WO2024053677A1 - 重複遺伝子のゲノム編集方法 - Google Patents

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WO2024053677A1
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sequence
genome editing
target sequence
mismatch
genome
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茂夫 菅野
玲花 長谷川
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国立研究開発法人産業技術総合研究所
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression

Definitions

  • the present invention relates to genome editing of duplicated genes.
  • Genome editing is a technology that introduces (edits) mutations into targeted locations in the genome of a target organism. Therefore, compared to existing mutagenesis methods such as radiation, the efficiency of obtaining the desired strain from a significantly smaller number of mutants is an advantage, and it is used for a variety of purposes.
  • CRISPR/Cas9 and CRISPR/Cas12a which are typical genome editing technologies
  • the sequences to be edited are mainly defined by sites called spacer sequences of the gRNAs or crRNAs that constitute them.
  • spacer sequence for gRNA or crRNA 20 to 24 bases are usually used as a target sequence that can be changed arbitrarily.
  • a base sequence of about 2 to 4 bases called a PAM sequence is required for the nucleases Cas9 and Cas12a to function. Therefore, genome editing is performed by specifically recognizing base sequences of about 22 to 28 bases in total, including the PAM sequence and spacer sequence. This recognition length is said to be long enough to specify a single region of the human genome.
  • Another method for editing multiple genes at the same time is to utilize the off-target effects of CRISPR.
  • This method utilizes the property of CRISPR/Cas9 gRNA or crRNA to cleave mismatched sequences.
  • CRISPR/Cas9 gRNA or crRNA to cleave mismatched sequences.
  • a gRNA sequence that targets 20 to 24 bases is designed to edit multiple different genes with 1 to 2 base mismatches
  • multiple genes can be edited simultaneously with a single gRNA or crRNA. be.
  • methods that utilize these off-target effects have the advantage that they require less effort to construct vectors because they can edit a large number of genes with fewer gRNAs or crRNAs. There is.
  • SpyCas9 Streptococcus pyogenes Cas9
  • Non-Patent Document 1 Nat Biotechnol. 2014 Mar; 32(3): 279-284. Therefore, currently, there is no choice but to choose between simultaneously editing the mismatched sequence by recognizing the PAM sequence + 20 bases, or simultaneously editing the homologous gene in which the PAM sequence + 17 bases completely match.
  • Non-patent document 2 Science (2020) 369, 333-337
  • Non-patent document 3 Nature Communications (2021) volume 12, Article number: 4476.
  • Reas ⁇ based on crystal structure analysis, and the reaction rate increases in vCas ⁇ in which positions 155 to 176, which correspond to the helix that is predicted to interact with the non-target chain, are deleted.
  • Non-Patent Document 4 Nature Structural & Molecular Biology (2021) vol.28, pp.652-661). Genome editing in plants using Cas ⁇ has also been reported (Non-Patent Document 5: Int. J. Mol. Sci. (2022), 23, 5755).
  • the inventors analyzed the genome sequence information of Arabidopsis thaliana, which is a typical example of a plant where functional redundancy is a problem, and analyzed the extent to which the sequences of genes with functional redundancy contiguously match each other. . As a result, it was found that nearly half of the genes had consecutive matching base sequences of less than 24 bases in length. Therefore, we found that CRISPR/Cas9 and CRISPR/Cas12a have problems in that the recognition length is too long or the off-target effect is too small in order to destroy homologous gene groups with functional redundancy.
  • the present invention was made to solve this problem, and aims to provide a technology for simultaneously editing a large number of genes with overlapping functions using a small number of gRNAs or crRNAs.
  • the invention therefore relates to: [1] A method for genome editing a duplicated gene in a cell, wherein the duplicated gene has only a 16 nucleotide long target sequence to be genome edited, or a 16 or 17 nucleotide long target sequence and the target.
  • the genome editing method according to item 1 wherein the Cas ⁇ protein includes an amino acid sequence having at least 80% sequence homology to an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 1, 2, 3, and 4. .
  • the duplicated gene is a duplicated sequence with functional redundancy.
  • the duplicated gene includes a PAM sequence in the vicinity of the target sequence.
  • the spacer sequence is determined to completely match the target sequence.
  • the duplicated gene has a target sequence with a length of 16 or more nucleotides, and optionally a mismatch sequence containing a mismatch of 1 to 2 bases with respect to the target sequence. Genome editing methods described. [8] The genome according to any one of items 1 to 7, wherein the duplicated gene has a target sequence with a length of 17 or more nucleotides and a mismatch sequence containing a 1 to 2 base mismatch with the target sequence. How to edit. [9] The genome editing method according to any one of items 1 to 8, wherein the duplicated gene is present in 2 to 100 copies in the genome of the cell.
  • a kit for genome editing of a duplicated gene in a cell wherein the duplicated gene has only a 16 nucleotide long target sequence to be subjected to genome editing, or a 16 or 17 nucleotide long target sequence and the and a mismatch sequence containing a mismatch of 1 to 2 bases with respect to the target sequence, and the kit has; (a) an expression cassette for crRNA into which a spacer sequence targeting the target sequence and the mismatch sequence can be introduced; and (b) The kit is derived from a huge phage and includes an expression cassette for a Cas ⁇ protein capable of cleaving the target sequence and the mismatch sequence.
  • a large number of homologous genes can be edited simultaneously using a small number of crRNAs.
  • FIG. 1A shows a graph in which duplicated genes in Arabidopsis are divided into groups and classified according to the length of contiguous base sequences that match within each group. 1383 overlapping gene groups were extracted from PTGbase. The horizontal axis represents the length of matching continuous base sequences, and the vertical axis represents the number of groups.
  • FIG. 1B shows a graph in which the length of consecutive base sequences that match on the horizontal axis in FIG. 1A is enlarged from 1 to 60 residues. There are 818 groups of duplicated genes with consecutive matches of less than 30 bases, and when PAM is included, there is a low probability that many duplicated genes will be targeted simultaneously.
  • Figure 2A shows the vector map of pEX-35S-HPT.
  • FIG. 2B shows the vector map of pEX-CasPhi2-HPT.
  • FIG. 3 is a graph showing the editing efficiency when the nucleotide length of the spacer sequence is changed when genome editing is performed using Cas ⁇ 2 and vCas ⁇ .
  • FIG. 4 shows an analysis of the results of genome editing at the site where a gene was introduced by performing agroinfiltration on tobacco leaves.
  • FIG. 4(A) shows the mutations introduced when targeting NbPDS-1.
  • FIG. 4 shows an analysis of the results of genome editing at the site where a gene was introduced by performing agroinfiltration on tobacco leaves.
  • FIG. 4(B) shows the mutations introduced when targeting NbPDS-2.
  • FIG. 4 shows an analysis of the results of genome editing at the site where a gene was introduced by performing agroinfiltration on tobacco leaves.
  • FIG. 4(C) shows the mutations introduced when targeting NbRDR6-1.
  • FIG. 4 shows an analysis of the results of genome editing at the site where a gene was introduced by performing agroinfiltration on tobacco leaves.
  • FIG. 4(D) shows the mutations introduced when targeting NbRDR6-2.
  • FIG. 4 shows an analysis of the results of genome editing at the site where a gene was introduced by performing agroinfiltration on tobacco leaves.
  • FIG. 4(E) shows the mutations introduced when targeting NbSGS3-1.
  • FIG. 4 shows an analysis of the results of genome editing at the site where a gene was introduced by performing agroinfiltration on tobacco leaves.
  • FIG. 4(C) shows the mutations introduced when targeting NbRDR6-1.
  • FIG. 4 shows an analysis of the results of genome editing at the site where a gene was introduced by performing agroinfiltration on tobacco leaves
  • FIG. 5(A) shows the amino acid sequence of Cas ⁇ 2 (SEQ ID NO: 1).
  • FIG. 5(B) shows the amino acid sequence of Cas ⁇ 1 (SEQ ID NO: 2).
  • FIG. 5(C) shows the amino acid sequence of Cas ⁇ 3 (SEQ ID NO: 3).
  • FIG. 5(D) shows the DNA sequence (uppercase letters) of Arabidopsis thaliana codon-optimized Cas ⁇ 2 + the DNA sequence encoding the nuclear export signal and FLAG tag (SEQ ID NO: 9).
  • FIG. 5(E) shows the base sequence (SEQ ID NO: 10) of the coding region of Cas ⁇ 2 on the constructed plasmid.
  • FIG. 5(A) shows the amino acid sequence of Cas ⁇ 2 (SEQ ID NO: 1).
  • FIG. 5(B) shows the amino acid sequence of Cas ⁇ 1 (SEQ ID NO: 2).
  • FIG. 5(C) shows the amino acid sequence of Cas ⁇ 3 (SEQ ID NO: 3).
  • FIG. 5(F) shows the amino acid sequence (SEQ ID NO: 5) of the coding region of Cas ⁇ 2 on the constructed plasmid.
  • FIG. 5(G) shows the DNA sequence (uppercase letters) of Arabidopsis codon-optimized vCas ⁇ + the DNA sequence (lowercase letters) encoding the nuclear export signal and FLAG tag (SEQ ID NO: 11).
  • FIG. 5(H) shows the amino acid sequence (SEQ ID NO: 6) of the coding region of vCas ⁇ on the constructed plasmid.
  • FIG. 5(I) shows the crRNA sequences (SEQ ID NO: 12) of Cas ⁇ 2 and vCas ⁇ (uppercase letters indicate direct repeat sequence; spacer sequence is on the 3' side).
  • FIG. 5(J) shows the crRNA sequence (SEQ ID NO: 13) of Cas ⁇ 1 (uppercase letters indicate direct repeat sequence; spacer sequence is on the 3' side).
  • FIG. 5(K) shows the crRNA sequence (SEQ ID NO: 14) of Cas ⁇ 3 (uppercase letters indicate direct repeat sequence; spacer sequence is on the 3' side).
  • FIG. 5(L) shows the amino acid sequence of vCas ⁇ (SEQ ID NO: 4).
  • the duplicated gene to be edited in the duplicated gene genome editing method of the present invention has a 16 or 17 nucleotide long target sequence to be genome edited, and/or a 1 to 2 nucleotide long target sequence with respect to the target sequence. It is characterized by having a mismatched sequence containing a mismatch.
  • the genome editing method for a duplicated gene of the present invention provides a method for editing a cell containing such a duplicated gene by: (a) crRNA containing a spacer sequence targeting the target sequence and the mismatch sequence; (b) a Cas ⁇ protein derived from a huge phage and capable of cleaving the target sequence and the mismatch sequence;
  • the method includes the step of expressing in the cells.
  • crRNA and Cas ⁇ are expressed in cells, so that the target sequence of the duplicated gene can be recognized and cleaved, thereby making genome editing possible.
  • the method of the present invention is preferably used for cells of organisms that contain many duplicated genes. Such organisms include plants, animals, and fungi.
  • grasses such as rice, wheat, barley, oats, rye, millet, millet, millet, corn, and sugarcane
  • Legumes such as soybeans, Polygonaceae such as buckwheat, Cucurbitaceae such as cucumbers, watermelons, pumpkins, and zucchini, Solanaceae such as eggplants, tomatoes, potatoes, chili peppers, green peppers, and tobacco, Convolvulaceae such as sweet potatoes , Araceae plants such as taro and taro; Dioscoreaceae plants such as wild yam, yam, and Japanese yam; Cruciferae plants such as cabbage, Chinese cabbage, turnip, radish, and Arabidopsis; Lamiaceae plants such as perilla, basil, and rosemary; Sakura; Industrial plants include Rosaceae plants such as plums, peaches, strawberries, apples, and
  • a duplicate gene refers to two or more homologous genes contained in one genome.
  • Homologous genes refer to, for example, genes that are derived from the same ancestral gene and have the same structure and function.
  • overlapping genes can be defined as genes having nucleotide sequences having sequence homology (preferably sequence identity) of 60% or more, preferably 70% or more, more preferably 80% or more with each other. can.
