスミド、及びｐＲＣ２－ｍｉＲＮＡ６８２３発現用プラスミドの構築＞＞
　製造例２－１で調製したバックボーンプラスミドＤＮＡ断片と、製造例２－２及び製造例２－３で調製した３種類のＰＣＲ増幅断片（ＣＭＶプロモーター領域、ポリＡ付加シグナル領域、及び各ｍｉＲＮＡの発現カセットを含むＤＮＡ断片）と、をＮＥＢ　Ｂｕｉｌｄｅｒ（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ社）を用いて連結し、Ｅ．ｃｏｌｉ　ＮＥＢ　Ｓｔａｂｌｅ　ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ　ｃｅｌｌｓ（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ社）を形質転換し、ｐＲＣ２－ｍｉＲＮＡ１１８５発現用プラスミド、ｐＲＣ２－ｍｉＲＮＡ３１４８発現用プラスミド、ｐＲＣ２－ｍｉＲＮＡ４６５７発現用プラスミド、及びｐＲＣ２－ｍｉＲＮＡ６８２３発現用プラスミド（以下、これらの４種をまとめて「ｐＲＣ２－ｍｉＲＮＡ発現用プラスミド」と略記することがある）を得た。得られた形質転換体から抽出したｐＲＣ２－ｍｉＲＮＡ発現用プラスミドのＤＮＡのシーケンス配列を確認して、想定通りの配列であることを確認した。
＜試験例１　ｍｉＲＮＡの定量＞
＜＜試験例１－１　ｍｉＲＮＡ発現用プラスミドの調製＞＞
　製造例２で構築したｐＲＣ２－ｍｉＲＮＡ発現用プラスミドを１種類ずつ用いて、Ｅ．ｃｏｌｉ　ＮＥＢ　Ｓｔａｂｌｅ　ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ　ｃｅｌｌｓを形質転換してから培養して、各プラスミドを大量調製した。各プラスミドの精製にはＮｕｃｌｅｏｂｏｎｄ　Ｘｔｒａ　Ｍｉｄｉ　ＥＦ（マッハライナーゲル社）を用いた。
＜＜試験例１－２　２９３Ｆ細胞の調製＞＞
　浮遊ＨＥＫ２９３細胞（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社；ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ（商標）２９３Ｆ細胞）を、４ｍＭ　ＧｌｕｔａＭＡＸ（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）を含むＦ１７培地（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）に１×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるように懸濁した。この懸濁液５ｍＬを５０ｍＬフィルターキャップ付遠沈管に播種した。８％ＣＯ２雰囲気下、３７℃のインキュベーター内に入れて、２００ｒｐｍで１時間振盪培養してトランスフェクションに供した。
＜＜試験例１－３　２９３Ｆ細胞へのプラスミド導入（トランスフェクション）＞＞
　試験例１－１で調製した各ｐＲＣ２－ｍｉＲＮＡ発現用プラスミド（１μｇ／μＬ、４μＬ）をＯｐｔｉ－ＭＥＭ（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）中でＰＥＩ　ＭＡＸ（１μｇ／μＬ、１２μＬ、ＰｏｌｙＳｃｉｅｎｃｅｓ社）と混合し、試験例１－２で調製した２９３Ｆ細胞に前記プラスミドを導入した。８％ＣＯ２雰囲気下、３７℃のインキュベーター内に入れて、２００ｒｐｍで３日間培養した。
　陰性対照として、ｐＲＣ２－ｍｉ３４２をＳｎａＢＩ（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ社）とＳｍａＩ（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ社）で消化して調製した、ｍｉＲＮＡ発現カセットを有さないプラスミドｐＲＣ２も同様にプラスミドを調製して、トランスフェクション及び培養を実施した。
