KR20240009658A - 인간 모낭 유래 불멸화 모유두 세포주 및 각질세포 공배양을 통한 모낭유사 구조체 형성 방법 - Google Patents
인간 모낭 유래 불멸화 모유두 세포주 및 각질세포 공배양을 통한 모낭유사 구조체 형성 방법 Download PDFInfo
- Publication number
- KR20240009658A KR20240009658A KR1020220086813A KR20220086813A KR20240009658A KR 20240009658 A KR20240009658 A KR 20240009658A KR 1020220086813 A KR1020220086813 A KR 1020220086813A KR 20220086813 A KR20220086813 A KR 20220086813A KR 20240009658 A KR20240009658 A KR 20240009658A
- Authority
- KR
- South Korea
- Prior art keywords
- dermal papilla
- hair follicle
- cells
- immortalized
- hair
- Prior art date
Links
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 title claims abstract description 162
- 230000002500 effect on skin Effects 0.000 title claims abstract description 88
- 210000004209 hair Anatomy 0.000 title claims abstract description 40
- 210000002510 keratinocyte Anatomy 0.000 title claims abstract description 30
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 17
- 238000012258 culturing Methods 0.000 title claims description 16
- 210000002220 organoid Anatomy 0.000 title 1
- 210000003780 hair follicle Anatomy 0.000 claims abstract description 43
- 239000000427 antigen Substances 0.000 claims description 7
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 claims description 7
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 claims description 7
- 108010017842 Telomerase Proteins 0.000 claims description 2
- 102100032938 Telomerase reverse transcriptase Human genes 0.000 claims description 2
- 241000700605 Viruses Species 0.000 claims description 2
- 210000004918 root sheath Anatomy 0.000 claims 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 abstract description 15
- 238000003501 co-culture Methods 0.000 abstract description 10
- 239000000463 material Substances 0.000 abstract description 7
- 201000004384 Alopecia Diseases 0.000 abstract description 6
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 abstract description 6
- 230000003676 hair loss Effects 0.000 abstract description 6
- 208000024963 hair loss Diseases 0.000 abstract description 6
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 abstract description 6
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 abstract description 5
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 abstract description 4
- 230000004888 barrier function Effects 0.000 abstract description 3
- 230000003658 preventing hair loss Effects 0.000 abstract description 3
- 108091035539 telomere Proteins 0.000 abstract description 3
- 210000003411 telomere Anatomy 0.000 abstract description 3
- 102000055501 telomere Human genes 0.000 abstract description 3
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 abstract description 2
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 abstract description 2
- 108700025716 Tumor Suppressor Genes Proteins 0.000 abstract description 2
- 102000044209 Tumor Suppressor Genes Human genes 0.000 abstract description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 abstract description 2
- 230000009583 hair follicle growth Effects 0.000 abstract description 2
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 abstract description 2
- 210000002488 outer root sheath cell Anatomy 0.000 description 19
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 15
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 14
- UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N streptomycin Chemical compound CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@H]1O UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N 0.000 description 12
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 8
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 8
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 8
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 8
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 8
- 230000007773 growth pattern Effects 0.000 description 7
- 229930182555 Penicillin Natural products 0.000 description 6
- JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N Penicillin G Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N 0.000 description 6
- JYGXADMDTFJGBT-VWUMJDOOSA-N hydrocortisone Chemical compound O=C1CC[C@]2(C)[C@H]3[C@@H](O)C[C@](C)([C@@](CC4)(O)C(=O)CO)[C@@H]4[C@@H]3CCC2=C1 JYGXADMDTFJGBT-VWUMJDOOSA-N 0.000 description 6
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 6
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 6
- NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N insulin Chemical compound N1C(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(NC(=O)CN)C(C)CC)CSSCC(C(NC(CO)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CCC(N)=O)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CSSCC(NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2C=CC(O)=CC=2)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(C)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2NC=NC=2)NC(=O)C(CO)NC(=O)CNC2=O)C(=O)NCC(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)NC(C(C)O)C(=O)N3C(CCC3)C(=O)NC(CCCCN)C(=O)NC(C)C(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(O)=O)=O)NC(=O)C(C(C)CC)NC(=O)C(CO)NC(=O)C(C(C)O)NC(=O)C1CSSCC2NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CC(N)=O)NC(=O)C(NC(=O)C(N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)CC1=CN=CN1 NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 229940049954 penicillin Drugs 0.000 description 6