  • a duplicate gene is defined as a gene that includes a common base sequence of a predetermined length or longer and/or a base sequence that has a mismatch of one or two bases with respect to a base sequence of a predetermined length or longer. You can also.
  • the predetermined length here may be selected as appropriate, and is, for example, 16 bases or more, 17 bases or more, or 18 bases or more.
  • Duplicate genes are preferably genes with functional redundancy.
  • a group containing multiple homologous genes is called a duplicate gene group.
  • Duplicated genes mainly exist repeatedly on one chromosome, but may also be translocated and exist on different chromosomes.
  • the group of duplicated genes to be genome edited includes a plurality of genes that share a target sequence and/or a mismatch sequence containing a 1 to 2 base mismatch with the target sequence. From the perspective of achieving genome editing in all duplicated gene groups targeted for genome editing in one round of genome editing, the target sequence and/or mismatch sequence must be shared among all genes included in the duplicated gene group.
  • the number of duplicated genes included in the group of duplicated genes to be genome edited is not particularly limited, but usually 2 to 100 copies may exist.
  • the number of duplicated genes included in the group of duplicated genes to be genome edited may be 3 or more copies, or 5 or more copies, as long as the duplicated genes originate from whole-genome duplication, and The number may be 50 copies or less, 20 copies or less, and more preferably 10 copies or less.
  • the genome editing method of the present invention causes cleavage in part or all of the target sequences and/or mismatched sequences of multiple genes in the overlapping gene group, making genome editing possible. It is desirable that the genes included in the group of duplicated genes to be genome edited have high sequence similarity to each other.
  • the target sequence is a sequence corresponding to the crRNA spacer sequence in the genome editing method of the present invention, and relates to a sequence that is cleaved and genome edited by the genome editing method of the present invention.
  • the target sequence is a common sequence included in duplicated genes in the duplicated gene group, and can be composed of a continuous sequence of 16 or 17 nucleotides in length.
  • a target sequence is a perfectly matched sequence within a group of overlapping genes.
  • a mismatch sequence containing one or two mismatches with respect to the target sequence can also be cleaved and genome edited by the genome editing method of the present invention.
  • the spacer sequence in crRNA needs to be set so that the PAM sequence is included in the vicinity of the target sequence, particularly on the 5' side.
  • the PAM sequence may be any PAM sequence recognized by Cas ⁇ , and examples thereof include TTN and NTN.
  • the target sequence and the mismatched sequence are cleaved by the genome editing method, making genome editing possible. Thereby, genome editing becomes possible for all or part of the target sequence and the mismatched sequence included in the duplicated gene group.
  • Arabidopsis has 1383 overlapping gene groups, of which 818 have consecutive matches of less than 30 bases (Fig. 1A). Therefore, when conventional Cas9 is used, it is difficult to perform genome editing with one crRNA spacer sequence for many duplicated genes.
  • Arabidopsis thaliana about 70% of the overlapped gene groups have a continuous common sequence of 16 or more nucleotides in length.
  • genome editing becomes possible with a spacer sequence of one crRNA for a gene group with over about 80% overlap.
  • about 65% of the overlapping gene groups have a contiguous common sequence of 17 or more nucleotides in length.
  • genome editing is possible with a spacer sequence of one crRNA for a gene group with over about 75% overlap.
  • the nucleotide length of the target sequence can vary depending on the Cas ⁇ used.
  • the target sequence may be set so that the duplicated gene group targeted for genome editing consists of genes containing only the target sequence, or may include mismatched sequences.
  • the target sequence may be set to further include the gene.
  • the target sequence is a 17 nucleotide long sequence
  • the target sequence should be set so that the duplicated gene group targeted for genome editing includes genes containing the target sequence and genes containing mismatched sequences. Can be done.
  • crRNA is RNA that includes a spacer sequence consisting of the same base sequence as the target sequence. crRNA forms a complex with Cas protein, guides it to the target sequence or mismatch sequence of genomic DNA, and can cleave the DNA between the target sequence or mismatch sequence and PAM by the action of Cas protein.
  • the crRNA sequence can be selected and used depending on the type of Cas protein used. Known crRNA sequences for Cas ⁇ protein can be used, but examples include SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, and SEQ ID NO: 14 (RNA sequences SEQ ID NO: 167, SEQ ID NO: 168, and SEQ ID NO: 169). A sequence selected from the following can be used depending on the type of Cas ⁇ protein.
  • the arrangement of SEQ ID NO: 12 can be used.
  • the array of SEQ ID NO: 13 can be used.
  • the arrangement of SEQ ID NO: 14 can be used.
  • crRNA can be expressed transiently or constitutively using the expression cassettes described below.
  • Cas ⁇ protein is a Cas family protein derived from huge phage.
  • Cas ⁇ protein has the activity of cleaving a target sequence with a length of 16 or more nucleotides, as well as cleaving a mismatched sequence containing a 1 to 2 base mismatch with the target sequence.
  • the upper limit of the length of the target sequence to be cleaved by the Cas ⁇ protein is not particularly limited, but from the viewpoint of cleavage activity, it is usually 20 or less, preferably 18 or less, more preferably 17 or less.
  • Cas ⁇ may be selected from the group consisting of Cas ⁇ 1, Cas ⁇ 2, and Cas ⁇ 3, but it is particularly preferred to use Cas ⁇ 2 (also referred to as Cas12j2), particularly from the viewpoint of off-target activity.
  • Cas ⁇ may have amino acid sequence mutations (eg, substitutions, deletions, additions, etc.) as long as the activity is not completely impaired.
  • Cas ⁇ protein has an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, and SEQ ID NO: 4, or 60% or more, 70% or more, 80% or more of the sequence.
  • Non-Patent Document 3 the rate of cleavage reaction is It is more preferable because it improves.
  • the "homology" of two amino acid sequences is the ratio at which the same or similar amino acid residues appear at each corresponding position when both amino acid sequences are aligned
  • the “homology” of two amino acid sequences is “Identity” is the ratio at which the same amino acid residue appears at each corresponding position when both amino acid sequences are aligned.
  • “homology” and “identity” between two amino acid sequences can be determined using, for example, the BLAST (Basic Local Alignment Search Tool) program (Altschul et al., J. Mol. Biol., (1990), 215(3): 403-10 etc.
  • Cas ⁇ proteins having sequences specified by sequence homology or identity are further specified by a desired cleavage activity.
  • Such cleavage activity can be specified by the cleavage activity of a target sequence of 16 nucleotides or more in length and a mismatched sequence containing a 1 to 2 base mismatch with the target sequence in vitro or in vivo.
  • the cleavage activity of Cas ⁇ protein can be evaluated in vitro according to known methods.
  • the RMSD value between the skeleton of Cas ⁇ 2 and the skeleton of Cas ⁇ 3 is less than 1.135A when calculated with PyMOL software align when using PDB_ID: 7odf (Cas ⁇ 3), 7lys (Cas ⁇ 2), and when nucleic acid is further included.
  • the Ca root mean square deviation (RMSD) between the backbone of at least one Cas protein selected from the group consisting of Cas ⁇ 1, Cas ⁇ 2, Cas ⁇ 3, and vCas ⁇ and the backbone of the mutant is less than 2.5A, preferably less than 1.5A. , more preferably less than 1A, it can be said that there is a high probability of producing an effect equivalent to that exerted by the original Cas protein.
  • the TM-score between the backbone of at least one Cas protein selected from the group consisting of Cas ⁇ 1, Cas ⁇ 2, Cas ⁇ 3, and vCas ⁇ and the backbone of the mutant is 0.8 or more, preferably 0.85 or more, more preferably When it is 0.9 or more, it can be said that there is a high probability that an effect equivalent to that exerted by the original Cas protein will be produced.
  • the Cas ⁇ protein may contain additional sequences such as a signal sequence, a tag sequence, a reporter sequence, etc., as long as the desired activity is not impaired. From the viewpoint of ensuring that the expressed protein acts in the nucleus, it is desirable that a nuclear localization signal be added to the signal sequence.
  • the nuclear localization signal may include one or more nuclear localization signals arranged in series.
  • the nuclear translocation signal can be appropriately selected depending on the plant species, and as an example, KRPAATKKAGQAKKKK (SEQ ID NO: 7) and/or GSDYKDHDGDYKDHDIDYKDDDDKPKKKRKV (SEQ ID NO: 8) can be used. As a result, the Cas ⁇ protein expressed within the cell can migrate into the nucleus and cleave the target sequence in cooperation with crRNA within the nucleus.
  • a crRNA or expression cassette usually includes a promoter sequence, and can be created by placing a sequence encoding the crRNA under the control of the promoter sequence.
  • the crRNA expression cassette may be contained on one polynucleotide or on different polynucleotides.
  • the crRNA may be used as a crRNA expression cassette by placing a sequence encoding a single-stranded guide RNA linked to multiple crRNAs under the control of a promoter sequence.
  • the Cas ⁇ protein can also be expressed transiently or permanently in cells according to standard methods.
  • a Cas ⁇ expression cassette is prepared by placing a polynucleotide of a Cas ⁇ protein-encoding sequence under the control of a promoter in an expression cassette containing a promoter sequence that allows transient or constant expression. Can be done. Placed under the control of a promoter refers to placed so that expression is controlled by the promoter, and placed an appropriate number of bases, for example, 10 to 200 bases, from the 3' end of the promoter. Good too.
  • the crRNA expression cassette and the Cas ⁇ expression cassette may be contained on one polynucleotide or on different polynucleotides. These expression cassettes may contain other elements as necessary. Such elements may include elements necessary for expression, such as terminators, and elements necessary for plasmid or vector preparation, such as multi-cloning sites, drug resistance genes, reporter genes, and origins of replication.
  • the promoter used in the crRNA expression cassette and the Cas ⁇ expression cassette can be appropriately selected depending on the species of organism to be expressed.
  • a pol II promoter can be used, but a pol III promoter is preferred from the viewpoint of more accurate transcription of relatively short RNAs.
  • pol II promoters include CaMV35S promoter, RPS5A promoter, UBQ promoter, DD45 promoter, NOS promoter, and the like.
  • Examples of the polIII promoter include U6-snRNA (eg, U6.1-snRNA, U6.26-snRNA, etc.) promoter, U3-snRNA promoter, and the like.
  • the terminator used in the crRNA expression cassette and the Cas ⁇ expression cassette terminates transcription from the Cas protein coding sequence (preferably, can further add a polyA sequence to the mRNA transcribed from the Cas protein coding sequence).
  • a polyT sequence can also be added to the guide RNA.
  • the termination signal include heat shock protein termination signal (HspT), NosT (Noparin synhase Terminator), 35sT (CaMV 35S Terminator), Pea3A (Pea Rubisco subunit 3A), and the like.
  • the present invention may relate to a method for producing a crRNA expression cassette, which includes a step of determining a target sequence in a group of overlapping genes to be genome edited.
  • the target sequence in the duplicated gene group may be selected from genome information such that in the duplicated gene group to be genome edited, a continuous sequence of 16 nucleotides in length near the PAM sequence of Cas ⁇ does not contain any mismatch, or Alternatively, it may be selected to allow two mismatches.
  • the target sequence in the duplicated gene group is determined from the genome information that in the duplicated gene group to be genome edited, there is a continuous sequence of 17 nucleotides in length near the PAM sequence of Cas ⁇ , and a sequence that does not contain a mismatch, or A mismatch sequence containing two mismatches is selected.
  • a crRNA sequence can be designed by using the determined target sequence as a spacer sequence and linking it with the remaining sequences.
  • a polynucleotide consisting of the crRNA sequence designed in this way can be easily created according to known genetic engineering techniques.
  • the polynucleotide consisting of the crRNA sequence or guide RNA sequence thus prepared is incorporated into a crRNA expression cassette using known genetic engineering methods, such as PCR, restriction enzyme treatment, DNA ligation, in vitro transcription technology, etc. Can be done.
  • kits for genome editing of duplicate genes in cells the duplicated gene to be genome edited has only a 16 nucleotide long target sequence, or a 16 or 17 nucleotide long target sequence and a mismatched sequence containing a 1 to 2 base mismatch with respect to the target sequence. It is characterized by having the following.
