WO2023287322A1 - Средство для коррекции митохондриальной дисфункции - Google Patents

Средство для коррекции митохондриальной дисфункции Download PDF

Info

Publication number
WO2023287322A1
WO2023287322A1 PCT/RU2022/050007 RU2022050007W WO2023287322A1 WO 2023287322 A1 WO2023287322 A1 WO 2023287322A1 RU 2022050007 W RU2022050007 W RU 2022050007W WO 2023287322 A1 WO2023287322 A1 WO 2023287322A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
agent
mitochondrial
animals
cells
drug
Prior art date
Application number
PCT/RU2022/050007
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Владислав Николаевич ЛАСКАВЫЙ
Михаил Аркадьевич ШУРДОВ
Original Assignee
Владислав Николаевич ЛАСКАВЫЙ
Михаил Аркадьевич ШУРДОВ
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Владислав Николаевич ЛАСКАВЫЙ, Михаил Аркадьевич ШУРДОВ filed Critical Владислав Николаевич ЛАСКАВЫЙ
Priority to CN202280045462.8A priority Critical patent/CN117715631A/zh
Priority to EP22842551.8A priority patent/EP4371561A1/en
Publication of WO2023287322A1 publication Critical patent/WO2023287322A1/ru
Priority to ZA2024/00909A priority patent/ZA202400909B/en

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/11—Aldehydes
    • A61K31/115—Formaldehyde
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/0012—Galenical forms characterised by the site of application
    • A61K9/0019—Injectable compositions; Intramuscular, intravenous, arterial, subcutaneous administration; Compositions to be administered through the skin in an invasive manner
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/08—Solutions
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators

