WO2024085105A1 - 抗炎症剤、TNF-α産生抑制剤、インターロイキン10産生亢進剤、皮膚外用組成物、飲食品組成物、炎症性疾患の予防、改善または治療方法、および抗炎症剤の製造のための植物由来ポリアミン含有抽出物の使用 - Google Patents
抗炎症剤、TNF-α産生抑制剤、インターロイキン10産生亢進剤、皮膚外用組成物、飲食品組成物、炎症性疾患の予防、改善または治療方法、および抗炎症剤の製造のための植物由来ポリアミン含有抽出物の使用 Download PDFInfo
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Classifications
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- A—HUMAN NECESSITIES
- A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
- A23L—FOODS, FOODSTUFFS, OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES, NOT COVERED BY SUBCLASSES A21D OR A23B-A23J; THEIR PREPARATION OR TREATMENT, e.g. COOKING, MODIFICATION OF NUTRITIVE QUALITIES, PHYSICAL TREATMENT; PRESERVATION OF FOODS OR FOODSTUFFS, IN GENERAL
- A23L2/00—Non-alcoholic beverages; Dry compositions or concentrates therefor; Their preparation
- A23L2/52—Adding ingredients
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-
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-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
Definitions
- the present invention relates to an anti-inflammatory agent, a TNF- ⁇ production inhibitor, an interleukin-10 production enhancer, a skin topical composition, and a food and beverage composition.
- the present invention also relates to a method for preventing, ameliorating, or treating an inflammatory disease.
- the present invention also relates to the use of a plant-derived polyamine-containing extract for producing an anti-inflammatory agent used for preventing, ameliorating, or treating an inflammatory disease.
- Skin problems such as dermatitis and rashes are caused by external stimuli from detergents and metals that affect the endocrine system, resulting in inflammation of the skin.
- TNF- ⁇ tumor necrosis factor- ⁇
- TNF- ⁇ tumor necrosis factor- ⁇
- Macrophages are a typical cell that produces TNF- ⁇ .
- TNF- ⁇ excessive production of TNF- ⁇ is thought to be involved in rheumatoid arthritis, osteoarthritis, psoriasis, pemphigus vulgaris, allergic contact dermatitis, and atopic dermatitis.
- TNF- ⁇ The production of TNF- ⁇ can be suppressed by steroids.
- people may hesitate to use steroids due to their side effects.
- people may hesitate to use steroids on areas of sensitive skin or on the soft skin of infants.
- a polyamine-containing extract extracted from soybean germ suppresses ultraviolet light-induced skin erythema (see Patent Document 1). It is also known that a polyamine-containing extract extracted from soybean germ suppresses the increased expression of interleukin-1 ⁇ gene, interleukin-8 gene, and CYP gene induced by PM2.5 in epidermal cells (see Patent Document 2).
- the present invention aims to provide an anti-inflammatory agent, a TNF- ⁇ production inhibitor, and an IL-10 production enhancer that contain plant-derived active ingredients.
- the present invention also aims to provide a skin topical composition and a food and beverage composition that contain plant-derived active ingredients and have anti-inflammatory effects.
- the present invention which has been completed based on these findings, is as follows.
- [1] Contains plant-derived polyamine-containing extracts, The plant-derived polyamine-containing extract comprises a fraction of less than 1 kDa; The fraction less than 1 kDa contains an active ingredient; Anti-inflammatory.
- [2] The anti-inflammatory agent according to [1], wherein the plant is at least one of soybean and wheat.
- [3] The anti-inflammatory agent according to [1] or [2], wherein the plant-derived polyamine-containing extract is extracted from at least one material selected from the group consisting of soybean seeds, soybean germs, soybean embryos, soybean sprouts, wheat seeds, wheat germs, wheat embryos, wheat sprouts, soy milk, and okara.
- a composition for external use on skin comprising the anti-inflammatory agent according to any one of [1] to [9].
- composition for external application to skin according to [11], wherein the inflammatory disease is arthritis or dermatitis.
- composition for external application to skin according to [11], wherein the inflammatory disease is rheumatoid arthritis, osteoarthritis, psoriasis, pemphigus vulgaris, allergic contact dermatitis, or atopic dermatitis.
- a food or drink composition comprising the anti-inflammatory agent according to any one of [1] to [9].
- the food and drink composition according to [14] which is used for the prevention or amelioration of inflammatory bowel disease.
- [16] Contains plant-derived polyamine-containing extracts, The plant-derived polyamine-containing extract comprises a fraction of less than 1 kDa; The fraction less than 1 kDa contains an active ingredient; TNF- ⁇ production inhibitor. [17] Contains plant-derived polyamine-containing extracts, The plant-derived polyamine-containing extract comprises a fraction of less than 1 kDa; The fraction less than 1 kDa contains an active ingredient; Interleukin 10 production enhancer. [18] The anti-inflammatory agent according to any one of the above, wherein the plant-derived polyamine-containing extract is a soybean-derived polyamine-containing extract.
- the anti-inflammatory agent according to any one of the above, wherein the plant-derived polyamine-containing extract is a wheat-derived polyamine-containing extract.
- the anti-inflammatory agent according to any one of the above, wherein the plant-derived polyamine-containing extract is obtained by a method comprising a step of extracting wheat germ with an aqueous solution having a pH of 6.0 or less.
- the anti-inflammatory agent according to any one of the above, wherein the aqueous solution has a pH of 5.0 or less.
- the anti-inflammatory agent according to any one of the above, wherein the aqueous solution has a pH of 4.0 or less.
- the anti-inflammatory agent according to any one of the above, wherein the aqueous solution has a pH of 3.0 or less.
- the plant-derived polyamine-containing extract contains putrescine, spermidine, and spermine.
- the anti-inflammatory agent according to any one of the above, wherein the inflammatory disease is inflammatory bowel disease.
- the anti-inflammatory agent according to any one of the above, wherein the inflammatory bowel disease is ulcerative colitis, Crohn's disease, or intestinal Behcet's disease.
- a method for preventing, ameliorating, or treating an inflammatory disease comprising administering any of the anti-inflammatory agents described above to a subject.
- the subject is preferably a mammal such as a human, monkey, mouse, rat, dog, cat, rabbit, pig, horse, cow, sheep, goat, or deer, and more preferably a human.
- a mammal such as a human, monkey, mouse, rat, dog, cat, rabbit, pig, horse, cow, sheep, goat, or deer, and more preferably a human.
- the inflammatory disease is rheumatoid arthritis, osteoarthritis, psoriasis, pemphigus vulgaris, allergic contact dermatitis, atopic dermatitis, or inflammatory bowel disease.
- a plant-derived polyamine-containing extract for producing an anti-inflammatory agent, comprising: The plant-derived polyamine-containing extract comprises a fraction of less than 1 kDa; The fraction less than 1 kDa contains an active ingredient; use.
- the anti-inflammatory agent is used for the prevention, amelioration, or treatment of an inflammatory disease,
- the inflammatory disease is rheumatoid arthritis, osteoarthritis, psoriasis, pemphigus vulgaris, allergic contact dermatitis, atopic dermatitis, or inflammatory bowel disease; The use according to [33].
- a method for preventing, ameliorating or treating an inflammatory disease comprising applying to the skin any of the above compositions for external use on the skin.
- examples of the method of "using the composition for external use on the skin” include applying the composition for external use on the skin, applying a nonwoven fabric containing the composition for external use on the skin to the skin, spraying the composition for external use on the skin, etc.
- the composition for external use on the skin may be impregnated into a nonwoven fabric.
- the present invention can provide an anti-inflammatory agent, a TNF- ⁇ production inhibitor, and an IL-10 production enhancer that contain plant-derived active ingredients.
- the present invention can also provide a skin topical composition and a food and beverage composition that contain plant-derived active ingredients and have an anti-inflammatory effect.
- FIG. 1 is a graph showing the TNF- ⁇ production inhibitory effect of soybean germ extract in Example 1.
- FIG. 11 is a graph showing the TNF- ⁇ production inhibitory effect of an ultrafiltration fraction of a soybean germ extract in Example 3.
- FIG. 11 is a graph showing the TNF- ⁇ production inhibitory effect of an ultrafiltration fraction of wheat germ extract in Example 4.
- FIG. 13 is a graph showing the TNF- ⁇ production inhibitory effect of an ultrafiltrated fraction of soybean germ extract (particularly the fraction less than 1 kDa) and an ultrafiltrated fraction of wheat germ extract (particularly the fraction less than 1 kDa) for Example 5.
- FIG. 13 is a graph showing the TNF- ⁇ production inhibitory effect of an autoclaved soybean germ extract in Example 6.
- FIG. 13 is a graph showing the TNF- ⁇ production inhibitory effect of an ethanol extract fraction of a soybean germ extract in Example 7. 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, and 100% are the ethanol concentrations of the aqueous ethanol solutions used for extraction.
- FIG. 13 is a graph showing the TNF- ⁇ production inhibitory effect of an ethanol extract fraction of a soybean germ extract in Example 8. 50%, 80%, 90%, 92%, 94%, 96%, 98%, and 100% are the ethanol concentrations of the aqueous ethanol solutions used for extraction.
- FIG. 13 is a graph showing the inhibitory effect of soybean germ extract on TNF- ⁇ gene expression in Example 9. FIG.
- FIG. 13 is a graph showing the inhibitory effect of soybean germ extract on the production of TNF- ⁇ and the inhibitory effect of dexamethasone on the production of TNF- ⁇ in Example 10.
- FIG. 11 shows the IL-10 production enhancing effect of soybean germ extract and wheat germ extract in Example 11.
- the anti-inflammatory agent, TNF- ⁇ production inhibitors, IL-10 production enhancers, skin external composition, and food and beverage compositions contain a plant-derived polyamine-containing extract.
- skin topical composition refers to a composition that is used on the skin.
- Plant-derived polyamine-containing extract is a plant extract containing polyamines.
- the plant-derived polyamine-containing extract can be extracted from plants and/or processed plant products.
- plants include dicotyledonous plants, monocotyledonous plants, herbaceous plants, woody plants, cucurbitaceae plants, solanaceae plants, grasses, cruciferous plants, legumes, mallows, Asteraceae plants, Chenopodiaceae plants, and legumes. Among these, grasses and legumes are preferred.
- grasses examples include wheat, barley, rice, corn, sorghum, sugarcane, turfgrass, oats, rye, and foxtail millet.
- wheat is preferred because it provides a large amount of net food supply per person per year, meaning that the annual per capita consumption is high, and it is also inexpensive to obtain.
- Leguminous plants include, for example, soybeans, alfalfa, adzuki beans, kidney beans, and cowpeas. Among them, soybeans are preferred because they have a large net food supply per person per year, meaning that the annual per capita consumption is high, and they are also inexpensively available.
- plants other than grasses and legumes include sweet potato, tomato, cucumber, pumpkin, melon, watermelon, tobacco, Arabidopsis, bell pepper, eggplant, taro, spinach, carrot, strawberry, potato, rapeseed, eucalyptus, poplar, kenaf, eucommia, sugar beet, cassava, sago palm, chenopodium, lily, orchid, carnation, rose, chrysanthemum, petunia, torenia, snapdragon, cyclamen, baby's breath, geranium, sunflower, cotton, enoki mushroom, shimeji mushroom, matsutake mushroom, shiitake mushroom, mushrooms, ginseng, agaricus, turmeric, ginseng, citrus fruits, banana, and kiwi.
- Parts of a plant from which an extract i.e., a plant-derived polyamine-containing extract
- an extract i.e., a plant-derived polyamine-containing extract
- fruits, leaves, stems, buds, seeds, dried seeds, germs, and embryos are preferred, seeds, dried seeds, germs, and embryos are more preferred, and germs (e.g., soybean germ, wheat germ, rice germ, barley germ, corn germ, milo germ, and sunflower germ) are even more preferred. It is of course possible to obtain an extract from the entire body of a plant.
- the plant is preferably soybean.
- the plant-derived polyamine-containing extract is preferably a soybean-derived polyamine-containing extract.
- the soybean-derived polyamine-containing extract may be obtained from unprocessed soybeans (e.g. soybean germ) or from a product obtained by adding some processing to soybeans, i.e., a processed product. Examples of processed products include soybean extracts fermented as necessary (e.g. soybean germ extract, soybean embryo extract), natto, soy milk, and okara.
- the plant-derived polyamine-containing extract is preferably a wheat-derived polyamine-containing extract.
- the wheat-derived polyamine-containing extract may be obtained from unprocessed wheat (e.g., wheat germ) or from a product in which wheat has been processed in some way, i.e., a processed product.
- processed products include wheat extract (e.g., wheat germ extract, wheat germ extract) and wheat flour, which have been fermented as necessary.
- the plant-derived polyamine-containing extract may be obtained from a processed product.
- processed products include green tea, black tea, oolong tea, and fruit juice.
- the plant-derived polyamine-containing extract is preferably one extracted from at least one material selected from the group consisting of soybean seeds, soybean germs, soybean embryos, soybean sprouts, wheat seeds, wheat germs, wheat germs, wheat sprouts, soy milk, and okara, because the raw materials are inexpensive, available in large quantities, and rich in polyamines.
- the plant-derived polyamine-containing extract be one extracted from at least one of soybean germs and wheat germs, and even more preferable that it be one extracted from soybean germs.
- Plant-derived polyamine-containing extracts can be extracted with an aqueous solution having a pH of 6.0 or less (hereinafter sometimes referred to as "acidic aqueous solution").
- an acidic aqueous solution By extracting with an acidic aqueous solution, the recovery rate of polyamines can be increased compared to extraction with organic solvents such as ethanol or methanol.
- organic solvents such as ethanol or methanol.
- the residual organic solvent used for extraction can be avoided compared to extraction with an organic solvent. Therefore, the safety of plant-derived polyamine-containing extracts can be increased.
- the recovery rate of polyamines can be further increased and the stability of polyamines in acidic aqueous solution can be improved.
- the extraction procedure can be, for example, a procedure in which the plant and/or processed plant product is crushed as necessary, and then an extract containing plant-derived polyamines is extracted with an acidic aqueous solution.
- a more specific procedure can be, for example, a procedure in which an acidic aqueous solution is added to the plant and/or processed plant product, a polyphenol adsorbent is further added as necessary, the plant and/or processed plant product is crushed as necessary, and then an extract containing plant-derived polyamines is extracted in the acidic aqueous solution.
- the pH of the acidic aqueous solution is preferably 5.0 or less, more preferably 4.0 or less, more preferably 3.0 or less, and even more preferably 2.0 or less.
- the pH of the acidic aqueous solution can be, for example, 1.0 or more.
- acidic aqueous solutions include aqueous solutions of mineral acids in water, aqueous solutions of organic acids in water, aqueous solutions of both mineral and organic acids in water, and acidic water.
- examples include aqueous solutions of mineral acids such as hydrochloric acid, sulfuric acid, phosphoric acid, nitric acid, and perchloric acid in water, and aqueous solutions of organic acids such as formic acid, acetic acid, propionic acid, butyric acid, oxalic acid, malonic acid, succinic acid, fumaric acid, maleic acid, malic acid, lactic acid, tartaric acid, citric acid, benzoic acid, trichloroacetic acid, and sulfosalicylic acid in water.
- mineral acids such as hydrochloric acid, sulfuric acid, phosphoric acid, nitric acid, and perchloric acid in water
- organic acids such as formic acid, acetic acid, propionic acid, butyric acid,
- 0.01N to 6N hydrochloric acid, sulfuric acid, nitric acid, acetic acid, phosphoric acid, trichloroacetic acid, sulfosalicylic acid, citric acid, and lactic acid, and 0.1% to 10% perchloric acid are preferred, and 0.0625N to 1N hydrochloric acid and 0.25% to 5% perchloric acid are more preferred.
- a mixer, blender, homogenizer, mortar, ultrasonic crusher, etc. can be used to crush the plant and/or processed plant product.
- the plant and/or processed plant product can be made into, for example, a slurry, fine particles, granules, or powder form, and then extraction can be performed.
- the operation of crushing the plant and/or processed plant product may be performed in an acidic aqueous solution. In other words, the plant and/or processed plant product may be crushed after being immersed in an acidic aqueous solution.
- the extraction time is preferably 10 minutes or more, more preferably 20 minutes or more, and even more preferably 30 minutes or more. On the other hand, the extraction time may be 48 hours or less, 24 hours or less, 12 hours or less, 6 hours or less, or 3 hours or less.
- the extraction temperature i.e., the temperature of the acidic aqueous solution during extraction, may be, for example, 10°C or more, 15°C or more, or 20°C or more. On the other hand, the extraction temperature may be 40°C or less, 35°C or less, or 30°C or less. Stirring may be performed during extraction.
- the extraction may be carried out in the presence of a polyphenol adsorbent.
- polyphenols By carrying out the extraction in the presence of a polyphenol adsorbent, polyphenols can be removed.
- polyphenol adsorbents include PVPP (polyvinyl polypyrrolidone), PVP (polyvinyl pyrrolidone), and PEG (polyethylene glycol). Of these, PVPP is preferred.
- An example of a commercially available polyphenol adsorbent is Polyclar (registered trademark) from ISP.
- the polyphenol adsorbent can be added to the acidic aqueous solution to a concentration of, for example, 0.1% (w/v) to 30% (w/v), preferably 0.5% (w/v) to 20% (w/v), and more preferably 1% (w/v) to 10% (w/v).
- % (w/v) may be referred to as "w/v%”.
- centrifugation and/or filtration may be performed as necessary to recover the extract.
- the pH of the extract is adjusted as necessary.
- a basic aqueous solution such as an aqueous sodium hydroxide solution or an aqueous sodium carbonate solution can be added.
- the pH of the extract after the pH adjustment is preferably neutral or close to neutral, and may be, for example, 6.0 or more, 6.2 or more, 6.5 or more, or 6.7 or more.
- the pH of the extract after the pH adjustment may be, for example, 8.0 or less, 7.8 or less, 7.5 or less, or 7.3 or less.
- the extract may be used as it is as a plant-derived polyamine-containing extract, or may be used after adjusting the concentration, or may be used after drying, or may be used after purification. For example, ultrafiltration may be used as a purification method.
- the polyamine concentration of the extract may be adjusted to, for example, 0.00001 mM to 100 mM.
- the polyamine concentration after adjustment may be 0.00005 mM to 75 mM, or 0.0001 mM to 50 mM.
- M represents moles/liter.
- the polyamine concentration after adjustment may be 0.0001% by weight to 100% by weight, 0.001% by weight to 75% by weight, or 0.01% by weight to 50% by weight.
- plant-derived polyamine-containing extract contained in the anti-inflammatory agent, TNF- ⁇ production inhibitor, IL-10 production enhancer, skin topical composition, and food and beverage composition of this embodiment may or may not be purified (e.g., ultrafiltration).
- the plant-derived polyamine-containing extract contains polyamines. Examples of polyamines include putrescine, spermidine, and spermine.
- the plant-derived polyamine-containing extract can contain one or more polyamines.
- the plant-derived polyamine-containing extract preferably contains putrescine, spermidine, and spermine. Of course, the plant-derived polyamine-containing extract may contain polyamines other than these.
- the plant-derived polyamine-containing extract is a soybean germ extract, it is known to contain putrescine, spermidine, and spermine (see Patent No. 5018171).
- the plant-derived polyamine-containing extract is a wheat germ extract, it is known to contain putrescine, spermidine, and spermine (see Patent No. 5018171).
- Plant-derived polyamine-containing extracts can exhibit an inhibitory effect on TNF- ⁇ production. Plant-derived polyamine-containing extracts can also exhibit an inhibitory effect on IL-10 production.
- the plant-derived polyamine-containing extract contains a fraction of less than 1 kDa.
- Fraction of less than 1 kDa refers to components that pass through an ultrafiltration membrane with a 1 kDa cut-off, i.e., an ultrafiltration membrane with a nominal molecular weight limit (NMWL) of 1 kDa.
- An example of a product having an ultrafiltration membrane with a 1 kDa cut-off is an ultrafiltration tube with a 1 kDa cut-off (Microsep Advance with 1K Omega, MCP001C41, Pall).
- Substances that may be contained in fractions less than 1 kDa include polyamines (e.g., putrescine, spermidine, spermine) and water-soluble substances other than polyamines.
- polyamines e.g., putrescine, spermidine, spermine
- water-soluble substances other than polyamines include water-soluble substances other than polyamines.
- active ingredients those that exert an effect of suppressing TNF- ⁇ production or enhancing IL-10 production are sometimes called "active ingredients.”
- active ingredient may be composed of some of the components contained in the fraction less than 1 kDa.
- the active ingredients are derived from plants, the anti-inflammatory agent, TNF- ⁇ production inhibitor, IL-10 production enhancer, topical skin composition, and food and beverage composition of this embodiment are highly safe.
- the active ingredient is capable of not losing its TNF- ⁇ production inhibitory effect even after heat treatment at 121°C for 15 minutes. In other words, the active ingredient is capable of not being inactivated even after heat treatment at 121°C for 15 minutes.
- the active ingredient may be insoluble in ethanol.
- the plant-derived polyamine-containing extract can be suitably used as an anti-inflammatory agent, a TNF- ⁇ production inhibitor, an IL-10 production enhancer, a skin topical composition, or a food and beverage composition. That is, the plant-derived polyamine-containing extract can be suitably used as it is, i.e., without adding additives, as an anti-inflammatory agent, a TNF- ⁇ production inhibitor, an IL-10 production enhancer, a skin topical composition, or a food and beverage composition. Of course, it is also preferable to add additives and then use it as an anti-inflammatory agent, a TNF- ⁇ production inhibitor, an IL-10 production enhancer, or a food and beverage composition.
- the content of the plant-derived polyamine-containing extract in the anti-inflammatory agent, TNF- ⁇ production inhibitor, IL-10 production enhancer, skin topical composition, and food and beverage composition of this embodiment can be set appropriately depending on the application, formulation, etc.
- the anti-inflammatory agent, TNF- ⁇ production inhibitor, IL-10 production enhancer, skin topical composition, and food and beverage composition of this embodiment may contain the plant-derived polyamine-containing extract so that the polyamine concentration is, for example, 0.00001 mM to 100 mM, 0.00005 mM to 75 mM, or 0.0001 mM to 50 mM.
- the anti-inflammatory agent, TNF- ⁇ production inhibitor, IL-10 production enhancer, skin topical composition, and food and beverage composition of the present embodiment may further contain one or more other ingredients in addition to the plant-derived polyamine-containing extract.
- examples of such ingredients include oils and fats, waxes, mineral oils, fatty acids, alcohols, esters, metal soaps, gums, water-soluble polymeric compounds, surfactants, vitamins, amino acids, skin whitening agents, moisturizing agents, hair growth agents, extracts, microbial culture metabolites, ⁇ -hydroxy acids, inorganic pigments, ultraviolet absorbers, astringents, antioxidants, anti-inflammatory agents, germicides and disinfectants, hair care agents, fragrances, pigments and colorants, sweeteners, and nutritional supplements.