  • kits include: (a) an expression cassette for crRNA into which a spacer sequence targeting the target sequence and the mismatch sequence can be introduced; and (b) an expression cassette for a Cas ⁇ protein derived from a huge phage and capable of cleaving the target sequence and the mismatch sequence; including.
  • the crRNA expression cassette and the Cas ⁇ protein expression cassette are incorporated into a plasmid or a vector, and the genes are introduced into cells.
  • the genome editing kit according to the present invention may further contain other materials, reagents, instruments, etc. necessary for carrying out the genome editing method of the present invention, such as nucleic acid introduction reagents and buffer solutions, as necessary. good.
  • other materials necessary for carrying out the genome editing method of the present invention include a donor polynucleotide. By introducing the donor polynucleotide into the nucleus, it is possible to knock the donor polynucleotide into the cleavage site created by the CRISPR/Cas system.
  • the present invention may also relate to a method for genome editing a duplicated gene in a cell, which includes the step of introducing into a cell a Cas ⁇ expression cassette that encodes a Cas ⁇ protein capable of cleaving the cassette.
  • the crRNA expression cassette and the Cas ⁇ expression cassette may be introduced onto two polynucleotides separately or simultaneously, or may be introduced simultaneously onto one polynucleotide.
  • a donor polynucleotide In addition to introducing the expression cassette of crRNA and/or the expression cassette of Cas ⁇ protein into cells, it is possible to introduce a donor polynucleotide. By introducing the donor polynucleotide into the nucleus, it is possible to knock the donor polynucleotide into the cleavage site created by the CRISPR/Cas system.
  • Gene introduction can be performed using techniques known in the technical field.
  • the method of introduction is not particularly limited, and can be selected as appropriate depending on the type of substance to be introduced and the target to be introduced.
  • Introduction methods are broadly classified into direct methods and methods using viral vectors.
  • Direct methods that can be used include the PEG method that utilizes the phagocytosis of protoplasts from which the cell wall of plant cells has been removed, the electroporation method, the particle gun method in which gold particles are injected together, and the whisker method.
  • Methods using viral vectors include Agrobacterium, tobacco mosaic virus (TMV), plum pox virus (PPV), potato X virus (PVX), alfalfa mosaic virus (AIMV), and cucumber, depending on the host plant species.
  • CMV cowpea mosaic virus
  • ZYMV zucchini yellow mosaic virus
  • gemini virus etc.
  • the Agrobacterium method is preferred from the viewpoint of simplicity and safety.
  • vectors suitable for introduction into plants or plant cells such as the above-mentioned vectors
  • vectors for transferring the polynucleotide of the present invention to such vectors for example, Gateway (registered trademark)
  • Gateway registered trademark
  • Entry clone vector, etc. can also be mentioned as an example.
  • the cells to be introduced may be cells cultured in vitro or cells constituting a plant body.
  • introduction sites in plants include flowers (particularly egg cells, pollen, etc. within flowers), leaves, roots, seeds, embryos, and the like.
  • the target for introduction is preferably the shoot tip from the viewpoint of performing genome editing more efficiently in germ cells.
  • a method of obtaining a genome-edited individual by redifferentiating cells into which a gene has been introduced, or a method of obtaining a genome-edited individual by utilizing a gene that induces a shoot apex from somatic cells may be used.
  • Example 1 Preparation of vectors for Huge phage-derived Cas ⁇ 2 and vCas ⁇ (1) Preparation of Huge phage-derived Cas ⁇ 2 gene Based on the amino acid sequence information (SEQ ID NO: 1) derived from Huge phage, a codon-optimized vector for Arabidopsis was A DNA sequence encoding a C-terminal nuclear export signal sequence-FLAG tag was added to a DNA sequence encoding the Cas protein obtained by adding a DNA sequence encoding the FLAG tag (SEQ ID NO: 9). Sanger method or next generation sequencing method was used to determine the base sequence. The amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 can be found in well-known databases such as GenBank of NCBI (National Center for Biotechnology Information).
  • coli DH5a was transformed with the obtained circular plasmid, and transformants were selected by culturing on LB agar plates containing 50 ⁇ g/mL ampicillin. Several colonies were picked up, a clone containing the circular plasmid of interest was selected, and the plasmid was purified. The base sequence (SEQ ID NO: 10) and amino acid sequence (SEQ ID NO: 5) of the Cas ⁇ coding sequence of the constructed vector are shown. Next, the vector was digested with BsaI and NruI to obtain linear DNA. At the same time, the following array: A double-stranded DNA annealed with an oligonucleotide having the following was prepared.
  • Each type of double-stranded DNA annealed with the cut vector was made into a circular plasmid using T4 DNA ligase.
  • a circular plasmid was purified using the procedure described above. This vector is designated as pEX_35S-Cas ⁇ 2_HPT ( Figure 2B).
  • coli DH5a was transformed with the obtained circular plasmid, and transformants were selected by culturing on LB agar plates containing 50 ⁇ g/mL ampicillin. Several colonies were picked up, a clone containing the circular plasmid of interest was selected, and the plasmid was purified.
  • the base sequence (SEQ ID NO: 11) and amino acid sequence (SEQ ID NO: 6) of the vCas ⁇ coding sequence of the constructed vector are shown, respectively. This vector is designated as pEX_35S-vCas ⁇ _HPT.
  • This vector is designated as pCA_35S-Cas ⁇ 2_HPT and pCA_35S-vCas ⁇ _HPT.
  • Example 2 Mutation introduction with Cas ⁇ 2 and vCas ⁇ in Arabidopsis protoplast cells (1) Preparation of plasmid for genome editing experiments of Arabidopsis genes The pEX_35S-Cas ⁇ 2_HPT vector or pEX_35S-vCas ⁇ _HPT vector was cut with BsaI-HF. First, in order to investigate whether genome editing is possible using these vectors, we used the following method to clone the spacer sequence of Cas ⁇ crRNA for genome editing experiments of the Arabidopsis-derived PDS3 gene (a single copy gene in the Arabidopsis genome).
  • a total of three types of double-stranded DNA were prepared by annealing oligonucleotides having the following for each set.
  • the PDS3 gene is the phytoene desaturase 3 gene, which is a carotenoid biosynthetic enzyme, and is known to cause whitening of plant cells when knocked out. This makes it possible to identify the location of the knockout in the plant.
  • Each type of double-stranded DNA annealed with the cut vector was made into a circular plasmid using T4 DNA ligase.
  • E. coli DH5a was transformed with the obtained circular plasmid, and transformants were selected by culturing on LB agar plates containing 50 ⁇ g/mL ampicillin. Several colonies were picked up, a clone containing the circular plasmid of interest was selected, and the plasmid was purified.
  • the protoplasts were filtered through a nylon filter with a pore size of 70 ⁇ m, collected in a 50 ml tube, centrifuged at 100 x g for 10 minutes to collect the protoplasts, the supernatant was discarded, and the mixture was incubated with 150 mM NaCl, 125 mM CaCl 2 , 5 mM KCl, 2 mM MES ( pH 5.7) buffer (W5 buffer).
  • W5 buffer 150 mM NaCl, 125 mM CaCl 2 , 5 mM KCl, 2 mM MES ( pH 5.7) buffer
  • W5 buffer 150 mM NaCl, 125 mM CaCl 2 , 5 mM KCl, 2 mM MES ( pH 5.7) buffer
  • W5 buffer 150 mM NaCl, 125 mM CaCl 2 , 5 mM KCl, 2 mM MES ( pH 5.7) buffer
  • the protoplasts were centrifuged at 100 ⁇ g for 5 minutes, and then resuspended in a 400 mM mannitol, 15 mM MgCl 2 , 4 mM MES (pH 5.7) buffer. After that, the protoplasts were collected by centrifugation at 100 x g for 5 minutes, and the cell concentration was adjusted to 2.0 to 3.0 x 10 5 cells/ml using the same buffer, and the protoplasts for transformation were suspended. I got the liquid.
  • Genomic DNA was recovered from the heat-treated protoplast suspension by isopropanol precipitation. The recovered genomic DNA was suspended in sterile water, and a DNA fragment of approximately 300 bp was amplified using a primer set with the sequence listed in Table 4 below.
  • FIG. 3 shows the results of analyzing the editing efficiency using CRISPResso2 software when the target sequence length was changed to 15, 16, and 18, respectively, when vCas ⁇ was introduced.
  • a group in which the fluorescent protein GFP expression vector was introduced was used as a control.
  • editing efficiency was investigated when SpyCas9 was used for a target sequence length of 18.
  • vCas ⁇ in FIG. 3 was used, gene editing was possible when the target sequence length was 16 and 18, but when the target sequence length was 15, genome editing did not occur.
  • the genome editing efficiency when using SpyCas9 was about 0.02, but when using vCas ⁇ , it was about 0.09 at maximum.
  • Example 3 Mutation introduction using vCas ⁇ in tobacco leaf cells (1) Preparation of plasmid for genome editing experiments of tobacco genes The pEX_35S-vCas ⁇ _HPT vector was cut with BsaI-HF. In order to clone a spacer sequence for forming Cas ⁇ crRNA for genome editing experiments of tobacco-derived PDS, RDR6, and SGS3 genes, oligonucleotides having the sequences listed in Table 5 below were annealed for each set. A total of 21 types of double-stranded DNA were prepared: The PDS gene is a phytoene desaturase gene, which is a carotenoid biosynthetic enzyme, and is known to cause whitening of plant cells when knocked out.
  • the RDR6 gene is an RNA-dependent RNA polymerase 6 that is involved in distinguishing between foreign RNA and normal mRNA, and is known to have the effect of reducing resistance to viruses when knocked out. There is. It is known that in tobacco there are two duplicate genes of the RDR6 gene.
  • the SGS3 gene is gene silencing suppressor 3, which cooperates with RDR6 and functions as a defense against viruses. It is known that when the SGS3 gene is knocked out, resistance to viruses is reduced. It is known that there are two duplicated SGS3 genes in tobacco.
  • E. coli DH5a was transformed with the obtained circular plasmid, and transformants were selected by culturing on LB agar plates containing 50 ⁇ g/mL spectinomycin. Several colonies were picked up, a clone containing the circular plasmid of interest was selected, and the plasmid was purified.
  • the purified plasmid was introduced into Agrobacterium GV3101 strain by electroporation, and the transformant was cultured on an LB agar plate containing 50 ⁇ g/mL spectinomycin, 50 ⁇ g/mL gendamicin, and 50 ⁇ g/mL rifampicillin. were selected.
  • the agroinfiltrated area of the plant is colored red.
  • the cultured bacterial solution was centrifuged at 3000 rpm for 20 minutes to collect bacteria, suspended in about 5 ml of infiltration buffer (composition: 10 mM MgCl 2 , 10 mM MES, 100 ⁇ M acetosyringone, pH 5.7), and adjusted to an OD600 of about 1. .
