WO2023280220A1 - 一种冠状病毒s蛋白变体及其应用 - Google Patents

一种冠状病毒s蛋白变体及其应用 Download PDF

Info

Publication number
WO2023280220A1
WO2023280220A1 PCT/CN2022/104158 CN2022104158W WO2023280220A1 WO 2023280220 A1 WO2023280220 A1 WO 2023280220A1 CN 2022104158 W CN2022104158 W CN 2022104158W WO 2023280220 A1 WO2023280220 A1 WO 2023280220A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
protein
protein variant
composition
nucleic acid
coronavirus
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Ceased
Application number
PCT/CN2022/104158
Other languages
English (en)
French (fr)
Other versions
WO2023280220A9 (zh
Inventor
林金钟
卢静
谭舒丹
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Shanghai Rnacure Biopharma Co Ltd
Fudan University
Original Assignee
Shanghai Rnacure Biopharma Co Ltd
Fudan University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Shanghai Rnacure Biopharma Co Ltd, Fudan University filed Critical Shanghai Rnacure Biopharma Co Ltd
Publication of WO2023280220A1 publication Critical patent/WO2023280220A1/zh
Publication of WO2023280220A9 publication Critical patent/WO2023280220A9/zh
Anticipated expiration legal-status Critical
Ceased legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A61K39/215—Coronaviridae, e.g. avian infectious bronchitis virus
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/06—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite
    • A61K47/16—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite containing nitrogen, e.g. nitro-, nitroso-, azo-compounds, nitriles, cyanates
    • A61K47/18—Amines; Amides; Ureas; Quaternary ammonium compounds; Amino acids; Oligopeptides having up to five amino acids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/06—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite
    • A61K47/24—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite containing atoms other than carbon, hydrogen, oxygen, halogen, nitrogen or sulfur, e.g. cyclomethicone or phospholipids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/06—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite
    • A61K47/28—Steroids, e.g. cholesterol, bile acids or glycyrrhetinic acid
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/10—Dispersions; Emulsions
    • A61K9/127—Synthetic bilayered vehicles, e.g. liposomes or liposomes with cholesterol as the only non-phosphatidyl surfactant
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • C07K14/08—RNA viruses
    • C07K14/165—Coronaviridae, e.g. avian infectious bronchitis virus
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K19/00—Hybrid peptides, i.e. peptides covalently bound to nucleic acids, or non-covalently bound protein-protein complexes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/80—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi
    • C12N15/81—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi for yeasts
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/53—DNA (RNA) vaccination
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
    • C07K2319/02—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a signal sequence
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
    • C12N2770/00011—Details
    • C12N2770/20011—Coronaviridae
    • C12N2770/20022—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
    • C12N2770/00011—Details
    • C12N2770/20011—Coronaviridae
    • C12N2770/20034—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2800/00—Nucleic acids vectors
    • C12N2800/22—Vectors comprising a coding region that has been codon optimised for expression in a respective host
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Definitions

  • This application relates to the field of biomedicine, in particular to a coronavirus S protein variant and its application in the preparation of vaccines.
  • the present application provides a coronavirus S protein variant, as well as nucleic acid molecules (including DNA and/or RNA) encoding it, which can stimulate the body to generate an immune response.
  • the S protein variant of the present application has a higher expression level, and when used to stimulate an immune response, it can produce higher total antibodies, and at the same time, protective antibodies/neutralizing antibodies also have Great improvement.
  • the S protein variants of the present application and their nucleic acid molecules can be prepared as vaccines.
  • mRNAs encoding S protein variants and lipid nanoparticles comprising them can be prepared as vaccines.
  • the vaccine of the present application can greatly improve the immune response, reduce the dosage and reduce side effects.
  • the present application provides a variant of the S protein, which does not contain a complete cytoplasmic tail domain compared with the S protein of the wild-type coronavirus.
  • the S protein variant comprises the amino acid sequence shown in any one of SEQ ID NO:8, 21, 24, 27, 30, 33, 35, 38, 41, 45, 59 and 61 .
  • the S protein variant comprises the amino acid sequence shown in SEQ ID NO:8.
  • the signal peptide comprises the amino acid sequence shown in any one of SEQ ID NO: 1-2.
  • the present application provides an isolated nucleic acid molecule comprising a polynucleotide encoding the S protein variant described in the present application.
  • the nucleic acid molecule comprises at least one modified nucleotide.
  • the present application provides a vector comprising the nucleic acid molecule described in the present application.
  • the present application provides a cell comprising the nucleic acid molecule, and/or the vector.
  • the present application provides a composition comprising (1) mRNA encoding the S protein variant described in the present application, and (2) a delivery vehicle.
  • the delivery vehicle comprises cationic lipids.
  • the molar ratio of the cationic lipid is about 45% to about 55%.
  • the cationic lipid can be Dlin-MC3-DMA.
  • the chemical structural formula of the Dlin-MC3-DMA can be:
  • the delivery vehicle includes cholesterol.
  • the present application provides a pharmaceutical composition, the pharmaceutical composition comprising the S protein variant described in the present application, the nucleic acid molecule, the vector, the cell and/or the composition, and optionally a pharmaceutically acceptable carrier.
  • Figure 1A shows the in vitro expression results of the S protein variant mRNA transfected into 293T cells.
  • truncated cytoplasmic tail domain generally refers to a cytoplasmic tail domain in which there is an amino acid deletion relative to the intact cytoplasmic tail domain.
  • SARS severe Acute Respiratory Syndrome
  • SARS-CoV severe Respiratory Syndrome
  • SM102 generally refers to an ionizable amino lipid that has been combined with other lipids to form lipid nanoparticles.
  • the molecular structure of SM102 can be found in CAS 2089251-47-6.
  • the cytoplasmic tail domain of the S protein variant may be missing about 40 to about 60 amino acids at the C-terminus. In the present application, compared with the S protein of the wild-type SARS-CoV-2 virus, the cytoplasmic tail domain of the S protein variant may be missing about 30 to about 40 amino acids at the C-terminus. In the present application, compared with the S protein of the wild-type SARS-CoV-2 virus, the cytoplasmic tail domain of the S protein variant may be missing about 20 to about 30 amino acids at the C-terminus.
  • the coronavirus may be SARS-CoV virus.
  • the cytoplasmic tail domain of the S protein variant may be deleted at the C-terminus by about 14, about 15, about 16, about 17, About 18, about 19 or about 20 amino acids.
  • the cytoplasmic tail domain of the S protein variant may be deleted at the C-terminus by about 10, about 20, about 30, about 40, About 50 or about 60 amino acids.
  • the cytoplasmic tail domain of the S protein variant may be missing about 22 to about 64 amino acids at the C-terminus. In the present application, compared with the S protein of the wild-type SARS-CoV virus, the cytoplasmic tail domain of the S protein variant may be missing about 22 to about 60 amino acids at the C-terminus. In the present application, compared with the S protein of the wild-type SARS-CoV virus, the cytoplasmic tail domain of the S protein variant may be missing about 30 to about 60 amino acids at the C-terminus.
  • the cytoplasmic tail domain of the S protein variant may be missing about 40 to about 60 amino acids at the C-terminus. In the present application, compared with the S protein of the wild-type SARS-CoV virus, the cytoplasmic tail domain of the S protein variant may be missing about 30 to about 40 amino acids at the C-terminus. In the present application, compared with the S protein of the wild-type SARS-CoV virus, the cytoplasmic tail domain of the S protein variant may be missing about 20 to about 30 amino acids at the C-terminus.
  • the cytoplasmic tail domain of the S protein variant may be missing about 22 to about 64 amino acids at the C-terminus. In the present application, compared with the S protein of the wild-type MERS-CoV virus, the cytoplasmic tail domain of the S protein variant may be missing about 22 to about 60 amino acids at the C-terminus. In the present application, compared with the S protein of the wild-type MERS-CoV virus, the cytoplasmic tail domain of the S protein variant may be missing about 30 to about 60 amino acids at the C-terminus.
  • the cytoplasmic tail domain of the S protein variant may be missing about 40 to about 60 amino acids at the C-terminus. In the present application, compared with the S protein of the wild-type MERS-CoV virus, the cytoplasmic tail domain of the S protein variant may be missing about 30 to about 40 amino acids at the C-terminus. In the present application, compared with the S protein of the wild-type MERS-CoV virus, the cytoplasmic tail domain of the S protein variant may be missing about 20 to about 30 amino acids at the C-terminus.
  • the nucleic acid molecule may be RNA.
  • the nucleic acid molecule may be mRNA.
  • the mRNA may include a 5' cap, a 5' untranslated region (5'UTR), an open reading frame, a 3' untranslated region (3'UTR) and a poly A tail.
  • said poly A can comprise the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO:66.
  • the mRNA can include a 5' cap, a 5' untranslated region (5'UTR), an open reading frame, a 3' untranslated region (3'UTR) and a poly A tail; wherein the 5'UTR can be Comprising the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO:64, the 5'UTR can include the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO:65, and the poly A can include the nucleoside shown in SEQ ID NO:66 acid sequence, the open reading frame can comprise the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO:7; the mRNA can comprise the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO:67.
