WO2024043404A1 - 표적물질 신호 검출 위한 이미지 획득 장치 및 획득방법 - Google Patents

표적물질 신호 검출 위한 이미지 획득 장치 및 획득방법 Download PDF

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WO2024043404A1
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excitation light
acquisition device
image acquisition
camera
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정용균
문대경
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주식회사 이지다이아텍
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Definitions

  • the present invention relates to an image acquisition device and acquisition method for detecting target material signals, and more specifically, to an image acquisition device and acquisition method for detecting target material signals with improved sensitivity and uniformity compared to existing fluorescence microscopes used to acquire fluorescence images. It's about method.
  • a fluorescence microscope In the case of this immunological analysis method, a fluorescence microscope is used in most cases because the luminescence of a fluorescent substance is used to determine whether a pathogen is present.
  • a device In the case of a commonly used fluorescence microscope, a device is required to separate and observe the optical path supplying the excitation light and the optical path of the fluorescence generated from the sample as they match. To separate these light paths, it is common to use a dichroic mirror in existing fluorescence microscopes.
  • the present invention seeks to provide an image acquisition device and acquisition method for detecting target material signals with improved sensitivity and uniformity compared to existing fluorescence microscopes used to acquire fluorescence images.
  • the present invention includes (a) a camera for detecting fluorescence signals; (b) light sources arranged in a circle and at even intervals outside the camera; (c) a shielding guide located above the light source and transmitting only vertical light among the light emitted from the light source; and (d) a prism that refracts the light passing through the shielding guide in the sample direction.
  • the shielding guide includes: a central guide portion formed at the center of the shielding guide through which the fluorescent signal generated from the sample passes; and an excitation light guide portion installed at regular intervals outside the central guide portion and allowing excitation light generated from the light source to pass through.
  • a light-absorbing coating layer may be formed inside the central guide portion or the excitation light guide portion.
  • R/L when the internal diameter of the excitation light guide is R and the length from the point of contact with the excitation light to the top is L, R/L may be 0.05 to 0.5.
  • the excitation light guide unit may have an internal diameter (R) of 2 to 5 mm and a length (L) of 10 to 50 mm.
  • the shielding guide includes 2 to 30 excitation light guide units, and the light source may be independently installed in each of the excitation light guide units.
  • an excitation light lens may be formed on an upper portion of the light source to converge excitation light generated from the light source.
  • the image acquisition device may acquire a fluorescence image at a magnification of 0.5 to 2.
  • a prism may be installed on the upper part of the shielding guide to refract the excitation light passing through the shielding guide in the direction of the sample.
  • the light source may be a light emitting diode (LED) that emits excitation light with a wavelength of 400 to 700 nm.
  • LED light emitting diode
  • the image acquisition device may have a surface uniformity of 70% or more, expressed in Equation 1 below.
  • Uniformity (min for the fluorescence signal in each pixel area divided among the entire image analysis area/max for the fluorescence signal in each pixel area divided among the entire image analysis area)
  • the image acquisition device may have sensitivity to fluorescence more than 5 times that of a conventional low-magnification fluorescence microscope.
  • the present invention also provides (i) a camera for detecting fluorescence signals and optical signals; (ii) a sample unit installed at a certain distance from the camera; (iii) a fluorescent unit that supplies excitation light from the camera direction to the sample unit; and (iv) an optical unit installed at a predetermined distance from the sample unit in the direction opposite to the camera and supplying visible light in the direction of the camera, wherein the fluorescent unit (1) forms a circle outside the camera. Evenly spaced light sources; (2) a shielding guide located above the light source and transmitting only vertical light among the light emitted from the light source; and (3) a prism that refracts the light passing through the shielding guide in the sample direction.
  • the sample may contain magnetic particles.
  • the magnetic particles may be shaped like microrods or spheres.
  • the present invention also provides an image analysis method using an image acquisition device for detecting target material signals, wherein the image acquisition device includes (i) a camera for detecting fluorescence signals and optical signals; (ii) a sample unit installed at a certain distance from the camera; (iii) a fluorescent unit that supplies excitation light from the camera direction to the sample unit; and (iv) an optical unit installed at regular intervals in the direction opposite to the camera from the sample unit and supplying visible light in the direction of the camera, 1 placing magnetic particles bound with a target material into each well of the multi-well plate. Injecting into; 2 Fixing the multi-well plate to the sample unit; 3 Obtaining an optical image by applying power to the upper optical unit; and 4 applying power to the lower fluorescent unit to obtain a fluorescence image.
  • the image acquisition device includes (i) a camera for detecting fluorescence signals and optical signals; (ii) a sample unit installed at a certain distance from the camera; (iii) a fluorescent unit that supplies excitation light from the camera direction
  • the image acquisition device for detecting target substance signals according to the present invention can improve the uniformity and sensitivity of the fluorescence signal by blocking the diffusion of excitation light when observing the fluorescence signal, and thus fluorescence images with higher resolution compared to existing fluorescence microscopes. can be obtained.
  • the image acquisition device for detecting target substance signals according to the present invention has high uniformity and sensitivity, so it is possible to acquire low-magnification fluorescence images and analyze large-area samples simultaneously.
  • Figure 1 shows the structure of an image acquisition device for detecting target material signals according to an embodiment of the present invention.
  • Figure 2 shows the internal structure of an image acquisition device for detecting target material signals according to an embodiment of the present invention.
  • Figure 3 is a schematic diagram showing the generation of an optical image and a fluorescence image in an image acquisition device for detecting target material signals according to an embodiment of the present invention.
  • Figure 4 shows the structure of a shielding guide and lens according to an embodiment of the present invention.
  • Figure 5 is a schematic diagram showing how excitation light is aligned within an excitation light guide according to an embodiment of the present invention.
  • Figure 6 shows the degree to which excitation light is concentrated according to the length of the excitation light guide according to an embodiment of the present invention.
  • Figure 7 shows the shape of a prism according to an embodiment of the present invention.
  • Figures 8 to 12 show uniformity test results according to an embodiment of the present invention.
  • Figure 13 shows the results of a resolution (resolution) experiment according to an embodiment of the present invention.
  • Figure 14 shows the results of a resolution and sensitivity experiment according to an embodiment of the present invention.
  • Figure 15 is a graph showing the results of a sensitivity test according to an embodiment of the present invention.
  • Figure 16 is a photograph showing the results of a sensitivity test according to an embodiment of the present invention.
  • each process forming the method may occur differently from the specified order unless a specific order is clearly stated in the context. That is, each process may occur in the same order as specified, may be performed substantially simultaneously, or may be performed in the opposite order.
  • 'and/or' includes a combination of a plurality of listed items or any of a plurality of listed items.
  • 'A or B' may include 'A', 'B', or 'both A and B'.
  • the present invention provides (a) a camera for detecting fluorescence signals; (b) light sources arranged in a circle and at even intervals outside the camera; (c) a shielding guide located above the light source and transmitting only vertical light among the light emitted from the light source; and (d) a prism that refracts the light passing through the shielding guide in the sample direction.
  • FIGS. 1 and 2 show the internal structure of the image acquisition device of the present invention, and Figure 2 shows it from the side.
  • the camera 100 is used to detect fluorescence generated by being excited by excitation light, and can be a commonly used optical camera.
  • fluorescent substances used in immunoassays can have an emission peak of 400 to 800 nm. That is, the fluorescence generated by being excited in the sample by the excitation light is generally in the visible light range. Therefore, in the case of the camera 100, a commonly used optical camera can be used.
  • the fluorescence generated from the sample has multiple colors
  • the camera may be equipped with three types of cameras to detect red, blue, and yellow, and in order to separate the optical path for each color, the front of the camera can selectively reflect each color.
  • a dichroic mirror may be installed. Looking at this in detail, the fluorescence generated from the sample can be detected by the first camera by separating the colors of some wavelengths using the first dichroic mirror, and the light passing through the first dichroic mirror is detected by the second dichroic mirror. Some wavelengths can be separated again through the same process in the Loic mirror. The remaining wavelengths of light can be detected by a third camera.
  • the fluorescence generated from the sample passes through two dichroic mirrors and can be separated into three depending on the wavelength and incident on each camera.
  • Each camera calculates the difference in intensity of the incident light to determine the maximum of each fluorescence.
  • the peak wavelength can be measured. Therefore, since the peak wavelength of fluorescence generated is different depending on the type of phosphor attached to each sample, it is possible to determine the type of each sample.
  • the light source 310 is installed to supply excitation light to the sample 200, and may serve to supply light to excite the phosphor contained in the sample 200.
  • excitation light In general, in fluorescence microscopes, short-wavelength lasers are often used as excitation light. However, in the case of the above laser, large equipment is required for generation or a lot of power is required. Therefore, recently, fluorescence microscopes using light-emitting diodes (LEDs) as light sources have been widely used to miniaturize the overall equipment. In the case of the light emitting diode, not only does it use a small amount of energy due to its high power conversion efficiency, but its size is very small, so it can contribute to miniaturization of equipment.
  • LEDs light-emitting diodes
  • the light emitting diode can supply light of a wavelength that can excite the phosphor contained in the sample 200. Specifically, it is desirable to generate excitation light with a wavelength of 400 to 700 nm.
  • the light-emitting diode may be used as a light-emitting diode that generates short-wavelength light, but a light-emitting diode capable of emitting light of 400 to 700 nm in a continuous spectrum can be used, but the desired excitation light filter is used according to each phosphor. Excitation light of any wavelength may be formed.
  • light emitting diodes generally generate monochromatic light.
  • light emitting diodes emit red, green, or blue light, and some diodes can also emit ultraviolet rays.
  • a light emitting diode that emits ultraviolet rays is used, and a light emitting diode capable of forming the entire wavelength of visible light can be used by installing a light emitting lens containing a phosphor excited by infrared rays on the top of the light emitting body. .
  • the light-emitting semiconductor in the light-emitting diode can generate infrared rays, but the phosphor included in the light-emitting lens is excited by this infrared ray and emits light, making it possible to form light of a desired spectrum.
  • the light emitting diode may be supplied with a voltage of 1 to 5 V and a current of 100 to 500 mA, and the light amount may be adjusted to 20 to 200 lm. It is known that the amount of light is proportional to the supplied voltage and current, and in the case of general light emitting diodes, it is known that light is generated by supplying voltage and current below a certain level. When voltage and current within the above range are supplied, heat generation can be minimized and lifespan can be extended while maintaining an appropriate amount of light. However, if it is below the above range, the amount of light may be reduced and it may be difficult to use it as excitation light, and if it is above the above range, heat generation may become severe and lifespan may be reduced.
  • the light source 310 may include an excitation filter that transmits a wavelength of 466 nm to 526 nm with a bandwidth of 60 (see FIG. 3). As seen above, the light source can generate light with a wavelength of 400 to 700 nm. However, commonly used excitation light has a peak wavelength of 466 nm to 526 nm. If excitation light of a wavelength other than this excitation light is supplied, it may be reflected from the sample and observed as a false positive. Therefore, by using the excitation filter, it is possible to block wavelengths other than the excitation light.
  • the light source 310 may include a heat dissipation unit for discharging heat generated from the light source.
  • this heat dissipation part it can serve to discharge heat from the light source, and a heat dissipation fin placed around the light source can simply be used, or heat generated from the light source can be moved to another part and processed using a heat dissipation part. It may be possible. Looking at this in detail, one end of a heat pipe containing heat inside may be installed in the heating part of the light source, and a heat dissipating fin or a cooling part may be installed at the other end of the heat pipe. Through this, the heat generated by the light source can be transferred to the heat dissipation fin or cooling unit through the heat pipe and processed.
  • heat generated from the light source is not quickly discharged to the outside, not only may there be thermal damage to the light source unit, but heat may be transferred to the generated excitation light, resulting in a haze. Therefore, by installing the heat dissipation unit as described above, heat generated from the light source can be quickly discharged.
  • the light source 310 may be arranged in a circular shape outside the camera 100 (see FIG. 3).
  • excitation light generated from a light source travels in a straight line, so if the light source is placed only on one side of the camera, shading may occur depending on the direction.
  • it has the disadvantage that the intensity of fluorescence generated as the amount of light increases only in the direction in which the light source is placed is not constant (asymmetry). Therefore, in the case of the present invention, in order to resolve the asymmetry of the excitation light, a plurality of light sources are installed, and the asymmetric supply of the excitation light can be minimized by arranging them in a circular shape outside the camera.
  • a method was used to install a powerful light source at the bottom of the camera, then refract the light generated from the light source and supply it to the surroundings of the camera.
  • this case has the disadvantage that the camera may malfunction due to the heat from the strong light source, and the fluorescent image supplied to the camera may be disturbed by the heat generated from the light source.
  • a method of supplying excitation light using a dichroic mirror is widely used, but not only does the image quality of the fluorescence image obtained due to the dichroic mirror deteriorate, but the amount of light may be reduced when reflected using the dichroic mirror. It has the disadvantage of having to use a strong light source to obtain the desired fluorescence image.
  • a plurality of small light sources are arranged in a circular shape on the main surface of the camera 100 and then used to supply excitation light, thereby minimizing the asymmetry of the excitation light and saving energy. And miniaturization of the device can be achieved.
  • 2 to 30 light sources 310 may be installed at even intervals. As seen above, if only one light source is used, asymmetry in the excitation light may occur, and if more than 30 light sources are used, the number of light sources may increase and the size of the device may become excessively large.
  • the light emitting diode of the present invention since it emits excitation light in a hemispherical shape, it is desirable to properly adjust this and use only light irradiated at a certain angle as excitation light. If hemispherical light is used, excitation light may be supplied to unwanted areas, resulting in fluorescence, and it may be difficult to supply uniform light. The method and device will be described later.
  • An excitation light lens 340 may be installed on top of the light source to focus the excitation light generated from the light source.
  • a typical light emitting diode generates light in a hemispherical direction. If such a light emitting diode is used as is and blocks all excitation light except for the excitation light having a certain direction, a lot of light loss may occur. Therefore, it is desirable to install an excitation light lens on top of the light source and primarily collect the excitation light generated from the light source.
  • the excitation light lens 340 may be installed independently at each light source, or may be formed in a donut shape so that one lens covers the entire light source (see (b) of FIG. 4). That is, the excitation light lens may be installed independently in each gangwon, and the entire excitation light lens may be manufactured as an integrated piece by processing one lens into a donut shape.
  • the excitation light lens 340 When manufacturing the excitation light lens 340 as an integrated piece, it is desirable to form individual protrusions on the upper part of the light source (FIG. 4(b)). At this time, the protrusion acts as a kind of convex lens and can focus the light generated from the light source in one direction.
  • the light from the light source In the case of existing donut-shaped lenses, the light from the light source is concentrated in a certain direction by manufacturing a semicircular cross section.
  • these existing lenses can collect light spreading in the cross-sectional direction of the donut-shaped lens, they have limitations in collecting light that sag in the tangential direction of the lens.
  • the excitation light lens 340 is manufactured in a donut shape, but each protrusion is formed on the upper part of the light source, which can have the same effect as installing a convex lens on each light source.
  • This integrated excitation light lens 340 not only incurs a lower installation cost compared to installing each excitation light lens on each light emitting diode, but also allows the lens to be replaced in one minute, so the focal length can be changed or the color of the excitation light lens can be changed. It has the advantage of being able to replace the entire lens at once if changes are needed.
  • the excitation light collected by the excitation light lens 340 may pass through the shielding guide 320 (see FIG. 3).
  • the shielding guide 320 may operate as a type of filter that passes only vertical light among the light generated from the light source.
  • the excitation light generated from the light source 310 passes through the excitation light lens 340 and may be condensed at a certain angle. However, even if it passes through the excitation light lens 340, the excitation light travels straight at a certain angle. Additionally, in the case of excitation light that does not pass through the excitation light lens, it may be diffused to the surroundings and irradiated upward (ambient light). Therefore, it is desirable to use the shielding guide 320 to remove ambient light and excitation light emitted beyond a certain angle.
  • the shielding guide 320 includes a central guide portion 321 formed at the center of the shielding guide through which the fluorescent signal generated from the sample passes; and an excitation light guide unit 322 installed at regular intervals outside the central guide unit and allowing excitation light generated from the light source to pass through.
