WO2024122636A1 - ポリエチレンテレフタレート分解活性を有する蛋白質及びポリエチレンテレフタレートを分解する方法 - Google Patents

ポリエチレンテレフタレート分解活性を有する蛋白質及びポリエチレンテレフタレートを分解する方法 Download PDF

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WO2024122636A1
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amino acid
protein
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acid residue
seq
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隆 松▲崎▼
史 山▲崎▼
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キリンホールディングス株式会社
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/40—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a carboxyl group including Peroxycarboxylic acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/62—Carboxylic acid esters

Definitions

  • the present invention relates to a protein having polyethylene terephthalate decomposition activity, DNA encoding the protein, a transformant obtained by transforming a host cell with the DNA, a method for decomposing polyethylene terephthalate, and a method for producing at least one of terephthalic acid and monohydroxyethyl terephthalate.
  • PET Polyethylene terephthalate
  • mechanical recycling cannot fully remove impurities, so there is a problem that the uses of PET after decomposition are limited.
  • chemical recycling makes it easy to remove impurities because PET can be decomposed and repolymerized on a monomer basis, and it is also attracting attention as a sustainable recycling technology.
  • PET decomposition method using enzymes can be said to be an environmentally friendly recycling method because the reaction proceeds under mild conditions and no organic solvents are used.
  • PETase derived from Ideonella sakaiensis (Patent Document 1) and Cutinase derived from Thermobifida fusca (Patent Document 2) have been discovered as PET decomposition enzymes.
  • LC-Cutinase derived from dead leaf compost metagenome has high decomposition activity and heat resistance (Patent Document 3), and it has been reported that enzyme modification can decompose 97% or more of PET within 24 hours (Non-Patent Document 1).
  • Non-Patent Document 2 In addition, in a report on searching for PET decomposition enzymes from metagenomes, PET2, which has a relatively high heat resistance among enzymes, was found, and it is known that it can decompose PET, albeit in small amounts (Non-Patent Document 2). In addition, there are reports that modification of PET2 improves decomposition activity and heat resistance (Non-Patent Document 3).
  • Patent Documents 1 and 2 have been researched and developed but have not yet been put to practical use. Furthermore, the inventors' investigations have shown that all of them have low decomposition activity and low heat resistance. Furthermore, the inventors' investigations have shown that even when the enzymes described in Patent Document 3 and Non-Patent Documents 1 to 3 are used, it takes a long time to decompose PET through an enzymatic reaction, so there is a need for the development of a PET-degrading enzyme with higher activity for industrial applications.
  • the present invention aims to provide a protein with high PET decomposition activity.
  • a protein having an amino acid sequence in which at least one modification has been introduced in which an amino acid residue at a specific position in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO:1 is replaced with a specific amino acid residue, has a higher PET degradation activity than a protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO:1, and thus completed the present invention.
  • the present invention is as follows. ⁇ 1> A protein consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, wherein at least one modification selected from the group consisting of the following [1] to [7] has been introduced: [1] A modification in which the 103rd amino acid residue is replaced with a lysine residue; [2] A modification in which the 76th amino acid residue is replaced with a cysteine residue; [3] A modification in which the 144th amino acid residue is replaced with a cysteine residue; [4] A modification in which the 134th amino acid residue is replaced with a glycine residue; [5] A modification in which the 222nd amino acid residue is replaced with a methionine residue; [6] A modification in which the 73rd amino acid residue is replaced with a glutamine residue; [7] A modification in which the 203rd amino acid residue is replaced with a threonine residue.
  • PET polyethylene terephthalate
  • ⁇ 4> A DNA encoding the protein according to any one of ⁇ 1> to ⁇ 3>.
  • ⁇ 5> A recombinant DNA comprising the DNA according to ⁇ 4>.
  • ⁇ 6> A transformant obtained by transforming a host cell with the recombinant DNA according to ⁇ 5>.
  • ⁇ 7> A method for decomposing PET, using the protein according to any one of ⁇ 1> to ⁇ 3>.
  • ⁇ 8> A method for decomposing PET according to ⁇ 7>, comprising decomposing PET in a reaction solution containing the protein according to any one of ⁇ 1> to ⁇ 3>, PET, magnesium chloride, and sodium carbonate.
  • ⁇ 9> The method for decomposing PET according to ⁇ 8>, wherein the concentration of magnesium chloride in the reaction solution is 0.1 mM to 5 mM.
  • TPA terephthalic acid
  • MHET monohydroxyethyl terephthalate
  • ⁇ 11> A method for producing at least one of TPA and MHET according to ⁇ 10>, comprising decomposing PET in a reaction solution containing the protein according to any one of ⁇ 1> to ⁇ 3>, PET, magnesium chloride and sodium carbonate.
  • the protein according to one embodiment of the present invention contains amino acid residue substitutions at specific sites, and thus has higher PET degradation activity than a protein that does not have those substitutions.
  • the present invention will be described in detail below, but these are merely examples of preferred embodiments and the present invention is not limited to these contents.
  • the numerical range “to” includes the numerical values before and after it. For example, "0% by mass to 100% by mass” means a range from 0% by mass or more to 100% by mass or less.
  • the protein of one embodiment of the present invention has an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, in which at least one modification selected from the group consisting of the following [1] to [7] has been introduced: [1] A modification in which the 103rd amino acid residue is replaced with a lysine residue; [2] A modification in which the 76th amino acid residue is replaced with a cysteine residue; [3] A modification in which the 144th amino acid residue is replaced with a cysteine residue; [4] A modification in which the 134th amino acid residue is replaced with a glycine residue; [5] A modification in which the 222nd amino acid residue is replaced with a methionine residue; [6] A modification in which the 73rd amino acid residue is replaced with a glutamine residue; [7] A modification in which the 203rd amino acid residue is replaced with a threonine residue.
  • the protein consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO:1 is the PET2 enzyme described in Non-Patent Document 1.
  • at least one modification selected from the group consisting of [1] to [7] into the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 to form a protein at least one of heat resistance and substrate binding ability is improved, and it is believed that the protein will exhibit higher PET decomposition activity than protein (A) having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1.
  • Non-limiting specific examples of the protein of one aspect of the present invention include a protein having an amino acid sequence represented by SEQ ID NO:1 into which any of the following (A1) to (A7) has been introduced: (A1) The above [1] (A2) The above [1] and [2] (A3) The above [1] and [3] (A4) The above [1], [2] and [3] (A5) The above [1], [2], [3] and [4] (A6) The above [1], [2], [3], [4] and [5] (A7) The above [1], [2], [3], [4], [5] and [6] (A8) The above [1], [2], [3], [4], [5], [6] and [7]
  • a non-limiting specific example of the protein of one aspect of the present invention includes a protein consisting of an amino acid sequence represented by SEQ ID NO:1 into which at least the modification [1] has been introduced, and further, optionally, at least one of the modifications [2] to [7] has been introduced.
  • Other non-limiting specific embodiments of the protein of one aspect of the present invention include a protein consisting of an amino acid sequence represented by SEQ ID NO:1 into which at least the modifications [1] and [2] have been introduced, and further, optionally, at least one of the modifications [3] to [7] has been introduced.
  • non-limiting specific embodiments of the protein of one aspect of the present invention include a protein consisting of an amino acid sequence represented by SEQ ID NO:1 into which at least the modifications [1] and [3] have been introduced, and further, optionally, at least one of the modifications [2] and [4] to [7] has been introduced.
  • Other non-limiting specific embodiments of the protein of one aspect of the present invention include a protein consisting of an amino acid sequence represented by SEQ ID NO:1 into which at least the modifications [1], [2], and [3] have been introduced, and further, optionally, at least one of the modifications [4] to [7] has been introduced.
  • non-limiting specific embodiments of the protein of one aspect of the present invention include a protein consisting of an amino acid sequence represented by SEQ ID NO:1 into which at least the modifications [1], [2], [3], and [4] have been introduced, and further, optionally, at least one of the modifications [5] to [7] has been introduced.
  • Other non-limiting specific embodiments of the protein of one aspect of the present invention include a protein consisting of an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 into which at least the modifications [1], [2], [3], [4], and [5] have been introduced, and further, optionally, at least one of the modifications [6] and [7] has been introduced.
  • non-limiting specific embodiments of the protein of one aspect of the present invention include a protein consisting of an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 into which at least the modifications [1], [2], [3], [4], [5] and [6] have been introduced, and further, optionally, the modification [7] has been introduced.
  • Other non-limiting specific embodiments of the protein of one aspect of the present invention include a protein consisting of an amino acid sequence represented by SEQ ID NO:1 into which modifications [1], [2], [3], [4], [5], [6], and [7] have been introduced.
  • One embodiment of the protein of the present invention comprises an amino acid sequence in which at least one modification selected from the group consisting of [1'] to [7'] below has been introduced into the amino acid sequence of mutant protein (B), which has at least one modification consisting of deletion, substitution, insertion, and addition of 1 to 20 amino acid residues relative to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, and has a higher PET degradation activity than the above-mentioned mutant protein (B).
  • [1'] An alteration in which the amino acid residue corresponding to the 103rd amino acid residue of SEQ ID NO:1 is replaced with a lysine residue.
  • a mutant protein refers to a protein obtained by artificially deleting or substituting amino acid residues in a base protein, or by inserting or adding amino acid residues into the base protein.
  • the amino acid modification consisting of at least one of deletion, substitution, insertion, and addition may mean that 1 to 20 amino acids may be modified by at least one of deletion, substitution, insertion, and addition at any position in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO:1.
  • the number of amino acids modified by at least one of deletion, substitution, insertion, and addition is 1 to 20, preferably 1 to 10, more preferably 1 to 8, and most preferably 1 to 5.
  • the amino acids that are modified by at least one of deletion, substitution, insertion, and addition may be natural or non-natural.
  • Natural amino acids include L-alanine, L-asparagine, L-aspartic acid, L-glutamine, L-glutamic acid, glycine, L-histidine, L-isoleucine, L-leucine, L-lysine, L-arginine, L-methionine, L-phenylalanine, L-proline, L-serine, L-threonine, L-tryptophan, L-tyrosine, L-valine, and L-cysteine.
  • amino acids in the same group can be substituted for each other.
  • Group A leucine, isoleucine, norleucine, valine, norvaline, alanine, 2-aminobutanoic acid, methionine, O-methylserine, t-butylglycine, t-butylalanine, cyclohexylalanine
  • Group B aspartic acid, glutamic acid, isoaspartic acid, isoglutamic acid, 2-aminoadipic acid, 2-aminosuberic acid
  • Group C asparagine, glutamine
  • D lysine, arginine, ornithine, 2,4-diaminobutanoic acid, 2,3-diaminopropionic acid
  • Group E proline, 3-hydroxyproline, 4-hydroxyproline
  • Group F serine, threonine, homoserine
  • Group G phenylalanine, tyros
  • a non-limiting specific example of the protein of one aspect of the present invention is a protein having an amino acid sequence in which any of the following (B1) to (B8) has been introduced into the amino acid sequence of mutant protein (B), which has at least one modification consisting of deletion, substitution, insertion, and addition of 1 to 20 amino acid residues relative to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1: (B1) The above [1'] (B2) The above [1'] and [2'] (B3) The above [1'] and [3'] (B4) The above [1'], [2'] and [3'] (B5) The above [1'], [2'], [3'] and [4'] (B6) The above [1'], [2'], [3'], [4'] and [5'] (B7) The above [1'], [2'], [3'], [4'], [5'] and [6'] (B8) The above [1'], [2'], [3'], [4'], [5'] and [6
  • a non-limiting specific embodiment of a protein according to one aspect of the present invention includes a protein having an amino acid sequence in which at least modification [1'] has been introduced into the amino acid sequence of the above-mentioned mutant protein (B), and further, optionally, at least one modification [2'] to [7'] has been introduced.
  • Other non-limiting specific embodiments of the protein of one aspect of the present invention include a protein having an amino acid sequence in which at least modifications [1'] and [2'] have been introduced into the amino acid sequence of the above-mentioned mutant protein (B), and further, optionally, at least one modification [3'] to [7'] has been introduced.
  • non-limiting specific embodiments of the protein of one aspect of the present invention include a protein having an amino acid sequence in which at least modifications [1'] and [3'] have been introduced into the amino acid sequence of the above-mentioned mutant protein (B), and further, optionally, at least one of modifications [2'] and [4'] to [7'] has been introduced.
  • Other non-limiting specific embodiments of the protein of one aspect of the present invention include a protein having an amino acid sequence in which at least modifications [1'], [2'], and [3'] have been introduced into the amino acid sequence of the above-mentioned mutant protein (B), and further, optionally, at least one modification [4'] to [7'] has been introduced.
  • non-limiting specific embodiments of the protein of one aspect of the present invention include a protein having an amino acid sequence in which at least modifications [1'], [2'], [3'] and [4'] have been introduced into the amino acid sequence of the above-mentioned mutant protein (B), and further, optionally, at least one modification [5'] to [7'] has been introduced.
  • Other non-limiting specific embodiments of the protein of one aspect of the present invention include a protein having an amino acid sequence in which at least modifications [1'], [2'], [3'], [4'] and [5'] have been introduced into the amino acid sequence of the above-mentioned mutant protein (B), and further, optionally, at least one modification [6'] and [7'] has been introduced.
  • non-limiting specific embodiments of the protein of one aspect of the present invention include a protein having an amino acid sequence in which at least modifications [1'], [2'], [3'], [4'], [5'] and [6'] have been introduced into the amino acid sequence of the above-mentioned mutant protein (B), and further, optionally, a modification [7'] has been introduced.
  • Other non-limiting specific embodiments of the protein of one aspect of the present invention include a protein having an amino acid sequence in which modifications [1'], [2'], [3'], [4'], [5'], [6'] and [7'] have been introduced into the amino acid sequence of the above-mentioned mutant protein (B).
  • a protein according to one embodiment of the present invention comprises an amino acid sequence in which at least one modification selected from the group consisting of [1′′] to [7′′] below has been introduced into the amino acid sequence of a homologous protein (C) having 80% or more identity to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO:1, and has a higher polyethylene terephthalate (PET) decomposition activity than the homologous protein (C).
  • C homologous protein
  • PET polyethylene terephthalate
  • homologous protein refers to a protein that is similar in structure and function to the original protein.
  • homologous proteins include amino acid sequences that have an identity of 80% or more, preferably 90% or more, and particularly preferably 95% or more, to the amino acid sequence of the target protein.
  • the alignment of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO:1 with the amino acid sequence of a homologous protein can be created using the well-known alignment program ClustalW [Nucelic Acids Research 22, 4673, (1994)].
  • ClustalW is available from http://www.ebi.ac.uk/clustalw/ (European Bioinformatics Institute).
  • ClustalW is available from http://www.ebi.ac.uk/clustalw/ (European Bioinformatics Institute).
  • Non-limiting specific examples of the protein of one aspect of the present invention include a protein having an amino acid sequence in which any of the following (C1) to (C8) has been introduced into the amino acid sequence of a homologous protein (C) having 80% or more identity with the amino acid sequence represented by SEQ ID NO:1: (C1) The above [1 ''] (C2) The above [1′′] and [2′′] (C3) The above [1′′] and [3′′] (C4) The above [1′′], [2′′] and [3′′] (C5) The above [1′′], [2′′], [3′′] and [4′′] (C6) The above [1′′], [2′′], [3′′], [4′′] and [5′′] (C7) The above [1′′], [2′′], [3′′], [4′′], [5′′] and [6′′] (C8) The above [1′′], [2′′], [3′′], [4′′], [5′′], [6′′] and [7′′]
  • a non-limiting specific embodiment of the protein of one aspect of the present invention includes a protein having an amino acid sequence in which at least the modification [1′′] has been introduced into the amino acid sequence of the above-mentioned homologous protein (C), and further, optionally, at least one of the modifications [2′′] to [7′′] has been introduced.
  • Other non-limiting specific embodiments of the protein of one aspect of the present invention include a protein having an amino acid sequence in which at least the modifications [1′′] and [2′′] have been introduced into the amino acid sequence of the above-mentioned homologous protein (C), and further, optionally, at least one of the modifications [3′′] to [7′′] has been introduced.
  • non-limiting specific embodiments of the protein of one aspect of the present invention include a protein having an amino acid sequence in which at least the modifications [1′′] and [3′′] have been introduced into the amino acid sequence of the above-mentioned homologous protein (C), and further, optionally, at least one of the modifications [2′′] and [4′′] to [7′′] has been introduced.
  • Other non-limiting specific embodiments of the protein of one aspect of the present invention include a protein having an amino acid sequence in which at least the modifications [1′′], [2′′], and [3′′] have been introduced into the amino acid sequence of the above-mentioned homologous protein (C), and further, optionally, at least one of the modifications [4′′] to [7′′] has been introduced.
  • non-limiting specific embodiments of the protein of one aspect of the present invention include a protein having an amino acid sequence in which at least the modifications [1′′], [2′′], [3′′] and [4′′] have been introduced into the amino acid sequence of the above-mentioned homologous protein (C), and further, optionally, at least one of the modifications [5′′] to [7′′] has been introduced.
  • non-limiting specific embodiments of the protein of one aspect of the present invention include a protein having an amino acid sequence in which at least the modifications [1′′], [2′′], [3′′], [4′′] and [5′′] have been introduced into the amino acid sequence of the above-mentioned homologous protein (C), and further, optionally, at least one of the modifications [6′′] and [7′′] has been introduced.
