WO2023282573A1 - 클로스트리디움 보툴리눔 독소 복합체 단백질의 정제방법 - Google Patents

클로스트리디움 보툴리눔 독소 복합체 단백질의 정제방법 Download PDF

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WO2023282573A1
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botulinum toxin
clostridium botulinum
complex protein
column
toxin complex
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백승걸
김형건
김정한
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주식회사 파마리서치바이오
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    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Definitions

  • the present invention relates to a method for purifying Clostridium botulinum toxin complex protein.
  • Botulinum toxin is a type of neurotoxin protein produced by bacteria such as Clostridium botulinum. It attaches irreversibly to presynaptic nerve terminals and blocks muscle contraction by inhibiting the secretion of acetylcholine at the nerve junction. It acts as a secondary muscle relaxant. Due to this function, botulinum toxin has been used for therapeutic or cosmetic purposes since approval by the US FDA in 1989 (KR 10-2010-0107475 A, KR 10-2008-0049152 A, etc.).
  • neuromuscular diseases such as strabismus, torticollis or blepharospasm
  • cosmetic purposes removing wrinkles, frown lines, treating square jaws, treating hyperhidrosis or migraine. It is used as an injection in Cases such as dysphagia, voice change, dry mouth, and blurred vision have been reported as side effects, but there have been no direct deaths caused by botulinum toxin yet, so it is very effective when used appropriately. It is considered a safe drug.
  • botulinum toxin naturally consists of a complex bound with several non-toxic proteins.
  • the present inventors intend to provide an improved purification method for isolating a stable and biologically active botulinum toxin complex protein.
  • An object of the present invention is to provide a method for purifying Clostridium botulinum toxin complex protein.
  • a high-purity botulinum toxin complex protein can be obtained economically and efficiently.
  • FIG. 1 shows the results of SDS-PAGE, that is, sodium dodecylsulfate polyacrylamide gel electrophoresis, of purified botulinum toxin complex protein (900 kD) (NTNH: non-toxic non-hemagglutinin, HC : heavy chain of neurotoxin protein, LC: light chain of neurotoxin protein, HA33: hemagglutinin 33, HA17: hemagglutinin 17, HA50: hemagglutinin 50, HA20: hemagglutinin 20).
  • NTNH non-toxic non-hemagglutinin
  • HC heavy chain of neurotoxin protein
  • LC light chain of neurotoxin protein
  • HA33 hemagglutinin 33
  • HA17 hemagglutinin 17
  • HA50 hemagglutinin 50
  • HA20 hemagglutinin 20
  • One aspect of the present invention provides a method for purifying Clostridium botulinum toxin complex protein.
  • the purification method a solution containing Clostridium botulinum toxin complex protein separated from the culture medium,
  • step (b) separating the toxin captured in step (a) to obtain an eluent containing the toxin;
  • step (c) loading the eluate obtained in step (b) onto a secondary hydrophobic interaction column to capture the toxin and pass impurities through;
  • step (d) separating the toxin captured in step (c) to obtain an eluate containing the toxin;
  • step (e) performing size exclusion chromatography using the eluent obtained in step (d).
  • Clostridium botulinum toxin is also referred to as “Botulinum toxin”, and is a kind of protein derived from Clostridium botulinum , which irreversibly attaches to presynaptic nerve terminals and causes nerve damage. By inhibiting the secretion of acetylcholine at the junction, it refers to a protein that blocks muscle contraction and secondarily acts to show the muscle relaxation effect.
  • the botulinum toxin protein has a molecular weight of about 150 kD and is divided into 7 types from A to G according to serological characteristics.
  • Botulinum toxin type A is the most lethal natural substance known to humans and besides serotype A, there are six other generally immunologically distinct botulinum toxins, namely botulinum toxin serotypes B, C, D, E, F, and G. has been identified
  • the different serotypes can be identified by neutralization with type-specific antibodies, and differ in the severity of the paralysis they cause and the animal species they most affect.
  • botulinum toxin is released by clostridial bacteria as a complex comprising a 150 kD botulinum toxin protein molecule along with related non-toxin proteins. Therefore, the botulinum toxin type A complex can be produced by clostridial bacteria in the 900 kD, 500 kD and 300 kD forms.
  • Botulinum toxin types B and C can be produced as 500 kD complexes, and botulinum toxin type D as 300 kD and 500 kD complexes.
  • Botulinum toxin types E and F can be produced as complexes of about 300 kD. These complexes (ie those with a molecular weight greater than about 150 kD) are believed to include non-toxic hemagglutinin proteins and non-toxin and non-toxic hemagglutinin proteins.
  • Botulinum toxin proteins include a pure neurotoxin component of about 150 kD as well as a high molecular weight complex containing non-toxin proteins.
  • the complexed form may comprise a botulinum neurotoxin protein and one or more non-toxin hemagglutinin proteins and/or one or more non-toxin non-hemagglutinin proteins.
  • the botulinum toxin complex protein may be a complex of botulinum neurotoxin (BoNT), nontoxic nonhemagglutinin (NTNH), and hemagglutinin (HA) proteins.
  • the molecular weight of the complex may be greater than about 150 kD.
  • a complexed form of botulinum toxin type A may have a molecular weight of about 900 kD, about 500 kD or about 300 kD.
  • the purification method of the Clostridium botulinum toxin complex of the present invention can purify the various complexes.
  • the botulinum toxin of the present invention may be a type A toxin.
  • the botulinum toxin of the present invention may be in the form of a complex bound with a non-toxic protein.
  • the botulinum toxin complex protein of the present invention may be a complex of botulinum toxin (BoNT), nontoxic nonhemagglutinin (NTNH), and hemagglutinin (HA) proteins.
  • the botulinum toxin complex protein of the present invention may be a complex of BoNT, NTNH, hemagglutinin 70 (HA70), hemagglutinin 33 (HA33), and hemagglutinin 17 (HA17).
  • the HA70 is divided into HA20 (hemagglutinin 20) and HA50 (hemagglutinin 50), or the BoNT may be divided into about 50 kD light chain (LC: light chain) and about 100 kD heavy chain (HC: heavy chain). .
  • LC light chain
  • HC heavy chain
  • the botulinum toxin complex protein of the present invention may have a molecular weight greater than 150 kD. Specifically, it may have a molecular weight of about 250 kD to 1400 kD, and more specifically, it may have a molecular weight of 280 kD to 1300 kD, 300 kD to 1200 kD, 700 kD to 1100 kD, 800 kD to 1000 kD, or about 900 kD, but is not limited thereto.
  • the term “about” includes not only the exact number described after the term, but also a range that is or is close to the number. It can be determined whether the number is close to or nearly the specific number mentioned, given the context in which it is presented. As an example, the term “about” can refer to a range of -10% to +10% of a numerical value. As another example, the term “about” can refer to a range of -5% to +5% of a given numerical value. However, it is not limited thereto.
  • the Clostridium botulinum toxin complex protein of the present invention may be obtained from a Clostridium botulinum culture medium. Specifically, the protein may be isolated from Clostridium botulinum culture medium.
  • a step of culturing Clostridium botulinum may be further included, but is not limited thereto.
  • the Clostridium botulinum strain may be cultured according to an appropriate medium and culture conditions known in the art. Specifically, Clostridium botulinum strains can be cultured in a normal medium containing appropriate carbon sources, nitrogen sources, phosphorus, inorganic compounds, etc., while controlling temperature, pH, etc. under anaerobic conditions.
  • the culture may be about 25 ° C to 40 ° C, specifically 27 ° C to 40 ° C under anaerobic conditions, but is not limited thereto.
  • the culturing period may be continued until a desired production amount of toxin protein is obtained, specifically, about 12 to 150 hours, but is not limited thereto.
  • the solution containing the Clostridium botulinum toxin complex protein of the present invention may be precipitated prior to the first hydrophobic chromatography step.
  • the precipitation may be acid precipitation, but is not limited thereto.
  • the acid precipitation may include adding an acid to pH 3.0 to pH 4.0, specifically pH 3.3 to 3.5, and more specifically pH 3.4 to 3.5.
  • an acidic solution known in the art for example, sulfuric acid or hydrochloric acid, may be used, but is not limited thereto.
  • the solution containing the Clostridium botulinum toxin complex protein of the present invention may be filtered prior to the first hydrophobic chromatography step. Specifically, the solution may be filtered after acid precipitation.
  • the filtration step may be performed by a conventionally known process such as microfiltration, ultrafiltration, microfiltration, or deep filtration, and impurities may be removed in the filtration step.
  • the device used in the filtration treatment may include a filter having a pore size of about 0.1 ⁇ m to about 0.3 ⁇ m, specifically about 0.2 ⁇ m. However, it is not limited thereto.