  • a camera 100 is installed in the center, and the light sources 310 are arranged in a circle around the camera (see Figure 3). Therefore, it is desirable that the shielding guide 320 is also manufactured in a shape to correspond to this.
  • a central guide portion 321 may be formed in the center of the shielding guide through which fluorescence generated from the sample can pass.
  • the central guide part 321 is a part formed between the sample and the camera through which fluorescence generated from the sample passes.
  • the camera is installed at the bottom, and the sample can be located at the top. That is, the fluorescence of the sample generated by being excited by the excitation light of the light source can be observed with the camera through the central guide part (see Figures 3 and 4 (a)).
  • the diameter of the bottom of the central guide part has a diameter similar to that of the outermost lens 110 of the camera. If the diameter of the central guide portion is excessively larger than the outermost lens 110 of the camera, light may enter between the camera lens and the central guide portion 321 and the resolution may be reduced during observation. Conversely, the diameter of the central guide portion may be lowered when observing. If it is excessively smaller than the outermost lens 110 of the camera, the camera's field of view may become narrow.
  • the term “outermost lens of the camera” refers to the lens placed on the outermost side of the camera lens arrangement, and generally refers to the lens that external light comes into contact with first.
  • the diameter of the outermost lens of this camera can be expressed as the lens aperture.
  • the central guide portion 321 may be manufactured to have the same diameter from the top to the bottom, but if the size of the sample and the size of the outermost lens 110 of the camera are different, it may have a tapered shape to match each size. It may be manufactured to have . That is, if the diameter of the outermost lens of the camera is excessively large compared to the size of the sample part where the sample is installed, the camera can be manufactured in a way that the diameter of the sample part is reduced and the diameter of the outermost lens part of the camera is increased. The opposite is also possible. Through this, it is possible to effectively transmit fluorescence generated from the sample to the camera.
  • An excitation light guide unit 322 may be arranged outside the central guide unit 321 (see Figure 4 (a)).
  • the excitation light guide part 322 is a part through which the excitation light generated by the light source passes and is supplied to the sample, and is formed in the same direction as the central guide part, but the direction of light passing through the inside is in the opposite direction.
  • the tree portion excluding the excitation light having a certain angle among the excitation light can be absorbed and removed (see FIG. 5).
  • the excitation light is supplied adjusted to have a narrow angle in order to generate uniform fluorescence. If the excitation light is supplied at a wide angle, the excitation light is supplied to areas other than the desired area, and light other than the fluorescence of the sample may be observed. Additionally, to prevent this, if the irradiation range of the excitation light is reduced, the excitation light is supplied to the peripheral area. There are cases where this does not work. Therefore, in the case of the present invention, it is possible to obtain images of the sample fluorescence with higher resolution by removing the excitation light having a certain angle or more by passing through the excitation light guide unit 322.
  • the excitation light guide unit 322 is manufactured to have a cylindrical interior, and excitation light can pass through the interior. At this time, since the excitation light passes through a long cylinder, only the excitation light with a certain angle can pass through the inside of the excitation light guide without being reflected, and in the case of the excitation light with a certain angle or more, it contacts the inner surface of the excitation light guide. I do it. That is, when a light-absorbing coating layer is formed on the inner surface of the excitation light guide unit, it is possible to remove excitation light at a certain angle or more that contacts the wall of the excitation light guide unit (see FIG. 5).
  • excitation light filters In the case of existing excitation light filters, a filter that is simply open in the form of a slit or dot is used, but in this case, there may be limitations in removing excitation light that is out of angle, and the amount of excitation light passing through is reduced. Therefore, in the case of the present invention, by optimizing the length of the excitation light guide part, it is possible to supply excitation light with a high amount of light while supplying only excitation light below a certain angle.
  • R/L may be 0.05 to 0.5.
  • the excitation light guide part has a certain length and can remove excitation light having an angle of more than a certain amount. However, if the length of the excitation light guide becomes longer than a certain level, the size of the entire system may increase, and the amount of excitation light supplied to the sample may decrease (second picture in FIG. 6). Additionally, if the excitation light guide part is shortened below a certain length, the irradiation range may become excessively wide and the effectiveness of the excitation light guide may be reduced (third picture in FIG. 6).
  • the internal diameter and length of the excitation light guide may have a constant ratio. If the R/L is less than 0.05, the length of the excitation light guide may become excessively long and the amount of supplied excitation light may decrease, and if R/L exceeds 0.5, the angle of the supplied excitation light may increase, thereby reducing the resolution of the fluorescence image. may fall.
  • the internal diameter of the excitation light guide unit 322 is preferably 2 to 5 mm.
  • the light emitting diode used in the above light source often has a size of less than 5 mm, and in the case of the present invention, it is recommended to use a light emitting diode with a light emitting portion of 2 to 5 mm in size as the light source 310 in order to miniaturize the device. desirable. Therefore, the internal diameter of the excitation light guide portion is preferably 2 to 5 mm so as to be similar to the size of the light emitting portion of the light emitting diode.
  • the length of the excitation light guide may be 10 to 50 mm so as to have an appropriate ratio to the internal diameter of the excitation light guide.
  • the length of the excitation light guide may refer to the entire length of the excitation light guide, but may also refer to the length from the point in contact with the excitation light to the top.
  • a light-absorbing coating layer may be formed on the inside of the central guide part 321 or the excitation light guide part 322. As seen above, a coating layer that absorbs light is required inside the excitation light guide unit. Additionally, separately from this, in the case of the central guide portion, a light-absorbing coating layer may be formed to remove images reflected from the wall surface of the central guide portion. That is, in the case of the present invention, excitation light is supplied through the shielding guide and a fluorescence image is acquired at the same time, but the resolution and accuracy of the image can be increased by minimizing light reflection by the wall of the shielding guide.
  • the light-absorbing coating layer can be used without limitation as long as it is a coating layer capable of absorbing the excitation light and fluorescence, but preferably includes carbon black, carbon nanotubes, or graphene.
  • carbon black, carbon nanotubes, or graphene they are black in color and can easily absorb light.
  • light incident from one side of the tube can be diffusely reflected and absorbed inside the tube structure.
  • graphene since graphene has a two-dimensional structure, incident light can be reflected and absorbed between each layer of graphene. That is, when the carbon nanotubes and graphene are included in the light absorption layer, a higher light absorption effect can be achieved.
  • the excitation light guide unit 322 may be installed independently of the light source 310 (see FIG. 3). That is, in the case of the light source, the excitation light guide unit may be installed one by one at the top of each light source. Accordingly, it is preferable that the excitation light generated from each light source passes through the excitation light guide unit 322 and is supplied toward the sample. As described above, it is preferable that 2 to 30 light sources are installed, and therefore, it is preferable that 2 to 30 excitation light guide units are also installed.
  • the light source 310 may be installed outside the excitation light guide unit 322, but part or all of the light source 310 may be installed inside the excitation light guide unit 322.
  • the light source When the light source is installed externally, it can easily dissipate heat and have the advantage of being easy to install and maintain. However, if the alignment with the excitation light guide unit is misaligned, the excitation light supplied to the sample may be reduced.
  • the light source when the light source is installed inside the excitation light guide, the overall size of the device increases, and it has the advantage that it may be difficult to dissipate the heat generated from the light source. However, once the light source is aligned, even if it receives an impact, the light source remains intact. This can prevent misalignment.
  • the prism 330 is installed on the upper part of the shielding guide and can refract the light (excitation light) passing through the excitation light guide unit 320 in the direction of the sample (see FIG. 3). At this time, it is preferable to use a prism arranged in a donut shape or manufactured in a donut shape on the upper part of the shielding guide so as not to interfere with observing the fluorescence of the sample.
  • Figure 7(a) shows the prism of the present invention and Figure 7(b) shows its cross section.
  • the prism is used to collect the excitation light toward the center where the sample is located.
  • the prism is installed in a donut shape on the upper part of the excitation light guide, and the height of the inner portion is equal to the height of the outer portion. It can be manufactured higher. That is, in the case of the prism of the present invention, the upper part can form a diagonal line that becomes lower toward the outside. Additionally, the upper part of the prism may have an angle of 30 to 40°, preferably 31 to 38°, and most preferably 35.5° with the horizontal plane, that is, the surface in contact with the excitation light guide unit.
  • the angle of the upper part is less than 30°, the excitation light is not concentrated in the center, which may lower the uniformity of the excitation light. If the angle is more than 40°, the amount of light in the peripheral area may decrease and uniformity may also be lowered.
  • the height of the inner part may be 3 to 8 mm, preferably 6 to 7 mm, and more preferably 6.4 mm. If the height of the inner part is less than 3 mm, all of the excitation light generated from the excitation light guide cannot be refracted. If it exceeds 8 mm, the size of the prism becomes excessively large and external light other than the excitation light enters, resulting in a low signal-to-noise ratio. It can be lowered.
  • the image acquisition device may acquire a fluorescence image at a magnification of 0.5 to 2.
  • existing fluorescence microscopes it is common to acquire images enlarged by 2 to 100 times due to low resolution. This is because, as seen above, the resolution of the image may decrease due to the use of multiple dichroic mirrors, and uniformity and clarity also decrease due to the imbalance of the excitation light. Therefore, most fluorescence microscopes only observe one well or a portion of the particles to which the entire target substance is attached.
  • uniform supply of excitation light is possible without the use of a dichroic mirror, and thus high-resolution images can be obtained. Therefore, in the case of the present invention, unlike existing fluorescence microscopes, images can be acquired at 0.5 to 2 times magnification, preferably 1 times magnification, which means that it is possible to acquire and analyze images of all sample parts simultaneously.
  • the image acquisition device may have a uniformity of 70% or more, expressed by Equation 1 below.
  • Uniformity (min for the fluorescence signal in each pixel area divided among the entire image analysis area/max for the fluorescence signal in each pixel area divided among the entire image analysis area)
  • the uniformity represents the difference between the maximum and minimum values of the fluorescence signal among each pixel area divided within the entire image analysis area, and it is generally known that the higher the uniformity, the more uniform light is supplied.
  • the uniformity expressed by Equation 1 above may be 70% or more, preferably 80 to 100%, and more preferably 85 to 96%. If the uniformity is less than 80%, it is difficult to supply uniform excitation light, so additional correction may be required or incomplete observation may occur. Additionally, 100% means that the same light is supplied to the entire area, so values higher than this are impossible.
  • the uniformity can be divided into uniformity of the entire area and uniformity of the observable area (see FIG. 8). Although it is desirable to have high uniformity in the entire area, it is more desirable to have high uniformity in the observable area. In particular, since the area observed by a fluorescence microscope corresponds to pixels of the observable area rather than pixels of the entire area, it is desirable that the uniformity of the observable area is 80% or more.
  • the image acquisition device may have a sensitivity to fluorescence that is 5 times higher than that of a conventional fluorescence microscope.
  • the sensitivity is the average value of the fluorescence signal intensity and can be expressed as MFI (Mean Fluorescence Intensity).
  • a lens of the same magnification can have a sensitivity of at least 5 times, preferably 5 to 20 times, and more preferably 8 to 12 times compared to a conventional low-magnification fluorescence microscope.
  • the image acquisition device of the present invention can obtain a fluorescence value of 5 times or more when using a lens under the same conditions compared to a conventional low-magnification fluorescence microscope.
  • the magnification is required.
  • a high-magnification fluorescence microscope using this high lens must be used or the exposure time to the excitation light must be increased.
  • the area that can be observed at once is reduced, which may increase the overall analysis time, and when exposed to excitation light for a long period of time, the signal-to-noise ratio may decrease and photobleaching may occur.
  • the present invention also provides (i) a camera for detecting fluorescence signals and optical signals; (ii) a sample unit installed at a certain distance from the camera; (iii) a fluorescent unit that supplies excitation light from the camera direction to the sample unit; and (iv) an optical unit installed at a predetermined distance from the sample unit in the direction opposite to the camera and supplying visible light in the direction of the camera, wherein the fluorescent unit (1) forms a circle outside the camera. Evenly spaced light sources; (2) a shielding guide located above the light source and transmitting only vertical light among the light emitted from the light source; and (3) an image acquisition device for detecting target material signals, including a prism that refracts light passing through the shielding guide in the sample direction.
  • the observation light of the optical signal is supplied from the opposite side of the sample (see Figure 3).
  • the light source is supplied from the objective part and arranged to easily observe the shape of the surface.
  • the observation light is transmitted in a transmissive manner. It is okay to install it.
  • the excitation light for the fluorescence image is supplied from the same direction as the camera, and the observation light for the optical image is supplied from the opposite direction to the camera, so that the optical image and the fluorescence image can be acquired selectively or simultaneously.
  • the sample unit 200 is a part where the sample is placed and fixed, and the sample can be directly seated or a well plate containing the sample may be seated (see FIG. 1).
  • multi-well plates are a standard tool for processing and analyzing large numbers of samples.
  • Multi-well plates can take on a variety of shapes, sizes and shapes, but are generally made of standard sizes and shapes and have a standard arrangement of wells. Standard arrangements of wells include 96-well plates (12x8 well arrangement), 384-well plates (24x16 well arrangements), and 1536-well plates (48x32 well arrangements), as well as a variety of other commercially available multi-well arrangements. Plates may be used.
  • a well plate containing a sample is used in the sample portion, but has specifications similar to commercial multi-well plates, so that it can be easily compatible with various conventional biological analysis techniques.
  • the sample may contain magnetic particles.
  • a fluorescent substance is attached to an antibody, the sample is supplied to a solution containing the antibody, and the test is performed by attaching the antigen through an antigen-antibody reaction.
  • this case has the disadvantage that it is not easy to separate non-competing antibodies.
  • handling during immunodiagnosis can be facilitated by attaching the antibody to a magnetic particle and then using it to perform an antigen-antibody reaction.
  • the magnetic particles may be formed in a microrod or spherical shape, and may preferably have a microrod shape.
  • the magnetic particles of the present invention include a core containing a magnetically reactive metal; a shell layer surrounding the core and having a uniform thickness; and a capture probe introduced on the shell layer to capture biomaterial.
  • the core portion may include a magnetically reactive metal, preferably a magnetic metal or a metal alloyed with a magnetic metal.
  • the magnetic metal may be an alloy containing iron (Fe), nickel (Ni), cobalt (Co), and manganese (Mn).
  • the magnetically reactive metal may include transition metals such as iron, nickel, cobalt, manganese, etc. as main components, rare earth metals such as gadolinium (Gd), terbium (Tb), and samarium (Sm), and other boron (B), It may include silicon (Si), carbon (C), etc.
  • Representative examples of the magnetically reactive metal include iron alloy or cobalt alloy.
  • an iron alloy is Fe 70 B 15 Si 10 C 5
  • an example of a cobalt alloy is Co 68 Mn 7 Si 10 B 15
  • the magnetic metal may be used mixed or alloyed with copper (Cu), gold (Au), silver (Ag), iron (Fe), or platinum (Pt), and more preferably may include a superparamagnetic metal.
  • the core part does not directly have magnetism, it is magnetized as a magnet approaches and can have an attractive force with the magnet, making it useful for movement and mixing using magnets. However, in the case of the present invention, it is preferable to use a paramagnetic material rather than a ferromagnetic material.
  • the magnetic particles preferably have a size and specific gravity that do not float in the water phase so that they can be quickly collected or separated by an external magnet such as a permanent magnet or electromagnet.
  • the core may occupy more than 60% of the total volume of the magnetic particles.
  • the core may be 60 to 99%, preferably 75 to 99%, of the total volume of the magnetic particle.
  • the size (for example, diameter or length) of the magnetic particles may be on the order of tens to hundreds of ⁇ m, and the specific gravity is preferably 5 or more, for example, 5 or more and 30 or less. If the magnetic particles 130 are nanoparticles with a size of less than 1 micrometer, they can float in water even if the particles have a high specific gravity (ex: 7.876 for iron).
  • the magnetic control of the magnetic particles may not be smooth due to the low magnetic force of the fine particles when a magnetic field is applied, resulting in difficulties in separation.
  • the magnetic rod is moved up and down within the well to promote an immune response, the attachment and detachment of fine particles occurs.