- Fats and oils include avocado oil, almond oil, fennel oil, perilla oil, olive oil, orange oil, orange raffaella oil, sesame oil, cocoa butter, chamomile oil, carrot oil, cucumber oil, beef tallow, beef tallow fatty acids, kukui nut oil, safflower oil, soybean oil, camellia oil, corn oil, rapeseed oil, persic oil, castor oil, cottonseed oil, peanut oil, turtle oil, mink oil, egg yolk oil, palm oil, palm kernel oil, Japan wax, coconut oil, lard, hardened oil, and hardened castor oil.
- Waxes include beeswax, carnauba wax, whale wax, lanolin, liquid lanolin, reduced lanolin, hard lanolin, candelilla wax, montan wax, and shellac wax.
- Mineral oils include liquid paraffin, petrolatum, paraffin, ozokeride, ceresin, microcrystalline wax, polyethylene powder, squalene, squalane, and pristane.
- Fatty acids include natural fatty acids such as lauric acid, myristic acid, palmitic acid, stearic acid, behenic acid, oleic acid, 12-hydroxystearic acid, undecylenic acid, tall oil, and lanolin fatty acids, and synthetic fatty acids such as isononanoic acid, caproic acid, 2-ethylbutanoic acid, isopentanoic acid, 2-methylpentanoic acid, 2-ethylhexanoic acid, and isopentanoic acid.
- natural fatty acids such as lauric acid, myristic acid, palmitic acid, stearic acid, behenic acid, oleic acid, 12-hydroxystearic acid, undecylenic acid, tall oil, and lanolin fatty acids
- synthetic fatty acids such as isononanoic acid, caproic acid, 2-ethylbutanoic acid, isopentanoic acid, 2-methylpentanoic acid, 2-ethyl
- alcohols examples include natural alcohols such as ethanol, isopropanol, lauryl alcohol, cetanol, stearyl alcohol, oleyl alcohol, lanolin alcohol, cholesterol, and phytosterol; synthetic alcohols such as 2-hexyldecanol, isostearyl alcohol, and 2-octyldodecanol; and polyhydric alcohols such as ethylene oxide, ethylene glycol, diethylene glycol, triethylene glycol, ethylene glycol monoethyl ether, ethylene glycol monobutyl ether, diethylene glycol monomethyl ether, diethylene glycol monoethyl ether, polyethylene glycol, propylene oxide, propylene glycol, polypropylene glycol, 1,3-butylene glycol, glycerin, batyl alcohol, pentaerythritol, sorbitol, mannitol, glucose, and sucrose.
- natural alcohols such as ethanol, isopropanol, lauryl alcohol, cet
- Esters include isopropyl myristate, isopropyl palmitate, butyl stearate, hexyl laurate, myristyl myristate, oleyl oleate, decyl oleate, octyldodecyl myristate, hexyldecyl dimethyloctanoate, cetyl lactate, myristyl lactate, diethyl phthalate, dibutyl phthalate, lanolin acetate, ethylene glycol monostearate, propylene glycol monostearate, and propylene glycol dioleate.
- Metal soaps include aluminum stearate, magnesium stearate, zinc stearate, calcium stearate, zinc palmitate, magnesium myristate, zinc laurate, zinc undecylenate, etc.
- Gum and water-soluble polymeric compounds include gum arabic, gum benzoin, gum dammar, guaiac butter, Irish moss, gum karaya, gum tragacanth, carob gum, quince seed, agar, casein, dextrin, gelatin, pectin, starch, carrageenan, carboxyalkyl chitin, chitosan, hydroxyalkyl chitin, low molecular weight chitosan, chitosan salts, sulfated chitin, phosphorylated chitin, alginic acid and its salts, hyaluronic acid and its salts, chondroitin sulfate, heparin, ethyl cellulose, methyl cellulose, carboxymethyl cellulose, carboxyethyl cellulose, sodium carboxyethyl cellulose, hydroxyethyl cellulose, hydroxypropyl cellulose, nitrocellulose, crystalline cellulose, polyvinyl
- Surfactants include anionic surfactants (carboxylates, sulfonates, sulfate ester salts, phosphate ester salts), cationic surfactants (amine salts, quaternary ammonium salts), amphoteric surfactants (carboxylate amphoteric surfactants, sulfate ester amphoteric surfactants, sulfonate amphoteric surfactants, phosphate ester amphoteric surfactants), nonionic surfactants (ether type nonionic surfactants, ether ester type nonionic surfactants, ester type nonionic surfactants, block polymer type nonionic surfactants, nitrogen-containing type nonionic surfactants), other surfactants (natural surfactants, derivatives of protein hydrolysates, polymeric surfactants, surfactants containing titanium/silicon, fluorocarbon surfactants), etc.
- anionic surfactants carboxylates, sulfonates, sulfate este
- Vitamins include the vitamin A group, retinol, retinal (vitamin A1), dehydroretinal (vitamin A2), carotene, and lycopene (provitamin A); the vitamin B group, thiamine hydrochloride, thiamine sulfate (vitamin B1), riboflavin (vitamin B2), pyridoxine (vitamin B6), cyanocobalamin (vitamin B12), folic acid, nicotinic acid, pantothenic acid, biotin, choline, and inositol; the vitamin C group, ascorbic acid and its derivatives; the vitamin D group, ergocalciferol (vitamin D2), cholecalciferol (vitamin D3), and dihydrotachysterol; the vitamin E group, tocopherol and its derivatives, and ubiquinones; and the vitamin K group, phytonadione (vitamin K1), menaquinone (vitamin K2), menad
- Amino acids include valine, leucine, isoleucine, threonine, methionine, phenylalanine, tryptophan, lysine, glycine, alanine, asparagine, glutamine, serine, cysteine, cystine, tyrosine, proline, hydroxyproline, aspartic acid, glutamic acid, hydroxylysine, arginine, ornithine, histidine, and the like, as well as their sulfates, phosphates, nitrates, citrates, and amino acid derivatives such as pyrrolidone carboxylic acid.
- Skin whitening agents include ascorbic acid or derivatives thereof, sulfur, placental hydrolysate, ellagic acid or derivatives thereof, kojic acid or derivatives thereof, glucosamine or derivatives thereof, arbutin or derivatives thereof, hydroxycinnamic acid or derivatives thereof, glutathione, arnica extract, Scutellaria root extract, Sophora japonica extract, Bupleurum extract, Ganoderma lucidum mycelium culture or extract, Tilia extract, peach leaf extract, Angelica acutiloba extract, Sophora root extract, Jew's wort extract, persimmon leaf extract, Rhubarb extract, Peony extract, Hamamelis extract, Horse chestnut extract, Hypericum perforatum extract, oil-soluble licorice extract, etc.
- Hydrating agents include hyaluronic acid, polyglutamic acid, serine, glycine, threonine, alanine, collagen, hydrolyzed collagen, hydronectin, fibronectin, keratin, elastin, royal jelly, chondroitin sulfate heparin, glycerophospholipid, glyceroglycolipid, sphingophospholipid, sphingoglycolipid, linoleic acid or its esters, eicosapentaenoic acid or its esters, pectin, bifidobacterium fermentation product, lactic acid fermentation product, yeast extract, ganoderma lucidum mycelium culture or its extract, wheat germ oil, avocado oil, rice germ oil, jojoba oil, soybean phospholipid, ⁇ -oryzanol, bilberry extract, coix seed extract, rehmannia root extract, taiso extract, kaiso extract, aloe arborescens
- Hair growth agents include glyceride pentadecanoate, coleus extract, gentiana extract, matsukasa extract, royal jelly extract, kumazasa extract, t-flavanone, 6-benzylaminopurine, Swertia japonica extract, carpronium chloride, minoxidil, finasteride, adenosine, nicotinamide, mulberry root extract, rehmannia extract, and 5-aminolevulinic acid.
- Extracts and essences of animals, plants, or herbal medicines include asenyaku (asenyaku), angelica tree, acerola, althea, arnica, avocado, amacha (sweet tea), aloe, aloe vera, nettle, ginkgo (ginkgo leaf, ginkgo), fennel, turmeric, uzubasaishin (spinning spices), plum (Japanese plum), salicylic acid oak, uva-ursi, multiflora rose, Japanese knotweed (Japanese laurel), astragalus root, scutellaria, wild cherry (cherry bark), amplexicaule (yellow oak), and scutellaria.
- Microbial culture metabolites include yeast extract, zinc-containing yeast extract, germanium-containing yeast extract, selenium-containing yeast extract, magnesium-containing yeast extract, rice fermentation extract, Euglena extract, and lactic acid fermentation products of skim milk powder.
- ⁇ -Hydroxy acids include glycolic acid, citric acid, malic acid, tartaric acid, and lactic acid.
- Inorganic pigments include silicic anhydride, magnesium silicate, talc, kaolin, bentonite, mica, titanium mica, bismuth oxychloride, zirconium oxide, magnesium oxide, zinc oxide, titanium oxide, calcium carbonate, magnesium carbonate, yellow iron oxide, red iron oxide, black iron oxide, gunjo, chromium oxide, chromium hydroxide, carbon black, and calamine.
- ultraviolet absorbers examples include p-aminobenzoic acid derivatives, salicylic acid derivatives, anthranilic acid derivatives, coumarin derivatives, amino acid compounds, benzotriazole derivatives, tetrazole derivatives, imidazoline derivatives, pyrimidine derivatives, dioxane derivatives, camphor derivatives, furan derivatives, pyrone derivatives, nucleic acid derivatives, allantoin derivatives, nicotinic acid derivatives, vitamin B6 derivatives, oxybenzone, benzophenone, guaiazulene, shikonin, baicalin, baicalein, and berberine.
- Astringents include lactic acid, tartaric acid, succinic acid, citric acid, allantoin, zinc chloride, zinc sulfate, zinc oxide, calamine, zinc p-phenolsulfonate, potassium aluminum sulfate, resorcinol, ferric chloride, and tannic acid.
- Antioxidants include ascorbic acid and its salts, stearic acid esters, tocopherol and its ester derivatives, nordihydroguaiaretic acid, butylhydroxytoluene (BHT), butylhydroxyanisole (BHA), parahydroxyanisole, propyl gallate, sesamol, sesamolin, gossypol, etc.
- Anti-inflammatory agents include ichthammol, indomethacin, kaolin, salicylic acid, sodium salicylate, methyl salicylate, acetylsalicylic acid, diphenhydramine hydrochloride, d- or dl-camphor, hydrocortisone, guaiazulene, chamazulene, chlorpheniramine maleate, glycyrrhizic acid and its salts, glycyrrhetinic acid and its salts, etc.
- Bactericides and disinfectants include acrinol, sulfur, benzalkonium chloride, benzethonium chloride, methylrosaniline chloride, cresol, calcium gluconate, chlorhexidine gluconate, sulfamine, mercurochrome, lactoferrin or its hydrolysates, etc.
- Hair products include selenium disulfide, alkylisoquinolinium bromide solution, zinc pyrithione, biphenamine, thianthol, castor tincture, ginger tincture, capsicum tincture, quinine hydrochloride, strong ammonia water, potassium bromate, sodium bromate, and thioglycolic acid.
- Fragrances include natural animal fragrances such as musk, civet, castoreum, and ambergris, anise essential oil, angelica essential oil, ylang ylang essential oil, iris essential oil, fennel essential oil, orange essential oil, cananga essential oil, caraway essential oil, cardamom essential oil, guaiac wood essential oil, cumin essential oil, black letter essential oil, cassia bark essential oil, cinnamon essential oil, geranium essential oil, copaiba balsam essential oil, coriander essential oil, shiso essential oil, cedarwood essential oil, citronella essential oil, jasmine essential oil, ginger grass essential oil, cedar essential oil, spearmint essential oil, and western hawthorn essential oil.
- natural animal fragrances such as musk, civet, castoreum, and ambergris
- anise essential oil angelica essential oil
- ylang ylang essential oil iris essential oil
- fennel essential oil orange essential oil
- Examples of plant-based fragrances include essential oils of kaolin, anise, tuberose, clove, orange blossom, wintergreen, tolu balsam, butterbur, rose, palmarosa, cypress, Japanese cypress, sandalwood, petitgrain, bay, vetiver, bergamot, balsam of Peru, bois de rose, camphor, mandarin, eucalyptus, lime, lavender, linaloe, lemongrass, lemon, rosemary, and Japanese peppermint, as well as other synthetic fragrances.
- Dyes and coloring agents include red cabbage dye, red rice dye, madder dye, annatto dye, squid ink dye, turmeric dye, sophora japonica dye, krill dye, persimmon dye, caramel, gold, silver, gardenia dye, corn dye, onion dye, tamarind dye, spirulina dye, whole buckwheat dye, cherry dye, seaweed dye, hibiscus dye, grape juice dye, marigold dye, purple sweet potato dye, purple yam dye, lac dye, and rutin.
- Sweeteners include sugar, sweet tea, fructose, arabinose, galactose, xylose, mannose, maltose, honey, glucose, miraculin, monellin, etc.
- Nutritional supplements include calcined shell calcium, cyanocobalamin, yeast, wheat germ, soybean germ, egg yolk powder, hemicellulose, and heme iron.
- hormones include hormones, sequestering agents, pH adjusters, chelating agents, preservatives and antifungals, cooling agents, stabilizers, emulsifiers, animal and vegetable proteins and their decomposition products, animal and vegetable polysaccharides and their decomposition products, animal and vegetable glycoproteins and their decomposition products, blood flow promoters, anti-inflammatory and anti-allergic agents, cell activators, keratolytic agents, wound healing agents, foaming agents, thickening agents, oral agents, deodorizing agents, bittering agents, seasonings, and enzymes.
- the anti-inflammatory agent of the present embodiment can be suitably used for the prevention, improvement or treatment of inflammatory diseases.
- inflammatory diseases include arthritis, dermatitis and inflammatory bowel disease.
- arthritis and dermatitis include rheumatoid arthritis, osteoarthritis, psoriasis, pemphigus vulgaris, allergic contact dermatitis, atopic dermatitis and inflammatory bowel disease.
- inflammatory bowel diseases include ulcerative colitis, Crohn's disease and intestinal Behcet's disease.
- compositions for external use on skin can be suitably used as, for example, medicines, quasi-drugs, and cosmetics.
- these include basic cosmetics such as lotion, milky lotion, cream, ointment, lotion, oil, and pack; hair cosmetics such as face wash, skin cleanser, shampoo, rinse, hair treatment, hair cream, pomade, hair spray, hair styling agent, perm agent, hair tonic, hair dye, and hair growth and hair care agent; makeup cosmetics such as foundation, face powder, face powder, lipstick, blusher, eye shadow, eyeliner, mascara, eyebrow ink, and eyelashes; finishing cosmetics such as nail beautifier.
- perfumes, bath agents, toothpastes, mouth fresheners and mouthwashes, liquid odor and deodorizing agents, sanitary goods, sanitary cotton, wet tissues, and skin external agents can also be mentioned.
- formulation form of the topical skin composition of this embodiment can of course be set as appropriate.
- formulation forms include powder, granules, solid, liquid, gel, foam, emulsion, cream, ointment, sheet, and mousse.
- the topical skin composition of this embodiment can be suitably used for the prevention, improvement, or treatment of inflammatory diseases.
- inflammatory diseases include arthritis and dermatitis.
- the composition can be suitably used for the prevention, improvement, or treatment of inflammatory diseases caused by the overproduction of TNF- ⁇ , such as rheumatoid arthritis, osteoarthritis, psoriasis, pemphigus vulgaris, allergic contact dermatitis, and atopic dermatitis.
- the food and drink composition of the present embodiment may be, for example, a general food, or a food with health claims (for example, a food for specified health uses, a food with functional claims, or a food with nutrient functions). Among these, a food with health claims is preferable.
- the food and beverage composition of this embodiment can be suitably used for the prevention, amelioration, or treatment of inflammatory bowel disease.
- inflammatory bowel disease examples include ulcerative colitis, Crohn's disease, and intestinal Behcet's disease.
- soybean germ extract was obtained by the method of Example 3 described in the Detailed Description of the Invention section of Japanese Patent No. 5018171. Specifically, 500 mL of 5% aqueous perchloric acid solution was added to 100 g of soybean germ (manufactured by For You Co., Ltd.) and left at room temperature for 1 hour. Then, 16 g of polychlor VT (manufactured by ISP Co., Ltd.), a polyphenol adsorbent, was added, and the soybean germ was thoroughly crushed with a blender mixer, and then left at room temperature for 30 minutes to be extracted under acidic conditions.
- polychlor VT manufactured by ISP Co., Ltd.
- the crushed material was centrifuged at 2°C and 22,000 x g for 20 minutes to collect a liquid fraction, which was neutralized with a 30% sodium hydroxide solution to make it neutral.
- the neutralized liquid fraction was desalted using an electrodialysis device (Acilyzer, manufactured by Astom Co., Ltd.) and then freeze-dried.
- the powder thus obtained i.e., the powder of soybean germ extract, was used for various evaluations.
- the amounts of putrescine, spermidine, and spermine in the soybean germ extract were also determined.
- polychlor VT manufactured by ISP Co., Ltd.
- the crushed material was centrifuged at 2°C and 22,000 x g for 20 minutes to collect a liquid fraction, which was neutralized with a 30% sodium hydroxide solution to make it neutral.
- the amounts of putrescine, spermidine, and spermine were determined using the neutralized liquid fraction by the method described in the Detailed Description of the Invention column of Japanese Patent No. 5018171.
- the soybean germ extract contained 23.5 mg of putrescine, 24.0 mg of spermidine, and 9.6 mg of spermine, totaling 57.1 mg.
- the wheat germ extract was obtained by the method of Example 4 described in the detailed description of the invention of Japanese Patent No. 5018171. Specifically, 500 mL of 5% aqueous perchloric acid solution was added to 100 g of wheat germ (roasted type, manufactured by Nisshin Pharma Co., Ltd.) and left at room temperature for 1 hour. Then, 16 g of polychlor VT (manufactured by ISP Co., Ltd.), which is a polyphenol adsorbent, was added, and the wheat germ was sufficiently crushed with a blender mixer, and then left at room temperature for 30 minutes to be extracted under acidic conditions.
- polychlor VT manufactured by ISP Co., Ltd.
- the crushed material was centrifuged at 2°C and 22,000 x g for 20 minutes to collect a liquid fraction, which was neutralized with a 30% sodium hydroxide solution to make it neutral.
- the neutralized liquid fraction was desalted using an electrodialysis device (Acilyzer, manufactured by Astom Co., Ltd.).
- the desalted wheat germ extract liquid (hereinafter sometimes referred to as "liquid product") was used for various evaluations.
- the amounts of putrescine, spermidine, and spermine in the wheat germ extract were also determined.
- a polyphenol adsorbent Polyclar VT (manufactured by ISP Co., Ltd.)
- the crushed material was centrifuged at 2°C and 22,000 x g for 20 minutes to collect a liquid fraction, which was neutralized with a 30% sodium hydroxide solution to make it neutral.
- the amounts of putrescine, spermidine, and spermine were determined using the neutralized liquid fraction according to the method described in the Detailed Description of the Invention section of Japanese Patent No. 5018171.
- the wheat germ extract contained 6.4 mg of putrescine, 23.9 mg of spermidine, and 14.3 mg of spermine, totaling 44.6 mg.
- Macrophages play an important role as the command center of the immune system in the body, and are polarized into attack mode (M1) or repair mode (M2) depending on the situation.
- a sample e.g., soybean germ extract, wheat germ extract
- inflammatory cytokines e.g., TNF- ⁇
- the sample can be evaluated as having anti-inflammatory effects.
- anti-inflammatory cytokines e.g., IL-10
- M1 macrophages may be referred to as "macrophages (M1)”.
- M2 macrophages may be referred to as “macrophages (M2)”.
- Cells and reagents used Cells Human acute monocytic leukemia-derived cell line (THP-1) Passage number: P10 or less Seeding density and number of days cultured at the time of passage: 0.5 x 10 6 cells/dish to 2.0 x 10 6 cells/dish, cultured for 2 to 4 days Cell confluence just before passage: 60% to 80% Culture medium: RPMI1640 (+L-Glutamine) (11875-119, Gibco) (unless otherwise specified, containing 10% FBS and 1% Penicillin-Streptmycin) PMA: phorbol 12-myristate 13-acetate (P8139-1MG, SIGMA) LPS: LPS (L6529-1MG, SIGMA) TNF- ⁇ : The following kit was used for measuring TNF- ⁇ . DuoSet ELISA development system Human TNF- ⁇ (DY210-05, R&D systems) DuoSet Ancillary Reagent Kit2 (DY008, R&D systems)
- sample-containing M1 induction medium This resulted in obtaining a sample-containing M1 induction medium.
- the medium was replaced with sample-containing M1 induction medium at 400 ⁇ L/well, and incubation was started in a CO2 incubator (37°C, 5.0%).
- (4) Collection of culture supernatant and measurement of humoral factors After the start of the culture in (3), the culture supernatant was collected 6 hours later and stored in a freezer at ⁇ 80° C. It was thawed later, and the TNF- ⁇ concentration in the culture supernatant was measured according to the kit protocol.
- Example 1 Anti-inflammatory effect of soybean germ extract In order to examine whether soybean germ extract has an anti-inflammatory effect, it was examined whether soybean germ extract has an effect of suppressing the production of TNF- ⁇ .
- soybean germ extract inhibited the production of TNF- ⁇ . Specifically, the production of TNF- ⁇ was inhibited at a low concentration of 0.001 w/v%. The higher the concentration of soybean germ extract, the lower the amount of TNF- ⁇ produced.
- Example 2 Ultrafiltration fractionation of soybean germ extract Ultrafiltration was performed to simply fractionate the soybean germ extract according to the difference in molecular weight. Specifically, 3 mL of 2 w/v% soybean germ extract solution was concentrated in the order of increasing pore size of the ultrafiltration tube (100 kDa ⁇ 50 kDa ⁇ 30 kDa ⁇ 10 kDa ⁇ 3 kDa cut off) to fractionate according to the difference in molecular weight.
- the extract was fractionated into a fraction of less than 3 kDa, a fraction of 3 kDa to 10 kDa, a fraction of 10 kDa to 30 kDa, a fraction of 30 kDa to 50 kDa, a fraction of 50 kDa to 100 kDa, and a fraction of 100 kDa or more.
- Each fraction was washed three times with physiological saline, and finally returned to the original liquid volume (i.e., 3 mL) with physiological saline, so that the liquid volume used in the culture experiment was the same for each fraction.
- the ultrafiltration tubes, centrifuges, and centrifugation conditions used were as follows.
- Ultrafiltration tubing "Amicon Ultra” Centrifugal Filters Ultracel® 100K (UFC910024), 50K (UFC805096), 30K (UFC903008), 10K (UFC901024), and 3K (UFC800324) Centrifuge: CR21F (HITACHI) Centrifugation conditions: 6,000 rpm, 4° C.
- Example 3 Anti-inflammatory effect of ultrafiltration fraction of soybean germ extract An investigation was carried out to determine which fraction has the effect of suppressing the production of TNF- ⁇ . ⁇ 6.1. Cells and reagents used> As described in “3. Overview of the procedure for evaluating anti-inflammatory effects.”
- a condition was also set in which soybean germ extract was added to a final concentration of 0.1 w/v %.
- a condition in which no LPS was added after M0 polarization induction i.e. -LPS
- a condition in which Otsuka distilled water or PBS was used as a sample i.e. Control
- (4) Collection of culture supernatant and measurement of humoral factors After the start of the culture in (3), the culture supernatant was collected 6 hours later and stored in a freezer at ⁇ 80° C. It was thawed later, and the TNF- ⁇ concentration in the culture supernatant was measured according to the kit protocol.
