WO2024115365A1 - Dendrimer-functionalized solid support, biochip comprising such a solid support and use for detecting a target molecule in a medium - Google Patents
Dendrimer-functionalized solid support, biochip comprising such a solid support and use for detecting a target molecule in a medium Download PDFInfo
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Classifications
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- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
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- G01N33/54353—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals with ligand attached to the carrier via a chemical coupling agent
Definitions
- the present invention is part of the field of detection of target molecules in a given medium, in particular a biological sample.
- the present invention relates to a solid or semi-solid support functionalized by phosphorus dendrimers, a process for the preparation of such a support, and its use for the manufacture of a biochip.
- the invention also relates to a biochip comprising such a support and its use for the detection of a target molecule in a sample.
- the detection of molecules, chemical or biochemical, within a given environment is defined as the perception, via the implementation of a device and/or a physico-chemical or biochemical process, of the presence or the absence of targeted molecules.
- Such detection is of interest in numerous applications, to meet different purposes, such as medical or health diagnosis (detection of molecular markers associated with a disease or molecules constituting organisms, particularly pathogenic ones), environmental diagnosis (detection of molecules pollutants, detection of microorganisms present in a given environment), microbial and/or agronomic selection and/or identification (detection of transcripts following the expression of genes or protein molecules produced from these transcripts), etc.
- the target molecules can be of all types; they can be organic molecules (nucleic acids, proteins, polysaccharides, fatty acid chains, etc.) and it is important to be able to have detection methods adapted to their structural and functional specificities.
- detection solutions based on genomic technologies exploit genome sequencing data which is deposited in public databases such as NCBI.
- Public research laboratories and manufacturers use it on a massive scale for the detection of molecules of interest, with applications in different fields of activity (human health, plant breeding, agri-food, etc.).
- PCR Polymerization Chain Reaction
- Biochips constitute detection technologies resulting from the combination of skills in chemistry, biology, microelectronics, and bioinformatics. More specifically, these are tools allowing the analysis of interactions between a probe fixed on a support and a target.
- the support solid or semi-solid, is functionalized by a molecule presenting free functions to which probe molecules are fixed, capable of interacting specifically with one or more given target molecules, also called molecules of interest, the possible presence of which we wish to determine in an environment.
- the probe molecules are typically biomolecules of a different nature depending on the type of biochip concerned: we can cite, in a non-exhaustive manner, nucleic acids (DNA biochips), proteins or peptides (protein biochips), glycans or glycosylated biomolecules (biochips). sugars), or whole cells (cell biochips).
- DNA biochips nucleic acids
- proteins or peptides protein biochips
- biochips proteins or peptides
- biochips glycans or glycosylated biomolecules
- sugars or whole cells
- whole cells cell biochips
- the biochip disclosed in this document uses a support comprising at least one surface covalently functionalized by phosphorus dendrimers having a central core which contains at least two functional groups and up to 12 layers of dendrimeric units carrying phosphorus atoms which make it possible to stiffen the structure to ensure good detection sensitivity to the biochip.
- These phosphorus dendrimers which have a size between 1 and 20 nanometers, have at their periphery several functions capable of allowing the fixation or in situ synthesis of probe molecules.
- dendrimers are generally constructed by the iterative succession of two synthesis steps from the core.
- the first step is the formation of free aldehyde functions on the molecule.
- the second step creates the branching points between the successive layers and consists of a condensation reaction with a compound having two types of functions: an NH2 group and at least one PCI2 group.
- the iterative sequence of synthesis steps makes it possible to construct dendrimers of increasing generation.
- the formation of a phosphorus dendrimer of sufficient size for its implementation within a high-performance biochip requires at least 1 1 synthesis steps.
- the biochips described in this paper exhibit good performance with low background noise and high detection signal intensity.
- the present invention aims to propose a functionalized support allowing the manufacture of a biochip which is just as efficient as the biochips of the prior art, and which is even more efficient in terms of sensitivity and/or reproducibility of detection, this functionalized support being easier, faster and less expensive to manufacture than the functionalized supports with phosphorous dendrimers for biochips proposed by the prior art, in particular as described above.
- the present invention proposes a solid or semi-solid support, called a “functionalized support”, comprising a surface on which phosphorus dendrimers are fixed comprising at their periphery at least one functional group for their covalent bond to said support. and at least one free functional group.
- These dendrimers consist of a central phosphorus core P0 comprising at least two groups from which several successive layers are formed, comprising: - n intermediate layers, identical or different, n being an integer between 1 and 4, each of the intermediate layers consisting of units P1, identical or different, each responding to general formula (I): in which: R 1 represents an oxygen atom, a sulfur atom, a silicon atom, an -NH- or -NR 4 group - where R 4 represents a linear, branched and/or cyclic, saturated or unsaturated alkyl group , comprising from 1 to 5 carbons, or R 1 represents a carbon radical, saturated or unsaturated, linear, branched and/or cyclic, comprising from 1 to 6 carbon atoms, optionally substituted and/or optionally interrupted by one or more chosen heteroatoms among O, N, Si and S, Ar 1 represents an aromatic ring comprising 6 or 8 members, optionally substituted by one or more linear, branched and/or cyclic alkyl groups each
- R 2 and R 3 identical or different, each represent a saturated or unsaturated carbon radical, linear or branched, comprising from 1 to 3 carbon atoms, said intermediate layers being devoid of phosphorus atom,
- R 5 represents an oxygen atom, a sulfur atom, a silicon atom, an -NH- or -NR 8 group - where R 8 represents a linear, branched and/or cyclic, saturated or unsaturated alkyl group, comprising 1 to 5 carbons, or R 5 represents a carbon radical, saturated or unsaturated, linear, branched and/or cyclic, comprising from 1 to 6 carbon atoms, optionally substituted and/or optionally interrupted by one or more heteroatoms chosen from O, N, Si and S,
- Ar 2 represents an aromatic ring comprising 6 or 8 members, optionally substituted by one or more linear, branched and/or cyclic alkyl groups each comprising 1 to 3 carbons,
- R 6 and R 7 do not simultaneously represent a hydrogen atom.
- part of said functional groups entering into the constitution of R 6 and/or R 7 are involved in the covalent bonding of the dendrimers to the surface of the support, the other part remaining free and being able to in particular be used for the subsequent fixation or in situ synthesis of probe molecules in the context of an application of the support according to the invention to the manufacture of a biochip.
- Dendrimers are polymers with a branched tree structure formed by an iterative process from a central core comprising several reactive functions, by repetitive radial branching, from this central core, of concentric branches, each carrying several reactive functions for branching the next level of branches. Each new generation of dendrimer is obtained by introducing a new level of branching onto the previous one.
- dendrimers for the manufacture of biochips, as spacer arms between a solid or semi-solid support and probe molecules of a biochip, proves to be particularly advantageous due to their structural properties. specific. More precisely, the large number of free functional groups which are present at the periphery of the dendrimers makes it possible to fix a high density of probe molecules per unit surface of the support, as well as better accessibility of the probe molecules, which advantageously results in sensitivity. high detection.
- the support according to the present invention advantageously takes advantage of these general properties of dendrimers.
- the functionalized support meeting the definition of the present invention that is to say comprising dendrimers having the particular chemical structure above described, when integrated into a biochip, gives the latter particularly good properties in terms of reliability, reproducibility and detection sensitivity.
- the dendrimers in accordance with the invention have a small size, due to the low number of intermediate layers that they include, and therefore include a reduced number of free functions at their surface for the attachment of probe molecules, and that on the other hand, they are devoid of phosphorus atoms in their intermediate layers, phosphorus atoms which the person skilled in the art knows that they stiffen the structure of the dendrimers, and that this contributes to the performance of the biochips in which they are integrated.
- the inventors have demonstrated that dendrimers as defined above, used to functionalize a biochip, make it possible to obtain a detection signal of greater intensity than that obtained with a biochip using the dendrimers proposed by the prior art, in which each of the intermediate layers contains phosphorus atoms, and which nevertheless present on the periphery a much larger number of free functional groups for the connection of probe molecule(s).
- the inventors have thus shown that the biochips formed from a functionalized support according to the invention present better performances in terms of reliability, reproducibility and detection sensitivity, which is demonstrated in particular by the obtaining of better defined and rounder detection spots than those obtained with biochips integrating dendrimers of the prior art.
- the support according to the invention can be solid or semi-solid in nature, such as a gel. It can be rigid or flexible, and have any shape. Its surface functionalized by the dendrimers is preferably substantially planar.
- the support is formed of glass, silicon, plastic or metal.
- Supports that can be used in the context of the invention are for example blades, beads and glass capillaries, or even supports comprising at least one gold surface.
- the surface of the support may have been subjected to a pretreatment aimed at fixing one or more functional group(s) capable of reacting with free functional groups of dendrimers, to allow the fixation of the latter by covalent bond on this surface. It is within the skills of those skilled in the art to determine which pretreatment must be carried out, and in what manner, depending on the particular material constituting the surface of the support and the functional groups present at the periphery of the dendrimers. As an example of such a treatment, when the support is formed from glass, it may have previously been subjected to pretreatment by silanization of its surface, carried out in a conventional manner in itself.
- the dendrimers of the support according to the invention may have one or more of the following characteristics, implemented separately or according to each of their technically effective combinations.
- the central core P0 of the dendrimers can include at least two groups onto which the P1 units of the first intermediate layer are grafted.
- the central core P0 comprises at least three such groups, preferably at least four, and more preferably at least five.
- the central core P0 may in particular comprise six groups onto which the units P1 of the first intermediate layer are grafted.
- the central core P0 of the dendrimers corresponds to the following formula (IlIa):
- the central nucleus P0 can otherwise for example respond to the following formula (IIIb), formula (Ille) or formula (llld):
- the number of intermediate layers of the dendrimers according to the invention can be between 1 and 4. It is preferably equal to 2 or 3. Each of these successive intermediate layers comprises twice as many P1 units as the previous intermediate layer.
- the P1 units within the same intermediate layer of the dendrimer can be different from each other. They are preferably all identical. Likewise, the P1 units of one intermediate layer may be different from the P1 units of another intermediate layer. In preferred embodiments of the invention, in particular particularly advantageous in terms of the ease of the mode of synthesis, all of the P1 units of all the intermediate layers of the dendrimers are identical to each other. One or more, preferably all, of the P1 units of the dendrimer according to the invention may meet one or more of the characteristics below.
- the aromatic ring Ar 1 may be a heterocycle, comprising for example one or more atoms of oxygen, nitrogen and/or sulfur in place of one or more carbon atoms of the ring. It is preferably made up only of carbon atoms.
- R 1 , R 2 and R 3 can be arranged at any position relative to each other on the aromatic ring Ar 1 . Preferably, they are not located on adjacent atoms of the cycle, in particular in an ortho position relative to each other in the case of a 6-membered aromatic ring.
- R 2 and R 3 are preferably located in the meta position relative to each other. They are also preferably each located in meta position relative to R 1 .
- the aromatic ring Ar 1 may also be substituted, on one or more of its atoms forming the ring not linked to R 1 , R 2 or R 3 , in particular on all these unbonded atoms, by one or more groups, which may be identical or different, each chosen from methyl, ethyl, n-propyl, isopropyl, or cyclopropyl groups.
- Ar 1 is not substituted on any of its ring atoms not linked to R 1 , R 2 or R 3 .
- R 2 and R 3 are preferably identical.
- R 1 represents an oxygen atom, a sulfur atom, a silicon atom, a group -NH- or -NR 4 - where R 4 represents a methyl group,
- Ar 1 represents an aromatic ring, preferably 6-membered, unsubstituted
- R 2 and R 3 each represent a linear alkyl radical comprising 1, 2 or 3 carbon atoms, in particular a methylene radical -CH 2 -.
- At least one, preferably each, unit P1 of the intermediate layers of the dendrimers can correspond to one of the following formulas (la) to (le): in which Ar 1 preferably represents an unsubstituted 6 or 8-membered aromatic ring, and/or R 2 and R 3 are identical and preferably represent a linear alkyl radical comprising 1, 2 or 3 carbon atoms, in particular a radical methylene, in which R 2 and R 3 are identical and preferably represent a linear alkyl radical comprising 1, 2 or 3 carbon atoms, in particular a methylene radical, in which Ar 1 preferably represents an unsubstituted 6- or 8-membered aromatic ring, in which R 1 preferably represents an oxygen atom, a sulfur atom, a silicon atom, an -NH- or -NR 4 group - where R represents a methyl group, and/or Ar 1 preferably represents a cycle unsubstituted 6- or 8-membered aromatic, in which R 1 preferably represents an oxygen atom,
- P1 units of the intermediate layers of the dendrimers correspond to the following formula (If):
- the outer layer of the dendrimers according to the invention may comprise, depending on the number of intermediate layers of the latter, and the number of groups of the central core P0 to which units P1 of the first intermediate layer are connected, from 4 to 64 units P2. It preferably comprises from 6 to 48, preferably from 12 to 24, P2 units.
- P2 units may be different from each other. They are preferably all identical. One or more, preferably all, of the P2 units of the dendrimer according to the invention may meet one or more of the characteristics below.
- the Ar 2 aromatic ring may be a heterocycle, comprising for example one or more oxygen, nitrogen and/or sulfur atoms in place of one or more carbon atoms forming the cycle. It is preferably made up only of carbon atoms.
- the groups R 5 , R 6 and R 7 can be arranged at any position relative to each other on the aromatic ring Ar 2 . Preferably, they are not located on adjacent atoms of the cycle, in particular in an ortho position relative to each other in the case of a 6-membered aromatic ring.
- Ar 2 represents a 6-membered aromatic ring
- R 6 and R 7 when R 6 and R 7 are both different from a hydrogen atom, they are preferably located in the meta l position. one in relation to the other. They are also preferably each located in meta position relative to R 5 .
- R 6 and R 7 represents a hydrogen atom
- the other of these groups is preferably located in the para position relative to R 5 .
- the Ar 2 aromatic ring may also be substituted, on one or more of its ring atoms not linked to R 5 , R 6 or R 7 , or even on all of these atoms, by one or more groups, which may be identical or different. , each chosen from methyl, ethyl, n-propyl, isopropyl or cyclopropyl groups.
- Ar 2 is not substituted on any of its ring atoms not linked to R 5 , R 6 or R 7 .
- R 6 and R 7 are identical. In particular alternative embodiments, they are different, one of them then preferably representing a hydrogen atom.
- R 5 represents an oxygen atom, a sulfur atom, a silicon atom, or an -NH- or -NR 8 group where R 8 represents a methyl group
- Ar 2 represents an aromatic ring, preferably with 6 members, unsubstituted
- DNA deoxyribonucleic acid
- At least one, preferably each, P2 unit of the outer layer of the dendrimers can correspond to one of the following formulas (IIa) to (llj): in which R 5 preferably represents an oxygen atom, a sulfur atom, a silicon atom, an -NH- or -NR 8 group - where R 8 represents a methyl group, and/or Ar 2 preferably represents a unsubstituted 6- or 8-membered aromatic ring, in which R 5 preferably represents an oxygen atom, a sulfur atom, a silicon atom, an -NH- or -NR 8 group - where R 8 represents a methyl group, and/or Ar 2 preferably represents a unsubstituted 6- or 8-membered aromatic ring, in which R 5 preferably represents an oxygen atom, a sulfur atom, a silicon atom, an -NH- or -NR 8 group - where R 8 represents a methyl group, in which R 5 preferably represents
- the dendrimers according to the invention preferably correspond to the following general formula (IV): in which m is an integer greater than or equal to 2, in particular between 2 and 8 and for example equal to 6, P0 represents the central nucleus of the dendrimers, and R 1 , R 2 , R 3 , R 5 , R 6 , R 7 , Ar 1 , Ar 2 and n are as defined above.
- the dendrimers correspond to one of the following formulas (IVa) to (IVf):
- n is between 1 and 4, and is in particular equal to 2 or 3.
- the dendrimers according to the invention can be synthesized in any way known to those skilled in the art, in particular by repetition of the same reaction sequence allowing a new generation to be obtained at the end of each sequence.
- the dendrimers according to the invention can be synthesized according to the method presented in the following publication: Karpus et al., Crown Macromolecular Derivatives: Stepwise Design of New Types of Polyfunctionalized Phosphorus Dendrimers. The Journal of Organic Chemistry, 2022, vol. 87, no. 5, p. 3433-3441.
- the present invention relates to a process for preparing a solid or semi-solid support according to the invention, which comprises a step of fixing, in particular by covalent bond, dendrimers as defined above on said surface of the support.
- This fixing step can be carried out by reaction of functional groups of the dendrimers with chemical functions carried by the surface of the support which are capable of reacting with these functional groups to form a covalent bond.
- the free functional groups of the dendrimers are aldehyde groups
- the surface of the support on which the dendrimers must be fixed comprises amine functions.
- the step of fixing the dendrimers on the solid support or semi-solid then preferably comprises the immersion of the surface of the support carrying the amine functions in a bath containing the dendrimers in a solvent, for a period preferably between 10 minutes and 24 hours, preferably between 1 and 12 hours and preferably still between 2 and 8 hours.
- the solvent used is preferably an aprotic solvent, preferably polar, such as tetrahydrofuran.
- the method according to the invention may include, if necessary, a preliminary step of functionalization of the surface of the support to provide it with the required functions. It is within the skills of those skilled in the art to determine the operating conditions, and the reagents to be used, depending on each particular combination of material forming the solid support and functional groups carried by the dendrimers on their periphery. .
- this functionalization step can be carried out by a silanization reaction, carried out in a conventional manner in itself. , by means of a silanization active ingredient comprising amine functions capable of reacting with the functional groups of the dendrimers.
- the step of fixing the dendrimers to the surface of the support is carried out directly, without a prior step of specific functionalization of the surface of the support.
- the method according to the invention may further comprise, in the initial step, an optional step of cleaning the surface of the support to be functionalized by the dendrimers.
- This cleaning step can be carried out in any conventional manner in itself, for example using an alkaline solution, in particular based on sodium hydroxide. In particular embodiments of the invention, it is carried out by immersing the surface of the support in such an alkaline solution.
- the cleaning step can optionally be followed by a drying step, for example under a stream of nitrogen or by centrifugation.
- the quantity of dendrimers deposited on the support can in particular be between 0.1 and 1000 pg per cm 2 of support, for example be approximately equal to 50 pg/cm 2 .
- the present invention relates to the use of a solid or semi-solid support according to the invention for the manufacture of a biochip.
- the invention is also expressed in this regard in the terms of a process for manufacturing a biochip using a solid or semi-solid support according to the invention.
- biochip is understood to mean, in a conventional manner in itself, any system, preferably miniaturized, comprising a support on which molecules, called probe molecules, are immobilized, in particular covalently, each at a specific location. precision of the support, for the analysis of interactions of these probe molecules with target molecules in solution.
- the manufacture of the biochip comprises the covalent bonding of at least one molecule, called the probe molecule, preferably of a plurality of probe molecules, to free functional groups of the dendrimers grafted onto the surface of the support.
- the probe molecules are chosen according to the targeted target molecules. They can be of any nature or origin. These may in particular be nucleic acid molecules, peptides, proteins, polysaccharides, carbohydrates, glycosides, in particular amino glycosides, lipids, etc.
- the probe molecules may consist of single-stranded or double-stranded nucleic acid molecules, of natural or synthetic origin, for example consist of aptamers, or of amplicons obtained by polymerase chain reaction (PCR). ), which can be of any size, for example up to 500 nucleotides.
- the nucleic acid molecules are oligonucleotides obtained by chemical synthesis, by techniques known to those skilled in the art, preferably having a size of between 15 and 50 nucleotides.
- the probe molecules may otherwise consist of or include peptides and/or pseudo-peptides. Preferably, these peptides are chosen to possess a free amine function. Peptides comprising a lysine, arginine, glutamine, asparagine and/or histidine residue are thus particularly preferred in the context of the invention.
- the free functional groups of the dendrimers are aldehyde groups
- the probe molecule(s) contain at least one amine function.
- the probe molecule may have been previously modified to introduce a function capable of reacting with free functional groups of the dendrimers.
- the probe molecule may have been modified to introduce an amine function capable of reacting with free aldehyde groups located at the periphery of the dendrimers.
- the manufacture of the biochip notably comprises a step of ordered addressing of the probe molecules on the surface of the functionalized support according to the invention, following a given geometric arrangement, for their connection with the dendrimers which are immobilized there, this step being able to be carried out by any conventional manner for those skilled in the art.
- the arrangement made is preferably adapted to the mode of reading the biochip envisaged.
