WO2024080637A1 - 인플루엔자 A 바이러스 항원 단백질 HA, NA 또는 M2e5x를 포함하는 바이러스 유사입자 조합 백신 - Google Patents

인플루엔자 A 바이러스 항원 단백질 HA, NA 또는 M2e5x를 포함하는 바이러스 유사입자 조합 백신 Download PDF

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WO2024080637A1
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virus
influenza
nucleic acid
seq
acid sequence
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전복실
윤건웅
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경희대학교 산학협력단
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    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A61K39/145—Orthomyxoviridae, e.g. influenza virus
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A61P31/16—Antivirals for RNA viruses for influenza or rhinoviruses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof

Definitions

  • the present invention relates to a virus-like particle combination vaccine containing the influenza A virus antigen protein hemagglutinin (HA), neuraminidase (NA), or heterologous tandem M2e repeats (M2e5x).
  • HA hemagglutinin
  • NA neuraminidase
  • M2e5x heterologous tandem M2e repeats
  • Influenza is an acute infectious disease that is highly contagious and causes symptoms such as fever, muscle pain, chills, and cough. Starting with Mexico in 2009, influenza A virus was confirmed in more than 214 countries, causing 18,500 deaths from April to August 2010, when the pandemic ended. Current potential candidates for causing a pandemic include avian influenza A(H5N1) and avian influenza A(H7N9) viruses (‘H5N1’ and ‘H7N9’). In the case of H5N1, 826 people were infected in 16 countries, of which 440 died, showing a high fatality rate of about 53% (2015, WHO). Influenza B virus accounts for 23% of all influenza infections and 52% of influenza-related pediatric mortality.
  • pandemic If an influenza pandemic occurs, it is estimated that approximately 7.4 to 150 million deaths will occur worldwide, and in the United States, economic damage in the event of a pandemic is estimated to be approximately $71 billion to $167 billion.
  • influenza A virus A/PR/8/34, H1N1, A/Hong Kong/1/68, H3N2, A/Vietnam/2003, H5N1
  • influenza B virus B/Victoria lineages
  • the object of the present invention is to treat influenza viruses expressing a combination of the influenza A virus antigen proteins hemagglutinin (HA), neuraminidase (NA), or heterologous tandem M2e repeats (M2e5x).
  • the goal is to provide virus-like particles (VLPs) that can induce an immune response.
  • Another object of the present invention is to provide a vaccine composition containing the virus-like particles as an active ingredient.
  • another object of the present invention is to provide an expression vector for producing the virus-like particles, a host cell transformed by the expression vector, and a method for producing the virus-like particles.
  • the present invention provides a method for influenza virus containing hemagglutinin 3 (HA3), neuraminidase (NA1), and neuraminidase (NA2).
  • HA3 hemagglutinin 3
  • NA1 neuraminidase
  • NA2 neuraminidase
  • VLPs virus-like particles
  • virus-like particles that can induce an immune response against influenza viruses, including hemagglutinin 1 (HA1) and hemagglutinin 3 (HA3). ) is provided.
  • HA1 hemagglutinin 1
  • HA3 hemagglutinin 3
  • influenza viruses containing hemagglutinin 3 (HA3), neuraminidase (NA1), and heterologous tandem M2e repeats (M2e5x).
  • HA3 hemagglutinin 3
  • NA1 neuraminidase
  • M2e5x heterologous tandem M2e repeats
  • VLPs virus-like particles
  • VLPs virus-like particles
  • the present invention provides a vaccine composition containing the virus-like particles as an active ingredient.
  • the present invention provides a nucleic acid sequence of SEQ ID NO: 3 encoding HA3;
  • An expression vector for producing a virus-like particle capable of inducing an immune response to an influenza virus is provided, including the nucleic acid sequence of SEQ ID NO: 2 encoding NA1 and the nucleic acid sequence of SEQ ID NO: 4 encoding NA2.
  • the present invention provides an expression vector for producing virus-like particles capable of inducing an immune response to influenza virus, comprising the nucleic acid sequence of SEQ ID NO: 1 encoding HA1 and the nucleic acid sequence of SEQ ID NO: 3 encoding HA3. .
  • the present invention provides a nucleic acid sequence of SEQ ID NO: 3 encoding HA3;
  • An expression vector for producing a virus-like particle capable of inducing an immune response to an influenza virus is provided, including the nucleic acid sequence of SEQ ID NO: 2 encoding NA1 and the nucleic acid sequence of SEQ ID NO: 5 encoding M2e5x.
  • the present invention provides a nucleic acid sequence of SEQ ID NO: 1 encoding HA1;
  • An expression vector for producing virus-like particles capable of inducing an immune response to an influenza virus is provided, including the nucleic acid sequence of SEQ ID NO: 3 encoding HA3 and the nucleic acid sequence of SEQ ID NO: 5 encoding M2e5x.
  • the present invention provides host cells transformed by the expression vector.
  • the present invention includes the steps of transforming a host cell with the expression vector; and culturing the host cells to express the virus-like particles.
  • the present invention relates to a virus-like particle combination vaccine containing influenza A virus antigen proteins HA, NA or M2e5x, and is directed to the 2020/2021 influenza virus A/Guangdong-Maonan/SWL1536/2019 recently predicted by the World Health Organization (WHO).
  • WHO World Health Organization
  • Hemagglutinin (HA) and neuraminidase (NA) antigen proteins of (H1N1) and A/Hong Kong/2671/2019 (H3N2) and heterologous tandem M2e of existing human, swine, and avian influenza viruses are examples of viruses.
  • a virus-like particle vaccine expressed by a combination of heterologous tandem M2e repeats (M2e5x) antigen proteins is manufactured to protect against infection with influenza A virus (H1N1, H3N2, H5N1) and influenza B virus (B/Victoria lineages).
  • M2e5x heterologous tandem M2e repeats
  • a recombinant universal influenza virus-like particle vaccine was developed. By developing a highly immunogenic vaccine based on the present invention, a virus-like particle vaccine with high efficacy against various types of influenza can reduce infection and mortality due to influenza A and B viruses in a global pandemic situation.
  • Figure 1 shows the results of confirming the characteristics of influenza A virus-like particles.
  • FIG. 2 shows the results of IgG influenza type A and B specific antibody responses in serum.
  • Figure 3 shows the results of virus titer analysis in the lungs after influenza A and B virus infection.
  • Figure 4 shows the results of analysis of body weight change rate and survival rate after influenza B virus infection.
  • Figure 5 shows the influenza B virus animal experiment protocol.
  • Figure 6 shows lung virus titer results after influenza B virus infection.
  • Figure 7 shows the results of body weight change and survival rate after influenza B virus infection.
  • the present invention provides a method for inducing an immune response against influenza viruses, including hemagglutinin 3 (HA3), neuraminidase (NA1), and neuraminidase (NA2).
  • influenza viruses including hemagglutinin 3 (HA3), neuraminidase (NA1), and neuraminidase (NA2).
  • HA3 hemagglutinin 3
  • NA1 neuraminidase
  • NA2 neuraminidase
  • VLPs virus-like particles
  • virus-like particles that can induce an immune response against influenza viruses, including hemagglutinin 1 (HA1) and hemagglutinin 3 (HA3). ) is provided.
  • HA1 hemagglutinin 1
  • HA3 hemagglutinin 3
  • influenza viruses containing hemagglutinin 3 (HA3), neuraminidase (NA1), and heterologous tandem M2e repeats (M2e5x).
  • HA3 hemagglutinin 3
  • NA1 neuraminidase
  • M2e5x heterologous tandem M2e repeats
  • VLPs virus-like particles
  • VLPs virus-like particles
  • the HA1 is encoded by the nucleic acid sequence of SEQ ID NO: 1
  • the NA1 is encoded by the nucleic acid sequence of SEQ ID NO: 2
  • the HA3 is encoded by the nucleic acid sequence of SEQ ID NO: 3
  • the NA2 is the sequence It is encoded by the nucleic acid sequence of SEQ ID NO: 4
  • the M2e5x may be encoded by the nucleic acid sequence of SEQ ID NO: 5, but is not limited thereto.
  • influenza virus may be an influenza A virus or an influenza B virus, but is not limited thereto.
  • HA1 and NA1 used in the present invention are antigen proteins of A/Guangdng-Maonan/SWL1536/2019 (H1N1), HA1 is Accession #: EPI1542570, and NA1 is Accession #: EPI1542569.
  • HA3 and NA2 used in the present invention are antigen proteins of A/Hong Kong/2671/2019 (H3N2), HA3 is Accession #: EPI1698489, and NA2 is Accession #: EPI1698488.
  • virus-Like Particles refers to non-infectious viral subunits with or without viral proteins.
  • the virus-like particle may completely lack a DNA or RNA genome, or in the case of a virus-like particle containing a viral capsid protein, it may undergo spontaneous self-assembly.