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 6
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 description 6
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 5
- 108010076876 Keratins Proteins 0.000 description 4
- 102000011782 Keratins Human genes 0.000 description 4
- 239000003104 tissue culture media Substances 0.000 description 4
- 102000004877 Insulin Human genes 0.000 description 3
- 108090001061 Insulin Proteins 0.000 description 3
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 3
- 229930182816 L-glutamine Natural products 0.000 description 3
- 238000012790 confirmation Methods 0.000 description 3
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 3
- 229960000890 hydrocortisone Drugs 0.000 description 3
- 229940125396 insulin Drugs 0.000 description 3
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 3
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 2
- 102000008186 Collagen Human genes 0.000 description 2
- 108010035532 Collagen Proteins 0.000 description 2
- 229930193140 Neomycin Natural products 0.000 description 2
- 239000002771 cell marker Substances 0.000 description 2
- 229920001436 collagen Polymers 0.000 description 2
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 2
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 2
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 2
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 2
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- 239000012091 fetal bovine serum Substances 0.000 description 2
- 210000004919 hair shaft Anatomy 0.000 description 2
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 description 2
- 229960004927 neomycin Drugs 0.000 description 2
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 2
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 2
- 239000000047 product Substances 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 238000002054 transplantation Methods 0.000 description 2
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 2
- 238000012795 verification Methods 0.000 description 2
- 208000034826 Genetic Predisposition to Disease Diseases 0.000 description 1
- 102100034343 Integrase Human genes 0.000 description 1
- 108010092799 RNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 210000005056 cell body Anatomy 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 1
- 239000002537 cosmetic Substances 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 235000006694 eating habits Nutrition 0.000 description 1
- 210000003953 foreskin Anatomy 0.000 description 1
- 235000013376 functional food Nutrition 0.000 description 1
- 210000000442 hair follicle cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000036541 health Effects 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 239000008204 material by function Substances 0.000 description 1
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 1
- 238000007747 plating Methods 0.000 description 1
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 description 1
- 239000013589 supplement Substances 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
- C12N5/0602—Vertebrate cells
- C12N5/0625—Epidermal cells, skin cells; Cells of the oral mucosa
- C12N5/0627—Hair cells
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2502/00—Coculture with; Conditioned medium produced by
- C12N2502/09—Coculture with; Conditioned medium produced by epidermal cells, skin cells, oral mucosa cells
- C12N2502/094—Coculture with; Conditioned medium produced by epidermal cells, skin cells, oral mucosa cells keratinocytes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2510/00—Genetically modified cells
- C12N2510/04—Immortalised cells
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2513/00—3D culture
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Dermatology (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
본 발명은 인간 모낭 유래 불멸화 모유두 세포주 및 각질세포 공배양을 통한 모낭유사 구조체 형성 방법에 관한 것으로, 상세하게는, 인간 모낭 유래 모유두 세포에 암억제 유전자를 불활성화하는 SV40T 과 텔로미어 신장 효소 촉진 유전자인 hTERT 유전자를 강제 발현시켜 불멸화시킨 모유두 세포주(SV40T-hTERT DPC)와 각질세포를 3차원 공배양한 결과, 초대배양(primary cultrue) 모낭 유래 세포 조합의 모낭 유사체와 유사한 형태로 각질층부가 생장하는 모낭 유사 구조가 형성됨을 확인하였다. 이에, 본 발명은 동물대체시험, 탈모예방/모낭생장촉진 소재의 효능평가 등 다양한 분야에 적용 가능하고, 불멸화된 모유두세포를 통해, 기존 기술 대비 높은 결과 일관성을 확보할 수 있고, 안정적인 모낭 유래 세포 공급을 가능하게 하여, 탈모소재의 세포기반 효능평가에 대한 높은 진입 장벽을 해소할 수 있을 것으로 기대된다.
Description
본 발명은 인간 모낭 유래 불멸화 모유두 세포주 및 각질세포 공배양을 통한 모낭유사 구조체 형성 방법에 관한 것이다.
탈모는 환자에게 심리적, 사회적으로 상당히 부정적인 요인을 주는 질환으로, 최근 현대 사회에서는 유전적 소인 뿐 아니라, 노년인구 증가, 스트레스, 식습관 변화 등의 다양한 요인으로 인해 환자수가 급증하는 추세이다. 이로부터, 기존의 침습적 치료법인 자가모발이식과 약물적 치료법 이외에도 탈모를 극복하고 예방하기 위한 수요가 꾸준히 늘고 있으며, 관련 산업 역시 증가하고 있음. 또한 의약품/의약외품 분야 외에, 기능성화장품, 건강기능식품 산업군에서도 탈모 소재의 중요성이 부각되고 있다.
이러한 수요 및 산업군의 성장에도 불구하고, 현재 탈모 관련 소재의 효능 및 안전성을 검증하기 위한 방법은 여타의 기능성 소재 검증 방법에 비해 여러 애로사항이 존재한다. 인체적용시험의 경우 피험자 모집이 다른 질환에 비하여 어려우며, 이로 인하여 시험 소요 기간 및 비용이 높다. 동물 시험의 경우 실험모델과 인체의 생리학적 특성 차이로 인하여 그 효능을 간접적으로 추정 증명하는 수준이며, 최근 전 세계적으로 동물윤리가 부각되고 있어 동물시험 진행이 어렵다. 인체 유래 세포 시험의 경우에는 세포 공여자 간의 차이로 인하여 일관된 결과를 확보하기 어렵고, 실제 인체적용시험과의 결과 괴리가 가장 크다.
