WO2024014752A1 - 인간 모낭 유래 불멸화 모유두 세포주 및 각질세포 공배양을 통한 모낭유사 구조체 형성 방법 - Google Patents

인간 모낭 유래 불멸화 모유두 세포주 및 각질세포 공배양을 통한 모낭유사 구조체 형성 방법 Download PDF

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박순선
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    • C12N2513/00—3D culture

Definitions

  • the present invention relates to a method of forming a hair follicle-like structure through co-culture of an immortalized human hair follicle-derived dermal papilla cell line and keratinocytes.
  • Hair loss is a disease that poses significant psychological and social negative factors to patients. Recently, in modern society, the number of patients is rapidly increasing due to various factors such as genetic predisposition, an increase in the elderly population, stress, and changes in eating habits. From this, in addition to the existing invasive treatments such as autologous hair transplantation and drug treatment, the demand for overcoming and preventing hair loss is steadily increasing, and related industries are also increasing. In addition to the pharmaceutical/quasi-drug industry, the importance of hair loss materials is also being highlighted in the functional cosmetics and health functional food industries.
  • the current method for verifying the efficacy and safety of hair loss-related materials has several difficulties compared to other functional material verification methods.
  • human application tests recruiting subjects is more difficult than for other diseases, and as a result, the test period and cost are high.
  • animal testing the efficacy is indirectly estimated and proven due to differences in the physiological characteristics of the experimental model and the human body, and it is difficult to conduct animal testing due to the recent rise in animal ethics around the world.
  • human-derived cell testing it is difficult to secure consistent results due to differences between cell donors, and the gap between results from actual human application testing is the largest.
  • the purpose of the present invention is to provide a method of forming a hair follicle-like structure including the step of three-dimensional co-culturing immortalized dermal papilla cells and keratinocytes.
  • the present invention includes the steps of (1) separating dermal papilla cells from hair follicles; (2) immortalizing the isolated dermal papilla cells; and (3) providing a method of forming a hair follicle-like structure comprising the step of three-dimensional co-culturing the immortalized dermal papilla cells and keratinocytes.
  • the present invention relates to a method of forming a hair follicle-like structure through co-culture of an immortalized human hair follicle-derived dermal papilla cell line and keratinocytes, and specifically, SV40T, which inactivates a tumor suppressor gene in human hair follicle-derived dermal papilla cells, and a telomere elongation enzyme promoting gene.
  • the present invention can be applied to various fields such as animal replacement testing and efficacy evaluation of hair loss prevention/hair follicle growth promotion materials, and through immortalized dermal papilla cells, high consistency of results can be secured compared to existing technologies, and stable hair follicle-derived cells By enabling supply, it is expected that the high entry barrier to cell-based efficacy evaluation of hair loss materials can be resolved.
  • Figure 1 shows a schematic diagram of human hair follicle-derived dermal papilla cells and outer root sheath cell primary culture.
  • Figure 2 shows the process and results of dermal papilla cell immortalization.
  • Figure 3 shows a schematic diagram confirming the comparison of spheroid growth patterns between primary cultured dermal papilla cells and immortalized dermal papilla cells.
  • Figure 4 shows a schematic diagram confirming the formation of a hair follicle-like structure using primary cultured dermal papilla cells and immortalized dermal papilla cell spheroids.
  • Figure 5 shows a schematic diagram of confirming the formation of a hair follicle-like structure using only immortalized cells.
  • Figure 6 shows a schematic diagram confirming the cell arrangement shape of the formed hair follicle-like structure.
  • Figure 7 shows the results of comparing the growth patterns of primary cultured dermal papilla cell spheroids and SV40T-hTERT introduced dermal papilla cell line SV40T-hTERT DPC spheroids.
  • Figure 8 shows the results of spheroid size change according to culture time.
  • spheroids with a diameter similar to the size of the previously known dermal papilla in hair follicles were formed under the conditions of initial cell number ⁇ 1K and culture time ⁇ 72 hr (A) .
  • A initial cell number
  • B spheroids using primary culture cells
  • Figure 9 shows a hair follicle-like structure using co-culture of primary cultured dermal papilla cells (Primary DPC) or immortalized dermal papilla cell line (SV40T-hTERT DPC) spheroids and human hair follicle outer root sheath cells ORSC.
  • Primary DPC primary cultured dermal papilla cells
  • SV40T-hTERT DPC immortalized dermal papilla cell line
  • ORSC human hair follicle outer root sheath cells
  • results of co-culture with primary DPC or SV40T-hTERT DPC and human hair follicle-derived outer root sheath cells over time (A), hair follicle-like structures according to the start date of co-culture of immortalized dermal papilla cell line SV40T-hTERT DPC and outer root sheath cells (ORSC) Formation results (B), co-culture results of immortalized dermal papilla cell line SV40T-hTERT DPC and outer root sheath cells according to outer root sheath cell number (C).
  • Figure 10 shows the results of hair follicle-like structure formation by medium condition over time.