- the probe molecules can be addressed on the surface of the support using a needle or inkjet robot.
- the deposition patterns are round spots, the size of which is compatible with the resolution of the fluorescence reading scanner.
- the probe molecules are preferably ordered on the functionalized support according to so-called diffracting patterns, the size and shape of which depend on the reading system of diffraction.
- the addressing of the probe molecules can then, for example, be carried out using a microcontact printing technique. All of the above techniques are well known to those skilled in the art, who know how and by means of which devices to implement them.
- Contact between the functionalized support and the probe molecules is maintained for a sufficient time, and carried out under suitable conditions, to allow the grafting of the probe molecules onto the dendrimers.
- This contacting can be followed by a washing step, in order to eliminate all unbound molecules, and by an optional drying step, for example under a stream of nitrogen or by centrifugation.
- Another object of the invention is a biochip, which comprises a solid or semi-solid support according to the invention and at least one molecule, called a probe molecule, preferably a plurality of probe molecules, attached covalently to free functional groups of the dendrimers of the support.
- the probe molecules may respond to one or more of the characteristics described above with reference to the use of a functionalized support according to the invention for the manufacture of a biochip.
- the biochip according to the invention may in particular be a DNA biochip or an RNA biochip. It may in particular be a genomic or transcriptomic type DNA chip comprising respectively DNA fragments obtained by Polymerase Chain Reaction (PCR) or DNA transcripts.
- PCR Polymerase Chain Reaction
- the biochip which is the subject of the present invention can be used for the search, in a medium, for a particular target molecule with which the probe molecule is able to interact, and find application in multiple fields.
- another aspect of the invention concerns the use of a biochip according to the invention for the detection, in a sample, of a target molecule with which the probe molecule is able to interact in a specific manner.
- This sample can be of any type. It may in particular be a biological sample, in particular from an individual in an advantageous field of application of the biochip according to the invention which is medical diagnosis.
- the probe molecule can in particular be:
- nucleotide probe for example DNA
- DNA for the analysis of DNA-DNA and/or DNA-RNA interactions, for example for the detection of specific DNA of a pathogen or to detect mutations of a gene predisposing patients to a certain type of disease
- the detection of the interaction between the probe molecule and the target molecule can be carried out by any conventional technique in itself.
- the target molecule can be previously marked by a conventional detectable marker in itself, in particular by a fluorescent marker such as a fluorophore, or by a label having a strong binding affinity with a partner itself linked to a detectable marker, so as to generate a detectable and where appropriate quantifiable signal, in particular a fluorescence signal.
- a conventional detectable marker in itself, in particular by a fluorescent marker such as a fluorophore, or by a label having a strong binding affinity with a partner itself linked to a detectable marker, so as to generate a detectable and where appropriate quantifiable signal, in particular a fluorescence signal.
- the detection of the interaction of the probe molecule with the target molecule can otherwise, for example, be carried out by a technique based on the principle of light diffraction gratings.
- Figure 1 shows the steps of a synthesis route for a first dendrimer precursor in accordance with the invention.
- FIG. 2 shows the steps of a synthesis route for a second dendrimer precursor in accordance with the invention.
- FIG. 3 shows the steps of a synthesis route for a first dendrimer in accordance with invention D1.
- Figure 4 shows the steps of a synthesis route for a second dendrimer in accordance with invention D2.
- FIG. 5 shows an image obtained by scanning electron microscopy (SEM), of a detection spot obtained in an experiment of detection of a target oligonucleotide in a liquid medium, by means of a biochip using, for the functionalization of the support, a phosphorous dendrimer of the prior art (“96 CHO”) and, as a probe immobilized on said dendrimer, an oligonucleotide complementary to the target oligonucleotide, the detection being carried out by colorimetry.
- SEM scanning electron microscopy
- FIG. 6 shows an image obtained by scanning electron microscopy (SEM), of a detection spot obtained in an experiment similar to that of Figure 5, but carried out by means of a biochip using, for the functionalization of the support, a dendrimer according to the invention (“D1”).
- SEM scanning electron microscopy
- FIG. 7 shows a histogram representing the detection intensities obtained in the context of the detection of target molecules by different bacterial probes fixed on a biochip comprising a dendrimer of the prior art ("96 CHO") on the one hand, and a biochip comprising a D1 dendrimer in accordance with the invention on the other hand.
- the target molecules are 5 amplicons obtained from a biological sample by the PCR technique aimed at the amplification of specific DNA fragments of Proteus mirabilis and specific fragments of Escherichia coli, the bacterial probes of which are complementary.
- Probes 12 and 13 detect DNA from Proteus mirabilis
- probes 10 and 11 detect DNA from Escherichia coli
- probes 68P, 71 P and 72P target DNA from species of the Enterobacteriaceae family in general, which includes the species Proteus mirabilis and Escherichia coli.
- a mixture of hexachlorocyclotriphosphazene 1 (12.00 g, 34.5 mmol, 1 eq.) and dimethyl 5-hydroxyisophthalate (44.26 g, 21 1 mmol, 6 eq.) is dissolved in 750 mL of acetone.
- Potassium carbonate (K 2 CO 3 ) (57.38 g, 415 mmol, 12 eq.) is added to the solution with vigorous stirring.
- the mixture is stirred at room temperature for 24 h.
- the volatile solvents are removed under vacuum then the mixture is dissolved in 500 mL of dichloromethane (CH 2 CI 2 ) and 500 mL of 1 M sodium hydroxide solution (NaOH).
- EXAMPLE 2 Synthesis of a first dendrimer in accordance with the invention (“D1”) from the precursors obtained in Example 1
- FIG. 3 describes the synthesis of a first example of dendrimer according to the invention, called D1, phosphorus only at the core and presenting 48 aldehyde functions on the surface.
- FIG. 4 describes the synthesis of a second example of dendrimer according to the invention, called D2, phosphorated only at the core and presenting 24 aldehyde functions on the surface.
- the glass slides thus cleaned are immersed in a solution of 3-aminopropyltriethoxysilane (APTES, Merck) at 10% in 96% ethanol and are placed under stirring overnight at room temperature. They are then left for 30 min in the open air, rinsed with milliQ water (2 washes of 5 min each and 1 wash of 2 min with sonication) then with 96% ethanol (1 wash of 5 min) and finally with 99% ethanol (1 wash of 5 min) before being dried under a stream of nitrogen or by centrifugation. They are then placed for 3 hours at a temperature of 120°C.
- APTES 3-aminopropyltriethoxysilane
- the silanized slides are placed in a solution of dendrimers D1 or D2 (58 pM in tetrahydrofuran) for 6 h with stirring at room temperature. They are then washed with tetrahydrofuran (1 wash of 5 min) then with 96% ethanol (1 wash of 5 min) and finally with 99% ethanol (1 wash of 5 min) before be dried under a stream of nitrogen or by centrifugation.
- dendrimers D1 or D2 58 pM in tetrahydrofuran
- the oligonucleotide used as a probe molecule (CIH_ol) is modified at its 5' end by an arm with 6 carbon atoms terminated by an amine function, of formula NH 2 -(CH 2 ) 6 - (Eurogentec, Belgium), which allows the reaction with the aldehyde functions carried by the dendrimers. It presents the nucleotide sequence:
- the 100 pM of oligonucleotide are diluted twice in a 0.3 M phosphate buffer (pH 9) and deposited on the supports functionalized by the dendrimers using the sciFLEXARRAYER robot (Scienion, Germany). The volume deposited is 600 pL.
- the slides are left overnight at room temperature. They are then immersed in an aqueous solution of sodium borohydride (NaBH 4 , 1.74 g/L) (step of reduction of imine functions) and are left there for 30 min at room temperature. They are rinsed with milliQ water (3 washes of 5 min each) and are dried under a stream of nitrogen or by centrifugation.
- NaBH 4 sodium borohydride
- EXAMPLE 5 Hybridization protocol of the target molecule on the probe molecule
- the solution used during the hybridization step is composed of:
- Target oligonucleotide oligonucleotide complementary to the probe molecule CIH_ol with a biotin at the 5' end, of nucleotide sequence:
- BIOTEG-GACACGACCGGAAACATATT 3' (SEQ ID No: 2) (Integrated DNA Technology Inc., in which BIO represents biotin, and TEG represents a triethylene glycol spacer disposed between the biotin and the nucleotide sequence.
- the labeled target is hybridized to the biochip in an automated manner using a Microlab Starlet robot (Hamilton) controlled by VENUS 4.5 software.
- the automaton is equipped with a Hamilton Heater Shaker (HHS) heating and stirring module, a Hamilton Heater heating and cooling module. Cooler (HHC), a HeatPAC heating block (Inheco) with a temperature range from ambient to 135°C, a NucleoMag SEP magnet (Macherey-Nagel®) and a HEPA hood (Noroit).
- washing solution 2 PBS 1 X, 0.05% Tween®-20
- the biochip is read using the sciREADER CL2 colorimetric scanner (Scienion).
- the intensity of each spot is measured by subtracting the surrounding background noise. The size of the spots is also measured.
- EXAMPLE 7 Comparison tests of detection spots between a prior art dendrimer and dendrimers conforming to the invention
- Test 1 Comparison of the intensity of the detection spots resulting from the hybridization of a target and a probe with a dendrimer of the prior art ("96 CHO") or by bi dendrimers conforming to the invention D1 and D2
- This dendrimer can for example be prepared as described in patent application FR2838737A1.
- a biochip based on this dendrimer is prepared as described in Example 4 above. This biochip is subject to the operating protocols of Examples 5 and 6 above.
- the biochips were also analyzed by scanning electron microscopy. The images obtained are shown respectively in Figure 5 for the dendrimer of the prior art 96 CHO and Figure 6 for the dendrimer according to the invention D1. These images show obtaining a much rounder detection spot on the D1-based biochip. D1 was also much simpler to produce than 96 CHO (the production time being approximately 10 times shorter, to which is added a simplification of the purification as well as an increase in synthesis yields compared to the preparation 96 CHO dendrimers).
- DNA from the biological sample was extracted with the DNeasy® Blood & Tissue kit (Qiagen) according to the supplier's instructions. 500 ⁇ L was used for extraction. After centrifugation for 10 min at 3000 g, the pellet was resuspended in 180 ⁇ L of lysis buffer (lysozyme 40 mg/mL in 20 mM Tris-Ci, pH 8.0, 2 mM Sodium EDTA, 1.2% Triton ®X-100) and incubated at 37°C for 1 h.
- lysis buffer lysozyme 40 mg/mL in 20 mM Tris-Ci, pH 8.0, 2 mM Sodium EDTA, 1.2% Triton ®X-100
- a multiplex PCR aimed at amplifying the amplicons of the target genes representative of the microbial species present in the sample was then carried out with 5 pairs of primers: the list of PCR primers used for amplification, as well as the targeted genes, are presented. below in Table 2.
- the antisense primer was labeled at 5' with biotin linked to the primer by a TEG spacer arm ("Bioteg").
- the PCR reaction was carried out in a final volume of 50 ⁇ L in a mixture consisting of 1 X PCR buffer comprising:
- dNTPs deoxynucleotides
- the amplification was carried out in a GTQ-Cycler 96 thermal cycler (Hain Life Sciences, Nehren, Germany), with the following program: 30 s at 94°C, 30 s at 58°C and 40 s at 72°C over 35 cycles.
- the purification of the amplicons thus obtained was carried out on a Microlab Starlet automaton (Hamilton) controlled by the VENUS 4.50 software.
- the controller is equipped with a Hamilton Heater Shaker (HHS) heating and stirring module, a Hamilton Heater Cooler (HHC) heating and cooling module, a HeatPAC heating block (Inheco) with a temperature range of ambient at 135°C, a NucleoMag SEP magnet (Macherey-Nagel®) and a HEPA hood (Noroit).
- HHS Hamilton Heater Shaker
- HHC Hamilton Heater Cooler
- HeatPAC heating block Inheco
- the entire PCR reaction volume was purified using sparQ Beads magnetic beads (Quantabio) according to the recommendations of the supplier.
- the purified DNAs were eluted in 50 ⁇ L of molecular biology quality water.
- the amplicons were then denatured at 95°C for one minute and then placed at 4°C. 115 ⁇ L of hybridization buffer were added to the 50 ⁇ L of denatured amplicons, previously obtained by the amplification described previously.
- the hybridization buffer included the following constituents:
- BSA bovine serum albumin
- hybridization control oligonucleotide complementary to CIH_ol with a biotin at the 5' end of nucleotide sequence 5' BIOTEG- GACACGACCGGAAACATATT 3' (SEQ ID No: 2) (Integrated DNA Technology Inc.)).
- the marked target molecules thus obtained were brought into contact with the biochips for carrying out the hybridization according to the protocol presented in Example 5: two experiments were carried out, one with a biochip comprising a dendrimer proposed by the prior art. 96 CHO”, and the second with a biochip comprising a dendrimer in accordance with invention D1. These dendrimers are as described, respectively, in Test 1 and Example 2 above.
- the fixation of the dendrimers on the biochips was carried out as described in Example 4 above. Different probe molecules were fixed on the dendrimers as described in Example 4.
- the probes fixed on the dendrimers were defined from each target gene, using the BioEdit software; these probe molecules are as described in Table 3.
- the results obtained in terms of signal intensity presented in Figure 7, generally showed intensities of hybridization of significantly higher target molecules for the biochip comprising the D1 dendrimer in accordance with the invention, compared to those obtained with the biochip comprising the “96 CHO” dendrimer.
- the differences in intensity between the two types of dendrimers are particularly marked when the intensities obtained for the “96 CHO” dendrimer are low: these results attest to the superior performance of biochips comprising a D1 dendrimer in accordance with the invention. Indeed, for the same probe, obtaining a more intense hybridization signal means better sensitivity and therefore better detection performance.
- Table 5 also shows, for dendrimer D1, a better probability of detecting the presence of a specific microorganism: if the two types of dendrimers (Dendrimer D1 and Dendrimer “96 CHO”) allow the detection of the genus Enterobacteriaceae, with a probability of presence which can however be noted higher for the D1 dendrimer, only the D1 dendrimer allows the detection of Escherichia coli within the Enterobacteriacea family. Indeed, for a microorganism to be detected, the probability of its presence in the biological sample must be greater than or equal to 0.5.
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Abstract
The invention concerns a solid or semi-solid support comprising a surface on which are attached phosphorus-containing dendrimers comprising at their periphery at least one functional group for covalent bonding thereof to said support and at least one free functional group. Said dendrimers consist of a phosphorus-containing central core P0 comprising at least two groups from which a plurality of successive layers are formed, comprising 1 to 4 intermediate layers devoid of phosphorus atoms, and an outer layer. Such a support is easy and quick to manufacture, and a biochip comprising same proves to be particularly effective for detecting target molecules in a medium.
Description
SUPPORT SOLIDE FONCTIONNALISÉ PAR DES DENDRIMÈRES, BIOPUCE COMPRENANT UN TEL SUPPORT SOLIDE ET UTILISATION POUR LA DÉTECTION D’UNE MOLÉCULE CIBLE DANS UN MILIEU SOLID SUPPORT FUNCTIONALIZED BY DENDRIMERS, BIOCHIP COMPRISING SUCH A SOLID SUPPORT AND USE FOR THE DETECTION OF A TARGET MOLECULE IN A MEDIUM
La présente invention s’inscrit dans le domaine de la détection de molécules cibles dans un milieu donné, en particulier un échantillon biologique. The present invention is part of the field of detection of target molecules in a given medium, in particular a biological sample.
Plus particulièrement, la présente invention concerne un support solide ou semi- solide fonctionnalisé par des dendrimères phosphorés, un procédé pour la préparation d’un tel support, et son utilisation pour la fabrication d’une biopuce. L’invention concerne également une biopuce comprenant un tel support et son utilisation pour la détection d’une molécule cible dans un échantillon. More particularly, the present invention relates to a solid or semi-solid support functionalized by phosphorus dendrimers, a process for the preparation of such a support, and its use for the manufacture of a biochip. The invention also relates to a biochip comprising such a support and its use for the detection of a target molecule in a sample.
La détection de molécules, chimiques ou biochimiques, au sein d’un milieu donné, se définit comme la perception, via la mise en place d’un dispositif et/ou d’un procédé physico-chimique ou biochimique, de la présence ou de l’absence des molécules ciblées. The detection of molecules, chemical or biochemical, within a given environment, is defined as the perception, via the implementation of a device and/or a physico-chemical or biochemical process, of the presence or the absence of targeted molecules.
Une telle détection trouve intérêt dans de nombreuses applications, pour répondre à différentes finalités, telles que le diagnostic médical ou sanitaire (détection de marqueurs moléculaires associées à une maladie ou de molécules constitutives d’organismes notamment pathogènes), le diagnostic environnemental (détection de molécules polluantes, détection des micro- organismes présents dans un milieu donné), la sélection et/ou identification microbienne et/ou agronomique (détection de transcrits suite à l’expression de gènes ou de molécules protéiques produites de ces transcrits), etc. Such detection is of interest in numerous applications, to meet different purposes, such as medical or health diagnosis (detection of molecular markers associated with a disease or molecules constituting organisms, particularly pathogenic ones), environmental diagnosis (detection of molecules pollutants, detection of microorganisms present in a given environment), microbial and/or agronomic selection and/or identification (detection of transcripts following the expression of genes or protein molecules produced from these transcripts), etc.
Les molécules cibles peuvent être de tous types ; il peut s’agir de molécules organiques (acides nucléiques, protéines, polysaccharides, chaines d’acides gras, etc.) et il est important de pouvoir disposer de méthodes de détection adaptées à leurs spécificités structurales et fonctionnelles. The target molecules can be of all types; they can be organic molecules (nucleic acids, proteins, polysaccharides, fatty acid chains, etc.) and it is important to be able to have detection methods adapted to their structural and functional specificities.
A titre d’exemple, les solutions de détection reposant sur les technologies génomiques exploitent les données de séquençage des génomes qui sont déposées dans des bases de données publiques telles que NCBI. Les laboratoires de recherche publics et les industriels y ont recours de manière massive pour la détection de molécules d’intérêt, avec des applications dans différents domaines d’activité (santé humaine, sélection végétale,
agroalimentaire, etc.). For example, detection solutions based on genomic technologies exploit genome sequencing data which is deposited in public databases such as NCBI. Public research laboratories and manufacturers use it on a massive scale for the detection of molecules of interest, with applications in different fields of activity (human health, plant breeding, agri-food, etc.).
Pour la détection de microorganismes pathogènes, par exemple, un test de détection et de quantification des légionelles par Réaction de Polymérisation en Chaîne (PCR) est décrit dans la norme NF T 9-471. Ce test est actuellement couramment mis en œuvre pour quantifier des bactéries de l’espèce Legionella pneumophila dans les tours aéro-réfrigérantes, en alternative des techniques de culture. Le taux de détection des espèces de légionnelles par PCR est généralement élevé (plus de 90% d’échantillons positifs), mais la mise en œuvre de ce test nécessite plusieurs étapes relativement chronophages et complexes à mettre en œuvre, et il ne permet pas de détection multi-spécifique, c’est-à-dire la détection de plusieurs pathogènes à la fois. For the detection of pathogenic microorganisms, for example, a test for the detection and quantification of legionella by Polymerization Chain Reaction (PCR) is described in standard NF T 9-471. This test is currently commonly used to quantify bacteria of the Legionella pneumophila species in air-cooling towers, as an alternative to culture techniques. The detection rate of legionella species by PCR is generally high (more than 90% of positive samples), but the implementation of this test requires several relatively time-consuming and complex steps to implement, and it does not allow multi-species detection, that is to say the detection of several pathogens at the same time.
