WO2024048837A1 - 고정화된 이산화탄소 환원 효소를 이용한 연속적인 개미산 제조 장치 및 방법 - Google Patents

고정화된 이산화탄소 환원 효소를 이용한 연속적인 개미산 제조 장치 및 방법 Download PDF

Info

Publication number
WO2024048837A1
WO2024048837A1 PCT/KR2022/015180 KR2022015180W WO2024048837A1 WO 2024048837 A1 WO2024048837 A1 WO 2024048837A1 KR 2022015180 W KR2022015180 W KR 2022015180W WO 2024048837 A1 WO2024048837 A1 WO 2024048837A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
formic acid
carbon dioxide
dehydrogenase
exchange resin
reactor
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Ceased
Application number
PCT/KR2022/015180
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
김용환
전병욱
류정기
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
UNIST Academy Industry Research Corp
Original Assignee
UNIST Academy Industry Research Corp
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by UNIST Academy Industry Research Corp filed Critical UNIST Academy Industry Research Corp
Publication of WO2024048837A1 publication Critical patent/WO2024048837A1/ko
Anticipated expiration legal-status Critical
Ceased legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M21/00—Bioreactors or fermenters specially adapted for specific uses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M1/00—Apparatus for enzymology or microbiology
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M1/00—Apparatus for enzymology or microbiology
    • C12M1/34—Measuring or testing with condition measuring or sensing means, e.g. colony counters
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M1/00—Apparatus for enzymology or microbiology
    • C12M1/40—Apparatus specially designed for the use of free, immobilised, or carrier-bound enzymes, e.g. apparatus containing a fluidised bed of immobilised enzymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M21/00—Bioreactors or fermenters specially adapted for specific uses
    • C12M21/18—Apparatus specially designed for the use of free, immobilized or carrier-bound enzymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M29/00—Means for introduction, extraction or recirculation of materials, e.g. pumps
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M41/00—Means for regulation, monitoring, measurement or control, e.g. flow regulation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N11/00—Carrier-bound or immobilised enzymes; Carrier-bound or immobilised microbial cells; Preparation thereof
    • C12N11/02—Enzymes or microbial cells immobilised on or in an organic carrier
    • C12N11/08—Enzymes or microbial cells immobilised on or in an organic carrier the carrier being a synthetic polymer
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • C12N9/0006—Oxidoreductases (1.) acting on CH-OH groups as donors (1.1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/40—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a carboxyl group including Peroxycarboxylic acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y101/00—Oxidoreductases acting on the CH-OH group of donors (1.1)
    • C12Y101/99—Oxidoreductases acting on the CH-OH group of donors (1.1) with other acceptors (1.1.99)
    • C12Y101/99033—Formate dehydrogenase (acceptor) (1.1.99.33)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/20—Fusion polypeptide containing a tag with affinity for a non-protein ligand
    • C07K2319/21—Fusion polypeptide containing a tag with affinity for a non-protein ligand containing a His-tag

