WO2024029527A1 - 長波長の光照射で機能する光スイッチタンパク質 - Google Patents

長波長の光照射で機能する光スイッチタンパク質 Download PDF

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WO2024029527A1
WO2024029527A1 PCT/JP2023/028106 JP2023028106W WO2024029527A1 WO 2024029527 A1 WO2024029527 A1 WO 2024029527A1 JP 2023028106 W JP2023028106 W JP 2023028106W WO 2024029527 A1 WO2024029527 A1 WO 2024029527A1
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WO
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del
rpppsr2
rpbphp1
mutant
protein
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PCT/JP2023/028106
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English (en)
French (fr)
Inventor
守俊 佐藤
隆浩 中嶋
Original Assignee
国立大学法人 東京大学
地方独立行政法人神奈川県立産業技術総合研究所
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria

Definitions

  • the present invention relates to a set of proteins whose binding and dissociation can be controlled by light irradiation.
  • Proteins which are one of the biological substances, play a variety of functions in living organisms. For example, interactions between proteins are involved in the control of systems that form the basis of life, such as intracellular signal transmission and substance transport.
  • optogenetics technology technologies have been developed to control protein-protein interactions in living organisms through optical manipulation, and for example, optical switch proteins are currently attracting attention.
  • a photoswitch protein is a pair of proteins whose binding and dissociation can be controlled by turning ON/OFF light irradiation (Patent Document 1).
  • Patent Document 1 Through the binding/dissociation of optical switch proteins through optical manipulation, it is possible to control various intracellular phenomena, such as signal transduction, genome editing, and gene expression (Non-Patent Document 1 and Non-Patent Document 2).
  • photoswitch proteins that can be controlled by blue light ⁇ 470 nm
  • blue light is absorbed by hemoglobin and other substances, its permeability through biological tissue is low, and photoswitch proteins that can be manipulated by blue light have not been sufficiently effective for use in optical manipulation in vivo. .
  • RpBphP1 and RpPpsR2 can be controlled by near-infrared light, which is highly penetrating to biological tissues, and biliverdin, a cofactor required for RpBphP1 to accept light, Since it is widely present in the cells of various animal species including mammals, it was expected to be used in the medical field.
  • the pair of wild-type RpBphP1 and RpPpsR2 binds even in the dark, that is, in the absence of light irradiation, so it is difficult to reliably control binding and dissociation by light irradiation. was holding.
  • an object of the present invention is to provide RpBphP1 mutants and RpPpsR2 mutants that have been improved so that binding and dissociation can be reliably controlled by irradiation and blocking of near-infrared light. do.
  • the inventors created various mutants of RpBphP1 and RpPpsR2, and found that the binding and dissociation of the mutants and wild type can be reliably controlled by turning on/off near-infrared light irradiation. We succeeded in finding combinations or combinations of mutants.
  • the present invention has the following (1) to (13).
  • a protein set consisting of two proteins that bind under near-infrared light irradiation,
  • the protein set is a set of RpBphP1 mutant and wild type RpPpsR2, a set of wild type RpBphP1 and RpPpsR2 mutant, or a set of RpBphP1 mutant and RpPpsR2 mutant.
  • the wild type RpBphP1 has 90% or more sequence identity with a protein consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 2, or with the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 2.
  • the above (1) is a protein
  • the wild type RpPpsR2 is a protein consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 3, or a protein having 90% or more sequence identity with the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 3. ).
  • the protein set is a set of wild type RpPpsR2 and RpBphP1 mutant
  • the RpBphP1 variant has Q514A, D607E, R638A, H661A, R696A, E327A, E332A, E337A, D339A, E365A, Q367A, E429A, R490A, D498A, Q502A, Q502G, Q502V, Q502L, Q502I, Q502S, Q502T, Q502E, Q502K, Q502R, Q502H, Q502N, Q502F, Q502Y, Q502W, Q502C, Q502M, Q502P, F503A, R504A, R507 A, E513G, E513D, E513P, E516A, F518A, S525A, D607A, D607G, D60
  • the protein set is a set of wild type RpBphP1 and RpPpsR2 mutant,
  • the RpPpsR2 variant has Q105T, T133A, L137A, N103A, Q105A, Q105C, Q105H, V107A, T108A, L110A, R113A, L114A, I115A, Q119A, M121A, M121E, R123A in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 3.
  • the protein set is a set of wild type RpBphP1 and RpPpsR2 mutant
  • the RpPpsR2 mutant has an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 3, D1-D1-D2, D3-D1-D2, D1-D2 (del N 77), D1-D2, D2-D1, D2-D2, D3.
  • D1-D2 D1-D2-D1, D1-D2-D2, D1-D2-D4, D2-D1-D2, D2-D3-D4, D4-D1-D2, D2-D3-D4-D1, D2-D3-D4-D2, D2-D3-D4-D3, D2-D3-D4-D5, D1-D2 (del N 88), D1-D2 (del N 89), D1-D2 (del N 90), D1-D2 (del N 91), D1-D2 (del N 92), D1-D2 (del N 93), D1-D2 (del N 94), D1-D2 (del N 95), D1-D2 (del N 96), D1-D2 (del N 97), D1-D2 (del C 5), D1-D2 (del C 15), D1-D2 (del N 93)(
  • the protein set is a set of RpBphP1 mutant and RpPpsR2 mutant
  • the RpBphP1 variant has Q514A, D607E, R638A, H661A, R696A, E327A, E332A, E337A, D339A, E365A, Q367A, E429A, R490A, D498A, Q502A in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 2.
  • the RpPpsR2 variant has Q105T, T133A, L137A, N103A, Q105A, Q105C, Q105H, V107A, T108A, L110A, R113A, L114A, I115A, Q119A, M121A, M121E, R123A in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 3.
  • the protein set is a set of RpBphP1 mutant and RpPpsR2 mutant
  • the RpBphP1 variant has Q514A, D607E, R638A, H661A, R696A, E327A, E332A, E337A, D339A, E365A, Q367A, E429A, R490A, D498A, Q502A in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 2.
  • the RpPpsR2 mutant has an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 3, D1-D1-D2, D3-D1-D2, D1-D2 (del N 77), D1-D2, D2-D1, D2-D2, D3.
  • D1-D2 D1-D2-D1, D1-D2-D2, D1-D2-D4, D2-D1-D2, D2-D3-D4, D4-D1-D2, D2-D3-D4-D1, D2-D3-D4-D2, D2-D3-D4-D3, D2-D3-D4-D5, D1-D2 (del N 88), D1-D2 (del N 89), D1-D2 (del N 90), D1-D2 (del N 91), D1-D2 (del N 92), D1-D2 (del N 93), D1-D2 (del N 94), D1-D2 (del N 95), D1-D2 (del N 96), D1-D2 (del N 97), D1-D2 (del C 5), D1-D2 (del C 15), D1-D2 (del N 93)(
  • the RpBphP1 mutant which comprises an amino acid sequence having one or more of the following point mutations in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 2; Q514A, D607E, R638A, H661A, R696A, E327A, E332A, E337A, D339A, E365A, Q367A, E429A, R490A, D498A, Q502A, Q502G, Q502V, Q502L, Q502I, Q502S, Q502 T, Q502E, Q502K, Q502R, Q502H, Q502N, Q502F, Q502Y, Q502W, Q502C, Q502M, Q502P, F503A, R504A, R507A, E513G, E513D, E513P, E516A, F518A, S525A, D60
  • the RpPpsR2 variant which consists of an amino acid sequence having one or more of the following point mutations in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 3; Q105T, T133A, L137A, N103A, Q105A, Q105C, Q105H, V107A, T108A, L110A, R113A, L114A, I115A, Q119A, M121A, M121E, R123A, D124A, Y125A, Y125E, W12 6A, R127A, R129A, E132A, R134A, R136A, Q105V, Q105S, K102A, Q105P, Q105R, L137E, V138A, V138E, F139E, V146A.
  • the RpPpsR2 mutant which is a mutant in which the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 3 has been modified in any of the following ways; D1-D1-D2, D3-D1-D2, D1-D2 (del N 77), D1-D2, D2-D1, D2-D2, D3-D2, D3-D2 (L137E), D4-D2, D1- D2-D1, D1-D2-D2, D1-D2-D4, D2-D1-D2, D2-D3-D4, D4-D1-D2, D2-D3-D4-D1, D2-D3-D4-D2, D2-D3-D4-D3, D2-D3-D4-D5, D1-D2 (del N 88), D1-D2 (del N 89), D1-D2 (del N 90), D1-D2 (del N 91 ), D1-D2 (del N 92), D1-D2 (del N 77),
  • a photoswitch protein according to the present invention i.e., a combination (set) of RpBphP1 mutant and wild type RpPpsR2, a combination (set) of wild type RpBphP1 and RpPpsR2 mutant, or a combination (set) of RpBphP1 mutant and RpPpsR2 mutant
  • Their binding and dissociation can be reliably controlled by irradiation and blocking of near-infrared light. Therefore, the binding and dissociation of the photoswitch protein according to the present invention can be reliably controlled by near-infrared light even in vivo.
  • (a) is a schematic diagram of CPTS (CRISPR-Cas9-based photoactivatable transcription system).
  • (b) shows the results of confirming the binding state of wild type RpBphP1 and wild type RpPpsR2 in the dark and under near-infrared light irradiation. Functional analysis of the photoswitch protein consisting of RpBphP1 mutant and wild type RpPpsR2 (Part 1).
  • the results of analyzing the binding state of point mutation-introduced RpBphP1 and wild-type RpPpsR2 in the dark and under near-infrared light irradiation are shown (a to c). Functional analysis of the photoswitch protein consisting of RpBphP1 mutant and wild type RpPpsR2 (Part 2). The results of analyzing the binding state of point mutation-introduced RpBphP1 and wild-type RpPpsR2 in the dark and under near-infrared light irradiation are shown (a and b). Functional analysis of the photoswitch protein consisting of wild type RpBphP1 and RpPpsR2 mutant (Part 1).
  • the results of analyzing the binding state between wild-type RpBphP1 and the RpPpsR2 domain variant in the dark and under near-infrared light irradiation are shown (a and b).
  • Functional analysis of photoswitch proteins consisting of wild-type RpBphP1 and RpPpsR2 domain variants (Part 2).
  • the results of analyzing the binding state between wild-type RpBphP1 and RpPpsR2 domain variant in the dark and under near-infrared light irradiation are shown.
  • Functional analysis of the photoswitch protein consisting of wild-type RpBphP1 and a modified RpPpsR2 domain containing a deletion within the domain (Part 1).
  • the amino acid sequence shown in a is the amino acid sequence of the D1-D2 domain of RpPpsR2.
  • D1-D2 (del N 77), D1-D2 (del N 93) and D1-D2 (del C 15) are deletions of 77 amino acids on the N-terminal side, deletion of 93 amino acids on the N-terminal side, and deletion of the C-terminal side, respectively.
  • the amino acid sequence of the D1-D2 variant having a deletion of 15 amino acids on the side is shown.
  • b shows the results of analyzing the binding state between wild-type RpBphP1 and the RpPpsR2 domain variant containing a deletion within the domain in the dark and under near-infrared light irradiation.
  • the amino acid sequence shown in a (SEQ ID NO: 6) is the amino acid sequence of the D1-D2 domain of RpPpsR2.
  • D1-D2 (del N 47) and D1-D2 (del N 64) indicate the amino acid sequences of D1-D2 variants having a deletion of 47 amino acids on the N-terminal side and a deletion of 64 amino acids on the N-terminal side, respectively.
  • . b shows the results of analyzing the binding state between wild-type RpBphP1 and the RpPpsR2 domain variant containing a deletion within the domain in the dark and under near-infrared light irradiation. Functional analysis of the photoswitch protein consisting of wild-type RpBphP1 and a modified RpPpsR2 domain containing a deletion within the domain (part 3).
  • the amino acid sequence shown in a is the amino acid sequence of the D1-D2 domain of RpPpsR2.
  • D1-D2 (del N 88), D1-D2 (del N 93) and D1-D2 (del N 97) are deletions of 88 amino acids from the N-terminus, deletion of 93 amino acids from the N-terminus, and deletion of the N-terminus, respectively.
  • the amino acid sequence of the D1-D2 variant having a deletion of 97 amino acids on the side is shown.
  • b shows the results of analyzing the binding state between wild-type RpBphP1 and the RpPpsR2 domain variant containing a deletion within the domain in the dark and under near-infrared light irradiation.
  • Functional analysis of the photoswitch protein consisting of wild-type RpBphP1 and a modified RpPpsR2 domain containing a deletion within the domain (Part 4).
  • the amino acid sequence shown in a (SEQ ID NO: 6) is the amino acid sequence of the D1-D2 domain of RpPpsR2.
  • D1-D2 (del N 93), D1-D2 (del N 93) (del C 5) and D1-D2 (del N 93) (del C 12) are deletions of the N-terminal 93 amino acids, N
  • the amino acid sequences of D1-D2 variants are shown, which have a deletion of 93 amino acids on the terminal side and 5 amino acids on the C-terminal side, and a deletion of 93 amino acids on the N-terminal side and a deletion of 12 amino acids on the C-terminal side.
  • b shows the results of analyzing the binding state between wild-type RpBphP1 and the RpPpsR2 domain variant containing a deletion within the domain in the dark and under near-infrared light irradiation.
  • a combination of mutations and modifications that have beneficial effects in RpBphP1 and RpPpsR2 (mutations and modifications that lower dark leak signals and mutations and modifications that increase NIR signals) to improve functionality.
  • a total of 12 patterns are shown.
  • FIG. 7 An example in which the combination pattern of RpBphP1 and RpPpsR2 is combination 7 in FIG.
  • the results of analyzing the binding state between wild-type RpBphP1 and RpPpsR2 mutant having both domain modification (D3-D2) and point mutation (L137E introduced) in the dark and under near-infrared light irradiation are shown.
  • This combination pattern is the same as that shown in Figure 13b, except that a domain modification and a point mutation are introduced into RpPpsR2.
  • *2 represents a point mutation that increases the NIR signal.
  • *3 represents a domain variant that lowers the Dark leak signal.
  • *2 represents a point mutation that increases the NIR signal.
  • *3 represents a domain variant that lowers the Dark leak signal.
  • Necessary components such as guide RNA targeting genomic genes ( ASCL1 , HBG1 , MYOD1 , or IL1R2 ) and photoswitch protein genes were transfected into HEK293T cells, and near-infrared light irradiation was performed to determine the expression level of each genomic gene.
  • Examined. a shows the expression level of each genomic gene in the dark and under near-infrared light irradiation.
  • b shows the temporal change in ASCL1 mRNA expression level after near-infrared light irradiation.
  • the area within the frame shows an enlarged view up to 3 hours of near-infrared light irradiation.
  • Panel c shows the results of examining how ASCL1 mRNA expression is affected by turning on or off near-infrared light irradiation. Confirmation of gene activation in vivo in mice by the photoswitch protein of the present invention. Necessary components such as guide RNA (targeting a luminescent reporter gene or targeting the mouse ASCL1 gene) and a photoswitch protein gene were transfected into mouse livers, and the mice were exposed to light using an LED panel from outside the body.
  • Figure a shows the near-infrared light irradiation experiment.
  • b shows the results of analysis using a luminescent reporter gene.
  • c shows a liver removed from a mouse for analysis of ASCL1 gene expression level.
  • Light panel shows the results of examining the expression level of the ASCL1 gene in mouse livers in the dark and under near-infrared light irradiation.
  • the first embodiment is a protein set (also referred to as “protein set according to this embodiment” or “photoprotein according to this embodiment") consisting of two proteins that bind together under near-infrared light irradiation.
  • the protein set is a set of RpBphP1 mutant and wild type RpPpsR2, a set of wild type RpBphP1 and RpPpsR2 mutant, or a set of RpBphP1 mutant and RpPpsR2 mutant,
  • the binding of the protein set is weaker in the dark and/or stronger under near-infrared light irradiation than the binding between wild-type RpBphP1 and wild-type RpPpsR2, The above protein set.
  • the pair of wild-type RpBphP1 and RpPpsR2 binds to some extent even in the dark, that is, in the absence of light irradiation. Therefore, it was difficult to control reliably. Therefore, the present inventors first identified protein pairs that have weaker binding in the dark and/or proteins that have stronger binding under near-infrared light irradiation compared to the binding between wild-type RpBphP1 and wild-type RpPpsR2. I tried to create a pair.
  • the binding between RpBphP1 mutant and wild type RpPpsR2 the binding between wild type RpBphP1 and RpPpsR2 mutant, and the binding between RpBphP1 mutant and RpPpsR2 mutant; 1. 2. It is weak when near-infrared light is not irradiated (hereinafter also referred to as “in the dark”); and/or 2. Strong under near-infrared light irradiation, We attempted to create each of the mutants described above.
  • “near infrared light” refers to light with a wavelength of approximately 650 nm to 900 nm.
  • the binding of the protein set according to the present embodiment is "weak" compared to the binding between wild-type RpBphP1 and wild-type RpPpsR2, it means that the binding strength evaluated by the reporter assay described below is higher than that between wild-type RpBphP1 and wild-type RpPpsR2. This is a case where the binding strength is 0.6 times or less, preferably 0.4 times or less, and more preferably 0.2 times or less than that of wild type RpPpsR2.
  • the binding of the protein set according to the present embodiment is "strong" compared to the binding between wild-type RpBphP1 and wild-type RpPpsR2, it is preferably 1.1 times or more the binding strength between wild-type RpBphP1 and wild-type RpPpsR2. This is a case of 1.5 times or more.
  • the binding strength under near-infrared light irradiation is at most about twice that of the binding strength in the dark. With such a change in binding strength, it is difficult to accurately control binding and dissociation by turning on/off near-infrared light irradiation.
  • the protein set according to this embodiment has a larger difference in binding strength between the dark and near-infrared light irradiation than the wild-type pair, and its binding and dissociation can be controlled more accurately. I can do it.
  • the binding strength under near-infrared light irradiation is preferably about 3 times or more, more preferably about 5 times or more, compared to the binding strength in the dark. Even more preferably, it is about 7 times or more. Note that in this specification, "about” means a numerical range of ⁇ 10%.
  • wild type RpBphP1 is substantially the same as a protein consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 2 shown below, or a protein consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 2. is the same protein.
  • a protein that is substantially the same as a protein consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 2 refers to a protein that has a sequence of 80% or more with the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 2.
  • Amino acid sequences having identity more preferably 90% or more, 91% or more, 92% or more, 93% or more, 94% or more, 95% or more, 96% or more, 97% or more, 98% or more or 99% or more A protein consisting of amino acid sequences that have sequence identity.
  • the RpBphP1 mutant according to this embodiment is excluded.
  • the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 is a sequence registered in the NCBI database as accession number WP_119846077.
  • the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 is the sequence used as the amino acid sequence of wild type RpBphP1 in this example, and is the sequence between the first M and the next A of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2. V has been inserted, and Q at position 641 of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 is L. These mutations were made to improve the expression rate of wild-type RpBphP1.
  • the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 and the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 have more than 99% sequence identity, It has been confirmed that the activity is the same.
  • the third A of SEQ ID NO: 1 (the second A in SEQ ID NO: 2) is referred to as amino acid number 1, and the variant of RpBphP1 is described.
  • wild type RpPpsR2 is a protein consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 3 shown below, or a protein substantially the same as the protein consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 3.
  • a protein substantially identical to the protein consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 3 refers to an amino acid sequence having 80% or more sequence identity with the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 3.
  • the RpPpsR2 mutant according to this embodiment is excluded.
  • a mutation in which the 105th amino acid of wild-type RpPpsR2 is substituted from Q to T is designated as Q105T, and a mutant having this mutation is described as an RpPpsR2 mutant having a Q105T point mutation.
  • RpBphP1 mutants with Q514A and D607E point mutations a mutation in which Q at position 514 is replaced by A and D at position 607 is replaced by E). body
  • RpPpsR2 mutants include mutants in which the positions of the five domains that make up wild-type RpPpsR2 are swapped, and mutants in which one or more of the five domains is partially or completely deleted.
  • This embodiment also includes variants in which the positions of the five domains are swapped, and one or more of the five domains is partially or completely deleted.
  • domain variants are also referred to as "domain variants.”
  • the positions of the five domains of RpPpsR2 are defined as follows; In the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 3, Domain 1 (also written as D1): From A2 to N103 Domain 2 (also written as D2): From Q105 to A141 Domain 3 (also written as D3): From V146 to T241 Domain 4 (also written as D4): From D253 Domain 5 (also written as D5) up to N362: from A369 to D464
  • the amino acid sequences between domains such as M104, A142-A145, P242-V252, V363-D368, etc., are amino acid residues or amino acid sequences (linker ) is positioned as an amino acid or an amino acid linker that connects domains.
  • the domains in this embodiment have a number of amino acid residues (for example, 1 ⁇ 10 residues) may be added or deleted.
  • a domain variant expressed as D2-D1-D4 the polypeptide (D2) from Q105 to A141 of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 3, and the polypeptide from A2 to N103.
  • D1, polypeptides from D253 to N362 (D4) are arranged in this order from the N-terminal side, and D2, D1, and D4 may be connected by a polypeptide consisting of one to several amino acids. .
  • a polypeptide consisting of one to several amino acids may be added to the C-terminal side of D4 or the N-terminal side of D2.
  • D1-D2-D3 (del C 25), D1-D2 (del N 93), D1-D2 (del N 93)(del C 5) etc.
  • D1-D2-D3 (del C 25) has D1, D2, and D3 domains connected in this order from the N-terminus, but 25 amino acids are deleted from the C-terminus of D1-D2-D3.
  • domain variants such as In addition, in D1-D2 (del N 93), the domains of D1 and D2 are connected in this order from the N-terminus, but 93 amino acids appear to be deleted from the N-terminus of D1-D2. domain variants are shown. Furthermore, in D1-D2 (del N 93) (del C 5), the domains of D1 and D2 are connected in this order from the N-terminus, but 93 amino acids are missing from the N-terminus of D1-D2. This shows a domain variant in which 5 amino acids are deleted from the C-terminal side. Note that the title of the domain variant above indicates either the domain variant itself or the amino acid sequence of the domain variant.
  • amino acid is used in the broadest sense, and includes not only natural amino acids but also their derivatives and artificial amino acids.
  • Amino acids in this specification include, for example, natural amino acids as well as unnatural amino acids.
  • amino acids with a main chain structure different from the natural type amino acids with a side chain structure different from the natural type, amino acids with an extra methylene in the side chain, and amino acids with a carboxylic acid functional group in the side chain are substituted with a sulfonic acid group.
  • amino acids also include amino acids.
  • the protein set according to this embodiment includes a set of RpBphP1 mutant and wild type RpPpsR2, a set of wild type RpBphP1 and RpPpsR2 mutant, or a set of RpBphP1 mutant and RpPpsR2 mutant.