Les biopuces constituent quant à elles des technologies de détection issues de la combinaison des compétences en chimie, biologie, microélectronique, et bio- informatique. Il s’agit plus particulièrement d’outils permettant l’analyse d’interactions entre une sonde fixée sur un support et une cible. Typiquement, le support, solide ou semi-solide, est fonctionnalisé par une molécule présentant des fonctions libres sur lesquelles sont fixées des molécules sondes, aptes à interagir de manière spécifique avec une ou des molécules cible(s) donnée(s), également appelées molécules d’intérêt, dont on souhaite déterminer la présence éventuelle dans un milieu. Les molécules sondes sont typiquement des biomolécules de nature différente selon le type de biopuce concernée : on peut citer, de manière non exhaustive, des acides nucléiques (biopuces à ADN), protéines ou peptides (biopuces à protéines), glycanes ou biomolécules glycosylées (biopuces à sucres), ou des cellules entières (biopuces à cellules). Pour répondre à des objectifs de plus en plus ambitieux, les utilisateurs sont amenés à utiliser des biopuces avec des exigences croissantes en termes de spécificité et fiabilité de détection d’une part, et en termes de simplicité et de rapidité de mise en œuvre d’autre part. La réduction des coûts de fabrication des biopuces constitue également un critère important pour ces structures du fait de l’augmentation constante des besoins en termes de volumes d’analyse. Biochips constitute detection technologies resulting from the combination of skills in chemistry, biology, microelectronics, and bioinformatics. More specifically, these are tools allowing the analysis of interactions between a probe fixed on a support and a target. Typically, the support, solid or semi-solid, is functionalized by a molecule presenting free functions to which probe molecules are fixed, capable of interacting specifically with one or more given target molecules, also called molecules of interest, the possible presence of which we wish to determine in an environment. The probe molecules are typically biomolecules of a different nature depending on the type of biochip concerned: we can cite, in a non-exhaustive manner, nucleic acids (DNA biochips), proteins or peptides (protein biochips), glycans or glycosylated biomolecules (biochips). sugars), or whole cells (cell biochips). To meet increasingly ambitious objectives, users are required to use biochips with increasing requirements in terms of specificity and reliability of detection on the one hand, and in terms of simplicity and speed of implementation of somewhere else. Reducing biochip manufacturing costs also constitutes an important criterion for these structures due to the constant increase in needs in terms of analysis volumes.
Un type de biopuce particulière, couramment qualifiée de « dendripuce » utilisant un support fonctionnalisé par des dendrimères phosphorés, a été décrite dans le document FR2838737A1. La biopuce divulguée dans ce document
utilise un support comprenant au moins une surface fonctionnalisée de façon covalente par des dendrimères phosphorés possédant un noyau central qui contient au moins deux groupements fonctionnels et jusqu’à 12 couches d’unités dendrimériques porteuses d’atomes de phosphore qui permettent d’en rigidifier la structure afin d’assurer une bonne sensibilité de détection à la biopuce. Ces dendrimères phosphorés, qui présentent une taille comprise entre 1 et 20 nanomètres, comportent à leur périphérie plusieurs fonctions aptes à permettre la fixation ou la synthèse in situ de molécules sondes. Ces dendrimères sont généralement construits par la succession itérative de deux étapes de synthèse à partir du cœur. La première étape est la formation de fonctions aldéhydes libres sur la molécule. La deuxième étape créé les points de ramification entre les couches successives et consiste en une réaction de condensation avec un composé ayant deux types de fonctions : un groupement NH2 et au moins un groupement PCI2. La suite itérative des étapes de synthèse permet de construire des dendrimères de génération croissante. Ainsi, la formation d’un dendrimère phosphoré de taille suffisante pour sa mise en œuvre au sein d’une biopuce performante nécessite au moins 1 1 étapes de synthèse. Les biopuces décrites dans ce document présentent de bonnes performances avec un bruit de fond faible et une intensité de signal de détection élevée. A particular type of biochip, commonly referred to as a “dendrichip” using a support functionalized by phosphorus dendrimers, was described in document FR2838737A1. The biochip disclosed in this document uses a support comprising at least one surface covalently functionalized by phosphorus dendrimers having a central core which contains at least two functional groups and up to 12 layers of dendrimeric units carrying phosphorus atoms which make it possible to stiffen the structure to ensure good detection sensitivity to the biochip. These phosphorus dendrimers, which have a size between 1 and 20 nanometers, have at their periphery several functions capable of allowing the fixation or in situ synthesis of probe molecules. These dendrimers are generally constructed by the iterative succession of two synthesis steps from the core. The first step is the formation of free aldehyde functions on the molecule. The second step creates the branching points between the successive layers and consists of a condensation reaction with a compound having two types of functions: an NH2 group and at least one PCI2 group. The iterative sequence of synthesis steps makes it possible to construct dendrimers of increasing generation. Thus, the formation of a phosphorus dendrimer of sufficient size for its implementation within a high-performance biochip requires at least 1 1 synthesis steps. The biochips described in this paper exhibit good performance with low background noise and high detection signal intensity.
La présente invention vise à proposer un support fonctionnalisé permettant la fabrication d’une biopuce qui soit tout aussi performante que les biopuces de l’art antérieur, et qui soit même plus performante sur le plan de la sensibilité et/ou reproductibilité de détection, ce support fonctionnalisé étant plus facile, plus rapide et moins coûteux à fabriquer que les supports fonctionnalisés à dendrimères phosphorés pour biopuces proposés par l’art antérieur, en particulier tels que décrits ci-avant. The present invention aims to propose a functionalized support allowing the manufacture of a biochip which is just as efficient as the biochips of the prior art, and which is even more efficient in terms of sensitivity and/or reproducibility of detection, this functionalized support being easier, faster and less expensive to manufacture than the functionalized supports with phosphorous dendrimers for biochips proposed by the prior art, in particular as described above.
A cet effet, il est proposé par la présente invention un support solide ou semi- solide, dit « support fonctionnalisé », comprenant une surface sur laquelle sont fixés des dendrimères phosphorés comportant à leur périphérie au moins un groupement fonctionnel pour leur liaison covalente audit support et au moins un groupement fonctionnel libre. Ces dendrimères sont constitués d’un noyau central phosphoré P0 comprenant au moins deux groupements à partir desquels sont formées plusieurs couches successives, comprenant :
- n couches intermédiaires, identiques ou différentes, n étant un nombre entier compris entre 1 et 4, chacune des couches intermédiaires étant constituée d’unités P1 , identiques ou différentes, répondant chacune à la formule générale (I) :
dans laquelle : R1 représente un atome d’oxygène, un atome de soufre, un atome de silicium, un groupement -NH- ou -NR4- où R4 représente un groupement alkyle linéaire, ramifié et/ou cyclique, saturé ou insaturé, comprenant de 1 à 5 carbones, ou R1 représente un radical carboné, saturé ou insaturé, linéaire, ramifié et/ou cyclique, comprenant de 1 à 6 atomes de carbones, éventuellement substitué et/ou éventuellement interrompu par un ou plusieurs hétéroatomes choisis parmi O, N, Si et S, Ar1 représente un cycle aromatique comprenant 6 ou 8 chaînons, éventuellement substitué par un ou plusieurs groupements alkyle linéaires, ramifiés et/ou cycliques comprenant chacun de 1 à 3 carbones, For this purpose, the present invention proposes a solid or semi-solid support, called a “functionalized support”, comprising a surface on which phosphorus dendrimers are fixed comprising at their periphery at least one functional group for their covalent bond to said support. and at least one free functional group. These dendrimers consist of a central phosphorus core P0 comprising at least two groups from which several successive layers are formed, comprising: - n intermediate layers, identical or different, n being an integer between 1 and 4, each of the intermediate layers consisting of units P1, identical or different, each responding to general formula (I): in which: R 1 represents an oxygen atom, a sulfur atom, a silicon atom, an -NH- or -NR 4 group - where R 4 represents a linear, branched and/or cyclic, saturated or unsaturated alkyl group , comprising from 1 to 5 carbons, or R 1 represents a carbon radical, saturated or unsaturated, linear, branched and/or cyclic, comprising from 1 to 6 carbon atoms, optionally substituted and/or optionally interrupted by one or more chosen heteroatoms among O, N, Si and S, Ar 1 represents an aromatic ring comprising 6 or 8 members, optionally substituted by one or more linear, branched and/or cyclic alkyl groups each comprising 1 to 3 carbons,
R2 et R3, identiques ou différents, représentent chacun un radical carboné saturé ou insaturé, linéaire ou ramifié, comprenant de 1 à 3 atomes de carbones, lesdites couches intermédiaires étant dépourvues d’atome de phosphore,R 2 and R 3 , identical or different, each represent a saturated or unsaturated carbon radical, linear or branched, comprising from 1 to 3 carbon atoms, said intermediate layers being devoid of phosphorus atom,
- et une couche externe constituée d’unités P2, identiques ou différentes, répondant chacune à la formule générale (II) :
dans laquelle - and an external layer made up of P2 units, identical or different, each responding to general formula (II): in which
R5 représente un atome d’oxygène, un atome de soufre, un atome de silicium, un groupement -NH- ou -NR8- où R8 représente un groupement alkyle linéaire, ramifié et/ou cyclique, saturé ou insaturé, comprenant de 1 à 5 carbones, ou R5
représente un radical carboné, saturé ou insaturé, linéaire, ramifié et/ou cyclique, comprenant de 1 à 6 atomes de carbones, éventuellement substitué et/ou éventuellement interrompu par un ou plusieurs hétéroatomes choisis parmi O, N, Si et S, R 5 represents an oxygen atom, a sulfur atom, a silicon atom, an -NH- or -NR 8 group - where R 8 represents a linear, branched and/or cyclic, saturated or unsaturated alkyl group, comprising 1 to 5 carbons, or R 5 represents a carbon radical, saturated or unsaturated, linear, branched and/or cyclic, comprising from 1 to 6 carbon atoms, optionally substituted and/or optionally interrupted by one or more heteroatoms chosen from O, N, Si and S,
Ar2 représente un cycle aromatique comprenant 6 ou 8 chaînons, éventuellement substitué par un ou plusieurs groupements alkyle linéaires, ramifiés et/ou cycliques comprenant chacun de 1 à 3 carbones, Ar 2 represents an aromatic ring comprising 6 or 8 members, optionally substituted by one or more linear, branched and/or cyclic alkyl groups each comprising 1 to 3 carbons,
R6 et R7, identiques ou différents, représentent chacun un atome d’hydrogène, un groupement fonctionnel choisi parmi un atome d’halogène, -CH=O, -CH2OH, -CH2CI, -OH, -SH, -CH2-SH, -CO-OCH3, -COOH, -NHR9, -NR12R13, -O-R9, -R9- SO2-R10, -CN3, -CNO2, -P(O)(OR9)OR10 et -P(O)R9R10R11, ou un radical carboné, saturé ou insaturé, linéaire ou ramifié, comprenant de 1 à 3 atomes de carbones et comprenant au moins un groupement fonctionnel choisi parmi un atome d’halogène, -CH=O, -CH2OH, -CH2CI, -OH, -SH, -CH2-SH, -CO-OCH3,- COOH, -NHR9, -NR12R13, -O-R9, -R9-SO2-R10, -CN3, -CNO2, -P(O)(OR9)OR10 et -P(O)R9R10R11, où R9, R10 et R11, identiques ou différents, représentent chacun un groupement alkyle linéaire ou ramifié comprenant de 1 à 5 atomes de carbones, R12 et R13, identiques ou différents, représentent chacun un groupement alkyle linéaire ou ramifié comprenant de 1 à 5 atomes de carbones, ou R12 et R13 forment ensemble, avec l’atome d’azote auxquels ils sont attachés, un cycle à 5 à 7 chaînons, saturé ou insaturé, R 6 and R 7 , identical or different, each represent a hydrogen atom, a functional group chosen from a halogen atom, -CH=O, -CH 2 OH, -CH 2 CI, -OH, -SH, -CH 2 -SH, -CO-OCH 3 , -COOH, -NHR 9 , -NR 12 R 13 , -OR 9 , -R 9 - SO 2 -R 10 , -CN 3 , -CNO 2 , -P( O)(OR 9 )OR 10 and -P(O)R 9 R 10 R 11, or a carbon radical, saturated or unsaturated, linear or branched, comprising from 1 to 3 carbon atoms and comprising at least one selected functional group among a halogen atom, -CH=O, -CH 2 OH, -CH 2 CI, -OH, -SH, -CH 2 -SH, -CO-OCH 3 ,- COOH, -NHR 9 , -NR 12 R 13 , -OR 9 , -R 9 -SO 2 -R 10 , -CN 3 , -CNO 2 , -P(O)(OR 9 )OR 10 and -P(O)R 9 R 10 R 11 , where R 9 , R 10 and R 11 , identical or different, each represent a linear or branched alkyl group comprising from 1 to 5 carbon atoms, R 12 and R 13 , identical or different, each represent a linear or branched alkyl group comprising 1 to 5 carbon atoms, or R 12 and R 13 together form, with the nitrogen atom to which they are attached, a 5 to 7-membered ring, saturated or unsaturated,
R6 et R7 ne représentant pas simultanément un atome d’hydrogène. R 6 and R 7 do not simultaneously represent a hydrogen atom.
Dans les dendrimères du support fonctionnalisé selon l’invention, une partie desdits groupements fonctionnels entrant dans la constitution de R6 et/ou R7 sont impliqués dans la liaison covalente des dendrimères à la surface du support, l’autre partie restant libre et pouvant notamment être mise à profit pour la fixation ou la synthèse in situ ultérieures de molécules sondes dans le contexte d’une application du support selon l’invention à la fabrication d’une biopuce. In the dendrimers of the functionalized support according to the invention, part of said functional groups entering into the constitution of R 6 and/or R 7 are involved in the covalent bonding of the dendrimers to the surface of the support, the other part remaining free and being able to in particular be used for the subsequent fixation or in situ synthesis of probe molecules in the context of an application of the support according to the invention to the manufacture of a biochip.
Les dendrimères sont des polymères à structure ramifiée arborescente formés par un procédé itératif à partir d’un noyau central comportant plusieurs fonctions réactives, par branchement radial répétitif, depuis ce noyau central, de
ramifications concentriques, chacune portant plusieurs fonctions réactives pour le branchement du niveau de ramifications suivant. Chaque nouvelle génération de dendrimère est obtenue par introduction d’un nouveau niveau de ramification sur le précédent. Dendrimers are polymers with a branched tree structure formed by an iterative process from a central core comprising several reactive functions, by repetitive radial branching, from this central core, of concentric branches, each carrying several reactive functions for branching the next level of branches. Each new generation of dendrimer is obtained by introducing a new level of branching onto the previous one.
Comme exposé ci-avant, l’utilisation de dendrimères pour la fabrication de biopuces, en tant que bras espaceurs entre un support solide ou semi-solide et des molécules sondes d’une biopuce, s’avère particulièrement avantageuse en raison de leurs propriétés structurelles spécifiques. Plus précisément, le nombre important de groupements fonctionnels libres qui sont présents en périphérie des dendrimères permet de fixer une densité importante de molécules sondes par unité de surface du support, ainsi qu’une meilleure accessibilité des molécules sondes, ce dont il résulte avantageusement une sensibilité de détection élevée. Le support selon la présente invention tire avantageusement profit de ces propriétés générales des dendrimères. En outre, et de manière tout à fait surprenante, il a été découvert par les présents inventeurs que le support fonctionnalisé répondant à la définition de la présente invention, c’est-à-dire comportant des dendrimères présentant la structure chimique particulière ci- dessus décrite, lorsqu’il est intégré dans une biopuce, confère à cette dernière des propriétés particulièrement bonnes en termes de fiabilité, de reproductibilité et sensibilité de détection. Une telle performance est d’autant plus surprenante que d’une part, les dendrimères conformes à l’invention présentent une petite taille, en raison du faible nombre de couches intermédiaires qu’ils comportent, et donc comportent un nombre réduit de fonctions libres à leur surface pour la fixation de molécules sondes, et que d’autre part, ils sont dépourvus d’atomes de phosphore dans leurs couches intermédiaires, atomes de phosphore dont la personne du métier sait qu’ils rigid ifient la structure des dendrimères, et que ceci participe à la performance des biopuces dans lesquelles ils sont intégrés. As explained above, the use of dendrimers for the manufacture of biochips, as spacer arms between a solid or semi-solid support and probe molecules of a biochip, proves to be particularly advantageous due to their structural properties. specific. More precisely, the large number of free functional groups which are present at the periphery of the dendrimers makes it possible to fix a high density of probe molecules per unit surface of the support, as well as better accessibility of the probe molecules, which advantageously results in sensitivity. high detection. The support according to the present invention advantageously takes advantage of these general properties of dendrimers. Furthermore, and quite surprisingly, it was discovered by the present inventors that the functionalized support meeting the definition of the present invention, that is to say comprising dendrimers having the particular chemical structure above described, when integrated into a biochip, gives the latter particularly good properties in terms of reliability, reproducibility and detection sensitivity. Such performance is all the more surprising since, on the one hand, the dendrimers in accordance with the invention have a small size, due to the low number of intermediate layers that they include, and therefore include a reduced number of free functions at their surface for the attachment of probe molecules, and that on the other hand, they are devoid of phosphorus atoms in their intermediate layers, phosphorus atoms which the person skilled in the art knows that they stiffen the structure of the dendrimers, and that this contributes to the performance of the biochips in which they are integrated.
Par exemple, et comme démontré dans les exemples ci-après, les inventeurs ont mis en évidence que les dendrimères tels que définis ci-dessus, utilisés pour fonctionnaliser une biopuce, permettent d’obtenir un signal de détection d’intensité supérieure à celui obtenu avec une biopuce utilisant les dendrimères proposés par l’art antérieur, dans lesquels chacune des couches intermédiaires contient des atomes de phosphore, et qui présentent pourtant en périphérie un
nombre beaucoup plus important de groupements fonctionnels libres pour le branchement de molécule(s) sonde(s). Les inventeurs ont ainsi montré que les biopuces formées d’un support fonctionnalisé selon l’invention présentent de meilleures performances en termes de fiabilité, reproductibilité et sensibilité de détection, ce dont témoigne notamment l’obtention de spots de détection mieux définis et plus ronds que ceux obtenus avec des biopuces intégrant des dendrimères de l’art antérieur. Ces performances améliorées ont été observées alors même que la petite taille des dendrimères entrant dans la constitution du support fonctionnalisé selon l’invention, et l’absence d’atomes de phosphore dans leurs couches intermédiaires, laissaient présager du contraire. For example, and as demonstrated in the examples below, the inventors have demonstrated that dendrimers as defined above, used to functionalize a biochip, make it possible to obtain a detection signal of greater intensity than that obtained with a biochip using the dendrimers proposed by the prior art, in which each of the intermediate layers contains phosphorus atoms, and which nevertheless present on the periphery a much larger number of free functional groups for the connection of probe molecule(s). The inventors have thus shown that the biochips formed from a functionalized support according to the invention present better performances in terms of reliability, reproducibility and detection sensitivity, which is demonstrated in particular by the obtaining of better defined and rounder detection spots than those obtained with biochips integrating dendrimers of the prior art. These improved performances were observed even though the small size of the dendrimers used in the constitution of the functionalized support according to the invention, and the absence of phosphorus atoms in their intermediate layers, suggested the opposite.
Le support selon l’invention peut être de nature solide ou semi-solide, tel qu’un gel. Il peut être rigide ou flexible, et présenter toute forme. Sa surface fonctionnalisée par les dendrimères est de préférence sensiblement plane.The support according to the invention can be solid or semi-solid in nature, such as a gel. It can be rigid or flexible, and have any shape. Its surface functionalized by the dendrimers is preferably substantially planar.
Dans des modes de réalisation particuliers de l’invention, le support est formé en verre, en silicium, en plastique ou en métal. Des supports pouvant être utilisés dans le cadre de l’invention sont par exemple les lames, les billes et les capillaires en verre, ou encore les supports comportant au moins une surface d’or. In particular embodiments of the invention, the support is formed of glass, silicon, plastic or metal. Supports that can be used in the context of the invention are for example blades, beads and glass capillaries, or even supports comprising at least one gold surface.
Selon le matériau qui la constitue, la surface du support peut avoir été soumise à un prétraitement visant à y fixer un ou des groupement(s) fonctionnel(s) apte(s) à réagir avec des groupements fonctionnels libres de dendrimères, pour permettre la fixation de ces derniers par liaison covalente sur cette surface. Il entre dans les compétences de l’homme du métier de déterminer quel prétraitement doit être réalisé, et de quelle manière, en fonction du matériau particulier constituant la surface du support et des groupements fonctionnels présents en périphérie des dendrimères. A titre d’exemple d’un tel traitement, lorsque le support est formé en verre, il peut avoir préalablement été soumis à un prétraitement par silanisation de sa surface, réalisé de manière classique en elle-même. Depending on the material which constitutes it, the surface of the support may have been subjected to a pretreatment aimed at fixing one or more functional group(s) capable of reacting with free functional groups of dendrimers, to allow the fixation of the latter by covalent bond on this surface. It is within the skills of those skilled in the art to determine which pretreatment must be carried out, and in what manner, depending on the particular material constituting the surface of the support and the functional groups present at the periphery of the dendrimers. As an example of such a treatment, when the support is formed from glass, it may have previously been subjected to pretreatment by silanization of its surface, carried out in a conventional manner in itself.