  • the lipid nanoparticles may comprise cationic and/or ionizable lipids, anionic lipids, neutral lipids, amphipathic lipids, pegylated lipids and/or structured Lipid, or a combination of the above
  • the lipid nanoparticle comprises one or more RNAs described herein, such as mRNA, and for example, mRNA encoding a S protein variant.
  • the nanolipid particles may comprise one or more (eg 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 or 8) non-cationic lipids.
  • the non-cationic lipids may include anionic lipids.
  • Anionic lipids suitable for lipid nanoparticles of the present application may include phosphatidylglycerol, cardiolipin, diacylphosphatidylserine, diacylphosphatidic acid, N-dodecanoylphosphatidylethanolamine, N-succinylphosphatidylethanolamine , N-glutarylphosphatidylphosphoethanolyl, and other neutral lipids with attached anionic groups.
  • the nano-lipid particles may also contain cholesterol.
  • the molar proportion of cholesterol in the lipid nanoparticles is about 5-15%, for example, about 6-14%, about 7-13%, about 8-12%, or about 9-11% %. In certain embodiments, the molar proportion of cholesterol in the lipid nanoparticles may be about 10%.
  • the present application provides a cell comprising the nucleic acid molecule, and/or the vector.
  • the cells may be prokaryotic cells, for example, Escherichia coli.
  • the cells may be eukaryotic cells such as yeast cells, insect cells, plant cells and animal cells.
  • the cells may be mammalian cells, such as mouse cells, human cells and the like.
  • the vaccine may be a protein vaccine, which may contain the S protein variant.
  • the present application provides a method for producing antibodies against coronavirus, the method comprising administering the S protein variant, the nucleic acid molecule, the carrier, the cell, the composition, the drug Composition and/or said vaccine.
  • SARS-Cov-2 virus S protein (code name: SDC60Alb) containing Alb signal peptide and SARS virus S protein (SARS S).
  • SARS-Cov-2 virus SDC60 Alb protein has the following variants: full-length protein (FL), full-length protein (2P) containing K986P and V987P mutations, and the C-terminus of the full-length protein is truncated by 10, 18, Proteins with 20, 40, 60, and 67 amino acids (DC10, DC18, DC20, DC40, DC60, DC67);
  • the SARS S protein variants of SARS virus include: full-length protein (FL), full-length C-terminal truncated by 10 , 18, 40 amino acid proteins (DC10, DC18, DC40).

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Oil, Petroleum & Natural Gas (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Dispersion Chemistry (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)

Abstract

涉及一种S蛋白变体，与野生型冠状病毒的S蛋白相比，其不包含完整的细胞质尾巴结构域。还提供了编码所述S蛋白变体的核酸分子，以及所述S蛋白变体和核酸分子在制备疫苗中的应用。

Description

一种冠状病毒S蛋白变体及其应用 技术领域
本申请涉及生物医药领域，具体的涉及一种冠状病毒S蛋白变体及其在制备疫苗中的应用。
背景技术
冠状病毒(coronavirus，CoV)是一类有包膜的单股正链RNA病毒，宿主范围广泛，人和多种动物普遍易感，并且与许多疾病有关。已知的冠状病毒包括HCoV-OC43、HCoV-229E、HCoV-NL63、HCoV-HKU1、SARS-CoV和/或MERS-CoV，研究表明，SARS-CoV-2病毒的基因序列(GenBank accession:MN908947)与SARS冠状病毒相比具有超过85％的序列相似度。
针对冠状病毒表面刺突蛋白抗原(S蛋白)，主要研发了重组蛋白疫苗、mRNA疫苗、DNA疫苗、非复制型病毒载体疫苗、复制性病毒载体疫苗、多肽疫苗、病毒样颗粒疫苗、减毒疫苗和灭活疫苗。但是存在对细胞的转染率低，表达效率低，刺激的免疫应答弱，临床需要的剂量高，一方面导致生产成本高，病人用药费用高，负担重等问题，另一方面高剂量用药使得引入的杂质更多，可能会导致毒副作用的增大，从而增加了临床风险。因此亟待制备新型疫苗。
发明内容
本申请提供了一种冠状病毒S蛋白变体，以及编码其的核酸分子(包括DNA和/或RNA)，其能够刺激机体产生免疫应答。与野生型冠状病毒的S蛋白相比，本申请的S蛋白变体具有较高的表达量，在用于刺激产生免疫应答时，可产生更高的总抗体，同时保护抗体/中和抗体也有极大的提升。本申请的S蛋白变体及其核酸分子，可以被制备为疫苗。例如，编码S蛋白变体的mRNA及包含其的脂质纳米颗粒可以被制备为疫苗。与野生型冠状病毒的S蛋白的疫苗相比，本申请的疫苗可极大地提高免疫应答，降低施用剂量，减少副作用。
一方面，本申请提供了一种S蛋白变体，与野生型冠状病毒的S蛋白相比，其不包含完整的细胞质尾巴结构域。
在某些实施方式中，与野生型冠状病毒的S蛋白相比，所述S蛋白变体包含截短的细胞质尾巴结构域。
在某些实施方式中，与野生型冠状病毒的S蛋白相比，所述S蛋白变体在C末端截短了 18-20个氨基酸。
在某些实施方式中，与野生型冠状病毒的S蛋白相比，所述S蛋白变体在C末端截短了18个氨基酸。