  • the purification method of the present invention comprises the steps of (a) loading a solution containing Clostridium botulinum toxin complex protein onto a primary hydrophobic interaction column to capture the toxin and pass impurities through; and (b) isolating the toxin captured in step (a) to obtain an eluent containing the toxin by first hydrophobic interaction using a solution containing Clostridium botulinum toxin complex protein. It may be referred to as a step of performing hydrophobic interaction chromatography, but is not limited thereto.
  • chromatography refers to any process of separating components of a mixture by passing a mixture through a medium such that the components of the mixture pass through the medium at different rates.
  • Chromatography of the present invention includes column chromatography, planar chromatography, thin layer chromatography, gas chromatography, liquid chromatography, fast protein liquid chromatography (FPLC), and high performance liquid chromatography (HPLC). Exemplary types of chromatographic processes or apparatuses are disclosed for each step of the purification process of the present invention, which are applicable to all types of chromatography described above.
  • hydrophobic chromatography or “hydrophobic interaction chromatography” is a method for separating molecules based on the relative strength of their hydrophobic interaction with a non-polar stationary phase.
  • Hydrophobic chromatography uses the principle that the higher the salt concentration, the stronger the interaction between the non-polar stationary phase and the substance to be separated, and the lower the ionic strength or salt concentration of the buffer solution, the weaker the interaction. Therefore, in the case of using a downward gradient of salt concentration, the less hydrophobic material is eluted first, and the more hydrophobic material is eluted later.
  • the hydrophobic interaction column contains ligands such as ether, isopropyl, butyl, octyl, and phenyl. You can use branched columns.
  • the hydrophobic interaction column may be a butyl sepharose column or a phenyl sepharose column. Specifically, the hydrophobic interaction column may be a phenyl sepharose column.
  • the hydrophobic interaction column includes butyl sepharose high performance (HP), butyl sepharose fast flow (Butyl sepharose fast flow), phenyl sepharose high performance (HP), and phenyl sepharose fast flow ( Phenyl sepharose Fast Flow) column, but is not limited thereto, and any column belonging to a hydrophobic interaction column may be used without limitation.
  • HP butyl sepharose high performance
  • Butyl sepharose fast flow butyl sepharose fast flow
  • HP phenyl sepharose high performance
  • Phenyl sepharose Fast Flow Phenyl sepharose Fast Flow
  • the step of equilibrating the column using a buffer may be further included.
  • equilibration may refer to a step of stabilizing a column with a buffer to prevent protein aggregation or loss of activity due to environmental changes before a protein to be purified is injected into the column.
  • conditions such as flow rate, temperature, time, and conductivity of flowing the buffer may be appropriately adjusted.
  • a phosphate buffer for example, a citrate buffer, or an acetate buffer may be used as the buffer.
  • the column buffer may be a phosphate buffer, for example sodium phosphate.
  • step (a) of the purification method of the present invention may be performed under pH 4 to pH 8 conditions, but is not limited thereto.
  • step (a) of the purification method of the present invention may be performed under a conductivity condition of about 170 to 220 mS/cm, but is not limited thereto.
  • conditions such as flow rate, temperature, and time for flowing the solution may be appropriately adjusted.
  • a phosphate buffer, a citrate buffer, or an acetate buffer may be used as the column buffer.
  • the column buffer may be a phosphate buffer, for example sodium phosphate.
  • the concentration of the column buffer may be adjusted to about 5 mM to 100 mM, for example, 25 mM to 75 mM, or 40 mM to 60 mM.
  • the flow rate of the mobile phase may be about 1.0 ml/min to 20.0 ml/min. However, it is not limited thereto.
  • an appropriate elution solvent may be used in the step of obtaining an elution solution containing the toxin complex protein in step (b).
  • the step (b) may use a concentration gradient.
  • toxin complex proteins can be eluted using a stepwise salt gradient or a continuous salt gradient.
  • Step (b) may include decreasing the ionic strength or increasing the pH.
  • the hydrophobic portion of the protein adsorbed on the stationary phase can be desorbed to the mobile phase by, for example, initiating an inverse salt gradient to decrease the salt concentration.
  • a decreasing concentration gradient (descending gradient) of the buffer may be used.
  • a buffer having a concentration gradient ranging from about 5.0 M to about 0.0 M, about 4.0 to about 0.0 M, about 3.5 M to about 0.0 M, and about 3.0 M to about 0.0 M may be used.
  • the buffer may be, for example, sodium sulfate (Na 2 S0 4 ), sodium chloride (NaCl), potassium chloride (KCl), ammonium acetate (NH 4 OAc), and the like, and may specifically be sodium chloride (NaCl), but is not limited thereto. It may be appropriately selected and used from a range known in the art without.
  • the eluent obtained in step (b) of the purification method of the present invention may be precipitated prior to performing step (c).
  • the precipitation may be acid precipitation.
  • the acid precipitation may include adding an acid. Specifically, the acid precipitation may be adding ammonium sulfate to the eluent. More specifically, the acid precipitation may be adding ammonium sulfate to the eluent so that the final saturation is about 30 to 50%. For example, the concentration of ammonium sulfate at the degree of saturation may be about 19g/100ml to about 32g/100ml, but is not limited thereto.
  • the precipitated eluent may undergo an additional purification process, for example, filtration and/or centrifugation.
  • the precipitate obtained can be redissolved for further deduction processes.
  • the precipitate may be dissolved using a solution of pH 5.0 to 7.0, for example, a sodium phosphate buffer solution having a concentration of about 40 to 60 mM may be used, but is not limited thereto.
  • step (c) loading the eluent obtained in step (b) onto a secondary hydrophobic interaction column to capture the toxin and pass impurities through; and (d) isolating the toxin captured in step (c) to obtain an eluent containing the toxin by performing second hydrophobic interaction chromatography using the eluent obtained by performing the first chromatography. It can be referred to as a step to perform. Hydrophobic interaction chromatography is as described above.
  • the secondary hydrophobic interaction column is ether, isopropyl, butyl, octyl, phenyl, etc.
  • a column having a ligand can be used.
  • the hydrophobic interaction column may be a butyl sepharose column or a phenyl sepharose column.
  • the hydrophobic interaction column may be a phenyl sepharose column.
  • the hydrophobic interaction column includes butyl sepharose high performance (HP), butyl sepharose fast flow (Butyl sepharose fast flow), phenyl sepharose high performance (HP), and phenyl sepharose fast flow ( Phenyl sepharose Fast Flow) column, but is not limited thereto, and any column belonging to a hydrophobic interaction column may be used without limitation.
  • HP butyl sepharose high performance
  • Butyl sepharose fast flow butyl sepharose fast flow
  • HP phenyl sepharose high performance
  • Phenyl sepharose Fast Flow Phenyl sepharose Fast Flow
  • the step of equilibrating the column may be further included prior to step (c) of the purification method of the present invention.
  • the buffer for example, phosphate buffer, citrate buffer or acetate buffer may be used.
  • the column buffer may be a phosphate buffer, for example sodium phosphate.
  • the flow rate may be, for example, about 1.0 ml/min to 20.0 ml/min.
  • the conductivity may be, for example, about 130 to 170 mS/cm. However, it is not limited thereto.
  • step (c) of the purification method of the present invention may be performed under pH 4 to pH 8 conditions, but is not limited thereto.
  • step (c) of the purification method of the present invention may be performed under a conductivity condition of 130 to 170 mS/cm, but is not limited thereto.
  • conditions such as flow rate, temperature, and time for flowing the solution may be appropriately adjusted.
  • a phosphate buffer, a citrate buffer, or an acetate buffer may be used as the column buffer.
  • the column buffer may be a phosphate buffer, for example sodium phosphate.
  • the concentration of the column buffer may be adjusted to about 5 mM to 100 mM, for example, 25 mM to 75 mM, or 40 mM to 60 mM.
  • the flow rate of the mobile phase may be about 1.0 ml/min to 20.0 ml/min. However, it is not limited thereto.
  • an appropriate elution solvent in the step (d) of obtaining an eluent containing the toxin complex protein, an appropriate elution solvent may be used.
  • a concentration gradient may be used.
  • toxin complex proteins can be eluted using a stepwise salt gradient or a continuous salt gradient.
  • Step (d) may include decreasing the ionic strength or increasing the pH.
  • the hydrophobic portion of the protein adsorbed on the stationary phase can be desorbed to the mobile phase by, for example, initiating an inverse salt gradient to decrease the salt concentration.
  • a decreasing concentration gradient (downward gradient) of the buffer may be used.
  • a buffer having a concentration gradient ranging from about 2.5 M to about 0.0 M, about 2.3 M to about 0.0 M, about 2.1 M to about 0.0 M, or about 2.0 M to about 0.0 M may be used.