  • the magnetic particles once attached to the magnetic rod remain at the bottom of the well even when the magnetic field is removed due to their low weight. It does not fall again and can continue to remain by non-specific binding to the magnetic rod. In this case, the reproducibility of quantitative analysis may be reduced when detecting biomaterials in the well.
  • this magnetic particle forms a core-shell structure by having a magnetic reactive metal in the center and a shell layer surrounding it.
  • the shell layer may be made of an organic or inorganic material, and is preferably made of glass ( glass).
  • the main ingredient of the glass may be a compound selected from the group consisting of soda lime, borosilicate, aluminosilicate, silica, alkali silicate, Pyrex, and quartz. It is preferably used for experiments requiring heat resistance, acid resistance, and water resistance, and may be a borosilicate that can minimize non-specific binding to antibodies.
  • the shell surface may include hydrophilic functional groups.
  • the shell surface it contains various functional groups and can be combined with a capture probe to be described later.
  • the functional group is a hydrophilic functional group
  • the hydrophilic functional group is a silanol group or a carboxyl group derived from a silanol group, an amino group, a hydroxy group, a thiol group, or an aldehyde. It could be a sign. More preferably, the functional group may be a silanol group.
  • the hydrophilic functional group may be directly bound to the capture probe, but may preferably be bound using a linker.
  • the linker is located between the hydrophilic functional group and the capture probe to facilitate attachment of the capture probe to the shell layer, and is preferably a silane compound, more preferably amino-silane, and most preferably 3-aminopropyltri. Methoxysilane (3-Aminopropyltrimethoxysilane, APTES) may be used.
  • the magnetic particle may include a capture probe introduced on the shell layer to capture a biological material (antigen), and the capture probe may be an antibody that uses a biomarker as an antigen.
  • hydrophilic functional groups/nm 2 may be introduced on the surface of the shell.
  • the linker or capture probe is attached to the magnetic particle by combining with the hydrophilic functional group of the shell layer, the number of linkers or capture probes that can be bound can be determined depending on the number of the hydrophilic functional group. Therefore, when forming a plurality of hydrophilic functional groups on the surface of the magnetic particle, it is possible to attach a large amount of linker or probe to the surface of the magnetic particle. At this time, if the density of the hydrophilic functional group is less than 1/nm 2 , measurement may be difficult due to low fluorescence during fluorescence measurement, and if the density of the hydrophilic functional group exceeds 80/nm 2 , when the probes are combined, a gap between the probes may occur. There may be no further increase in fluorescence due to interference.
  • the optical unit 400 supplies visible light for optical observation to the sample unit and may include a light source using a light-emitting diode (see FIG. 3).
  • the light source used at this time may simply be a light source using a light emitting diode (LED), and unlike the fluorescent part, it emits visible light traveling straight, so an optical lens formed on the front part of the light emitting diode can be used. That is, in the case of the fluorescent part, a structure including a shielding guide was used to avoid interference with the camera, but in the case of the optical part, since there is no such interference, it is possible to simply use LED lighting.
  • LED light emitting diode
  • the light source of the optical unit 400 may be supplied with a voltage of 1 to 5 V and a current of 1 to 50 mA, and the light amount may be adjusted to 1 to 100 lm.
  • the light amount may be adjusted to 1 to 100 lm.
  • optical observation of the sample is easy, but if it exceeds the above range, accurate observation of the sample may be difficult due to the high amount of light. Additionally, if it is below the above range, it may be difficult to observe the sample seated in the sample unit due to the low light intensity.
  • the present invention also provides an image analysis method using an image acquisition device for detecting target material signals, wherein the image acquisition device includes (i) a camera for detecting fluorescence signals and optical signals; (ii) a sample unit installed at a certain distance from the camera; (iii) a fluorescent unit that supplies excitation light from the camera direction to the sample unit; and (iv) an optical unit installed at regular intervals in the direction opposite to the camera from the sample unit and supplying visible light in the direction of the camera, 1 placing magnetic particles bound with a target material into each well of the multi-well plate. Injecting into; 2 Fixing the multi-well plate to the sample unit; 3 Obtaining an optical image by applying power to the upper optical unit; and 4 applying power to the lower fluorescent unit to obtain a fluorescence image.
  • the image acquisition device includes (i) a camera for detecting fluorescence signals and optical signals; (ii) a sample unit installed at a certain distance from the camera; (iii) a fluorescent unit that supplies excitation light from the camera direction
  • Step 1 is a step of binding the target material to the surface of the magnetic particle and then injecting it into the will plate.
  • a capture probe is formed on the surface of the magnetic particle as seen above, and at this time, the capture probe can bind to the target substance (antigen).
  • the target substance antigen
  • a second antibody that can bind to another part of the target material is mixed, and the second antibody may include a fluorescent material.
  • the second antibody When using a second antibody as above, if an antigen is attached to the surface of the magnetic particle, the second antibody is also attached to the antigen, so the magnetic particle can emit fluorescence, and if the antigen is not attached, the second antibody is also attached to the antigen. Since the second antibody is also not attached, the magnetic particles do not emit fluorescence.
  • the capture probe By using this to bind each capture probe to magnetic particles of different lengths or sizes, they can compete with different antigens according to each size, and the type of antigen can be read simply by observing fluorescence. means that In the case of conventional fluorescence analysis, the spectrum of fluorescence was separated to confirm the peak wavelength of each fluorescence, and a complex method was used to read the type of antigen through this.
  • magnetic particles bound to a target material can be injected into each well of a multi-wall plate.
  • the multi-well plate can be fixed to the sample section.
  • a fixing fixture capable of combining the multi-well plate is formed, it is preferable to use this to fix the multi-well plate.
  • optical images can be acquired by applying power to the upper optical unit.
  • the light source of the optical junction supplies visible light from the opposite side of the camera with respect to the sample unit, the magnetic particles can obtain images that can confirm their size and quantity rather than direct observation of the surface.
  • the fluorescence image of the present invention is an image with a magnification of 0.5 to 2, so it is possible to acquire images of the entire sample area at the same time. Compared to existing fluorescence microscopes, this produces images of a larger area and at a faster speed. It can be analyzed.
  • an image acquisition device was prepared to detect target material signals.
  • the device used at this time is as follows.
  • Fluorescent light source 505nm LED (OSRAM, LV CRBP.01)
  • Optical light source White LED (Seoul Semiconductor, LW514)
  • Shielding guide Central guide part (inner diameter 30mm) in the center, 21 excitation light guide parts (inner diameter 4mm) formed on the outside of the central guide part, the length of the shielding guide is 25mm, and the total outer diameter is 50mm.
  • Excitation light lens Manufactured so that a protrusion is formed on the top of the light source as shown in Figure 4 (b).
  • Example 1 The same procedure as in Example 1 was performed except that only four excitation light guide units were formed in the shielding guide and only four fluorescent unit light sources were used.
  • Example 1 The same procedure as in Example 1 was performed except that only one excitation light guide part was formed in the shielding guide and only one fluorescent part light source was used.
  • Example 2 The same procedure as in Example 1 was performed except that 25 excitation light guide units were formed in the shielding guide and 25 fluorescent unit light sources were also used.
  • Example 2 The same procedure as in Example 1 was performed except that the length of the shielding guide was manufactured to 10 mm.
  • Example 2 The same procedure as in Example 1 was performed except that the length of the shielding guide was manufactured to 5 mm.
  • Example 2 The same procedure as in Example 1 was performed except that the length of the shielding guide was manufactured to 50 mm.
  • Example 2 The same procedure as in Example 1 was performed except that the length of the shielding guide was manufactured to 60 mm.
  • Example 2 The same procedure as in Example 1 was performed except that the internal diameter of the excitation light guide was manufactured to be 2 mm.
  • Example 2 The same procedure as in Example 1 was performed except that the internal diameter of the excitation light guide was manufactured to be 1 mm.
  • Example 2 The same procedure as in Example 1 was performed except that the internal diameter of the excitation light guide was manufactured to be 5 mm.
  • Example 2 The same procedure as in Example 1 was performed except that the internal diameter of the excitation light guide was manufactured to be 8 mm.
  • Example 2 The same procedure as in Example 1 was performed except that light-absorbing paint was not used.
  • 300 um cylindrical magnetic microparticles bound to biotin were prepared by treating them with a fluorescent substance bound to streptavidin.
  • the prepared fluorescent material-bound cylindrical magnetic microparticles were placed in the reaction well, and the 852 (horizontal) x 852 (vertical) pixel area displayed in the fluorescence measurement mode of the image acquisition device was divided into 6 (horizontal) x 6 (vertical) equal parts. Fluorescent signals were obtained by moving magnetic microparticles bound to fluorescent substances. Uniformity was analyzed using the mix and max values for the fluorescence signals of a total of 36 regions.
  • Uniformity (min for the fluorescence signal in each pixel area divided among the entire image analysis area/max for the fluorescence signal in each pixel area divided among the entire image analysis area)
  • Example 1 of the present invention As shown in Table 1, in Example 1 of the present invention ( Figure 8(a)), the uniformity, which represents the ratio between the minimum and maximum light amounts, was high, so there was almost no difference in light amount. However, it was confirmed that uniformity decreased when the number of fluorescent light sources generating excitation light was reduced (Example 2, Figure 8 (b)) or only one was used (Example 3). In particular, in Example 3 using only one light source, it was confirmed that light was concentrated on one side of the observable area, as shown in (a) of FIG. 9. On the contrary, when 25 light sources were used (Example 4), there was no further increase in uniformity.
  • Example 10 This was confirmed in the same way when the internal diameter (inner diameter) of the excitation light guide was reduced (Examples 9 and 10).
  • Example 10 where the internal diameter was excessively reduced, the overall light amount was reduced and at the same time the light in the peripheral area was weakened, resulting in uniformity. It was found to decrease significantly (see (a) of Figure 11).
  • Example 11 where the inner diameter was increased, uniformity was maintained to some extent, but the overall amount of light was confirmed to be reduced (see Figure 11 (b)). Therefore, it was confirmed that the excitation light guide part must have a ratio of inner diameter and length within a certain range.
  • Example 13 in which light-absorbing paint was not used, there was little change in uniformity as the excitation light passed through diffuse reflection inside.
  • the prepared fluorescent material-coupled cylindrical magnetic microparticles were placed in the reaction well, and the results were measured using 1, 4, and 10x lenses with an exposure time of 50 ms in the fluorescence measurement mode of the image acquisition device.
  • the resolution of the image acquisition device was measured by comparing.
  • Example 13 in Example 1, Examples 2, and 4 of the present invention, it was shown that it was possible to obtain photographs with high resolution even when a 1x lens was used.
  • the present invention not only can large-area imaging be possible using a 1x magnification lens, but it can also have resolution that can be analyzed normally even when magnified and analyzed.
  • Example 1 of the present invention was able to acquire images without problems under all conditions, but in Comparative Example 3, in order to obtain the same image as that of the present invention, a lens with a magnification of at least 4 times or more must be used.
  • the magnetic microrod manufactured in the present invention was a glass-coated microwire according to the information described in Korean Patent Application No. 10-2018-0130436.
  • the diagnostic system using the manufactured magnetic microrod was configured through the following steps according to the contents described in Korean Patent Application No. 10-2020-0123989 to analyze the sensitivity of the image acquisition device of the present invention. was carried out.
  • Step 1 Fabrication and surface treatment of magnetic microrods
  • Step 2 Preparation of a large microrod magnetic conjugate on which the first antibody is immobilized
  • Step 3 QC of the first window immobilized giant microrod
  • Step 5 Sample dropping step
  • Step 6 Mixing/Heating Step
  • Step 7 Washing Step
  • Step 8 Detection signal measurement step
  • Capture antibodies (GFAP_cAb_09 and UCHL1_cAb_02) coupled to RSMP prepared in the above method and detection Abs (GFAP_dAb_03 and UCHL1_dAb_07) coupled with biotin were applied.
  • Hytest's antigen GFAP and Origene's antigen UCHL1 were added to PBS or serum at 0, 3.125, 6.25, 12.5, 25, 50, 100, 200, 400, 800, 1600, 3200 pg/ml, and then The experiment was conducted in the same manner.
  • the image acquisition device of the present invention was applied to the above diagnostic system, and the test results at GFAP and UCHL1 concentrations of 0 to 3200 pg/ml were compared and analyzed with ELISA, and it was confirmed that the sensitivity was 40 times higher than that of ELISA ( Figures 15 and 16).
  • Example 1 Conventional fluorescence microscope Lens magnification (x) 1x 1x 4x 10x 20x Exposure time (ms) 50 31520 3194 8119 12701 13052 200 65202 5833 15664 30708 32703 500 65513 8482 33736 52983 54115
  • Example 1 of the present invention was found to have a sensitivity to fluorescence about 10 times that of a conventional fluorescence microscope when using a 1x lens. It was confirmed that in order to have sensitivity to fluorescence similar to that of the present invention using an existing fluorescence microscope, a magnifying lens of 10x or more must be used, and the exposure time must also be 4 times or more.

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Abstract

본 발명은 형광 이미지 획득을 위하여 사용되는 기존의 형광 현미경에 비하여 민감도 및 균일도가 향상된 표적물질 신호 검출 위한 이미지 획득 장치 및 획득방법에 관한 것이다. 본 발명은 (a) 형광신호 검출을 위한 카메라; (b) 상기 카메라의 외측에 원형을 이루며 균일한 간격으로 배치된 광원; (c) 상기 광원의 상부에 위치하며, 상기 광원에서 발산되는 빛 중 수직방향의 빛 만을 투과시키는 차폐가이드; 및 (d) 상기 차폐가이드를 통과한 빛을 시료방향으로 굴절시키는 프리즘을 포함하는 표적물질 신호 검출 위한 이미지 획득 장치를 제공한다.

Description

표적물질 신호 검출 위한 이미지 획득 장치 및 획득방법
본 발명은 표적물질 신호 검출 위한 이미지 획득 장치 및 획득방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 형광 이미지 획득을 위하여 사용되는 기존의 형광 현미경에 비하여 민감도 및 균일도가 향상된 표적물질 신호 검출 위한 이미지 획득 장치 및 획득방법에 관한 것이다.
과거부터 병원성 물질을 검출하기 위한 많은 방법이 수행되어 왔다. 기존의 방법은 환자 또는 감염원으로부터 검체를 채취한 다음, 이를 광학적 또는 화학적으로 분석하여 병원성 물질의 종류를 판별하였다. 하지만 이러한 기존의 방법은 많은 양의 검체를 필요로 할 뿐만 아니라 검사원의 숙련도에 따라 검출여부가 결정되는 경우가 많아 병원성 물질의 정확한 진단에는 한계를 가지고 있다.
특히 신규 병원체 또는 화학성 물질에 의하여 증상이 발생하는 경우 이를 분석하기 위해서는 많은 양의 검체를 확보하는 것이 필요하며, 이는 환자에게 많은 부담으로 작용할 수 있다.
이를 개선하기 위하여 PCR를 이용한 병원체의 증폭방법이 사용되고 있다. 이 PCR의 경우 병원체의 DNA를 증폭하는 것으로 소량의 검체에서도 병원체의 확보가 가능하지만, DNA의 증폭에 많은 시간이 걸리는 단점을 가지고 있어 병원체의 초기 진단에는 제한적으로만 사용할 수 있다.
최근 생화학적 테러 및 병원체에 의한 대량 감염이 일어나면서 빠른 시간내에 검체의 확인이 가능한 기술을 필요로 하고 있다. 이를 위하여 병원성 물질에 형광체가 부착된 항체를 결합시켜 검사하는 면역학적 분석방법이 많이 도입되고 있다. 이 면역학적 분석방법의 경우 기존의 PCR을 이용한 분석방법에 비하여 빠르게 결과를 확인할 수 있으며, 소량의 검체만으로도 분석이 가능하다는 장점을 가지고 있다.
이 면역학적 분석방법의 경우 형광체의 발광을 이용하여 병원성 물질의 여부를 판별하기 때문에 형광현미경을 사용하는 경우가 대부분이다. 일반적으로 사용되는 형광현미경의 경우 여기광을 공급하는 광경로와 시료에서 발생되는 형광의 광경로가 일치함에 따라 이를 분리하여 관찰하기 위한 장치를 필요로 하고 있다. 이러한 광경로의 분리를 위하여 기존의 형광현미경에서는 다이크로익 미러(dichroic mirror)를 사용하는 것이 일반적이다.