在某些实施方式中，与野生型冠状病毒的S蛋白相比，所述S蛋白变体不包含细胞质尾巴结构域。
在某些实施方式中，与野生型冠状病毒的S蛋白相比，所述S蛋白变体不包含跨膜域。
在某些实施方式中，与野生型冠状病毒的S蛋白相比，所述S蛋白变体在C末端截短了22-64个氨基酸。
在某些实施方式中，所述冠状病毒为MERS冠状病毒和/或SARS-CoV类病毒。
在某些实施方式中，所述冠状病毒为SARS-CoV-2病毒。
在某些实施方式中，所述野生型冠状病毒的S蛋白的细胞质尾巴结构域包含SEQ ID NO:48-49中任一项所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述野生型冠状病毒的S蛋白的跨膜域包含SEQ ID NO:50-51中任一项所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述野生型冠状病毒的S蛋白包含SEQ ID NO:5、34和44中任一项所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述S蛋白变体包含SEQ ID NO:8、21、24、27、30、33、35、38、41、45、59和61中任一项所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述S蛋白变体包含SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述S蛋白变体还包括信号肽，且所述信号肽位于所述S蛋白变体的N末端。
在某些实施方式中，所述信号肽包含SEQ ID NO:1-2中任一项所示的氨基酸序列。
另一方面，本申请提供了分离的核酸分子，所述分离的核酸分子包含编码本申请所述S蛋白变体的多核苷酸。
在某些实施方式中，所述核酸分子为DNA。
在某些实施方式中，所述核酸分子包含SEQ ID NO:6、9-19、22、25、28、31、36、39、42、46、60、62和63中任一项所述的核苷酸序列。
在某些实施方式中，所述核酸分子为mRNA。
在某些实施方式中，所述核酸分子在选自下组的一个或多个位置处包含修饰：5’帽、5’非翻译区、开放阅读框、3’非翻译区和3’聚腺苷酸。
在某些实施方式中，所述核酸分子包含至少一种经修饰的核苷酸。
在某些实施方式中，所述核酸分子为密码子优化的。
在某些实施方式中，所述核酸分子包含SEQ ID NO:7、20、23、26、29、32、37、40、43和47中任一项所示的核苷酸序列。
另一方面，本申请提供了载体，所述载体包含本申请所述核酸分子。
另一方面，本申请提供了细胞，所述细胞包含所述核酸分子，和/或所述载体。
另一方面，本申请提供了制备本申请所述S蛋白变体的方法，所述方法包括在使得所述S蛋白变体表达的条件下，培养所述细胞。
另一方面，本申请提供了组合物，所述组合物包含(1)编码本申请所述S蛋白变体的mRNA，和(2)递送载体。
在某些实施方式中，所述mRNA在选自下组的一个或多个位置处包含修饰：5’帽、5’非翻译区、开放阅读框、3’非翻译区和poly A尾。
在某些实施方式中，所述mRNA包含至少一种经修饰的核苷酸。
在某些实施方式中，所述mRNA包含的经修饰的核苷酸为假尿苷(Ψ)。
在某些实施方式中，所述mRNA是密码子优化的。
在某些实施方式中，所述mRNA包含如SEQ ID NO:7、20、23、26、29、32、37、40、43和47中任一项所示的核苷酸序列。
在某些实施方式中，与野生型冠状病毒(例如，SARS CoV-2病毒)的S蛋白相比，所述S蛋白变体在C末端截短了18个氨基酸。
在某些实施方式中，所述mRNA包含如SEQ ID NO:7所示的核苷酸序列。
在某些实施方式中，所述递送载体包括脂质体。
在某些实施方式中，所述递送载体包括脂质纳米颗粒(LNP)。
在某些实施方式中，所述递送载体包括阳离子脂质。
在某些实施方式中，在所述递送载体中，其中所述阳离子脂质的摩尔比为约45％至约55％。
在某些实施方式中，所述阳离子脂质包括SM102和/或Dlin-MC3-DMA。例如，所述阳离子脂质可以为SM102。例如，所述SM102的化学结构式可以为：
Figure PCTCN2022104158-appb-000001
例如，所述阳离子脂质可以为Dlin-MC3-DMA。例如，所述Dlin-MC3-DMA的化学结构式可以为：
Figure PCTCN2022104158-appb-000002
在某些实施方式中，所述递送载体包括非阳离子脂质。
在某些实施方式中，所述非阳离子脂质包括磷脂和/或脂质缀合物。
在某些实施方式中，所述磷脂包括二硬脂酰基磷脂酰胆碱(DSPC)。
在某些实施方式中，在所述递送载体中，其中所述磷脂的摩尔比为约35％至约40％。
在某些实施方式中，所述脂质缀合物包括聚乙二醇修饰的脂分子。
在某些实施方式中，在所述递送载体中，其中所述脂质缀合物的摩尔比为约1％至约2％。
在某些实施方式中，所述聚乙二醇修饰的脂分子包括DMG-PEG2000。
在某些实施方式中，所述递送载体包括胆固醇。
在某些实施方式中，在所述递送载体中，其中所述胆固醇的摩尔比为约8％至约12％。
在某些实施方式中，所述递送载体包含阳离子脂质、胆固醇、磷脂和脂质缀合物，且所述阳离子脂质、胆固醇、磷脂和脂质缀合物的质量比为50:10:38.5:1.5。
在某些实施方式中，所述递送载体包含SM102、胆固醇、DSPC和DMG-PEG2000，且所述SM102、胆固醇、DSPC和DMG-PEG2000的质量比为50:10:38.5:1.5。
在某些实施方式中，在某些实施方式中，所述mRNA包载在所述递送载体中。
另一方面，本申请提供了药物组合物，所述药物组合物包含本申请所述S蛋白变体、所述核酸分子、所述载体、所述细胞和/或所述组合物，以及任选地药学上可接受的载体。
另一方面，本申请提供了疫苗，所述疫苗包含本申请所述S蛋白变体、所述核酸分子、所述载体、所述细胞、所述组合物和/或所述药物组合物，以及药学上可接受的佐剂。
在某些实施方式中，所述疫苗为蛋白疫苗。
在某些实施方式中，所述疫苗为核酸疫苗。
在某些实施方式中，所述疫苗为DNA疫苗。
在某些实施方式中，所述疫苗为mRNA疫苗。
另一方面，本申请提供了试剂盒，所述试剂盒包含本申请所述S蛋白变体、所述核酸分子、所述载体、所述细胞、所述合物、所述药物组合物和/或所述疫苗。
另一方面，本申请提供了本申请所述S蛋白变体、所述核酸分子、所述载体、所述细胞、所述组合物、所述药物组合物和/或所述疫苗在制备药物中的用途，所述药物用于缓解、预防和/或治疗冠状病毒引起的疾病。
在某些实施方式中，所述疾病或病症为新型冠状病毒肺炎(COVID-19)和/或重症急性呼吸综合征(SARS)。
另一方面，本申请提供了缓解、预防和/或治疗冠状病毒引起的疾病或病症的方法，所述方法包括向有需要的受试者施用本申请所述S蛋白变体、所述核酸分子、所述载体、所述细胞、所述组合物、所述药物组合物和/或所述疫苗。
在某些实施方式中，所述疾病或病症为新型冠状病毒肺炎(COVID-19)和/或重症急性呼吸综合征(SARS)。
另一方面，本申请提供了产生针对冠状病毒抗体的方法，所述方法包括施用本申请所述S蛋白变体、所述核酸分子、所述的载体、所述细胞、所述组合物、所述药物组合物和/或所述疫苗。
另一方面，本申请提供了激活免疫的方法，所述方法包括施用所述S蛋白变体、所述核酸分子、所述载体、所述细胞、所述组合物、所述药物组合物和/或所述疫苗。
本领域技术人员能够从下文的详细描述中容易地洞察到本申请的其它方面和优势。下文的详细描述中仅显示和描述了本申请的示例性实施方式。如本领域技术人员将认识到的，本申请的内容使得本领域技术人员能够对所公开的具体实施方式进行改动而不脱离本申请所涉及发明的精神和范围。相应地，本申请的附图和说明书中的描述仅仅是示例性的，而非为限制性的。
附图说明
本申请所涉及的发明的具体特征如所附权利要求书所显示。通过参考下文中详细描述的示例性实施方式和附图能够更好地理解本申请所涉及发明的特点和优势。对附图简要说明如下：
图1A显示的是本申请所述S蛋白变体的mRNA转染293T细胞的体外表达结果。
图1B显示的是本申请所述表达SARS病毒的S蛋白的mRNA转染细胞的体外表达结果。
图1C显示的是本申请所述S蛋白变体的mRNA用脂质体包被转染293A细胞后，Western Blot检测蛋白表达的结果图，其中，S：野生型S蛋白mRNA；SDC60 Nat：带Nat(病毒原始)信号肽，密码子优化的野生型S蛋白mRNA(密码子序列代号SDC60，其中序列中GC含量为60％)；SDC60 Alb:带Alb(血清白蛋白)信号肽的SDC60密码子序列的S蛋白mRNA；FL：全长S蛋白；DC18：C端截短18个氨基酸的S蛋白突变体；2P：包含2个脯氨酸(Proline)序列突变(K986P和V987P)的S蛋白突变体。