  • non-limiting specific embodiments of the protein of one aspect of the present invention include a protein having an amino acid sequence in which at least the modifications [1′′], [2′′], [3′′], [4′′], [5′′] and [6′′] have been introduced into the amino acid sequence of the above-mentioned homologous protein (C), and further, optionally, the modification [7′′] has been introduced.
  • Other non-limiting specific embodiments of the protein of one aspect of the present invention include a protein having an amino acid sequence in which modifications [1′′], [2′′], [3′′], [4′′], [5′′], [6′′] and [7′′] have been introduced into the amino acid sequence of the above-mentioned homologous protein (C).
  • the protein of one embodiment of the present invention can degrade the main chain of PET.
  • the protein of one embodiment of the present invention can degrade bis(2-hydroxyethyl)terephthalate (hereinafter also referred to as "BHET”), an intermediate product of PET degradation, into monohydroxyethyl terephthalate (hereinafter also referred to as "MHET”), and can further degrade MHET into terephthalic acid (hereinafter also referred to as "TPA”) and ethylene glycol (hereinafter also referred to as "EG”).
  • BHET bis(2-hydroxyethyl)terephthalate
  • MHET monohydroxyethyl terephthalate
  • TPA terephthalic acid
  • EG ethylene glycol
  • the protein of one embodiment of the present invention can hydrolyze PET or BHET, a partial structure of PET, as a substrate to produce MHET, and further produce TPA and EG.
  • the PET decomposition activity of a protein can be confirmed, for example, by preparing a reaction solution containing the protein and a PET film fragment, carrying out an enzymatic reaction, and measuring the amounts of TPA and MHET produced after the reaction is completed. If the total amount of TPA and MHET produced from a reaction solution containing the protein of one embodiment of the present invention and a PET film fragment is greater than the total amount of TPA and MHET produced from a reaction solution containing a comparative protein and a PET film fragment, it can be said that the protein of one embodiment of the present invention has a higher PET decomposition activity than the comparative protein.
  • the amounts of TPA and MHET produced can be measured by high performance liquid chromatography (hereinafter also referred to as "HPLC").
  • the protein of one aspect of the present invention is also referred to as the mutant PET2 of this embodiment.
  • DNA An example of the DNA according to one embodiment of the present invention is a DNA encoding the protein according to one embodiment of the present invention described in 1 above.
  • Transformant An example of a transformant transformed with a DNA encoding a protein according to one embodiment of the present invention is a transformant obtained by transforming a host cell by a known method using a recombinant DNA containing the DNA described in 2.
  • the host cell may be any of prokaryotes, yeast, animal cells, insect cells, plant cells, etc., but is preferably a prokaryote such as a bacterium, and more preferably a microorganism belonging to the genera Escherichia, Serratia, Bacillus, Brevibacterium, Corynebacterium, Microbacterium, Pseudomonas, etc.
  • DNA (a) which is a DNA of one embodiment of the present invention, encoding a protein consisting of an amino acid sequence having at least one modification selected from the group consisting of [1] to [7] above in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO:1, can be obtained by the following method.
  • the DNA (a) can be obtained by using a DNA encoding a protein consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO:1, for example, by site-directed mutagenesis described in Molecular Cloning, 3rd Edition and Current Protocols in Molecular Biology, and by substituting a nucleotide sequence encoding an amino acid residue before substitution at least one modification site selected from the group consisting of [1] to [7] described in 1. above, with a nucleotide sequence encoding an amino acid residue after substitution.
  • DNA (b), which is one embodiment of the present invention has an amino acid sequence in which at least one modification selected from the group consisting of [1'] to [7'] has been introduced into the amino acid sequence of mutant protein (B), which has at least one modification consisting of deletion, substitution, insertion, and addition of 1 to 20 amino acid residues relative to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, and encodes a protein having higher PET degradation activity than the mutant protein (B), and can be obtained by the following method.
  • the DNA (b) can be obtained by using a DNA encoding a mutant protein (B) having at least one of the modifications consisting of deletion, substitution, insertion, and addition of 1 to 20 amino acid residues in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, aligning the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 with the mutant protein (B) by the method described in 1. above, and replacing the base sequence of a portion encoding the amino acid residue before substitution with a base sequence encoding the amino acid residue after substitution at at least one modification site selected from the group consisting of [1'] to [7'] described in 1. above in the amino acid sequence of the mutant protein (B) by site-directed mutagenesis.
  • the above DNA (b) can also be obtained by using a DNA encoding a protein consisting of an amino acid sequence in which at least one modification selected from the group consisting of [1] to [7] has been introduced into the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, and introducing mutations into the base sequence of a portion encoding the amino acid residues such that 1 to 20 amino acid residues other than the site of the modification are modified by at least one of deletion, substitution, insertion, and addition.
  • the above DNA (b) can also be obtained by using a DNA encoding a protein consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO:1 and introducing a mutation into the base sequence of a portion encoding the modification site so that at least one modification selected from the group consisting of the above [1'] to [7'] and at least one modification consisting of deletion, substitution, insertion, and addition of 1 to 20 amino acid residues are made at a site other than the modification site.
  • a primer designed so as to introduce the target modification can be used.
  • DNA (c) which is one embodiment of the DNA of the present invention, has an amino acid sequence in which at least one modification selected from the group consisting of [1′′] to [7′′] has been introduced into the amino acid sequence of a homologous protein (C) having 80% or more identity with the amino acid sequence represented by SEQ ID NO:1, and encodes a protein having higher PET degradation activity than the homologous protein (C), and can be obtained by the following method.
  • the DNA (c) can be prepared by aligning the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 with the homologous protein (C) by the method described in 1 above using a DNA encoding the homologous protein (C) having 80% or more identity with the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, and by site-directed mutagenesis, replacing a nucleotide sequence of a portion encoding an amino acid residue before substitution with a nucleotide sequence encoding an amino acid residue after substitution at at least one modification site selected from the group consisting of [1′′] to [7′′] described in 1 above in the amino acid sequence of the homologous protein (C).
  • the DNA (c) can be obtained by introducing an alteration into the base sequence of a portion encoding a site other than the alteration site, using a DNA encoding a protein consisting of an amino acid sequence in which at least one alteration selected from the group consisting of [1] to [7] has been introduced into the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1.
  • the alteration site is designed so that the amino acid sequence other than the at least one alteration site selected from the group consisting of [1] to [7] has 80% or more identity with the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1.
  • the DNA of one embodiment of the present invention can be obtained by using a DNA encoding a protein consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO:1 and introducing at least one modification selected from the group consisting of [1′′] to [7′′] above and modifications into the base sequence of a portion encoding the other parts than the modification.
  • the modification parts are designed so that the amino acid sequence other than the at least one modification part selected from the group consisting of [1′′] to [7′′] above has 80% or more identity with the amino acid sequence represented by SEQ ID NO:1.
  • a primer designed so as to introduce the target modification can be used.
  • Examples of the transformant according to one embodiment of the present invention include a transformant obtained by introducing a recombinant DNA containing the DNA according to one embodiment of the present invention into a host cell, and a transformant obtained by introducing a recombinant DNA obtained by incorporating the DNA according to one embodiment of the present invention into a vector DNA into a host cell.
  • vectors into which the DNA of the present invention can be incorporated include pET28a (Sigma-Aldrich), pBluescriptII KS(+) (Stratagene), pDIRECT [Nucleic Acids Res., 18, 6069 (1990)], pCR-Script Amp SK(+) (Stratagene), pT7Blue (Novagen), pCR II (Invitrogen), pCR-TRAP (Gene Hunter), and pQE-60 (Qiagen).
  • Host cells include microorganisms belonging to the genus Escherichia.
  • microorganisms belonging to the genus Escherichia include, for example, Escherichia coli SHuffle T7 Express Competent, Escherichia coli XL1-Blue, Escherichia coli XL2-Blue, Escherichia coli DH1, Escherichia coli DH5 ⁇ , Escherichia coli MC1000, Escherichia coli ATCC 12435, Escherichia coli W1485, Escherichia coli JM109, Escherichia coli HB101, and Escherichia coli No.
  • Escherichia coli W3110 Escherichia coli NY49, Escherichia coli MP347, Escherichia coli NM522, Escherichia coli BL21, Escherichia coli ME8415, etc.
  • Any method for introducing recombinant DNA into the host cells can be used, such as the calcium ion method [Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 69, 2110 (1972)], the protoplast method (JP Patent Publication 63-248394), and the electroporation method [Nucleic Acids Res., 16, 6127 (1988)].
  • Method for Producing a Protein of an Embodiment of the Present Invention (1) Production of a Transformant Producing a Protein of an Embodiment of the Present Invention Based on the DNA of an embodiment of the present invention, a DNA fragment of an appropriate length containing a portion encoding the protein of an embodiment of the present invention is prepared as necessary. In addition, by substituting bases in the base sequence of the portion encoding the protein so that it has optimal codons for expression in the host, a transformant with improved production efficiency of the protein can be obtained.
  • the recombinant DNA can be introduced into a host cell compatible with the expression vector to obtain a transformant that produces the protein of one embodiment of the present invention.
  • a host cell any cell capable of expressing the target gene can be used, including bacteria, yeast, animal cells, insect cells, plant cells, and the like.
  • the expression vector used is one which is capable of autonomous replication in the above-mentioned host cells or can be integrated into a chromosome and contains a promoter at a position where the DNA of the present invention can be transcribed.
  • the recombinant DNA having the DNA of the present invention is preferably capable of autonomously replicating in the prokaryote and is composed of a promoter, a ribosome binding sequence, the DNA of the present invention, and a transcription termination sequence, and may also contain a gene that controls the promoter.
  • Expression vectors include pET28a (Sigma-Aldrich), pColdI (Takara Bio), pCDF-1b, pRSF-1b (both Novagen), pMAL-c2x (New England Biolabs), pGEX-4T-1 (GE Healthcare Biosciences), pTrcHis (Invitrogen), pSE280 (Invitrogen), pGEMEX-1 (Promega), pQE-30 (Qiagen), and pQE-60 ( Qiagen), pET-3 (Novagen), pKYP10 (JP Patent Publication 58-110600), pKYP200 [Agric. Biol.
  • the promoter may be any promoter that functions in a host cell such as E. coli.
  • Examples include promoters derived from E. coli or phages, such as the trp promoter (Ptrp), lac promoter (Plac), PL promoter, PR promoter, and PSE promoter, as well as the SPO1 promoter, SPO2 promoter, and penP promoter.
  • artificially designed and modified promoters such as a promoter with two Ptrp promoters in series (Ptrp x 2), the tac promoter, the lacT7 promoter, and the let I promoter can also be used.
  • a transcription termination sequence is not necessarily required for the expression of the DNA of one embodiment of the present invention, but in recombinant DNA, it is preferable to place a transcription termination sequence immediately downstream of the structural gene.
  • Prokaryotes include microorganisms belonging to the genera Escherichia, Serratia, Bacillus, Brevibacterium, Corynebacterium, Microbacterium, and Pseudomonas, such as Escherichia coli SHuffle T7 Expr.
  • Escherichia coli XL1-Blue Escherichia coli XL2-Blue
  • Escherichia coli DH1 Escherichia coli DH5 ⁇
  • Escherichia coli NM522 Escherichia coli MC1000, Escherichia coli KY3276, Escherichia coli W1485, Escherichia coli JM109, Escherichia coli HB101, Escherichia coli No.
  • the microorganism belongs to the genus Escherichia or Corynebacterium, more preferably Escherichia coli XL1-Blue, Escherichia coli XL2-Blue, Escherichia coli DH1, Escherichia coli DH5 ⁇ , Escherichia coli MC1000, Escherichia coli MM294, Escherichia coli W1485, Escherichia coli JM109, Escherichia coli HB101, Escherichia coli No.
  • Any method for introducing a recombinant vector can be used so long as it is a method for introducing DNA into the host cells, such as the method using calcium ions [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 69, 2110 (1972)], the protoplast method (JP Patent Publication Nos. 57-186492 and 57-18649), the electroporation method [e.g., Journal of Bacteriology, 175, 4096 (1993); Appl. Microbiol. Biotechnol., 52, 541 (1999)], and the methods described in Gene, 17, 107 (1982) and Molecular & General Genetics, 168, 111 (1979).
  • YEp13 ATCC37115
  • YEp24 ATCC37051
  • YCp50 ATCC37419
  • pHS19 pHS15, etc.
  • Any promoter may be used as long as it functions in a yeast strain, and examples of such promoters include the PHO5 promoter, the PGK promoter, the GAP promoter, the ADH promoter, the gal 1 promoter, the gal 10 promoter, the heat shock polypeptide promoter, the MF ⁇ 1 promoter, and the CUP 1 promoter.
  • Host cells include yeast strains belonging to the genera Saccharomyces, Schizosaccharomyces, Kluyveromyces, Trichosporon, Siwanniomyces, Pichia, Candida, etc., and more specifically, examples thereof include Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces pombe, Kluyveromyces lactis, Trichosporon pullulans, Schwanniomyces alluvius, Pichia pastoris, Candida utilis, etc.
  • Any method for introducing recombinant DNA into yeast can be used, such as electroporation (Methods Enzymol., 194, 182 (1990)), the spheroplast method (Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 81, 4889 (1984)), and the lithium acetate method (J. Bacteriol., 153, 163 (1983)).
  • the host for the transformant for producing the protein of one embodiment of the present invention may be any of prokaryotes, yeast, animal cells, insect cells, plant cells, etc., but is preferably a prokaryote such as a bacterium, and more preferably a microorganism belonging to the genera Escherichia, Serratia, Bacillus, Brevibacterium, Corynebacterium, Microbacterium, Pseudomonas, etc.
  • the above transformant can be cultured in a medium according to a conventional method used for culturing a host.
  • a medium for culturing a transformant obtained using a prokaryote such as Escherichia coli or a eukaryote such as yeast as a host either a natural medium or a synthetic medium may be used as long as it contains a carbon source, a nitrogen source, inorganic salts, etc. that can be assimilated by the organism and allows efficient cultivation of the transformant.
  • the carbon source may be any that can be assimilated by the organism, and examples of the carbon source that can be used include carbohydrates such as glucose, fructose, sucrose, molasses containing these, starch or starch hydrolysates, organic acids such as acetic acid and propionic acid, and alcohols such as ethanol and propanol.
  • carbohydrates such as glucose, fructose, sucrose, molasses containing these, starch or starch hydrolysates, organic acids such as acetic acid and propionic acid, and alcohols such as ethanol and propanol.
  • nitrogen sources examples include ammonia, ammonium salts of inorganic or organic acids such as ammonium chloride, ammonium sulfate, ammonium acetate, and ammonium phosphate, other nitrogen-containing compounds, as well as peptone, meat extract, yeast extract, corn steep liquor, casein hydrolysate, soybean meal and soybean meal hydrolysate, various fermentation bacteria, and digested products thereof.
  • ammonia ammonium salts of inorganic or organic acids such as ammonium chloride, ammonium sulfate, ammonium acetate, and ammonium phosphate
  • other nitrogen-containing compounds as well as peptone, meat extract, yeast extract, corn steep liquor, casein hydrolysate, soybean meal and soybean meal hydrolysate, various fermentation bacteria, and digested products thereof.
  • Inorganic salts that can be used include potassium dihydrogen phosphate, potassium dihydrogen phosphate, magnesium phosphate, magnesium sulfate, sodium chloride, ferrous sulfate, manganese sulfate, copper sulfate, calcium carbonate, etc.
  • Cultivation is usually carried out under aerobic conditions such as shaking culture or deep aeration agitation culture.
  • the culture temperature is preferably 15 to 40°C, and the culture time is usually 5 hours to 7 days.
  • the pH during cultivation is maintained at 3.0 to 11.
  • the pH is adjusted using inorganic or organic acids, alkaline solutions, urea, calcium carbonate, ammonia, etc.
  • antibiotics such as kanamycin, ampicillin, tetracycline, etc. may be added to the medium, if necessary.
  • an inducer may be added to the medium as necessary.
  • isopropyl- ⁇ -D-thiogalactopyranoside or the like may be added to the medium when culturing a microorganism transformed with an expression vector using a lac promoter, and indoleacrylic acid or the like may be added to the medium when culturing a microorganism transformed with an expression vector using a trp promoter.
  • the protein can be produced within a host cell, secreted outside the host cell, or produced on the outer membrane of the host cell.
  • the structure of the protein produced can be altered depending on the method selected.
  • a protein according to one embodiment of the present invention When a protein according to one embodiment of the present invention is produced inside a host cell or on the outer membrane of the host cell, the protein can be actively secreted outside the host cell by applying, mutatis mutandis, the method of Paulson et al. [J. Biol. Chem., 264, 17619 (1989)], the method of Rowe et al. [Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 86, 8227 (1989), Genes Develop., 4, 1288 (1990)], or the methods described in Japanese Patent Application Laid-Open No. 05-336963 and International Publication No. 94/23021, etc.
  • the protein can be actively secreted outside the host cell. Furthermore, the production amount can be increased by utilizing a gene amplification system using a dihydrofolate reductase gene or the like, according to the method described in Japanese Patent Application Laid-Open No. 2-227075.