  • infiltration buffer composition: 10 mM MgCl 2 , 10 mM MES, 100 ⁇ M acetosyringone, pH 5.7

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Abstract

少数のｇＲＮＡ又はｃｒＲＮＡを用いて、機能重複している多数の遺伝子を同時に編集する技術を提供することを目的とする。ヒュージファージ由来のＣａｓΦタンパク質が、１６以上のヌクレオチド長であるターゲット配列、及び当該ターゲット配列に対して１～２塩基のミスマッチを含むミスマッチ配列を切断可能であることを見出し、斯かるＣａｓΦタンパク質を用いた重複遺伝子のゲノム編集方法を提供する。

Description

重複遺伝子のゲノム編集方法
　本発明は、重複遺伝子のゲノム編集に関する。
　ゲノム編集は、対象生物のゲノムの狙った箇所に変異を導入する（編集する）技術である。そのため、放射線などの既存の変異導入方法に比べて圧倒的に少ない数の変異体から望みの株を取得できる効率性がメリットとなり、様々な用途に使用されている。
　典型的なゲノム編集技術であるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９やＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ａでは、編集対象の配列はおもにそれらを構成するｇＲＮＡまたはｃｒＲＮＡのスペーサー配列とよばれる部位によって規定される。ｇＲＮＡまたはｃｒＲＮＡのスペーサー配列としては、通常、２０～２４塩基を任意に変更可能な標的配列として使用する。このスペーサー配列に加えて、ヌクレアーゼであるＣａｓ９やＣａｓ１２ａが機能するには、ＰＡＭ配列と呼ばれる２～４塩基程度の塩基配列が必要となる。したがって、ＰＡＭ配列とスペーサー配列を合わせた総計２２～２８塩基ほどの塩基配列を特異的に認識してゲノム編集が行われている。この認識長は、ヒトゲノムのうちの単一の領域を指定するのに十分な長さであるとされる。
　しかしながら、植物をはじめとした多くの生物では、ゲノム中に存在する相同遺伝子が機能を補償する現象（機能冗長性）が存在するため、ひとつの遺伝子を破壊しただけでは、目的とした表現型が現れないことがある。したがって、目的とした表現型を発現させるには、配列類似性がある複数の相同遺伝子を同時に編集する必要がある場合が多い。
　複数の遺伝子を同時に編集するために、多くの場合、ｇＲＮＡ又はｃｒＲＮＡを複数発現させて、それぞれのｇＲＮＡ又はｃｒＲＮＡで互いに異なる遺伝子を指定する、という方法がとられている。この方法では、編集対象の遺伝子が増えれば増えるほど、ｇＲＮＡ又はｃｒＲＮＡを多数発現させる必要があるためにベクター構築などに労力がかかるという問題がある。
　複数の遺伝子を同時に編集する他の方法として、ＣＲＩＳＰＲのオフターゲット効果を利用するという手段がある。この方法では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９のｇＲＮＡ又はｃｒＲＮＡがミスマッチ配列を切断する性質を利用する。すなわち、２０～２４塩基をターゲットするｇＲＮＡの配列を、異なる複数の遺伝子をそれぞれ１～２塩基ミスマッチで編集するように設計すれば、ひとつのｇＲＮＡ又はｃｒＲＮＡで複数の遺伝子を同時に編集できるというものである。こうしたオフターゲット効果を利用した方法には、ひとつの遺伝子にひとつのｇＲＮＡ又はｃｒＲＮＡを使用する方法に比べて、少ないｇＲＮＡ又はｃｒＲＮＡで多数の遺伝子を編集できるために、ベクター構築に労力がかからないというメリットがある。
　一方で、オフターゲット効果を利用する方法には、制約もあることが知られている。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ではスペーサー配列を短くするほどオフターゲット効果が少なくなることが報告されている。ストレプトコッカス・ピオゲネス（Streptococcus pyogenes）のＣａｓ９（以下、SpyCas9と呼ぶ）においては、２０塩基認識のスペーサー配列をもつｇＲＮＡ又はｃｒＲＮＡを使用すると、１－２ミスマッチの配列も切断するが、１７塩基認識のスペーサー配列をもつｇＲＮＡ又はｃｒＲＮＡを使用するとミスマッチ配列を切断し、変異を入れる効率は劇的に低下する（非特許文献１：Nat Biotechnol. 2014 Mar; 32(3): 279-284）。したがって、現状では、ＰＡＭ配列＋２０塩基の認識でミスマッチ配列も同時に編集するか、ＰＡＭ配列＋１７塩基が完全に一致する相同遺伝子を同時に編集するか、どちらかの方法を選択せざるを得なかった。
　新たなＣａｓとして、ヒュージファージが有するＣａｓΦという小型のＣａｓファミリーが存在することが報告されており、その中のＣａｓΦ２が、試験管内の実験において、１６残基という短いターゲット配列を切断することが報告された（非特許文献２：Science (2020）369, 333-337、非特許文献３：Nature Communications (2021) volume 12, Article number: 4476）。さらにＣａｓΦについては、結晶構造解析に基づく研究が行われており、非標的鎖と相互作用することが予測されるヘリックスに対応する１５５位～１７６位を欠失させたｖＣａｓΦにおいて、反応速度が増大することが開示された（非特許文献４：Nature Structural & Molecular Biology (2021) vol.28, pp.652-661）。ＣａｓΦを用いた植物におけるゲノム編集についても報告されている（非特許文献５：Int. J. Mol. Sci. (2022), 23, 5755)。
Nat Biotechnol. 2014 Mar; 32(3): 279-284 Science (2020）369, 333-337 Nature Communications (2021) volume 12, Article number: 4476 Nature Structural & Molecular Biology (2021) vol. 28, pp. 652-661 Int. J. Mol. Sci. (2022), 23, 5755 Plant Biotechnology (2016) 33, 235-243
　上述した多数の遺伝子を同時に編集する技術、とくに、オフターゲットを活用する技術は、機能冗長性をもつ遺伝子同士がある程度の配列類似性を持つことを前提とする。しかしながら、実際には機能重複する遺伝子の配列類似度は十分に高くない、という問題があることが経験的に知られていた。
　発明者らは、とくに機能冗長性が問題となる植物の代表例であるシロイヌナズナのゲノム配列情報を解析し、機能冗長性を持つ遺伝子同士の配列がどの程度連続して一致しているかを解析した。その結果、塩基配列が連続して一致する長さが２４塩基未満であるような遺伝子が、過半数に近いことが分かった。したがって、機能冗長性を有する相同遺伝子群を破壊するためには、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９やＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ａでは認識長が長すぎるか、またはオフターゲット効果が少なすぎるという問題があることを見出した。
　そこで、本発明は、かかる問題を解決すべくなされたものであって、少数のｇＲＮＡ又はｃｒＲＮＡを用いて、機能重複している多数の遺伝子を同時に編集する技術を提供することを目的とする。
　本発明の上記目的を解決すべく鋭意研究を行ったところ、ヒュージファージ由来のＣａｓΦタンパク質が、１６以上のヌクレオチド長であり、０～２個のミスマッチを含むターゲット配列を、細胞内で切断可能であることを見出し、重複遺伝子のゲノム編集方法についての発明に至った。
　そこで本発明は以下に関する：
［１］　細胞の重複遺伝子のゲノム編集方法であって、前記重複遺伝子が、ゲノム編集の対象となる１６ヌクレオチド長のターゲット配列のみを有するか、或いは１６又は１７ヌクレオチド長のターゲット配列と、当該ターゲット配列に対して１～２塩基のミスマッチを含むミスマッチ配列とを有し；ここで前記方法が、
　（ａ）前記ターゲット配列及びミスマッチ配列を標的とするスペーサー配列を含むｃｒＲＮＡ；及び、
　（ｂ）ヒュージファージ由来であり、前記ターゲット配列及び前記ミスマッチ配列を切断可能なＣａｓΦタンパク質；
を、前記細胞内で発現させる工程を含む、重複遺伝子のゲノム編集方法。
［２］前記ＣａｓΦタンパク質が、ＣａｓΦ１、ＣａｓΦ２、ｖＣａｓΦ及びＣａｓΦ３からなる群から選ばれる少なくとも１のタンパク質である、項目１に記載のゲノム編集方法。
［３］　前記ＣａｓΦタンパク質が、配列番号１、２、３及び４からなる群から選ばれるアミノ酸配列に対し、少なくとも８０％の配列相同性を有するアミノ酸配列を含む、項目１に記載のゲノム編集方法。
［４]　前記重複遺伝子が、機能冗長性を有する重複配列である、項目１～３に記載のゲノム編集方法。
［５］　前記重複遺伝子が、ターゲット配列の近傍にＰＡＭ配列を含む、項目１～４のいずれか一項に記載のゲノム編集方法。
［６］　前記スペーサー配列が、前記ターゲット配列と、完全一致するように決定される、項目１～５のいずれか一項に記載のゲノム編集方法。
［７］　前記重複遺伝子が、１６以上のヌクレオチド長のターゲット配列と、場合により当該ターゲット配列に対して１～２塩基のミスマッチを含むミスマッチ配列とを有する、項目１～６のいずれか一項に記載のゲノム編集方法。
［８］　　前記重複遺伝子が、１７以上のヌクレオチド長のターゲット配列と当該ターゲット配列に対して１～２塩基のミスマッチを含むミスマッチ配列とを有する、項目１～７のいずれか一項に記載のゲノム編集方法。
［９］　前記重複遺伝子が、前記細胞のゲノム中に２～１００コピー存在する、項目１～８のいずれか一項に記載のゲノム編集方法。
［１０］　前記細胞のゲノム中に含まれる重複遺伝子のうち、一部又は全ての重複遺伝子を編集する、項目１～９のいずれか一項に記載のゲノム編集方法。
［１１］　前記細胞が、植物細胞である、項目１～１０のいずれか一項に記載のゲノム編集方法。
［１２］　前記ｃｒＲＮＡ及び／又は前記ＣａｓΦタンパク質を、発現ベクターにより前記細胞内に導入して発現させる、項目１～１１のいずれか一項に記載のゲノム編集方法。
［１３］　前記発現ベクターが、一過性又は恒常性発現ベクターである、項目１２に記載のゲノム編集方法。
［１４］　細胞の重複遺伝子のゲノム編集用キットであって、前記重複遺伝子が、ゲノム編集の対象となる１６ヌクレオチド長のターゲット配列のみを有するか、或いは１６又は１７ヌクレオチド長のターゲット配列と、当該ターゲット配列に対して１～２塩基のミスマッチを含むミスマッチ配列とを有し、前記キットが；