Les dendrimères du support selon l’invention peuvent présenter l’une ou plusieurs des caractéristiques ci-après, mises en œuvre séparément ou selon chacune de leurs combinaisons techniquement opérantes. The dendrimers of the support according to the invention may have one or more of the following characteristics, implemented separately or according to each of their technically effective combinations.
Le noyau central P0 des dendrimères peut comporter au moins deux
groupements sur lesquels sont greffées les unités P1 de la première couche intermédiaire. Préférentiellement, le noyau central P0 comporte au moins trois tels groupements, de préférence au moins quatre, et de préférence encore au moins cinq. Le noyau central P0 peut en particulier comporter six groupements sur lesquels sont greffées les unités P1 de la première couche intermédiaire.The central core P0 of the dendrimers can include at least two groups onto which the P1 units of the first intermediate layer are grafted. Preferably, the central core P0 comprises at least three such groups, preferably at least four, and more preferably at least five. The central core P0 may in particular comprise six groups onto which the units P1 of the first intermediate layer are grafted.
Dans des modes de réalisation particuliers de l’invention, le noyau central P0 des dendrimères répond à la formule (IlIa) suivante :
In particular embodiments of the invention, the central core P0 of the dendrimers corresponds to the following formula (IlIa):
Ce noyau central particulier est représenté, dans certaines des formules chimiques ci-après, pour plus de commodité de représentation des dendrimères selon l’invention, par la formule « N3P3 ». This particular central nucleus is represented, in some of the chemical formulas below, for greater convenience in representing the dendrimers according to the invention, by the formula “N 3 P 3 ”.
Le noyau central P0 peut autrement par exemple répondre à la formule (IIIb), à la formule (Ille) ou à la formule (llld) suivantes :
The central nucleus P0 can otherwise for example respond to the following formula (IIIb), formula (Ille) or formula (llld):
Le nombre de couches intermédiaires des dendrimères selon l’invention peut
être compris entre 1 et 4. Il est préférentiellement égal à 2 ou 3. Chacune de ces couches intermédiaires successives comprend 2 fois plus d’unités P1 que la couche intermédiaire précédente. The number of intermediate layers of the dendrimers according to the invention can be between 1 and 4. It is preferably equal to 2 or 3. Each of these successive intermediate layers comprises twice as many P1 units as the previous intermediate layer.
Les unités P1 au sein d’une même couche intermédiaire du dendrimère peuvent être différentes les unes des autres. Elles sont préférentiellement toutes identiques. De la même façon, les unités P1 d’une couche intermédiaire peuvent être différentes des unités P1 d’une autre couche intermédiaire. Dans des modes de réalisation préférés de l’invention, notamment particulièrement avantageux sur le plan de la facilité du mode de synthèse, l’ensemble des unités P1 de toutes les couches intermédiaires des dendrimères sont identiques les unes aux autres. Une ou plusieurs, de préférence l’ensemble, des unités P1 du dendrimère selon l’invention peuvent répondre à l’une ou plusieurs des caractéristiques ci-après. Le cycle aromatique Ar1 peut être un hétérocycle, comprenant par exemple un ou plusieurs atomes d’oxygène, azote et/ou soufre en lieu et place d’un ou plusieurs atomes de carbone du cycle. Il est de préférence uniquement constitué d’atomes de carbone. The P1 units within the same intermediate layer of the dendrimer can be different from each other. They are preferably all identical. Likewise, the P1 units of one intermediate layer may be different from the P1 units of another intermediate layer. In preferred embodiments of the invention, in particular particularly advantageous in terms of the ease of the mode of synthesis, all of the P1 units of all the intermediate layers of the dendrimers are identical to each other. One or more, preferably all, of the P1 units of the dendrimer according to the invention may meet one or more of the characteristics below. The aromatic ring Ar 1 may be a heterocycle, comprising for example one or more atoms of oxygen, nitrogen and/or sulfur in place of one or more carbon atoms of the ring. It is preferably made up only of carbon atoms.
Les groupements R1, R2 et R3 peuvent être disposés à toute position les uns par rapport aux autres sur le cycle aromatique Ar1. Préférentiellement, ils ne sont pas situés sur des atomes adjacents du cycle, notamment en position ortho les uns par rapport aux autres dans le cas d’un cycle aromatique à 6 chainons. Dans les modes de réalisation particuliers de l’invention dans lesquels Ar1 représente un cycle aromatique à 6 chainons, R2 et R3 sont de préférence situés en position méta l’un par rapport à l’autre. Ils sont en outre de préférence chacun situés en position méta par rapport à R1. The groups R 1 , R 2 and R 3 can be arranged at any position relative to each other on the aromatic ring Ar 1 . Preferably, they are not located on adjacent atoms of the cycle, in particular in an ortho position relative to each other in the case of a 6-membered aromatic ring. In particular embodiments of the invention in which Ar 1 represents a 6-membered aromatic ring, R 2 and R 3 are preferably located in the meta position relative to each other. They are also preferably each located in meta position relative to R 1 .
Le cycle aromatique Ar1 peut en outre être substitué, sur un ou plusieurs de ses atomes formant le cycle non liés à R1, R2 ou R3, notamment sur tous ces atomes non liés, par un ou plusieurs groupements, pouvant être identiques ou différents, choisis chacun parmi les groupements méthyle, éthyle, n-propyle, isopropyle, ou cyclopropyle. Préférentiellement, Ar1 n’est substitué sur aucun de ses atomes du cycle non liés à R1, R2 ou R3. The aromatic ring Ar 1 may also be substituted, on one or more of its atoms forming the ring not linked to R 1 , R 2 or R 3 , in particular on all these unbonded atoms, by one or more groups, which may be identical or different, each chosen from methyl, ethyl, n-propyl, isopropyl, or cyclopropyl groups. Preferably, Ar 1 is not substituted on any of its ring atoms not linked to R 1 , R 2 or R 3 .
R2 et R3 sont de préférence identiques. R 2 and R 3 are preferably identical.
Préférentiellement, dans la formule générale (I) : Preferably, in general formula (I):
- R1 représente un atome d’oxygène, un atome de soufre, un atome de silicium,
un groupement -NH- ou -NR4- où R4 représente un groupe méthyle, - R 1 represents an oxygen atom, a sulfur atom, a silicon atom, a group -NH- or -NR 4 - where R 4 represents a methyl group,
- et/ou Ar1 représente un cycle aromatique, de préférence à 6 chaînons, non substitué, - and/or Ar 1 represents an aromatic ring, preferably 6-membered, unsubstituted,
- et/ou R2 et R3 représentent chacun un radical alkyle linéaire comprenant 1 , 2 ou 3 atomes de carbone, en particulier un radical méthylène -CH2-. - and/or R 2 and R 3 each represent a linear alkyl radical comprising 1, 2 or 3 carbon atoms, in particular a methylene radical -CH 2 -.
Au moins une, de préférence chaque, unité P1 des couches intermédiaires des dendrimères peut répondre à l’une des formules (la) à (le) suivantes :
dans laquelle Ar1 représente de préférence un cycle aromatique à 6 ou 8 chaînons non substitué, et/ou R2 et R3 sont identiques et représentent de préférence un radical alkyle linéaire comprenant 1 , 2 ou 3 atomes de carbone, en particulier un radical méthylène,
dans laquelle R2 et R3 sont identiques et représentent de préférence un radical alkyle linéaire comprenant 1 , 2 ou 3 atomes de carbone, en particulier un radical méthylène,
dans laquelle Ar1 représente de préférence un cycle aromatique à 6 ou 8 chaînons non substitué,
dans laquelle R1 représente de préférence un atome d’oxygène, un atome de soufre, un atome de silicium, un groupement -NH- ou -NR4- où R représente un groupe méthyle, et/ou Ar1 représente de préférence un cycle aromatique à 6 ou 8 chaînons non substitué,
dans laquelle R1 représente de préférence un atome d’oxygène, un atome de soufre, un atome de silicium, un groupement -NH- ou -NR4- où R4 représente un groupe méthyle. At least one, preferably each, unit P1 of the intermediate layers of the dendrimers can correspond to one of the following formulas (la) to (le): in which Ar 1 preferably represents an unsubstituted 6 or 8-membered aromatic ring, and/or R 2 and R 3 are identical and preferably represent a linear alkyl radical comprising 1, 2 or 3 carbon atoms, in particular a radical methylene, in which R 2 and R 3 are identical and preferably represent a linear alkyl radical comprising 1, 2 or 3 carbon atoms, in particular a methylene radical, in which Ar 1 preferably represents an unsubstituted 6- or 8-membered aromatic ring, in which R 1 preferably represents an oxygen atom, a sulfur atom, a silicon atom, an -NH- or -NR 4 group - where R represents a methyl group, and/or Ar 1 preferably represents a cycle unsubstituted 6- or 8-membered aromatic, in which R 1 preferably represents an oxygen atom, a sulfur atom, a silicon atom, an -NH- or -NR 4 - group where R 4 represents a methyl group.
Dans des modes de réalisation particuliers de l’invention, des unités P1 des couches intermédiaires des dendrimères, de préférence l’ensemble des unités P1 des dendrimères, répondent à la formule (If) suivante :
In particular embodiments of the invention, P1 units of the intermediate layers of the dendrimers, preferably all of the P1 units of the dendrimers, correspond to the following formula (If):
La couche externe des dendrimères selon l’invention peut comprendre, en fonction du nombre de couches intermédiaires de ce dernier, et du nombre de groupements du noyau central P0 sur lesquels sont branchées des unités P1 de la première couche intermédiaire, de 4 à 64 unités P2. Elle comprend de préférence de 6 à 48, préférentiellement de 12 à 24, unités P2. The outer layer of the dendrimers according to the invention may comprise, depending on the number of intermediate layers of the latter, and the number of groups of the central core P0 to which units P1 of the first intermediate layer are connected, from 4 to 64 units P2. It preferably comprises from 6 to 48, preferably from 12 to 24, P2 units.
Ces unités P2 peuvent être différentes les unes des autres. Elles sont préférentiellement toutes identiques.
Une ou plusieurs, de préférence l’ensemble, des unités P2 du dendrimère selon l’invention peuvent répondre à l’une ou plusieurs des caractéristiques ci-après.These P2 units may be different from each other. They are preferably all identical. One or more, preferably all, of the P2 units of the dendrimer according to the invention may meet one or more of the characteristics below.
Le cycle aromatique Ar2 peut être un hétérocycle, comprenant par exemple un ou plusieurs atomes d’oxygène, azote et/ou soufre en lieu et place d’un ou plusieurs atomes de carbone formant le cycle. Il est de préférence uniquement constitué d’atomes de carbone. The Ar 2 aromatic ring may be a heterocycle, comprising for example one or more oxygen, nitrogen and/or sulfur atoms in place of one or more carbon atoms forming the cycle. It is preferably made up only of carbon atoms.
Les groupements R5, R6 et R7 peuvent être disposés à toute position les uns par rapport aux autres sur le cycle aromatique Ar2. Préférentiellement, ils ne sont pas situés sur des atomes adjacents du cycle, notamment en position ortho les uns par rapport aux autres dans le cas d’un cycle aromatique à 6 chainons.The groups R 5 , R 6 and R 7 can be arranged at any position relative to each other on the aromatic ring Ar 2 . Preferably, they are not located on adjacent atoms of the cycle, in particular in an ortho position relative to each other in the case of a 6-membered aromatic ring.
Dans les modes de réalisation particuliers de l’invention dans lesquels Ar2 représente un cycle aromatique à 6 chainons, lorsque R6 et R7 sont tous deux différents d’un atome d’hydrogène, ils sont de préférence situés en position méta l’un par rapport à l’autre. Ils sont en outre de préférence chacun situés en position méta par rapport à R5. Lorsque l’un des groupements R6 et R7 représente un atome d’hydrogène, l’autre de ces groupements est de préférence situé en position para par rapport à R5. In particular embodiments of the invention in which Ar 2 represents a 6-membered aromatic ring, when R 6 and R 7 are both different from a hydrogen atom, they are preferably located in the meta l position. one in relation to the other. They are also preferably each located in meta position relative to R 5 . When one of the groups R 6 and R 7 represents a hydrogen atom, the other of these groups is preferably located in the para position relative to R 5 .
Le cycle aromatique Ar2 peut en outre être substitué, sur un ou plusieurs de ses atomes du cycle non liés à R5, R6 ou R7, ou même sur tous ces atomes, par un ou plusieurs groupements, pouvant être identiques ou différents, choisis chacun parmi les groupements méthyle, éthyle, n-propyle, isopropyle ou cyclopropyle. Préférentiellement, Ar2 n’est substitué sur aucun de ses atomes du cycle non liés à R5, R6 ou R7. The Ar 2 aromatic ring may also be substituted, on one or more of its ring atoms not linked to R 5 , R 6 or R 7 , or even on all of these atoms, by one or more groups, which may be identical or different. , each chosen from methyl, ethyl, n-propyl, isopropyl or cyclopropyl groups. Preferably, Ar 2 is not substituted on any of its ring atoms not linked to R 5 , R 6 or R 7 .
Dans des modes de réalisation particuliers de l’invention, R6 et R7 sont identiques. Dans des modes de réalisation particuliers alternatifs, ils sont différents, l’un d’entre eux représentant alors de préférence un atome d’hydrogène. In particular embodiments of the invention, R 6 and R 7 are identical. In particular alternative embodiments, they are different, one of them then preferably representing a hydrogen atom.
Préférentiellement, dans la formule générale (II) : Preferably, in general formula (II):
- R5 représente un atome d’oxygène, un atome de soufre, un atome de silicium, ou un groupement -NH- ou -NR8 où R8 représente un groupe méthyle, - R 5 represents an oxygen atom, a sulfur atom, a silicon atom, or an -NH- or -NR 8 group where R 8 represents a methyl group,
- et/ou Ar2 représente un cycle aromatique, de préférence à 6 chainons, non substitué, - and/or Ar 2 represents an aromatic ring, preferably with 6 members, unsubstituted,
- et/ou R6 et R7 représentent chacun un atome d’hydrogène ou un groupement
fonctionnel choisi parmi un atome d’halogène, -CH=O, -CH2OH, -CH2CI, -OH, - SH, -CH2-SH, -CO-OCH3, -COOH, -NHR9, -NR12R13, -O-R9, -R9-SO2-R10, -CN3, -CNO2, -P(O)(OR9)OR10 et -P(O)R9R10R11, R6 et R7 ne représentant pas simultanément un atome d’hydrogène ; parmi les groupements fonctionnels ci- avant, le groupement aldéhyde -CH=O est particulièrement préféré dans le cadre d’une application du support fonctionnalisé à la fabrication de biopuces à molécules d’acide nucléique, en particulier à sondes d’acide désoxyribonucléique (ADN), pour sa capacité à réagir avec les fonctions amines. Au moins une, de préférence chaque, unité P2 de la couche externe des dendrimères peut répondre à l’une des formules (IIa) à (llj) suivantes :
dans laquelle R5 représente de préférence un atome d’oxygène, un atome de soufre, un atome de silicium, un groupement -NH- ou -NR8- où R8 représente un groupe méthyle, et/ou Ar2 représente de préférence un cycle aromatique à 6 ou 8 chaînons non substitué,
dans laquelle R5 représente de préférence un atome d’oxygène, un atome de soufre, un atome de silicium, un groupement -NH- ou -NR8- où R8 représente un groupe méthyle, et/ou Ar2 représente de préférence un cycle aromatique à 6 ou 8 chaînons non substitué,
dans laquelle R5 représente de préférence un atome d’oxygène, un atome de soufre, un atome de silicium, un groupement -NH- ou -NR8- où R8 représente un groupe méthyle,
dans laquelle R5 représente de préférence un atome d’oxygène, un atome de soufre, un atome de silicium, un groupement -NH- ou -NR8- où R8 représente un groupe méthyle,
dans laquelle Ar2 représente de préférence un cycle aromatique à 6 ou 8 chainons non substitué, et/ou R6 et R7 représentent chacun un atome d’hydrogène ou un groupement fonctionnel choisi parmi un atome d’halogène, - CH=O, -CH2OH, -CH2CI, -OH, -SH, -CH2-SH, -CO-OCH3, -COOH, -NHR9, - NR12R13, -O-R9, -R9-SO2-R10, -CN3, -CNO2, -P(O)(OR9)OR10 et -P(O)R9R10R11,- and/or R 6 and R 7 each represent a hydrogen atom or a group functional chosen from a halogen atom, -CH=O, -CH 2 OH, -CH 2 CI, -OH, - SH, -CH 2 -SH, -CO-OCH 3 , -COOH, -NHR 9 , - NR 12 R 13 , -OR 9 , -R 9 -SO 2 -R 10 , -CN 3 , -CNO 2 , -P(O)(OR 9 )OR 10 and -P(O)R 9 R 10 R 11 , R 6 and R 7 not simultaneously representing a hydrogen atom; among the functional groups above, the aldehyde group -CH=O is particularly preferred in the context of an application of the functionalized support to the manufacture of biochips with nucleic acid molecules, in particular with deoxyribonucleic acid (DNA) probes. ), for its ability to react with amine functions. At least one, preferably each, P2 unit of the outer layer of the dendrimers can correspond to one of the following formulas (IIa) to (llj): in which R 5 preferably represents an oxygen atom, a sulfur atom, a silicon atom, an -NH- or -NR 8 group - where R 8 represents a methyl group, and/or Ar 2 preferably represents a unsubstituted 6- or 8-membered aromatic ring, in which R 5 preferably represents an oxygen atom, a sulfur atom, a silicon atom, an -NH- or -NR 8 group - where R 8 represents a methyl group, and/or Ar 2 preferably represents a unsubstituted 6- or 8-membered aromatic ring, in which R 5 preferably represents an oxygen atom, a sulfur atom, a silicon atom, an -NH- or -NR 8 group - where R 8 represents a methyl group, in which R 5 preferably represents an oxygen atom, a sulfur atom, a silicon atom, an -NH- or -NR 8 group - where R 8 represents a methyl group, in which Ar 2 preferably represents an unsubstituted 6 or 8-membered aromatic ring, and/or R 6 and R 7 each represent a hydrogen atom or a functional group chosen from a halogen atom, - CH=O, -CH 2 OH, -CH 2 CI, -OH, -SH, -CH 2 -SH, -CO-OCH 3 , -COOH, -NHR 9 , - NR 12 R 13 , -OR 9 , -R 9 -SO 2 -R 10 , -CN 3 , -CNO 2 , -P(O)(OR 9 )OR 10 and -P(O)R 9 R 10 R 11 ,
R6 et R7 ne représentant pas simultanément un atome d’hydrogène,
dans laquelle Ar2 représente de préférence un cycle aromatique à 6 ou 8 chainons non substitué,
dans laquelle Ar2 représente de préférence un cycle aromatique à 6 ou 8 chainons non substitué,
dans laquelle R6 et R7 représentent chacun un atome d’hydrogène ou un groupement fonctionnel choisi parmi un atome d’halogène, -CH=O, -CH2OH, -
CH2CI, -OH, -SH, -CH2-SH, -CO-OCH3, -COOH, -NHR9, -NR12R13, -O-R9, -R9-R 6 and R 7 not simultaneously representing a hydrogen atom, in which Ar 2 preferably represents an unsubstituted 6- or 8-membered aromatic ring, in which Ar 2 preferably represents an unsubstituted 6- or 8-membered aromatic ring, in which R 6 and R 7 each represent a hydrogen atom or a functional group chosen from a halogen atom, -CH=O, -CH 2 OH, - CH 2 CI, -OH, -SH, -CH 2 -SH, -CO-OCH 3 , -COOH, -NHR 9 , -NR 12 R 13 , -OR 9 , -R 9 -
SO2-R10, -CN3, -CNO2, -P(O)(OR9)OR10 et -P(O)R9R10R11, R6 et R7 ne représentant pas simultanément un atome d’hydrogène,
SO 2 -R 10 , -CN 3 , -CNO 2 , -P(O)(OR 9 )OR 10 and -P(O)R 9 R 10 R 11 , R6 and R7 not simultaneously representing a hydrogen atom ,
Les dendrimères selon l’invention répondent de préférence à la formule générale (IV) suivante :
dans laquelle m est un nombre entier supérieur ou égal à 2, notamment compris entre 2 et 8 et par exemple égal à 6, P0 représente le noyau central des dendrimères, et R1, R2, R3, R5, R6, R7, Ar1, Ar2 et n sont tels que définis ci-avant. The dendrimers according to the invention preferably correspond to the following general formula (IV): in which m is an integer greater than or equal to 2, in particular between 2 and 8 and for example equal to 6, P0 represents the central nucleus of the dendrimers, and R 1 , R 2 , R 3 , R 5 , R 6 , R 7 , Ar 1 , Ar 2 and n are as defined above.