  • a purified preparation can be obtained by using, alone or in combination, a conventional enzyme isolation and purification method, i.e., solvent extraction, salting out with ammonium sulfate or the like, desalting, precipitation with an organic solvent, anion exchange chromatography using resins such as diethylaminoethyl (DEAE)-Sepharose, DIAION (registered trademark) HPA-75 (manufactured by Mitsubishi Chemical Corporation), cation exchange chromatography using resins such as S-Sepharose FF (manufactured by Amersham Biosciences), hydrophobic chromatography using resins such as butyl Sepharose and phenyl Sepharose, gel filtration using molecular sieves, affinity chromatography, chromatofocusing, electrophoresis such as isoelectric focusing, and the like.
  • a conventional enzyme isolation and purification method i.e., solvent extraction, salting out with ammonium sulfate or the like, desalting
  • the cells are similarly recovered, disrupted, and centrifuged to recover the insoluble protein as a precipitate fraction.
  • the recovered insoluble protein is solubilized with a protein denaturant.
  • the solubilized solution is diluted or dialyzed to reduce the concentration of the protein denaturant in the solubilized solution, thereby returning the protein to its normal three-dimensional structure.
  • a purified sample of the protein can be obtained by the same isolation and purification method as above.
  • the protein or the derivative can be recovered from the culture supernatant. That is, the culture can be treated by a method such as centrifugation similar to that described above to obtain a culture supernatant, and a purified specimen can be obtained from the culture supernatant by the same isolation and purification method as described above.
  • the protein of one embodiment of the present invention may be produced as a fusion protein with another protein, and purified by affinity chromatography using a substance having affinity for the fusion protein.
  • the protein of one embodiment of the present invention may be produced as a fusion protein with protein A, and purified by affinity chromatography using immunoglobulin G, in accordance with the methods described in Lowe et al. [Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 86, 8227 (1989), Genes Develop., 4, 1288 (1990)], JP-A-5-336963, and WO 94/23021.
  • the protein of one embodiment of the present invention can be produced as a fusion protein with Flag peptide and purified by affinity chromatography using anti-Flag antibody [Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 86, 8227 (1989), Genes Develop., 4, 1288 (1990)], or produced as a fusion protein with polyhistidine and purified by affinity chromatography using a metal coordination resin that has high affinity for polyhistidine. Furthermore, it can be purified by affinity chromatography using an antibody against the protein itself.
  • the protein of one embodiment of the present invention can be produced by chemical synthesis methods such as the Fmoc method (fluorenylmethyloxycarbonyl method) and the tBoc method (t-butyloxycarbonyl method).
  • chemical synthesis can also be performed using peptide synthesizers manufactured by Advanced ChemTech, PerkinElmer, Pharmacia, Protein Technology Instrument, Synthecell-Vega, Applied Biosystems, Shimadzu Corporation, etc.
  • Method for Degrading PET An example of a method for degrading PET according to an embodiment of the present invention is a method using the protein according to an embodiment of the present invention.
  • the method for degrading PET according to an embodiment of the present invention preferably includes, but is not limited to, degrading PET in a reaction solution containing the protein according to an embodiment of the present invention, PET, magnesium chloride, and sodium carbonate.
  • the concentration of the protein of one embodiment of the present invention in the reaction solution when decomposing PET is preferably 1 to 100 ⁇ g/mL, more preferably 5 to 20 ⁇ g/mL, from the viewpoint of the efficiency of PET decomposition, but is not limited to this concentration and can be set appropriately depending on the amount of PET to be decomposed, etc.
  • the concentration of magnesium chloride in the reaction solution when decomposing PET is preferably 0.05 to 10 mM, and more preferably 0.1 to 5 mM.
  • Magnesium chloride contributes to the stabilization of the protein mentioned in 1 above, and when it is 0.05 mM or more, it has the advantage of enhancing the heat resistance of the protein, and when it is 10 mM or less, it has the advantage that the binding ability of the protein to the substrate is less likely to decrease.
  • the reaction temperature is preferably 40 to 70°C, more preferably 55 to 65°C, from the viewpoint of the heat resistance or PET decomposition activity of the protein described in 1 above.
  • the pH during the reaction is preferably 6 to 11, more preferably 8.5 to 9.5, from the viewpoint of the PET decomposition activity of the protein described in 1 above.
  • the reaction time can be set appropriately depending on the amount of PET to be decomposed, and is preferably 12 to 48 hours. If the treatment is carried out over a long period of time, the protein described above in 1 may be added periodically.
  • PET When decomposing PET using a protein according to one embodiment of the present invention, there is no limitation on the form of the PET to be decomposed, and examples of such forms include fibrous, granular, flake, pellet, film, block, and bottle forms. Mixtures of these can also be used.
  • Waste materials such as PET bottles can be treated using the protein of one embodiment of the present invention.
  • PET can be decomposed using the protein of one embodiment of the present invention, and the decomposition products can be used for recycling.
  • the protein of one embodiment of the present invention can also be used to modify the surface of PET processed products such as PET films, modify the surface of PET fibers, wash clothes made of PET fibers, wash PET resin to be recycled, etc.
  • the method for producing at least one of TPA and MHET according to one embodiment of the present invention includes a method comprising decomposing PET using the protein according to one embodiment of the present invention.
  • the method for producing at least one of TPA and MHET according to one embodiment of the present invention preferably comprises decomposing PET in a reaction solution containing the protein according to one embodiment of the present invention, PET, magnesium chloride, and sodium carbonate, but is not limited thereto.
  • the protein of one embodiment of the present invention can degrade the main chain of PET.
  • the protein of one embodiment of the present invention can degrade BHET, an intermediate product of PET degradation, into MHET, and can further degrade MHET into TPA and EG.
  • the protein of one embodiment of the present invention can hydrolyze PET or BHET, a partial structure of PET, as a substrate to produce MHET, and further produce TPA and EG.
  • the concentration of the protein in the reaction solution according to one embodiment of the present invention, the concentration of magnesium chloride in the reaction solution when decomposing PET, the reaction temperature, the pH during the reaction, the reaction time, and the form of the decomposed PET are as described in 7. above.
  • Example 1 Construction of mutant PET2 expression strain (1) Construction of wild-type PET2 expression plasmid Using DNA (SEQ ID NO: 2) consisting of the base sequence of a gene encoding the amino acid sequence (SEQ ID NO: 1) of wild-type PET2 described in Non-Patent Document 2 as a template, PCR was performed using DNA consisting of the base sequences represented by SEQ ID NOs: 5 and 6 as a primer set to obtain a DNA fragment of PET2. The DNA represented by SEQ ID NO: 2 was prepared by artificial synthesis.
  • the wild-type PET2 DNA fragment obtained above and the expression vector pET28a (Sigma-Aldrich) were ligated using In-Fusion HD Cloning Kit (Takara Bio Inc.) to obtain a wild-type PET2 expression plasmid pET28a-PET2.
  • PCR was performed using the pET28a-L103K obtained above as a template and DNA consisting of the base sequences represented by SEQ ID NOs: 9 and 10 as a primer set to produce an expression plasmid pET28a-L103K/G76C for the mutant PET2 of this embodiment, in which the 103rd L-leucine residue in the amino acid sequence of PET2 was replaced with an L-lysine residue and the 76th L-glycine residue was replaced with an L-cysteine residue.
  • the plasmid obtained in the previous step was used as a template, and PCR was performed using DNAs consisting of base sequences corresponding to each of the sequence numbers shown in Table 1 as a primer set to sequentially prepare expression plasmids for mutant PET2 according to this embodiment in which mutations were added to the amino acid sequence of PET2.
  • Table 1 shows each added mutation point and the sequence number of the corresponding primer set.
  • mutant PET2 expression plasmid according to this embodiment-2
  • mutant PET2 expression plasmid pET28a-L103K/G76C/A144C/Q134G/A222M
  • SEQ ID NOs: 5 and 6 DNA consisting of the base sequences represented by SEQ ID NOs: 5 and 6 as a primer set
  • error-prone PCR was performed using Diversify PCR Random Mutagenesis Kit (manufactured by Takara Bio Inc.).
  • a DNA fragment of mutant PET2 according to this embodiment to which a new mutation point L73Q the 73rd L-leucine residue is replaced with an L-glutamine residue
  • the resulting DNA fragment was linked to the expression vector pET28a using the In-Fusion HD Cloning Kit to produce an expression plasmid for the mutant PET2 of this embodiment, which contains the following mutations in the amino acid sequence of PET2: L103K, G76C, A144C, Q134G, A222M, and L73Q.
  • the obtained DNA fragment was linked to the expression vector pET28a to prepare an expression plasmid of mutant PET2 according to this embodiment with the mutations L103K, G76C, A144C, Q134G, A222M, L73Q, and I203T added to the amino acid sequence of PET2.
  • an expression plasmid pET28a-N257D of a comparative mutant PET2 in which the 257th L-asparagine residue in the amino acid sequence of PET2 represented by SEQ ID NO: 1 was replaced with an L-aspartic acid residue was prepared.
  • an expression plasmid pET28a-L103D of a comparative mutant PET2 in which the 103rd L-leucine residue in the amino acid sequence of PET2 represented by SEQ ID NO: 1 was replaced with an L-aspartic acid residue was prepared.
  • Example 2 Evaluation of each mutation point based on measurement of PET decomposition activity of various PET2 purified enzymes (1) Acquisition of various PET2 purified enzymes A total of 12 transformants obtained in Example 1 (5) were cultured on an LB plate at 30 ° C. for 24 hours, inoculated into a large test tube containing 5 mL of LB medium containing 100 mg / L of kanamycin, and cultured with shaking at 30 ° C. for 20 hours. Then, 0.6 mL of the resulting culture was transferred to a flask containing 30 mL of LB medium containing 100 mg / L of kanamycin, and cultured with shaking at 37 ° C.
  • IPTG isopropyl- ⁇ -D-thiogalactopyranoside
  • PET decomposition activity of various PET2 purified enzymes was measured by the following enzyme reaction, and the effects of introducing each mutation were compared.
  • a reaction solution 0.5 mL
  • the concentration of TPA and MHET produced by the enzyme reaction and the total value of these (hereinafter referred to as the decomposition amount) are increased compared to the purified enzyme of the wild-type PET2 and the purified enzyme of the comparative mutant PET2, and it was shown that the introduction of the mutation improved the PET decomposition activity.
  • the purified enzyme into which the mutation L73Q was introduced had a decomposition amount increased by 6.7 mM compared to the purified enzyme without the mutation, indicating that the mutation greatly contributes to the improvement of the PET decomposition activity.
  • the purified enzyme into which the mutation Q134G was introduced had a decomposition amount increased by 5.7 mM compared to the purified enzyme without the mutation, indicating that the mutation greatly contributes to the improvement of the PET decomposition activity.
  • the decomposition amount of the mutation A144C was increased by 2.5 mM by introducing it in combination with the mutation G76C, indicating that the combination of the mutations A144C and G76C greatly contributes to the improvement of the PET decomposition activity.
  • the amount of decomposition was greater when the magnesium chloride concentration in the reaction solution was 1 mM than when it was 10 mM, indicating that this is a suitable concentration for the decomposition of PET by the mutant PET2 according to this embodiment.
  • Example 3 Comparison of PET degradation activity between previously reported mutant PET2 and mutant PET2 according to the present embodiment
  • DNA SEQ ID NO: 4 consisting of the base sequence of a gene encoding mutant PET2 (SEQ ID NO: 3) (hereinafter referred to as PET2s) described in Non-Patent Document 3 was used as a template, and PCR was performed using DNA consisting of the base sequences represented by SEQ ID NOs: 23 and 24 as a primer set to obtain a DNA fragment of PET2s.
  • the DNA represented by SEQ ID NO: 4 was prepared by artificial synthesis.
  • the above-obtained DNA fragment of PET2s and the expression vector pET28a were ligated using In-Fusion HD Cloning Kit to obtain the expression plasmid pET28a-PET2s of PET2s.
  • the culture solution was centrifuged to remove the supernatant, and the bacterial cells were collected.
  • a crude protein extract was obtained from the obtained bacterial cells by a standard method, and a PET2s enzyme solution was recovered from the extract using TALON (registered trademark) Metal Affinity Resin (manufactured by Takara Bio Inc.).
  • the enzyme solution was diluted with 100 mM sodium carbonate buffer (pH 9.2) and concentrated and desalted using Amicon (registered trademark) Ultra- (manufactured by Merck Millipore) to obtain a purified PET2s enzyme.
  • PET decomposition activity of the PET2s purified enzyme and the four mutant PET2 purified enzymes according to this embodiment obtained in Example 1 was measured by the following enzyme reaction.
  • a reaction solution of 0.5 mL consisting of 5 ⁇ g of each purified enzyme, 100 mM sodium carbonate buffer (pH 9.2), 10 mM magnesium chloride, and 0.01 g of PET film fragments was prepared, and the enzyme reaction was carried out at 60 ° C. for 24 hours. After the reaction was completed, the TPA and MHET produced by PET decomposition were analyzed by HPLC.
  • the mutation points of various PET2 purified enzymes, the concentrations (mM) of TPA and MHET produced by the enzymatic reaction of each purified enzyme, and the total value (mM) of these (decomposition amount) are shown in Table 4.
  • the purified enzyme of the mutant PET2 according to the present embodiment having the mutations L103K, G76C, A144C, and Q134G introduced the purified enzyme of the mutant PET2 according to the present embodiment having the mutations L103K, G76C, A144C, Q134G, and A222M introduced
  • the protein according to one embodiment of the present invention contains amino acid residue substitutions at specific sites, and thus has higher PET degradation activity than a protein that does not have those substitutions.