  • Immortalized dermal papilla cell line SV40T-hTERT DPC Shows the results of co-culturing 1,000 (A) and 3,000 (B) keratinocyte lines on 1,000 cell number spheroids.
  • Figure 11 shows the results of confirming the cell arrangement status by quantity of keratin cell line in the hair follicle-like structure using only immortalized cells.
  • Figure 12 shows the results of confirming cell biomarkers within the hair follicle-like structure by frozen sectioning the hair follicle-like structure and performing immunohistochemical staining.
  • the present invention includes the steps of (1) separating dermal papilla cells from hair follicles; (2) immortalizing the isolated dermal papilla cells; and (3) providing a method of forming a hair follicle-like structure comprising the step of three-dimensional co-culturing the immortalized dermal papilla cells and keratinocytes.
  • the immortalized dermal papilla cells may be dermal papilla cells (SV40T-hTERT DPC) expressing simian virus 40T (SV40T) antigen and telomerase reverse transcriptase (hTERT), but are not limited thereto. .
  • SV40T-hTERT DPC dermal papilla cells
  • SV40T simian virus 40T
  • hTERT telomerase reverse transcriptase
  • the keratinocytes may be hair follicle-derived outer root sheath cells (ORSC) or the skin keratinocyte cell line Ker-CT, but are not limited thereto.
  • ORSC hair follicle-derived outer root sheath cells
  • Ker-CT skin keratinocyte cell line
  • the cell ratio of the immortalized dermal papilla cells and keratinocytes may be 1:1 to 1:4, but is not limited thereto.
  • step (3) may be performed by adding the keratinocytes immediately after culturing the immortalized dermal papilla cells to within 72 hours of culturing them, but is not limited thereto.
  • DPC Dermal papilla cells
  • penicillin 100U/ml
  • streptomycin 100ug/ml
  • 20% heat-inactivated serum were added to a culture dish coated with collagen type 1, DMEM (Hyclone) with 5% CO 2 and After culturing at 37°C, when the hair shaft settles on the bottom of the culture dish, keratinocyte-specific culture medium containing penicillin (100U/ml), streptomycin (100ug/ml), and EpiLifeTM Defined Growth Supplement (Gibco) The cells were cultured in EpiLife (Gibco) medium under conditions of 5% CO 2 and 37°C ( Figure 1).
  • the pGRN145 plasmid containing the human telomere elongation enzyme reverse transcriptase hTERT gene and Hygrmycine was transfected into the obtained dermal papilla cells expressing the SV40T antigen, and then cultured in Hygrmycine-containing medium to select surviving cells, followed by immunoassay and reverse transcription polymerase.
  • Immortalized dermal papilla cell line SV40T-hTERT DPC was obtained by confirming cells expressing SV40T antigen and hTERT through chain reaction ( Figure 2).
  • Immortalized human skin keratinocyte cell line Ker-CT was purchased from ATCC and cultured in collagen type 1 coated culture medium with Lonza's KGM-GoldTM BulletKitTM under conditions of 5% CO 2 and 37°C.
  • the immortalized dermal papilla cell line SV40T-hTERT DPC and primary cultured dermal papilla cells were plated on a U bottom low attachment 96 well plate. Inject 500, 1000, 3000 cells/well, primary cultured dermal papilla cells (Primary DPC) at 3,000 cells/well and culture for more than 16 hours in 5% CO 2 and 37°C in DMEM 100 ⁇ l/well with 10% heat-inactivated serum. This formed a spheroid. Afterwards, the diameter of the spheroid was measured and observed after taking pictures under a microscope every 24 hours ( Figure 3).
  • spheroids To form spheroids, primary cultured dermal papilla cells plated on a culture dish and the immortalized dermal papilla cell line SV40T-hTERT DPC were removed with 0.25% trypsin/10mM EDTA and then placed in a U bottom low attachment 96 well plate at 1,000 cells/well. The cells were cultured at 5% CO 2 and 37°C in 100 ⁇ l/well of DMEM supplemented with 10% heat-inactivated fetal bovine serum.
  • the outer root sheath cells plated on a culture dish were washed with 0.25% trypsin/10mM EDTA, and then incubated with 30,000 mL of William's E medium containing 100U/ml of penicillin/streptomycin, 10ng/ml of hydrocortisone, 10ug/ml of insulin, and 2mM of L-glutamin. Diluted to cells/ml, 100 ⁇ l/well was added to the low attachment 96 well plate described above, co-cultured under conditions of 5% CO 2 and 37°C, and observed under a microscope over time.
  • the number of immortalized dermal papilla cells SV40T-hTERT DPC
  • the injection time of keratinocytes was adjusted from immediately after injection of dermal papilla cells to 72 hours after incubation after injection of dermal papilla cells.
  • the experiment was conducted by adjusting the number of hair follicle-derived keratinocytes from the same number to three times that of the immortalized cells ( Figure 4).
  • SV40T-hTERT DPC After plate-cultured SV40T-hTERT DPC was removed with 0.25% trypsin/10mM EDTA, 1,000 cells/well were added to a U bottom low attachment 96 well plate at 5% CO 2 and 37°C, and 100 ⁇ l/well of DMEM supplemented with 10% heat-inactivated serum. After culturing for 24 hours in well conditions, spheroids were formed.