Dans des modes de réalisation particuliers de l’invention, les dendrimères répondent à l’une des formules (IVa) à (IVf) suivantes :
In particular embodiments of the invention, the dendrimers correspond to one of the following formulas (IVa) to (IVf):
(IVg) ou (Vlh) :
18
dans lesquelles n, Ar1, Ar2, R6 et R7 sont tels que défini ci-avant. (IVg) or (Vlh): 18 in which n, Ar 1 , Ar 2 , R 6 and R 7 are as defined above.
Des dendrimères particuliers selon l’invention répondent à la formule (IVi) ou à la formule (I Vj) : Particular dendrimers according to the invention correspond to formula (IVi) or to formula (I Vj):
5
5
Les dendrimères selon l’invention peuvent être synthétisés de toute façon connue de la personne du métier, notamment par répétition d’une même séquence réactionnelle permettant l’obtention d’une nouvelle génération à la fin de chaque séquence. En particulier, les dendrimères selon l’invention peuvent être synthétisés selon la méthode présentée dans la publication suivante : Karpus et al., Crown Macromolecular Derivatives: Stepwise Design of New Types of Polyfunctionalized Phosphorus Dendrimers. The Journal of Organic Chemistry, 2022, vol. 87, no 5, p. 3433-3441 . The dendrimers according to the invention can be synthesized in any way known to those skilled in the art, in particular by repetition of the same reaction sequence allowing a new generation to be obtained at the end of each sequence. In particular, the dendrimers according to the invention can be synthesized according to the method presented in the following publication: Karpus et al., Crown Macromolecular Derivatives: Stepwise Design of New Types of Polyfunctionalized Phosphorus Dendrimers. The Journal of Organic Chemistry, 2022, vol. 87, no. 5, p. 3433-3441.
Selon un autre aspect, la présente invention concerne un procédé de préparation d’un support solide ou semi-solide selon l’invention, qui comprend une étape de fixation, en particulier par liaison covalente, de dendrimères tel que définis ci- avant sur ladite surface du support. According to another aspect, the present invention relates to a process for preparing a solid or semi-solid support according to the invention, which comprises a step of fixing, in particular by covalent bond, dendrimers as defined above on said surface of the support.
Cette étape de fixation peut être réalisée par réaction de groupements fonctionnels des dendrimères avec des fonctions chimiques portées par la surface du support qui sont aptes à réagir avec ces groupements fonctionnels pour former une liaison covalente. This fixing step can be carried out by reaction of functional groups of the dendrimers with chemical functions carried by the surface of the support which are capable of reacting with these functional groups to form a covalent bond.
Dans des modes de mise en œuvre particuliers de l’invention, les groupements fonctionnels libres des dendrimères sont des groupements aldéhyde, et la surface du support sur laquelle les dendrimères doivent être fixés comporte des fonctions amine. L’étape de fixation des dendrimères sur le support solide ou
semi-solide comprend alors de préférence l’immersion de la surface du support portant les fonctions amine dans un bain contenant les dendrimères dans un solvant, pendant une durée de préférence comprise entre 10 minutes et 24 heures, préférentiellement comprise entre 1 et 12 heures et préférentiellement encore comprise entre 2 et 8 heures. Le solvant mis en œuvre est de préférence un solvant aprotique, préférentiellement polaire tel que le tétrahydrofurane. In particular embodiments of the invention, the free functional groups of the dendrimers are aldehyde groups, and the surface of the support on which the dendrimers must be fixed comprises amine functions. The step of fixing the dendrimers on the solid support or semi-solid then preferably comprises the immersion of the surface of the support carrying the amine functions in a bath containing the dendrimers in a solvent, for a period preferably between 10 minutes and 24 hours, preferably between 1 and 12 hours and preferably still between 2 and 8 hours. The solvent used is preferably an aprotic solvent, preferably polar, such as tetrahydrofuran.
Le procédé selon l’invention peut comprendre, si nécessaire, une étape préalable de fonctionnalisation de la surface du support pour lui apporter les fonctions requises. Il entre dans les compétences de l’homme du métier d’en déterminer les conditions opératoires, et les réactifs à mettre en œuvre, en fonction de chaque combinaison particulière de matériau formant le support solide et de groupements fonctionnels portés par les dendrimères sur leur périphérie. A titre d’exemple, lorsque le matériau constituant le support est le verre, et les groupements fonctionnels portés par les dendrimères sont des fonctions aldéhyde, cette étape de fonctionnalisation peut être réalisée par une réaction de silanisation, réalisée de manière classique en elle-même, au moyen d’un actif de silanisation comportant des fonctions amine aptes à réagir avec les groupements fonctionnels des dendrimères . The method according to the invention may include, if necessary, a preliminary step of functionalization of the surface of the support to provide it with the required functions. It is within the skills of those skilled in the art to determine the operating conditions, and the reagents to be used, depending on each particular combination of material forming the solid support and functional groups carried by the dendrimers on their periphery. . For example, when the material constituting the support is glass, and the functional groups carried by the dendrimers are aldehyde functions, this functionalization step can be carried out by a silanization reaction, carried out in a conventional manner in itself. , by means of a silanization active ingredient comprising amine functions capable of reacting with the functional groups of the dendrimers.
Dans des modes de mise en œuvre particuliers de l’invention, lorsque la surface du support comporte déjà des fonctions aptes à réagir avec des groupements fonctionnels des dendrimères pour former une liaison covalente, par exemple lorsque la surface du support est formée en or et que les dendrimères comportent à leur périphérie des fonctions thiol, l’étape de fixation des dendrimères sur la surface du support est réalisée directement, sans étape préalable de fonctionnalisation spécifique de la surface du support. In particular embodiments of the invention, when the surface of the support already comprises functions capable of reacting with functional groups of the dendrimers to form a covalent bond, for example when the surface of the support is formed of gold and that the dendrimers contain thiol functions at their periphery, the step of fixing the dendrimers to the surface of the support is carried out directly, without a prior step of specific functionalization of the surface of the support.
Le procédé selon l’invention peut en outre comporter, en étape initiale, une étape optionnelle de nettoyage de la surface du support à fonctionnaliser par les dendrimères. Cette étape de nettoyage peut être réalisée de toute manière classique en elle-même, par exemple au moyen d’une solution alcaline, notamment à base d’hydroxyde de sodium. Dans des modes de mise en œuvre particuliers de l’invention, elle est réalisée par immersion de la surface du support dans une telle solution alcaline. L’étape de nettoyage peut
optionnellement être suivie d’une étape de séchage, par exemple sous courant d’azote ou par centrifugation. The method according to the invention may further comprise, in the initial step, an optional step of cleaning the surface of the support to be functionalized by the dendrimers. This cleaning step can be carried out in any conventional manner in itself, for example using an alkaline solution, in particular based on sodium hydroxide. In particular embodiments of the invention, it is carried out by immersing the surface of the support in such an alkaline solution. The cleaning step can optionally be followed by a drying step, for example under a stream of nitrogen or by centrifugation.
La quantité de dendrimères déposée sur le support peut notamment être comprise entre 0,1 et 1000 pg par cm2 de support, par exemple être environ égale à 50 pg/cm2. The quantity of dendrimers deposited on the support can in particular be between 0.1 and 1000 pg per cm 2 of support, for example be approximately equal to 50 pg/cm 2 .
Selon un autre aspect, la présente invention concerne l’utilisation d’un support solide ou semi-solide selon l’invention pour la fabrication d’une biopuce. L’invention s’exprime également à cet égard dans les termes d’un procédé de fabrication d’une biopuce mettant en œuvre un support solide ou semi-solide selon l’invention. According to another aspect, the present invention relates to the use of a solid or semi-solid support according to the invention for the manufacture of a biochip. The invention is also expressed in this regard in the terms of a process for manufacturing a biochip using a solid or semi-solid support according to the invention.
Dans toute la présente description, on entend par biopuce, de manière classique en elle-même, tout système, de préférence miniaturisé, comportant un support sur lequel sont immobilisées, notamment de façon covalente, des molécules, dites molécules sondes, chacune à un endroit précis du support, pour l’analyse d’interactions de ces molécules sondes avec des molécules cibles en solution.Throughout the present description, the term biochip is understood to mean, in a conventional manner in itself, any system, preferably miniaturized, comprising a support on which molecules, called probe molecules, are immobilized, in particular covalently, each at a specific location. precision of the support, for the analysis of interactions of these probe molecules with target molecules in solution.
Selon la présente invention, la fabrication de la biopuce comprend la liaison covalente d’au moins une molécule, dite molécule sonde, de préférence d’une pluralité de molécules sondes, sur des groupements fonctionnels libres des dendrimères greffés sur la surface du support. According to the present invention, the manufacture of the biochip comprises the covalent bonding of at least one molecule, called the probe molecule, preferably of a plurality of probe molecules, to free functional groups of the dendrimers grafted onto the surface of the support.
Les molécules sondes sont choisies en fonction des molécules cibles visées. Elles peuvent être de toute nature ou origine. Il peut notamment s’agir de molécules d’acide nucléique, de peptides, de protéines, de polysaccharides, de glucides, de glycosides, notamment aminés, de lipides, etc. The probe molecules are chosen according to the targeted target molecules. They can be of any nature or origin. These may in particular be nucleic acid molecules, peptides, proteins, polysaccharides, carbohydrates, glycosides, in particular amino glycosides, lipids, etc.
En particulier, les molécules sondes peuvent consister en des molécules d’acide nucléique simple-brin ou double-brins, d’origine naturelle ou synthétique, par exemple consister en des aptamères, ou en des amplicons obtenus par réaction de polymérisation en chaîne (PCR), pouvant présenter toute taille, par exemple jusqu’à 500 nucléotides. Dans des modes de mise en œuvre particuliers de l’invention, les molécules d’acide nucléique sont des oligonucléotides obtenus par synthèse chimique, par des techniques connues de l’homme du métier, présentant de préférence une taille comprise entre 15 et 50 nucléotides. In particular, the probe molecules may consist of single-stranded or double-stranded nucleic acid molecules, of natural or synthetic origin, for example consist of aptamers, or of amplicons obtained by polymerase chain reaction (PCR). ), which can be of any size, for example up to 500 nucleotides. In particular embodiments of the invention, the nucleic acid molecules are oligonucleotides obtained by chemical synthesis, by techniques known to those skilled in the art, preferably having a size of between 15 and 50 nucleotides.
Les molécules sondes peuvent autrement consister en ou comprendre des peptides et/ou pseudo-peptides. Préférentiellement, ces peptides sont choisis
pour posséder une fonction amine libre. Des peptides comprenant un résidu lysine, arginine, glutamine, asparagine et/ou histidine sont ainsi particulièrement préférés dans le cadre de l’invention. The probe molecules may otherwise consist of or include peptides and/or pseudo-peptides. Preferably, these peptides are chosen to possess a free amine function. Peptides comprising a lysine, arginine, glutamine, asparagine and/or histidine residue are thus particularly preferred in the context of the invention.
Dans des modes de mise en œuvre particuliers de l’invention, les groupements fonctionnels libres des dendrimères sont des groupements aldéhyde, et la ou les molécules sondes contiennent au moins une fonction amine. In particular embodiments of the invention, the free functional groups of the dendrimers are aldehyde groups, and the probe molecule(s) contain at least one amine function.
La molécule sonde peut avoir été préalablement modifiée pour y introduire une fonction apte à réagir avec des groupements fonctionnels libres des dendrimères. Par exemple, la molécule sonde peut avoir été modifiée pour y introduire une fonction amine apte à réagir avec des groupements aldéhydes libres situés en périphérie des dendrimères. The probe molecule may have been previously modified to introduce a function capable of reacting with free functional groups of the dendrimers. For example, the probe molecule may have been modified to introduce an amine function capable of reacting with free aldehyde groups located at the periphery of the dendrimers.
La fabrication de la biopuce comprend notamment une étape d’adressage ordonné des molécules sondes sur la surface du support fonctionnalisé selon l’invention, suivant un agencement géométrique donné, pour leur liaison avec les dendrimères qui y sont immobilisés, cette étape pouvant être réalisée de toute manière conventionnelle pour l’homme du métier. L’agencement réalisé est de préférence adapté au mode de lecture de la biopuce envisagé. Par exemple, pour les biopuces à fluorescence, les molécules sondes peuvent être adressées sur la surface du support au moyen d’un robot à aiguille ou à jet d’encre. Dans ce cas, les motifs de dépôt sont des spots ronds, dont la taille est compatible avec la résolution du scanner de lecture de la fluorescence. Dans le cas d’une détection sans marquage par fluorescence, par exemple par diffraction de la lumière, les molécules sondes sont de préférence ordonnées sur le support fonctionnalisé selon des motifs dits diffractants, dont la taille et la forme sont dépendantes du système de lecture de la diffraction. L’adressage des molécules sondes peut alors par exemple être réalisé par une technique d’impression par microcontact. L’ensemble des techniques ci-avant sont bien connues de l’homme du métier, qui sait comment et au moyen de quels dispositifs les mettre en œuvre. The manufacture of the biochip notably comprises a step of ordered addressing of the probe molecules on the surface of the functionalized support according to the invention, following a given geometric arrangement, for their connection with the dendrimers which are immobilized there, this step being able to be carried out by any conventional manner for those skilled in the art. The arrangement made is preferably adapted to the mode of reading the biochip envisaged. For example, for fluorescence biochips, the probe molecules can be addressed on the surface of the support using a needle or inkjet robot. In this case, the deposition patterns are round spots, the size of which is compatible with the resolution of the fluorescence reading scanner. In the case of detection without fluorescence marking, for example by light diffraction, the probe molecules are preferably ordered on the functionalized support according to so-called diffracting patterns, the size and shape of which depend on the reading system of diffraction. The addressing of the probe molecules can then, for example, be carried out using a microcontact printing technique. All of the above techniques are well known to those skilled in the art, who know how and by means of which devices to implement them.
La mise en contact entre le support fonctionnalisé et les molécules sondes est maintenue pendant un temps suffisant, et réalisée dans des conditions adéquates, pour permettre le greffage des molécules sondes sur les dendrimères.
Cette mise en contact peut être suivie d’une étape de lavage, afin d’éliminer toutes les molécules non liées, et d’une étape de séchage optionnelle, par exemple sous courant d’azote ou par centrifugation. Contact between the functionalized support and the probe molecules is maintained for a sufficient time, and carried out under suitable conditions, to allow the grafting of the probe molecules onto the dendrimers. This contacting can be followed by a washing step, in order to eliminate all unbound molecules, and by an optional drying step, for example under a stream of nitrogen or by centrifugation.
Un autre objet de l’invention est une biopuce, qui comporte un support solide ou semi-solide selon l’invention et au moins une molécule, dite molécule sonde, de préférence une pluralité de molécules sondes, fixée(s) de manière covalente à des groupements fonctionnels libres des dendrimères du support. Another object of the invention is a biochip, which comprises a solid or semi-solid support according to the invention and at least one molecule, called a probe molecule, preferably a plurality of probe molecules, attached covalently to free functional groups of the dendrimers of the support.
Les molécules sondes peuvent répondre à l’une ou plusieurs des caractéristiques décrites ci-avant en référence à l’utilisation d’un support fonctionnalisé selon l’invention pour la fabrication d’une biopuce. The probe molecules may respond to one or more of the characteristics described above with reference to the use of a functionalized support according to the invention for the manufacture of a biochip.
La biopuce selon l’invention peut notamment être une biopuce à ADN ou une biopuce à ARN. Il peut notamment s’agir d’une puce à ADN de type génomique ou transcriptomique comprenant respectivement des fragments d’ADN obtenus par Réaction de Polymérisation en Chaîne (PCR) ou des retranscrits d’ADN.The biochip according to the invention may in particular be a DNA biochip or an RNA biochip. It may in particular be a genomic or transcriptomic type DNA chip comprising respectively DNA fragments obtained by Polymerase Chain Reaction (PCR) or DNA transcripts.
La biopuce objet de la présente invention peut être utilisée pour la recherche, dans un milieu, d’une molécule cible particulière avec laquelle la molécule sonde est apte à interagir, et trouver application dans de multiples domaines. The biochip which is the subject of the present invention can be used for the search, in a medium, for a particular target molecule with which the probe molecule is able to interact, and find application in multiple fields.
Ainsi, un autre aspect de l’invention concerne l’utilisation d’une biopuce selon l’invention pour la détection, dans un échantillon, d’une molécule cible avec laquelle la molécule sonde est apte à interagir de manière spécifique. Thus, another aspect of the invention concerns the use of a biochip according to the invention for the detection, in a sample, of a target molecule with which the probe molecule is able to interact in a specific manner.
Cet échantillon peut être de tout type. Il peut notamment s’agir d’un échantillon biologique, en particulier issu d’un individu dans un domaine d’application avantageux de la biopuce selon l’invention qu’est le diagnostic médical. Dans un tel domaine d’application, la molécule sonde peut notamment être : This sample can be of any type. It may in particular be a biological sample, in particular from an individual in an advantageous field of application of the biochip according to the invention which is medical diagnosis. In such a field of application, the probe molecule can in particular be:
- une sonde nucléotidique, par exemple d’ADN, pour l’analyse d’interactions ADN-ADN et/ou ADN-ARN, par exemple pour la détection d’ADN spécifique d’un pathogène ou pour détecter des mutations d’un gène prédisposant les patients à un certain type de maladie ; - a nucleotide probe, for example DNA, for the analysis of DNA-DNA and/or DNA-RNA interactions, for example for the detection of specific DNA of a pathogen or to detect mutations of a gene predisposing patients to a certain type of disease;
- une sonde peptidique, pour l’analyse d’interactions protéine-protéine et/ou protéine-anticorps ; - a peptide probe, for the analysis of protein-protein and/or protein-antibody interactions;
- un aptamère, pour l’analyse de l’interaction protéine-ADN ; - an aptamer, for the analysis of protein-DNA interaction;
- un glycoside aminé, pour l’analyse glycomique. - an amino glycoside, for glycomic analysis.
Tout autre domaine d’application d’une biopuce selon l’invention entre
également dans le cadre de l’invention. Any other field of application of a biochip according to the invention between also within the scope of the invention.
La détection de l’interaction entre la molécule sonde et la molécule cible peut être réalisée par toute technique classique en elle-même. The detection of the interaction between the probe molecule and the target molecule can be carried out by any conventional technique in itself.
Par exemple, la molécule cible peut être préalablement marquée par un marqueur détectable classique en lui-même, notamment par un marqueur fluorescent tel qu’un fluorophore, ou par une étiquette présentant une forte affinité de liaison avec un partenaire lui-même lié à un marqueur détectable, de sorte à générer un signal détectable et le cas échéant quantifiable, notamment un signal de fluorescence. Après mise en contact du support sur lequel est immobilisée la molécule sonde avec le milieu susceptible de contenir la molécule cible à détecter, et le cas échéant mise en présence du partenaire lié au marqueur détectable, l’interaction spécifique entre la molécule sonde et la molécule cible est alors simplement déterminée par excitation du marqueur détectable qui s’est éventuellement assemblé sur le support, puis détection du signal, notamment de fluorescence, alors éventuellement réémis par le marqueur. For example, the target molecule can be previously marked by a conventional detectable marker in itself, in particular by a fluorescent marker such as a fluorophore, or by a label having a strong binding affinity with a partner itself linked to a detectable marker, so as to generate a detectable and where appropriate quantifiable signal, in particular a fluorescence signal. After bringing the support on which the probe molecule is immobilized into contact with the medium likely to contain the target molecule to be detected, and where appropriate bringing the partner linked to the detectable marker into contact, the specific interaction between the probe molecule and the molecule target is then simply determined by excitation of the detectable marker which has possibly assembled on the support, then detection of the signal, in particular fluorescence, then possibly re-emitted by the marker.
La détection de l’interaction de la molécule sonde avec la molécule cible peut autrement par exemple être réalisée par une technique basée sur le principe des réseaux de diffraction de la lumière. The detection of the interaction of the probe molecule with the target molecule can otherwise, for example, be carried out by a technique based on the principle of light diffraction gratings.