  • SEQ ID NO: 1 Amino acid sequence of PET2 SEQ ID NO: 2: Nucleotide sequence of PET2 SEQ ID NO: 3: Amino acid sequence of PET2s SEQ ID NO: 4: Nucleotide sequence of PET2s SEQ ID NO: 5: Nucleotide sequence of primer Fw for amplifying PET2 fragment SEQ ID NO: 6: Nucleotide sequence of primer Rv for amplifying PET2 fragment SEQ ID NO: 7: Nucleotide sequence of primer Fw for amplifying L103K fragment SEQ ID NO: 8: Nucleotide sequence of primer Rv for amplifying L103K fragment SEQ ID NO: 9: Nucleotide sequence of primer Fw for amplifying G76C fragment SEQ ID NO: 10: Nucleotide sequence of primer Rv for amplifying G76C fragment SEQ ID NO: 11: Nucleotide sequence of primer Fw for amplifying A144C fragment SEQ ID NO: 12: Nucleotide sequence of primer Rv for

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Abstract

本発明は、配列番号１で表されるアミノ酸配列において、以下の［１］～［７］からなる群より選ばれる少なくとも１の改変が導入されたアミノ酸配列からなる蛋白質等に関する。 ［１］１０３番目のアミノ酸残基をリジン残基に置換する改変、 ［２］７６番目のアミノ酸残基をシステイン残基に置換する改変、 ［３］１４４番目のアミノ酸残基をシステイン残基に置換する改変、 ［４］１３４番目のアミノ酸残基をグリシン残基に置換する改変、 ［５］２２２番目のアミノ酸残基をメチオニン残基に置換する改変、 ［６］７３番目のアミノ酸残基をグルタミン残基に置換する改変、 ［７］２０３番目のアミノ酸残基をスレオニン残基に置換する改変。

Description

ポリエチレンテレフタレート分解活性を有する蛋白質及びポリエチレンテレフタレートを分解する方法
　本発明は、ポリエチレンテレフタレート分解活性を有する蛋白質、該蛋白質をコードするＤＮＡ、該ＤＮＡで宿主細胞を形質転換して得られる形質転換体、ポリエチレンテレフタレートを分解する方法、並びにテレフタル酸及びモノヒドロキシエチルテレフタレートの少なくとも一方を製造する方法に関する。
　ポリエチレンテレフタレート（以下、「ＰＥＴ」とも称する。）は飲料ボトル・繊維・包装材など多岐に利用されているが、環境中で分解されないことで環境汚染の問題が存在することから、ＰＥＴのリサイクル技術が求められている。ＰＥＴリサイクル技術の内、メカニカルリサイクルでは不純物を十分に取り除けないため、分解後のＰＥＴの用途が限られるとの問題がある。一方、ケミカルリサイクルでは、モノマー単位でＰＥＴを分解及び再重合できるため不純物の除去が容易であり、また、持続的可能なリサイクル技術として注目されている。
　ケミカルリサイクルのうち、酵素を用いたＰＥＴ分解法は温和な条件で反応が進行する点及び有機溶媒を使用しない点等から環境調和型のリサイクル法と言える。ＰＥＴ分解酵素としては、Ｉｄｅｏｎｅｌｌａ　ｓａｋａｉｅｎｓｉｓ由来ＰＥＴａｓｅ（特許文献１）、Ｔｈｅｒｍｏｂｉｆｉｄａ　ｆｕｓｃａ由来Ｃｕｔｉｎａｓｅ（特許文献２）等が発見されている。また、枯葉コンポストメタゲノム由来ＬＣ－Ｃｕｔｉｎａｓｅは高い分解活性と耐熱性を有しており（特許文献３）、酵素改変により２４時間以内に９７％以上のＰＥＴを分解できることが報告された（非特許文献１）。また、メタゲノムからＰＥＴ分解酵素を探索した報告において、酵素の中では比較的高い熱耐性を有するＰＥＴ２が見いだされており、微量ながらＰＥＴを分解可能なことも知られている（非特許文献２）。さらに、ＰＥＴ２の改変により分解活性・熱耐性が向上するという報告も存在する（非特許文献３）。
国際公開第２０１５／０２５８６１号 日本国特許第６３１５９７８号公報 国際公開第２０１２／０９９０１８号
Nature, 2020, 580, 9, p.216-219 Appl. Environ. Microbiol, 2018, 84, 8, p.e02773-17 ACS Catal. 2021, 11, p.8550-8564
　特許文献１及び２に記載のＰＥＴ分解酵素は、研究開発が行われているものの実用化には至っておらず、また、本発明者らが検討したところ、いずれも分解活性や熱耐性が低い。また、本発明者らが検討したところ、特許文献３及び非特許文献１～３に記載の酵素を用いたとしても、酵素反応によるＰＥＴ分解に長時間を要することから、産業応用においてはより高い活性を有するＰＥＴ分解酵素の開発が望まれている。
　したがって、本発明は、高いＰＥＴ分解活性を有する蛋白質の提供を目的とする。
　本発明者らは、上記課題について鋭意検討した結果、配列番号１で表されるアミノ酸配列において、配列番号１の特定箇所のアミノ酸残基を特定のアミノ酸残基に置換する、少なくとも１の改変が導入されたアミノ酸配列からなる蛋白質が、配列番号１で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質に比べて高いＰＥＴ分解活性を有することを見出し、本発明を完成させた。
　すなわち、本発明は以下の通りである。
＜１＞　配列番号１で表されるアミノ酸配列において、以下の［１］～［７］からなる群より選ばれる少なくとも１の改変が導入されたアミノ酸配列からなる蛋白質。
［１］１０３番目のアミノ酸残基をリジン残基に置換する改変
［２］７６番目のアミノ酸残基をシステイン残基に置換する改変
［３］１４４番目のアミノ酸残基をシステイン残基に置換する改変
［４］１３４番目のアミノ酸残基をグリシン残基に置換する改変
［５］２２２番目のアミノ酸残基をメチオニン残基に置換する改変
［６］７３番目のアミノ酸残基をグルタミン残基に置換する改変
［７］２０３番目のアミノ酸残基をスレオニン残基に置換する改変
＜２＞　配列番号１で表されるアミノ酸配列に対して１～２０個のアミノ酸残基が欠失、置換、挿入及び付加の少なくとも１からなる改変を有する変異蛋白質（Ｂ）のアミノ酸配列において、以下の［１´］～［７´］からなる群より選ばれる少なくとも１の改変が導入されたアミノ酸配列からなり、前記変異蛋白質（Ｂ）に比べて高いポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）分解活性を有する蛋白質。
［１´］配列番号１の１０３番目のアミノ酸残基に対応するアミノ酸残基をリジン残基に置換する改変
［２´］配列番号１の７６番目のアミノ酸残基に対応するアミノ酸残基をシステイン残基に置換する改変
［３´］配列番号１の１４４番目のアミノ酸残基に対応するアミノ酸残基をシステイン残基に置換する改変
［４´］配列番号１の１３４番目のアミノ酸残基に対応するアミノ酸残基をグリシン残基に置換する改変
［５´］配列番号１の２２２番目のアミノ酸残基に対応するアミノ酸残基をメチオニン残基に置換する改変
［６´］配列番号１の７３番目のアミノ酸残基に対応するアミノ酸残基をグルタミン残基に置換する改変
［７´］配列番号１の２０３番目のアミノ酸残基に対応するアミノ酸残基をスレオニン残基に置換する改変
＜３＞　配列番号１で表されるアミノ酸配列と８０％以上の同一性を有する相同蛋白質（Ｃ）のアミノ酸配列において、以下の［１´´］～［７´´］からなる群より選ばれる少なくとも１の改変が導入されたアミノ酸配列からなり、前記相同蛋白質（Ｃ）に比べて高いポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）分解活性を有する蛋白質。
［１´´］配列番号１の１０３番目のアミノ酸残基に対応するアミノ酸残基をリジン残基に置換する改変
［２´´］配列番号１の７６番目のアミノ酸残基に対応するアミノ酸残基をシステイン残基に置換する改変
［３´´］配列番号１の１４４番目のアミノ酸残基に対応するアミノ酸残基をシステイン残基に置換する改変
［４´´］配列番号１の１３４番目のアミノ酸残基に対応するアミノ酸残基をグリシン残基に置換する改変
［５´´］配列番号１の２２２番目のアミノ酸残基に対応するアミノ酸残基をメチオニン残基に置換する改変
［６´´］配列番号１の７３番目のアミノ酸残基に対応するアミノ酸残基をグルタミン残基に置換する改変
［７´´］配列番号１の２０３番目のアミノ酸残基に対応するアミノ酸残基をスレオニン残基に置換する改変
＜４＞　＜１＞～＜３＞のいずれか１に記載の蛋白質をコードするＤＮＡ。
＜５＞　＜４＞に記載のＤＮＡを含有する組換え体ＤＮＡ。
＜６＞　＜５＞に記載の組換え体ＤＮＡで宿主細胞を形質転換して得られる形質転換体。
＜７＞　＜１＞～＜３＞のいずれか１に記載の蛋白質を用いて、ＰＥＴを分解する方法。
＜８＞　＜１＞～＜３＞のいずれか１に記載の蛋白質、ＰＥＴ、塩化マグネシウム及び炭酸ナトリウムを含む反応液中でＰＥＴを分解することを含む、＜７＞に記載のＰＥＴを分解する方法。
＜９＞　前記反応液中の塩化マグネシウムの濃度が０．１ｍＭ～５ｍＭである、＜８＞に記載のＰＥＴを分解する方法。
＜１０＞　＜１＞～＜３＞のいずれか１に記載の蛋白質を用いてＰＥＴを分解することを含む、テレフタル酸（ＴＰＡ）及びモノヒドロキシエチルテレフタレート（ＭＨＥＴ）の少なくとも一方を製造する方法。
＜１１＞　＜１＞～＜３＞のいずれか１に記載の蛋白質、ＰＥＴ、塩化マグネシウム及び炭酸ナトリウムを含む反応液中でＰＥＴを分解することを含む、＜１０＞に記載のＴＰＡ及びＭＨＥＴの少なくとも一方を製造する方法。
＜１２＞　前記反応液中の塩化マグネシウムの濃度が０．１ｍＭ～５ｍＭである、＜１１＞に記載のＴＰＡ及びＭＨＥＴの少なくとも一方を製造する方法。
　本発明の一態様に係る蛋白質は、特定箇所のアミノ酸残基置換を含むことで、その置換を有さない蛋白質に比べて高いＰＥＴ分解活性を有する。
　以下、本発明について詳細に説明するが、これらは望ましい実施態様の一例を示すものであり、これらの内容に特定されるものではない。
　数値範囲の「～」は、その前後の数値を含む範囲であり、例えば、「０質量％～１００質量％」は、０質量％以上であり、かつ、１００質量％以下である範囲を意味する。
１．ＰＥＴ分解活性を有する蛋白質
　本発明の一態様の蛋白質は、配列番号１で表されるアミノ酸配列において、以下の［１］～［７］からなる群より選ばれる少なくとも１の改変が導入されたアミノ酸配列からなる。
［１］１０３番目のアミノ酸残基をリジン残基に置換する改変
［２］７６番目のアミノ酸残基をシステイン残基に置換する改変
［３］１４４番目のアミノ酸残基をシステイン残基に置換する改変
［４］１３４番目のアミノ酸残基をグリシン残基に置換する改変
［５］２２２番目のアミノ酸残基をメチオニン残基に置換する改変
［６］７３番目のアミノ酸残基をグルタミン残基に置換する改変
［７］２０３番目のアミノ酸残基をスレオニン残基に置換する改変
　配列番号１で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質は、非特許文献１に記載のＰＥＴ２酵素である。
　配列番号１で表されるアミノ酸配列において、上記［１］～［７］からなる群より選ばれる少なくとも１の改変を導入されたアミノ酸配列からなる蛋白質とすることにより、耐熱性及び基質との結合能の少なくともいずれか一方が向上するため、配列番号１で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質（Ａ）に比べて高いＰＥＴ分解活性を示すと考えられる。
　本発明の一態様の蛋白質の非限定的な具体的態様として、例えば、配列番号１で表されるアミノ酸配列において、以下の（Ａ１）～（Ａ７）のいずれかが導入されたアミノ酸配列からなる蛋白質が挙げられる。
（Ａ１）上記［１］
（Ａ２）上記［１］及び［２］
（Ａ３）上記［１］及び［３］
（Ａ４）上記［１］、［２］及び［３］
（Ａ５）上記［１］、［２］、［３］及び［４］
（Ａ６）上記［１］、［２］、［３］、［４］及び［５］
（Ａ７）上記［１］、［２］、［３］、［４］、［５］及び［６］
（Ａ８）上記［１］、［２］、［３］、［４］、［５］、［６］及び［７］
　また、本発明の一態様の蛋白質の非限定的な具体的態様としては、配列番号１で表されるアミノ酸配列において少なくとも［１］の改変が導入され、更に、［２］～［７］の少なくとも１の改変が任意に導入されたアミノ酸配列からなる蛋白質が挙げられる。
　本発明の一態様の蛋白質の非限定的な他の具体的態様としては、配列番号１で表されるアミノ酸配列において少なくとも［１］及び［２］の改変が導入され、更に、［３］～［７］の少なくとも１の改変が任意に導入されたアミノ酸配列からなる蛋白質が挙げられる。
　本発明の一態様の蛋白質の非限定的な他の具体的態様としては、配列番号１で表されるアミノ酸配列において少なくとも［１］及び［３］の改変が導入され、更に、［２］及び［４］～［７］の少なくとも１の改変が任意に導入されたアミノ酸配列からなる蛋白質が挙げられる。
　本発明の一態様の蛋白質の非限定的な他の具体的態様としては、配列番号１で表されるアミノ酸配列において少なくとも［１］、［２］及び［３］の改変が導入され、更に、［４］～［７］の少なくとも１の改変が任意に導入されたアミノ酸配列からなる蛋白質が挙げられる。
　本発明の一態様の蛋白質の非限定的な他の具体的態様としては、配列番号１で表されるアミノ酸配列において少なくとも［１］、［２］、［３］及び［４］の改変が導入され、更に、［５］～［７］の少なくとも１の改変が任意に導入されたアミノ酸配列からなる蛋白質が挙げられる。
　本発明の一態様の蛋白質の非限定的な他の具体的態様としては、配列番号１で表されるアミノ酸配列において少なくとも［１］、［２］、［３］、［４］及び［５］の改変が導入され、更に、［６］及び［７］の少なくとも１の改変が任意に導入されたアミノ酸配列からなる蛋白質が挙げられる。
　本発明の一態様の蛋白質の非限定的な他の具体的態様としては、配列番号１で表されるアミノ酸配列において少なくとも［１］、［２］、［３］、［４］、［５］及び［６］の改変が導入され、更に、［７］の改変が任意に導入されたアミノ酸配列からなる蛋白質が挙げられる。
　本発明の一態様の蛋白質の非限定的な他の具体的態様としては、配列番号１で表されるアミノ酸配列において［１］、［２］、［３］、［４］、［５］、［６］及び［７］の改変が導入されたアミノ酸配列からなる蛋白質が挙げられる。
　本発明の一態様の蛋白質は、配列番号１で表されるアミノ酸配列に対して１～２０個のアミノ酸残基が欠失、置換、挿入及び付加の少なくとも１からなる改変を有する変異蛋白質（Ｂ）のアミノ酸配列において、以下の［１´］～［７´］からなる群より選ばれる少なくとも１の改変が導入されたアミノ酸配列からなり、上記変異蛋白質（Ｂ）に比べて高いＰＥＴ分解活性を有する。
［１´］配列番号１の１０３番目のアミノ酸残基に対応するアミノ酸残基をリジン残基に置換する改変
［２´］配列番号１の７６番目のアミノ酸残基に対応するアミノ酸残基をシステイン残基に置換する改変
［３´］配列番号１の１４４番目のアミノ酸残基に対応するアミノ酸残基をシステイン残基に置換する改変
［４´］配列番号１の１３４番目のアミノ酸残基に対応するアミノ酸残基をグリシン残基に置換する改変
［５´］配列番号１の２２２番目のアミノ酸残基に対応するアミノ酸残基をメチオニン残基に置換する改変
［６´］配列番号１の７３番目のアミノ酸残基に対応するアミノ酸残基をグルタミン残基に置換する改変
［７´］配列番号１の２０３番目のアミノ酸残基に対応するアミノ酸残基をスレオニン残基に置換する改変
　本明細書において、変異蛋白質とは、元となる蛋白質中のアミノ酸残基を人為的に欠失若しくは置換、または該蛋白質中にアミノ酸残基を挿入若しくは付加して得られる蛋白質をいう。
　上記変異蛋白質において、アミノ酸が欠失、置換、挿入及び付加の少なくとも１つからなる改変を有するとは、配列番号１で表されるアミノ酸配列中の任意の位置において、１～２０個のアミノ酸が欠失、置換、挿入及び付加の少なくとも１つからなる改変がなされていてもよい。欠失、置換、挿入及び付加の少なくとも１つからなる改変がなされるアミノ酸の数は１～２０個、好ましくは１～１０個、さらに好ましくは１～８個、最も好ましくは１～５個である。