하지만 이러한 다이크로익 미러의 경우 검체에서 발생되는 형광의 일부를 반사하는 특성을 가지고 있어 해상도가 떨어질 뿐만 아니라 형광의 강도를 확보하기 위하여 강한 여기광을 사용하는 경우 검체의 손상이 나타날 수 있다는 단점을 가지고 있다.
따라서 검체의 손상을 방지하면서도 높은 해상도의 형광이미지를 획득할 수 있는 새로운 형광현미경의 개발이 필요한 실정이다.
전술한 문제를 해결하기 위하여, 본 발명은 형광 이미지 획득을 위하여 사용되는 기존의 형광 현미경에 비하여 민감도 및 균일도가 향상된 표적물질 신호 검출 위한 이미지 획득 장치 및 획득방법을 제공하고자 한다.
상술한 문제를 해결하기 위해, 본 발명은 (a) 형광신호 검출을 위한 카메라; (b) 상기 카메라의 외측에 원형을 이루며 균일한 간격으로 배치된 광원; (c) 상기 광원의 상부에 위치하며, 상기 광원에서 발산되는 빛 중 수직방향의 빛 만을 투과시키는 차폐가이드; 및 (d) 상기 차폐가이드를 통과한 빛을 시료방향으로 굴절시키는 프리즘을 포함하는 표적물질 신호 검출 위한 이미지 획득 장치를 제공한다.
일 실시예에 있어서, 상기 차폐가이드는, 차폐가이드의 중앙에 형성되며, 시료에서 발생되는 상기 형광신호가 통과하는 중앙가이드부; 및 상기 중앙가이드 부의 외측에 일정한 간격으로 설치되며, 상기 광원에서 발생되는 여기광을 통과시키는 여기광 가이드부를 포함할 수 있다.
일 실시예에 있어서, 상기 중앙가이드부 또는 상기 여기광 가이드부의 내측에는 광흡수 코팅층이 형성될 수 있다.
일 실시예에 있어서, 상기 여기광 가이드부는 내부직경을 R, 여기광과 접촉되는 지점부터 최상단까지의 길이를 L이라 할 때 R/L이 0.05~0.5일 수 있다.
일 실시예에 있어서, 상기 여기광 가이드부는 내부직경(R)이 2~5mm이며, 길이(L)이 10~50mm일 수 있다.
일 실시예에 있어서, 상기 차폐가이드는 2~30개의 여기광 가이드부를 포함하며, 상기 여기광 가이드부 각각에는 상기 광원이 독립적으로 설치된 것일 수 있다.
일 실시예에 있어서, 상기 광원의 상부에는 상기 광원에서 발생되는 여기광을 집광시키기 위한 여기광렌즈가 형성될 수 있다.
일 실시예에 있어서, 상기 이미지 획득장치는 0.5~2배율의 형광이미지를 획득하는 것일 수 있다.
일 실시예에 있어서, 상기 차폐가이드의 상부에는 상기 차폐가이드를 통과한 여기광을 상기 시료방향으로 굴절시키는 프리즘이 설치될 수 있다.
일 실시예에 있어서, 상기 광원은 400~700nm 파장의 여기광을 방출하는 발광다이오드(LED)일 수 있다.
상기 이미지 획득 장치는 하기의 식 1로 표면되는 균일도(Uniformity)가 70%이상일 수 있다.
[식 1]
균일도 = (이미지 분석 전체 영역중 분할된 각각 픽셀 영역의 형광신호에 대한 min/이미지 분석 전체 영역중 분할된 각각 픽셀 영역의 형광신호에 대한 max) X 100(%)
상기 이미지 획득장치는 형광에 대한 민감도(sensitivity)가 기존의 저배율 형광현미경 대비 5배 이상일 수 있다.
본 발명은 또한 (i) 형광신호 및 광학신호를 검출하기 위한 카메라; (ii) 상기 카메라와 일정간격이 이격되어 설치되는 시료부; (iii) 상기 카메라 방향에서 상기 시료부 방향으로 여기광을 공급하는 형광부; 및 (iv) 상기 시료부에서 상기 카메라의 반대방향으로 일정간격이 이격되어 설치되며 상기 카메라 방향으로 가시광선을 공급하는 광학부를 포함하되, 상기 형광부는, (1) 상기 카메라의 외측에 원형을 이루며 균일한 간격으로 배치된 광원; (2) 상기 광원의 상부에 위치하며, 상기 광원에서 발산되는 빛 중 수직방향의 빛 만을 투과시키는 차폐가이드; 및 (3) 상기 차폐가이드를 통과한 빛을 시료방향으로 굴절시키는 프리즘을 포함하는 표적물질 신호 검출 위한 이미지 획득 장치를 제공한다.
일 실시예에 있어서, 상기 시료는 자성입자를 포함하는 것일 수 있다.
일 실시예에 있어서, 상기 자성입자는 마이크로로드형 또는 구형으로 형성된 것일 수 있다.
본 발명은 또한 표적물질 신호 검출 위한 이미지 획득 장치를 이용한 이미지 분석방법으로서, 상기 이미지 획득장치는 (i) 형광신호 및 광학신호를 검출하기 위한 카메라; (ii) 상기 카메라와 일정간격이 이격되어 설치되는 시료부; (iii) 상기 카메라 방향에서 상기 시료부 방향으로 여기광을 공급하는 형광부; 및 (iv) 상기 시료부에서 상기 카메라의 반대방향으로 일정간격이 이격되어 설치되며 상기 카메라 방향으로 가시광선을 공급하는 광학부를 포함하며, ① 표적물질이 결합된 자성입자를 멀티 웰 플레이트의 각 웰에 주입하는 단계; ② 상기 멀티 웰 플레이트를 시료부에 고정하는 단계; ③ 상부 광학부에 전원을 인가하여 광학 이미지를 획득하는 단계; 및 ④ 하부 형광부에 전원을 인가하여 형광 이미지를 획득하는 단계를 포함하는 표적물질 신호 검출 위한 이미지 분석 방법을 제공한다.
본 발명에 의한 표적물질 신호 검출 위한 이미지 획득장치는 형광신호 관찰시 여기광의 확산을 차단하는 것으로 형광신호의 균일도 및 민감도를 형상시킬 수 있으며, 이에 따라 기존의 형광현미경에 비하여 높은 해상도를 가지는 형광 이미지를 획득할 수 있다.
또한 본 발명에 의한 표적물질 신호 검출 위한 이미지 획득장치는 높은 균일도 및 민감도를 가지고 있으므로, 저배율의 형광이미지의 획득이 가능하며, 대면적의 시료를 동시에 분석할 수 있다.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 의한 표적물질 신호 검출 위한 이미지 획득 장치의 구조를 나타낸 것이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 의한 표적물질 신호 검출 위한 이미지 획득 장치의 내부구조를 나타낸 것이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 의한 표적물질 신호 검출 위한 이미지 획득 장치에서 광학이미지의 생성과 형광이미지의 생성을 나타낸 개요도이다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 의한 차폐가이드 및 렌즈의 구조를 나타낸 것이다
도 5는 본 발명의 일 실시예에 의한 여기광 가이드 내에서 여기광이 정렬되는 것을 나타낸 모식도이다.
도 6은 본 발명의 일 실시예에 의한 여기광 가이드의 길이에 따른 여기광이 집광되는 정도를 각각 나타낸 것이다.
도 7은 본 발명의 일 실시예에 의한 프리즘의 형상을 나타낸 것이다.
도 8 내지 도 12는 본 발명의 일 실시예에 의한 균일도 실험결과를 나타낸 것이다.
도 13은 본 발명의 일 실시예에 의한 해상도(분해능)실험결과를 나타낸 것이다.
도 14은 본 발명의 일 실시예에 의한 해상도 및 민감도 실험결과를 나타낸 것이다.
도 15은 본 발명의 일 실시예에 의한 민감도 실험결과를 나타낸 그래프이다.
도 16은 본 발명의 일 실시예에 의한 민감도 실험결과를 나타낸 사진이다.
이하에서는 본 발명의 바람직한 실시예를 상세하게 설명한다. 본 발명을 설명함에 있어서 관련된 공지 기술에 대한 구체적인 설명이 본 발명의 요지를 흐리게 할 수 있다고 판단되는 경우 그 상세한 설명을 생략하기로 한다. 명세서 전체에서, 단수의 표현은 문맥상 명백하게 다르게 뜻하지 않는 한 복수의 표현을 포함하는 것으로 이해되어야 하고, “포함하다” 또는 “가지다”등의 용어는 기술되는 특징, 숫자, 단계, 동작, 구성요소, 부분품 또는 이들을 조합한 것이 존재함을 지정하려는 것이지, 하나 또는 그 이상의 다른 특징들이나 숫자, 단계, 동작, 구성요소, 부분품 또는 이들을 조합한 것들의 존재 또는 부가 가능성을 미리 배제하지 않는 것으로 이해되어야 한다. 또, 방법 또는 제조 방법을 수행함에 있어서, 상기 방법을 이루는 각 과정들은 문맥상 명백하게 특정 순서를 기재하지 않은 이상 명기된 순서와 다르게 일어날 수 있다. 즉, 각 과정들은 명기된 순서와 동일하게 일어날 수도 있고 실질적으로 동시에 수행될 수도 있으며 반대의 순서대로 수행될 수도 있다.
본 명세서에 개시된 기술은 여기서 설명되는 구현예들에 한정되지 않고 다른 형태로 구체화될 수도 있다. 단지, 여기서 소개되는 구현예들은 개시된 내용이 철저하고 완전해질 수 있도록 그리고 당업자에게 본 기술의 기술적 사상이 충분히 전달될 수 있도록 하기 위해 제공되는 것이다. 도면에서 각 장치의 구성요소를 명확하게 표현하기 위하여 상기 구성요소의 폭이나 두께 등의 크기를 다소 확대하여 나타내었다. 전체적으로 도면 설명시 관찰자 시점에서 설명하였고, 일 요소가 다른 요소 위에 위치하는 것으로 언급되는 경우, 이는 상기 일 요소가 다른 요소 위에 바로 위치하거나 또는 그들 요소들 사이에 추가적인 요소가 개재될 수 있다는 의미를 모두 포함한다. 또한, 해당 분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 본 발명의 기술적 사상을 벗어나지 않는 범위 내에서 본 발명의 사상을 다양한 다른 형태로 구현할 수 있을 것이다. 그리고 복수의 도면들 상에서 동일 부호는 실질적으로 서로 동일한 요소를 지칭한다.
본 명세서에서, '및/또는' 이라는 용어는 복수의 기재된 항목들의 조합 또는 복수의 기재된 항목들 중의 어느 항목을 포함한다. 본 명세서에서, 'A 또는 B'는, 'A', 'B', 또는 'A와 B 모두'를 포함할 수 있다.
본 발명은 (a) 형광신호 검출을 위한 카메라; (b) 상기 카메라의 외측에 원형을 이루며 균일한 간격으로 배치된 광원; (c) 상기 광원의 상부에 위치하며, 상기 광원에서 발산되는 빛 중 수직방향의 빛 만을 투과시키는 차폐가이드; 및 (d) 상기 차폐가이드를 통과한 빛을 시료방향으로 굴절시키는 프리즘을 포함하는 표적물질 신호 검출 위한 이미지 획득 장치에 관한 것이다.
이하 본 발명을 도 1 및 도 2를 참조하여 설명하기로 한다. 도 1은 본 발명의 이미지 획득장치의 내부구도를 나타낸 것이며, 도 2는 이를 측면에서 나타낸 것이다.
상기 카메라(100)는 여기광에 의하여 여기되어 발생되는 형광을 검출하기 위한 것으로 일반적으로 사용되는 광학카메라를 사용할 수 있다. 일반적으로 면역검사법에 사용되는 형광체의 경우 400~800nm의 발광피크를 가질 수 있다. 즉 상기 여기광에 의하여 상기 시료에서 여기되어 발생되는 형광의 경우 가시광선 범위에 있는 것이 일반적이며, 따라서 상기 카메라(100)의 경우 일반적으로 사용되는 광학카메라를 사용할 수 있다.
다만 상기 시료에서 발생되는 형광이 다색을 가지는 경우 각 색상을 분리하여 관찰하기 위한 각각의 카메라가 설치될 수 있다. 일예로서 상기 카메라는 적색, 청색 및 황색을 감지하기 위한 3종의 카메라가 설치될 수 있으며, 각각의 색상에 따른 광경로를 분리하기 위하여 상기 카메라의 전면부에는 각 색상을 선택적으로 반사시킬 수 있는 다이크로익 미러가 설치될 수 있다. 이를 상세히 살펴보면, 시료에서 발생되는 형광은 제1 다이크로익 미러를 이용하여 일부 파장의 색상이 분리되어 제1 카메라에 검지될 수 있고, 상기 제1 다이크로익 미러를 통과한 빛은 제2 다이크로익 미러에서 동일한 과정을 거쳐 일부 파장이 재차 분리될 수 있다. 나머지 파장의 빛은 제3 카메라에 검지될 수 있다. 즉 상기 시료에서 발생되는 형광은 2개의 다이크로익 미러를 통과하며 파장에 따라 3개로 분리되어 각각의 카메라에 입사될 수 있으며, 각 카메라는 이러한 입사된 빛의 강도차이를 계산하여 각 형광의 최대 피크 파장을 측정할 수 있다. 따라서, 각 시료에 부착된 형광체의 종류에 따라 발생되는 형광의 피크파장이 상이하므로 각 시료의 종류를 판별하는 것이 가능하다.
상기 광원(310)은 상기 시료(200)에 여기광을 공급하기 위하여 설치되는 것으로 상기 시료(200)에 포함되어 있는 형광체를 여기시키기 위한 광을 공급하는 역할을 수행할 수 있다. 일반적으로 형광현미경에서 이러한 여기광은 단파장의 레이저를 사용하는 경우가 많이 있다. 하지만 상기 레이저의 경우 발생을 위하여 커다란 장비가 필요하거나 많은 전력을 필요로 하고 있다. 따라서 최근에는 전체적인 장비의 소형화를 위하여 발광다이오드(LED)를 광원으로 하는 형광현미경이 많이 사용되고 있다. 상기 발광다이오드의 경우 전력변환효율이 높아 적은 양의 에너지를 사용할 뿐만 아니라 그 크기가 매우 작아 장비의 소형화에도 기여할 수 있다.
이때 상기 발광다이오드는 상기 시료(200)에 포함되어 있는 형광체가 여기될 수 있는 파장의 빛을 공급할 수 있다. 구체적으로 400~700nm 파장의 여기광을 발생시키는 것이 바람직하다. 아울러 상기 발광다이오드는 단파장 빛을 발생시키는 발광다이오드를 사용할 수도 있지만, 400~700nm의 빛을 연속적인 스팩트럼으로 발광시킬 수 있는 발광다이오드를 사용하되, 각 형광체에 따라 적절한 여기광 필터를 사용하는 것으로 원하는 파장의 여기광을 형성할 수도 있다.
이를 상세히 살펴보면, 일반적으로 발광다이오드는 단색의 빛을 발생시키고 있다. 즉 발광다이오드의 경우 적색, 녹색 또는 청색의 발광을 수행하고 있으며, 일부 다이오드는 자외선을 발광시킬수도 있다. 본 발명의 경우 자외선을 발산하는 발광다이오드를 사용하되, 상기 발광체의 상부에 적외선에 의하여 여기되는 형광체를 포함하는 발광렌즈를 설치하는 것으로 가시광선 전체의 파장을 형성할 수 있는 발광다이오드를 사용할 수 있다. 즉 상기 발광다이오드 내의 발광반도체는 적외선을 발생시킬 수 있지만, 이 적외선에 의하여 발광렌즈에 포함되는 형광체가 여기되어 발광하는 것으로 원하는 스팩트럼의 빛을 형성하는 것이 가능하다. 또한 이를 응용하는 경우 상기 발광다이오드 전체를 교체하지 않고 상기 발광렌즈를 교체하는 것 만으로도 다양한 파장을 가지는 빛을 공급하는 것이 가능하다.