  • the RpBphP1 mutant according to this embodiment consists of an amino acid sequence containing one or more point mutations in which the following amino acids are substituted with other amino acids in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 2.
  • the RpPpsR2 variant according to this embodiment includes a variant consisting of an amino acid sequence having one or more point mutations in which the following amino acids are substituted with other amino acids in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 3. be; K102, N103, Q105, V107, T108, L110, L113, L113, I115, Q115, Q119, M119, R123, D123, Y125, W125, R126, R129, R129, E133, R136, R136, L139, F139, F139, F139, F139, V146 More specifically, the RpPpsR2 variant in this embodiment includes a variant consisting of an amino acid sequence having one or more of the following point mutations in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 3.
  • the RpPpsR2 mutant in this embodiment includes a mutant in which the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 3 is modified to one of the following domain modification sequences; D1-D1-D2, D3-D1-D2, D1-D2 (del N 77), D1-D2, D2-D1, D2-D2, D3-D2, D4-D2, D1-D2-D1, D1-D2-D2, D1-D2-D4, D2-D1-D2, D2-D3-D4, D4-D1-D2, D2-D3-D4-D1, D2-D3-D4-D2, D2-D3-D4-D3, D2-D3-D4-D5, D1-D2 (del N 88), D1-D2 (del N 89), D1-D2 (del N 90), D1-D2 (del N 91), D1-D2 (del N 92), D1-D2 (del N 93), D1-D2 (de
  • the above domain variants are classified into the following four groups; (1) The binding between the domain variant of RpPpsR2 and wild-type RpBphP1 is weaker in the dark than the binding between wild-type RpBphP1 and wild-type RpPpsR2, and the binding is weaker under near-infrared light irradiation.
  • D1-D1-D2, D3-D1-D2, D1-D2 (del N 77) (2)
  • the binding between the domain variant of RpPpsR2 and wild-type RpBphP1 is weaker in the dark compared to the binding between wild-type RpBphP1 and wild-type RpPpsR2, and the binding is weaker under near-infrared light irradiation.
  • D1-D2 (del N 64) (4)
  • the binding between the domain variant of RpPpsR2 and wild-type RpBphP1 is stronger under near-infrared light irradiation than the binding between wild-type RpBphP1 and wild-type RpPpsR2, and the binding is stronger in the dark.
  • the RpPpsR2 mutant in this embodiment also includes a mutant having both the above-mentioned point mutation and a mutation due to domain modification. That is, the RpPpsR2 variant in this embodiment has the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 3, D1-D1-D2, D3-D1-D2, D1-D2 (del N 77), D1-D2, D2-D1, D2-D2, D3-D2, D4-D2, D1-D2-D1, D1-D2-D2, D1-D2-D4, D2-D1-D2, D2-D3-D4, D4-D1-D2, D2-D3-D4-D1, D2-D3-D4-D2, D2-D3-D4-D3, D2-D3-D4-D5, D1-D2 (del N 88), D1-D2 (del N 89), D1-D2 (del N 90), D1-D2 (del N 91), D1-D2 (del
  • the D3-D2 variant having the L137E point mutation means a D3-D2 variant in which lysine is substituted with glutamic acid at position 137 of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 3, and as used herein, , marked as D3-D2 (L137E).
  • D3-D2 (L137E) can be mentioned as an RpPpsR2 mutant having both the above domain modification and point mutation, and the binding between D3-D2 (L137E) and wild-type RpBphP1 is different from that between wild-type RpBphP1 and wild-type RpPpsR2. In comparison, this is a mutant that has weaker binding in the dark and weaker binding under near-infrared light irradiation.
  • the protein set according to this embodiment is a set of wild type RpPpsR2 and RpBphP1 mutant,
  • the RpBphP1 mutant has Q514A, D607E, R638A, H661A, R696A, E327A, E332A, E337A, D339A, E365A, Q367A, E429A, R490A, D498A, Q502A, Q502G, Q502V, Q502L, Q502I, Q502S, Q502T, Q502E, Q502K, Q502R, Q502H, Q502 N, Q502F, Q502Y, Q502W, Q502C, Q502M, Q502P, F503A, R504A, R507A, E513G, E513D, E513P, E516A, F518A, S525A, D607A, D60
  • the protein set according to this embodiment is a set of wild type RpBphP1 and RpPpsR2 mutant,
  • the RpPpsR2 variant has Q105T, T133A, L137A, N103A, Q105A, Q105C, Q105H, V107A, T108A, L110A, R113A, L114A, I115A, Q119A, M121A, M121E, R123A, D124A, Y125A, Y125E, W126A, R127A, R129A, E13 2A, R134A, R136A, Q105V, Q105S, Included is a protein set that is a variant consisting of an amino acid sequence having one or more point mutations selected from the group of point mutations consisting of K102A, Q105P, Q105R, L137E, V138A, V138E, F139E, V146A.
  • the protein set according to this embodiment is a set of wild type RpBphP1 and RpPpsR2 mutant,
  • the RpPpsR2 mutant has an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 3 of D1-D1-D2, D3-D1-D2, D1-D2 (del N 77), D1-D2, D2-D1, D2-D2, D3-D2, D3-D2 (L137E), D4-D2, D1-D2-D1, D1-D2-D2, D1-D2-D4, D2-D1-D2 , D2-D3-D4, D4-D1-D2, D2-D3-D4-D1, D2-D3-D4-D2, D2-D3-D4-D3, D2-D3-D4-D5, D1-D2 (del N 88), D1-D2 (del N 89), D1-D2 (del N 90), D1-D2 (del N 91), D1-D2
  • the protein set according to this embodiment is a set of RpBphP1 mutant and RpPpsR2 mutant,
  • the RpBphP1 mutant has Q514A, D607E, R638A, H661A, R696A, E327A, E332A, E337A, D339A, E365A, Q367A, E429A, R490A, D498A, Q502A, Q502G, Q502V, Q502L, Q502I, Q502S, Q502T, Q502E, Q502K, Q502R, Q502H, Q502 N, Q502F, Q502Y, Q502W, Q502C, Q502M, Q502P, F503A, R504A, R507A, E513G, E513D, E513P, E516A, F518A, S525A, D607A, D607
  • the protein set according to this embodiment is a set of RpBphP1 mutant and RpPpsR2 mutant,
  • the RpBphP1 mutant has Q514A, D607E, R638A, H661A, R696A, E327A, E332A, E337A, D339A, E365A, Q367A, E429A, R490A, D498A, Q502A, Q502G, Q502V, Q502L, Q502I, Q502S, Q502T, Q502E, Q502K, Q502R, Q502H, Q502 N, Q502F, Q502Y, Q502W, Q502C, Q502M, Q502P, F503A, R504A, R507A, E513G, E513D, E513P, E516A, F518A, S525A, D607A, D607
  • the binding strength between the proteins constituting the photoswitch protein according to this embodiment is well known in the art.
  • Those skilled in the art can easily measure it by the method or a modified version of the well-known method.
  • Such a method includes, for example, a method using CPTS disclosed in Examples.
  • CPTS CRISPR-Cas9-based photoactivatable transcription system
  • Cas9 mutants lacking DNA cleavage activity can form a complex with guide RNA and bind to the DNA base sequence targeted by guide RNA.
  • protein 1 When an aptamer sequence that binds to a specific protein (for example, "protein 1") is inserted into the loop exposed from dCas9 among the several loop structures of the guide RNA, protein 1 interacts with dCas9 through the aptamer sequence. It becomes possible to combine.
  • One of the photoswitch proteins according to this embodiment is linked to protein 1, and the other protein (for example, "RpPpsR2 mutant") is linked to activate transcription.
  • ligating factors e.g., p65, HSF1, etc.
  • a protein 1-wild type RpBphP1 conjugate and an RpPpsR2 mutant-transcription activator conjugate are prepared.
  • dCas9 binds to the guide RNA near the target DNA base sequence.
  • light near infrared light in this embodiment
  • the wild type RpBphP1 and the RpPpsR2 mutant bind, and the transcriptional activator linked to the RpPpsR2 mutant is anchored near the transcription start site. Ru.
  • transcription of the reporter gene is activated, mRNA transcription occurs, and translation into protein occurs.
  • the wild type RpBphP1 and the RpPpsR2 mutant dissociate, so the transcriptional activator moves far away from the transcription start site and the expression of the gene stops.
  • the binding strength between RpBphP1 mutant and wild-type RpPpsR2, wild-type RpBphP1 and RpPpsR2 mutant, or RpBphP1 mutant and RpPpsR2 mutant can be quantitatively evaluated using the expression level of the reporter gene as an index. can do.
  • the binding strength between the proteins constituting the photoswitch protein according to this embodiment can also be determined by reporter gene assay using TetO-tetR and fluorescence microscopy using translocation to the cell membrane as an indicator. It can also be measured by a method using an assay or the like.
  • Each protein (for example, wild-type RpBphP1 and RpPpsR2 mutant) constituting the photoswitch protein according to the present embodiment has a "different substance (that is, a substance different from each protein constituting the photoswitch protein)". may be combined or fused.
  • the "another substance” is not particularly limited, and may be any substance, including various biological substances such as proteins, lipids, saccharides, and nucleic acids.
  • the optical switch protein according to this embodiment and “another substance” may be bonded via a linker or the like, and when the "another substance” is a protein, they may be fused.
  • protein 1 and “transcription activator” correspond to “another substance.”
  • interacting protein A and protein B may be bound or fused to each protein of the optical switch protein according to this embodiment.
  • the photoswitch protein according to this embodiment when the photoswitch protein according to this embodiment is irradiated with near-infrared light, interaction between protein A and protein B can be induced, and when near-infrared light irradiation is stopped, protein A and protein B can be induced to interact. Can be dissociated. Therefore, by using the photoswitch protein according to this embodiment, it is possible to freely manipulate the interaction between proteins by turning on/off light irradiation.
  • the photoswitch protein according to this embodiment has useful uses (see Non-Patent Document 1 and Non-Patent Document 2, etc.).
  • the second embodiment is a nucleic acid (DNA or RNA) encoding the RpBphP1 variant and the RpPpsR2 variant among the proteins constituting the photoswitch protein according to the present embodiment.
  • the nucleic acid according to this embodiment can be prepared by a method known in the art or an appropriately modified method.
  • a desired nucleic acid may be obtained by introducing a desired mutation into DNA encoding a wild type.
  • it can also be synthesized by an automatic synthesizer.
  • a nucleic acid encoding such a fusion protein is also included in the nucleic acid according to this embodiment.
  • wild-type RpBphP1, wild-type RpPpsR2, RpBphP1 mutant, and RpPpsR2 mutant are each incorporated into a nucleic acid encoding them into an appropriate expression vector, and transformed or transformed into an appropriate host cell with the expression vector. It can be prepared by transfecting the protein, culturing it in an appropriate medium, and purifying each expressed protein.
  • Host cells for protein expression include, for example, bacterial cells (e.g., Escherichia coli B strain , E. coli Kl2 strain, Corynebacterium ammoniagenes , C. glutamicum , Serratia liquefaciens , Streptomyces lividans , Pseudomonas putida, etc.), molds (e.g., Penicillium camembertii , Acremonium chrysogenum , etc.), animal cells, plant cells, baculovirus/insect cells, or yeast cells (eg, Saccharomyces cerevisiae and Pichia pastoris , etc.).
  • bacterial cells e.g., Escherichia coli B strain , E. coli Kl2 strain, Corynebacterium ammoniagenes , C. glutamicum , Serratia liquefaciens , Streptomyces lividans , Pse
  • expression vectors suitable for various host cells can be used.
  • expression vectors include pBR322, pBR325, pUC118, pET, etc. (Escherichia coli host), pEGFP-C, pEGFP-N, etc. (animal cell host), pVL1392, pVL1393, etc. (insect cell host, baculovirus vector), pG -1, Yep13 or pPICZ (yeast cell host) can be used.
  • These expression vectors have replication origins, selection markers, and promoters that are suitable for each vector, and as necessary, enhancers, transcription termination sequences (terminators), ribosome binding sites, polyadenylation signals, etc. may have.
  • the expression vector may have a base sequence inserted therein for expression by fusing FLAG tag, His tag, HA tag, GST tag, etc.
  • Production of expression vectors can be carried out by methods known to those skilled in the art, and can also be carried out using commercially available kits, etc., as appropriate.
  • the bacterial cells or cultured cells are collected by a known method, suspended in an appropriate buffer, and treated with ultrasound, lysozyme and/or After destroying the bacterial bodies or cells by freezing and thawing, a soluble extract is obtained by centrifugation or filtration.
  • a soluble extract is obtained by centrifugation or filtration.
  • Known separation and purification methods include methods that utilize solubility such as salting out and solvent precipitation, methods that mainly utilize differences in molecular weight such as dialysis, ultrafiltration, gel filtration, and SDS-PAGE, and ion Methods that utilize differences in charge such as exchange chromatography, methods that utilize specific affinity such as affinity chromatography (for example, when expressing a polypeptide together with a GST tag, a resin with glutathione bound to a carrier may be used).
  • affinity chromatography for example, when expressing a polypeptide together with a GST tag, a resin with glutathione bound to a carrier may be used.
  • Ni-NTA resin or Co-based resin when the polypeptide is expressed with a His tag anti-HA antibody resin when the polypeptide is expressed with an HA tag
  • anti-HA antibody resin when the polypeptide is expressed with a FLAG tag.
  • methods using anti-FLAG antibody binding resin, etc. methods that utilize differences in hydrophobicity such as reversed-phase high performance
  • Experimental method 1-1 Wild-type RpBphP1 gene and wild-type RpPpsR2 gene
  • the wild-type RpBphP1 gene (SEQ ID NO: 4) and the wild-type RpPpsR2 gene (SEQ ID NO: 5) were purchased from GenScript's artificial gene synthesis service. At that time, the company's codon optimization algorithm was used to optimize human codons.
  • Point mutations can be introduced into RpBphP1 and RpPpsR2 using the overlap extension PCR method (Ho, S. N et al., Gene 77: 51-59 1989) or the transfer PCR method (Erijman et al., J. Struct. Biol. 175: 171-177 2011).
  • oligo DNA used as primers was purchased from Eurofins genomics.
  • Takara Bio Inc.'s PrimeSTAR HS DNA polymerase was used as the DNA polymerase, and the PCR reaction conditions were according to the instruction manual of the product.
  • the obtained PCR product fragment was treated with restriction enzymes and ligated with a vector treated with the same restriction enzymes. Restriction enzymes from Takara Bio or New England Bio were used, and Ligation high Ver. 2 from TOYOBO was used for the ligation reaction. Reaction conditions were in accordance with each product's instruction manual.
  • pcDNA3.1-V5HisA a mammalian cell expression vector from Invitrogen. The ligation product was mixed with Mach1 chemical competent cells from Invitrogen and transformed by heat shock at 42°C. Plasmids were cloned from transformed E. coli according to standard methods for genetic engineering experiments.
  • the sequence of the obtained plasmid was confirmed by the sequence contract service of Eurofins genomics.
  • a plasmid in which the wild-type sequence was cloned into pcDNA3.1-V5HisA was prepared, and a transfer PCR reaction was performed using this as a template.
  • the wild-type template plasmid was digested using Dpn I from Takara Bio.
  • the products after the digestion reaction were transformed into Mach1 chemical competent cells and cloned according to the standard method for genetic engineering experiments.
  • the sequence of the obtained plasmid was confirmed by the sequence contract service of Eurofins genomics.
  • Domain shuffling Domain shuffling of RpPpsR2 was performed as follows. First, we added a restriction enzyme site to the domain we wanted to shuffle. PCR amplification was performed using a conventional PCR method using primers designed to contain restriction enzyme sites. The obtained domain fragment was cloned into pcDNA3.1-V5HisA, and the sequence was confirmed by the sequence contract service of Eurofins genomics. The sequence-confirmed domain fragments were excised by restriction enzyme treatment, ligated in desired combinations, and cloned into pcDNA3.1-V5HisA.
  • a domain-deleted product of RpPpsR2 was prepared as follows using a conventional PCR method. In order to delete the N-terminus or C-terminus of the desired domain, design primers to cause deletions on the 5' or 3' side of the domain DNA. Amplify the deleted domain using standard PCR methods. The obtained deleted domain fragment was cloned into pcDNA3.1-V5HisA, and the sequence was confirmed by the sequence contract service of Eurofins genomics.
  • CRISPR-Cas9-based photoactivatable transcription system CPTS
  • CPTS CRISPR-Cas9-based photoactivatable transcription system
  • the CPTS system consists of the following four components: (1) A mutant that lacks DNA cleavage activity by introducing mutations into the 10th and 840th amino acids of Cas9 (Cas9D10A/H840A; dCas9), (2) Insertion of an aptamer sequence that binds to MS2 coat protein (3) one side of the photoswitch protein pair linked to the MS2 coat protein, and (4) the other side of the photoswitch protein pair linked to the transcriptional activator (p65-HSF1).
  • the photoswitch protein pair of this time is an RpBphP1 mutant and an RpPpsR2 mutant
  • the RpBphP1 mutant and p65-HSF1 were linked
  • the RpPpsR2 mutant and the MS2 coat protein were linked.
  • the p65-HSF1 DNA was amplified by PCR from Addgene plasmid #61423 purchased from Addgene, followed by subcloning, and the sequence was confirmed using the sequence contract service of Eurofins genomics.
  • the DNA of MS2 coat protein (MS2 delta FG) was amplified by PCR from Addgene plasmid #27122 purchased from Addgene, followed by subcloning, and the sequence was confirmed using the sequence contract service of Eurofins genomics.
  • dCas9 As streptococcus pyogenes-derived Cas9 (SpCas9) DNA optimized for human codons, Addgene plasmid #42230 hSpCas9 purchased from Addgene was used. In order to delete the DNA cleavage activity of hSpCas9, point mutations of D10A and H840A were introduced using Agilent's Quick change Multi Site-Directed Mutagenesis Kit according to the instruction manual. In addition, SV40-derived nuclear localization signals (NLS) were added to the N-terminus and C-terminus by PCR. The thus obtained NLS-dSpCas9-NLS was cloned into pcDNA3.1-V5HisA, and then its sequence was confirmed using the sequence contract service of Eurofins genomics.
  • SpCas9 streptococcus pyogenes-derived Cas9
  • pSPgRNA vector (Addgene plasmid #47108) was purchased from Addgene and used.
  • the aptamer sequence that binds to MS2 coat protein was purchased from Eurofins genomics' artificial gene synthesis service.
  • the synthesized aptamer sequence was cloned into the Kpn I/Sac I site of pSPgRNA vector.
  • a sequence targeting the upstream activation sequence of the GAL4/UAS system was inserted into the Bbs I site of the constructed vector. This target sequence was created by annealing oligo DNA purchased from Eurofins genomics.
  • the sequence of the completed aptamer-attached guide RNA was confirmed by the sequence contract service of Eurofins genomics.
  • Luminescence Reporter Plasmid To easily evaluate the function of the mutant, we used the increase or decrease in luminescence signal as an indicator. For this purpose, we used a reporter plasmid whose luminescent reporter gene is activated by CPTS in a light irradiation-dependent manner. Using Promega's pGL4.31, which carries the upstream activation sequence of the GAL4/UAS system, we transferred the downstream luminescent reporter gene from the short-lived firefly luciferase gene to the normal-lived firefly luciferase gene. used. The aptamer-attached guide RNA described above is designed to bind to this upstream activation sequence.
  • HEK293T cells were obtained from American Type Culture Collection (ATCC). The medium was Dulbecco's Modified Eagle medium supplemented with 10% FBS (Gibco), 100 units/mL penicillin and 100 ⁇ g/mL streptomycin (Gibco), and 0.584 g/L L-glutamine (Gibco). The cells were cultured using medium (DMEM, Sigma Aldrich) in an incubator at 37° C. and 5% CO 2 .
  • DMEM Dulbecco's Modified Eagle medium supplemented with 10% FBS (Gibco), 100 units/mL penicillin and 100 ⁇ g/mL streptomycin (Gibco), and 0.584 g/L L-glutamine (Gibco). The cells were cultured using medium (DMEM, Sigma Aldrich) in an incubator at 37° C. and 5% CO 2 .
  • WT-03N CUSTOM ON/OFF timer
  • CPTS luminescence reporter assay (1) Cell seeding First, HEK293T cells were seeded in a 96-well black-walled plate (Greiner Bio). 100 ⁇ L of the cell suspension was placed in each well so that the cell concentration was 2.3 ⁇ 10 4 cells/well. When biliverdin (BV; Frontier Scientific) was added, it was added at a final concentration of 25 ⁇ M. Since BV has the property of being easily decomposed by light, the work was carried out in the dark. The plate seeded with cells was cultured in an incubator at 37°C and 5% CO2 for 24 hours.
  • BV biliverdin
  • Plasmid transfection Plasmid transfection was performed using either method (A) or (B) below.
  • pcDNA3.1 V5/His-A vector and a plasmid encoding GAL4UAS-Firefly Luciferase reporter were introduced at a ratio of 4:1. After gene introduction, the plate was immediately wrapped in aluminum foil to protect it from light and returned to the incubator.
  • PEI MAX Transfection Grade Linear Polyethylenimine Hydrochloride; Polysciences
  • the PEI MAX was set to 0.6 ⁇ L/well, and the plasmid used in the experiment was introduced. The total amount of DNA introduced was 0.1 ⁇ g per well. Plasmids encoding SpCas9, guide RNA, MS2-RpPpsR2, RpBphP1-p65HSF1, and GAL4UAS-Firefly Luciferase reporter were introduced at a ratio of 1:1:1:1:1.
  • plasmids encoding the pcDNA3.1 V5/His-A vector and the GAL4UAS-Firefly Luciferase reporter were introduced at a ratio of 4:1. After gene introduction, the plate was immediately wrapped in aluminum foil to protect it from light and returned to the incubator.
  • Intracellular genomic gene activation by CPTS (1) Cell seeding First, HEK293T cells were seeded in a 96-well plate (Thermo Fisher Scientific). 100 ⁇ L of the cell suspension was placed in each well so that the cell concentration was 2.3 ⁇ 10 4 cells/well. When BV was added, it was added to a final concentration of 25 ⁇ M. Furthermore, since BV has the property of being easily decomposed by light, the work was carried out in a dark place. The plate seeded with cells was cultured for 24 hours in an incubator at 37°C and 5% CO2 .
  • Plasmids encoding dSpCas9, guide RNA, MS2-RpPpsR2, and RpBphP1-p65HSF1 were introduced at a ratio of 1:1:1:1.
  • a guide RNA plasmid without a target sequence was used as a negative control. After gene introduction, the plate was immediately wrapped in aluminum foil to protect it from light and returned to the incubator.