　欠失、置換、挿入及び付加の少なくとも１つからなる改変がなされるアミノ酸は天然型と非天然型とを問わない。天然型アミノ酸としては、Ｌ－アラニン、Ｌ－アスパラギン、Ｌ－アスパラギン酸、Ｌ－グルタミン、Ｌ－グルタミン酸、グリシン、Ｌ－ヒスチジン、Ｌ－イソロイシン、Ｌ－ロイシン、Ｌ－リジン、Ｌ－アルギニン、Ｌ－メチオニン、Ｌ－フェニルアラニン、Ｌ－プロリン、Ｌ－セリン、Ｌ－スレオニン、Ｌ－トリプトファン、Ｌ－チロシン、Ｌ－バリン、Ｌ－システインなどが挙げられる。
　以下に、相互に置換可能なアミノ酸の例を示す。同一群に含まれるアミノ酸は相互に置換可能である。
Ａ群：ロイシン、イソロイシン、ノルロイシン、バリン、ノルバリン、アラニン、２－アミノブタン酸、メチオニン、Ｏ－メチルセリン、ｔ－ブチルグリシン、ｔ－ブチルアラニン、シクロヘキシルアラニン
Ｂ群：アスパラギン酸、グルタミン酸、イソアスパラギン酸、イソグルタミン酸、２－アミノアジピン酸、２－アミノスベリン酸
Ｃ群：アスパラギン、グルタミン
Ｄ群：リジン、アルギニン、オルニチン、２，４－ジアミノブタン酸、２，３－ジアミノプロピオン酸
Ｅ群：プロリン、３－ヒドロキシプロリン、４－ヒドロキシプロリン
Ｆ群：セリン、スレオニン、ホモセリン
Ｇ群：フェニルアラニン、チロシン
　本発明の一態様の蛋白質の非限定的な具体的態様として、例えば、配列番号１で表されるアミノ酸配列に対して１～２０個のアミノ酸残基が欠失、置換、挿入及び付加の少なくとも１からなる改変を有する変異蛋白質（Ｂ）のアミノ酸配列において、以下の（Ｂ１）～（Ｂ８）のいずれかが導入されたアミノ酸配列からなる蛋白質が挙げられる。
（Ｂ１）上記［１´］
（Ｂ２）上記［１´］及び［２´］
（Ｂ３）上記［１´］及び［３´］
（Ｂ４）上記［１´］、［２´］及び［３´］
（Ｂ５）上記［１´］、［２´］、［３´］及び［４´］
（Ｂ６）上記［１´］、［２´］、［３´］、［４´］及び［５´］
（Ｂ７）上記［１´］、［２´］、［３´］、［４´］、［５´］及び［６´］
（Ｂ８）上記［１´］、［２´］、［３´］、［４´］、［５´］、［６´］及び［７´］
　また、本発明の一態様の蛋白質の非限定的な具体的態様としては、上記変異蛋白質（Ｂ）のアミノ酸配列において、少なくとも［１´］の改変が導入され、更に、［２´］～［７´］の少なくとも１の改変が任意に導入されたアミノ酸配列からなる蛋白質が挙げられる。
　本発明の一態様の蛋白質の非限定的な他の具体的態様としては、上記変異蛋白質（Ｂ）のアミノ酸配列において、少なくとも［１´］及び［２´］の改変が導入され、更に、［３´］～［７´］の少なくとも１の改変が任意に導入されたアミノ酸配列からなる蛋白質が挙げられる。
　本発明の一態様の蛋白質の非限定的な他の具体的態様としては、上記変異蛋白質（Ｂ）のアミノ酸配列において、少なくとも［１´］及び［３´］の改変が導入され、更に、［２´］及び［４´］～［７´］の少なくとも１の改変が任意に導入されたアミノ酸配列からなる蛋白質が挙げられる。
　本発明の一態様の蛋白質の非限定的な他の具体的態様としては、上記変異蛋白質（Ｂ）のアミノ酸配列において、少なくとも［１´］、［２´］及び［３´］の改変が導入され、更に、［４´］～［７´］の少なくとも１の改変が任意に導入されたアミノ酸配列からなる蛋白質が挙げられる。
　本発明の一態様の蛋白質の非限定的な他の具体的態様としては、上記変異蛋白質（Ｂ）のアミノ酸配列において、少なくとも［１´］、［２´］、［３´］及び［４´］の改変が導入され、更に、［５´］～［７´］の少なくとも１の改変が任意に導入されたアミノ酸配列からなる蛋白質が挙げられる。
　本発明の一態様の蛋白質の非限定的な他の具体的態様としては、上記変異蛋白質（Ｂ）のアミノ酸配列において、少なくとも［１´］、［２´］、［３´］、［４´］及び［５´］の改変が導入され、更に、［６´］及び［７´］の少なくとも１の改変が任意に導入されたアミノ酸配列からなる蛋白質が挙げられる。
　本発明の一態様の蛋白質の非限定的な他の具体的態様としては、上記変異蛋白質（Ｂ）のアミノ酸配列において、少なくとも［１´］、［２´］、［３´］、［４´］、［５´］及び［６´］の改変が導入され、更に、［７´］の改変が任意に導入されたアミノ酸配列からなる蛋白質が挙げられる。
　本発明の一態様の蛋白質の非限定的な他の具体的態様としては、上記変異蛋白質（Ｂ）のアミノ酸配列において、［１´］、［２´］、［３´］、［４´］、［５´］、［６´］及び［７´］の改変が導入されたアミノ酸配列からなる蛋白質が挙げられる。
　本発明の一態様の蛋白質は、配列番号１で表されるアミノ酸配列と８０％以上の同一性を有する相同蛋白質（Ｃ）のアミノ酸配列において、以下の［１´´］～［７´´］からなる群より選ばれる少なくとも１の改変が導入されたアミノ酸配列からなり、上記相同蛋白質（Ｃ）に比べて高いポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）分解活性を有する。
［１´´］配列番号１の１０３番目のアミノ酸残基に対応するアミノ酸残基をリジン残基に置換する改変
［２´´］配列番号１の７６番目のアミノ酸残基に対応するアミノ酸残基をシステイン残基に置換する改変
［３´´］配列番号１の１４４番目のアミノ酸残基に対応するアミノ酸残基をシステイン残基に置換する改変
［４´´］配列番号１の１３４番目のアミノ酸残基に対応するアミノ酸残基をグリシン残基に置換する改変
［５´´］配列番号１の２２２番目のアミノ酸残基に対応するアミノ酸残基をメチオニン残基に置換する改変
［６´´］配列番号１の７３番目のアミノ酸残基に対応するアミノ酸残基をグルタミン残基に置換する改変
［７´´］配列番号１の２０３番目のアミノ酸残基に対応するアミノ酸残基をスレオニン残基に置換する改変
　本明細書において、相同蛋白質とは、元となる蛋白質と構造および機能が類似する蛋白質をいう。
　相同蛋白質としては、例えば、対象となる蛋白質が有するアミノ酸配列と８０％以上、好ましくは９０％以上、特に好ましくは９５％以上の同一性を有するアミノ酸配列が挙げられる。
　アミノ酸配列および塩基配列の同一性は、Ｋａｒｌｉｎ　ａｎｄ　ＡｌｔｓｃｈｕｌによるアルゴリズムＢＬＡＳＴ［Ｐｒｏ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　ＵＳＡ，　９０，　５８７３（１９９３）］やＦＡＳＴＡ［Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｅｎｚｙｍｏｌ．，　１８３，　６３　（１９９０）］を用いて決定できる。このアルゴリズムＢＬＡＳＴに基づいて、ＢＬＡＳＴＮやＢＬＡＳＴＸとよばれるプログラムが開発されている［Ｊ．　Ｍｏｌ．　Ｂｉｏｌ．，　２１５，　４０３（１９９０）］。ＢＬＡＳＴに基づいてＢＬＡＳＴＮによって塩基配列を解析する場合には、パラメータは例えばＳｃｏｒｅ＝１００、ｗｏｒｄｌｅｎｇｔｈ＝１２とする。また、ＢＬＡＳＴに基づいてＢＬＡＳＴＸによってアミノ酸配列を解析する場合には、パラメータは例えばｓｃｏｒｅ＝５０、ｗｏｒｄｌｅｎｇｔｈ＝３とする。ＢＬＡＳＴとＧａｐｐｅｄ　ＢＬＡＳＴプログラムを用いる場合には、各プログラムのデフォルトパラメーターを用いる。これらの解析方法の具体的な手法は公知である。
　配列番号１で表されるアミノ酸配列と、相同蛋白質のアミノ酸配列とのアライメントは、公知のアライメントプログラムＣｌｕｓｔａｌＷ[Nucelic Acids Research 22, 4673, (1994)]を用いて作成することができる。ＣｌｕｓｔａｌＷは、http://www.ebi.ac.uk/clustalw/(European Bioinformatics Institute)より利用することができる。ＣｌｕｓｔａｌＷを用いてアライメントを作成する際のパラメータは、例えばデフォルトの値を用いる。
　本発明の一態様の蛋白質の非限定的な具体的態様として、例えば、配列番号１で表されるアミノ酸配列と８０％以上の同一性を有する相同蛋白質（Ｃ）のアミノ酸配列において、以下の（Ｃ１）～（Ｃ８）のいずれかが導入されたアミノ酸配列からなる蛋白質が挙げられる。
（Ｃ１）上記［１´´］
（Ｃ２）上記［１´´］及び［２´´］
（Ｃ３）上記［１´´］及び［３´´］
（Ｃ４）上記［１´´］、［２´´］及び［３´´］
（Ｃ５）上記［１´´］、［２´´］、［３´´］及び［４´´］
（Ｃ６）上記［１´´］、［２´´］、［３´´］、［４´´］及び［５´´］
（Ｃ７）上記［１´´］、［２´´］、［３´´］、［４´´］、［５´´］及び［６´´］
（Ｃ８）上記［１´´］、［２´´］、［３´´］、［４´´］、［５´´］、［６´´］及び［７´´］
　また、本発明の一態様の蛋白質の非限定的な具体的態様としては、上記相同蛋白質（Ｃ）のアミノ酸配列において、少なくとも［１´´］の改変が導入され、更に、［２´´］～［７´´］の少なくとも１の改変が任意に導入されたアミノ酸配列からなる蛋白質が挙げられる。
　本発明の一態様の蛋白質の非限定的な他の具体的態様としては、上記相同蛋白質（Ｃ）のアミノ酸配列において、少なくとも［１´´］及び［２´´］の改変が導入され、更に、［３´´］～［７´´］の少なくとも１の改変が任意に導入されたアミノ酸配列からなる蛋白質が挙げられる。
　本発明の一態様の蛋白質の非限定的な他の具体的態様としては、上記相同蛋白質（Ｃ）のアミノ酸配列において、少なくとも［１´´］及び［３´´］の改変が導入され、更に、［２´´］及び［４´´］～［７´´］の少なくとも１の改変が任意に導入されたアミノ酸配列からなる蛋白質が挙げられる。
　本発明の一態様の蛋白質の非限定的な他の具体的態様としては、上記相同蛋白質（Ｃ）のアミノ酸配列において、少なくとも［１´´］、［２´´］及び［３´´］の改変が導入され、更に、［４´´］～［７´´］の少なくとも１の改変が任意に導入されたアミノ酸配列からなる蛋白質が挙げられる。
　本発明の一態様の蛋白質の非限定的な他の具体的態様としては、上記相同蛋白質（Ｃ）のアミノ酸配列において、少なくとも［１´´］、［２´´］、［３´´］及び［４´´］の改変が導入され、更に、［５´´］～［７´´］の少なくとも１の改変が任意に導入されたアミノ酸配列からなる蛋白質が挙げられる。
　本発明の一態様の蛋白質の非限定的な他の具体的態様としては、上記相同蛋白質（Ｃ）のアミノ酸配列において、少なくとも［１´´］、［２´´］、［３´´］、［４´´］及び［５´´］の改変が導入され、更に、［６´´］及び［７´´］の少なくとも１の改変が任意に導入されたアミノ酸配列からなる蛋白質が挙げられる。
　本発明の一態様の蛋白質の非限定的な他の具体的態様としては、上記相同蛋白質（Ｃ）のアミノ酸配列において、少なくとも［１´´］、［２´´］、［３´´］、［４´´］、［５´´］及び［６´´］の改変が導入され、更に、［７´´］の改変が任意に導入されたアミノ酸配列からなる蛋白質が挙げられる。
　本発明の一態様の蛋白質の非限定的な他の具体的態様としては、上記相同蛋白質（Ｃ）のアミノ酸配列において、［１´´］、［２´´］、［３´´］、［４´´］、［５´´］、［６´´］及び［７´´］の改変が導入されたアミノ酸配列からなる蛋白質が挙げられる。
　本発明の一態様の蛋白質は、ＰＥＴの主鎖を分解し得る。従って、本発明の一態様の蛋白質は、ＰＥＴ分解の中間産物のビス（２－ヒドロキシエチル）テレフタレート（以下、「ＢＨＥＴ」とも称する。）をモノヒドロキシエチルテレフタレート（以下、「ＭＨＥＴ」とも称する。）に分解することができ、さらに、ＭＨＥＴをテレフタル酸（以下、「ＴＰＡ」とも称する。）とエチレングリコール（以下、「ＥＧ」とも称する。）に分解することができる。すなわち、本発明の一態様の蛋白質は、ＰＥＴ又はＰＥＴの部分構造であるＢＨＥＴを基質として加水分解し、ＭＨＥＴを生成させ、さらにＴＰＡとＥＧを生成させることができる。
　蛋白質のＰＥＴ分解活性は、例えば、蛋白質及びＰＥＴフィルム断片を含む反応液を調製して酵素反応を行い、反応終了後、生成したＴＰＡ及びＭＨＥＴの量を測定することで確認できる。本発明の一態様の蛋白質及びＰＥＴフィルム断片を含む反応液から生成したＴＰＡ及びＭＨＥＴの合計量が、比較対象の蛋白質及びＰＥＴフィルム断片を含む反応液から生成したＴＰＡ及びＭＨＥＴの合計量よりも多ければ、本発明の一態様の蛋白質が、比較対象の蛋白質よりも高いＰＥＴ分解活性を有しているといえる。
　生成したＴＰＡ及びＭＨＥＴの量は、高速液体クロマトグラフ（以下、「ＨＰＬＣ」とも称する。）により測定できる。
　本発明の一態様の蛋白質は、本実施形態に係る変異型ＰＥＴ２とも称する。
２．ＤＮＡ
　本発明の一態様のＤＮＡとしては、上記１．に記載の本発明の一態様の蛋白質をコードするＤＮＡを挙げることができる。
３．形質転換体
　本発明の一態様の蛋白質をコードするＤＮＡで形質転換した形質転換体としては、上記２．のＤＮＡを含む組換え体ＤＮＡを用い、宿主細胞を公知の方法で形質転換して得られる形質転換体を挙げることができる。宿主細胞としては、原核生物、酵母、動物細胞、昆虫細胞等、植物細胞等いずれであってもよいが、好ましくは細菌等の原核生物、より好ましくはエシェリヒア属、セラチア属、バチルス属、ブレビバクテリウム属、コリネバクテリウム属、ミクロバクテリウム属、シュードモナス属等に属する微生物を挙げることができる。
４．本発明の一態様のＤＮＡの調製
　本発明の一態様のＤＮＡである、配列番号１で表されるアミノ酸配列において、上記［１］～［７］からなる群より選ばれる少なくとも１の改変が導入されたアミノ酸配列からなる蛋白質をコードするＤＮＡ（ａ）は、以下の方法で取得できる。
　上記ＤＮＡ（ａ）は、配列番号１で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質をコードするＤＮＡを用いて、例えばモレキュラー・クローニング第３版およびカレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー等に記載された部位特異的変異導入法により、上記１．に記載の上記［１］～［７］からなる群から選ばれる少なくとも１の改変箇所において、置換前のアミノ酸残基をコードする部分の塩基配列を、置換後のアミノ酸残基をコードする塩基配列に置換することにより取得することができる。
　また、本発明の一態様のＤＮＡである、配列番号１で表されるアミノ酸配列に対して１～２０個のアミノ酸残基が欠失、置換、挿入及び付加の少なくとも１からなる改変を有する変異蛋白質（Ｂ）のアミノ酸配列において、上記［１´］～［７´］からなる群より選ばれる少なくとも１の改変が導入されたアミノ酸配列からなり、上記変異蛋白質（Ｂ）に比べて高いＰＥＴ分解活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ（ｂ）は、以下の方法で取得できる。
　上記ＤＮＡ（ｂ）は、配列番号１で表されるアミノ酸配列のうち１～２０個のアミノ酸残基が欠失、置換、挿入及び付加の少なくとも１つからなる改変を有する変異蛋白質（Ｂ）をコードするＤＮＡを用いて、配列番号１で表されるアミノ酸配列と、上記変異蛋白質（Ｂ）とを上記１．に記載の方法によってアライメントして、部位特異的変異導入法により、上記変異蛋白質（Ｂ）のアミノ酸配列において、上記１．に記載の上記［１´］～［７´］からなる群から選ばれる少なくとも１の改変箇所において、置換前のアミノ酸残基をコードする部分の塩基配列を、置換後のアミノ酸残基をコードする塩基配列に置換することにより取得することができる。
　上記ＤＮＡ（ｂ）は、配列番号１で表されるアミノ酸配列において上記［１］～［７］からなる群より選ばれる少なくとも１の改変が導入されたアミノ酸配列からなる蛋白質をコードするＤＮＡを用いて、該改変部位以外の箇所の１～２０個のアミノ酸残基が欠失、置換、挿入及び付加の少なくとも１つからなる改変がされるように、該アミノ酸残基をコードする部分の塩基配列に変異を導入する方法でも取得することができる。
　上記ＤＮＡ（ｂ）は、配列番号１で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質をコードするＤＮＡを用いて、上記［１´］～［７´］からなる群より選ばれる少なくとも１の改変及び該改変箇所以外の箇所に１～２０個のアミノ酸残基の欠失、置換、挿入及び付加の少なくとも１つからなる改変がされるように、該改変箇所をコードする部分の塩基配列に変異を導入する方法でも取得することができる。
　上記取得方法においては、対象の改変を導入できるように設計したプライマーを用いることができる。
　また、本発明の一態様のＤＮＡである、配列番号１で表されるアミノ酸配列と８０％以上の同一性を有する相同蛋白質（Ｃ）のアミノ酸配列において、上記［１´´］～［７´´］からなる群より選ばれる少なくとも１の改変が導入されたアミノ酸配列からなり、上記相同蛋白質（Ｃ）に比べて高いＰＥＴ分解活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ（ｃ）は、以下の方法で取得できる。