또한 상기 발광다이오드는 전압 1~5V 및 전류 100~500mA의 전력이 공급되어 광량이 20 ~ 200lm으로 조절되는 것 일 수 있다. 상기 광량의 경우 공급되는 전압 및 전류에 비례하는 것으로 알려져 있으며, 일반적인 발광다이오드의 경우 일정이하의 전압 및 전류가 공급되어 빛을 발생하는 것으로 알려져 있다. 상기 범위 내의 전압 및 전류가 공급되는 경우 적절한 광량을 가지면서도 발열이 최소화되고 수명이 길어질 수 있다. 하지만 상기 범위 미만인 경우 광량이 줄어들어 여기광으로 활용이 어려울 수 있으며, 상기 범위를 초과하는 경우 발열이 심해짐과 동시에 수명이 줄어들 수 있다.
아울러 상기 광원(310)에는 bandwidth 60의 466nm ~ 526nm의 파장을 투과시키는 여기 필터(excitation filter)를 포함할 수 있다(도 3 참조). 위에서 살펴본 바와 같이 상기 광원의 경우 400~700nm의 파장을 가지는 빛을 생성할 수 있다. 하지만 일반적으로 사용되는 여기광의 경우 466nm ~ 526nm의 피크파장을 가지고 있다. 이 여기광을 제외한 파장의 여기광이 공급되는 경우 시료에서 반사되어 위양성으로 관찰될 수 있다. 따라서 상기 여기필터를 사용하는 것으로 여기광 이외의 파장 부분을 차단시킬 수 있다.
또한 상기 광원(310)에는 상기 광원에서 발생되는 열을 배출하기 위한 방열부를 포함할 수 있다. 이 방열부의 경우 상기 광원의 열을 배출시키는 역할을 할 수 있으며, 단순히 상기 광원의 주변에 배치된 방열핀을 사용할 수 있으며, 또한 열매를 이용하여 상기 광원에서 발생하는 열을 다른 부분으로 이동시켜 처리할 수도 있다. 이를 상세히 살펴보면 상기 광원의 발열부에는 내부에 열미를 포함하는 히트파이프의 일단이 설치될 수 있으며, 상기 히트파이프의 타단에는 방열핀 또는 냉각부가 설치될 수 있다. 이를 통하여 상기 광원에서 발생된 열을 상기 히트파이프를 통하여 방열핀 또는 냉각부에 전달되어 처리될 수 있다. 상기 광원에서 발생되는 열을 신속히 외부로 배출하지 않는 경우 광원부의 열손상이 있을 뿐만 아니라 발생되는 여기광에 열이 전달되어 아지랑이가 발생할 수 있다. 따라서 상기와 같이 방열부를 설치하는 것으로 광원에서 생성되는 열을 신속히 배출할 수 있다.
상기 광원(310)은 상기 카메라(100)의 외측에 원형을 이루며 배열될 수 있다(도 3 참조). 일반적으로 광원에서 발생되는 여기광은 직진성이 있기 때문에 상기 카메라의 일측에만 광원이 배치되는 경우 방향에 따라 음영이 발생할 수 있다. 아울러 상기 광원이 배치되는 방향에만 광량이 높아짐에 따라 발생되는 형광의 세기가 일정하지 못하다는 단점을 가지고 있다(비대칭성). 따라서 본 발명의 경우 이러한 여기광의 비대칭성을 해소하기 위하여 상기 광원을 다수개 설치하되, 상기 카메라의 외측에 원형을 이루어 배치되도록 하는 것으로 여기광의 비대칭 공급을 최소화할 수 있다.
아울러 기존의 비대칭성을 해결하기 위한 방법으로 상기 카메라의 하부에 강력한 광원을 설치한 다음, 상기 광원에서 발생되는 빛을 굴절시켜 상기 카메라의 주변으로 공급하는 방법을 사용되었다. 하지만 이 경우 강력한 광원의 열로 인하여 카메라가 오작동할 수 있으며, 또한 광원에서 발생되는 열에 의하여 카메라로 공급되는 형광이미지가 흐트러질 수 있다는 단점을 가지고 있다. 또한 다이크로익 미러를 이용하여 여기광을 공급하는 방법도 많이 사용되고 있지만, 다이크로익 미러로 인하여 획득되는 형광화상의 화질이 떨어질 뿐만 아니라 다이크로익 미러를 이용한 반사시 광량이 감소될 수 있으므로, 원하는 형광화상을 얻기 위해서는 강한 광원을 사용해야 한다는 단점을 가지고 있다.
하지만 본 발명의 경우 상기 카메라(100)의 주면에 소형의 광원(발광다이오드, 310))를 다수개 원형으로 배열한 다음, 이를 이용하여 여기광을 공급함에 따라 여기광의 비대칭성을 최소화 하면서도 에너지 절감 및 장치의 소형화를 달성할 수 있다.
이때 상기 광원(310)은 2~30개가 균일한 간격으로 설치될 수 있다. 위에서 살펴본 바와 같이 1개의 광원만을 사용하는 경우 여기광의 비대칭성이 나타날 수 있으며, 30개를 초과하는 경우 광원의 수량이 많아져 장치의 크기가 과도하게 커질 수 있다.
본 발명의 발광다이오드의 경우 반구형으로 퍼지는 형상의 여기광을 발산하기 때문에 이를 적절히 조절하여 일정한 각도를 가지고 조사되는 빛만을 여기광으로 사용하는 것이 바람직하다. 반구형으로 발상되는 빛을 사용하는 경우 원하지 않는 부분이 여기광이 공급되어 형광이 형성될 수도 있으며, 균일한 빛의 공급이 어려울 수 있다. 그 방법 및 장치에 관해서는 후술하기로 한다.
상기 광원의 상부에는 상기 광원에서 발생되는 여기광을 집중하기 위한 여기광렌즈(340)가 설치될 수 있다. 위에서 살펴본 바와 같이 일반적인 발광 다이오드의 경우 반구형의 방향으로 빛을 발생시킨다. 이러한 발광다이오드를 그대로 사용하며, 일정한 방향을 가지는 여기광을 제외한 나머지 여기광을 차단하는 경우 많은 광손실이 발생할 수 있다. 따라서 상기 광원의 상부에는 여기광 렌즈를 설치하며, 상기 광원에서 발생되는 여기광을 1차적으로 모아주는 것이 바람직하다.
이때 상기 여기광 렌즈(340)는 각 광원에 독립적으로 설치될 수도 있지만, 도넛형으로 형성되어 상기 광원 전체를 하나의 렌즈가 커버하는 것일 수도 있다(도 4의 (b)참조). 즉 상기 여기광 렌즈는 각 강원에 독립적으로 설치될 수도 있으며, 하나의 렌즈를 가공하여 도넛형으로 제조하는 것으로 전체의 여기광 렌즈를 일체형으로 제작할 수도 있다.
상기 여기광 렌즈(340)를 일체형으로 제작하는 경우 상기 광원의 상부에는 각각의 돌출부를 형성하는 것이 바람직하다(도 4의 (b)). 이때 상기 돌출부는 일종의 볼록렌즈 역할을 하여 상기 광원에서 발생되는 빛을 한방향으로 모아줄 수 있다. 기존의 도넛형 렌즈의 경우 단면을 반원형으로 제작하는 것으로 광원의 빛을 일정한 방향으로 집중시켰다. 하지만 이러한 기존의 렌즈는 도넛형 렌즈의 단면 방향으로 퍼지는 빛을 모아줄 수 있지만, 렌즈의 접선방향으로 처지는 빛을 모아주는 것에는 한계를 가지고 있다. 따라서 본 발명의 경우 상기 여기광렌즈(340)를 도넛형으로 제작하되, 상기 광원의 상부에 돌출부를 각각 형성하는 것으로 각 광원에 볼록렌즈를 설치한 것과 동일한 효과를 가질 수 있다. 이러한 일체형 여기광렌즈(340)는 각 발광다이오드에 여기광렌즈를 각각 설치하는 것에 비하여 적은 설치비용이 발생할 뿐만 아니라 렌즈의 교환을 한분에 수행할 수 있어 초점거리가 변경되거나 여기광 렌즈의 색상을 변경할 필요가 있는 경우 렌즈 전체를 한번에 교체가능하다는 장점을 가지고 있다.
상기와 같이 여기광 렌즈(340)에 의하여 집광된 여기광은 차폐가이드(320)를 통과할 수 있다(도 3 참조). 상기 차폐 가이드(320)는 상기 광원에서 발생되는 빛 중 수직방향의 빛만을 통과시키는 일종의 필터로서 작동될 수 있다. 위에서 살펴본 바와 같이 상기 광원(310)에서 발생되는 여기광은 상기 여기광 렌즈(340)를 통과하며 일정한 각도로 집광될 수 있다. 하지만 상기 여기광렌즈(340)를 통과하더라도 여기광은 일정한 각도를 가지며 직진하게 된다. 또한 상기 여기광 렌즈를 통과하지 않은 여기광의 경우 주변으로 확산되어 상부로 조사될 수 있다(주변광). 따라서 이러한 주변광 및 일정각도 이상으로 발산되는 여기광을 제거하기 위하여 상기 차폐가이드(320)를 사용하는 것이 바람직하다.
이를 위하여 상기 차폐가이드(320)는, 차폐가이드의 중앙에 형성되며, 시료에서 발생되는 상기 형광신호가 통과하는 중앙가이드부(321); 및 상기 중앙가이드 부의 외측에 일정한 간격으로 설치되며, 상기 광원에서 발생되는 여기광을 통과시키는 여기광 가이드부(322)를 포함할 수 있다.
본 발명의 경우 중앙부에 카메라(100)가 설치되어 있으며, 상기 카메라를 중심으로 상기 광원(310)이 원형으로 배열되고 있다(도 3 참조). 따라서 상기 차폐가이드(320) 역시 이에 대응하기 위한 형상으로 제작되는 것이 바람직하다.
구체적으로 살펴보면, 상기 차폐가이드의 중앙에는 상기 시료에서 발생되는 형광이 통과할 수 있는 중앙가이드부(321)가 형성될 수 있다. 상기 중앙가이드부(321)는 상기 시료와 상기 카메라 사이에 형성되어 시료에서 발생되는 형광이 통과하는 부분으로, 하부에는 상기 카메라가 설치되어 있으며, 상부에는 상기 시료가 위치할 수 있다. 즉 광원의 여기광으로 여기되어 발생되는 시료의 형광은 상기 중앙가이드부를 통하여 상기 카메라로 관찰될 수 있다(도 3 및 도 4의 (a) 참조).
이때 상기 중앙가이드부 하단의 직경은 상기 카메라의 최외곽렌즈(110)와 유사한 직경을 가지는 것이 바람직하다. 상기 중앙가이드부의 직경이 상기 카메라의 최외곽렌즈(110) 보다 과도하게 큰 경우 카메라 렌즈와 상기 중앙가이드부(321) 사이로 빛이 들어와 관찰시 해상도가 떨어질 수 있으며, 반대로 상기 중앙가이드부의 직경이 상기 카메라의 최외곽렌즈(110)보다 과도하게 작은 경우 카메라의 시아가 좁아질 수 있다.
본 발명에서 용어 “카메라의 최외곽렌즈”는 카메라 렌즈 배열에 있어서 가장 외측에 의치하는 렌즈를 의미하는 것으로 일반적으로 외부의 빛이 가장 먼저 접촉되는 렌즈를 의미한다. 일반적으로 이 카메라의 최외곽렌즈의 직경은 렌즈 구경으로 나타낼 수 있다.
또한 상기 중앙가이드부(321)는 상부에서 하부까지 동일한 직경을 가지도록 제작될 수 있지만, 상기 시료의 크기와 상기 카메라의 최외곽렌즈(110)의 크기가 상이한 경우 각각의 크기를 맞추기 위하여 테이퍼 형상을 가지도록 제작될 수도 있다. 즉 상기 카메라의 최외곽렌즈의 직경이 상기 시료가 설치된 시료부의 크기보가 과도하게 큰 경우 상기 시료부측의 직경을 작게 하고 상기 카메라의 최외곽렌즈 부분의 직경을 크게하는 형식으로 제작될 수 있으며, 이 반대도 가능하다. 이를 통하여 상기 시료에서 발생되는 형광을 상기 카메라로 효과적으로 전달하는 것이 가능하다.
상기 중앙가이드부(321)의 외측에는 여기광가이드부(322)가 배열될 수 있다(도 4의 (a) 참조). 상기 여기광가이드부(322)는 상기 광원에서 발생된 여기광이 통과하여 상기 시료에 공급되는 부분으로 상기 중앙가이드부와 동일한 방향으로 형성되어 있지만, 내부를 통과하는 빛의 방향은 반대방향이다.
상기 여기광가이드부(322)에서는 상기 여기광중 일정한 각도를 가지는 여기광을 제외한 나무지 부분을 흡수하여 제거될 수 있다(도 5 참조). 이를 상세히 살펴보면 상기 여기광은 균일한 형광의 발생을 위하여 좁은 각도를 가지도록 조절되어 공급되는 것이 바람직하다. 상기 여기광이 넓은 각도를 가지도록 공급되는 경우 원하는 부분 이외에도 여기광이 공급되어 시료의 형광이외의 빛이 관찰될 수 있으며, 또한 이를 방지하기 위하여 여기광의 조사범위를 줄이게 되면 주변부에 여기광이 공급되지 않는 경우가 발생한다. 따라서 본 발명의 경우 상기 여기광 가이드부(322)를 통과시켜 일정각도이상을 가지는 여기광을 제거하는 것으로 상기 시료릐 형광을 더욱 고해상도로 이미지 획득이 가능하다.
상기 여기광 가이드부(322)의 원리를 좀 더 자세히 살펴보면, 상기 여기광가이드부(322)는 내부가 원통형으로 제작되며, 내부에 여기광이 통과할 수 있다. 이때 상기 여기광의 경우 긴 원통을 통과하고 있으므로, 일정한 각도를 가지는 여기광만이 상기 여기광가이드부의 내부에 반사되지 않고 통과할 수 있으며, 일정각도이상을 가지는 여기광의 경우 상기 여기광가이드부의 내면에 접촉하게 된다. 즉 상기 여기광가이드부의 내면에 광흡수코팅층이 형성되는 경우 상기 여기광가이드부의 벽면에 접촉되는 일정각도이상의 여기광을 제거하는 것이 가능하다(도 5 참조). 기존의 여기광 필터의 경우 단순히 슬릿 또는 도트형상으로 개방된 필터를 사용하고 있지만 이 경우에는 각도를 벗어난 여기광의 제거에 한계를 가질 수 있으며, 또한 통과되는 여기광의 광량이 줄어들게 된다. 따라서 본 발명의 경우 상기 여기광가이드부의 길이를 최적화하여 일정한 각도 미만의 여기광만을 공급하면서도 높은 광량으로 여기광의 공급이 가능하다
이를 위하여 상기 여기광 가이드부(322)는 내부직경을 R, 여기광과 접촉되는 지점부터 최상단까지의 길이를 L이라 할 때 R/L이 0.05~0.5일 수 있다. 상기 여기광 가이드부는 일정한 길이를 가지는 것으로 일정이상의 각도를 가지는 여기광을 제거할 수 있다는 것은 위에서 살펴본 바와 같다. 하지만 상기 여기광 가이드부의 길이가 일정이상으로 길어지는 경우 전체 시스템의 크기가 커질 수 있으며, 시료에 공급되는 여기광의 광량이 줄어들 수 있다(도 6의 두 번째 그림). 또한 여기광 가이드부가 일정길이 미만으로 짧아지는 경우 그 조사범위가 과도하게 넓어져 여기광 가이드의 효과가 떨어질 수 있다(도 6의 세 번째 그림). 다만 상기 여기광 가이드부의 직경이 커지게 되면 통과되는 여기광의 각도가 커지며, 광량 역시 늘어나게 되므로 상기 여기광 가이드부의 길이가 길어져야 된다. 따라서 상기 여기광 가이드부의 내부직경과 길이는 일정한 비율을 가질 수 있다. 상기 R/L이 0.05미만인 경우 상기 여기광 가이드부의 길이가 과도하게 길어져 공급되는 여기광의 광량이 떨어질 수 있으며, R/L이 0.5를 초과하는 경우 공급되는 여기광의 각도가 커지게 되므로 형광 이미지의 해상도가 떨어질 수 있다.