图2显示的是使用本申请的脂质纳米颗粒免疫小鼠的示意图。
图3显示的是mRNA疫苗二免后的第1周S蛋白结合抗体滴度，其中，S：野生型S蛋白mRNA；SDC60 Alb-2P：带Alb信号肽，含2个脯氨酸突变(K986P，V987P)，SDC60密码子序列的S蛋白mRNA；SDC60 Alb-DC18：带Alb信号肽，基于SDC60密码子序列的C端截短18个氨基酸的S蛋白mRNA。
具体实施方式
以下由特定的具体实施例说明本申请发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所公开的内容容易地了解本申请发明的其他优点及效果。
术语定义
在本申请中，术语“递送载体”通常是指能够将试剂(例如，mRNA)递送至靶细胞的转移媒介物。递送载体可以将试剂(例如，mRNA)递送到特定的细胞亚类。例如，借助递送载体的固有特征或者通过与载体相偶联的部分、包含在其内的部分(或者与载体结合的部分，从而使得该部分和该递送载体维持在一起，进而使得该部分足以靶向递送载体)使递送载体靶向某些类型的细胞。递送载体还可提高要递送的试剂(例如，mRNA)的体内半衰期和/或要递送的试剂的生物利用度。递送载体可包括病毒载体、病毒样颗粒、聚阳离子载体、肽载体、脂质体和/或杂交载体。例如，如果靶细胞是肝细胞，所述递送载体的性质(例如，尺寸、电荷和/或pH)可以有效地将所述递送载体和/或其中包载的分子(例如，mRNA)递送至靶细胞、降低免疫清除和/或促进在该靶细胞中停留。
在本申请中，术语“多核苷酸”通常包括DNA分子(例如cDNA或基因组DNA)、RNA分子(例如mRNA)、使用核苷酸类似物(例如肽核酸和非天然存在的核苷酸类似物)产生的DNA或RNA的类似物，及其杂合体。核酸分子可以是单链或双链的。
在本申请中，术语“分离的核酸分子”通常是指从5’至3’末端阅读的脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸碱基的单链或双链聚合物或其类似物，其已与至少约50％的当从来源细胞分离总核酸时与核酸分子一起被天然发现的多肽、肽、脂质、糖类、多核苷酸或其它材料分离。例如，分离的核酸分子大体上不含任何其它污染性核酸分子或在核酸的天然环境中发现的可干扰其的用途或其治疗性、诊断性、预防性或研究用途的其它分子。
在本申请中，术语“mRNA”通常是指经过处理去除了内含子，且能够被翻译成多肽的RNA转录本。mRNA通常包括5'帽子、5'非翻译区域(5'UTR)、编码区(又称开放阅读框)、3'非翻译区域(3'UTR)和poly(A)尾。
在本申请中，术语“修饰”用于核酸(例如RNA或DNA)时通常是指，与相应的野生型相比，所述核酸具有不同的核苷酸分子，不同的核苷酸序列，由不同的键组成和/或在其结构中掺入非天然部分。例如，所述修饰可包括核苷酸的修饰，例如，所述核苷酸可包含经修饰的碱基、糖或磷酸基团。例如，所述修饰可包括不同的核苷酸序列但是编码相同氨基酸序列的多肽或蛋白质，或相同功能的多肽或蛋白质。所述修饰可以是化学修饰和/或生物修饰。“化学修饰”可包括引入不同于野生型或天然存在的核酸中所见到的那些化学物质的修饰，例如，共价修饰，例如，引入经修饰的核苷酸(例如，核苷酸类似物，或者引入在这些核酸分子中未天然发现的侧基)。术语“经修饰的核苷酸”通常是指核酸聚合物中的单元，其含有经修饰的碱基、糖或磷酸基团，或在其结构中掺入非天然部分。
在本申请中，术语“跨膜域”通常是指蛋白质序列中跨越细胞膜的区域。
在本申请中，术语“密码子优化”用于核酸时，通常表示通过用在细胞中具有不同的相对使用频率的编码相同氨基酸残基的密码子，替换亲代多肽编码核酸中的一个、至少一个、或一个以上密码子，已经改良而在细胞中具有改善的表达的编码多肽的核酸，例如哺乳动物细胞或细菌细胞。
在本申请中，术语“信号肽”通常是指作为N-端肽存在于蛋白前体形式上的前肽。信号肽的功能是促进连接至内质网的表达多肽的易位。信号肽通常在该过程中被切除。信号肽对于用于产生多肽的生物体可以是异源的或同源的。
在本申请中，术语“药物组合物”通常是指以允许活性成分(例如，本申请的S蛋白变体、核酸分子)的生物学活性有效的形式的制剂，并且其不含有对所述制剂待施用的受试者有不可接受的毒性的另外成分。这些制剂可为无菌的。
在本申请中，术语“S蛋白”，也可称为“刺突蛋白”或“Spike蛋白”，通常是指冠状病毒表面的膜蛋白，其可在病毒表面形成突出的同型三聚体。该术语还可包括S蛋白的糖基化形式。S蛋白通常包含两个功能性亚基S1和S2，其中S1亚基负责与宿主细胞受体结合，S2亚基负责病毒膜和细胞膜融合。S蛋白可以介导冠状病毒进入宿主细胞。不同的冠状病毒使用S1亚基内的不同结构域来识别靶细胞表面的附着受体并通过受体进入靶细胞。对于SARS-CoV和/或SARS-CoV-2，可通过S蛋白S1亚基的结构域B与血管紧张素转化酶2(ACE2)直接相互作用而进入靶细胞。另外，病毒进入宿主需要引发(priming)S蛋白，这需要通过宿主的蛋白酶在S1/S2和S2'位点进行S蛋白裂解，并由S2亚基驱动病毒胞膜融合。S1亚基包含N端结构域和受体结合域(RBD)，S2亚基包含融合肽(FP)、七肽重复序列1(HR1)、七肽重复序列2(HR2)、跨膜域(TM domain)和细胞质尾巴结构域。“S蛋白”涵盖任何病毒来源的S蛋白，例如，MERS CoV、SARS-CoV和/或SARS-CoV-2。示例性的SARS-CoV-2的S蛋白的氨基酸序列可参见NCBI数据库登录号YP_009724390.1。示例性的SARS-CoV的S蛋白的氨基酸序列可参见NCBI数据库登录号YP009825051.1。示例性的MERS-CoV的S蛋白的氨基酸序列可参见NCBI数据库登录号NC019843。
在本申请中，术语“野生型冠状病毒的S蛋白”通常是指包含完整序列的细胞质尾巴结构域和/或跨膜域的冠状病毒的S蛋白。野生型冠状病毒的S蛋白可以是从大自然中获得的冠状病毒的全长序列的S蛋白。示例性的SARS-CoV-2的S蛋白的全长氨基酸序列可参见NCBI数据库登录号YP_009724390.1或Uniprot数据库登录号P0DTC2。野生型SARS-CoV-2的S蛋白可包含1273个氨基酸(aa)，自N端至C端，通常依次包含13aa的信号肽，然后是S1亚基(氨基酸残基14-685位)和S2亚基(氨基酸残基686-1273位)。在S1亚基内，自N端至C端依次包含N端结构域(氨基酸残基14-305位)和一个受体结合结构域(RBD；氨基酸残基319-541位)，在S2亚基内，自N端至C端依次包含融合肽(FP；氨基酸残基788-806)、七肽重复序列1和2(HR1；氨基酸残基912-984位和HR2；氨基酸残基1163-1213)、跨膜域(TMD；氨基酸残基1213-1237位)和细胞质尾巴结构域(cytoplasmic tail；氨基酸残基1237-1273位)。示例性的SARS-CoV的S蛋白的全长氨基酸序列可参见NCBI数据库登录号YP_009825051.1或Uniprot数据库登录号P59594，野生型SARS-CoV的S蛋白可包含1255个氨基酸(aa)，其细胞质尾巴结构域的氨基酸残基为1217-1255位)。“位置”当在本 文中使用时意指蛋白的序列中的定位。位置可以被连续编号，或依照已制定的格式编号。，例如，K986P或V987P是相对于野生型S蛋白具有在位置第986位和第987位氨基酸K和V均突变为P。
在本申请中，术语“细胞质尾巴结构域”通常是指野生型S蛋白中位于细胞质内部的结构域。冠状病毒的细胞质尾巴结构域通常富含Cys，且被棕榈酰化。
在本申请中，术语“截短的细胞质尾巴结构域”通常是指相对于完整的细胞质尾巴结构域，存在氨基酸缺失的细胞质尾巴结构域。
在本申请中，术语“疫苗”通常是指含有有效诱导受试者的抗特定病原体或疾病的治疗程度的免疫性的活性组分的试剂或组合物。
在本申请中，术语“脂质纳米颗粒”通常是指包含通过分子间力彼此物理结合(例如，共价或非共价)的多个(即多于一个)脂质分子的颗粒。脂质纳米颗粒可以是例如微球(包括单层和多层囊泡，例如脂质体)、乳液中的分散相、胶团或悬浮液中的内相。脂质纳米颗粒可以包含一种或多种脂质(例如，阳离子脂质、非阳离子脂质和PEG-修饰的脂质)。
在本申请中，术语“脂质体”通常是指通过一个或多个双层的膜与外部介质隔离的具有内部空间的囊泡。例如，所述双层的膜可以通过两性分子形成，如包含空间隔离的亲水性和疏水性结构域的合成或天然来源的脂质；又例如，所述双层的膜可以通过两亲性聚合物和表面活性剂形成。