  • the IDs of the TaqMan probes used are as follows; Human ASCL1 gene: Hs04187546_g1 Human HBG1 gene: Hs00361131_g1 Human MYOD1 gene: Hs02330075_g1 Human IL1R2 gene: Hs01030384_m1 Human GAPDH gene: Hs99999905_m1
  • a StepOnePlus system (Thermo Fisher Scientific) was used as the thermal cycler and software for real-time PCR.
  • the standard ⁇ Ct method was used to measure the mRNA expression level relative to that of untransfected HEK293T cells.
  • mice 1-11-3.
  • CPTS In vivo gene activation in mice by CPTS (1) Preparation of experimental mice Animal experiments using mice were conducted in accordance with the animal experiment implementation manual and experimental guidelines established by the University of Tokyo. Six-week-old female BALB/c mice (Sankyo Labo Service) were used.
  • Bioluminescence imaging of mouse liver cells was performed 25 hours after injection. 200 ⁇ L of 10 mM Akalumine-HCl (Fujifilm Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) was intraperitoneally injected into the mouse. After the injection, mice were anesthetized with isoflurane (Fujifilm Wako Pure Chemical Industries, Ltd.). After anesthesia, bioluminescence images of the mice were taken using a Lumazone bioluminescence imager (Shoshin) equipped with an Evolve 512 EMCCD camera (Photometrics). Data were analyzed using SlideBook 4.2 software (Intelligent Innovations).
  • Genomic gene activation in mouse liver cells Using guide RNA targeting the mouse ASCL1 gene, dSpCas9, guide RNA, MS2-RpPpsR2, and RpBphP1-p65HSF1 were combined at a ratio of 1:1:1:1. Gene introduction was performed using the Hydrodynamic Tail Vein Injection method. The total amount of plasmid DNA was 120 ⁇ g per mouse. Light irradiation is the same as in the case of the luminescent reporter gene described above. After light irradiation, mRNA was extracted from the mouse liver. Mouse liver was crushed using Precellys Evolution tissue homogenizer (Bertin Instruments).
  • the extracted mRNA was reverse transcribed into cDNA using Superscript IV VILO Master Mix (Thermo Fisher Scientific). The procedure followed the instruction manual. After reverse transcription, cDNA amount was evaluated by real-time PCR.
  • Luna Universal Probe qPCR Master Mix New England Biolabs
  • TaqMan Gene Expression Assay Thermo Fisher Scientific
  • the IDs of the TaqMan probes used are as follows; Mouse ASCL1 gene: Mm03058063_m1 Mouse GAPDH gene: Mm99999915_g1
  • a StepOnePlus system (Thermo Fisher Scientific) was used as the thermal cycler and software for real-time PCR.
  • the standard ⁇ Ct method was used to measure mRNA expression levels relative to that of untransfected mouse liver cells.
  • This guide RNA has been devised.
  • Factors that activate transcription p65 and HSF1 are linked to the other photoswitch protein.
  • the photoswitch protein binds, and as a result, the transcriptional activator is anchored near the transcription start site. This activates transcription of the gene, causing mRNA transcription and translation into protein.
  • the photoswitch protein dissociates, so the transcriptional activator moves far away from the transcription initiation site, and the expression of the gene in question stops. In this way, a gene encoded on the genome or a luminescent reporter gene on a luminescent reporter plasmid can be switched on or off by light.
  • the photoswitch protein consisting of the RpPpsR2 mutant with a mutation in Q105S and wild-type RpBphP1 has a high NIR signal without being affected by the dark leak signal (Figure 5b).
  • Mutations like Q105S are promising amino acid mutation candidates for improving the function of RpPpsR2 in combination with other mutations.
  • the present inventors found that the binding to RpBphP1 was also changed by deleting the N-terminal side or the C-terminal side within the RpPpsR2 domain (domain deletion product).
  • a domain variant in which the N-terminal side or the C-terminal side of one of the domain shuffles (D1-D2) of RpPpsR2 is deleted has a change in the binding property with RpBphP1.
  • the domain variant D1-D2 (del C 15) significantly reduced the Dark leak signal and increased light-dependent activation by 9.6-fold ( Figure 8b).
  • domain variant D1-D2 (del N 77) reduced the Dark leak signal without reducing the NIR signal ( Figure 8b).
  • Such domain modification including amino acid deletion is promising for improving the function of RpPpsR2 in combination with other mutations.
  • mutants with increased NIR signals were found (FIGS. 9a and b).
  • D1-D2 (del N 64) increases the NIR signal without changing the Dark leak signal ( Figure 9b).
  • Such domain variants are promising for improving the function of RpPpsR2 in combination with other mutations.
  • D1-D2 (del N 93), which is one of the domain variants containing a deletion
  • a deletion variant in which the C-terminal side was deleted was investigated (see FIG. 11a). As a result, it was found that deletion of the C-terminal side further reduced the dark leak signal ( Figure 11b). Domain variants containing such deletions are promising for improving the function of RpPpsR2 in combination with other mutations.
  • FIG. 12 shows possible combinations when there are multiple mutations/modifications that lower the Dark leak signal and mutations/modifications that increase the NIR signal in RpBphP1 and RpPpsR2. There are 12 pattern combinations in total. As a result of this combination, the researchers found that a photoswitch protein with multiple beneficial mutations has a cumulative effect of the mutations, further improving its function. A specific explanation will be given below.
  • RpBphP1 and RpPpsR2 are combination 4 in Figure 12
  • the combination pattern of RpBphP1 and RpPpsR2 is combination 11 in Figure 12, in which an RpPpsR2 mutant that has both domain modification and point mutation was combined with an RpBphP1 mutant that lowers the dark leak signal.
  • the combination pattern of RpBphP1 and RpPpsR2 is combination 12 in FIG. 12, in which an RpPpsR2 mutant having both domain modification and point mutations was combined with an RpBphP1 mutant having multiple point mutations.
  • the present invention provides a photoswitch protein whose binding and dissociation can be precisely controlled by turning on/off irradiation with near-infrared light.
  • the functions of the photoswitch protein of the present invention introduced into a living body can be controlled by near-infrared light from outside the living body, so it can be used for the treatment of diseases, etc., and is useful in the medical field. There is expected.

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Abstract

本発明は、近赤外光の光照射および遮断によって、結合および解離を確実に制御することができるように改良を加えた、RpBphP1変異体およびRpPpsR2変異体の提供を課題とする。より具体的には、本発明は、近赤外光照射下で結合する2つのタンパク質からなるタンパク質セットであって、当該タンパク質セットはRpBphP1変異体と野生型RpPpsR2のセット、野生型RpBphP1とRpPpsR2変異体のセット、または、RpBphP1変異体とRpPpsR2変異体のセットであり、当該タンパク質セットの結合が、野生型RpBphP1と野生型RpPpsR2の結合と比較して、暗所下での結合が弱い、および／または近赤外光照射下での結合が強い、タンパク質セットである。

Description

長波長の光照射で機能する光スイッチタンパク質
　本発明は、光照射により、結合および解離を制御し得るタンパク質のセットに関する。
　生体物質の１つであるタンパク質は、生体内で様々な機能を担っている。例えば、タンパク質同士で相互作用を行うことで、細胞内でのシグナル伝達や物質輸送などの生命の根本をなすシステムの制御に関わっている。近年、オプトジェネティクス技術の発展に伴い、光操作により、生体内におけるタンパク質間相互作用をコントロールするための技術が開発されており、例えば、光スイッチタンパク質などが現在注目を浴びている。
　光スイッチタンパク質とは、光照射のON/OFFによって、結合および解離を制御することができるタンパク質ペアである（特許文献１）。光操作により光スイッチタンパク質の結合／解離を通じて、細胞内における様々な現象、例えば、シグナル伝達、ゲノム編集、遺伝子発現などをコントロールすることが可能である（非特許文献１および非特許文献２）。ところで、これまでは、青色光（～470 nm）で制御できる光スイッチタンパク質が広く光操作に用いられてきた。しかし、青色光はヘモグロビンなどに吸収されるため、生体組織の透過性が低く、青色光で操作可能な光スイッチタンパク質は、生体内における光操作の使用には十分な効果を発揮できていなかった。そのため、ヘモグロビンに吸収されず、生体組織透過性の高い、近赤外光によって操作可能な光スイッチタンパク質の使用が望まれていた。そんな折り、ある研究グループが、バクテリア（Rhodopseudomonas palustris）が持つ光受容体（RpBphP1）とその結合タンパク質（RpPpsR2）が、近赤外光の照射によって光スイッチタンパク質として、利用できることを報告した（非特許文献３および４）。
　RpBphP1とRpPpsR2の結合および解離は、生体組織透過性の高い近赤外光によって制御することが可能であること、また、RpBphP1 が光を受容するために必要とする補因子であるビリベルジン（Biliverdin）は、哺乳類を含む様々な動物種の細胞内に広く存在することなどから、医療分野における利用が期待された。しかしながら、野生型のRpBphP1とRpPpsR2のペアは、暗所下、すなわち、光が照射されていない状態においても、結合してしまうため、結合および解離を光照射で確実に制御することが難しいという問題を抱えていた。
特開２０１５－１６５７７６
Kawanoら, Nature Chemical Biology 12:1059-1064 2016. Kawanoら, Nature Communications 6:6256 2015. Kaberniukら, Nature Methods 13:591-597 2016. Redchukら, Nature Chemical Biology 13:633-639 2017.
　上記事情に鑑み、本発明は、近赤外光の光照射および遮断によって、結合および解離を確実に制御することができるように改良を加えた、RpBphP1変異体およびRpPpsR2変異体の提供を課題とする。
　発明者らは、RpBphP1とRpPpsR2の様々な変異体を作製したところ、近赤外光の光照射のON/OFFにより、結合および解離を確実に制御することが可能な、変異体と野生型の組み合わせ、または変異体同士の組み合わせを見出すことに成功した。
　すなわち、本発明は以下の（１）～（１３）である。
（１）近赤外光照射下で結合する2つのタンパク質からなるタンパク質セットであって、
当該タンパク質セットはRpBphP1変異体と野生型RpPpsR2のセット、野生型RpBphP1とRpPpsR2変異体のセット、または、RpBphP1変異体とRpPpsR2変異体のセットであり、当該タンパク質セットの結合が、野生型RpBphP1と野生型RpPpsR2の結合と比較して、暗所下での結合が弱い、および／または近赤外光照射下での結合が強い、タンパク質セット。
（２）前記野生型RpBphP1が、配列番号１または配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質、または配列番号１または配列番号２で表されるアミノ酸配列と90%以上の配列同一性を有するタンパク質であり、前記野生型RpPpsR2が、配列番号３で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質、または配列番号３で表されるアミノ酸配列と90%以上の配列同一性を有するタンパク質である、上記（１）に記載のタンパク質セット。
（３）前記タンパク質セットが、野生型RpPpsR2とRpBphP1変異体のセットであって、
当該RpBphP1変異体が、配列番号１または配列番号２で表されるアミノ酸配列中に、Q514A、D607E、 R638A、H661A、R696A、E327A、E332A、E337A、D339A、E365A、Q367A、E429A、R490A、D498A、Q502A、Q502G、Q502V、Q502L、Q502I、Q502S、Q502T、Q502E、Q502K、Q502R、Q502H、Q502N、Q502F、Q502Y、Q502W、Q502C、Q502M、Q502P、F503A、R504A、R507A、E513G、E513D、E513P、E516A、F518A、S525A、D607A、D607G、D607V、D607L、D607I、D607S、D607T、D607K、D607R、D607H、D607N、D607Q、D607F、D607W、D607C、D607M、D607P、E613A、R636A、F639A、D654A、E678A、Y681A、E693A、H712D、H712E、H712P、R512A、E513V、E513A、E513L、E513T、E513M、Q521Aからなる点変異のグループから選択される１または複数の点変異を有するアミノ酸配列からなる変異体のいずれかである、上記（２）に記載のタンパク質セット。
（４）前記タンパク質セットが、野生型RpBphP1とRpPpsR2変異体のセットであって、
当該RpPpsR2変異体が、配列番号３で表されるアミノ酸配列中にQ105T、T133A、L137A、N103A、Q105A、Q105C、Q105H、V107A、T108A、L110A、R113A、L114A、I115A、Q119A、M121A、M121E、R123A、D124A、Y125A、Y125E、W126A、R127A、R129A、E132A、R134A、R136A、Q105V、Q105S、K102A、Q105P、Q105R、L137E、V138A、V138E、F139E、V146Aからなる点変異のグループから選択される１または複数の点変異を有するアミノ酸配列からなる変異体のいずれかである、上記（２）に記載のタンパク質セット。
（５）前記タンパク質セットが、野生型RpBphP1とRpPpsR2変異体のセットであって、
当該RpPpsR2変異体が、配列番号３で表されるアミノ酸配列がD1-D1-D2、D3-D1-D2、D1-D2 (del N 77)、D1-D2、D2-D1、D2-D2、D3-D2、D3-D2（L137E）、D4-D2、D1-D2-D1、D1-D2-D2、D1-D2-D4、D2-D1-D2、D2-D3-D4、D4-D1-D2、D2-D3-D4-D1、D2-D3-D4-D2、D2-D3-D4-D3、D2-D3-D4-D5、D1-D2 (del N 88)、D1-D2 (del N 89)、D1-D2 (del N 90)、D1-D2 (del N 91)、D1-D2 (del N 92)、D1-D2 (del N 93)、D1-D2 (del N 94)、D1-D2 (del N 95)、D1-D2 (del N 96)、D1-D2 (del N 97)、D1-D2 (del C 5)、D1-D2 (del C 15)、D1-D2 (del N 93)(del C 5)、D1-D2 (del N 93)(del C 6)、D1-D2 (del N 93)(del C 11)、D1-D2 (del N 93)(del C 12)、D1-D2-D3 (del C 25)、D1-D2-D3 (del C 41)、D1-D2-D3 (del C 49)、D1-D2-D3 (del C 70)、D1-D2-D3 (del C 87)、D1-D2-D3 (del C 96)、D1-D2-D3 (del C 104)、D1-D2 (del N 64)、D2-D3、D1-D2-D3、D2-D2-D3、D2-D3-D1、D2-D3-D3、D3-D2-D3、D4-D2-D3、D1-D1-D2-D3、D1-D2-D3-D1、D1-D2-D3-D2、D1-D2-D3-D3、D1-D2-D3-D4、D2-D1-D2-D3、D2-D2-D3-D4、D2-D3-D4-D4、D3-D1-D2-D3、D3-D2-D3-D4、D1-D2 (del N 15)、D1-D2 (del N 33)、D1-D2 (del N 47)またはD1-D2-D3 (del C 9)のいずれかに改変されたアミノ酸配列からなる変異体である、上記（２）に記載のタンパク質セット。
（６）前記タンパク質セットが、RpBphP1変異体とRpPpsR2変異体のセットであって、
当該RpBphP1変異体が、配列番号１または配列番号２で表されるアミノ酸配列中にQ514A、D607E、 R638A、H661A、R696A、E327A、E332A、E337A、D339A、E365A、Q367A、E429A、R490A、D498A、Q502A、Q502G、Q502V、Q502L、Q502I、Q502S、Q502T、Q502E、Q502K、Q502R、Q502H、Q502N、Q502F、Q502Y、Q502W、Q502C、Q502M、Q502P、F503A、R504A、R507A、E513G、E513D、E513P、E516A、F518A、S525A、D607A、D607G、D607V、D607L、D607I、D607S、D607T、D607K、D607R、D607H、D607N、D607Q、D607F、D607W、D607C、D607M、D607P、E613A、R636A、F639A、D654A、E678A、Y681A、E693A、H712D、H712E、H712P、R512A、E513V、E513A、E513L、E513T、E513M、Q521Aからなる点変異のグループから選択される１または複数の点変異を有するアミノ酸配列からなる変異体のいずれかであり、