Les caractéristiques et avantages de l’invention apparaîtront plus clairement à la lumière des exemples de mise en œuvre ci-après, fournis à simple titre illustratif et nullement limitatifs de l’invention, avec l’appui des figures 1 à 7, dans lesquelles : The characteristics and advantages of the invention will appear more clearly in the light of the examples of implementation below, provided purely for illustrative purposes and in no way limiting the invention, with the support of Figures 1 to 7, in which:
[Fig. 1 ] La figure 1 montre les étapes d’une voie de synthèse d’un premier précurseur de dendrimères conformes à l’invention. [Fig. 1 ] Figure 1 shows the steps of a synthesis route for a first dendrimer precursor in accordance with the invention.
[Fig. 2] La figure 2 montre les étapes d’une voie de synthèse d’un deuxième précurseur de dendrimères conformes à l’invention. [Fig. 2] Figure 2 shows the steps of a synthesis route for a second dendrimer precursor in accordance with the invention.
[Fig. 3] La figure 3 montre les étapes d’une voie de synthèse d’un premier dendrimère conforme à l’invention D1. [Fig. 3] Figure 3 shows the steps of a synthesis route for a first dendrimer in accordance with invention D1.
[Fig. 4] La figure 4 montre les étapes d’une voie de synthèse d’un deuxième dendrimère conforme à l’invention D2. [Fig. 4] Figure 4 shows the steps of a synthesis route for a second dendrimer in accordance with invention D2.
[Fig. 5] La figure 5 montre une image obtenue par microscopie électronique à balayage (MEB), d’un spot de détection obtenu dans une expérience de
détection d’un oligonucléotide cible dans un milieu liquide, au moyen d’une biopuce utilisant, pour la fonctionnalisation du support, un dendrimère phosphoré de l’art antérieur (« 96 CHO ») et, en tant que sonde immobilisée sur ledit dendrimère, un oligonucléotide complémentaire de l’oligonucléotide cible, la détection étant réalisée par colorimétrie. [Fig. 5] Figure 5 shows an image obtained by scanning electron microscopy (SEM), of a detection spot obtained in an experiment of detection of a target oligonucleotide in a liquid medium, by means of a biochip using, for the functionalization of the support, a phosphorous dendrimer of the prior art (“96 CHO”) and, as a probe immobilized on said dendrimer, an oligonucleotide complementary to the target oligonucleotide, the detection being carried out by colorimetry.
[Fig. 6] La figure 6 montre une image obtenue par microscopie électronique à balayage (MEB), d’un spot de détection obtenu dans une expérience similaire à celle de la figure 5, mais réalisée au moyen d’une biopuce utilisant, pour la fonctionnalisation du support, un dendrimère conforme à l’invention (« D1 »).[Fig. 6] Figure 6 shows an image obtained by scanning electron microscopy (SEM), of a detection spot obtained in an experiment similar to that of Figure 5, but carried out by means of a biochip using, for the functionalization of the support, a dendrimer according to the invention (“D1”).
[Fig. 7] La figure 7 montre un histogramme représentant les intensités de détection obtenues dans le cadre de la détection de molécules cibles par différentes sondes bactériennes fixées sur une biopuce comprenant un dendrimère de l’art antérieur (« 96 CHO ») d’une part, et une biopuce comprenant un dendrimère D1 conforme à l’invention d’autre part. Les molécules cibles sont 5 amplicons obtenus à partir d’un échantillon biologique par la technique PCR visant l’amplification de fragments d’ADN spécifiques de Proteus mirabilis et de fragments spécifiques d’ Escherichia coli, dont les sondes bactériennes sont complémentaires. Les sondes 12 et 13 détectent de l’ADN de Proteus mirabilis, les sondes 10 et 11 détectent de l’ADN d’ Escherichia coli et les sondes 68P, 71 P et 72P ciblent de l’ADN des espèces de la famille des Enterobacteriaceae en général, dont font partie les espèces Proteus mirabilis et Escherichia coli. [Fig. 7] Figure 7 shows a histogram representing the detection intensities obtained in the context of the detection of target molecules by different bacterial probes fixed on a biochip comprising a dendrimer of the prior art ("96 CHO") on the one hand, and a biochip comprising a D1 dendrimer in accordance with the invention on the other hand. The target molecules are 5 amplicons obtained from a biological sample by the PCR technique aimed at the amplification of specific DNA fragments of Proteus mirabilis and specific fragments of Escherichia coli, the bacterial probes of which are complementary. Probes 12 and 13 detect DNA from Proteus mirabilis, probes 10 and 11 detect DNA from Escherichia coli and probes 68P, 71 P and 72P target DNA from species of the Enterobacteriaceae family in general, which includes the species Proteus mirabilis and Escherichia coli.
Dans les exemples ci-après, les différentes étapes de synthèse s’effectuent dans des solvants exempts d’humidité et sous atmosphère d’Argon. In the examples below, the different synthesis steps are carried out in solvents free of humidity and under an Argon atmosphere.
EXEMPLE 1 : Synthèse de précurseurs de dendrimères conformes à l’invention Précurseur 8 EXAMPLE 1: Synthesis of dendrimer precursors in accordance with the invention Precursor 8
Les différentes étapes de synthèse d’un premier précurseur de dendrimères selon l’invention (composé 8) sont détaillées sur la figure 1 . The different stages of synthesis of a first dendrimer precursor according to the invention (compound 8) are detailed in Figure 1.
Synthèse du composé 3 Synthesis of compound 3
Un mélange d’hexachlorocyclotriphosphazène 1 (12,00 g, 34,5 mmol, 1 éq.) et de diméthyl 5-hydroxyisophthalate (44,26 g, 21 1 mmol, 6 éq.) est dissous dans 750 mL d’acétone. Du carbonate de potassium (K2CO3) (57,38 g, 415 mmol, 12 éq.) est ajouté à la solution sous une agitation vigoureuse. Le mélange est agité
à température ambiante pendant 24 h. Les solvants volatils sont retirés sous vide puis le mélange est dissous dans 500 mL de dichlorométhane (CH2CI2) et 500 mL de solution de soude (NaOH) 1 M. Le mélange est extrait avec 3 x 500 mL de dichlorométhane (CH2CI2). Les fractions organiques sont lavées avec de l’eau puis séchées avec du sulfate de sodium (Na2SO4). Après retrait du solvant, le composé 3 pur est obtenu sous la forme d’un solide blanc (45,95 g, 33,1 mmol). Synthèse des composés 4 et 7 A mixture of hexachlorocyclotriphosphazene 1 (12.00 g, 34.5 mmol, 1 eq.) and dimethyl 5-hydroxyisophthalate (44.26 g, 21 1 mmol, 6 eq.) is dissolved in 750 mL of acetone. Potassium carbonate (K 2 CO 3 ) (57.38 g, 415 mmol, 12 eq.) is added to the solution with vigorous stirring. The mixture is stirred at room temperature for 24 h. The volatile solvents are removed under vacuum then the mixture is dissolved in 500 mL of dichloromethane (CH 2 CI 2 ) and 500 mL of 1 M sodium hydroxide solution (NaOH). The mixture is extracted with 3 x 500 mL of dichloromethane (CH 2 IC 2 ). The organic fractions are washed with water then dried with sodium sulfate (Na 2 SO 4 ). After removal of the solvent, pure compound 3 is obtained in the form of a white solid (45.95 g, 33.1 mmol). Synthesis of compounds 4 and 7
Au composé 3 (ou 6) (7,95 mmol) dans 550 mL de tétrahydrofurane (THF), le complexe borane diméthyl sulfide (2,75 éq. par groupe CO2Me) est ajouté lentement et le mélange obtenu est chauffé à reflux avec contrôle de la conversion par RMN 1H and 31P (dans CD3OD). Après réaction complète (168h) les solvants sont retirés sous vide afin d’obtenir un solide blanc séché sous vide pendant 1 nuit. Le produit est ensuite dissous dans 600 mL de méthanol (MeOH) et agité pendant 24 h. Après filtration et concentration de la solution, une huile incolore est obtenue. Ce produit est alors chauffé à reflux dans 100 mL d’acétone puis filtré pour obtenir le composé 4 (ou 7) sous la forme d’un solide blanc.To compound 3 (or 6) (7.95 mmol) in 550 mL of tetrahydrofuran (THF), the borane dimethyl sulfide complex (2.75 eq. per CO 2 Me group) is added slowly and the mixture obtained is heated to reflux with control of the conversion by 1 H and 31 P NMR (in CD 3 OD). After complete reaction (168 hours) the solvents are removed under vacuum to obtain a white solid dried under vacuum for 1 night. The product is then dissolved in 600 mL of methanol (MeOH) and stirred for 24 h. After filtration and concentration of the solution, a colorless oil is obtained. This product is then heated to reflux in 100 mL of acetone then filtered to obtain compound 4 (or 7) in the form of a white solid.
Synthèse des composés 5 et 8 Synthesis of compounds 5 and 8
Au composé 4 (ou 7) (5,35 mmol) dans 250 mL de tétrahydrofurane (THF), la triphénylphosphine (33,68 g, 128,4 mmol, 2 éq. par groupe CH2OH) et l’hexachloroéthane (30,40 g, 128,4 mmol, 2 éq. par groupe CH2OH) sont ajoutés. Le mélange obtenu est agité à température ambiante avec contrôle de la conversion par RMN 1H and 31 P. Après réaction complète (48h), les solvants sont retirés sous vide et le mélange est purifié par chromatographie flash sur silice (SiO2) avec un mélange dichlorométhane (CH2CI2)/Hexane = 5/1 comme éluant pour obtenir le composé 5 (ou 8) sous la forme d’un produit solide blanc. Synthèse du composé 6 To compound 4 (or 7) (5.35 mmol) in 250 mL of tetrahydrofuran (THF), triphenylphosphine (33.68 g, 128.4 mmol, 2 eq. per CH 2 OH group) and hexachloroethane (30 .40 g, 128.4 mmol, 2 eq. per CH 2 OH group) are added. The mixture obtained is stirred at room temperature with control of the conversion by 1 H and 31 P NMR. After complete reaction (48 hours), the solvents are removed under vacuum and the mixture is purified by flash chromatography on silica (SiO 2 ) with a mixture of dichloromethane (CH 2 CI 2 )/Hexane = 5/1 as eluent to obtain compound 5 (or 8) in the form of a white solid product. Synthesis of compound 6
Un mélange du composé 5 (1 ,75 mmol) et de diméthyl 5-hydroxyisophthalate (1 ,03 éq. par groupe CH2CI) est dissous dans 250 mL d’acétonitrile (CH3CN). Du carbonate de potassium (K2CO3) (2,0 éq. par groupe CH2CI) est ajouté à la solution sous une agitation vigoureuse. Le mélange obtenu est chauffé à reflux avec contrôle de la conversion par RMN 1H and 31 P. Après réaction complète (16h), les solvants volatils sont retirés sous vide puis le mélange est dissous dans 300 mL de dichlorométhane (CH2CI2) et 300 mL de solution de soude
(NaOH) 1 M. Le mélange est extrait avec 3 x 150 mL de dichlorométhane (CH2CI2). Les fractions organiques sont lavées avec de l’eau et séchées avec du sulfate de sodium (Na2SO4). Après retrait du solvant, le composé 6 pur est obtenu sous la forme d’un solide blanc. A mixture of compound 5 (1.75 mmol) and dimethyl 5-hydroxyisophthalate (1.03 eq. per CH 2 CI group) is dissolved in 250 mL of acetonitrile (CH 3 CN). Potassium carbonate (K 2 CO 3 ) (2.0 eq. per CH 2 CI group) is added to the solution with vigorous stirring. The mixture obtained is heated to reflux with control of the conversion by 1 H and 31 P NMR. After complete reaction (16 hours), the volatile solvents are removed under vacuum then the mixture is dissolved in 300 mL of dichloromethane (CH 2 CI 2 ) and 300 mL of soda solution (NaOH) 1 M. The mixture is extracted with 3 x 150 mL of dichloromethane (CH 2 CI 2 ). The organic fractions are washed with water and dried with sodium sulfate (Na 2 SO 4 ). After removal of the solvent, pure compound 6 is obtained in the form of a white solid.
Précurseur 13 Precursor 13
Les différentes étapes de synthèse d’un deuxième précurseur de dendrimères selon l’invention (composé 13), destiné à réagir avec le composé 8 ci-dessus pour former des dendrimères selon l’invention, sont détaillées sur la figure 2. Une solution de diméthyl 5-hydroxyisophthalate 2 (8,41 g, 40 mmol) dans 300 mL de THF est refroidie à -10 °C . A cette température, de l’aluminohydrure de lithium (LiAIH4) est ajouté goutte à goutte pendant 35 min. Le mélange obtenu est agité à température ambiante pendant 16 h puis refroidi dans un bain de glace avant d’être bloqué par une solution contenant 20 mL d’acétate d’éthyle (EtOAc), 10 mL d’éthanol (EtOH) et 56 mL d’acide sulfurique à 10 %. Le mélange est ensuite dilué avec 200 mL de tétrahydrofurane (THF) et 100 g de sulfate de sodium anhydre sont ajoutés. Après 2 h à température ambiante, le mélange est filtré puis concentré afin d’obtenir une huile jaune pâle. Ce produit est alors chauffé à reflux dans 50 mL de dichlorométhane (CH2CI2) puis filtré et lavé avec 2 fois 50 mL de dichlorométhane (CH2CI2) pour obtenir le (5-hydroxy-1 ,3- phénylène)diméthanol 12 sous la forme d’un solide blanc (5,71 g, 37 mmol). A une solution de (5-hydroxy-1 ,3-phénylène)diméthanol 12 (4,02 g, 26 mmol, 1 éq.) dans 240 mL d’un mélange tétrahydrofurane/dichlorométhane (THF/CH2CI2) 1/1 sont ajoutés de la silice (SiO2) (16,0 g) et du chlorochromate de pyridinium (PCC) (16,9 g, 78 mmol, 3 éq.). Le mélange obtenu est agité vigoureusement pendant 3 h à température ambiante puis de la silice SiO2 (16,0 g) est ajoutée avant de concentrer le mélange puis de le purifier sur chromatographie flash sur silice (SiO2) (300 mL) avec un mélange acétate d’éthyle (EtOAc)ZHexane = 1/1 comme éluant (Rf = 0,35). L’hydroxyisophthalaldéhyde 13 est obtenu sous la forme d’un solide blanc (2,73 g, 18 mmol). The different stages of synthesis of a second dendrimer precursor according to the invention (compound 13), intended to react with compound 8 above to form dendrimers according to the invention, are detailed in Figure 2. A solution of dimethyl 5-hydroxyisophthalate 2 (8.41 g, 40 mmol) in 300 mL of THF is cooled to -10 °C. At this temperature, lithium aluminohydride (LiAIH 4 ) is added dropwise for 35 min. The mixture obtained is stirred at room temperature for 16 h then cooled in an ice bath before being blocked with a solution containing 20 mL of ethyl acetate (EtOAc), 10 mL of ethanol (EtOH) and 56 mL 10% sulfuric acid. The mixture is then diluted with 200 mL of tetrahydrofuran (THF) and 100 g of anhydrous sodium sulfate are added. After 2 hours at room temperature, the mixture is filtered then concentrated to obtain a pale yellow oil. This product is then heated to reflux in 50 mL of dichloromethane (CH 2 CI 2 ) then filtered and washed twice with 50 mL of dichloromethane (CH 2 CI 2 ) to obtain (5-hydroxy-1,3-phenylene)dimethanol. 12 as a white solid (5.71 g, 37 mmol). To a solution of (5-hydroxy-1,3-phenylene)dimethanol 12 (4.02 g, 26 mmol, 1 eq.) in 240 mL of a tetrahydrofuran/dichloromethane mixture (THF/CH 2 CI 2 ) 1/ 1 are added silica (SiO 2 ) (16.0 g) and pyridinium chlorochromate (PCC) (16.9 g, 78 mmol, 3 eq.). The mixture obtained is stirred vigorously for 3 h at room temperature then silica SiO 2 (16.0 g) is added before concentrating the mixture then purifying it on flash chromatography on silica (SiO 2 ) (300 mL) with a mixture of ethyl acetate (EtOAc)ZHexane = 1/1 as eluent (R f = 0.35). Hydroxyisophthalaldehyde 13 is obtained in the form of a white solid (2.73 g, 18 mmol).
EXEMPLE 2 : Synthèse d’un premier dendrimère conforme à l’invention (« D1 ») à partir des précurseurs obtenus dans l’exemple 1 EXAMPLE 2: Synthesis of a first dendrimer in accordance with the invention (“D1”) from the precursors obtained in Example 1
Le schéma montré sur la figure 3 décrit la synthèse d’un premier exemple de dendrimère conforme à l’invention, appelé D1 , phosphore uniquement à cœur et
présentant 48 fonctions aldéhydes en surface. The diagram shown in Figure 3 describes the synthesis of a first example of dendrimer according to the invention, called D1, phosphorus only at the core and presenting 48 aldehyde functions on the surface.
Un mélange du composé 8 (0,2 mmol) et de 5-hydroxyisophthalaldéhyde 13 (1 ,05 éq. par groupe CH2CI) est dissous dans 100 mL d’acétonitrile (CH3CN). La solution est agitée vigoureusement et du carbonate de potassium (K2CO3) (2,0 éq. par groupe CH2CI) est ajouté. Le mélange obtenu est chauffé à reflux avec contrôle de la conversion par RMN 1H and 31 P. Après réaction complète (120 h), le mélange est refroidi à température ambiante puis filtré. Le dendrimère 16 (D1 ), obtenu sous forme de solide blanc, est lavé avec de l’eau puis séché sous vide. A mixture of compound 8 (0.2 mmol) and 5-hydroxyisophthalaldehyde 13 (1.05 eq. per CH 2 CI group) is dissolved in 100 mL of acetonitrile (CH 3 CN). The solution is stirred vigorously and potassium carbonate (K 2 CO 3 ) (2.0 eq. per CH 2 CI group) is added. The mixture obtained is heated to reflux with control of the conversion by 1 H and 31 P NMR. After complete reaction (120 h), the mixture is cooled to room temperature then filtered. Dendrimer 16 (D1), obtained in the form of a white solid, is washed with water then dried under vacuum.
EXEMPLE 3 : Synthèse d’un deuxième dendrimère conforme à l’invention (« D2 ») à partir des précurseurs obtenus dans l’exemple 1 EXAMPLE 3: Synthesis of a second dendrimer in accordance with the invention (“D2”) from the precursors obtained in Example 1
Le schéma montré sur la figure 4 décrit la synthèse d’un second exemple de dendrimère conforme à l’invention, appelé D2, phosphoré uniquement à cœur et présentant 24 fonctions aldéhydes en surface. The diagram shown in Figure 4 describes the synthesis of a second example of dendrimer according to the invention, called D2, phosphorated only at the core and presenting 24 aldehyde functions on the surface.
Un mélange du composé 8 (0,8 mmol) et de 4-hydroxybenzaldéhyde 17 (1 ,05 éq. par groupe CH2CI) est dissous dans 150 mL d’acétonitrile (CH3CN). La solution est agitée vigoureusement et du carbonate de potassium (K2CO3) (2,0 éq. par groupe CH2CI) est ajouté. Le mélange obtenu est chauffé à reflux avec contrôle de la conversion par RMN 1H and 31 P. Après réaction complète (24 h), le mélange est refroidi à température ambiante puis filtré. Le mélange solide est dissous dans 300 mL de dichlorométhane (CH2CI2) et 500 mL d’eau et extrait avec 3 fois 150 mL de dichlorométhane (CH2CI2). Les fractions organiques sont lavées avec de l’eau et séchées avec du sulfate de sodium (Na2SO4). Le produit pur 19 (D2) est obtenu sous la forme d’un solide blanc. A mixture of compound 8 (0.8 mmol) and 4-hydroxybenzaldehyde 17 (1.05 eq. per CH 2 CI group) is dissolved in 150 mL of acetonitrile (CH 3 CN). The solution is stirred vigorously and potassium carbonate (K 2 CO 3 ) (2.0 eq. per CH 2 CI group) is added. The mixture obtained is heated to reflux with control of the conversion by 1 H and 31 P NMR. After complete reaction (24 h), the mixture is cooled to room temperature then filtered. The solid mixture is dissolved in 300 mL of dichloromethane (CH 2 CI 2 ) and 500 mL of water and extracted with 3 times 150 mL of dichloromethane (CH 2 CI 2 ). The organic fractions are washed with water and dried with sodium sulfate (Na 2 SO 4 ). The pure product 19 (D2) is obtained in the form of a white solid.