  • the buffer may be, for example, sodium sulfate (Na 2 S0 4 ), sodium chloride (NaCl), potassium chloride (KCl), ammonium acetate (NH 4 OAc), etc., and may be specifically sodium chloride (NaCl), but is not limited thereto. It may be appropriately selected and used from a range known in the art without.
  • the eluent obtained in step (d) of the purification method of the present invention may be precipitated prior to step (e).
  • the precipitation may be acid precipitation.
  • the acid precipitation may include adding an acid. Specifically, the acid precipitation may be adding ammonium sulfate to the eluent. More specifically, the acid precipitation may be adding ammonium sulfate to the eluent so that the final saturation is about 70 to 90%. For example, the concentration of ammonium sulfate at the degree of saturation may be about 47g/100ml to about 67g/100ml, but is not limited thereto.
  • the precipitated eluent may undergo an additional purification process, for example, filtration and/or centrifugation.
  • the precipitate obtained can be redissolved for further purification processes.
  • the precipitate may be dissolved using a solution of pH 5.0 to 7.0, for example, a sodium phosphate buffer solution having a concentration of about 10 to 30 mM may be used, but is not limited thereto.
  • components may be separated according to molecular size by (e) size exclusion chromatography (SEC).
  • SEC size exclusion chromatography
  • a botulinum toxin complex protein having a specific size can be isolated from step (e).
  • size exclusion chromatography means to separate a mixture based on the rate at which solutes of various sizes pass through a porous matrix (permeability).
  • the column that can be used for the size exclusion chromatography of the present invention is superdex, sephacryl, superose, sephadex, sepharose, polyacrylic
  • a polyacrylamide or silica-based column may be used, specifically a Superose column, more specifically a Superose-6 column, but it is not limited as long as it can separate the desired botulinum toxin complex protein.
  • a phosphate buffer, a citrate buffer, or an acetate buffer may be used as the column buffer for the size exclusion chromatography.
  • the column buffer may be a phosphate buffer, for example sodium phosphate.
  • the concentration of the column buffer may be adjusted to about 5 mM to 100 mM, for example, 5 mM to 50 mM, or 10 mM to 30 mM.
  • a buffer solution having a pH of 5 to 7 may be used as the buffer solution.
  • the flow rate may be about 0.001 ml/min to 10.0 ml/min or about 0.05 ml/min to 0.5 ml/min. However, it is not limited thereto.
  • botulinum toxin complex proteins of 250 kD to 1400 kD may be separated through the size exclusion chromatography step of the present invention, but is not limited thereto.
  • the botulinum toxin complex protein isolated according to the purification method of the present invention can have high purity. Specifically, it may have a purity of about 90% or more, about 95% or more, about 96% or more, about 97% or more, about 97.5% or more, or about 98% or more, but is not limited thereto.
  • Example 1 Cultivation of botulinum bacteria and isolation of toxin
  • Clostridium botulinum stored at -80 ° C was thawed, put in a seed culture medium, and cultured for 24 hours at 37 ° C anaerobic conditions to increase the number of bacteria. After putting the culture solution with the increased number of bacteria into the main culture solution and further culturing for 92 to 100 hours under 35 °C anaerobic conditions, virus inactivation was performed through acid precipitation to pH 3.4. Upon completion of the precipitation, the botulinum toxin was eluted with a buffer and then filtered through a sterilized 0.2 ⁇ m filter without external contact.
  • the filtered solution containing the botulinum type A toxin of Example 1 was loaded onto a column filled with Phenyl Sepharose hydrophobic interaction chromatography resin. Equilibration/washing was performed by flowing the equilibration/elution buffer (50 mM sodium phosphate, 3M sodium chloride, pH 6.0) before loading at a flow rate of 5 ml/min and a conductivity of 188 mS/cm.
  • equilibration/elution buffer 50 mM sodium phosphate, 3M sodium chloride, pH 6.0
  • the salt step change was reduced with a buffer of 50 mM sodium phosphate, pH 6.0 under conditions of a flow rate of 5 ml/min and a conductivity of 188 mS/cm. (3.0M-0.0M sodium chloride gradient) was used to elute the botulinum toxin from the column.
  • Ammonium sulfate was added to the eluent collected by the method of Example 2-1 to a final saturation of 40% (24.3 g/100 ml) to precipitate, and then centrifuged to obtain a precipitate.
  • the toxin protein was in contact with the inner surface of the sterile container, and contact with the outside did not occur.
  • 50 mM sodium phosphate buffer (pH 6.0) secondary hydrophobic interaction chromatography was performed.
  • Example 2-2 The re-dissolved solution of Example 2-2 was centrifuged to separate the supernatant, and the separated supernatant was subjected to FPLC (fast protein liquid chromatography, Fast Protein Liquid Chromatography).
  • FPLC fast protein liquid chromatography, Fast Protein Liquid Chromatography
  • an equilibration buffer 50 mM sodium phosphate, 2 M sodium chloride, pH 6.0
  • the toxin-containing buffer 50 mM sodium phosphate, 2 M sodium chloride buffer, pH 6.0
  • the injection step was performed and the flow through (FT) liquid was collected in a sterile vessel while the toxin complex was bound to the hydrophobic interaction column material.
  • FT flow through
  • Ammonium sulfate was added to the eluent collected by the method of Example 2-3 so that the final saturation was 80% (56.1 g/100 ml) to precipitate, and then centrifuged to obtain a precipitate.
  • the toxin protein was in contact with the inner surface of the sterile container, and contact with the outside did not occur.
  • size exclusion chromatography was performed.
  • the re-dissolved solution of Examples 2-4 was centrifuged to separate the supernatant, and the separated supernatant was subjected to FPLC (fast protein liquid chromatography) connected to a Superose-6 size exclusion chromatography column. ) was loaded. Before loading, the column was equilibrated by flowing equilibration/elution buffer (20 mM sodium phosphate, pH 6.0) at a flow rate of 0.2 ml/min. After equilibration, 100 mL of 20 mM sodium phosphate buffer at pH 6.0 was flowed, and fractions of the eluted peak were sequentially obtained to separate samples containing proteins of about 900 kDa in size.
  • equilibration/elution buffer (20 mM sodium phosphate, pH 6.0
  • SDS Sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis
  • a 50 mM sodium phosphate solution containing 250 mM NaCl at pH 6.0 was used, the HPLC column was connected, and 20 ⁇ g of botulinum type A toxin protein obtained in Example 2 was loaded to obtain 0.4 mL. /min for 60 minutes.
  • botulinum toxin complex protein (about 900 kD) such as botulinum toxin type A can be obtained in high purity without impurities.

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Abstract

본 발명은 클로스트리디움 보툴리눔 독소 복합체 단백질의 정제방법에 관한 것이다.

Description

클로스트리디움 보툴리눔 독소 복합체 단백질의 정제방법
본 발명은 클로스트리디움 보툴리눔 독소 복합체 단백질의 정제방법에 관한 것이다.
보툴리눔 독소는 클로스트리디움 보툴리눔(Clostridium botulinum)과 같은 박테리아에 의해서 생산되는 신경독소 단백질의 일종으로, 시냅스전 신경말단에 비가역적으로 부착하여 신경접합부에 아세틸콜린의 분비를 억제함으로써 근육의 수축을 차단하여 이차적으로 근육의 이완효과를 나타내는 작용을 한다. 이러한 기능으로, 보툴리눔 독소는 1989년 미국 FDA 승인 이후, 치료 또는 미용 목적으로 사용되고 있다(KR 10-2010-0107475 A, KR 10-2008-0049152 A 등).
치료 목적으로는 사시 (strabismus), 사경(torticollis) 또는 안면 경련(blepharospasm)과 같은 신경근육질환에, 미용 목적으로는 주름, 찌푸린 주름 제거 및 사각턱 치료, 다한증(hyperhidrosis) 또는 편두통(migraine) 치료에 주사제로 사용되고 있다. 부작용으로는 연하곤란(dysphagia), 목소리 변화(voice change), 구강건조 (dry mouth) 및 몽롱 (blurred vision) 등과 같은 사례들이 보고되었으나, 아직 보툴리눔 독소로 인한 직접적인 사망사고가 없어 적절하게 사용하면 매우 안전한 약품으로 평가받고 있다.
한편 보툴리눔 독소는, 자연적으로는 여러 비독성 단백질들과 결합되어 있는 복합체로 이루어져 있다.
본 발명자들은 안정하고 생물학적으로 활성을 나타내는 보툴리눔 독소 복합체 단백질을 분리하기 위한 개선된 정제방법을 제공하고자 한다.