＜＜試験例１－４　ＲＮＡの抽出と定量＞＞
　トランスフェクションした２９３Ｆ細胞を回収して、ｍｉＲＮｅａｓｙ　Ｍｉｎｉｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社）を用いてｔｏｔａｌ　ＲＮＡを抽出し、Ｍｉｒ－Ｘ（商標）　ｍｉＲＮＡ　ｑＲＴ－ＰＣＲ　ＴＢ　Ｇｒｅｅｎ（登録商標）Ｋｉｔ（タカラバイオ株式会社）を用いて、ｍｉＲＮＡを定量した。操作は、キットに記載の方法に従った。抽出したｔｏｔａｌ　ＲＮＡに、ｍＲＱ　Ｅｎｚｙｍｅを用いてポリＡを付加してから、逆転写した後に、ｍＲＱ　３’　Ｐｒｉｍｅｒ及び各ｍｉＲＮＡに特異的なプライマーを用いて定量ＰＣＲ法で測定した。ｍｉＲＮＡ１１８５はプライマー（各ｍｉＲＮＡに特異的なプライマー）として、配列番号１５に記載の塩基配列からなるｍｉＲＮＡ１１８５定量用プライマーを用いた。ｍｉＲＮＡ３１４８はプライマー（各ｍｉＲＮＡに特異的なプライマー）として、配列番号１６に記載の塩基配列からなるｍｉＲＮＡ３１４８定量用プライマーを用いた。ｍｉＲＮＡ４６５７はプライマー（各ｍｉＲＮＡに特異的なプライマー）として、配列番号１７に記載の塩基配列からなるｍｉＲＮＡ４６５７定量用プライマーを用いた。ｍｉＲＮＡ６８２３はプライマー（各ｍｉＲＮＡに特異的なプライマー）として、配列番号１８に記載の塩基配列からなるｍｉＲＮＡ６８２３定量用プライマーを用いた。結果を表２に示した。
　表２の、「ｃｏｎｔｒｏｌ」は陰性対照（プラスミドｐＲＣ２）をトランスフェクションした２９３Ｆ細胞のＣｔ値を示しており、「ｓａｍｐｌｅ」は各ｍｉＲＮＡを発現するプラスミド（ｐＲＣ２－ｍｉＲＮＡ発現用プラスミド）をトランスフェクションした２９３Ｆ細胞のＣｔ値を示している。ΔΔＣｔは閾値に達したサイクル数であるＣｔ値のｃｏｎｔｒｏｌとｓａｍｐｌｅの差分を示している。全てのｓａｍｐｌｅにおいて閾値に達するＣｔ値が早くなっており、ｍｉＲＮＡが増加していることが分かった。「倍率」はｃｏｎｔｒｏｌに対するｓａｍｐｌｅの増加率を示している。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
 　表２の結果より、全てのｍｉＲＮＡが増加していることが確認できた。
＜試験例２　ｍｉＲＮＡのＡＡＶ生産性評価＞
＜＜試験例２－１　２９３Ｆ細胞の調製＞＞
　試験例１－２と同様に２９３Ｆ細胞を調製した。
＜＜試験例２－２　２９３Ｆ細胞へのプラスミド導入（トランスフェクション）＞＞
　試験例１－１で調製した各ｐＲＣ２－ｍｉＲＮＡ発現用プラスミド（１μｇ／μＬ、４μＬ）及びｐＡＡＶ－Ｖｅｎｕｓ（１μｇ／μＬ、１μＬ）、ｐＨｅｌｐｅｒ（１μｇ／μＬ、１μＬ）、及びＰＥＩ　ＭＡＸ（１μｇ／μＬ、１２μＬ）をＯｐｔｉ－ＭＥＭ中で混合して静置した。プラスミドＤＮＡ－ＰＥＩ混合液を試験例２－１で調製した２９３Ｆ細胞培養液に添加することにより細胞内にプラスミドを導入した。８％ＣＯ２雰囲気下、３７℃のインキュベーター内に入れて、２００ｒｐｍで４時間培養した後に、ＤＭＳＯを用いて５０μＭに調製したノコダゾール（Ｃａｙｍａｎ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ社）を５０μＬ添加し、同様の条件で更に３日間培養した。
＜＜試験例２－３　ＡＡＶの回収＞＞
　得られた培養液を遠心し、上清と細胞ペレットを分離し、上清に対して、終濃度が１０％となるように培養液に対して１／４容量の４０％ＰＥＧ８０００（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社）溶液を加えてＡＡＶを沈殿させた。残渣に１ｍＬの０．１％Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ－１００（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社）溶液を加えて細胞破砕処理した後、１μＬのカネカエンドヌクレアーゼ（株式会社カネカ）を加えてＤＮＡを分解した。１５μＬのＥＤＴＡ（株式会社ニッポンジーン）を加えて遠心分離し、上清を回収した（上清由来サンプル）。