当該RpPpsR2変異体が、配列番号３で表されるアミノ酸配列中にQ105T、T133A、L137A、N103A、Q105A、Q105C、Q105H、V107A、T108A、L110A、R113A、L114A、I115A、Q119A、M121A、M121E、R123A、D124A、Y125A、Y125E、W126A、R127A、R129A、E132A、R134A、R136A、Q105V、Q105S、K102A、Q105P、Q105R、L137E、V138A、V138E、F139E、V146Aからなる点変異のグループから選択される１または複数の点変異を有するアミノ酸配列からなる変異体のいずれかである、上記（２）に記載のタンパク質セット。
（７）前記タンパク質セットが、RpBphP1変異体とRpPpsR2変異体のセットであって、
当該RpBphP1変異体が、配列番号１または配列番号２で表されるアミノ酸配列中にQ514A、D607E、 R638A、H661A、R696A、E327A、E332A、E337A、D339A、E365A、Q367A、E429A、R490A、D498A、Q502A、Q502G、Q502V、Q502L、Q502I、Q502S、Q502T、Q502E、Q502K、Q502R、Q502H、Q502N、Q502F、Q502Y、Q502W、Q502C、Q502M、Q502P、F503A、R504A、R507A、E513G、E513D、E513P、E516A、F518A、S525A、D607A、D607G、D607V、D607L、D607I、D607S、D607T、D607K、D607R、D607H、D607N、D607Q、D607F、D607W、D607C、D607M、D607P、E613A、R636A、F639A、D654A、E678A、Y681A、E693A、H712D、H712E、H712P、R512A、E513V、E513A、E513L、E513T、E513M、Q521Aからなる点変異のグループから選択される１または複数の点変異を有するアミノ酸配列からなる変異体のいずれかであり、
当該RpPpsR2変異体が、配列番号３で表されるアミノ酸配列がD1-D1-D2、D3-D1-D2、D1-D2 (del N 77)、D1-D2、D2-D1、D2-D2、D3-D2、D3-D2（L137E）、D4-D2、D1-D2-D1、D1-D2-D2、D1-D2-D4、D2-D1-D2、D2-D3-D4、D4-D1-D2、D2-D3-D4-D1、D2-D3-D4-D2、D2-D3-D4-D3、D2-D3-D4-D5、D1-D2 (del N 88)、D1-D2 (del N 89)、D1-D2 (del N 90)、D1-D2 (del N 91)、D1-D2 (del N 92)、D1-D2 (del N 93)、D1-D2 (del N 94)、D1-D2 (del N 95)、D1-D2 (del N 96)、D1-D2 (del N 97)、D1-D2 (del C 5)、D1-D2 (del C 15)、D1-D2 (del N 93)(del C 5)、D1-D2 (del N 93)(del C 6)、D1-D2 (del N 93)(del C 11)、D1-D2 (del N 93)(del C 12)、D1-D2-D3 (del C 25)、D1-D2-D3 (del C 41)、D1-D2-D3 (del C 49)、D1-D2-D3 (del C 70)、D1-D2-D3 (del C 87)、D1-D2-D3 (del C 96)、D1-D2-D3 (del C 104)、D1-D2 (del N 64)、D2-D3、D1-D2-D3、D2-D2-D3、D2-D3-D1、D2-D3-D3、D3-D2-D3、D4-D2-D3、D1-D1-D2-D3、D1-D2-D3-D1、D1-D2-D3-D2、D1-D2-D3-D3、D1-D2-D3-D4、D2-D1-D2-D3、D2-D2-D3-D4、D2-D3-D4-D4、D3-D1-D2-D3、D3-D2-D3-D4、D1-D2 (del N 15)、D1-D2 (del N 33)、D1-D2 (del N 47)またはD1-D2-D3 (del C 9)のいずれかに改変されたアミノ酸配列からなる変異体である、上記（２）に記載のタンパク質セット。
（８）RpBphP1変異体であって、配列番号１または配列番号２で表されるアミノ酸配列中に、以下の点変異のいずれか１または複数の変異を有するアミノ酸配列からなる、前記RpBphP1変異体；
Q514A、D607E、 R638A、H661A、R696A、E327A、E332A、E337A、D339A、E365A、Q367A、E429A、R490A、D498A、Q502A、Q502G、Q502V、Q502L、Q502I、Q502S、Q502T、Q502E、Q502K、Q502R、Q502H、Q502N、Q502F、Q502Y、Q502W、Q502C、Q502M、Q502P、F503A、R504A、R507A、E513G、E513D、E513P、E516A、F518A、S525A、D607A、D607G、D607V、D607L、D607I、D607S、D607T、D607K、D607R、D607H、D607N、D607Q、D607F、D607W、D607C、D607M、D607P、E613A、R636A、F639A、D654A、E678A、Y681A、E693A、H712D、H712E、H712P、R512A、E513V、E513A、E513L、E513T、E513M、Q521A。
（９）RpPpsR2変異体であって、配列番号３で表されるアミノ酸配列中に、以下の点変異のいずれか１または複数の変異を有するアミノ酸配列からなる、前記RpPpsR2変異体；
Q105T、T133A、L137A、N103A、Q105A、Q105C、Q105H、V107A、T108A、L110A、R113A、L114A、I115A、Q119A、M121A 、M121E、R123A、D124A、Y125A、Y125E、W126A、R127A、R129A、E132A、R134A、R136A、Q105V、Q105S、K102A、Q105P、Q105R、L137E、V138A、V138E、F139E、V146A。
（１０）RpPpsR2変異体であって、配列番号３で表されるアミノ酸配列が、以下のいずれかに改変されたアミノ酸配列からなる変異体である、前記RpPpsR2変異体；
D1-D1-D2、D3-D1-D2、D1-D2 (del N 77)、D1-D2、D2-D1、D2-D2、D3-D2、D3-D2（L137E）、D4-D2、D1-D2-D1、D1-D2-D2、D1-D2-D4、D2-D1-D2、D2-D3-D4、D4-D1-D2、D2-D3-D4-D1、D2-D3-D4-D2、D2-D3-D4-D3、D2-D3-D4-D5、D1-D2 (del N 88)、D1-D2 (del N 89)、D1-D2 (del N 90)、D1-D2 (del N 91)、D1-D2 (del N 92)、D1-D2 (del N 93)、D1-D2 (del N 94)、D1-D2 (del N 95)、D1-D2 (del N 96)、D1-D2 (del N 97)、D1-D2 (del C 5)、D1-D2 (del C 15)、D1-D2 (del N 93)(del C 5)、D1-D2 (del N 93)(del C 6)、D1-D2 (del N 93)(del C 11)、D1-D2 (del N 93)(del C 12)、D1-D2-D3 (del C 25)、D1-D2-D3 (del C 41)、D1-D2-D3 (del C 49)、D1-D2-D3 (del C 70)、D1-D2-D3 (del C 87)、D1-D2-D3 (del C 96)、D1-D2-D3 (del C 104)、D1-D2 (del N 64)、D2-D3、D1-D2-D3、D2-D2-D3、D2-D3-D1、D2-D3-D3、D3-D2-D3、D4-D2-D3、D1-D1-D2-D3、D1-D2-D3-D1、D1-D2-D3-D2、D1-D2-D3-D3、D1-D2-D3-D4、D2-D1-D2-D3、D2-D2-D3-D4、D2-D3-D4-D4、D3-D1-D2-D3、D3-D2-D3-D4、D1-D2 (del N 15)、D1-D2 (del N 33)、D1-D2 (del N 47)およびD1-D2-D3 (del C 9)。
（１１）上記（８）に記載のいずれかのRpBphP1変異体をコードする核酸。
（１２）上記（９）に記載のいずれかのRpPpsR2変異体をコードする核酸。
（１３）上記（１０）に記載のいずれかのRpPpsR2変異体をコードする核酸。
　なお、本明細書において「～」の符号は、その左右の値を含む数値範囲を示す。
　本発明にかかる光スイッチタンパク質（すなわち、RpBphP1変異体と野生型RpPpsR2の組合せ（セット）、野生型RpBphP1とRpPpsR2変異体の組合せ（セット）、またはRpBphP1変異体とRpPpsR2変異体の組合せ（セット））は、近赤外光の照射および遮断によって、その結合および解離を確実に制御することができる。従って、本発明にかかる光スイッチタンパク質は、生体内においても、近赤外光によって、その結合および解離を確実に制御することが可能である。
野生型RpBphP1と野生型RpPpsR2からなる光スイッチタンパク質の機能の確認。（ａ）はCPTS（CRISPR-Cas9-based photoactivatable transcription system）の概略図である。（ｂ）は暗所下および近赤外光照射下における野生型RpBphP1と野生型RpPpsR2の結合状態を確認した結果である。 RpBphP1変異体と野生型RpPpsR2からなる光スイッチタンパク質の機能解析（その１）。点変異を導入したRpBphP1と野生型RpPpsR2の、暗所下および近赤外光照射下における結合状態を解析した結果を示す（ａ～ｃ）。 RpBphP1変異体と野生型RpPpsR2からなる光スイッチタンパク質の機能解析（その２）。点変異を導入したRpBphP1と野生型RpPpsR2の、暗所下および近赤外光照射下における結合状態を解析した結果を示す（ａおよびｂ） 野生型RpBphP1とRpPpsR2変異体からなる光スイッチタンパク質の機能解析（その１）。点変異を導入したRpPpsR2と野生型RpBphP1の、暗所下および近赤外光照射下における結合状態を解析した結果を示す（ａおよびｂ）。 野生型RpBphP1とRpPpsR2変異体からなる光スイッチタンパク質の機能解析（その２）。点変異を導入したRpPpsR2と野生型RpBphP1の、暗所下および近赤外光照射下における結合状態を解析した結果を示す（ａ～ｃ）。 野生型RpBphP1とRpPpsR2ドメイン改変体からなる光スイッチタンパク質の機能解析（その１）。暗所下および近赤外光照射下における、野生型RpBphP1とRpPpsR2ドメイン改変体との結合状態を解析した結果を示す（ａおよびｂ）。 野生型RpBphP1とRpPpsR2ドメイン改変体からなる光スイッチタンパク質の機能解析（その２）。暗所下および近赤外光照射下における、野生型RpBphP1とRpPpsR2ドメイン改変体との結合状態を解析した結果を示す。 野生型RpBphP1とドメイン内に欠失を含むRpPpsR2ドメイン改変体からなる光スイッチタンパク質の機能解析（その１）。ａに示すアミノ酸配列（配列番号６）は、RpPpsR2のD1-D2ドメインのアミノ酸配列である。D1-D2 (del N 77)、D1-D2 (del N 93)およびD1-D2 (del C 15)は、各々、N末端側77アミノ酸の欠失、N末端側93アミノ酸の欠失およびC末端側15アミノ酸の欠失を有するD1-D2改変体のアミノ酸配列を示す。ｂは、暗所下および近赤外光照射下における、野生型RpBphP1とドメイン内に欠失を含むRpPpsR2ドメイン改変体との結合状態を解析した結果を示す。 野生型RpBphP1とドメイン内に欠失を含むRpPpsR2ドメイン改変体からなる光スイッチタンパク質の機能解析（その２）。ａに示すアミノ酸配列（配列番号６）は、RpPpsR2のD1-D2ドメインのアミノ酸配列である。D1-D2 (del N 47)およびD1-D2 (del N 64)は、各々、N末端側47アミノ酸の欠失およびN末端側64アミノ酸の欠失を有するD1-D2改変体のアミノ酸配列を示す。ｂは、暗所下および近赤外光照射下における、野生型RpBphP1とドメイン内に欠失を含むRpPpsR2ドメイン改変体との結合状態を解析した結果を示す。 野生型RpBphP1とドメイン内に欠失を含むRpPpsR2ドメイン改変体からなる光スイッチタンパク質の機能解析（その３）。ａに示すアミノ酸配列（配列番号６）は、RpPpsR2のD1-D2ドメインのアミノ酸配列である。D1-D2 (del N 88)、D1-D2 (del N 93) およびD1-D2 (del N 97)は、各々、N末端側88アミノ酸の欠失、N末端側93アミノ酸の欠失およびN末端側97アミノ酸の欠失を有するD1-D2改変体のアミノ酸配列を示す。ｂは、暗所下および近赤外光照射下における、野生型RpBphP1とドメイン内に欠失を含むRpPpsR2ドメイン改変体との結合状態を解析した結果を示す。 野生型RpBphP1とドメイン内に欠失を含むRpPpsR2ドメイン改変体からなる光スイッチタンパク質の機能解析（その４）。ａに示すアミノ酸配列（配列番号６）は、RpPpsR2のD1-D2ドメインのアミノ酸配列である。D1-D2 (del N 93)、D1-D2 (del N 93) (del C 5)  およびD1-D2 (del N 93) (del C 12)は、各々、N末端側93アミノ酸の欠失、N末端側93アミノ酸の欠失かつC末端側5アミノ酸の欠失、およびN末端側93アミノ酸の欠失かつC末端側12アミノ酸の欠失を有するD1-D2改変体のアミノ酸配列を示す。ｂは、暗所下および近赤外光照射下における、野生型RpBphP1とドメイン内に欠失を含むRpPpsR2ドメイン改変体との結合状態を解析した結果を示す。 RpBphP1とRpPpsR2において有益な効果を持つ変異や改変（Darkリークシグナルを下げる変異・改変とNIRシグナルを上げる変異・改変）を、複数個積み重ねて機能向上を行う際の組み合わせ。全１２パターンを示す。 有益な点変異を複数個有するRpBphP1変異体と野生型RpPpsR2からなる光スイッチタンパク質、および有益な点変異を複数個有するRpPpsR2変異体と野生型RpBphP1からなる光スイッチタンパク質の機能解析。（ａ）RpBphP1とRpPpsR2の組み合わせパターンが、図１２の組み合わせ２である例。暗所下および近赤外光照射下における、RpBphP1変異体（Q502AおよびE513Aを導入）と野生型RpPpsR2との結合状態を解析した結果を示す。（ｂ）RpBphP1とRpPpsR2の組み合わせパターンが、図１２の組み合わせ７である例。暗所下および近赤外光照射下における、野生型RpBphP1とRpPpsR2変異体（Q105TおよびL137Eを導入）との結合状態を解析した結果を示す。*1は、Darkリークシグナルを下げる点変異を表す。*2は、NIRシグナルを上げる点変異を表す。 有益なドメイン改変と点変異を併せ持つRpPpsR2変異体と野生型RpBphP1からなる光スイッチタンパク質の機能解析。RpBphP1とRpPpsR2の組み合わせパターンが、図１２の組み合わせ７である例。暗所下および近赤外光照射下における、野生型RpBphP1とドメイン改変（D3-D2）と点変異（L137Eを導入）を併せ持つRpPpsR2変異体との結合状態を解析した結果を示す。この組み合わせパターンは図１３ｂの場合と同じであるが、RpPpsR2にドメイン改変と点変異を導入している点が違う。*2は、NIRシグナルを上げる点変異を表す。*3は、Darkリークシグナルを下げるドメイン改変体を表す。 RpBphP1とRpPpsR2の双方に、有益な変異を導入した場合の光スイッチタンパク質の機能解析（その１）。（ａ）RpBphP1とRpPpsR2の組み合わせパターンが、図１２の組み合わせ９である例。暗所下および近赤外光照射下における、RpBphP1変異体（Q367AまたはF518Aを導入）とRpPpsR2ドメイン改変体（D3-D1-D2）との結合状態を解析した結果を示す。（ｂ）RpBphP1とRpPpsR2の組み合わせパターンが、図１２の組み合わせ３である例。暗所下および近赤外光照射下における、RpBphP1変異体（D607Eを導入）とRpPpsR2変異体（Q105Sを導入）との結合状態を解析した結果を示す。*1は、Darkリークシグナルを下げる点変異を表す。*2は、NIRシグナルを上げる点変異を表す。*3は、Darkリークシグナルを下げるドメイン改変体を表す。 RpBphP1とRpPpsR2の双方に、有益な変異を導入した場合の光スイッチタンパク質の機能解析（その２）。（ａ）RpBphP1とRpPpsR2の組み合わせパターンが、図１２の組み合わせ４である例。暗所下および近赤外光照射下における、RpBphP1変異体（Q502AおよびE513Aを導入）とRpPpsR2変異体（Q105Sを導入）との結合状態を解析した結果を示す。（ｂ）RpBphP1とRpPpsR2の組み合わせパターンが、図１２の組み合わせ１０である例。暗所下および近赤外光照射下における、RpBphP1変異体（Q502AおよびE513Aを導入）とRpPpsR2変異体（Q105T）との結合状態を解析した結果を示す。*1は、Darkリークシグナルを下げる点変異を表す。*2は、NIRシグナルを上げる点変異を表す。 RpBphP1とRpPpsR2の双方に、有益な変異を導入した場合の光スイッチタンパク質の機能解析（その３）。（ａ）RpBphP1とRpPpsR2の組み合わせパターンが、図１２の組み合わせ３である例。暗所下および近赤外光照射下における、RpBphP1変異体（D607Eを導入）とRpPpsR2変異体（Q105SおよびL137Eを導入）との結合状態を解析した結果を示す。この組み合わせパターンは図１５ｂの場合と同じであるが、RpPpsR2に点変異を２つ導入している点が違う。（ｂ）RpBphP1とRpPpsR2の組み合わせパターンが、図１２の組み合わせ１１である例。暗所下および近赤外光照射下における、RpBphP1変異体（D607Eを導入）とRpPpsR2変異体（Q105TおよびL137Eを導入）との結合状態を解析した結果を示す。*1は、Darkリークシグナルを下げる点変異を表す。*2は、NIRシグナルを上げる点変異を表す。 RpBphP1とRpPpsR2の双方に、有益な変異を導入した場合の光スイッチタンパク質の機能解析（その４）。（ａ）RpBphP1とRpPpsR2の組み合わせパターンが、図１２の組み合わせ４である例。暗所下および近赤外光照射下における、RpBphP1変異体（Q502AおよびE513Aを導入）とRpPpsR2変異体（Q105SおよびL137Eを導入）との結合状態を解析した結果を示す。この組み合わせパターンは図１６ａの場合と同じであるが、RpPpsR2に点変異を２つ導入している点が違う。（ｂ）RpBphP1とRpPpsR2の組み合わせパターンが、図１２の組み合わせ１２である例。暗所下および近赤外光照射下における、RpBphP1変異体（Q502AおよびE513Aを導入）とRpPpsR2変異体（Q105TおよびL137Eを導入）との結合状態を解析した結果を示す。*1は、Darkリークシグナルを下げる点変異を表す。*2は、NIRシグナルを上げる点変異を表す。 RpBphP1とRpPpsR2の双方に、有益な変異を導入した場合の光スイッチタンパク質の機能解析（その５）。RpBphP1とRpPpsR2の組み合わせパターンが、図１２の組み合わせ１１である例。暗所下および近赤外光照射下における、RpBphP1変異体（D609E、S525AまたはE327Aを導入）とドメイン改変（D3-D2）と点変異（L137Eを導入）を併せ持つRpPpsR2変異体との結合状態を解析した結果を示す。この組み合わせパターンは図１７ｂの場合と同じであるが、RpPpsR2にドメイン改変と点変異を導入している点が違う。*1は、Darkリークシグナルを下げる点変異を表す。*2は、NIRシグナルを上げる点変異を表す。*3は、Darkリークシグナルを下げるドメイン改変体を表す。 RpBphP1とRpPpsR2の双方に、有益な変異を導入した場合の光スイッチタンパク質の機能解析（その６）。RpBphP1とRpPpsR2の組み合わせパターンが、図１２の組み合わせ１２である例。暗所下および近赤外光照射下における、RpBphP1変異体（Q502AおよびE513Aを導入）とドメイン改変（D3-D2）と点変異（L137Eを導入）を併せ持つRpPpsR2変異体との結合状態を解析した結果を示す。この組み合わせパターンは図１８ｂの場合と同じであるが、RpPpsR2にドメイン改変と点変異を導入している点が違う。*1は、Darkリークシグナルを下げる点変異を表す。*2は、NIRシグナルを上げる点変異を表す。*3は、Darkリークシグナルを下げるドメイン改変体を表す。 本発明の光スイッチタンパク質による、細胞内におけるゲノム遺伝子活性化の確認。ゲノム遺伝子（ASCL1、HBG1、MYOD1またはIL1R2）を標的とするガイドRNAおよび光スイッチタンパク質遺伝子などの必要なコンポーネントをHEK293T細胞に遺伝子導入し、近赤外光照射を行い、各ゲノム遺伝子の発現量を調べた。ａは、暗所下および近赤外光照射下における、各ゲノム遺伝子の発現量を示す。ｂは、近赤外光照射後、ASCL1 mRNA発現量の経時変化を示す。枠線内は、近赤外光照射３時間までの拡大図を示す。ｃは、近赤外光照射のONまたはOFFにより、ASCL1 mRNA発現がどのような影響を受けるか調べた結果を示す。 本発明の光スイッチタンパク質による、マウス生体内における遺伝子活性化の確認。ガイドRNA（発光レポーター遺伝子を標的とするもの、またはマウスASCL1遺伝子を標的とするもの）および光スイッチタンパク質遺伝子などの必要なコンポーネントをマウス肝臓に遺伝子導入し、マウス生体外からLEDパネルを用いて光照射した（760 nm、300 W/m2）。ａに近赤外光照射実験の様子を示す。ｂは、発光レポーター遺伝子を用いた解析結果を示す。ｃ（左図）は、ASCL1遺伝子発現量の解析のためにマウスより摘出した肝臓を示す。（右図）は、暗所下および近赤外光照射下における、マウス肝臓内におけるASCL1遺伝子の発現量を調べた結果を示す。
　以下、本発明を実施するための形態について説明する。
　第１の実施形態は、近赤外光照射下で結合する2つのタンパク質からなるタンパク質セット（「本実施形態にかかるタンパク質セット」または「本実施形態にかかる光タンパク質」とも記載する）であって、
当該タンパク質セットはRpBphP1変異体と野生型RpPpsR2のセット、野生型RpBphP1とRpPpsR2変異体のセット、または、RpBphP1変異体とRpPpsR2変異体のセットであり、
当該タンパク質セットの結合が、野生型RpBphP1と野生型RpPpsR2の結合と比較して、暗所下では弱く、および／または近赤外光照射下では強い、
前記タンパク質セットである。
　前述の通り、野生型のRpBphP1とRpPpsR2のペアは、暗所下、すなわち、光が照射されていない状態においてもある程度結合してしまうため、RpBphP1とRpPpsR2の結合および解離を光照射のON/OFFにより確実に制御することが困難であった。
　そこで、まず、本発明者らは、野生型RpBphP1と野生型RpPpsR2の結合と比較して、暗所下での結合が弱いタンパク質ペア、および／または近赤外光照射下での結合が強いタンパク質ペアの作出を試みた。具体的には、RpBphP1変異体と野生型RpPpsR2の結合、野生型RpBphP1とRpPpsR2変異体の結合、RpBphP1変異体とRpPpsR2変異体の結合が；
１．近赤外光を照射していない状態（以下「暗所下」とも記載する）で弱い、および／または
２．近赤外光の照射下において強い、
以上のような各変異体の作出を試みた。
　ここで、「近赤外光」とは、波長がおよそ 650 nm～900 nm程度の光のことである。
　また、本実施形態にかかるタンパク質セットの結合が、野生型RpBphP1と野生型RpPpsR2の結合と比較して、「弱い」とは、後述のレポーターアッセイなどで評価される結合力が、野生型RpBphP1と野生型RpPpsR2の結合力の0.6倍以下、好ましくは0.4倍以下、より好ましくは0.2倍以下の場合である。また、本実施形態にかかるタンパク質セットの結合が、野生型RpBphP1と野生型RpPpsR2の結合と比較して、「強い」とは、野生型RpBphP1と野生型RpPpsR2の結合力の1.1倍以上、好ましくは1.5倍以上の場合である。
　前述の通り、野生型RpBphP1と野生型RpPpsR2のペアの場合、暗所下での結合力に対し、近赤外光照射下での結合力は、高々、約2倍程度である。この程度の結合力の変化では、近赤外光照射のON/OFFによって、結合および解離を正確に制御するのが難しい。本実施形態にかかるタンパク質セットは、野生型同士のペアと比較して、暗所下と近赤外光照射下での結合力の差がより大きく、その結合および解離をより正確に制御することができる。具体的には、本実施形態におけるタンパク質セットに関し、暗所下での結合力に対し、近赤外光照射下での結合力が、好ましくは約3倍以上、より好ましくは約5倍以上、さらにより好ましくは、約7倍以上である。
　なお、本明細書において、「約」とは±10%の数値範囲を意味する。