본 발명의 목적은 클로스트리디움 보툴리눔 독소 복합체 단백질의 정제방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 정제 방법을 사용함으로써 경제적이고 효율적으로 고순도 보툴리눔 독소 복합체 단백질을 수득할 수 있다.
도 1은 정제된 보툴리눔 독소 복합체 단백질 (900kD)의 SDS-PAGE 즉, 소디움 도데실설페이트 폴리아크릴아미드 겔 전기영동(sodium dodecylsulfate polyacrylamide gel electrophoresis) 결과를 나타낸 것이다(NTNH: 비독성 비헤마글루티닌, HC: 신경독소 단백질의 중쇄, LC: 신경독소 단백질의 경쇄, HA33: 헤마글루티닌 33, HA17: 헤마글루티닌 17, HA50: 헤마글루티닌 50, HA20: 헤마글루티닌 20).
도 2는 정제된 900kD의 보툴리눔 독소 복합체의 HPLC 즉, 크기 배제 크로마토그래피(size exclusion chromatography: SEC-HPLC) 결과를 나타낸 것이다.
이를 구체적으로 설명하면 다음과 같다. 한편, 본 발명에서 개시된 각각의 설명 및 실시형태는 각각의 다른 설명 및 실시 형태에도 적용될 수 있다. 즉, 본 발명에서 개시된 다양한 요소들의 모든 조합이 본 발명의 범주에 속한다. 또한, 하기 기술된 구체적인 서술에 의하여 본 발명의 범주가 제한된다고 볼 수 없다.
또한, 당해 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 통상의 실험만을 사용하여 본 발명에 기재된 본 발명의 특정 양태에 대한 다수의 등가물을 인지하거나 확인할 수 있다. 또한, 이러한 등가물은 본 발명에 포함되는 것으로 의도된다.
본 발명의 하나의 양태는 클로스트리디움 보툴리눔 독소 복합체 단백질의 정제방법을 제공한다.
구체적으로, 상기 정제방법은, 배양액으로부터 분리된 클로스트리디움 보툴리눔 (Clostridium botulinum) 독소 복합체 단백질을 포함하는 용액을,
(a) 1차 소수성 상호작용 컬럼에 로딩하여, 상기 독소를 포획하고 불순물을 통과시키는 단계;
(b) 상기 (a) 단계에서 포획된 독소를 분리하여, 상기 독소를 포함하는 용리액을 수득하는 단계;
(c) 상기 (b) 단계에서 수득한 용리액을 2차 소수성 상호작용 컬럼에 로딩하여, 상기 독소를 포획하고 불순물을 통과시키는 단계;
(d) 상기 (c) 단계에서 포획된 독소를 분리하여, 상기 독소를 포함하는 용리액을 수득하는 단계; 및
(e) 상기 (d) 단계에서 수득한 용리액을 이용하여 크기배제 크로마토그래피를 수행하는 단계를 포함할 수 있다.
본 발명에서 "(a), (b), (c), (d)…"와 같은 단계 사이에는 시간적인 간격이 없거나, 동시에 수행되거나, 수 초, 수 분, 수 시간 등 임의의 간격을 두고 수행될 수 있다.
본 발명에서, 용어 "클로스트리디움 보툴리눔 독소" 는 "보툴리눔 독소(Botulinum toxin)" 로도 지칭되며, 클로스트리디움 보툴리눔(Clostridium botulinum) 유래 단백질의 일종으로, 시냅스전 신경말단에 비가역적으로 부착하여 신경접합부에 아세틸콜린의 분비를 억제함으로써 근육의 수축을 차단하여 이차적으로 근육의 이완효과를 나타내는 작용을 하는 단백질을 지칭한다.
보툴리눔 독소 단백질은 약 150kD의 분자량을 가지며, 혈청학적 특징에 따라 A에서 G까지의 7가지 형으로 나뉜다. 보툴리눔 독소 A형은 인간에 대해서 알려진 가장 치명적인 천연물질이며 혈청형 A 이외에도, 6 가지의 다른 일반적으로 면역학적으로 상이한 보툴리눔 독소, 즉 보툴리눔 독소 혈청형 B, C, D, E, F, 및 G가 규명되었다. 상이한 혈청형은 형-특이적 항체에 의한 중화에 의해서 식별될 수 있으며, 이들이 유발하는 마비의 중증도 및 이들이 가장 영향을 미치는 동물 종은 상이하다.
보툴리눔 독소 단백질 분자의 분자량은, 알려진 보툴리눔 독소 혈청형 7가지 모두에서, 약 150kD이다. 한편, 클로스트리디움계 박테리아에 의해서 보툴리눔 독소는 관련된 비-독소 단백질과 함께 150kD 보툴리눔 독소 단백질 분자를 포함하는 복합체로서 방출된다. 그러므로, 보툴리눔 독소 타입 A 복합체는 클로스트리디움계 박테리아에 의해서, 900kD, 500kD 및 300kD 형으로 생성될 수 있다. 보툴리눔 독소 타입 B 및 C는 500kD 복합체로, 보툴리눔 독소 타입 D는 300kD 및 500kD 복합체로 생성될 수 있다. 보툴리눔 독소 타입 E 및 F는 약 300kD 복합체로 생성될 수 있다. 이 복합체들(즉, 분자량이 약 150kD 보다 큰 것)은 비독성 적혈구응집소 단백질 및 비-독소 및 비독성 비적혈구응집소 단백질을 포함하는 것으로 여겨진다.
보툴리눔 독소 단백질은 약 150 kD의 순수 신경독소 성분과 아울러 비-독소 단백질을 포함하는 고분자량의 복합체 형태를 포함한다. 따라서, 복합체화된 형태는 보툴리눔 신경독소 단백질 및 하나 또는 그 이상의 비-독소 헤마글루티닌 단백질 및/또는 하나 또는 그 이상의 비-독소 비-헤마글루티닌 단백질을 포함할 수 있다. 구체적으로, 보툴리눔 독소 복합체 단백질은 보툴리눔 신경독소(BoNT; Botulinum neurotoxin), 비독성 비헤마글루티닌(NTNH; nontoxic nonhemagglutinin), 및 헤마글루티닌(HA) 단백질의 복합체일 수 있다. 상기 복합체의 분자량은 약 150 kD보다 클 수 있다. 예를 들어, 보툴리눔 독소 A형의 복합체화된 형태는 약 900 kD, 약 500 kD 또는 약 300 kD의 분자량을 가질 수 있다. 본 발명의 클로스트리디움 보툴리눔 독소 복합체의 정제 방법은 상기 다양한 복합체를 정제할 수 있다.
일 구현예로, 본 발명의 보툴리눔 독소는 A형 독소일 수 있다.
전술한 구현예 중의 어느 하나의 구현예로, 본 발명의 보툴리눔 독소는 비독성 단백질과 결합한 복합체 형태일 수 있다. 구체적으로, 본 발명의 보툴리눔 독소 복합체 단백질은 보툴리눔 독소(BoNT; Botulinum neurotoxin), 비독성 비헤마글루티닌(NTNH; nontoxic nonhemagglutinin), 및 헤마글루티닌(HA: hemagglutinin) 단백질의 복합체일 수 있다. 보다 구체적으로, 본 발명의 보툴리눔 독소 복합체 단백질은 BoNT, NTNH, HA70(hemagglutinin 70), HA33(hemagglutinin 33) 및 HA17(hemagglutinin 17)의 복합체일 수 있다. 보다 구체적으로 상기 HA70은 HA20(hemagglutinin 20)와 HA50(hemagglutinin 50)으로 나누어지거나, 상기 BoNT는 약 50 kD 경쇄(LC: Light chain)와 약 100 kD 중쇄(HC: Heavy chain)로 나누어질 수 있다. 그러나 이에 제한되지 않는다.
전술한 구현예 중의 어느 하나의 구현예로, 본 발명의 보툴리눔 독소 복합체 단백질은 150kD 초과의 분자량을 갖는 것일 수 있다. 구체적으로 약 250 kD 내지 1400 kD의 분자량을 가질 수 있으며, 보다 구체적으로 280kD 내지 1300kD, 300kD 내지 1200kD, 700kD 내지 1100kD, 800kD 내지 1000kD, 또는 약 900kD의 분자량을 가질 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.
본 발명에서, 용어"약(about)"은 용어 뒤에 기재되는 정확한 숫자뿐만 아니라, 거의 그 숫자이거나 그 숫자에 가까운 범위까지 포함한다. 그 숫자가 제시된 문맥을 고려하여, 언급된 구체적인 숫자와 가깝거나 거의 그 숫자인지 여부를 결정할 수 있다. 일 예로, 용어 "약"은 숫자 값의 -10% 내지 +10% 범위를 지칭할 수 있다. 다른 예로, 용어 "약"은 주어진 숫자 값의 -5% 내지 +5% 범위를 지칭할 수 있다. 그러나 이에 제한되지 않는다.