　細胞ペレットに対しては、１ｍＬの０．１％Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ－１００溶液を加えて細胞破砕処理した後、１μＬのカネカエンドヌクレアーゼを加えてＤＮＡを分解した。１５μＬのＥＤＴＡ（株式会社ニッポンジーン）を加えて遠心分離し、上清を回収した（細胞由来サンプル）。定量ＰＣＲに供するまで４℃又は－２０℃にて保存した。
＜＜試験例２－４　ＡＡＶのゲノム力価測定＞＞
　試験例２－３で調製したサンプルに含まれるＡＡＶベクターの力価を、プライマー（配列番号１９に記載の塩基配列からなるＡＡＶタイター測定用フォワードプライマー及び配列番号２０に記載の塩基配列からなるＡＡＶタイター測定用リバースプライマー）を用いた定量ＰＣＲ法（ＱｕａｎｔＳｔｕｄｉｏ３、ＳＹＢＲ－Ｇｒｅｅｎ法）で測定した。
　前記定量ＰＣＲには、１２．５μＬのＰｏｗｅｒＵｐ（商標）　ＳＹＢＲ（登録商標）　Ｇｒｅｅｎ　Ｍａｓｔｅｒ　Ｍｉｘ（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）、各０．１２５μＬのプライマー（５０μＭ、配列番号１９及び配列番号２０）、１１．２５μＬの滅菌水、及び１μＬの標準品又は５０００倍希釈したサンプルからなる試料（合計２５μＬ）を用い、上記試料に対してＱｕａｎｔＳｔｕｄｉｏ３（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）を用いて、９４℃／１５秒（熱変性）、６０℃／３０秒（アニーリング）、７２℃／３０秒（伸長反応）を３０サイクル繰り返すことによりＰＣＲ反応を行った。
　上記標準品は、ｐＡＡＶ－ＭＣＳ　Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　Ｖｅｃｔｏｒ（０．６７μｇ／μＬ、ＴＥ溶液、Ｃｅｌｌ　Ｂｉｏｌａｂｓ社）をＰｖｕＩＩ（タカラバイオ株式会社）で３７℃、２時間消化して直鎖化することにより作製した。定量ＰＣＲの結果（ＡＡＶ生産量）を図１に示す。
　図１の、ｖｇ／Ｌは培養液量当たりのＶｅｃｔｏｒ　Ｇｅｎｏｍｅ量を示している。図１のｂａｒは標準偏差を示している。
　この中で最もＡＡＶを生産していたのが、ｐＲＣ２－ｍｉＲＮＡ１１８５発現用プラスミドを用いたときであり、ｈｓａ－ｍｉＲ－１１８５の効果でＡＡＶ生産量が増加したと考えられた。
＜実施例１　２９３Ｆ細胞を用いたｐＲＣ２－ｍｉＲＮＡ１１８５発現用プラスミドの評価＞
　２９３Ｆ細胞を用いてｍｉＲＮＡ１１８５によるＡＡＶ生産性の向上を検証した。
＜＜実施例１－１　２９３Ｆ細胞の調製＞＞
　試験例１－２と同様に２９３Ｆ細胞を調製した。
＜＜実施例１－２　２９３Ｆ細胞へのプラスミド導入（トランスフェクション）＞＞
　試験例１－１で調製したｐＲＣ２－ｍｉＲＮＡ１１８５発現用プラスミド（１μｇ／μＬ、３μＬ）、ｐＡＡＶ－Ｖｅｎｕｓ（１μｇ／μＬ、１μＬ）、ｐＨｅｌｐｅｒ（１μｇ／μＬ、２μＬ）、及びＰＥＩ　ＭＡＸ（１μｇ／μＬ、１２μＬ）をＯｐｔｉ－ＭＥＭ中で混合して静置した。プラスミドＤＮＡ－ＰＥＩ混合液を実施例１－１で調製した２９３Ｆ細胞培養液に添加することにより細胞内にプラスミドを導入した。８％ＣＯ２雰囲気下、３７℃のインキュベーター内に入れて、２００ｒｐｍで４時間培養した後に、ＤＭＳＯを用いて５０μＭに調製したノコダゾールを５０μＬ添加し、同様の条件で更に３日間培養した。
　陰性対照として、ｐＲＣ２－ｍｉ３４２をＳｎａＢＩ（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ社）とＳｍａＩ（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ社）で消化して調製した、ｍｉＲＮＡ発現カセットを有さないプラスミドｐＲＣ２も同様にプラスミドを調製して、トランスフェクション及び培養を実施した。