상기 비율에도 불구하고 상기 여기광 가이드부(322)의 내부직경은 2~5mm인 것이 바람직하다. 상기 광원에 사용되는 발광다이오드의 경우 5mm미만의 크기를 가지고 있는 경우가 많으며, 본 발명의 경우에도 기기의 소형화를 위하여 광원(310)으로 발광부가 2~5mm의 크기를 가지는 발광다이오드를 사용하는 것이 바람직하다. 따라서 상기 여기광 가이드부의 내부직경은 상기 발광다이오드의 발광부의 크기와 유사하도록 2~5mm인 것이 바람직하다. 상기 여기광 가이드부(322)의 내부직경이 2mm미만인 경우 통과되는 여기광이 줄어들어 시료의 형광 광량이 부족할 수 있으며, 5mm를 초과하는 경우 기기의 크기가 커짐과 동시에 이미지의 해상도가 떨어질 수 있다. 또한 상기 여기광 가이드부의 내부직경에 적절한 비율을 가질 수 있도록 상기 여기광 가이드부의 길이는 10~50mm일 수 있다. 아울러 상기 여기광 가이드부의 길이는 여기광 가이드부의 전체길이를 의미할 수도 있지만, 여기광과 접촉되는 지점부터 최상단까지의 길이를 의미할 수도 있다.
상기 중앙가이드부(321) 또는 상기 여기광 가이드부(322)의 내측에는 광흡수 코팅층이 형성될 수 있다. 위에서 살펴본 바와 같이 상기 여기광 가이드부의 내부에는 광을 흡수하는 코팅층을 필요로 한다. 또한 이와는 별도로 상기 중앙가이드부의 경우에도 중앙가이드부의 벽면에서 반사되는 이미지를 제거하기 위한 광흡수 코팅층이 형성될 수 있다. 즉 본 발명의 경우 상기 차폐가이드를 통하여 여기광을 공급함과 동시에 형광화상을 획득하고 있지만, 상기 차폐가이드의 벽면에 의한 빛의 반사를 최소화하여 이미지의 해상도 및 정확성을 높일 수 있다. 이때 상기 광흡수 코팅층은 상기 여기광 및 형광을 흡수할 수 있는 코팅층이라면 제한없이 사용할 수 있지만, 바람직하게는 카본블랙, 탄소나노튜브 또는 그래핀을 포함할 수 있다. 상기 카본블랙, 탄소나노튜브 또는 그래핀의 경우 자체적으로 흑색을 가지고 있어 광의 흡수가 용이하며, 특히 상기 탄소 나노튜브의 경우 튜브의 일측에서 입사된 빛을 튜브구조 내부에서 난반사 하며 흡수할 수 있다. 또한 상기 그래핀의 경우 2차원적인 구조를 가지고 있으므로, 입사된 빛은 각 그래핀의 층사이에서 반사되며 흡수될 수 있다. 즉 상기 탄소나노튜브 및 그래핀이 상기 광흡수층에 포함되는 경우 더욱 높은 광흡수효과를 가질 수 있다.
또한 상기 여기광 가이드부(322)는 상기 광원(310)이 각각 독립적으로 설치될 수 있다(도 3 참조). 즉 상기 광원의 경우 각각의 상부에 상기 여기광 가이드부가 하나씩 설치될 수 있으며, 이에 따라 각 광원에서 발생되는 여기광은 상기 여기광 가이드부(322)를 통과하여 시료방향으로 공급되는 것이 바람직하다. 위에 기술한 바와 같이 상기 광원이 2~30개가 설치되는 것이 바람직하므로 상기 여기광 가이드부 역시 2~30개가 설치되는 것이 바람직하다.
또한 상기 광원(310)의 경우 상기 여기광 가이드부(322)의 외부에 설치될 수도 있지만, 상기 광원(310)의 일부 또는 전부가 상기 여기광 가이드부(322)의 내부에 설치될 수도 있다. 상기 광원이 외부에 설치되는 경우 열발산이 용이하며 설치 및 보수가 쉽다는 장점을 가질 수 있지만 상기 여기광 가이드부와의 정렬이 어긋나는 경우 시료로 공급되는 여기광이 줄어들 수 있다. 또한 상기 광원이 상기 여기광 가이드부의 내부에 설치되는 경우에는 전체적인 기기의 크기가 커지며, 광원에서 발생되는 열의 발산이 어려울 수 있다는 장점을 가지지만 한번 상기 광원을 정렬하면 충격을 받는 경우에도 상기 광원의 정렬이 어긋나는 것을 방지할 수 있다.
상기 프리즘(330)은 상기 차폐가이드의 상부에 설치되는 것으로 상기 여기광 가이드부(320)를 통과한 빛(여기광)을 시료방향으로 굴절시킬 수 있다(도 3 참조). 이때 상기 프리즘은 시료의 형광이 관찰되는 것을 방해하지 않도록 상기 차폐가이드의 상부에 도넛형으로 배열되거나 도넛형으로 제작된 프리즘을 사용하는 것이 바람직하다.
도 7의 (a)는 본 발명의 프리즘을 나타낸 것이며 도 7의 (b)는 그 단면을 나타낸 것이다.
상기 프리즘은 상기 여기광을 샘플이 위치하는 중앙방향으로 모아주기 위하여 사용되는 것으로 도 7의 (a)에 나타난 바와 같이 상기 여기광 가이드 부의 상부에 도넛형으로 설치되며, 내측부의 높이가 외측부의 높이보다 높게 제작될 수 있다. 즉 본 발명의 프리즘의 경우 상부가 외측으로 갈수록 낮아지는 사선을 형성할 수 있다. 또한 상기 프리즘의 상부는 수평면 즉 상기 여기광 가이드부와 접촉되는 면과 30~40°, 바람직하게는 31~38°, 가장 바람직하게는 35.5°의 각도를 가질 수 있다. 상기 상부의 각도가 30°미만인 경우 여기광이 중심부로 집중되지 않아 상기 여기광의 균일도가 낮아질 수 있으며, 상기 각도가 40°를 초과하는 경우 주변부의 광량이 줄어들어 또한 균일도가 낮아질 수 있다.
아울러 상기 프리즘의 경우 상기 여기광 가이드부 전체를 커버하기 위하여 내측 부의 높이가 3~8mm 바람직하게는 6~7mm 더욱 바람직하게는 6.4mm일 수 있다. 상기 내측부의 높이가 3mm미만인 경우 상기 여기광 가이드부에서 발생되는 여기광의 전부를 굴절시킬 수 없으며, 8mm를 초과하는 경우 프리즘의 크기가 과도하게 커져 여기광을 제외한 외부 광이 유입되므로 신호대비 잡음비가 낮아질 수 있다.
상기 이미지 획득장치는 0.5~2배율의 형광이미지를 획득하는 것일 수 있다. 기존의 형광 현미경의 경우 낮은 해상도로 인하여 2~100배의 확대된 이미지를 획득하는 것이 일반적이다. 이는 위에서 살펴본 바와 같이 다이크로익 미러를 다수 사용함에 따라 이미지의 해상도가 떨어질 수 있으며, 또한 여기광의 불균형으로 인하여 균일도 및 명확도가 떨어지기 때문이다. 따라서 대부분의 형광현미경은 하나의 웰 또는 전체 표적물질이 부착된 입자의 일부만을 관측대상으로 하고 있다. 하지만 본 발명의 경우 다이크로익 미러의 사용 없이도 균일한 여기광의 공급이 가능하므로 높은 해상도의 화상을 획득할 수 있다. 따라서 본 발명의 경우 기존의 형광현미경과는 달리 0.5~2배율, 바람직하게는 1배율의 화상을 획득할 수 있으며, 이는 전제 시료부의 화상을 동시에 획득 및 분석하는 것이 가능하다는 것을 의미한다.
상기 이미지 획득 장치는 하기의 식 1로 표현되는 균일도(Uniformity)가 70%이상일 수 있다.
[식 1]
균일도 = (이미지 분석 전체 영역중 분할된 각각 픽셀 영역의 형광신호에 대한 min/이미지 분석 전체 영역중 분할된 각각 픽셀 영역의 형광신호에 대한 max) X 100(%)
상기 균일도는 이미지 분석 전체 영역중 분할된 각각 픽셀 영역 중 형광신호에 대한 최대값과 최소값의 차이를 나타내는 것으로 일반적으로 상기 균일도가 높을수록 균일한 광을 공급하는 것으로 알려져 있다. 특히 형광현미경에서는 여기광을 통하여 형광물질을 여기시키며 이때 관측되는 형광의 세기와 양을 통하여 분석을 수행하고 있으므로, 관측가능한 영역내에 균일한 여기광을 공급하는 것이 매우 중요하다. 본 발명의 경우 상기 식 1로 표현되는 균일도가 70%이상, 바람직하게는 80~100%, 더욱 바람직하게는 85~96%일 수 있다. 상기 균일도가 80%미만인 경우 균일한 여기광의 공급이 어려워 추가적인 보정이 필요하거나 불완전하게 관측될 수 있다. 아울러 100%의 경우 전체 영역에 동일한 광이 공급된다는 것을 의미하므로 이 이상의 수치는 불가능하다.
아울러 상기 균일도의 경우 전체 영역의 균일도와 관측 가능한 영역의 균일도로 나뉠 수 있으며(도 8참조), 전체영역의 균일도가 높은 것도 바람직하지만 관측 가능한 영역내의 균일도가 높은 것이 더욱 바람직하다. 특히 형광현미경에 의하여 관측되는 영역은 전체 영역의 픽셀이 아닌 관측가능한 영역의 픽셀에 해당하므로, 관측가능한 영역의 균일도가 80%이상인 것이 바람직하다.
상기 이미지 획득장치는 형광에 대한 민감도(sensitivity)가 기존의 형광현미경 대비 5배 이상일 수 있다. 이때 상기 민감도(sensitivity)는 형광 신호 강도에 대한 평균값으로 MFI(Mean Fluorescence Intensity)로 표기될 수 있다.
일반적으로 형광에 대한 민감도는 동일한 조건에서 높은 형광값이 관측될수록 높아지는 것으로 알려져 있다. 본 발명의 이미지 획득장치의 경우 동일한 배율의 렌즈는 사용하는 조건이라면 기존에 사용되는 저배율 형광현미경 대비 5배 이상 바람직하게는 5~20배, 더욱 바람직하게는 8~12배의 민감도를 가질 수 있다. 즉 본 발명의 이미지 획득장치는 기존의 저배율 형광현미경에 비하여 동일한 조건의 렌즈를 사용하는 경우 5배 이상의 형광값을 얻을 수 있으며, 기존의 형광현미경을 이용하여 본 발명과 동일한 형광값을 얻기 위해서는 배율이 높은 렌즈를 사용하는 고배율 형광현미경을 사용하거나 여기광에 노출되는 시간을 늘려야 한다. 다만 위에서 살펴본 바와 같이 배율이 높은 렌즈를 사용하는 경우 한번에 관측 가능한 영역이 줄어들어 전체 분석시간이 늘어날 수 있으며, 장시간 여기광에 노출시키는 경우 신호대비잡음비가 낮아짐과 동시에 광표백이 발생될 수 있다.
본 발명은 또한 (i) 형광신호 및 광학신호를 검출하기 위한 카메라; (ii) 상기 카메라와 일정간격이 이격되어 설치되는 시료부; (iii) 상기 카메라 방향에서 상기 시료부 방향으로 여기광을 공급하는 형광부; 및 (iv) 상기 시료부에서 상기 카메라의 반대방향으로 일정간격이 이격되어 설치되며 상기 카메라 방향으로 가시광선을 공급하는 광학부를 포함하되, 상기 형광부는, (1) 상기 카메라의 외측에 원형을 이루며 균일한 간격으로 배치된 광원; (2) 상기 광원의 상부에 위치하며, 상기 광원에서 발산되는 빛 중 수직방향의 빛 만을 투과시키는 차폐가이드; 및 (3) 상기 차폐가이드를 통과한 빛을 시료방향으로 굴절시키는 프리즘을 포함하는 표적물질 신호 검출 위한 이미지 획득 장치에 관한 것이다.
일반적인 형광현미경의 경우 시료에서 형광체가 여기되어 발생되는 형광만을 관찰할 수 있다. 하지만 이 경우 발광하지 않은 시료는 관찰이 불가능하며 이에따라 형광의 존재 여부만을 확인할 수 있을 뿐, 시료의 비율 및 종류를 판정하기 위해서는 추가적인 검사를 수행해야 한다. 하지만 광학관찰을 병행하는 경우 방광하지 않은 시료까지 관찰할 수 있어 시료에 포함된 형광의 발광여부를 더욱 용이하게 관찰할 수 있다. 다만 상기 형광신호와 상기 광학신호의 경우 그 형성기전이 상이하므로 각각의 광원을 사용해야 하며, 특히 형광신호의 경우 시료의 형광을 최대화하기 위하여 여기광의 공급을 상기 카메라와 동일한 방향에서 수행해야 하므로 상기 형광 신호의 발생을 위한 여기광 및 상기 광학신호의 발생을 위한 관찰광의 배치를 최적화할 필요가 있다.
본 발명의 경우 상기 광학신호를 이용하여 시료의 위치 및 수량을 특정하면 되므로, 상기 광학신호의 관찰광은 시료의 반대편에서 공급하는 것이 바람직하다(도 3 참조). 기존의 광학현미경의 경우 광원이 대물부에서 공급되어 표면의 형상을 용이하게 관찰하도록 배치하였지만, 본 발명의 경우 시료의 크기, 위치, 수량과 같은 외관만을 관찰하면 되므로, 상기 관찰광을 투과식으로 설치하여도 무방하다. 즉 본 발명의 경우 형광이미지를 위한 여기광은 상기 카메라와 동일한 방향에서 공급되며, 광학이미지를 위한 관찰광은 카메라와 반대방향에서 공급하는 것으로 광학이미지와 형광이미지를 선택적 또는 동시에 획득할 수 있다.
상기 사용되는 형광부(300)의 구성 및 카메라(100)의 구성은 위에서 기제된 바와 동일하므로 생략하기로 한다.
상기 시료부(200)는 시료가 안착되어 고정되는 부분으로 시료가 직접 안착되거나 시료를 포함하는 웰플레이트가 안착될 수 있다(도 1 참조).
화학적, 생화학적, 및/또는 생물학적 분석에 있어서 멀티-웰 플레이트는 다수의 샘플을 처리하고 분석하기 위한 표준 도구이다. 멀티-웰 플레이트는 다양한 형태, 크기 및 모양을 취할 수 있는데, 일반적으로 표준 크기 및 모양으로 만들어지고, 웰들의 표준 배열을 가진다. 웰들의 표준 배열은 96-웰 플레이트(12x8의 웰 배열), 384-웰 플레이트(24x16의 웰 배열), 및 1536-웰 플레이트(48x32의 웰 배열)를 포함하며, 기타 다양한 방식의 상용 멀티-웰 플레이트가 사용될 수 있다. 본 발명의 경우 상기 시료부에 시료를 포함하는 웰 플레이트를 사용하되, 상용 멀티-웰 플레이트와 유사한 규격을 가짐으로써 종래의 다양한 생물학적 분석 기술과 용이하게 호환될 수 있다.
상기 시료는 자성입자를 포함하는 것일 수 있다. 일반적인 면역학적 분석방법에서는 항체에 형광물질을 부착한 다음, 검체를 상기 항체가 포함된 용액에 공급하고, 항원-항체반응을 통하여 항원을 부착시켜 검사를 수행하였다. 하지만 이 경우 경합되지 않은 항체의 분리가 용이하지 못하다는 단점을 가지고 있다. 본 발명의 경우 자성입자에 상기 항체를 부착한 다음 이를 이용하여 항원-항체 반응을 수행하는 것으로 면역진단시 취급을 용이하게 할 수 있다.