EXEMPLE 4 : Protocole de fabrication de biopuces à ADN EXAMPLE 4: Protocol for manufacturing DNA biochips
1/ Préparation d’un support solide constitué par une lame de verre fonctionnalisée par des dendrimères à fonctions aldéhyde libres en surface a/ 1 ère Etape : Nettoyage des lames de verre 1/ Preparation of a solid support consisting of a glass slide functionalized with dendrimers with free aldehyde functions on the surface a/ 1st step: Cleaning the glass slides
Des lames de verre commerciales (Gold Seal, EMS) sont placées sur des portoirs et sont immergées dans une solution alcaline de lavage constituée de 300 g de soude dans 1 ,2 L d’eau milliQ et de 1 ,8 I d’éthanol à 96%. Les lames sont agitées pendant 2h à température ambiante à l’aide d’un agitateur orbital à une vitesse de 30 rotations par minute (Heidolph Instruments Polymax 1040).
Elles sont ensuite abondamment rincées avec de l’eau milliQ (4 lavages de 5 min chacun) et séchées sous courant d’azote ou par centrifugation. b/ 2ème étape : Silanisation Commercial glass slides (Gold Seal, EMS) are placed on racks and are immersed in an alkaline washing solution consisting of 300 g of sodium hydroxide in 1.2 L of milliQ water and 1.8 L of ethanol at 96%. The slides were shaken for 2 h at room temperature using an orbital shaker at a speed of 30 rotations per minute (Heidolph Instruments Polymax 1040). They are then rinsed thoroughly with milliQ water (4 washes of 5 min each) and dried under a stream of nitrogen or by centrifugation. b/ 2nd step: Silanization
Les lames de verre ainsi nettoyées sont immergées dans une solution de 3- aminopropyltriéthoxysilane (APTES, Merck) à 10 % dans l’éthanol à 96% et sont placées sous agitation pendant une nuit à température ambiante. Elles sont ensuite laissées pendant 30 min à l’air libre, rincées avec de l’eau milliQ (2 lavages de 5 min chacun et 1 lavage de 2 min avec sonication) puis avec de l’éthanol à 96 % (1 lavage de 5 min) et enfin avec de l’éthanol à 99% (1 lavage de 5 min) avant d’être séchées sous courant d’azote ou par centrifugation. Elles sont ensuite placées pendant 3 h à une température de 120 °C. c/ 3ème étape : Fonctionnalisation avec les dendrimères The glass slides thus cleaned are immersed in a solution of 3-aminopropyltriethoxysilane (APTES, Merck) at 10% in 96% ethanol and are placed under stirring overnight at room temperature. They are then left for 30 min in the open air, rinsed with milliQ water (2 washes of 5 min each and 1 wash of 2 min with sonication) then with 96% ethanol (1 wash of 5 min) and finally with 99% ethanol (1 wash of 5 min) before being dried under a stream of nitrogen or by centrifugation. They are then placed for 3 hours at a temperature of 120°C. c/ 3rd step: Functionalization with dendrimers
Les lames silanisées sont placées dans une solution de dendrimères D1 ou D2 (58 pM dans du tétrahydrofurane) pendant 6 h sous agitation à température ambiante. Elles sont ensuite lavées avec du tétrahydrofurane (1 lavage de 5 min) puis avec de l’éthanol à 96 % (1 lavage de 5 min) et enfin avec de l’éthanol à 99% (1 lavage de 5 min) avant d’être séchées sous courant d’azote ou par centrifugation. The silanized slides are placed in a solution of dendrimers D1 or D2 (58 pM in tetrahydrofuran) for 6 h with stirring at room temperature. They are then washed with tetrahydrofuran (1 wash of 5 min) then with 96% ethanol (1 wash of 5 min) and finally with 99% ethanol (1 wash of 5 min) before be dried under a stream of nitrogen or by centrifugation.
On obtient ainsi des supports solides fonctionnalisés par des dendrimères à fonctions aldéhydes. Ces supports fonctionnalisés peuvent ensuite être utilisés pour la fabrication de puces, par immobilisation de molécules sondes sur les dendrimères. We thus obtain solid supports functionalized by dendrimers with aldehyde functions. These functionalized supports can then be used for the manufacture of chips, by immobilizing probe molecules on the dendrimers.
2/ Fabrication de la biopuce 2/ Manufacturing the biochip
L’oligonucléotide utilisé en tant que molécule sonde (CIH_ol) est modifié à son extrémité 5’ par un bras à 6 atomes de carbones terminé par une fonction amine, de formule NH2-(CH2)6- (Eurogentec, Belgique), ce qui permet la réaction avec les fonctions aldéhydes portées par les dendrimères. Il présente la séquence nucléotidique : The oligonucleotide used as a probe molecule (CIH_ol) is modified at its 5' end by an arm with 6 carbon atoms terminated by an amine function, of formula NH 2 -(CH 2 ) 6 - (Eurogentec, Belgium), which allows the reaction with the aldehyde functions carried by the dendrimers. It presents the nucleotide sequence:
5’ NH2-(CH2)6-AATATGTTTCCGGTCGTGTC 3’ (SEQ ID No :1 ) 5' NH 2 -(CH 2 ) 6 -AATATGTTTCCGGTCGTGTC 3' (SEQ ID No: 1)
Sur les supports fonctionnalisés par les dendrimères, les 100pM d’oligonucléotide sont dilués 2 fois dans un tampon phosphate 0,3 M (pH 9) et déposés sur les supports fonctionnalisés par les dendrimères en utilisant le robot sciFLEXARRAYER (Scienion, Allemagne). Le volume déposé est de 600 pL.
Après dépôt, les lames sont laissées pendant une nuit à température ambiante. Elles sont ensuite immergées dans une solution aqueuse de borohydrure de sodium (NaBH4, 1 ,74 g/L) (étape de réduction des fonctions imines) et y sont laissées pendant 30 min à température ambiante. Elles sont rincées avec de l’eau milliQ (3 lavages de 5 min chacun) et sont séchées sous courant d’azote ou par centrifugation. On the supports functionalized by the dendrimers, the 100 pM of oligonucleotide are diluted twice in a 0.3 M phosphate buffer (pH 9) and deposited on the supports functionalized by the dendrimers using the sciFLEXARRAYER robot (Scienion, Germany). The volume deposited is 600 pL. After deposition, the slides are left overnight at room temperature. They are then immersed in an aqueous solution of sodium borohydride (NaBH 4 , 1.74 g/L) (step of reduction of imine functions) and are left there for 30 min at room temperature. They are rinsed with milliQ water (3 washes of 5 min each) and are dried under a stream of nitrogen or by centrifugation.
EXEMPLE 5 : Protocole d’hybridation de la molécule cible sur la molécule sonde La solution utilisée lors de l’étape d’hybridation est composée de : EXAMPLE 5: Hybridization protocol of the target molecule on the probe molecule The solution used during the hybridization step is composed of:
- Solution de Denhardt avec 1 % de Ficoll (400) 1 % de polyvinylpyrrolidone et 1 % d’albumine de sérum bovin (BSA), - Denhardt solution with 1% Ficoll (400), 1% polyvinylpyrrolidone and 1% bovine serum albumin (BSA),
- Citrate de solution saline-sodium (SSC) 2,5X, - Saline-Sodium Citrate (SSC) 2.5X,
- ADN de sperme de saumon (100 pg/mL), - Salmon sperm DNA (100 pg/mL),
- Oligonucléotide cible : oligonucléotide complémentaire de la molécule sonde CIH_ol avec une biotine à l’extrémité 5’, de séquence nucléotidique : - Target oligonucleotide: oligonucleotide complementary to the probe molecule CIH_ol with a biotin at the 5' end, of nucleotide sequence:
5’ BIOTEG-GACACGACCGGAAACATATT 3’ (SEQ ID No : 2) (Integrated DNA Technology Inc., dans laquelle BIO représente la biotine, et TEG représente un espaceur triéthylèneglycol disposé entre la biotine et la séquence nucléotidique. La cible marquée est hybridée sur la biopuce de manière automatisée en utilisant un robot Microlab Starlet (Hamilton) contrôlé par le logiciel VENUS 4.5. L’automate est équipé d’un module de chauffage et agitation Hamilton Heater Shaker (HHS), d’un module de chauffage et refroidissement Hamilton Heater Cooler (HHC), d’un bloc chauffant HeatPAC (Inheco) à plage de température de l’ambiante à 135 °C, d’un aimant NucleoMag SEP (Macherey-Nagel®) et d’une hotte HEPA (Noroit). 5' BIOTEG-GACACGACCGGAAACATATT 3' (SEQ ID No: 2) (Integrated DNA Technology Inc., in which BIO represents biotin, and TEG represents a triethylene glycol spacer disposed between the biotin and the nucleotide sequence. The labeled target is hybridized to the biochip in an automated manner using a Microlab Starlet robot (Hamilton) controlled by VENUS 4.5 software. The automaton is equipped with a Hamilton Heater Shaker (HHS) heating and stirring module, a Hamilton Heater heating and cooling module. Cooler (HHC), a HeatPAC heating block (Inheco) with a temperature range from ambient to 135°C, a NucleoMag SEP magnet (Macherey-Nagel®) and a HEPA hood (Noroit).
Les conditions pratiques d’hybridation de l’oligonucléotide cible sur l’oligonucléotide sonde immobilisé sur les dendrimères sont les suivantes :The practical conditions for hybridization of the target oligonucleotide on the probe oligonucleotide immobilized on the dendrimers are as follows:
- dépôt de 1 15 μL de tampon d’hybridation contenant l’oligonucléotide cible marqué sur la biopuce, - deposit of 115 μL of hybridization buffer containing the target oligonucleotide marked on the biochip,
- chauffage de la biopuce à 60 °C et 250 tr/min pendant 30 min, - heating the biochip at 60°C and 250 rpm for 30 min,
- retrait du liquide et lavage avec 200 μL de solution de lavage (PBS 1 X),- removal of the liquid and washing with 200 μL of washing solution (PBS 1 X),
- ajout de 100 μL de solution de streptavidine couplée à la peroxydase de raifort (HRP-Streptavidin), solution commerciale (référence PIERN504, Thermo Scientific ) diluée au 400ème.
- incubation pendant 20 min à l’abri de la lumière, - addition of 100 μL of streptavidin solution coupled with horseradish peroxidase (HRP-Streptavidin), commercial solution (reference PIERN504, Thermo Scientific) diluted 400 times . - incubation for 20 min away from light,
- retrait du liquide et 3 lavages avec 200 μL de solution de lavage 2 (PBS 1 X, 0,05% Tween®-20) , - removal of the liquid and 3 washes with 200 μL of washing solution 2 (PBS 1 X, 0.05% Tween®-20),
- ajout de 100 μL de substrat sciCOLOR T3 (Scienion), - addition of 100 μL of sciCOLOR T3 substrate (Scienion),
- incubation pendant 20 min à l’abri de la lumière, - incubation for 20 min away from light,
- retrait du liquide et séchage de la lame à 50 °C pendant 5 min. - removal of the liquid and drying of the blade at 50 °C for 5 min.
EXEMPLE 6 : Protocole de détection et acquisition des données EXAMPLE 6: Detection and data acquisition protocol
La biopuce est lue en utilisant le scanner colorimétrique sciREADER CL2 (Scienion). L’intensité de chaque spot est mesurée en soustrayant le bruit de fond environnant. La taille des spots est également mesurée. The biochip is read using the sciREADER CL2 colorimetric scanner (Scienion). The intensity of each spot is measured by subtracting the surrounding background noise. The size of the spots is also measured.
EXEMPLE 7 : Tests de comparaison des spots de détection entre un dendrimère l’art antérieur et les dendrimères conformes à l’inventionEXAMPLE 7: Comparison tests of detection spots between a prior art dendrimer and dendrimers conforming to the invention
1/ Test 1 : Comparaison de l’intensité des spots de détection issus de l’hybridation d’une cible et d’une sonde une un dendrimère l’art antérieur (« 96 CHO ») ou par des bi des dendrimères conformes à l’invention D1 et D2 1/ Test 1: Comparison of the intensity of the detection spots resulting from the hybridization of a target and a probe with a dendrimer of the prior art ("96 CHO") or by bi dendrimers conforming to the invention D1 and D2
Le dendrimère proposé par l’art antérieur utilisé à titre comparatif dans cet exemple, nommé « 96 CHO », répond à la formule suivante :
The dendrimer proposed by the prior art used for comparison in this example, named “96 CHO”, corresponds to the following formula:
Ce dendrimère peut par exemple être préparé comme décrit dans la demande de brevet FR2838737A1 .
Une biopuce à base de ce dendrimère est préparée comme décrit dans l’exemple 4 ci-avant. Cette biopuce est soumise aux protocoles opératoires des exemples 5 et 6 ci-avant. This dendrimer can for example be prepared as described in patent application FR2838737A1. A biochip based on this dendrimer is prepared as described in Example 4 above. This biochip is subject to the operating protocols of Examples 5 and 6 above.
Les résultats obtenus, en termes de valeur médiane de l’intensité des spots et de coefficient de variation (CV) médian, sont présentés dans le Tableau 1 ci- dessous.
The results obtained, in terms of median value of spot intensity and median coefficient of variation (CV), are presented in Table 1 below.
Tableau 1 - Valeur médiane de l’intensité des spots et coefficient de variation (CV) médian Table 1 - Median value of spot intensity and median coefficient of variation (CV)
Ces résultats montrent que tant D1 que D2 sont plus performants que le dendrimère 96 CHO de l’art antérieur. L’hybridation entre les molécules sondes et les molécules cibles sur les biopuces confectionnées avec D1 et D2 conduit en effet à un rapport signal sur bruit plus important, ainsi qu’à une dispersion du signal moindre que celles confectionnées avec le dendrimère 96 CHO. These results show that both D1 and D2 are more efficient than the 96 CHO dendrimer of the prior art. The hybridization between the probe molecules and the target molecules on the biochips made with D1 and D2 leads to a greater signal-to-noise ratio, as well as to less signal dispersion than those made with the 96 CHO dendrimer.
Les biopuces ont par ailleurs été analysées par microscopie électronique à balayage. Les images obtenues sont montrées respectivement sur la figure 5 pour le dendrimère de l’art antérieur 96 CHO et la figure 6 pour le dendrimère conforme à l’invention D1. Ces images montrent l’obtention d’un spot de détection beaucoup plus rond sur la biopuce à base de D1. D1 a en outre été beaucoup plus simple à produire que 96 CHO (le temps de production étant environ 10 fois moins long, ce à quoi s’ajoutent une simplification de la purification ainsi qu’une augmentation des rendements de synthèse par rapport à la préparation des dendrimères 96 CHO). The biochips were also analyzed by scanning electron microscopy. The images obtained are shown respectively in Figure 5 for the dendrimer of the prior art 96 CHO and Figure 6 for the dendrimer according to the invention D1. These images show obtaining a much rounder detection spot on the D1-based biochip. D1 was also much simpler to produce than 96 CHO (the production time being approximately 10 times shorter, to which is added a simplification of the purification as well as an increase in synthesis yields compared to the preparation 96 CHO dendrimers).
2/ Test 2 : Comparaison de l’intensité des spots de détection issus de l’hybridation d’oligonucléotides cibles marqués obtenus par amplification PCR d’un échantillon d’ADN de bactéries avec des sondes complémentaires immobilisées sur une biopuce comprenant un dendrimère proposé par l’art antérieur (« 96 CHO ») ou sur une biopuce comprenant un dendrimère conforme à l’invention D1
Afin d’obtenir les oligonucléotides cibles marqués, un échantillon clinique comprenant les microorganismes Proteus mirabilis à une concentration de 104 UFC/mL et Escherichia coli à une concentration de 104 UFC/mL, provenant du Centre de Biologie Médicale (CBM) de Muret, a été utilisé. L’ADN de l’échantillon biologique a été extrait avec le kit DNeasy® Blood & Tissue (Qiagen) selon les instructions du fournisseur. 500 μL ont été utilisés pour l’extraction. Après centrifugation 10 min à 3000 g, le culot a été suspendu à nouveau dans 180 μL de tampon de lyse (lysozyme 40 mg/mL dans 20 mM Tris- Ci, pH 8,0, 2 mM Sodium EDTA, 1 ,2% Triton®X-100) et incubé à 37°C pendant 1 h. 2/ Test 2: Comparison of the intensity of the detection spots resulting from the hybridization of labeled target oligonucleotides obtained by PCR amplification of a bacterial DNA sample with complementary probes immobilized on a biochip comprising a dendrimer proposed by the prior art (“96 CHO”) or on a biochip comprising a dendrimer in accordance with the invention D1 In order to obtain the labeled target oligonucleotides, a clinical sample comprising the microorganisms Proteus mirabilis at a concentration of 10 4 CFU/mL and Escherichia coli at a concentration of 10 4 CFU/mL, coming from the Medical Biology Center (CBM) of Muret , has been used. DNA from the biological sample was extracted with the DNeasy® Blood & Tissue kit (Qiagen) according to the supplier's instructions. 500 μL was used for extraction. After centrifugation for 10 min at 3000 g, the pellet was resuspended in 180 μL of lysis buffer (lysozyme 40 mg/mL in 20 mM Tris-Ci, pH 8.0, 2 mM Sodium EDTA, 1.2% Triton ®X-100) and incubated at 37°C for 1 h.
Une PCR multiplexe visant à amplifier les amplicons des gènes cibles représentatifs des espèces microbiennes présentes dans l’échantillon a ensuite été réalisée avec 5 couples d’amorces : la liste des amorces PCR utilisées pour l’amplification, ainsi que les gènes ciblés, sont présentée ci-dessous dans le Tableau 2.
A multiplex PCR aimed at amplifying the amplicons of the target genes representative of the microbial species present in the sample was then carried out with 5 pairs of primers: the list of PCR primers used for amplification, as well as the targeted genes, are presented. below in Table 2.
Tableau 2 - Liste des amorces PCR utilisées pour l’amplification des gènes cibles, où « F » désigne l’amorce sens et « R » désigne l’amorce antisensTable 2 - List of PCR primers used for the amplification of target genes, where “F” designates the sense primer and “R” designates the antisense primer
Pour chaque couple d’amorces, l’amorce antisens a été marquée en 5’ avec de la biotine liée à l’amorce par un bras espaceur TEG (« Bioteg »). La réaction de PCR a été réalisée dans un volume final de 50 μL dans un mélange constitué de tampon 1 X PCR comprenant : For each pair of primers, the antisense primer was labeled at 5' with biotin linked to the primer by a TEG spacer arm ("Bioteg"). The PCR reaction was carried out in a final volume of 50 μL in a mixture consisting of 1 X PCR buffer comprising:
- 3,75 U de Taq® ADN polymérase Hot Diamond (Eurogentec, Selland, Belgium)- 3.75 U of Taq® DNA polymerase Hot Diamond (Eurogentec, Selland, Belgium)
- 3 mM MgCL, 0,2 mM désoxynucléotides (dNTPs) (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) - 3 mM MgCL, 0.2 mM deoxynucleotides (dNTPs) (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)
- entre 0,08 et 0,2 pM de chaque amorce (Integrated DNA Technologies, Clareville, IA, USA) - between 0.08 and 0.2 pM of each primer (Integrated DNA Technologies, Clareville, IA, USA)
- 50 pg d’ADN extrait de l’échantillon à tester. - 50 pg of DNA extracted from the sample to be tested.
L'amplification a été réalisée dans un thermocycleur GTQ-Cycler 96 (Hain Life Sciences, Nehren, Germany), avec le programme suivant : 30s à 94°C, 30s à 58°C et 40s à 72°C sur 35 cycles. The amplification was carried out in a GTQ-Cycler 96 thermal cycler (Hain Life Sciences, Nehren, Germany), with the following program: 30 s at 94°C, 30 s at 58°C and 40 s at 72°C over 35 cycles.
La purification des amplicons ainsi obtenus a été réalisée sur un automate Microlab Starlet (Hamilton) contrôlé par le logiciel VENUS 4.50. L’automate est équipé d’un module de chauffage et agitation Hamilton Heater Shaker (HHS), d’un module de chauffage et refroidissement Hamilton Heater Cooler (HHC), d’un bloc chauffant HeatPAC (Inheco) à plage de température de l’ambiante à 135 °C, d’un aimant NucleoMag SEP (Macherey-Nagel®) et d’une hotte HEPA (Noroit). La totalité du volume de réaction par PCR a été purifié à l’aide de billes magnétiques sparQ Beads (Quantabio) selon les recommandations du
fournisseur. Les ADN purifiés ont été élués dans 50μL d’eau qualité biologie moléculaire. The purification of the amplicons thus obtained was carried out on a Microlab Starlet automaton (Hamilton) controlled by the VENUS 4.50 software. The controller is equipped with a Hamilton Heater Shaker (HHS) heating and stirring module, a Hamilton Heater Cooler (HHC) heating and cooling module, a HeatPAC heating block (Inheco) with a temperature range of ambient at 135°C, a NucleoMag SEP magnet (Macherey-Nagel®) and a HEPA hood (Noroit). The entire PCR reaction volume was purified using sparQ Beads magnetic beads (Quantabio) according to the recommendations of the supplier. The purified DNAs were eluted in 50 μL of molecular biology quality water.
