WO2024034644A1 - 核酸前駆体 - Google Patents

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WO2024034644A1
WO2024034644A1 PCT/JP2023/029131 JP2023029131W WO2024034644A1 WO 2024034644 A1 WO2024034644 A1 WO 2024034644A1 JP 2023029131 W JP2023029131 W JP 2023029131W WO 2024034644 A1 WO2024034644 A1 WO 2024034644A1
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atp
formula
substituent
alkyl
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PCT/JP2023/029131
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貴久 穴田
賢 田中
慎吾 小林
道治 河原
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国立大学法人九州大学
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    • A61K31/706—Compounds having saccharide radicals and heterocyclic rings having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. nucleosides, nucleotides containing six-membered rings with nitrogen as a ring hetero atom
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    • C07H19/00—Compounds containing a hetero ring sharing one ring hetero atom with a saccharide radical; Nucleosides; Mononucleotides; Anhydro-derivatives thereof
    • C07H19/02—Compounds containing a hetero ring sharing one ring hetero atom with a saccharide radical; Nucleosides; Mononucleotides; Anhydro-derivatives thereof sharing nitrogen
    • C07H19/04—Heterocyclic radicals containing only nitrogen atoms as ring hetero atom
    • C07H19/16—Purine radicals
    • C07H19/20—Purine radicals with the saccharide radical esterified by phosphoric or polyphosphoric acids
    • C07H19/207—Purine radicals with the saccharide radical esterified by phosphoric or polyphosphoric acids the phosphoric or polyphosphoric acids being esterified by a further hydroxylic compound, e.g. flavine adenine dinucleotide or nicotinamide-adenine dinucleotide

Definitions

  • the present invention generally relates to nucleic acid precursors and pharmaceutical compositions containing the same, and specifically to prodrugified ATP and pharmaceutical compositions containing the same.
  • ATP Adenosine triphosphate
  • ATP is administered intravenously to treat pulmonary hypertension, blood pressure during anesthesia/surgery, lung cancer, multiple organ failure, weight loss associated with cancer, acute renal failure, cystic fibrosis, ischemia, cardiac stress testing, etc.
  • ATP deficiency is one of the main causes of delayed healing of diabetic chronic wounds (Non-Patent Document 2).
  • Non-Patent Document 2 As we age, the energy metabolism function of cells decreases, leading to aging, which is a decline in physical functions, and it has been reported that there is a correlation between the decrease in energy metabolism due to aging and the decrease in intracellular ATP levels. In other words, as we age, the amount of intracellular ATP decreases, and the stress tolerance of cells decreases, causing various age-related diseases.
  • Adenosine derivatives such as ATP have extremely low stability in the blood, with a half-life of about 10 seconds, and are inefficient when administered directly.
  • ATP has a negative charge, it has no cell membrane permeability and hardly enters into cells when applied from outside the cell.
  • ATP ATP alone has low cell membrane permeability, so even when added to cells, it has almost no effect as ATP. Therefore, currently reported ATP delivery methods include encapsulating ATP in lipid bilayer membranes (liposomes) or nanoparticles and introducing them into cells. However, its effectiveness is limited, and it has not reached the level where ATP can be used as a medicine, and there is currently almost no data showing that it can increase intracellular ATP concentration.
  • prodrugified ATP such as phosphoramidated AMP (ATP prodrug) can penetrate cell membranes because of its high hydrophobicity, unlike ATP which cannot penetrate cell membranes.
  • ATP prodrug phosphoramidated AMP
  • the present invention was completed based on the discovery that this compound is a prodrug that undergoes metabolism within cells, converting AMP to ATP and exerting the effect of increasing intracellular ATP levels.
  • Substituent group A When the atom connected to the phosphorus atom is O, formula 1: -OR 1 (In the formula, R 1 is hydrogen, C 1 to C 8 alkyl group, C 1 to C 3 alkylaryl group, CH 3 OCH 2 -, CH 3 OCH 2 CH 2 -, ester group, phenyl group, pyridyl group, selected from benzyl group, indolyl group, and naphthyl group, whose aromatic or heterocyclic ring may be substituted with 1 to 3 functional groups as shown below; halogen, C 1 -C 6 alkyl , C2 - C6 alkenyl, C1 - C6 halogenated alkyl, C1 - C6 alkoxy, C1 - C6 halogenated alkoxy, phenyl, hydroxyC1 - C6 alkyl, C3 - C6 cycloalkyl , C 1 -C 6 alkylcarbonyl, C 3 -
  • R 3 is a substituent bonded to the carboxylic acid moiety of the aminocarboxylic acid in R 2 , and is preferably a linear C 1 -C 6 alkyl group, a branched or cyclic C 3 -C 6 alkyl group, and , preferably, for example, methyl group, ethyl group, n-propyl group, isopropyl group, cyclopropyl group, n-butyl group, isobutyl group, sec-butyl group, tert-butyl group, n-pentyl group, isopentyl group, sec -pentyl group, tert-pentyl group, neopentyl group, 1-methylpentyl group, n-hexyl group, isohexyl group, sec-hexyl group, tert-hexyl group,
  • R2 is an amino acid residue selected from alanine, glycine, isoleucine, leucine, proline, methionine, phenylglycine, phenylalanine, valine, and asparagine
  • formula 2: -R 2 -R 3 In the formula, R 3 is a methyl group, ethyl group, n-propyl group, isopropyl group, cyclopropyl group, n-butyl group, isobutyl group, sec-butyl group, tert-butyl group, n-pentyl group, isopentyl group) group, sec-pentyl group, tert-pentyl group, neopentyl group, 1-
  • ⁇ Pharmaceutical composition> [7] A pharmaceutical composition containing the compound according to any one of [1] to [6], or a pharmaceutically acceptable salt or solvate thereof. [8] The pharmaceutical composition according to [7], for treating or preventing a state of decreased intracellular ATP level. [9] The pharmaceutical composition according to [8], wherein the state of decreased intracellular ATP level is associated with the state of aging and non-alcoholic fatty liver disease and/or hepatitis. [10] The pharmaceutical composition according to [8], wherein the state of decreased intracellular ATP level is a mitochondrial disease, a hypoxic state due to cancer or insufficient blood flow, or a tissue regeneration area accompanied by inflammation.
  • the pharmaceutical composition according to [8], wherein the state of decreased intracellular ATP level is a neurodegenerative disease.
  • the pharmaceutical composition according to [11], wherein the neurodegenerative disease is selected from Parkinson's disease, Alzheimer's disease and ALS.
  • the phosphoramidated AMP of the present invention has high hydrophobicity, it can permeate cell membranes. This compound exerts its effect by undergoing metabolism within cells, converting AMP to ATP, and as a result increases intracellular ATP concentration.
  • Figure 1 shows (S)-2-ethylbutyl 2-(((S)-(((2R,3S4R,5R)-5-(6-amino-9H-purine-9) prepared in Example 1-1.
  • NMR spectrum chart of -yl)-2,2-dimethyltetrahydrofuro[3.4-d][1,3]dioxol-4-yl)methoxy)(phenoxy)phosphoryl)amino)propanoate 400 MHz, 1 H NMR, MeOD.
  • FIG. 2 is an NMR spectrum chart (400 MHz, 1 H NMR, MeOD) of the phosphoramidated AMP (ATP prodrug) prepared in Example 1.
  • FIG. 3 is a chart of FAB MS spectra of ATP prodrugs.
  • FIG. 4 is an NMR spectrum chart (400 MHz, 1 H NMR, MeOD) of the phosphoramidated AMP (ATP prodrug-neo) prepared in Example 2.
  • FIG. 5 is a graph showing the effect of ATP prodrugs on intracellular ATP concentration. In the figure, "proATP” means ATP prodrug.
  • FIG. 6 is a graph showing the effects of adenosine, AMP, ATP, and ATP prodrugs on intracellular ATP concentration.
  • proATP means ATP prodrug.
  • FIG. 7 is a graph showing the effect of ATP prodrugs on intracellular ATP concentration using normal cells.
  • proATP means ATP prodrug.
  • FIG. 8 is a graph showing the effect of increasing ATP on senescent cells and the effect on stress load.
  • FIG. 8(A) is a graph showing the effect of ATP prodrugs on young cells and senescent cells
  • FIG. 8(B) is a graph showing the effect of ATP prodrugs on oxidative stress load on senescent cells.
  • FIG. 8(B) shows the ratio of the cell number, with the cell number in the absence of both hydrogen peroxide and proATP as 100%.
  • proATP means ATP prodrug.
  • FIG. 9 is a graph showing the cytotoxicity of ATP prodrugs using the amount of LDH released as an index.
  • proATP means ATP prodrug.
  • FIG. 10 is a graph showing the amount of intracellular ATP induced by ATP prodrugs in two types of liver cells (established cell lines and primary cells). In the figure, "proATP” means ATP prodrug.
  • FIG. 11 is a graph showing the effect of an AMPK inhibitor on the amount of intracellular ATP caused by an ATP prodrug.
  • proATP means ATP prodrug.
  • FIG. 12 is a graph showing the lifespan extension effect of ATP prodrugs on nematodes.
  • proATP means ATP prodrug.
  • FIG. 13 is a graph showing changes in the amount of ATP in nematodes due to ATP prodrugs.
  • proATP means ATP prodrug.
  • FIG. 14 is a graph showing the effect of ATP prodrug-neo on intracellular ATP concentration.
  • FIG. 15 is a graph showing the lifespan extension effect of ATP prodrug-neo on nematodes.
  • proATP-neo means ATP prodrug-neo.
  • ATP adenosine triphosphate
  • Substituent group A When the atom connected to the phosphorus atom is O, formula 1: -OR 1 (In the formula, R 1 is hydrogen, C 1 to C 8 alkyl group, C 1 to C 3 alkylaryl group, CH 3 OCH 2 -, CH 3 OCH 2 CH 2 -, ester group, phenyl group, pyridyl group, selected from benzyl group, indolyl group, and naphthyl group, whose aromatic or heterocyclic ring may be substituted with 1 to 3 functional groups as shown below; halogen, C 1 -C 6 alkyl , C2 - C6 alkenyl, C1 - C6 halogenated alkyl, C1 - C6 alkoxy, C1 - C6 halogenated alkoxy, phenyl, hydroxyC1 - C6 alkyl, C3 - C6 cycloalkyl , C 1 -C 6 alkylcarbonyl, C 3 -
  • R 2 is a residue in the L form. More preferably, from the viewpoint of hydrolyzability, it is an amino acid residue selected from alanine, glycine, isoleucine, leucine, proline, methionine, phenylglycine, phenylalanine, valine, and asparagine, R 3 is a substituent that binds to the carboxylic acid moiety of the aminocarboxylic acid in R 2 , and is preferably a linear C 1 -C 6 alkyl group, a branched or cyclic one, from the viewpoint of membrane permeability of the drug.