Definitions

  • the present invention relates to an apparatus and method for continuously producing formic acid from carbon dioxide using immobilized carbon dioxide reductase.
  • formic acid is the most ideal chemical raw material in terms of economic and environmental benefits.
  • the direct formate fuel cell (DFFC) which converts formic acid into electrical energy
  • DFFC direct formate fuel cell
  • formic acid has the advantage of being safer to transport than hydrogen gas because it is non-flammable, non-toxic, and inert in the environment.
  • the enzyme reactor that converts carbon dioxide into formic acid and the cathode portion of the electrochemical reactor in which the reduced electron transport material is produced are separated from each other and/or the ion exchange resin tower is introduced, thereby producing a high concentration of formic acid continuously for a long time.
  • One aspect of the present invention is to provide a device capable of continuously producing formic acid from carbon dioxide using immobilized carbon dioxide reductase.
  • Another aspect of the present invention is to provide a method for continuously producing formic acid from carbon dioxide using immobilized carbon dioxide reductase.
  • One aspect of the present invention is
  • An electrochemical reactor including a cathode portion and an anode portion, wherein the cathode and anode are electrically connected to an electrical power source, and the cathode portion contains an electron carrier and contains carbon dioxide or carbon dioxide.
  • An electrochemical reactor in which a device for supplying a gas containing a gas is provided in the cathode portion;
  • Formic acid production device comprising a pump for transferring carbon dioxide and reduced electron carrier dissolved in the cathode portion to the enzyme reactor, or transferring formic acid and oxidized electron carrier produced in the enzyme reactor to the electrochemical reactor.
  • Another aspect of the present invention is
  • the method for producing formic acid further includes the step of (4) transferring the electron carrier oxidized due to the formic acid production reaction from the enzyme reactor to the cathode portion of the electrochemical reactor, the step ( A method for producing formic acid is provided, in which steps 1) to (4) are repeatedly performed.
  • the enzyme reactor that converts carbon dioxide into formic acid and the cathode portion of the electrochemical reactor in which the reduced electron carrier is produced are separated from each other, so there is no problem in future scale-up and the scale of formic acid production can be increased. It is advantageous for commercialization because it can be made large.
  • the produced formic acid is continuously recovered by the ion exchange resin tower, product inhibition phenomenon caused by the produced formic acid can be prevented, and formic acid production can be continued.
  • Figure 1 shows the structure of carbon dioxide reductase immobilized on Ni-NTA agarose beads (nickel-nitrilotriacetic acid agarose beads) using histidine-tagged formate dehydrogenase 1 (FDH1).
  • Figure 2 is a schematic diagram of an electrochemical reactor using a circulation system according to an embodiment of the present invention.
  • Figures 3a and 3b are graphs showing the results of producing formic acid over a long period of time using a cyclic electrochemical reactor according to an embodiment of the present invention.
  • Figure 4 shows a schematic diagram and conditions of an ion exchange resin adsorption experiment for separating formic acid using an anion exchange resin.
  • Figure 5 is a graph showing the results of measuring the formic acid concentration and pH change of the discharged sample when separating formic acid using an anion exchange resin.
  • Figure 6 is a schematic diagram of a cyclic electrochemical CO 2 reduction reaction system using an anion exchange resin.
  • Figure 7 is a graph showing the change in current depending on whether or not the ion exchange resin tower is installed.
  • Figure 8 is a graph showing the concentration of reduced ethyl viologen (EV) at the inlet and outlet of the immobilized enzyme when equipped with an ion exchange resin tower.
  • Figure 9 is a graph comparing the formic acid concentration in the electrolyte and the formic acid concentration expected by current.
  • Figure 10 is a graph showing the concentration of formic acid adsorbed and separated in the column of the ion exchange resin tower.
  • Embodiments of the present invention may be modified into various other forms, and the scope of the present invention is not limited to the embodiments described below. Additionally, the embodiments of the present invention are provided to more completely explain the present invention to those with average knowledge in the relevant technical field.
  • One aspect of the present invention is,
  • An electrochemical reactor including a cathode portion and an anode portion, the cathode and anode being electrically connected to a power source, the cathode portion including an electron transporter, and a device for supplying carbon dioxide or a gas containing carbon dioxide to the cathode.
  • An electrochemical reactor provided in the unit;
  • Formic acid production device comprising a pump for transferring carbon dioxide and reduced electron carrier dissolved in the cathode portion to the enzyme reactor, or transferring formic acid and oxidized electron carrier produced in the enzyme reactor to the electrochemical reactor.
  • the electrochemical reactor includes a cathode portion and an anode portion, and the cathode and anode may be electrically connected to a power source and spaced apart from each other.
  • the cathode unit includes an electron transporter, and carbon dioxide is supplied to the cathode unit by a device that supplies carbon dioxide or a gas containing carbon dioxide.
  • the cathode portion of the electrochemical reactor includes an electron carrier, thereby increasing the efficiency of formic acid production through the electron carrier.
  • the electron carrier is first put into the cathode part of the electrochemical reactor, it is reduced in the cathode part, and then after producing formic acid in the enzyme reactor, it is oxidized and circulated back to the electrochemical reactor.
  • the electron transporter may be a natural electron transporter or an artificial electron transporter. Additionally, the electron transporter may be at least one electron transporter selected from the group consisting of an electron transporter having a viologen group and an electron transporter having an adenine dinucleotide group.
  • the electron carrier may be a compound having a viologen group, for example, alkyl viologen, benzyl viologen, nicotinamide adeninedi nucleotide (NAD), and flavin adenine (FAD). It may be at least one electron carrier selected from the group consisting of dinucleotide), and the alkyl viologen may be methyl viologen, ethyl viologen, propyl viologen, etc. It may include, but is not limited to this.
  • the electron carrier is selected from the group consisting of methyl viologen, ethyl viologen, benzyl viologen, NAD (nicotinamide adenine dinucleotide), and FAD (Flavin adenine dinucleotide). It may be at least one electron transporter, and more specifically, it may be at least one electron transporter selected from the group consisting of methyl viologen and ethyl viologen.
  • the device for supplying carbon dioxide or a gas containing carbon dioxide may be installed in the cathode portion according to an embodiment of the present invention, and is not particularly limited as long as it is a device capable of injecting carbon dioxide or a gas containing carbon dioxide into the cathode.
  • the enzyme reactor includes an immobilized carbon dioxide reductase enzyme.
  • the carbon dioxide reductase may be formic acid dehydrogenase, and the formic acid dehydrogenase may contact carbon dioxide and convert carbon dioxide into formic acid.
  • formic acid dehydrogenase can produce formic acid by catalyzing the reaction of Scheme 1 below:
  • the formic acid dehydrogenase may be derived from nature, or may be obtained through various protein synthesis methods well known in the art. As an example, it can be manufactured using genetic recombination and protein expression systems, in vitro synthesis through chemical synthesis such as protein synthesis, or cell-free protein synthesis. Additionally, as an example, the formic acid dehydrogenase may be a peptide, an extract of plant-derived tissue or cell, or a product obtained by culturing microorganisms (e.g., bacteria or fungi, and especially yeast).
  • microorganisms e.g., bacteria or fungi, and especially yeast
  • protein refers to a polymer consisting of two or more amino acids linked by amide bonds (or peptide bonds).
  • expression refers to the process by which a polypeptide is produced from a structural gene. The process involves transcription of a gene (polynucleotide) into mRNA, and translation of this mRNA into polypeptide (protein)(s).
  • recombinant refers to a cell that replicates a heterologous nucleic acid, expresses a heterologous nucleic acid, or expresses a peptide, heterologous peptide, or protein encoded by a heterologous nucleic acid.
  • Recombinant cells can express genes or gene segments that are not found in the natural form of the cell, either in sense or antisense form. Additionally, recombinant cells can express genes found in cells in their natural state, but the genes are modified and reintroduced into the cells by artificial means.
  • the formic acid dehydrogenase has about 70% or more, about 75% or more, about 80% or more, about 85% or more, about 90% or more, about 92% or more, about 95% or more, and about 97% or more of the amino acid sequence of formic acid dehydrogenase, respectively. It may include proteins having sequence homology of at least %, at least about 98%, or at least about 99%.
  • homology is intended to indicate the degree of similarity with the wild-type amino acid sequence. Comparison of such homologies can be performed using a comparison program widely known in the art, and homology between two or more sequences is used. It can be calculated as a percentage (%).
  • the formic acid dehydrogenase may be an isozyme of formic acid dehydrogenase.
  • the formic acid dehydrogenase may be used in the genus Methylobacterium sp., Candida sp., and Thiobacillus sp. .), Ralstonia sp., and Rhodobacter sp.
  • the formic acid dehydrogenase is Methylobacterium extorquens , Candida boidinii , Thiobacillus sp. KNK65MA, Ralstonia eutropha , and Rhodobacter capsulatus.
  • the formic acid dehydrogenase may be FDH1 (formate dehydrogenase 1) derived from Methylobacterium extorquens AM1, which contains tungsten, and may be manufactured through genetic recombination.
  • FDH1 formate dehydrogenase 1
  • Methylobacterium extorquens AM1 which contains tungsten
  • the Methylobacterium extorquens AM1 has an endogenous gene encoding FDH1 alpha (formate dehydrogenase 1 alpha subunit) and an endogenous gene encoding FDH1 beta (formate dehydrogenase 1 beta subunit) deleted, and Methylobacterium It may be a recombinant microorganism into which exogenous genes encoding FDH1 and histidine marker derived from Rium extorquens AM1 have been introduced.
  • the formic acid dehydrogenase may be formic acid dehydrogenase I derived from Methylobacterium extorquens AM1 (ATCC 14718, GenBank accession No. CP001510.1).
  • the formic acid dehydrogenase I derived from Methylobacterium extorquens AM1 may be composed of a MeFDH I alpha subunit (GenBank accession No. ACS42636.1) and a MeFDH I beta subunit (GenBank accession No.
  • fdh1A GenBank accession, CP001510.1:5169596-5172565, Methylobacterium extorquens AM1, complete genome
  • fdh1B GenBank accession, CP001510.1:5167825-5169543, Methylobacterium extorquens AM1. , complete genome
  • fdh1A GenBank accession, CP001510.1:5169596-5172565, Methylobacterium extorquens AM1, complete genome
  • fdh1B GenBank accession, CP001510.1:5167825-5169543, Methylobacterium extorquens AM1.
  • complete genome may be a polypeptide encoded by it.
  • a protecting group may be bound to the C-terminus.
  • the protecting group may be an acetyl group, fluorenyl methoxy carbonyl group, formyl group, palmitoyl group, myristyl group, stearyl group, or polyethylene glycol (PEG), but the modification of the formic acid dehydrogenase, especially the stability of the formic acid dehydrogenase, Any ingredient that can enhance can be included without limitation.
  • the formic acid dehydrogenase may additionally include a targeting sequence, a tag, and an amino acid sequence prepared for a specific purpose for the labeled residue, but is not particularly limited thereto.
  • the formic acid dehydrogenase may be a histidine-tagged formic acid dehydrogenase.
  • the enzyme reactor includes immobilized carbon dioxide reductase, and the carbon dioxide reductase can be immobilized by physical adsorption or chemical bonding. By using immobilized carbon dioxide reductase, the carbon dioxide reductase can be reused, making it advantageous for use in continuous processes.
  • the histidine-labeled formic acid dehydrogenase may be formic acid dehydrogenase immobilized by nickel-nitrilotriacetic acid (Ni-NTA).
  • Ni-NTA nickel-nitrilotriacetic acid
  • Ni-NTA nickel-nitrilotriacetic acid
  • Ni-NTA resin nickel-nitrilotriacetic acid
  • Ni-NTA affinity resin Ni-NTA column
  • Ni-NTA affinity column Ni-NTA agarose
  • Ni-NTA bead Ni-NTA agarose bead
  • Ni-NTA magnetic bead Ni-NTA magnetic bead
  • the Ni-NTA may be Ni-NTA agarose bead. there is.
  • a recombinant enzyme is produced so that the formic acid dehydrogenase from Methylobacterium extorqueens AM1 containing tungsten has a histidine label, and the enzyme is immobilized on Ni-NTA agarose beads to perform enzyme catalyst at the same time. Make it easy to prepare.