  • the immortalized keratinocyte cell line Ker-CT plated on a culture dish was washed with 0.25% trypsin/10mM EDTA, and then cultured in DMEM containing 10% heat-inactivated fetal bovine serum, 100U/ml of penicillin/streptomycin, and hydrocortisone, which is a medium for dermal papilla cell growth.
  • DMEM fetal bovine serum
  • penicillin/streptomycin fetal bovine serum
  • hydrocortisone hydrocortisone
  • the medium of the immortalized dermal papilla cell line SV40T-hTERT DPC plated on a culture dish was removed, and the cells were treated with phosphate-buffered saline (PBS) containing 1 ⁇ M CM-DiI, a cell tracker, for 30 minutes. After washing with 0.25% trypsin/10mM EDTA, 1,000 cells/well were added to a U bottom low attachment 96 well plate and incubated for 24 hours in 5% CO 2 and 37°C in DMEM 100 ⁇ l/well with 10% heat-inactivated serum. Spheroids were formed by culturing.
  • PBS phosphate-buffered saline
  • the keratinocytes plated on a culture dish were removed with 0.25% trypsin/10mM EDTA, and then 30,000 cells were placed in William's E medium containing 100U/ml of penicillin/streptomycin, 10ng/ml of hydrocortisone, 10ug/ml of insulin, and 2mM of L-glutamin. /ml and added to the low attachment 96 well plate described above at 100 ⁇ l/well, co-cultured under conditions of 5% CO 2 and 37°C, and observed with an optical microscope and fluorescence microscope every 24 hours (FIG. 6).
  • Example 1 Spheroid growth pattern between dermal papilla cells and immortalized dermal papilla cells
  • the size of the dermal papilla within a human hair follicle is approximately 100 to 250 ⁇ m. From this, in order to form dermal papilla cell spheroids with a diameter of approximately 250um, 3,000 primary cultured dermal papilla cells (primary DPC) were injected per well of a 96-well U bottom plate. As a result, spheroids with a diameter of approximately 250um were confirmed. , it was confirmed that the size of the spheroids slightly decreased over time.
  • the spheroid growth pattern after injection of 3,000 SV40T-hTERT DPCs per well of a 96-well U bottom plate confirmed an increase in spheroid size after a certain period of time. It was confirmed that the ratio of cells in the spheroids was higher in density compared to primary cultured dermal papilla cells ( Figures 7 and 8).
  • the cell number and culture time must be adjusted to produce a form similar to the primary cultured dermal papilla cell spheroid, and in the present invention, the immortalized dermal papilla cells
  • the growth pattern of immortalized dermal papilla cells was similar to the growth pattern of dermal papilla cells based on 1/3 times the number of cells compared to the existing primary cultured dermal papilla cells and within 72 hours of spheroid formation time (Figure 8).
  • Example 2 Dermal papilla cells and immortalization papillae cell spheroid used Similar to hair follicles Confirm structure formation
  • outer root sheath cells which are hair follicle-derived keratinocytes, were injected into the U bottom plate where spheroids were formed.
  • a hair follicle-like structure with a structure similar to a hair follicle was obtained regardless of primary cultured dermal papilla cells and SV40T-hTERT DPC cells.
  • the formation of was confirmed ( Figure 9).
  • As a result of testing by adjusting the administration time of outer root sheath cells it was confirmed that the formation of hair follicle-like structures was smooth when the outer root sheath cells were injected within 24 hours after injection of dermal papilla cells to form spheroids (Figure 9B).
  • the hair follicle-like structures were frozen sectioned and immunohistochemical staining was performed to identify cellular biomarkers within the hair follicle-like structures.
  • immunohistochemical staining the expression of Vimentin, a dermal papilla cell line-specific biomarker, and keratin 14, a keratinocyte cell line-specific biomarker, was confirmed. From this, it was confirmed that cells were distributed inside the hair follicle-like structure in a form similar to human hair follicles (FIG. 12).

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Abstract

본 발명은 인간 모낭 유래 불멸화 모유두 세포주 및 각질세포 공배양을 통한 모낭유사 구조체 형성 방법에 관한 것으로, 상세하게는, 인간 모낭 유래 모유두 세포에 암억제 유전자를 불활성화하는 SV40T 과 텔로미어 신장 효소 촉진 유전자인 hTERT 유전자를 강제 발현시켜 불멸화시킨 모유두 세포주(SV40T-hTERT DPC)와 각질세포를 3차원 공배양한 결과, 초대배양(primary cultrue) 모낭 유래 세포 조합의 모낭 유사체와 유사한 형태로 각질층부가 생장하는 모낭 유사 구조가 형성됨을 확인하였다. 이에, 본 발명은 동물대체시험, 탈모예방/모낭생장촉진 소재의 효능평가 등 다양한 분야에 적용 가능하고, 불멸화된 모유두세포를 통해, 기존 기술 대비 높은 결과 일관성을 확보할 수 있고, 안정적인 모낭 유래 세포 공급을 가능하게 하여, 탈모소재의 세포기반 효능평가에 대한 높은 진입 장벽을 해소할 수 있을 것으로 기대된다.