　本実施形態において、野生型RpBphP1は、以下に示す配列番号１もしくは配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質、または配列番号１もしくは配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質と実質的に同一のタンパク質である。ここで、「配列番号１もしくは配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質と実質的に同一のタンパク質」とは、配列番号１もしくは配列番号２で表されるアミノ酸配列と80％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列、より好ましくは90％以上、91％以上、92％以上、93％以上、94％以上、95％以上、96％以上、97％以上、98％以上または99％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるタンパク質である。ただし、本実施形態にかかるRpBphP1変異体は除く。
配列番号１；
MVAGHASGSPAFGTADLSNCEREEIHLAGSIQPHGALLVVSEPDHRIIQASANAAEFLNLGSVLGVPLAEIDGDLLIKILPHLDPTAEGMPVAVRCRIGNPSTEYDGLMHRPPEGGLIIELERAGPPIDLSGTLAPALERIRTAGSLRALCDDTALLFQQCTGYDRVMVYRFDEQGHGEVFSERHVPGLESYFGNRYPSSDIPQMARRLYERQRVRVLVDVSYQPVPLEPRLSPLTGRDLDMSGCFLRSMSPIHLQYLKNMGVRATLVVSLVVGGKLWGLVACHHYLPRFIHFELRAICELLAEAIATRITALESFAQSQSELFVQRLEQRMIEAITREGDWRAAIFDTSQSILQPLHADGCALVYEDQIRTIGDVPSTQDVREIAGWLDRQPRAAVTSTASLGLDVPELAHLTRMASGVVAAPISDHRGEFLMWFRPERVHTVTWGGDPKKPFTMGDTPADLSPRRSFAKWHQVVEGTSDPWTAADLAAARTIGQTVADIVLQFRAVRTLIAREQYEQFSSQVHASMQPVLITDAEGRILLMNDSFRDMLPAGSPSAVHLDDLAGFFVESNDFLRNVAELIDHGRGWRGEVLLRGAGNRPLPLAVRADPVTRTEDQSLGFVLIFSDATDRRTADAARTRFLEGILASARPGVRLDSKSDLLHEKLLSALVENAQLAALEITYGVETGRIAELLEGVRQSMLRTAEVLGHLVQHAARTAGSDSSSNGSQN
配列番号２；
MAGHASGSPAFGTADLSNCEREEIHLAGSIQPHGALLVVSEPDHRIIQASANAAEFLNLGSVLGVPLAEIDGDLLIKILPHLDPTAEGMPVAVRCRIGNPSTEYDGLMHRPPEGGLIIELERAGPPIDLSGTLAPALERIRTAGSLRALCDDTALLFQQCTGYDRVMVYRFDEQGHGEVFSERHVPGLESYFGNRYPSSDIPQMARRLYERQRVRVLVDVSYQPVPLEPRLSPLTGRDLDMSGCFLRSMSPIHLQYLKNMGVRATLVVSLVVGGKLWGLVACHHYLPRFIHFELRAICELLAEAIATRITALESFAQSQSELFVQRLEQRMIEAITREGDWRAAIFDTSQSILQPLHADGCALVYEDQIRTIGDVPSTQDVREIAGWLDRQPRAAVTSTASLGLDVPELAHLTRMASGVVAAPISDHRGEFLMWFRPERVHTVTWGGDPKKPFTMGDTPADLSPRRSFAKWHQVVEGTSDPWTAADLAAARTIGQTVADIVLQFRAVRTLIAREQYEQFSSQVHASMQPVLITDAEGRILLMNDSFRDMLPAGSPSAVHLDDLAGFFVESNDFLRNVAELIDHGRGWRGEVLLRGAGNRPLPLAVRADPVTRTEDQSLGFVLIFSDATDRRTADAARTRFQEGILASARPGVRLDSKSDLLHEKLLSALVENAQLAALEITYGVETGRIAELLEGVRQSMLRTAEVLGHLVQHAARTAGSDSSSNGSQNKK
　なお、配列番号２のアミノ酸配列は、アクセッション番号WP_119846077としてNCBIのデータベースに、登録されている配列である。配列番号１で表されるアミノ酸配列は、本実施例において、野生型RpBphP1のアミノ酸配列として使用した配列であって、配列番号２で表されるアミノ酸配列の最初のMと次のAの間にVが挿入されており、また、配列番号２で表されるアミノ酸配列の641番目のQがLとなっている。これらの変異は、野生型RpBphP1発現率を向上させるなどのために行ったもので配列番号１のアミノ酸配列と配列番号２のアミノ酸配列は、99%以上の配列同一性を有しており、RpBphP1としての活性も同一であることを確認している。
　なお、本明細書においては、配列番号１の3番目のA（配列番号２では、2番目のA）を、アミノ酸番号１として、RpBphP1の変異体を表記する。
　本実施形態において、野生型RpPpsR2は、以下に示す配列番号３で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質、または配列番号３で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質と実質的に同一のタンパク質である。ここで、「配列番号３で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質と実質的に同一のタンパク質」とは、配列番号３で表されるアミノ酸配列と80％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列、より好ましくは90％以上、91％以上、92％以上、93％以上、94％以上、95％以上、96％以上、97％以上、98％以上または99％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるタンパク質である。ただし、本実施形態にかかるRpPpsR2変異体は除く。
配列番号３；
MASKSVHADITLLLDMEGVIREATLSPTMAAESVDGWLGRRWSDIAGAEGGDKVRRMVEDARRSGISAFRQINQPFPSGVEIPIEFTTMLLGDRTGMIAVGKNMQAVTELHSRLIAAQQAMERDYWRLRELETRYRLVFDAAADAVMIVSAGDMRIVEANRAAVNAISRVERGNDDLAGRDFLAEVAAADRDAVRDMLAQVRQRGTALSVLVHLGRYDRAWMLRGSLMSSERRQVFLLHFTPVTTTPAIDDVDDDAVLRGLIDRIPDGFVALDSEGVVRHANQAFLDLVQIGSKPAAVGRSLGVWMGRPGADLSSLLTLLRRYKTVRLFQTTIRGELGTETEVEVSAVDGEDDQYIGVLMRNVARRLDAADDHDALRQALGPISKQLGRSSLRKLVKNAVSIVEQHYVKEALLRSKGNRTATAELLGLSRQSLYAKLNSYGFDDKGVVASAADGAEGASDDAED
　本実施形態において、アミノ酸配列上の特定のアミノ酸を表示する場合、当該アミノ酸配列における「特定のアミノ酸（1文字表記）」、「アミノ酸位置番号」の順に記載する。例えば、アミノ酸配列上514番目のグルタミンは、Q514のように標記する。また、本実施形態における点変異の表記は、野生型の配列における「アミノ酸」、「アミノ酸位置番号」、「置換したアミノ酸」の順に記載するものとする。例えば、野生型RpBphP1の514番目のアミノ酸がQからAに置換された変異はQ514Aと標記し、当該変異を有する変異体はQ514Aの点変異を有するRpBphP1変異体などと記載する。同様に、野生型RpPpsR2の105番目のアミノ酸がQからTに置換された変異はQ105Tと標記し、当該変異を有する変異体はQ105Tの点変異を有するRpPpsR2変異体などと記載する。また、複数の点変異を有する変異体の場合は、例えば、Q514AおよびD607Eの点変異を有するRpBphP1変異体（514番目のQがAに置換され、かつ607番目のDがEに置換された変異体）などと記載する。
　RpPpsR2変異体については、点変異体以外にも、野生型RpPpsR2を構成する5つのドメインの位置を入れ換えた変異体、5つのドメインの１または複数のドメインの一部または全部を欠失させた変異体、5つのドメインの位置を入れ換え、かつ、5つのドメインの１または複数のドメインの一部または全部を欠失させた変異体なども、本実施形態には含まれる。これらのドメインに関する変異体は、「ドメイン改変体」とも記載する。本明細書において、RpPpsR2の5つのドメインの位置は以下のように定める；
配列番号３で表されるアミノ酸配列において、
ドメイン１（D1とも記載する）：A2からN103まで
ドメイン２（D2とも記載する）：Q105からA141まで
ドメイン３（D3とも記載する）：V146からT241まで
ドメイン４（D4とも記載する）：D253からN362まで
ドメイン５（D5とも記載する）：A369からD464まで
　ここで、ドメイン間のアミノ酸配列、例えば、M104、A142～A145、P242～V252、V363～D368などの、アミノ酸残基またはアミノ酸配列（リンカーなどとも称する）は、ドメイン間を連結するアミノ酸またはアミノ酸リンカーとしての位置づけである。ただし、本実施形態におけるドメインは、上記で定められる各ドメインのアミノ酸配列以外にも、そのN末端および／またはC末端に、各ドメインの機能を損なわない程度の数のアミノ酸残基（例えば、1～10残基程度）が付加されていても、又は、欠失されていてもよい。具体的には、例えば、D2-D1-D4と表記されるドメイン改変体の場合、配列番号３で表されるアミノ酸配列のQ105からA141までのポリペプチド（D2）、A2からN103までのポリペプチド（D1）、D253からN362までのポリペプチド（D4）がN末端側からこの順に配置され、D2、D1およびD4の間は、1から数個のアミノ酸からなるポリペプチドによって連結されていてもよい。さらに、D4のC端側またはD2のN末端側には1～数個のアミノ酸からなるポリペプチドが付加されていてもよい。
　ドメイン改変体を構成するドメインのいずれかまたは両方が欠失している場合には、例えば、D1-D2-D3 (del C 25)、D1-D2 (del N 93)、D1-D2 (del N 93)(del C 5)などと記載する。D1-D2-D3 (del C 25)は、D1、D2およびD3の各ドメインがN末端側からこの順に連結されているが、D1-D2-D3 のC末端側から25個のアミノ酸が欠失しているようなドメイン改変体を示す。また、D1-D2 (del N 93)は、D1およびD2の各ドメインがN末端側からこの順に連結されているが、D1-D2のN末端側から93個のアミノ酸が欠失しているようなドメイン改変体を示す。さらに、D1-D2 (del N 93)(del C 5)は、D1およびD2の各ドメインがN末端側からこの順に連結されているが、D1-D2のN末端側から93個のアミノ酸が欠失し、かつ、C末端側から5個のアミノ酸が欠失しているようなドメイン改変体を示す。なお、上記ドメイン改変体の標記は、ドメイン改変体自体またはドメイン改変体のアミノ酸配列のいずれかを示すものとする。
　本明細書において、「アミノ酸」は、最も広い意味で用いられ、天然アミノ酸に加え、その誘導体や人工のアミノ酸も含まれる。本明細書におけるアミノ酸としては、例えば、天然アミノ酸の他、非天然アミノ酸も含まれる。また、主鎖の構造が天然型と異なるアミノ酸、側鎖の構造が天然型と異なるアミノ酸、側鎖に余分のメチレンを有するアミノ酸および側鎖中のカルボン酸官能基アミノ酸がスルホン酸基で置換されるアミノ酸なども「アミノ酸」に含まれる。
　本実施形態にかかるタンパク質セットには、RpBphP1変異体と野生型RpPpsR2のセット、野生型RpBphP1とRpPpsR2変異体のセット、または、RpBphP1変異体とRpPpsR2変異体のセットが含まれる。
　本実施形態にかかるRpBphP1変異体には、配列番号１または配列番号２で表されるアミノ酸配列中に、以下のアミノ酸が他のアミノ酸に置換された点変異の１または複数を含むアミノ酸配列からなる変異体が含まれる；
E327、E332、E337、D339、E365、Q367、E429、R490、D498、Q502、F503、R504、R507、R512、E513、Q514、E516、F518、Q521、S525、D607、E613、R636、R638、F639、D654、H661、E678、Y681、E693、R696、H712、
　より具体的には、本実施形態におけるRpBphP1変異体には、配列番号１または配列番号２で表されるアミノ酸配列中に、以下の点変異のいずれか１または複数の変異を有するアミノ酸配列からなる変異体が含まれる；
Q514A、D607E、 R638A、H661A、R696A、
E327A、E332A、E337A、D339A、E365A、Q367A、E429A、R490A、D498A、Q502A、Q502G、Q502V、Q502L、Q502I、Q502S、Q502T、Q502E、Q502K、Q502R、Q502H、Q502N、Q502F、Q502Y、Q502W、Q502C、Q502M、Q502P、F503A、R504A、R507A、E513G、E513D、E513P、E516A、F518A、S525A、D607A、D607G、D607V、D607L、D607I、D607S、D607T、D607K、D607R、D607H、D607N、D607Q、D607F、D607W、D607C、D607M、D607P、E613A、R636A、F639A、D654A、E678A、Y681A、E693A、H712D、H712E、H712P、
R512A、E513V、E513A、E513L、E513T、E513M、Q521A
　上記点変異は、以下の3グループに分類される；
（１）当該変異を少なくとも1つ有するRpBphP1変異体と野生型RpPpsR2の結合が、野生型RpBphP1と野生型RpPpsR2の結合と比較して、暗所下での結合が弱くなり、近赤外光照射下での結合はほぼ同等である変異；
Q514A、D607E、 R638A、H661A、R696A
（２）当該変異を少なくとも1つ有するRpBphP1変異体と野生型RpPpsR2の結合が、野生型RpBphP1と野生型RpPpsR2の結合と比較して、暗所下での結合が弱くなり、近赤外光照射下での結合も弱くなる変異；
E327A、E332A、E337A、D339A、E365A、Q367A、E429A、R490A、D498A、Q502A、Q502G、Q502V、Q502L、Q502I、Q502S、Q502T、Q502E、Q502K、Q502R、Q502H、Q502N、Q502F、Q502Y、Q502W、Q502C、Q502M、Q502P、F503A、R504A、R507A、E513G、E513D、E513P、E516A、F518A、S525A、D607A、D607G、D607V、D607L、D607I、D607S、D607T、D607K、D607R、D607H、D607N、D607Q、D607F、D607W、D607C、D607M、D607P、E613A、R636A、F639A、D654A、E678A、Y681A、E693A、H712D、H712E、H712P
（３）当該変異を少なくとも1つ有するRpBphP1変異体と野生型RpPpsR2の結合が、野生型RpBphP1と野生型RpPpsR2の結合と比較して、近赤外光照射下での結合が強くなり、暗所下での結合も強くなる変異；
R512A、E513V、E513A、E513L、E513T、E513M、Q521A
　本実施形態にかかるRpPpsR2変異体には、配列番号３で表されるアミノ酸配列中に、以下のアミノ酸が他のアミノ酸に置換された点変異の１または複数を有するアミノ酸配列からなる変異体が含まれる；
K102、N103、Q105、V107、T108、L110、R113、L114、I115、Q119、M121、R123、D124、Y125、W126、R127、R129、E132、T133、R134、R136、L137、V138、F139、V146
　より具体的には、本実施形態におけるRpPpsR2変異体には、配列番号３で表されるアミノ酸配列中に、以下の点変異のいずれか１または複数の変異を有するアミノ酸配列からなる変異体が含まれる；
Q105T、T133A、L137A、 
N103A、Q105A、Q105C、Q105H、V107A、T108A、L110A、R113A、L114A、I115A、Q119A、M121A 、M121E、R123A、D124A、Y125A、Y125E、W126A、R127A、R129A、E132A、R134A、R136A、 
Q105V、Q105S、 
K102A、Q105P、Q105R、L137E、V138A、V138E、F139E、V146A
　上記点変異は、以下の4グループに分類される；
（１）当該変異を少なくとも1つ有するRpPpsR2変異体と野生型RpBphP1の結合が、野生型RpBphP1と野生型RpPpsR2の結合と比較して、暗所下での結合が弱くなり、近赤外光照射下での結合はほぼ同等である変異；
Q105T、T133A、L137A
（２）当該変異を少なくとも1つ有するRpPpsR2変異体と野生型RpBphP1の結合が、野生型RpBphP1と野生型RpPpsR2の結合と比較して、暗所下での結合が弱くなり、近赤外光照射下での結合も弱くなる変異；
N103A、Q105A、Q105C、Q105H、V107A、T108A、L110A、R113A、L114A、I115A、Q119A、M121A 、M121E、R123A、D124A、Y125A、Y125E、W126A、R127A、R129A、E132A、R134A、R136A
（３）当該変異を少なくとも1つ有するRpPpsR2変異体と野生型RpBphP1の結合が、野生型RpBphP1と野生型RpPpsR2の結合と比較して、近赤外光照射下での結合が強くなり、暗所下での結合はほぼ同等である変異；
Q105V、Q105S
（４）当該変異を少なくとも1つ有するRpPpsR2変異体と野生型RpBphP1の結合が、野生型RpBphP1と野生型RpPpsR2の結合と比較して、近赤外光照射下での結合が強くなり、暗所下での結合も強くなる変異；
K102A、Q105P、Q105R、L137E、V138A、V138E、F139E、V146A
　さらに、本実施形態におけるRpPpsR2変異体には、配列番号３で表されるアミノ酸配列が以下のドメイン改変配列のいずれかに改変されたアミノ酸配列からなる変異体が含まれる；
D1-D1-D2、D3-D1-D2、D1-D2 (del N 77)、 
D1-D2、D2-D1、D2-D2、D3-D2、D4-D2、D1-D2-D1、D1-D2-D2、D1-D2-D4、D2-D1-D2、D2-D3-D4、D4-D1-D2、D2-D3-D4-D1、D2-D3-D4-D2、D2-D3-D4-D3、D2-D3-D4-D5、D1-D2 (del N 88)、D1-D2 (del N 89)、D1-D2 (del N 90)、D1-D2 (del N 91)、D1-D2 (del N 92)、D1-D2 (del N 93)、D1-D2 (del N 94)、D1-D2 (del N 95)、D1-D2 (del N 96)、D1-D2 (del N 97)、D1-D2 (del C 5)、D1-D2 (del C 15)、D1-D2 (del N 93)(del C 5)、D1-D2 (del N 93)(del C 6)、D1-D2 (del N 93)(del C 11)、D1-D2 (del N 93)(del C 12)、D1-D2-D3 (del C 25)、D1-D2-D3 (del C 41)、D1-D2-D3 (del C 49)、D1-D2-D3 (del C 70)、D1-D2-D3 (del C 87)、D1-D2-D3 (del C 96)、D1-D2-D3 (del C 104)、 
D1-D2 (del N 64)、 
D2-D3、D1-D2-D3、D2-D2-D3、D2-D3-D1、D2-D3-D3、D3-D2-D3、D4-D2-D3、D1-D1-D2-D3、D1-D2-D3-D1、D1-D2-D3-D2、D1-D2-D3-D3、D1-D2-D3-D4、D2-D1-D2-D3、D2-D2-D3-D4、D2-D3-D4-D4、D3-D1-D2-D3、D3-D2-D3-D4、D1-D2 (del N 15)、D1-D2 (del N 33)、D1-D2 (del N 47)、D1-D2-D3 (del C 9)
　上記ドメイン改変体は、以下の4グループに分類される；
（１）当該RpPpsR2のドメイン改変体と野生型RpBphP1の結合が、野生型RpBphP1と野生型RpPpsR2の結合と比較して、暗所下での結合が弱くなり、近赤外光照射下での結合はほぼ同等である変異；
D1-D1-D2、D3-D1-D2、D1-D2 (del N 77)
（２）当該RpPpsR2のドメイン改変体と野生型RpBphP1の結合が、野生型RpBphP1と野生型RpPpsR2の結合と比較して、暗所下での結合が弱くなり、近赤外光照射下での結合も弱くなる変異；
D1-D2、D2-D1、D2-D2、D3-D2、D4-D2、D1-D2-D1、D1-D2-D2、D1-D2-D4、D2-D1-D2、D2-D3-D4、D4-D1-D2、D2-D3-D4-D1、D2-D3-D4-D2、D2-D3-D4-D3、D2-D3-D4-D5、D1-D2 (del N 88)、D1-D2 (del N 89)、D1-D2 (del N 90)、D1-D2 (del N 91)、D1-D2 (del N 92)、D1-D2 (del N 93)、D1-D2 (del N 94)、D1-D2 (del N 95)、D1-D2 (del N 96)、D1-D2 (del N 97)、D1-D2 (del C 5)、D1-D2 (del C 15)、D1-D2 (del N 93)(del C 5)、D1-D2 (del N 93)(del C 6)、D1-D2 (del N 93)(del C 11)、D1-D2 (del N 93)(del C 12)、D1-D2-D3 (del C 25)、D1-D2-D3 (del C 41)、D1-D2-D3 (del C 49)、D1-D2-D3 (del C 70)、D1-D2-D3 (del C 87)、D1-D2-D3 (del C 96)、D1-D2-D3 (del C 104)
（３）当該RpPpsR2のドメイン改変体と野生型RpBphP1の結合が、野生型RpBphP1と野生型RpPpsR2の結合と比較して、近赤外光照射下での結合が強くなり、暗所下での結合はほぼ同等である変異；
D1-D2 (del N 64)
（４）当該RpPpsR2のドメイン改変体と野生型RpBphP1の結合が、野生型RpBphP1と野生型RpPpsR2の結合と比較して、近赤外光照射下での結合が強くなり、暗所下での結合も強くなる変異；
D2-D3、D1-D2-D3、D2-D2-D3、D2-D3-D1、D2-D3-D3、D3-D2-D3、D4-D2-D3、D1-D1-D2-D3、D1-D2-D3-D1、D1-D2-D3-D2、D1-D2-D3-D3、D1-D2-D3-D4、D2-D1-D2-D3、D2-D2-D3-D4、D2-D3-D4-D4、D3-D1-D2-D3、D3-D2-D3-D4、D1-D2 (del N 15)、D1-D2 (del N 33)、D1-D2 (del N 47)、D1-D2-D3 (del C 9)
　さらにまた、本実施形態におけるRpPpsR2変異体には、上記点変異とドメイン改変による変異を併せて持つ変異体も含まれる。
　すなわち、本実施形態におけるRpPpsR2変異体には、配列番号３で表されるアミノ酸配列が、
D1-D1-D2、D3-D1-D2、D1-D2 (del N 77)、 
D1-D2、D2-D1、D2-D2、D3-D2、D4-D2、D1-D2-D1、D1-D2-D2、D1-D2-D4、D2-D1-D2、D2-D3-D4、D4-D1-D2、D2-D3-D4-D1、D2-D3-D4-D2、D2-D3-D4-D3、D2-D3-D4-D5、D1-D2 (del N 88)、D1-D2 (del N 89)、D1-D2 (del N 90)、D1-D2 (del N 91)、D1-D2 (del N 92)、D1-D2 (del N 93)、D1-D2 (del N 94)、D1-D2 (del N 95)、D1-D2 (del N 96)、D1-D2 (del N 97)、D1-D2 (del C 5)、D1-D2 (del C 15)、D1-D2 (del N 93)(del C 5)、D1-D2 (del N 93)(del C 6)、D1-D2 (del N 93)(del C 11)、D1-D2 (del N 93)(del C 12)、D1-D2-D3 (del C 25)、D1-D2-D3 (del C 41)、D1-D2-D3 (del C 49)、D1-D2-D3 (del C 70)、D1-D2-D3 (del C 87)、D1-D2-D3 (del C 96)、D1-D2-D3 (del C 104)、 
D1-D2 (del N 64)、 
D2-D3、D1-D2-D3、D2-D2-D3、D2-D3-D1、D2-D3-D3、D3-D2-D3、D4-D2-D3、D1-D1-D2-D3、D1-D2-D3-D1、D1-D2-D3-D2、D1-D2-D3-D3、D1-D2-D3-D4、D2-D1-D2-D3、D2-D2-D3-D4、D2-D3-D4-D4、D3-D1-D2-D3、D3-D2-D3-D4、D1-D2 (del N 15)、D1-D2 (del N 33)、D1-D2 (del N 47)、D1-D2-D3 (del C 9)のいずれかのドメイン改変変異に改変されたアミノ酸配列からなる変異体であって、
配列番号３で表されるアミノ酸配列中の以下の点変異のいずれか１または複数の変異に対応する点変異をそのアミノ酸配列中に有する変異体が含まれる；
Q105T、T133A、L137A、 