Definitions

  • the invention relates to the field of experimental medicine and concerns the creation of a new effective agent for correcting mitochondrial dysfunction in laboratory animals.
  • Mitochondrial diseases include disorders caused by a wide variety of molecular damage or defects, the phenotypic manifestation of the disease being further complicated by the stochastic distributions of mitochondria in different tissues.
  • a genetic construct for the correction of mitochondrial dysfunction is known (see RF patent D 1 "2642972 according to IPC class A61K48 / Q0, published on January 29, 2018), which is a section of mitochondrial DNA that is absent in mutant DNA, containing nucleotide sequences complementary to oligonucleotides at the ends SEQ ID N°1 and SEQ ID N°2 from the set of oligonucleotides.
  • this drug showed the best results when administered intracerebral (injection directly into the brain) in a study on Mongolian gerbils (Meriones uniculatus). This method of administration is traumatic and undesirable for mass use of the drug.
  • an immunomodulatory agent for injection containing the active ingredient and targeted additives (see RF patent N ° 2077882 according to class IPC A61K 31/115, pub. 27.04.1997).
  • active principle it contains formaldehyde, and as target additives NaCl and distilled water, while it is an injection solution containing, wt.%: formaldehyde 0.07 0.24, NaCl 0.9 0.95, distilled water - the rest is up to 100%.
  • the technical problem of the claimed invention is the creation of an effective and easy-to-use agent for the correction of mitochondrial dysfunction in the experiment.
  • the technical result is an increase in the membrane potential of mitochondria and an increase in the oxygen-dependent metabolism of neutrophils.
  • the technical result is achieved by using an immunomodulating agent for intramuscular injections containing formic aldehyde in an amount of 0.076-0.078% in an isotonic sodium chloride solution of 0.85-0.95% concentration as a means to increase the membrane potential of mitochondria and increase the oxygen-dependent metabolism of neutrophils.
  • Fig. 1 subpopulations of blood cells of mice of all groups, assessed for the inclusion of mitochondrial dye JC-1 and apoptosis marker BCL-2, where A is an assessment of the dy potential of mitochondria within lymphocytes (CD45+ Ly6G-), monocytes (Ly6G+Cd45+) and neutrophils ( Ly6G+CD451ow), B - the amount of BCL-2+, the main protein involved in cell apoptosis. in fig.
  • 2 is an example of assessing the dy potential of mitochondria of various populations, as well as the proportions of monomers and aggregates of mouse lymphocytes, neutrophils and monocytes: within monocytes (population of Ly6G+Cd45+ cells), within neutrophils (population of Ly6G+CD451ow cells), B - proportion of monomers (lower right quadrant) - 68.5% and proportion of aggregates (activated cells, upper right quadrant) - 30, 8% within the lymphocyte population; B - the proportion of monomers (lower right quadrant) - 92.7% and the proportion of aggregates (upper right quadrant) - 7.3% within neutrophils; D - the proportion of monomers (lower right quadrant) - 66.1% and the proportion of aggregates (activated cells, upper right quadrant) - 33.9% within the population of monocytes.
  • aqueous solution of formic aldehyde (formaldehyde formic acid) is a clear, colorless liquid with a peculiar pungent odor, miscible with water and alcohol in all proportions.
  • Formic aldehyde is a representative of the class of HCO aldehydes. It is a colorless gas with a pungent odor. weight 30.03, its density at 20°C is 0.815, melting point 92°C, boiling point 19.2°C. Let's well dissolve in water, alcohol.
  • Isotonic sodium chloride solution for injection is a colorless transparent liquid with a salty taste.
  • the solution is sterile, non-pyrogenic.
  • the claimed product is a clear, colorless, odorless liquid with a slightly salty taste.
  • the tool is prepared as follows.
  • mice 140 mature F1 hybrid male mice (CBAxC57B16). Animals were kept in standard polypropylene boxes for keeping animals under vivarium conditions, under natural light conditions, on a standard diet (piled feed PK-120-1000
  • the agent was administered once intramuscularly at a dose of 12.5 ml/kg, which corresponded to 0.25 ml of the drug per mouse (the average body weight of mice was 20.5 ⁇ 0.24 g). Animals were slaughtered by decapitation under ether anesthesia 1, 3 and 24 hours after drug administration. Control animals were injected intramuscularly with 0.25 ml of 0.9% sodium chloride solution (physiological saline).
  • mitochondrial depolarization is one of the first events that occurs during apoptosis and may even be a prerequisite for the release of cytochrome c.
  • the depolarization of the dy indicator may indirectly indicate a decrease in the functional potential of the mitochondrial membrane, i.e., their deactivation, possibly eventually leading to cell death.
  • the fluorescence emission spectrum of JC-1 depends on its concentration, which, in turn, is determined by the dy state.
  • JC-1 can exist in two different states, aggregates or monomers, each with different emission spectra.
  • JC-1 forms monomers at low dye concentrations and aggregates at higher concentrations.
  • Both JC-1 aggregates and monomers exhibit fluorescence in the green end of the spectrum, which is measured in the green channel (FL-1) on flow cytometers.
  • JC-1 When living cells are incubated with JC-1, JC-1 enters the plasma membrane of the cell as a monomer. The absorption of JC-1 into mitochondria is due to dy. Further, Dy of normal, healthy mitochondria is polarized and JC-1 is quickly absorbed by such mitochondria. This uptake increases the concentration gradient of JC-1, resulting in the formation of JC-1 aggregates (known as J-aggregates) in mitochondria.
  • JC-1 aggregates exhibit a red spectral shift resulting in higher levels of red fluorescence emission, which is measured in the red channel (FL-2) on most flow cytometers.
  • JC-1 dye can be used as both a qualitative (taking into account the shift from green to red fluorescence emission) and a quantitative (taking into account only the pure fluorescence intensity) measure of the mitochondrial membrane potential.
  • Accumulation of fluorescent dyes in mitochondria can be optically detected using flow cytometry, fluorescence microscopy, confocal microscopy, and using a fluorescent plate reader.
  • fluorescence coefficient determination gives researchers the ability to compare membrane potential measurements as well as estimate the percentage of mitochondrial depolarization occurring in a pathological state (eg, cellular stress, apoptosis, etc.).
  • Mitochondrial dy potential and BCL-2+ cell counts were studied immunologically using blood flow cytometry techniques within several mouse whole blood populations.
  • leukocytes - CD45+ cells within lymphocytes (population of CD45+ Ly6G-), within monocytes (population of Ly6G+Cd45+ cells), within neutrophils (population of Ly6G+CD451ow cells), and additionally the number of BCL-2+ cells was estimated within CD45+CD3+ T cells. The estimated populations are shown in Figs. 1 A, B.
  • FIG. 2A shows a scatter plot of cell locations of the sample populations being assessed within lymphocytes (CD45+ Ly6G- population), within monocytes (Ly6G+Cd45+ cell population), within neutrophils (Ly6G+CD451ow cell population).
  • FIG. 2B shows that the proportion of monomers (lower right quadrant) is 68.5%.
  • the proportion of aggregates (activated cells, upper right quadrant) is 30.8% within the mouse blood lymphocyte population.
  • FIG. 2B shows that the proportion of monomers (lower right quadrant) is 92.7%.
  • the proportion of aggregates (upper right quadrant) is 7.3% within neutrophils.
  • FIG. 2 G the proportion of monomers (lower right quadrant) - 66.1%. Aggregate proportion (upper right quadrant) - 33.8% within mouse peripheral blood monocytes.
  • Example 2 The evaluation of oxygen-dependent activation of neutrophils was carried out by the chemiluminescence method.
  • the ring of mononuclear cells was carefully taken, the mononuclear cells were transferred into a test tube and diluted with Hanks' solution with heparin 1:5, carefully resuspended and centrifuged for 10 minutes at 3000 rpm. The supernatant was removed from the resulting sample, and the precipitate was dispersed in 2 ml of Hanks' working solution with heparin.
  • the program was launched on the LKB WALLAC 1251 Luminometer and the luminol-dependent zymosan-induced chemiluminescence was evaluated in 10 cuvettes with control samples and in 10 cuvettes with experimental samples with a total cell concentration in each cuvette of 1 * 10 6 in Hank's solution with the addition of luminol. Based on the number of cycles given in the program, the peak value of Imax was reached with a subsequent decrease.
  • Table 1 presents the results of a study of oxygen-dependent activation of neutrophils by chemiluminescence 3 hours after the administration of the agent.
  • the data obtained allow us to speak about a significant increase in the oxygen-dependent metabolism of neutrophils under the influence of the test drug, which can be indirectly regarded as the activation of mitochondria in this cell subpopulation (see Fig. 4).
  • the horizontal axis shows the numbers of the studied cuvettes, and the vertical axis shows the values of the index Imax, mV.
  • FIG. 6 shows a comparison of the average values of chemiluminescence in all analyzed groups.
  • the horizontal axis indicates the time of the study after the injection of the drug, and the vertical axis indicates the results of Imax, mV.
  • the figure 6 shows a comparison of the average indicators of chemiluminescence in all analyzed groups and it is clear that under the influence of the proposed agent, oxygen-dependent activation of neutrophils is manifested. At the same time, the maximum effect was detected a day after the administration of the drug, this effect persisted for three weeks, gradually decreasing.