이러한 효능 검증의 애로사항으로 발생하는 다양한 문제점(인체적용시험 결과와 세포시험 결과의 불일치, 높은 효능 검증 비용과 소요 시간 등)은 탈모 관련 기능성 소재 및 제품의 신뢰도를 저해하며, 기능성 제품 산업군의 성장을 막는 진입장벽으로 작용한다. 따라서 동물윤리를 준수하며, 인체적용시험 결과와 유사하며, 결과의 일관성과 안정성이 보장된 새로운 세포 기반 효능평가 시스템의 필요성이 대두되고 있다.
최근 선행 연구에서, 인체 모낭 유래 세포를 이용하여 체내 모낭구조와 유사한 세포 구조체의 형성법 및 효능평가에 대한 적용 가능성이 발표된 바 있으나, 해당 연구에서 사용된 세포는 초대배양 세포로, 공여자 간의 세포 차이, 세포 계대수에 따른 급격한 특성 변화 등으로 일관된 결과를 얻기 힘들다는 문제점이 여전히 존재한다. 또한, 제한적인 모낭 공여로 인해 모낭 유래 초대 세포를 안정적으로 확보하기 어려운 단점이 있다.
본 발명의 목적은 불멸화된 모유두세포 및 각질세포를 3차원 공배양하는 단계를 포함하는 모낭유사 구조체 형성 방법을 제공하는데 있다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 (1) 모낭으로부터 모유두세포를 분리하는 단계; (2) 상기 분리된 모유두세포를 불멸화시키는 단계; 및 (3) 상기 불멸화된 모유두세포 및 각질세포를 3차원 공배양하는 단계를 포함하는 모낭유사 구조체 형성 방법을 제공한다.
본 발명은 인간 모낭 유래 불멸화 모유두 세포주 및 각질세포 공배양을 통한 모낭유사 구조체 형성 방법에 관한 것으로, 상세하게는, 인간 모낭 유래 모유두 세포에 암억제 유전자를 불활성화하는 SV40T 과 텔로미어 신장 효소 촉진 유전자인 hTERT 유전자를 강제 발현시켜 불멸화시킨 모유두 세포주(SV40T-hTERT DPC)와 각질세포를 3차원 공배양한 결과, 초대배양(primary cultrue) 모낭 유래 세포 조합의 모낭 유사체와 유사한 형태로 각질층부가 생장하는 모낭 유사 구조가 형성됨을 확인하였다. 이에, 본 발명은 동물대체시험, 탈모예방/모낭생장촉진 소재의 효능평가 등 다양한 분야에 적용 가능하고, 불멸화된 모유두세포를 통해, 기존 기술 대비 높은 결과 일관성을 확보할 수 있고, 안정적인 모낭 유래 세포 공급을 가능하게 하여, 탈모소재의 세포기반 효능평가에 대한 높은 진입 장벽을 해소할 수 있을 것으로 기대된다.
도 1은 인체 모낭 유래 모유두세포 및 외모근초세포 초대배양 모식도를 나타낸다.
도 2는 모유두 세포 불멸화 과정 및 결과를 나타낸다.
도 3은 초대배양 모유두세포와 불멸화 모유두 세포 간의 스페로이드 생장 패턴 비교 확인 모식도를 나타낸다.
도 4는 초대배양 모유두세포와 불멸화 모유두 세포 스페로이드를 이용한 모낭유사 구조체 형성 확인 모식도를 나타낸다.
도 5는 불멸화 세포만을 이용한 모낭유사 구조체 형성 여부 확인 모식도를 나타낸다.
도 6은 형성된 모낭 유사 구조체의 세포 배열 형태 확인 모식도를 나타낸다.
도 7은 초대배양 모유두세포 스페로이드와 SV40T-hTERT 도입 모유두 세포주 SV40T-hTERT DPC 스페로이드의 생장 패턴 비교 결과를 나타낸다.
도 8은 배양 시간에 따른 스페로이드 크기 변화 결과를 나타낸다. SV40T-hTERT DPC 스페로이드의 초기 세포수 및 배양 시간에 따른 직경의 경우, 초기 세포수≤1K, 배양 시간≤72hr 조건에서 기존에 알려진 모낭 내 모유두 크기와 비슷한 직경의 스페로이드를 형성하였고(A), 72시간 배양한 스페로이드의 관찰 결과, 초대배양 세포이용 스페로이드 대비 SV40T-hTERT DPC 이용 스페로이드가 스페로이드 내부 세포 배치가 더욱 조밀하고, 초기 세포수가 적더라도 72hr 배양 시 직경은 비슷한 규모로 확인되었다(B 내지 F).
도 9는 초대배양 모유두세포(Primary DPC) 혹은 불멸화 모유두 세포주(SV40T-hTERT DPC) 스페로이드와 인간모낭 외모근초세포 ORSC의 공배양을 이용한 모낭유사구조를 나타낸다. 시간에 따른 Primary DPC 혹은 SV40T-hTERT DPC와 인간 모낭 유래 외모근초세포와의 공배양 결과(A), 불멸화 모유두 세포주 SV40T-hTERT DPC와 외모근초세포(ORSC)의 공배양 시작 일자에 따른 모낭유사 구조체 형성 결과 (B), 외모근초세포 세포수에 따른 불멸화 모유두 세포주 SV40T-hTERT DPC와 외모근초세포 공배양 결과(C).