在本申请中，术语“SARS-CoV-2”通常是指严重急性呼吸道综合征冠状病毒2型，英文全称为Severe Acute Respiratory Syndrome Coronavirus 2。SARS-CoV-2属于冠状病毒科(Coronaviridae)乙型冠状病毒属(Betacoronavirus)沙贝病毒亚属(Sarbecovirus)。SARS-CoV-2是一种具有包膜的、不分节段的正链单股RNA病毒。
在本申请中，术语“SARS-CoV类病毒”通常是指严重急性呼吸道综合征相关冠状病毒，即Severe acute respiratory syndrome-related coronavirus，其是冠状病毒科乙型冠状病毒属的一个种。SARS-CoV类病毒也可称为SARS冠状病毒或SARS相关冠状病毒。
在本申请中，术语“SARS-CoV”通常是指SARS冠状病毒，即严重急性呼吸道综合征冠状病毒(英文全称为Severe acute respiratory syndrome coronavirus)，其属于冠状病毒科(Coronaviridae)乙型冠状病毒属(Betacoronavirus)沙贝病毒亚属(Sarbecovirus)。
在本申请中，术语“新型冠状病毒肺炎(COVID-19)”通常是指2019冠状病毒病(英文全称为coronavirus disease 2019)，其是由SARS-CoV-2引发的疾病。大多数COVID-19患者的表现以下呼吸道症状为主，常见临床表现包括发热、四肢乏力、干咳等症状。
在本申请中，术语“重症急性呼吸综合征(SARS)”通常是指由SARS-CoV引发的疾病。SARS通常以肌肉疼痛、头痛和发烧的全身症状为特征，并于2-14天内出现咳嗽、呼吸困难和肺炎等呼吸道症状。
在本申请中，术语“药学上可接受的佐剂”通常是指任何与所施用的活性成分相容的溶剂、分散介质、涂层、等渗剂和吸收延迟剂等佐剂、赋形剂或其它药物载体。
在本申请中，术语“SM102”通常是指一种可电离的氨基脂质，已与其他脂质结合用于形成脂质纳米颗粒。SM102的分子结构可参见CAS 2089251-47-6。
发明详述
S蛋白变体
一方面，本申请提供了一种S蛋白变体，与野生型冠状病毒的S蛋白相比，其可以不包含完整的细胞质尾巴结构域。在本申请中，与野生型冠状病毒的S蛋白相比，所述S蛋白变体可以包含截短的细胞质尾巴结构域。
在本申请中，与野生型冠状病毒的S蛋白相比，所述S蛋白变体可以不包含细胞质尾巴结构域。
在本申请中，与野生型冠状病毒的S蛋白相比，所述S蛋白变体的细胞质尾巴结构域可以在C末端缺失约14个、约15个、约16个、约17个、约18个、约19个或约20个氨基酸。在本申请中，与野生型冠状病毒的S蛋白相比，所述S蛋白变体的细胞质尾巴结构域可以在C末端缺失约10个、约20个、约30个、约40个、约50个或约60个氨基酸。
在本申请中，与野生型冠状病毒的S蛋白相比，所述S蛋白变体的细胞质尾巴结构域可以在C末端缺失约22-约64个氨基酸。在本申请中，与野生型冠状病毒的S蛋白相比，所述S蛋白变体的细胞质尾巴结构域可以在C末端缺失约22-约60个氨基酸。在本申请中，与野生型冠状病毒的S蛋白相比，所述S蛋白变体的细胞质尾巴结构域可以在C末端缺失约30-约60个氨基酸。在本申请中，与野生型冠状病毒的S蛋白相比，所述S蛋白变体的细胞质尾巴结构域可以在C末端缺失约40-约60个氨基酸。在本申请中，与野生型冠状病毒的S蛋白相比，所述S蛋白变体的细胞质尾巴结构域可以在C末端缺失约30-约40个氨基酸。在本申请中，与野生型冠状病毒的S蛋白相比，所述S蛋白变体的细胞质尾巴结构域可以在C末端缺失约20-约30个氨基酸。
在本申请中，与野生型冠状病毒的S蛋白相比，所述S蛋白变体的细胞质尾巴结构域可以在C末端缺失18-20个氨基酸。在本申请中，与野生型冠状病毒的S蛋白相比，所述S蛋白变体的细胞质尾巴结构域可以在C末端缺失18个氨基酸。
在本申请中，与野生型冠状病毒的S蛋白相比，所述S蛋白变体可以不包含跨膜域。在本申请中，与野生型冠状病毒的S蛋白相比，所述S蛋白变体可以不包含完整的跨膜域。在本申请中，与野生型冠状病毒的S蛋白相比，所述S蛋白变体可以包含截短的跨膜域。
在本申请中，所述冠状病毒可以为MERS冠状病毒和/或SARS-CoV类病毒。所述SARS-CoV类病毒可以是SARS-CoV或SARS-CoV-2病毒。
在本申请中，所述冠状病毒可以为SARS-CoV-2病毒。在本申请中，与野生型SARS-CoV-2病毒的S蛋白相比，所述S蛋白变体的细胞质尾巴结构域可以在C末端缺失约14个、约15个、约16个、约17个、约18个、约19个或约20个氨基酸。在本申请中，与野生型SARS-CoV-2病毒的S蛋白相比，所述S蛋白变体的细胞质尾巴结构域可以在C末端缺失约10个、约20个、约30个、约40个、约50个或约60个氨基酸。
在本申请中，与野生型SARS-CoV-2病毒的S蛋白相比，所述S蛋白变体的细胞质尾巴结构域可以在C末端缺失约22-约64个氨基酸。在本申请中，与野生型SARS-CoV-2病毒的S蛋白相比，所述S蛋白变体的细胞质尾巴结构域可以在C末端缺失约22-约60个氨基酸。在本申请中，与野生型SARS-CoV-2病毒的S蛋白相比，所述S蛋白变体的细胞质尾巴结构域可以在C末端缺失约30-约60个氨基酸。在本申请中，与野生型SARS-CoV-2病毒的S蛋白相比，所述S蛋白变体的细胞质尾巴结构域可以在C末端缺失约40-约60个氨基酸。在本申请中，与野生型SARS-CoV-2病毒的S蛋白相比，所述S蛋白变体的细胞质尾巴结构域可以在C末端缺失约30-约40个氨基酸。在本申请中，与野生型SARS-CoV-2病毒的S蛋白相比，所述S蛋白变体的细胞质尾巴结构域可以在C末端缺失约20-约30个氨基酸。
在本申请中，与野生型SARS-CoV-2病毒的S蛋白相比，所述S蛋白变体的细胞质尾巴结构域可以在C末端缺失18-20个氨基酸。在本申请中，与野生型SARS-CoV-2病毒的S蛋白相比，所述S蛋白变体的细胞质尾巴结构域可以在C末端缺失18个氨基酸。
在本申请中，所述S蛋白变体可包含SEQ ID NO:8、21、24、27、30、33、35、38、41、45、59和61中任一项所示的氨基酸序列。例如，所述S蛋白变体可包含SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列。
在本申请中，所述冠状病毒可以为SARS-CoV病毒。在本申请中，与野生型SARS-CoV病毒的S蛋白相比，所述S蛋白变体的细胞质尾巴结构域可以在C末端缺失约14个、约15个、约16个、约17个、约18个、约19个或约20个氨基酸。在本申请中，与野生型SARS-CoV病毒的S蛋白相比，所述S蛋白变体的细胞质尾巴结构域可以在C末端缺失约10个、约20个、约30个、约40个、约50个或约60个氨基酸。
在本申请中，与野生型SARS-CoV病毒的S蛋白相比，所述S蛋白变体的细胞质尾巴结构域可以在C末端缺失约22-约64个氨基酸。在本申请中，与野生型SARS-CoV病毒的S蛋白相比，所述S蛋白变体的细胞质尾巴结构域可以在C末端缺失约22-约60个氨基酸。在本申请中，与野生型SARS-CoV病毒的S蛋白相比，所述S蛋白变体的细胞质尾巴结构域可以在C末端缺失约30-约60个氨基酸。在本申请中，与野生型SARS-CoV病毒的S蛋白相比，所述S蛋白变体的细胞质尾巴结构域可以在C末端缺失约40-约60个氨基酸。在本申请中，与野生型SARS-CoV病毒的S蛋白相比，所述S蛋白变体的细胞质尾巴结构域可以在C末端缺失约30-约40个氨基酸。在本申请中，与野生型SARS-CoV病毒的S蛋白相比，所述S蛋白变体的细胞质尾巴结构域可以在C末端缺失约20-约30个氨基酸。
在本申请中，与野生型SARS-CoV病毒的S蛋白相比，所述S蛋白变体的细胞质尾巴结构域可以在C末端缺失18-20个氨基酸。在本申请中，与野生型SARS-CoV病毒的S蛋白相比，所述S蛋白变体的细胞质尾巴结构域可以在C末端缺失18个氨基酸。
在本申请中，所述S蛋白变体可包含SEQ ID NO:35所示的氨基酸序列。
在本申请中，所述冠状病毒可以为MERS-CoV病毒。在本申请中，与野生型MERS-CoV病毒的S蛋白相比，所述S蛋白变体的细胞质尾巴结构域可以在C末端缺失约14个、约15个、约16个、约17个、约18个、约19个或约20个氨基酸。在本申请中，与野生型MERS-CoV病毒的S蛋白相比，所述S蛋白变体的细胞质尾巴结构域可以在C末端缺失约10个、约20个、约30个、约40个、约50个或约60个氨基酸。