전술한 구현예 중의 어느 하나의 구현예로, 본 발명의 클로스트리디움 보툴리눔 (Clostridium botulinum) 독소 복합체 단백질은 클로스트리디움 보툴리눔 (Clostridium botulinum) 배양액으로부터 수득한 것일 수 있다. 구체적으로, 상기 단백질은 클로스트리디움 보툴리눔 (Clostridium botulinum) 배양액으로부터 분리한 것일 수 있다.
따라서, 본 발명의 정제 방법에 있어서, 정제를 위한 크로마토그래피 단계 이전에, 클로스트리디움 보툴리눔 (Clostridium botulinum)을 배양하는 단계를 더 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 배양 단계에 있어서, 클로스트리디움 보툴리눔 균주의 배양은 당업계에 알려진 적당한 배지와 배양조건에 따라 이루어질 수 있다. 구체적으로 클로스트리디움 보툴리눔 균주는 적당한 탄소원, 질소원, 인원, 무기화합물 등을 함유한 통상의 배지 내에서, 혐기성 조건 하에서 온도, pH 등을 조절하면서 배양할 수 있다.
예를 들어, 배양은 혐기 조건에서 약 25℃ 내지 40℃, 구체적으로는 27℃ 내지 40℃일 수 있으나 이에 제한되지 않는다. 배양 기간은 독소 단백질의 원하는 생성량이 수득될 때까지 계속될 수 있으며, 구체적으로는 약 12 내지 150시간 동안 이루어질 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.
전술한 구현예 중의 어느 하나의 구현예로, 본 발명의 클로스트리디움 보툴리눔 (Clostridium botulinum) 독소 복합체 단백질을 포함하는 용액은 1차 소수성 크로마토그래피 단계 이전에 침전 처리된 것일 수 있다.
일 구현예로, 상기 침전은 산(acid) 침전일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 그 예로, 상기 산 침전은 pH 3.0 내지 pH 4.0, 구체적으로 pH 3.3 내지 3.5, 보다 구체적으로 pH 3.4 내지 3.5가 되도록 산(acid)을 첨가하는 것을 포함할 수 있다. 상기 산 침전에는 당업계에 공지된 산성 용액, 예를 들어 황산 또는 염산 등을 이용할 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.
전술한 구현예 중의 어느 하나의 구현예로, 본 발명의 클로스트리디움 보툴리눔 (Clostridium botulinum) 독소 복합체 단백질을 포함하는 용액은 1차 소수성 크로마토그래피 단계 이전에 여과 처리된 것일 수 있다. 구체적으로, 상기 용액은 산 침전 후 여과 처리되는 것일 수 있다.
상기 여과(filtration) 단계는 종래의 공지된 미세여과, 한외여과, 정밀여과, 심층여과 등의 공정으로 진행될 수 있으며, 여과 단계에서 불순물이 제거될 수 있다.
일 구현예로, 상기 여과 처리에서 사용하는 장치는 약 0.1 ㎛ 내지 0.3 ㎛, 구체적으로 약 0.2 ㎛의 공극 크기를 가지는 필터를 포함할 수 있다. 그러나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 정제 방법에 있어서, 클로스트리디움 보툴리눔 (Clostridium botulinum) 독소 복합체 단백질을 포함하는 용액을 (a) 1차 소수성 상호작용 컬럼에 로딩하여, 상기 독소를 포획하고 불순물을 통과시키는 단계; 및 (b) 상기 (a) 단계에서 포획된 독소를 분리하여, 상기 독소를 포함하는 용리액을 수득하는 단계는, 클로스트리디움 보툴리눔 (Clostridium botulinum) 독소 복합체 단백질을 포함하는 용액을 이용해 1차 소수성 상호작용 크로마토그래피(Hydrophobic interaction chromatography)를 수행하는 단계로 칭해질 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에서 "크로마토그래피"는, 혼합물의 성분이 상이한 속도로 매질을 통하여 통과되도록 혼합물을 매질을 통하여 통과시켜 혼합물의 성분을 분리하는 임의의 프로세스를 지칭한다.
본 발명의 크로마토그래피는 컬럼 크로마토그래피, 플래너(planar) 크로마토그래피, 박층 크로마토그래피, 가스 크로마토그래피, 액체 크로마토그래피, 신속 단백질 액체 크로마토그래피(FPLC), 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC) 를 포함한다. 본 발명의 정제공정의 각 단계에서 예시적인 타입의 크로마토그래피 공정 또는 장치에 대해 개시하며, 이는 전술한 모든 타입의 크로마토그래피에 대해 적용할 수 있다.
본 발명에서, "소수성 크로마토그래피"또는 "소수성 상호작용 크로마토그래피"는 비극성 정지상과의 소수성 상호반응의 상대 강도에 기초하여 분자를 분리하는 방법이다. 소수성 크로마토그래피는 염 농도가 높을수록 비극성 정지상과 분리하고자 하는 물질 간의 상호작용이 강하게 일어나고, 완충액의 이온 강도 또는 염 농도가 낮아질수록 상호작용이 약해지는 원리를 이용한다. 따라서 염 농도의 하향 구배를 이용하는 경우 소수성이 작은 물질일수록 먼저 용출되고, 소수성이 강한 물질일수록 나중에 용출될 수 있다.
일 구현예로, 본 발명의 정제 방법의 (a)단계에서 소수성 상호작용 컬럼은 에터(ether), 아이소프로필(isopropyl), 부틸(butyl), 옥틸(octyl), 페닐(phenyl) 등의 리간드를 가지는 컬럼을 사용할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 정제 방법의 (a)단계에서 소수성 상호작용 컬럼은 부틸 세파로스 또는 페닐 세파로스 컬럼일 수 있다. 구체적으로, 상기 소수성 상호작용 컬럼은 페닐 세파로스 컬럼일 수 있다. 보다 구체적으로 상기 소수성 상호작용 컬럼은 부틸 세파로스 HP(butyl sepharose high performance), 부틸 세파로스 고속 유동(Butyl sepharose Fast Flow), 페닐 세파로스 HP(Phenyl sepharose high performance), 및 페닐 세파로스 고속 유동(Phenyl sepharose Fast Flow) 컬럼으로 구성된 군에서 선택되는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않고 소수성 상호작용 컬럼에 속하는 것이면 제한 없이 사용할 수 있다.
전술한 구현예 중의 어느 하나의 구현예로, 본 발명의 정제 방법의 (a) 단계 이전에, 완충액을 이용해 컬럼을 평형화하는 단계를 더 포함할 수 있다.
본 발명에서 평형화(equilibration)는 정제하고자 하는 단백질이 컬럼에 주입되기 전에, 환경의 변화에 의해 단백질이 응집되거나 활성이 소실되는 것을 방지하기 위하여 완충액으로 컬럼을 안정화하는 단계를 지칭할 수 있다.
상기 (a) 단계 이전의 평형화 단계에서 완충액을 흘려주는 유속, 온도, 시간 및 전도도 등의 조건은 적절히 조절될 수 있다.
일 예로, 상기 완충액으로는 인산 완충액, 시트르산 완충액 또는 아세트산 완충액을 사용할 수 있다. 일 예로, 상기 컬럼 완충액은 인산 완충액일 수 있고, 예를 들어 인산나트륨일 수 있다.
일 예로, 상기 유속은 약 1.0㎖/분 내지 20.0㎖/분일 수 있다. 일 예로, 상기 전도도는 약 170 내지 220 mS/cm 일 수 있다. 그러나, 이에 제한되지 않는다.
전술한 구현예 중의 어느 하나의 구현예로, 본 발명의 정제 방법의 (a) 단계는 pH 4 내지 pH 8 조건하에 수행될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
전술한 구현예 중의 어느 하나의 구현예로, 본 발명의 정제 방법의 (a) 단계는 약 170 내지 220 mS/cm 전도도 조건하에 수행될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 (a) 및/또는 (b) 단계에서, 용액을 흘려주는 유속, 온도, 시간 등의 조건은 적절히 조절될 수 있다.
일 예로, 컬럼 완충액으로는 인산 완충액, 시트르산 완충액 또는 아세트산 완충액을 사용할 수 있다. 일 예로, 상기 컬럼 완충액은 인산 완충액일 수 있고, 예를 들어 인산나트륨일 수 있다. 일 예로, 컬럼 완충액의 농도는 약 5mM 내지 100 mM, 예를 들면, 25mM 내지 75 mM, 또는 40mM 내지 60 mM로 조절할 수 있다. 일 예로, 이동상의 유속은 약 1.0㎖/분 내지 20.0㎖/분일 수 있다. 그러나, 이에 제한되지 않는다.