  • C 3 to C 6 alkyl group preferably, for example, methyl group, ethyl group, n-propyl group, isopropyl group, cyclopropyl group, n-butyl group, isobutyl group, sec-butyl group, tert-butyl group, n-pentyl group, isopentyl group, sec-pentyl group, tert-pentyl group, neopentyl group, 1-methylpentyl group, n-hexyl group, isohexyl group, sec-hexyl group, tert-hexyl group, neohexyl group; C 4 -C 8 cycloalkyl group which may be substituted with 1 - C 8 alkyl group; tetrahydropyranyl group; substituted with halogen, C 1 -C 8 alkyl group or C 1 -C 6 alkoxy group a benzyl group which may be
  • Substituent group C When the atom connected to the phosphorus atom is N, it may be a heterocycle, such as a C 3 to C 5 heterocycle, morpholino ring, piperazine ring, thiomorphine ring, or formula 3:
  • R 4 is hydrogen, C 1 -C 8 alkyl group which may be substituted with C 3 -C 6 cycloalkyl group: C 4 -C 8 cycloalkyl group: Tetrahydropyranyl group: halogen, C a benzyl group which may be substituted by a 1 to C 8 alkyl group or a C 1 to C 6 alkyl group; a 2-phenylethyl group which may be substituted by a halogenated phenyl group; or an indole group; be) Cyclic structure shown by ] or a pharmaceutically acceptable salt or solv
  • C 1 -C 8 alkyl group means a group consisting of the indicated number of carbon and hydrogen atoms, containing no unsaturation, and connected to the remainder of the molecule by a single bond. means a straight or branched hydrocarbon chain group. Examples include methyl group, ethyl group, n-propyl group, isopropyl group, isobutyl group, 3-methyl-1-pentyl group, 4-methyl-1-pentyl group, 3,3-dimethyl-1-butyl group, Alkyl groups include, but are not limited to, t-butyl, pentyl, isopentyl, and hexyl.
  • C 1 -C 3 alkylaryl group refers to an aryl group substituted by an alkyl group consisting of the indicated number of carbon atoms and hydrogen atoms.
  • aryl is a general term for the atomic group remaining after removing one hydrogen atom on the aromatic ring of an aromatic hydrocarbon.
  • the aryl group includes, but is not limited to, a phenyl group and a naphthyl group.
  • ester group is a bond -COO- bond formed by dehydration condensation of a hydroxyl group and an acid.
  • C 1 -C 6 alkoxy group means an -O-alkyl group in alkyl as defined above.
  • C1 - C6 alkoxy groups include, but are not limited to, lower alkyl alkoxy, lower cycloalkylalkoxy, and lower bicycloalkoxy.
  • aminocarboxylic acids are not particularly limited as long as they have a structure having an amino group and a carboxylic acid, but are typically amino acid residues.
  • amino acid residue refers to natural or non-natural ⁇ -amino acid and ⁇ -amino acid residues.
  • ⁇ -amino acid residue means the "-CHR-NH- group” in the group of the formula: -C(O)-CHR-NH-, and either the D-configuration or the L-configuration. Contains natural and unnatural amino acids.
  • ⁇ -amino acid includes ⁇ -amino acids having the D-configuration, L-configuration or racemic (D,L) configuration.
  • the amino acid residues have the conventional amino acid configuration, and each amino acid residue moiety can independently exist in "L” or "D" stereoisomeric forms.
  • natural or unnatural amino acids are alanine, arginine, asparagine, aspartic acid, cysteine, glutamine, glutamic acid, glycine, histidine, isoleucine, leucine, lysine, methionine, phenylalanine, proline, serine, threonine, tryptophan, tyrosine, and valine. Can be mentioned.
  • halogen means chloro, bromo, iodo or fluoro.
  • the compound of the present invention may be in the form of a salt, preferably a pharmaceutically acceptable salt, or a solvate.
  • pharmaceutically acceptable salt refers to a salt that, when administered to a subject, is capable of providing (directly or indirectly) a compound described herein. Preparation of salts can be performed by methods known in the art. Preferably, the "pharmaceutically acceptable salt” is one that is physiologically tolerated and typically does not cause allergic or similar untoward reactions (e.g., upset stomach, dizziness, etc.) when administered to humans. Give the molecular part that is not.
  • salts of the compounds provided herein are synthesized by conventional chemical methods from a parent compound containing a basic or acidic moiety.
  • such salts are prepared by combining the free acid or free base form of these compounds with stoichiometric amounts of the appropriate base or acid, for example, in water or an organic solvent, or in a mixture of the two. It is prepared by reacting.
  • non-aqueous media such as ether, ethyl acetate, ethanol, isopropanol or acetonitrile are preferred.
  • acid addition salts include mineral acid addition salts (e.g.
  • hydrochlorides, hydrobromides, hydroiodides, sulfates, nitrates, phosphates), organic acid addition salts such as acetates Mention may be made of maleate, fumarate, citrate, oxalate, succinate, tartrate, malate, mandelate, methanesulfonate and p-toluenesulfonate.
  • alkali addition salts include inorganic salts (e.g. sodium, potassium, calcium, ammonium, magnesium, aluminum, lithium salts), organic alkali salts (e.g. ethylenediamine, ethanolamine, N,N-dialkyleneethanolamine, (including salts of triethanolamine, glucamine, and basic amino acids).
  • solvate refers to any form of an active compound of the present invention in which another molecule, most likely a polar solvent, is connected via a non-covalent bond.
  • solvates include hydrates and alcoholates, such as methanolates.
  • the compounds of the invention may be in crystalline form, either as free compounds or as solvates (eg, hydrates), and both forms are intended to be within the scope of the invention.
  • Methods of solvation are generally known in the art. Suitable solvates are pharmaceutically acceptable solvates. In specific embodiments, the solvate is a hydrate.
  • prodrug refers to the term “prodrug” which has undergone chemical derivatization, such as substitution or addition of further chemical groups, to improve any of its physicochemical properties, such as solubility or Refers to chemical compounds with variable bioavailability. Examples include ester and ether derivatives of the active compound which provide the active compound itself after administration to a subject. Examples of well-known methods of making prodrugs of a given active compound are known to those skilled in the art, and see, for example, Krogsgaard-Larsen et al., Textbook of Drug design and Discovery, Taylor & Francis (April 2002). can be found inside.
  • salts, solvates and prodrugs can be performed by methods known in the art. It is understood that salts, solvates or prodrugs that are not pharmaceutically acceptable are also within the scope of the invention as they may be useful in the preparation of pharmaceutically acceptable salts, solvates or prodrugs. right.
  • ATP prodrug As mentioned above, the phosphoramidated AMP (ATP prodrug) developed in this research is a prodrug that exerts its effect by converting AMP to ATP through metabolism within cells, and the intracellular ATP concentration to rise.
  • various prodrugs have been reported that exert their medicinal effects through similar intracellular metabolism.
  • remdesivir GS 5734
  • an antiviral drug for Ebola virus infection and coronavirus infection is triphosphorylated in cells to exert its medicinal effect (inhibition of virus replication) (ACS Cent. Sci. 2020, 6, 5, 672-683).
  • the expected effects of drugs that can increase the amount of intracellular ATP are as follows. 1. Brings anti-aging effects to cells, tissues, organs, and individuals by compensating for the decrease in ATP level due to aging. It has been reported that the amount of intracellular ATP decreases with age (PNAS, 2006, 103, 1727). Replenishing ATP may reduce oxidative stress damage to cells.
  • Therapeutic drugs for neurodegenerative diseases (Parkinson's disease, Alzheimer's disease, ALS, etc.) In Parkinson's disease, a decrease in ATP due to decreased mitochondrial function is thought to be related to the disease (EBioMedicine, 2017, 22, 225). It may be effective as a therapeutic agent by replenishing ATP, and it may be effective against the onset of ALS due to abnormal intracellular liquid-liquid phase separation.
  • non-alcoholic fatty liver disease and/or hepatitis In non-alcoholic fatty liver disease and/or hepatitis (NAFLD and/or NASH), the mitochondria of liver cells are damaged, resulting in a decrease in intracellular ATP levels and worsening of the condition. It has been reported. If ATP decreased in such liver diseases can be increased, it can be expected to be applied to the prevention and treatment of NAFLD and/or NASH diseases.
  • AMPK activation effect It has been reported that low-molecular-weight drugs known as anti-aging drugs have the effect of activating AMPK. Examples include metformin (B. Onken et al., PLOS ONE, 2010) and resveratrol (JG Wood et al., Nature, 2004).
  • metformin B. Onken et al., PLOS ONE, 2010
  • resveratrol JG Wood et al., Nature, 2004.
  • the ATP prodrug of the present invention has been shown to have a function as an activator of AMP-activated protein kinase (AMPK). It increases the amount of internal ATP, which in turn has anti-aging effects.
  • the present invention in another form, relates to pharmaceutical compositions containing a compound of the present invention, or a pharmaceutically acceptable salt or solvate thereof.
  • the invention in one embodiment in this form, relates to a pharmaceutical composition containing a compound of the invention, or a pharmaceutically acceptable salt or solvate thereof.
  • it is a pharmaceutical composition for treating or preventing a state of decreased intracellular ATP level.
  • the term "treat”, unless otherwise specified, includes reversing, alleviating the disorder or condition to which such term applies, or one or more symptoms of such disorder or condition. , means to inhibit or prevent its progress.
  • the term “treatment” refers to a compound or composition of the invention for reducing or eliminating the symptoms of a low intracellular ATP level condition and/or reducing a low intracellular ATP level condition in an individual. It means administering something. Treatment may be administered before the onset of the disease or condition as a prophylactic measure, or alternatively, treatment may be administered after the onset of the disease.
  • Prevention means any treatment of a disease or condition that prevents clinical symptoms of the disease or condition from occurring.
  • prevention also includes the administration of a therapeutically effective amount of a compound or composition according to the invention to prevent the appearance of symptoms of a disease and/or to prevent intracellular ATP levels from reaching a state of reduced levels. (e.g., pre-exposure prophylaxis).
  • the pharmaceutical composition usually means a drug for treating or preventing a disease, or for testing or diagnosing a disease.
  • the pharmaceutical composition of the present invention can be formulated by methods known to those skilled in the art. For example, it can be used orally or parenterally in the form of a sterile solution or suspension with water or other pharmaceutically acceptable liquid, or parenterally in the form of an injection.
  • pharmacologically acceptable carriers or vehicles specifically sterile water, physiological saline, vegetable oils, emulsifiers, suspending agents, surfactants, stabilizers, flavoring agents, excipients, vehicles, preservatives.
  • the preparations may be formulated by admixture in unit dosage form as required by generally accepted pharmaceutical practice, in appropriate combinations with binders, binders and the like. The amount of active ingredient in these preparations is determined so that an appropriate amount within the indicated range can be obtained.
  • Sterile compositions for injection can be formulated according to conventional pharmaceutical practices using a vehicle such as water for injection.
  • aqueous solutions for injection include physiological saline and isotonic solutions containing glucose and other adjuvants (eg, D-sorbitol, D-mannose, D-mannitol, sodium chloride).
  • glucose and other adjuvants eg, D-sorbitol, D-mannose, D-mannitol, sodium chloride.
  • Appropriate solubilizing agents such as alcohols (ethanol, etc.), polyalcohols (propylene glycol, polyethylene glycol, etc.), and nonionic surfactants (polysorbate 80 (TM), HCO-50, etc.) may be used in combination.
  • oily liquid examples include sesame oil and soybean oil, and benzyl benzoate and/or benzyl alcohol may be used together as a solubilizing agent. They may also be formulated with buffers (eg, phosphate buffers and sodium acetate buffers), soothing agents (eg, procaine hydrochloride), stabilizers (eg, benzyl alcohol and phenol), and antioxidants.
  • buffers eg, phosphate buffers and sodium acetate buffers
  • soothing agents eg, procaine hydrochloride
  • stabilizers eg, benzyl alcohol and phenol
  • antioxidants antioxidants.
  • the prepared injection solution is usually filled into suitable ampoules.