Description

인간 모낭 유래 불멸화 모유두 세포주 및 각질세포 공배양을 통한 모낭유사 구조체 형성 방법
본 발명은 인간 모낭 유래 불멸화 모유두 세포주 및 각질세포 공배양을 통한 모낭유사 구조체 형성 방법에 관한 것이다.
탈모는 환자에게 심리적, 사회적으로 상당히 부정적인 요인을 주는 질환으로, 최근 현대 사회에서는 유전적 소인 뿐 아니라, 노년인구 증가, 스트레스, 식습관 변화 등의 다양한 요인으로 인해 환자수가 급증하는 추세이다. 이로부터, 기존의 침습적 치료법인 자가모발이식과 약물적 치료법 이외에도 탈모를 극복하고 예방하기 위한 수요가 꾸준히 늘고 있으며, 관련 산업 역시 증가하고 있음. 또한 의약품/의약외품 분야 외에, 기능성화장품, 건강기능식품 산업군에서도 탈모 소재의 중요성이 부각되고 있다.
이러한 수요 및 산업군의 성장에도 불구하고, 현재 탈모 관련 소재의 효능 및 안전성을 검증하기 위한 방법은 여타의 기능성 소재 검증 방법에 비해 여러 애로사항이 존재한다. 인체적용시험의 경우 피험자 모집이 다른 질환에 비하여 어려우며, 이로 인하여 시험 소요 기간 및 비용이 높다. 동물 시험의 경우 실험모델과 인체의 생리학적 특성 차이로 인하여 그 효능을 간접적으로 추정 증명하는 수준이며, 최근 전 세계적으로 동물윤리가 부각되고 있어 동물시험 진행이 어렵다. 인체 유래 세포 시험의 경우에는 세포 공여자 간의 차이로 인하여 일관된 결과를 확보하기 어렵고, 실제 인체적용시험과의 결과 괴리가 가장 크다.
이러한 효능 검증의 애로사항으로 발생하는 다양한 문제점(인체적용시험 결과와 세포시험 결과의 불일치, 높은 효능 검증 비용과 소요 시간 등)은 탈모 관련 기능성 소재 및 제품의 신뢰도를 저해하며, 기능성 제품 산업군의 성장을 막는 진입장벽으로 작용한다. 따라서 동물윤리를 준수하며, 인체적용시험 결과와 유사하며, 결과의 일관성과 안정성이 보장된 새로운 세포 기반 효능평가 시스템의 필요성이 대두되고 있다.
최근 선행 연구에서, 인체 모낭 유래 세포를 이용하여 체내 모낭구조와 유사한 세포 구조체의 형성법 및 효능평가에 대한 적용 가능성이 발표된 바 있으나, 해당 연구에서 사용된 세포는 초대배양 세포로, 공여자 간의 세포 차이, 세포 계대수에 따른 급격한 특성 변화 등으로 일관된 결과를 얻기 힘들다는 문제점이 여전히 존재한다. 또한, 제한적인 모낭 공여로 인해 모낭 유래 초대 세포를 안정적으로 확보하기 어려운 단점이 있다.
본 발명의 목적은 불멸화된 모유두세포 및 각질세포를 3차원 공배양하는 단계를 포함하는 모낭유사 구조체 형성 방법을 제공하는데 있다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 (1) 모낭으로부터 모유두세포를 분리하는 단계; (2) 상기 분리된 모유두세포를 불멸화시키는 단계; 및 (3) 상기 불멸화된 모유두세포 및 각질세포를 3차원 공배양하는 단계를 포함하는 모낭유사 구조체 형성 방법을 제공한다.
본 발명은 인간 모낭 유래 불멸화 모유두 세포주 및 각질세포 공배양을 통한 모낭유사 구조체 형성 방법에 관한 것으로, 상세하게는, 인간 모낭 유래 모유두 세포에 암억제 유전자를 불활성화하는 SV40T 과 텔로미어 신장 효소 촉진 유전자인 hTERT 유전자를 강제 발현시켜 불멸화시킨 모유두 세포주(SV40T-hTERT DPC)와 각질세포를 3차원 공배양한 결과, 초대배양(primary cultrue) 모낭 유래 세포 조합의 모낭 유사체와 유사한 형태로 각질층부가 생장하는 모낭 유사 구조가 형성됨을 확인하였다. 이에, 본 발명은 동물대체시험, 탈모예방/모낭생장촉진 소재의 효능평가 등 다양한 분야에 적용 가능하고, 불멸화된 모유두세포를 통해, 기존 기술 대비 높은 결과 일관성을 확보할 수 있고, 안정적인 모낭 유래 세포 공급을 가능하게 하여, 탈모소재의 세포기반 효능평가에 대한 높은 진입 장벽을 해소할 수 있을 것으로 기대된다.