이를 위하여 상기 자성입자는 마이크로로드 또는 구형으로 형성된 것일 수 있으며, 바람직하게는 마이크로로드 형상을 가지는 것일 수 있다.
이하 본 발명의 자성입자는 마이크로로드 형상을 가지는 것을 기준으로 설명한다.
본 발명의 자성입자는 자석 반응 금속을 포함하는 코어; 상기 코어를 둘러싸며 균일한 두께를 갖는 쉘 층; 및 생체물질을 포획하기 위해 상기 쉘 층 위에 도입된 포획 프로브를 포함할 수 있다.
상기 코어부는 자석 반응 금속, 바람직하게는 자성금속 또는 자성금속과 합금이 된 금속을 포함할 수 있다. 상기 자성금속은 철 (Fe), 니켈(Ni), 코발트(Co), 망간(Mn)을 포함한 합금일 수 있다. 상기 자석 반응 금속은 철, 니켈, 코발트, 망간 등과 같은 전이금속을 주성분으로 하여 가돌리늄(Gd), 터븀(Tb), 사마륨(Sm) 등과 같은 희토류 금속을 포함할 수 있고, 기타 붕소(B), 규소(Si), 탄소(C) 등을 포함할 수 있다. 상기 자석 반응 금속의 대표적인 예로서 철 합금 또는 코발트 합금을 들 수 있다. 구체적인 철 합금의 예로 Fe70B15Si10C5를 들 수 있고, 코발트 합금의 예로 Co68Mn7Si10B15를 들 수 있다. 또한 상기 자성금속은 구리(Cu), 금(Au), 은(Ag), 철(Fe) 또는 백금(Pt)과 혼합되거나 합금되어 사용될 수 있으며, 더욱 바람직하게는 초상자성 금속을 포함할 수 있다. 상기 코어부는 자성을 직접 가지지는 않지만 자석이 접근함에 따라 자화되어 자석과 인력을 가질 수 있어 자석을 이용한 이동 및 혼합에 유용하게 사용될 수 있다. 다만 본 발명의 경우 강자성체가 아닌 상자성체를 사용하는 것이 바람직한데 이는 자석을 제거하는 경우 각 자성입자 사이의 자성인력이 발생하여 뭉치는 형상을 줄이기 위한 것으로 강자성체를 사용하는 경우 이러한 뭉침 현상으로 인하여 각 입자의 개별적인 형광관찰이 용이하지 않을 수 있다. 따라서 본원발명의 코어부는 강자성입자를 사용하는 것이 바람직하다. 아울러 상기 자성 입자는 영구자석이나 전자석과 같은 외부 자석에 의해 신속하게 수집되거나 분리될 수 있도록 수상에서 부유하지 않는 크기 및 비중을 갖는 것이 바람직하다.
상기 코어는 자성입자 총 부피의 60% 이상을 차지할 수 있다. 예를 들어 코어는 자성입자 총 부피의 60 내지 99%, 바람직하게는 75 내지 99%일 수 있다. 또한 자성입자는 그 크기(예를 들어 직경 또는 길이)가 수십 내지 수백 ㎛ 정도일 수 있으며, 비중은 5 이상, 예를 들어 5이상 30이하인 것이 바람직하다. 자성입자(130)가 1 마이크로미터 미만의 크기를 갖는 나노입자일 경우 높은 비중을 가지는 입자(ex: 철의 경우 7.876)라 하더라도 수중에서 부유할 수 있다. 이 경우 자성입자를 이용하여 웰 내의 생체물질을 검출하는 바이오 어세이 과정에서 자장 인가 시 미세 입자의 낮은 자력으로 말미암아 상기 자성입자의 자성 제어가 원활하지 않아 분리에 어려움을 겪을 수 있다. 면역 반응을 촉진시키기 위해 자석봉을 웰 내에서 상하 이동할 때 미세 입자들의 탈부착이 발생하는데, 자석봉이 상하 이동하는 과정에서 자석봉에 한번 부착된 자성입자들이 낮은 무게로 인하여 자기장을 제거하여도 웰 바닥으로 다시 떨어지지 않고 자석봉에 비특이적 결합으로 계속 잔존할 수 있다. 이 경우 웰 내 생체물질을 검출할 때 정량분석의 재현성이 저하될 수 있다.
한편, 본 자성입자는 중심부에 자석 반응 금속이 있고 그 주위를 둘러싼 쉘 층(shell layer)을 구비함으로써 코어-쉘 구조를 형성하는데, 쉘 층은 유기물 또는 무기물로 이루어질 수 있으며, 바람직하게는 유리(glass)이다.
상기 유리는 소다라임, 보로실리케이트, 알루미노실리케이트, 실리카, 알칼리 실리케이트, 파이렉스 및 석영으로 이루어진 군 중에서 선택되는 화합물이 주성분이 될 수 있다. 바람직하게는 내열성, 내산성, 내수성이 요구되는 실험용이며, 항체와 비특이적 결합이 최소화 될 수 있는 보로실리케이트일 수 있다.
상기 쉘 표면은 친수성 작용기를 포함할 수 있다.
상기 쉘 표면의 경우 여러 가지 작용기를 포함하여 후술할 포획 프로브와 결합될 수 있는데 상기 작용기는 친수성 작용기이며, 상기 친수성 작용기는 실라놀기 또는 실라놀기로부터 유래된 카복실기, 아미노기, 히드록시기, 티올기 또는 알데히드기일 수 있다. 더욱 바람직하게 상기 작용기는 실라놀기 일 수 있다.
또한 상기 친수성 작용기는 상기 포획 프로브와 직접 결합할 수 있지만 바람직하게는 링커를 이용하여 결합될 수 있다. 상기 링커는 상기 친수성 작용기와 상기 포획 프로브 사이에 위치하여 포획 프로브가 상기 쉘 층에 용이하게 부착되도록 하는 것으로 바람직하게는 실란화합물, 더욱 바람직하게는 아미노-실란, 가장 바람직하게는 3-아미노프로필트리메톡시실란(3-Aminopropyltrimethoxysilane, APTES)이 사용될 수 있다.
상기 자성입자는 생체물질(항원)을 포획하기 위하여 상기 쉘 층 위에 도입된 포획 프로브를 포함할 수 있으며, 상기 포획 프로브는 바이오마커를 항원으로 하는 항체일 수 있다.
상기 쉘의 표면에는 1~80개/nm2의 친수성 작용기가 도입될 수 있다.
상기 링커 또는 포획 프로브의 경우 쉘 층의 친수성 작용기과 결합하여 상기 자성입자에 부착되므로, 상기 친수성 작용기의 수에 따라 결합 가능한 링커 또는 포획 프로브의 수가 정해질 수 있다. 따라서 상기 자성입자의 표면에 다수개의 친수성 작용기를 형성하는 경우 많은 양의 링커 또는 프로브를 상기 자성입자의 표면에 부착시키는 것이 가능하다. 이때 상기 친수성 작용기의 밀도가 1개/nm2 미만인 경우 형광 측정시 낮은 형광을 보임에 따라 측정이 어려울 수 있으며, 상기 친수성 작용기의 밀도가 80개/nm2를 초과하는 경우 프로브의 결합시 프로브 사이의 간섭으로 인하여 더 이상의 형광의 증대는 없을 수 있다.
상기 광학부(400)는 상기 시료부에 광학관찰을 위한 가시광선을 공급하는 부분으로 발광다이오드를 이용한 광원을 포함할 수 있다(도 3 참조). 이때 사용되는 광원은 단순히 발광다이오드(LED)를 사용한 광원일 수 있으며, 상기 형광부와는 달리 직진하는 가시광을 발상하게 되므로, 상기 발광다이오드의 전면부에 광학렌즈가 형성된 것을 사용할 수 있다. 즉 상기 형광부의 경우 상기 카메라와의 간섭을 피하기 위하여 차폐가이드를 포함하는 구조물을 사용하였지만, 상기 광학부의 경우 이러한 간섭이 없으므로 단순히 LED조명을 사용하는 것이 가능하다.
이때 상기 광학부(400)의 광원은 전압 1~5V 및 전류 1~50mA의 전력이 공급되며, 광량이 1~100lm으로 조절되는 것일 수 있다. 상기 범위 내에서는 상기 시료의 광학적 관찰이 용이하지만 상기 범위를 초과하는 경우 높은 광량으로 인하여 시료의 정확한 관찰이 어려울 수 있다. 또한 상기 범위 미만인 경우 낮은 광량으로 인하여 상기 시료부에 안착되는 시료의 관찰이 어려울 수 있다.
본 발명은 또한 표적물질 신호 검출 위한 이미지 획득 장치를 이용한 이미지 분석방법으로서, 상기 이미지 획득장치는 (i) 형광신호 및 광학신호를 검출하기 위한 카메라; (ii) 상기 카메라와 일정간격이 이격되어 설치되는 시료부; (iii) 상기 카메라 방향에서 상기 시료부 방향으로 여기광을 공급하는 형광부; 및 (iv) 상기 시료부에서 상기 카메라의 반대방향으로 일정간격이 이격되어 설치되며 상기 카메라 방향으로 가시광선을 공급하는 광학부를 포함하며, ① 표적물질이 결합된 자성입자를 멀티 웰 플레이트의 각 웰에 주입하는 단계; ② 상기 멀티 웰 플레이트를 시료부에 고정하는 단계; ③ 상부 광학부에 전원을 인가하여 광학 이미지를 획득하는 단계; 및 ④ 하부 형광부에 전원을 인가하여 형광 이미지를 획득하는 단계를 포함하는 표적물질 신호 검출 위한 이미지 분석 방법에 관한 것이다.
상기 ①단계는 자성입자의 표면에 표적물질을 결합시킨 다음 이를 윌플레이트에 주입하는 단계이다. 이때 상기 자성입자의 표면은 위에서 살펴본 바와 같이 포획 프로브가 형성되어 있으며, 이때 상기 포획 프로브는 상기 표적물질(항원)과 결합될 수 있다. 다만 이 경우 형광을 이용한 관찰이 불가능하므로 상기 표적물질의 다른 부분에 결합될 수 있는 제2항체를 혼합하되, 상기 제2 항체에는 형광물질이 포함될 수 있다.
위와 같이 제2항체를 사용하는 경우 상기 자성입자의 표면에 항원이 부착된 경우에는 상기 제2항체 역시 상기 항원에 부착되므로, 상기 자성입자는 형광을 발산할 수 있으며, 상기 항원이 부착되지 않는 경우 상기 제2항체 역시 부착되지 않으므로 자성입자는 형광을 발산하지 않는다. 이를 이용하여 각기 다른 길이 또는 크기를 가지는 자성입자에 각각의 포획 프로브를 결합시키게 되면 각 크기에 따라 다른 항원과 경합할 수 있으며, 이는 단순히 형광을 관찰하는 것만으로도 항원의 종류를 판독할 수 있다는 것을 의미한다. 기존의 형광 분석의 경우 형광의 스팩트럼을 분리하여 각 형광의 피크파장을 확인하였으며, 이를 통하여 항원의 종류를 판독하는 복잡한 방법을 사용하였다. 하지만 본 발명의 경우 상기 항원이 부착된 자성입자의 크기를 비교하는 것 만으로도 항원의 종류를 즉각적으로 판정하는 것이 가능하다. 아울러 상기 항원에 부착되지 않은 형광물질의 경우 단순히 세척만으로도 상기 자성입자에서 용이하게 제거될 수 있으므로, 위양성에 의한 형광발산을 최소화 할 수 있다.
상기와 같이 표적물질이 결합된 자성입자는 멀티 월 플레이트의 각 웰에 주입될 수 있다.
상기와 같이 멀티 웰 플레이트가 준비되면 이를 시료부에 고정시킬 수 있다. 상기 시료부의 경우 상기 멀티 웰 플레이트를 결합시킬 수 있는 고정정치가 형성되어 있으므로 이를 이용하여 상기 멀티웰 플레이트를 고정하는 것이 바람직하다.
상기와 같이 멀티 웰 플레이트가 결합되면, 상부의 광학부에 전원을 인가하여 광학이미지를 획득 할 수 있다. 이때 상기 광합부의 광원은 상기 시료부를 기준으로 상기 카메라의 반대편에서 가시광을 공급하므로 상기 자성입자는 표면의 직접적인 관찰보다는 크기 및 수량을 확인할 수 있는 이미지를 획득할 수 있다.
상기와 같인 광학이미지의 획득이 완료된 이후 형광부에 전원을 공급하여 형광이미지를 획득할 수 있다. 위에서 살펴본 바와 같이 본 발명의 형광이미지는 0.5~2배율의 이미지이므로 상기 시료부 전체의 이미지를 동시에 획득할 수 있으며, 이는 기존의 형광현미경에 비하여 대면적의 이미지를 생성함과 동시에 빠른 속도로 이를 분석할 수 있다.
이하, 본 발명의 바람직한 실시예를 첨부한 도면을 참조하여 당해 분야의 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있도록 설명하기로 한다. 또한, 본 발명을 설명함에 있어 관련된 공지의 기능 또는 공지의 구성에 대한 구체적인 설명이 본 발명의 요지를 불필요하게 흐릴 수 있다고 판단되는 경우에는 그 상세한 설명을 생략하기로 한다. 그리고 도면에 제시된 어떤 특징들은 설명의 용이함을 위해 확대 또는 축소 또는 단순화된 것이고, 도면 및 그 구성요소들이 반드시 적절한 비율로 도시되어 있지는 않다. 그러나 당업자라면 이러한 상세 사항들을 쉽게 이해할 것이다.
실시예 1
도 1 및 도 2에 나타난 바와 같이 표적물질 신호 검출 위한 이미지 획득 장치를 준비하였다. 이때 사용된 장치는 아래와 같다.
카메라 : ac1920-40um(Basler)
형광부 광원 : 505nm LED(오스람, LV CRBP.01)
광학부 광원 : 화이트 LED(서울반도체, LW514)
차폐가이드 : 중앙부에 중앙가이드부(내경30mm) 중앙가이드부 외곽에 여기광 가이드부(내경 4mm) 21개 형성, 차폐가이드의 길이는 25mm 전체 외경은 50mm
여기광 렌즈 : 도 4의 (b)에 나타난 바와 같이 돌출부가 광원상부에 형성되도록 제작
실시예 2
상기 실시예 1에서 차폐가이드에 여기광가이드부를 4개만 형성하며 형광부 광원 역시 4개만 사용한 것을 제외하고 동일하게 실시하였다.
실시예 3
상기 실시예 1에서 차폐가이드에 여기광가이드부를 1개만 형성하며 형광부 광원 역시 1개만 사용한 것을 제외하고 동일하게 실시하였다.
실시예 4
상기 실시예 1에서 차폐가이드에 여기광가이드부를 25개 형성하며 형광부 광원 역시 25개 사용한 것을 제외하고 동일하게 실시하였다.
실시예 5
상기 실시예 1에서 상기 차폐가이드의 길이를 10mm로 제작한 것을 제외하고 동일하게 실시하였다.
실시예 6
상기 실시예 1에서 차폐가이드의 길이를 5mm로 제작한 것을 제외하고 동일하게 실시하였다.
실시예 7
상기 실시예 1에서 차폐가이드의 길이를 50mm로 제작한 것을 제외하고 동일하게 실시하였다.
실시예 8
상기 실시예 1에서 차폐가이드의 길이를 60mm로 제작한 것을 제외하고 동일하게 실시하였다.
실시예 9
상기 실시예 1에서 여기광 가이드부의 내부 직경을 2mm로 제작한 것을 제외하고 동일하게 실시하였다.
실시예 10
상기 실시예 1에서 여기광 가이드부의 내부 직경을 1mm로 제작한 것을 제외하고 동일하게 실시하였다.
실시예 11
상기 실시예 1에서 여기광 가이드부의 내부 직경을 5mm로 제작한 것을 제외하고 동일하게 실시하였다.
실시예 12
상기 실시예 1에서 여기광 가이드부의 내부 직경을 8mm로 제작한 것을 제외하고 동일하게 실시하였다.
실시예 13
상기 실시예 1에서 광흡수페인트를 사용하지 않은 것을 제외하고 동일하게 실시하였다.
비교예 1
상기 실시예 1에서 차폐가이드를 사용하지 않은 것을 제외하고 동일하게 실시하였다.