  • composition of the present invention is administered orally or parenterally.
  • the composition can be in the form of an injection, a nasal administration, a pulmonary administration, or a transdermal administration.
  • it can be administered systemically or locally by intravenous injection, intramuscular injection, intraperitoneal injection, subcutaneous injection, etc.
  • the administration method can be selected as appropriate depending on the age and symptoms of the patient.
  • the dosage of the pharmaceutical composition can be set, for example, in the range of 0.0001 mg to 1000 mg per kg of body weight per dose. Alternatively, the dosage may be, for example, 0.001 to 100000 mg per patient, although the present invention is not necessarily limited to these values.
  • the dosage and method of administration vary depending on the patient's weight, age, symptoms, etc., and those skilled in the art can take these conditions into account and set an appropriate dosage and method of administration.
  • the present invention provides a method for treating conditions with decreased intracellular ATP levels, such as aging conditions, non-alcoholic fatty liver disease and/or hepatitis, mitochondrial diseases, hypoxic conditions due to cancer or poor blood flow, and tissue regeneration accompanied by inflammation.
  • a method for treating or preventing a neurodegenerative disease or a neurodegenerative disease comprising administering a compound of the invention to a subject in need of such treatment, preferably and administering an amount to such a subject.
  • the present invention relates to conditions with reduced intracellular ATP levels, such as conditions of aging, non-alcoholic fatty liver disease and/or hepatitis, mitochondrial diseases, hypoxic conditions due to cancer or poor blood flow, and inflammation.
  • the present invention relates to compounds for treating or preventing tissue regeneration areas or neurodegenerative diseases.
  • the present invention treats or prevents conditions in which intracellular ATP levels are reduced, such as aging conditions, mitochondrial diseases, hypoxic conditions due to cancer or poor blood flow, areas of tissue regeneration accompanied by inflammation, or neurodegenerative diseases.
  • Example 1-1 (S)-2-ethylbutyl 2-(((S)-(((2R,3S,4R,5R)-5-(6-amino-9H-purin-9-yl)-2 ,2-dimethyltetrahydrofuro[3.4-d][1,3]dioxol-4-yl)methoxy)(phenoxy)phosphoryl)amino)propanoate
  • Example 1-2 Phosphoramidated AMP (ATP prodrug) (S)-2-Ethylbutyl 2-(((S)-(((2R,3S,4R,5R)-5-(6-amino-9H-purin-9-yl)-3,4-dihydroxytetrahydrofuran- 2-yl)methoxy)(phenoxy)phosphoryl)amino)propanoate
  • the compound (1.2 g, 2 mmol) prepared in Example 1-1 was reacted with 2 ml of 37% hydrochloric acid in THF (10 mL) at 0°C, and after purification with a silica gel column, the title compound (1.5 g, 75%, melting point 129.9°C).
  • Example 2 Phosphoramidated AMP (ATP prodrug-neo)
  • Example 2-1 4-Nitrophenylphosphorodichloridate (1.3 g, 5.1 mmol) purchased from MERCK and L-alanine neopentyl ester hydrochloride (2.0 g, 10.2 mmol) purchased from ACROTEIN were reacted in dichloromethane in the presence of triethylamine at room temperature. I let it happen. After purification with a silica gel column, the desired compound was obtained (0.8 g, 30%).
  • Example 2-2 2',3'-O-isopropylidene adenosine (1.0 g, 3.3 mmol) purchased from Tokyo Kasei was added to the compound synthesized in Example 2-1 (0.6 g, 1.2 mmol) in acetonitrile (20 mL). The reaction was carried out at 50°C in the presence of magnesium chloride and N,N-diisopropylethylamine. After purification with a silica gel column, the desired compound (0.5 g, 79%) was obtained.
  • Example 2-3 The compound (0.53 g, 0.79 mmol) prepared in Example 2-2 was reacted with 2 ml of 37% hydrochloric acid in THF (5 mL) at 0°C, and after purification with a silica gel column, the desired compound (0.1 g, 22%).
  • Test example 1 Effect of ATP prodrugs on intracellular ATP concentration MCF7 (human breast cancer cells) (RIKEN BRC) were seeded at 5000 cells/well (DMEM low glucose, 10% FBS, 1% penicillin/streptomycin), and 3 hours later, Example A solution prepared by dissolving the ATP prodrug prepared in 1 in DMSO at varying concentrations was added. After 1, 2, and 3 days, the amount of DNA was measured using picogreen and converted to the number of cells using a separately prepared standard curve. The amount of ATP was quantified using an ATP measurement kit (Dojindo Chemical Co., Ltd.), and the amount of ATP per cell was calculated. The obtained results are shown in FIG.
  • Figure 5 shows that the amount of intracellular ATP increased in an ATP prodrug concentration-dependent manner, and after 3 days, the amount of intracellular ATP increased to approximately 2.5 times that of the control (ATP prodrug 100 ⁇ M). In this way, intracellular ATP concentration could be increased by converting ATP into a prodrug.
  • Test example 2 Effect of ATP analogs on intracellular ATP concentration Adenosine, AMP, ATP, and ATP prodrugs were added to the medium at 100 ⁇ M to MCF7 cells (5000 cells/well), and ATP was measured 1 and 2 days later. Standardized by quantity. The obtained results are shown in FIG. Figure 6 shows that the amount of intracellular ATP increases only when ATP prodrug is added.
  • Test example 3 Effect on intracellular ATP concentration using normal cells NHDF (human fibroblasts) (Takara Bio) were seeded at 5000 cells/well (DMEM low glucose, 10% FBS, 1% penicillin/streptomycin), and after 3 hours, Solutions in which the ATP prodrug prepared in Example 1 was dissolved in DMSO at varying concentrations were added. One day later, the amount of DNA was measured using picogreen and converted to the number of cells using a separately prepared standard curve. The amount of ATP was quantified using an ATP measurement kit (Dojindo Chemical Co., Ltd.), and the amount of ATP per cell was calculated. The obtained results are shown in FIG.
  • Figure 7 shows that even in normal NHDF cells, addition of the ATP prodrug increased the amount of intracellular ATP in a concentration-dependent manner, and when using the ATP prodrug (200 ⁇ M), the amount increased to 1.7 times that of the control (0 ⁇ M). It shows.
  • Test example 4 Effect of increasing ATP on senescent cells and stress load HDF (human skin cells) (Toyobo) derived from humans aged 75 and 29 were seeded at 5000 cells/well (DMEM low glucose, 10% FBS, 1% penicillin/streptomycin) After 3 hours, 0 or 50 ⁇ M of ATP prodrug dissolved in DMSO was added. (A) Incubated for 24 hours. The amount of DNA was measured using picogreen and converted to the number of cells using a separately prepared standard curve. The amount of ATP was quantified using an ATP measurement kit (Dojindo Chemical Co., Ltd.), and the amount of ATP per cell was calculated.
  • HDF human skin cells
  • FIG. 8(A) shows that the amount of intracellular ATP increased in cells derived from 29-year-olds and 75-year-olds by addition of the ATP prodrug.
  • Figure 8 (B) shows that in cells derived from 75-year-olds, the cell number decreases due to stress load in the absence of ATP prodrug, and the decrease in cell number is suppressed by adding 75 ⁇ M of ATP prodrug. There is. Thus, it was suggested that even in aged cells, the increase in intracellular ATP concentration due to the addition of ATP prodrugs improved stress tolerance.
  • Test example 5 Cytotoxicity of ATP prodrugs NHDF (normal human dermal fibroblasts) were seeded at 5000 cells/well (DMEM/F12, 10% FBS, 1% penicillin/streptomycin), and after 3 hours, cells prepared as in Example 1 were seeded. Solutions of ATP prodrugs dissolved in DMSO at varying concentrations were added. After 24 hours, the amount of LDH (lactate dehydrogenase) released, which is an indicator of cytotoxicity, was quantified using an LDH assay kit (Dojindo Chemical Co., Ltd.), and cytotoxicity was calculated.
  • LDH lactate dehydrogenase
  • Figure 9 shows that even when ATP prodrugs are added to high concentrations (256 ⁇ M), LDH release is low. Thus, it was confirmed that ATP prodrugs have low toxicity to cells.
  • Test example 6 Effect of ATP prodrug on hepatocytes Human hepatoma cells (HepG2) were seeded at 5000 cells/well (DMEM, 10% FBS, 1% penicillin/streptomycin), and after 3 hours, the cells prepared as in Example 1 were seeded. Solutions of ATP prodrugs dissolved in DMSO at varying concentrations were added. After 24 hours, the amount of DNA was measured using picogreen and converted to the number of cells using a separately prepared standard curve. The amount of ATP was quantified using an ATP measurement kit (Dojindo Chemical Co., Ltd.) to yield the amount of ATP per cell.
  • DMEM 10% FBS, 1% penicillin/streptomycin
  • normal porcine hepatocytes were seeded at 5000 cells/well (Hepatocyte Differentiation Environment Hepatp-STIM, 1 ⁇ g/100 mL EGF, 1% penicillin/streptomycin), and after 3 h, ATP prodrugs were added at varying concentrations. A solution in DMSO was added. After 24 hours, the amount of DNA was measured using picogreen. The amount of ATP was quantified using an ATP measurement kit (Dojindo Chemical Co., Ltd.) to yield the amount of ATP.
  • Hepatocyte Differentiation Environment Hepatp-STIM 1 ⁇ g/100 mL EGF, 1% penicillin/streptomycin
  • Test example 7 Evaluation of intracellular ATP amount using AMPK inhibitor 100 ⁇ L of serum medium (DMEM/F12, 10% FBS) was added to a 96-well plate and preconditioned in an incubator for 1 hour. Thereafter, normal human skin fibroblasts were seeded (number of cells seeded: 5 ⁇ 10 3 cells/well). Three hours after seeding, the ATP prodrug prepared in Example 1 (final concentration: 100 ⁇ M) and Dorsomorphin, an AMP-activated protein kinase (AMPK) inhibitor (final concentration 0 or 12.5 ⁇ M was added to each well and cultured at 37°C for 24 hours.
  • serum medium DMEM/F12, 10% FBS
  • Test example 8 Confirmation of lifespan extension effect using model animals (nematodes) Part 1 Preparation of substrate
  • NGM sterilized liquid nematode growth medium
  • an ATP prodrug-containing NGM plate was prepared. At this time, the final concentration of DMSO to NGM was adjusted to 1%.
  • DMSO was also added to NGM plates without ATP prodrugs so that the final DMSO concentration was 1%.
  • Escherichia coli strain OP50 stirred in M9 buffer was applied as bait to the nematodes on the surface of the NGM plate immediately before use in survival analysis.
  • FIG. 12 shows that worms cultured on NGM plates containing ATP prodrugs had an approximately 33% increase in average lifespan over controls. Thus, by adding an ATP prodrug to C. elegans, we were able to extend the average lifespan of C. elegans.
  • the table shows a comparison with other drugs known to be effective in extending the lifespan of nematodes.
  • Comparison of ATP levels in the body of model organisms (nematodes) Cultivation of nematodes and addition of ATP prodrugs to nematodes were performed under the same conditions as for survival analysis. Five nematodes on day 7 of culture, a total of 25 nematodes for each condition, were collected in a 24-well plate supplemented with PBS, and ultrasonic disruption was performed while cooling on ice (1 minute). Thereafter, the crushed solution was collected into a microtube, and after centrifugation (15000 rpm, 30 minutes, 4°C), the supernatant was collected. The amount of ATP in the supernatant was quantified using an ATP measurement kit (Dojindo Chemical Co., Ltd.), and the amount of ATP per nematode was calculated.