  • recombinant FDH1 containing tungsten was prepared using a plasmid that additionally encoded a histidine mark at the C-terminus of the FDH1 alpha subunit and an exogenous gene encoding the FDH1 beta subunit was introduced, and the FDH1 enzyme prepared in this way was Using Ni-NTA agarose beads, it is easily immobilized on Ni-NTA agarose beads based on its affinity to the FDH1-His tag. Using this immobilized enzyme, high concentration formic acid can be produced through long-term operation in an electrochemical reactor and continuous reuse is possible.
  • an electrochemical reactor including a cathode unit for dissolving carbon dioxide and reducing an electron transporter and an enzyme reactor in which a reaction for converting carbon dioxide to formic acid proceeds may be installed separately and independently from each other.
  • carbon dioxide reductase was added directly to the electrochemical reactor, but the electrode area was limited, which limited the scale of formic acid production. If the electrochemical reactor and the enzyme reactor that converts carbon dioxide into formic acid are installed separately according to the present invention, there is no limit to the electrode area, so there is no problem in increasing the scale of formic acid production, which can be advantageous for mass producing formic acid.
  • the formic acid production device includes a pump for transferring carbon dioxide and reduced electron carrier dissolved in the cathode portion of the electrochemical reactor to the enzyme reactor, or transferring formic acid and oxidized electron carrier produced in the enzyme reactor to the electrochemical reactor. .
  • the pump transfers an aqueous solution containing carbon dioxide and a reduced electron carrier from the cathode portion of the electrochemical reactor to the enzyme reactor, or transfers an aqueous solution containing formic acid and an oxidized electron carrier produced in the enzyme reactor to the electrochemical reactor.
  • It is a means for transferring liquid, and is not particularly limited as long as it is a device that can perform this function.
  • the pump is a pump for transferring liquid, for example, a peristatic pump capable of delivering a certain amount of material may be used.
  • the metering pump supplies a certain amount of reduced electron carrier and dissolved carbon dioxide from the cathode to the enzyme reactor.
  • the formic acid production device may further include an ion exchange resin tower.
  • formic acid has a negative charge in the electrolyte, formic acid can be selectively adsorbed using an anion exchange resin.
  • the ion exchange resin tower may be located between the enzyme reactor and the electrochemical reactor.
  • an aqueous solution containing formic acid produced from carbon dioxide by an immobilized carbon dioxide reductase and an oxidized electron carrier is injected into a packed tower filled with an anion exchange resin, thereby attaching formic acid to the anion exchange resin and maintaining the unattached oxidized state.
  • the aqueous solution containing the electron carrier is sent to the cathode portion of the electrochemical reactor.
  • the produced formic acid is continuously recovered by the ion exchange resin tower, so the product inhibition phenomenon caused by the produced formic acid can be prevented, and formic acid can be continuously produced.
  • the concentration of hydrogen ions produced by dissociation by the produced formic acid matches the concentration of hydroxide ions dissociated when recovered by the ion exchange resin tower, eliminating the need for separate pH adjustment.
  • Step (1) is a step of reducing the electron carrier and dissolving carbon dioxide in the cathode part of the electrochemical reactor to increase formic acid production efficiency.
  • the electron carrier is included in the cathode portion, and the carbon dioxide is provided from a device that supplies carbon dioxide or a gas containing carbon dioxide.
  • the electron transporter may be at least one electron transporter selected from the group consisting of an electron transporter having a viologen group and an electron transporter having an adenine dinucleotide group, and the “electron transporter” is within the above-mentioned range. You can.
  • the electron transporter may be a compound having a viologen group.
  • the carbon dioxide may be provided from a device that supplies carbon dioxide or a gas containing carbon dioxide, and the device may be within the range described above.
  • the enzyme reactor contains immobilized carbon dioxide reductase enzyme necessary to convert carbon dioxide to formic acid.
  • the carbon dioxide reductase may be formic acid dehydrogenase, and in one embodiment, the formic acid dehydrogenase may be FDH1 derived from Methylobacterium extorquens AM1 containing tungsten.
  • the formic acid dehydrogenase may be histidine-labeled formic acid dehydrogenase and/or may be immobilized on Nickel-Nitrilotriacetic Acid (Ni-NTA).
  • the “formic acid dehydrogenase”, “histidine label”, “Ni-NTA”, etc. may be within the above-mentioned range.
  • Step (2) is a step of transferring the reduced electron carrier and dissolved carbon dioxide from the cathode unit to the enzyme reactor
  • step (3) is a step of producing formic acid by reducing carbon dioxide with a carbon dioxide reductase in the enzyme reactor.
  • the method for producing formic acid according to the present invention further includes the step of (4) transferring the oxidized electron carrier from the formic acid production reaction from the enzyme reactor to the cathode portion of the electrochemical reactor, wherein steps (1) to ( 4) can be performed repeatedly.
  • Step (4) is a step of transferring the electron carrier oxidized in step (3) to the cathode portion.
  • the method for producing formic acid according to the present invention can continuously produce formic acid by repeatedly performing steps (1) to (4).
  • steps (2) and (4) the delivery of carbon dioxide, electron carriers, generated formic acid, etc. can be performed by a pump, and the “pump” is as described above.
  • steps (1) and (3) are performed independently and separately from each other. In this way, when the electrochemical reaction and the enzymatic reaction that converts carbon dioxide into formic acid are performed separately, there is no problem in increasing the scale of formic acid production because there is no limit to the electrode area of the electrochemical reactor, making it possible to mass-produce formic acid.
  • the method for producing formic acid according to the present invention may further include the step of recovering the produced formic acid by adsorbing it on an ion exchange resin tower after step (3) and before step (4).
  • formic acid has a negative charge in the electrolyte, it can be recovered by adsorbing formic acid on an anion exchange resin tower. Therefore, since formic acid produced by reducing carbon dioxide with carbon dioxide reductase in the enzyme reactor is removed by adsorption in the anion exchange resin tower, product inhibition due to formic acid may not occur.
  • the hydrogen ions dissociated from the produced formic acid are neutralized by the hydroxide ions dissociated in the anion exchange resin tower, which has the effect of eliminating the need for separate pH adjustment, making it possible to continuously produce formic acid for a long time.
  • recombinant FDH1 containing tungsten immobilized on Ni-NTA agarose beads is charged into an enzyme reactor, (b) carbon dioxide is injected into the cathode portion of the electrochemical reactor to dissolve it in water, Reduce the electron carrier (e.g., ethyl viologen) dissolved in the cathode portion, (c) supply the aqueous solution containing carbon dioxide and the electron carrier in the cathode portion to the enzyme reactor with a liquid transfer pump (e.g., metering pump), ( d) Formic acid is produced by consuming carbon dioxide and reduced electron carriers by formic acid dehydrogenase immobilized in the enzyme reactor, and (e) the aqueous solution containing the produced formic acid and oxidized electron carriers is transferred to an anion exchange resin using a liquid transfer pump. is injected into a packed tower to attach formic acid to the anion exchange resin, and (f) the aqueous solution containing the electron transporter in the unattache
  • carbon dioxide is dissolved in the cathode part of the electrochemical reactor, and the electron carrier is reduced and continuously supplied to the enzyme reactor, and at the same time, formic acid produced in the enzyme reactor is continuously separated using an ion exchange resin. This can increase productivity in the electrochemical reactor.
  • the manufacturing method is not limited to one embodiment of the present invention presented as an example, and the description of the formic acid manufacturing apparatus may be applied unless there is a contradiction.
  • MeFDH1alpha/beta coding gene GenBank accession numbers ACS42636.1(fdh1a), ACS42635.1(fdh1b)
  • the MeFDH1alpha/beta coding gene was amplified with a His6 tag at the C-terminus of the alpha subunit.
  • PCR products were inserted into pCM110 through multicloning sites (Spe1 and Kpn1). All plasmids and mutant strains are described in Table 1 below.
  • Table 1 below shows bacterial strains and plasmids for knock-out or recombinant expression.
  • the knockout mutant (MeAM1( ⁇ ) containing pCM110-MeFDH1-His was grown at 30°C for 20 h until the optical density (OD600) reached 0.5 to 0.8, followed by a final addition of methanol. Recombinant expression was induced at a concentration of % After 48 h of culture, cultured cells were harvested and aliquots of the cell pellet obtained by centrifugation (7000 rpm, 4°C, 15 min) were stored at -70°C until use.
  • the basic culture medium for the microorganisms contains 16 g/L succinic acid as a carbon source and minimal salt medium (1.62 g/L NH 4 Cl, 0.2 g/L MgSO 4 , 2.21 g/LK 2 HPO 4 , and 1.25 g/L NaH 2 PO 4 ⁇ 2H 2 O).
  • Selective antibiotics for selecting recombinant microorganisms include 50 ⁇ g/mL rifamycin (Rif), 50 ⁇ g/mL kanamycin (Kan), or 10 ⁇ g/mL. mL tetracycline (Tet) was used.
  • All of the above microorganisms were cultured in a 1 L Erlenmeyer shake flask at 26°C and 200 rpm in a volume of 200 mL.
  • the cell concentration was 0.5 to 0.8 based on OD600. 0.5% methanol was added to express the target FDH1-his tag enzyme.
  • the cells were cultured for a total of 48 hours, and the cultured cells were obtained by centrifugation at 7,000 rpm for 15 minutes. Afterwards, they were crushed using a cell crusher. After centrifugation at 4,611 g for 30 minutes to recover the supernatant, only the FDH1-his tag was selectively immobilized using Ni-NTA agarose beads (Bio-Rad, Cat No. 7321010).
  • Figure 1 shows the structure of the enzyme immobilized on Ni-NTA agarose beads.
  • FIG. 1 shows a schematic diagram of an electrochemical reactor using a circulation system.
  • Formic acid was produced using the cyclic electrochemical reactor, and the results are shown in Figures 3a and 3b.
  • the cyclic electrochemical reactor produced 1.74 M formic acid for 500 hours, and the Faradaic efficiency was 100.3%, confirming that all supplied electrons were used to produce formic acid.
  • the concentration of formic acid did not increase any further after 500 hours. This can be inferred for two reasons: 1) a competitive product inhibition mechanism and 2) inactivation of the enzyme due to a long-term reaction. Accordingly, after 500 hours of reaction, the reaction was performed again by replacing it with a new electrolyte without formic acid. As a result, it was confirmed that productivity recovered after formic acid, which no longer increased at 1.74 M, was replaced. From this, it was confirmed that the main cause of the decrease in productivity of formic acid during long-term reaction was competitive inhibition by the product.
  • Example 1 According to the main cause of the decrease in formic acid productivity identified in Example 1, a real-time separation process of formic acid produced in a cyclic electrochemical reactor was additionally required. Because formic acid has a negative charge in the electrolyte, selective adsorption of formic acid was expected when using an anion exchange resin.
  • Table 2 compares the formic acid production of the electrochemical reactor and the formic acid adsorption of the anion exchange resin.
  • Electrochemical formic acid production Anion exchange resin tower Volume (mL) 40 70 Formic acid concentration (M) 1.7 One Number of moles of formic acid produced or adsorbed (mmol) 68 70
  • FIG. 6 is a schematic diagram of a cyclic electrochemical CO 2 reduction reaction system using an anion exchange resin.
  • the concentration of reduced EV at the inlet and outlet of the immobilized enzyme when equipped with an anion exchange resin tower is shown in Figure 8. It was confirmed that the concentration of reduced EV was maintained at 4 to 6 mM when the anion exchange resin tower was installed. However, the concentration of EV was maintained lower than 10 mM and the low current showed that a small amount of EV was adsorbed on the anion exchange resin. It was estimated that
  • Figure 9 is a graph comparing the formic acid concentration in the electrolyte and the formic acid concentration expected by current. A low formic acid concentration was maintained in the electrolyte compared to the formic acid concentration expected from the current data, and it was estimated that formic acid was adsorbed to the anion exchange resin tower to the extent of this difference.
  • Table 3 below shows formic acid production and Faraday efficiency in the electrochemical reactor.