  • virus-like particle capable of inducing an immune response to influenza virus refers to a protein structure (particle) that induces a specific immune response to an influenza virus and has a shape similar to that of a virus.
  • the virus-like particle assembles structural proteins derived from the virus to produce a particle with a shape similar to the virus and at the same time contains an antigenic determining site derived from the influenza virus, so that when the virus-like particle is inoculated into a specific individual. It is characterized by being able to induce a specific immune response against the influenza virus.
  • the protein structure may have a form in which an antigen-determining site derived from an influenza virus is bound to the outside of a structural protein derived from a virus.
  • the structural protein (core protein) derived from the virus may be influenza virus matrix protein (M1).
  • “Influenza virus matrix protein (M1)” is a structural protein of the influenza virus and is a matrix protein that forms a coat inside the fat layer, which is the envelope of the influenza virus.
  • the influenza virus consists of eight segmented negative-strand RNAs, surface proteins hemagglutinin (HA), neuraminidase (NA), nucleoprotein (NP) matrix (M1), Proton ion-channel protein (M2), polymerase acidic protein (PA), polymerase basic protein 2 (PB2, polyMerase basic protein 2), polymerase acidic protein (PA) It includes proteins such as acidic protein) and nonstructural protein 2 (NS2), where matrix protein 1 surrounds the outer layer with layers and acts as a linker between the core and the outer shell.
  • the matrix protein 1 plays an important role in assembling virus-like particles into a stable form in the production of virus-like particles.
  • the virus-like particle acts as an antigen within the organism and can label T or B immune cells with the antigen through reaction with antigen-labeled cells such as dendritic cells.
  • the present invention provides a vaccine composition containing the virus-like particles as an active ingredient.
  • vaccine composition refers to a composition that can prevent subsequent pathogen infection by administering a protein antigen having a vaccine effect.
  • the vaccine composition may be a composition containing virus-like particles that exhibit antigenicity against the influenza virus.
  • the vaccine composition may include any one selected from the group consisting of pharmaceutically acceptable carriers, adjuvants, immune stimulants, and combinations thereof.
  • the pharmaceutically acceptable carriers are known in the art and include proteins, sugars, etc.
  • the carrier may be aqueous or non-aqueous solutions, suspensions and emulsions.
  • Non-aqueous carriers include propylene glycol, polyethylene glycol, edible oils such as olive oil, and injectable organic esters such as ethyl oleate.
  • Aqueous carriers include water, alcohol/aqueous solutions, emulsions or suspensions, including drinking water and buffered media.
  • Parenteral carriers include sodium chloride solution, Ringer's dextrose, dextrose and sodium chloride, lactated Ringer's or fixed oils.
  • Carriers for intravenous injection include electrolyte supplements, liquid and nutritional supplements, such as those based on Ringer's dextrose.
  • Preservatives and other additives such as antimicrobial agents, antioxidants, chelating agents, inert gases, etc. may be additionally included.
  • Preservatives may include, but are not limited to, formalin thimerosal, neomycin, polymyxin B, and amphotericin B.
  • the vaccine composition may further include adjuvants.
  • the adjuvant refers to a compound or mixture that enhances the immune response and/or accelerates the rate of absorption after vaccination and includes any absorption-enhancing agent.
  • Acceptable auxiliaries include Freund's complete preservative, Freund's incomplete preservative, saponins, mineral gels such as aluminum hydroxide, surfactants such as lysolecithin, plutonic polyol, polyanions, peptides, oil or hydrocarbon emulsions, keyhole limpet hemocyanin, D It includes, but is not limited to, nitrophenol, etc.
  • the vaccine composition may further include an immune stimulant.
  • the immune stimulants may include artificially synthesized levamisole, isoprenosine, and cytokines.
  • cytokines include interferon- ⁇ , interleukin-2, GM-CSF, and GCSF.
  • the vaccine composition can be used in the form of the virus-like particles or a concentrate thereof, or in the form of a dried powder of the transformed host cells themselves or the transformed cells. Additionally, the vaccine composition can be used together with other foods or food ingredients and can be used appropriately according to conventional methods.
  • the vaccine composition includes stabilizers, emulsifiers, aluminum hydroxide, aluminum phosphate, pH adjusters, surfactants, liposomes, iscom adjuvants, synthetic glycopeptides, extenders, carboxypolymethylene, bacterial cell walls, derivatives of bacterial cell walls, bacterial vaccines, Animal poxvirus protein, subviral particle adjuvant, cholera toxin, N, N-dioctadecyl-N',N'-bis(2-hydroxyethyl)-propanediamine, monophosphoryl lipid A, dimethyldiamine It may further include one or more second auxiliaries selected from the group consisting of octadecyl-ammonium bromide and mixtures thereof.
  • the vaccine composition can be formulated and used in the form of oral dosage forms such as powders, granules, tablets, capsules, suspensions, emulsions, syrups, aerosols, etc., and sterile injectable solutions according to conventional methods.
  • oral dosage forms such as powders, granules, tablets, capsules, suspensions, emulsions, syrups, aerosols, etc.
  • sterile injectable solutions according to conventional methods.
  • commonly used diluents or excipients such as fillers, extenders, binders, wetting agents, disintegrants, and surfactants may be used together.
  • Solid preparations for oral administration include tablets, pills, powders, granules, capsules, etc. These solid preparations include the lecithin-like emulsifier and at least one excipient such as starch, calcium carbonate, sucrose or lactose, and gelatin. etc. can be used together. In addition to the above excipients, lubricants such as magnesium styrate talc may also be used.
  • Liquid preparations for oral administration include suspensions, oral solutions, emulsions, and syrups.
  • various excipients such as wetting agents, sweeteners, fragrances, and preservatives can be used. there is.
  • Preparations for parenteral administration may include sterilized aqueous solutions, non-aqueous preparations, suspensions, emulsions, and freeze-dried preparations.
  • Non-aqueous preparations and suspensions may include propylene glycol, polyethylene glycol, vegetable oil such as olive oil, and injectable ester such as ethyl oleate.
  • the present invention provides a nucleic acid sequence of SEQ ID NO: 3 encoding HA3;
  • An expression vector for producing a virus-like particle capable of inducing an immune response to an influenza virus is provided, including the nucleic acid sequence of SEQ ID NO: 2 encoding NA1 and the nucleic acid sequence of SEQ ID NO: 4 encoding NA2.
  • the present invention provides an expression vector for producing virus-like particles capable of inducing an immune response to influenza virus, comprising the nucleic acid sequence of SEQ ID NO: 1 encoding HA1 and the nucleic acid sequence of SEQ ID NO: 3 encoding HA3. .
  • the present invention provides a nucleic acid sequence of SEQ ID NO: 3 encoding HA3;
  • An expression vector for producing a virus-like particle capable of inducing an immune response to an influenza virus is provided, including the nucleic acid sequence of SEQ ID NO: 2 encoding NA1 and the nucleic acid sequence of SEQ ID NO: 5 encoding M2e5x.
  • the present invention provides a nucleic acid sequence of SEQ ID NO: 1 encoding HA1;
  • An expression vector for producing virus-like particles capable of inducing an immune response to an influenza virus is provided, including the nucleic acid sequence of SEQ ID NO: 3 encoding HA3 and the nucleic acid sequence of SEQ ID NO: 5 encoding M2e5x.
  • the term “vector” refers to a nucleic acid molecule used to transport linked nucleic acid fragments.
  • the vector may include, but is not limited to, bacteria, plasmids, phages, cosmids, episomes, viruses, and insertable DNA fragments (i.e., fragments that can be inserted into the host cell genome by homologous recombination).
  • the plasmid is a type of vector and refers to a circular double-stranded DNA loop within which additional DNA fragments can be linked. Additionally, viral vectors can incorporate additional DNA into the viral genome.
  • expression vector refers to a vector that can direct the expression of a gene encoding an operably linked target protein.
  • expression vectors are in the form of plasmids, so the terms plasmid and vector can be used interchangeably.
  • other types of expression vectors that perform the same function such as viral vectors, may also be included.
  • the vector may be a baculovirus vector.
  • the baculovirus refers to a pathogenic virus that is not pathogenic to humans or vertebrates and is pathogenic only to insects.
  • the expression vector is introduced into a host cell, and the host cell transformed by the introduced vector can produce the virus-like particle.
  • the vector may contain a promoter recognized by the host organism.
  • the nucleic acid sequence encoding the virus-like particle may be operably linked to the promoter sequence.
  • operably linked means that one nucleic acid fragment is linked to another nucleic acid fragment so that its function or expression is affected by the other nucleic acid fragment.
  • the gene encoding the virus-like particle can be operably linked to a promoter in the vector to control its expression.
  • the expression vector may contain an appropriate marker gene necessary for selecting transformed host cells.
  • the marker gene may be an antibiotic resistance gene or a fluorescent protein gene, and the antibiotic resistance gene may be selected from the group consisting of a hygromycin resistance gene, a kanamycin resistance gene, a chloramphenicol resistance gene, and a tetracycline resistance gene, but is limited thereto. That is not the case.