- TNF- ⁇ production was clearly suppressed only in the fraction less than 3 kDa. Although TNF- ⁇ production was somewhat suppressed in other fractions, such as the 3 kDa to 10 kDa fraction, this is thought to be due to some components less than 3 kDa remaining in the 3 kDa to 10 kDa fraction. From these results, it is thought that the inhibitory effect on TNF- ⁇ production is exerted by components less than 3 kDa in the soybean germ extract.
- Example 4 Anti-inflammatory effect of ultrafiltration fraction of wheat germ extract
- wheat germ extract also has the effect of inhibiting the production of TNF- ⁇ , and if so, which fraction has this effect, and whether the effective fraction (i.e., the fraction having the effect of inhibiting the production of TNF- ⁇ ) differs between wheat germ extract and soybean germ extract.
- Cells and reagents used As described in “3. Overview of the procedure for evaluating anti-inflammatory effects.”
- wheat germ extract also inhibited the production of TNF- ⁇ . Furthermore, wheat germ extract also inhibited the production of TNF- ⁇ in the fraction less than 3 kDa. From these results, it is considered highly likely that the inhibitory effect on TNF- ⁇ production is exerted by a substance with a molecular weight of less than 3 kDa and common to soybean germ and wheat germ.
- Example 5 Anti-inflammatory effect of soybean germ extract and wheat germ extract fractions less than 1 kDa
- the less than 3 kDa fraction of soybean germ extract was divided into a less than 1 kDa fraction and a 1 kDa to 3 kDa fraction, and it was investigated which fraction had the effect of inhibiting TNF- ⁇ production. It was also investigated which fraction of wheat germ extract had the effect of inhibiting TNF- ⁇ production.
- the medium was replaced with these at 400 ⁇ L/well, and culture was started in a CO2 incubator (37°C, 5.0%).
- soybean germ extract was added to the M1 induction medium at a final concentration of 0.02 w/v%
- soybean germ extract less than 3 kDa fraction was added to the M1 induction medium at a final concentration of 0.02 w/v%
- wheat germ extract less than 3 kDa fraction was added to the M1 induction medium at a final concentration of 2.5 v/v%.
- a condition in which no LPS was added after M0 polarization induction i.e. -LPS
- a condition in which Otsuka distilled water or PBS was used as a sample i.e. Control
- Example 6 Anti-inflammatory effect of autoclaved soybean germ extract It was examined whether the components exhibiting the inhibitory effect on TNF- ⁇ production were inactivated by autoclaving (ie, whether they were inactivated by heat).
- both non-autoclaved soybean germ extract i.e., soybean germ extract before autoclaving
- autoclaved soybean germ extract i.e., soybean germ extract after autoclaving
- Example 7 Anti-inflammatory effect of ethanol extract fraction of soybean germ extract (1)
- the soybean germ extract powder was further extracted with aqueous ethanol solutions of various concentrations, and the fraction extracted with which aqueous ethanol solution concentration exhibited TNF- ⁇ production inhibitory activity was examined, thereby evaluating the degree of water solubility of the components exhibiting TNF- ⁇ production inhibitory activity.
- the lid of the container was opened, the solvent was evaporated (50°C, 17 hours), and the extract was dissolved in 5 mL of distilled water (i.e., after preparing a 4 w/v % ethanol extract fraction), sterilized by filter, and stored at -30°C.
- TNF- ⁇ As shown in Figure 6, the production of TNF- ⁇ was suppressed in the fraction extracted with ethanol concentrations of 50% to 90%. On the other hand, the production of TNF- ⁇ was slightly suppressed in the fraction extracted with 95% ethanol. The production of TNF- ⁇ was not suppressed at all in the fraction extracted with 100% ethanol. Based on these results, it is presumed that the components that exhibit TNF- ⁇ production inhibitory effects are readily soluble in water and unnecessary in ethanol.
- Example 8 Anti-inflammatory effect of ethanol extract fraction of soybean germ extract (2) The degree of water solubility of the components exhibiting the TNF- ⁇ production inhibitory effect was further evaluated. Specifically, soybean germ extract powder was extracted with an aqueous ethanol solution having a high concentration (specifically, an ethanol concentration of 90% to 100%), and the fraction extracted with the aqueous ethanol solution at which concentration exhibited the TNF- ⁇ production inhibitory effect was examined, thereby evaluating the degree of water solubility of the components exhibiting the TNF- ⁇ production inhibitory effect.
- soybean germ extract powder was extracted with an aqueous ethanol solution having a high concentration (specifically, an ethanol concentration of 90% to 100%), and the fraction extracted with the aqueous ethanol solution at which concentration exhibited the TNF- ⁇ production inhibitory effect was examined, thereby evaluating the degree of water solubility of the components exhibiting the TNF- ⁇ production inhibitory effect.
- ethanol extract fraction of soybean germ extract (4 w/v % fraction)> 0.2 g of soybean germ extract powder was suspended or dissolved in 2 mL of ethanol aqueous solution (ethanol concentration 90%, 92%, 94%, 96%, 98%, 100%) and stirred with a shaker (30 rpm, 2-3 hours, room temperature). The supernatant was collected by centrifugation (13,000 rpm, 10 minutes), and then centrifuged again (13,000 rpm, 10 minutes) to collect the supernatant again.
- the lid of the container was opened, the solvent was evaporated (50°C, 17 hours), and the extract was dissolved in 5 mL of distilled water (i.e., after preparing a 4 w/v % ethanol extract fraction), sterilized by filter, and stored at -30°C.
- a condition was also set in which the 50% ethanol extract fraction and the 80% ethanol extract fraction prepared in Example 7 were added to a final concentration of 0.02 w/v%.
- a condition was also set in which soybean germ extract was added to a final concentration of 0.02 w/v%.
- a condition in which no LPS was added after M0 polarization induction (i.e. -LPS) and a condition in which Otsuka distilled water or PBS was used as a sample (i.e. Control) were set.
- (4) Collection of culture supernatant and measurement of humoral factors After the start of the culture in (3), the culture supernatant was collected 6 hours later and stored in a freezer at ⁇ 80° C. It was thawed later, and the TNF- ⁇ concentration in the culture supernatant was measured according to the kit protocol.
- Example 9 Suppression of TNF- ⁇ gene expression
- soybean germ extract has any effect on the expression of TNF- ⁇ gene in M1 macrophages. ⁇ 12.1. Cells and reagents used> As described in “3. Overview of the procedure for evaluating anti-inflammatory effects.”
- RNA-directTM Realtime PCR Master Mix (QRT-101, TOYOBO)
- Primers Taqman GAPDH (endogenous control) (Hs02786624_g1, GAPDH VIC, PN4448489, Thermo Scientific)
- Primers Taqman TNF- ⁇ (Hs01113624_g1 TNF, Thermo Scientific)
- Equipment 7500 Real Time PCR system (Applied Biosystems)
- the device menu was as follows: ⁇ 7500 (96 wells) Quantitation-Comparative CT ( ⁇ CT) Taqman® Reagent ⁇ Standard
- ⁇ CT Quantitation-Comparative CT
- RNA concentration was mixed to be 200 ng/well under each condition.
- the mixture was dispensed into a dedicated plate, a plate seal was carefully attached, and the plate was spun down and set in the device to start the reaction.
- the final relative quantification (RQ) value was calculated by the comparative CT method, taking the condition "-LPS" as 1.
- the RQ value of the control in which M1 polarization induction was performed with LPS was 4 or more, which indicates that TNF- ⁇ expression was significantly enhanced as a result of M1 polarization induction.
- the expression of TNF- ⁇ was strongly suppressed by adding soybean germ extract and the soybean germ extract ultrafiltrate less than 3 kDa fraction after M1 polarization induction.
- Example 10 Comparison of anti-inflammatory effects with dexamethasone (TNF- ⁇ index) The anti-inflammatory effect of soybean germ extract was compared with that of dexamethasone, a steroid anti-inflammatory drug used for acute and chronic inflammation, autoimmune diseases, allergic diseases, etc., using the amount of TNF- ⁇ produced as an indicator.
- a condition in which no LPS was added after M0 polarization induction i.e., -LPS
- a condition in which Otsuka distilled water or PBS was used as a sample i.e., Control
- An experiment was performed with n 3 per condition in one experiment.
- (4) Collection of culture supernatant and measurement of humoral factors After the start of the culture in (3), the culture supernatant was collected 6 hours later and stored in a freezer at ⁇ 80° C. It was thawed later, and the TNF- ⁇ concentration in the culture supernatant was measured according to the kit protocol.
- dexamethasone exerted a strong inhibitory effect on TNF- ⁇ production at concentrations of 10 nM (i.e., 0.01 ⁇ M) or higher.
- 0.1 w/v% soybean germ extract exerted the same inhibitory effect on TNF- ⁇ production as 10 nM dexamethasone.
- Example 11 Comparison of anti-inflammatory effects with dexamethasone (IL-10 index) Using the amount of IL-10 produced as an indicator, the anti-inflammatory effects of the extracts (soybean germ extract and wheat germ extract) were compared with the anti-inflammatory effect of dexamethasone.
- a condition was set in which dexamethasone was added to a final concentration of 10 nM.
- the amount of IL-10 produced in the control group was higher than that in the -LPS group. This is because IL-10 is a cytokine secreted by M2 (anti-inflammatory) macrophages, but is also produced in small amounts by LPS stimulation. Therefore, when discussing the anti-inflammatory effect using IL-10 as an indicator, attention should be paid to whether the amount of IL-10 produced is higher than that of the control. Under the conditions of 0.1 w/v% soybean germ extract, 0.1 w/v% soybean germ extract less than 3 kDa fraction, and 2.5 v/v% wheat germ extract, the amount of IL-10 produced was higher than that of the control.
- the present invention has industrial applicability because it can provide an anti-inflammatory agent, a TNF- ⁇ production inhibitor, an IL-10 production enhancer, a skin topical composition, and a food and beverage composition.
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Abstract
植物由来の有効成分を含む抗炎症剤、TNF-α産生抑制剤、およびIL-10産生亢進剤を提供することを目的とする。植物由来の有効成分を含む、抗炎症作用を有する皮膚外用組成物および飲食品組成物を提供することを目的とする。抗炎症剤、TNF-α産生抑制剤、およびIL-10産生亢進剤が、植物由来ポリアミン含有抽出物を含み、前記植物由来ポリアミン含有抽出物が1kDa未満の画分を含み、前記1kDa未満の画分が有効成分を含む。皮膚外用組成物および飲食品組成物が、前記抗炎症剤を含む。
Description
本発明は、抗炎症剤、TNF-α産生抑制剤、インターロイキン10産生亢進剤、皮膚外用組成物、および飲食品組成物に関する。本発明はまた、炎症性疾患の予防、改善または治療方法に関する。本発明はまた、炎症性疾患の予防、改善または治療のために用いられる抗炎症剤を製造するための植物由来ポリアミン含有抽出物の使用に関する。