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Sustainable Development (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)

Abstract

본 발명은 고정화된 이산화탄소 환원 효소를 이용한 연속적인 개미산 제조 장치 및 방법에 관한 것으로, 환원된 전자전달체가 생산되는 전기화학 반응기와 이산화탄소를 개미산으로 전환하는 효소 반응기를 서로 분리함으로써 향후 스케일업을 하는데 문제가 없어 개미산 생산 스케일을 크게 하는데 유리하다. 또한, 이온 교환수지탑을 이용하여 생산된 개미산을 분리 회수함으로써 생산물 저해 현상을 막을 수 있어 개미산 생산이 지속적으로 이루어질 수 있으며, 별도의 pH를 조절할 필요가 없는 장점이 있다.

Description

고정화된 이산화탄소 환원 효소를 이용한 연속적인 개미산 제조 장치 및 방법
본 발명은 고정화된 이산화탄소 환원 효소를 이용하여 이산화탄소로부터 개미산을 연속적으로 제조할 수 있는 장치 및 방법에 관한 것이다.
화석 연료를 이용하는 산업 전반의 빠른 발전은 대기 중 이산화탄소의 농도를 급속하게 증가시키고 있다. 게다가, 대기 중 이산화탄소의 증가가 온실효과를 통한 지구온난화를 발생시키는 결정적인 원인임이 다수의 논문들에 의해 확인된 바 있다. 따라서 이러한 이산화탄소를 고부가가치의 화학물질로 전환하는 것은 대기 중 이산화탄소 증가의 속도를 늦추는데 필수적인 기술로 상정되고 있다. 다행히도, 이산화탄소는 개미산, 디메틸 카보네이트, 고분자 등 환경 친화적인 화학 플랫폼을 생산할 수 있는 유망한 재생 가능한 자원이다.
이산화탄소로부터 생산할 수 있는 많은 후보 물질들 중에서 개미산은 경제적 및 환경적 이익 측면에서 가장 이상적인 화학 원료이다. 특히, 개미산을 전기에너지로 전환시키는 직접적 개미산 연료셀(direct formate fuel cell; DFFC)은 풍력, 태양력, 수력 등 다양한 재생 에너지원에서 생산된 에너지를 개미산으로 쉽게 저장할 수 있기 때문에 재생 에너지 저장의 해결책으로 제시되고 있다. 또한, 개미산은 환경에서 불연성, 무독성, 및 불활성이므로 수소 가스보다 안전하게 수송이 가능한 장점이 있다.
이처럼 유망한 잠재력에도 불구하고, 이산화탄소로부터 고부가가치의 화합물을 생산하는 기존의 기술은 가혹한 반응 조건과 희귀한 귀금속 촉매 및 수소 가스, 수소화물 등과 같은 값 비싼 환원제를 요구하는 치명적인 한계를 갖고 있다. 상대적으로 낮은 전기 에너지 비용을 고려할 때, 이산화탄소의 전기 촉매 반응이 유망한 대안일지라도, 일부 화학 전기 촉매는 이산화탄소의 개미산 전환 중에 높은 비율로 부산물인 수소 가스를 생산하기 때문에 불충분한 반응선택성을 보여주고 있는 실정이다. 따라서, 효소 기반의 전기화학반응에 의한 이산화탄소로부터의 개미산 생산은 탁월한 개미산 선택성으로 인하여 더 많은 관심을 받고 있다.
그러나, 효소 기반의 전기화학반응의 경우 이러한 장점에도 불구하고 여러가지 문제점으로 인하여 실용화되지 못하고 있다. 그 중 가장 큰 요인은 이산화탄소 환원반응속도가 큰 금속 함유 효소의 경우, 산소에 극히 불안정하여 쉽게 활성을 잃는다는 것이다. 또한, 이산화탄소를 환원시키는 반응과 생성된 개미산을 다시 산화시키는 반응은 모두 효소가 촉매하므로 결과적으로 반응 평형이 존재하고 이로 인하여 고농도의 개미산 생산이 어려운 단점이 존재한다.
이에, 본 발명에서는 이산화탄소를 개미산으로 전환하는 효소 반응기와 환원된 전자전달체가 생산되는 전기화학 반응기의 음극 부위를 서로 분리하고/하거나 이온 교환수지탑을 도입함으로써 장시간 연속적으로 고농도의 개미산을 생산할 수 있는 장치 및 방법을 개발하기에 이르렀다.
본 발명의 일 양상은 고정화된 이산화탄소 환원 효소를 이용하여 이산화탄소로부터 개미산을 연속적으로 제조할 수 있는 장치를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 양상은 고정화된 이산화탄소 환원 효소를 이용하여 이산화탄소로부터 개미산을 연속적으로 제조할 수 있는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 일 양상은
(i) 캐소드(cathode)부 및 애노드(anode)부를 포함하며, 캐소드 및 애노드는 전기적으로 전원(electrical power source)에 연결되어 있는 전기화학 반응기로서, 상기 캐소드부는 전자전달체를 포함하며, 이산화탄소 또는 이산화탄소를 포함하는 기체를 공급하는 장치가 상기 캐소드부에 구비되어 있는, 전기화학 반응기;
(ii) 고정화된 이산화탄소 환원 효소를 포함하는 효소 반응기; 및
(iii) 상기 캐소드부에 용해된 이산화탄소와 환원된 전자전달체를 상기 효소 반응기로 전달하거나, 효소 반응기에서 생산된 개미산과 산화된 전자전달체를 전기화학 반응기로 전달하기 위한 펌프를 포함하는, 개미산 제조 장치를 제공한다.
본 발명의 다른 양상은
(1) 전기화학 반응기의 캐소드부에서 전자전달체를 환원시키고 이산화탄소를 용해시키는 단계로서, 상기 전자전달체는 캐소드부에 포함되어 있고, 상기 이산화탄소는 이산화탄소 또는 이산화탄소를 포함하는 기체를 공급하는 장치로부터 제공되는 단계;
(2) 상기 캐소드부에서 환원된 전자전달체와 용해된 이산화탄소를, 고정화된 이산화탄소 환원 효소를 포함하는 효소 반응기로 전달하는 단계; 및
(3) 상기 효소 반응기에서 이산화탄소 환원 효소에 의해 이산화탄소를 환원시켜 개미산을 생산하는 단계를 포함하는, 개미산의 제조 방법을 제공한다.
본 발명의 또 다른 양상은, 상기 개미산의 제조 방법에서 (4) 개미산 생산 반응으로 인해 산화된 전자전달체를 상기 효소 반응기에서 상기 전기화학 반응기의 캐소드부로 전달하는 단계를 추가로 포함하며, 상기 단계 (1) 내지 (4)가 반복적으로 수행되는, 개미산의 제조 방법을 제공한다.
본 발명에서 따른 개미산 제조 장치 및 방법은 이산화탄소를 개미산으로 전환하는 효소 반응기와 환원된 전자전달체가 생산되는 전기화학 반응기의 음극 부위가 서로 분리되어 있기 때문에 향후 스케일업을 하는데 문제가 없어 개미산 생산 규모를 크게 할 수 있으므로 상업화하는데 유리하다. 또한, 생산된 개미산이 연속적으로 이온 교환수지탑에 의하여 회수되므로 생산된 개미산에 의하여 유발되는 생산물 저해 현상을 막을 수 있어 개미산 생산이 지속적으로 이루어질 수 있다. 뿐만 아니라, 생산된 개미산에 의하여 해리되어 생산된 수소 이온 농도와, 이온 교환수지탑에 의하여 회수될 때 해리된 수산화 이온 농도가 일치하여 별도로 pH를 조절할 필요가 없는 장점이 있다. 따라서, 본 발명에 따라 이산화탄소로부터 개미산을 제조하는 장치는 배치형이지만 중간에 반응을 중단할 필요없이 연속적으로 개미산을 생산하는 것이 가능하다.
도 1은 히스티딘 표지(histidine tag)된 FDH1(formate dehydrogenase 1)를 이용하여 Ni-NTA 아가로즈 비드(nickel-nitrilotriacetic acid agarose bead)에 고정화된 이산화탄소 환원 효소의 구조를 나타낸 것이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 순환 시스템을 이용한 전기화학 반응기의 모식도이다.
도 3a 및 3b는 본 발명의 일 실시예에 따른 순환형 전기화학 반응기를 이용하여 장기간 개미산을 생산한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 4는 음이온 교환수지를 이용하여 개미산을 분리하기 위한 이온 교환수지 흡착 실험 모식도 및 조건을 나타낸 것이다.
도 5는 음이온 교환수지를 이용하여 개미산을 분리하는 경우 배출된 시료의 개미산 농도 및 pH 변화를 측정한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 6은 음이온 교환수지를 이용한 순환형 전기화학적 CO2 환원반응 시스템의 모식도이다.
도 7은 이온 교환수지탑 장착 유무에 따른 전류의 변화를 나타낸 그래프이다.
도 8은 이온 교환수지탑을 장착한 경우 고정화된 효소의 입구와 출구에서의 환원된 에틸 바이올로젠(ethyl viologen: EV)의 농도를 나타낸 그래프이다.
도 9는 전해질에서의 개미산 농도 및 전류에 의하여 예상되는 개미산 농도를 비교한 그래프이다.
도 10은 이온 교환수지탑의 컬럼에서 흡착 분리된 개미산의 농도를 나타낸 그래프이다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명의 실시 형태는 여러 가지 다른 형태로 변형될 수 있으며, 본 발명의 범위가 이하 설명하는 실시 형태로 한정되는 것은 아니다. 또한, 본 발명의 실시 형태는 당해 기술분야에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 더욱 완전하게 설명하기 위해서 제공되는 것이다.
나아가, 명세서 전체에서 어떤 구성요소를 "포함"한다는 것은 특별히 반대되는 기재가 없는 한 다른 구성요소를 제외하는 것이 아니라 다른 구성요소를 더 포함할 수 있다는 것을 의미한다.
본 발명의 일 양상은,
(i) 캐소드부 및 애노드부를 포함하며, 캐소드 및 애노드는 전기적으로 전원에 연결되어 있는 전기화학 반응기로서, 상기 캐소드부는 전자전달체를 포함하며, 이산화탄소 또는 이산화탄소를 포함하는 기체를 공급하는 장치가 상기 캐소드부에 구비되어 있는, 전기화학 반응기;
(ii) 고정화된 이산화탄소 환원 효소를 포함하는 효소 반응기; 및
(iii) 상기 캐소드부에 용해된 이산화탄소와 환원된 전자전달체를 상기 효소 반응기로 전달하거나, 효소 반응기에서 생산된 개미산과 산화된 전자전달체를 전기화학 반응기로 전달하기 위한 펌프를 포함하는, 개미산 제조 장치를 제공한다.
상기 개미산 제조 장치에서 전기화학 반응기는 캐소드부 및 애노드부를 포함하며, 캐소드 및 애노드는 전기적으로 전원에 연결되고 서로 이격될 수 있다. 이때 상기 캐소드부는 전자전달체를 포함하며, 이산화탄소 또는 이산화탄소를 포함하는 기체를 공급하는 장치에 의해 이산화탄소가 캐소드부로 공급된다.
상기 전기화학 반응기의 캐소드부는 전자전달체를 포함함으로써 전자전달체를 통해 개미산 제조 효율을 증가시킬 수 있다. 전자전달체는 처음에 전기화학 반응기의 캐소드부에 한 번 넣어주면 캐소드부에서 환원되었다가 효소 반응기에서 개미산 생산 후 산화되어 다시 전기화학 반응기로 순환된다.
상기 전자전달체는 천연 전자전달체 또는 인공 전자전달체일 수 있다. 또한, 상기 전자전달체는 바이올로젠(viologen)기를 갖는 전자전달체 및 아데닌 디뉴클레오티드(adenine dinucleotide)기를 갖는 전자전달체로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나의 전자전달체일 수 있다.
구체적으로, 상기 전자전달체는 바이올로젠(viologen)기를 갖는 화합물일 수 있으며, 예를 들어, 알킬 바이올로젠(alkyl viologen), 벤질 바이올로젠(benzyl viologen), NAD(nicotinamide adeninedi nucleotide) 및 FAD(Flavin adenine dinucleotide)로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나의 전자전달체일 수 있으며, 상기 알킬 바이올로젠(alkyl viologen)은 메틸 바이올로젠(methyl viologen), 에틸 바이올로젠(ethyl viologen), 프로필 바이올로젠(propyl viologen) 등을 포함할 수 있으며, 이에 한정되는 것은 아니다.
구체적으로, 상기 전자전달체는 메틸 바이올로젠(methyl viologen), 에틸 바이올로젠(ethyl viologen), 벤질 바이올로젠(Benzyl viologen), NAD(nicotinamide adenine dinucleotide) 및 FAD(Flavin adenine dinucleotide)로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나의 전자전달체일 수 있고, 보다 구체적으로, 메틸 바이올로젠(methyl viologen) 및 에틸 바이올로젠(ethyl viologen)로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나의 전자전달체일 수 있다.
상기 이산화탄소 또는 이산화탄소를 포함하는 기체를 공급하는 장치는 본 발명의 일 실시예에 따라 캐소드부에 설치될 수 있으며, 캐소드에 이산화탄소 또는 이산화탄소를 포함하는 기체를 주입할 수 있는 장치라면 특별히 제한되지 않는다.