  • FIG. 13 shows that the amount of ATP in each nematode cultured on NGM plates containing ATP prodrugs was improved by about 23% over the control. In this way, by adding an ATP prodrug to nematodes, we were able to increase the amount of ATP in nematodes.
  • Test example 9 Effect of ATP prodrug-neo on intracellular ATP concentration HDF75 (75-year-old human dermal fibroblasts) (Cell applications, inc) were seeded at 5000 cells/well (human dermal fibroblast growth medium), 3 hours later. A solution in which the ATP prodrug-neo prepared in Example 2 was dissolved in DMSO at varying concentrations was added. After 24 hours, the amount of DNA was measured using picogreen and converted to the number of cells using a separately prepared standard curve. The amount of ATP was quantified using an ATP measurement kit (Dojindo Chemical Co., Ltd.), and the amount of ATP per cell was calculated.
  • FIG. 14 shows that the ATP prodrug-neo increased the amount of intracellular ATP. In this way, even with the ATP prodrug having a different structure from the ATP prodrug of Example 1, it was possible to increase the intracellular ATP concentration.
  • Test example 10 Confirmation of lifespan extension effect using model animals (nematodes) Part 2 Preparation of substrate Add ATP prodrug-neo prepared in Example 2 dissolved in DMSO to a sterilized liquid nematode growth medium (NGM) kept at 60°C to a final concentration of 200 ⁇ M. By doing so, an NGM plate containing ATP prodrug-neo was prepared. At this time, the final concentration of DMSO to NGM was adjusted to 1%. DMSO was also added to the NGM plate not containing ATP prodrug-neo so that the final DMSO concentration was 1%. Escherichia coli strain OP50 (Escherichia coli strain OP50) stirred in M9 buffer was applied as bait to the nematodes on the surface of the NGM plate immediately before use in survival analysis.
  • NGM sterilized liquid nematode growth medium
  • Figure 15 shows that nematodes cultured on NGM plates containing ATP prodrug-neo had an approximately 26% increase in average lifespan over controls. In this way, by adding proATP-neo to nematodes, we were able to extend the average lifespan of nematodes.
  • the ATP prodrug of the present invention is an epoch-making substance that can artificially increase intracellular ATP.
  • ATP is an energy currency substance that exists in all living things, so the impact of the present invention that can control this concentration is high. , its applicability to medicine is extremely high.

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Abstract

本発明は、細胞内ATPレベル低下状態を処置または予防するための化合物を提供する。　本発明は、式（I）：［式中、XおよびYは同一または異なって、それぞれ、置換基群A：リン原子につながる原子がOの場合、式１：-O-R1（式中、R1は、水素、C1～C8アルキル基、C1～C3アルキルアリール基、CH3OCH2-、CH3OCH2CH2-、エステル基、フェニル基、ピリジル基、ベンジル基、インドリル基、およびナフチル基の中から選ばれ、これらの芳香環または複素環は、1から3個の下記に示す官能基によって置換されていても良い等）で示される基； または、置換基群B：リン原子につながる原子がNの場合、式２：-R2-R3（式中、R2は、アミノカルボン酸として総称される残基等であり、R3は、R2におけるアミノカルボン酸のカルボン酸部分に結合する置換基である） で示される基等）、など］ で示される化合物、またはその製薬的に許容できる塩もしくは溶媒和物、およびそれを含有する医薬組成物に関する。

Description

核酸前駆体
　本特許出願は、日本国特許出願２０２２－１２８１７５（２０２２年８月１０日出願）に基づくパリ条約上の優先権および利益を主張するものであり、ここに引用することによって、上記出願に記載された内容の全体が本明細書中に組み込まれるものとする。
　本発明は一般に、核酸前駆体およびそれを含有する医薬組成物、具体的にはプロドラッグ化ATPおよびそれを含有する医薬組成物に関する。
　単細胞生物からヒトまであらゆる生物は細胞内で代謝を行って生きている。そのエネルギー源となるのがアデノシン三リン酸（ATP）であり、全ての生物が共通して細胞内エネルギー通貨としてATPを利用している。ごく最近、ATPは、細胞内エネルギー通貨としての役割の他に、細胞内で高濃度にタンパク質を溶解させる能力や細胞内で形成される液滴を溶解する能力が注目されている（非特許文献１）。
　ATPは、肺高血圧症、麻酔・手術時の血圧、肺がん、多臓器不全、がんに伴う体重減少、急性腎不全、嚢胞性線維症、虚血、心負荷試験などに静脈内投与され、医薬として用いられることがある。そして、ATP欠乏は、糖尿病性慢性創傷の治癒が遅れる主な原因のひとつである（非特許文献２）。加齢によって細胞のエネルギー代謝機能が低下し、身体機能の低下である老化を招くが、加齢に依るエネルギー代謝の低下と細胞内ATPレベルの低下に相関があることが報告されている。すなわち、加齢に伴って細胞内ATP量が低下していき、細胞のストレス耐性が低下することで様々な加齢性疾患が引き起こされる。
　ATPなどのアデノシン誘導体は血中における半減期が10秒程度と、血中安定性が極めて低く、そのまま投与しても効率は悪い。また、ATPは負電荷を有しているため、細胞膜透過性が無く、細胞外からの適用では細胞内にほとんど入らない性質である。
A. Patel et al., Science, 356, 753-756 (2017) J. Drug Targeting, 2015, 23, 580-596
　ATPだけでは細胞膜透過性が低く、細胞に添加してもATPとしての効果はほとんど見られない。そのため、現在のところ、ATPデリバリー手法として、脂質二重膜（リポソーム）やナノ粒子にATPを封入して細胞内に導入する方法が報告されている。しかしその効果は限定的であり、ATPを医薬として用いるレベルには達しておらず、細胞内ATP濃度を上昇させることができるというようなデータはほとんどないのが現状である。
　このような状況下、ATP細胞内レベルを上昇させるため鋭意研究を行った。
　本発明では、ホスホロアミダート化AMP（ATPプロドラッグ）などのプロドラッグ化ATPは、細胞膜を透過できないATPとは異なり、疎水性が高いため、細胞膜を透過することができる。この化合物は、細胞内で代謝を受けることで、AMPからATPへと変換されて細胞内ATPレベル上昇効果を発揮するプロドラッグであることを発見し、本発明を完成させた。
　従って、本発明は、以下の態様を含む。
＜化合物＞
［１］
　式（I）：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000005
 ［式中、XおよびYは同一または異なって、それぞれ、下記で表される置換基群Aの中から選択される置換基、下記で表される置換基群Bおよび下記で表される置換基群Cの中から選択される置換基である。ただし、XおよびYはともに、置換基群Aの中から選択される置換基ではない。
置換基群A：リン原子につながる原子がOの場合、式１：
-O-R1
（式中、R1は、水素、C1～C8アルキル基、C1～C3アルキルアリール基、CH3OCH2-、CH3OCH2CH2-、エステル基、フェニル基、ピリジル基、ベンジル基、インドリル基、およびナフチル基の中から選ばれ、これらの芳香環または複素環は、1から3個の下記に示す官能基によって置換されていても良い；ハロゲン、C1-C6アルキル、C2-C6アルケニル、C1-C6ハロゲン化アルキル、C1-C6アルコキシ、C1-C6ハロゲン化アルコキシ、フェニル、ヒドロキシC1-C6アルキル、C3-C6シクロアルキル、C1-C6アルキルカルボニル、C3-C6シクロアルキルカルボニル、カルボキシCe-Ceアルキル、ヒドロキシ基、アミノ基、シアノ基、ニトロ基、トリメチルシリル基）
で示される基；
置換基群B：リン原子につながる原子がNの場合、式２：
-R2-R3
（式中、R2は、アミノカルボン酸として総称される残基、好ましくはアミノ酸残基、より好ましくはL体アミノ酸残基であり、さらに好ましくは、アラニン、グリシン、イソロイシン、ロイシン、プロリン、メチオニン、フェニルグリシン、フェニルアラニン、バリン、アスパラギンの中から選ばれるアミノ酸残基であり、
　R3は、R2におけるアミノカルボン酸のカルボン酸部分に結合する置換基であり、好ましくは直鎖状C1～C6アルキル基、分枝状または環状のC3～C6アルキル基であり、好ましくは例えば、メチル基、エチル基、ｎ－プロピル基、イソプロピル基、シクロプロピル基、ｎ－ブチル基、イソブチル基、ｓｅｃ－ブチル基、ｔｅｒｔ－ブチル基、ｎ－ペンチル基、イソペンチル基、ｓｅｃ－ペンチル基、ｔｅｒｔ－ペンチル基、ネオペンチル基、１－メチルペンチル基、ｎ－ヘキシル基、イソヘキシル基、ｓｅｃ－ヘキシル基、ｔｅｒｔ－ヘキシル基、ネオヘキシル基等；C1～C8アルキル基で置換されていることあるC4～C8シクロアルキル基；テトラヒドロピラニル基；ハロゲン、C1～C8アルキル基、またはC1～C6アルコキシ基によって置換されていることのあるベンジル基；ハロゲン化フェニル基によって置換されていることのある2-フェニルエチル基；インドール基である）