在本申请中，与野生型MERS-CoV病毒的S蛋白相比，所述S蛋白变体的细胞质尾巴结构域可以在C末端缺失约22-约64个氨基酸。在本申请中，与野生型MERS-CoV病毒的S蛋白相比，所述S蛋白变体的细胞质尾巴结构域可以在C末端缺失约22-约60个氨基酸。在本申请中，与野生型MERS-CoV病毒的S蛋白相比，所述S蛋白变体的细胞质尾巴结构域可以在C末端缺失约30-约60个氨基酸。在本申请中，与野生型MERS-CoV病毒的S蛋白相比，所述S蛋白变体的细胞质尾巴结构域可以在C末端缺失约40-约60个氨基酸。在本申请中，与野生型MERS-CoV病毒的S蛋白相比，所述S蛋白变体的细胞质尾巴结构域可以在C末端缺失约30-约40个氨基酸。在本申请中，与野生型MERS-CoV病毒的S蛋白相比，所述S蛋白变体的细胞质尾巴结构域可以在C末端缺失约20-约30个氨基酸。
在本申请中，与野生型MERS-CoV病毒的S蛋白相比，所述S蛋白变体的细胞质尾巴结构域可以在C末端缺失18-20个氨基酸。在本申请中，与野生型MERS-CoV病毒的S蛋白相比，所述S蛋白变体的细胞质尾巴结构域可以在C末端缺失18个氨基酸。
在本申请中，所述S蛋白变体可包含SEQ ID NO:45所示的氨基酸序列。
在本申请中，所述S蛋白变体可以包括信号肽，且所述信号肽位于所述S蛋白变体的N末端。在本申请中，所述信号肽可以包含SEQ ID NO:1或2所示的氨基酸序列。
核酸分子
另一方面，本申请提供了分离的核酸分子，所述分离的核酸分子可以包含编码所述S蛋白变体的多核苷酸。
在本申请中，所述核酸分子可以为DNA。例如，所述DNA可以包含SEQ ID NO:6、9-19、22、25、28、31、36、39、42、46、60、62和63中任一项所示的核苷酸序列。在本申请中，所述DNA可以包含与SEQ ID NO:6、9-19、22、25、28、31、36、39、42、46、60、62和63中任一项所示的核苷酸序列具有至少80％(例如，82％、85％、88％、90％、95％、98％、99％或以上)的序列同一性的核苷酸序列。
例如，所述DNA可以包含SEQ ID NO:6、9-19、22、25、28和31中任一项所示的核苷酸序列。
例如，所述DNA可以包含SEQ ID NO:6、9-18、60、62和63中任一项所述的核苷酸序列。
在本申请中，所述DNA可以在5’帽处包含修饰。在本申请中，所述DNA可以在5’非翻译区处包含修饰。在本申请中，所述DNA可以在开放阅读框处包含修饰。在本申请中，所述DNA可以在3’非翻译区处包含修饰。在本申请中，所述DNA可以在3’聚腺苷酸包含修饰。在本申请中，所述DNA包含至少一种经修饰的核苷酸。
在本申请中，所述DNA可以为密码子优化的。例如，所述DNA可以包含SEQ ID NO:9-18中任一项所述的核苷酸序列。
在本申请中，所述核酸分子可以为RNA。在本申请中，所述核酸分子可以为mRNA。所述mRNA可以包括5’帽、5’非翻译区(5’UTR)、开放阅读框、3’非翻译区(3’UTR)和poly A尾。
例如，所述5’UTR可以包含SEQ ID NO:64所示的核苷酸序列。
例如，所述5’UTR可以包含SEQ ID NO:65所示的核苷酸序列。
例如，所述poly A可以包含SEQ ID NO:66所示的核苷酸序列。
例如，所述开放阅读框可以包含SEQ ID NO:7、20、23、26、29、32、37、40、43和47中任一项所示的核苷酸序列。在本申请中，所述开放阅读框可以包含与SEQ ID NO:7、20、23、26、29、32、37、40、43和47中任一项所示的核苷酸序列具有至少80％(例如，82％、 85％、88％、90％、95％、98％、99％或以上)的序列同一性的核苷酸序列。
例如，所述开放阅读框可以包含SEQ ID NO:7、20、23、26、29和32中任一项所示的核苷酸序列。
例如，所述开放阅读框可以包含SEQ ID NO:7所示的核苷酸序列。
又例如，所述mRNA可以包括5’帽、5’非翻译区(5’UTR)、开放阅读框、3’非翻译区(3’UTR)和poly A尾；其中，所述5’UTR可以包含SEQ ID NO:64所示的核苷酸序列，所述5’UTR可以包含SEQ ID NO:65所示的核苷酸序列，所述poly A可以包含SEQ ID NO:66所示的核苷酸序列，所述开放阅读框可以包含SEQ ID NO:7所示的核苷酸序列；所述mRNA可以包含SEQ ID NO:67所示的核苷酸序列。
在本申请中，所述RNA(例如，mRNA)可以在5’帽处包含修饰。在本申请中，所述RNA(例如，mRNA)可以在5’非翻译区处包含修饰。在本申请中，所述RNA(例如，mRNA)可以在开放阅读框处包含修饰。在本申请中，所述RNA(例如，mRNA)可以在3’非翻译区处包含修饰。在本申请中，所述RNA(例如，mRNA)可以在3’聚腺苷酸包含修饰。在本申请中，所述RNA(例如，mRNA)包含至少一种经修饰的核苷酸。
在本申请中，所述mRNA可以为密码子优化的。
所述核酸分子的(例如DNA或RNA)修饰可以是化学修饰或生物修饰。在本申请中，所述核酸分子可以包含一个或多个修饰的核碱基、核苷或核苷酸。与未经修饰的参考序列(例如，天然存在的或野生型的核酸分子)相比，修饰的核酸分子可具有有用的性质，例如，包括增强的稳定性、提高的细胞内保留、增强的翻译效果和/或降低的免疫原性。因此，使用修饰的核酸分子可以提高蛋白质生产的效率、提高核酸在细胞内的保留以及降低免疫原性。
核酸分子的(例如DNA或RNA)密码子优化方法是本领域已知的，可用于多种目的：匹配宿主生物中的密码子频率以确保正确折叠；偏置GC含量以增加核酸分子稳定性或减少二级结构；最小化可能重复的串联重复密码子或可能损害基因的构建或表达的碱基序列；定制转录和翻译控制区；插入或去除蛋白质运输序列；去除/添加编码蛋白中的翻译后修饰位点(例如糖基化位点)；添加，去除或改组蛋白结构域；插入或删除限制性位点；修饰核糖体结合位点和核酸分子降解位点；调节翻译速率以允许蛋白质的各个结构域正确折叠；或，减少或消除多核苷酸内有问题的二级结构。
脂质纳米颗粒
另一方面，本申请提供了一种组合物，所述组合物可包含本申请所述的mRNA，还可以包含递送载体。
本申请的mRNA可以配制在纳米颗粒或其他递送载体中，例如，以避免它们在递送至受试者时被降解。在本申请中，所述mRNA可以被包封在纳米颗粒内。在特定的实施方案中，纳米颗粒包括脂质。脂质纳米颗粒可以包括但不限于脂质体和胶束。在本申请中，所述脂质纳米颗粒可以包括阳离子和/或可电离的脂质、阴离子脂质、中性脂质、两亲性脂质、聚乙二醇化的脂质和/或结构性脂质，或上述的组合在某些实施方案中，脂质纳米颗粒包含一种或多种本申请所述的RNA，例如mRNA，又例如，编码S蛋白变体的mRNA。
本申请所述组合物中的递送载体可以是纳米脂质颗粒。所述纳米脂质颗粒可包含一种或多种(例如1、2、3、4、5、6、7或8)阳离子和/或可离子化的脂质。“阳离子脂质”通常指在一定pH(例如，生理pH)下携带任意数目的净正电荷的脂质。所述阳离子脂质可包括但不限于SM102、3-(双十二烷基氨基)-N1,N1,4-三十二烷基-1-哌嗪乙胺(KL10)、N1-[2-(二十二烷基氨基)乙基]-N1,N4,N4-三十二烷基-1,4-哌嗪二乙胺(KL22)、14,25-二十三烷基-15,18,21,24-四氮杂八孔并烷(KL25)、DLin-DMA、DLin-K-DMA、DLin-KC2-DMA、Octyl-CLinDMA、辛基-CLinDMA(2S)、DODAC、DOTMA、DDAB、DOTAP、DOTAP.C1、DC-Choi、DOSPA、DOGS、DODAP、DODMA和DMRIE。例如，所述阳离子脂质可以是SM102
在某些实施方式中，所述阳离子脂质在脂质纳米颗粒中的摩尔比例为约40-70％，例如，约40-65％、约40-60％、约45-55％或约48-53％。在某些实施方式中，所述阳离子脂质(例如，SM102)在脂质纳米颗粒中的摩尔比例为约50％。
在本申请中，所述纳米脂质颗粒可包含一种或多种(例如1、2、3、4、5、6、7或8)非阳离子脂质。所述非阳离子脂质可以包括阴离子脂质。适用于本申请的脂质纳米颗粒的阴离子脂质可包括磷脂酰甘油、心磷脂、二酰基磷脂酰丝氨酸、二酰基磷脂酸、N-十二烷酰基磷脂酰乙醇胺、N-琥珀酰基磷脂酰乙醇胺、N-戊二酰基磷脂酰磷酸乙醇基，以及其他连接了阴离子基团的中性脂质。