도 1은 인체 모낭 유래 모유두세포 및 외모근초세포 초대배양 모식도를 나타낸다.
도 2는 모유두 세포 불멸화 과정 및 결과를 나타낸다.
도 3은 초대배양 모유두세포와 불멸화 모유두 세포 간의 스페로이드 생장 패턴 비교 확인 모식도를 나타낸다.
도 4는 초대배양 모유두세포와 불멸화 모유두 세포 스페로이드를 이용한 모낭유사 구조체 형성 확인 모식도를 나타낸다.
도 5는 불멸화 세포만을 이용한 모낭유사 구조체 형성 여부 확인 모식도를 나타낸다.
도 6은 형성된 모낭 유사 구조체의 세포 배열 형태 확인 모식도를 나타낸다.
도 7은 초대배양 모유두세포 스페로이드와 SV40T-hTERT 도입 모유두 세포주 SV40T-hTERT DPC 스페로이드의 생장 패턴 비교 결과를 나타낸다.
도 8은 배양 시간에 따른 스페로이드 크기 변화 결과를 나타낸다. SV40T-hTERT DPC 스페로이드의 초기 세포수 및 배양 시간에 따른 직경의 경우, 초기 세포수≤1K, 배양 시간≤72hr 조건에서 기존에 알려진 모낭 내 모유두 크기와 비슷한 직경의 스페로이드를 형성하였고(A), 72시간 배양한 스페로이드의 관찰 결과, 초대배양 세포이용 스페로이드 대비 SV40T-hTERT DPC 이용 스페로이드가 스페로이드 내부 세포 배치가 더욱 조밀하고, 초기 세포수가 적더라도 72hr 배양 시 직경은 비슷한 규모로 확인되었다(B 내지 F).
도 9는 초대배양 모유두세포(Primary DPC) 혹은 불멸화 모유두 세포주(SV40T-hTERT DPC) 스페로이드와 인간모낭 외모근초세포 ORSC의 공배양을 이용한 모낭유사구조를 나타낸다. 시간에 따른 Primary DPC 혹은 SV40T-hTERT DPC와 인간 모낭 유래 외모근초세포와의 공배양 결과(A), 불멸화 모유두 세포주 SV40T-hTERT DPC와 외모근초세포(ORSC)의 공배양 시작 일자에 따른 모낭유사 구조체 형성 결과 (B), 외모근초세포 세포수에 따른 불멸화 모유두 세포주 SV40T-hTERT DPC와 외모근초세포 공배양 결과(C).
도 10은 시간에 따른 배지 조건별/ 모낭유사 구조체 형성 결과를 나타낸다. 불멸화 모유두 세포주 SV40T-hTERT DPC 1,000 세포수의 스페로이드에, 1,000(A), 3000(B)개의 각질세포주를 공배양한 결과를 나타낸다.
도 11은 불멸화 세포만을 이용한 모낭유사 구조체의 각질세포주 수량별 세포 배열 상태 확인 결과를 나타낸다.
도 12는 모낭유사 구조체를 동결 절편하여 면역조직염색을 실시하여 모낭유사 구조체 내 세포 바이오마커를 확인한 결과를 나타낸다.
본 발명은 (1) 모낭으로부터 모유두세포를 분리하는 단계; (2) 상기 분리된 모유두세포를 불멸화시키는 단계; 및 (3) 상기 불멸화된 모유두세포 및 각질세포를 3차원 공배양하는 단계를 포함하는 모낭유사 구조체 형성 방법을 제공한다.
바람직하게는, 상기 불멸화된 모유두세포는 simian virus 40T(SV40T) 항원 및 텔로머라제 역전사효소(telomerase reverse transcriptase; hTERT)를 발현하는 모유두세포(SV40T-hTERT DPC)될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
바람직하게는, 상기 각질세포는 모낭 유래 외모근초세포(out root sheath cell; ORSC) 또는 피부각질세포주 Ker-CT일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
바람직하게는, 상기 (3) 단계에서 상기 불멸화된 모유두세포 및 각질세포의 세포비는 1 : 1 내지 1 : 4일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
바람직하게는, 상기 (3) 단계는 상기 불멸화된 모유두세포 배양 직후 내지 배양 72시간 이내에, 상기 각질세포를 첨가하여 3차원 공배양할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.
<실험예>
하기의 실험예들은 본 발명에 따른 각각의 실시예에 공통적으로 적용되는 실험예를 제공하기 위한 것이다.
1. 인체 모낭 유래 세포 배양 및 모유두세포 불멸화
사람 모낭조직은 경북대학교 모발이식센터에서 환자의 동의하에 자가모발이식술 후 잔여 모발을 제공받아 실험을 진행하였다.
모발 조직에서 모구를 절단하여 분리한 모유두를 페니실린 (100U/ml), 스트렙토마이신 (100ug/ml)과 20% 열비활성 혈청을 첨가한 DMEM (Hyclone) 에서 배양하여 모유두세포(DPC)를 분리하였다. 배양배지에 안착한 모유두 조직으로부터 세포가 자라면 0.25% trypsin/10mM EDTA를 이용하며 세포를 모으고, 5% CO2와 37℃의 조건아래 10% 열비활성화 혈청이 첨가된 DMEM에서 유지하였다.