비교예 2
기존에 사용되는 슬릿형 광차단판을 차폐가이드 대신 사용한 것을 제외하고 동일하게 실시하였다.
실험예 1
본 발명에서 이미지 획득 장치에 대한 균일도 분석을 위해 바이오틴(biotin)이 결합된 300 um 크기의 원기둥형 자성 미세입자에 스트렙타아비딘(Streptavidin)과 결합되어 있는 형광물질을 처리하여 준비하였다.
준비된 형광물질 결합 원기둥형 자성 미세입자를 반응 웰(well)부에 넣어 이미지 획득 장치의 형광 측정 모드에서 나타나는 852(가로) x 852(세로) pixel 영역을 6(가로) x 6(세로) 등분하여 형광물질이 결합된 자성미세 입자를 이동해 가며 형광신호를 획득하였다. 총 36 영역의 형광신호에 대한 mix, max 값을 이용하여 균일도(Uniformity)를 분석하였다.
[식 1]
균일도 = (이미지 분석 전체 영역중 분할된 각각 픽셀 영역의 형광신호에 대한 min/이미지 분석 전체 영역중 분할된 각각 픽셀 영역의 형광신호에 대한 max) X 100(%)
균일도(%)-전체 균일도(%)-관찰가능영역
실시예 1 89.87 95.40
실시예 2 77.87 86.83
실시예 3 61.14 76.98
실시예 4 78.49 90.44
실시예 5 77.31 86.69
실시예 6 63.57 71.58
실시예 7 76.32 85.26
실시예 8 64.18 72.45
실시예 9 78.11 81.15
실시예 10 63.16 71.29
실시예 11 74.73 85.28
실시예 12 69.45 72.58
실시예 13 81.59 80.19
비교예 1 65.73 70.75
비교예 2 57.72 63.85
표 1에 나타난 바와 같이 본 발명의 실시예 1(도 8의 (a))의 경우 최소광량과 최대광량의 비를 나타내는 균일도가 높아 광량의 차이가 거의 없는 것으로 나타났다. 하지만 여기광을 발생시키는 형광부 광원의 숫자를 줄이거나(실시예 2, 도 8의 (b)) 하나만 사용하는 경우(실시예 3) 균일도가 낮아지는 것을 확인할 수 있었다. 특히 하나의 광원만을 사용한 실시예 3의 경우 도 9의 (a)에 나타난 바와 같이 관찰가능한 영역의 일측으로 광이 집중되는 것을 확인할 수 있었다. 이와는 반대로 25개의 광원을 사용한 경우(실시예 4) 더 이상의 균일도 상승이 없는 것으로 나타났다.
또한 차폐가이드의 길이를 줄일수록(실시예 5(도 9의(b)) 및 6(도 10의 (a))균일도가 낮아지고 있었으며, 특히 5mm의 두께를 가지는 실시예 6의 경우 균일도가 낮아져 많은 광량의 차이를 보이는 것으로 나타났다(도 10의 (a)참조). 반대로 차폐가이드의 길이를 높이는 경우 즉 여기광가이드부의 길이를 길게 하는 경우 일정이상의 길이를 가지게 되면(실시예 8 길이 60mm) 가이드를 통과하는 여기광의 세기가 약해져 광량의 차이가 발생하는 것으로 나타났다.
여기광 가이드부의 내부직경(내경)을 줄이는 경우(실시예 9, 10)이를 동일하게 확인할 수 있었으며, 특히 내경을 과도하게 줄인 실시예 10의 경우 전체적인 광량이 줄어듬과 동시에 주변부의 광이 약해져 균일도가 대폭감소하는 것으로 나타났다(도 11의 (a) 참조).
이와는 반대로 내경을 늘리는 경우(실시예 11, 12)에도 광량이 줄어드는 것을 확인할 수 있었으며, 특히 내경을 늘린 실시예 11의 경우 균일도가 어느정도 유지되기는 하였지만, 전체적인 광량이 줄어든 것을 확인할 수 있었다(도 11의 (b)). 따라서 상기 여기광 가이드부는 일정 범위 내의 내경 및 길이의 비를 가져야 함을 확인할 수 있었다.
광흡수 페인트를 사용하시 않을 실시예 13의 경우 내부에서 여기광이 난반사되어 통과함에 따라 균일도의 변화가 적은 것으로 나타났다.
차폐가이드를 사용하지 않은 비교예 1(도 12의 (a))의 경우 균일도가 매우 낮게 나타나고 있으며, 여기광이 외부로 유출되어 광찰가능영역 중앙부의 광량이 낮은 것을 확인할 수 있었다. 따라서 본 발명의 차폐가이드를 사용하게 되면 시료 전체에 균일한 여기광을 공급할 수 있다는 것을 확인할 수 있었다. 또한 기존의 슬릿형 광 차단판을 사용한 경우(비교예 2, 도 12의 (b)) 균일도가 많이 감소되는 것을 확인할 수 있었으며, 이는 기존의 슬릿형 광차단판 만으로는 시료에 균일한 광을 공급하지 못한다는 것을 의미한다.
실험예 2
상기 준비된 형광물질 결합 원기둥형 자성 미세입자를 반응 웰(well)부에 넣어 이미지 획득 장치의 형광 측정 모드에서 노출시간(exposure time) 50ms을 주어 1, 4, 10배의 렌즈를 이용하여 측정한 결과를 비교하여 이미지 획득 장치의 분해능을 측정하였다.
도 13에 나타난 바와 같이 본 발명의 실시예 1을 비롯한 실시예 2, 4의 경우 1배율의 렌즈를 사용한 경우에도 높은 분해능을 가지는 사진의 획득이 가능한 것으로 나타났다. 즉 본 발명의 경우 1배율의 렌즈를 사용하여 대면적 촬영이 가능할 뿐만 아니라 이를 확대하여 분석하는 경우에도 정상적으로 분석할 수 있는 분해능을 가질 수 있다.
또한 기존의 형광현미경과의 비교를 위한 실험을 실시하였다. 도 14에 나타난 바와 같이 상기 준비된 형광물질 결합 원기둥형 자성 미세입자를 반응 웰(well)부에 넣어 실시예 1의 이미지 획득 장치 형광 측정 모드에서 노출시간(exposure time) 50, 200, 500 ms을 주어 측정하고, 비교예 3의 경우 동일한 자성 미세입자를 형광현미경 하에서 1, 4, 10, 20배의 렌즈를 이용하여 노출시간(exposure time) 50, 200, 500 ms을 주어 측정한 결과를 비교하였다. 도 14에 나타난 바와 같이 본 발명의 실시예 1은 모든 조건에서 이상없는 이미지의 획득이 가능하였지만, 비교예 3의 경우 본 발명과 동일한 이미지를 획득하기 위해서는 최소 4배 이상의 배율을 가지는 렌즈를 사용하여야 하며, 바람직하게는 10배율의 렌즈를 사용해야지만 정상적인 이미지의 획득이 가능하였다. 즉 본 발명의 경우 1배율의 렌즈를 사용하여 대면적의 고해상도 이미지를 획득하는 것이 가능하지만, 기존의 형광현미경의 경우 낮은 해상도 및 낮은 광량을 가지고 있어 소면적의 이미지만을 획득할 수 있으므로, 본 발명의 경우 대면적의 분석을 빠른 시간내에 수행할 수 있다.
실험예 3
본 발명에서 제조되는 자성 마이크로로드는 대한민국 특허 출원번호 10-2018-0130436에 기재된 내용에 따라 유리-코팅 미세와이어를 제조하였다. 또한, 상기 제조된 자성 마이크로로드를 이용하여 진단시스템의 구성은 대한민국 특허출원번호 10-2020-0123989에 기재된 내용에 따라 진단시스템을 하기의 단계를 거처 구성하여 본 발명의 이미지 획득 장치에 대한 민감도 분석을 수행하였다.
제1단계: 자성 마이크로로드의 제조 및 표면 처리
제2단계: 제1항체가 고정화된 거대 마이크로로드 자성 결합체의 제조
제3단계: 제1창체가 고정화된 거대 마이크로로드의 QC
제4단계: 면역반응 물질의 준비 단계
제5단계: 검체 투하 단계
제6단계: 혼합/가열 단계
제7단계: 세척 단계
제8단계: 검출신호 측정 단계
[GFAP 및 UCHL1 검사]
상기의 방법에서 제작된 RSMP에 coupling된 캡처 항체 (GFAP_cAb_09 및 UCHL1_cAb_02)와 바이오틴(biotin)이 결합된 detection Ab(GFAP_dAb_03 및 UCHL1_dAb_07)를 적용하였다. Hytest 사의 항원 GFAP과 Origene 사의 항원 UCHL1을 PBS 또는 serum에 0, 3.125, 6.25, 12.5, 25, 50, 100, 200, 400, 800, 1600, 3200 pg/ml되게 첨가한 다음 앞에 쓰인 심험예 1과 동일한 방법으로 실험을 실시하였다.
또한, R&D system 사의 GFAP 및 UCHL1 DuoSet ELISA assay 제품과 민감도 비교분석을 수행하였다.
본 발명의 이미지 획득 장치를 상기 진단 시스템에 적용하여 GFAP 및 UCHL1 농도 0~3200 pg/ml에서 시험한 결과를 ELISA와 비교 분석한 결과 ELISA에 비해 40배 높은 민감도를 보이는 것으로 확인되었다(도 15 및 도 16 참조).
실험예 4
본 발명에 의한 이미지 획득장치의 형광에 대한 민감도를 측정하기 위한 실험을 실시하였다. 본 발명과 기존에 사용되는 형광 현미경의 형광이미지를 획득한 다음, 각각의 형광값(MFI)를 비교하였다. 이때 실험방법은 상기 실험예 2와 동일하게 실시하였다
실시예 1 기존 형광 현미경
렌즈 배율(배) 1x 1x 4x 10x 20x
노출시간(ms) 50 31520 3194 8119 12701 13052
200 65202 5833 15664 30708 32703
500 65513 8482 33736 52983 54115
표 2 및 도 14에 나타난 바와 같이 본 발명의 실시예 1은 1x렌즈를 사용하는 경우 기존의 형광현미경 대비 10배 정도의 형광에 대한 민감도를 가지는 것으로 나타났다. 만약 기존의 형광현미경을 이용하여 본 발명과 유사한 형광에 대한 민감도를 가지기 위해서는 10x이상의 확대 렌즈를 사용해야 하며, 노출시간 역시 4배 이상이 필요하다는 것을 확인할 수 있었다.
이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시 양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

Claims (16)

  1. (a) 형광신호 검출을 위한 카메라;
    (b) 상기 카메라의 외측에 원형을 이루며 균일한 간격으로 배치된 광원;
    (c) 상기 광원의 상부에 위치하며, 상기 광원에서 발산되는 빛 중 수직방향의 빛 만을 투과시키는 차폐가이드; 및
    (d) 상기 차폐가이드를 통과한 빛을 시료방향으로 굴절시키는 프리즘;
    을 포함하는 표적물질 신호 검출 위한 이미지 획득 장치.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 차폐가이드는,
    차폐가이드의 중앙에 형성되며, 시료에서 발생되는 상기 형광신호가 통과하는 중앙가이드부; 및
    상기 중앙가이드 부의 외측에 일정한 간격으로 설치되며, 상기 광원에서 발생되는 여기광을 통과시키는 여기광 가이드부;
    를 포함하는 표적물질 신호 검출 위한 이미지 획득 장치.
  3. 제2항에 있어서,
    상기 중앙가이드부 또는 상기 여기광 가이드부의 내측에는 광흡수 코팅층이 형성되어 있는 표적물질 신호 검출 위한 이미지 획득 장치.
  4. 제2항에 있어서,
    상기 여기광 가이드부는 내부직경을 R, 여기광과 접촉되는 지점부터 최상단까지의 길이를 L이라 할 때 R/L이 0.05~0.5인 표적물질 신호 검출 위한 이미지 획득 장치.
  5. 제4항에 있어서,
    상기 여기광 가이드부는 내부직경(R)이 2~5mm이며, 길이(L)이 10~50mm인 표적물질 신호 검출 위한 이미지 획득 장치.
  6. 제2항에 있어서,
    상기 차폐가이드는 2~30개의 여기광 가이드부를 포함하며, 상기 여기광 가이드부 각각에는 상기 광원이 독립적으로 설치된 것인 표적물질 신호 검출 위한 이미지 획득 장치.
  7. 제1항에 있어서,
    상기 광원의 상부에는 상기 광원에서 발생되는 여기광을 집광시키기 위한 여기광렌즈가 형성되어 있는 표적물질 신호 검출 위한 이미지 획득 장치.
  8. 제1항에 있어서,
    상기 이미지 획득장치는 0.5~2배율의 형광이미지를 획득하는 것인 표적물질 신호 검출 위한 이미지 획득 장치.
  9. 제1항에 있어서,
    상기 차폐가이드의 상부에는 상기 차폐가이드를 통과한 여기광을 상기 시료방향으로 굴절시키는 프리즘이 설치된 표적물질 신호 검출 위한 이미지 획득 장치.
  10. 제1항에 있어서,
    상기 광원은 400~700nm 파장의 여기광을 방출하는 발광다이오드(LED)인 표적물질 신호 검출 위한 이미지 획득 장치.
  11. 제1항에 있어서,
    상기 이미지 획득 장치는 하기의 식 1로 표면되는 균일도(Uniformity)가 70%이상인 이미지 획득장치.
    [식 1]
    균일도 = (픽셀 영역의 형광신호에 대한 min/픽셀 영역의 형광신호에 대한 max) X 100(%)
  12. 제1항에 있어서,
    상기 이미지 획득장치는 형광에 대한 민감도(sensitivity)가 기존의 저배율 형광현미경 대비 5배 이상인 이미지 획득장치.
  13. (i) 형광신호 및 광학신호를 검출하기 위한 카메라;
    (ii) 상기 카메라와 일정간격이 이격되어 설치되는 시료부;
    (iii) 상기 카메라 방향에서 상기 시료부 방향으로 여기광을 공급하는 형광부; 및
    (iv) 상기 시료부에서 상기 카메라의 반대방향으로 일정간격이 이격되어 설치되며 상기 카메라 방향으로 가시광선을 공급하는 광학부;
    를 포함하되,
    상기 형광부는,
    (1) 상기 카메라의 외측에 원형을 이루며 균일한 간격으로 배치된 광원;
    (2) 상기 광원의 상부에 위치하며, 상기 광원에서 발산되는 빛 중 수직방향의 빛 만을 투과시키는 차폐가이드; 및
    (3) 상기 차폐가이드를 통과한 빛을 시료방향으로 굴절시키는 프리즘;
    을 포함하는 표적물질 신호 검출 위한 이미지 획득 장치.
  14. 제13항에 있어서,
    상기 시료는 자성입자를 포함하는 것인 표적물질 신호 검출 위한 이미지 획득 장치.
  15. 제14항에 있어서,
    상기 자성입자는 마이크로로드형 또는 구형으로 형성된 것인 표적물질 신호 검출 위한 이미지 획득 장치.
  16. 표적물질 신호 검출 위한 이미지 획득 장치를 이용한 이미지 분석방법으로서,
    상기 이미지 획득장치는 (i) 형광신호 및 광학신호를 검출하기 위한 카메라; (ii) 상기 카메라와 일정간격이 이격되어 설치되는 시료부; (iii) 상기 카메라 방향에서 상기 시료부 방향으로 여기광을 공급하는 형광부; 및 (iv) 상기 시료부에서 상기 카메라의 반대방향으로 일정간격이 이격되어 설치되며 상기 카메라 방향으로 가시광선을 공급하는 광학부를 포함하며,
    ① 표적물질이 결합된 자성입자를 멀티 웰 플레이트의 각 웰에 주입하는 단계;
    ② 상기 멀티 웰 플레이트를 시료부에 고정하는 단계;
    ③ 상부 광학부에 전원을 인가하여 광학 이미지를 획득하는 단계; 및
    ④ 하부 형광부에 전원을 인가하여 형광 이미지를 획득하는 단계;
    를 포함하는 표적물질 신호 검출 위한 이미지 분석 방법.
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