　（ａ）前記ターゲット配列及び前記ミスマッチ配列を標的とするスペーサー配列を導入可能なｃｒＲＮＡの発現カセット；及び、
　（ｂ）ヒュージファージ由来であり、前記ターゲット配列及び前記ミスマッチ配列を切断可能なＣａｓΦタンパク質の発現カセット
を含む、前記キット。
　本発明によれば、少数のｃｒＲＮＡを用いて多数の相同な遺伝子を同時に編集することができる。
図１Ａは、シロイヌナズナにおける重複遺伝子をグループ分けし、グループ内において一致する連続塩基配列の長さにより分類したグラフを示す。１３８３個の重複遺伝子群をPTGbaseより抽出した。横軸が一致する連続塩基配列の長さであり、縦軸がグループの数を表す。図１Ｂは、図１Ａにおける横軸の一致する連続塩基配列の長さについて、１～６０残基長を拡大して示したグラフを示す。連続一致が３０塩基未満の重複遺伝子群は、８１８群であり、ＰＡＭを含めた場合に、多くの重複遺伝子では同時ターゲットができる蓋然性が低い。 図２Ａは、ｐＥＸ－３５Ｓ－ＨＰＴのベクターマップを示す。 図２Ｂは、ｐＥＸ－ＣａｓＰｈｉ２－ＨＰＴのベクターマップを示す。 図３は、ＣａｓΦ２及びｖＣａｓΦを用いてゲノム編集を行った場合の、スペーサー配列のヌクレオチド長を変えた場合の、編集効率を示すグラフである。 図４は、タバコの葉に対して、アグロインフィルトレーションを行い、遺伝子導入された箇所におけるゲノム編集の結果の解析を示す。図４（Ａ）は、ＮｂＰＤＳ－１をターゲットとした場合の、導入された変異を示す。 図４は、タバコの葉に対して、アグロインフィルトレーションを行い、遺伝子導入された箇所におけるゲノム編集の結果の解析を示す。図４（Ｂ）は、ＮｂＰＤＳ－２をターゲットとした場合の、導入された変異を示す。 図４は、タバコの葉に対して、アグロインフィルトレーションを行い、遺伝子導入された箇所におけるゲノム編集の結果の解析を示す。図４（Ｃ）は、ＮｂＲＤＲ６－１をターゲットとした場合の、導入された変異を示す。 図４は、タバコの葉に対して、アグロインフィルトレーションを行い、遺伝子導入された箇所におけるゲノム編集の結果の解析を示す。図４（Ｄ）は、ＮｂＲＤＲ６－２をターゲットとした場合の、導入された変異を示す。 図４は、タバコの葉に対して、アグロインフィルトレーションを行い、遺伝子導入された箇所におけるゲノム編集の結果の解析を示す。図４（Ｅ）は、ＮｂＳＧＳ３－１をターゲットとした場合の、導入された変異を示す。 図４は、タバコの葉に対して、アグロインフィルトレーションを行い、遺伝子導入された箇所におけるゲノム編集の結果の解析を示す。図４（Ｆ）は、ＮｂＳＧＳ３－２をターゲットとした場合の、導入された変異を示す。 図５（Ａ）は、ＣａｓΦ２のアミノ酸配列（配列番号１）を示す。図５（Ｂ）は、ＣａｓΦ１のアミノ酸配列（配列番号２）を示す。図５（Ｃ）は、ＣａｓΦ３のアミノ酸配列（配列番号３）を示す。 図５（Ｄ）は、シロイヌナズナコドン最適化を行ったＣａｓΦ２のＤＮＡ配列（大文字）＋核移行シグナルおよびＦＬＡＧタグをコードするＤＮＡ配列（配列番号９）を示す。 図５（Ｅ）は、作製したプラスミド上のＣａｓΦ２のコード領域の塩基配列（配列番号１０）を示す。 図５（Ｆ）は、作製したプラスミド上のＣａｓΦ２のコード領域のアミノ酸配列（配列番号５）を示す。図５（Ｇ）は、シロイヌナズナコドン最適化を行ったｖＣａｓΦのＤＮＡ配列（大文字）＋核移行シグナルおよびＦＬＡＧタグをコードするＤＮＡ配列（小文字）（配列番号１１）を示す。 図５（Ｈ）は、作製したプラスミド上のｖＣａｓΦのコード領域のアミノ酸配列（配列番号６）を示す。図５（Ｉ）は、ＣａｓΦ２およびｖＣａｓΦのｃｒＲＮＡ配列（配列番号１２）（大文字がｄｉｒｅｃｔ　ｒｅｐｅａｔ配列；スペーサー配列は３’側につく）を示す。図５（Ｊ）は、ＣａｓΦ１のｃｒＲＮＡ配列（配列番号１３）（大文字がｄｉｒｅｃｔ　ｒｅｐｅａｔ配列；スペーサー配列は３’側につく）を示す。図５（Ｋ）は、ＣａｓΦ３のｃｒＲＮＡ配列（配列番号１４）（大文字がｄｉｒｅｃｔ　ｒｅｐｅａｔ配列；スペーサー配列は３’側につく）を示す。図５（Ｌ）は、ｖＣａｓΦのアミノ酸配列（配列番号４）を示す。
　本発明の一の態様は、重複遺伝子のゲノム編集方法に関する。より具体的に、本発明の重複遺伝子のゲノム編集方法において編集される重複遺伝子は、ゲノム編集の対象となる１６又は１７ヌクレオチド長のターゲット配列、及び/又は当該ターゲット配列に対して１～２塩基のミスマッチを含むミスマッチ配列を有することにより特徴づけられる。本発明の重複遺伝子のゲノム編集方法は、かかる重複遺伝子を含む細胞に
　（ａ）前記ターゲット配列及びミスマッチ配列を標的とするスペーサー配列を含むｃｒＲＮＡ；及び、
　（ｂ）ヒュージファージ由来であり、前記ターゲット配列及び前記ミスマッチ配列を切断可能なＣａｓΦタンパク質；
を、前記細胞内で発現させる工程を含む。本発明の方法により、ｃｒＲＮＡとＣａｓΦとが細胞内で発現することにより、重複遺伝子のターゲット配列が認識されて切断が可能になり、それによりゲノム編集が可能になる。本発明の方法は、重複遺伝子を多く含む生物の細胞に対して使用されることが好ましい。そのような生物として、植物、動物、菌類が挙げられる。植物の中でも特に、穀物、園芸作物、観賞用植物、又は飼料植物において用いられることが好ましく、特にイネ、コムギ、オオムギ、カラスムギ、ライムギ、キビ、アワ、ヒエ、トウモロコシ、サトウキビなどのイネ科植物、ダイズなどのマメ科植物、そばなどのタデ科植物、キュウリ、スイカ、カボチャ、ズッキーニなどのウリ科植物、ナス、トマト、ジャガイモ、トウガラシ、ピーマン、タバコなどのナス科植物、サツマイモなどのヒルガオ科植物、タロイモ、サトイモなどのサトイモ科植物、自然薯、ヤマイモ、ナガイモなどのヤマノイモ科植物、キャベツ、ハクサイ、カブ、ダイコン、シロイヌナズナなどのアブラナ科植物、シソ、バジル、ローズマリーなどのシソ科植物、サクラ、ウメ、モモ、イチゴ、リンゴ、ナシなどのバラ科植物、ニンジン、セロリ、クミン、ミツバ、パセリなどのセリ科植物、タマネギ、ネギ、ニンニクなどのヒガンバナ科植物、キャッサバなどのトウダイクサ科植物など、産業上有用な任意の植物が挙げられる。
　一態様によれば、重複遺伝子とは、１つのゲノム内に２つ以上含まれる相同遺伝子のことをいう。相同遺伝子とは、例えば、同一の祖先遺伝子に由来し、同じ構造・機能を持つ遺伝子のことをいう。一態様によれば、重複遺伝子は、互いに６０％以上、好ましくは７０％以上、さらに好ましくは８０％以上の配列相同性（好ましくは配列同一性）を有する塩基配列を有する遺伝子として定義することができる。一態様によれば、重複遺伝子は、所定長以上の共通する塩基配列を含むか、及び／又は所定長以上の塩基配列に対し、１塩基又は２塩基のミスマッチを有する塩基配列を含む遺伝子として定義することもできる。ここでいう所定長は、適宜選択されてよいが、一例として１６塩基以上、１７塩基以上、又は１８塩基以上である。重複遺伝子は、好ましくは機能冗長性を有する遺伝子である。複数の相同遺伝子を含むグループを重複遺伝子群という。重複遺伝子は、主に１つの染色体上で繰り返し存在しているが、転座して異なる染色体上に存在していてもよい。ゲノム編集対象となる重複遺伝子群には、ターゲット配列、及び／又は当該ターゲット配列に対して１～２塩基のミスマッチを含むミスマッチ配列を共有する遺伝子が複数存在する。１回のゲノム編集でゲノム編集対象となる重複遺伝子群の全てにおいてゲノム編集を達成する観点からは、重複遺伝子群に含まれるすべての遺伝子において、ターゲット配列及び／又はミスマッチ配列が共有されていることが好ましい。ゲノム編集対象となる重複遺伝子群に含まれる重複遺伝子の数は、特に限定されないが、通常２～１００コピー存在しうる。ゲノム編集対象となる重複遺伝子群に含まれる重複遺伝子の数は、全ゲノム重複を起源として持つ重複遺伝子であれば、３コピー以上であってもよいし、５コピー以上であってもよく、かつ５０コピー以下であってもよいし、２０コピー以下であってもよいし、１０コピー以下がより好ましい。ターゲット配列を共有することにより、本発明のゲノム編集方法によって、重複遺伝子群内の複数の遺伝子のターゲット配列及び／又はミスマッチ配列の一部又は全てにおいて切断が生じ、ゲノム編集が可能になる。ゲノム編集対象となる重複遺伝子群に含まれる遺伝子は、互いに高い配列類似性を有することが望ましい。
　本発明において、ターゲット配列とは、本発明に係るゲノム編集方法におけるｃｒＲＮＡのスペーサー配列に対応する配列であり、本発明に係るゲノム編集方法より切断されて、ゲノム編集される配列に関する。ターゲット配列は、重複遺伝子群内の重複遺伝子に含まれる共通する配列であって、１６又は１７ヌクレオチド長の連続する配列から構成されうる。ターゲット配列は、重複遺伝子群内で完全に一致する配列である。一方、ターゲット配列に対して、１又は２個のミスマッチが含まれているミスマッチ配列も、本発明に係るゲノム編集方法より切断されて、ゲノム編集されうる。ｃｒＲＮＡにおけるスペーサー配列は、ターゲット配列の近傍、特に５’側に隣接してＰＡＭ配列が含まれるようにターゲット配列を設定することが必要となる。ＰＡＭ配列としては、ＣａｓΦが認識するＰＡＭ配列であればよく、一例としてＴＴＮ、ＮＴＮが挙げられる。
　１つのｃｒＲＮＡスペーサー配列により、ターゲット配列とミスマッチ配列とがゲノム編集方法により切断されて、ゲノム編集が可能になる。これにより、重複遺伝子群に含まれるターゲット配列とミスマッチ配列の全て又は一部について、ゲノム編集が可能になる。シロイヌナズナは１３８３個の重複遺伝子群を有しており、そのうち、３０塩基未満の連続一致を有する重複遺伝子群は８１８個である（図１Ａ）。したがって、従来のＣａｓ９を用いた場合には、多くの重複遺伝子では、１つのｃｒＲＮＡスペーサー配列でゲノム編集を行うことは困難である。一方、シロイヌナズナにおいて１６以上のヌクレオチド長の連続する共通配列を有する重複遺伝子群は、約７０％となる。さらに、１又は２個のミスマッチを許容することで、約８０％超の重複遺伝子群について、１つのｃｒＲＮＡのスペーサー配列によって、ゲノム編集が可能になる。シロイヌナズナにおいて１７以上のヌクレオチド長の連続する共通配列を有する重複遺伝子群は、約６５％となる。さらに、１又は２個のミスマッチを許容することで、約７５％超の重複遺伝子群について、１つのｃｒＲＮＡのスペーサー配列によって、ゲノム編集が可能になる。ターゲット配列のヌクレオチド長は、使用するＣａｓΦに応じて変化しうる。
　ターゲット配列が１６ヌクレオチド長の配列である場合、ゲノム編集対象となる重複遺伝子群には、ターゲット配列のみを含む遺伝子から構成されるように、ターゲット配列を設定してもよいし、ミスマッチ配列を含む遺伝子をさらに含むようにターゲット配列を設定してもよい。
　一方、ターゲット配列が１７ヌクレオチド長の配列である場合、ゲノム編集対象となる重複遺伝子群には、ターゲット配列を含む遺伝子と、ミスマッチ配列を含む遺伝子とが含まれるように、ターゲット配列を設定することができる。