전술한 구현예 중의 어느 하나의 구현예로, 상기 (b) 단계에서 독소 복합체 단백질을 포함하는 용리액을 수득하는 단계에 있어서, 적절한 용출 용매를 사용할 수 있다.
상기 (b) 단계는 농도구배(concentration gradient)를 이용할 수 있다. 예를 들어 단계식 염 구배 (stepwise salt gradient) 또는 연속식 염 구배 (continuous salt gradient)로 독소 복합체 단백질을 용출시킬 수 있다.
상기 (b) 단계는 이온 세기를 감소시키거나 pH를 증가시키는 것을 포함할 수 있다. 용리 단계에서는, 예를 들어, 역염 기울기를 시작하여 염농도를 감소시킴으로써 정지상에 흡착되어 있던 단백질의 소수성 부분이 이동상으로 탈착될 수 있다. 구체적으로, 상기 용리 단계에서는 완충제의 감소하는 농도 구배(하향 구배, descending gradient) 를 이용할 수 있다. 그 예로 약 5.0M 내지 약 0.0M, 약 4.0 내지 약 0.0M, 약 3.5M 내지 약 0.0M, 약 3.0M 내지 약 0.0M의 범위를 가지는 농도구배의 완충제를 사용할 수 있다. 상기 완충제는 예를 들어 황산나트륨 (Na2S04), 염화나트륨 (NaCl), 염화칼륨 (KCl), 암모늄 아세테이트 (NH4OAc) 등을 사용할 수 있고, 구체적으로 염화나트륨 (NaCl)일 수 있으나, 이에 제한되지 않고 당업계에 공지된 범위에서 적절하게 선택하여 사용할 수 있다.
전술한 구현예 중의 어느 하나의 구현예로, 본 발명의 정제 방법의 (b) 단계에서 수득한 용리액은 (c) 단계 수행 이전에 침전 처리할 수 있다. 예를 들어, 상기 침전은 산 침전(acid precipitation)일 수 있다.
상기 산 침전은 산(acid)을 첨가하는 것을 포함할 수 있다. 구체적으로, 상기 산 침전은 용리액에 황산암모늄을 첨가하는 것일 수 있다. 보다 구체적으로, 상기 산 침전은 용리액에 황산암모늄을 최종 포화도가 약 30 내지 50%가 되도록 첨가하는 것일 수 있다. 그 예로 상기 포화도에서 황산암모늄의 농도는 약 19g/100ml 내지 32g/100ml일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 침전 처리된 용리액은 추가적인 정제 공정을 거칠 수 있으며, 예를 들어 여과 및/또는 원심분리 등의 공정을 거칠 수 있다. 수득된 침전물은 추가적인 공제 공정을 위해 재용해될 수 있다. 예를 들어, 상기 침전물은 pH 5.0 내지 7.0의 용액을 이용해 용해될 수 있고, 그 예로 약 40 내지 60mM 농도의 인산나트륨 완충액을 사용할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 정제 방법에 있어서, (c) 상기 (b) 단계에서 수득한 용리액을 2차 소수성 상호작용 컬럼에 로딩하여, 상기 독소를 포획하고 불순물을 통과시키는 단계; 및 (d) 상기 (c) 단계에서 포획된 독소를 분리하여, 상기 독소를 포함하는 용리액을 수득하는 단계는, 1차 크로마토그래피를 수행하여 수득한 용리액을 이용하여 2차 소수성 상호작용 크로마토그래피를 수행하는 단계로 지칭할 수 있다. 소수성 상호작용 크로마토그래피에 대해서는 전술한 바와 같다.
일 구현예로, 본 발명의 정제 방법의 (c)단계에서 2차 소수성 상호작용 컬럼은 에터(ether), 아이소프로필(isopropyl), 부틸(butyl), 옥틸(octyl), 페닐(phenyl) 등의 리간드를 가지는 컬럼을 사용할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 정제 방법의 (c)단계에서 소수성 상호작용 컬럼은 부틸 세파로스 또는 페닐 세파로스 컬럼일 수 있다. 구체적으로, 상기 소수성 상호작용 컬럼은 페닐 세파로스 컬럼일 수 있다. 보다 구체적으로 상기 소수성 상호작용 컬럼은 부틸 세파로스 HP(butyl sepharose high performance), 부틸 세파로스 고속 유동(Butyl sepharose Fast Flow), 페닐 세파로스 HP(Phenyl sepharose high performance), 및 페닐 세파로스 고속 유동(Phenyl sepharose Fast Flow) 컬럼으로 구성된 군에서 선택되는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않고 소수성 상호작용 컬럼에 속하는 것이면 제한 없이 사용할 수 있다.
전술한 구현예 중의 어느 하나의 구현예로, 본 발명의 정제 방법의 (c) 단계에 앞서 컬럼을 평형화하는 단계를 더 포함할 수 있다.
상기 완충액은 예를 들어, 인산 완충액, 시트르산 완충액 또는 아세트산 완충액을 사용할 수 있다. 일 예로, 상기 컬럼 완충액은 인산 완충액일 수 있고, 예를 들어 인산나트륨일 수 있다.
상기 유속은 예를 들어, 약 1.0㎖/분 내지 20.0㎖/분일 수 있다. 상기 전도도는 예를 들어, 약 130 내지 170 mS/cm 일 수 있다. 그러나, 이에 제한되지 않는다.
전술한 구현예 중의 어느 하나의 구현예로, 본 발명의 정제 방법의 (c) 단계는 pH 4 내지 pH 8 조건하에 수행될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
전술한 구현예 중의 어느 하나의 구현예로, 본 발명의 정제 방법의 (c) 단계는 130 내지 170 mS/cm 전도도 조건하에 수행될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 (c) 및/또는 (d) 단계에서, 용액을 흘려주는 유속, 온도, 시간 등의 조건은 적절히 조절될 수 있다.
일 예로, 컬럼 완충액으로는 인산 완충액, 시트르산 완충액 또는 아세트산 완충액을 사용할 수 있다. 일 예로, 상기 컬럼 완충액은 인산 완충액일 수 있고, 예를 들어 인산나트륨일 수 있다. 일 예로, 컬럼 완충액의 농도는 약 5mM 내지 100 Mm, 예를 들면, 25mM 내지 75 mM, 또는 40mM 내지 60 mM로 조절할 수 있다. 일 예로, 이동상의 유속은 약 1.0㎖/분 내지 20.0㎖/분일 수 있다. 그러나, 이에 제한되지 않는다.
전술한 구현예 중의 어느 하나의 구현예로, 상기 (d) 단계에서 독소 복합체 단백질을 포함하는 용리액을 수득하는 단계에 있어서, 적절한 용출 용매를 사용할 수 있다.
상기 (d) 단계에서는, 농도구배(concentration gradient)를 이용할 수 있다. 예를 들어 단계식 염 구배 (stepwise salt gradient) 또는 연속식 염 구배 (continuous salt gradient)로 독소 복합체 단백질을 용출시킬 수 있다.
상기 (d) 단계는 이온 세기를 감소시키거나 pH를 증가시키는 것을 포함할 수 있다. 용리 단계에서는, 예를 들어, 역염 기울기를 시작하여 염농도를 감소시킴으로써 정지상에 흡착되어 있던 단백질의 소수성 부분이 이동상으로 탈착될 수 있다. 구체적으로, 상기 용리 단계에서는 완충제의 감소하는 농도 구배 (하향 구배)를 이용할 수 있다. 그 예로 약 2.5 M 내지 약 0.0M, 약 2.3 M 내지 약 0.0 M, 약 2.1 M 내지 약 0.0 M, 약 2.0 M 내지 약 0.0 M 의 범위를 가지는 농도구배의 완충제를 사용할 수 있다. 상기 완충제는 예를 들어 황산나트륨 (Na2S04), 염화나트륨 (NaCl), 염화칼륨 (KCl), 암모늄 아세테이트 (NH4OAc) 등을 사용할 수 있고, 구체적으로 염화나트륨(NaCl)일 수 있으나, 이에 제한되지 않고 당업계에 공지된 범위에서 적절하게 선택하여 사용할 수 있다.
전술한 구현예 중의 어느 하나의 구현예로, 본 발명의 정제 방법의 (d) 단계에서 수득한 용리액은 (e) 단계 수행 이전에 침전 처리할 수 있다. 예를 들어, 상기 침전은 산 침전(acid precipitation)일 수 있다.