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Acyclic And Carbocyclic Compounds In Medicinal Compositions (AREA)

Abstract

Изобретение относится к области экспериментальной медицины, и касается создания нового эффективного средства для коррекции митохондриальной дисфункции у лабораторных животных. Технической проблемой заявляемого изобретения является создание эффективного и простого в применении средства для коррекции митохондриальной дисфункции 5 в эксперименте. Техническим результатом является повышение мембранного потенциала митохондрий и повышение кислородзависимого метаболизма нейтрофилов. Технический результат достигается применением иммуномодулирующего средства для внутримышечных инъекций, содержащего муравьиный альдегид в количестве 0,076-0,078% в изотоническом растворе хлорида 0 натрия 0,85-0,95%-ной концентрации в качестве средства для повышения мембранного потенциала митохондрий и повышения кислородзависимого метаболизма нейтрофилов.

Description

СРЕДСТВО ДЛЯ КОРРЕКЦИИ МИТОХОНДРИАЛЬНОЙ ДИСФУНКЦИИ
Изобретение относится к области экспериментальной медицины, и касается создания нового эффективного средства для коррекции митохондриальной дисфункции у лабораторных животных.
Митохондриальные заболевания включают в себя нарушения, вызываемые огромным разнообразием молекулярных повреждений или дефектов, причем фенотипическое проявление заболевания дополнительно усложняется стохастическими распределениями митохондрий в различных тканях.
Известна генетическая конструкция для коррекции митохондриальной дисфункции (см. патент РФ Д1» 2642972 по кл. МПК A61K48/Q0, опуб. 29.01.2018), представляющая собой участок митохондриальной ДНК, отсутствующий в мутантной ДНК, содержащий на концах последовательности нуклеотидов, комплементарные олигонуклеотидам SEQ ID N°1 и SEQ ID N°2 из набора олигонуклеотидов.
Данная конструкция только в перспективе может быть использована для коррекции митохондриальной дисфункции. Однако, следует учесть, что все эксперименты проведены пока только на культуре клеток и нет исследований на животных.
Известен способ коррекции митохондриальной дисфункции при ишемии мозга в эксперименте (см. патент Украины N° 104516 по кл. МПК А61Р 25/28, опуб. 10.02.2016), заключающийся во введении нейропротективного средства, в качестве которого используют цереброкурин, который вводят внутрибрюшинно раз в сутки в дозе 0,02 мл / 100 г веса животного в течение 21 дня.
Однако, следует принять во внимание, что наилучшие результаты этот препарат показал при интрацеребральном введении (инъекция непосредственно в мозг) при исследовании на монгольских песчанках (Meriones uniculatus). Данный метод введения травматичен и нежелателен при массовом применении препарата.
Наиболее близким к заявляемому является иммуномодулирующее средство для инъекций, содержащее активное начало и целевые добавки (см. патент РФ N° 2077882 по кл. МПК А61К 31/115, опуб. 27.04.1997). В качестве активного начала оно содержит формальдегид, а в качестве целевых добавок NaCl и дистиллированную воду, при этом оно представляет собой инъекционный раствор, содержащий, мас.%: формальдегид 0,07 0,24, NaCl 0,9 0,95, дистиллированная вода - остальное до 100%.
Приведенные аналоги показывают, что создание средств для коррекции митохондриальных дисфункций является далеко не решенной задачей. Поэтому поиск новых средств коррекции весьма актуален.
Технической проблемой заявляемого изобретения является создание эффективного и простого в применении средства для коррекции митохондриальной дисфункции в эксперименте.
Техническим результатом является повышение мембранного потенциала митохондрий и повышение кислородзависимого метаболизма нейтрофилов.
Технический результат достигается применением иммуномодулирующего средства для внутримышечных инъекций, содержащего муравьиный альдегид в количестве 0,076-0,078% в изотоническом растворе хлорида натрия 0,85-0,95%-ной концентрации в качестве средства для повышения мембранного потенциала митохондрий и повышения кислородзависимого метаболизма нейтрофилов.
Известно, что естественный метаболит - альдегид муравьиной кислоты используется для иммунокоррекции при различных нарушениях иммунного статуса организма (см. патент РФ N° 2077882), для лечения вирусных инфекций (см. патент РФ N° 2146134), в качестве холестеринорегулирующего средства (см. патент РФ N° 2352331), для активизации собственных стволовых клеток организма (см. патент РФ *Г° 2376985).
Однако, до настоящего времени неизвестно использование препарата на основе муравьиного альдегида для коррекции митохондриальной дисфункии у лабораторных животных.