  • the fluorescent protein genes include the yeast-enhanced green fluorescent protein (yEGFP) gene, green fluorescent protein (GFP) gene, blue fluorescent protein (BFP) gene, and red fluorescent protein. (red fluorescent protein, RFP) may be selected from the group consisting of genes, but is not limited thereto.
  • the present invention provides host cells transformed by expression vectors.
  • the term “host cell” refers to any organism that can be infected by a virus and immunized by a virus-like particle.
  • the host cells can be metabolically engineered by transformation.
  • the host cells may be microorganisms, animal cells, plant cells, cultured cells derived from animals, or cultured cells derived from plants.
  • the suitable host cells may be naturally occurring or wild-type host cells, or may be altered host cells.
  • the wild-type host cell may be a host cell that has not been genetically changed by recombination.
  • transformation refers to a method of transporting the vector into a microorganism or a specific cell. If the target cell for transformation is a prokaryotic cell, it can be carried out by the CaCl2 method, Hanhan method, electroporation method, etc. . If the target cell for transformation is a eukaryotic cell, the transformation can be performed using microinjection, calcium phosphate precipitation, electroporation, liposome-mediated transfection, DEAE-dextran treatment, and gene bombardment. It is not limited. In the case of transformation of fungi such as yeast, transformation may generally be performed using lithium acetate and heat shock and electroporation, but is not limited thereto.
  • the present invention includes the steps of transforming a host cell with the expression vector; and culturing the host cells to express the virus-like particles.
  • the virus-like particles can be manufactured by genetic engineering methods, and can be manufactured by genetic engineering methods without a separate causative infectious agent, that is, the influenza virus in the present invention, so that high productivity and economic efficiency can be realized.
  • the virus-like particles can be manufactured by methods well known in the art.
  • the virus-like particle can be produced by transforming a given host cell using a recombinant DNA molecule encoding the structural protein and the antigen recognition site and then culturing it, and the protein expressed in the cell is assembled on the cell surface. After that, it can be discharged into the culture supernatant. At this time, since the surface protein contained in the virus-like particle maintains its natural form without going through an immobilization process, it can induce a desired immune response against a specific pathogen within the individual.
  • the transformed host cells may be cultured under batch, fed-batch or continuous fermentation conditions, and the host cells may express the virus-like particles by transformation, thereby producing the virus-like particles from the cultured host cells.
  • Particle proteins can be obtained.
  • Example 1 Confirmation of characteristics after manufacturing influenza A virus-like particle vaccine using HA1, NA1, HA3, NA2, and M2e5x antigens of influenza A virus
  • HA and NA genes of influenza A virus were cloned into pFast vector.
  • Recombinant baculovirus (rBV) expressing each antigen gene was cultured at 27°C for 7 days after transfection of the recombinant plasmid into SF-9 cells using Cellfectine II reagent (Invitrogen Waltham MA USA) in a 12-well plate. After confirming that the sf -9 cells infected with baculovirus increased in size under a microscope, each antigen was cultured at 2.5 ⁇ 10 6 cells/mL in a 250 mL flask at 100 mL of sf -9 media, 27°C, and 140 rpm.
  • Each of the generated recombinant baculoviruses (rBVs) HA1, NA1, HA3, NA2, and M1 rBVs was centrifuged at 3000 rpm for 30 minutes to obtain rBVs.
  • the prepared rBVs were cultured at 2.5 did.
  • the obtained VLPs were centrifuged at 30,000 rpm for 1 hour through a 60%, 30%, and 15% sucrose density gradient, and then the separated VLPs layer was obtained to obtain purified VLPs.
  • influenza A virus-like particles were generated from each antigen gene.
  • the manufactured virus-like particle vaccine was confirmed for its NA characteristics using a monoclonal antibody, and its HA characteristics were confirmed using a poly-clonal antibody.
  • H3N1N2, H1H3, H3N1M2e, and H1H3M2e were successfully prepared.
  • influenza A virus-like particle vaccines were inoculated into mice and influenza A virus (A/Puerto Rico/8/34, H1N1, A/HongKong/1/1968, H3N2, A/chicken/Vietnam/G04/2004, H5N1 ) and B/Colorado/06/2017 (Victoria lineage) were infected in mice and specific immune responses were confirmed in serum and lungs.
  • influenza A virus A/Puerto Rico/8/34, H1N1, A/HongKong/1/1968, H3N2, A/chicken/Vietnam/G04/2004, H5N1
  • B/Colorado/06/2017 Victoria lineage
  • the mouse group inoculated with H3N1N2, H1H3, H3N1M2e, and H1H3M2e VLPs showed higher antibody responses than Naive.
  • the antibody response in the vaccine group increased.
  • influenza B virus antigen an antibody response was observed upon vaccination with VLPs vaccine.
  • the H3N1M2e and H1H3M2e VLPs in the vaccination group containing M2e5x showed higher influenza-specific antibody responses to all A and B influenza antigens.
  • Example 3 Determination of virus titer in the lungs after influenza A and B virus infection
  • influenza A virus ⁇ A/Puerto Rico/8/34 (H1N1) and A/HongKong/1/1968 (H3N2), A/chicken/Vietnam/G04/2004 (H5N1) ⁇ , and B virus ⁇ B/Colorado/06/2017 (Victoria lineage) ⁇ was infected by the intranasal route in each group of mice.
  • lung tissue was separated, ground, and centrifuged at 6000 rpm at 4°C to obtain the supernatant.
  • MDCK cells are cultured in a 12 well plate at 37°C until the cell density reaches 100-110%. Afterwards, the virus supernatant obtained from the lung was serially diluted 10-fold and subjected to plaque assay. Incubate at 37°C for approximately 3 to 4 days until plaques form. Afterwards, it was stained with crystal violet.
  • H3N1M2e and H1H3M2e VLPs vaccines in the vaccinated group containing M2e5x showed lower virus titers compared to the unvaccinated group in both influenza A virus (H1N1, H3N2, H5N1) and influenza B virus (B/Victoria lineage).
  • H1N1, H3N2, H5N1 influenza A virus
  • H3N1N2, H1H3, H3N1M2e VLPs vaccinated group lost about 15-20% of body weight.
  • the H1H3M2e VLPs vaccine showed the lowest weight loss rate at about 10%. All VLPs vaccines showed a 100% survival rate.
  • the body weight of the H1H3 VLPs vaccine group decreased by approximately 20% or less on the 7th day after challenge.
  • body weight decreased by approximately 10%. decreased. All VLPs vaccinated groups recovered on days 7 to 9, showing a 100% survival rate.
  • the universal influenza A virus-derived virus-like particle vaccine (H1H3M2e, H3N1M2e, H3N1N2, and H1H3 VLPs) manufactured in the present invention is effective against lethal doses of various influenza A viruses (A/Puerto Rico/8/34, H1N1, A/ HongKong/1/1968, H3N2, A/chicken/Vietnam/G04/2004, H5N1) infection showed a 100% survival rate, and vaccine efficacy was shown in the order of H1H3M2e, H3N1M2e, H3N1N2, and H1H3 VLPs.
  • influenza B virus infection which has not yet been reported, a 100% survival rate was shown for all vaccines derived from influenza A virus H1H3M2e, H3N1N2, and H1H3 VLPs, and efficacy was shown in the order of H1H3M2e, H3N1N2, and H1H3 VLPs.
  • Virus-like particle vaccines expressing HA, NA, or M2e5X of the influenza A virus (H1H3M2e5x VLPs, H3N1M2e5x VLPs, H1H3 VLPs) were prepared, and an inactivated influenza A virus (Inactivated A/PR/8/34) vaccine was prepared as a control. .
  • Each vaccine 50 ⁇ g/ ⁇ l was inoculated three times at 4-week intervals in mice (BALB/c) as suggested in the animal infection experiment plan.
  • subjects were infected with a lethal dose (500 pfu/ml) of influenza B virus (Colorado/06/2017, Victoria lineage). Mice were sacrificed on the 4th day after infection, viral titers were measured in lung tissue, body weight was measured at the same time every day for 14 days after infection, and survival rate was measured (Figure 5).
  • mice inoculated with VLP vaccines had significantly reduced virus titers compared to the unvaccinated normal control group.
  • the H1H3M2e5x, H3N1M2e5x, and H1H3 VLPs vaccines showed virus titers that were approximately 2-2.5 times lower than those in the inactivated influenza A virus vaccine group (Figure 6).
  • the groups vaccinated with the virus-like particle vaccine showed similar weight loss (15-20%), all recovered to normal body weight, and all survived.
  • the control group inoculated with the inactivated influenza A virus did not recover to normal weight and showed a survival rate of about 60%.
  • all non-vaccinated normal mice died.
  • the three types of VLPs vaccines (H1H3M2e5x VLPs, H3N1M2e5x VLPs, H1H3 VLPs) were found to have better vaccine efficacy than the inactivated influenza A virus vaccine (Figure 7).