＜＜実施例１－３　ＡＡＶの回収＞＞
　試験例２－３と同様の方法で回収した。
＜＜実施例１－４　ＡＡＶのゲノム力価測定＞＞
　試験例２－４と同様の方法で測定した。
　定量ＰＣＲの結果を図２に示す。
　図２の、ｖｇ／Ｌは培養液量当たりのＶｅｃｔｏｒ　Ｇｅｎｏｍｅ量を示しており、「ｃｏｎｔｒｏｌ」は陰性対照（プラスミドｐＲＣ２）の結果を示している。
　ｐＲＣ２－ｍｉＲＮＡ１１８５発現用プラスミドを用いたときに、陰性対照と比較して、生産性が増加した。
＜実施例２　ＶＰＣｓ２．０細胞を用いたｐＲＣ２－ｍｉＲＮＡ１１８５発現用プラスミドの評価＞
　より生産性が高いとされる、ＶＰＣｓ２．０細胞（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）を用いてｍｉＲＮＡ１１８５によるＡＡＶ生産性の向上を検証した。
＜＜実施例２－１　ＶＰＣｓ２．０細胞の調製＞＞
　ＶＰＣｓ２．０細胞を４ｍＭ　ＧｌｕｔａＭＡＸ（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）を含むＶｉｒａｌ　Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ培地（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）に３×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるように懸濁した。この懸濁液５ｍＬを５０ｍＬフィルターキャップ付遠沈管に播種した。８％ＣＯ２雰囲気下、３７℃のインキュベーター内に入れて、２００ｒｐｍで１時間振盪培養してトランスフェクションに供した。
＜＜実施例２－２　ＶＰＣｓ２．０細胞へのプラスミド導入（トランスフェクション）＞＞
　試験例１－１で調製したｐＲＣ２－ｍｉＲＮＡ１１８５発現用プラスミド（１μｇ／μＬ、５μＬ）、ｐＡＡＶ－Ｖｅｎｕｓ（１μｇ／μＬ、１．２５μＬ）、ｐＨｅｌｐｅｒ（１μｇ／μＬ、１．２５μＬ）、及びＰＥＩ　ＭＡＸ（１μｇ／μＬ、１５μＬ）をＯｐｔｉ－ＭＥＭ中で混合して静置した。プラスミドＤＮＡ－ＰＥＩ混合液を実施例２－１で調製したＶＰＣｓ２．０細胞培養液に添加することにより細胞内にプラスミドを導入した。８％ＣＯ２雰囲気下、３７℃のインキュベーター内に入れて、２００ｒｐｍで４時間培養した後に、ＤＭＳＯを用いて５０μＭに調製したノコダゾールを５０μＬ添加し、同様の条件で更に３日間培養した。
　陰性対照として、ｐＲＣ２－ｍｉ３４２をＳｎａＢＩ（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ社）とＳｍａＩ（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ社）で消化して調製した、ｍｉＲＮＡ発現カセットを有さないプラスミドｐＲＣ２も同様にプラスミドを調製して、トランスフェクション及び培養を実施した。
＜＜実施例２－３　ＡＡＶの回収＞＞
　試験例２－３と同様の方法で回収した。
＜＜実施例２－４　ＡＡＶのゲノム力価測定＞＞
　試験例２－４と同様の方法で測定した。
　定量ＰＣＲの結果を図３に示す。
　図３の、ｖｇ／Ｌは培養液量当たりのＶｅｃｔｏｒ　Ｇｅｎｏｍｅ量を示しており、「ｃｏｎｔｒｏｌ」は陰性対照（プラスミドｐＲＣ２）の結果を示している。
　ＶＰＣｓ２．０細胞を用いたときも２９３Ｆ細胞を用いた時と同様に、陰性対照と比較して、ｐＲＣ２－ｍｉＲＮＡ１１８５発現用プラスミドの効果で生産性が増加した。
＜実施例３　ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を用いたｐＲＣ２－ｍｉＲＮＡ１１８５発現用プラスミドの評価＞