상기 산 침전은 산(acid)을 첨가하는 것을 포함할 수 있다. 구체적으로, 상기 산 침전은 용리액에 황산암모늄을 첨가하는 것일 수 있다. 보다 구체적으로, 상기 산 침전은 용리액에 황산암모늄을 최종 포화도가 약 70 내지 90%가 되도록 첨가하는 것일 수 있다. 그 예로 상기 포화도에서 황산암모늄의 농도는 약 47g/100ml 내지 67g/100ml 일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 침전 처리된 용리액은 추가적인 정제 공정을 거칠 수 있으며, 예를 들어 여과 및/또는 원심분리 등의 공정을 거칠 수 있다. 수득된 침전물은 추가적인 정제 공정을 위해 재용해될 수 있다. 예를 들어, 상기 침전물은 pH 5.0 내지 7.0의 용액을 이용해 용해될 수 있고, 그 예로 약 10 내지 30mM 농도의 인산나트륨 완충액을 사용할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 정제 방법에 있어서, (e) 크기배제 크로마토그래피 (Size exclusion chromatography; SEC) 단계에 의해 분자 크기별로 성분이 분리될 수 있다. 예를 들어, 상기 (e) 단계로부터 특정 크기를 갖는 보툴리눔 독소 복합체 단백질을 분리할 수 있다. 본 발명에서 "크기 배제 크로마토그래피(size exclusion chromatography, SEC)"라 함은 다양한 크기의 용질이 다공성 매트릭스를 통과하는 속도(투과도)를 기반으로 혼합물을 분리하는 것을 의미한다. 크기 배제 크로마토그래피는 분석대상 시료를 젤, 매트릭스, 구슬(bead)과 같은 다공성 정지상(stationary phase)이 채워진 컬럼을 통과시키면, 컬럼의 구멍을 통과할 수 없는 큰 분자들은 구멍에 들어가지 못하고 주변의 빈 공간을 통해 빠르게 컬럼을 빠져 나오는 반면, 작은 분자들은 컬럼의 구멍을 통해 나오면서 상대적으로 천천히 이동하여 컬럼을 빠져 나오는 원리를 이용한 것일 수 있다.
일 구현예로, 본 발명의 크기배제 크로마토그래피에 사용할 수 있는 컬럼은 수퍼덱스 (superdex), 세파크릴 (sephacryl), 수퍼로스 (superose), 세파덱스 (sephadex), 세파로스(Sepharose), 폴리아크릴아마이드(polyacrylamide) 또는 실리카 기반(silica-based) 컬럼을 사용할 수 있고, 구체적으로 수퍼로스 컬럼, 보다 구체적으로는 수퍼로스-6일 수 있으나, 목적하는 보툴리눔 독소 복합체 단백질을 분리할 수 있는 것이면 제한되지 않는다.
일 예로, 상기 크기배제 크로마토그래피의 컬럼 완충액으로는 인산 완충액, 시트르산 완충액 또는 아세트산 완충액을 사용할 수 있다. 일 예로, 상기 컬럼 완충액은 인산 완충액일 수 있고, 예를 들어 인산나트륨일 수 있다. 일 예로, 컬럼 완충액의 농도는 약 5mM 내지 100 mM, 예를 들면, 5mM 내지 50 mM, 또는 10mM 내지 30 mM로 조절할 수 있다. 일 예로, 상기 완충액은 pH 5 내지 7의 완충액을 사용할 수 있다. 일 예로, 유속은 약 0.001㎖/분 내지 10.0㎖/분 또는 약 0.05㎖/분 내지 0.5㎖/분일 수 있다. 그러나, 이에 제한되지 않는다.
전술한 구현예 중의 어느 하나의 구현예로, 본 발명의 크기배제 크로마토그래피 단계를 통해 250kD 내지 1400kD의 보툴리눔 독소 복합체 단백질을 분리할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 정제 방법에 따라 분리된 보툴리눔 독소 복합체 단백질은 높은 순도를 가질 수 있다. 구체적으로, 약 90% 이상, 약 95% 이상, 약 96% 이상, 약 97% 이상, 약 97.5% 이상, 또는 약 98% 이상의 순도를 가질 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
이하 본 발명을 실시예 및 실험예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나 이들 실시예 및 실험예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예 및 실험예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. 보툴리눔 균의 배양 및 독소의 분리
-80℃에서 보관되어 있던 클로스트리디움 보툴리눔(clostridium botulinum)을 해동하여, 종 배양액에 넣고 37℃ 혐기 조건에서 24시간 동안 배양하여 균 수를 증가시켰다. 상기의 균 수가 증가된 배양액을 본 배양액에 넣고 35 ℃ 혐기 조건 하에서 92 내지 100 시간 동안 추가 배양한 후, pH 3.4가 되도록 산 침전을 통한 바이러스 불활화를 실시하였다. 침전이 완료되면, 완충액으로 보툴리눔 독소를 용출한 후 멸균된 0.2㎛ 필터를 통하여 외부와 접촉없이 여과하였다.
실시예 2. 보툴리눔 독소의 정제
2-1. 1차 소수성 상호작용 크로마토그래피
상기 실시예 1의 보툴리눔 A형 독소가 포함되어 있는 여과된 액을 Phenyl Sepharose 소수성 상호작용 크로마토그래피 수지가 충진된 컬럼에 로딩하였다. 상기 로딩 전 평형/용출 완충액 (50 mM 인산나트륨, 3M 염화나트륨, pH 6.0) 을 유속 5ml/분, 전도도 188mS/cm 조건으로 흘려 평형화/세척을 실시하였다.
상기 실시예 1의 보툴리눔 A형 독소가 포함되어 있는 여과된 액을 Phenyl Sepharose 컬럼에 로딩 후, 유속 5ml/분, 전도도 188mS/cm 조건으로 50 mM 인산나트륨, pH 6.0의 완충제로 감소되는 염 단계 변화(3.0M-0.0M 염화나트륨 구배)를 이용하여 컬럼으로부터 보툴리눔 독소를 용리하였다.
2-2. 황산암모늄 침전
상기 실시예 2-1의 방법으로 수집된 용리액에 황산암모늄을 최종 포화도가 40%(24.3g/100ml)가 되도록 첨가하여 침전시킨 후, 원심분리하여 침전물을 수득하였다. 이 과정 역시, 독소 단백질은 무균 용기의 내부 표면과 접촉하고 있었으며, 외부와의 접촉은 일어나지 않았다. 상기 침전물을 50 mM 인산나트륨 완충액(pH 6.0)으로 용해한 후, 2차 소수성 상호작용 크로마토그래피를 실시하였다.
2-3. 2차 소수성 상호작용 크로마토그래피
상기 실시예 2-2의 상기의 재용해액을 원심분리하여 상층액을 분리하고, 분리된 상층액을 페닐 세파로스(Phenyl Sepharose) 소수성 상호작용 크로마토그래피 컬럼이 연결된 FPLC(고속 단백질 액체 크로마토그래피, Fast Protein Liquid Chromatography)에 주입하였다.
상기 상층액 주입 전 평형 완충액 (50mM 인산나트륨, 2M 염화나트륨, pH 6.0)을 페닐 세파로스(Phenyl Sepharose) 수지가 충진된 컬럼에 흘려주어 평형화하고, 상기 독소가 함유된 완충액 (50mM 인산나트륨, 2M 염화나트륨 완충액, pH 6.0)을 컬럼을 통하여 유속 5ml/분, 전도도 147mS/cm의 조건으로 흘려 주었다. 평형 후, 상기 주입 단계가 수행되었고, 독소 복합체가 소수성 상호작용 컬럼 물질에 결합되는 동안, 흐름 통과(flow through, FT) 액은 멸균된 용기에 수집되었다. 이후에 세척 단계가 이어졌고, 세척 후 50 mM 인산나트륨, pH 6.0의 완충제로 감소되는 염 단계 변화(2.0M-0.0M 염화나트륨 구배)를 이용하여 컬럼으로부터 용리되었다.
2-4. 2차 황산암모늄 침전 및 농축
상기 실시예 2-3의 방법으로 수집된 용리액에 황산암모늄을 최종 포화도가 80%(56.1g/100ml)가 되도록 첨가하여 침전시킨 후, 원심분리하여 침전물을 수득하였다. 이 과정 역시, 독소 단백질은 무균 용기의 내부 표면과 접촉하고 있었으며, 외부와의 접촉은 일어나지 않았다. 상기 침전물을 20 mM 인산나트륨 완충액(pH 6.0) 1ml으로 용해한 후, 크기배제 크로마토그래피를 실시하였다.
2-5. 크기배제 크로마토그래피
상기 실시예 2-4의 상기의 재용해액을 원심분리하여 상층액을 분리하고, 분리된 상층액을 수퍼로스-6 크기 배제 크로마토그래피(size exclusion chromatography) 컬럼이 연결된 FPLC(고속 단백질 액체 크로마토그래피)에 로딩하였다. 상기 로딩 전 평형/용출 완충액(20mM 인산나트륨, pH 6.0)을 유속 0.2ml/분으로 흘려 컬럼을 평형화 하였다. 평형화가 끝나면 pH 6.0의 20mM 인산나트륨 완충액 100mL를 흘려준 다음, 용출된 피크의 분획을 순차적으로 수득하여 약 900kDa 크기의 단백질을 포함하는 시료를 분리하였다.