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Abstract

본 발명은 인플루엔자 A 바이러스 항원 단백질 HA, NA 또는 M2e5x를 포함하는 바이러스 유사입자 조합 백신에 관한 것으로서, 최근 세계보건기구 (WHO)가 예측한 2020/2021년 인플루엔자 바이러스 A/Guangdong-Maonan/SWL1536/2019 (H1N1) 와 A/Hong Kong/2671/2019 (H3N2)의 헤마글루티닌(hemaglutinin; HA) 및 뉴라미니다아제(neuraminidase; NA) 항원 단백질 및 기존 사람, 돼지, 조류 인플루엔자 바이러스의 이종 탠덤 M2e 반복(heterologous tandem M2e repeats; M2e5x) 항원 단백질의 조합이 발현하는 바이러스 유사입자 백신을 제조하여, A형 인플루엔자 바이러스 (H1N1, H3N2, H5N1) 및 B형 인플루엔자 바이러스 (B/Victoria lineages) 감염을 방어하는 재조합 범용 인플루엔자 바이러스 유사입자 백신을 개발하였다. 본 발명을 토대로 높은 면역원성을 나타내는 백신 개발로 다양한 인플루엔자에 높은 효능을 가진 바이러스 유사입자 백신은 세계적인 대유행 상황에서 인플루엔자 A 및 B 바이러스로 인한 감염 및 사망률을 낮출 수 있다.

Description

인플루엔자 A 바이러스 항원 단백질 HA, NA 또는 M2e5x를 포함하는 바이러스 유사입자 조합 백신
본 발명은 인플루엔자 A 바이러스 항원 단백질 헤마글루티닌(hemaglutinin; HA), 뉴라미니다아제(neuraminidase; NA) 또는 이종 탠덤 M2e 반복(heterologous tandem M2e repeats; M2e5x)를 포함하는 바이러스 유사입자 조합 백신에 대한 것이다.
인플루엔자는 급성 감염성 질병으로 높은 전염성을 가지며 발열, 근육통, 오한, 기침과 같은 증상이 발생한다. 2009년 멕시코를 시작으로 214개국 이상에서 인플루엔자 A형 바이러스가 확진되었으며 4월부터 대유행(Pandemic)이 종료한 2010년 8월까지 18,500명의 사망자를 발생시켰다. 현재 대유행(pandemic)을 일으킬 수 있는 유력한 후보로는 조류 인플루엔자 A(H5N1) 및 조류 인플루엔자 A(H7N9) 바이러스 (‘H5N1’ 및 ‘H7N9’) 가 있다. H5N1의 경우 16개국에서 826명의 감염자를 발생시켰고, 이 중 440명이 사망하여 약 53%의 높은 치사율을 나타냈다(2015, WHO). 인플루엔자 B 바이러스는 전체 인플루엔자 감염에 23%를 차지하고 있으며, 인플루엔자 관련 소아 사망률의 52%를 차지하고 있다.
인플루엔자 대유행이 발생할 경우 전 세계적으로 약 740만 ~ 1억 5천만 명에 이르는 사망자가 발생할 것으로 추정되며, 미국의 경우 대유행 발생 시 경제적 피해가 약 710억 ~ 1,670억 달러에 이를 것으로 추정된다.
현재, A형 인플루엔자 바이러스(A/PR/8/34, H1N1, A/Hong Kong/1/68, H3N2, A/Vietnam/2003, H5N1) 및 B형 인플루엔자 바이러스(B/Victoria lineages) 감염을 모두 방어할 수 있는 범용 백신은 아직 보고된 바 없어, 이를 개발할 필요성이 높다.
본 발명의 목적은 인플루엔자 A 바이러스 항원 단백질 헤마글루티닌(hemaglutinin; HA), 뉴라미니다아제(neuraminidase; NA) 또는 이종 탠덤 M2e 반복(heterologous tandem M2e repeats; M2e5x)을 조합하여 발현하는 인플루엔자 바이러스에 대한 면역 반응을 유도할 수 있는 바이러스-유사입자(Virus-like particles, VLPs)을 제공하는데 있다.
또한, 본 발명의 다른 목적은 상기 바이러스-유사입자를 유효성분으로 포함하는 백신 조성물을 제공하는데 있다.
또한, 본 발명의 또 다른 목적은 상기 바이러스-유사입자 제조용 발현 벡터, 상기 발현 벡터에 의해 형질 전환된 숙주 세포 및 상기 바이러스-유사입자의 제조방법을 제공하는데 있다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 헤마글루티닌 3(hemaglutinin 3; HA3), 뉴라미니다아제 1(neuraminidase; NA1) 및 뉴라미니다아제 2(neuraminidase; NA2)를 포함하는 인플루엔자 바이러스에 대한 면역 반응을 유도할 수 있는 바이러스-유사입자(Virus-like particles, VLPs)를 제공한다.
또한, 헤마글루티닌 1(hemaglutinin 1; HA1) 및 헤마글루티닌 3(hemaglutinin 3; HA3)를 포함하는 인플루엔자 바이러스에 대한 면역 반응을 유도할 수 있는 바이러스-유사입자(Virus-like particles, VLPs)를 제공한다.
또한, 헤마글루티닌 3(hemaglutinin 3; HA3), 뉴라미니다아제 1(neuraminidase; NA1) 및 이종 탠덤 M2e 반복(heterologous tandem M2e repeats; M2e5x)를 포함하는 인플루엔자 바이러스에 대한 면역 반응을 유도할 수 있는 바이러스-유사입자(Virus-like particles, VLPs)를 제공한다.
또한, 헤마글루티닌 1(hemaglutinin 1; HA1), 헤마글루티닌 3(hemaglutinin 3; HA3) 및 이종 탠덤 M2e 반복(heterologous tandem M2e repeats; M2e5x)를 포함하는 인플루엔자 바이러스에 대한 면역 반응을 유도할 수 있는 바이러스-유사입자(Virus-like particles, VLPs)를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 바이러스-유사입자를 유효성분으로 포함하는 백신 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 HA3을 암호화하는 서열번호 3의 핵산 서열; NA1을 암호화하는 서열번호 2의 핵산 서열 및 NA2를 암호화하는 서열번호 4의 핵산 서열을 포함하는 인플루엔자 바이러스에 대한 면역 반응을 유도할 수 있는 바이러스-유사입자 제조용 발현 벡터를 제공한다.
또한, 본 발명은 HA1을 암호화하는 서열번호 1의 핵산 서열 및 HA3을 암호화하는 서열번호 3의 핵산 서열을 포함하는 인플루엔자 바이러스에 대한 면역 반응을 유도할 수 있는 바이러스-유사입자 제조용 발현 벡터를 제공한다.
또한, 본 발명은 HA3을 암호화하는 서열번호 3의 핵산 서열; NA1을 암호화하는 서열번호 2의 핵산 서열 및 M2e5x를 암호화하는 서열번호 5의 핵산 서열을 포함하는 인플루엔자 바이러스에 대한 면역 반응을 유도할 수 있는 바이러스-유사입자 제조용 발현 벡터를 제공한다.
또한, 본 발명은 HA1을 암호화하는 서열번호 1의 핵산 서열; HA3을 암호화하는 서열번호 3의 핵산 서열 및 M2e5x를 암호화하는 서열번호 5의 핵산 서열을 포함하는 인플루엔자 바이러스에 대한 면역 반응을 유도할 수 있는 바이러스-유사입자 제조용 발현 벡터를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 발현 벡터에 의해 형질 전환된 숙주 세포를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 발현 벡터로 숙주 세포를 형질 전환하는 단계; 및 상기 숙주 세포를 배양하여 바이러스-유사입자를 발현시키는 단계를 포함하는 인플루엔자 바이러스에 대한 면역 반응을 유도할 수 있는 바이러스-유사입자의 제조 방법을 제공한다.
본 발명은 인플루엔자 A 바이러스 항원 단백질 HA, NA 또는 M2e5x를 포함하는 바이러스 유사입자 조합 백신에 관한 것으로서, 최근 세계보건기구 (WHO)가 예측한 2020/2021년 인플루엔자 바이러스 A/Guangdong-Maonan/SWL1536/2019 (H1N1) 와 A/Hong Kong/2671/2019 (H3N2)의 헤마글루티닌(hemaglutinin; HA) 및 뉴라미니다아제(neuraminidase; NA) 항원 단백질 및 기존 사람, 돼지, 조류 인플루엔자 바이러스의 이종 탠덤 M2e 반복(heterologous tandem M2e repeats; M2e5x) 항원 단백질의 조합이 발현하는 바이러스 유사입자 백신을 제조하여, A형 인플루엔자 바이러스 (H1N1, H3N2, H5N1) 및 B형 인플루엔자 바이러스 (B/Victoria lineages) 감염을 방어하는 재조합 범용 인플루엔자 바이러스 유사입자 백신을 개발하였다. 본 발명을 토대로 높은 면역원성을 나타내는 백신 개발로 다양한 인플루엔자에 높은 효능을 가진 바이러스 유사입자 백신은 세계적인 대유행 상황에서 인플루엔자 A 및 B 바이러스로 인한 감염 및 사망률을 낮출 수 있다.