상기 개미산 제조 장치에서 효소 반응기는 고정화된 이산화탄소 환원 효소를 포함한다. 상기 이산화탄소 환원 효소는 포름산 탈수소효소(formate dehydrogenase)일 수 있으며, 상기 포름산 탈수소효소는 이산화탄소와 접촉하여 이산화탄소를 개미산으로 전환시킬 수 있다. 구체적으로, 포름산 탈수소효소는 하기 반응식 1의 반응을 촉매하여 개미산을 제조할 수 있다:
[반응식 1]
CO2 + 2H+ + EM(환원된 상태) -> HCOOH + EM(산화된 상태).
상기 포름산 탈수소효소는 천연으로부터 유래될 수도 있고, 당해 분야에서 널리 공지된 다양한 단백질 합성 방법으로 획득할 수 있다. 일례로서, 유전자 재조합과 단백질 발현 시스템을 이용하여 제조하거나 단백질 합성과 같은 화학적 합성을 통하여 시험관 내에서 합성하는 방법 및 무세포 단백질 합성법 등으로 제조될 수 있다. 또한, 일례로서, 상기 포름산 탈수소효소는 펩티드, 식물 유래 조직이나 세포의 추출물, 미생물(예를 들어 세균류 또는 진균류, 그리고 특히 효모)의 배양으로 얻어진 생산물일 수 있다.
용어 "단백질(Protein)"은 아마이드 결합(또는 펩티드 결합)으로 연결된 2개 이상의 아미노산으로 이루어진 폴리머를 의미한다.
용어 "발현(expression)"은 폴리펩티드(polypeptide)가 구조 유전자로부터 생산되는 과정을 지칭한다. 상기 과정은 유전자(폴리뉴클레오티드)의 mRNA로의 전사, 및 이러한 mRNA의 폴리펩티드(단백질)(들)로의 해독을 포함한다.
용어 "재조합"은 세포가 이종의 핵산을 복제하거나, 상기 핵산을 발현하거나 또는 펩티드, 이종의 펩티드 또는 이종의 핵산에 의해 코딩된 단백질을 발현하는 세포를 지칭하는 것이다. 재조합 세포는 상기 세포의 천연 형태에서는 발견되지 않는 유전자 또는 유전자 절편을, 센스 또는 안티센스 형태 중 하나로 발현할 수 있다. 또한 재조합 세포는 천연 상태의 세포에서 발견되는 유전자를 발현할 수 있으나, 상기 유전자는 변형된 것으로써 인위적인 수단에 의해 세포 내 재도입된 것이다.
상기 포름산 탈수소효소는 포름산 탈수소효소의 아미노산 서열과 각각 약 70% 이상, 약 75% 이상, 약 80% 이상, 약 85%이상, 약 90% 이상, 약 92% 이상, 약 95% 이상, 약 97% 이상, 약 98% 이상, 또는 약 99% 이상의 서열 상동성을 갖는 단백질을 포함할 수 있다.
용어 "상동성(Homology)"은 야생형 아미노산 서열과의 유사한 정도를 나타내기 위한 것으로서, 이러한 상동성의 비교는 당업계에서 널리 알려진 비교 프로그램을 이용하여 수행할 수 있으며, 2개 이상의 서열간 상동성을 백분율(%)로 계산할 수 있다.
상기 포름산 탈수소효소는 포름산 탈수소효소의 동질효소일 수 있고, 예를 들어, 상기 포름산 탈수소효소는 메틸로박테리움속(Methylobacterium sp.), 칸디다속(Candida sp.), 싸이오바실러스속(Thiobacillus sp.), 랄스토니아속(Ralstonia sp.) 및 로도박터속(Rhodobacter sp.)으로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나의 속의 미생물에서 유래할 수 있다.
구체적으로, 상기 포름산 탈수소효소는 메틸로박테리움 엑스토쿠엔스(Methylobacterium extorquens), 칸디다 보이디니(Candida boidinii), 싸이오바실러스속(Thiobacillus sp.) KNK65MA, 랄스토니아 유트로파(Ralstonia eutropha), 및 로도박터 캡슐레이터스(Rhodobacter capsulatus)로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나의 미생물에서 유래할 수 있다.
일 구체예로서, 상기 포름산 탈수소효소는 텅스텐을 함유하는 메틸로박테리움 엑스토르쿠엔스(Methylobacterium extorquens) AM1 유래 FDH1(formate dehydrogenase 1)일 수 있으며, 유전자 재조합으로 제조된 것일 수 있다. 구체적으로, 상기 메틸로박테리움 엑스토르쿠엔스 AM1은 FDH1알파(formate dehydrogenase 1 alpha subunit)를 코딩하는 내인성 유전자 및 FDH1베타(formate dehydrogenase 1 beta subunit)를 코딩하는 내인성 유전자가 결실되고, 메틸로박테리움 엑스토르쿠엔스 AM1 유래 FDH1 및 히스티딘 표지를 코딩하는 외인성 유전자가 도입된 재조합 미생물일 수 있다.
보다 구체적으로 상기 포름산 탈수소효소는 메틸로박테리움 엑스토르쿠엔스(Methylobacterium extorquens) AM1(ATCC 14718, GenBank accession No. CP001510.1) 유래 포름산 탈수소효소 I일 수 있다. 상기 메틸로박테리움 엑스토르쿠엔스 AM1 유래 포름산 탈수소효소 I은 MeFDH I 알파 subunit(GenBank accession No. ACS42636.1) 및 MeFDH I 베타 subunit(GenBank accession No. ACS42635.1)으로 이루어질 수 있고, 상기 메틸로박테리움 엑스토르쿠엔스 유래 포름산 탈수소효소 I은 fdh1A(GenBank accession, CP001510.1:5169596-5172565, Methylobacterium extorquens AM1, complete genome) 및 fdh1B(GenBank accession, CP001510.1:5167825-5169543, Methylobacterium extorquens AM1, complete genome)가 코딩하는 폴리펩티드일 수 있다.
또한, 보다 나은 화학적 안정성, 강화된 약리 특성(반감기, 흡수성, 역가, 효능 등), 변경된 특이성(예를 들어, 광범위한 생물학적 활성 스펙트럼), 감소된 항원성을 획득하기 위하여, 상기 포름산 탈수소효소의 N- 또는 C-말단에 보호기가 결합되어 있을 수 있다. 상기 보호기는 아세틸기, 플루오레닐 메톡시 카르보닐기, 포르밀기, 팔미토일기, 미리스틸기, 스테아릴기 또는 폴리에틸렌글리콜(PEG)일 수 있으나, 상기 포름산 탈수소효소의 개질, 특히 포름산 탈수소효소의 안정성을 증진시킬 수 있는 성분이라면, 제한없이 포함될 수 있다.
상기 포름산 탈수소효소는 표적화 서열, 태그(tag), 표지된 잔기를 위한 특정 목적으로 제조된 아미노산 서열을 추가적으로 포함할 수 있으며, 특별히 이에 제한되지 않는다. 구체적으로, 상기 포름산 탈수소효소는 히스티딘 표지(histidine tag)된 포름산 탈수소효소일 수 있다.
상기 효소 반응기는 고정화된 이산화탄소 환원 효소를 포함하며, 이산화탄소 환원 효소는 물리적 흡착 또는 화학적 결합에 의해 고정화할 수 있다. 고정화된 이산화탄소 환원 효소를 사용함으로써 이산화탄소 환원 효소의 재사용이 가능하여 연속 공정에 사용하기 유리하다.
구체적으로, 상기 히스티딘 표지된 포름산 탈수소효소는 Ni-NTA(nickel-nitrilotriacetic acid)에 의해 고정화된 포름산 탈수소효소일 수 있다. 히스티딘 표지된 포름산 탈수소효소는 Ni-NTA에 고정화된 경우, 고정화되지 않은 히스티딘 표지된 포름산 탈수소효소에 비해 장기간 동안 효율이 떨어지지 않고 개미산 제조가 가능하며, 재사용이 가능할 뿐만 아니라, 용존 산소 농도에 따라 활성 감소가 적을 수 있다.
상기 Ni-NTA는 Ni-NTA(nickel-nitrilotriacetic acid)로서, Ni-NTA를 포함한다면 제한되지 않으나, 예를 들어, Ni-NTA resin(수지), Ni-NTA affinity resin, Ni-NTA column(컬럼), Ni-NTA affinity column, Ni-NTA agarose, Ni-NTA bead, Ni-NTA 아가로즈 비드, Ni-NTA magnetic bead 등일 수 있고, 구체적으로, 상기 Ni-NTA는 Ni-NTA 아가로즈 비드일 수 있다.
본 발명의 일 구체예에서는 텅스텐을 포함하는 메틸로박테리움 엑스토르쿠엔스 AM1 유래 포름산 탈수소효소가 히스티딘 표지를 가지도록 재조합 효소를 생산하고 이를 Ni-NTA 아가로즈 비드에 고정화시켜 분리와 동시에 효소 촉매로 손쉽게 준비할 수 있도록 한다. 예컨대, FDH1 alpha 서브유닛 C-말단에 히스티딘 표지를 부가적으로 코딩하고 FDH1 beta 서브유닛을 코딩하는 외인성 유전자가 도입된 플라스미드를 이용하여 텅스텐을 포함하는 재조합 FDH1을 제조하고, 이렇게 제조된 FDH1 효소는 Ni-NTA 아가로즈 비드를 이용하여 FDH1-His tag와의 친화도를 바탕으로 손쉽게 Ni-NTA 아가로즈 비드에 고정화한다. 이렇게 고정화된 효소를 이용하여 전기화학 반응기에서 장기간 운전을 통하여 고농도의 개미산을 생산하고 동시에 연속적인 재사용이 가능하게 한다.
상기 개미산을 제조하는 장치에서, 이산화탄소를 용해시키고 전자전달체를 환원시키는 캐소드부를 포함하는 전기화학 반응기와, 이산화탄소를 개미산으로 전환하는 반응이 진행되는 효소 반응기는 서로 독립적으로 분리하여 설치될 수 있다. 이전에는 전기화학 반응기에 이산화탄소 환원 효소를 직접 추가하였는데, 전극은 면적이 제한되므로 개미산 생산 스케일을 키우는데 제약이 있었다. 본 발명에 따라 전기화학 반응기와 이산화탄소를 개미산으로 전환하는 효소 반응기를 분리하여 설치하는 경우, 전극 면적에 제한을 받지 않으므로 개미산 생산 규모를 키우는데 문제가 없어 개미산을 대량 생산하기에 유리할 수 있다.
상기 개미산 제조 장치는 전기화학 반응기의 캐소드부에 용해된 이산화탄소와 환원된 전자전달체를 효소 반응기로 전달하거나, 효소 반응기에서 생산된 개미산과 산화된 전자전달체를 전기화학 반응기로 전달하기 위한 펌프를 포함한다.
상기 펌프는 이산화탄소 및 환원된 전자전달체를 포함하는 수용액을 전기화학 반응기의 캐소드부에서 효소 반응기로 전달하거나, 효소 반응기에서 생산된 개미산과 산화된 전자전달체를 포함하는 수용액을 전기화학 반응기로 전달하는 등 액체를 이송 위한 수단으로, 이러한 기능을 수행할 수 있는 장치라면 특별히 제한되지 않는다. 구체적으로 펌프는 액체 이송용 펌프로서, 예컨대 일정량의 물질을 전달할 수 있는 정량 펌프(peristatic pump)를 사용할 수 있다. 상기 정량 펌프는 일정량의 환원된 전자전달체와 용해된 이산화탄소를 캐소드부에서 효소 반응기로 공급하게 된다.
한편, 상기 개미산 제조 장치는 이온 교환수지탑을 추가로 포함할 수 있다. 구체적으로, 개미산은 전해질에서 음전하를 갖기 때문에, 음이온 교환수지를 이용하여 개미산을 선택적으로 흡착할 수 있다.
상기 이온 교환수지탑은 효소 반응기와 전기화학 반응기 사이에 위치할 수 있다. 이렇게 되면, 고정화된 이산화탄소 환원 효소에 의해 이산화탄소로부터 생산된 개미산 및 산화된 전자전달체를 포함하는 수용액을 음이온 교환수지가 충진된 충진탑에 주입함으로써 개미산을 음이온 교환수지에 부착시키고 부착되지 않은 산화 상태의 전자전달체가 포함된 수용액은 전기화학 반응기의 캐소드부로 보내지게 된다.
상기와 같이 이온 교환수지탑을 추가로 포함하는 경우, 생산된 개미산이 연속적으로 이온 교환수지탑에 의하여 회수되므로 생산된 개미산에 의하여 유발되는 생산물 저해 현상을 막을 수 있어 개미산을 계속 연속적으로 생산할 수 있다. 또한, 생산된 개미산에 의하여 해리되어 생산된 수소 이온 농도와 이온 교환수지탑에 의하여 회수될 때 해리된 수산화 이온 농도가 일치하여 별도의 pH를 조절할 필요가 없게 된다.
본 발명의 다른 양상에서,
(1) 전기화학 반응기의 캐소드부에서 전자전달체를 환원시키고 이산화탄소를 용해시키는 단계로서, 상기 전자전달체는 캐소드부에 포함되어 있고, 상기 이산화탄소는 이산화탄소 또는 이산화탄소를 포함하는 기체를 공급하는 장치로부터 제공되는 단계;
(2) 상기 캐소드부에서 환원된 전자전달체와 용해된 이산화탄소를, 고정화된 이산화탄소 환원 효소를 포함하는 효소 반응기로 전달하는 단계; 및
(3) 상기 효소 반응기에서 이산화탄소 환원 효소에 의해 이산화탄소를 환원시켜 개미산을 생산하는 단계를 포함하는, 개미산의 제조 방법을 제공한다.
단계 (1)은 개미산 제조 효율을 증가시키기 위하여 전기화학 반응기의 캐소드부에서 전자전달체를 환원시키고, 이산화탄소를 용해시키는 단계이다. 이때, 상기 전자전달체는 캐소드부에 포함되어 있고, 상기 이산화탄소는 이산화탄소 또는 이산화탄소를 포함하는 기체를 공급하는 장치로부터 제공된다.
상기 전자전달체는 바이올로젠(viologen)기를 가지는 전자전달체 및 아데닌 디뉴클레오티드(adenine dinucleotide)기를 가지는 전자전달체로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나의 전자전달체일 수 있고, 상기 “전자전달체”는 전술한 범위 내일 수 있다. 예컨대, 상기 전자전달체는 바이올로젠(viologen)기를 갖는 화합물일 수 있다.
상기 이산화탄소는 이산화탄소 또는 이산화탄소를 포함하는 기체를 공급하는 장치로부터 제공될 수 있으며, 상기 장치는 전술한 범위 내일 수 있다.