で示される基；
置換基群C：リン原子につながる原子がNの場合、複素環であってもよく、例えばC3～C5複素環、モルホリノ環、ピペラジン環、チオモルフィリン環、もしくは式３：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000006
 （式中、R4は水素、C3～C6シクロアルキル基によって置換されていることあるC1～C8アルキル基：C4～C8シクロアルキル基：テトラヒドロピラニル基：ハロゲン、C1～C8アルキル基、またはC1～C6アルキル基アルコキシ基によって置換されていることのあるベンジル基：ハロゲン化フェニル基によって置換されていることのある2-フェニルエチル基、またはインドール基である）
で示される環状構造］
で示される化合物、またはその製薬的に許容できる塩もしくは溶媒和物。
［２］
　置換基群Aにおいて、ハロゲン、C1～C8アルキル基、またはC1-C6アルコキシ基によって置換されていることのあるフェニル基である、［１］記載の化合物、またはその製薬的に許容できる塩もしくは溶媒和物。
［３］
　置換基群Bにおいて、式２：
-R2-R3
（式中、R2は、アラニン、グリシン、イソロイシン、ロイシン、プロリン、メチオニン、フェニルグリシン、フェニルアラニン、バリン、アスパラギンの中から選ばれるアミノ酸残基である）
で示される基である、［１］記載の化合物、またはその製薬的に許容できる塩もしくは溶媒和物。
［４］
　置換基群Bにおいて、式２：
-R2-R3
（式中、R3は、メチル基、エチル基、ｎ－プロピル基、イソプロピル基、シクロプロピル基、ｎ－ブチル基、イソブチル基、ｓｅｃ－ブチル基、ｔｅｒｔ－ブチル基、ｎ－ペンチル基、イソペンチル基、ｓｅｃ－ペンチル基、ｔｅｒｔ－ペンチル基、ネオペンチル基、１－メチルペンチル基、ｎ－ヘキシル基、イソヘキシル基、ｓｅｃ－ヘキシル基、ｔｅｒｔ－ヘキシル基、ネオヘキシル基の中から選ばれる）
で示される基である、［１］記載の化合物、またはその製薬的に許容できる塩もしくは溶媒和物。
［５］
　置換基群Bにおいて、式２：
-R2-R3
（式中、R3は、直鎖状または分枝状のC4～C6アルキル基である）
で示される基である、［１］記載の化合物、またはその製薬的に許容できる塩もしくは溶媒和物。
［６］
　式（II）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000007
 または
　式（III）：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000008
 で示される、［１］記載の化合物、またはその製薬的に許容できる塩もしくは溶媒和物。
＜医薬組成物＞
［７］
　［１］から［６］までのいずれか記載の化合物、またはその製薬的に許容できる塩もしくは溶媒和物を含有する医薬組成物。
［８］
　細胞内ATPレベル低下状態を処置または予防するための、［７］記載の医薬組成物。
［９］
　細胞内ATPレベル低下状態が、老化の状態、ならびに非アルコール性脂肪肝疾患および／または肝炎に関連する、［８］記載の医薬組成物。
［１０］
　細胞内ATPレベル低下状態が、ミトコンドリア病、がんや血流不足による低酸素状態、炎症を伴う組織再生領域である、［８］記載の医薬組成物。
［１１］
　細胞内ATPレベル低下状態が、神経変性疾患である、［８］記載の医薬組成物。
［１２］
　神経変性疾患が、パーキンソン病、アルツハイマー病およびALSの中から選ばれる、［１１］記載の医薬組成物。
　本発明のホスホロアミダート化AMPは、疎水性が高いため、細胞膜を透過することができる。この化合物は、細胞内で代謝を受けることで、AMPからATPへと変換されて効果を発揮し、結果、細胞内ATP濃度を上昇させる。
図１は、実施例１－１にて調製した(S)-2-エチルブチル 2-(((S)-(((2R,3S4R,5R)-5-(6-アミノ-9H-プリン-9-イル)-2,2-ジメチルテトラヒドロフロ[3.4-d][1,3]ジオキソル-4-イル)メトキシ)(フェノキシ)ホスホリル)アミノ)プロパノエートのNMRスペクトルのチャート（400 MHz, 1H NMR, MeOD）である。 図２は、実施例１にて調製したホスホロアミダート化AMP（ATPプロドラッグ）のNMRスペクトルのチャート（400 MHz, 1H NMR, MeOD）である。 図３は、ATPプロドラッグのFAB MSスペクトルのチャートである。 図４は、実施例２にて調製したホスホロアミダート化AMP（ATPプロドラッグ-neo）のNMRスペクトルのチャート（400 MHz, 1H NMR, MeOD）である。 図５は、ATPプロドラッグの細胞内ATP濃度に対する効果を示すグラフである。図中、「proATP」は、ATPプロドラッグを意味する。
図６は、アデノシン、AMP、ATP、およびATPプロドラッグによる細胞内ATP濃度に対する効果を示すグラフである。図中、「proATP」は、ATPプロドラッグを意味する。 図７は、正常細胞を用いた細胞内ATP濃度に対するATPプロドラッグの効果を示すグラフである。図中、「proATP」は、ATPプロドラッグを意味する。 図８は、老化細胞へのATP増加効果とストレス負荷に対する効果を示すグラフである。図８（A）は若年細胞および老化細胞におけるATPプロドラッグの効果を示すグラフ、および図８（B）は老化細胞に対する酸化ストレス負荷に対するATPプロドラッグの効果を示すグラフである。図８（B）の縦軸は、過酸化水素およびproATPがともに存在しない場合の細胞数を100％としての細胞数の割合を示す。図中、「proATP」は、ATPプロドラッグを意味する。 図９は、LDH放出量を指標としてATPプロドラッグの細胞毒性を調べたグラフである。図中、「proATP」は、ATPプロドラッグを意味する。 図１０は、2種類の肝臓細胞（株化細胞および初代細胞）におけるATPプロドラッグによる細胞内ATP量を示すグラフである。図中、「proATP」は、ATPプロドラッグを意味する。
図１１は、ATPプロドラッグによる細胞内ATP量に対するAMPK阻害剤の効果を示すグラフである。図中、「proATP」は、ATPプロドラッグを意味する。 図１２は、ATPプロドラッグによる線虫の寿命延長効果を示すグラフである。図中、「proATP」は、ATPプロドラッグを意味する。 図１３は、ATPプロドラッグによる線虫内ATP量の変化を示すグラフである。図中、「proATP」は、ATPプロドラッグを意味する。 図１４は、ATPプロドラッグ-neoの細胞内ATP濃度に対する効果を示すグラフである。 図１５は、ATPプロドラッグ-neoによる線虫の寿命延長効果を示すグラフである。図中、「proATP-neo」は、ATPプロドラッグ-neoを意味する。
　あらゆる生物の細胞内エネルギー通貨として知られているアデノシン三リン酸（ATP）の前駆物質を発明した。この化合物は細胞外ではATPとしての活性を有さないが、細胞膜を透過して細胞内に入ると酵素反応および加水分解により、ATPへと変換されることでエネルギー通貨として機能する。
＜化合物＞
　本発明は、一つの形態として、
　式（I）：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000009
 ［式中、XおよびYは同一または異なって、それぞれ、下記で表される置換基群Aの中から選択される置換基、下記で表される置換基群Bおよび下記で表される置換基群Cの中から選択される置換基である。ただし、XおよびYはともに、置換基群Aの中から選択される置換基ではない。
置換基群A：リン原子につながる原子がOの場合、式１：
-O-R1
（式中、R1は、水素、C1～C8アルキル基、C1～C3アルキルアリール基、CH3OCH2-、CH3OCH2CH2-、エステル基、フェニル基、ピリジル基、ベンジル基、インドリル基、およびナフチル基の中から選ばれ、これらの芳香環または複素環は、1から3個の下記に示す官能基によって置換されていても良い；ハロゲン、C1-C6アルキル、C2-C6アルケニル、C1-C6ハロゲン化アルキル、C1-C6アルコキシ、C1-C6ハロゲン化アルコキシ、フェニル、ヒドロキシC1-C6アルキル、C3-C6シクロアルキル、C1-C6アルキルカルボニル、C3-C6シクロアルキルカルボニル、カルボキシCe-Ceアルキル、ヒドロキシ基、アミノ基、シアノ基、ニトロ基、トリメチルシリル基）
で示される基；
置換基群B：リン原子につながる原子がNの場合、式２：
-R2-R3
（式中、R2は、アミノカルボン酸として総称される残基、好ましくはアミノ酸残基である。これは、加水分解後の細胞毒性の観点から好ましい。また、代謝効率の観点からL体であることが特に好ましい。より好ましくは、加水分解性の観点から、アラニン、グリシン、イソロイシン、ロイシン、プロリン、メチオニン、フェニルグリシン、フェニルアラニン、バリン、アスパラギンの中から選ばれるアミノ酸残基であり、
　R3は、R2におけるアミノカルボン酸のカルボン酸部分に結合する置換基であり、好ましくは、ドラッグの膜透過性の観点から直鎖状C1～C6アルキル基、分枝状または環状のC3～C6アルキル基であり、好ましくは例えば、メチル基、エチル基、ｎ－プロピル基、イソプロピル基、シクロプロピル基、ｎ－ブチル基、イソブチル基、ｓｅｃ－ブチル基、ｔｅｒｔ－ブチル基、ｎ－ペンチル基、イソペンチル基、ｓｅｃ－ペンチル基、ｔｅｒｔ－ペンチル基、ネオペンチル基、１－メチルペンチル基、ｎ－ヘキシル基、イソヘキシル基、ｓｅｃ－ヘキシル基、ｔｅｒｔ－ヘキシル基、ネオヘキシル基等；C1～C8アルキル基で置換されていることのあるC4～C8シクロアルキル基；テトラヒドロピラニル基；ハロゲン、C1～C8アルキル基、またはC1～C6アルコキシ基によって置換されていることのあるベンジル基；ハロゲン化フェニル基によって置換されていることのある2-フェニルエチル基；インドール基である。この中で直鎖状、分枝状のC4～C6アルキル基が好ましい。
で示される基；
置換基群C：リン原子につながる原子がNの場合、複素環であってもよく、例えばC3～C5複素環、モルホリノ環、ピペラジン環、チオモルフィリン環、もしくは式３：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000010
 （式中、R4は水素、C3～C6シクロアルキル基によって置換されていることのあるC1～C8アルキル基：C4～C8シクロアルキル基：テトラヒドロピラニル基：ハロゲン、C1～C8アルキル基、またはC1～C6アルキル基アルコキシ基によって置換されていることのあるベンジル基：ハロゲン化フェニル基によって置換されていることのある2-フェニルエチル基、またはインドール基である）
で示される環状構造］
で示される化合物、またはその製薬的に許容できる塩もしくは溶媒和物に関する。
　式（I）中、XおよびYは同一または異なって、それぞれ、置換基群A、置換基群Bおよび置換基群Cの中から選択される置換基であるが、ただし、XおよびYはともに、置換基群Aの中から選択される置換基ではない。従って、XおよびYにおける置換基群の選択肢は、次の通りである：
・XおよびY＝置換基群Aの置換基および置換基群Bの置換基
・XおよびY＝置換基群Aの置換基および置換基群Cの置換基
・XおよびY＝置換基群Bの置換基および置換基群Aの置換基
・XおよびY＝置換基群Bの置換基および置換基群Bの置換基
・XおよびY＝置換基群Bの置換基および置換基群Cの置換基
・XおよびY＝置換基群Cの置換基および置換基群Aの置換基
・XおよびY＝置換基群Cの置換基および置換基群Bの置換基
・XおよびY＝置換基群Cの置換基および置換基群Cの置換基
　本明細書において、「C1～C8アルキル基」の用語は、指示されている数の炭素原子と水素原子からなり、不飽和を含まず、分子の残りの部分に単結合によって接続している直鎖または分枝鎖の炭化水素鎖基を意味する。例としては、メチル基、エチル基、ｎ－プロピル基、イソプロピル基、イソブチル基、3－メチル－1－ペンチル基、4－メチル－1－ペンチル基、3,3－ジメチル－1－ブチル基、ｔ－ブチル基、ペンチル基、イソペンチル基およびヘキシル基のようなアルキル基が挙げられるが、これらに限定されない。