　ｃｒＲＮＡは、ターゲット配列と同一の塩基配列からなるスペーサー配列を含むＲＮＡである。ｃｒＲＮＡは、Ｃａｓタンパク質と複合体を形成し、ゲノムＤＮＡのターゲット配列又はミスマッチ配列に誘導し、Ｃａｓタンパク質の作用によりターゲット配列又はミスマッチ配列とＰＡＭとの間でＤＮＡを切断することができる。ｃｒＲＮＡ配列は、利用するＣａｓタンパク質の種類に応じて選択して使用することができる。ＣａｓΦタンパク質に対するｃｒＲＮＡ配列は公知のものを使用することができるが、一例として、配列番号１２、配列番号１３、及び配列番号１４（ＲＮＡ配列として配列番号１６７、配列番号１６８、及び配列番号１６９）からなる配列から選ばれる配列をＣａｓΦタンパク質の種類に応じて、使用することができる。一例として、ＣａｓΦ２及びｖＣａｓを使用する場合には、配列番号１２の配列を用いることができる。ＣａｓΦ１を用いる場合には、配列番号１３の配列を用いることができる。ＣａｓΦ３を使用する場合には、配列番号１４の配列を用いることができる。ｃｒＲＮＡは、以下に説明する発現カセットを用いて、一過的又は恒常的で発現することができる。
　ＣａｓΦタンパク質とは、ヒュージファージ由来のＣａｓファミリーのタンパク質である。ＣａｓΦタンパク質は、１６以上のヌクレオチド長のターゲット配列を切断するとともに、当該ターゲット配列に対して１～２塩基のミスマッチを含むミスマッチ配列を切断する活性を有する。ＣａｓΦタンパク質が切断するターゲット配列の長さの上限は、特に限定されないが、切断活性の観点から、通常２０以下、好ましくは１８以下、さらに好ましくは１７以下である。ＣａｓΦは、ＣａｓΦ１、ＣａｓΦ２、及びＣａｓΦ３からなる群から選ばれうるが、特にオフターゲット活性の観点から特にＣａｓΦ２（Ｃａｓ１２ｊ２とも呼ばれる）を使用することが好ましい。ＣａｓΦに対しては、活性を完全に損なわない限りにおいて、アミノ酸配列の変異（例えば、置換、欠失、付加など）を有していてもよい。この観点から、ＣａｓΦタンパク質は、配列番号１、配列番号２、配列番号３、及び配列番号４からなる群から選ばれるアミノ酸配列、又は当該配列に対し、６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上、９３％以上、９５％以上、９７％以上、９８％以上、又は９９％以上の配列相同性（好ましくは配列同一性）を有する配列を有しうる。特にＣａｓΦ２において、非ターゲット鎖と相互作用するとされるヘリックス領域（配列番号１の１５５位～１７６位）を削除した変異型ＣａｓΦ２（ｖＣａｓΦとも呼ばれる：アミノ酸配列：配列番号４）において、切断反応の速度が向上することから、より好ましい（非特許文献３）。
　なお、本明細書において、２つのアミノ酸配列の「相同性」とは、両アミノ酸配列をアラインメントした際に各対応箇所に同一又は類似のアミノ酸残基が現れる比率であり、２つのアミノ酸配列の「同一性」とは、両アミノ酸配列をアラインメントした際に各対応箇所に同一のアミノ酸残基が現れる比率である。なお、２つのアミノ酸配列の「相同性」及び「同一性」は、例えばBLAST（Basic Local Alignment Search Tool）プログラム（Altschul et al., J. Mol. Biol., (1990), 215(3):403-10）等を用いて求めることが可能である。
　配列相同性又は同一性により特定された配列を有するＣａｓΦタンパク質は、さらに所望される切断活性により特定される。このような切断活性としては、インビトロ又はインビボにおける、１６ヌクレオチド長以上のターゲット配列及び当該ターゲット配列に対して１～２塩基のミスマッチを含むミスマッチ配列の切断活性により特定されうる。ＣａｓΦタンパク質の切断活性については、in vitroにおいて公知の方法に従い評価することができる。ＣａｓΦ２の骨格と、ＣａｓΦ３の骨格との間でＲＭＳＤ値は、ＰＤＢ＿ＩＤ：７ｏｄｆ（ＣａｓΦ３）、７ｌｙｓ（ＣａｓΦ２）を用いた場合に、ＰｙＭＯＬソフトウェアａｌｉｇｎにて計算すると１．１３５Ａ未満、核酸をさらに含めると０．９７であることから、ＣａｓΦ２と、ＣａｓΦ３との間の構造はかなり類似している。加えて、および、独自ソフトウェアにてTM-score=0.85以上であったことからも、構造が類似していることが支持される。したがって、変異体については、配列同一性又は相同性で特定に加えて、又は代えてＲＭＳＤ値により特定することができる。ＣａｓΦ１、ＣａｓΦ２、ＣａｓΦ３、ｖＣａｓΦからなる群から選ばれる、少なくとも１のＣａｓタンパク質の骨格と、変異体の骨格との間のCα平均二乗偏差（ＲＭＳＤ）が２．５Ａ未満、好ましくは１．５Ａ未満、さらに好ましくは１Ａ未満である場合に、元のＣａｓタンパク質が奏する作用と同等の作用を生じる蓋然性が高いといえる。あるいは、TM-score値により特定することができる。ＣａｓΦ１、ＣａｓΦ２、ＣａｓΦ３、ｖＣａｓΦからなる群から選ばれる、少なくとも１のＣａｓタンパク質の骨格と、変異体の骨格との間のTM-scoreが０．８以上、好ましくは０．８５以上、さらに好ましくは０．９以上である場合に、元のＣａｓタンパク質が奏する作用と同等の作用を生じる蓋然性が高いといえる。
　ＣａｓΦタンパク質には、所望される活性が損なわれない限りにおいて、シグナル配列、タグ配列、レポーター配列などの追加の配列が含まれてもよい。発現されたタンパク質が、核内で作用することを担保する観点から、シグナル配列としては、核移行シグナルが付加されていることが望ましい。核移行シグナルは、１つ又は複数の核移行シグナルを直列に配置してもよい。核移行シグナルとしては、植物種に応じて適宜選択することができ、一例として、KRPAATKKAGQAKKKK（配列番号７）、及び／又はGSDYKDHDGDYKDHDIDYKDDDDKPKKKRKV（配列番号８）を使用することができる。これにより細胞内で発現されたＣａｓΦタンパク質は、核内に移行し、核内にてｃｒＲＮＡと協働してターゲット配列を切断することができる。
　ｃｒＲＮＡ又は発現用カセットとしては、通常、プロモーター配列を含み、その制御下に、ｃｒＲＮＡをコードする配列を配置することで作成することができる。ｃｒＲＮＡ発現用カセットは、１のポリヌクレオチド上に含まれてもよいし、異なるポリヌクレオチド上に含まれてもよい。ｃｒＲＮＡとして、ｃｒＲＮＡと複数連結して一本鎖としたガイドＲＮＡをコードする配列をプロモーター配列の制御下に配置することで、ｃｒＲＮＡ発現用カセットとしてもよい。
　ＣａｓΦタンパク質についても、定法に従い、一過的又は恒常的に細胞内で発現させることができる。一例として、ＣａｓΦタンパク質をコードする配列のポリヌクレオチドを、一過的又は恒常的に発現を許容するプロモーター配列を含む発現カセット中に、プロモーターの制御下に配置してＣａｓΦ発現用カセットを調製することができる。プロモーターの制御下に配置するとは、プロモーターにより発現が制御されるように配置されることを言い、プロモーターの３’末端から、適切な塩基数、例えば１０ｂｐ～２００ｂｐの塩基数を空けて配置されてもよい。
　ｃｒＲＮＡ発現用カセットとＣａｓΦ発現用カセットは、１のポリヌクレオチド上に含まれてもよいし、異なるポリヌクレオチド上に含まれてもよい。これらの発現用カセットは、必要に応じて他の要素を含んでもよい。このような要素としては、ターミネーターなど発現に必要な要素や、マルチクローニングサイト、薬剤耐性遺伝子、レポーター遺伝子、複製起点など、プラスミド又はベクターの調製に必要な要素が含まれていてもよい。
　ｃｒＲＮＡ発現用カセット及びＣａｓΦ発現用カセットにおいて使用されるプロモーターとしては、発現させる生物種に応じて適宜選択することができる。植物において発現さ
せる場合、一例として、ｐｏｌＩＩ系プロモーターを使用することもできるが、比較的短いＲＮＡの転写をより正確に行わせるという観点から、ｐｏｌＩＩＩ系プロモーターが好ましい。ｐｏｌＩＩ系プロモーターとしては、例えばＣａＭＶ３５Ｓプロモーター、ＲＰＳ５Ａプロモーター、ＵＢＱプロモーター、ＤＤ４５プロモーター、ＮＯＳプロモーター等が挙げられる。ｐｏｌＩＩＩ系プロモーターとしては、Ｕ６－ｓｎＲＮＡ（例えばＵ６．１－ｓｎＲＮＡ、Ｕ６．２６－ｓｎＲＮＡ等）プロモーター、Ｕ３－ｓｎＲＮＡプロモーター等が挙げられる。
　ｃｒＲＮＡ発現用カセット及びＣａｓΦ発現用カセットにおいて使用されるターミネーターとしては、Ｃａｓタンパク質コード配列からの転写を終結させ（好ましくは、さらにＣａｓタンパク質コード配列から転写されるｍＲＮＡにｐｏｌｙＡ配列を付加でき）ることができる塩基配列である限り特に制限されない。またガイドＲＮＡについては、ｐｏｌｙＴ配列を付加することもできる。終結シグナルとしては、例えば、ヒートショックタンパク質終結シグナル（HspT:Heat shock protein Terminator）、NosT(Noparin synhase Terminator)、３５ｓＴ(CaMV 35S Terminator)、Ｐｅａ３Ａ(Pea Rubisco subunit 3A)等が挙げられる。
　別の態様では、本発明はゲノム編集対象となる重複遺伝子群におけるターゲット配列を決定する工程を含む、ｃｒＲＮＡ発現用カセットの製造方法に関してもよい。重複遺伝子群におけるターゲット配列は、ゲノム情報から、ゲノム編集対象となる重複遺伝子群において、ＣａｓΦのＰＡＭ配列近傍に１６ヌクレオチド長の連続配列が、ミスマッチを含まないように選択されてもよいし、１又は２個のミスマッチを許容するように選択されてもよい。別の態様では、重複遺伝子群におけるターゲット配列は、ゲノム情報から、ゲノム編集対象となる重複遺伝子群において、ＣａｓΦのＰＡＭ配列近傍に１７ヌクレオチド長の連続配列が、ミスマッチを含まない配列と、１又は２個のミスマッチを含むミスマッチ配列とから構成されるように選択される。決定されたターゲット配列をスペーサー配列とし、その余の配列と連結することで、ｃｒＲＮＡ配列を設計することができる。こうして設計されたｃｒＲＮＡ配列からなるポリヌクレオチドを、公知の遺伝子工学的手法に従って容易に作成することができる。こうして作製されたｃｒＲＮＡ配列又はガイドＲＮＡ配列からなるポリヌクレオチドを、公知の遺伝子工学的手法、例えばＰＣＲ、制限酵素処理、ＤＮＡ連結、in vitro転写技術などを利用して、ｃｒＲＮＡ発現用カセットに組み込むことができる。
　本発明の別の態様では、細胞の重複遺伝子のゲノム編集用キットに関していてもよい。かかるキットにおいて、ゲノム編集される重複遺伝子は、１６ヌクレオチド長のターゲット配列のみを有するか、或いは１６又は１７ヌクレオチド長のターゲット配列と、当該ターゲット配列に対して１～２塩基のミスマッチを含むミスマッチ配列とを有することを特徴とする。かかるキットは以下の：
　（ａ）前記ターゲット配列及び前記ミスマッチ配列を標的とするスペーサー配列を導入可能なｃｒＲＮＡの発現カセット；及び、