　上記ＤＮＡ（ｃ）は、配列番号１で表されるアミノ酸配列と８０％以上の同一性を有する相同蛋白質（Ｃ）をコードするＤＮＡを用いて、配列番号１で表されるアミノ酸配列と、上記相同蛋白質（Ｃ）とを上記１．に記載の方法によってアライメントして、部位特異的変異導入法により、上記相同蛋白質（Ｃ）のアミノ酸配列において、上記１．に記載の上記［１´´］～［７´´］からなる群から選ばれる少なくとも１の改変箇所において、置換前のアミノ酸残基をコードする部分の塩基配列を、置換後のアミノ酸残基をコードする塩基配列に置換することができる。
　上記ＤＮＡ（ｃ）は、配列番号１で表されるアミノ酸配列において上記［１］～［７］からなる群より選ばれる少なくとも１の改変が導入されたアミノ酸配列からなる蛋白質をコードするＤＮＡを用いて、該改変部位以外の箇所をコードする部分の塩基配列に改変を導入して、取得することができる。このとき、上記［１］～［７］からなる群より選ばれる少なくとも１の改変箇所以外のアミノ酸配列が、配列番号１で表されるアミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するように改変箇所を設計する。
　また、本発明の一態様のＤＮＡは、配列番号１で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質をコードするＤＮＡを用いて、上記［１´´］～［７´´］からなる群より選ばれる少なくとも１の改変及び該改変箇所以外の箇所をコードする部分の塩基配列に改変を導入して、取得することができる。このとき、上記［１´´］～［７´´］からなる群より選ばれる少なくとも１の改変箇所以外のアミノ酸配列が、配列番号１で表されるアミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するように改変箇所を設計する。
　上記取得方法においては、対象の改変を導入できるように設計したプライマーを用いることができる。
５．本発明の一態様の形質転換体の製造
　本発明の一態様の形質転換体としては、本発明の一態様のＤＮＡを含有する組換え体ＤＮＡを宿主細胞に導入して得られる形質転換体や、本発明の一態様のＤＮＡをベクターＤＮＡに組み込んで得られる組換え体ＤＮＡを宿主細胞に導入して得られる形質転換体を挙げることができる。
　本発明のＤＮＡを組み込むベクターとしては、ｐＥＴ２８ａ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社製）、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ　ＫＳ（＋）（ストラタジーン社製）、ｐＤＩＲＥＣＴ[Nucleic Acids Res., 18, 6069 (1990)]、ｐＣＲ－Ｓｃｒｉｐｔ　Ａｍｐ　ＳＫ（＋）（ストラタジーン社製）、ｐＴ７Ｂｌｕｅ（ノバジェン社製）、ｐＣＲ　ＩＩ（インビトロジェン社製）、ｐＣＲ－ＴＲＡＰ（ジーンハンター社製）、ｐＱＥ－６０（キアゲン社製）等を挙げることができる。
　宿主細胞としては、エシェリヒア属に属する微生物などを挙げることができる。エシェリヒア属に属する微生物としては、例えば、エシェリヒア・コリ　ＳＨｕｆｆｌｅ　Ｔ７　Ｅｘｐｒｅｓｓ　Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ、エシェリヒア・コリ　ＸＬ１－Ｂｌｕｅ、エシェリヒア・コリ　ＸＬ２－Ｂｌｕｅ、エシェリヒア・コリ　ＤＨ１、エシェリヒア・コリ　ＤＨ５α、エシェリヒア・コリ　ＭＣ１０００、エシェリヒア・コリ　ＡＴＣＣ　１２４３５、エシェリヒア・コリ　Ｗ１４８５、エシェリヒア・コリ　ＪＭ１０９、エシェリヒア・コリ　ＨＢ１０１、エシェリヒア・コリ　Ｎｏ．４９、エシェリヒア・コリ　Ｗ３１１０、エシェリヒア・コリ　ＮＹ４９、エシェリヒア・コリ　ＭＰ３４７、エシェリヒア・コリ　ＮＭ５２２、エシェリヒア・コリ　ＢＬ２１、エシェリヒア・コリ　ＭＥ８４１５等を挙げることができる。
　組換え体ＤＮＡの導入方法としては、上記宿主細胞へＤＮＡを導入する方法であればいずれも用いることができ、例えば、カルシウムイオンを用いる方法[Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 69, 2110 (1972)]、プロトプラスト法（日本国特開昭６３－２４８３９４号公報）、エレクトロポレーション法[Nucleic Acids Res., 16, 6127 (1988)]等を挙げることができる。
６.本発明の一態様の蛋白質の製造法
（１）本発明の一態様の蛋白質を生産する形質転換体の製造
　本発明の一態様のＤＮＡをもとにして、必要に応じて、本発明の一態様の蛋白質をコードする部分を含む適当な長さのＤＮＡ断片を調製する。また、該蛋白質をコードする部分の塩基配列を、宿主の発現に最適なコドンとなるように、塩基を置換することにより、該蛋白質の生産効率が向上した形質転換体を取得することができる。
　該組換え体ＤＮＡを、該発現ベクターに適合した宿主細胞に導入することにより、本発明の一態様の蛋白質を生産する形質転換体を得ることができる。
　宿主細胞としては、細菌、酵母、動物細胞、昆虫細胞等、植物細胞等、目的とする遺伝子を発現できるものであればいずれも用いることができる。
　発現ベクターとしては、上記宿主細胞において自律複製可能ないしは染色体中への組込が可能で、本発明のＤＮＡを転写できる位置にプロモーターを含有しているものが用いられる。
　細菌等の原核生物を宿主細胞として用いる場合は、本発明のＤＮＡを有する組換え体ＤＮＡは、原核生物中で自律複製可能であると同時に、プロモーター、リボソーム結合配列、本発明のＤＮＡ、転写終結配列より構成された組換え体ＤＮＡであることが好ましく、プロモーターを制御する遺伝子が含まれていてもよい。
　発現ベクターとしては、ｐＥＴ２８ａ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社製）、ｐＣｏｌｄＩ（タカラバイオ株式会社製）、ｐＣＤＦ－１ｂ、ｐＲＳＦ－１ｂ（いずれもノバジェン社製）、ｐＭＡＬ－ｃ２ｘ（ニューイングランドバイオラブス社製）、ｐＧＥＸ－４Ｔ－１（ジーイーヘルスケアバイオサイエンス社製）、ｐＴｒｃＨｉｓ（インビトロジェン社製）、ｐＳＥ２８０（インビトロジェン社製）、ｐＧＥＭＥＸ－１（プロメガ社製）、ｐＱＥ－３０（キアゲン社製）、ｐＱＥ－６０（キアゲン社製）、ｐＥＴ－３（ノバジェン社製）、ｐＫＹＰ１０（日本国特開昭５８－１１０６００号公報）、ｐＫＹＰ２００[Agric. Biol. Chem., 48, 669 (1984)]、ｐＬＳＡ１[Agric. Biol. Chem., 53, 277 (1989)]、ｐＧＥＬ１[Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 82, 4306 (1985)]、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ　ＳＫ（＋）、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ　ＩＩ　ＫＳ（－）（ストラタジーン社製）、ｐＴｒＳ３０　［エシェリヒア・コリ　ＪＭ１０９／ｐＴｒＳ３０（ＦＥＲＭ　ＢＰ－５４０７）より調製］、ｐＴｒＳ３２　［エシェリヒア・コリ　ＪＭ１０９／ｐＴｒＳ３２（ＦＥＲＭ　ＢＰ－５４０８）より調製］、ｐＰＡＣ３１　（国際公開第９８／１２３４３号）、ｐＵＣ１９　［Ｇｅｎｅ，　３３，　１０３　（１９８５）］、ｐＳＴＶ２８（タカラバイオ株式会社製）、ｐＵＣ１１８（タカラバイオ株式会社製）、ｐＰＡ１（日本国特開昭６３－２３３７９８号公報）、ｐＧＨＡ２〔エシェリヒア・コリ　ＩＧＨＡ２（ＦＥＲＭ　Ｂ－４００）より調製、日本国特開昭６０－２２１０９１号公報〕、ｐＧＫＡ２〔エシェリヒア・コリ　ＩＧＫＡ２（ＦＥＲＭ　ＢＰ－６７９８）より調製、日本国特開昭６０－２２１０９１号公報〕、ｐＴｅｒｍ２（米国特許第４６８６１９１号明細書、米国特許第４９３９０９４号明細書、米国特許第５１６０７３５号明細書）、ｐＳｕｐｅｘ、ｐＵＢ１１０、ｐＴＰ５、ｐＣ１９４、ｐＥＧ４００〔Ｊ．　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，　１７２，　２３９２　（１９９０）〕、ｐＣＧ１（日本国特開昭５７－１３４５００号公報）、ｐＣＧ２（日本国特開昭５８－３５１９７号公報）、ｐＣＧ４（日本国特開昭５７－１８３７９９号公報）、ｐＣＧ１１（日本国特開昭５７－１３４５００号公報）、ｐＣＧ１１６、ｐＣＥ５４、ｐＣＢ１０１（いずれも日本国特開昭５８－１０５９９９号公報）、ｐＲＩ１０９（国際公開第００／０４４８８６号）、ｐＣＥ５１、ｐＣＥ５２、ｐＣＥ５３［いずれもＭｏｌｅｃｕｌａｒ　ａｎｄ　Ｇｅｎｅｒａｌ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，　１９６，　１７５　（１９８４）］等を挙げることができる。
　プロモーターとしては、大腸菌等の宿主細胞中で機能するものであればいかなるものでもよい。例えば、ｔｒｐプロモーター（Ｐｔｒｐ）、ｌａｃプロモーター（Ｐｌａｃ）、ＰＬプロモーター、ＰＲプロモーター、ＰＳＥプロモーター等の、大腸菌やファージ等に由来するプロモーター、ＳＰＯ１プロモーター、ＳＰＯ２プロモーター、ｐｅｎＰプロモーター等を挙げることができる。またＰｔｒｐを２つ直列させたプロモーター（Ｐｔｒｐ　×２）、ｔａｃプロモーター、ｌａｃＴ７プロモーター、ｌｅｔ　Ｉプロモーターのように人為的に設計改変されたプロモーター等も用いることができる。
　リボソーム結合配列であるシャイン－ダルガノ（Shine-Dalgarno）配列と開始コドンとの間を適当な距離（例えば６～１８塩基）に調節したプラスミドを用いることが好ましい。本発明の一態様のＤＮＡの発現に転写終結配列は必ずしも必要ではないが、組換え体ＤＮＡにおいては、構造遺伝子の直下に転写終結配列を配置することが好ましい。
　原核生物としては、エシェリヒア属、セラチア（Serratia）属、バチルス（Bacillus）属、ブレビバクテリウム（Brevibacterium）属、コリネバクテリウム（Corynebacterium）属、ミクロバクテリウム（Microbacterium）属、シュードモナス（Pseudomonas）属等に属する微生物、例えば、エシェリヒア・コリ　ＳＨｕｆｆｌｅ　Ｔ７　Ｅｘｐｒｅｓｓ　Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ、エシェリヒア・コリ　ＸＬ１－Ｂｌｕｅ、エシェリヒア・コリ　ＸＬ２－Ｂｌｕｅ、エシェリヒア・コリ　ＤＨ１、エシェリヒア・コリ　ＤＨ５α、エシェリヒア・コリ　ＮＭ５２２、エシェリヒア・コリ　ＭＣ１０００、エシェリヒア・コリ　ＫＹ３２７６、エシェリヒア・コリ　Ｗ１４８５、エシェリヒア・コリ　ＪＭ１０９、エシェリヒア・コリ　ＨＢ１０１、エシェリヒア・コリ　Ｎｏ．４９、エシェリヒア・コリ　Ｗ３１１０、エシェリヒア・コリ　ＮＹ４９、セラチア・フィカリア（Serratia ficaria）、セラチア・フォンティコラ（Serratia fonticola）、セラチア・リケファシエンス（Serratia liquefaciens）、セラチア・マルセッセンス（Serratia marcescens）、バチルス・サチラス（Bacillus subtilis）、バチルス・アミロリケファシエンス（Bacillus amyloliquefaciens）、ブレビバクテリウム・イマリオフィラム（Brevibacterium immariophilum）ＡＴＣＣ１４０６８、ブレビバクテリウム・サッカロリティカム（Brevibacterium saccharolyticum）ＡＴＣＣ１４０６６、コリネバクテリウム・アンモニアゲネス（Corynebacterium ammoniagenes）、コリネバクテリウム・グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）ＡＴＣＣ１３０３２、コリネバクテリウム・グルタミカム　ＡＴＣＣ１４０６７、コリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３８６９、コリネバクテリウム・アセトアシドフィラム（Corynebacterium acetoacidophilum）ＡＴＣＣ１３８７０、ミクロバクテリウム・アンモニアフィラム（Microbacterium ammoniaphilum）ＡＴＣＣ１５３５４、シュードモナス・エスピー（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｓｐ．）　Ｄ－０１１０等を挙げることができる。好ましくはエシェリヒア属またはコリネバクテリウム属に属する微生物、より好ましくはエシェリヒア・コリ　ＸＬ１－Ｂｌｕｅ、エシェリヒア・コリ　ＸＬ２－Ｂｌｕｅ、エシェリヒア・コリ　ＤＨ１、エシェリヒア・コリ　ＤＨ５α、エシェリヒア・コリ　ＭＣ１０００、エシェリヒア・コリ　ＭＭ２９４、エシェリヒア・コリ　Ｗ１４８５、エシェリヒア・コリ　ＪＭ１０９、エシェリヒア・コリ　ＨＢ１０１、エシェリヒア・コリ　Ｎｏ．４９、エシェリヒア・コリ　Ｗ３１１０、エシェリヒア・コリ　ＮＹ４９、エシェリヒア・コリ　ＧＩ６９８、コリネバクテリウム・アンモニアゲネスＡＴＣＣ６８７２、コリネバクテリウム・アンモニアゲネス　ＡＴＣＣ２１１７０、コリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３０３２、コリネバクテリウム・グルタミカム　ＡＴＣＣ２１１７１等を挙げることができる。
　組換えベクターの導入方法としては、上記宿主細胞へＤＮＡを導入する方法であればいずれも用いることができ、例えば、カルシウムイオンを用いる方法〔Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 69, 2110 (1972)〕、プロトプラスト法（日本国特開昭５７－１８６４９２号公報、日本国特開昭５７－１８６４９号公報）、電気穿孔法［例えば、Journal of Bacteriology, 175, 4096 (1993)、Appl. Microbiol. Biotechnol., 52, 541 (1999)］、Gene, 17, 107 (1982)およびMolecular & General Genetics, 168, 111 (1979)に記載の方法等を挙げることができる。
　酵母菌株を宿主細胞として用いる場合には、発現ベクターとして、例えば、ＹＥｐ１３（ＡＴＣＣ３７１１５）、ＹＥｐ２４（ＡＴＣＣ３７０５１）、ＹＣｐ５０（ＡＴＣＣ３７４１９）、ｐＨＳ１９、ｐＨＳ１５等を用いることができる。
　プロモーターとしては、酵母菌株中で機能するものであればいずれのものを用いてもよく、例えば、ＰＨＯ５プロモーター、ＰＧＫプロモーター、ＧＡＰプロモーター、ＡＤＨプロモーター、ｇａｌ １プロモーター、ｇａｌ １０プロモーター、ヒートショックポリペプチドプロモーター、ＭＦα１　プロモーター、ＣＵＰ １プロモーター等のプロモーターを挙げることができる。
　宿主細胞としては、サッカロマイセス属、シゾサッカロマイセス属、クルイベロミセス属、トリコスポロン属、シワニオミセス属、ピチア属、キャンディダ属等に属する酵母菌株を挙げることができ、具体的には、サッカロマイセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）、シゾサッカロマイセス・ポンベ（Schizosaccharomyces pombe）、クリュイベロマイセス・ラクティス（Kluyveromyces lactis）、トリコスポロン・プルランス（Trichosporon pullulans）、シワニオマイセス・アルビウス（Schwanniomyces alluvius）、ピヒア・パストリス（Pichia pastoris）、キャンディダ・ユーティリス（Candida utilis）等を挙げることができる。
　組換え体ＤＮＡの導入方法としては、酵母にＤＮＡを導入する方法であればいずれも用いることができ、例えば、エレクトロポレーション法（Methods Enzymol., 194, 182 (1990)）、スフェロプラスト法（Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 81, 4889 (1984)）、酢酸リチウム法（J. Bacteriol., 153, 163 (1983)）等を挙げることができる。
（２）本発明の一態様の蛋白質の製造法
　上記（１）の方法で得られる形質転換体を培地に培養し、培養物中に本発明の一態様の蛋白質を生成、蓄積させ、該培養物から採取することにより、該蛋白質を製造することができる。
　本発明の一態様の蛋白質を製造するための上記形質転換体の宿主としては、原核生物、酵母、動物細胞、昆虫細胞等、植物細胞等いずれであってもよいが、好ましくは細菌等の原核生物、より好ましくはエシェリヒア属、セラチア属、バチルス属、ブレビバクテリウム属、コリネバクテリウム属、ミクロバクテリウム属、シュードモナス属等に属する微生物を挙げることができる。