　接着細胞である、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞（ＡＴＣＣ）を用いてｍｉＲＮＡ１１８５によるＡＡＶ生産性の向上を検証した。
＜＜実施例３－１　ＨＥＫ２９３Ｔ細胞の調製＞＞
　ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を、５％ウシ胎児血清（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）、４ｍＭ　ＧｌｕｔａＭＡＸ、及び０．５％ペニシリンストレプトマイシン混合液（ナカライテスク株式会社）を含むＡｄｖａｎｃｅｄ　Ｄ－ＭＥＭ培地（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）に５．３×１０４ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるように懸濁した。この懸濁液１２ｍＬを細胞培養用９ｃｍディッシュ（住友ベークライト株式会社、５７ｃｍ２）に播種し、５％ＣＯ２雰囲気下、３７℃インキュベーターで３日間培養した。
＜＜実施例３－２　ＨＥＫ２９３Ｔ細胞へのプラスミド導入（トランスフェクション）＞＞
　トランスフェクション当日に培養液を除去し、４ｍＭ　ＧｌｕｔａＭＡＸ、及び０．５％ペニシリンストレプトマイシン混合液を含むＡｄｖａｎｃｅｄ　Ｄ－ＭＥＭ培地（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）１９ｍＬに交換した。
　試験例１－１で調製したｐＲＣ２－ｍｉＲＮＡ１１８５発現用プラスミド（１μｇ／μＬ、１６μＬ）、ｐＡＡＶ－Ｖｅｎｕｓ（１μｇ／μＬ、４μＬ）、ｐＨｅｌｐｅｒ（１μｇ／μＬ、４μＬ）、及びＰＥＩ　ＭＡＸ（１μｇ／μＬ、４８μＬ）をＯｐｔｉ－ＭＥＭ中で混合して静置した。プラスミドＤＮＡ－ＰＥＩ混合液を実施例３－１で調製したＨＥＫ２９３Ｔ細胞培養液に添加することにより細胞内にプラスミドを導入した。
　陰性対照として、ｐＲＣ２－ｍｉ３４２をＳｎａＢＩ（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ社）とＳｍａＩ（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ社）で消化して調製した、ｍｉＲＮＡ発現カセットを有さないプラスミドｐＲＣ２も同様にプラスミドを調製して、トランスフェクション及び培養を実施した。
＜＜実施例３－３　ＡＡＶの回収＞＞
　培養したＨＥＫ２９３Ｔ細胞をアキュターゼ（Ｉｎｎｏｖａｔｉｖｅ　Ｃｅｌｌ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）を用いてディッシュから剥離後、遠心し上清と細胞ペレットを分離し、試験例２－３と同様の方法で回収した。
＜＜実施例３－４　ＡＡＶのゲノム力価測定＞＞
　試験例２－４と同様の方法で測定した。
　定量ＰＣＲの結果を図４に示す。
　図４の、ｖｇ／ｄｉｓｈ（９ｃｍ）は９ｃｍディッシュ当たりのＶｅｃｔｏｒ　Ｇｅｎｏｍｅ量を示しており、「ｃｏｎｔｒｏｌ」は陰性対照（プラスミドｐＲＣ２）の結果を示している。
　接着細胞であるＨＥＫ２９３Ｔ細胞を用いたときも浮遊細胞である、２９３Ｆ細胞やＶＰＣｓ２．０細胞を用いた時と同様に、陰性対照と比較して、ｐＲＣ２－ｍｉＲＮＡ１１８５の効果で生産性が増加した。
　本発明の態様としては、例えば、以下のものなどが挙げられる。
　＜１＞　配列番号１に記載の塩基配列からなるＲＮＡに対応するＤＮＡを含むことを特徴とするタンパク質発現増強用核酸である。
　＜２＞　前記＜１＞に記載のタンパク質発現増強用核酸を含むベクターである。
　＜３＞　ウイルスをコードする核酸を含む、前記＜２＞に記載のベクターである。
　＜４＞　前記ウイルスがアデノ随伴ウイルスである、前記＜３＞に記載のベクターである。
　＜５＞　前記＜１＞に記載のタンパク質発現増強用核酸を含む組成物である。