Les amplicons ont été ensuite dénaturés à 95°C pendant une minute puis placés à 4°C. 115μL de tampon d’hybridation ont été ajoutés aux 50 μL d’amplicons dénaturés, préalablement obtenus par l’amplification décrite précédemment. Le tampon d’hybridation comprenait les constituants suivants : The amplicons were then denatured at 95°C for one minute and then placed at 4°C. 115 μL of hybridization buffer were added to the 50 μL of denatured amplicons, previously obtained by the amplification described previously. The hybridization buffer included the following constituents:
- Solution de Denhardt avec 1 % de Ficoll (400), 1 % de polyvinylpyrrolidone et- Denhardt's solution with 1% Ficoll (400), 1% polyvinylpyrrolidone and
1 % d’albumine de sérum bovin (BSA) (Invitrogen), 1% bovine serum albumin (BSA) (Invitrogen),
- Citrate de solution saline-sodium (SSC) 2,5X (Sigma), - Saline-Sodium Citrate (SSC) 2.5X (Sigma),
- ADN de sperme de saumon (100 pg/mL) (Invitrogen), - Salmon sperm DNA (100 pg/mL) (Invitrogen),
- l’oligonucléotide de contrôle de l’hybridation et complémentaire de CIH_ol avec une biotine à l’extrémité 5’, de séquence nucléotidique 5’ BIOTEG- GACACGACCGGAAACATATT 3’ (SEQ ID No : 2) (Integrated DNA Technology Inc.)). - the hybridization control oligonucleotide complementary to CIH_ol with a biotin at the 5' end, of nucleotide sequence 5' BIOTEG- GACACGACCGGAAACATATT 3' (SEQ ID No: 2) (Integrated DNA Technology Inc.)).
Les molécules cibles marquées ainsi obtenues ont été mises en présence des biopuces pour la réalisation de l’hybridation selon le protocole présenté dans l’exemple 5 : deux expérimentations ont été réalisées, une avec une biopuce comprenant un dendrimère proposé par l’art antérieur « 96 CHO », et la seconde avec une biopuce comprenant un dendrimère conforme à l’invention D1. Ces dendrimères sont tels que décrits, respectivement, dans le Test 1 et l’Exemple 2 ci-avant. La fixation des dendrimères sur les biopuces a été réalisée comme décrit dans l’Exemple 4 ci-avant. Différentes molécules sondes ont été fixées sur les dendrimères comme décrit dans l’Exemple 4. Les sondes fixées sur les dendrimères ont été définies à partir de chaque gène cible, en utilisant le logiciel BioEdit ; ces molécules sondes sont telles que décrites dans le Tableau 3.
The marked target molecules thus obtained were brought into contact with the biochips for carrying out the hybridization according to the protocol presented in Example 5: two experiments were carried out, one with a biochip comprising a dendrimer proposed by the prior art. 96 CHO”, and the second with a biochip comprising a dendrimer in accordance with invention D1. These dendrimers are as described, respectively, in Test 1 and Example 2 above. The fixation of the dendrimers on the biochips was carried out as described in Example 4 above. Different probe molecules were fixed on the dendrimers as described in Example 4. The probes fixed on the dendrimers were defined from each target gene, using the BioEdit software; these probe molecules are as described in Table 3.
Tableau 3 - Liste des sondes fixées sur le dendrimère « 96 CHO » et le dendrimère D1 conforme à l’invention au sein des biopuces Table 3 - List of probes fixed on the “96 CHO” dendrimer and the D1 dendrimer conforming to the invention within the biochips
La même quantité de chacun des amplicons a été déposée sur la biopuce fonctionnalisée par le dendrimère « 96 CHO » de l’art antérieur et sur la biopuce fonctionnalisée par le dendrimère D1 conforme à l’invention. The same quantity of each of the amplicons was deposited on the biochip functionalized by the “96 CHO” dendrimer of the prior art and on the biochip functionalized by the D1 dendrimer according to the invention.
Après la réalisation du protocole de détection, mis en place conformément à ce qui est présenté dans l’exemple 6 ci-avant, les résultats obtenus en termes d’intensité du signal, présentés figure 7, ont montré de manière générale des intensités d’hybridation des molécules cibles significativement supérieures pour la biopuce comprenant le dendrimère D1 conforme à l’invention, comparé à celles obtenues avec la biopuce comprenant le dendrimère « 96 CHO ». Les différences d’intensité entre les deux types de dendrimères sont particulièrement marquées lorsque les intensités obtenues pour le dendrimère « 96 CHO » sont faibles : ces résultats attestent des performances supérieures des biopuces comprenant un dendrimère D1 conforme à l’invention. En effet, pour une même sonde, l’obtention d’un signal d’hybridation plus intense signifie une meilleure sensibilité et donc de meilleures performances de détection. After carrying out the detection protocol, implemented in accordance with what is presented in Example 6 above, the results obtained in terms of signal intensity, presented in Figure 7, generally showed intensities of hybridization of significantly higher target molecules for the biochip comprising the D1 dendrimer in accordance with the invention, compared to those obtained with the biochip comprising the “96 CHO” dendrimer. The differences in intensity between the two types of dendrimers are particularly marked when the intensities obtained for the “96 CHO” dendrimer are low: these results attest to the superior performance of biochips comprising a D1 dendrimer in accordance with the invention. Indeed, for the same probe, obtaining a more intense hybridization signal means better sensitivity and therefore better detection performance.
Ces performances supérieures ont également été confirmées par l’analyse comparative de la somme et de la moyenne des intensités de détection mesurées pour l’ensemble des sondes, présentée dans le Tableau 4 ci- dessous :
This superior performance was also confirmed by the comparative analysis of the sum and the average of the detection intensities measured for all the probes, presented in Table 4 below:
Tableau 4 - Comparaison, pour le dendrimère D1 et le dendrimère « 96 CHO », des intensités de détection mesurées (somme et moyenne des intensités, unité arbitraire) pour l’ensemble des sondes, et des performances de prédiction de la présence des microorganismes dans l’échantillon biologique. Les valeurs des variables « somme » et « moyenne » des intensités de détection mesurées apparaissent significativement plus élevées pour le dendrimère D1 conforme à l’invention, ce qui indique un pronostic d’identification plus fiable pour ce dernier que pour le dendrimère « 96 CHO ». Le tableau 5 montre également, pour le dendrimère D1 , une meilleure probabilité de détection de la présence d’un microorganisme spécifique : si les deux types de dendrimères (Dendrimère D1 et Dendrimère « 96 CHO ») permettent la détection du genre Enterobacteriaceae , avec une probabilité de présence que l’on peut toutefois noter plus élevée pour le dendrimère D1 , seul le dendrimère D1 permet la détection d’ Escherichia coli au sein de la famille des Enterobacteriacea. En effet, pour qu’un microorganisme puisse être détecté, la probabilité de sa présence au sein de l’échantillon biologique doit être supérieure ou égale à 0,5.
Table 4 - Comparison, for the D1 dendrimer and the “96 CHO” dendrimer, of the measured detection intensities (sum and average of the intensities, arbitrary unit) for all the probes, and of the performance in predicting the presence of microorganisms in the biological sample. The values of the “sum” and “average” variables of the measured detection intensities appear significantly higher for the D1 dendrimer in accordance with the invention, which indicates a more reliable identification prognosis for the latter than for the “96 CHO” dendrimer. ". Table 5 also shows, for dendrimer D1, a better probability of detecting the presence of a specific microorganism: if the two types of dendrimers (Dendrimer D1 and Dendrimer “96 CHO”) allow the detection of the genus Enterobacteriaceae, with a probability of presence which can however be noted higher for the D1 dendrimer, only the D1 dendrimer allows the detection of Escherichia coli within the Enterobacteriacea family. Indeed, for a microorganism to be detected, the probability of its presence in the biological sample must be greater than or equal to 0.5.
Claims
1. Support solide ou semi-solide comprenant une surface sur laquelle sont fixés des dendrimères phosphorés comportant à leur périphérie au moins un groupement fonctionnel pour leur liaison covalente audit support et au moins un groupement fonctionnel libre, caractérisé en ce que lesdits dendrimères sont constitués d’un noyau central phosphoré P0 comprenant au moins deux groupements à partir desquels sont formées plusieurs couches successives, comprenant : 1. Solid or semi-solid support comprising a surface on which phosphorus dendrimers are fixed comprising at their periphery at least one functional group for their covalent bond to said support and at least one free functional group, characterized in that said dendrimers consist of a central phosphorus core P0 comprising at least two groups from which several successive layers are formed, comprising:
- n couches intermédiaires, identiques ou différentes, n étant un nombre entier compris entre 1 et 4, chacune des couches intermédiaires étant constituée d’unités P1 , identiques ou différentes, répondant chacune à la formule générale (I) :
dans laquelle : R1 représente un atome d’oxygène, un atome de soufre, un atome de silicium, un groupement -NH- ou -NR4- où R4 représente un groupement alkyle linéaire, ramifié et/ou cyclique, saturé ou insaturé, comprenant de 1 à 5 carbones, ou R1 représente un radical carboné, saturé ou insaturé, linéaire, ramifié et/ou cyclique, comprenant de 1 à 6 atomes de carbones, éventuellement substitué et/ou éventuellement interrompu par un ou plusieurs hétéroatomes choisis parmi O, N, Si et S, Ar1 représente un cycle aromatique comprenant 6 ou 8 chaînons, éventuellement substitué par un ou plusieurs groupements alkyle linéaires, ramifiés et/ou cycliques comprenant chacun de 1 à 3 carbones, - n intermediate layers, identical or different, n being an integer between 1 and 4, each of the intermediate layers consisting of units P1, identical or different, each responding to general formula (I): in which: R 1 represents an oxygen atom, a sulfur atom, a silicon atom, an -NH- or -NR 4 group - where R 4 represents a linear, branched and/or cyclic, saturated or unsaturated alkyl group , comprising from 1 to 5 carbons, or R 1 represents a carbon radical, saturated or unsaturated, linear, branched and/or cyclic, comprising from 1 to 6 carbon atoms, optionally substituted and/or optionally interrupted by one or more chosen heteroatoms among O, N, Si and S, Ar 1 represents an aromatic ring comprising 6 or 8 members, optionally substituted by one or more linear, branched and/or cyclic alkyl groups each comprising 1 to 3 carbons,
R2 et R3, identiques ou différents, représentent chacun un radical carboné saturé ou insaturé, linéaire ou ramifié, comprenant de 1 à 3 atomes de carbones, lesdites couches intermédiaires étant dépourvues d’atome de phosphore, - et une couche externe constituée d’unités P2, identiques ou différentes, répondant chacune à la formule générale (II) :
dans laquelle R 2 and R 3 , identical or different, each represent a saturated or unsaturated carbon radical, linear or branched, comprising from 1 to 3 carbon atoms, said intermediate layers being devoid of phosphorus atom, - and an outer layer consisting of P2 units, identical or different, each responding to the general formula (II): in which
R5 représente un atome d’oxygène, un atome de soufre, un atome de silicium, un groupement -NH- ou -NR8- où R8 représente un groupement alkyle linéaire, ramifié et/ou cyclique, saturé ou insaturé, comprenant de 1 à 5 carbones, ou R5 représente un radical carboné, saturé ou insaturé, linéaire, ramifié et/ou cyclique, comprenant de 1 à 6 atomes de carbones, éventuellement substitué et/ou éventuellement interrompu par un ou plusieurs hétéroatomes choisis parmi O, N, Si et S, R 5 represents an oxygen atom, a sulfur atom, a silicon atom, an -NH- or -NR 8 group - where R 8 represents a linear, branched and/or cyclic, saturated or unsaturated alkyl group, comprising 1 to 5 carbons, or R 5 represents a carbon radical, saturated or unsaturated, linear, branched and/or cyclic, comprising from 1 to 6 carbon atoms, optionally substituted and/or optionally interrupted by one or more heteroatoms chosen from O, N, Si and S,
Ar2 représente un cycle aromatique comprenant 6 ou 8 chaînons, éventuellement substitué par un ou plusieurs groupements alkyle linéaires, ramifiés et/ou cycliques, comprenant chacun de 1 à 3 carbones, Ar 2 represents an aromatic ring comprising 6 or 8 members, optionally substituted by one or more linear, branched and/or cyclic alkyl groups, each comprising from 1 to 3 carbons,
R6 et R7, identiques ou différents, représentent chacun un atome d’hydrogène, un groupement fonctionnel choisi parmi un atome d’halogène, -CH=O, -CH2OH, -CH2CI, -OH, -SH, -CH2-SH, -CO-OCH3, -COOH, -NHR9, -NR12R13, -O-R9, -R9- SO2-R10, -CN3, -CNO2, -P(O)(OR9)OR10 et -P(O)R9R10R11, ou un radical carboné, saturé ou insaturé, linéaire ou ramifié, comprenant de 1 à 3 atomes de carbones et comprenant au moins un groupement fonctionnel choisi parmi un atome d’halogène -CH=O, -CH2OH, -CH2CI, -OH, -SH, -CH2-SH, -CO-OCH3,- COOH, -NHR9, -NR12R13, -O-R9, -R9-SO2-R10, -CN3, -CNO2, -P(O)(OR9)ORIO et -P(O)R9R10R11, où R9, R10 et R11, identiques ou différents, représentent chacun un groupement alkyle linéaire ou ramifié comprenant de 1 à 5 atomes de carbones, et R12 et R13, identiques ou différents, représentent chacun un groupement alkyle linéaire ou ramifié comprenant de 1 à 5 atomes de carbones, ou R12 et R13 forment ensemble, avec l’atome d’azote auxquels ils sont attachés, un cycle à 5 à 7 chaînons, saturé ou insaturé, R 6 and R 7 , identical or different, each represent a hydrogen atom, a functional group chosen from a halogen atom, -CH=O, -CH 2 OH, -CH 2 CI, -OH, -SH, -CH 2 -SH, -CO-OCH 3 , -COOH, -NHR 9 , -NR 12 R 13 , -OR 9 , -R 9 - SO 2 -R 10 , -CN 3 , -CNO 2 , -P( O)(OR 9 )OR 10 and -P(O)R 9 R 10 R 11 , or a carbon radical, saturated or unsaturated, linear or branched, comprising from 1 to 3 carbon atoms and comprising at least one selected functional group among a halogen atom -CH=O, -CH 2 OH, -CH 2 CI, -OH, -SH, -CH 2 -SH, -CO-OCH 3 ,- COOH, -NHR 9 , -NR 12 R 13 , -OR 9 , -R 9 -SO 2 -R 10 , -CN 3 , -CNO 2 , -P(O)(OR 9 )ORIO and -P(O)R 9 R 10 R 11 , where R 9 , R 10 and R 11 , identical or different, each represent a linear or branched alkyl group comprising from 1 to 5 carbon atoms, and R 12 and R 13 , identical or different, each represent a linear or branched alkyl group comprising 1 with 5 carbon atoms, or R 12 and R 13 together form, with the nitrogen atom to which they are attached, a 5 to 7-membered ring, saturated or unsaturated,
R6 et R7 ne représentant pas simultanément un atome d’hydrogène.
R 6 and R 7 do not simultaneously represent a hydrogen atom.
2. Support selon la revendication 1 , dans lequel des unités P1 de couches intermédiaires desdits dendrimères répondent à la formule (If) :
2. Support according to claim 1, in which P1 units of intermediate layers of said dendrimers correspond to the formula (If):
3. Support selon la revendication 1 ou 2, dans lequel des unités P2 de la couche externe desdits dendrimères répondent à la formule (IIf) ou (IIg) :
3. Support according to claim 1 or 2, in which P2 units of the outer layer of said dendrimers correspond to the formula (IIf) or (IIg):
4. Support selon l’une quelconque des revendications 1 à 3, dans lequel le noyau central desdits dendrimères répond à la formule (Ilia) :
4. Support according to any one of claims 1 to 3, in which the central core of said dendrimers corresponds to the formula (Ilia):
5. Support selon l’une quelconque des revendications 1 à 4, dans lequel lesdits dendrimères répondent à la formule (IVf) :
5. Support according to any one of claims 1 to 4, in which said dendrimers correspond to formula (IVf):
6. Support selon l’une quelconque des revendications 1 à 5, formé en verre, en silicium, en plastique ou en métal. 6. Support according to any one of claims 1 to 5, formed of glass, silicon, plastic or metal.
7. Procédé de préparation d’un support solide ou semi-solide selon l’une quelconque des revendications 1 à 6, caractérisé en ce qu’il comprend une étape de fixation desdits dendrimères sur ladite surface dudit support. 7. Process for preparing a solid or semi-solid support according to any one of claims 1 to 6, characterized in that it comprises a step of fixing said dendrimers on said surface of said support.
8. Procédé selon la revendication 7, selon lequel ladite étape de fixation est réalisée par réaction de groupements fonctionnels desdits dendrimères avec des fonctions portées par ladite surface du support aptes à réagir avec lesdits groupements fonctionnels pour former une liaison covalente. 8. Method according to claim 7, according to which said fixing step is carried out by reaction of functional groups of said dendrimers with functions carried by said surface of the support capable of reacting with said functional groups to form a covalent bond.
9. Procédé selon la revendication 8, selon lequel des groupements fonctionnels libres desdits dendrimères sont des groupements aldéhyde, et ladite surface du support comporte des fonctions amine. 9. Method according to claim 8, according to which free functional groups of said dendrimers are aldehyde groups, and said surface of the support comprises amine functions.
10. Utilisation d’un support solide ou semi-solide selon l’une quelconque des revendications 1 à 6 pour la fabrication d’une biopuce. 10. Use of a solid or semi-solid support according to any one of claims 1 to 6 for the manufacture of a biochip.
11. Utilisation selon la revendication 10, comprenant la liaison covalente d’au moins une molécule, dite molécule sonde, sur des groupements fonctionnels libres desdits dendrimères. 11. Use according to claim 10, comprising the covalent bonding of at least one molecule, called a probe molecule, to free functional groups of said dendrimers.
12. Biopuce caractérisée en ce qu’elle comporte un support solide ou semi- solide selon l’une quelconque des revendications 1 à 6 et au moins une molécule, dite molécule sonde, fixée de manière covalente à des groupements fonctionnels libres desdits dendrimères. 12. Biochip characterized in that it comprises a solid or semi-solid support according to any one of claims 1 to 6 and at least one molecule, called a probe molecule, attached covalently to free functional groups of said dendrimers.
13. Biopuce selon la revendication 12, dans laquelle ladite molécule sonde est une molécule d’acide nucléique, un lipide, un polysaccharide, un glucide, un glycoside, un peptide ou une protéine. 13. Biochip according to claim 12, wherein said probe molecule is a nucleic acid molecule, a lipid, a polysaccharide, a carbohydrate, a glycoside, a peptide or a protein.
14. Utilisation d’une biopuce selon la revendication 12 ou 13 pour la détection, dans un échantillon, d’une molécule cible avec laquelle ladite molécule sonde est apte à interagir de manière spécifique.
14. Use of a biochip according to claim 12 or 13 for the detection, in a sample, of a target molecule with which said probe molecule is able to interact in a specific manner.
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| FR2838737A1 (en) | 2002-04-23 | 2003-10-24 | Centre Nat Rech Scient | Solid support carrying functionalized dendrimer, useful for immobilization or synthesis of e.g. nucleic acids or proteins, particularly as biochip for studying interactions |
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2022
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-
2023
- 2023-11-27 WO PCT/EP2023/083126 patent/WO2024115365A1/en unknown
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| FR2838737A1 (en) | 2002-04-23 | 2003-10-24 | Centre Nat Rech Scient | Solid support carrying functionalized dendrimer, useful for immobilization or synthesis of e.g. nucleic acids or proteins, particularly as biochip for studying interactions |
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| KARPUS ET AL.: "Crown Macromolecular Derivatives: Stepwise Design of New Types of Polyfunctionalized Phosphorus Dendrimers", THE JOURNAL OF ORGANIC CHEMISTRY, vol. 87, no. 5, 2022, pages 3433 - 3441 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| FR3142558A1 (en) | 2024-05-31 |
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