　本明細書において、「C1～C3アルキルアリール基」の用語は、指示されている数の炭素原子と水素原子からなるアルキルによって置換されているアリール基を意味する。「アリール」の用語は、芳香族炭化水素の芳香環上の水素原子1個を除いた残りの原子団の総称である。本発明の一実施形態では、アリール基は、フェニル基やナフチル基が挙げられるが、これらに限定されない。
　本明細書において、「エステル基」は、水酸基と酸が脱水縮合してできた結合-COO-結合である。
　本明細書において、「C1-C6アルコキシ基」の用語は、上記のように定義されるアルキルにおける、－O－アルキル基を意味する。C1-C6アルコキシ基としては、低級アルキルアルコキシ、低級シクロアルキルアルコキシ、および低級ビシクロアルコキシが挙げられるが、これらに限定されない。
　本明細書において、「アミノカルボン酸として総称される残基」とは、アミノ基とカルボン酸を有する構造であれば特に限定されないが、代表的にはアミノ酸残基である。
　本明細書において、「アミノ酸残基」の用語は、天然または非天然のα－アミノ酸およびβ－アミノ酸残基を意味する。
　「α－アミノ酸残基」の用語は、式：－C(O)－CHR－NH－の基における「－CHR－NH－の基」を意味し、D－立体配置またはL－立体配置いずれかの天然アミノ酸および非天然アミノ酸を含む。「α－アミノ酸」は、D－立体配置、L－立体配置またはラセミ(D,L)立体配置を有するα－アミノ酸を含む。本発明において、アミノ酸残基は、通常のアミノ酸の立体配置を有し、それぞれのアミノ酸残基部分は独立して、「L」または「D」型の立体異性体形態で存在することができる。天然または非天然アミノ酸の例として、アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン、グルタミン酸、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リシン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、トレオニン、トリプトファン、チロシン、バリンが挙げられる。
　本明細書において、「ハロゲン」の用語は、クロロ、ブロモ、ヨードまたはフルオロを意味する。
　上記各定義における「置換されてもよい」とは、置換基が、置換可能な(炭素原子およびヘテロ原子を含む)任意の位置で、1個以上の置換基でさらに置換されていてもよいことを意味する。
　本発明の化合物は、塩、好ましくは製薬的に許容できる塩の形態、または溶媒和物の形態であってもよい。
　「製薬的に許容できる塩」の用語は、被検者に投与すると、本明細書に記載の化合物を(直接的または間接的に)与えることができる塩を意味する。塩の調製は、当該技術分野で既知の方法によって行うことができる。好ましくは、「製薬的に許容できる塩」は、ヒトに投与したとき、生理学的に忍容され、典型的にはアレルギー反応または同様の不都合な反応(例えば、胃のむかつき、めまいなど)を起こさない分子部分を与える。
　例えば、本明細書にて提供される化合物の製薬的に許容できる塩は、塩基性部分または酸性部分を含む親化合物から従来の化学方法によって合成される。一般的に、このような塩は、例えば、水中または有機溶媒中、またはこの2つの混合物中、これらの化合物の遊離酸または遊離塩基の形態と、化学量論量の適切な塩基または酸とを反応させることによって調製される。一般的に、エーテル、酢酸エチル、エタノール、イソプロパノールまたはアセトニトリルのような非水系媒体が好ましい。酸付加塩の例としては、鉱物酸付加塩(例えば、塩酸塩、臭化水素酸塩、ヨウ化水素酸塩、硫酸塩、硝酸塩、リン酸塩)、有機酸付加塩、例えば、酢酸塩、マレイン酸塩、フマル酸塩、クエン酸塩、シュウ酸塩、コハク酸塩、酒石酸塩、リンゴ酸塩、マンデル酸塩、メタンスルホン酸塩およびｐ－トルエンスルホン酸塩が挙げられる。アルカリ付加塩の例としては、無機塩(例えば、ナトリウム、カリウム、カルシウム、アンモニウム、マグネシウム、アルミニウム、リチウムの塩)、有機アルカリ塩(例えば、エチレンジアミン、エタノールアミン、N,N－ジアルキレンエタノールアミン、トリエタノールアミン、グルカミン、塩基性アミノ酸の塩を含む)が挙げられる。
　本発明によれば、「溶媒和物」の用語は、別の分子(ほとんどの場合、極性溶媒であると思われる)が非共有結合を介して接続した本発明の活性化合物の任意の形態を意味すると理解すべきである。このような溶媒和物の例としては、水和物およびアルコラート、例えば、メタノラートが挙げられる。
　本発明の化合物は、遊離化合物または溶媒和物(例えば、水和物)のいずれかとして、結晶形態であってもよく、両方の形態が本発明の範囲内にあることが意図されている。溶媒和の方法は、一般的に当該技術分野で知られている。適切な溶媒和物は、製薬的に許容できる溶媒和物である。具体的な実施形態では、溶媒和物は水和物である。
　「プロドラッグ」の用語は、本明細書で使用する場合、さらなる化学基の置換または付加のような化学誘導体化を受け、医薬用途のために、その物理化学特性のいずれか、例えば、溶解度またはバイオアベイラビリティが変化する化学化合物を意味する。例えば、被検者に投与した後、活性化合物自体を与える活性化合物のエステル誘導体およびエーテル誘導体が挙げられる。所与の活性化合物のプロドラッグを製造するよく知られた方法の例は、当業者なら知っており、例えば、Krogsgaard－Larsenら、Textbook of Drug design and Discovery, Taylor & Francis (2002年4月)中に見いだすことができる。
　塩、溶媒和物およびプロドラッグの調製は、当該技術分野で既知の方法によって行うことができる。医薬的に許容されない塩、溶媒和物またはプロドラッグも、製薬的に許容できる塩、溶媒和物またはプロドラッグの調製に有用な場合があるため、本発明の範囲内にあることが理解されるだろう。
　本研究で開発したホスホロアミダート化AMP（ATPプロドラッグ）は上記の通り、細胞内で代謝を受けることでAMPからATPへと変換されて効果を発揮するプロドラッグであり、細胞内ATP濃度を上昇させる。これまでに同様の細胞内代謝によって薬効を発揮する種々のプロドラッグ報告されている。例として、エボラウイルス 感染症やコロナウイルス感染症に対する抗ウイルス治療薬であるレムデシビル（ GS 5734 は細胞内で三 リン酸化されて薬効を発揮する（ウイルス複製の阻害）（ACS Cent. Sci. 2020, 6, 5, 672-683）。
　細胞内ATP量を上げることができる医薬（プロドラッグ）により期待される効果は次の通りである。
１. 加齢によるATP量低下を補うことで細胞、組織、臓器、個体に抗老化作用をもたらす。
　加齢とともに細胞内ATP量が減少することが報告されている（PNAS, 2006, 103, 1727）。ATPを補充することで細胞への酸化ストレスダメージを軽減することができる可能性がある。
２. 神経変性疾患（パーキンソン病、アルツハイマー病、ALSなど）に対する治療薬
　パーキンソン病ではミトコンドリア機能低下によるATP減少が、病気と関連があると考えられている（EBioMedicine, 2017, 22, 225）。ATPを補充することで有効か治療薬となる可能性、および細胞内液液相分離異常によるALS発症に有効な可能性がある。
３. 低酸素によるATP欠乏を補充することで三次元培養における細胞生存率や機能の維持への効果
　酸素が欠乏するとATP産生量が大幅に減少し、細胞が壊死してしまうため、ATP補充によりこれを抑制できる可能性がある。
４. 組織再生におけるATP補充効果
　リポソームにATPを内包させてデリバリーする報告がある（The American Journal of Surgery (2010) 199, 823-832）。
　皮膚やその他組織の欠損領域へATPを補充することで組織再生を促進することができる可能性がある。
　上記の通り、ATPを人為的に補充することができ、その効果が確かめられれば様々な応用が期待できる。本発明は、新たなATPセラピーを提案するものである。
５．非アルコール性脂肪肝疾患および／または肝炎に対する治療効果
　非アルコール性脂肪肝疾患および／または肝炎（NAFLDおよび／またはNASH）において肝臓細胞のミトコンドリアが障害を受け、細胞内ATP量減少、病態悪化が多く報告されている。このような肝疾患で減少したATPを向上させることができれば、NAFLDおよび／またはNASH疾患の予防、治療への応用可能性が期待できる。
６．AMPK活性化効果
　抗老化薬として知られている低分子薬物にはAMPKを活性化する作用があること報告されている。例えば、メトホルミン（B. Onken et al., PLOS ONE, 2010）やレスベラトロール（JG Wood et al., Nature, 2004）が挙げられる。本発明のATPプロドラッグは、AMP-活性化プロテインキナーゼ（AMPK: AMP-activated protein kinase）活性化剤としての機能があることが示されたことから、本発明化合物にはAMPKを活性化し、細胞内ATP量を増加させ、ひいては抗老化効果を示す。
＜医薬組成物＞
　本発明は、別の形態として、本発明の化合物、またはその製薬的に許容できる塩もしくは溶媒和物を含有する、医薬組成物に関する。
　この形態における一実施態様では、本発明は、本発明の化合物、またはその製薬的に許容できる塩もしくは溶媒和物を含有する医薬組成物に関する。具体的には、細胞内ATPレベル低下状態を処置または予防するための医薬組成物である。
　本発明において、「処置する」の用語は、別段指定されない限り、このような用語が適用される障害もしくは状態、またはこのような障害もしくは状態の１つまたは複数の症状を、逆転する、軽減する、その進行を阻害する、または防止することを意味する。一つの実施形態では、「処置」の用語は、細胞内ATPレベル低下状態の症状を軽減もしくは排除する、および／または個体における細胞内ATPレベル低下状態を低減するための、本発明の化合物または組成物の投与を意味する。処置は、予防的措置として疾患または状態の発症前に施してもよいし、あるいはまた、処置は、疾患の発症後に施してもよい。
　「予防する」は、疾患または状態の臨床症状を生じさせないようにする、疾患または状態の任意の処置を意味する。「予防」の用語はまた、疾患の症状の出現を防止する、および／または細胞内ATPレベル低下状態のレベルに達するのを防止するための、治療有効量の本発明による化合物または組成物の投与（例えば、曝露前予防）を包含する。
　本発明において医薬組成物とは、通常、疾患の処置もしくは予防、あるいは検査・診断のための薬剤を意味する。
　本発明の医薬組成物は、当業者に公知の方法で製剤化することが可能である。例えば、水もしくはそれ以外の薬学的に許容し得る液との無菌性溶液、または懸濁液剤の形で経口、非経口的に、また注射剤の形で非経口的に使用できる。例えば、薬理学上許容される担体もしくは媒体、具体的には、滅菌水や生理食塩水、植物油、乳化剤、懸濁剤、界面活性剤、安定剤、香味剤、賦形剤、ベヒクル、防腐剤、結合剤などと適宜組み合わせて、一般に認められた製薬実施に要求される単位用量形態で混和することによって製剤化することが考えられる。これら製剤における有効成分量は、指示された範囲の適当な容量が得られるように設定する。
　注射のための無菌組成物は注射用蒸留水のようなビヒクルを用いて通常の調剤に従って処方することができる。
　注射用の水溶液としては、例えば生理食塩水、ブドウ糖やその他の補助薬 (例えばD－ソルビトール、D－マンノース、D－マンニトール、塩化ナトリウム) を含む等張液が挙げられる。適当な溶解補助剤、例えばアルコール (エタノール等) 、ポリアルコール (プロピレングリコール、ポリエチレングリコール等) 、非イオン性界面活性剤 (ポリソルベート80 (TM) 、HCO－50等) を併用してもよい。