도 1은 인플루엔자 A 바이러스 유사입자 특성 확인 결과를 나타낸다.
도 2는 혈청에서의 IgG 인플루엔자 A형 및 B형 특이 항체 반응 결과를 나타낸다.
도 3은 인플루엔자 A형 및 B형 바이러스 감염 이후 폐에서의 바이러스 역가 분석 결과를 나타낸다.
도 4는 인플루엔자 B 바이러스 감염 이후 몸무게 변화율 및 생존율 분석 결과를 나타낸다.
도 5는 인플루엔자 B 바이러스 동물 실험 계획표를 나타낸다
도 6은 인플루엔자 B 바이러스 감염 이후 폐 바이러스 역가 결과를 나타낸다.
도 7은 인플루엔자 B 바이러스 감염 이후 몸무게 변화 및 생존율 결과를 나타낸다.
본 발명은 헤마글루티닌 3(hemaglutinin 3; HA3), 뉴라미니다아제 1(neuraminidase; NA1) 및 뉴라미니다아제 2(neuraminidase; NA2)를 포함하는 인플루엔자 바이러스에 대한 면역 반응을 유도할 수 있는 바이러스-유사입자(Virus-like particles, VLPs)를 제공한다.
또한, 헤마글루티닌 1(hemaglutinin 1; HA1) 및 헤마글루티닌 3(hemaglutinin 3; HA3)를 포함하는 인플루엔자 바이러스에 대한 면역 반응을 유도할 수 있는 바이러스-유사입자(Virus-like particles, VLPs)를 제공한다.
또한, 헤마글루티닌 3(hemaglutinin 3; HA3), 뉴라미니다아제 1(neuraminidase; NA1) 및 이종 탠덤 M2e 반복(heterologous tandem M2e repeats; M2e5x)를 포함하는 인플루엔자 바이러스에 대한 면역 반응을 유도할 수 있는 바이러스-유사입자(Virus-like particles, VLPs)를 제공한다.
또한, 헤마글루티닌 1(hemaglutinin 1; HA1), 헤마글루티닌 3(hemaglutinin 3; HA3) 및 이종 탠덤 M2e 반복(heterologous tandem M2e repeats; M2e5x)를 포함하는 인플루엔자 바이러스에 대한 면역 반응을 유도할 수 있는 바이러스-유사입자(Virus-like particles, VLPs)를 제공한다.
바람직하게는, 상기 HA1은 서열번호 1의 핵산 서열에 의해 암호화되고, 상기 NA1은 서열번호 2의 핵산 서열에 의해 암호화되며, 상기 HA3은 서열번호 3의 핵산 서열에 의해 암호화되고, 상기 NA2는 서열번호 4의 핵산 서열에 의해 암호화되며, 상기 M2e5x는 서열번호 5의 핵산 서열에 의해 암호화될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
바람직하게는, 상기 인플루엔자 바이러스는 인플루엔자 A 바이러스 또는 인플루엔자 B 바이러스일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 사용된 HA1 및 NA1은 A/Guangdng-Maonan/SWL1536/2019 (H1N1)의 항원 단백질이고, HA1은 Accession #: EPI1542570이고, NA1은 Accession #: EPI1542569이다.
본 발명에 사용된 HA3 및 NA2는 A/Hong Kong/2671/2019 (H3N2)의 항원 단백질이고, HA3은 Accession #: EPI1698489이고, NA2는 Accession #: EPI1698488이다.
본 발명에서 “바이러스-유사입자(Virus-Like Particles, VLPs)”는 바이러스성 단백질을 수반하거나 수반하지 않는 비감염성 바이러스성 소단위체를 의미한다. 예컨대, 상기 바이러스-유사입자는 DNA 또는 RNA 게놈이 완전히 결여되어 있거나, 바이러스성 캡시드 단백질을 포함하는 바이러스 유사 입자의 경우 자발적 자가 어셈블리를 진행할 수도 있다.
본 발명에서 “인플루엔자 바이러스에 대한 면역 반응을 유도할 수 있는 바이러스-유사입자”는 인플루엔자 바이러스에 대한 특이적인 면역 반응을 유도하며, 바이러스와 유사한 형태를 가진 단백질 구조체(입자)를 의미한다.
상기 바이러스-유사입자는 바이러스에서 유래한 구조 단백질이 조립되어 바이러스와 유사한 형태의 입자를 생성함과 동시에 인플루엔자 바이러스으로부터 유래한 항원 결정 부위를 포함함으로써, 상기 바이러스-유사입자를 특정 개체에 접종하였을 때 인플루엔자 바이러스에 대한 특이적인 면역 반응을 유도할 수 있는 것을 특징으로 한다. 본 발명의 구체적 일 예로서, 상기 단백질 구조체는 바이러스 유래의 구조 단백질 외부에 인플루엔자 바이러스 유래의 항원 결정 부위가 결합된 형태를 가질 수 있다.
상기 바이러스 유래의 구조 단백질(core protein)은 인플루엔자 바이러스 매트릭스 단백질 1(Influenza virus matrix protein, M1)일 수 있다.
본 발명에서 “인플루엔자 바이러스 매트릭스 단백질 1(Influenza virus matrix protein, M1)”은 인플루엔자 바이러스의 구조 단백질로서, 인플루엔자 바이러스의 외피(envelop)인 지방층 안쪽에 코트(coat)를 형성하는 기질단백질(matrix protein)을 의미한다. 상기 인플루엔자 바이러스는 8개의 분절된 음성가닥 RNA, 표면 단백질인 헤마글루티닌(hemaglutinin, HA), 뉴라미니다아제(neuraminidase, NA), 뉴클레오프로테인(neucleoprotein, NP) 매트릭스(matrix, M1), 프로톤 이온-채널 단백질(proton ion-channel protein, M2), 중합효소 염기 단백질 1(polymerase acidic protein, PA), 중합효소 염기 단백질 2(PB2, polyMerase basic protein 2), 중합효소 산성 단백질(PA, polymerase acidic protein) 및 비구조 단백질 2(NS2, nonstructural protein 2)와 같은 단백질을 포함하는데, 이때 매트릭스 단백질 1은 외형을 층으로 둘러 쌓고 있음으로써 코어와 외피 간의 연결체로 작용한다. 상기 매트릭스 단백질 1은 바이러스-유사입자 생성에 있어, 바이러스-유사입자를 안정한 형태로 조립하는데 중요한 역할을 한다.
상기 바이러스-유사입자는 개체 내에서 항원으로 작용하며 수상돌기세포(dendritic cells)와 같은 항원 표지 세포와의 반응을 통해 T 또는 B 면역 세포에 항원을 표지할 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 바이러스-유사입자를 유효성분으로 포함하는 백신 조성물을 제공한다.
본 발명에서 “백신 조성물”은 백신 효과를 가지는 단백질 항원을 투여함으로써 이후의 병원균 감염을 예방할 수 있는 조성물을 의미한다. 상기 백신 조성물은 인플루엔자 바이러스에 대한 항원성을 나타내는 바이러스-유사입자를 포함하는 조성물일 수 있다.
구체적으로, 상기 백신 조성물은 약학적으로 허용되는 담체, 보조제, 면역 자극제 및 이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나를 포함하는 것일 수 있다.
상기 약학적으로 허용되는 담체는 당업계에 공지되어있으며, 단백질, 설탕 등을 포함한다. 상기 담체는 수용액 또는 비-수용액, 현탁액 및 에멀전일 수 있다. 비-수용액 담체는 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 식용유 예컨대 올리브 오일 및 주사 가능한 유기 에스테르 예컨대 에틸 올리에이트를 포함한다. 수용액 담체는 식용수 및 완충배지를 포함하는 물, 알코올/수용액, 에멀전 또는 현탁액을 포함한다. 비경구 담체는 염화나트륨 용액, 링거 덱스트로오스, 덱스트로오스 및 염화나트륨, 유산처리 링거 또는 고정 오일을 포함한다. 정맥주사용 담체는 링거 덱스트로오스를 기본으로 하는 것과 같은 전해질 보충제, 액체 및 영양 보충제 등을 포함한다. 방부제 및 기타 첨가제로서 항미생물제제, 항산화제, 킬레이트제, 불활성 가스 등과 같은 것을 추가로 포함할 수 있다. 방부제로는 포르말린 티메로살, 네오마이신, 폴리믹신 B 및 암포테리신 B를 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 백신 조성물은 보조제를 추가로 포함할 수 있다. 상기 보조제는 면역반응의 향상 및/또는 접종 후 흡수 속도를 촉진하는 화합물 또는 혼합물을 칭하는 것으로 임의의 흡수-촉진제를 포함한다. 허용가능한 보조제는 프로인트 완전보존제, 프로인트 불완전보존제, 사포닌, 미네랄 젤 예컨대 수산화 알루미늄, 계면활성제 예컨대 리소레시틴, 플투론 폴리올, 다가음이온, 펩타이드, 오일 또는 탄화수소 에멀전, 키홀림펫 헤모시아닌, 디니트로페놀 등을 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 백신 조성물은 면역 자극제를 추가로 포함할 수 있다. 상기 면역 자극제는 인공적으로 합성된 레바미솔, 이소프레노신 및 사이토카인을 포함할 수 있다. 사이토카인의 일 예로서 인터페론-α, 인터류킨-2, GM-CSF, GCSF 등이 있다. 상기 백신 조성물은 상기 바이러스-유사입자 또는 이의 농축액을 포함하는 형태이거나, 형질전환 숙주 세포 자체 또는 형질전환 세포의 건조 분말 형태로 사용할 수 있다. 또한, 상기 백신 조성물은 다른 식품 또는 식품 성분과 함께 사용할 수 있으며 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다.