皮膚炎やかぶれといった皮膚トラブルの原因は、洗剤や金属による外からの刺激が、内分泌系に影響を及ぼすことによって起こる皮膚の炎症である。
皮膚の炎症にはTNF-α(すなわち腫瘍壊死因子-α)が関わると考えられている。TNF-αは、それ自身が皮膚や組織を刺激して炎症を引き起こすだけでなく、炎症を起こす別のサイトカインの産生を促し、間接的に炎症を引き起こす。こうしたことから、TNF-αは、炎症を引き起こすサイトカインの司令塔のような物質であると言える。なお、TNF-αを産生する代表的な細胞はマクロファージである。
とりわけ、TNF-αの過剰産生は、関節リウマチ、変形性関節症、乾癬、尋常性天疱瘡、アレルギー性接触皮膚炎、アトピー性皮膚炎などに関わると考えられている。
TNF-αの産生はステロイド剤によって抑制することができる。しかしながら、ステロイド剤は、その副作用を理由に使用がためらわれる場合がある。たとえば、皮膚の弱い部分や、乳児の柔らかい肌へのステロイド剤の使用がためらわれる場合がある。
ところで、大豆胚芽から抽出した、ポリアミンを含有する抽出物が、紫外線によって誘発される皮膚の紅斑を抑制することが知られている(特許文献1参照)。大豆胚芽から抽出した、ポリアミンを含有する抽出物が、表皮細胞においてPM2.5に惹起されるインターロイキン1α遺伝子やインターロイキン8遺伝子、CYP遺伝子の発現亢進を抑制することも知られている(特許文献2参照)。
これら抽出物は大豆を原料とするため、植物由来である。その意味で、すなわち天然物であるという意味で、これら抽出物には高い安全性を期待できる。
本発明は、植物由来の有効成分を含む抗炎症剤、TNF-α産生抑制剤、およびIL-10産生亢進剤を提供することを目的とする。本発明はまた、植物由来の有効成分を含む、抗炎症作用を有する皮膚外用組成物および飲食品組成物を提供することを目的とする。
この課題を解決するために本発明者は、大豆胚芽抽出物や小麦胚芽抽出物を用いて研究をすすめるなかで、1kDa未満の画分が、TNF-α産生抑制作用やインターロイキン10(すなわちIL-10)産生亢進作用を有することを見出した。
このような知見に基づき完成された本発明は、次の通りである。
[1]
植物由来ポリアミン含有抽出物を含み、
前記植物由来ポリアミン含有抽出物が1kDa未満の画分を含み、
前記1kDa未満の画分が有効成分を含む、
抗炎症剤。
[2]
前記植物が、大豆および小麦の少なくとも一方である、[1]に記載の抗炎症剤。
[3]
前記植物由来ポリアミン含有抽出物が、大豆種子、大豆胚芽、大豆胚、大豆芽、小麦種子、小麦胚芽、小麦胚、小麦芽、豆乳およびオカラからなる群から選ばれた少なくとも1種の材料から抽出されたものである、[1]または[2]に記載の抗炎症剤。
[4]
前記植物由来ポリアミン含有抽出物が、大豆胚芽および小麦胚芽の少なくとも一方から抽出されたものである、[1]~[3]のいずれかに記載の抗炎症剤。
[5]
前記植物由来ポリアミン含有抽出物が、pH6.0以下の水溶液で抽出する工程を含む方法で得られたものである、[1]~[4]のいずれかに記載の抗炎症剤。
[6]
前記有効成分が、121℃で15分間の熱処理によって失活しない、[1]~[5]のいずれかに記載の抗炎症剤。
[7]
前記有効成分がエタノールに不溶である、[1]~[6]のいずれかに記載の抗炎症剤。
[8]
炎症性疾患の予防、改善または治療のために用いられる、[1]~[7]のいずれかに記載の抗炎症剤。
[9]
前記炎症性疾患が関節リウマチ、変形性関節症、乾癬、尋常性天疱瘡、アレルギー性接触皮膚炎、アトピー性皮膚炎、または炎症性腸疾患である、[8]に記載の抗炎症剤。
[10]
[1]~[9]のいずれかに記載の抗炎症剤を含む、皮膚外用組成物。
[11]
炎症性疾患の予防、改善または治療のために用いられる、[10]に記載の皮膚外用組成物。
[12]
前記炎症性疾患が関節炎または皮膚炎である、[11]に記載の皮膚外用組成物。
[13]
前記炎症性疾患が、関節リウマチ、変形性関節症、乾癬、尋常性天疱瘡、アレルギー性接触皮膚炎、またはアトピー性皮膚炎である、[11]に記載の皮膚外用組成物。
[14]
[1]~[9]のいずれかに記載の抗炎症剤を含む、飲食品組成物。
[15]
炎症性腸疾患の予防または改善のために用いられる、[14]に記載の飲食品組成物。
[16]
植物由来ポリアミン含有抽出物を含み、
前記植物由来ポリアミン含有抽出物が1kDa未満の画分を含み、
前記1kDa未満の画分が有効成分を含む、
TNF-α産生抑制剤。
[17]
植物由来ポリアミン含有抽出物を含み、
前記植物由来ポリアミン含有抽出物が1kDa未満の画分を含み、
前記1kDa未満の画分が有効成分を含む、
インターロイキン10産生亢進剤。
[18]
前記植物由来ポリアミン含有抽出物が大豆由来ポリアミン含有抽出物である、前記いずれかに記載の抗炎症剤。
[19]
前記植物由来ポリアミン含有抽出物が大豆胚芽から抽出されたものである、すなわち大豆胚芽抽出物である、前記いずれかに記載の抗炎症剤。
[20]
前記植物由来ポリアミン含有抽出物が、pH6.0以下の水溶液で大豆胚芽から抽出する工程を含む方法で得られたものである、前記いずれかに記載の抗炎症剤。
[21]
前記植物由来ポリアミン含有抽出物が小麦由来ポリアミン含有抽出物である、前記いずれかに記載の抗炎症剤。
[22]
前記植物由来ポリアミン含有抽出物が小麦胚芽から抽出されたものである、すなわち小麦胚芽抽出物である、前記いずれかに記載の抗炎症剤。
[23]
前記植物由来ポリアミン含有抽出物が、pH6.0以下の水溶液で小麦胚芽から抽出する工程を含む方法で得られたものである、前記いずれかに記載の抗炎症剤。
[24]
前記水溶液のpHが5.0以下である、前記いずれかに記載の抗炎症剤。
[25]
前記水溶液のpHが4.0以下である、前記いずれかに記載の抗炎症剤。
[26]
前記水溶液のpHが3.0以下である、前記いずれかに記載の抗炎症剤。
[27]
前記水溶液のpHが2.0以下である、前記いずれかに記載の抗炎症剤。
[28]
前記植物由来ポリアミン含有抽出物が、プトレシン、スペルミジン、およびスペルミンを含有する、前記いずれかに記載の抗炎症剤。
[29]
前記炎症性疾患が炎症性腸疾患である、前記いずれかに記載の抗炎症剤。
[30]
前記炎症性腸疾患が、潰瘍性大腸炎、クローン病、または腸管ベーチェット病である、前記いずれかに記載の抗炎症剤。
[31]
前記いずれかに記載の抗炎症剤を対象に投与することを含む、炎症性疾患の予防、改善または治療方法。
ここで、対象としては、たとえばヒト、サル、マウス、ラット、イヌ、ネコ、ウサギ、ブタ、ウマ、ウシ、ヒツジ、ヤギ、シカといった哺乳動物が好ましく、ヒトがより好ましい。
[32]
前記炎症性疾患が関節リウマチ、変形性関節症、乾癬、尋常性天疱瘡、アレルギー性接触皮膚炎、アトピー性皮膚炎、または炎症性腸疾患である、[31]に記載の炎症性疾患の予防、改善または治療方法。
[33]
抗炎症剤を製造するための植物由来ポリアミン含有抽出物の使用であって、
前記植物由来ポリアミン含有抽出物が1kDa未満の画分を含み、
前記1kDa未満の画分が有効成分を含む、
使用。
[34]
前記抗炎症剤が、炎症性疾患の予防、改善または治療のために用いられる抗炎症剤であって、
前記炎症性疾患が関節リウマチ、変形性関節症、乾癬、尋常性天疱瘡、アレルギー性接触皮膚炎、アトピー性皮膚炎、または炎症性腸疾患である、
[33]に記載の使用。
[35]
前記いずれかに記載の皮膚外用組成物を皮膚に使用することを含む、炎症性疾患の予防、改善または治療方法。
ここで、「皮膚外用組成物を皮膚に使用する」方法として、たとえば、皮膚外用組成物を皮膚に塗る、皮膚外用組成物を含む不織布を皮膚に当てる、皮膚外用組成物を皮膚に噴霧する、といった方法を挙げることができる。なお、皮膚外用組成物を含む不織布を得るために、たとえば、皮膚外用組成物を不織布に含浸させてもよい。
[36]
前記炎症性疾患が、関節リウマチ、変形性関節症、乾癬、尋常性天疱瘡、アレルギー性接触皮膚炎、またはアトピー性皮膚炎である、[35]に記載の炎症性疾患の予防、改善または治療方法。
[1]
植物由来ポリアミン含有抽出物を含み、
前記植物由来ポリアミン含有抽出物が1kDa未満の画分を含み、
前記1kDa未満の画分が有効成分を含む、
抗炎症剤。
[2]
前記植物が、大豆および小麦の少なくとも一方である、[1]に記載の抗炎症剤。
[3]
前記植物由来ポリアミン含有抽出物が、大豆種子、大豆胚芽、大豆胚、大豆芽、小麦種子、小麦胚芽、小麦胚、小麦芽、豆乳およびオカラからなる群から選ばれた少なくとも1種の材料から抽出されたものである、[1]または[2]に記載の抗炎症剤。
[4]
前記植物由来ポリアミン含有抽出物が、大豆胚芽および小麦胚芽の少なくとも一方から抽出されたものである、[1]~[3]のいずれかに記載の抗炎症剤。
[5]
前記植物由来ポリアミン含有抽出物が、pH6.0以下の水溶液で抽出する工程を含む方法で得られたものである、[1]~[4]のいずれかに記載の抗炎症剤。
[6]
前記有効成分が、121℃で15分間の熱処理によって失活しない、[1]~[5]のいずれかに記載の抗炎症剤。
[7]
前記有効成分がエタノールに不溶である、[1]~[6]のいずれかに記載の抗炎症剤。
[8]
炎症性疾患の予防、改善または治療のために用いられる、[1]~[7]のいずれかに記載の抗炎症剤。
[9]
前記炎症性疾患が関節リウマチ、変形性関節症、乾癬、尋常性天疱瘡、アレルギー性接触皮膚炎、アトピー性皮膚炎、または炎症性腸疾患である、[8]に記載の抗炎症剤。
[10]
[1]~[9]のいずれかに記載の抗炎症剤を含む、皮膚外用組成物。
[11]
炎症性疾患の予防、改善または治療のために用いられる、[10]に記載の皮膚外用組成物。
[12]
前記炎症性疾患が関節炎または皮膚炎である、[11]に記載の皮膚外用組成物。
[13]
前記炎症性疾患が、関節リウマチ、変形性関節症、乾癬、尋常性天疱瘡、アレルギー性接触皮膚炎、またはアトピー性皮膚炎である、[11]に記載の皮膚外用組成物。
[14]
[1]~[9]のいずれかに記載の抗炎症剤を含む、飲食品組成物。
[15]
炎症性腸疾患の予防または改善のために用いられる、[14]に記載の飲食品組成物。
[16]
植物由来ポリアミン含有抽出物を含み、
前記植物由来ポリアミン含有抽出物が1kDa未満の画分を含み、
前記1kDa未満の画分が有効成分を含む、
TNF-α産生抑制剤。
[17]
植物由来ポリアミン含有抽出物を含み、
前記植物由来ポリアミン含有抽出物が1kDa未満の画分を含み、
前記1kDa未満の画分が有効成分を含む、
インターロイキン10産生亢進剤。
[18]
前記植物由来ポリアミン含有抽出物が大豆由来ポリアミン含有抽出物である、前記いずれかに記載の抗炎症剤。
[19]
前記植物由来ポリアミン含有抽出物が大豆胚芽から抽出されたものである、すなわち大豆胚芽抽出物である、前記いずれかに記載の抗炎症剤。
[20]
前記植物由来ポリアミン含有抽出物が、pH6.0以下の水溶液で大豆胚芽から抽出する工程を含む方法で得られたものである、前記いずれかに記載の抗炎症剤。
[21]
前記植物由来ポリアミン含有抽出物が小麦由来ポリアミン含有抽出物である、前記いずれかに記載の抗炎症剤。
[22]
前記植物由来ポリアミン含有抽出物が小麦胚芽から抽出されたものである、すなわち小麦胚芽抽出物である、前記いずれかに記載の抗炎症剤。
[23]
前記植物由来ポリアミン含有抽出物が、pH6.0以下の水溶液で小麦胚芽から抽出する工程を含む方法で得られたものである、前記いずれかに記載の抗炎症剤。
[24]
前記水溶液のpHが5.0以下である、前記いずれかに記載の抗炎症剤。
[25]
前記水溶液のpHが4.0以下である、前記いずれかに記載の抗炎症剤。
[26]
前記水溶液のpHが3.0以下である、前記いずれかに記載の抗炎症剤。
[27]
前記水溶液のpHが2.0以下である、前記いずれかに記載の抗炎症剤。
[28]
前記植物由来ポリアミン含有抽出物が、プトレシン、スペルミジン、およびスペルミンを含有する、前記いずれかに記載の抗炎症剤。
[29]
前記炎症性疾患が炎症性腸疾患である、前記いずれかに記載の抗炎症剤。
[30]
前記炎症性腸疾患が、潰瘍性大腸炎、クローン病、または腸管ベーチェット病である、前記いずれかに記載の抗炎症剤。
[31]
前記いずれかに記載の抗炎症剤を対象に投与することを含む、炎症性疾患の予防、改善または治療方法。
ここで、対象としては、たとえばヒト、サル、マウス、ラット、イヌ、ネコ、ウサギ、ブタ、ウマ、ウシ、ヒツジ、ヤギ、シカといった哺乳動物が好ましく、ヒトがより好ましい。
[32]
前記炎症性疾患が関節リウマチ、変形性関節症、乾癬、尋常性天疱瘡、アレルギー性接触皮膚炎、アトピー性皮膚炎、または炎症性腸疾患である、[31]に記載の炎症性疾患の予防、改善または治療方法。
[33]
抗炎症剤を製造するための植物由来ポリアミン含有抽出物の使用であって、
前記植物由来ポリアミン含有抽出物が1kDa未満の画分を含み、
前記1kDa未満の画分が有効成分を含む、
使用。
[34]
前記抗炎症剤が、炎症性疾患の予防、改善または治療のために用いられる抗炎症剤であって、
前記炎症性疾患が関節リウマチ、変形性関節症、乾癬、尋常性天疱瘡、アレルギー性接触皮膚炎、アトピー性皮膚炎、または炎症性腸疾患である、
[33]に記載の使用。
[35]
前記いずれかに記載の皮膚外用組成物を皮膚に使用することを含む、炎症性疾患の予防、改善または治療方法。
ここで、「皮膚外用組成物を皮膚に使用する」方法として、たとえば、皮膚外用組成物を皮膚に塗る、皮膚外用組成物を含む不織布を皮膚に当てる、皮膚外用組成物を皮膚に噴霧する、といった方法を挙げることができる。なお、皮膚外用組成物を含む不織布を得るために、たとえば、皮膚外用組成物を不織布に含浸させてもよい。
[36]
前記炎症性疾患が、関節リウマチ、変形性関節症、乾癬、尋常性天疱瘡、アレルギー性接触皮膚炎、またはアトピー性皮膚炎である、[35]に記載の炎症性疾患の予防、改善または治療方法。
本発明によれば、植物由来の有効成分を含む抗炎症剤、TNF-α産生抑制剤、およびIL-10産生亢進剤を提供することができる。本発明によれば、植物由来の有効成分を含む、抗炎症作用を有する皮膚外用組成物および飲食品組成物を提供することもできる。
以下、本発明の実施形態について説明する。
<1.抗炎症剤、TNF-α産生抑制剤、IL-10産生亢進剤、皮膚外用組成物、および飲食品組成物>
本実施形態の抗炎症剤やTNF-α産生抑制剤、IL-10産生亢進剤、皮膚外用組成物、飲食品組成物は植物由来ポリアミン含有抽出物を含む。なお、「皮膚外用組成物」とは、皮膚に用いられる組成物を意味する。
本実施形態の抗炎症剤やTNF-α産生抑制剤、IL-10産生亢進剤、皮膚外用組成物、飲食品組成物は植物由来ポリアミン含有抽出物を含む。なお、「皮膚外用組成物」とは、皮膚に用いられる組成物を意味する。
<1.1.植物由来ポリアミン含有抽出物>
植物由来ポリアミン含有抽出物は、ポリアミンを含有する植物抽出物である。植物由来ポリアミン含有抽出物は、植物および/または植物加工物から抽出されることができる。
植物由来ポリアミン含有抽出物は、ポリアミンを含有する植物抽出物である。植物由来ポリアミン含有抽出物は、植物および/または植物加工物から抽出されることができる。
植物として、たとえば双子葉植物、単子葉植物、草本性植物、木本性植物、ウリ科植物、ナス科植物、イネ科植物、アブラナ科植物、マメ科植物、アオイ科植物、キク科植物、アカザ科植物、マメ科植物を挙げることができる。なかでも、イネ科植物、マメ科植物が好ましい。
イネ科植物として、たとえば、小麦、オオムギ、イネ、トウモロコシ、ソルガム、サトウキビ、シバ、オートむぎ、ライムギ、アワを挙げることができる。なかでも、国民一人・一年当たり供給純食料が多く、すなわち、国民一人当たり年間消費量が多く、しかも、安価に入手可能であるという理由で小麦が好ましい。
マメ科植物として、たとえば、大豆、アルファルファ、アズキ、インゲンマメ、ササゲを挙げることができる。なかでも、国民一人・一年当たり供給純食料が多く、すなわち、国民一人当たり年間消費量が多く、しかも、安価に入手可能であるという理由で大豆が好ましい。
イネ科植物やマメ科植物以外の植物として、たとえば、サツマイモ、トマト、キュウリ、カボチャ、メロン、スイカ、タバコ、シロイヌナズナ、ピーマン、ナス、サトイモ、ホウレンソウ、ニンジン、イチゴ、ジャガイモ、ナタネ、ユーカリ、ポプラ、ケナフ、杜仲、シュガービート、キャッサバ、サゴヤシ、アカザ、ユリ、ラン、カーネーション、バラ、キク、ペチュニア、トレニア、キンギョソウ、シクラメン、カスミソウ、ゼラニウム、ヒマワリ、ワタ、エノキダケ、ホンシメジ、マツタケ、シイタケ、キノコ類、チョウセンニンジン、アガリクス、ウコン、オタネニンジン、柑橘類、バナナ、キウイを挙げることができる。
抽出物(すなわち植物由来ポリアミン含有抽出物)を得るための植物の部位として、たとえば、花、蕾、子房、果実、葉、子葉、茎、芽、根、種子、乾燥種子、胚、胚芽などを挙げることができる。なかでも、果実、葉、茎、芽、種子、乾燥種子、胚芽、胚が好ましく、種子、乾燥種子、胚芽、胚がより好ましく、胚芽(たとえば、大豆胚芽、小麦胚芽、コメ胚芽、オオムギ胚芽、トウモロコシ胚芽、マイロ胚芽、ヒマワリ胚芽)がさらに好ましい。なお、植物のからだ全体から抽出物を得てもよいことはもちろんである。
植物としては、上述の通り大豆が好ましい。すなわち、植物由来ポリアミン含有抽出物が大豆由来ポリアミン含有抽出物であることが好ましい。大豆由来ポリアミン含有抽出物は、未加工の大豆(たとえば大豆胚芽)から得られたものでもよいし、大豆に何らかの手を加えた製品、すなわち加工物から得られたものでもよい。加工物として、たとえば、必要に応じて発酵させた大豆エキス(たとえば、大豆胚芽エキス、大豆胚エキス)、納豆、豆乳、オカラを挙げることができる。
植物としては、上述の通り小麦も好ましい。すなわち、植物由来ポリアミン含有抽出物が小麦由来ポリアミン含有抽出物であることが好ましい。小麦由来ポリアミン含有抽出物は、未加工の小麦(たとえば小麦胚芽)から得られたものでもよいし、小麦に何らかの手を加えた製品、すなわち加工物から得られたものでもよい。加工物として、たとえば、必要に応じて発酵させた小麦エキス(たとえば小麦胚芽エキス、小麦胚エキス)、小麦粉を挙げることができる。
なお、植物が、大豆や小麦以外に由来する場合でももちろん、植物由来ポリアミン含有抽出物が加工物から得られたものでもよい。そのような加工物として、たとえば、緑茶、紅茶、ウーロン茶、果汁などを挙げることができる。
原料が安価であり、しかも大量に入手可能であり、そのうえポリアミンを豊富に含むという理由で、植物由来ポリアミン含有抽出物が、大豆種子、大豆胚芽、大豆胚、大豆芽、小麦種子、小麦胚芽、小麦胚、小麦芽、豆乳、およびオカラからなる群から選ばれた少なくとも1種の材料から抽出されたものであることが好ましい。なかでも、植物由来ポリアミン含有抽出物が、大豆胚芽および小麦胚芽の少なくとも一方から抽出されたものであることがより好ましく、大豆胚芽から抽出されたものであることがさらに好ましい。
植物由来ポリアミン含有抽出物は、pH6.0以下の水溶液(以下、「酸性水溶液」と言うことがある。)で抽出されることができる。酸性水溶液で抽出することによって、エタノールやメタノールといった有機溶媒で抽出する場合に比べて、ポリアミンの回収率を高めることができる。しかも、酸性水溶液で抽出することによって、有機溶媒で抽出する場合に比べて、抽出のための有機溶媒の残留を回避できる。したがって、植物由来ポリアミン含有抽出物の安全性を高めることができる。そのうえ、pH6.0以下であることによって、ポリアミンの回収率をいっそう高めることができるとともに、酸性水溶液中でのポリアミンの安定性を向上できる。
抽出の手順として、たとえば、植物および/または植物加工物を必要に応じて砕いたうえで、酸性水溶液で植物由来ポリアミン含有抽出物を抽出する、という手順を挙げることができる。より具体的な手順として、たとえば、植物および/または植物加工物に酸性水溶液を加え、必要に応じてポリフェノール吸着剤をさらに加え、植物および/または植物加工物を必要に応じて砕き、酸性水溶液中で植物由来ポリアミン含有抽出物を抽出する、という手順を挙げることができる。
酸性水溶液のpHは5.0以下が好ましく、4.0以下が好ましく、3.0以下がさらに好ましく、2.0以下がさらに好ましい。いっぽう、酸性水溶液のpHはたとえば1.0以上であることができる。
酸性水溶液として、たとえば、鉱酸を水に溶かした水溶液、有機酸を水に溶かした水溶液、鉱酸および有機酸の両者を水に溶かした水溶液、酸性水を挙げることができる。たとえば、塩酸、硫酸、リン酸、硝酸、過塩素酸などの鉱酸を水に溶かした水溶液や、ギ酸、酢酸、プロピオン酸、酪酸、蓚酸、マロン酸、コハク酸、フマル酸、マレイン酸、リンゴ酸、乳酸、酒石酸、クエン酸、安息香酸、トリクロロ酢酸、スルホサリチル酸などの有機酸を水に溶かした水溶液を挙げることができる。なかでも、0.01N~6Nの塩酸、硫酸、硝酸、酢酸、リン酸、トリクロロ酢酸、スルホサリチル酸、クエン酸、乳酸や、0.1%~10%の過塩素酸が好ましく、0.0625N~1Nの塩酸、0.25%~5%の過塩素酸がより好ましい。
植物および/または植物加工物を砕くために、たとえば、ミキサー、ブレンダー、ホモジナイザー、乳鉢、超音波破砕機などを使用することができる。植物および/または植物加工物を砕くことによって、植物および/または植物加工物を、たとえば、スラリー状、細粒状、顆粒状または粉末状にしたうえで抽出をおこなうことができる。なお、植物および/または植物加工物を砕く操作は、酸性水溶液中でおこなってもよい。すなわち、酸性水溶液に浸漬したうえで植物および/または植物加工物を砕いてもよい。
抽出時間は、10分以上が好ましく、20分以上がより好ましく、30分以上がさらに好ましい。いっぽう、抽出時間は、48時間以下であってもよく、24時間以下であってもよく12時間以下であってもよく、6時間以下であってもよく、3時間以下であってもよい。抽出温度、すなわち、抽出中の酸性水溶液の温度は、たとえば、10℃以上であってもよく、15℃以上であってもよく、20℃以上であってもよい。いっぽう、抽出温度は、40℃以下であってもよく、35℃以下であってもよく、30℃以下であってもよい。なお、抽出中に、攪拌をおこなってもよい。
抽出は、ポリフェノール吸着剤の存在下でおこなってもよい。抽出をポリフェノール吸着剤の存在下でおこなうことによってポリフェノール類を除去することができる。ポリフェノール吸着剤として、たとえば、PVPP(ポリビニルポリピロリドン)、PVP(ポリビニルピロリドン)、PEG(ポリエチレングリコール)を挙げることができる。なかでもPVPPが好ましい。ポリフェノール吸着剤の市販品として、ISP社のポリクラール(登録商標)を例示できる。ポリフェノール吸着剤は、たとえば0.1%(w/v)~30%(w/v)、好ましくは0.5%(w/v)~20%(w/v)、より好ましくは1%(w/v)~10%(w/v)となるように酸性水溶液に加えることができる。なお、以下では、「%(w/v)」を「w/v%」と言うことがある。
抽出後、必要に応じて、遠心分離および/またはろ過をおこない、抽出液を回収する。
抽出液のpHを必要に応じて調整する。抽出液のpHを調整するために、水酸化ナトリウム水溶液、炭酸ナトリウム水溶液といった塩基性水溶液を加えることができる。pH調整後の抽出液のpHは、中性または中性付近であることが好ましく、たとえば6.0以上であってもよく、6.2以上であってもよく、6.5以上であってもよく、6.7以上であってもよい。pH調整後の抽出液のpHは、たとえば8.0以下であってもよく、7.8以下であってもよく、7.5以下であってもよく、7.3以下であってもよい。
抽出液は、植物由来ポリアミン含有抽出物としてそのまま使用してもよく、濃度を調整したうえで使用してもよく、乾燥したうえで使用してよく、精製をおこなったうえで使用してもよい。精製として、たとえば、限外ろ過を挙げることができる。なお、抽出液の濃度を調整する場合、ポリアミン濃度が、たとえば0.00001mM~100mMとなるように抽出液のポリアミン濃度を調整してもよい。調整後のポリアミン濃度は、0.00005mM~75mMであってもよく、0.0001mM~50mMであってもよい。ここで「M」は、モル/リットルを表す。いっぽう、調整後のポリアミン濃度は、0.0001重量%~100重量%であってもよく、0.001重量%~75重量%であってもよく、0.01重量%~50重量%であってもよい。