Изобретение поясняется иллюстрациями, где представлено: на фиг. 1 - субпопуляции клеток крови мышей всех групп, оцененных на предмет включения митохондриального красителя JC-1 и маркера апоптоза BCL-2, где А -оценка dy потенциала митохондрий в пределах лимфоцитов (CD45+ Ly6G-), моноцитов (Ly6G+Cd45+) и нейтрофилов (Ly6G+CD451ow), Б - количество BCL- 2+, основного белка участвующего в апоптозе клеток. на фиг. 2 - пример оценки dy потенциала митохондрий различных популяций, а также пропорции мономеров и агрегатов лимфоцитов, нейтрофилов и моноцитов крови мыши: где А - точечный график расположения клеток оцениваемых популяций образца в пределах лимфоцитов (популяция CD45+ Ly6G-), в пределах моноцитов (популяция Ly6G+Cd45+ клетки), в пределах нейтрофилов (популяция Ly6G+CD451ow клеток), Б - пропорция мономеров (правый нижний квадрант) - 68,5% и пропорция агрегатов (активированные клетки, правый верхний квадрант) - 30,8% в пределах популяции лимфоцитов; В - пропорция мономеров (правый нижний квадрант) - 92,7% и пропорция агрегатов (правый верхний квадрант) - 7,3% в пределах нейтрофилов; Г - пропорция мономеров (правый нижний квадрант) - 66,1% и пропорция агрегатов (активированные клетки, правый верхний квадрант) - 33,9% в пределах популяции моноцитов. на фиг. 3, 4, 5 - изменения показателей кислород -зависимого метаболизма нейтрофилов крови через 3 часа после введения средства (фиг. 3), через 24 часа (фиг. 4), через 3 недели (фиг.5); на фиг. 6 - сравнение средних показателей кислород-зависимого метаболизма нейтрофилов крови методом хемилюминесценции во всех анализируемых группах мышей.
Водный раствор муравьиного альдегида (альдегид муравьиной кислоты) - прозрачная бесцветная жидкость со своеобразным острым запахом, смешивающаяся с водой и спиртом во всех соотношениях.
Муравьиный альдегид - представитель класса альдегидов НСОН. Представляет собой бесцветный газ с резким запахом, мол. массой 30,03, плотность его при 20°С равна 0,815, температура плавления 92°С, температура кипения 19,2°С. Хорошо растворим в воде, спирте.
Изотонический раствор натрия хлорида для инъекций - бесцветная прозрачная жидкость солоноватого вкуса. Раствор стерилен, апирогенен.
Хлорид натрия - кубические кристаллы или белый кристаллический порошок соленого вкуса, без запаха. Растворим в воде (1:3).
Заявляемое средство представляет собой прозрачную бесцветную жидкость без запаха слегка солоноватого вкуса.
Средство готовят следующим образом.
Берут 2 весовых части 36,5-37,5%-ного медицинского раствора муравьиного альдегида, добавляют его в 998 весовых частей стерильного 0,85-0,95%-ного раствора хлорида натрия для инъекций до получения 0,076-0,078%-ного раствора альдегида. Средство хранят в темном месте при температуре 15-35°С.
Для доказательств возможности коррекции митохондриальной дисфункции при введении заявляемого средства лабораторным животным проводилось 2 теста. 1. Проводилась оценка потенциала мембраны митохондрий с применением митохондриального флуоресцентного красителя JC-1, а также оценка пропорции клеток с признаками апоптоза на основании оценки пропорции BCL2+ популяций. Оба показателя оценивались иммунологически с применением метода проточной цитометрии.
2. Проводилась оценка кислород -зависимой активации нейтрофилов методом хемилюминесценции
В первом тесте проводилась индивидуальная оценка активности митохондрий клеток крови каждого животного, во втором тесте для достижения адекватных результатов кровь животных пулировалась, при этом для каждой группы животных оценивалось 2 образца - кровь контрольной группы и пулированная кровь опытной группы.
Исследования проводились на 140 половозрелых мышах-самцах гибридах F1 (СВАхС57В16). Животные находились в стандартных полипропиленовых боксах для содержания животных в условиях вивария, при естественном световом режиме, на стандартном пищевом рационе (брикетированный корм ПК- 120-1 000
«Лабораторснаб», РФ) со свободным доступом к поилкам с водой.
Вся работа с лабораторными животными выполнялась в соответствии с общепринятыми этическими нормами и соответствовала правилам Европейской конвенции по защите животных, используемых для научных целей (ETS 123).
Средство вводили однократно внутримышечно в дозе 12,5 мл/кг, что соответствовало 0,25 мл препарата на мышь (масса тела мышей в среднем составляла 20,5±0,24 г.). Забой животных осуществляли методом декапитации под эфирным наркозом через 1, 3 и 24 часа после введения препарата. Контрольным животным вводили внутримышечно 0,25 мл 0,9% раствора хлористого натрия (физиологический раствор).
Оценка активности митохондрий под влиянием средства проводилась в нескольких группах животных:
1 - контроль (животные получали аналогичный испытуемому препарату объем физиологического раствора (0,9% раствор NaCL) -10 животных
2 - животные, получившие указанную дозу препарата и подвергнутые эвтаназии через 1 час от введения -20 животных
3 - животные, получившие указанную дозу препарата и подвергнутые эвтаназии через 3 часа от введения - 20 животных 4 - животные, получившие указанную дозу препарата и подвергнутые эвтаназии через 24 часа от введения - 20 животных
5 - животные, получившие препарат и подвергнутые эвтаназии через 3 недели отведения препарата -20 животных 6 - животные, получившие препарат двукратно (1 -одномоментно с животными 2-5 групп и повторное введение через 3 недели от первого) и подвергнутые эвтаназии через 3 часа от повторного введения -20 животных.
Забор крови производили в одноразовые стерильные пробирки с раствором К2ЭДТА. Пример 1. Изучение мембранного потенциала митохондрий (dy).