N103A、Q105A、Q105C、Q105H、V107A、T108A、L110A、R113A、L114A、I115A、Q119A、M121A 、M121E、R123A、D124A、Y125A、Y125E、W126A、R127A、R129A、E132A、R134A、R136A、 
Q105V、Q105S、 
K102A、Q105P、Q105R、L137E、V138A、V138E、F139E、V146A
　より具体的に、ドメイン改変と点変異を併せもつRpPpsR2変異体として、D3-D2改変変異とL137E点変異を併せて持つ変異体を例に説明する。D3-D2改変体がL137E点変異を併せもつとは、配列番号３で表されるアミノ酸配列の137番目がリシンからグルタミン酸に置換されたD3-D2改変体のことを意味し、本明細書において、D3-D2（L137E）と標記する。
　上記ドメイン改変と点変異を併せ持つRpPpsR2変異体として、上記D3-D2（L137E）を挙げることができ、D3-D2（L137E）と野生型RpBphP1の結合が、野生型RpBphP1と野生型RpPpsR2の結合と比較して、暗所下での結合が弱くなり、近赤外光照射下での結合も弱くなる変異体である。
　本実施形態にかかるタンパク質セットには、当該タンパク質セットが、野生型RpPpsR2とRpBphP1変異体のセットであって、
当該RpBphP1変異体が、配列番号１または配列番号２で表されるアミノ酸配列中にQ514A、D607E、 R638A、H661A、R696A、
E327A、E332A、E337A、D339A、E365A、Q367A、E429A、R490A、D498A、Q502A、Q502G、Q502V、Q502L、Q502I、Q502S、Q502T、Q502E、Q502K、Q502R、Q502H、Q502N、Q502F、Q502Y、Q502W、Q502C、Q502M、Q502P、F503A、R504A、R507A、E513G、E513D、E513P、E516A、F518A、S525A、D607A、D607G、D607V、D607L、D607I、D607S、D607T、D607K、D607R、D607H、D607N、D607Q、D607F、D607W、D607C、D607M、D607P、E613A、R636A、F639A、D654A、E678A、Y681A、E693A、H712D、H712E、H712P、
R512A、E513V、E513A、E513L、E513T、E513M、Q521Aからなる点変異のグループから選択される１または複数の点変異を有するアミノ酸配列からなる変異体である、タンパク質セットが含まれる。
　本実施形態にかかるタンパク質セットには、当該タンパク質セットが、野生型RpBphP1とRpPpsR2変異体のセットであって、
当該RpPpsR2変異体が、配列番号３で表されるアミノ酸配列中にQ105T、T133A、L137A、
N103A、Q105A、Q105C、Q105H、V107A、T108A、L110A、R113A、L114A、I115A、Q119A、M121A 、M121E、R123A、D124A、Y125A、Y125E、W126A、R127A、R129A、E132A、R134A、R136A、
Q105V、Q105S、
K102A、Q105P、Q105R、L137E、V138A、V138E、F139E、V146Aからなる点変異のグループから選択される１または複数の点変異を有するアミノ酸配列からなる変異体である、タンパク質セットが含まれる。
　本実施形態にかかるタンパク質セットには、当該タンパク質セットが、野生型RpBphP1とRpPpsR2変異体のセットであって、
当該RpPpsR2変異体が、配列番号３で表されるアミノ酸配列がD1-D1-D2、D3-D1-D2、D1-D2 (del N 77)、
D1-D2、D2-D1、D2-D2、D3-D2、D3-D2（L137E）、D4-D2、D1-D2-D1、D1-D2-D2、D1-D2-D4、D2-D1-D2、D2-D3-D4、D4-D1-D2、D2-D3-D4-D1、D2-D3-D4-D2、D2-D3-D4-D3、D2-D3-D4-D5、D1-D2 (del N 88)、D1-D2 (del N 89)、D1-D2 (del N 90)、D1-D2 (del N 91)、D1-D2 (del N 92)、D1-D2 (del N 93)、D1-D2 (del N 94)、D1-D2 (del N 95)、D1-D2 (del N 96)、D1-D2 (del N 97)、D1-D2 (del C 5)、D1-D2 (del C 15)、D1-D2 (del N 93)(del C 5)、D1-D2 (del N 93)(del C 6)、D1-D2 (del N 93)(del C 11)、D1-D2 (del N 93)(del C 12)、D1-D2-D3 (del C 25)、D1-D2-D3 (del C 41)、D1-D2-D3 (del C 49)、D1-D2-D3 (del C 70)、D1-D2-D3 (del C 87)、D1-D2-D3 (del C 96)、D1-D2-D3 (del C 104)、
D1-D2 (del N 64)、
D2-D3、D1-D2-D3、D2-D2-D3、D2-D3-D1、D2-D3-D3、D3-D2-D3、D4-D2-D3、D1-D1-D2-D3、D1-D2-D3-D1、D1-D2-D3-D2、D1-D2-D3-D3、D1-D2-D3-D4、D2-D1-D2-D3、D2-D2-D3-D4、D2-D3-D4-D4、D3-D1-D2-D3、D3-D2-D3-D4、D1-D2 (del N 15)、D1-D2 (del N 33)、D1-D2 (del N 47)、D1-D2-D3 (del C 9)のいずれかに改変されたアミノ酸配列からなる変異体である、タンパク質セットが含まれる。
　本実施形態にかかるタンパク質セットには、当該タンパク質セットが、RpBphP1変異体とRpPpsR2変異体のセットであって、
当該RpBphP1変異体が、配列番号１または配列番号２で表されるアミノ酸配列中にQ514A、D607E、 R638A、H661A、R696A、
E327A、E332A、E337A、D339A、E365A、Q367A、E429A、R490A、D498A、Q502A、Q502G、Q502V、Q502L、Q502I、Q502S、Q502T、Q502E、Q502K、Q502R、Q502H、Q502N、Q502F、Q502Y、Q502W、Q502C、Q502M、Q502P、F503A、R504A、R507A、E513G、E513D、E513P、E516A、F518A、S525A、D607A、D607G、D607V、D607L、D607I、D607S、D607T、D607K、D607R、D607H、D607N、D607Q、D607F、D607W、D607C、D607M、D607P、E613A、R636A、F639A、D654A、E678A、Y681A、E693A、H712D、H712E、H712P、
R512A、E513V、E513A、E513L、E513T、E513MおよびQ521Aからなる点変異のグループから選択される１または複数の点変異を有するアミノ酸配列からなる変異体であり、
当該RpPpsR2変異体が、配列番号３で表されるアミノ酸配列中にQ105T、T133A、L137A、
N103A、Q105A、Q105C、Q105H、V107A、T108A、L110A、R113A、L114A、I115A、Q119A、M121A 、M121E、R123A、D124A、Y125A、Y125E、W126A、R127A、R129A、E132A、R134A、R136A、
Q105V、Q105S、
K102A、Q105P、Q105R、L137E、V138A、V138E、F139EおよびV146Aからなる点変異のグループから選択される１または複数の点変異を有するアミノ酸配列からなる変異体のいずれかである、タンパク質セットが含まれる。
　本実施形態にかかるタンパク質セットには、当該タンパク質セットが、RpBphP1変異体とRpPpsR2変異体のセットであって、
当該RpBphP1変異体が、配列番号１または配列番号２で表されるアミノ酸配列中にQ514A、D607E、 R638A、H661A、R696A、
E327A、E332A、E337A、D339A、E365A、Q367A、E429A、R490A、D498A、Q502A、Q502G、Q502V、Q502L、Q502I、Q502S、Q502T、Q502E、Q502K、Q502R、Q502H、Q502N、Q502F、Q502Y、Q502W、Q502C、Q502M、Q502P、F503A、R504A、R507A、E513G、E513D、E513P、E516A、F518A、S525A、D607A、D607G、D607V、D607L、D607I、D607S、D607T、D607K、D607R、D607H、D607N、D607Q、D607F、D607W、D607C、D607M、D607P、E613A、R636A、F639A、D654A、E678A、Y681A、E693A、H712D、H712E、H712P、
R512A、E513V、E513A、E513L、E513T、E513MおよびQ521Aからなる点変異のグループから選択される１または複数の点変異を有するアミノ酸配列からなる変異体のいずれかであり、
当該RpPpsR2変異体が、配列番号３で表されるアミノ酸配列がD1-D1-D2、D3-D1-D2、D1-D2 (del N 77)、
D1-D2、D2-D1、D2-D2、D3-D2、D3-D2（L137E）、D4-D2、D1-D2-D1、D1-D2-D2、D1-D2-D4、D2-D1-D2、D2-D3-D4、D4-D1-D2、D2-D3-D4-D1、D2-D3-D4-D2、D2-D3-D4-D3、D2-D3-D4-D5、D1-D2 (del N 88)、D1-D2 (del N 89)、D1-D2 (del N 90)、D1-D2 (del N 91)、D1-D2 (del N 92)、D1-D2 (del N 93)、D1-D2 (del N 94)、D1-D2 (del N 95)、D1-D2 (del N 96)、D1-D2 (del N 97)、D1-D2 (del C 5)、D1-D2 (del C 15)、D1-D2 (del N 93)(del C 5)、D1-D2 (del N 93)(del C 6)、D1-D2 (del N 93)(del C 11)、D1-D2 (del N 93)(del C 12)、D1-D2-D3 (del C 25)、D1-D2-D3 (del C 41)、D1-D2-D3 (del C 49)、D1-D2-D3 (del C 70)、D1-D2-D3 (del C 87)、D1-D2-D3 (del C 96)、D1-D2-D3 (del C 104)、
D1-D2 (del N 64)、
D2-D3、D1-D2-D3、D2-D2-D3、D2-D3-D1、D2-D3-D3、D3-D2-D3、D4-D2-D3、D1-D1-D2-D3、D1-D2-D3-D1、D1-D2-D3-D2、D1-D2-D3-D3、D1-D2-D3-D4、D2-D1-D2-D3、D2-D2-D3-D4、D2-D3-D4-D4、D3-D1-D2-D3、D3-D2-D3-D4、D1-D2 (del N 15)、D1-D2 (del N 33)、D1-D2 (del N 47)およびD1-D2-D3 (del C 9)のいずれかに改変されたアミノ酸配列からなる変異体である、タンパク質セットが含まれる。
　本実施形態にかかる光スイッチタンパク質を構成するタンパク質同士（すなわち、RpBphP1変異体と野生型RpPpsR2、野生型RpBphP1とRpPpsR2変異体、RpBphP1変異体とRpPpsR2変異体）の結合力は、当該技術分野において周知の方法または、当該周知の方法を改変した方法によって、当業者であれば容易に測定することができる。そのような方法として、例えば、実施例において開示されるCPTSを利用した方法などがある。
　以下、CPTS（CRISPR-Cas9-based photoactivatable transcription system）の動作原理について説明する。CPTS は、DNA切断活性を欠損したCas9を利用した光操作ツールである。ゲノム遺伝子の活性化やレポーターアッセイ系として用いることができる。DNA切断活性を欠損させたCas9変異体（例えば、Cas9D10A/H840A；dCas9）は、ガイドRNAと複合体を形成し、ガイドRNAが標的とするDNA塩基配列に結合することができる。ガイドRNAのいくつかのループ構造のうち、dCas9から露出しているループに特定のタンパク質（例えば「タンパク質１」とする）と結合するアプタマー配列を挿入すると、タンパク質１はアプタマー配列を介してdCas9と結合することが可能となる。
　タンパク質１に本実施形態にかかる光スイッチタンパク質の片方のタンパク質（例えば、「野生型RpBphP1」とする）を連結し、もう一方のタンパク質（例えば、「RpPpsR2変異体」とする）には転写を活性化する因子（例えば、p65、HSF1など）を連結する。すなわち、タンパク質１-野生型RpBphP1連結体とRpPpsR2変異体-転写活性化因子連結体を作製する。ガイドRNAが標的とするDNA塩基配列を転写開始点付近に有するレポーター遺伝子、タンパク質１-野生型RpBphP1連結体とdCas9の複合体、RpPpsR2変異体-転写活性化因子連結体が共存する状態では、dCas9がガイドRNAの標的DNA塩基配列付近に結合する。ここで、光（本実施形態においては近赤外光）照射をすると、野生型RpBphP1とRpPpsR2変異体が結合し、RpPpsR2変異体に連結された転写活性化因子が転写開始点の近傍に係留される。その結果、レポーター遺伝子の転写が活性化され、mRNA転写が起こり、タンパク質への翻訳が起こる。一方、光照射を止めると、野生型RpBphP1とRpPpsR2変異体は解離するため、転写活性化因子が転写開始点から大きく離れて、当該遺伝子の発現は停止する。
　以上のようなCPTSを用いると、レポーター遺伝子の発現量を指標として、RpBphP1変異体と野生型RpPpsR2、野生型RpBphP1とRpPpsR2変異体、またはRpBphP1変異体とRpPpsR2変異体の結合力を定量的に評価することができる。
　また、CPTSを利用した方法以外に、本実施形態にかかる光スイッチタンパク質を構成するタンパク質同士の結合力は、TetO-tetRを用いたレポーター遺伝子アッセイ、細胞膜へのトランスロケーションを指標とした蛍光顕微鏡によるアッセイなどを利用した方法によっても測定することができる。
　本実施形態にかかる光スイッチタンパク質を構成する各タンパク質（例えば、野生型RpBphP1とRpPpsR2変異体）には、各々、「別の物質（すなわち、光スイッチタンパク質を構成する各タンパク質とは異なる物質）」が結合または融合されていてもよい。当該「別の物質」は、特に限定されものではなく、いかなる物質であってもよく、タンパク質、脂質、糖類、核酸などの種々の生体物質などを例示することができる。本実施形態にかかる光スイッチタンパク質と「別の物質」とは、リンカーなどを介して結合されていてもよく、当該「別の物質」がタンパク質である場合には、融合されていてもよい。
　上述のCPTSの説明において、「タンパク質１」と「転写活性化因子」が、「別の物質」に相当する。
　あるいは、「別の物質」として、相互作用するタンパク質Aおよびタンパク質Bを、本実施形態にかかる光スイッチタンパク質の各タンパク質のそれぞれに、結合または融合させてもよい。この場合、本実施形態にかかる光スイッチタンパク質に近赤外光を照射すると、タンパク質Aとタンパク質Bの相互作用を誘導することができ、近赤外光照射を停止すると、タンパク質Aとタンパク質Bを解離することができる。従って、本実施形態にかかる光スイッチタンパク質を用いることで、タンパク質同士の相互作用を光照射のON/OFFで自在に操ることが可能である。ここに示した例以外にも、本実施形態にかかる光スイッチタンパク質には有用な用途が存在する（非特許文献１および非特許文献２などを参照のこと）。
第２の実施形態は、本実施形態にかかる光スイッチタンパク質を構成する各タンパク質のうち、すなわち、RpBphP1変異体およびRpPpsR2変異体をコードする核酸（DNAまたはRNA）である。
　本実施形態にかかる核酸は、当該技術分野において公知の方法または当該方法を適宜改変した方法により調製することができる。例えば、野生型をコードするDNAに所望の変異を導入して所望の核酸を取得してもよい。あるいは、自動合成装置によって合成することもできる。本実施形態にかかる光スイッチを構成する各タンパク質が、別のタンパク質と融合している場合、このような融合タンパク質をコードする核酸も、本実施形態にかかる核酸に含まれる。
　本実施形態における、野生型RpBphP1、野生型RpPpsR2、RpBphP1変異体およびRpPpsR2変異体は、各々、これらをコードする核酸、適当な発現用ベクターに組込み、該発現ベクターで適当な宿主細胞を形質転換または形質移入し、これを適当な培地中で培養し、発現した各タンパク質を精製することで調製することができる。
　タンパク質発現用の宿主細胞としては、例えば、細菌細胞（例えば、Escherichia coli B strain, E. coli Kl2 strain, Corynebacterium ammoniagenes, C. glutamicum, Serratia liquefaciens, Streptomyces lividans, Pseudomonas putidaなど）、カビ（例えば、Penicillium camembertii, Acremonium chrysogenumなど）、動物細胞、植物細胞、バキュロウイルス／昆虫細胞または酵母細胞（例えば、Saccharomyces cerevisiae およびPichia pastorisなど）などを使用してもよい。
　タンパク質を発現させるための発現用ベクターは、各種宿主細胞に適したベクターを用いることができる。発現用ベクターとしては、例えば、pBR322、pBR325、pUC118、pETなど（大腸菌宿主）、pEGFP-C、pEGFP-Nなど（動物細胞宿主）、pVL1392、pVL1393など（昆虫細胞宿主、バキュロウイルスベクター）、pG-1、Yep13またはpPICZなど（酵母細胞宿主）を使用することができる。これらの発現ベクターは、各々のベクターに適した、複製開始点、選択マーカーおよびプロモーターを有しており、必要に応じて、エンハンサー、転写終結配列（ターミネーター）、リボソーム結合部位およびポリアデニル化シグナル等を有していてもよい。さらに、発現ベクターには、発現したポリペプチドの精製を容易にするため、FLAGタグ、Hisタグ、HAタグおよびGSTタグなどを融合させて発現させるための塩基配列が挿入されていてもよい。
　発現用ベクターの作製は、当業者に公知の手法により実施することができ、適宜、市販のキットなどを使用して行うこともできる。
　発現させたタンパク質を培養菌体または培養細胞から抽出する際には、培養後、公知の方法で菌体または培養細胞を集め、これを適当な緩衝液に懸濁し、超音波、リゾチームおよび／または凍結融解などによって菌体または細胞を破壊したのち、遠心分離や濾過により、可溶性抽出液を取得する。特に、培養細胞を宿主として用いる場合は、培養上清中に発現させたタンパク質を、上清を回収する事により取得する方が望ましい。得られた抽出液または培養上清から、公知の分離・精製法を適切に組み合わせて目的のタンパク質を取得することができる。公知の分離、精製法としては、塩析や溶媒沈澱法などの溶解度を利用する方法、透析法、限外ろ過法、ゲルろ過法、SDS-PAGE等の主として分子量の差を利用する方法、イオン交換クロマトグラフィーなどの電荷の差を利用する方法、アフィニティークロマトグラフィーなどの特異的親和性を利用する方法（例えば、GSTタグと共にポリペプチドを発現させた場合にはグルタチオンを担体に結合させた樹脂を、Hisタグと共にポリペプチドを発現させた場合にはNi-NTA樹脂やCoベースの樹脂を、HAタグと共にポリペプチドを発現させた場合には抗HA抗体樹脂を、FLAGタグと共にポリペプチドを発現させた場合には、抗FLAG抗体結合樹脂などを使用する方法）、逆相高速液体クロマトグラフィーなどの疎水性の差を利用する方法または等電点電気泳動法などの等電点の差を利用する方法などが用いられる。
　本明細書が英語に翻訳されて、単数形の「a」、「an」および「the」の単語が含まれる場合、文脈から明らかにそうでないことが示されていない限り、単数のみならず複数のものも含むものとする。
　以下に実施例を示してさらに本発明の説明を行うが、本実施例は、あくまでも本発明の実施形態の例示にすぎず、本発明の範囲を限定するものではない。
１．実験方法
１－１．野生型RpBphP1遺伝子および野生型RpPpsR2遺伝子
　野生型RpBphP1遺伝子（配列番号４）と野生型RpPpsR2遺伝子（配列番号５）は、GenScript社の人工遺伝子合成サービスより購入した。その際、同社のコドン最適化アルゴリズムによって、ヒトのコドンに対する最適化を行った。
１－２．点変異の導入
　RpBphP1およびRpPpsR2への点変異導入は、overlap extension PCR法（Ho, S. Nら, Gene 77: 51-59 1989）またはtransfer PCR法（Erijmanら,　J. Struct. Biol. 175:171-177 2011）を用いて行った。両PCR法とも、プライマーとして使用するオリゴDNAはEurofins genomics社より購入した。DNA polymeraseとしてタカラバイオ社のPrimeSTAR HS DNA polymeraseを用い、PCR反応条件は同製品の取扱説明書に従った。Overlap extension PCR法による点変異導入の場合は、得られたPCR産物断片に対して制限酵素処理を行い、同様の制限酵素処理を行ったベクターとライゲーションをした。制限酵素はタカラバイオ社またはNew England Bio社のものを用い、ライゲーション反応はTOYOBO社のLigation high Ver. 2を用いた。それぞれの反応条件は、各製品の取り扱い説明書に従った。ベクターとしては、Invitrogen社の哺乳類細胞発現ベクターであるpcDNA3.1-V5HisAを用いた。ライゲーション産物をInvitrogen社のMach1ケミカルコンピテントセルと混合して、42℃でのヒートショックにより形質転換した。遺伝子工学実験の常法に従い、形質転換した大腸菌からプラスミドをクローニングした。得られたプラスミドは、Eurofins genomics社のシーケンス受託サービスにより配列確認をした。Transfer PCR法による点変異導入の場合は、まず pcDNA3.1-V5HisA に野生型配列をクローニングしたプラスミドを準備して、これをテンプレートとしてtransfer PCR反応を行った。PCR反応後、野生型テンプレートプラスミドは、タカラバイオ社のDpn Iを用いて消化した。消化反応後の産物をMach1ケミカルコンピテントセルに形質転換して、遺伝子工学実験の常法に従いクローニングをした。得られたプラスミドは、Eurofins genomics社のシーケンス受託サービスにより配列確認をした。
１－３．ドメインシャッフリング
　RpPpsR2のドメインシャッフリングは、次のように行った。まず、シャッフルしたいドメインへ制限酵素サイト付加した。これは制限酵素サイトを含むようにデザインしたプライマーを用いて、通常のPCR法によりPCR増幅を行った。得られたドメイン断片はpcDNA3.1-V5HisAにクローニングして、Eurofins genomics社のシーケンス受託サービスにより配列確認をした。配列確認済みのドメイン断片を制限酵素処理によって切り出し、望みの組み合わせでライゲーションをして、pcDNA3.1-V5HisAにクローニングした。
１－４．ドメイン欠失体の作製
　RpPpsR2のドメイン欠失体の作製は、通常のPCR法を用いて次のように行った。望みのドメインのN末端側やC末端側を欠失させるため、ドメインDNAの5’側や3’側において欠失を起こすようにプライマーをデザインする。通常のPCR法により、欠失ドメインを増幅する。得られた欠失ドメイン断片はpcDNA3.1-V5HisAにクローニングして、Eurofins genomics社のシーケンス受託サービスにより配列確認をした。
１－５．変異体のCPTSシステムへの導入
　変異体の機能評価は、CRISPR-Cas9システムを基盤とする光依存的遺伝子活性化ツール（CRISPR-Cas9-based photoactivatable transcription system；CPTS）を用いて行った。CPTSは、本発明者らが開発したツール（Nihongakiら, Nature Methods 14: 963-966 2017）である。CPTSシステムは次の４つのコンポーネントからなる。（１）Cas9の10番目のアミノ酸と840番目のアミノ酸に変異を導入してDNA切断活性を欠損させた変異体（Cas9D10A/H840A；dCas9）、（２）MS2コートタンパク質と結合するアプタマー配列を挿入したガイドRNA、（３）MS2コートタンパク質と連結した光スイッチタンパク質ペアの片方、（４）転写活性化因子（p65-HSF1）と連結した光スイッチタンパク質ペアのもう一方、である。今回の光スイッチタンパク質ペアは、RpBphP1変異体とRpPpsR2変異体であるので、RpBphP1変異体とp65-HSF1を連結し、RpPpsR2変異体とMS2コ―トタンパク質を連結した。p65-HSF1のDNAは、Addgeneより購入したAddgene plasmid #61423からPCRで増幅した後、サブクローニングをして、Eurofins genomics社のシーケンス受託サービスにより配列確認をした。MS2コートタンパク質（MS2 delta FG）のDNAは、Addgeneより購入したAddgene plasmid #27122からPCRで増幅した後、サブクローニングをして、Eurofins genomics社のシーケンス受託サービスにより配列確認をした。これらを光スイッチタンパク質と連結する際は、すべて制限酵素サイトを用いて行った。また、それぞれのコンストラクトのN末端には、SV40由来の核移行シグナル（Nuclear Localization Signal；NLS）を３回連続した配列（NLSx3；ASPKKKRKVEASASPKKKRKVEASASPKKKSKVEAS；配列番号４）を連結した。核移行シグナルの連結も制限酵素サイトを用いて行った。得られたNLSx3-RpBphP1変異体-p65-HSF1およびNLSx3-MS2-RpPpsR2変異体は、pcDNA3.1-V5HisAにクローニングした。