　（ｂ）ヒュージファージ由来であり、前記ターゲット配列及び前記ミスマッチ配列を切断可能なＣａｓΦタンパク質の発現カセット；
を含む。ｃｒＲＮＡの発現カセットとＣａｓΦタンパク質の発現カセットは、一例としてプラスミドやベクターなどに組み込み、細胞へと遺伝子導入される。本発明に係るゲノム編集用キットには、さらに、必要に応じて核酸導入試薬、緩衝液等、本発明のゲノム編集方法の実施に必要な他の材料、試薬、器具等を適宜含んでいてもよい。本発明のゲノム編集方法の実施に必要な他の材料としては、ｃｒＲＮＡの発現カセット及び／又はＣａｓΦタンパク質の発現カセットに加えて、ドナーポリヌクレオチドが挙げられる。ドナーポリヌクレオチドを核内へと導入することにより、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムにより生じた切断箇所に、ドナーポリヌクレオチドのノックインが可能となる。
　本発明の別の態様では、以下の：
　（ａ）ｃｒＲＮＡ発現用カセットの製造方法により製造されたｃｒＲＮＡ発現用カセットを細胞に導入する工程、及び
　（ｂ）ヒュージファージ由来であり、前記ターゲット配列及び前記ミスマッチ配列を切断可能なＣａｓΦタンパク質の発現カセットを切断可能なＣａｓΦタンパク質をコードする、ＣａｓΦ発現用カセットを細胞に導入する工程
　を含む、細胞の重複遺伝子のゲノム編集方法に関してもよい。ｃｒＲＮＡ発現用カセット及びＣａｓΦ発現用カセットは、２つのポリヌクレオチド上で別個に又は同時に導入されてもよいし、１のポリヌクレオチド上で同時に導入されてもよい。ｃｒＲＮＡの発現カセット及び／又はＣａｓΦタンパク質の発現カセットの細胞への導入に加えて、ドナーポリヌクレオチドを導入することが挙げられる。ドナーポリヌクレオチドを核内へと導入することにより、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムにより生じた切断箇所に、ドナーポリヌクレオチドのノックインが可能となる。
　遺伝子導入は、本技術分野に公知の手法を用いて行うことができる。導入方法は、特に制限されず、導入する物の種類や導入対象に応じて、適宜選択することができる。導入方法としては、直接法とウイルスベクターを用いた方法とに大別される。直接法としては、植物細胞の細胞壁を取り除いたプロトプラストの貪食作用を利用するPEG法やエレクトロポレーション法、金粒子とともに打ち込むパーティクル・ガン法、ウイスカー法などが利用されうる。ウイルスベクターを用いた方法としては、宿主の植物種に応じて、アグロバクテリウム、タバコモザイクウイルス（ＴＭＶ）、プラムポックスウイルス（ＰＰＶ）、ジャガイモＸウイルス（ＰＶＸ）、アルファルファモザイクウイルス（ＡＩＭＶ）、キュウリモザイクウイルス（ＣＭＶ）、カウピーモザイク　ウイルス（ＣＰＭＶ）、ズッキーニイエローモザイクウイルス（ＺＹＭＶ）、ジェミニウイルスなどをベクターとして使用することができる。これらの中でも、簡便性や安全性等の観点から、好ましくはアグロバクテリウム法が挙げられる。また、上記のベクターのように、植物体又は植物細胞への導入に適したベクター以外にも、このようなベクターに本発明のポリヌクレオチドを移し替えるためのベクター（例えば、ゲートウェイ（登録商標）のエントリークローンベクター等）も一例として挙げることができる。
　導入される細胞は、インビトロで培養された細胞であってもよいし、植物体を構成する細胞であってもよい。植物体における導入部位としては、例えば花（特に、花の中の、卵細胞、花粉等）、葉、根、種子、胚等が挙げられる。ゲノム編集による変異を次世代に伝えるべく、生殖細胞においてより効率的にゲノム編集を行うという観点から、導入対象としては、好ましくは茎頂が挙げられる。また、好ましくは、遺伝子導入した細胞から再分化を行ってゲノム編集個体を得る方法、もしくは、体細胞から茎頂を誘導する遺伝子を活用してゲノム編集個体を得る方法を用いてもよい。
　本明細書において言及される全ての文献はその全体が引用により本明細書に取り込まれる。
　以下、本発明を実施例に則して更に詳細に説明するが、これらの実施例はあくまでも説明のために便宜的に示す例に過ぎず、本発明は如何なる意味でもこれらの実施例に限定されるものではない。
実施例１：ヒュージファージ（Huge phage）由来ＣａｓΦ２、ｖＣａｓΦのベクターの調製
（１）ヒュージファージ由来ＣａｓΦ２遺伝子の調製
　ヒュージファージ由来のアミノ酸配列情報（配列番号１）を基に、シロイヌナズナにコドン最適化されたＣａｓタンパク質をコードするＤＮＡ配列に、Ｃ末端核移行シグナル配列－ＦＬＡＧタグをコードするＤＮＡ配列を付加したものを人工合成した（配列番号９）。塩基配列の決定にはサンガー法あるいは次世代シーケンス法を用いた。配列番号１のアミノ酸配列はＮＣＢＩ（国立バイオテクノロジー情報センター）のＧｅｎＢａｎｋなどのよく知られたデータベースにおいて見出すことができる。
（２）植物における一過的ＣａｓΦ２発現用ベクターの構築
　核移行シグナル－ＦＬＡＧタグを付与したシロイヌナズナコドン最適化ＣａｓΦ遺伝子（配列番号９）をｐＥＸ＿３５Ｓ＿ｖｅｃｔｏｒ（ユーロフィンジェノミクス株式会社にて遺伝子合成：図２Ａ）に組み込んだ。配列番号９の合成遺伝子断片と、ＮｃｏＩとＨｉｎｄＩＩＩで切断したリニア化ｐＥＸ＿３５Ｓ＿ｖｅｃｔｏｒを混合し、NEBuilder HiFi DNA Assembly Master Mixにより、ＤＮＡ断片を環状プラスミド化した。得られた環状プラスミドで大腸菌ＤＨ５ａを形質転換し、５０μｇ／ｍＬアンピシリンを含むＬＢ寒天プレート上で培養することにより形質転換体を選択した。数個のコロニーをピックアップし、目的の環状プラスミドを有するクローンを選択し、プラスミドを精製した。作製されたベクターのＣａｓΦコード配列の塩基配列（配列番号１０）、アミノ酸配列（配列番号５）をそれぞれ示す。次に、そのベクターについて、ＢｓａＩとＮｒｕＩで切断し、線状ＤＮＡを得た。同時に、以下の配列：
を有するオリゴヌクレオチドをアニーリングした２本鎖ＤＮＡを準備した。切断したベクターとアニーリングした２本鎖ＤＮＡを一種類ずつＴ４　ＤＮＡ　ｌｉｇａｓｅを用いて環状プラスミド化した。上記の手順で環状プラスミドを精製した。本ベクターはｐＥＸ＿３５Ｓ－ＣａｓΦ２＿ＨＰＴと表記する(図２Ｂ)。
（３）植物における一過的ｖＣａｓΦ発現用ベクターの構築
　核移行シグナル－ＦＬＡＧタグを付与したシロイヌナズナコドン最適化ＣａｓΦ遺伝子（配列番号９）をＰＣＲにて分割した。
以下の配列：
それぞれのプライマーセットをもちいて、配列番号９の合成遺伝子断片を鋳型としてＰＣＲ反応により増幅した。ＰＣＲ反応により増幅できた２本のリニアＤＮＡと、ＮｃｏＩとＨｉｎｄＩＩＩで切断したリニア化ｐＥＸ＿Ｃａｓ９ベクターを混合し、NEBuilder HiFi DNA Assembly Master Mixにより、DNA断片を環状プラスミド化した。得られた環状プラスミドで大腸菌ＤＨ５ａを形質転換し、５０μｇ／ｍＬアンピシリンを含むＬＢ寒天プレート上で培養することにより形質転換体を選択した。数個のコロニーをピックアップし、目的の環状プラスミドを有するクローンを選択し、プラスミドを精製した。作製されたベクターのｖＣａｓΦコード配列の塩基配列（配列番号１１）、アミノ酸配列（配列番号６）をそれぞれ示す。本ベクターはｐＥＸ＿３５Ｓ－ｖＣａｓΦ＿ＨＰＴと表記する。
（４）植物個体用ＣａｓΦ２，ｖＣａｓΦベクターの構築
　ｐＣＡＭＢＩＡ１０５．１Ｒ（コスモバイオ）をＰｍｌＩとＡｓｅＩで切断して線状バイナリーベクターを取得した。同時に、ｐＥＸ＿３５Ｓ－ＣａｓΦ２＿ＨＰＴ、ｐＥＸ＿３５Ｓ－ｖＣａｓΦ＿ＨＰＴそれぞれをＰａｑＣＩで切断して線状ＤＮＡを取得した。それぞれのＤＮＡを線状バイナリーベクターと混合し、NEBuilder HiFi DNA Assembly Master Mixにより、DNA断片を環状プラスミド化した。得られた環状プラスミドで大腸菌DH5aを形質転換し、５０μｇ／ｍＬアンピシリンを含むＬＢ寒天プレート上で培養することにより形質転換体を選択した。数個のコロニーをピックアップし、目的の環状プラスミドを有するクローンを選択し、プラスミドを精製した。本ベクターはｐＣＡ＿３５Ｓ－ＣａｓΦ２＿ＨＰＴ、ｐＣＡ＿３５Ｓ－ｖＣａｓΦ＿ＨＰＴと表記する。
実施例２：シロイヌナズナプロトプラスト細胞におけるＣａｓΦ２、ｖＣａｓΦによる変異導入
（１）シロイヌナズナ遺伝子のゲノム編集実験用のプラスミドの調整
　ｐＥＸ＿３５Ｓ－ＣａｓΦ２＿ＨＰＴベクターもしくはｐＥＸ＿３５Ｓ－ｖＣａｓΦ＿ＨＰＴベクターをＢｓａＩ－ＨＦで切断した。まずは、これらのベクターによりゲノム編集が可能かを調べるために、シロイヌナズナ由来ＰＤＳ３遺伝子（シロイヌナズナゲノム中にシングルコピーの遺伝子）のゲノム編集実験用のＣａｓΦのｃｒＲＮＡのスペーサー配列をクローニングするために、以下の表３に記載の配列：
　を有するオリゴヌクレオチドをそれぞれのＳｅｔごとにアニーリングした２本鎖ＤＮＡを合計３種類準備した。ＰＤＳ３遺伝子は、カロテノイド生合成酵素である フィトエン不飽和化酵素（phytoene desaturase)３遺伝子であり、ノックアウトされると植物細胞が白化することが知られている。これにより、植物体でノックアウトされている箇所の特定が可能になる。切断したベクターとアニーリングした２本鎖ＤＮＡを一種類ずつＴ４　ＤＮＡ　ｌｉｇａｓｅを用いて環状プラスミド化した。得られた環状プラスミドで大腸菌ＤＨ５ａを形質転換し、５０μｇ／ｍＬアンピシリンを含むＬＢ寒天プレート上で培養することにより形質転換体を選択した。数個のコロニーをピックアップし、目的の環状プラスミドを有するクローンを選択し、プラスミドを精製した。
（２）シロイヌナズナプロトプラストの調製
　約２０～３０日間生育させたシロイヌナズナの葉を、セロハンテープにより表皮を剥ぎとり葉肉細胞を露出させた後、その葉を適量の１．０％セルラーゼ－オノズカＲ１０（ヤクルト社製）、０．２５％マセロザイム　Ｒ－１０（ヤクルト社製）、１０ｍＭメルカプトエタノール、４００ｍＭマンニトール、２０ｍＭ　ＫＣｌ、１０ｍＭ　ＣａＣｌ2、２０ｍＭ　ＭＥＳ（ｐＨ５．７）溶液に浸し、２２℃、５０ｒｐｍで振とうしながら、１時間インキュベートし、プロトプラストを遊離させた。プロトプラストは孔径７０μｍのナイロンフィルターで濾した後、５０ｍｌ容チューブに集め、１００×ｇ、１０分間遠心しプロトプラストを回収した後、上清を捨て、１５０ｍＭ　ＮａＣｌ、１２５ｍＭ　ＣａＣｌ2、５ｍＭ　ＫＣｌ、２ｍＭ　ＭＥＳ（ｐＨ５．７）緩衝液（Ｗ５緩衝液）で再懸濁した。再懸濁したプロトプラストは１８％スクロース溶液に重層し、４００ｘｇ、５分遠心して、健全な細胞のみを濃縮した。濃縮した細胞は、Ｗ５緩衝液で再度懸濁した。Ｗ５緩衝液による洗浄を２度繰り返した後、４℃で１０分間インキュベートした。インキュベート後のプロトプラストは、１００×ｇ、５分間遠心後、４００ｍＭマンニトール、１５ｍＭ　ＭｇＣｌ2、４ｍＭ　ＭＥＳ（ｐＨ５．７）緩衝液で再懸濁した。その後、１００×ｇ、５分間遠心することでプロトプラストを回収した後、２．０～３．０×１０5ｃｅｌｌｓ／ｍｌになるよう同緩衝液で細胞濃度を調製し、形質転換用プロトプラスト懸濁液を得た。