도 10은 시간에 따른 배지 조건별/ 모낭유사 구조체 형성 결과를 나타낸다. 불멸화 모유두 세포주 SV40T-hTERT DPC 1,000 세포수의 스페로이드에, 1,000(A), 3000(B)개의 각질세포주를 공배양한 결과를 나타낸다.
도 11은 불멸화 세포만을 이용한 모낭유사 구조체의 각질세포주 수량별 세포 배열 상태 확인 결과를 나타낸다.
도 2는 모유두 세포 불멸화 과정 및 결과를 나타낸다.
도 3은 초대배양 모유두세포와 불멸화 모유두 세포 간의 스페로이드 생장 패턴 비교 확인 모식도를 나타낸다.
도 4는 초대배양 모유두세포와 불멸화 모유두 세포 스페로이드를 이용한 모낭유사 구조체 형성 확인 모식도를 나타낸다.
도 5는 불멸화 세포만을 이용한 모낭유사 구조체 형성 여부 확인 모식도를 나타낸다.
도 6은 형성된 모낭 유사 구조체의 세포 배열 형태 확인 모식도를 나타낸다.
도 7은 초대배양 모유두세포 스페로이드와 SV40T-hTERT 도입 모유두 세포주 SV40T-hTERT DPC 스페로이드의 생장 패턴 비교 결과를 나타낸다.
도 8은 배양 시간에 따른 스페로이드 크기 변화 결과를 나타낸다. SV40T-hTERT DPC 스페로이드의 초기 세포수 및 배양 시간에 따른 직경의 경우, 초기 세포수≤1K, 배양 시간≤72hr 조건에서 기존에 알려진 모낭 내 모유두 크기와 비슷한 직경의 스페로이드를 형성하였고(A), 72시간 배양한 스페로이드의 관찰 결과, 초대배양 세포이용 스페로이드 대비 SV40T-hTERT DPC 이용 스페로이드가 스페로이드 내부 세포 배치가 더욱 조밀하고, 초기 세포수가 적더라도 72hr 배양 시 직경은 비슷한 규모로 확인되었다(B 내지 F).
도 9는 초대배양 모유두세포(Primary DPC) 혹은 불멸화 모유두 세포주(SV40T-hTERT DPC) 스페로이드와 인간모낭 외모근초세포 ORSC의 공배양을 이용한 모낭유사구조를 나타낸다. 시간에 따른 Primary DPC 혹은 SV40T-hTERT DPC와 인간 모낭 유래 외모근초세포와의 공배양 결과(A), 불멸화 모유두 세포주 SV40T-hTERT DPC와 외모근초세포(ORSC)의 공배양 시작 일자에 따른 모낭유사 구조체 형성 결과 (B), 외모근초세포 세포수에 따른 불멸화 모유두 세포주 SV40T-hTERT DPC와 외모근초세포 공배양 결과(C).
도 10은 시간에 따른 배지 조건별/ 모낭유사 구조체 형성 결과를 나타낸다. 불멸화 모유두 세포주 SV40T-hTERT DPC 1,000 세포수의 스페로이드에, 1,000(A), 3000(B)개의 각질세포주를 공배양한 결과를 나타낸다.
도 11은 불멸화 세포만을 이용한 모낭유사 구조체의 각질세포주 수량별 세포 배열 상태 확인 결과를 나타낸다.
본 발명은 (1) 모낭으로부터 모유두세포를 분리하는 단계; (2) 상기 분리된 모유두세포를 불멸화시키는 단계; 및 (3) 상기 불멸화된 모유두세포 및 각질세포를 3차원 공배양하는 단계를 포함하는 모낭유사 구조체 형성 방법을 제공한다.
바람직하게는, 상기 불멸화된 모유두세포는 simian virus 40T(SV40T) 항원 및 텔로머라제 역전사효소(telomerase reverse transcriptase; hTERT)를 발현하는 모유두세포(SV40T-hTERT DPC)될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
바람직하게는, 상기 각질세포는 모낭 유래 외모근초세포(out root sheath cell; ORSC) 또는 피부각질세포주 Ker-CT일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
바람직하게는, 상기 (3) 단계에서 상기 불멸화된 모유두세포 및 각질세포의 세포비는 1 : 1 내지 1 : 4일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
바람직하게는, 상기 (3) 단계는 상기 불멸화된 모유두세포 배양 직후 내지 배양 72시간 이내에, 상기 각질세포를 첨가하여 3차원 공배양할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
이하, 하기 실시예를 통해 본 발명을 보다 상세하게 설명한다. 다만, 이러한 실시예에 의해 본 발명이 한정되는 것은 아니다.
<
실험예
>
하기의 실험예들은 본 발명에 따른 각각의 실시예에 공통적으로 적용되는 실험예를 제공하기 위한 것이다.
1. 인체 모낭 유래 세포 배양 및
모유두세포
불멸화
사람 모낭조직은 경북대학교 모발이식센터에서 환자의 동의하에 자가모발이식술 후 잔여 모발을 제공받아 실험을 진행하였다.