Энергия, выделяемая в ходе реакций окисления в митохондриальной дыхательной цепи, хранится в виде отрицательного электрохимического градиента мембраны митохондрий, и dy является поляризованным. Коллапс dy приводит к деполяризации мембранного потенциала митохондрий, и часто, но не всегда, наблюдается на ранних стадиях апоптоза, также изменения данного показателя описаны во время процессов некроза (в результате деполяризации мембраны) и процессов остановки клеточного цикла (в результате гиперполяризации мембраны). Несмотря на идущие научные дискуссии, было сделано обобщение, что деполяризация митохондрий является одним из первых событий, происходящих во время апоптоза, и может даже быть предпосылкой для высвобождения цитохрома с.
Таким образом, деполяризация показателя dy опосредовано может указывать на снижение функционального потенциала мембраны митохондрий, то есть об их деактивации, возможно в итоге приводящей к гибели клеток.
В настоящее время проточная цитометрия стала методом выбора для анализа мембранного потенциала митохондрий dy в целых клетках. При этом в качестве тестового зонда используют мембранно-проницаемые липофильные катионные флуорохромы которые проникают в клетки, и их флуоресценция является отражением Dy. Одним из предложенных к оценке данного состояния флуорохромов является JC-1 (ЗД’ б’-тетрахлор-СГДД’-тетраэтил-бензимидазол карбоцианин йодид), который является агрегатообразующим катионным красителем, чувствительным к dy.
Спектр излучения флуоресценции JC-1 зависит от его концентрации, которая, в свою очередь, определяется состоянием dy. JC-1 может существовать в двух различных состояниях, агрегатах или мономерах, каждый из которых имеет разные спектры излучения. JC-1 образует мономеры при низких концентрациях красителя и агрегаты при более высоких концентрациях. Как агрегаты JC-1, так и мономеры проявляют флуоресценцию в зеленом конце спектра, которая измеряется в зеленом канале (FL-1) на проточных цитометрах.
Когда живые клетки инкубируются с JC-1, JC-1 проникает в плазматическую мембрану клетки как мономер. Поглощение JC-1 в митохондрии обусловлено dy. Далее Dy нормальных, здоровых митохондрий поляризуется и JC-1 быстро поглощается такими митохондриями. Это поглощение увеличивает градиент концентрации JC-1, что приводит к образованию агрегатов JC-1 (известных как J- агрегаты) в митохондриях.
Агрегаты JC-1 демонстрируют красный спектральный сдвиг, приводящий к более высоким уровням излучения красной флуоресценции, которое измеряется в красном канале (FL-2) на большинстве проточных цитометров.
Таким образом, на основании оценки количества JC-lgreen+ (мономеры) и JClred+ (агрегаты) клеток можно говорить о состоянии мембраны митохондрий в изучаемом пуле клеток и преобладание JClred+ (агрегаты) клеток будет косвенно указывать на активацию митохондрий.
Важно, что краситель JC-1 может использоваться как качественная (учитывая сдвиг от зеленого к красному излучению флуоресценции), так и количественная (учитывая только чистую интенсивность флуоресценции) мера мембранного потенциала митохондрий.
Накопление флуоресцентных красителей в митохондриях можно оптически обнаружить с помощью проточной цитометрии, флуоресцентной микроскопии, конфокальной микроскопии и с помощью считывателя флуоресцентных пластин.
Использование определения коэффициента флуоресценции дает исследователям возможность сравнивать измерения мембранного потенциала, а также оценивать процент деполяризации митохондрий, происходящей в патологическом состоянии (например, клеточный стресс, апоптоз и т. Д.).
Учитывая то, что таким образом изучается не столько активация митохондрий, сколько апоптоз, то для исключения вероятности данного процесса параллельно те же самые клетки крови животных изучены на предмет количества BCL-2+ клеток с применением метода многопараметровой проточной цитометрии.
Оценка dy потенциала митохондрий и количество BCL-2+ клеток изучалось иммунологически с применением методов проточной цитометрии в крови в пределах нескольких популяций цельной крови мышей. В пределах лейкоцитов - CD45+ клетки, в пределах лимфоцитов (популяция CD45+ Ly6G-) в пределах моноцитов (популяция Ly6G+Cd45+ клетки), в пределах нейтрофилов (популяция Ly6G+CD451ow клеток), а также дополнительно количество BCL-2+ клеток оценено в пределах CD45+CD3+ Т-клеток. Оцениваемые популяции представлены на фиг 1 А, Б.
На фиг. 2 А - показан точечный график расположения клеток оцениваемых популяций образца в пределах лимфоцитов (популяция CD45+ Ly6G-), в пределах моноцитов (популяция Ly6G+Cd45+ клетки), в пределах нейтрофилов (популяция Ly6G+CD451ow клеток).
На фиг. 2 Б видно, что пропорция мономеров (правый нижний квадрант) составляет 68,5%. Пропорция агрегатов (активированные клетки, правый верхний квадрант) - 30,8% в пределах популяции лимфоцитов крови мыши.
На фиг. 2 В видно, что пропорция мономеров (правый нижний квадрант) составляет 92,7%. Пропорция агрегатов (правый верхний квадрант) - 7,3% в пределах нейтрофилов.
На фиг. 2 Г - пропорция мономеров (правый нижний квадрант) - 66,1%. Пропорция агрегатов (правый верхний квадрант) - 33,8% в пределах моноцитов периферической крови мыши.