상기 백신 조성물은 안정제, 유화제, 수산화알루미늄, 인산알루미늄, pH 조정제, 계면활성제, 리포솜, 이스콤(iscom) 보조제, 합성 글리코펩티드, 증량제, 카복시폴리메틸렌, 세균 세포벽, 세균 세포벽의 유도체, 세균백신, 동물 폭스바이러스 단백질, 바이러스 일부(subviral) 입자 보조제, 콜레라 독소, N, N-디옥타데실-N',N'-비스(2-하이드록시에틸)-프로판디아민, 모노포스포릴 지질 A, 디메틸디옥타데실-암모늄 브로마이드 및 이의 혼합물로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 제2보조제를 더 포함할 수 있다.
상기 백신 조성물은 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용할 수 있다. 제제화할 경우에는 통상적으로 사용되는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제가 함께 사용될 수 있다.
경구투여를 위한 고형제제는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 레시틴 유사 유화제에 적어도 하나 이상의 부형제 예컨대, 전분, 칼슘카보네이트calcium carbonate), 수크로오스 또는 락토오스, 젤라틴 등이 함께 사용될 수 있다. 또한 상기 부형제 이외에 마그네슘 스티레이트 탈크 같은 윤활제가 사용될 수도 있다.
경구투여를 위한 액상제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 사용될 수 있으며, 통상적으로 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 다양한 부형제, 예컨대 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 사용될 수 있다.
비경구투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수용성제, 현탁제, 유제, 동결건조제제가 사용될 수 있다. 비수용성제제, 현탁제는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다.
또한, 본 발명은 HA3을 암호화하는 서열번호 3의 핵산 서열; NA1을 암호화하는 서열번호 2의 핵산 서열 및 NA2를 암호화하는 서열번호 4의 핵산 서열을 포함하는 인플루엔자 바이러스에 대한 면역 반응을 유도할 수 있는 바이러스-유사입자 제조용 발현 벡터를 제공한다.
또한, 본 발명은 HA1을 암호화하는 서열번호 1의 핵산 서열 및 HA3을 암호화하는 서열번호 3의 핵산 서열을 포함하는 인플루엔자 바이러스에 대한 면역 반응을 유도할 수 있는 바이러스-유사입자 제조용 발현 벡터를 제공한다.
또한, 본 발명은 HA3을 암호화하는 서열번호 3의 핵산 서열; NA1을 암호화하는 서열번호 2의 핵산 서열 및 M2e5x를 암호화하는 서열번호 5의 핵산 서열을 포함하는 인플루엔자 바이러스에 대한 면역 반응을 유도할 수 있는 바이러스-유사입자 제조용 발현 벡터를 제공한다.
또한, 본 발명은 HA1을 암호화하는 서열번호 1의 핵산 서열; HA3을 암호화하는 서열번호 3의 핵산 서열 및 M2e5x를 암호화하는 서열번호 5의 핵산 서열을 포함하는 인플루엔자 바이러스에 대한 면역 반응을 유도할 수 있는 바이러스-유사입자 제조용 발현 벡터를 제공한다.
본 발명에서 용어 “벡터”는 연결되어 있는 핵산 단편을 운반하는데 이용되는 핵산 분자를 의미한다. 상기 벡터는 박테리아, 플라스미드, 파지, 코스미드, 에피솜, 바이러스 및 삽입가능한 DNA 단편(즉, 상동재조합에 의해 숙주 세포 게놈 안으로 삽입 가능한 단편)이 사용될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 상기 플라스미드는 벡터의 일종으로서 내부에 추가적으로 DNA 단편을 연결시킬 수 있는 고리형의 이중 가닥 DNA 루프를 의미한다. 또한, 바이러스 벡터는 추가적인 DNA를 바이러스 게놈 안에 연결시킬 수 있다.
본 발명에서 용어 “발현 벡터”는 작동 가능하도록 연결된 목적 단백질을 암호화하는 유전자의 발현을 지시할 수 있는 벡터를 의미한다. 일반적으로, 재조합 DNA 기술의 사용에서 발현 벡터는 플라스미드 형태이므로, 용어 플라스미드 및 벡터가 상호 교환적으로 사용될 수 있다. 그러나, 바이러스 벡터와 같이 동일한 기능을 수행하는 다른 형태의 발현 벡터들도 포함할 수 있다.
구체적으로, 상기 벡터는 베큘로바이러스(Baculovirus) 벡터일 수 있다. 상기 베큘로바이러스(Baculovirus)는 사람이나 척추동물에는 병원성이 없으며, 곤충에 대해서만 병원성을 가지고 있는 병원성 바이러스를 의미한다.
상기 발현 벡터는 숙주 세포 내로 도입되고, 상기 도입된 벡터에 의해 형질 전환된 숙주 세포는 상기 바이러스-유사입자를 생산할 수 있다. 이 때, 상기 벡터는 숙주 생물체에 의해 인지되는 프로모터를 포함할 수 있다.
상기 바이러스-유사입자를 암호화하는 핵산 서열은 상기 프로모터 서열과 작동 가능하게 연결될(operably linked) 수 있다. 상기 "작동 가능하게 연결된(operably linked)"은 하나의 핵산 단편이 다른 핵산 단편과 결합되어 그의 기능 또는 발현이 다른 핵산 단편에 의해 영향을 받는 것을 의미한다. 즉, 상기 바이러스-유사입자를 암호화하는 유전자는 벡터 내에 있는 프로모터와 작동 가능하게 연결되어 발현이 조절될 수 있다.
또한, 상기 발현 벡터는 형질 전환된 숙주 세포를 선별하는데 필요한 적절한 마커 유전자를 포함할 수 있다. 상기 마커 유전자는 항생제 저항성 유전자 또는 형광 단백질 유전자일 수 있으며, 상기 항생제 저항성 유전자는 히그로마이신 저항성 유전자, 카나마이신 저항성 유전자, 클로람페니콜 저항성 유전자 및 테트라사이클린 저항성 유전자로 구성된 군에서 선택될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 형광 단백질 유전자는 효모-강화 녹색 형광 단백질(yeast-enhanced green fluorescent protein, yEGFP) 유전자, 녹색 형광 단백질(green fluorescent protein, GFP) 유전자, 청색 형광 단백질(blue fluorescent protein, BFP) 유전자 및 적색 형광 단백질(red fluorescent protein, RFP) 유전자로 구성된 군에서 선택될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 본 발명은 발현 벡터에 의해 형질 전환된 숙주 세포를 제공한다.
본 발명에서 용어 “숙주 세포(host cell)”는 바이러스에 의해 감염될 수 있고 바이러스 유사 입자에 의해 면역될 수 있는 모든 유기체를 의미한다. 상기 숙주 세포는 형질 전환에 의해 대사 조작될 수 있다.
상기 숙주 세포는 미생물, 동물세포, 식물세포, 동물에서 유래한 배양세포, 또는 식물에서 유래한 배양세포일 수 있다. 상기 적합한 숙주 세포는 자연적으로 발생하거나 또는 야생형 숙주 세포일 수 있고, 또는 변화된 숙주 세포일 수 있다. 상기 야생형 숙주 세포(wide-type host cell)는 재조합 방법에 의해 유전적으로 변화되지 않은 숙주 세포일 수 있다.
본 발명에서 “형질 전환”은 상기 벡터를 미생물 또는 특정 세포 내로 운반하는 방법을 의미하며, 형질 전환 대상 세포가 원핵세포인 경우에는, CaCl2 방법, 하나한 방법 및 전기 천공 방법 등에 의해 실시될 수 있다. 형질 전환 대상 세포가 진핵세포인 경우에는, 미세 주입법, 칼슘 포스페이트 침전법, 전기 천공법, 리포좀-매개 형질감염법, DEAE-덱스트란 처리법 및 유전자 밤바드먼트 등을 이용하여 실시할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 효모와 같은 진균의 형질 전환의 경우에는, 일반적으로 리튬 아세테이트 및 열 충격을 이용한 형질 전환법과 전기천공법에 의해 실시될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 본 발명은 상기 발현 벡터로 숙주 세포를 형질 전환하는 단계; 및 상기 숙주 세포를 배양하여 바이러스-유사입자를 발현시키는 단계를 포함하는 인플루엔자 바이러스에 대한 면역 반응을 유도할 수 있는 바이러스-유사입자의 제조 방법을 제공한다.