なお、本実施形態の抗炎症剤やTNF-α産生抑制剤、IL-10産生亢進剤、皮膚外用組成物、飲食品組成物に含まれる植物由来ポリアミン含有抽出物は、精製(たとえば限外ろ過)を経てもよいし、経なくてもよいことを念のため断っておく。
なお、本実施形態の抗炎症剤やTNF-α産生抑制剤、IL-10産生亢進剤、皮膚外用組成物、飲食品組成物に含まれる植物由来ポリアミン含有抽出物は、精製(たとえば限外ろ過)を経てもよいし、経なくてもよいことを念のため断っておく。
植物由来ポリアミン含有抽出物はポリアミンを含有する。ポリアミンとして、たとえば、プトレシン、スペルミジン、スペルミンを挙げることができる。植物由来ポリアミン含有抽出物は、ポリアミンを一種、または二種以上含有することができる。植物由来ポリアミン含有抽出物は、プトレシン、スペルミジン、およびスペルミンを含有することが好ましい。もちろん、植物由来ポリアミン含有抽出物はこれら以外のポリアミンを含有していてもよい。なお、植物由来ポリアミン含有抽出物が大豆胚芽抽出物である場合、プトレシンや、スペルミジン、スペルミンを含有することが知られている(特許第5018171号公報参照)。植物由来ポリアミン含有抽出物が小麦胚芽抽出物である場合も、プトレシンや、スペルミジン、スペルミンを含有することが知られている(特許第5018171号公報参照)。
植物由来ポリアミン含有抽出物は、TNF-α産生抑制作用を示すことができる。植物由来ポリアミン含有抽出物は、IL-10産生亢進作用を示すこともできる。
植物由来ポリアミン含有抽出物は、1kDa未満の画分を含む。「1kDa未満の画分」とは、1kDa cut offの限外ろ過膜、すなわち、Nominal Molecular Weight Limit(NMWL)が1kDaである限外ろ過膜を通り抜ける成分を意味する。1kDa cut offの限外ろ過膜を有する製品として、たとえば、1kDa cut offの限外ろ過チューブ(Microsep Advance with 1K Omega,MCP001C41,Pall)を挙げることができる。
1kDa未満の画分に含まれ得る物質として、ポリアミン(たとえば、プトレシン、スペルミジン、スペルミン)や、ポリアミン以外の水溶性物質を挙げることができる。
1kDa未満の画分に含まれる成分のいくつかが共働して、TNF-α産生抑制作用を発揮すると考えられる。同様に、1kDa未満の画分に含まれる成分のいくつかが共働して、IL-10産生亢進作用を発揮すると考えられる。
1kDa未満の画分に含まれる成分のうち、TNF-α産生抑制作用やIL-10産生亢進作用を発揮する成分を「有効成分」と言うことがある。なお、有効成分は、1kDa未満の画分に含まれる成分のうちのいくつかによって構成される可能性がある。
有効成分が植物由来であるため、本実施形態の抗炎症剤やTNF-α産生抑制剤、IL-10産生亢進剤、皮膚外用組成物、飲食品組成物は安全性に優れている。
有効成分は、121℃で15分間の熱処理によってTNF-α産生抑制作用を失わないことができる。すなわち、有効成分は、121℃で15分間の熱処理によって失活しないことができる。
有効成分は、エタノールに不溶であることができる。
植物由来ポリアミン含有抽出物は、抗炎症剤や、TNF-α産生抑制剤、IL-10産生亢進剤、皮膚外用組成物、飲食品組成物として好適に使用できる。すなわち、植物由来ポリアミン含有抽出物は、そのまま、すなわち添加剤を加えずに、抗炎症剤や、TNF-α産生抑制剤、IL-10産生亢進剤、皮膚外用組成物、飲食品組成物として好適に使用できる。もちろん、添加剤を加えたうえで、抗炎症剤や、TNF-α産生抑制剤、IL-10産生亢進剤、飲食品組成物として使用することも好ましい。
なお、本実施形態の抗炎症剤やTNF-α産生抑制剤、IL-10産生亢進剤、皮膚外用組成物、飲食品組成物における植物由来ポリアミン含有抽出物の含有量は、用途や製剤形態などに応じて適宜設定できる。たとえば、本実施形態の抗炎症剤やTNF-α産生抑制剤、IL-10産生亢進剤、皮膚外用組成物、飲食品組成物は、ポリアミン濃度が、たとえば0.00001mM~100mMや、0.00005mM~75mM、0.0001mM~50mMとなるように植物由来ポリアミン含有抽出物を含んでいてもよい。
<1.2.他の成分>
本実施形態の抗炎症剤やTNF-α産生抑制剤、IL-10産生亢進剤、皮膚外用組成物、飲食品組成物は、植物由来ポリアミン含有抽出物に加えて、一種または二種以上の他の成分をさらに含んでいてもよい。そのような成分として、たとえば、油脂類、ロウ類、鉱物油、脂肪酸類、アルコール類、エステル類、金属セッケン、ガム質、水溶性高分子化合物、界面活性剤、ビタミン類、アミノ酸、美白剤、保湿剤、育毛剤、抽出物、エキス、微生物培養代謝物、α-ヒドロキシ酸、無機顔料、紫外線吸収剤、収斂剤、抗酸化剤、抗炎症剤、殺菌・消毒薬、頭髪用剤、香料、色素・着色剤、甘味料、栄養強化剤を挙げることができる。
本実施形態の抗炎症剤やTNF-α産生抑制剤、IL-10産生亢進剤、皮膚外用組成物、飲食品組成物は、植物由来ポリアミン含有抽出物に加えて、一種または二種以上の他の成分をさらに含んでいてもよい。そのような成分として、たとえば、油脂類、ロウ類、鉱物油、脂肪酸類、アルコール類、エステル類、金属セッケン、ガム質、水溶性高分子化合物、界面活性剤、ビタミン類、アミノ酸、美白剤、保湿剤、育毛剤、抽出物、エキス、微生物培養代謝物、α-ヒドロキシ酸、無機顔料、紫外線吸収剤、収斂剤、抗酸化剤、抗炎症剤、殺菌・消毒薬、頭髪用剤、香料、色素・着色剤、甘味料、栄養強化剤を挙げることができる。
油脂類として、アボガド油、アルモンド油、ウイキョウ油、エゴマ油、オリーブ油、オレンジ油、オレンジラファー油、ゴマ油、カカオ脂、カミツレ油、カロット油、キューカンバー油、牛脂、牛脂脂肪酸、ククイナッツ油、サフラワー油、大豆油、ツバキ油トウモロコシ油、ナタネ油、パーシック油、ヒマシ油、綿実油、落花生油、タートル油、ミンク油、卵黄油、パーム油、パーム核油、モクロウ、ヤシ油、豚脂、硬化油、硬化ヒマシ油などを挙げることができる。
ロウ類として、ミツロウ、カルナバロウ、鯨ロウ、ラノリン、液状ラノリン、還元ラノリン、硬質ラノリン、カンデリラロウ、モンタンロウ、セラックロウなどを挙げることができる。
鉱物油として、流動パラフィン、ワセリン、パラフィン、オゾケライド、セレシン、マイクロクリスタンワックス、ポリエチレン末、スクワレン、スクワラン、プリスタンなどを挙げることができる。
脂肪酸類として、ラウリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、ベヘン酸、オレイン酸、12-ヒドロキシステアリン酸、ウンデシレン酸、トール油、ラノリン脂肪酸などの天然脂肪酸、イソノナン酸、カプロン酸、2-エチルブタン酸、イソペンタン酸、2-メチルペンタン酸、2-エチルヘキサン酸、イソペンタン酸などの合成脂肪酸を挙げることができる。
アルコール類として、エタノール、イソプロパノール、ラウリルアルコール、セタノール、ステアリルアルコール、オレイルアルコール、ラノリンアルコール、コレステロール、フィトステロールなどの天然アルコール、2-ヘキシルデカノール、イソステアリルアルコール、2-オクチルドデカノールなどの合成アルコール、酸化エチレン、エチレングリコール、ジエチレングリコール、トリエチレングリコール、エチレングリコールモノエチルエーテル、エチレングリコールモノブチルエーテル、ジエチレングリコールモノメチルエーテル、ジエチレングリコールモノエチルエーテル、ポリエチレングリコール、酸化プロピレン、プロピレングリコール、ポリプロピレングリコール、1,3-ブチレングリコール、グリセリン、バチルアルコール、ペンタエリトリトール、ソルビトール、マンニトール、ブドウ糖、ショ糖などの多価アルコール類などを挙げることができる。
エステル類として、ミリスチン酸イソプロピル、パルミチン酸イソプロピル、ステアリン酸ブチル、ラウリン酸ヘキシル、ミリスチン酸ミリスチル、オレイン酸オレイル、オレイン酸デシル、ミリスチン酸オクチルドデシル、ジメチルオクタン酸ヘキシルデシル、乳酸セチル、乳酸ミリスチル、フタル酸ジエチル、フタル酸ジブチル、酢酸ラノリン、モノステアリン酸エチレングリコール、モノステアリン酸プロピレングリコール、ジオレイン酸プロピレングリコールなどを挙げることができる。
金属セッケンとして、ステアリン酸アルミニウム、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸亜鉛、ステアリン酸カルシウム、パルミチン酸亜鉛、ミリスチン酸マグネシウム、ラウリン酸亜鉛、ウンデシレン酸亜鉛などを挙げることができる。
ガム質および水溶性高分子化合物として、アラビアゴム、ベンゾインゴム、ダンマルゴム、グアヤク脂、アイルランド苔、カラヤゴム、トラガントゴム、キャロブゴム、クインシード、寒天、カゼイン、デキストリン、ゼラチン、ペクチン、デンプン、カラギーナン、カルボキシアルキルキチン、キトサン、ヒドロキシアルキルキチン、低分子キトサン、キトサン塩、硫酸化キチン、リン酸化キチン、アルギン酸およびその塩、ヒアルロン酸およびその塩、コンドロイチン硫酸、ヘパリン、エチルセルロース、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、カルボキシエチルセルロース、カルボキシエチルセルロースナトリウム、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ニトロセルロース、結晶セルロース、ポリビニルアルコール、ポリビニルメチルエーテル、ポリビニルピロリドン、ポリビニルメタアクリレート、ポリアクリル酸塩、ポリエチレンオキサイドやポリプロピレンオキサイド等のポリアルキレンオキサイドまたはその架橋重合物、カルボキシビニルポリマー、ポリエチレンイミンなどを挙げることができる。
界面活性剤として、アニオン界面活性剤(カルボン酸塩、スルホン酸塩、硫酸エステル塩、リン酸エステル塩)、カチオン界面活性剤(アミン塩、四級アンモニウム塩)、両性界面活性剤(カルボン酸型両性界面活性剤、硫酸エステル型両性界面活性剤、スルホン酸型両性界面活性剤、リン酸エステル型両性界面活性剤)、非イオン界面活性剤(エーテル型非イオン界面活性剤、エーテルエステル型非イオン界面活性剤、エステル型非イオン界面活性剤、ブロックポリマー型非イオン界面活性剤、含窒素型非イオン界面活性剤)、その他の界面活性剤(天然界面活性剤、タンパク質加水分解物の誘導体、高分子界面活性剤、チタン・ケイ素を含む界面活性剤、フッ化炭素系界面活性剤)などを挙げることができる。
ビタミン類として、ビタミンA群ではレチノール、レチナール(ビタミンA1)、デヒドロレチナール(ビタミンA2)、カロチン、リコピン(プロビタミンA)、ビタミンB群では、チアミン塩酸塩、チアミン硫酸塩(ビタミンB1)、リボフラビン(ビタミンB2)、ピリドキシン(ビタミンB6)、シアノコバラミン(ビタミンB12)、葉酸類、ニコチン酸類、パントテン酸類、ビオチン類、コリン、イノシトール類、ビタミンC群では、アスコルビン酸およびその誘導体、ビタミンD群では、エルゴカルシフェロール(ビタミンD2)、コレカルシフェロール(ビタミンD3)、ジヒドロタキステロール、ビタミンE群では、トコフェロールおよびその誘導体、ユビキノン類、ビタミンK群では、フィトナジオン(ビタミンK1)、メナキノン(ビタミンK2)、メナジオン(ビタミンK3)、メナジオール(ビタミンK4)などを挙げることができる。
アミノ酸として、バリン、ロイシン、イソロイシン、トレオニン、メチオニン、フェニルアラニン、トリプトファン、リジン、グリシン、アラニン、アスパラギン、グルタミン、セリン、システイン、シスチン、チロシン、プロリン、ヒドロキシプロリン、アスパラギン酸、グルタミン酸、ヒドロキシリジン、アルギニン、オルニチン、ヒスチジンなどや、それらの硫酸塩、リン酸塩、硝酸塩、クエン酸塩、あるいはピロリドンカルボン酸の如きアミノ酸誘導体などを挙げることができる。
美白剤として、アスコルビン酸またはその誘導体、イオウ、胎盤加水分解物、エラグ酸またはその誘導体、コウジ酸またはその誘導体、グルコサミンまたはその誘導体、アルブチンまたはその誘導体、ヒドロキシケイヒ酸またはその誘導体、グルタチオン、アルニカエキス、オウゴンエキス、ソウハクヒエキス、サイコエキス、ボウフウエキス、マンネンタケ菌糸体培養物またはその抽出物、シナノキエキス、モモ葉エキス、エイジツエキス、クジンエキス、ジユエキス、トウキエキス、ヨクイニンエキス、カキ葉エキス、ダイオウエキス、ボタンピエキス、ハマメリスエキス、マロニエエキス、オトギリソウエキス、油溶性カンゾウエキスなどを挙げることができる。
保湿剤として、ヒアルロン酸、ポリグルタミン酸、セリン、グリシン、スレオニン、アラニン、コラーゲン、加水分解コラーゲン、ヒドロネクチン、フィブロネクチン、ケラチン、エラスチン、ローヤルゼリー、コンドロイチン硫酸ヘパリン、グリセロリン脂質、グリセロ糖脂質、スフィンゴリン脂質、スフィンゴ糖脂質、リノール酸またはそのエステル類、エイコサペンタエン酸またはそのエステル類、ペクチン、ビフィズス菌発酵物、乳酸発酵物、酵母抽出物、レイシ菌糸体培養物またはその抽出物、小麦胚芽油、アボガド油、米胚芽油、ホホバ油、ダイズリン脂質、γ-オリザノール、ビロウドアオイエキス、ヨクイニンエキス、ジオウエキス、タイソウエキス、カイソウエキス、キダチアロエエキス、ゴボウエキス、マンネンロウエキス、アルニカエキス、小麦フスマなどを挙げることができる。
育毛剤として、ペンタデカン酸グリセリド、コレウスエキス、ゲンチアナエキス、マツカサエキス、ローヤルゼリーエキス、クマザサエキス、t-フラバノン、6-ベンジルアミノプリン、センブリエキス、塩化カルプロニウム、ミノキシジル、フィナステリド、アデノシン、ニコチン酸アミド、桑の根エキス、ジオウエキス、5-アミノレブリン酸などを挙げることができる。
動物、植物、または生薬の抽出物やエキスとしては、アセンヤク(阿仙薬)、アシタバ、アセロラ、アルテア、アルニカ、アボカド、アマチャ(甘茶)、アロエ、アロエベラ、イラクサ、イチョウ(銀杏葉、銀杏)、ウイキョウ(茴香)、ウコン(鬱金)、ウスバサイシン(細辛)、ウメ(烏梅)、ウラジロガシ、ウワウルシ、ノイバラ(営実)、ヒキオコシ(延命草)、オウギ(黄耆)、コガネバナ(オウゴン)、ヤマザクラ(桜皮)、キハダ(黄柏)、オウレン(黄連)、オタネニンジン(人参)、オトギリソウ(弟切草)、オドリコソウ、オランダガラシ、オレンジ、イトヒメハギ(遠志)、ウツボグサ(夏枯草)、ツルドクダミ(何首烏)、エンジュ(槐花)、ヨモギ(ガイ葉)、ガジュツ(莪朮)、クズ(葛根)、カノコソウ(吉草根)、カミツレ、キカラスウリ(瓜呂根)、カワラヨモギ(茵チン蒿)、カンゾウ(甘草)、フキタンポポ(款冬花、款冬葉)、キイチゴ、キウイ果実、キキョウ(桔梗)、キク(菊花)、キササゲ(梓実)、ミカン属植物果実(枳実)、タチバナ(橘皮)、キュウリ、ウドまたはシシウド(羌活、独活)、アンズ(杏仁)、クコ(地骨皮、枸杞子、枸杞葉)、クララ(苦参)、クスノキ、クマザサ、グレープフルーツ果実、ニッケイ(桂皮)、ケイガイ(ケイガイ)、エビスグサ(決明子)、マルバアサガオまたはアサガオ(ケン牛子)、ベニバナ(紅花)、ゴバイシ(五倍子)、コンフリー、コパイバ、クチナシ(山梔子)、ゲンチアナ、ホオノキ(厚朴)、ヒナタイノコズチ(牛膝)、ゴシュユ(呉茱萸)、ゴボウ、チョウセンゴミシ(五味子)、米、米ぬか、ミシマサイコ(柴胡)、サフラン、サボンソウ、サンザシ(山ザ子)、サンショウ(山椒)、サルビア、サンシチニンジン(三七人参)、シイタケ(椎茸)、ジオウ(地黄)、シクンシ(使君子)、ムラサキ(紫根)、シソ(紫蘇葉、紫蘇子)、カキ(柿蒂)、シャクヤク(芍薬)、オオバコ(車前子、車前草)、ショウガ(生姜)、ショウブ(菖蒲)、トウネズミモチ(女貞子)、シモツケソウ、シラカバ、スイカズラ(金銀花、忍冬)、セイヨウキヅタ、セイヨウノコギリソウ、セイヨウニワトコ、アズキ(赤小豆)、ニワトコ(接骨木)、ゼニアオイ、センキュウ(川キュウ)、センブリ(当薬)、クワ(桑白皮、桑葉)、ナツメ(大棗)、ダイズ、タラノキ、チクセツニンジン(竹節人参)、ハナスゲ(知母)、ワレモコウ(地楡)、ドクダミ(十薬)、フユムシナツクサタケ(冬虫夏草)、トウガラシ、ホオズキ(登呂根)、タチジャコウソウ、リョクチャ(緑茶)、コウチャ(紅茶)、チョウジ(丁子)、ウンシュウミカン(陳皮)、ツバキ、ツボクサ、トウガラシ(番椒)、トウキ(当帰)、トウキンセンカ、ダイダイ(橙皮)、トウモロコシ(南蛮毛)、トチュウ(杜仲、杜仲葉)、トマト、ナンテン(南天実)、ニンニク(大サン)、オオムギ(麦芽)、ハクセン(白蘚皮)、ジャノヒゲ(麦門冬)、パセリ、バタタ、ハッカ(薄荷)、ハマメリス、バラ、ビワ葉(枇杷葉)、マツホド(茯リョウ)、ブドウまたはその葉、ヘチマ、ボダイジュ、ボタン(牡丹皮)、ホップ、マイカイ(マイ瑰花)、松葉、マロニエ、マンネンロウ、ムクロジ、メリッサ、メリロート、ボケ(木瓜)、モヤシ、モモ(桃仁、桃葉)、ヒオウギ(射干)、ビンロウジュ(檳ロウ子)、メハジキ(益母草)、ヤグルマギク、ユキノシタ(虎耳草)、ヤマモモ(楊梅皮)、ヤシャブシ(矢車)、ハトムギ(ヨクイニン)、モウコヨモギ、ヤマヨモギ、ラベンダー、リンゴ果実、マンネンタケ(霊芝)、レモン果実、レンギョウ(連翹)、レンゲソウ、ゲンノショウコ(老鸛草)、ハシリドコロ(ロート根)、鶏トサカ、牛・人の胎盤抽出物、豚・牛の胃、十二指腸、或いは腸の抽出物若しくはその分解物、水溶性コラーゲン、水溶性コラーゲン誘導体、コラーゲン加水分解物、エラスチン、エラスチン加水分解物、水溶性エラスチン誘導体、シルク蛋白、シルク蛋白分解物、牛血球蛋白分解物などを挙げることができる。
微生物培養代謝物として、酵母エキス、亜鉛含有酵母エキス、ゲルマニウム含有酵母エキス、セレン含有酵母エキス、マグネシウム含有酵母エキス、米醗酵エキス、ユーグレナ抽出物、脱脂粉乳の乳酸発酵物などを挙げることができる。
α-ヒドロキシ酸として、グリコール酸、クエン酸、リンゴ酸、酒石酸、乳酸などを挙げることができる。
無機顔料として、無水ケイ酸、ケイ酸マグネシウム、タルク、カオリン、ベントナイト、マイカ、雲母チタン、オキシ塩化ビスマス、酸化ジルコニウム、酸化マグネシウム、酸化亜鉛、酸化チタン、炭酸カルシウム、炭酸マグネシウム、黄酸化鉄、ベンガラ、黒酸化鉄、グンジョウ、酸化クロム、水酸化クロム、カーボンブラック、カラミンなどを挙げることができる。
紫外線吸収剤として、p-アミノ安息香酸誘導体、サルチル酸誘導体、アントラニル酸誘導体、クマリン誘導体、アミノ酸系化合物、ベンゾトリアゾール誘導体、テトラゾール誘導体、イミダゾリン誘導体、ピリミジン誘導体、ジオキサン誘導体、カンファー誘導体、フラン誘導体、ピロン誘導体、核酸誘導体、アラントイン誘導体、ニコチン酸誘導体、ビタミンB6誘導体、オキシベンゾン、ベンゾフェノン、グアイアズレン、シコニン、バイカリン、バイカレイン、ベルベリンなどを挙げることができる。
収斂剤として、乳酸、酒石酸、コハク酸、クエン酸、アラントイン、塩化亜鉛、硫酸亜鉛、酸化亜鉛、カラミン、p-フェノールスルホン酸亜鉛、硫酸アルミニウムカリウム、レソルシン、塩化第二鉄、タンニン酸などを挙げることができる。
抗酸化剤として、アスコルビン酸およびその塩、ステアリン酸エステル、トコフェロールおよびそのエステル誘導体、ノルジヒドログアセレテン酸、ブチルヒドロキシトルエン(BHT)、ブチルヒドロキシアニソール(BHA)、パラヒドロキシアニソール、没食子酸プロピル、セサモール、セサモリン、ゴシポールなどを挙げることができる。
抗炎症剤として、イクタモール、インドメタシン、カオリン、サリチル酸、サリチル酸ナトリウム、サリチル酸メチル、アセチルサリチル酸、塩酸ジフェンヒドラミン、dまたはdl-カンフル、ヒドロコルチゾン、グアイアズレン、カマズレン、マレイン酸クロルフェニラミン、グリチルリチン酸およびその塩、グリチルレチン酸およびその塩などを挙げることができる。
殺菌・消毒薬として、アクリノール、イオウ、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、塩化メチルロザニリン、クレゾール、グルコン酸カルシウム、グルコン酸クロルヘキシジン、スルファミン、マーキュロクロム、ラクトフェリンまたはその加水分解物などを挙げることができる。
頭髪用剤として、二硫化セレン、臭化アルキルイソキノリニウム液、ジンクピリチオン、ビフェナミン、チアントール、カスタリチンキ、ショウキョウチンキ、トウガラシチンキ、塩酸キニーネ、強アンモニア水、臭素酸カリウム、臭素酸ナトリウム、チオグリコール酸などを挙げることができる。
香料として、ジャコウ、シベット、カストリウム、アンバーグリスなどの天然動物性香料、アニス精油、アンゲリカ精油、イラン精油、イリス精油、ウイキョウ精油、オレンジ精油、カナンガ精油、カラウェー精油、カルダモン精油、グアヤクウッド精油、クミン精油、黒文字精油、ケイ皮精油、シンナモン精油、ゲラニウム精油、コパイババルサム精油、コリアンデル精油、シソ精油、シダーウッド精油、シトロネラ精油、ジャスミン精油、ジンジャーグラス精油、杉精油、スペアミント精油、西洋ハッカ精油、大茴香精油、チュベローズ精油、丁字精油、橙花精油、冬緑精油、トルーバルサム精油、バチュリー精油、バラ精油、パルマローザ精油、檜精油、ヒバ精油、白檀精油、プチグレン精油、ベイ精油、ベチバ精油、ベルガモット精油、ペルーバルサム精油、ボアドローズ精油、芳樟精油、マンダリン精油、ユーカリ精油、ライム精油、ラベンダー精油、リナロエ精油、レモングラス精油、レモン精油、ローズマリー精油、和種ハッカ精油などの植物性香料、その他合成香料などを挙げることができる。
色素・着色剤として、赤キャベツ色素、赤米色素、アカネ色素、アナトー色素、イカスミ色素、ウコン色素、エンジュ色素、オキアミ色素、柿色素、カラメル、金、銀、クチナシ色素、コーン色素、タマネギ色素、タマリンド色素、スピルリナ色素、ソバ全草色素、チェリー色素、海苔色素、ハイビスカス色素、ブドウ果汁色素、マリーゴールド色素、紫イモ色素、紫ヤマイモ色素、ラック色素、ルチンなどを挙げることができる。
甘味料として、砂糖、甘茶、果糖、アラビノース、ガラクトース、キシロース、マンノース、麦芽糖、蜂蜜、ブドウ糖、ミラクリン、モネリンなどを挙げることができる。
栄養強化剤として、貝殻焼成カルシウム、シアノコバラミン、酵母、小麦胚芽、大豆胚芽、卵黄粉末、ヘミセルロース、ヘム鉄などを挙げることができる。
その他、ホルモン類、金属イオン封鎖剤、pH調整剤、キレート剤、防腐・防バイ剤、清涼剤、安定化剤、乳化剤、動・植物性蛋白質およびその分解物、動・植物性多糖類およびその分解物、動・植物性糖蛋白質およびその分解物、血流促進剤、消炎剤・抗アレルギー剤、細胞賦活剤、角質溶解剤、創傷治療剤、増泡剤、増粘剤、口腔用剤、消臭・脱臭剤、苦味料、調味料、酵素などを挙げることができる。
<1.3.抗炎症剤の好適例>
本実施形態の抗炎症剤は、炎症性疾患の予防、改善または治療のために好適に用いることができる。炎症性疾患として、たとえば、関節炎、皮膚炎、炎症性腸疾患を挙げることができる。関節炎や皮膚炎として、たとえば、関節リウマチ、変形性関節症、乾癬、尋常性天疱瘡、アレルギー性接触皮膚炎、アトピー性皮膚炎、炎症性腸疾患を挙げることができる。炎症性腸疾患として、たとえば潰瘍性大腸炎、クローン病、腸管ベーチェット病を挙げることができる。
本実施形態の抗炎症剤は、炎症性疾患の予防、改善または治療のために好適に用いることができる。炎症性疾患として、たとえば、関節炎、皮膚炎、炎症性腸疾患を挙げることができる。関節炎や皮膚炎として、たとえば、関節リウマチ、変形性関節症、乾癬、尋常性天疱瘡、アレルギー性接触皮膚炎、アトピー性皮膚炎、炎症性腸疾患を挙げることができる。炎症性腸疾患として、たとえば潰瘍性大腸炎、クローン病、腸管ベーチェット病を挙げることができる。
<1.4.皮膚外用組成物の好適例>
本実施形態の皮膚外用組成物は、たとえば、医薬品、医薬部外品、化粧品として好適に用いることができる。それらの例として、化粧水、乳液、クリーム、軟膏、ローション、オイル、パックなどの基礎化粧料、洗顔料、皮膚洗浄料、シャンプー、リンス、ヘアートリートメント、ヘアクリーム、ポマード、ヘアスプレー、整髪料、パーマ剤、ヘアートニック、染毛料、育毛・養毛料などの頭髪化粧料、ファンデーション、白粉、おしろい、口紅、頬紅、アイシャドウ、アイライナー、マスカラ、眉墨、まつ毛などのメークアップ化粧料、美爪料などの仕上げ用化粧料などを挙げることができる。これに加えて、香水類、浴用剤、歯磨き類、口中清涼剤・含嗽剤、液臭・防臭防止剤、衛生用品、衛生綿類、ウエットティシュ、皮膚外用剤(具体的には医薬品としての皮膚外用剤)などを挙げることもできる。