　油性液としてはゴマ油、大豆油があげられ、溶解補助剤として安息香酸ベンジルおよび／またはベンジルアルコールを併用してもよい。また、緩衝剤 (例えば、リン酸塩緩衝液および酢酸ナトリウム緩衝液)、無痛化剤 (例えば、塩酸プロカイン)、安定剤 (例えば、ベンジルアルコールおよびフェノール)、酸化防止剤と配合してもよい。調製された注射液は通常、適当なアンプルに充填する。
　本発明の医薬組成物は、経口もしくは非経口投与により投与される。例えば、注射剤型、経鼻投与剤型、経肺投与剤型、経皮投与型の組成物とすることができる。例えば、静脈内注射、筋肉内注射、腹腔内注射、皮下注射などにより全身または局部的に投与することができる。
　投与方法は、患者の年齢、症状により適宜選択することができる。医薬組成物の投与量は、例えば、１回につき体重1kgあたり0.0001mgから1000mgの範囲に設定することが可能である。または、例えば、患者あたり0.001～100000mgの投与量とすることもできるが、本発明はこれらの数値に必ずしも制限されるものではない。投与量および投与方法は、患者の体重、年齢、症状などにより変動するが、当業者であればそれらの条件を考慮し適当な投与量および投与方法を設定することが可能である。
　本発明は別の態様として、細胞内ATPレベル低下状態、例えば老化の状態、非アルコール性脂肪肝疾患および／または肝炎、ミトコンドリア病、がんや血流不足による低酸素状態、炎症を伴う組織再生領域または神経変性疾患を処置もしくは予防するための方法であって、本発明の化合物を、そのような処置等を必要としている対象に投与することを含む方法、好ましくは、本発明の化合物の有効量をそのような対象に投与することを含む方法に関する。
　さらに、本発明は別の態様として、細胞内ATPレベル低下状態、例えば老化の状態、非アルコール性脂肪肝疾患および／または肝炎、ミトコンドリア病、がんや血流不足による低酸素状態、炎症を伴う組織再生領域または神経変性疾患を処置もしくは予防するための本発明の化合物に関する。
　本発明はさらなる別の態様として、細胞内ATPレベル低下状態、例えば老化の状態、ミトコンドリア病、がんや血流不足による低酸素状態、炎症を伴う組織再生領域または神経変性疾患を処置もしくは予防するための医薬を製造するための、本発明の化合物の使用に関する。
　以下、本発明を実施例により、詳細に説明するが、これらは本発明の範囲を限定するものでなく、単なる例示であることに留意すべきである。
実施例１
ホスホロアミダート化AMP（ATPプロドラッグ）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000011
実施例１－１：(S)-2-エチルブチル 2-(((S)-(((2R,3S,4R,5R)-5-(6-アミノ-9H-プリン-9-イル)-2,2-ジメチルテトラヒドロフロ[3.4-d][1,3]ジオキソル-4-イル)メトキシ)(フェノキシ)ホスホリル)アミノ)プロパノエート
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000012
　Combi-Blocksから入手した2-エチルブチル (2s)-2-([(s)-(4-ニトロフェノキシ)(フェノキシ)ホスホリル]アミノ)プロパノエート(1.8 g、4 mmol)および東京化成から入手した2',3'-O-イソプロピリデンアデノシン(1.0 g、3.3 mmol)を、アセトニトリル (20 mL) 中、塩化マグネシウム、N,N-ジイソプロピルエチルアミンの存在下、50℃にて反応させた。シリカゲルカラムで精製後、標題の化合物(1.9 g、92%) を得た。
　得られた化合物のNMRスペクトルのチャートを図１に示す。
実施例１－２：ホスホロアミダイート化AMP（ATPプロドラッグ）
(S)-2-エチルブチル 2-(((S)-(((2R,3S,4R,5R)-5-(6-アミノ-9H-プリン-9-イル)-3,4-ジヒドロキシテトラヒドロフラン-2-イル)メトキシ)(フェノキシ)ホスホリル)アミノ)プロパノエート
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000013
 　実施例１－１にて調製した化合物(1.2 g、2 mmol)を、THF (10 mL) 中、37%塩酸 2 ml、0℃にて反応させ、シリカゲルカラムで精製後、標題の化合物 (1.5 g、75%、融点129.9℃) を得た。
　得られた化合物のNMRスペクトルのチャートおよびFAB MSスペクトルをそれぞれ、図２および図３に示す。
実施例２
ホスホロアミダート化AMP（ATPプロドラッグ-neo）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000014
実施例２－１
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000015
 　MERCKから購入した4-ニトロフェニルホスホロジクロリダート（1.3 g, 5.1 mmol）およびACROTEINから購入したL-アラニンネオペンチルエステル塩酸塩（2.0 g、10.2 mmol）をジクロロメタン中、トリエチルアミン存在下、室温で反応させた。シリカゲルカラムで精製後、目的の化合物を得た（0.8 g、30%）。
実施例２－２
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000016
 　実施例２－１にて合成した化合物（0.6 g、1.2 mmol）に東京化成から購入した2’,3’-O-イソプロピリデンアデノシン(1.0 g、3.3 mmol)を、アセトニトリル (20 mL) 中、塩化マグネシウム、N,N-ジイソプロピルエチルアミンの存在下、50℃にて反応させた。シリカゲルカラムで精製後、目的の化合物(0.5 g、79%) を得た。
実施例２－３
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000017
 　実施例２－２にて調製した化合物(0.53 g、0.79 mmol)を、THF (5 mL) 中、37%塩酸 2 ml、0℃にて反応させ、シリカゲルカラムで精製後、目的の化合物 (0.1 g、22%) を得た。
　得られた化合物のNMRスペクトルのチャートを図４に示す。
試験例１
ATPプロドラッグの細胞内ATP濃度に対する効果
　MCF7（ヒト乳がん細胞）（RIKEN BRC）を 5000細胞/ウエル (DMEM 低グルコース、10%FBS、1% ペニシリン／ストレプトマイシン）で播種し、3時間後、実施例１にて調製したATPプロドラッグを、濃度を変えてDMSOに溶解させた溶液を添加した。1、2、3日後にDNA量を、ピコグリーン（picogreen）を使って測定し、別に作成した検量線から細胞数に換算した。ATP量を、ATP測定キット（同仁化学）を用いて定量し、細胞あたりのATP量を算出した。
　得られた結果を図５に示す。図５は、ATPプロドラッグ濃度依存的に細胞内ATP量が増大し、3日後には、細胞内ATP量が対照に対して約2.5 倍量まで増えたことを示している（ATPプロドラッグ 100 μM 添加時）。このように、ATPのプロドラッグ化によって、細胞内ATP濃度を上昇させることができた。
試験例２
ATP類縁物質による細胞内ATP濃度に対する効果
　MCF7細胞（5000細胞/ウエル）にアデノシン、AMP、ATP、およびATPプロドラッグを100 μMで培地に添加し、1日後、2日後にATPを測定し、DNA量で規格化した。
　得られた結果を図６に示す。図６は、ATPプロドラッグ添加の場合のみ、細胞内ATP量が上昇することを示している。
試験例３
正常細胞を用いた細胞内ATP濃度に対する効果
　NHDF（ヒト線維芽細胞）（Takara Bio）を5000細胞/ウエル (DMEM 低グルコース、10%FBS、1% ペニシリン／ストレプトマイシン）で播種し、3時間後、実施例１にて調製したATPプロドラッグを、濃度を変えてDMSOに溶解させた溶液を添加した。1日後にDNA量を、ピコグリーン（picogreen）を使って測定し、別に作成した検量線から細胞数に換算した。ATP量を、ATP測定キット（同仁化学）を用いて定量し、細胞あたりのATP量を算出した。
　得られた結果を図７に示す。図７は、正常細胞NHDFにおいてもATPプロドラッグを添加することで濃度依存的に細胞内ATP量が増大し、ATPプロドラッグ（200μM）のとき、対照（0μM）の 1.7 倍量まで増えたことを示している。
試験例４
老化細胞へのATP増加効果とストレス負荷に対する効果
　ヒト75歳と29歳由来HDF（ヒト皮膚細胞）（東洋紡）を5000 細胞/ウエル（DMEM 低グルコース、10%FBS、1% ペニシリン／ストレプトマイシン）で播種し、三時間後にDMSOに溶解させたATPプロドラッグを0または50 μM添加した。（A）24 時間インキュベートした。DNA量をピコグリーン（picogreen）を使って測定し、別に作成した検量線から細胞数に換算した。ATP 量を ATP 測定キット（同仁化学）を用いて定量し、細胞あたりのATP量を算出した。（B）75歳由来のHDFに75 μMのATPプロドラッグを添加し、24時間後に200 μM 過酸化水素を含む無血清培地に交換し、6時間インキュベートした。6時間後に細胞を洗浄し、WST-8 kitを用いて細胞数を比較した。
　得られた結果を図８に示す。図８（Ａ）は、２９歳および７５歳由来の細胞においてATPプロドラッグ添加によって細胞内ATP量が増加したことを示している。図８（Ｂ）は、75歳由来の細胞において、ATPプロドラッグが無い場合ではストレス負荷により細胞数が減少し、ATPプロドラッグ 75μMを添加することで細胞数減少が抑制されることを示している。このように、老化した細胞においてもATPプロドラッグ添加による細胞内ATP濃度上昇により、ストレス負荷耐性が向上したことが示唆された。
試験例５
ATPプロドラッグの細胞毒性
　NHDF（正常ヒト皮膚線維芽細胞）を5000細胞/ウエル (DMEM/F12、10%FBS、1% ペニシリン／ストレプトマイシン）で播種し、3時間後、実施例１にて調製したATPプロドラッグを、濃度を変えてDMSOに溶解させた溶液を添加した。24時間後に細胞毒性の指標となるLDH（乳酸脱水素酵素）の放出量を、LDHアッセイキット（同仁化学）を用いて定量し、細胞傷害性を算出した。
　得られた結果を図９に示す。図９は、ATPプロドラッグを高濃度（256 μM）まで添加しても、LDH放出量が低いことを示している。このように、ATPプロドラッグは細胞に対する傷害性が低いことが確認できた。
試験例６
ATPプロドラッグの肝細胞への効果
　ヒト肝がん細胞（HepG2）を5000細胞/ウエル（DMEM、10%FBS、1%ペニシリン/ストレプトマイシン）で播種し、3時間後、実施例１にて調製したATPプロドラッグを濃度を変えてDMSOに溶解させた溶液を添加した。24時間後にDNA量をピコグリーン（picogreen）を用いて測定し、別に作成した検量線から細胞数に換算した。ATP量を、ATP測定キット（同仁化学）を用いて定量し、細胞あたりのATP量を産出した。
　これとは別に、正常ブタ肝細胞を5000細胞/ウエル（肝細胞分化エンバイロメントHepatp-STIM、1μg/100mL EGF、1%ペニシリン/ストレプトマイシン）で播種し、3時間後ATPプロドラッグを濃度を変えてDMSOに溶解させた溶液を添加した。24時間後にDNA量をピコグリーン（picogreen）を用いて測定した。ATP量をATP測定キット（同仁化学）を用いて定量し、ATP量を産出した。
　得られた結果を図１０に示す。2種類の肝臓細胞（株化細胞および初代細胞）において、ATPプロドラッグによる細胞内ATP量上昇が確認された。
試験例７
AMPK阻害剤を用いた細胞内ATP量の評価
　96ウエルプレートに血清培地（DMEM/F12、10%FBS）を100 μL添加してインキュベーターで1時間プレコンディショニングを行った。その後、正常ヒト皮膚線維芽細胞を播種（細胞播種数：5×103 細胞/ウエル）した。播種から 3時間後、実施例１にて調製したATPプロドラッグ（終濃度：100μM）とAMP-活性化プロテインキナーゼ（AMPK: AMP-activated protein kinase）阻害剤であるドルソモルフィン（Dorsomorphin）（終濃度 0もしくは12.5μMを各ウエルに添加し 37℃下で 24時間培養を行った。各ウエルにATP測定キットに含まれる検出試薬を 100 μL添加し、遮光下、室温で 30分間、呈色反応を行った。その後、各ウエルに反応停止液 50 μLを添加し、マイクロプレートリーダーを用いて490 nmの吸光度を測定した。