상기 효소 반응기는 이산화탄소를 개미산으로 전환하는데 필요한, 고정화된 이산화탄소 환원 효소를 포함하고 있다. 상기 이산화탄소 환원 효소는 포름산 탈수소효소일 수 있으며, 일 구체예에서, 상기 포름산 탈수소효소는 텅스텐을 함유하는 메틸로박테리움 엑스토르쿠엔스 AM1 유래 FDH1일 수 있다. 상기 포름산 탈수소효소는 히스티딘 표지된 포름산 탈수소효소일 수 있거나/있고 Ni-NTA(Nickel-Nitrilotriacetic Acid)에 고정화될 수 있다.
상기 “포름산 탈수소효소”, “히스티딘 표지”, “Ni-NTA” 등은 전술한 범위 내일 수 있다.
단계 (2)는 상기 캐소드부에서 환원된 전자전달체와 용해된 이산화탄소를 효소 반응기로 전달하는 단계이며, 단계 (3)는 상기 효소 반응기에서 이산화탄소 환원 효소에 의해 이산화탄소를 환원시켜 개미산을 생산하는 단계이다.
본 발명에 따른 상기 개미산의 제조 방법은 (4) 개미산 생산 반응으로 인해 산화된 전자전달체를 상기 효소 반응기에서 상기 전기화학 반응기의 캐소드부로 전달하는 단계를 추가로 포함하며, 상기 단계 (1) 내지 (4)는 반복적으로 수행될 수 있다. 상기 단계 (4)는 단계 (3)에서 산화된 전자전달체를 캐소드부로 전달하는 단계이다. 본 발명에 따른 상기 개미산의 제조 방법은 상기 단계 (1) 내지 (4)를 반복적으로 수행함으로써 개미산을 연속적으로 생산할 수 있다.
상기 단계 (2) 및 단계 (4)에서 이산화탄소, 전자전달체, 생성된 개미산 등의 전달은 펌프에 의해 수행될 수 있으며, 상기 “펌프”는 전술한 바와 같다.
본 발명에 따른 개미산 제조 방법에서 상기 단계 (1)과 단계 (3)이 서로 독립적으로 분리되어 수행된다. 이와 같이 전기화학 반응과 이산화탄소를 개미산으로 전환하는 효소 반응을 분리하여 수행하는 경우, 전기화학 반응기의 전극 면적에 제한을 받지 않으므로 개미산 생산 규모를 키우는데 문제가 없어 개미산을 대량 생산하는 것이 가능하게 된다.
또한, 본 발명에 따른 개미산의 제조 방법은 상기 단계 (3) 이후 단계 (4) 전에, 생성된 개미산을 이온 교환수지탑에 흡착시켜 회수하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 구체적으로, 개미산은 전해질에서 음전하를 갖기 때문에, 음이온 교환수지탑에 개미산을 흡착시켜 회수할 수 있다. 따라서, 효소 반응기에서 이산화탄소 환원 효소에 의해 이산화탄소를 환원시켜 제조된 개미산이 음이온 교환수지탑에서 흡착에 의해 제거되므로, 개미산으로 인한 생산물 저해 현상이 생기지 않을 수 있다. 또한, 생산된 개미산에서 해리되는 수소 이온이 음이온 교환수지탑에서 해리되는 수산화 이온에 의해 중화되어 별도로 pH를 조절할 필요가 없게 되는 효과가 있어, 개미산을 장시간 연속적으로 제조하는 것이 가능하다.
일 구체예에서, (a) Ni-NTA 아가로즈 비드에 고정화된 텅스텐을 포함하는 재조합 FDH1를 효소 반응기에 충진하고, (b) 전기화학 반응기의 캐소드부에 이산화탄소를 주입하여 수중에 용해시키는 한편, 캐소드부에 용해된 전자전달체(예: 에틸 바이올로젠)을 환원시키고, (c) 액체 이송용 펌프(예: 정량 펌프)로 캐소드부의 이산화탄소와 전자전달체가 포함된 수용액을 효소 반응기에 공급하고, (d) 효소 반응기 내에서 고정화된 포름산 탈수소효소에 의하여 이산화탄소와 환원된 전자전달체를 소모하여 개미산을 생산하고, (e) 생산된 개미산 및 산화된 전자전달체를 포함한 수용액은 액체 이송용 펌프로 음이온 교환수지가 충진된 충진탑에 주입하여 개미산을 음이온 교환수지에 부착시키고 (f) 부착되지 않은 산화 상태의 전자전달체가 포함된 수용액은 전기화학 반응기의 캐소드부로 다시 주입된다.
이와 같이, 본 발명에 따라 전기화학 반응기의 캐소드부에서 이산화탄소를 용해시키면서 동시에 전자전달체를 환원시켜서 연속적으로 효소 반응기에 공급함과 동시에 효소 반응기에서 생산된 개미산을 이온 교환수지를 이용하여 연속적으로 분리하는 것에 의해 전기화학 반응기에서의 생산성을 증가시킬 수 있다.
상기 제조 방법은 하나의 예시로서 제시된 본 발명의 일 실시예에 한정되는 것은 아니며, 모순되지 않는 한 상기 개미산 제조 장치에 대한 설명이 적용될 수 있다.
이하, 본 발명을 제조예 및 실시예를 통해 상세히 설명한다.
단, 후술하는 제조예 및 실시예는 본 발명을 일 측면에서 구체적으로 예시하는 것일 뿐, 본 발명이 이에 한정되는 것은 아니다.
<제조예> FDH1-His tag 재조합 효소의 제조
pCM110의 메탄올-유도성 발현을 적용하여 재조합 MeFDH1의 발현 시간 및 수준을 제어하였다. MeFDH1알파/베타암호화 유전자(GenBank 수탁 번호 ACS42636.1(fdh1a), ACS42635.1(fdh1b))는 알파 서브유닛의 C-말단에 His6 태그로 증폭되었다. PCR 산물은 멀티클로닝 사이트(Spe1 및 Kpn1)를 통해 pCM110에 삽입되었다. 모든 플라스미드 및 돌연변이 균주는 하기 표 1에 설명되어 있다.
하기 표 1은 박테리아 균주 및 녹-아웃 또는 재조합 발현을 위한 플라스미드를 나타낸 것이다.
균주/플라스미드 관련 특성
균주
M. 엑스토르쿠엔스 AM1 리파마이신(Rifamycin) 저항, 야생형
M. 엑스토르쿠엔스 AM1 (Δ fdh1알파) Δ fdh1알파 M. 엑스토르쿠엔스 AM1
M. 엑스토르쿠엔스 AM1 (Δ fdh1알파/베타) Δ fdh1알파/베타 M. 엑스토르쿠엔스 AM1
플라스미드
pCM184 대립 유전자 교환 벡터 (AmpR, TetR, KanR)
pCM184-Δ fdh1알파 pCM184 for fdh1알파 녹-아웃
pCM184-Δ fdh1베타 pCM184 for fdh1베타녹-아웃
pCM157 Cre 재조합효소 발현 벡터 (TetR)
pCM110 재조합 발현 벡터 (TetR), P mxaF 프로모터
pCM110-MeFDH1-His 알파 서브유닛의 C-말단 His 태그를 포함하는 MeFDH1 상동 발현 벡터
세포 배양을 위해 pCM110-MeFDH1-His를 함유하는 녹아웃 돌연변이체(MeAM1(Δ를 광학 밀도(OD600)가 0.5 내지 0.8에 도달할 때까지 30℃에서 20시간 동안 성장시킨 다음 메탄올을 최종 첨가하였다. 0.5%의 농도로 재조합 발현을 유도하였다. 배양 48시간 후에 배양된 세포를 수확하고 원심분리(7000rpm, 4℃, 15분)에 의해 얻은 세포 펠릿의 분취량을 사용할 때까지 -70℃에서 보관했다. 상기 미생물들의 기본적인 배양 배지는 탄소공급원으로 16 g/L 숙신산 및 최소염 배지(minimal salt medium) (1.62 g/L NH4Cl, 0.2 g/L MgSO4, 2.21 g/L K2HPO4, 및 1.25 g/L NaH2PO4·2H2O)를 포함한다. 재조합 미생물을 선별하기 위한 선택적 항생제로는 50 ㎍/mL 리파미신 (Rif), 50 ㎍/mL 카나미신 (Kan), 또는 10 ㎍/mL 테트라시클린 (Tet)을 사용하였다. 상기 미생물들은 모두 1 L 에를렌마이어 쉐이크 플라스크 중에 200 mL의 부피로 하여 26℃, 200 rpm에서 배양하였다. 세포 농도가 OD600 기준으로 0.5에서 0.8이 될 때 0.5% 메탄올을 첨가하여 목표로 하는 FDH1-his tag 효소를 발현하였다. 세포는 총 48시간을 배양하였으며, 7,000 rpm에서 15분간 원심 분리하여 배양된 세포를 획득하였다. 이후 이를 세포 파쇄기를 이용하여 분쇄한 후 4,611 g 30분간 원심 분리하여 상등액을 회수한 후 이를 Ni-NTA 아가로즈 비드 (Bio-Rad, Cat No. 7321010)을 이용하여 FDH1-his tag만을 선택적으로 고정화시켰다.
도 1에 Ni-NTA 아가로즈 비드에 고정화된 효소의 구조를 나타내었다.
<실시예 1> 순환형 전기화학 반응기 제작 및 실험
산업에 적용하기 위하여 전기화학 반응기에 순환 시스템을 적용하고 각 반응 요소들을 모듈화하여 연속 공정을 가능하게 하였다. 순환 시스템은 정량 펌프를 이용하여 캐소드의 전해질에서 환원된 에틸 바이올로겐(EV)와 포화 용해된 이산화탄소를 효소 반응기로 전달하고, 전자를 전달한 산화 EV와 개미산은 다시 캐소드 전해질로 전달되어 EV는 전자를 얻고 이산화탄소가 용해되어 고정화 효소에 공급된다. 도 2에 순환 시스템을 이용한 전기화학 반응기 모식도를 나타내었다.
상기 순환형 전기화학 반응기를 이용하여 개미산을 생산하였으며, 그 결과를 도 3a 및 도 3b에 나타내었다. 순환형 전기화학 반응기는 500시간 동안 1.74 M의 개미산을 생산하였으며, 패러데이 효율이 100.3%로서 모든 공급된 전자가 개미산을 만드는데 이용되는 것을 확인하였다. 그러나 이 실험에서 500시간 이후에 개미산의 농도가 더 이상 늘어나지 않았다. 이는 두 가지 원인으로 1) 경쟁적 생산물 저해 기작과 2) 효소의 장기간 반응에 따른 비활성화를 유추할 수 있다. 이에 따라, 500시간 반응 후 개미산이 없는 새로운 전해질로 교체하며 재반응을 진행하였다. 그 결과, 1.74 M에서 더 이상 늘지 않았던 개미산이 교체된 후에 생산성이 회복되는 것을 확인하였다. 이로부터 장기간 반응 시에 개미산의 생산성이 감소하는 주된 원인이 생산물에 의한 경쟁적인 저해 현상임을 확인하였다.
<실시예 2> 이온 교환수지탑을 이용한 개미산의 실시간 분리 실험
상기 실시예 1에서 확인한 개미산 생산성 감소의 주된 원인에 따라, 순환형 전기화학 반응기에서 생성된 개미산의 실시간 분리 공정이 추가로 요구되었다. 개미산은 전해질에서 음전하를 갖기 때문에, 음이온 교환수지를 이용하는 경우 개미산의 선택적인 흡착이 예상되었다.
이에 따라 순환 시의 개미산 흡착 관련 실험을 진행하였으며, 모식도 및 조건을 도 4에 나타내었다. 음이온 교환수지를 이용하여 개미산을 분리하는 경우 배출된 시료의 개미산 농도 및 pH 변화를 측정한 결과를 도 5에 나타내었다. 전기화학적 개미산 생산 실험에서 총 68 mmol의 개미산이 생산되었으며, 이와 대비하여 45 g의 음이온 교환수지(Ambersep 900)는 총 70 mmol의 개미산을 흡착하였다. 이로부터 충진된 음이온 교환수지탑이 생산되는 개미산을 모두 흡착할 수 있을 것으로 추측되었다.
하기 표 2는 전기화학 반응기의 개미산 생산량과 음이온 교환수지의 개미산 흡착량을 비교한 것이다.
전기화학적 개미산 생산 음이온 교환수지탑
부피 (mL) 40 70
개미산 농도 (M) 1.7 1
생성 또는 흡착된 개미산 몰 수 (mmol) 68 70
<실시예 3> 이온 교환수지탑을 이용한 연속적인 개미산 회수 및 생산성 향상 성능 평가
순환형 전기화학 반응기에서 고정화 효소 뒤로 음이온 교환수지탑을 장착하였다. 이와 더불어 고정화 효소 입구와 출구에 순환용 큐벳을 장착하여 실시간으로 환원된 EV의 농도를 측정하였다. 도 6은 음이온 교환수지를 이용한 순환형 전기화학적 CO2 환원반응 시스템의 모식도이다.
음이온 교환수지탑 장착 유무에 따른 전류의 변화를 도 7에 나타내었다. 도 7에 따르면, 음이온 교환수지탑을 장착하지 않은 기존의 순환형 전기화학 반응기에서 전류가 감소하는 추세를 나타내었던 것과는 달리, 이온 교환수지탑을 장착하였을 때 전류가 400 시간 동안 유지되었다.
또한, 음이온 교환수지탑을 장착한 경우 고정화된 효소의 입구와 출구에서의 환원된 EV의 농도를 도 8에 나타내었다. 환원된 EV의 농도는 음이온 교환수지탑을 장착하였을 때 4 내지 6 mM로 유지되는 것을 확인할 수 있었으나, EV의 농도가 10 mM보다 낮게 유지되고 낮은 전류로 보아 소량의 EV가 음이온 교환수지에 흡착되는 것으로 추정되었다.
도 9는 전해질에서의 개미산 농도 및 전류에 의하여 예상되는 개미산 농도를 비교한 그래프이다. 전류 데이터에서 예상되는 개미산 농도 대비 전해질에서 낮은 개미산 농도가 유지되며, 이 차이만큼 음이온 교환수지탑에 개미산이 흡착되는 것으로 추정되었다.
음이온 교환수지탑을 이용한 전기화학적 개미산 생산 실험 후, 음이온 교환수지탑의 컬럼을 따로 분리하여 개미산 탈착 실험을 진행하였다. 이에 따라 1 M의 NaOH를 이용하였을 때 개미산이 탈착됨을 확인하였다. 전해질에서의 개미산 농도와 수지에서 탈착된 개미산의 총 몰 수는 107.2 mmol로 측정되었으며, 전류에서 예상되는 개미산의 몰수는 107.7 mmol로 최종 99.5%의 패러데이 효율을 갖는 반응 시스템을 확보하였다.
음이온 교환수지탑의 컬럼에서 흡착 분리된 개미산의 농도를 도 10으로 나타내었다.
하기 표 3은 전기화학 반응기에서의 개미산 생산량과 페러데이 효율을 나타낸 것이다.
총 개미산 생산 및 페러데이 효율
음이온 교환수지의 개미산 흡착량 (mmol) 72.6
전해질의 개미산 잔존량 (mmol) 34.6
총 개미산 생산량 (mmol) 107.2
전자 공급량에 따른 예상 개미산 생산량 (mmol, 100% 전환 기준) 107.7
패러데이 효율 (%) 99.5