本実施形態の皮膚外用組成物は、たとえば、医薬品、医薬部外品、化粧品として好適に用いることができる。それらの例として、化粧水、乳液、クリーム、軟膏、ローション、オイル、パックなどの基礎化粧料、洗顔料、皮膚洗浄料、シャンプー、リンス、ヘアートリートメント、ヘアクリーム、ポマード、ヘアスプレー、整髪料、パーマ剤、ヘアートニック、染毛料、育毛・養毛料などの頭髪化粧料、ファンデーション、白粉、おしろい、口紅、頬紅、アイシャドウ、アイライナー、マスカラ、眉墨、まつ毛などのメークアップ化粧料、美爪料などの仕上げ用化粧料などを挙げることができる。これに加えて、香水類、浴用剤、歯磨き類、口中清涼剤・含嗽剤、液臭・防臭防止剤、衛生用品、衛生綿類、ウエットティシュ、皮膚外用剤(具体的には医薬品としての皮膚外用剤)などを挙げることもできる。
なお、本実施形態の皮膚外用組成物の製剤形態も、適宜設定できることはもちろんである。製剤形態として、たとえば、粉末状、顆粒状、固形状、液状、ゲル状、気泡状、乳液状、クリーム状、軟膏状、シート状、ムース状を挙げることができる。
本実施形態の皮膚外用組成物は、炎症性疾患の予防、改善または治療のために好適に用いることができる。炎症性疾患として、たとえば、関節炎、皮膚炎を挙げることができる。とりわけ、TNF-αの過剰産生に起因する炎症性疾患、たとえば、関節リウマチ、変形性関節症、乾癬、尋常性天疱瘡、アレルギー性接触皮膚炎、アトピー性皮膚炎の予防、改善または治療のために特に好適に用いることができる。
<1.5.飲食品組成物の好適例>
本実施形態の飲食品組成物は、たとえば、一般食品であってもよく、保健機能食品(たとえば特定保健用食品、機能性表示食品、栄養機能食品)であってもよい。なかでも、保健機能食品であることが好ましい。
本実施形態の飲食品組成物は、たとえば、一般食品であってもよく、保健機能食品(たとえば特定保健用食品、機能性表示食品、栄養機能食品)であってもよい。なかでも、保健機能食品であることが好ましい。
本実施形態の飲食品組成物は、炎症性腸疾患の予防、改善または治療のために好適に用いることができる。炎症性腸疾患として、たとえば潰瘍性大腸炎、クローン病、腸管ベーチェット病を挙げることができる。
以下、本発明を実施例でさらに詳細に説明するが、本発明はその要旨を超えない限り、以下の実施例に限定されるものではない。
<1.大豆胚芽抽出物の調製>
大豆胚芽抽出物は、特許第5018171号公報の発明の詳細な説明の欄に記載された実施例3の方法で得た。具体的には、100gの大豆胚芽(フォーユー社製)に、500mLの5%過塩素酸水溶液を加えて室温下で1時間放置した。その後、ポリフェノール吸着剤であるポリクラールVT(ISP社製)を16g添加し、ブレンダーミキサーで大豆胚芽を十分に破砕後、室温下で30分間放置して酸性条件下で抽出した。破砕物を2℃・22,000×gで20分間遠心分離して液体画分を採取し、30%の水酸化ナトリウム溶液で中性となるように中和した。中和後の液体画分について、電気透析装置(アシライザー、アストム社製)により脱塩をおこなったうえで凍結乾燥した。このようにして得られた粉末、すなわち大豆胚芽抽出物の粉末を種々の評価に用いた。
なお、大豆胚芽抽出物中のプトレシンや、スペルミジン、スペルミンの量も求めた。これらの量を求めるために、100gの大豆胚芽(フォーユー社製)に希釈内部標準液(1,7-diaminoheptane、内部標準量=1200nmol)、および500mLの5%過塩素酸水溶液を加えて室温下で1時間放置した。その後、ポリフェノール吸着剤であるポリクラールVT(ISP社製)を16g添加し、ブレンダーミキサーで大豆胚芽を十分に破砕後、室温下で30分間放置して酸性条件下で抽出した。破砕物を2℃・22,000×gで20分間遠心分離して液体画分を採取し、30%の水酸化ナトリウム溶液で中性となるように中和した。中和後の液体画分を用いて、特許第5018171号公報の発明の詳細な説明の欄に記載された方法でプトレシンや、スペルミジン、スペルミンの量を求めた。プトレシン、スペルミジン、およびスペルミンについて大豆胚芽抽出物中には、プトレシンが23.5mg、スペルミジンが24.0mg、スペルミンが9.6mg含まれており、これらは合計で57.1mgであった。
大豆胚芽抽出物は、特許第5018171号公報の発明の詳細な説明の欄に記載された実施例3の方法で得た。具体的には、100gの大豆胚芽(フォーユー社製)に、500mLの5%過塩素酸水溶液を加えて室温下で1時間放置した。その後、ポリフェノール吸着剤であるポリクラールVT(ISP社製)を16g添加し、ブレンダーミキサーで大豆胚芽を十分に破砕後、室温下で30分間放置して酸性条件下で抽出した。破砕物を2℃・22,000×gで20分間遠心分離して液体画分を採取し、30%の水酸化ナトリウム溶液で中性となるように中和した。中和後の液体画分について、電気透析装置(アシライザー、アストム社製)により脱塩をおこなったうえで凍結乾燥した。このようにして得られた粉末、すなわち大豆胚芽抽出物の粉末を種々の評価に用いた。
なお、大豆胚芽抽出物中のプトレシンや、スペルミジン、スペルミンの量も求めた。これらの量を求めるために、100gの大豆胚芽(フォーユー社製)に希釈内部標準液(1,7-diaminoheptane、内部標準量=1200nmol)、および500mLの5%過塩素酸水溶液を加えて室温下で1時間放置した。その後、ポリフェノール吸着剤であるポリクラールVT(ISP社製)を16g添加し、ブレンダーミキサーで大豆胚芽を十分に破砕後、室温下で30分間放置して酸性条件下で抽出した。破砕物を2℃・22,000×gで20分間遠心分離して液体画分を採取し、30%の水酸化ナトリウム溶液で中性となるように中和した。中和後の液体画分を用いて、特許第5018171号公報の発明の詳細な説明の欄に記載された方法でプトレシンや、スペルミジン、スペルミンの量を求めた。プトレシン、スペルミジン、およびスペルミンについて大豆胚芽抽出物中には、プトレシンが23.5mg、スペルミジンが24.0mg、スペルミンが9.6mg含まれており、これらは合計で57.1mgであった。
<2.小麦胚芽抽出物の調製>
小麦胚芽抽出物は、特許第5018171号公報の発明の詳細な説明の欄に記載された実施例4の方法で得た。具体的には、100gの小麦胚芽(培焼・ローストタイプ、日清ファルマ社製)に、500mLの5%過塩素酸水溶液を加えて室温下で1時間放置した。その後、ポリフェノール吸着剤であるポリクラールVT(ISP社製)を16g添加し、ブレンダーミキサーで小麦胚芽を十分に破砕後、室温下で30分間放置して酸性条件下で抽出した。破砕物を2℃・22,000×gで20分間遠心分離して液体画分を採取し、30%の水酸化ナトリウム溶液で中性となるように中和した。中和後の液体画分について、電気透析装置(アシライザー、アストム社製)により脱塩をおこなった。脱塩後の小麦胚芽抽出物液(以下、「液体品」と言うことがある。)を種々の評価に用いた。
なお、小麦胚芽抽出物中のプトレシンや、スペルミジン、スペルミンの量も求めた。これらの量を求めるために、100gの小麦胚芽(培焼・ローストタイプ,日清ファルマ社製)に希釈内部標準液(1,7-diaminoheptane、内部標準量=1200nmol)、および500mLの5%過塩素酸水溶液を加えて室温下で1時間放置した。その後、ポリフェノール吸着剤であるポリクラールVT(ISP社製)を16g添加し、ブレンダーミキサーで小麦胚芽を十分に破砕後、室温下で30分間放置して酸性条件下で抽出した。破砕物を2℃・22,000×gで20分間遠心分離して液体画分を採取し、30%の水酸化ナトリウム溶液で中性となるように中和した。中和後の液体画分を用いて、特許第5018171号公報の発明の詳細な説明の欄に記載された方法でプトレシンや、スペルミジン、スペルミンの量を求めた。プトレシン、スペルミジン、およびスペルミンについて小麦胚芽抽出物中には、プトレシンが6.4mg、スペルミジンが23.9mg、スペルミンが14.3mg含まれており、これらは合計で44.6mgであった。
小麦胚芽抽出物は、特許第5018171号公報の発明の詳細な説明の欄に記載された実施例4の方法で得た。具体的には、100gの小麦胚芽(培焼・ローストタイプ、日清ファルマ社製)に、500mLの5%過塩素酸水溶液を加えて室温下で1時間放置した。その後、ポリフェノール吸着剤であるポリクラールVT(ISP社製)を16g添加し、ブレンダーミキサーで小麦胚芽を十分に破砕後、室温下で30分間放置して酸性条件下で抽出した。破砕物を2℃・22,000×gで20分間遠心分離して液体画分を採取し、30%の水酸化ナトリウム溶液で中性となるように中和した。中和後の液体画分について、電気透析装置(アシライザー、アストム社製)により脱塩をおこなった。脱塩後の小麦胚芽抽出物液(以下、「液体品」と言うことがある。)を種々の評価に用いた。
なお、小麦胚芽抽出物中のプトレシンや、スペルミジン、スペルミンの量も求めた。これらの量を求めるために、100gの小麦胚芽(培焼・ローストタイプ,日清ファルマ社製)に希釈内部標準液(1,7-diaminoheptane、内部標準量=1200nmol)、および500mLの5%過塩素酸水溶液を加えて室温下で1時間放置した。その後、ポリフェノール吸着剤であるポリクラールVT(ISP社製)を16g添加し、ブレンダーミキサーで小麦胚芽を十分に破砕後、室温下で30分間放置して酸性条件下で抽出した。破砕物を2℃・22,000×gで20分間遠心分離して液体画分を採取し、30%の水酸化ナトリウム溶液で中性となるように中和した。中和後の液体画分を用いて、特許第5018171号公報の発明の詳細な説明の欄に記載された方法でプトレシンや、スペルミジン、スペルミンの量を求めた。プトレシン、スペルミジン、およびスペルミンについて小麦胚芽抽出物中には、プトレシンが6.4mg、スペルミジンが23.9mg、スペルミンが14.3mg含まれており、これらは合計で44.6mgであった。
<3.抗炎症作用の評価手順の概要>
マクロファージは、体内で免疫システムの司令塔として重要な役割を担うところ、マクロファージは、状況に応じて攻撃モード(M1)/修復モード(M2)に分極する。
試料(たとえば大豆胚芽抽出物、小麦胚芽抽出物)の添加によって、M1マクロファージから分泌される炎症性サイトカイン(たとえばTNF-α)の産生が抑制された場合、その試料が抗炎症作用を有する、と評価することができる。試料の添加によって、M2マクロファージから分泌される抗炎症性サイトカイン(たとえばIL-10)の産生が促進された場合、その試料が抗炎症作用を有する、とより心強く評価することができる。なお、マクロファージの分極モードはM1とM2とにはっきり分けられる訳ではなく、M1とM2との間に連続的なバリエーションがあると言われている。ちなみに、以下では、M1マクロファージを「マクロファージ(M1)」と言うことがある。M2マクロファージを「マクロファージ(M2)」と言うことがある。
ここでは、TNF-α産生量の評価手順の概要を説明する。なぜなら、後述する実施例の多くで、TNF-α産生量を指標に抗炎症作用を評価したためである。
マクロファージは、体内で免疫システムの司令塔として重要な役割を担うところ、マクロファージは、状況に応じて攻撃モード(M1)/修復モード(M2)に分極する。
試料(たとえば大豆胚芽抽出物、小麦胚芽抽出物)の添加によって、M1マクロファージから分泌される炎症性サイトカイン(たとえばTNF-α)の産生が抑制された場合、その試料が抗炎症作用を有する、と評価することができる。試料の添加によって、M2マクロファージから分泌される抗炎症性サイトカイン(たとえばIL-10)の産生が促進された場合、その試料が抗炎症作用を有する、とより心強く評価することができる。なお、マクロファージの分極モードはM1とM2とにはっきり分けられる訳ではなく、M1とM2との間に連続的なバリエーションがあると言われている。ちなみに、以下では、M1マクロファージを「マクロファージ(M1)」と言うことがある。M2マクロファージを「マクロファージ(M2)」と言うことがある。
ここでは、TNF-α産生量の評価手順の概要を説明する。なぜなら、後述する実施例の多くで、TNF-α産生量を指標に抗炎症作用を評価したためである。
<3.1.使用した細胞や試薬など>
細胞:ヒト急性単球性白血病由来細胞株(THP-1)
継代数:P10以下
継代時の播種密度・培養日数:0.5×106cells/dish~2.0×106cells/dishで2~4日間培養
継代時直前の細胞コンフルエンス:60%~80%
培地:RPMI1640(+L-Glutamine)(11875-119,gibco)(特に記載がない限り、10%FBS、および1%Penicillin-Streptmycin含有)
PMA:ホルボール12‐ミリスタート13‐アセタート(P8139-1MG,SIGMA)
LPS:LPS(L6529-1MG,SIGMA)
TNF-α:TNF-α測定のために次のキットを使用した。
DuoSet ELISA development system Human TNF-α (DY210-05,R&D systems)
DuoSet Ancillary Reagent Kit2 (DY008,R&D systems)
細胞:ヒト急性単球性白血病由来細胞株(THP-1)
継代数:P10以下
継代時の播種密度・培養日数:0.5×106cells/dish~2.0×106cells/dishで2~4日間培養
継代時直前の細胞コンフルエンス:60%~80%
培地:RPMI1640(+L-Glutamine)(11875-119,gibco)(特に記載がない限り、10%FBS、および1%Penicillin-Streptmycin含有)
PMA:ホルボール12‐ミリスタート13‐アセタート(P8139-1MG,SIGMA)
LPS:LPS(L6529-1MG,SIGMA)
TNF-α:TNF-α測定のために次のキットを使用した。
DuoSet ELISA development system Human TNF-α (DY210-05,R&D systems)
DuoSet Ancillary Reagent Kit2 (DY008,R&D systems)
<3.2.手順>
(1)マクロファージ(M0)への分極誘導
10cmディッシュで培養したTHP-1細胞培養液を50mL遠心チューブへ移し、遠心により細胞を回収した。上清除去後、培地適量で懸濁し、細胞計数をおこなった。先に調製しておいたM0誘導用培地(20ng/mL PMA含有培地)で5×105cells/mLの細胞懸濁液を調製し、48ウェルプレートへ400μL/well(2.0×105cells/well)へ播種し、CO2インキュベーター(37℃,5.0%)内で16時間培養した。
(2)マクロファージ(M1)への分極誘導
(1)の48ウェルプレートを取り出し、顕微鏡で細胞が接着していることを確認後、RPMI1640に400μL/wellで培地交換し、PMAを除去した。CO2インキュベーター(37℃,5.0%)内で4時間以上インキュベート後、M1誘導用培地(80ng/mL LPS含有培地)に400μL/wellで培地交換し、CO2インキュベーター(37℃,5.0%)内で20~22時間培養した。
(3)試料添加
M1誘導用培地を必要量調製したのち、これに試料(たとえば、大豆胚芽抽出物、小麦胚芽抽出物)を混合した。これによって試料含有M1誘導用培地を得た。試料含有M1誘導用培地に400μL/wellで培地交換してCO2インキュベーター(37℃,5.0%)内で培養を開始した。
(4)培養上清回収・液性因子の測定
(3)で培養開始後、6時間後に培養上清を回収し、-80℃フリーザーへ保存した。後日解凍して、培養上清中のTNF-α濃度を、キットのプロトコルにしたがって測定した。
(1)マクロファージ(M0)への分極誘導
10cmディッシュで培養したTHP-1細胞培養液を50mL遠心チューブへ移し、遠心により細胞を回収した。上清除去後、培地適量で懸濁し、細胞計数をおこなった。先に調製しておいたM0誘導用培地(20ng/mL PMA含有培地)で5×105cells/mLの細胞懸濁液を調製し、48ウェルプレートへ400μL/well(2.0×105cells/well)へ播種し、CO2インキュベーター(37℃,5.0%)内で16時間培養した。
(2)マクロファージ(M1)への分極誘導
(1)の48ウェルプレートを取り出し、顕微鏡で細胞が接着していることを確認後、RPMI1640に400μL/wellで培地交換し、PMAを除去した。CO2インキュベーター(37℃,5.0%)内で4時間以上インキュベート後、M1誘導用培地(80ng/mL LPS含有培地)に400μL/wellで培地交換し、CO2インキュベーター(37℃,5.0%)内で20~22時間培養した。
(3)試料添加
M1誘導用培地を必要量調製したのち、これに試料(たとえば、大豆胚芽抽出物、小麦胚芽抽出物)を混合した。これによって試料含有M1誘導用培地を得た。試料含有M1誘導用培地に400μL/wellで培地交換してCO2インキュベーター(37℃,5.0%)内で培養を開始した。
(4)培養上清回収・液性因子の測定
(3)で培養開始後、6時間後に培養上清を回収し、-80℃フリーザーへ保存した。後日解凍して、培養上清中のTNF-α濃度を、キットのプロトコルにしたがって測定した。
<4.実施例1_大豆胚芽抽出物の抗炎症作用>
大豆胚芽抽出物が、抗炎症作用を有するかどうかを調べるために、大豆胚芽抽出物が、TNF-αの産生抑制作用を有するかどうかを調べた。
<4.1.使用した細胞や試薬など>
「3.抗炎症作用の評価手順の概要」に記載した通り。
大豆胚芽抽出物が、抗炎症作用を有するかどうかを調べるために、大豆胚芽抽出物が、TNF-αの産生抑制作用を有するかどうかを調べた。
<4.1.使用した細胞や試薬など>
「3.抗炎症作用の評価手順の概要」に記載した通り。
<4.2.手順>
(1)マクロファージ(M0)への分極誘導
「3.抗炎症作用の評価手順の概要」に記載した通り。
(2)マクロファージ(M1)への分極誘導
「3.抗炎症作用の評価手順の概要」に記載した通り。
(3)試料添加
M1誘導用培地を必要量調製したのち、大豆胚芽抽出物を終濃度0.0001w/v%~0.2w/v%となるようにM1誘導用培地に添加(各条件n=3)し、400μL/wellで培地交換してCO2インキュベーター(37℃,5.0%)内で培養を開始した。コントロールとして、M0分極誘導後にLPSを全く添加しない条件(以下、「-LPS」と言うことがある。)と、試料として大塚蒸留水またはPBSを用いた条件(以下、「Control」と言うことがある。)とを設定した。
(4)培養上清回収・液性因子の測定
(3)で培養開始後、6時間後に培養上清を回収し、-80℃フリーザーへ保存した。後日解凍して、培養上清中のTNF-α濃度を、キットのプロトコルにしたがって測定した。
(1)マクロファージ(M0)への分極誘導
「3.抗炎症作用の評価手順の概要」に記載した通り。
(2)マクロファージ(M1)への分極誘導
「3.抗炎症作用の評価手順の概要」に記載した通り。
(3)試料添加
M1誘導用培地を必要量調製したのち、大豆胚芽抽出物を終濃度0.0001w/v%~0.2w/v%となるようにM1誘導用培地に添加(各条件n=3)し、400μL/wellで培地交換してCO2インキュベーター(37℃,5.0%)内で培養を開始した。コントロールとして、M0分極誘導後にLPSを全く添加しない条件(以下、「-LPS」と言うことがある。)と、試料として大塚蒸留水またはPBSを用いた条件(以下、「Control」と言うことがある。)とを設定した。
(4)培養上清回収・液性因子の測定
(3)で培養開始後、6時間後に培養上清を回収し、-80℃フリーザーへ保存した。後日解凍して、培養上清中のTNF-α濃度を、キットのプロトコルにしたがって測定した。
図1に示すように、大豆胚芽抽出物によってTNF-αの産生が抑制された。具体的には、0.001w/v%という低濃度で、TNF-αの産生が抑制された。なお、大豆胚芽抽出物の濃度が高いほど、TNF-αの産生量が低かった。
<5.実施例2_大豆胚芽抽出物の限外ろ過分画>
大豆胚芽抽出物を、分子量の違いで簡易的に分画するために限外ろ過をおこなった。具体的には、2w/v%大豆胚芽抽出物溶液3mLを、限外ろ過チューブのポアサイズの大きい順(100kDa→50kDa→30kDa→10kDa→3kDa cut off)に濃縮操作をおこなっていき、分子量の違いで分画した。具体的には、3kDa未満画分、3kDa~10kDa画分、10kDa~30kDa画分、30kDa~50kDa画分、50kDa~100kDa画分、および100kDa以上画分に分画した。なお、各分画は、生理食塩水で3回洗浄後、最終的に生理食塩水で元の液量(すなわち3mL)に戻し、培養実験で使用する液量を各画分でそろえた。使用した限外ろ過チューブおよび遠心機、遠心条件は以下の通りである。
限外ろ過チューブ:“Amicon Ultra” Centrifugal Filters Ultracel(登録商標)の100K(UFC910024)、50K(UFC805096)、30K(UFC903008)、10K(UFC901024)、および3K(UFC800324)
遠心機:CR21F(HITACHI)
遠心条件:6,000rpm,4℃
大豆胚芽抽出物を、分子量の違いで簡易的に分画するために限外ろ過をおこなった。具体的には、2w/v%大豆胚芽抽出物溶液3mLを、限外ろ過チューブのポアサイズの大きい順(100kDa→50kDa→30kDa→10kDa→3kDa cut off)に濃縮操作をおこなっていき、分子量の違いで分画した。具体的には、3kDa未満画分、3kDa~10kDa画分、10kDa~30kDa画分、30kDa~50kDa画分、50kDa~100kDa画分、および100kDa以上画分に分画した。なお、各分画は、生理食塩水で3回洗浄後、最終的に生理食塩水で元の液量(すなわち3mL)に戻し、培養実験で使用する液量を各画分でそろえた。使用した限外ろ過チューブおよび遠心機、遠心条件は以下の通りである。
限外ろ過チューブ:“Amicon Ultra” Centrifugal Filters Ultracel(登録商標)の100K(UFC910024)、50K(UFC805096)、30K(UFC903008)、10K(UFC901024)、および3K(UFC800324)
遠心機:CR21F(HITACHI)
遠心条件:6,000rpm,4℃
<6.実施例3_大豆胚芽抽出物の限外ろ過画分の抗炎症作用>
どの画分が、TNF-αの産生抑制作用を有するのかを調べた。
<6.1.使用した細胞や試薬など>
「3.抗炎症作用の評価手順の概要」に記載した通り。
どの画分が、TNF-αの産生抑制作用を有するのかを調べた。
<6.1.使用した細胞や試薬など>
「3.抗炎症作用の評価手順の概要」に記載した通り。
<6.2.手順>
(1)マクロファージ(M0)への分極誘導
「3.抗炎症作用の評価手順の概要」に記載した通り。
(2)マクロファージ(M1)への分極誘導
「3.抗炎症作用の評価手順の概要」に記載した通り。
(3)試料添加
M1誘導用培地を必要量調製したのち、実施例2で調製した大豆胚芽抽出物限外ろ過画分(2w/v%分)が1/20量となるように、大豆胚芽抽出物限外ろ過画分をM1誘導用培地に添加(終濃度0.1w/v%分、各条件n=3)し、400μL/wellで培地交換してCO2インキュベーター(37℃,5.0%)内で培養を開始した。大豆胚芽抽出物を終濃度0.1w/v%となるように添加した条件も設定した。コントロールとして、M0分極誘導後にLPSを全く添加しない条件(すなわち-LPS)と、試料として大塚蒸留水またはPBSを用いた条件(すなわちControl)とを設定した。
(4)培養上清回収・液性因子の測定
(3)で培養開始後、6時間後に培養上清を回収し、-80℃フリーザーへ保存した。後日解凍して、培養上清中のTNF-α濃度を、キットのプロトコルにしたがって測定した。
(1)マクロファージ(M0)への分極誘導
「3.抗炎症作用の評価手順の概要」に記載した通り。
(2)マクロファージ(M1)への分極誘導
「3.抗炎症作用の評価手順の概要」に記載した通り。
(3)試料添加
M1誘導用培地を必要量調製したのち、実施例2で調製した大豆胚芽抽出物限外ろ過画分(2w/v%分)が1/20量となるように、大豆胚芽抽出物限外ろ過画分をM1誘導用培地に添加(終濃度0.1w/v%分、各条件n=3)し、400μL/wellで培地交換してCO2インキュベーター(37℃,5.0%)内で培養を開始した。大豆胚芽抽出物を終濃度0.1w/v%となるように添加した条件も設定した。コントロールとして、M0分極誘導後にLPSを全く添加しない条件(すなわち-LPS)と、試料として大塚蒸留水またはPBSを用いた条件(すなわちControl)とを設定した。