모발 조직에서 모구를 절단하여 분리한 모유두를 페니실린 (100U/ml), 스트렙토마이신 (100ug/ml)과 20% 열비활성 혈청을 첨가한 DMEM (Hyclone) 에서 배양하여 모유두세포(DPC)를 분리하였다. 배양배지에 안착한 모유두 조직으로부터 세포가 자라면 0.25% trypsin/10mM EDTA를 이용하며 세포를 모으고, 5% CO2와 37℃의 조건아래 10% 열비활성화 혈청이 첨가된 DMEM에서 유지하였다.
모발 조직에서 모간을 절단한 뒤 collagen type 1 이 코팅된 배양접시에 페니실린 (100U/ml), 스트렙토마이신 (100ug/ml)과 20% 열비활성 혈청을 첨가한 DMEM (Hyclone) 에 5% CO2와 37℃의 조건에서 배양한 뒤, 모간이 배양접시 바닥에 안착했을 때, 페니실린 (100U/ml), 스트렙토마이신 (100ug/ml), EpiLife™ Defined Growth Supplement (Gibco) 가 포함된 각질세포 전용 배양배지인 EpiLife(Gibco) 배지에 5% CO2와 37℃의 조건으로 배양하였다(도 1).
모유두 세포의 불멸화 방법은 본 연구진의 이전 선행연구에 기술되었는데( BMB Reports. 44:8 512-516. 2011), 간략하게는, SV40T 항원과 Neomycine 저항 유전자를 포함하는 pSV3neo plasmid를 형질주입한 뒤, Neomycine 함유 배지에서 배양하여 생존한 세포를 선별한 뒤, 면역분석법을 통해 SV40T 항원 발현을 확인하여 SV40T 항원 발현 모유두 세포를 확보하였다. 확보한 SV40T 항원 발현 모유두 세포에, 인간 텔로미어 신장효소 역전사 효소 hTERT 유전자와 Hygromycine을 포함하는 pGRN145 plasmid를 형질주입한 뒤, Hygromycine 포함 배지에서 배양하여 생존한 세포를 선별한 뒤, 면역분석법과 역전사 중합효소 연쇄반응으로 SV40T 항원과 hTERT를 발현하는 세포를 확인하여 불멸화된 모유두 세포주 SV40T-hTERT DPC를 확보하였다(도 2).
불멸화된 인간 피부각질세포주 Ker-CT를 ATCC에서 구매하여, collagen type 1 코팅된 배양 배지에서 5% CO2와 37℃의 조건 아래 Lonza사의 KGM-Gold™ BulletKit™ 으로 배양하였다.
2.
모유두세포와
불멸화
모유두
세포 간의
스페로이드
생장 패턴 비교확인
본 발명자들의 선행 연구에서, 초대 배양한 모유두 세포와 불멸화한 모유두 세포 간의 유전자 발현 및 생장 특성을 확인하여 유사성을 검증한 바 있다. 해당 선행연구에서 주목할 만한 결과로, 초대 배양 모유두 세포와 불멸화 모유두 세포 간의 생장 속도가 유의한 차이를 보임에 따라, 모낭세포 스페로이드 형성 시 초기 세포수에 따른 스페로이드 크기 변화를 측정하였다.
배양접시에 평판 배양한 불멸화 모유두 세포주 SV40T-hTERT DPC와 초대 배양 모유두 세포(Primary DPC)를 0.25% trypsin/10mM EDTA로 걷은 뒤, U bottom low attachment 96 well plate 에 불멸화 모유두 세포주(SV40T-hTERT DPC) 500, 1000, 3000 세포/well, 초대배양 모유두 세포(Primary DPC) 3,000 세포/well로 투입하여 5% CO2와 37℃, 10% 열비활성화 혈청이 첨가된 DMEM 100μl/well 조건에서 16시간 이상 배양하여 스페로이드(spheroid)를 형성하였다. 이후 24시간마다 현미경으로 촬영 후 스페로이드의 직경을 측정하여 관찰하였다(도 3).
3.
모유두세포와
불멸화
모유두
세포
스페로이드를
이용한
모낭유사
구조체 형성 확인
스페로이드를 형성하기 위하여, 배양접시에 평판 배양한 초대배양 모유두세포와 불멸화 모유두 세포주 SV40T-hTERT DPC 를 0.25% trypsin/10mM EDTA로 걷은 뒤, U bottom low attachment 96 well plate 에 1,000 세포/well로 투입하여 5% CO2와 37℃, 10% 열비활성화 우태아혈청이 첨가된 DMEM 100μl/well 조건에서 배양하였다.
이후 배양접시에 평판 배양한 외모근초세포를 0.25% trypsin/10mM EDTA로 걷은 뒤, penicillin/streptomycin 100U/ml, hydrocortisone 10ng/ml, insulin 10ug/ml, L-glutamin 2mM 이 포함된 William's E 배지에 30,000 세포/ml 로 희석하여 상기 기술한 low attachment 96 well plate 에 100μl/ well 씩 추가한 뒤 5% CO2와 37℃의 조건아래 공배양하며 현미경 하에서 시간별로 관찰하였다.