　得られた結果を図１１に示す。AMPK阻害剤ドルソモルフィンを添加することで、ATPプロドラッグによるATP産生量の一部が阻害された。この結果から、ATPプロドラッグにはAMPKを活性化し、細胞内ATP量を増加させ、抗老化効果を示すことが示唆された。
試験例８
モデル動物（線虫）を用いた寿命延長効果の確認その１
基板の作製
　滅菌して60℃に保たれた液体状の線虫増殖培地（NGM）に、DMSOで溶かした実施例１にて調製したATPプロドラッグを最終濃度100μMとなるように添加することで、ATPプロドラッグ含有NGMプレートを作製した。この時、NGMに対するDMSOの最終濃度は1%となるように調整を行った。ATPプロドラッグを含まないNGMプレートについても、DMSOの最終濃度が1%となるようにDMSOの添加を行った。生存分析で使用する直前のNGMプレートの表面上には、線虫への餌として、M9緩衝液中で攪拌させた大腸菌OP50（Escherichia coli strain OP50）を塗布した。
生存分析
　年齢同期を行った後、NGMプレートに35匹の線虫を移した。線虫は、成虫の初日（3日目）から7日目までは毎日、8日目から線虫が死滅するまでは2日ごとに、線虫を新しいNGMプレートに移した。同時に、生きている線虫と死んだ線虫の数を記録した。線虫の生死は、触っても反応しないかどうかで判断を行った。得られた結果から、平均寿命を算出し、平均寿命を比較することで、線虫の寿命延長率を算出した。本実験は、4回反復して実験を行うことで、再現性の確認を行った（proATP添加した場合、しない場合ともにn=114）。
　得られた結果を図１２に示す。図１２は、ATPプロドラッグ含有NGMプレート上で培養した線虫が、対照よりも約33%平均寿命が延長したことを示している。このように、線虫にATPプロドラッグを添加することで、線虫の平均寿命を延ばすことができた。
　参考までに、線虫の寿延長効果が知られている他の薬物との比較を表に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000018
 モデル生物（線虫）の体内ATP量比較
　線虫の培養および線虫に対するATPプロドラッグの添加は、生存分析と同じ条件で行った。培養7日目の線虫を5匹ずつ、各条件合計25匹をPBSが添加された24ウエルプレートに回収し、氷冷しながら超音波破壊を行った（1分間）。その後、破砕液をマイクロチューブに回収し、遠心分離（15000rpm、30分間、4℃）後、上清を回収した。上清中のATP量を、ATP測定キット（同仁化学）を用いて定量し、線虫1匹あたりのATP量を算出した。
　得られた結果を図１３に示す。図１３は、ATPプロドラッグ含有NGMプレート上で培養した一匹あたりの線虫内ATP量が、対照よりも約23%向上したことを示している。このように、線虫にATPプロドラッグを添加することで、線虫内のATP量を向上させることができた。
試験例９
ATPプロドラッグ-neoの細胞内ATP濃度に対する効果
　HDF75（75歳由来ヒト皮膚線維芽細胞）（Cell applications, inc）を 5000細胞/ウエル （ヒト皮膚線維芽細胞増殖培地）で播種し、3時間後、実施例２にて調製したATPプロドラッグ-neoを、濃度を変えてDMSOに溶解させた溶液を添加した。24時間後にDNA量を、ピコグリーン（picogreen）を使って測定し、別に作成した検量線から細胞数に換算した。ATP量を、ATP測定キット（同仁化学）を用いて定量し、細胞あたりのATP量を算出した。
　得られた結果を図１４に示す。図１４は、ATPプロドラッグ-neoにより細胞内ATP量が増大したことを示している。このように、実施例１のATPプロドラッグとは構造の異なるATPプロドラッグについても、細胞内ATP濃度を上昇させることができた。
試験例１０
モデル動物（線虫）を用いた寿命延長効果の確認その２
基板の作製
　滅菌して60℃に保たれた液体状の線虫増殖培地（NGM）に、DMSOで溶かした実施例２にて調製したATPプロドラッグ-neoを最終濃度200 μMとなるように添加することで、ATPプロドラッグ-neo含有NGMプレートを作製した。この時、NGMに対するDMSOの最終濃度は1%となるように調整を行った。ATPプロドラッグ-neoを含まないNGMプレートについても、DMSOの最終濃度が1%となるようにDMSOの添加を行った。生存分析で使用する直前のNGMプレートの表面上には、線虫への餌として、M9バッファー中で攪拌させた大腸菌OP50 （Escherichia coli strain OP50）を塗布した。
生存分析
　年齢同期を行った後、NGMプレートに35匹の線虫を移した。線虫は、成虫の初日（3日目）から7日目までは毎日、8日目から線虫が死滅するまでは2日ごとに、線虫を新しいNGMプレートに移した。同時に、生きている線虫と死んだ線虫の数を記録した。線虫の生死は、触っても反応しないかどうかで判断を行った。得られた結果から、平均寿命を算出し、平均寿命を比較することで、線虫の寿命延長率を算出した。本実験は、4回反復して実験を行うことで、再現性の確認を行った。
　得られた結果を図１５に示す。図１５は、ATPプロドラッグ-neo含有NGMプレート上で培養した線虫が、対照よりも約26%平均寿命が延長したことを示している。このように、線虫にproATP-neoを添加することで、線虫の平均寿命を延ばすことができた。
　以上のように、本発明のATPプロドラッグは、細胞内ATPを人為的に上昇させることができる画期的な物質である。これまで、このようなATP濃度を上昇させることができるATP前駆体の報告はなく、また、ATPは全ての生物に共通して存在するエネルギー通貨物質であり、この濃度を制御できる本発明のインパクト、医薬への応用性は非常に高い。

Claims (12)

  1. 　式（I）：
    ［式中、XおよびYは同一または異なって、それぞれ、下記で表される置換基群Aの中から選択される置換基、下記で表される置換基群Bおよび下記で表される置換基群Cの中から選択される置換基である。ただし、XおよびYはともに、置換基群Aの中から選択される置換基ではない。
    置換基群A：リン原子につながる原子がOの場合、式１：
    -O-R1
    （式中、R1は、水素、C1～C8アルキル基、C1～C3アルキルアリール基、CH3OCH2-、CH3OCH2CH2-、エステル基、フェニル基、ピリジル基、ベンジル基、インドリル基、およびナフチル基の中から選ばれ、これらの芳香環または複素環は、1から3個の下記に示す官能基によって置換されていても良い；ハロゲン、ハロゲン、C1-C6アルキル、C2-C6アルケニル、C1-C6ハロゲン化アルキル、C1-C6アルコキシ、C1-C6ハロゲン化アルコキシ、フェニル、ヒドロキシC1-C6アルキル、C3-C6シクロアルキル、C1-C6アルキルカルボニル、C3-C6シクロアルキルカルボニル、カルボキシCe-Ceアルキル、ヒドロキシ基、アミノ基、シアノ基、ニトロ基、トリメチルシリル基）
    で示される基；
    置換基群B：リン原子につながる原子がNの場合、式２：
    -R2-R3
    （式中、R2は、アミノカルボン酸として総称される残基であり、
    　R3は、R2におけるアミノカルボン酸のカルボン酸部分に結合する直鎖状C1～C6アルキル基、分枝状または環状のC3～C6アルキル基であり、好ましくは例えば、メチル基、エチル基、ｎ－プロピル基、イソプロピル基、シクロプロピル基、ｎ－ブチル基、イソブチル基、ｓｅｃ－ブチル基、ｔｅｒｔ－ブチル基、ｎ－ペンチル基、イソペンチル基、ｓｅｃ－ペンチル基、ｔｅｒｔ－ペンチル基、ネオペンチル基、１－メチルペンチル基、ｎ－ヘキシル基、イソヘキシル基、ｓｅｃ－ヘキシル基、ｔｅｒｔ－ヘキシル基、ネオヘキシル基等；C1～C8アルキル基で置換されていることのあるC4～C8シクロアルキル基；テトラヒドロピラニル基；ハロゲン、C1～C8アルキル基、またはC1～C6アルコキシ基によって置換されていることのあるベンジル基；ハロゲン化フェニル基によって置換されていることのある2-フェニルエチル基；インドール基である）
    で示される基；
    置換基群C：リン原子につながる原子がNの場合、C3～C5複素環、モルホリノ環、ピペラジン環、チオモルフィリン環、もしくは式３：
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000002
     （式中、R4は水素、C3～C6シクロアルキル基によって置換されていることのあるC1～C8アルキル基：C4～C8シクロアルキル基：テトラヒドロピラニル基：ハロゲン、C1～C8アルキル基、またはC1～C6アルキル基アルコキシ基によって置換されていることのあるベンジル基：ハロゲン化フェニル基によって置換されていることのある2-フェニルエチル基、またはインドール基である）
    で示される環状構造］
    で示される化合物、またはその製薬的に許容できる塩もしくは溶媒和物。
  2. 　置換基群Aにおいて、ハロゲン、C1～C8アルキル基、またはC1-C6アルコキシ基によって置換されていることあるフェニル基である、請求項１記載の化合物、またはその製薬的に許容できる塩もしくは溶媒和物。
  3. 　置換基群Bにおいて、式２：
    -R2-R3
    （式中、R2は、アラニン、グリシン、イソロイシン、ロイシン、プロリン、メチオニン、フェニルグリシン、フェニルアラニン、バリン、アスパラギンの中から選ばれるアミノ酸残基である）
    で示される基である、請求項１記載の化合物、またはその製薬的に許容できる塩もしくは溶媒和物。
  4. 　置換基群Bにおいて、式２：
    -R2-R3
    （式中、R3は、メチル基、エチル基、ｎ－プロピル基、イソプロピル基、シクロプロピル基、ｎ－ブチル基、イソブチル基、ｓｅｃ－ブチル基、ｔｅｒｔ－ブチル基、ｎ－ペンチル基、イソペンチル基、ｓｅｃ－ペンチル基、ｔｅｒｔ－ペンチル基、ネオペンチル基、１－メチルペンチル基、ｎ－ヘキシル基、イソヘキシル基、ｓｅｃ－ヘキシル基、ｔｅｒｔ－ヘキシル基、ネオヘキシル基の中から選ばれる）
    で示される基である、請求項１記載の化合物、またはその製薬的に許容できる塩もしくは溶媒和物。
  5. 　置換基群Bにおいて、式２：
    -R2-R3
    （式中、R3は、直鎖状または分枝状のC4～C6アルキル基である）
    で示される基である、請求項１記載の化合物、またはその製薬的に許容できる塩もしくは溶媒和物。
  6. 　式（II）
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000003
     または
    　式（III）：
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000004
     で示される、請求項１記載の化合物、またはその製薬的に許容できる塩もしくは溶媒和物。
  7. 　請求項１から６までのいずれか記載の化合物、またはその製薬的に許容できる塩もしくは溶媒和物を含有する医薬組成物。
  8. 　細胞内ATPレベル低下状態を処置または予防するための、請求項７記載の医薬組成物。
  9. 　細胞内ATPレベル低下状態が、老化の状態、ならびに非アルコール性脂肪肝疾患および／または肝炎に関連する、請求項８記載の医薬組成物。
  10. 　細胞内ATPレベル低下状態が、ミトコンドリア病、がんや血流不足による低酸素状態、炎症を伴う組織再生領域である、請求項８記載の医薬組成物。
  11. 　細胞内ATPレベル低下状態が、神経変性疾患である、請求項８記載の医薬組成物。
  12. 　神経変性疾患が、パーキンソン病、アルツハイマー病およびALSの中から選ばれる、請求項１１記載の医薬組成物。
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