모발 조직에서 모간을 절단한 뒤 collagen type 1 이 코팅된 배양접시에 페니실린 (100U/ml), 스트렙토마이신 (100ug/ml)과 20% 열비활성 혈청을 첨가한 DMEM (Hyclone) 에 5% CO2와 37℃의 조건에서 배양한 뒤, 모간이 배양접시 바닥에 안착했을 때, 페니실린 (100U/ml), 스트렙토마이신 (100ug/ml), EpiLife™ Defined Growth Supplement (Gibco) 가 포함된 각질세포 전용 배양배지인 EpiLife(Gibco) 배지에 5% CO2와 37℃의 조건으로 배양하였다(도 1).
모유두 세포의 불멸화 방법은 본 연구진의 이전 선행연구에 기술되었는데( BMB Reports. 44:8 512-516. 2011), 간략하게는, SV40T 항원과 Neomycine 저항 유전자를 포함하는 pSV3neo plasmid를 형질주입한 뒤, Neomycine 함유 배지에서 배양하여 생존한 세포를 선별한 뒤, 면역분석법을 통해 SV40T 항원 발현을 확인하여 SV40T 항원 발현 모유두 세포를 확보하였다. 확보한 SV40T 항원 발현 모유두 세포에, 인간 텔로미어 신장효소 역전사 효소 hTERT 유전자와 Hygromycine을 포함하는 pGRN145 plasmid를 형질주입한 뒤, Hygromycine 포함 배지에서 배양하여 생존한 세포를 선별한 뒤, 면역분석법과 역전사 중합효소 연쇄반응으로 SV40T 항원과 hTERT를 발현하는 세포를 확인하여 불멸화된 모유두 세포주 SV40T-hTERT DPC를 확보하였다(도 2).
불멸화된 인간 피부각질세포주 Ker-CT를 ATCC에서 구매하여, collagen type 1 코팅된 배양 배지에서 5% CO2와 37℃의 조건 아래 Lonza사의 KGM-Gold™ BulletKit™ 으로 배양하였다.
2. 모유두세포와 불멸화 모유두 세포 간의 스페로이드 생장 패턴 비교확인
본 발명자들의 선행 연구에서, 초대 배양한 모유두 세포와 불멸화한 모유두 세포 간의 유전자 발현 및 생장 특성을 확인하여 유사성을 검증한 바 있다. 해당 선행연구에서 주목할 만한 결과로, 초대 배양 모유두 세포와 불멸화 모유두 세포 간의 생장 속도가 유의한 차이를 보임에 따라, 모낭세포 스페로이드 형성 시 초기 세포수에 따른 스페로이드 크기 변화를 측정하였다.
배양접시에 평판 배양한 불멸화 모유두 세포주 SV40T-hTERT DPC와 초대 배양 모유두 세포(Primary DPC)를 0.25% trypsin/10mM EDTA로 걷은 뒤, U bottom low attachment 96 well plate 에 불멸화 모유두 세포주(SV40T-hTERT DPC) 500, 1000, 3000 세포/well, 초대배양 모유두 세포(Primary DPC) 3,000 세포/well로 투입하여 5% CO2와 37℃, 10% 열비활성화 혈청이 첨가된 DMEM 100μl/well 조건에서 16시간 이상 배양하여 스페로이드(spheroid)를 형성하였다. 이후 24시간마다 현미경으로 촬영 후 스페로이드의 직경을 측정하여 관찰하였다(도 3).
3. 모유두세포와 불멸화 모유두 세포 스페로이드를 이용한 모낭유사 구조체 형성 확인
스페로이드를 형성하기 위하여, 배양접시에 평판 배양한 초대배양 모유두세포와 불멸화 모유두 세포주 SV40T-hTERT DPC 를 0.25% trypsin/10mM EDTA로 걷은 뒤, U bottom low attachment 96 well plate 에 1,000 세포/well로 투입하여 5% CO2와 37℃, 10% 열비활성화 우태아혈청이 첨가된 DMEM 100μl/well 조건에서 배양하였다.
이후 배양접시에 평판 배양한 외모근초세포를 0.25% trypsin/10mM EDTA로 걷은 뒤, penicillin/streptomycin 100U/ml, hydrocortisone 10ng/ml, insulin 10ug/ml, L-glutamin 2mM 이 포함된 William's E 배지에 30,000 세포/ml 로 희석하여 상기 기술한 low attachment 96 well plate 에 100μl/ well 씩 추가한 뒤 5% CO2와 37℃의 조건아래 공배양하며 현미경 하에서 시간별로 관찰하였다.