１－６．CPTSシステムのその他のコンポーネントの作製
（１）dCas9の作製
ヒトのコドンに対して最適化されているstreptococcus pyogenes由来Cas9 (SpCas9) のDNAは、Addgeneより購入したAddgene plasmid #42230のhSpCas9を使用した。hSpCas9のDNA切断活性を欠損させるため、D10AおよびH840Aの点変異導入をアジレント社のQuick change Multi Site-Directed Mutagenesis Kitを取扱説明書に従って使用して行った。また、N末端とC末端それぞれに、SV40由来の核移行シグナル（NLS）をPCRで付加した。このようにして得たNLS-dSpCas9-NLSは、pcDNA3.1-V5HisAにクローニングした後、Eurofins genomics社のシーケンス受託サービスにより配列確認をした。
（２）アプタマー付きガイドRNAの作製
　哺乳類細胞においてガイドRNAを発現させるために、pSPgRNAベクター（Addgene plasmid # 47108）をAddgeneより購入して用いた。MS2コートタンパク質と結合するアプタマー配列は、Eurofins genomics社の人工遺伝子合成サービスより購入した。合成されたアプタマー配列をpSPgRNAベクターのKpn I / Sac Iサイトにクローニングした。作製したベクターのBbs Iサイトに、GAL4/UASシステムの上流活性化配列を標的とする配列を挿入した。この標的配列は、Eurofins genomics社より購入したオリゴDNAをアニーリングすることで作製した。完成したアプタマー付きガイドRNAはEurofins genomics社のシーケンス受託サービスにより配列確認をした。
１－７．発光レポータープラスミドの作製
　変異体の機能評価を簡便に行うため、発光シグナルの増減を指標とした。そのために、CPTSによって光照射依存的に発光レポーター遺伝子が活性化するレポータープラスミドを用いた。GAL4/UASシステムの上流活性化配列を搭載しているプロメガ社のpGL4.31用いて、その下流の発光レポーター遺伝子を、短寿命型のホタルルシフェラーゼ遺伝子から通常寿命型のホタルルシフェラーゼ遺伝子に乗せ換えて使用した。前述のアプタマー付きガイドRNAは、この上流活性化配列に結合するようにデザインしている。
１－８．細胞培養
　変異体の機能評価は、HEK293T細胞を用いて行った。HEK293T細胞はAmerican Type Culture Collection（ATCC）より入手した。培地は、10 %FBS（Gibco社）、100 unit/mLペニシリンおよび100 μg/ mLストレプトマイシン（Gibco社）、0.584 g/LのL-グルタミン（Gibco社）を添加したダルベッコ改変イーグル培地（Dulbecco's Modified Eagle Medium；DMEM、Sigma Aldrich社）を用いて、37℃、5％CO2のインキュベーター内で培養した。
１－９．近赤外光の照射
　近赤外光の光源として、CCS社のLED光源（760 ± 20 nm）を使用した。照射強度は10 W/m2の強度で照射した。インキュベーター内および細胞培養プレートの温度上昇を防止するために、近赤外光の照射はCUSTOM社のON/OFFタイマー（WT-03N）を用いて、ON/OFF = 1分/4分のサイクルで行った。また、細胞培養プレートに近赤外光を均一な強度で照射する目的で、3M社の光拡散フィルム（スコッチカル透過率30%）を用いた。
１－１０．CPTSの発光レポーターアッセイ
（１）細胞の播種
　まず、96穴黒色壁プレート（Greiner Bio社）にHEK293T細胞を播種した。細胞の濃度が2.3×104 cells/wellとなるように、各wellに100 μLずつ細胞懸濁液を入れた。ビリベルジン（BV；Frontier scientific社）を添加する場合には、最終濃度25 μMとなるように添加した。なお、BVは光で分解されやすい性質をもつため、暗所で作業をおこなった。細胞を播種したプレートは37℃、5％CO2のインキュベーター内で24時間培養した．
（２）プラスミドのトランスフェション
　プラスミドのトランスフェクションは、以下の（Ａ）または（Ｂ）の、いずれかの方法で行った．
（Ａ）リポフェクション法によるトランスフェクション
　遺伝子導入試薬にLipofectamine 3000（Invitrogen社）を使用し、実験で使用するプラスミドをリポフェクション法で遺伝子導入した。取扱説明書に従い、Lipofectamineを0.2 μL/well、P3000を0.2 μL/wellとなるようにした。導入するDNAの総量は1 wellあたり0.1 μgとした。dSpCas9、ガイドRNA、MS2-RpPpsR2、RpBphP1-p65HSF1およびGAL4UAS-Firefly Luciferaseレポーターを、各々コードするプラスミドを1:1:1:1:1の比率で遺伝子導入した。また、Negative controlとしてpcDNA3.1 V5/His-AベクターとGAL4UAS-Firefly Luciferaseレポーターをコードするプラスミドを4:1の比率で遺伝子導入した。遺伝子導入後はプレートをすみやかにアルミホイルで包んで遮光し、インキュベーターに戻した。
（Ｂ）カチオン性ポリマー（PEI MAX）によるトランスフェクション
　遺伝子導入試薬にPEI MAX（Transfection Grade Linear Polyethylenimine Hydrochloride；Polysciences社）を使用した。PEI MAXは0.6 μL/wellとなるようにして、実験で使用するプラスミドを遺伝子導入した。導入するDNAの総量は1 wellあたり0.1 μgとした。SpCas9、ガイドRNA、MS2-RpPpsR2、RpBphP1-p65HSF1、およびGAL4UAS-Firefly Luciferaseレポーターを、各々コードするプラスミドを1:1:1:1:1の比率で遺伝子導入した。また、Negative controlとしてpcDNA3.1 V5/His-AベクターとGAL4UAS-Firefly Luciferaseレポーターを、各々コードするプラスミドを4:1の比率で遺伝子導入した。遺伝子導入後はプレートをすみやかにアルミホイルで包んで遮光し、インキュベーターに戻した。
（３）近赤外光照射
　遺伝子導入から24時間後、培地の蒸発による乾燥を防ぐため、各wellに培地を100 μLずつ補充した。BV(+)のwellには、25 μMのBVを添加した培地を補充した。このとき、光照射用のプレートと暗所条件用のプレートの作業は共に暗所で行った。暗所条件用のプレートは、培地の補充後すみやかに再びアルミホイルで包んで遮光してインキュベーター内に静置した。光照射用のプレートは、近赤外光をインキュベーター内で照射した。
（４）発光レポーター遺伝子の発光強度の測定
　光照射の開始から24時間後に、両プレートを回収した。回収したプレートの各wellから培地を抜き、200 μMのD-Luciferin（富士フイルム和光純薬）を添加したHBSS（Gibco社）を100 μLずつ加えた。室温で30分のインキュベーション後、発光プレートリーダー（Centro XS3 LB 960 Plate Reader; Berthold Technologies社）を用いて、生物発光測定を行った。露光時間は1秒/wellに設定した。
１－１１．細胞内および生体内における、本発明の光スイッチタンパク質によるゲノム遺伝子活性化の確認
１－１１－１．ゲノム遺伝子を標的としたアプタマー付きガイドRNAの作製
　ゲノム遺伝子を標的とするために、アプタマー付きガイドRNAのBbs Iサイトに、それぞれ次のような配列を挿入した。
ヒトASCL1遺伝子を標的とする場合；GCAGCCGCTCGCTGCAGCAG（配列番号７）
ヒトHBG1遺伝子を標的とする場合；GGCTAGGGATGAAGAATAAA（配列番号８）
ヒトMYOD1遺伝子を標的とする場合；GCCTGGGCTCCGGGGCGTTT（配列番号９）
ヒトIL1R2遺伝子を標的とする場合；GTCCTTGGCCACTTCCCCATC（配列番号１０）
マウスASCL1遺伝子を標的とする場合；AGCTGAGGAGGTGGGGGAAG（配列番号１１）
これらの標的配列は、Eurofins genomics社より購入したオリゴDNAをアニーリングすることで作製した。完成したアプタマー付きガイドRNAは、Eurofins genomics社のシーケンス受託サービスにより配列確認をした。
１－１１－２．CPTSによる細胞内でのゲノム遺伝子活性化
（１）細胞の播種
　まず、96穴プレート（Thermo Fisher Scientific社）にHEK293T細胞を播種した。細胞の濃度が2.3×104 cells/wellとなるように、各wellに100 μLずつ細胞懸濁液を入れた。BVを添加する場合には、最終濃度25 μMとなるように添加した。なお、BVは光で分解されやすい性質をもつため、暗所で作業をした。細胞を播種したプレートは、37℃、5％CO2のインキュベーターで24時間培養した。
（２）プラスミドのトランスフェション
　RpBphP1変異体（Q502AおよびE513Aを導入）と野生型RpPpsR2の組み合わせを光スイッチタンパク質として用いた。遺伝子導入試薬にLipofectamine 3000（Invitrogen社）を使用し、実験で使用するプラスミドをリポフェクション法で遺伝子導入した。取扱説明書に従い、Lipofectamineを0.2 μL/well、P3000を0.2 μL/wellとなるようにした。導入するDNAの総量は1 wellあたり0.1 μgとした。dSpCas9、ガイドRNA、MS2-RpPpsR2、RpBphP1-p65HSF1をコードするプラスミドを1:1:1:1の比率で遺伝子導入した。また、Negative controlとして標的配列を持たないガイドRNAプラスミドを用いた。遺伝子導入後はプレートをすみやかにアルミホイルで包んで遮光し、インキュベーターに戻した。
（３）近赤外光照射
　遺伝子導入から24時間後、培地の蒸発による乾燥を防ぐため、各wellに培地を100 μLずつ補充した。BV(+)のwellには、25 μMのBVを添加した培地を補充した。このとき、光照射用のプレートと暗所条件用のプレートのともに暗所で作業を行った。暗所条件用のプレートは、培地の補充後すみやかに再びアルミホイルで包んで遮光してインキュベーター内に静置した。光照射用のプレートは、近赤外光をインキュベーター内で照射した。
（４）リアルタイムPCRによるゲノム遺伝子の発現量の評価
　光照射の開始から24時間後に、両プレートを回収した。回収したプレートの細胞から、Takara Bio社のCellAmp Direct RNA Prep Kitを使用してmRNAを抽出した。抽出の手順は取扱説明書に従った。次に、抽出したmRNAをSuperscript IV VILO Master Mix（Thermo Fisher Scientific社）を使用してcDNAに逆転写した。手順は取扱説明書に従った。逆転写後、cDNA量をリアルタイムPCRによって評価した。リアルタイムPCR用試薬として、TaqMan Gene Expression Master Mix（Thermo Fisher Scientific社）、およびTaqMan Gene Expression Assay（Thermo Fisher Scientific社）を用いた。使用したTaqManプローブのIDは以下の通りである；
ヒトASCL1遺伝子：Hs04187546_g1
ヒトHBG1遺伝子：Hs00361131_g1
ヒトMYOD1 遺伝子：Hs02330075_g1
ヒトIL1R2遺伝子：Hs01030384_m1
ヒトGAPDH遺伝子：Hs99999905_m1
　リアルタイムPCRのためのサーマルサイクラーおよびソフトウェアにはStepOnePlusシステム（Thermo Fisher Scientific）を用いた。測定には標準的なΔΔCt法を使用し、未トランスフェクションのHEK293T細胞のmRNAに対する相対的なmRNA発現レベルを測定した。
１－１１－３．CPTSによるマウス生体内での遺伝子活性化
（１）実験用マウスの準備
　マウスを用いた動物実験は、東京大学の定める動物実験実施マニュアルおよび実験ガイドラインに従って行った。６週齢のメスのBALB/cマウス（三協ラボサービス社）を使用した。
（２）マウス肝臓への遺伝子導入
　RpBphP1変異体（Q502AおよびE513Aを導入）と野生型RpPpsR2の組み合わせを光スイッチタンパク質として用いた。Hydrodynamic Tail Vein Injection法によって、マウスの肝臓細胞に遺伝子導入した。Mirus Bio社のTransIT-EE Hydrodynamic Delivery Solutionを使用し、溶液の調製手順は取扱説明書に従った。プラスミドDNAの総量は1マウスあたり150 μgとした。遺伝子導入するプラスミドDNAの比率は、dSpCas9、ガイドRNA、MS2-RpPpsR2、RpBphP1-p65HSF1、GAL4UAS-Akalucレポーターを1:1:1:1:1の比率とした。テルモ社の27G注射針を用いて、調製した溶液をマウスの尾静脈に注射した。このとき、5～6秒程度で一度に注射し切ることに留意した。注射後はマウスをケージに戻し、8時間飼育した。
（３）マウスへの近赤外光照射
　注射から8時間後、マウスへの近赤外光照射を開始した（図２２ａ）。近赤外光は、760±20 nm、300 W/m2の強度で照射した。光照射後12時間後に、照射を一時中断して、ケージの清掃を行った。
（４）マウス肝臓細胞の生物発光イメージング
　注射から25時間後に、マウス肝臓細胞の生物発光イメージングを行った。マウスの腹腔内に10 mM Akalumine-HCl（富士フイルム和光純薬）を200 μL注射した。注射後、マウスをイソフルラン（富士フイルム和光純薬）で麻酔した。麻酔後、Evolve 512 EMCCDカメラ （Photometrics社）を搭載したLumazone bioluminescence imager（ショーシン社）を用いて、マウスの生物発光画像を撮影した。データは、SlideBook 4.2ソフトウェア（Intelligent Innovations社）を用いて解析した。
（５）マウス肝臓細胞内でのゲノム遺伝子活性化
　マウスASCL1遺伝子を標的とするガイドRNAを用いて、dSpCas9、ガイドRNA、MS2-RpPpsR2、RpBphP1-p65HSF1を1:1:1:1の比率で、Hydrodynamic Tail Vein Injection法によって遺伝子導入を行った。プラスミドDNAの総量は1マウスあたり120 μgとした。光照射は前述の発光レポーター遺伝子の場合と同様である。光照射後、マウス肝臓からmRNAを抽出した。マウス肝臓は、Precellys Evolution tissue homogenizer（Bertin Instruments 社）を用いて破砕した。抽出したmRNAは、Superscript IV VILO Master Mix（Thermo Fisher Scientific社）を使用してcDNAに逆転写した。手順は取扱説明書に従った。逆転写後、cDNA量をリアルタイムPCRによって評価した。リアルタイムPCR用試薬として、Luna Universal Probe qPCR Master Mix（New England Biolabs社）、およびTaqMan Gene Expression Assay（Thermo Fisher Scientific社）を用いた。使用したTaqManプローブのIDは以下の通りである；
マウスASCL1遺伝子：Mm03058063_m1
マウスGAPDH遺伝子: Mm99999915_g1
　リアルタイムPCRのためのサーマルサイクラー及びソフトウェアにはStepOnePlusシステム（Thermo Fisher Scientific）を用いた。測定には標準的なΔΔCt法を使用し、未トランスフェクションのマウス肝臓細胞のmRNAに対する相対的なmRNA発現レベルを測定した。
２．結果
２－１．野生型RpBphP1と野生型RpPpsR2からなる光スイッチタンパク質の機能の確認
　野生型のRpBphP1と野生型のRpPpsR2を、CRISPR-Cas9システムを基盤とする光依存的遺伝子活性化ツール（CPTS）に搭載した。CPTSの動作原理を以下に説明する（図１ａ参照）。
　Cas9の10番目のアミノ酸と840番目のアミノ酸に変異を導入してDNA切断活性を欠損させた変異体（Cas9D10A/H840A；dCas9）は、ガイドRNAと複合体を形成して、ガイドRNA で狙ったゲノムDNAの塩基配列に結合させることができる。例えば、発現を光操作したい遺伝子の転写開始点100~500 bp程度上流などである。このガイドRNAには工夫が施してある。ガイドRNAのいくつかのループ構造のうち、dCas9から露出しているループには、別のRNA配列を挿入することが可能である。そこで、特定のタンパク質と結合するアプタマー配列を挿入した。ここでは、バクテリオファージMS2の持つコートタンパク質と結合するアプタマー配列を挿入した。そして、MS2コートタンパク質に光スイッチタンパク質の片方を連結する。もう一方の光スイッチタンパク質には転写を活性化する因子（ｐ65とHSF1）を繋いでおく。こうすることで、光を照射すると、光スイッチタンパク質が結合し、その結果、転写活性化因子が転写開始点の近傍に係留される。これにより、当該遺伝子の転写を活性化させ、mRNA転写が起こり、タンパク質への翻訳が起こる。一方、光照射を止めると、光スイッチタンパク質は解離するので、転写活性化因子が転写開始点から大きく離れて、当該遺伝子の発現は停止する。このようにして、ゲノム上にコードされた遺伝子や発光レポータープラスミド上の発光レポーター遺伝子を、光によってスイッチON/OFFすることが可能である。
　野生型のRpBphP1と野生型のRpPpsR2は暗所下でも結合してしまい、遺伝子の活性化を起こしてしまうことがわかった（図１ｂ中、WT）。この「Darkリークシグナル（図１ｂ中WTの「Dark」）」が非常に高いせいで、光照射による遺伝子活性化はたかだか1.8倍の増加にしかならない。このように「Darkリークシグナル」が生じてしまうことは、光スイッチタンパク質として致命的な欠点であり、このままでは実用化することはできない。
２－２．RpBphP1変異体と野生型RpPpsR2からなる光スイッチタンパク質の機能解析
　RpBphP1に点変異を導入することでRpBphP1変異体を作製し、当該RpBphP1変異体と野生型RpPpsR2の結合状態が、暗所下および近赤外光照射下でどのようになるのかを調べた。その結果、野生型RpBphP1（WT）に比べ、Darkリークシグナルを下げる変異体が見つかった（図２ａ、ｂおよびｃ）。Darkリークシグナルが大幅に減少した変異体では、光照射による遺伝子活性化を大きく増加させることができた。例えば、D607A変異体では15.7倍の増加（図２ａ）を、Q502T変異体では12.4倍の増加（図２ｂ）を、D607S変異体では9.7倍の増加（図２ｃ）を、それぞれ得ることができた。しかし、これらは近赤外光照射下のシグナル（NIRシグナル）も相応に減少してしまう傾向も見られた。その一方で、D607Eのように、NIRシグナルを減少させることなく、Darkリークシグナルを減少させる効果があるアミノ酸変異体も存在した（図２ｃ）。D607EのようなRpBphP1変異は、他の変異との組合せによるRpBphP1の機能向上を行う上で、有望なアミノ酸変異候補となる。
　さらに、RpBphP1に点変異を導入した結果、 当該変異体と野生型RpPpsR2からなる光スイッチタンパク質のNIRシグナルが高くなる変異体を見出した（図３ａおよびｂ）。これらの変異も、他の変異との組み合わせによるRpBphP1の機能向上を行う上で、有望なアミノ酸変異候補となる。
２－３．野生型RpBphP1とRpPpsR2変異体からなる光スイッチタンパク質の機能解析
　次に、RpPpsR2に点変異を導入することでRpPpsR2変異体を作製し、野生型RpBphP1と当該RpPpsR2変異体の結合状態が、暗所下および近赤外光照射下でどのようになるのかを調べた。その結果、野生型のRpPpsR2（WT）に比べ、Darkリークシグナルを下げる変異体が見つかった（図４ａおよびｂ）。Darkリークシグナルが大幅に減少した変異体では，光照射による遺伝子活性化を大きく増加させることができた。例えば、L110A変異体では13.4倍の増加を得ることができた（図４ａ）。また、Q105Tのように、NIRシグナルを減少させることなく、Darkリークシグナルを減少させる効果があるアミノ酸変異体も存在した（図４ｂ）。Q105Tのような変異は、他の変異との組み合わせによるRpPpsR2の機能向上を行う上で、有望なアミノ酸変異候補となる。
　さらに、RpPpsR2に点変異を導入した結果、 当該変異体と野生型RpBphP1からなる光スイッチタンパク質のNIRシグナルが上がる変異体を見出した（図５ａ～ｃ）。特に、Q105Sに変異を有するRpPpsR2変異体と野生型RpBphP1からなる光スイッチタンパク質は、Darkリークシグナルには影響を受けずにNIRシグナルが高くなる（図５ｂ）。Q105Sのような変異は、他の変異との組み合わせによるRpPpsR2の機能向上を行う上で、有望なアミノ酸変異候補となる。
２－４．野生型RpBphP1とRpPpsR2ドメイン改変体からなる光スイッチタンパク質の機能解析
　アミノ酸の点変異によらずともDarkリークシグナルを減少させられるアプローチを試みた。野生型RpPpsR2の立体構造は、５つのドメインからなる。本発明者らは、これら５つのドメインのうちいくつかのドメインを抜き出したり（除去）、連結する順番を変えたり、数を変えたりすること（ドメインをシャッフリングすること）で、RpBphP1との結合性が変わることを見出した（図６）。例えば、D4-D1-D2というドメインシャッフリングを施したRpPpsR2ドメイン改変体と野生型RpBphP1からなる光スイッチタンパク質では、Darkリークシグナルが大幅に減少した結果、光依存的活性化が7.2倍に増加した（図６ｂ）。また、D3-D1-D2ドメイン改変体では、NIRシグナルは減少せずに、Darkリークシグナルが減少した（図６ｂ）。D3-D1-D2のようなドメインシャッフリングは、他の変異との組み合わせによるRpPpsR2の機能向上を行う上で有望である。
　ドメインシャッフリングにおいても、NIRシグナルを上昇させる変異体を見出した（図７）。これらのドメインシャッフリングも、他の変異との組み合わせによるRpPpsR2の機能向上を行う上で有望な変異候補となり得る。
　本発明者らは、RpPpsR2ドメイン内のN末端側やC末端側を削除すること（ドメイン欠失体）によってもRpBphP1との結合性が変わることを見出した。例えば、RpPpsR2のドメインシャッフリングの１つ（D1-D2）のN末端側やC末端側を削除した（図８ａ参照）ドメイン改変体は、RpBphP1との結合性が変化する。例えば、D1-D2 (del C 15)というドメイン改変体は、Darkリークシグナルを大幅に減少させて光依存的活性化を9.6倍に増加させた（図８ｂ）。また、D1-D2 (del N 77)というドメイン改変体は、NIRシグナルを減少させることなく、Darkリークシグナルを減少させた（図８ｂ）。このような、アミノ酸欠失を含むドメイン改変は、他の変異との組み合わせによるRpPpsR2の機能向上を行う上で有望である。
　さらに、欠失を含むドメイン改変体においても、NIRシグナルが上がる変異体が見出された（図９ａおよびｂ）。特に、D1-D2 (del N 64)は、Darkリークシグナルを変えずにNIRシグナルが上がる（図９ｂ）。このようなドメイン改変体は、他の変異との組み合わせによるRpPpsR2の機能向上を行う上で有望である。
　次に、欠失を含むドメイン改変体の１つであるD1-D2（del N 93）（図８ｂ）について、その周辺のアミノ酸欠失体を１アミノ酸毎に（del N 88）から（del N 97）まで調べた（図１０ａ参照）。その結果、この周辺の欠失体は全てDarkリークシグナルを減少させることがわかった（図１０ｂ）。このような欠失を含むドメイン改変体は、他の変異との組み合わせによるRpPpsR2の機能向上を行う上で有望である。
　さらに、欠失を含むドメイン改変体の１つであるD1-D2（del N 93）について、そのC末端側を削除した欠失体を調べた（図１１ａ参照）。その結果、C末端側を削除することで、さらにDarkリークシグナルを減少させることがわかった（図１１ｂ）。このような欠失を含むドメイン改変体は、他の変異との組み合わせによるRpPpsR2の機能向上を行う上で有望である。
２－５．複数の有益な変異（点変異またはドメイン改変など）を有するRpBphP1変異体および／またはRpPpsR2変異体からなる光スイッチタンパク質の機能解析
　これまでに機能解析を行ったアミノ酸点変異体またはドメイン改変体（ドメインシャッフリング体およびドメイン欠失体）の有益な変異を複数個有する、RpBphP1変異体および／またはRpPpsR2変異体からなる光スイッチタンパク質の機能解析を行った。図１２に、RpBphP1とRpPpsR2においてDarkリークシグナルを下げる変異・改変とNIRシグナルを上げる変異・改変が複数個ある場合に、どのような組み合わせがありうるかを示した。全部で１２パターンの組み合わせがある。このように組み合わせた結果、有益な変異を複数有する光スイッチタンパク質は、変異の効果が積み重ねられて、機能がさらに向上することを見出した。以下に、具体的に説明を行う。