（３）シロイヌナズナプロトプラストへのプラスミドＤＮＡ導入
　得られた形質転換用プロトプラスト懸濁液３５μＬと１０ｕＭのプラスミド溶液１０μＬを混合後、４０％（ｗ／ｖ）ＰＥＧ４０００、２００ｍＭマンニトール、１００ｍＭＣａＣｌ2溶液を４５μＬずつ、それぞれ９６穴プレート（ヌンク社製、丸底）に入れ、９００ｒｐｍ、１５秒間振とうし、溶液を混合した。混合液は１０分間室温で静置した。静置後の混合液にＷ５緩衝液を２００μＬ勢いよく加えることでプロトプラストを懸濁させた後、１００×ｇ、５分間遠心し、プロトプラスト細胞をプレート底に集め、上清を２００μＬ捨てることで、プロトプラスト懸濁液を洗浄した。この作業を計４回行った後、各ウェルをパラフィルムでシールし、２２℃で３６時間静置した。
（４）ゲノムＤＮＡのＡｍｐｌｉｃｏｎ－ｓｅｑ解析
　プラスミドＤＮＡを導入後２２℃で３６時間静置したプロトプラスト懸濁液を２００μＬ容チューブに回収し、ゲノム抽出バッファー（２００ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ７．５、２５０ｍＭ ＮａＣｌ、２５ｍＭ ＥＤＴＡ、０．５％ＳＤＳ）と混合後、９５℃で１０分間インキュベートした後、氷上で５分間静置した。熱処理後のプロトプラスト懸濁液からイソプロパノール沈殿によりゲノムＤＮＡを回収した。回収したゲノムＤＮＡは滅菌水で懸濁し、以下の表４に記載の配列のプライマーセットを使用して増幅した約３００ｂｐのＤＮＡ断片を、ｉＳｅｑ１００システム（Ｉｌｌｍｉｎａ社）によりＡｍｐｌｉｃｏｎ－ｓｅｑを行い、ゲノム編集を検出した。ｖＣａｓΦを導入した場合の、標的配列長をそれぞれ１５、１６、１８と変化させた場合の編集の編集効率を、ＣＲＩＳＰＲｅｓｓｏ２ソフトで分析した結果を図３に示す。Controlは、蛍光タンパク質GFP発現ベクターの導入区を対照として用いた。さらにｖＣａｓΦのさらなる対照として、ＳｐｙＣａｓ９を標的配列長１８に対して用いた場合の編集効率を調べた。図３のｖＣａｓΦを用いた場合、標的配列長が１６及び１８である場合に、遺伝子編集が可能であった一方で、標的配列長が１５になると、ゲノム編集が生じなかった。ＳｐｙＣａｓ９を用いた場合のゲノム編集効率は０．０２程度であったが、ｖＣａｓΦを用いた場合は最大で０．０９程度であった。
実施例３：　タバコ葉細胞におけるｖＣａｓΦによる変異導入
（１）タバコ遺伝子のゲノム編集実験用のプラスミドの調整
ｐＥＸ＿３５Ｓ－ｖＣａｓΦ＿ＨＰＴベクターをＢｓａＩ－ＨＦで切断した。タバコ由来ＰＤＳ、ＲＤＲ６、ＳＧＳ３遺伝子のゲノム編集実験用のＣａｓΦのｃｒＲＮＡを形成するためのスペーサー配列をクローニングするために、以下の表５に記載の配列を有するオリゴヌクレオチドをそれぞれのＳｅｔごとにアニーリングした２本鎖ＤＮＡを合計２１種類準備した：
　ＰＤＳ遺伝子は、カロテノイド生合成酵素であるフィトエン不飽和化酵素（phytoene desaturase）遺伝子であり、ノックアウトされると植物細胞が白化することが知られている。これにより、植物体でノックアウトされている箇所の特定が可能になる。タバコにおいて、ＰＤＳ遺伝子の重複遺伝子が２個存在することが知られている。ＲＤＲ６遺伝子は、ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ６であり、外来ＲＮＡと正常なｍＲＮＡとの識別に関与しており、ノックアウトされることで、ウイルスへの抵抗性が減じるという作用が生じることが知られている。タバコにおいて、ＲＤＲ６遺伝子の重複遺伝子が２個存在することが知られている。ＳＧＳ３遺伝子は、遺伝子サイレンシングサプレッサー３であり、ＲＤＲ６と協働し、ウイルスに対する防御機能として機能する。SGS３遺伝子は、ノックアウトされると、ウイルスへの抵抗性が減じるという作用が生じることが知られている。タバコにおいて、ＳＧＳ３遺伝子の重複遺伝子が２個存在することが知られている。切断したベクターとアニーリングした２本鎖ＤＮＡを一種類ずつＴ４ ＤＮＡ ｌｉｇａｓｅを用いて環状プラスミド化した。得られた環状プラスミドで大腸菌ＤＨ５ａを形質転換し、５０μｇ／ｍＬスペクチノマイシンを含むＬＢ寒天プレート上で培養することにより形質転換体を選択した。数個のコロニーをピックアップし、目的の環状プラスミドを有するクローンを選択し、プラスミドを精製した。精製したプラスミドを、アグロバクテリウムＧＶ３１０１株にエレクトロポレーション法で導入し、５０μｇ／ｍＬスペクチノマイシン、５０μｇ／ｍＬゲンダマイシン、５０μｇ／ｍＬリファンピシリンを含むＬＢ寒天プレート上で培養することにより形質転換体を選抜した。
（２）タバコの葉へのアグロインフィルトレーション実験
　目的の環状プラスミドを有するアグロバクテリウムＧＶ３１０１株（非特許文献６：Plant Biotechnology 33, 235-243 (2016)のMaterials and Methods 参照）のコロニーを、５０μｇ／ｍＬスペクチノマイシン、５０μｇ／ｍＬゲンダマイシン、５０μｇ／ｍＬリファンピシリンを含む液体ＬＢ培地に植菌し、２８℃、２日間振盪培養した。導入後に赤色色素を発現するｐＤＥＳＴ＿３５Ｓ＿ＲＵＢＹ＿ＨＳＰ（Ａｂ２８）　コンストラクトを有するＧＶ３１０１株を培養した。ｐＤＥＳＴ＿３５Ｓ＿ＲＵＢＹ＿ＨＳＰ（Ａｂ２８）　コンストラクトを用いることで、アグロインフィルトレーションがされた植物体の領域が赤色に着色する。
　培養した菌液を３０００ｒｐｍ、２０ｍｉｎ遠心して集菌し、インフィルトレーションバッファー（組成：１０ｍＭ ＭｇＣｌ2、１０ｍＭ　ＭＥＳ、１００μＭアセトシリンゴン、ｐＨ５．７）５ｍｌ程度に懸濁し、ＯＤ６００＝１程度に調整した。目的ゲノム編集ベクターを含有するアグロバクテリア溶液２ｍｌ、Ａｂ２８含有アグロバクテリア溶液０．５ｍｌ、インフィルトレーションバッファー２ｍｌを混合し、アグロインフィルトレーション溶液とした。
　２７℃、長日条件で生育させた播種後３週間目のタバコ植物体を用意し、１ｍｌシリンジで、アグロインフィルトレーション溶液を吸い取り、葉の裏側に打ち込み、３日間ほど２７℃、長日条件でインキュベートし、目的のプラスミドを発現させた（結果の一部を図４に示す）。
（３）ゲノムＤＮＡのＡｍｐｌｉｃｏｎ－ｓｅｑ解析
　赤色色素が発現した領域から１ｃｍ角程度の切片を切り出して２ｍｌ容チューブに回収し、ゲノム抽出バッファー(２００ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ７．５、２５０ｍＭ ＮａＣｌ、２５ｍＭ ＥＤＴＡ、０．５％ＳＤＳ）と混合して組織片を破砕したのち、９５℃で５分間インキュベートした後、イソプロパノール沈殿によりゲノムDNAを回収した。回収したゲノムDNAは滅菌水で懸濁し、以下の表６に記載の配列のプライマーセットを使用して増幅した約３００ｂｐのＤＮＡ断片を、ｉＳｅｑ１００システム（Ｉｌｌｍｉｎａ社）によりＡｍｐｌｉｃｏｎ－ｓｅｑを行い、ゲノム編集を検出した。
　ＣＲＩＳＰＲｅｓｓｏ２ソフトで分析した結果を図４に示す。それぞれの結果を、各標的毎にまとめたのが以下の表７である。
　各標的遺伝子について、標的長１６又は１７のいずれでも編集がされており、またミスマッチを含んだ配列でも編集が生じることが示された。

Claims (14)

  1. 　細胞の重複遺伝子のゲノム編集方法であって、前記重複遺伝子が、ゲノム編集の対象となる１６ヌクレオチド長のターゲット配列のみを有するか、或いはゲノム編集の対象となる１６又は１７ヌクレオチド長のターゲット配列と、当該ターゲット配列に対して１～２塩基のミスマッチを含むミスマッチ配列とを有し；ここで前記方法が、
    　（ａ）前記ターゲット配列及びミスマッチ配列を標的とするスペーサー配列を含むｃｒＲＮＡ；及び、
    　（ｂ）ヒュージファージ由来であり、前記ターゲット配列及び前記ミスマッチ配列を切断可能なＣａｓΦタンパク質；
    を、前記細胞内で発現させる工程を含む、重複遺伝子のゲノム編集方法。
  2. 　前記ＣａｓΦタンパク質が、ＣａｓΦ１、ＣａｓΦ２、ｖＣａｓΦ及びＣａｓΦ３からなる群から選ばれる少なくとも１のタンパク質である、請求項１に記載のゲノム編集方法。
  3. 　前記ＣａｓΦタンパク質が、配列番号１、２、３及び４からなる群から選ばれるアミノ酸配列に対し、少なくとも８０％の配列相同性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１に記載のゲノム編集方法。
  4. 　前記重複遺伝子が、機能冗長性を有する重複配列である、請求項１に記載のゲノム編集方法。
  5. 　前記重複遺伝子が、ターゲット配列の近傍にＰＡＭ配列を含む、請求項１に記載のゲノム編集方法。
  6. 　前記スペーサー配列が、前記ターゲット配列と完全一致するように決定される、請求項１に記載のゲノム編集方法。
  7. 　前記重複遺伝子が、１６以上のヌクレオチド長のターゲット配列のみを有するか、或いは１６以上のヌクレオチド長のターゲット配列と、当該ターゲット配列に対して１～２塩基のミスマッチを含むミスマッチ配列とを有する、請求項１に記載のゲノム編集方法。
  8. 　前記重複遺伝子が、１７以上のヌクレオチド長のターゲット配列と、当該ターゲット配列に対して１～２塩基のミスマッチを含むミスマッチ配列とを有する、請求項１に記載のゲノム編集方法。
  9. 　前記重複遺伝子が、前記細胞のゲノム中に２～１００コピー存在する、請求項１に記載のゲノム編集方法。
  10. 　前記細胞のゲノム中に含まれる重複遺伝子のうち、一部又は全ての重複遺伝子を編集する、請求項９に記載のゲノム編集方法。
  11. 　前記細胞が、植物細胞である、請求項１に記載のゲノム編集方法。
  12. 　前記ｃｒＲＮＡ及び／又は前記ＣａｓΦタンパク質を、発現ベクターにより前記細胞内に導入して発現させる、請求項１に記載のゲノム編集方法。
  13. 　前記発現ベクターが、一過性又は恒常性発現ベクターである、請求項１２に記載のゲノム編集方法。
  14. 　細胞の重複遺伝子のゲノム編集用キットであって、前記重複遺伝子が、ゲノム編集の対象となる１６ヌクレオチド長のターゲット配列のみを有するか、或いは１６又は１７ヌクレオチド長のターゲット配列と、当該ターゲット配列に対して１～２塩基のミスマッチを含むミスマッチ配列とを有し、前記キットが；
    　（ａ）前記ターゲット配列及び前記ミスマッチ配列を標的とするスペーサー配列を導入可能なｃｒＲＮＡの発現カセット；及び、
    　（ｂ）ヒュージファージ由来であり、前記ターゲット配列及び前記ミスマッチ配列を切断可能なＣａｓΦタンパク質の発現カセット；
    を含む、前記キット。
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