Пример 2. Оценка кислород -зависимой активации нейтрофилов проводилась методом хемилюминсценции.
Пулированную периферическую кровь (5 контролей и 10 опытных особей) разбавляли рабочим раствором Хэнкса с гепарином в соотношении 1:1 и выделяли мононуклеары посредством центрифугирования при 3000 об/мин 1 час на градиенте плотности фиколл-гиппак (10 мл 10771 г/смЗ и 10 мл г/смЗ 11191 Merc).
Кольцо мононуклеаров аккуратно отбирали, мононуклеары переносили в пробирку и разбавляли раствором Хэнкса с гепарином 1:5, аккуратно ресуспендировали и центрифугировали 10 минут при 3000 об/мин. В полученном образце убирали надосадок, а осадок диспергировали в 2 мл рабочего раствора Хэнкса с гепарином.
Производили подсчет клеток в полученном растворе в камере Горяева в 16 квадратах.
Далее на люминометре LKB WALLAC 1251 Luminometer запускали программу и оценивали люминол-зависимую зимозан-индуцированную хемилюминесценцию в 10 кюветах с контрольными образцами и в 10 кюветах с опытными образцами с общей концентрацией клеток в каждой кювете 1*106 в растворе Хэнкса с добавлением люминола. Исходя из количества заданных циклов по программе, величина пика Imax была достигнута с последующим понижением.
В таблице 1 представлены результаты исследования кислород-зависимой активации нейтрофилов методом хемилюминесценции через 3 часа после введения средства.
Таблица 1.
Figure imgf000009_0001
Судя по полученным данным, видимой разницы между контролем и опытом (животные, забитые через 3 часа после введения препарата) не наблюдается, и можно сделать вывод о том, что спустя 3 часа после внутримышечного введения препарата изменения показателей кислород-зависимого метаболизма нейтрофилов крови не выявлены, а скорее даже несколько подавлены с учетом данных опытной группы (см. фиг. 3). На фиг. 3 по горизонтальной оси указаны номера исследованных кювет, а по вертикальной оси указаны значения максимального показателя хемилюминесценции Imax, mV.
Экспериментальные данные результатов исследования кислород-зависимой активации нейтрофилов методом хемилюминесценции через 24 часа после внутримышечного введения я средства представлены в таблице 2, где показано, что через сутки после достигается значительное достоверное (р=0,01) увеличение максимального показателя хемилюминесценции Imax, отношение среднего значения опытного к контролю составляет 4,655162. Таблица 2
Figure imgf000010_0001
Следует отметить, что в 10 -й кювете в контроле явно виден дискордантный (выбивающийся из общих значений) результат, поэтому при оценке среднего результата его не учитывали.
Полученные данные позволяют говорить о существенном повышении кислородозависимого метаболизма нейтрофилов под влиянием испытуемого препарата, что опосредованно можно расценить как активация митохондрий в данной клеточной субпопуляции (см. Фиг. 4). На фиг. 4 по горизонтальной оси указаны номера исследованных кювет, а по вертикальной оси указаны значения показателя Imax, mV.
Результаты исследований кислородзависимой активации нейтрофилов методом хемилюминесценции через 3 недели после внутримышечного (в/м) введения средства (группа 5, пул из 5 животных) и после двухкратного в/м введения (группа 6, пул из 5 животных) представлены в таблице 3.
Таблица 3
Figure imgf000010_0002
Figure imgf000011_0001
Для подтверждения результатов был выполнен дополнительный анализ оставшихся десяти животных (5 из 5 группы и 5 из 6 группы) (см. таблица 4). Таблица 4.
Figure imgf000011_0002
Согласно полученным данным, выявлена тенденция к практически 2- кратному повышению активности нейтрофилов у животных, исследования которых проводили через 3 недели после первого введения препарата. У отдельных животных, подвергшихся двукратному введению препарата, также выявлена разница в активации нейтрофилов в сравнении с контролем, но в целом при этом однократное введение препарата было более эффективным в сравнении с двукратным введением.
На фиг. 6 представлено сравнение средних показателей хемилюминесценции во всех анализируемых группах. По горизонтальной оси указано время исследования после инъекции препарата, а по вертикальной оси указаны результаты Imax, mV. На фигуре 6 представлено сравнение средних показателей хемилюминесценции во всех анализируемых группах и видно, что под влиянием заявляемого средства проявляется кислород -зависимая активация нейтрофилов При этом максимальный эффект выявлен спустя сутки от введения препарата, данный эффект сохранялся в течение трех недель, постепенно снижаясь.
Таким образом, после проведения экспериментов выявлено влияние препарата на dy митохондрий. .Через несколько часов после введения препарата происходит активация нормальных здоровых митохондрий, что проявляется в их поляризации. Данные процессы выявлены на разных сроках от введения препарата и в различных клеточных популяциях. На более ранних сроках наибольший и равномерный эффект проявился на моноцитах, в то время как более длительное воздействие препарата приводило к поляризации мембран в лимфоцитах и у некоторых особей в суммарной популяции моноцитов-нейтрофилов крови. Полученные данные подтверждают возможность активации митохондрий под влиянием заявляемого средства.