　RpBphP1またはRpPpsR2に、Darkリークシグナルを下げる点変異またはドメイン改変とNIRシグナルを上げる点変異またはドメイン改変を同時に持たせた場合に光スイッチタンパク質の性質がどのようになるかを調べた。まず、RpBphP1とRpPpsR2の組み合わせパターンが、図１２の組み合わせ２である例を試した。RpBphP1に、Darkリークシグナルを下げる点変異とNIRシグナルを上げる点変異を同時に導入すると、光スイッチタンパク質のNIRシグナルをほとんど下げずにDarkリークシグナルを下げることができた（図１３ａ）。次にRpBphP1とRpPpsR2の組み合わせパターンが、図１２の組み合わせ７である例を試した。RpPpsR2に、Darkリークシグナルを下げる点変異とNIRシグナルを上げる点変異を同時に導入すると、光スイッチタンパク質のNIRシグナルをほとんど下げずにDarkリークシグナルを下げることができた（図１３ｂ）。さらに、RpBphP1とRpPpsR2の組み合わせパターンは図１２の組み合わせ７であるが、RpPpsR2においてドメイン改変と点変異を併せ持つ変異体を試した。すなわち、Darkリークシグナルを下げるドメイン改変（D3-D2）とNIRシグナルを上げる点変異（L137E）を併せ持つRpPpsR2変異体を作製し、野生型のRpBphP1と組み合わせた。その結果、光スイッチタンパク質のDarkリークシグナル強度に対するNIRシグナル強度の比率を改善することが可能であった（図１４）。
　以上のように、RpBphP1またはRpPpsR2に有益な効果を発揮する変異（点変異またはドメイン改変など）を複数導入することで、光スイッチタンパク質の機能向上が可能であることが明らかになった。
　次に、RpBphP1とRpPpsR2の双方に、有益な変異を導入した場合の光スイッチタンパク質の性質を調べた（図１５、図１６、図１７、図１８）。まず、RpBphP1とRpPpsR2の組み合わせパターンが、図１２の組み合わせ９である例を試した。Darkリークシグナルを下げる点変異を導入したRpBphP1変異体と、Darkリークシグナルを下げるドメインシャッフリング改変を行ったRpPpsR2変異体とを組み合わせた結果、光スイッチタンパク質のNIRシグナルをほとんど下げずにDarkリークシグナルを下げることができた（図１５ａ）。次に、RpBphP1とRpPpsR2の組み合わせパターンが、図１２の組み合わせ３である例を試した。Darkリークシグナルを下げる点変異を導入したRpBphP1変異体と、NIRシグナルを上げる点変異を導入したRpPpsR2変異体とを組み合わせた結果、光スイッチタンパク質のNIRシグナルをほとんど下げずにDarkリークシグナルを下げることができた（図１５ｂ）。
　次に、RpBphP1とRpPpsR2の組み合わせパターンが、図１２の組み合わせ４である例を試した。すなわち、Darkリークシグナルを下げる点変異とNIRシグナルを上げる点変異を導入したRpBphP1変異体と、NIRシグナルを上げる点変異を導入したRpPpsR2変異体とを組み合わせた。その結果、スイッチタンパク質のNIRシグナルをほとんど下げずにDarkリークシグナルを下げることができた（図１６ａ）。次に、RpBphP1とRpPpsR2の組み合わせパターンが、図１２の組み合わせ１０である例を試した。すなわち、Darkリークシグナルを下げる点変異とNIRシグナルを上げる点変異を導入したRpBphP1変異体と、Darkリークシグナルを下げる点変異を導入したRpPpsR2変異体とを組み合わせた。その結果、この場合でも、光スイッチタンパク質のDarkリークシグナル強度に対するNIRシグナル強度の比率を改善することが可能であった（図１６ｂ）。
　また、RpBphP1とRpPpsR2の組み合わせパターンは図１２の組み合わせ３であるが、NIRシグナルを上げる点変異をRpPpsR2に複数持つ場合を試した。すなわち、NIRシグナルを上げる点変異を２つ導入したRpPpsR2変異体と、Darkリークシグナルを下げる点変異を１つ導入したRpBphP1変異体を組み合わせた。その結果、光スイッチタンパク質のNIRシグナルをほとんど下げずにDarkリークシグナルを下げることができた（図１７ａ）。次に、RpBphP1とRpPpsR2の組み合わせパターンを図１２の組み合わせ１１のようにした場合、すなわち、RpPpsR2にDarkリークシグナルを下げる点変異とNIRシグナルを上げる点変異を１つずつ導入し、RpBphP1にDarkリークシグナルを下げる点変異を１つ導入した組み合わせを試した。その結果、この場合でも、光スイッチタンパク質のDarkリークシグナル強度に対するNIRシグナル強度の比率を改善することが可能であった（図１７ｂ）。
　さらに、RpBphP1とRpPpsR2の組み合わせパターンは図１２の組み合わせ４であるが、NIRシグナルを上げる点変異をRpPpsR2に複数持つ場合を試した。すなわち、NIRシグナルを上げる点変異を２つ導入したRpPpsR2変異体と、Darkリークシグナルを下げる点変異とNIRシグナルを上げる点変異を１つずつ導入したRpBphP1変異体を組み合わせた。その結果、この場合でも、光スイッチタンパク質のDarkリークシグナル強度に対するNIRシグナル強度の比率を改善することが可能であった（図１８ａ）。また、RpBphP1とRpPpsR2の組み合わせパターンが、図１２の組み合わせ１２である例を試した。すなわち、Darkリークシグナルを下げる点変異とNIRシグナルを上げる点変異を導入したRpBphP1変異体と、Darkリークシグナルを下げる点変異とNIRシグナルを上げる点変異を導入したRpPpsR2変異体とを組み合わせた。その結果、この場合でも、光スイッチタンパク質のDarkリークシグナル強度に対するNIRシグナル強度の比率を改善することが可能であった（図１８ｂ）。図１８ａの組み合わせと図１８ｂの組み合わせは、10倍以上の光依存的活性化（すなわち、Darkシグナル強度に対するNIRシグナル強度が10以上になる）を、起こすことが可能であった。以上の結果は、有益な効果を持つ変異をRpBphP1とRpPpsR2へ複数個導入することで、光スイッチタンパク質の機能向上が可能であることを示すものである。
　つぎに、RpBphP1とRpPpsR2の組み合わせパターンは図１２の組み合わせ１１であるが、ドメイン改変と点変異を併せ持つRpPpsR2変異体を、Darkリークシグナルを下げるRpBphP1変異体と組み合わせた。その結果、この場合でも、光スイッチタンパク質のDarkリークシグナル強度に対するNIRシグナル強度の比率を改善することが可能であった（図１９）。
　さらに、RpBphP1とRpPpsR2の組み合わせパターンは図１２の組み合わせ１２であるが、ドメイン改変と点変異を併せ持つRpPpsR2変異体を、複数の点変異を持つRpBphP1変異体と組み合わせた。すなわち、Darkリークシグナルを下げる点変異とNIRシグナルを上げる点変異を１つずつ導入したRpBphP1変異体と組み合わせた。その結果、この場合でも、光スイッチタンパク質のDarkリークシグナル強度に対するNIRシグナル強度の比率を改善することが可能であった（図２０）。
　以上の結果は、有益な効果を持つRpBphP1点変異とRpPpsR2のドメイン改変および点変異を全て組み合わせることで、光スイッチタンパク質の機能向上が可能であることを示すものである。
２－６．細胞内および生体内における、本発明の光スイッチタンパク質による遺伝子活性化の確認
２－６－１．細胞内におけるゲノム遺伝子活性化の確認
　近赤外光操作ツール（前述のCRISPR-Cas9システムに基づく遺伝子発現の光操作ツール；CPTS）を利用して、本発明の光スイッチタンパク質の培養細胞内における機能を解析した。
　光操作ツール用のガイドRNAを、ヒト遺伝子（ASCL1、HBG1、MYOD1またはIL1R2）のそれぞれをターゲットするものにデザインし直した。この４種類をヒト細胞株に同時に遺伝子導入して、近赤外光照射を行った。その結果、４種類のヒト遺伝子すべてを同時に光活性化することができた（図２１ａ）。この近赤外光操作ツールが、近赤外光照射を開始してどれくらいの時間で遺伝子を活性化できるのかを調べた。光操作ツールを導入したヒト細胞株に光照射を開始し、指定の時間において光操作ツールの活性化の程度を定量評価した。その結果、光照射後1.5時間で、すでに遺伝子活性化を18倍誘導できることがわかった（図２１ｂ）。さらに、光照射を止めた時に、この光操作ツールによる遺伝子活性化が止まるのかを調べた。その結果、光照射を止めると、遺伝子活性化を止めることができること、および光照射を再開すると遺伝子活性化も再開できることがわかった（図２１ｃ）。
２－６－２．生体内における遺伝子活性化の確認
　CPTSを利用して、本発明の光スイッチタンパク質のマウス生体内における機能を解析した。
　CPTSのコンポーネントをマウス肝臓に遺伝子導入し、マウス生体外からLEDパネルを用いて光照射した（760 nm、300 W/m2）。
　発光レポーター用のCPTSを用いた場合、暗所保持したマウス（Dark）からは発光シグナルが見られなかったが、近赤外光照射をしたマウス（NIR）では、肝臓の部位から強い発光シグナルが観察された（図２２ｂ）。次に、マウスのASCL1遺伝子用のCPTSを用いた場合、近赤外光照射後、マウスから肝臓を摘出し（図２２ｃ左図）、mRNAを抽出して定量分析した。その結果、暗所保持したマウス（Dark）に対して、近赤外光照射したマウス（NIR）の肝臓において、ASCL1遺伝子が47.8倍活性化されたことが確認できた（図２２ｃ右図）。
　本発明は、近赤外光の光照射のON/OFFにより、結合および解離を精密に制御することができる光スイッチタンパク質が提供される。生体内に導入した本発明にかかる光スイッチタンパク質は、生体外から近赤外光によってその機能を制御することができることから、疾患等の治療目的での使用が可能であり、医療分野等における利用が期待される。

Claims (13)

  1. 　近赤外光照射下で結合する2つのタンパク質からなるタンパク質セットであって、当該タンパク質セットはRpBphP1変異体と野生型RpPpsR2のセット、野生型RpBphP1とRpPpsR2変異体のセット、または、RpBphP1変異体とRpPpsR2変異体のセットであり、当該タンパク質セットの結合が、野生型RpBphP1と野生型RpPpsR2の結合と比較して、暗所下での結合が弱い、および／または近赤外光照射下での結合が強い、前記タンパク質セット。
  2. 　前記野生型RpBphP1が、配列番号１または配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質、または配列番号１または配列番号２で表されるアミノ酸配列と90%以上の配列同一性を有するタンパク質であり、前記野生型RpPpsR2が、配列番号３で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質、または配列番号３で表されるアミノ酸配列と90%以上の配列同一性を有するタンパク質である、請求項１に記載のタンパク質セット。
  3. 　前記タンパク質セットが、野生型RpPpsR2とRpBphP1変異体のセットであって、
    当該RpBphP1変異体が、配列番号１または配列番号２で表されるアミノ酸配列中に、Q514A、D607E、 R638A、H661A、R696A、E327A、E332A、E337A、D339A、E365A、Q367A、E429A、R490A、D498A、Q502A、Q502G、Q502V、Q502L、Q502I、Q502S、Q502T、Q502E、Q502K、Q502R、Q502H、Q502N、Q502F、Q502Y、Q502W、Q502C、Q502M、Q502P、F503A、R504A、R507A、E513G、E513D、E513P、E516A、F518A、S525A、D607A、D607G、D607V、D607L、D607I、D607S、D607T、D607K、D607R、D607H、D607N、D607Q、D607F、D607W、D607C、D607M、D607P、E613A、R636A、F639A、D654A、E678A、Y681A、E693A、H712D、H712E、H712P、R512A、E513V、E513A、E513L、E513T、E513M、Q521Aからなる点変異のグループから選択される１または複数の点変異を有するアミノ酸配列からなる変異体のいずれかである、請求項２に記載のタンパク質セット。
  4. 　前記タンパク質セットが、野生型RpBphP1とRpPpsR2変異体のセットであって、
    当該RpPpsR2変異体が、配列番号３で表されるアミノ酸配列中にQ105T、T133A、L137A、N103A、Q105A、Q105C、Q105H、V107A、T108A、L110A、R113A、L114A、I115A、Q119A、M121A、M121E、R123A、D124A、Y125A、Y125E、W126A、R127A、R129A、E132A、R134A、R136A、Q105V、Q105S、K102A、Q105P、Q105R、L137E、V138A、V138E、F139E、V146Aからなる点変異のグループから選択される１または複数の点変異を有するアミノ酸配列からなる変異体のいずれかである、請求項２に記載のタンパク質セット。
  5. 　前記タンパク質セットが、野生型RpBphP1とRpPpsR2変異体のセットであって、
    当該RpPpsR2変異体が、配列番号３で表されるアミノ酸配列がD1-D1-D2、D3-D1-D2、D1-D2 (del N 77)、D1-D2、D2-D1、D2-D2、D3-D2、D3-D2（L137E）、D4-D2、D1-D2-D1、D1-D2-D2、D1-D2-D4、D2-D1-D2、D2-D3-D4、D4-D1-D2、D2-D3-D4-D1、D2-D3-D4-D2、D2-D3-D4-D3、D2-D3-D4-D5、D1-D2 (del N 88)、D1-D2 (del N 89)、D1-D2 (del N 90)、D1-D2 (del N 91)、D1-D2 (del N 92)、D1-D2 (del N 93)、D1-D2 (del N 94)、D1-D2 (del N 95)、D1-D2 (del N 96)、D1-D2 (del N 97)、D1-D2 (del C 5)、D1-D2 (del C 15)、D1-D2 (del N 93)(del C 5)、D1-D2 (del N 93)(del C 6)、D1-D2 (del N 93)(del C 11)、D1-D2 (del N 93)(del C 12)、D1-D2-D3 (del C 25)、D1-D2-D3 (del C 41)、D1-D2-D3 (del C 49)、D1-D2-D3 (del C 70)、D1-D2-D3 (del C 87)、D1-D2-D3 (del C 96)、D1-D2-D3 (del C 104)、D1-D2 (del N 64)、D2-D3、D1-D2-D3、D2-D2-D3、D2-D3-D1、D2-D3-D3、D3-D2-D3、D4-D2-D3、D1-D1-D2-D3、D1-D2-D3-D1、D1-D2-D3-D2、D1-D2-D3-D3、D1-D2-D3-D4、D2-D1-D2-D3、D2-D2-D3-D4、D2-D3-D4-D4、D3-D1-D2-D3、D3-D2-D3-D4、D1-D2 (del N 15)、D1-D2 (del N 33)、D1-D2 (del N 47)またはD1-D2-D3 (del C 9)のいずれかに改変されたアミノ酸配列からなる変異体である、請求項２に記載のタンパク質セット。
  6. 　前記タンパク質セットが、RpBphP1変異体とRpPpsR2変異体のセットであって、
    当該RpBphP1変異体が、配列番号１または配列番号２で表されるアミノ酸配列中にQ514A、D607E、 R638A、H661A、R696A、E327A、E332A、E337A、D339A、E365A、Q367A、E429A、R490A、D498A、Q502A、Q502G、Q502V、Q502L、Q502I、Q502S、Q502T、Q502E、Q502K、Q502R、Q502H、Q502N、Q502F、Q502Y、Q502W、Q502C、Q502M、Q502P、F503A、R504A、R507A、E513G、E513D、E513P、E516A、F518A、S525A、D607A、D607G、D607V、D607L、D607I、D607S、D607T、D607K、D607R、D607H、D607N、D607Q、D607F、D607W、D607C、D607M、D607P、E613A、R636A、F639A、D654A、E678A、Y681A、E693A、H712D、H712E、H712P、R512A、E513V、E513A、E513L、E513T、E513M、Q521Aからなる点変異のグループから選択される１または複数の点変異を有するアミノ酸配列からなる変異体のいずれかであり、
    当該RpPpsR2変異体が、配列番号３で表されるアミノ酸配列中にQ105T、T133A、L137A、N103A、Q105A、Q105C、Q105H、V107A、T108A、L110A、R113A、L114A、I115A、Q119A、M121A、M121E、R123A、D124A、Y125A、Y125E、W126A、R127A、R129A、E132A、R134A、R136A、Q105V、Q105S、K102A、Q105P、Q105R、L137E、V138A、V138E、F139E、V146Aからなる点変異のグループから選択される１または複数の点変異を有するアミノ酸配列からなる変異体のいずれかである、請求項２に記載のタンパク質セット。
  7. 　前記タンパク質セットが、RpBphP1変異体とRpPpsR2変異体のセットであって、
    当該RpBphP1変異体が、配列番号１または配列番号２で表されるアミノ酸配列中にQ514A、D607E、 R638A、H661A、R696A、E327A、E332A、E337A、D339A、E365A、Q367A、E429A、R490A、D498A、Q502A、Q502G、Q502V、Q502L、Q502I、Q502S、Q502T、Q502E、Q502K、Q502R、Q502H、Q502N、Q502F、Q502Y、Q502W、Q502C、Q502M、Q502P、F503A、R504A、R507A、E513G、E513D、E513P、E516A、F518A、S525A、D607A、D607G、D607V、D607L、D607I、D607S、D607T、D607K、D607R、D607H、D607N、D607Q、D607F、D607W、D607C、D607M、D607P、E613A、R636A、F639A、D654A、E678A、Y681A、E693A、H712D、H712E、H712P、R512A、E513V、E513A、E513L、E513T、E513M、Q521Aからなる点変異のグループから選択される１または複数の点変異を有するアミノ酸配列からなる変異体のいずれかであり、
    当該RpPpsR2変異体が、配列番号３で表されるアミノ酸配列がD1-D1-D2、D3-D1-D2、D1-D2 (del N 77)、D1-D2、D2-D1、D2-D2、D3-D2、D3-D2（L137E）、D4-D2、D1-D2-D1、D1-D2-D2、D1-D2-D4、D2-D1-D2、D2-D3-D4、D4-D1-D2、D2-D3-D4-D1、D2-D3-D4-D2、D2-D3-D4-D3、D2-D3-D4-D5、D1-D2 (del N 88)、D1-D2 (del N 89)、D1-D2 (del N 90)、D1-D2 (del N 91)、D1-D2 (del N 92)、D1-D2 (del N 93)、D1-D2 (del N 94)、D1-D2 (del N 95)、D1-D2 (del N 96)、D1-D2 (del N 97)、D1-D2 (del C 5)、D1-D2 (del C 15)、D1-D2 (del N 93)(del C 5)、D1-D2 (del N 93)(del C 6)、D1-D2 (del N 93)(del C 11)、D1-D2 (del N 93)(del C 12)、D1-D2-D3 (del C 25)、D1-D2-D3 (del C 41)、D1-D2-D3 (del C 49)、D1-D2-D3 (del C 70)、D1-D2-D3 (del C 87)、D1-D2-D3 (del C 96)、D1-D2-D3 (del C 104)、D1-D2 (del N 64)、D2-D3、D1-D2-D3、D2-D2-D3、D2-D3-D1、D2-D3-D3、D3-D2-D3、D4-D2-D3、D1-D1-D2-D3、D1-D2-D3-D1、D1-D2-D3-D2、D1-D2-D3-D3、D1-D2-D3-D4、D2-D1-D2-D3、D2-D2-D3-D4、D2-D3-D4-D4、D3-D1-D2-D3、D3-D2-D3-D4、D1-D2 (del N 15)、D1-D2 (del N 33)、D1-D2 (del N 47)またはD1-D2-D3 (del C 9)のいずれかに改変されたアミノ酸配列からなる変異体である、請求項２に記載のタンパク質セット。
  8. 　RpBphP1変異体であって、配列番号１または配列番号２で表されるアミノ酸配列中に、以下の点変異のいずれか１または複数の変異を有するアミノ酸配列からなる、前記RpBphP1変異体；
    Q514A、D607E、 R638A、H661A、R696A、E327A、E332A、E337A、D339A、E365A、Q367A、E429A、R490A、D498A、Q502A、Q502G、Q502V、Q502L、Q502I、Q502S、Q502T、Q502E、Q502K、Q502R、Q502H、Q502N、Q502F、Q502Y、Q502W、Q502C、Q502M、Q502P、F503A、R504A、R507A、E513G、E513D、E513P、E516A、F518A、S525A、D607A、D607G、D607V、D607L、D607I、D607S、D607T、D607K、D607R、D607H、D607N、D607Q、D607F、D607W、D607C、D607M、D607P、E613A、R636A、F639A、D654A、E678A、Y681A、E693A、H712D、H712E、H712P、R512A、E513V、E513A、E513L、E513T、E513M、Q521A。
  9. 　RpPpsR2変異体であって、配列番号３で表されるアミノ酸配列中に、以下の点変異のいずれか１または複数の変異を有するアミノ酸配列からなる、前記RpPpsR2変異体；
    Q105T、T133A、L137A、N103A、Q105A、Q105C、Q105H、V107A、T108A、L110A、R113A、L114A、I115A、Q119A、M121A 、M121E、R123A、D124A、Y125A、Y125E、W126A、R127A、R129A、E132A、R134A、R136A、Q105V、Q105S、K102A、Q105P、Q105R、L137E、V138A、V138E、F139E、V146A。
  10. 　RpPpsR2変異体であって、配列番号３で表されるアミノ酸配列が、以下のいずれかに改変されたアミノ酸配列からなる変異体である、前記RpPpsR2変異体；
    D1-D1-D2、D3-D1-D2、D1-D2 (del N 77)、D1-D2、D2-D1、D2-D2、D3-D2、D3-D2（L137E）、D4-D2、D1-D2-D1、D1-D2-D2、D1-D2-D4、D2-D1-D2、D2-D3-D4、D4-D1-D2、D2-D3-D4-D1、D2-D3-D4-D2、D2-D3-D4-D3、D2-D3-D4-D5、D1-D2 (del N 88)、D1-D2 (del N 89)、D1-D2 (del N 90)、D1-D2 (del N 91)、D1-D2 (del N 92)、D1-D2 (del N 93)、D1-D2 (del N 94)、D1-D2 (del N 95)、D1-D2 (del N 96)、D1-D2 (del N 97)、D1-D2 (del C 5)、D1-D2 (del C 15)、D1-D2 (del N 93)(del C 5)、D1-D2 (del N 93)(del C 6)、D1-D2 (del N 93)(del C 11)、D1-D2 (del N 93)(del C 12)、D1-D2-D3 (del C 25)、D1-D2-D3 (del C 41)、D1-D2-D3 (del C 49)、D1-D2-D3 (del C 70)、D1-D2-D3 (del C 87)、D1-D2-D3 (del C 96)、D1-D2-D3 (del C 104)、D1-D2 (del N 64)、D2-D3、D1-D2-D3、D2-D2-D3、D2-D3-D1、D2-D3-D3、D3-D2-D3、D4-D2-D3、D1-D1-D2-D3、D1-D2-D3-D1、D1-D2-D3-D2、D1-D2-D3-D3、D1-D2-D3-D4、D2-D1-D2-D3、D2-D2-D3-D4、D2-D3-D4-D4、D3-D1-D2-D3、D3-D2-D3-D4、D1-D2 (del N 15)、D1-D2 (del N 33)、D1-D2 (del N 47)、D1-D2-D3 (del C 9)。
  11. 　請求項８に記載のいずれかのRpBphP1変異体をコードする核酸。
  12. 　請求項９に記載のいずれかのRpPpsR2変異体をコードする核酸。
  13. 　請求項１０に記載のいずれかのRpPpsR2変異体をコードする核酸。

     
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