Claims (22)

  1. (i) 캐소드(cathode)부 및 애노드(anode)부를 포함하며, 캐소드 및 애노드는 전기적으로 전원(electrical power source)에 연결되어 있는 전기화학 반응기로서, 상기 캐소드부는 전자전달체를 포함하며, 이산화탄소 또는 이산화탄소를 포함하는 기체를 공급하는 장치가 상기 캐소드부에 구비되어 있는, 전기화학 반응기;
    (ii) 고정화된 이산화탄소 환원 효소를 포함하는 효소 반응기; 및
    (iii) 상기 캐소드부에 용해된 이산화탄소와 환원된 전자전달체를 상기 효소 반응기로 전달하거나, 효소 반응기에서 생산된 개미산과 산화된 전자전달체를 전기화학 반응기로 전달하기 위한 펌프
    를 포함하는, 개미산 제조 장치.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 전자전달체는 바이올로젠(viologen)기를 갖는 화합물인, 개미산 제조 장치.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    상기 이산화탄소 환원 효소는 포름산 탈수소효소(formate dehydrogenase)인, 개미산 제조 장치.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 포름산 탈수소효소는 메틸로박테리움 엑스토르쿠엔스(Methylobacterium extorquens) AM1 유래 FDH1(formate dehydrogenase 1)인, 개미산 제조 장치.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 포름산 탈수소효소는 히스티딘 표지된 포름산 탈수소효소인, 개미산 제조 장치.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 포름산 탈수소효소는 Ni-NTA(nickel-nitrilotriacetic acid)에 고정화된 것인, 개미산 제조 장치.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 펌프는 정량 펌프(peristatic pump)인, 개미산 제조 장치.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 전기화학 반응기와 효소 반응기는 서로 독립적으로 분리되어 있는, 개미산 제조 장치.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서,
    이온 교환수지탑을 추가로 포함하는, 개미산 제조 장치.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 이온 교환수지탑은 음이온 교환수지탑인, 개미산 제조 장치.
  11. (1) 전기화학 반응기의 캐소드부에서 전자전달체를 환원시키고 이산화탄소를 용해시키는 단계로서, 상기 전자전달체는 캐소드부에 포함되어 있고, 상기 이산화탄소는 이산화탄소 또는 이산화탄소를 포함하는 기체를 공급하는 장치로부터 제공되는 단계;
    (2) 상기 캐소드부에서 환원된 전자전달체와 용해된 이산화탄소를, 고정화된 이산화탄소 환원 효소를 포함하는 효소 반응기로 전달하는 단계; 및
    (3) 상기 효소 반응기에서 이산화탄소 환원 효소에 의해 이산화탄소를 환원시켜 개미산을 생산하는 단계
    를 포함하는, 개미산의 제조 방법.
  12. 제11항에 있어서,
    (4) 개미산 생산 반응으로 인해 산화된 전자전달체를 상기 효소 반응기에서 상기 전기화학 반응기의 캐소드부로 전달하는 단계를 추가로 포함하며,
    상기 단계 (1) 내지 (4)가 반복적으로 수행되는, 개미산의 제조 방법.
  13. 제11항 또는 제12항에 있어서,
    상기 단계 (1)에서 전자전달체는 바이올로젠기를 갖는 화합물인, 개미산의 제조 방법.
  14. 제11항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 단계 (2)에서 이산화탄소 환원 효소는 포름산 탈수소효소인, 개미산의 제조 방법.
  15. 제11항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 포름산 탈수소효소는 메틸로박테리움 엑스토르쿠엔스 AM1 유래 FDH1인, 개미산의 제조 방법.
  16. 제11항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 포름산 탈수소효소는 히스티딘 표지된 포름산 탈수소효소인, 개미산의 제조 방법.
  17. 제11항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 포름산 탈수소효소는 Ni-NTA에 고정화된 것인, 개미산의 제조 방법.
  18. 제11항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 단계 (1)과 단계 (3)이 서로 독립적으로 분리되어 수행되는, 개미산 제조 방법.
  19. 제11항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 단계 (2), 또는 단계 (2) 및 단계 (4)가 펌프에 의해 수행되는, 개미산의 제조 방법.
  20. 제11항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 단계 (3) 이후 단계 (4) 전에, 생성된 개미산을 이온 교환수지탑에 흡착시켜 회수하는 단계를 추가로 포함하는, 개미산의 제조 방법.
  21. 제11항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 이온 교환수지탑이 음이온 교환수지탑인, 개미산의 제조 방법.
  22. 제11항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서,
    별도로 pH를 조절할 필요없이 장시간 연속적으로 개미산을 제조할 수 있는, 개미산의 제조 방법.
PCT/KR2022/015180 2022-08-30 2022-10-07 고정화된 이산화탄소 환원 효소를 이용한 연속적인 개미산 제조 장치 및 방법 Ceased WO2024048837A1 (ko)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020220109359A KR102844343B1 (ko) 2022-08-30 2022-08-30 고정화된 이산화탄소 환원 효소를 이용한 연속적인 개미산 제조 장치 및 방법
KR10-2022-0109359 2022-08-30