세포 조합에 따른 모낭 유사구조 형성 정도의 비교를 위해서, 스페로이드 형성 시, 불멸화 모유두 세포주 SV40T-hTERT DPC의 수를 조절하여 스페로이드당 불멸화 모유두 세포수를 최소 300개에서 최대 1000개로 조절하였고, 모유두 세포-각질세포 공배양 시작 시간에 따른 모낭유사구조 형성 정도의 비교를 위해 각질세포의 주입 시기를 모유두세포 주입 직후로부터 모유두세포 주입 후 72시간 배양 후까지 조절하였다. 또한, 모낭 유래 각질세포의 수를 불멸화 세포 대비 동수에서 3배수로 조절하여 실험을 진행하였다(도 4).
4.
불멸화
세포만를
이용한
모낭유사
구조체 형성 여부 확인
평판 배양한 SV40T-hTERT DPC를 0.25% trypsin/10mM EDTA로 걷은 뒤, U bottom low attachment 96 well plate 에 1,000 세포/well로 투입하여 5% CO2와 37℃, 10% 열비활성화 혈청 첨가 DMEM 100μl/well 조건에서 24시간 배양, 스페로이드를 형성하였다.
이후 배양접시에 평판 배양한 불멸화 각질세포주 Ker-CT 를 0.25% trypsin/10mM EDTA로 걷은 뒤, 모유두세포 생장용 배지인 10% 열비활성화 우태아혈청이 함유된 DMEM, penicillin/streptomycin 100U/ml, hydrocortisone 10ng/ml, insulin 10ug/ml, L-glutamin 2mM 이 포함된 조직배양용 배지인 William's E, 각질세포주 생장용 배지인 KGM Gold Medium Bulletkit 각각의 조건하에 30,000 세포/ml 로 희석하여 상기 기술한 low attachment 96 well plate 에 100μl/ well 씩 추가한 뒤 5% CO2와 37℃의 조건아래 공배양하며 24시간마다 관찰하였다(도 5).
5. 형성된 모낭 구조체의 세포 배열 형태 확인
배양접시에 평판 배양한 불멸화 모유두 세포주 SV40T-hTERT DPC의 배지를 제거하고, Cell tracker 인 CM-DiI 1μM 가 포함된 인산완충생리식염수(PBS)를 30분간 처리하였다. 이후 0.25% trypsin/10mM EDTA로 걷은 뒤, U bottom low attachment 96 well plate 에 1,000 세포/well로 투입하여 5% CO2와 37℃, 10% 열비활성화 혈청이 첨가된 DMEM 100μl/well 조건에서 24시간 배양하여 스페로이드를 형성하였다.
이후 배양접시에 평판 배양한 각질세포를 0.25% trypsin/10mM EDTA로 걷은 뒤, penicillin/streptomycin 100U/ml, hydrocortisone 10ng/ml, insulin 10ug/ml, L-glutamin 2mM 이 포함된 William's E 배지에 30,000 세포/ml 로 희석하여 상기 기술한 low attachment 96 well plate 에 100μl/ well 씩 추가한 뒤 5% CO2와 37℃의 조건아래 공배양하며 24시간마다 광학현미경 및 형광현미경으로 관찰하였다(도 6).
<
실시예
1>
모유두세포와
불멸화
모유두
세포 간의
스페로이드
생장 패턴
인체 모낭 내 모유두의 크기는 약 100~250um의 크기를 가짐이 알려진 바 있다. 이로부터 약 250um 내외 직경의 모유두 세포 스페로이드를 형성하기 위하여, 96well U bottom Plate 1 well 당 3,000 개의 초대배양한 모유두 세포(primary DPC) 를 주입한 결과 250um 내외의 직경을 가지는 스페로이드를 확인할 수 있었고, 시간의 경과에 따른 스페로이드의 크기는 약간의 감소함을 확인하였다. 96well U bottom Plate 1 well 당 3,000 개의 SV40T-hTERT DPC 주입 후 스페로이드 생장 패턴은 Primary DPC 와 달리, 일정 시간 이후 스페로이드 크기의 증가를 확인하였다. 스페로이드 내 세포의 비율은 초대배양 모유두 세포 대비 그 밀도가 높음을 확인하였다(도 7 및 도 8).
따라서 모낭유사 구조체 제조를 위해 불멸화 모유두 세포를 사용하여 스페로이드를 형성할 때, 초대배양 모유두 세포 스페로이드와 유사한 형태를 제조하기 위해서는 세포수와 배양 시간을 조절해야 하며, 본 발명에서는 불멸화 모유두세포의 경우 기존 초대배양 모유두세포 대비 1/3배의 세포수, 스페로이드 형성 시간 72시간 내의 기준에서 불멸화 모유두세포의 생장패턴이 모유두세포 생장패턴과 유사함을 확인하였다(도 8).