　酵母、動物細胞、昆虫細胞または植物細胞により発現させた場合には、糖あるいは糖鎖が付加された蛋白質を得ることができる。
　上記形質転換体を培地に培養する方法は、宿主の培養に用いられる通常の方法に従って行うことができる。
　エシェリヒア・コリ等の原核生物あるいは酵母等の真核生物を宿主として得られた形質転換体を培養する培地としては、該生物が資化し得る炭素源、窒素源、無機塩類等を含有し、形質転換体の培養を効率的に行える培地であれば天然培地、合成培地のいずれを用いてもよい。
　炭素源としては、該生物が資化し得るものであればよく、グルコース、フラクトース、スクロース、これらを含有する糖蜜、デンプンあるいはデンプン加水分解物等の炭水化物、酢酸、プロピオン酸等の有機酸、エタノール、プロパノール等のアルコール類等を用いることができる。
　窒素源としては、アンモニア、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、酢酸アンモニウム、リン酸アンモニウム等の無機酸もしくは有機酸のアンモニウム塩、その他の含窒素化合物、並びに、ペプトン、肉エキス、酵母エキス、コーンスチープリカー、カゼイン加水分解物、大豆粕および大豆粕加水分解物、各種発酵菌体、およびその消化物等を用いることができる。
　無機塩としては、リン酸第一カリウム、リン酸第二カリウム、リン酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、硫酸銅、炭酸カルシウム等を用いることができる。
　培養は、通常振盪培養または深部通気攪拌培養等の好気的条件下で行う。培養温度は１５～４０℃がよく、培養時間は、通常５時間～７日間である。培養中ｐＨは３．０～１１に保持する。ｐＨの調整は、無機または有機の酸、アルカリ溶液、尿素、炭酸カルシウム、アンモニア等を用いて行う。
　また、培養中必要に応じて、カナマイシン、アンピシリンやテトラサイクリン等の抗生物質を培地に添加してもよい。
　プロモーターとして誘導性のプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養するときには、必要に応じてインデューサーを培地に添加してもよい。例えば、ｌａｃプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養するときにはイソプロピル－β－Ｄ－チオガラクトピラノシド等を、ｔｒｐプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養するときにはインドールアクリル酸等を培地に添加してもよい。
　本発明の一態様の蛋白質の生産方法としては、宿主細胞内に生産させる方法、宿主細胞外に分泌させる方法、あるいは宿主細胞外膜上に生産させる方法があり、選択した方法に応じて、生産させる蛋白質の構造を変えることができる。
　本発明の一態様の蛋白質が宿主細胞内あるいは宿主細胞外膜上に生産される場合、ポールソンらの方法[J. Biol. Chem.，264, 17619 (1989)]、ロウらの方法[Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 86, 8227 (1989)、Genes Develop., 4, 1288（1990)]、または日本国特開平０５－３３６９６３号公報、国際公開第９４／２３０２１号等に記載の方法を準用することにより、該蛋白質を宿主細胞外に積極的に分泌させることができる。
　すなわち、遺伝子組換えの手法を用いて、本発明の一態様の蛋白質の活性部位を含む蛋白質の手前にシグナルペプチドを付加した形で生産させることにより、該蛋白質を宿主細胞外に積極的に分泌させることができる。
　また、日本国特開平２－２２７０７５号公報に記載されている方法に準じて、ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子等を用いた遺伝子増幅系を利用して生産量を上昇させることもできる。
　本発明の形質転換体により製造された蛋白質を単離精製するためには、通常の酵素の単離精製法を用いることができる。
　例えば本発明の一態様の蛋白質が、細胞内に溶解状態で発現した場合には、培養終了後、細胞を遠心分離により回収し、水系緩衝液にけん濁後、超音波破砕機、フレンチプレス、マントンガウリンホモゲナイザー、ダイノミル等により細胞を破砕し、無細胞抽出液を得る。該無細胞抽出液を遠心分離することにより得られる上清から、通常の酵素の単離精製法、即ち、溶媒抽出法、硫安等による塩析法、脱塩法、有機溶媒による沈殿法、ジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）－セファロース、ＤＩＡＩＯＮ（登録商標）　ＨＰＡ－７５（三菱ケミカル株式会社製）等のレジンを用いた陰イオン交換クロマトグラフィー法、Ｓ－Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ　ＦＦ（アマシャムバイオサイエンス社製）等のレジンを用いた陽イオン交換クロマトグラフィー法、ブチルセファロース、フェニルセファロース等のレジンを用いた疎水性クロマトグラフィー法、分子篩を用いたゲルろ過法、アフィニティークロマトグラフィー法、クロマトフォーカシング法、等電点電気泳動等の電気泳動法等の手法を単独あるいは組み合わせて用い、精製標品を得ることができる。
　また、該蛋白質が細胞内に不溶体を形成して発現した場合は、同様に細胞を回収後、破砕し、遠心分離を行うことにより、沈殿画分として蛋白質の不溶体を回収する。回収した蛋白質の不溶体を蛋白質変性剤で可溶化する。該可溶化液を希釈または透析し、該可溶化液中の蛋白質変性剤の濃度を下げることにより、該蛋白質を正常な立体構造に戻す。該操作の後、上記と同様の単離精製法により該蛋白質の精製標品を得ることができる。
　本発明の一態様の蛋白質、あるいは該蛋白質に糖鎖の付加された蛋白質等の誘導体が細胞外に分泌された場合には、培養上清から該蛋白質あるいは該蛋白質の誘導体を回収することができる。即ち、該培養物を上記と同様の遠心分離等の手法により処理することにより培養上清を取得し、該培養上清から、上記と同様の単離精製法を用いることにより、精製標品を得ることができる。
　このようにして取得される蛋白質として、本発明の一態様の蛋白質を挙げることができる。
　また、本発明の一態様の蛋白質を他の蛋白質との融合蛋白質として生産し、融合した蛋白質に親和性をもつ物質を用いたアフィニティークロマトグラフィーを利用して精製することもできる。例えば、ロウらの方法[Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 86, 8227 (1989)、Genes Develop., 4, 1288 (1990)]、日本国特開平５－３３６９６３号公報、国際公開第９４／２３０２１号に記載の方法に準じて、本発明の一態様の蛋白質をプロテインＡとの融合蛋白質として生産し、イムノグロブリンＧを用いるアフィニティークロマトグラフィーにより精製することができる。
　また、本発明の一態様の蛋白質をＦｌａｇペプチドとの融合蛋白質として生産し、抗Ｆｌａｇ抗体を用いるアフィニティークロマトグラフィー [Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 86, 8227 (1989)、Genes Develop., 4, 1288（1990)]や、ポリヒスチジンとの融合蛋白質として生産し、ポリヒスチジンと高親和性を有する金属配位レジンを用いるアフィニティークロマトグラフィーによって精製することもできる。更に、該蛋白質自身に対する抗体を用いたアフィニティークロマトグラフィーで精製することもできる。
　上記で取得された蛋白質のアミノ酸配列情報を基に、Ｆｍｏｃ法（フルオレニルメチルオキシカルボニル法）、ｔＢｏｃ法（ｔ－ブチルオキシカルボニル法）等の化学合成法により、本発明の一態様の蛋白質を製造することができる。また、Advanced ChemTech社、パーキン・エルマー社、Pharmacia社、Protein Technology Instrument社、Synthecell-Vega社、アプライドバイオシステムズ社、株式会社島津製作所等のペプチド合成機を利用して化学合成することもできる。
７．ＰＥＴを分解する方法
　本発明の一態様のＰＥＴを分解する方法には、本発明の一態様の蛋白質を用いる方法が挙げられる。本発明の一態様のＰＥＴを分解する方法が、本発明の一態様の蛋白質、ＰＥＴ、塩化マグネシウム及び炭酸ナトリウムを含む反応液中でＰＥＴを分解することを含むことが好ましいが、これに限られない。
　ＰＥＴを分解するときの本発明の一態様の蛋白質の反応液中の濃度は、ＰＥＴ分解の効率の観点から、好ましくは１～１００μｇ／ｍＬ、より好ましくは５～２０μｇ／ｍＬであるが、この濃度に限定はされず、分解するＰＥＴの量等に応じて適宜設定できる。
　ＰＥＴを分解するときの塩化マグネシウムの反応液中の濃度は、０．０５～１０ｍＭが好ましく、０．１ｍＭ～５ｍＭがより好ましい。塩化マグネシウムは、上記１．の蛋白質の安定化に寄与し、０．０５ｍＭ以上の場合は該蛋白質の耐熱性強化の利点があり、１０ｍＭ以下の場合は該蛋白質の基質に対する結合能が低下しにくいとの利点がある。
　反応温度は、上記１．の蛋白質の耐熱性又はＰＥＴ分解活性の観点から、好ましくは４０～７０℃、より好ましくは５５～６５℃である。
　反応時のｐＨは、上記１．の蛋白質のＰＥＴ分解活性の観点から、好ましくは６～１１、より好ましくは８．５～９．５である。
　反応時間は、分解するＰＥＴの量等により適宜設定でき、好ましくは１２～４８時間である。長時間の処理を行う場合は、定期的に上記１．の蛋白質を添加してもよい。
　本発明の一態様の蛋白質を用いてＰＥＴを分解する場合、分解するＰＥＴの形態に限定はなく、例えば、繊維状、粒状、フレーク状、ペレット状、フィルム状、塊状、ボトル状のものが挙げられる。また、これらの混合体を用いることもできる。
　本発明の一態様の蛋白質により、ＰＥＴボトルなどの廃棄物を処理することができる。本発明の一態様の蛋白質により、ＰＥＴを分解し、分解物をリサイクルに用いることができる。さらに、本発明の一態様の蛋白質を用いて、ＰＥＴフィルム等のＰＥＴ加工品の表面の修飾、ＰＥＴ繊維の表面修飾、ＰＥＴ繊維を使用した衣類の洗浄、リサイクルに供するＰＥＴ樹脂の洗浄等を行うこともできる。
８．ＴＰＡ及びＭＨＥＴの少なくとも一方を製造する方法
　本発明の一態様のＴＰＡ及びＭＨＥＴの少なくとも一方を製造する方法には、本発明の一態様の蛋白質を用いてＰＥＴを分解することを含む方法が挙げられる。本発明の一態様のＴＰＡ及びＭＨＥＴの少なくとも一方を製造する方法が、本発明の一態様の蛋白質、ＰＥＴ、塩化マグネシウム及び炭酸ナトリウムを含む反応液中でＰＥＴを分解することを含むことが好ましいが、これに限られない。
　本発明の一態様の蛋白質は、ＰＥＴの主鎖を分解し得る。従って、本発明の一態様の蛋白質は、ＰＥＴ分解の中間産物のＢＨＥＴをＭＨＥＴに分解することができ、さらに、ＭＨＥＴをＴＰＡとＥＧに分解することができる。すなわち、本発明の一態様の蛋白質は、ＰＥＴ又はＰＥＴの部分構造であるＢＨＥＴを基質として加水分解し、ＭＨＥＴを生成させ、さらにＴＰＡとＥＧを生成させることができる。
　本発明の一態様の蛋白質の反応液中の濃度、ＰＥＴを分解するときの塩化マグネシウムの反応液中の濃度、反応温度、反応時のｐＨ、反応時間、分解するＰＥＴの形態については、上記７．に記載の通りである。
［分析例］
　実施例において、ＴＰＡおよびＭＨＥＴの分析、定量は以下に示す手順で行った。
　酵素反応後の溶液を遠心分離し、上清を回収した。該上清に含まれるＴＰＡおよびＭＨＥＴをＨＰＬＣ（株式会社島津製作所製）にて分析した。
［分析条件］
カラム：ＹＭＣ－Ｔｒｉａｒｔ　Ｃ１８／Ｓ－５μｍ／１２ｎｍ　１５０×４．６　ｍｍ（株式会社ワイエムシィ製）
カラム温度：２５℃
移動相：０．１％ギ酸、２０％アセトニトリル（ｖ／ｖ）
流速：０．８ｍＬ／分
検出波長：２６０ｎｍ
　以下に、実施例をあげて本発明を具体的に説明するが、本発明はその要旨を超えない限り以下の実施例に限定されるものではない。
［実施例１］変異型ＰＥＴ２発現株の造成
（１）野生型ＰＥＴ２発現プラスミドの造成
　非特許文献２に記載の野生型ＰＥＴ２のアミノ酸配列（配列番号１）をコードする遺伝子の塩基配列からなるＤＮＡ（配列番号２）を鋳型とし、配列番号５および６で表される塩基配列からなるＤＮＡをプライマーセットに用いてＰＣＲを行い、ＰＥＴ２のＤＮＡ断片を得た。配列番号２で表されるＤＮＡは、人工合成により調製した。上記で得られた野生型ＰＥＴ２のＤＮＡ断片と発現ベクターｐＥＴ２８ａ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社製）を、Ｉｎ－Ｆｕｓｉｏｎ　ＨＤ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　Ｋｉｔ（タカラバイオ株式会社製）を用いて連結することにより、野生型ＰＥＴの２発現プラスミドｐＥＴ２８ａ－ＰＥＴ２を得た。
（２）本実施形態に係る変異型ＰＥＴ２発現プラスミドの造成－１
　上記（１）で得られたプラスミドｐＥＴ２８ａ－ＰＥＴ２を鋳型とし、配列番号７及び８で表される塩基配列からなるＤＮＡをプライマーセットとして用いてＰＣＲを行うことにより、配列番号１で表されるＰＥＴ２のアミノ酸配列のうち１０３番目のＬ－ロイシン残基をＬ－リジン残基に置換した、本実施形態に係る変異型ＰＥＴ２の発現プラスミドｐＥＴ２８ａ－Ｌ１０３Ｋを作製した。
　次に、上記で得られたｐＥＴ２８ａ－Ｌ１０３Ｋを鋳型とし、配列番号９及び１０で表される塩基配列からなるＤＮＡをプライマーセットとして用いてＰＣＲを行うことにより、ＰＥＴ２のアミノ酸配列のうち１０３番目のＬ－ロイシン残基をＬ－リジン残基に、７６番目のＬ－グリシン残基をＬ－システイン残基に置換した、本実施形態に係る変異型ＰＥＴ２の発現プラスミドｐＥＴ２８ａ－Ｌ１０３Ｋ／Ｇ７６Ｃを作製した。
　同様に、前の操作で得られたプラスミドを鋳型とし、表１に示される各配列番号に対応する塩基配列からなるＤＮＡをプライマーセットとして用いてＰＣＲを行うことで、ＰＥＴ２のアミノ酸配列に対し変異を追加した本実施形態に係る変異型ＰＥＴ２の発現プラスミドを順次作製した。追加した各変異点と対応するプライマーセットの配列番号とを表１に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
（３）本実施形態に係る変異型ＰＥＴ２発現プラスミドの造成－２
　表１に示される全ての変異を加えた本実施形態に係る変異型ＰＥＴ２発現プラスミド（ｐＥＴ２８ａ－Ｌ１０３Ｋ／Ｇ７６Ｃ／Ａ１４４Ｃ／Ｑ１３４Ｇ／Ａ２２２Ｍ）を鋳型とし、配列番号５及び６で表される塩基配列からなるＤＮＡをプライマーセットとして用い、Ｄｉｖｅｒｓｉｆｙ　ＰＣＲ　Ｒａｎｄｏｍ　Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ　Ｋｉｔ（タカラバイオ株式会社製）を用いてエラープローンＰＣＲを行った。結果、新たに変異点Ｌ７３Ｑ（７３番目のＬ－ロイシン残基をＬ－グルタミン残基に置換）が追加された本実施形態に係る変異型ＰＥＴ２のＤＮＡ断片を得た。
　得られたＤＮＡ断片と発現ベクターｐＥＴ２８ａをＩｎ－Ｆｕｓｉｏｎ　ＨＤ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　Ｋｉｔを用いて連結することにより、ＰＥＴ２のアミノ酸配列にＬ１０３Ｋ、Ｇ７６Ｃ、Ａ１４４Ｃ、Ｑ１３４Ｇ、Ａ２２２Ｍ及びＬ７３Ｑの変異を加えた本実施形態に係る変異型ＰＥＴ２の発現プラスミドを作製した。
　次に、上記で得られたプラスミド（ｐＥＴ２８ａ－Ｌ１０３Ｋ／Ｇ７６Ｃ／Ａ１４４Ｃ／Ｑ１３４Ｇ／Ａ２２２Ｍ／Ｌ７３Ｑ）を鋳型とし、配列番号５及び６で表される塩基配列からなるＤＮＡをプライマーセットとして用いて上記と同様にエラープローンＰＣＲを行い、新たに変異点Ｉ２０３Ｔ（２０３番目のＬ－イソロイシン残基をＬ－スレオニン残基に置換）が追加された本実施形態に係る変異型ＰＥＴ２のＤＮＡ断片を得た。得られたＤＮＡ断片と発現ベクターｐＥＴ２８ａとを連結し、ＰＥＴ２のアミノ酸配列にＬ１０３Ｋ、Ｇ７６Ｃ、Ａ１４４Ｃ、Ｑ１３４Ｇ、Ａ２２２Ｍ、Ｌ７３Ｑ及びＩ２０３Ｔの変異を加えた本実施形態に係る変異型ＰＥＴ２の発現プラスミドを作製した。
（４）比較変異型ＰＥＴ２発現プラスミドの造成
　上記（１）で得られたプラスミドｐＥＴ２８ａ－ＰＥＴ２を鋳型とし、配列番号１７及び１８で表される塩基配列からなるＤＮＡをプライマーセットとして用いてＰＣＲを行うことにより、配列番号１で表されるＰＥＴ２のアミノ酸配列のうち２５４番目のＬ－トリプトファン残基をＬ－フェニルアラニン残基に置換した比較変異型ＰＥＴ２の発現プラスミドｐＥＴ２８ａ－Ｗ２５４Ｆを作製した。