세포 조합에 따른 모낭 유사구조 형성 정도의 비교를 위해서, 스페로이드 형성 시, 불멸화 모유두 세포주 SV40T-hTERT DPC의 수를 조절하여 스페로이드당 불멸화 모유두 세포수를 최소 300개에서 최대 1000개로 조절하였고, 모유두 세포-각질세포 공배양 시작 시간에 따른 모낭유사구조 형성 정도의 비교를 위해 각질세포의 주입 시기를 모유두세포 주입 직후로부터 모유두세포 주입 후 72시간 배양 후까지 조절하였다. 또한, 모낭 유래 각질세포의 수를 불멸화 세포 대비 동수에서 3배수로 조절하여 실험을 진행하였다(도 4).
4. 불멸화 세포만를 이용한 모낭유사 구조체 형성 여부 확인
평판 배양한 SV40T-hTERT DPC를 0.25% trypsin/10mM EDTA로 걷은 뒤, U bottom low attachment 96 well plate 에 1,000 세포/well로 투입하여 5% CO2와 37℃, 10% 열비활성화 혈청 첨가 DMEM 100μl/well 조건에서 24시간 배양, 스페로이드를 형성하였다.
이후 배양접시에 평판 배양한 불멸화 각질세포주 Ker-CT를 0.25% trypsin/10mM EDTA로 걷은 뒤, 모유두세포 생장용 배지인 10% 열비활성화 우태아혈청이 함유된 DMEM, penicillin/streptomycin 100U/ml, hydrocortisone 10ng/ml, insulin 10ug/ml, L-glutamin 2mM 이 포함된 조직배양용 배지인 William's E, 각질세포주 생장용 배지인 KGM Gold Medium Bulletkit 각각의 조건하에 30,000 세포/ml 로 희석하여 상기 기술한 low attachment 96 well plate 에 100μl/ well 씩 추가한 뒤 5% CO2와 37℃의 조건아래 공배양하며 24시간마다 관찰하였다(도 5).
5. 형성된 모낭 구조체의 세포 배열 형태 확인
배양접시에 평판 배양한 불멸화 모유두 세포주 SV40T-hTERT DPC의 배지를 제거하고, Cell tracker 인 CM-DiI 1μM 가 포함된 인산완충생리식염수(PBS)를 30분간 처리하였다. 이후 0.25% trypsin/10mM EDTA로 걷은 뒤, U bottom low attachment 96 well plate 에 1,000 세포/well로 투입하여 5% CO2와 37℃, 10% 열비활성화 혈청이 첨가된 DMEM 100μl/well 조건에서 24시간 배양하여 스페로이드를 형성하였다.
이후 배양접시에 평판 배양한 각질세포를 0.25% trypsin/10mM EDTA로 걷은 뒤, penicillin/streptomycin 100U/ml, hydrocortisone 10ng/ml, insulin 10ug/ml, L-glutamin 2mM 이 포함된 William's E 배지에 30,000 세포/ml 로 희석하여 상기 기술한 low attachment 96 well plate 에 100μl/ well 씩 추가한 뒤 5% CO2와 37℃의 조건아래 공배양하며 24시간마다 광학현미경 및 형광현미경으로 관찰하였다(도 6).
<실시예 1> 모유두세포와 불멸화 모유두 세포 간의 스페로이드 생장 패턴
인체 모낭 내 모유두의 크기는 약 100~250um의 크기를 가짐이 알려진 바 있다. 이로부터 약 250um 내외 직경의 모유두 세포 스페로이드를 형성하기 위하여, 96well U bottom Plate 1 well 당 3,000 개의 초대배양한 모유두 세포(primary DPC) 를 주입한 결과 250um 내외의 직경을 가지는 스페로이드를 확인할 수 있었고, 시간의 경과에 따른 스페로이드의 크기는 약간의 감소함을 확인하였다. 96well U bottom Plate 1 well 당 3,000 개의 SV40T-hTERT DPC 주입 후 스페로이드 생장 패턴은 Primary DPC 와 달리, 일정 시간 이후 스페로이드 크기의 증가를 확인하였다. 스페로이드 내 세포의 비율은 초대배양 모유두 세포 대비 그 밀도가 높음을 확인하였다(도 7 및 도 8).
따라서 모낭유사 구조체 제조를 위해 불멸화 모유두 세포를 사용하여 스페로이드를 형성할 때, 초대배양 모유두 세포 스페로이드와 유사한 형태를 제조하기 위해서는 세포수와 배양 시간을 조절해야 하며, 본 발명에서는 불멸화 모유두세포의 경우 기존 초대배양 모유두세포 대비 1/3배의 세포수, 스페로이드 형성 시간 72시간 내의 기준에서 불멸화 모유두세포의 생장패턴이 모유두세포 생장패턴과 유사함을 확인하였다(도 8).