<
실시예
2>
모유두세포와
불멸화
모유두
세포
스페로이드를
이용한
모낭유
사 구조체 형성 확인
모낭유사 구조체를 형성하기 위하여, 모낭 유래 각질세포인 외모근초세포를 스페로이드가 형성된 U bottom plate에 주입한 결과, 초대 배양한 모유두세포와 SV40T-hTERT DPC 세포 구분없이 모낭과 유사한 구조의 모낭유사 구조체의 형성을 확인할 수 있었다(도 9). 외모근초세포의 투여 시기를 조절하여 시험한 결과, 스페로이드 형성을 위해 모유두 세포를 주입 후 24시간 내에 외모근초세포를 주입하였을 때 모낭유사 구조체의 형성이 원활함을 확인하였다(도 9B). 모유두세포 및 외모근초세포의 주입량을 조절하여 시험한 결과, 초대배양 모유두 세포의 경우 동수의 외모근초세포, SV40T-hTERT DPC의 경우 모유두세포 대비 3배수의 외모근초세포 조건에서 모낭유사 구조체의 생장이 두드러졌다. 위로부터 형성된 스페로이드와 각질세포 간 일정 비율을 유지하였을 때 모낭유사 구조체의 생장이 두드러짐을 확인하였다. 모낭 구조를 형성하는 데 모유두 세포와 외모근초세포의 세포비는 1:3~1:4 정도가 최적임을 확인할 수 있었다(도 9C).
<
실시예
3>
불멸화
세포만을 이용한
모낭유사
구조체 형성 여부 및 세포 배열 상태 확인
전체 불멸화 세포 모낭유사 구조체를 형성하기 위하여, 인간 신생포피세포를 불멸화한 세포주 Ker-CT를 이용하여 모낭유사구조 형성 시험을 진행한 결과, 외모근초세포 이용 모낭유사 구조체와 유사한 형태의 모낭유사구조 세포체의 형성을 확인하였다. 세포수 1,000개의 SV40T-hTERT DPC 스페로이드에, 1,000개의 각질세포주를 공배양한 결과와 3,000개의 각질세포주를 공배양한 결과, 모두 모낭유사 세포 구조를 형성함을 확인할 수 있었다(도 10 및 도 11). 3가지 배지 조건을 비교하였을 때, 다른 배지조건에 비해 조직배양용 배지인 William’s E 배지 조건에서 모낭유사구조가 가장 길게 뻗어남을 확인할 수 있었다(도 10). 각질세포주 Ker-CT 의 경우 동수의 모낭 외모근초세포 주입 시 형성되지 않은 1,000개 세포수 주입 시에도 모낭유사구조 형태를 형성함을 확인할 수 있었다(도 9C, 도 10). 위 결과로부터 모낭유사구조 생성이 확인된 조직배양용 배지에 1,000개 세포수의 불멸화 모유두세포스페로이드와 3,000개 세포수의 각질세포주 조합으로 조직배양용 배지인 William’s E 배지 조건 하에서 공배양한 결과 가장 모낭과 유사한 모낭 구조체의 형성을 확인할 수 있었다(도 10B 및 도 11).
불멸화 모유두 세포에 세포 표지자를 부착하여 형성된 모낭유사 구조체를 형광 관찰하여 체내 모낭 모구부 내에 위치한 모유두와 유사한 형태의 세포 배열 구조를 가짐을 확인하였다. 세포 표지자 부착 시험 결과, 세포 구조체의 모유두 세포주로 이루어진 스페로이드와 각질 세포주가 모낭과 유사한 구조를 형성함을 확인할 수 있었다(도 11).
이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시예일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
Claims (5)
- (1) 모낭으로부터 모유두세포를 분리하는 단계;
(2) 상기 분리된 모유두세포를 불멸화시키는 단계; 및
(3) 상기 불멸화된 모유두세포 및 각질세포를 3차원 공배양하는 단계를 포함하는 모낭유사 구조체 형성 방법. - 제1항에 있어서, 상기 불멸화된 모유두세포는 simian virus 40T(SV40T) 항원 및 텔로머라제 역전사효소(telomerase reverse transcriptase; hTERT)를 발현하는 모유두세포인 것을 특징으로 하는 모낭유사 구조체 형성 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 각질세포는 모낭 유래 외모근초세포(out root sheath cell; ORSC) 또는 피부각질세포주 Ker-CT인 것을 특징으로 하는 모낭유사 구조체 형성 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 (3) 단계에서 상기 불멸화된 모유두세포 및 각질세포의 세포비는 1 : 1 내지 1 : 4인 것을 특징으로 하는 모낭유사 구조체 형성 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 (3) 단계는 상기 불멸화된 모유두세포 배양 직후 내지 배양 72시간 이내에, 상기 각질세포를 첨가하여 3차원 공배양하는 것을 특징으로 하는 모낭유사 구조체 형성 방법.