Claims

Формула изобретения.
Применение иммуномодулирующего средства для внутримышечных инъекций, содержащего активную часть в виде муравьиного альдегида в количестве 0,076-0,078% и добавку в виде изотонического раствора хлорида натрия для инъекций 0,85-0,95%-ной концентрации - остальное, в качестве средства для повышения мембранного потенциала митохондрий и повышения кислородзависимого метаболизма нейтрофилов.
PCT/RU2022/050007 2021-07-12 2022-01-13 Средство для коррекции митохондриальной дисфункции WO2023287322A1 (ru)

Priority Applications (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202280045462.8A CN117715631A (zh) 2021-07-12 2022-01-13 治疗线粒体功能障碍的药物
EP22842551.8A EP4371561A1 (en) 2021-07-12 2022-01-13 Agent for correcting mitochondrial dysfunction
ZA2024/00909A ZA202400909B (en) 2021-07-12 2024-01-26 Drug for correction of mitochondrial dysfunction

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
RU2021120402 2021-07-12
RU2021120402A RU2765467C1 (ru) 2021-07-12 2021-07-12 Средство для коррекции митохондриальной дисфункции

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2023287322A1 true WO2023287322A1 (ru) 2023-01-19

Family

ID=80214608

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/RU2022/050007 WO2023287322A1 (ru) 2021-07-12 2022-01-13 Средство для коррекции митохондриальной дисфункции

Country Status (5)

Country Link
EP (1) EP4371561A1 (ru)
CN (1) CN117715631A (ru)
RU (1) RU2765467C1 (ru)
WO (1) WO2023287322A1 (ru)
ZA (1) ZA202400909B (ru)

Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2077882C1 (ru) 1995-11-21 1997-04-27 Владислав Николаевич Ласкавый Иммуномодулирующее средство
RU2146134C1 (ru) 1999-06-29 2000-03-10 Ласкавый Владислав Николаевич Антивирусный препарат для инъекций
RU2352331C1 (ru) 2007-07-04 2009-04-20 Владислав Николаевич Ласкавый Средство, обладающее холестеринорегулирующим действием
RU2376985C1 (ru) 2008-07-17 2009-12-27 Владислав Николаевич Ласкавый Средство для активации стволовых клеток
UA104516C2 (ru) 2012-10-04 2014-02-10 Анатолій Климентійович Завойський Люлька для отделочных работ на фасадах домов
US20140065099A1 (en) * 2011-02-15 2014-03-06 Ecole Polytechnique Federale De Lausanne (Epfl) Methods of Treating Mitochondrial Dysfunction
RU2642972C1 (ru) 2016-12-26 2018-01-29 Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Московский государственный университет имени М.В. Ломоносова" (МГУ) Способ коррекции митохондриальной дисфункции с помощью генетической конструкции