< 실시예 2> 모유두세포와 불멸화 모유두 세포 스페로이드를 이용한 모낭유사 구조체 형성 확인
모낭유사 구조체를 형성하기 위하여, 모낭 유래 각질세포인 외모근초세포를 스페로이드가 형성된 U bottom plate에 주입한 결과, 초대 배양한 모유두세포와 SV40T-hTERT DPC 세포 구분없이 모낭과 유사한 구조의 모낭유사 구조체의 형성을 확인할 수 있었다(도 9). 외모근초세포의 투여 시기를 조절하여 시험한 결과, 스페로이드 형성을 위해 모유두 세포를 주입 후 24시간 내에 외모근초세포를 주입하였을 때 모낭유사 구조체의 형성이 원활함을 확인하였다(도 9B). 모유두세포 및 외모근초세포의 주입량을 조절하여 시험한 결과, 초대배양 모유두 세포의 경우 동수의 외모근초세포, SV40T-hTERT DPC의 경우 모유두세포 대비 3배수의 외모근초세포 조건에서 모낭유사 구조체의 생장이 두드러졌다. 위로부터 형성된 스페로이드와 각질세포 간 일정 비율을 유지하였을 때 모낭유사 구조체의 생장이 두드러짐을 확인하였다. 모낭 구조를 형성하는 데 모유두 세포와 외모근초세포의 세포비는 1:3~1:4 정도가 최적임을 확인할 수 있었다(도 9C).
< 실시예 3> 불멸화 세포만을 이용한 모낭유사 구조체 형성 여부 및 세포 배열 상태 확인
전체 불멸화 세포 모낭유사 구조체를 형성하기 위하여, 인간 신생포피세포를 불멸화한 세포주 Ker-CT를 이용하여 모낭유사구조 형성 시험을 진행한 결과, 외모근초세포 이용 모낭유사 구조체와 유사한 형태의 모낭유사구조 세포체의 형성을 확인하였다. 세포수 1,000개의 SV40T-hTERT DPC 스페로이드에, 1,000개의 각질세포주를 공배양한 결과와 3,000개의 각질세포주를 공배양한 결과, 모두 모낭유사 세포 구조를 형성함을 확인할 수 있었다(도 10 및 도 11). 3가지 배지 조건을 비교하였을 때, 다른 배지조건에 비해 조직배양용 배지인 William’s E 배지 조건에서 모낭유사구조가 가장 길게 뻗어남을 확인할 수 있었다(도 10). 각질세포주 Ker-CT 의 경우 동수의 모낭 외모근초세포 주입 시 형성되지 않은 1,000개 세포수 주입 시에도 모낭유사구조 형태를 형성함을 확인할 수 있었다(도 9C, 도 10). 위 결과로부터 모낭유사구조 생성이 확인된 조직배양용 배지에 1,000개 세포수의 불멸화 모유두세포스페로이드와 3,000개 세포수의 각질세포주 조합으로 조직배양용 배지인 William’s E 배지 조건 하에서 공배양한 결과 가장 모낭과 유사한 모낭 구조체의 형성을 확인할 수 있었다(도 10B 및 도 11).
불멸화 모유두 세포에 세포 표지자를 부착하여 형성된 모낭유사 구조체를 형광 관찰하여 체내 모낭 모구부 내에 위치한 모유두와 유사한 형태의 세포 배열 구조를 가짐을 확인하였다. 세포 표지자 부착 시험 결과, 세포 구조체의 모유두 세포주로 이루어진 스페로이드와 각질 세포주가 모낭과 유사한 구조를 형성함을 확인할 수 있었다(도 11).
또한, 모낭유사 구조체를 동결 절편하여 면역조직염색을 실시하여 모낭유사 구조체 내 세포 바이오마커를 확인하였다. 면역조직염색 결과, 모유두 세포주 특이적 바이오마커인 Vimentin과 각질세포주 특이적 바이오마커인 keratin 14의 발현을 확인하였다. 이로부터 모낭유사 구조체 내부는 인체 모낭과 유사한 형태로 세포가 분포함을 확인할 수 있었다(도 12).
이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시예일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

Claims (5)

  1. (1) 모낭으로부터 모유두세포를 분리하는 단계;
    (2) 상기 분리된 모유두세포를 불멸화시키는 단계; 및
    (3) 상기 불멸화된 모유두세포 및 각질세포를 3차원 공배양하는 단계를 포함하는 모낭유사 구조체 형성 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 불멸화된 모유두세포는 simian virus 40T(SV40T) 항원 및 텔로머라제 역전사효소(telomerase reverse transcriptase; hTERT)를 발현하는 모유두세포인 것을 특징으로 하는 모낭유사 구조체 형성 방법.
  3. 제1항에 있어서, 상기 각질세포는 모낭 유래 외모근초세포(out root sheath cell; ORSC) 또는 피부각질세포주 Ker-CT인 것을 특징으로 하는 모낭유사 구조체 형성 방법.
  4. 제1항에 있어서, 상기 (3) 단계에서 상기 불멸화된 모유두세포 및 각질세포의 세포비는 1 : 1 내지 1 : 4인 것을 특징으로 하는 모낭유사 구조체 형성 방법.
  5. 제1항에 있어서, 상기 (3) 단계는 상기 불멸화된 모유두세포 배양 직후 내지 배양 72시간 이내에, 상기 각질세포를 첨가하여 3차원 공배양하는 것을 특징으로 하는 모낭유사 구조체 형성 방법.
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