所述非阳离子脂质可以包括中性脂质。适用于本申请的脂质纳米颗粒的中性脂质可包括磷脂，例如二硬脂酰基磷脂酰胆碱(DSPC)、二油酰基磷脂酰胆碱(DOPC)、二棕榈酰基磷脂酰胆碱(DPPC)、二油酰基磷脂酰甘油(DOPG)、二棕榈酰基磷脂酰甘油(DPPG)、二油酰基磷脂酰乙醇胺(DOPE)、棕榈酰基油酰基磷脂酰胆碱(POPC)、棕榈酰基油酰基-磷脂酰乙醇胺(POPE)、二油酰基-磷脂酰乙醇胺4-(N-马来酰亚胺基甲基)-环己烷-1-羧酸酯(DOPE-mal)、二棕榈酰基磷脂酰基乙醇胺(DPPE)、二肉豆蔻酰基磷酸乙醇胺(DMPE)、二硬脂酰基-磷脂酰基-乙醇胺(DSPE)、16-O-单甲基PE、16-O-二甲基PE、18-1-反式PE、1-硬脂酰基-2-油酰基-磷脂酰乙醇胺(SOPE)，或其混合物。另外，可以使用具有饱和和不饱和脂肪酸链 的混合物的脂质。例如，本申请所述的中性脂质可以选自DOPE、DSPC、DPPC、POPC或任何相关的磷脂酰胆碱。
在某些实施方式中，所述磷脂在脂质纳米颗粒中的摩尔比例为约30-45％，例如，约33-42％、约35-40％或约38-39％。在某些实施方式中，所述磷脂(例如，DSPC)在脂质纳米颗粒中的摩尔比例为约38.5％。
在本申请中，所述纳米脂质颗粒可包含脂质缀合物，例如，聚乙二醇(PEG)修饰的脂质和衍生的脂质。PEG修饰的脂质可包括但不限于与具有C6-C20长度的烷基链的脂质共价连接的长度至多为5kDa的聚乙二醇链。这些组分的加入可防止脂质聚集，也可增加循环持续时间，易于脂质-核酸组合物递送至靶细胞，或快速释放出核酸。例如，所述聚乙二醇(PEG)修饰的脂分子可以是具有较短的酰基链(例如，C14或C18)的PEG-神经酰胺。例如，所述纳米脂质颗粒可包含PEG2000-DMG。
在某些实施方式中，所述聚乙二醇(PEG)修饰的脂分子在脂质纳米颗粒中的摩尔比例为约0.5-2％，例如，约1-2％、约1.2-1.8％或约1.4-1.6％。在某些实施方式中，所述聚乙二醇(PEG)修饰的脂分子(例如，PEG2000-DMG)在脂质纳米颗粒中的摩尔比例为约1.5％。
在本申请中，所述纳米脂质颗粒还可包含胆固醇。在某些实施方式中，所述胆固醇在脂质纳米颗粒中的摩尔比例为约5-15％，例如，约6-14％、约7-13％、约8-12％或约9-11％。在某些实施方式中，所述胆固醇在脂质纳米颗粒中的摩尔比例可以为约10％。
在本申请中，所述纳米脂质颗粒可包括阳离子脂质、胆固醇、磷脂以及聚乙二醇修饰的脂分子。在某些实施方式中，所述阳离子脂质、胆固醇、磷脂以及聚乙二醇修饰的脂分子的摩尔比可以为45～55：5～15：35～45：0.5～2。在某些实施方式中，所述阳离子脂质、胆固醇、磷脂以及聚乙二醇修饰的脂分子的摩尔比可以为50:10:38.5:1.5。
另一方面，本申请提供了载体，所述载体包含所述核酸分子。例如，所述载体可以为病毒载体，例如，腺病毒载体、腺相关病毒载体和/或慢病毒载体。
另一方面，本申请提供了细胞，所述细胞包含所述核酸分子，和/或所述载体。在本申请中，所述细胞可以是原核细胞，例如，大肠杆菌。在本申请中，所述细胞可以是真核细胞例如酵母细胞，昆虫细胞，植物细胞和动物细胞。在本申请中，所述细胞可以为哺乳动物的细胞，例如小鼠细胞、人细胞等。
另一方面，本申请提供了制备所述S蛋白变体的方法，所述方法包括在使得所述S蛋白变体表达的条件下，培养所述细胞。
另一方面，本申请提供了药物组合物，所述药物组合物包含所述S蛋白变体、所述核酸 分子、所述载体、所述细胞和/或所述组合物，以及任选地药学上可接受的载体。
另一方面，本申请提供了疫苗，所述疫苗包含所述S蛋白变体、所述核酸分子、所述载体、所述细胞、所述组合物和/或所述药物组合物，以及药学上可接受的佐剂。
在本申请中，所述疫苗可以为蛋白疫苗，其可以包含所述S蛋白变体。
在本申请中，所述疫苗可以为核酸疫苗，其可以包含所述核酸分子。在本申请中，所述疫苗可以为DNA疫苗。在本申请中，所述疫苗可以为mRNA疫苗。
另一方面，本申请提供了试剂盒，所述试剂盒包含所述S蛋白变体、所述核酸分子、所述载体、所述细胞、所述合物、所述药物组合物和/或所述疫苗。
另一方面，本申请提供了所述S蛋白变体、所述核酸分子、所述载体、所述细胞、所述组合物、所述药物组合物和/或所述疫苗在制备药物中的用途，所述药物用于缓解、预防和/或治疗冠状病毒引起的疾病。
另一方面，本申请提供了缓解、预防和/或治疗冠状病毒引起的疾病或病症的方法，所述方法包括向有需要的受试者施用所述S蛋白变体、所述核酸分子、所述载体、所述细胞、所述组合物、所述药物组合物和/或所述疫苗。
在本申请中，所述疾病或病症可以为新型冠状病毒肺炎(COVID-19)和/或重症急性呼吸综合征(SARS)。
另一方面，本申请提供了产生针对冠状病毒抗体的方法，所述方法包括施用所述S蛋白变体、所述核酸分子、所述的载体、所述细胞、所述组合物、所述药物组合物和/或所述疫苗。
另一方面，本申请提供了激活免疫的方法，所述方法包括施用所述S蛋白变体、所述核酸分子、所述载体、所述细胞、所述组合物、所述药物组合物和/或所述疫苗。
在本申请中，所述S蛋白变体、所述核酸分子、所述载体、所述细胞、所述组合物、所述药物组合物和/或所述疫苗可以被单次施用、多次施用或连续施用，并且均具有安全性。在首次施用后，再次施用所述组合物和/或药物组合物可以缩短起效时间。在本申请中，所述S蛋白变体、所述核酸分子、所述载体、所述细胞、所述组合物、所述药物组合物和/或所述疫苗可以和其他活性物质或治疗/预防成分共同施用。在本申请中，所述S蛋白变体、所述核酸分子、所述载体、所述细胞、所述组合物、所述药物组合物和/或所述疫苗可以在其他活性物质或治疗/预防成分之前或之后施用。
不欲被任何理论所限，下文中的实施例仅仅是为了阐释本申请发明的各个技术方案，而不用于限制本申请发明的范围。
实施例
实施例1
实施例1.1 mRNA制备
mRNA是以线性化质粒为模板，通过一步法加帽法进行体外转录后得到，转录体系中使用了cap1帽子类似物(m7G(5')ppp(5')(2'OMeA)pG(APExBIO公司产品EZ Cap#B8176，cap1)、ATP、GTP、CTP、Pseudo-UTP(简称pseudoU，ApexBio，#B7972)，以产生cap1结构的pseudouridine(Ψ)修饰的mRNA，通过两步层析纯化得到高纯度mRNA。
制备得到以下mRNA样品：含Alb信号肽的SARS-Cov-2病毒S蛋白(代号：SDC60Alb)和SARS病毒的S蛋白(SARS S)。其中，SARS-Cov-2病毒SDC60 Alb蛋白存在以下几种变体：全长蛋白(FL)，含K986P和V987P突变的全长蛋白(2P)、全长蛋白C末端分别截短10、18、20、40、60、67个氨基酸的蛋白(DC10，DC18，DC20，DC40，DC60，DC67)；SARS病毒的SARS S蛋白变体有：全长蛋白(FL)、全长C末端分别截短10、18、40个氨基酸的蛋白(DC10，DC18，DC40)。
实施例1.2脂质纳米颗粒制备
将实施例1.1的mRNA在低pH下可离子化(阳离子)，两种辅助脂质(DSPC和胆固醇)和聚乙二醇化脂质(DMG-PEG2000)包被成纳米颗粒。通过将溶解在超纯水中的mRNA，与pH 4.0的100μmM柠檬酸盐缓冲液1：1(v/v)混合，制备了mRNA的水溶液。调节四种脂质组分(阳离子脂质SM102：胆固醇：DSPC：DMG-PEG2000)比例(50:10:38.5:1.5)，在乙醇(99.5％)中溶解为脂质溶液。将mRNA和脂质溶液在NanoAssemblr(Precision Nanosystems)微流体混合系统中以Aq：EtOH＝3：1的体积混合比和恒定的12mL/min的总流速混合，得到包含mRNA的脂质体纳米颗粒(LNP)。脂纳米颗粒经过透析、浓缩、过滤后保存。
实施例2酶联免疫吸附法测定mRNA转染的细胞中S蛋白的含量
将实施例1中制备的mRNA分别转染(通过ThermoFisher转染试剂Lipofectamine 2000标准操作流程)到293T细胞中，19hr后收集细胞，用Micro BCA TM蛋白检测试剂盒检测细胞裂解样品的总蛋白量，再用酶联免疫吸附法测定细胞裂解液中S蛋白的含量。