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2738719C1 (ru) * 2020-03-26 2020-12-15 Владислав Николаевич Ласкавый Средство для лечения коронавирусных, ретровирусных инфекций и гепатита с

Patent Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2077882C1 (ru) 1995-11-21 1997-04-27 Владислав Николаевич Ласкавый Иммуномодулирующее средство
RU2146134C1 (ru) 1999-06-29 2000-03-10 Ласкавый Владислав Николаевич Антивирусный препарат для инъекций
RU2352331C1 (ru) 2007-07-04 2009-04-20 Владислав Николаевич Ласкавый Средство, обладающее холестеринорегулирующим действием
RU2376985C1 (ru) 2008-07-17 2009-12-27 Владислав Николаевич Ласкавый Средство для активации стволовых клеток
US20140065099A1 (en) * 2011-02-15 2014-03-06 Ecole Polytechnique Federale De Lausanne (Epfl) Methods of Treating Mitochondrial Dysfunction
UA104516C2 (ru) 2012-10-04 2014-02-10 Анатолій Климентійович Завойський Люлька для отделочных работ на фасадах домов
RU2642972C1 (ru) 2016-12-26 2018-01-29 Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Московский государственный университет имени М.В. Ломоносова" (МГУ) Способ коррекции митохондриальной дисфункции с помощью генетической конструкции

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
ANONYMOUS: "Mitochondrial Diseases ", CLEVELAND CLINIC, 31 May 2018 (2018-05-31), XP093025536, Retrieved from the Internet <URL:https://my.clevelandclinic.org/health/diseases/15612-mitochondrial-diseases> [retrieved on 20230220] *

Also Published As

Publication number Publication date
EP4371561A1 (en) 2024-05-22
CN117715631A (zh) 2024-03-15
RU2765467C1 (ru) 2022-01-31
ZA202400909B (en) 2024-03-27

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Kerr et al. Chronic exposure of human neurons to quinolinic acid results in neuronal changes consistent with AIDS dementia complex
Goossens et al. Direct evidence for tumor necrosis factor-induced mitochondrial reactive oxygen intermediates and their involvement in cytotoxicity.
Troiano et al. Mitochondrial membrane potential and DNA stainability in human sperm cells: a flow cytometry analysis with implications for male infertility
CA2467333A1 (en) Methods for monitoring amyotrophic lateral sclerosis
CN101968484B (zh) 一种利用斑马鱼筛选线粒体靶向化合物的方法
JP2001520990A (ja) ポリアミンアナログを使用するマクロファージ増殖を調節するための方法
Smith et al. A comparative morphologic and physiologic study of fish blood
CN111358790B (zh) Nsc228155在制备防治急性肾损伤的药物中的用途
Liu et al. Cytoskeletal alterations in human fetal astrocytes induced by interleukin‐1β
WO2017156362A1 (en) Modulating t cell survival by targeting the one-carbon metabolic pathway
RU2765467C1 (ru) Средство для коррекции митохондриальной дисфункции
EP3377095B1 (en) Methods and pharmaceutical compositions for treating rhabdomyolysis
Lang et al. Impact of ambient temperature on inflammation-induced encephalopathy in endotoxemic mice—role of phosphoinositide 3-kinase gamma
Harun et al. Effects of Toxoplasma gondii infection on the function and integrity of human cerebrovascular endothelial cells and the influence of verapamil treatment in vitro
Chen et al. Trpm2 deficiency in microglia attenuates neuroinflammation during epileptogenesis by upregulating autophagy via the AMPK/mTOR pathway
JP6281831B2 (ja) 神経変性疾患の制御因子
US10031128B2 (en) Screening method, screening kit and analysis program
CN103667457B (zh) 检测白血病BCR/ABL b3a2，b2a2融合基因相对表达量的引物和方法
Gao et al. Infection with Trypanosoma lewisi or Trypanosoma musculi may promote the spread of Toxoplasma gondii
van Ebbenhorst Tengbergen The morphology of the mouse anterior pituitary during the oestrous cycle
RU2310196C2 (ru) Способ определения функциональной активности симпато-адреналовой системы
KR20230080367A (ko) 백혈구 핵 선택적 염색을 위한 시약 및 이를 이용한 염색 방법
CN118150536A (zh) 脊髓背角线粒体膜电位检测方法
ATHANASOPOULOS et al. Studies on the use of new methods in view of the early diagnosis of fish diseases.
Cossarizza et al. Mitochondria Functionality During HIV Infection

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 22842551

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 202393401

Country of ref document: EA

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 202280045462.8

Country of ref document: CN

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2022842551

Country of ref document: EP

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 2022842551

Country of ref document: EP

Effective date: 20240212