　また、上記（１）で得られたプラスミドｐＥＴ２８ａ－ＰＥＴ２を鋳型とし、配列番号１９及び２０で表される塩基配列からなるＤＮＡをプライマーセットとして用いてＰＣＲを行うことにより、配列番号１で表されるＰＥＴ２のアミノ酸配列のうち２５７番目のＬ－アスパラギン残基をＬ－アスパラギン酸残基に置換した比較変異型ＰＥＴ２の発現プラスミドｐＥＴ２８ａ－Ｎ２５７Ｄを作製した。
　また、上記（１）で得られたプラスミドｐＥＴ２８ａ－ＰＥＴ２を鋳型とし、配列番号２１及び２２で表される塩基配列からなるＤＮＡをプライマーセットとして用いてＰＣＲを行うことにより、配列番号１で表されるＰＥＴ２のアミノ酸配列のうち１０３番目のＬ－ロイシン残基をＬ－アスパラギン酸残基に置換した比較変異型ＰＥＴ２の発現プラスミドｐＥＴ２８ａ－Ｌ１０３Ｄを作製した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
（５）各種ＰＥＴ２発現プラスミドを有する形質転換体の造成
　（１）～（４）で造成した各プラスミドをＳＨｕｆｆｌｅ　Ｔ７　Ｅｘｐｒｅｓｓ　Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ　Ｅ．ｃｏｌｉ（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　ＢｉｏＬａｂｓ社製）へそれぞれ形質転換し、計１２種の形質転換体（ＰＥＴ２株、Ｌ１０３Ｋ株、Ｌ１０３Ｋ／Ｇ７６Ｃ株、Ｌ１０３Ｋ／Ａ１４４Ｃ株、Ｌ１０３Ｋ／Ｇ７６Ｃ／Ａ１４４Ｃ株、Ｌ１０３Ｋ／Ｇ７６Ｃ／Ａ１４４Ｃ／Ｑ１３４Ｇ株、Ｌ１０３Ｋ／Ｇ７６Ｃ／Ａ１４４Ｃ／Ｑ１３４Ｇ／Ａ２２２Ｍ株、Ｌ１０３Ｋ／Ｇ７６Ｃ／Ａ１４４Ｃ／Ｑ１３４Ｇ／Ａ２２２Ｍ／Ｌ７３Ｑ株、Ｌ１０３Ｋ／Ｇ７６Ｃ／Ａ１４４Ｃ／Ｑ１３４Ｇ／Ａ２２２Ｍ／Ｌ７３Ｑ／Ｉ２０３Ｔ株、Ｗ２５４Ｆ株、Ｎ２５７Ｄ株、及びＬ１０３Ｄ株）を得た。
［実施例２］各種ＰＥＴ２精製酵素のＰＥＴ分解活性の測定に基づく各変異点の評価
（１）各種ＰＥＴ２精製酵素の取得
　実施例１（５）で得た計１２種の形質転換体をＬＢプレート上で３０℃にて２４時間培養し、１００ｍｇ／Ｌのカナマイシンを含むＬＢ培地５ｍＬが入った大型試験管に植菌して３０℃で２０時間、振盪培養した。その後、得られた培養液０．６ｍＬを、１００ｍｇ／Ｌのカナマイシンを含むＬＢ培地３０ｍＬが入ったフラスコに移し、３７℃で振盪培養した。菌体ＯＤ６００が０．４～０．６の範囲に達した後、イソプロピル－β－Ｄ－チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を終濃度０．５ｍＭになるよう添加し、更に２０時間振盪培養した。培養終了後、培養液を遠心分離して上清を除去し、菌体を回収した。
　得られた菌体から定法により粗タンパク質抽出液を取得し、ＴＡＬＯＮ　Ｍｅｔａｌ　Ａｆｆｉｎｉｔｙ　Ｒｅｓｉｎ（タカラバイオ株式会社製）を用いて、該抽出液から各種ＰＥＴ２酵素液を回収した。該酵素液を、１００ｍＭ　炭酸ナトリウムバッファー（ｐＨ９．２）にて希釈し、Ａｍｉｃｏｎ　Ｕｌｔｒａ－４（メルクミリポア社製）を用いて濃縮、脱塩処理し、各種ＰＥＴ２精製酵素を得た。
（２）ＰＥＴ分解活性の測定
　以下の酵素反応により、各種ＰＥＴ２精製酵素のＰＥＴ分解活性を測定し、各変異点の導入による効果を比較した。
　各種ＰＥＴ２精製酵素５μｇ、１００ｍＭ　炭酸ナトリウムバッファー（ｐＨ９．２）、１ｍＭまたは１０ｍＭの塩化マグネシウム及びＰＥＴフィルム断片（ミネロン化成工業株式会社製Ａ－ＰＥＴ）０．０１ｇからなる反応液０．５ｍＬを調製し、６０℃で２４時間酵素反応を行った。反応終了後、ＰＥＴ分解により生成したＴＰＡおよびＭＨＥＴをＨＰＬＣにて分析した。各種ＰＥＴ２精製酵素の変異点、反応液中の塩化マグネシウム（ＭｇＣｌ２）の濃度（ｍＭ）、各種ＰＥＴ２精製酵素の酵素反応により生成されたＴＰＡ及びＭＨＥＴの濃度（ｍＭ）並びにこれらの合計値（ｍＭ）を表３に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
　表３に示す通り、野生型ＰＥＴ２の精製酵素及び比較変異型ＰＥＴ２の精製酵素に比べて、いずれの本実施形態に係る変異型ＰＥＴ２にかかる精製酵素においても、酵素反応により生成されるＴＰＡ及びＭＨＥＴの濃度量、及び、これらの合計値（以下、分解量という。）が増加しており、変異点の導入によりＰＥＴ分解活性が向上したことが示された。特に、変異点Ｌ７３Ｑを導入した精製酵素については、当該変異を導入しない精製酵素と比較して分解量が６．７ｍＭ増加しており、当該変異点がＰＥＴ分解活性の向上に大きく寄与することが示された。同様に、変異点Ｑ１３４Ｇを導入した精製酵素については、当該変異を導入しない精製酵素と比較して分解量が５．７ｍＭ増加しており、当該変異点がＰＥＴ分解活性の向上に大きく寄与することが示された。また、変異点Ａ１４４Ｃについては、変異点Ｇ７６Ｃと組み合わせて導入することにより分解量が２．５ｍＭ増加しており、変異点Ａ１４４Ｃ及びＧ７６Ｃの組み合わせがＰＥＴ分解活性の向上に大きく寄与することが示された。
　さらに、反応液中の塩化マグネシウム濃度は１０ｍＭの場合より１ｍＭの場合の方が分解量が多く、本実施形態に係る変異型ＰＥＴ２によるＰＥＴの分解に適した濃度であることが示された。
［実施例３］既報変異型ＰＥＴ２と本実施形態に係る変異型ＰＥＴ２によるＰＥＴ分解活性の比較
（１）既報変異型ＰＥＴ２の発現プラスミドの造成
　既報変異型ＰＥＴ２として、非特許文献３に記載の変異型ＰＥＴ２（配列番号３）（以下、ＰＥＴ２ｓという。）をコードする遺伝子の塩基配列からなるＤＮＡ（配列番号４）を鋳型とし、配列番号２３および２４で表される塩基配列からなるＤＮＡをプライマーセットに用いてＰＣＲを行い、ＰＥＴ２ｓのＤＮＡ断片を得た。配列番号４で表されるＤＮＡは、人工合成により調製した。
　上記で得られたＰＥＴ２ｓのＤＮＡ断片と発現ベクターｐＥＴ２８ａを、Ｉｎ－Ｆｕｓｉｏｎ　ＨＤ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　Ｋｉｔを用いて連結することにより、ＰＥＴ２ｓの発現プラスミドｐＥＴ２８ａ－ＰＥＴ２ｓを得た。
（２）ＰＥＴ２ｓ発現プラスミドを有する微生物の造成
　（１）で造成したプラスミドをＳＨｕｆｆｌｅ　Ｔ７　Ｅｘｐｒｅｓｓ　Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ　Ｅ．　ｃｏｌｉへ形質転換し、ＰＥＴ２ｓ株を得た。
（３）ＰＥＴ２ｓ精製酵素の取得
　（２）で得た形質転換体をＬＢプレート上で３０℃にて２４時間培養し、１００ｍｇ／Ｌのカナマイシンを含むＬＢ培地５ｍＬが入った大型試験管に植菌して３０℃で２０時間、振盪培養した。その後、得られた培養液を、１００ｍｇ／Ｌのカナマイシンを含むＬＢ培地３０ｍＬが入ったフラスコに０．６ｍＬ植菌し、３７℃で振盪培養した。菌体ＯＤ６００が０．４～０．６の範囲に達した後、ＩＰＴＧを終濃度０．５ｍＭになるよう添加し、更に２０時間振盪培養した。培養終了後、培養液を遠心分離して上清を除去し、菌体を回収した。
　得られた菌体から定法により粗タンパク質抽出液を取得し、ＴＡＬＯＮ（登録商標）　Ｍｅｔａｌ　Ａｆｆｉｎｉｔｙ　Ｒｅｓｉｎ（タカラバイオ株式会社製）を用いて、該抽出液からＰＥＴ２ｓ酵素液を回収した。該酵素液を、１００ｍＭ　炭酸ナトリウムバッファー（ｐＨ９．２）にて希釈し、Ａｍｉｃｏｎ（登録商標）　Ｕｌｔｒａ－（メルクミリポア社製）を用いて濃縮、脱塩処理し、ＰＥＴ２ｓ精製酵素を得た。
（４）ＰＥＴ分解活性の評価
　以下の酵素反応により、ＰＥＴ２ｓ精製酵素及び実施例１で得られた４種の本実施形態に係る変異型ＰＥＴ２精製酵素のＰＥＴ分解活性を測定した。
　各精製酵素５μｇ、１００ｍＭ　炭酸ナトリウムバッファー（ｐＨ９．２）、１０ｍＭの塩化マグネシウム及びＰＥＴフィルム断片０．０１ｇからなる反応液０．５ｍＬを調製し、６０℃で２４時間酵素反応を行った。反応終了後、ＰＥＴ分解により生成したＴＰＡおよびＭＨＥＴをＨＰＬＣにて分析した。各種ＰＥＴ２精製酵素の変異点、各精製酵素の酵素反応により生成されたＴＰＡ及びＭＨＥＴの濃度量（ｍＭ）並びにこれらの合計値（ｍＭ）（分解量）を表４に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
　表４に示される通り、Ｌ１０３Ｋ、Ｇ７６Ｃ、Ａ１４４Ｃ及びＱ１３４Ｇの変異を導入した本実施形態に係る変異型ＰＥＴ２にかかる精製酵素、Ｌ１０３Ｋ、Ｇ７６Ｃ、Ａ１４４Ｃ、Ｑ１３４Ｇ及びＡ２２２Ｍの変異を導入した本実施形態に係る変異型ＰＥＴ２にかかる精製酵素、Ｌ１０３Ｋ、Ｇ７６Ｃ、Ａ１４４Ｃ、Ｑ１３４Ｇ、Ａ２２２Ｍ及びＬ７３Ｑの変異を導入した本実施形態に係る変異型ＰＥＴ２にかかる精製酵素、並びに、Ｌ１０３Ｋ、Ｇ７６Ｃ、Ａ１４４Ｃ、Ｑ１３４Ｇ、Ａ２２２Ｍ、Ｌ７３Ｑ及びＩ２０３Ｔの変異を導入した本実施形態に係る変異型ＰＥＴ２にかかる精製酵素については、いずれもＰＥＴ２ｓより分解量が多く、ＰＥＴ分解活性が高いことが示された。
　以上、各種の実施の形態について説明したが、本発明はかかる例に限定されないことは言うまでもない。当業者であれば、特許請求の範囲に記載された範疇内において、各種の変更例又は修正例に想到し得ることは明らかであり、それらについても当然に本発明の技術的範囲に属するものと了解される。また、発明の趣旨を逸脱しない範囲において、上記実施の形態における各構成要素を任意に組み合わせてもよい。
　なお、本出願は、２０２２年１２月９日出願の日本特許出願（特願２０２２－１９７４０９）に基づくものであり、その内容は本出願の中に参照として援用される。
　本発明の一態様に係る蛋白質は、特定箇所のアミノ酸残基置換を含むことで、その置換を有さない蛋白質に比べて高いＰＥＴ分解活性を有する。
配列番号１：ＰＥＴ２のアミノ酸配列
配列番号２：ＰＥＴ２の塩基配列
配列番号３：ＰＥＴ２ｓのアミノ酸配列
配列番号４：ＰＥＴ２ｓの塩基配列
配列番号５：ＰＥＴ２断片増幅用プライマーＦｗの塩基配列
配列番号６：ＰＥＴ２断片増幅用プライマーＲｖの塩基配列
配列番号７：Ｌ１０３Ｋ断片増幅用プライマーＦｗの塩基配列
配列番号８：Ｌ１０３Ｋ断片増幅用プライマーＲｖの塩基配列
配列番号９：Ｇ７６Ｃ断片増幅用プライマーＦｗの塩基配列
配列番号１０：Ｇ７６Ｃ断片増幅用プライマーＲｖの塩基配列
配列番号１１：Ａ１４４Ｃ断片増幅用プライマーＦｗの塩基配列
配列番号１２：Ａ１４４Ｃ断片増幅用プライマーＲｖの塩基配列
配列番号１３：Ｑ１３４Ｇ断片増幅用プライマーＦｗの塩基配列
配列番号１４：Ｑ１３４Ｇ断片増幅用プライマーＲｖの塩基配列
配列番号１５：Ａ２２２Ｍ断片増幅用プライマーＦｗの塩基配列
配列番号１６：Ａ２２２Ｍ断片増幅用プライマーＲｖの塩基配列
配列番号１７：Ｗ２５４Ｆ断片増幅用プライマーＦｗの塩基配列
配列番号１８：Ｗ２５４Ｆ断片増幅用プライマーＲｖの塩基配列
配列番号１９：Ｎ２５７Ｄ断片増幅用プライマーＦｗの塩基配列
配列番号２０：Ｎ２５７Ｄ断片増幅用プライマーＲｖの塩基配列
配列番号２１：Ｌ１０３Ｄ断片増幅用プライマーＦｗの塩基配列
配列番号２２：Ｌ１０３Ｄ断片増幅用プライマーＲｖの塩基配列
配列番号２３：ＰＥＴ２ｓ断片増幅用プライマーＦｗの塩基配列
配列番号２４：ＰＥＴ２ｓ断片増幅用プライマーＲｖの塩基配列

Claims (12)

  1. 　配列番号１で表されるアミノ酸配列において、以下の［１］～［７］からなる群より選ばれる少なくとも１の改変が導入されたアミノ酸配列からなる蛋白質。
    ［１］１０３番目のアミノ酸残基をリジン残基に置換する改変
    ［２］７６番目のアミノ酸残基をシステイン残基に置換する改変
    ［３］１４４番目のアミノ酸残基をシステイン残基に置換する改変
    ［４］１３４番目のアミノ酸残基をグリシン残基に置換する改変
    ［５］２２２番目のアミノ酸残基をメチオニン残基に置換する改変
    ［６］７３番目のアミノ酸残基をグルタミン残基に置換する改変
    ［７］２０３番目のアミノ酸残基をスレオニン残基に置換する改変
  2. 　配列番号１で表されるアミノ酸配列に対して１～２０個のアミノ酸残基が欠失、置換、挿入及び付加の少なくとも１からなる改変を有する変異蛋白質（Ｂ）のアミノ酸配列において、以下の［１´］～［７´］からなる群より選ばれる少なくとも１の改変が導入されたアミノ酸配列からなり、前記変異蛋白質（Ｂ）に比べて高いポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）分解活性を有する蛋白質。
    ［１´］配列番号１の１０３番目のアミノ酸残基に対応するアミノ酸残基をリジン残基に置換する改変
    ［２´］配列番号１の７６番目のアミノ酸残基に対応するアミノ酸残基をシステイン残基に置換する改変
    ［３´］配列番号１の１４４番目のアミノ酸残基に対応するアミノ酸残基をシステイン残基に置換する改変
    ［４´］配列番号１の１３４番目のアミノ酸残基に対応するアミノ酸残基をグリシン残基に置換する改変
    ［５´］配列番号１の２２２番目のアミノ酸残基に対応するアミノ酸残基をメチオニン残基に置換する改変
    ［６´］配列番号１の７３番目のアミノ酸残基に対応するアミノ酸残基をグルタミン残基に置換する改変
    ［７´］配列番号１の２０３番目のアミノ酸残基に対応するアミノ酸残基をスレオニン残基に置換する改変
  3. 　配列番号１で表されるアミノ酸配列と８０％以上の同一性を有する相同蛋白質（Ｃ）のアミノ酸配列において、以下の［１´´］～［７´´］からなる群より選ばれる少なくとも１の改変が導入されたアミノ酸配列からなり、前記相同蛋白質（Ｃ）に比べて高いポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）分解活性を有する蛋白質。
    ［１´´］配列番号１の１０３番目のアミノ酸残基に対応するアミノ酸残基をリジン残基に置換する改変
    ［２´´］配列番号１の７６番目のアミノ酸残基に対応するアミノ酸残基をシステイン残基に置換する改変
    ［３´´］配列番号１の１４４番目のアミノ酸残基に対応するアミノ酸残基をシステイン残基に置換する改変
    ［４´´］配列番号１の１３４番目のアミノ酸残基に対応するアミノ酸残基をグリシン残基に置換する改変
    ［５´´］配列番号１の２２２番目のアミノ酸残基に対応するアミノ酸残基をメチオニン残基に置換する改変
    ［６´´］配列番号１の７３番目のアミノ酸残基に対応するアミノ酸残基をグルタミン残基に置換する改変
    ［７´´］配列番号１の２０３番目のアミノ酸残基に対応するアミノ酸残基をスレオニン残基に置換する改変
  4. 　請求項１～３のいずれか１項に記載の蛋白質をコードするＤＮＡ。
  5. 　請求項４に記載のＤＮＡを含有する組換え体ＤＮＡ。
  6. 　請求項５に記載の組換え体ＤＮＡで宿主細胞を形質転換して得られる形質転換体。
  7. 　請求項１～３のいずれか１項に記載の蛋白質を用いて、ＰＥＴを分解する方法。
  8. 　請求項１～３のいずれか１項に記載の蛋白質、ＰＥＴ、塩化マグネシウム及び炭酸ナトリウムを含む反応液中でＰＥＴを分解することを含む、請求項７に記載のＰＥＴを分解する方法。
  9. 　前記反応液中の塩化マグネシウムの濃度が０．１ｍＭ～５ｍＭである、請求項８に記載のＰＥＴを分解する方法。
  10. 　請求項１～３のいずれか１項に記載の蛋白質を用いてＰＥＴを分解することを含む、テレフタル酸（ＴＰＡ）及びモノヒドロキシエチルテレフタレート（ＭＨＥＴ）の少なくとも一方を製造する方法。
  11. 　請求項１～３のいずれか１項に記載の蛋白質、ＰＥＴ、塩化マグネシウム及び炭酸ナトリウムを含む反応液中でＰＥＴを分解することを含む、請求項１０に記載のＴＰＡ及びＭＨＥＴの少なくとも一方を製造する方法。
  12. 　前記反応液中の塩化マグネシウムの濃度が０．１ｍＭ～５ｍＭである、請求項１１に記載のＴＰＡ及びＭＨＥＴの少なくとも一方を製造する方法。
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PCT/JP2023/044010 WO2024122636A1 (ja) 2022-12-09 2023-12-08 ポリエチレンテレフタレート分解活性を有する蛋白質及びポリエチレンテレフタレートを分解する方法

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Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2015119670A (ja) * 2013-12-24 2015-07-02 国立大学法人京都工芸繊維大学 新規なクチナーゼ、クチナーゼをコードする遺伝子、及びクチナーゼを用いたポリエステル又はエステル化合物の分解方法

Patent Citations (1)

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Title
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