상기 바이러스-유사입자는 유전 공학적인 방법에 의해 제조될 수 있으며, 별도의 원인 감염체, 즉 본 발명에서는 인플루엔자 바이러스 없이도 유전 공학적인 방법에 의해 제조될 수 있으므로 높은 생산성 및 경제성이 구현될 수 있다.
상기 바이러스-유사입자는 당해 기술 분야에 널리 알려진 방법에 의해 제조될 수 있다. 예컨대, 상기 바이러스-유사입자는 상기 구조 단백질 및 항원 인식 부위를 암호화하는 재조합 DNA 분자를 이용하여 소정의 숙주 세포를 형질 전환시킨 후 배양하여 제조될 수 있으며, 세포 안에서 발현된 단백질이 세포 표면에서 조립된 후 배양 상층액으로 배출될 수 있다. 이 때, 상기 바이러스-유사입자에 포함된 표면단백질은 고정화 과정을 거치지 않고 자연 그대로의 형태를 유지하고 있으므로 개체 내에서 특정 병원체에 대한 목적하는 면역반응을 유도할 수 있다.
상기 형질 전환된 숙주 세포는 배치, 공급-배치 또는 연속 발효 조건 하에서 배양될 수 있으며, 상기 숙주 세포는 형질 전환에 의해 상기 바이러스-유사입자를 발현할 수 있으므로 상기 배양된 숙주 세포로부터 상기 바이러스-유사입자 단백질을 수득할 수 있다.
이하에서는, 본 발명을 한정하지 않는 실시예에 따라 본 발명을 상세히 설명한다. 본 발명의 하기 실시예는 본 발명을 구체화하기 위한 것일 뿐 본 발명의 권리범위를 제한하거나 한정하는 것이 아님은 물론이다. 따라서, 본 발명의 상세한 설명 및 실시예로부터 본 발명이 속하는 기술분야의 전문가가 용이하게 유추할 수 있는 것은 본 발명의 권리범위에 속하는 것으로 해석된다.
<실시예 1> 인플루엔자 A 바이러스의 HA1, NA1, HA3, NA2, M2e5x 항원을 이용하여 인플루엔자 A 바이러스 유사입자 백신 제조 후 특성 확인
인플루엔자 A 바이러스의 HA 및 NA 유전자를 pFast vector에 클로닝하였다. 각각의 항원 유전자를 발현하는 재조합 베큘로바이러스(rBV)는 12well 플레이트에서 재조합 플라스미드를 SF-9 cells에 Cellfectine II 시약 (Invitrogen Waltham MA USA)을 이용해 형질감염 후 7일간 27℃ 배양하였다. 베큘로바이러스에 감염된 sf-9 cell은 현미경에서 크기가 커짐을 확인 후 250mL 플라스크에 2.5×106cells/mL로 각각 항원을 sf-9 media 100mL, 27℃, 140rpm으로 배양하였다. 생성된 각각의 재조합 베큘로바이러스(rBVs) HA1, NA1, HA3, NA2, M1 rBVs는 3000rpm, 30분으로 원심분리 후 rBVs를 수득하였다. 제조된 rBVs는 제조할 VLPs 백신에 맞게 2.5×106cells/mL로 27℃, 140rpm으로 2-3일간 배양 후 6000rpm, 30분 원심분리하여 바이러스 유사입자 백신 H3N1N2, H1H3, H3N1M2e, H1H3M2e VLPs를 수득하였다. 수득한 VLPs는 60%, 30%, 15% 수크로오스 밀도 구배를 통해 30000rpm, 한 시간으로 원심분리 후 분리된 VLPs 층을 수득하여 정제된 VLPs를 얻었다.
도 1에서 나타낸 바와 같이, 웨스턴블롯을 통해 각각의 항원 유전자를 인플루엔자 A 바이러스 유사입자가 생성됨을 확인하였다. 제조된 바이러스 유사입자 백신은 monoclonal antibody를 이용해 NA의 특성 확인했으며, poly-clonal antibody를 이용해 HA의 특성을 확인하였다. H3N1N2, H1H3, H3N1M2e, H1H3M2e를 성공적으로 제조하였다.
<실시예 2> 동물모델에서 백신효능 검증
제조된 다양한 인플루엔자 A 바이러스 유사입자 백신을 마우스에 접종하고 인플루엔자 A 바이러스 (A/Puerto Rico/8/34, H1N1, A/HongKong/1/1968, H3N2, A/chicken/Vietnam/G04/2004, H5N1)와 B/Colorado/06/2017(Victoria lineage)를 마우스에 감염하여 혈청과 폐에서 특이 면역 반응 확인하였다.
제조한 H3N1N2, H1H3, H3N1M2e, H1H3M2e VLPs는 비강 경로로 10ug을 BALB/c 마우스에 3주 간격 3회 접종했으며 접종 4주 간격으로 헤파린 튜브를 이용해 마우스 안와 채혈로 혈청을 수집하고 한 시간 상온에서 반응 후 5000rpm 10분간 원심분리기를 통해 상등액을 수득하였다. 수득된 혈청은 Inactivated H1N1, H3N2, H5N1 및 B/Colorado 인플루엔자 바이러스를 각각 4ug/ml로 코팅하여 수득한 혈청을 희석(1:50)하여 37℃에서 한 시간 반응되었다. 이후 2차 항체로 HRP conjugated goat anti-mouse IgG (1:2000) 인플루엔자 A형 및 B형 바이러스 특이적으로 반응하는 IgG 항체 형성 정도를 ELISA로 분석하였다.
도 2에서 나타낸 바와 같이, H3N1N2, H1H3, H3N1M2e, H1H3M2e VLPs로 접종된 마우스 그룹은 Naive보다 항체 반응이 높게 나타났다. 백신을 접종하는 회차가 증가함에 따라 백신 그룹의 항체 반응이 증가되었다. B형 인플루엔자 바이러스 항원 코팅에도 불구하고 VLPs 백신으로 접종 시 항체 반응이 나타났다. 또한, M2e5x가 들어간 백신 접종 군 H3N1M2e, H1H3M2e VLPs의 경우 모든 A 및 B 인플루엔자 항원에서 더 높은 인플루엔자 특이적 항체 반응을 보였다.
< 실시예 3> 인플루엔자 A형 및 B형 바이러스 감염 이후 폐에서의 바이러스 역가 확인
백신 접종 이후 치사량의 인플루엔자 A형 바이러스 {A/Puerto Rico/8/34 (H1N1) 와 A/HongKong/1/1968 (H3N2), A/chicken/Vietnam/G04/2004 (H5N1)}, B형 바이러스 {B/Colorado/06/2017(Victoria lineage)}를 각 마우스 그룹에 비강 경로로 감염시켰다. 감염 4일 차에 폐 조직을 분리해 갈아 6000rpm, 4℃ 원심분리 후 상층액을 수득하였다. MDCK cell을 12 well 플레이트에 100-110%가 될 때까지 37℃에서 배양한다. 이후 폐에서 수득한 바이러스 상등액은 10배씩 연속 희석을 통해 plaque assay를 진행하였다. Plaque가 생기기까지 약 3~4일간 37℃에서 배양한다. 이후 Crystal violet으로 염색하였다.
도 3에서 나타낸 바와 같이, H3N1N2, H1H3, H3N1M2e, H1H3M2e VLPs 백신 접종그룹은 백신 미접종 그룹인 Naive+Cha에 비해 낮은 바이러스 역가가 측정되었다. H1N1, H3N2 유래 HA와 NA를 사용하여 VLPs 백신을 만들었음에도 불구하고 H5N1, B/Victoria lineage에서 Naive+Cha 대조군과 확연한 차이로 적은 바이러스 역가를 보였다. 특히 M2e5x가 들어간 백신 접종 군 H3N1M2e, H1H3M2e VLPs 백신은 A형 인플루엔자 바이러스(H1N1, H3N2, H5N1) 및 B형 인플루엔자 바이러스(B/Victoria lineage) 모두에서 미접종그룹에 비해 낮은 바이러스 역가를 나타냈다.
< 실시예 4> 인플루엔자 B 바이러스 감염 이후 몸무게 변화율 및 생존율 분석
3차 백신 접종 4주 후에 치사량의 인플루엔자 A 바이러스 {A/Puerto Rico/8/34 (H1N1) 와 A/HongKong/1/1968 (H3N2), A/chicken/Vietnam/G04/2004 (H5N1)}, B형 바이러스 {B/Colorado/06/2017(Victoria lineage)를 마우스에 감염시킴. 감염 14일 동안 24시간 주기로 몸무게 및 생존율을 관찰하였다.