(4)培養上清回収・液性因子の測定
(3)で培養開始後、6時間後に培養上清を回収し、-80℃フリーザーへ保存した。後日解凍して、培養上清中のTNF-α濃度を、キットのプロトコルにしたがって測定した。
図2に示すように、3kDa未満の画分でのみ、TNF-αの産生がはっきりと抑制された。他の画分、たとえば3kDa~10kDa画分でも、TNF-αの産生がいくらか抑制されたものの、これは、たとえば3kDa~10kDa画分に、3kDa未満の成分がいくらか残留したためであると考えられる。このたびの結果から、大豆胚芽抽出物中の3kDa未満の成分によって、TNF-α産生抑制作用が発揮されている、と考えられる。
<7.実施例4_小麦胚芽抽出物の限外ろ過画分の抗炎症作用>
小麦胚芽抽出物もTNF-αの産生抑制作用を有するのか、もしそれを有するとすれば、どの画分がそれを有するのか、有効な画分(すなわち、TNF-αの産生抑制作用を有する画分)が、小麦胚芽抽出物と大豆胚芽抽出物とで異なるのかを調べた。
<7.1.使用した細胞や試薬など>
「3.抗炎症作用の評価手順の概要」に記載した通り。
小麦胚芽抽出物もTNF-αの産生抑制作用を有するのか、もしそれを有するとすれば、どの画分がそれを有するのか、有効な画分(すなわち、TNF-αの産生抑制作用を有する画分)が、小麦胚芽抽出物と大豆胚芽抽出物とで異なるのかを調べた。
<7.1.使用した細胞や試薬など>
「3.抗炎症作用の評価手順の概要」に記載した通り。
<7.2.手順>
(1)小麦胚芽抽出物の限外ろ過画分の調製
小麦胚芽抽出物(液体品)を実施例2と同様の方法で限外ろ過し、分子量の違いで簡易的に分画した。具体的には、3kDa未満画分、3kDa~10kDa画分、10kDa~30kDa画分、30kDa~50kDa画分、50kDa~100kDa画分、および100kDa以上画分に分画した。
(2)マクロファージ(M0)への分極誘導
「3.抗炎症作用の評価手順の概要」に記載した通り。
(3)マクロファージ(M1)への分極誘導
「3.抗炎症作用の評価手順の概要」に記載した通り。
(4)試料添加
M1誘導用培地を必要量調製したのち、(1)で調製した小麦胚芽抽出物限外ろ過画分が1/40量となるように、小麦胚芽抽出物限外ろ過画分をM1誘導用培地に添加(終濃度2.5v/v%分、各条件n=3)し、400μL/wellで培地交換してCO2インキュベーター(37℃,5.0%)内で培養を開始した。小麦胚芽抽出物(液体品)を終濃度2.5v/v%となるようにM1誘導用培地に添加した条件も設定した。コントロールとして、M0分極誘導後にLPSを全く添加しない条件(すなわち-LPS)と、試料として大塚蒸留水またはPBSを用いた条件(Control)とを設定した。
(5)培養上清回収・液性因子の測定
(4)で培養開始後、6時間後に培養上清を回収し、-80℃フリーザーへ保存した。後日解凍して、培養上清中のTNF-α濃度を、キットのプロトコルにしたがって測定した。
(1)小麦胚芽抽出物の限外ろ過画分の調製
小麦胚芽抽出物(液体品)を実施例2と同様の方法で限外ろ過し、分子量の違いで簡易的に分画した。具体的には、3kDa未満画分、3kDa~10kDa画分、10kDa~30kDa画分、30kDa~50kDa画分、50kDa~100kDa画分、および100kDa以上画分に分画した。
(2)マクロファージ(M0)への分極誘導
「3.抗炎症作用の評価手順の概要」に記載した通り。
(3)マクロファージ(M1)への分極誘導
「3.抗炎症作用の評価手順の概要」に記載した通り。
(4)試料添加
M1誘導用培地を必要量調製したのち、(1)で調製した小麦胚芽抽出物限外ろ過画分が1/40量となるように、小麦胚芽抽出物限外ろ過画分をM1誘導用培地に添加(終濃度2.5v/v%分、各条件n=3)し、400μL/wellで培地交換してCO2インキュベーター(37℃,5.0%)内で培養を開始した。小麦胚芽抽出物(液体品)を終濃度2.5v/v%となるようにM1誘導用培地に添加した条件も設定した。コントロールとして、M0分極誘導後にLPSを全く添加しない条件(すなわち-LPS)と、試料として大塚蒸留水またはPBSを用いた条件(Control)とを設定した。
(5)培養上清回収・液性因子の測定
(4)で培養開始後、6時間後に培養上清を回収し、-80℃フリーザーへ保存した。後日解凍して、培養上清中のTNF-α濃度を、キットのプロトコルにしたがって測定した。
図3に示すように、小麦胚芽抽出物でもTNF-αの産生が抑制された。そのうえ、小麦胚芽抽出物でも3kDa未満の画分で、TNF-αの産生が抑制された。これらの結果から、TNF-α産生抑制作用は、分子量3kDa未満であり、かつ、大豆胚芽と小麦胚芽との共通物質によって発揮されている可能性が高い、と考えられる。
<8.実施例5_大豆胚芽抽出物および小麦胚芽抽出物の1kDa未満画分の抗炎症作用>
TNF-α産生抑制作用を示す成分をいっそう絞り込むために、大豆胚芽抽出物の3kDa未満画分を、1kDa未満画分と、1kDa~3kDa画分とに分けたうえで、どちらの画分が、TNF-αの産生抑制作用を有するのかを調べた。小麦胚芽抽出物についても、どちらの画分が、TNF-αの産生抑制作用を有するのかを調べた。
TNF-α産生抑制作用を示す成分をいっそう絞り込むために、大豆胚芽抽出物の3kDa未満画分を、1kDa未満画分と、1kDa~3kDa画分とに分けたうえで、どちらの画分が、TNF-αの産生抑制作用を有するのかを調べた。小麦胚芽抽出物についても、どちらの画分が、TNF-αの産生抑制作用を有するのかを調べた。
<8.1.使用した細胞や試薬など>
「3.抗炎症作用の評価手順の概要」に記載した通り。
「3.抗炎症作用の評価手順の概要」に記載した通り。
<8.2.手順>
(1)1kDa未満画分、および1kDa~3kDa画分の調製
実施例2の方法に準じて、1kDa cut offの限外ろ過チューブ(Microsep Advance with 1K Omega,MCP001C41,Pall)を用いて、大豆胚芽抽出物の3kDa未満画分を、1kDa未満画分と、1kDa~3kDa画分とに分画した。同じように、小麦胚芽抽出物の3kDa未満画分も、1kDa未満画分と、1kDa~3kDa画分とに分画した。
(2)マクロファージ(M0)への分極誘導
「3.抗炎症作用の評価手順の概要」に記載した通り。
(3)マクロファージ(M1)への分極誘導
「3.抗炎症作用の評価手順の概要」に記載した通り。
(4)試料添加
M1誘導用培地を必要量調製したのち、(1)で調製した2w/v%分大豆胚芽抽出物(1kDa未満画分、1kDa~3kDa画分)が1/100量となるように、2w/v%分大豆胚芽抽出物をM1誘導用培地に添加(終濃度0.02w/v%分、各条件n=3)した。いっぽう、小麦胚芽抽出物(1kDa未満画分、1kDa~3kDa画分)が1/40量となるように、小麦胚芽抽出物をM1誘導用培地に添加(終濃度2.5v/v%分、各条件n=3)した。これらを用いて400μL/wellで培地交換してCO2インキュベーター(37℃,5.0%)内で培養を開始した。大豆胚芽抽出物を終濃度0.02w/v%となるように添加した条件、大豆胚芽抽出物3kDa未満画分を終濃度0.02w/v%分となるようにM1誘導用培地に添加した条件、小麦胚芽抽出物3kDa未満画分を終濃度2.5v/v%分となるようにM1誘導用培地に添加した条件も設定した。コントロールとして、M0分極誘導後にLPSを全く添加しない条件(すなわち-LPS)と、試料として大塚蒸留水またはPBSを用いた条件(すなわちControl)とを設定した。
(5)培養上清回収・液性因子の測定
(4)で培養開始後、6時間後に培養上清を回収し、-80℃フリーザーへ保存した。後日解凍して、培養上清中のTNF-α濃度を、キットのプロトコルにしたがって測定した。
(1)1kDa未満画分、および1kDa~3kDa画分の調製
実施例2の方法に準じて、1kDa cut offの限外ろ過チューブ(Microsep Advance with 1K Omega,MCP001C41,Pall)を用いて、大豆胚芽抽出物の3kDa未満画分を、1kDa未満画分と、1kDa~3kDa画分とに分画した。同じように、小麦胚芽抽出物の3kDa未満画分も、1kDa未満画分と、1kDa~3kDa画分とに分画した。
(2)マクロファージ(M0)への分極誘導
「3.抗炎症作用の評価手順の概要」に記載した通り。
(3)マクロファージ(M1)への分極誘導
「3.抗炎症作用の評価手順の概要」に記載した通り。
(4)試料添加
M1誘導用培地を必要量調製したのち、(1)で調製した2w/v%分大豆胚芽抽出物(1kDa未満画分、1kDa~3kDa画分)が1/100量となるように、2w/v%分大豆胚芽抽出物をM1誘導用培地に添加(終濃度0.02w/v%分、各条件n=3)した。いっぽう、小麦胚芽抽出物(1kDa未満画分、1kDa~3kDa画分)が1/40量となるように、小麦胚芽抽出物をM1誘導用培地に添加(終濃度2.5v/v%分、各条件n=3)した。これらを用いて400μL/wellで培地交換してCO2インキュベーター(37℃,5.0%)内で培養を開始した。大豆胚芽抽出物を終濃度0.02w/v%となるように添加した条件、大豆胚芽抽出物3kDa未満画分を終濃度0.02w/v%分となるようにM1誘導用培地に添加した条件、小麦胚芽抽出物3kDa未満画分を終濃度2.5v/v%分となるようにM1誘導用培地に添加した条件も設定した。コントロールとして、M0分極誘導後にLPSを全く添加しない条件(すなわち-LPS)と、試料として大塚蒸留水またはPBSを用いた条件(すなわちControl)とを設定した。
(5)培養上清回収・液性因子の測定
(4)で培養開始後、6時間後に培養上清を回収し、-80℃フリーザーへ保存した。後日解凍して、培養上清中のTNF-α濃度を、キットのプロトコルにしたがって測定した。
図4に示すように、大豆胚芽抽出物でも小麦胚芽抽出物でも、1kDa~3kDa画分ではTNF-αの産生が抑制されず、1kDa未満の画分でTNF-αの産生が抑制された。このたびの結果から、TNF-α産生抑制作用は、分子量1kDa未満であり、かつ、大豆胚芽と小麦胚芽との共通物質によって発揮されている可能性が高い、と考えられる。
<9.実施例6_オートクレーブ処理大豆胚芽抽出物の抗炎症作用>
TNF-α産生抑制作用を示す成分が、オートクレーブ処理によって失活するかどうか(すなわち熱失活するかどうか)を調べた。
TNF-α産生抑制作用を示す成分が、オートクレーブ処理によって失活するかどうか(すなわち熱失活するかどうか)を調べた。
<9.1.使用した細胞や試薬など>
「3.抗炎症作用の評価手順の概要」に記載した通り。
「3.抗炎症作用の評価手順の概要」に記載した通り。
<9.2.手順>
(1)大豆胚芽抽出物および大豆胚芽抽出物(3kDa未満画分)のオートクレーブ処理
2w/v%大豆胚芽抽出物を耐熱チューブに入れ、オートクレーブにかけた(121℃,15分)。実施例2で調製した2w/v%分大豆胚芽抽出物(3kDa未満画分)も耐熱チューブに入れ、オートクレーブにかけた(121℃,15分)。
(2)マクロファージ(M0)への分極誘導
「3.抗炎症作用の評価手順の概要」に記載した通り。
(3)マクロファージ(M1)への分極誘導
「3.抗炎症作用の評価手順の概要」に記載した通り。
(4)試料添加
M1誘導用培地を必要量調製したのち、(1)で調製した大豆胚芽抽出物のオートクレーブ処理物、および大豆胚芽抽出物(3kDa未満画分)のオートクレーブ処理物をそれぞれ終濃度0.01w/v%分となるようにM1誘導用培地に添加(各条件n=3)し、400μL/wellで培地交換してCO2インキュベーター(37℃,5.0%)内で培養を開始した。オートクレーブ前の大豆胚芽抽出物、およびオートクレーブ前の大豆胚芽抽出物(3kDa未満画分)を終濃度0.01w/v%分となるように添加した条件も設定した。コントロールとして、M0分極誘導後にLPSを全く添加しない条件(すなわち-LPS)、添加試料として大塚蒸留水またはPBSを用いた条件(すなわちControl)の2条件を設定した。
(5)培養上清回収・液性因子の測定
(4)で培養開始後、6時間後に培養上清を回収し、-80℃フリーザーへ保存した。後日解凍して、培養上清中のTNF-α濃度を、キットのプロトコルにしたがって測定した。
(1)大豆胚芽抽出物および大豆胚芽抽出物(3kDa未満画分)のオートクレーブ処理
2w/v%大豆胚芽抽出物を耐熱チューブに入れ、オートクレーブにかけた(121℃,15分)。実施例2で調製した2w/v%分大豆胚芽抽出物(3kDa未満画分)も耐熱チューブに入れ、オートクレーブにかけた(121℃,15分)。
(2)マクロファージ(M0)への分極誘導
「3.抗炎症作用の評価手順の概要」に記載した通り。
(3)マクロファージ(M1)への分極誘導
「3.抗炎症作用の評価手順の概要」に記載した通り。
(4)試料添加
M1誘導用培地を必要量調製したのち、(1)で調製した大豆胚芽抽出物のオートクレーブ処理物、および大豆胚芽抽出物(3kDa未満画分)のオートクレーブ処理物をそれぞれ終濃度0.01w/v%分となるようにM1誘導用培地に添加(各条件n=3)し、400μL/wellで培地交換してCO2インキュベーター(37℃,5.0%)内で培養を開始した。オートクレーブ前の大豆胚芽抽出物、およびオートクレーブ前の大豆胚芽抽出物(3kDa未満画分)を終濃度0.01w/v%分となるように添加した条件も設定した。コントロールとして、M0分極誘導後にLPSを全く添加しない条件(すなわち-LPS)、添加試料として大塚蒸留水またはPBSを用いた条件(すなわちControl)の2条件を設定した。
(5)培養上清回収・液性因子の測定
(4)で培養開始後、6時間後に培養上清を回収し、-80℃フリーザーへ保存した。後日解凍して、培養上清中のTNF-α濃度を、キットのプロトコルにしたがって測定した。
図5に示すように、オートクレーブ未処理の大豆胚芽抽出物(すなわち、オートクレーブ処理前の大豆胚芽抽出物)でも、オートクレーブ処理された大豆胚芽抽出物(すなわち、オートクレーブ処理後の大豆胚芽抽出物)でも同じようにTNF-αの産生が抑制された。このたびの結果によれば、TNF-α産生抑制作用を示す成分は耐熱性を有すると考えられる。
<10.実施例7_大豆胚芽抽出物のエタノール抽出画分の抗炎症作用(1)>
大豆胚芽抽出物粉末を、様々な濃度のエタノール水溶液でさらに抽出し、どの濃度のエタノール水溶液によって抽出された画分がTNF-α産生抑制作用を示すのかを調べ、それによって、TNF-α産生抑制作用を示す成分の水溶性の程度を評価した。
大豆胚芽抽出物粉末を、様々な濃度のエタノール水溶液でさらに抽出し、どの濃度のエタノール水溶液によって抽出された画分がTNF-α産生抑制作用を示すのかを調べ、それによって、TNF-α産生抑制作用を示す成分の水溶性の程度を評価した。
<10.1.大豆胚芽抽出物のエタノール抽出画分の調製(4w/v%分)>
大豆胚芽抽出物粉末0.2gを、エタノール水溶液(エタノール濃度50%、60%、70%、80%、90%、95%、100%)2mLに懸濁または溶解し、振とう機で攪拌(30回転/分、2~3時間、室温)した。遠心(13,000rpm,10分)により上清を回収後、再遠心(13,000rpm,10分)して再び上清を回収した。容器のフタを開け、溶媒をとばし(50℃,17時間)、蒸留水5mLに溶解後(すなわち、4w/v%分エタノール抽出画分を調製した後)、フィルター滅菌して-30℃で保存した。
大豆胚芽抽出物粉末0.2gを、エタノール水溶液(エタノール濃度50%、60%、70%、80%、90%、95%、100%)2mLに懸濁または溶解し、振とう機で攪拌(30回転/分、2~3時間、室温)した。遠心(13,000rpm,10分)により上清を回収後、再遠心(13,000rpm,10分)して再び上清を回収した。容器のフタを開け、溶媒をとばし(50℃,17時間)、蒸留水5mLに溶解後(すなわち、4w/v%分エタノール抽出画分を調製した後)、フィルター滅菌して-30℃で保存した。
<10.2.使用した細胞や試薬など>
「3.抗炎症作用の評価手順の概要」に記載した通り。
「3.抗炎症作用の評価手順の概要」に記載した通り。
<10.3.手順>
(1)マクロファージ(M0)への分極誘導
「3.抗炎症作用の評価手順の概要」に記載した通り。
(2)マクロファージ(M1)への分極誘導
「3.抗炎症作用の評価手順の概要」に記載した通り。
(3)試料添加
M1誘導用培地を必要量調製したのち、10.1.で調製したエタノール抽出画分をそれぞれ終濃度0.02w/v%分となるようにM1誘導用培地に添加(各条件n=3)し、400μL/wellで培地交換してCO2インキュベーター(37℃,5.0%)内で培養を開始した。大豆胚芽抽出物の水溶液を終濃度0.02w/v%となるように添加した条件を設定した。コントロールとして、M0分極誘導後にLPSを全く添加しない条件(すなわち-LPS)と、試料として大塚蒸留水またはPBSを用いた条件(すなわちControl)とを設定した。
(4)培養上清回収・液性因子の測定
(3)で培養開始後、6時間後に培養上清を回収し、-80℃フリーザーへ保存した。後日解凍して、培養上清中のTNF-α濃度を、キットのプロトコルにしたがって測定した。
(1)マクロファージ(M0)への分極誘導
「3.抗炎症作用の評価手順の概要」に記載した通り。
(2)マクロファージ(M1)への分極誘導
「3.抗炎症作用の評価手順の概要」に記載した通り。
(3)試料添加
M1誘導用培地を必要量調製したのち、10.1.で調製したエタノール抽出画分をそれぞれ終濃度0.02w/v%分となるようにM1誘導用培地に添加(各条件n=3)し、400μL/wellで培地交換してCO2インキュベーター(37℃,5.0%)内で培養を開始した。大豆胚芽抽出物の水溶液を終濃度0.02w/v%となるように添加した条件を設定した。コントロールとして、M0分極誘導後にLPSを全く添加しない条件(すなわち-LPS)と、試料として大塚蒸留水またはPBSを用いた条件(すなわちControl)とを設定した。
(4)培養上清回収・液性因子の測定
(3)で培養開始後、6時間後に培養上清を回収し、-80℃フリーザーへ保存した。後日解凍して、培養上清中のTNF-α濃度を、キットのプロトコルにしたがって測定した。
図6に示すように、エタノール濃度50%~90%で抽出された画分で、TNF-αの産生が抑制された。いっぽう、95%で抽出された画分では、TNF-αの産生がわずかに抑制された。100%エタノールで抽出された画分では、TNF-αの産生が一切抑制されなかった。このたびの結果によれば、TNF-α産生抑制作用を示す成分は、水に易溶であり、エタノールには不要であると推察される。
<11.実施例8_大豆胚芽抽出物のエタノール抽出画分の抗炎症作用(2)>
TNF-α産生抑制作用を示す成分の水溶性の程度をさらに評価した。具体的には、大豆胚芽抽出物粉末を、高濃度(具体的にはエタノール濃度90%~100%)のエタノール水溶液で抽出し、どの濃度のエタノール水溶液によって抽出された画分がTNF-α産生抑制作用を示すのかを調べ、それによって、TNF-α産生抑制作用を示す成分の水溶性の程度を評価した。
TNF-α産生抑制作用を示す成分の水溶性の程度をさらに評価した。具体的には、大豆胚芽抽出物粉末を、高濃度(具体的にはエタノール濃度90%~100%)のエタノール水溶液で抽出し、どの濃度のエタノール水溶液によって抽出された画分がTNF-α産生抑制作用を示すのかを調べ、それによって、TNF-α産生抑制作用を示す成分の水溶性の程度を評価した。
<11.1.大豆胚芽抽出物のエタノール抽出画分の調製(4w/v%分)>
大豆胚芽抽出物粉末0.2gを、エタノール水溶液(エタノール濃度90%、92%、94%、96%、98%、100%)2mLに懸濁または溶解し、振とう機で攪拌(30回転/分、2~3時間、室温)した。遠心(13,000rpm,10分)により上清を回収後、再遠心(13,000rpm,10分)して再び上清を回収した。容器のフタを開け、溶媒をとばし(50℃,17時間)、蒸留水5mLに溶解後(すなわち、4w/v%分エタノール抽出画分を調製した後)、フィルター滅菌して-30℃で保存した。
大豆胚芽抽出物粉末0.2gを、エタノール水溶液(エタノール濃度90%、92%、94%、96%、98%、100%)2mLに懸濁または溶解し、振とう機で攪拌(30回転/分、2~3時間、室温)した。遠心(13,000rpm,10分)により上清を回収後、再遠心(13,000rpm,10分)して再び上清を回収した。容器のフタを開け、溶媒をとばし(50℃,17時間)、蒸留水5mLに溶解後(すなわち、4w/v%分エタノール抽出画分を調製した後)、フィルター滅菌して-30℃で保存した。
<11.2.使用した細胞や試薬など>
「3.抗炎症作用の評価手順の概要」に記載した通り。
「3.抗炎症作用の評価手順の概要」に記載した通り。
<11.3.手順>
(1)マクロファージ(M0)への分極誘導
「3.抗炎症作用の評価手順の概要」に記載した通り。
(2)マクロファージ(M1)への分極誘導
「3.抗炎症作用の評価手順の概要」に記載した通り。
(3)試料添加
M1誘導用培地を必要量調製したのち、11.1.で調製したエタノール抽出画分をそれぞれ終濃度0.02w/v%分となるようにM1誘導用培地に添加(各条件n=3)し、400μL/wellで培地交換してCO2インキュベーター(37℃,5.0%)内で培養を開始した。実施例7で調製した50%エタノール抽出画分、および80%エタノール抽出画分を終濃度0.02w/v%となるように添加した条件も設定した。大豆胚芽抽出物を終濃度0.02w/v%となるように添加した条件も設定した。コントロールとして、M0分極誘導後にLPSを全く添加しない条件(すなわち-LPS)と、試料として大塚蒸留水またはPBSを用いた条件(すなわちControl)とを設定した。
(4)培養上清回収・液性因子の測定
(3)で培養開始後、6時間後に培養上清を回収し、-80℃フリーザーへ保存した。後日解凍して、培養上清中のTNF-α濃度を、キットのプロトコルにしたがって測定した。
(1)マクロファージ(M0)への分極誘導
「3.抗炎症作用の評価手順の概要」に記載した通り。
(2)マクロファージ(M1)への分極誘導
「3.抗炎症作用の評価手順の概要」に記載した通り。
(3)試料添加
M1誘導用培地を必要量調製したのち、11.1.で調製したエタノール抽出画分をそれぞれ終濃度0.02w/v%分となるようにM1誘導用培地に添加(各条件n=3)し、400μL/wellで培地交換してCO2インキュベーター(37℃,5.0%)内で培養を開始した。実施例7で調製した50%エタノール抽出画分、および80%エタノール抽出画分を終濃度0.02w/v%となるように添加した条件も設定した。大豆胚芽抽出物を終濃度0.02w/v%となるように添加した条件も設定した。コントロールとして、M0分極誘導後にLPSを全く添加しない条件(すなわち-LPS)と、試料として大塚蒸留水またはPBSを用いた条件(すなわちControl)とを設定した。
(4)培養上清回収・液性因子の測定
(3)で培養開始後、6時間後に培養上清を回収し、-80℃フリーザーへ保存した。後日解凍して、培養上清中のTNF-α濃度を、キットのプロトコルにしたがって測定した。
図7に示すように、エタノール濃度90%以下で抽出された画分では、大豆胚芽抽出物と同程度にTNF-αの産生が抑制された。いっぽう、90%を超えるエタノール濃度の画分では、エタノール濃度が高くなるほど、TNF-αの産生抑制の程度が弱まり、エタノール濃度98%で抽出された画分、すなわち98%画分では、TNF-αの産生が一切抑制されなかった。水をわずかに含有する96%画分でTNF-αの産生がいくらか抑制され、100%エタノールで抽出された画分では、TNF-αの産生が一切抑制されなかったことに照らすと、TNF-α産生抑制作用を示す成分は、水に易溶であり、エタノールには不要であると推察される。
<12.実施例9_TNF-α遺伝子発現の抑制>
大豆胚芽抽出物が、M1マクロファージのTNF-α遺伝子の発現になんらかの影響を与えるかどうかを調べた。
<12.1.使用した細胞や試薬など>
「3.抗炎症作用の評価手順の概要」に記載した通り。
大豆胚芽抽出物が、M1マクロファージのTNF-α遺伝子の発現になんらかの影響を与えるかどうかを調べた。
<12.1.使用した細胞や試薬など>
「3.抗炎症作用の評価手順の概要」に記載した通り。
<12.2.手順>
(1)マクロファージ(M0)への分極誘導
「3.抗炎症作用の評価手順の概要」に記載した通り。
(2)マクロファージ(M1)への分極誘導
「3.抗炎症作用の評価手順の概要」に記載した通り。