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2024048837A1 true WO2024048837A1 (ko) 2024-03-07

Family

ID=90098069

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/KR2022/015180 Ceased WO2024048837A1 (ko) 2022-08-30 2022-10-07 고정화된 이산화탄소 환원 효소를 이용한 연속적인 개미산 제조 장치 및 방법

Country Status (2)

Country Link
KR (1) KR102844343B1 (ko)
WO (1) WO2024048837A1 (ko)

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20110315560A1 (en) * 2008-12-18 2011-12-29 The University Of Queensland Process for the production of chemicals
KR20160033411A (ko) * 2014-09-18 2016-03-28 광운대학교 산학협력단 메탄올 자화균을 이용하여 이산화탄소로부터 개미산을 합성하는 방법

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB202009513D0 (en) * 2020-06-22 2020-08-05 Univ Of Stellenbosch An enzyme-polymer matrix

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20110315560A1 (en) * 2008-12-18 2011-12-29 The University Of Queensland Process for the production of chemicals
KR20160033411A (ko) * 2014-09-18 2016-03-28 광운대학교 산학협력단 메탄올 자화균을 이용하여 이산화탄소로부터 개미산을 합성하는 방법

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
" KOREA CCS 2020 - Final Report of KOREA CCS 2020 Program", 8 October 2020, KOREA INSTITUTE OF SCIENCE AND TECHNOLOGY, Korea, article "Technology Development of Formic Acid Production by CO2 Hydrogenation.", pages: 1 - 136, XP009554993 *
BACCOUR MOHAMED, LAMOTTE ALEXANDRA, SAKAI KENTO, DUBREUCQ ERIC, MEHDI AHMAD, KANO KENJI, GALARNEAU ANNE, DRONE JULLIEN, BRUN NICOL: "Production of formate from CO 2 gas under ambient conditions: towards flow-through enzyme reactors", GREEN CHEMISTRY, ROYAL SOCIETY OF CHEMISTRY, GB, vol. 22, no. 12, 22 June 2020 (2020-06-22), GB , pages 3727 - 3733, XP093145725, ISSN: 1463-9262, DOI: 10.1039/D0GC00952K *
HERNÁNDEZ-IBÁÑEZ NAIARA; GOMIS-BERENGUER ALICIA; MONTIEL VICENTE; ANIA CONCHI O.; INIESTA JESÚS: "Fabrication of a biocathode for formic acid production upon the immobilization of formate dehydrogenase from Candida boidinii on a nanoporous carbon", CHEMOSPHERE, PERGAMON PRESS, OXFORD., GB, vol. 291, 30 November 2021 (2021-11-30), GB , XP086944804, ISSN: 0045-6535, DOI: 10.1016/j.chemosphere.2021.133117 *

Also Published As

Publication number Publication date
KR102844343B1 (ko) 2025-08-08
KR20240030388A (ko) 2024-03-07

Similar Documents

Publication Publication Date Title
KR101976691B1 (ko) 재조합 미생물 및 이를 이용한 개미산 제조 방법
WO2022220325A1 (ko) 유전자 재조합 포름산 탈수소효소 또는 고정화된 유전자 재조합 포름산 탈수소효소 및 그들을 이용한 개미산의 제조 방법
US20100041121A1 (en) Metabolically engineered organisms for the production of hydrogen and hydrogenase
KR100812442B1 (ko) Ｎａｄ(ｐ)ｈ의 간접 전기화학적 재생을 포함하는 방법
CN118086236B (zh) 一种甲酸脱氢酶突变体、其固定化酶及其在电酶催化co2中的应用
KR101655939B1 (ko) 메탄올 자화균을 이용하여 이산화탄소로부터 개미산을 합성하는 방법
CN111471736B (zh) 制备c1,2-位脱氢甾体化合物的方法
CN107287144B (zh) 一种代谢改造的枯草芽孢杆菌生物转化细胞及其制备方法与应用
CN119842644B (zh) 一种电子传递速率提高的甲酸脱氢酶突变体及应用
KR102844343B1 (ko) 고정화된 이산화탄소 환원 효소를 이용한 연속적인 개미산 제조 장치 및 방법
WO2022098162A1 (ko) 3-하이드록시프로피온산의 생산 방법
KR102642882B1 (ko) 아세토인 생성능이 증진된 재조합 미생물 및 이를 이용한 아세토인의 제조방법
CN121065227A (zh) 一种表达非特异性过氧合酶CciUPO的毕赤酵母重组菌株及其应用
WO2021112641A1 (ko) 중쇄 디올을 생산하는 재조합 균주 및 이를 이용한 중쇄 디올의 생산방법
CN118028392A (zh) 一种多酶级联合成去甲肾上腺素的方法
WO2015046978A1 (ko) 2,3-부탄디올의 생성능이 증강된 재조합 미생물 및 이를 이용한 2,3-부탄디올의 생산 방법
Wu et al. Enhanced photo-fermentative hydrogen production from different organic substrate using hupL inactivated Rhodopseudomonas palustris
CN106047754A (zh) 一种提高拜氏梭菌产电的方法及其应用
KR102703242B1 (ko) 캘빈회로 유전자가 도입된 대장균의 이산화탄소 고정 능력 향상을 위한 배양 방법
WO2020107783A1 (zh) 一种多酶耦合制备(s)-1，2，3，4-四氢异喹啉-3-甲酸的方法
CN116004683B (zh) 氢化酶的表达载体组合、重组菌、酶组合物及其应用
KR101397483B1 (ko) 에탄올 생산용 재조합 균주를 이용한 알코올 생산방법
KR20180068819A (ko) 클로스트리디움 아세토부티리쿰 ATCC 824 유래 FeFe-수소화효소 유전자를 포함하는 셔틀벡터
WO2024215179A1 (ko) 이산화탄소 고정화 균주 및 이를 사용한 대사산물의 생산방법
CN101633690A (zh) 一种产氢相关蛋白及其编码基因与应用

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 22957515

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

122 Ep: pct application non-entry in european phase

Ref document number: 22957515

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1