　＜６＞　ウイルスをコードする核酸を含む、前記＜５＞に記載の組成物である。
　＜７＞　前記ウイルスがアデノ随伴ウイルスである、前記＜６＞に記載の組成物である。
　＜８＞　前記＜１＞に記載のタンパク質発現増強用核酸が導入された細胞である。
　＜９＞　配列番号１に記載の塩基配列からなるＲＮＡ又は前記ＲＮＡに対応するＤＮＡを含むタンパク質発現増強用核酸が導入された細胞を培養する工程を含むことを特徴とするタンパク質の製造方法である。
　＜１０＞　配列番号１に記載の塩基配列からなるＲＮＡ又は前記ＲＮＡに対応するＤＮＡを含むタンパク質発現増強用核酸を細胞に導入する工程を含むことを特徴とするタンパク質の発現増強方法である。
　＜１１＞　（ａ）配列番号１に記載の塩基配列からなるＲＮＡ又は前記ＲＮＡに対応するＤＮＡを含む核酸、
　（ｂ）配列番号１に記載の塩基配列からなるＲＮＡ又は前記ＲＮＡに対応するＤＮＡを含む核酸を含むベクター、
　（ｃ）配列番号１に記載の塩基配列からなるＲＮＡ又は前記ＲＮＡに対応するＤＮＡを含む核酸を含む組成物、及び
　（ｄ）配列番号１に記載の塩基配列からなるＲＮＡ又は前記ＲＮＡに対応するＤＮＡを含む核酸が導入された細胞、
のいずれかのタンパク質発現増強のための使用である。
　＜１２＞　前記ベクターが、ウイルスをコードする核酸を含む、前記＜１１＞に記載のベクターのタンパク質発現増強のための使用である。
　＜１３＞　前記ウイルスがアデノ随伴ウイルスである、前記＜１２＞に記載のベクターのタンパク質発現増強のための使用である。
　＜１４＞　前記組成物が、ウイルスをコードする核酸を含む、前記＜１１＞に記載の組成物のタンパク質発現増強のための使用である。
　＜１５＞　前記ウイルスがアデノ随伴ウイルスである、前記＜１４＞に記載の組成物のタンパク質発現増強のための使用である。
　本国際出願は、２０２３年１月６日に出願した日本国特許出願第２０２３－００１００１号に基づく優先権を主張するものであり、日本国特許出願第２０２３－００１００１号の全内容を参照することにより本国際出願に援用する。

Claims (11)

  1. 　配列番号１に記載の塩基配列からなるＲＮＡ又は前記ＲＮＡに対応するＤＮＡを含むことを特徴とするタンパク質発現増強用核酸。
  2. 　請求項１に記載のタンパク質発現増強用核酸を含むベクター。
  3. 　ウイルスをコードする核酸を含む、請求項２に記載のベクター。
  4. 　前記ウイルスがアデノ随伴ウイルスである、請求項３に記載のベクター。
  5. 　請求項１に記載のタンパク質発現増強用核酸を含む組成物。
  6. 　ウイルスをコードする核酸を含む、請求項５に記載の組成物。
  7. 　前記ウイルスがアデノ随伴ウイルスである、請求項６に記載の組成物。
  8. 　請求項１に記載のタンパク質発現増強用核酸が導入された細胞。
  9. 　配列番号１に記載の塩基配列からなるＲＮＡ又は前記ＲＮＡに対応するＤＮＡを含むタンパク質発現増強用核酸が導入された細胞を培養する工程を含むことを特徴とするタンパク質の製造方法。
  10. 　配列番号１に記載の塩基配列からなるＲＮＡ又は前記ＲＮＡに対応するＤＮＡを含むタンパク質発現増強用核酸を細胞に導入する工程を含むことを特徴とするタンパク質の発現増強方法。
  11. 　（ａ）配列番号１に記載の塩基配列からなるＲＮＡ又は前記ＲＮＡに対応するＤＮＡを含む核酸、
    　（ｂ）配列番号１に記載の塩基配列からなるＲＮＡ又は前記ＲＮＡに対応するＤＮＡを含む核酸を含むベクター、
    　（ｃ）配列番号１に記載の塩基配列からなるＲＮＡ又は前記ＲＮＡに対応するＤＮＡを含む核酸を含む組成物、及び
    　（ｄ）配列番号１に記載の塩基配列からなるＲＮＡ又は前記ＲＮＡに対応するＤＮＡを含む核酸が導入された細胞、
    のいずれかのタンパク質発現増強のための使用。
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