(3)試料添加
M1誘導用培地を必要量調製したのち、大豆胚芽抽出物を終濃度0.1w/v%、または実施例2で調製した大豆胚芽抽出物限外ろ過3kDa未満画分を終濃度0.1w/v%分となるようにM1誘導用培地に添加(各条件n=3)し、400μL/wellで培地交換してCO2インキュベーター(37℃,5.0%)内で培養を開始した。コントロールとして、M0分極誘導後にLPSを全く添加しない条件(すなわち-LPS)と、試料として大塚蒸留水またはPBSを用いた条件(すなわちControl)とを設定した。
(4)細胞の回収・RNA抽出
(3)で培養開始後、6時間後に培養上清を除去し、細胞をPBSで1回洗浄したのち、RNeasy Plus Mini Kit(74136,QIAGEN)を用いてRNA抽出を行った。抽出したRNA濃度はNanoDrop 2000(Thermo Scientific)にて測定した。
(5)リアルタイムPCR
リアルタイムPCRのために、以下の試薬や装置を使用した。
One-step qPCR Kit:RNA-directTM Realtime PCR Master Mix (QRT-101,TOYOBO)
プライマー:Taqman GAPDH(内在性control)(Hs02786624_g1,GAPDH VIC,PN4448489,Thermo Scientific)
プライマー:Taqman TNF-α(Hs01113624_g1 TNF,Thermo Scientific)
装置:7500 Real Time PCR system(Applied Biosystems)
装置メニューは次の通りであった。
・7500 (96well)
・Quantitation-Comparative CT(ΔΔCT)
・Taqman(登録商標) Reagent
・Standard
(4)で抽出したRNA溶液と、One-step qPCR Kitの試薬と、プライマーとをキットのプロトコルに従い、所定の濃度で混合した。このとき、RNA濃度が各条件で200ng/wellとなるように混合した。専用プレートへ分注し、プレートシールを念入りに貼り、スピンダウンの上、装置にセットして反応をスタートさせた。
比較CT法により、条件「-LPS」を1とした最終相対定量(RQ)値を算出した。
(1)マクロファージ(M0)への分極誘導
「3.抗炎症作用の評価手順の概要」に記載した通り。
(2)マクロファージ(M1)への分極誘導
「3.抗炎症作用の評価手順の概要」に記載した通り。
(3)試料添加
M1誘導用培地を必要量調製したのち、大豆胚芽抽出物を終濃度0.1w/v%、または実施例2で調製した大豆胚芽抽出物限外ろ過3kDa未満画分を終濃度0.1w/v%分となるようにM1誘導用培地に添加(各条件n=3)し、400μL/wellで培地交換してCO2インキュベーター(37℃,5.0%)内で培養を開始した。コントロールとして、M0分極誘導後にLPSを全く添加しない条件(すなわち-LPS)と、試料として大塚蒸留水またはPBSを用いた条件(すなわちControl)とを設定した。
(4)細胞の回収・RNA抽出
(3)で培養開始後、6時間後に培養上清を除去し、細胞をPBSで1回洗浄したのち、RNeasy Plus Mini Kit(74136,QIAGEN)を用いてRNA抽出を行った。抽出したRNA濃度はNanoDrop 2000(Thermo Scientific)にて測定した。
(5)リアルタイムPCR
リアルタイムPCRのために、以下の試薬や装置を使用した。
One-step qPCR Kit:RNA-directTM Realtime PCR Master Mix (QRT-101,TOYOBO)
プライマー:Taqman GAPDH(内在性control)(Hs02786624_g1,GAPDH VIC,PN4448489,Thermo Scientific)
プライマー:Taqman TNF-α(Hs01113624_g1 TNF,Thermo Scientific)
装置:7500 Real Time PCR system(Applied Biosystems)
装置メニューは次の通りであった。
・7500 (96well)
・Quantitation-Comparative CT(ΔΔCT)
・Taqman(登録商標) Reagent
・Standard
(4)で抽出したRNA溶液と、One-step qPCR Kitの試薬と、プライマーとをキットのプロトコルに従い、所定の濃度で混合した。このとき、RNA濃度が各条件で200ng/wellとなるように混合した。専用プレートへ分注し、プレートシールを念入りに貼り、スピンダウンの上、装置にセットして反応をスタートさせた。
比較CT法により、条件「-LPS」を1とした最終相対定量(RQ)値を算出した。
図8に示すように、LPSを全く添加しない条件(すなわち-LPS)と比較して、LPSでM1分極誘導をかけたControlのRQ値が4以上であったことから、M1分極誘導の結果、TNF-αの発現が大幅に増強した。これに対して、M1分極誘導をかけたうえで大豆胚芽抽出物、および大豆胚芽抽出物限外ろ過3kDa未満画分を添加することによって、TNF-αの発現が強力に抑制された。このたびの結果から、大豆胚芽抽出物、および大豆胚芽抽出物限外ろ過3kDa未満画分によるTNF-αの産生の抑制は、TNF-α遺伝子の発現が抑制されることによることが明らかとなった。
<13.実施例10_デキサメタゾンとの抗炎症作用の比較(TNF-α指標)>
TNF-α産生量を指標に、大豆胚芽抽出物の抗炎症作用と、デキサメタゾンの抗炎症作用とを比較した。なお、デキサメタゾンは、急性・慢性炎症、自己免疫疾患、アレルギー性疾患などに使用されるステロイド系抗炎症薬である。
TNF-α産生量を指標に、大豆胚芽抽出物の抗炎症作用と、デキサメタゾンの抗炎症作用とを比較した。なお、デキサメタゾンは、急性・慢性炎症、自己免疫疾患、アレルギー性疾患などに使用されるステロイド系抗炎症薬である。
<13.1.使用した細胞や試薬など>
「3.抗炎症作用の評価手順の概要」に記載した通り。
「3.抗炎症作用の評価手順の概要」に記載した通り。
<13.2.手順>
(1)マクロファージ(M0)への分極誘導
「3.抗炎症作用の評価手順の概要」に記載した通り。
(2)マクロファージ(M1)への分極誘導
「3.抗炎症作用の評価手順の概要」に記載した通り。
(3)試料添加
M1誘導用培地を必要量調製したのち、大豆胚芽抽出物を終濃度0.1w/v%となるようにM1誘導用培地に添加(各条件n=3)し、400μL/wellで培地交換してCO2インキュベーター(37℃,5.0%)内で培養を開始した。比較対象としてデキサメタゾンを終濃度1nM~1000nMとなるように添加した条件を設定した。コントロールとして、M0分極誘導後にLPSを全く添加しない条件(すなわち-LPS)と、試料として大塚蒸留水またはPBSを用いた条件(すなわちControl)とを設定した。1回の実験で1条件あたりn=3で実験をおこなった。
(4)培養上清回収・液性因子の測定
(3)で培養開始後、6時間後に培養上清を回収し、-80℃フリーザーへ保存した。後日解凍して、培養上清中のTNF-α濃度を、キットのプロトコルにしたがって測定した。
(1)マクロファージ(M0)への分極誘導
「3.抗炎症作用の評価手順の概要」に記載した通り。
(2)マクロファージ(M1)への分極誘導
「3.抗炎症作用の評価手順の概要」に記載した通り。
(3)試料添加
M1誘導用培地を必要量調製したのち、大豆胚芽抽出物を終濃度0.1w/v%となるようにM1誘導用培地に添加(各条件n=3)し、400μL/wellで培地交換してCO2インキュベーター(37℃,5.0%)内で培養を開始した。比較対象としてデキサメタゾンを終濃度1nM~1000nMとなるように添加した条件を設定した。コントロールとして、M0分極誘導後にLPSを全く添加しない条件(すなわち-LPS)と、試料として大塚蒸留水またはPBSを用いた条件(すなわちControl)とを設定した。1回の実験で1条件あたりn=3で実験をおこなった。
(4)培養上清回収・液性因子の測定
(3)で培養開始後、6時間後に培養上清を回収し、-80℃フリーザーへ保存した。後日解凍して、培養上清中のTNF-α濃度を、キットのプロトコルにしたがって測定した。
図9に示すように、デキサメタゾンは、10nM(すなわち0.01μM)以上で強いTNF-α産生抑制作用を発揮した。10nMデキサメタゾンと同程度のTNF-α産生抑制作用を0.1w/v%大豆胚芽抽出物が発揮した。
なお、デキサメタゾンの経口薬の一般的な摂取量は、デカドロン錠0.5mg/デカドロン錠4mg 処方箋医薬品説明書(日医工)によれば、0.5mg/日~8mg/日である。1人の体重を60kg(=60L)であったとすると、デキサメタゾンの経口薬の一般的な摂取量は、1人1日あたり20nM~340nMとなる。経口摂取されたデキサメタゾンのうち、どれだけの量が吸収され患部に届いているかは明白ではないものの、このたびの結果によれば、0.1w/v%大豆胚芽抽出物の抗炎症作用は、デキサメタゾンを低用量服用した際の抗炎症作用と同程度ではないかと推察される。
<14.実施例11_デキサメタゾンとの抗炎症作用の比較(IL-10指標)>
IL-10産生量を指標に、抽出物(大豆胚芽抽出物や小麦胚芽抽出物)の抗炎症作用と、デキサメタゾンの抗炎症作用とを比較した。
IL-10産生量を指標に、抽出物(大豆胚芽抽出物や小麦胚芽抽出物)の抗炎症作用と、デキサメタゾンの抗炎症作用とを比較した。
<14.1.使用した細胞や試薬など>
IL-10測定のために次のキットを使用したこと以外は、「3.抗炎症作用の評価手順の概要」に記載した細胞や試薬などを使用した。
DuoSet ELISA development system Human IL-10(DY217B-05,R&D systems)
DuoSet Ancillary Reagent Kit2(DY008,R&D systems)
IL-10測定のために次のキットを使用したこと以外は、「3.抗炎症作用の評価手順の概要」に記載した細胞や試薬などを使用した。
DuoSet ELISA development system Human IL-10(DY217B-05,R&D systems)
DuoSet Ancillary Reagent Kit2(DY008,R&D systems)
<14.2.手順>
(1)マクロファージ(M0)への分極誘導
「3.抗炎症作用の評価手順の概要」に記載した通り。
(2)マクロファージ(M1)への分極誘導、および試料添加
(1)の48ウェルプレートを取り出し、顕微鏡で細胞が接着していることを確認後、400μL/wellで培地交換によりPMAを除去し、CO2インキュベーター(37℃,5.0%)内で4時間以上インキュベートした。
M1誘導用培地(80ng/mL LPS含有培地)を必要量調製したのち、大豆胚芽抽出物を終濃度0.1w/v%、または実施例2で調製した大豆胚芽抽出物3kDa未満画分を終濃度0.1w/v%分となるように、または小麦胚芽抽出物(液体品)を終濃度2.5v/v%となるようにM1誘導用培地に添加(各条件n=3)し、400μL/wellで培地交換してCO2インキュベーター(37℃,5.0%)内で培養を開始した。比較対象としてデキサメタゾンを終濃度10nMとなるように添加した条件を設定した。コントロールとして、M0分極誘導後にLPSを全く添加しない条件(すなわち-LPS)と、試料として大塚蒸留水またはPBSを用いた条件(Control)とを設定した。1回の実験で1条件あたりn=3で実験をおこなった。
(3)培養上清回収・液性因子の測定
(2)で培養開始後、72時間後に培養上清を回収し、-80℃フリーザーへ保存した。後日解凍して、培養上清中のIL-10濃度を、キットのプロトコルにしたがって測定した。
(1)マクロファージ(M0)への分極誘導
「3.抗炎症作用の評価手順の概要」に記載した通り。
(2)マクロファージ(M1)への分極誘導、および試料添加
(1)の48ウェルプレートを取り出し、顕微鏡で細胞が接着していることを確認後、400μL/wellで培地交換によりPMAを除去し、CO2インキュベーター(37℃,5.0%)内で4時間以上インキュベートした。
M1誘導用培地(80ng/mL LPS含有培地)を必要量調製したのち、大豆胚芽抽出物を終濃度0.1w/v%、または実施例2で調製した大豆胚芽抽出物3kDa未満画分を終濃度0.1w/v%分となるように、または小麦胚芽抽出物(液体品)を終濃度2.5v/v%となるようにM1誘導用培地に添加(各条件n=3)し、400μL/wellで培地交換してCO2インキュベーター(37℃,5.0%)内で培養を開始した。比較対象としてデキサメタゾンを終濃度10nMとなるように添加した条件を設定した。コントロールとして、M0分極誘導後にLPSを全く添加しない条件(すなわち-LPS)と、試料として大塚蒸留水またはPBSを用いた条件(Control)とを設定した。1回の実験で1条件あたりn=3で実験をおこなった。
(3)培養上清回収・液性因子の測定
(2)で培養開始後、72時間後に培養上清を回収し、-80℃フリーザーへ保存した。後日解凍して、培養上清中のIL-10濃度を、キットのプロトコルにしたがって測定した。
図10に示すように、ControlのIL-10産生量は、-LPSのIL-10産生量よりも高かった。これは、IL-10が、M2(抗炎症性)マクロファージが分泌するサイトカインであるものの、LPS刺激によっても若干産生されるためである。
そのため、IL-10を指標に抗炎症作用を議論する際は、IL-10産生量が、Controlと比べて高いかどうかに着目すべきである。
0.1w/v%大豆胚芽抽出物、0.1w/v%分大豆胚芽抽出物3kDa未満画分、および2.5v/v%小麦胚芽抽出物の条件では、ControlよりIL-10産生量が高かった。いっぽう、デキサメタゾンでは、IL-10の産生はControlと同程度であった。つまり、デキサメタゾンによってIL-10産生は促進されなかった。デキサメタゾンがIL-10産生を抑制する、ということを報告する文献(参考文献1および2参照)があるところ、このたびの結果は、それらの文献の報告に沿う。これら抽出物がIL-10産生を促進したのに対して、デキサメタゾンがIL-10産生を促進しなかったことから、これら抽出物は、ステロイド剤であるデキサメタゾンとは異なる機序で抗炎症作用を発揮する、と考えられる。
参考文献1:Bessler H.et al., Effect of Dexamethasone on IL-10 and IL-12p40 Production in Newborns and Adults, Biol Neonate 80:262-266(2001).
参考文献2:L.Cannarile et al., Dexamethasone Modulates IL-13 and IL-10 Expression, International Journal of Immunopathology and Phamacology, Vol.10(3):175-182(1997).
そのため、IL-10を指標に抗炎症作用を議論する際は、IL-10産生量が、Controlと比べて高いかどうかに着目すべきである。
0.1w/v%大豆胚芽抽出物、0.1w/v%分大豆胚芽抽出物3kDa未満画分、および2.5v/v%小麦胚芽抽出物の条件では、ControlよりIL-10産生量が高かった。いっぽう、デキサメタゾンでは、IL-10の産生はControlと同程度であった。つまり、デキサメタゾンによってIL-10産生は促進されなかった。デキサメタゾンがIL-10産生を抑制する、ということを報告する文献(参考文献1および2参照)があるところ、このたびの結果は、それらの文献の報告に沿う。これら抽出物がIL-10産生を促進したのに対して、デキサメタゾンがIL-10産生を促進しなかったことから、これら抽出物は、ステロイド剤であるデキサメタゾンとは異なる機序で抗炎症作用を発揮する、と考えられる。
参考文献1:Bessler H.et al., Effect of Dexamethasone on IL-10 and IL-12p40 Production in Newborns and Adults, Biol Neonate 80:262-266(2001).
参考文献2:L.Cannarile et al., Dexamethasone Modulates IL-13 and IL-10 Expression, International Journal of Immunopathology and Phamacology, Vol.10(3):175-182(1997).
本発明は、抗炎症剤、TNF-α産生抑制剤、IL-10産生亢進剤、皮膚外用組成物、および飲食品組成物を提供することができるため、産業上の利用可能性を有する。
Claims (23)
- 植物由来ポリアミン含有抽出物を含み、
前記植物由来ポリアミン含有抽出物が1kDa未満の画分を含み、
前記1kDa未満の画分が有効成分を含む、
抗炎症剤。 - 前記植物が、大豆および小麦の少なくとも一方である、請求項1に記載の抗炎症剤。
- 前記植物由来ポリアミン含有抽出物が、大豆種子、大豆胚芽、大豆胚、大豆芽、小麦種子、小麦胚芽、小麦胚、小麦芽、豆乳およびオカラからなる群から選ばれた少なくとも1種の材料から抽出されたものである、請求項1に記載の抗炎症剤。
- 前記植物由来ポリアミン含有抽出物が、大豆胚芽および小麦胚芽の少なくとも一方から抽出されたものである、請求項1に記載の抗炎症剤。
- 前記植物由来ポリアミン含有抽出物が、pH6.0以下の水溶液で抽出する工程を含む方法で得られたものである、請求項1に記載の抗炎症剤。
- 前記有効成分が、121℃で15分間の熱処理によって失活しない、請求項1に記載の抗炎症剤。
- 前記有効成分がエタノールに不溶である、請求項1に記載の抗炎症剤。
- 炎症性疾患の予防、改善または治療のために用いられる、請求項1に記載の抗炎症剤。
- 前記炎症性疾患が関節リウマチ、変形性関節症、乾癬、尋常性天疱瘡、アレルギー性接触皮膚炎、アトピー性皮膚炎、または炎症性腸疾患である、請求項8に記載の抗炎症剤。
- 請求項1に記載の抗炎症剤を含む、皮膚外用組成物。
- 炎症性疾患の予防、改善または治療のために用いられる、請求項10に記載の皮膚外用組成物。
- 前記炎症性疾患が関節炎または皮膚炎である、請求項11に記載の皮膚外用組成物。
- 前記炎症性疾患が、関節リウマチ、変形性関節症、乾癬、尋常性天疱瘡、アレルギー性接触皮膚炎、またはアトピー性皮膚炎である、請求項11に記載の皮膚外用組成物。
- 請求項1に記載の抗炎症剤を含む、飲食品組成物。
- 炎症性腸疾患の予防または改善のために用いられる、請求項14に記載の飲食品組成物。
- 植物由来ポリアミン含有抽出物を含み、
前記植物由来ポリアミン含有抽出物が1kDa未満の画分を含み、
前記1kDa未満の画分が有効成分を含む、
TNF-α産生抑制剤。 - 植物由来ポリアミン含有抽出物を含み、
前記植物由来ポリアミン含有抽出物が1kDa未満の画分を含み、
前記1kDa未満の画分が有効成分を含む、
インターロイキン10産生亢進剤。 - 請求項1に記載の抗炎症剤を対象に投与することを含む、炎症性疾患の予防、改善または治療方法。
- 前記炎症性疾患が関節リウマチ、変形性関節症、乾癬、尋常性天疱瘡、アレルギー性接触皮膚炎、アトピー性皮膚炎、または炎症性腸疾患である、請求項18に記載の炎症性疾患の予防、改善または治療方法。
- 抗炎症剤を製造するための植物由来ポリアミン含有抽出物の使用であって、
前記植物由来ポリアミン含有抽出物が1kDa未満の画分を含み、
前記1kDa未満の画分が有効成分を含む、
使用。 - 前記抗炎症剤が、炎症性疾患の予防、改善または治療のために用いられる抗炎症剤であって、
前記炎症性疾患が関節リウマチ、変形性関節症、乾癬、尋常性天疱瘡、アレルギー性接触皮膚炎、アトピー性皮膚炎、または炎症性腸疾患である、
請求項20に記載の使用。 - 請求項10に記載の皮膚外用組成物を皮膚に使用することを含む、炎症性疾患の予防、改善または治療方法。
- 前記炎症性疾患が、関節リウマチ、変形性関節症、乾癬、尋常性天疱瘡、アレルギー性接触皮膚炎、またはアトピー性皮膚炎である、請求項22に記載の炎症性疾患の予防、改善または治療方法。
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Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
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JP2022167517A JP2024060257A (ja) | 2022-10-19 | 2022-10-19 | 抗炎症剤、TNF-α産生抑制剤、インターロイキン10産生亢進剤、皮膚外用組成物、および飲食品組成物 |
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Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
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WO2024085105A1 true WO2024085105A1 (ja) | 2024-04-25 |
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Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
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PCT/JP2023/037358 WO2024085105A1 (ja) | 2022-10-19 | 2023-10-16 | 抗炎症剤、TNF-α産生抑制剤、インターロイキン10産生亢進剤、皮膚外用組成物、飲食品組成物、炎症性疾患の予防、改善または治療方法、および抗炎症剤の製造のための植物由来ポリアミン含有抽出物の使用 |
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WO (1) | WO2024085105A1 (ja) |
Citations (2)
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WO2019159588A1 (ja) * | 2018-02-16 | 2019-08-22 | 東洋紡株式会社 | アンチポリューション剤及び皮膚外用組成物 |
JP2021075495A (ja) * | 2019-11-12 | 2021-05-20 | 東洋紡株式会社 | 抗炎症剤 |
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2022
- 2022-10-19 JP JP2022167517A patent/JP2024060257A/ja active Pending
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2023
- 2023-10-16 WO PCT/JP2023/037358 patent/WO2024085105A1/ja unknown
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Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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WO2019159588A1 (ja) * | 2018-02-16 | 2019-08-22 | 東洋紡株式会社 | アンチポリューション剤及び皮膚外用組成物 |
JP2021075495A (ja) * | 2019-11-12 | 2021-05-20 | 東洋紡株式会社 | 抗炎症剤 |
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SODA, KUNIYASU: "Potential of polyamines as anti-inflammatory drugs and antiallergic agent", BIOTHERAPY, vol. 20, no. 1, 2006, pages 79 * |
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