도 4에서 나타낸 바와 같이, 인플루엔자 A 바이러스(H1N1, H3N2, H5N1)로 공격 감염 시 H3N1N2, H1H3, H3N1M2e VLPs 백신 접종군의 경우 약 15~20%의 체중 감소하였다. 특히 H1H3M2e VLPs 백신이 약 10%로 가장 낮은 체중 감소율을 보였다. 모든 VLPs 백신의 경우 100%의 생존율을 나타냈다.
인플루엔자 B/Colorado/06/2017(Victoria lineage) 바이러스로 공격 감염 시 H1H3 VLPs 백신 그룹은 공격 감염 7일 차 체중은 약 20% 이하로 감소하였으며 특히, H3N1N2, H1H3M2e VLPs 백신의 경우 체중이 약 10% 감소하였다. 모든 VLPs 백신 접종 군은 7~9일 차에 회복되어 100%의 생존율을 나타냈다.
결론적으로, 본 발명에서 제조한 A형 인플루엔자 바이러스 유래 바이러스 유사입자 범용 백신(H1H3M2e, H3N1M2e, H3N1N2 및 H1H3 VLPs)은 치사량의 다양한 인플루엔자 A형 바이러스(A/Puerto Rico/8/34, H1N1, A/HongKong/1/1968, H3N2, A/chicken/Vietnam/G04/2004, H5N1) 감염에 100%의 생존율를 보였으며 백신효능은 H1H3M2e, H3N1M2e, H3N1N2 및 H1H3 VLPs의 순서로 나타났다.
특히, 아직 보고 된적이 없는 인플루엔자 B형 바이러스 감염에서 A형 인플루엔자 바이러스 유래 H1H3M2e, H3N1N2 및 H1H3 VLPs 백신 모두에서 100% 생존율을 보였고, 효능은 H1H3M2e, H3N1N2 및 H1H3 VLPs의 순서로 나타났다.
<실시예 5> 인플루엔자 B 바이러스 동물 감염 실험
1. 실험방법
인플루엔자 A 바이러스의 HA, NA 또는 M2e5X를 발현하는 바이러스 유사입자 백신(H1H3M2e5x VLPs, H3N1M2e5x VLPs, H1H3 VLPs)을 제조하고 대조군으로 불활성화 인플루엔자 A 바이러스(Inactivated A/PR/8/34) 백신을 제조하였다. 동물 감염 실험 계획에 제시한 대로 각 백신(50 μg/μl)을 마우스(BALB/c)에 4주 간격으로 3차 접종하였다. 3차 백신 접종 후 4주차에 치사량(500 pfu/ml)의 인플루엔자 B 바이러스(Colorado/06/2017, Victoria lineage)을 감염시켰다. 감염 후 4일차에 마우스를 희생시켜 폐 조직에서 바이러스 역가를 측정하고 감염 후 14일간 매일 동일한 시간에 몸무게를 측정하고 생존율을 측정하였다(도 5).
2. 실험결과
(1) 폐 조직 인플루엔자 B 바이러스 역가
VLP 백신 (H1H3M2e5x VLPs, H3N1M2e5x VLPs, H1H3 VLPs)에 접종된 마우스는 접종이 안된 정상 대조군에 비해 바이러스 역가가 유의하게 감소되었다. 또한 H1H3M2e5x, H3N1M2e5x, H1H3 VLPs 백신은 불활성 인플루엔자 A 바이러스 백신 접종군에 비해 바이러스 역가가 약 2-2.5배 낮은 수준으로 나타났다(도 6).
(2) 마우스 몸무게 변화와 생존율 검사
바이러스 유사입자 백신(H1H3M2e5x VLPs, H3N1M2e5x VLPs, H1H3 VLPs) 접종 그룹들은 유사한 몸무게 감소(15-20%)을 보였으며 모두 정상 몸무게로 회복되었고 모두 생존하였다. 대조군 불활성화 인플루엔자 A 바이러스 접종군은 정상 몸무게로 회복되지 않았고 약 60%의 생존율 보였다. 반면에 백신 접종 안된 정상 마우스는 모두 사망하였다. 결론적으로 3종의 VLPs 백신(H1H3M2e5x VLPs, H3N1M2e5x VLPs, H1H3 VLPs)은 불활성화 인플루엔자 A 바이러스 백신 보다 백신 효능이 우수하다는 것을 알 수 있었다(도 7).
이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현 예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

Claims (14)

  1. 헤마글루티닌 3(hemaglutinin 3; HA3), 뉴라미니다아제 1(neuraminidase; NA1) 및 뉴라미니다아제 2(neuraminidase; NA2)를 포함하는 인플루엔자 바이러스에 대한 면역 반응을 유도할 수 있는 바이러스-유사입자(Virus-like particles, VLPs).
  2. 헤마글루티닌 1(hemaglutinin 1; HA1) 및 헤마글루티닌 3(hemaglutinin 3; HA3)를 포함하는 인플루엔자 바이러스에 대한 면역 반응을 유도할 수 있는 바이러스-유사입자(Virus-like particles, VLPs).
  3. 헤마글루티닌 3(hemaglutinin 3; HA3), 뉴라미니다아제 1(neuraminidase; NA1) 및 이종 탠덤 M2e 반복(heterologous tandem M2e repeats; M2e5x)를 포함하는 인플루엔자 바이러스에 대한 면역 반응을 유도할 수 있는 바이러스-유사입자(Virus-like particles, VLPs).
  4. 헤마글루티닌 1(hemaglutinin 1; HA1), 헤마글루티닌 3(hemaglutinin 3; HA3) 및 이종 탠덤 M2e 반복(heterologous tandem M2e repeats; M2e5x)를 포함하는 인플루엔자 바이러스에 대한 면역 반응을 유도할 수 있는 바이러스-유사입자(Virus-like particles, VLPs).
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 HA1은 서열번호 1의 핵산 서열에 의해 암호화되고, 상기 NA1은 서열번호 2의 핵산 서열에 의해 암호화되며, 상기 HA3은 서열번호 3의 핵산 서열에 의해 암호화되고, 상기 NA2는 서열번호 4의 핵산 서열에 의해 암호화되며, 상기 M2e5x는 서열번호 5의 핵산 서열에 의해 암호화되는 것을 특징으로 하는 인플루엔자 바이러스에 대한 면역 반응을 유도할 수 있는 바이러스-유사입자.
  6. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 인플루엔자 바이러스는 인플루엔자 A 바이러스 또는 인플루엔자 B 바이러스인 것을 특징으로 하는 인플루엔자 바이러스에 대한 면역 반응을 유도할 수 있는 바이러스-유사입자.
  7. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항의 바이러스-유사입자를 유효성분으로 포함하는 백신 조성물.
  8. HA3을 암호화하는 서열번호 3의 핵산 서열; NA1을 암호화하는 서열번호 2의 핵산 서열 및 NA2를 암호화하는 서열번호 4의 핵산 서열을 포함하는 인플루엔자 바이러스에 대한 면역 반응을 유도할 수 있는 바이러스-유사입자 제조용 발현 벡터.
  9. HA1을 암호화하는 서열번호 1의 핵산 서열 및 HA3을 암호화하는 서열번호 3의 핵산 서열을 포함하는 인플루엔자 바이러스에 대한 면역 반응을 유도할 수 있는 바이러스-유사입자 제조용 발현 벡터.
  10. HA3을 암호화하는 서열번호 3의 핵산 서열; NA1을 암호화하는 서열번호 2의 핵산 서열 및 M2e5x를 암호화하는 서열번호 5의 핵산 서열을 포함하는 인플루엔자 바이러스에 대한 면역 반응을 유도할 수 있는 바이러스-유사입자 제조용 발현 벡터.
  11. HA1을 암호화하는 서열번호 1의 핵산 서열; HA3을 암호화하는 서열번호 3의 핵산 서열 및 M2e5x를 암호화하는 서열번호 5의 핵산 서열을 포함하는 인플루엔자 바이러스에 대한 면역 반응을 유도할 수 있는 바이러스-유사입자 제조용 발현 벡터.
  12. 제8항 내지 제11항 중 어느 한 항의 발현 벡터에 의해 형질 전환된 숙주 세포.
  13. 제12항에 있어서, 상기 숙주 세포는 미생물, 동물세포, 식물세포, 동물에서 유래한 배양세포, 또는 식물에서 유래한 배양세포인 것을 특징으로 하는 숙주 세포.
  14. 제8항 내지 제11항 중 어느 한 항의 발현 벡터로 숙주 세포를 형질 전환하는 단계; 및
    상기 숙주 세포를 배양하여 바이러스-유사입자를 발현시키는 단계를 포함하는 인플루엔자 바이러스에 대한 면역 반응을 유도할 수 있는 바이러스-유사입자의 제조 방법.
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