실시예 3. 정제된 독소의 순도 분석
고순도의 복합체 신경독소를 정제하기 위해 상기 실시예 2에서 수행한 2회의 소수성 상호작용 크로마토그래피 및 크기배제 크로마토그래피로 이어지는 정제공정을 통해 얻어진 시료에 대하여 소디움 도데실설페이트 폴리아크릴아미드 겔 전기영동(SDS-PAGE: sodium dodecylsulfate polyacrylamide gel electrophoresis, 도 1) 와 크기 배제 크로마토그래피(size exclusion chromatography: SEC-HPLC, 도 2)를 통해 순도를 분석하였다. 전기영동은 4~20% 폴리아크릴아미드 겔을 사용하여 수행하였으며, 수행 후 쿠마시블루로 염색하였다. SEC-HPLC의 이동상은 pH6.0의 250mM NaCl 이 포함된 50 mM 인산나트륨 용액을 사용하였으며, HPLC컬럼을 연결하고 실시예 2에서 수득한 보툴리눔 A형 독소 단백질 20 ㎍을 로딩(loading)하여 0.4 mL/min으로 60분간 흘려주었다.
그 결과, 보툴리눔 복합체 신경독소 성분 외에는 불순물 단백질 밴드가 관찰되지 않았다(도 1). 또한 보툴리눔 독소의 순도는 99.97%인 것을 확인하였다(도 2). 따라서, 상기 정제방법을 이용하면, 보툴리눔 독소 타입 A 등의 보툴리눔 독소 복합체 단백질 (약 900kD)을 불순물 없이 고순도로 수득할 수 있다.
이로부터, 본 명세서에 교시된 방법 및 시스템을 사용하여 고순도로 보툴리눔 복합체 단백질을 분리 정제하여 제조할 수 있음을 알 수 있다.
이상의 설명으로부터, 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로 이해해야만 한다. 본 발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

Claims (22)

  1. 배양액으로부터 분리된 클로스트리디움 보툴리눔 (Clostridium botulinum) 독소 복합체 단백질을 포함하는 용액을,
    (a) 1차 소수성 상호작용 컬럼에 로딩하여, 상기 독소를 포획하고 불순물을 통과시키는 단계;
    (b) 상기 (a) 단계에서 포획된 독소를 분리하여, 상기 독소를 포함하는 용리액을 수득하는 단계;
    (c) 상기 (b) 단계에서 수득한 용리액을 2차 소수성 상호작용 컬럼에 로딩하여, 상기 독소를 포획하고 불순물을 통과시키는 단계;
    (d) 상기 (c) 단계에서 포획된 독소를 분리하여, 상기 독소를 포함하는 용리액을 수득하는 단계; 및
    (e) 상기 (d) 단계에서 수득한 용리액을 이용하여 크기배제 크로마토그래피를 수행하는 단계를 포함하는, 클로스트리디움 보툴리눔 독소 복합체 단백질의 정제방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 (a) 단계 이전에 클로스트리디움 보툴리눔 (Clostridium botulinum) 균주를 배양하는 단계를 포함하는, 클로스트리디움 보툴리눔 독소 복합체 단백질의 정제방법.
  3. 제2항에 있어서, 상기 균주의 배양액을 산 침전(acid precipitation) 하는 단계를 더 포함하는, 클로스트리디움 보툴리눔 독소 복합체 단백질의 정제방법.
  4. 제3항에 있어서, 상기 산 침전은 pH 3.0 내지 pH 4.0이 되도록 산(acid)을 첨가하는 것을 포함하는, 클로스트리디움 보툴리눔 독소 복합체 단백질의 정제방법.
  5. 제3항에 있어서, 상기 산 침전된 용액을 여과하는 단계를 더 포함하는, 클로스트리디움 보툴리눔 독소 복합체 단백질의 정제방법.
  6. 제1항에 있어서, 상기 (a) 단계는 pH 4 내지 pH 8; 및 전도도(conductivity) 170 내지 220 mS/cm의 조건에서 수행되는, 클로스트리디움 보툴리눔 독소 복합체 단백질의 정제방법.
  7. 제1항에 있어서, 상기 (a) 단계의 컬럼 완충액은 인산 완충액인 것인, 클로스트리디움 보툴리눔 독소 복합체 단백질의 정제방법.
  8. 제1항에 있어서, 상기 (b) 단계는 농도구배(concentration gradient) 를 이용하는 것인, 클로스트리디움 보툴리눔 독소 복합체 단백질의 정제방법.
  9. 제1항에 있어서, 상기 (b) 단계와 (c) 단계 사이에, (b) 단계에서 수득한 용리액을 산 침전(acid precipitation)하는 단계를 더 포함하는, 클로스트리디움 보툴리눔 독소 복합체 단백질의 정제방법.
  10. 제9항에 있어서, 상기 산 침전(acid precipitation) 단계는 용리액에 황산암모늄을 최종 포화도가 30 내지 50%가 되도록 첨가하는 것을 포함하는, 클로스트리디움 보툴리눔 독소 복합체 단백질의 정제방법.
  11. 제1항에 있어서, 상기 (c) 단계는 pH 4 내지 pH 8; 및 전도도(conductivity) 130 내지 170 mS/cm의 조건에서 수행되는, 클로스트리디움 보툴리눔 독소 복합체 단백질의 정제방법.
  12. 제1항에 있어서, 상기 (c) 단계의 컬럼 완충액은 인산 완충액인 것인, 클로스트리디움 보툴리눔 독소 복합체 단백질의 정제방법.
  13. 제1항에 있어서, 상기 (d) 단계는 농도구배를 이용하는 것인, 클로스트리디움 보툴리눔 독소 복합체 단백질의 정제방법.
  14. 제1항에 있어서, 상기 (d) 단계와 (e) 단계 사이에, (d) 단계에서 수득한 용리액을 산 침전(acid precipitation)하는 단계를 더 포함하는 것인, 클로스트리디움 보툴리눔 독소 복합체 단백질의 정제방법.
  15. 제14항에 있어서, 상기 산 침전(acid precipitation) 단계는 용리액에 황산암모늄을 최종 포화도가 70 내지 90%가 되도록 첨가하는 것을 포함하는, 클로스트리디움 보툴리눔 독소 복합체 단백질의 정제방법.
  16. 제1항에 있어서, 상기 소수성 상호작용 컬럼은 부틸 세파로스 및 페닐 세파로스 컬럼으로 구성된 군으로부터 선택되는 것인, 클로스트리디움 보툴리눔 독소 복합체 단백질의 정제방법.
  17. 제1항에 있어서, 상기 (e) 단계는 분자량 250 kD 내지 1400 kD의 단백질을 분리하여 수득하는 것을 포함하는, 클로스트리디움 보툴리눔 독소 복합체 단백질의 정제방법.
  18. 제1항에 있어서, 상기 (e) 단계의 크기배제 크로마토그래피는 수퍼덱스 (superdex), 세파크릴 (sephacryl), 수퍼로스 (superose), 세파덱스 (sephadex), 세파로스(Sepharose), 폴리아크릴아마이드(polyacrylamide) 또는 실리카 기반(silica-based) 컬럼을 사용하는 것인, 클로스트리디움 보툴리눔 독소 복합체 단백질의 정제방법.
  19. 제1항에 있어서, 상기 (e) 단계의 크기배제 크로마토그래피는 pH 5 내지 pH 7의 조건에서 수행되는 것인, 클로스트리디움 보툴리눔 독소 복합체 단백질의 정제방법.
  20. 제1항에 있어서, 상기 (e) 단계의 컬럼 완충액은 인산 완충액인 것인, 클로스트리디움 보툴리눔 독소 복합체 단백질의 정제방법.
  21. 제1항에 있어서, 상기 방법으로 정제된 클로스트리디움 보툴리눔 독소 복합체 단백질은 순도 98% 이상인 것인, 클로스트리디움 보툴리눔 독소 복합체 단백질의 정제방법.
  22. 제1항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 클로스트리디움 보툴리눔 독소 복합체 단백질은 보툴리눔 독소(BoNT; Botulinum neurotoxin), 비독성 비헤마글루티닌 (NTNH; nontoxic nonhemagglutinin), 및 헤마글루티닌(HA: hemagglutinin) 단백질의 복합체인 것인, 클로스트리디움 보툴리눔 독소 복합체 단백질의 정제방법.
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