Priority Applications (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020220086813A KR20240009658A (ko) | 2022-07-14 | 2022-07-14 | 인간 모낭 유래 불멸화 모유두 세포주 및 각질세포 공배양을 통한 모낭유사 구조체 형성 방법 |
| PCT/KR2023/009142 WO2024014752A1 (ko) | 2022-07-14 | 2023-06-29 | 인간 모낭 유래 불멸화 모유두 세포주 및 각질세포 공배양을 통한 모낭유사 구조체 형성 방법 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020220086813A KR20240009658A (ko) | 2022-07-14 | 2022-07-14 | 인간 모낭 유래 불멸화 모유두 세포주 및 각질세포 공배양을 통한 모낭유사 구조체 형성 방법 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| KR20240009658A true KR20240009658A (ko) | 2024-01-23 |
Family
ID=89537022
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| KR1020220086813A KR20240009658A (ko) | 2022-07-14 | 2022-07-14 | 인간 모낭 유래 불멸화 모유두 세포주 및 각질세포 공배양을 통한 모낭유사 구조체 형성 방법 |
Country Status (2)
| Country | Link |
|---|---|
| KR (1) | KR20240009658A (ko) |
| WO (1) | WO2024014752A1 (ko) |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR20210054749A (ko) | 2019-11-06 | 2021-05-14 | (주)아모레퍼시픽 | 인공 모낭 구조체의 제조방법 및 이에 의해 제조된 인공 모낭 구조체 |
Family Cites Families (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| GB0605450D0 (en) * | 2006-03-17 | 2006-04-26 | Intercytex Ltd | Cell co-culture |
| WO2010021245A1 (ja) * | 2008-08-22 | 2010-02-25 | 学校法人慶應義塾 | 毛乳頭細胞の培養方法 |
| KR102636511B1 (ko) * | 2020-03-20 | 2024-02-14 | 주식회사 에이엔케이 | 기판 상에 형성된 모낭 세포 스페로이드 및 이의 제조방법 |
-
2022
- 2022-07-14 KR KR1020220086813A patent/KR20240009658A/ko unknown
-
2023
- 2023-06-29 WO PCT/KR2023/009142 patent/WO2024014752A1/ko unknown
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR20210054749A (ko) | 2019-11-06 | 2021-05-14 | (주)아모레퍼시픽 | 인공 모낭 구조체의 제조방법 및 이에 의해 제조된 인공 모낭 구조체 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| WO2024014752A1 (ko) | 2024-01-18 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Kim et al. | Neural induction with neurogenin1 increases the therapeutic effects of mesenchymal stem cells in the ischemic brain | |
| Louis et al. | Enumeration of neural stem and progenitor cells in the neural colony-forming cell assay | |
| McKenzie et al. | Skin-derived precursors generate myelinating Schwann cells for the injured and dysmyelinated nervous system | |
| JP5600671B2 (ja) | 毛小嚢及びデノボ乳頭の作製方法並びにインビトロ試験及びインビボ移植のためのそれらの使用 | |
| EP3766966A1 (en) | Three dimensional heterogeneously differentiated tissue culture | |
| Song et al. | Comparison of neuron-like cells derived from bone marrow stem cells to those differentiated from adult brain neural stem cells | |
| Kruse et al. | Towards the development of a pragmatic technique for isolating and differentiating nestin‐positive cells from human scalp skin into neuronal and glial cell populations: generating neurons from human skin? | |
| KR102251129B1 (ko) | 모발 성장을 조정하기 위한 방법 및 조성물 | |
| CA2983332A1 (en) | Generation of muscle-lineage cells from stem cells | |
| JPWO2003027281A1 (ja) | 骨格筋間質由来多分化能幹細胞 | |
| Nam et al. | Identification of novel epithelial stem cell-like cells in human deciduous dental pulp | |
| Miller et al. | Tubulin transport in neurons. | |
| CN105073980A (zh) | 含有适合用于缺血性疾病治疗的细胞的细胞群体的体外增殖方法 | |
| CN109689858A (zh) | 用于产生具有体内血管形成能力的中胚层和/或内皮集落形成细胞样细胞的方法 | |
| KR20070080561A (ko) | 중추 또는 말초 신경계 손상 치료용 조성물 | |
| CN103348002A (zh) | 产生诱导多能干细胞和分化细胞的方法 | |
| JP5097387B2 (ja) | 人工皮膚 | |
| KR20210051508A (ko) | 3차원 뇌 오가노이드를 이용한 뇌신경계질환 치료용 줄기세포 스크리닝 방법 | |
| KR20240009658A (ko) | 인간 모낭 유래 불멸화 모유두 세포주 및 각질세포 공배양을 통한 모낭유사 구조체 형성 방법 | |
| JP2020521484A (ja) | 人工多能性幹細胞を生成するための基質および方法 | |
| TWI649422B (zh) | 成體多功能嗅幹細胞、其分離方法及其應用 | |
| Gao et al. | Putative epidermal stem cell convert into corneal epithelium-like cell under corneal tissue in vitro | |
| Berrone et al. | Establishment and characterization of a human retinal pericyte line: a novel tool for the study of diabetic retinopathy | |
| TW201504435A (zh) | 毛囊形成用組合物之品質管理方法 | |
| EP3783099B1 (en) | Method for isolating and culturing neural stem cells with high efficiency |