用2μg/mL捕获抗体(抗体原液用1×PBS稀释500倍),包被96孔ELISA板，50μL/孔，每孔共100ng，4度过夜避光存放。对于SARS-Cov-2病毒的S蛋白(SDC60 Alb)和SARS病毒的S蛋白(SARS S)，用40150-D006作为捕获抗体，抗体购自Sino Biological。1×PBST(0.05％Tween20)洗板3次，200μL/孔，每次倒扣ELISA板并轻击清洗干净。加100 μL/孔2％BSA(溶于1×PBST)封闭，室温孵育1小时。1×PBST(0.05％Tween20)洗板3次，200μL/孔，每次倒扣ELISA板并轻击清洗干净。用SARS-CoV-2和SARS的蛋白分别作为标准品用于定量。对于SDC60 Alb蛋白及其变体，用蛋白40589-V08B1作为标准品，对于SARS S蛋白及其变体，用40150-V08B1作为标准品，蛋白均购自Sino Biological。根据之前BCA定量结果，将待测样品的细胞裂解液分别用1×PBS进行相应浓度的稀释，使样本孔所加入的总蛋白量保持一致。混合均匀后分别移取100μL加到ELISA板中，最终加入ELISA板的每孔总蛋白，即转染SARS-Cov-2病毒的S mRNA的总蛋白量为10μg,转染SARS病毒的S mRNA的总蛋白量为20μg，室温孵育2小时。1×PBST(0.05％Tween20)洗板5次，200μL/孔，每次倒扣ELISA板并轻击清洗干净。用1×PBS将检测抗体稀释至工作浓度，混匀后每孔加入100μL，室温孵育1小时。用于SDC60 Alb蛋白的检测抗体为40591-MM43，工作浓度为0.609μg/mL，用于SARS S蛋白的检测抗体为40150-MM10，工作浓度为1μg/mL，抗体均购自Sino Biological。1×PBST(0.05％Tween20)洗板3次，200μL/孔，每次倒扣ELISA板并轻击清洗干净。用1×PBS将Peroxidase AffiniPure Goat Anti-Mouse IgG(H+L)稀释5000倍，每孔加入100μL，室温孵育1小时。1×PBST(0.05％Tween20)洗3次，200μL/孔，每次倒扣ELISA板并轻击清洗干净。分别加TMB底物，50μL/孔，室温等待5-15分钟(避光)，将呈现蓝色。分别加1M硫酸终止反应，150μL/孔，蓝色将变黄。酶标仪读取OD450。
如图1A，本申请的SARS-Cov-2的S蛋白变体mRNA转染细胞的体外表达结果显示，对SARS-Cov-2病毒的S蛋白(SDC60 Alb)来说，C末端截短10，18，20，40，60及67个氨基酸之后的蛋白表达量比全长蛋白的表达量高，且全长蛋白的表达量与C末端截短10，18，40个氨基酸之后的蛋白表达量之间有显著性差异。
如图1B，表达SARS病毒的S蛋白(SARS S)的mRNA转染细胞的体外表达结果显示，对SARS S蛋白来说，C末端截短18或40个氨基酸之后的蛋白表达量比全长蛋白的表达量高，且全长蛋白的表达量与C末端截短18或40个氨基酸之后的蛋白表达量之间有显著性差异。(检验方法为Ordinary one-way ANOVA，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，****P<0.0001，ns:not significant。)
实施例3脂质纳米颗粒转染细胞
将实施例2中所得的脂质纳米颗粒分别转染到293A细胞中，24hr后收集细胞用Western Blot检测蛋白表达。所得结果如图1C所示。结果显示，对于野生型S蛋白、SDC60密码子的野生型S蛋白和Alb信号肽的SDC60密码子的野生型S蛋白来说，C末端截短18个氨基酸之后的蛋白表达量均较高。
实施例4小鼠免疫实验
将包被好的表达新冠病毒Spike蛋白或者各突变体(SDC60 Alb，SDC60 Alb-2P，SDC60 Alb-DC18)的mRNA的脂质纳米颗粒，进行Balb/c小鼠(肌肉(i.m.)注射，具体信息如下表2所示，小鼠免疫示意图如图2所示。在第1、14、28、42、70天收集血液样品，并且在荧光抗体病毒中和检测中分析血清，具体如以下实施例所述。
表1施用信息
Figure PCTCN2022104158-appb-000003
实施例5酶联免疫吸附法测定血清中抗体效价
分别用2μg/ml抗原蛋白(溶于PBS)，100ng，包被96孔ELISA板，50μl/孔，4度过夜避光。其中S蛋白抗原购自Sino Biological，货号40589-V08B1；S蛋白RBD结构域，购自Novoprotein，货号DRA36。PBST(0.05％Tween)洗3次，200μl/孔，每次倒扣ELISA板并轻击清洗干净。加100μl/孔2％BSA(溶于PBST)封闭，室温孵育1hr。PBST(0.05％Tween)洗3次，200μl/孔，每次倒扣ELISA板并轻击清洗干净。加小鼠血清(稀释100倍作为起始浓度，之后5倍梯度稀释，共11个梯度)于PBS中，混合均匀后取100μl分别加到ELISA板中，室温孵育2hr。将实施例4中的小鼠进行眼周采血100μl约40μl血清。洗板后，分别加HRP-anti-mouse IgG(1:5000稀释于PBS)，100μl/孔，室温孵育1hr。洗板后，分别加TMB底物(Thermo Fisher，货号34022)，50μl/孔，室温等待5-15min(避光)，将呈现蓝色。分别加1M硫酸终止反应，150μl/孔，蓝色将变黄。酶标仪读取OD450。
图3显示，本申请的S蛋白变体mRNA疫苗均可有效激活小鼠免疫系统，血清中产生抗体，且其安全性高、有效性好。在小鼠二免后一周，在同样的免疫剂量(1μg)下，截短18个 氨基酸的S蛋白变体的mRNA产生的抗体滴度最高。
前述详细说明是以解释和举例的方式提供的，并非要限制所附权利要求的范围。目前本申请所列举的实施方式的多种变化对本领域普通技术人员来说是显而易见的，且保留在所附的权利要求和其等同方式的范围内。

Claims (65)

  1. S蛋白变体，与野生型冠状病毒的S蛋白相比，其不包含完整的细胞质尾巴结构域。
  2. 根据权利要求1所述的S蛋白变体，与野生型冠状病毒的S蛋白相比，其包含截短的细胞质尾巴结构域。
  3. 根据权利要求1-2中任一项所述的S蛋白变体，与野生型冠状病毒的S蛋白相比，其在C末端截短了18-20个氨基酸。
  4. 根据权利要求3所述的S蛋白变体，与野生型冠状病毒的S蛋白相比，其在C末端截短了18个氨基酸。
  5. 根据权利要求1所述的S蛋白变体，与野生型冠状病毒的S蛋白相比，其不包含细胞质尾巴结构域。
  6. 根据权利要求5所述的S蛋白变体，与野生型冠状病毒的S蛋白相比，其不包含跨膜域。
  7. 根据权利要求5-6中任一项所述的S蛋白变体，与野生型冠状病毒的S蛋白相比，其在C末端截短了22-64个氨基酸。
  8. 根据权利要求1-7中任一项所述的S蛋白变体，其中所述冠状病毒为MERS冠状病毒和/或SARS-CoV类病毒。
  9. 根据权利要求1-8中任一项所述的S蛋白变体，其中所述冠状病毒为SARS-CoV-2病毒。
  10. 根据权利要求1-9中任一项所述的S蛋白变体，其中所述野生型冠状病毒的S蛋白的细胞质尾巴结构域包含SEQ ID NO:48-49中任一项所示的氨基酸序列。
  11. 根据权利要求6-10中任一项所述的S蛋白变体，其中所述野生型冠状病毒的S蛋白的跨膜域包含SEQ ID NO:50-51中任一项所示的氨基酸序列。
  12. 根据权利要求1-11中任一项所述的S蛋白变体，其中所述野生型冠状病毒的S蛋白包含SEQ ID NO:5、34和44中任一项所示的氨基酸序列。
  13. 根据权利要求1-12中任一项所述的S蛋白变体，其包含SEQ ID NO:8、21、24、27、30、33、35、38、41、45、59和61中任一项所示的氨基酸序列。
  14. 根据权利要求1-13中任一项所述的S蛋白变体，其包含SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列。
  15. 根据权利要求1-14中任一项所述的S蛋白变体，其还包括信号肽，且所述信号肽位于所述S蛋白变体的N末端。
  16. 根据权利要求15所述的S蛋白变体，其中所述信号肽包含SEQ ID NO:1-2中任一项所 示的氨基酸序列。
  17. 分离的核酸分子，其包含编码权利要求1-16中任一项所述的S蛋白变体的多核苷酸。
  18. 根据权利要求17所述的核酸分子，其为DNA。
  19. 根据权利要求17-18中任一项所述的核酸分子，其包含SEQ ID NO:6、9-19、22、25、28、31、36、39、42、46、60、62和63中任一项所述的核苷酸序列。
  20. 根据权利要求17所述的核酸分子，其为mRNA。
  21. 根据权利要求20所述的核酸分子，其在选自下组的一个或多个位置处包含修饰：5’帽、5’非翻译区、开放阅读框、3’非翻译区和3’聚腺苷酸。
  22. 根据权利要求20-21中任一项所述的核酸分子，其包含至少一种经修饰的核苷酸。
  23. 根据权利要求20-22中任一项所述的核酸分子，其为密码子优化的。
  24. 根据权利要求20-23中任一项所述的核酸分子，其包含SEQ ID NO:7、20、23、26、29、32、37、40、43和47中任一项所示的核苷酸序列。
  25. 载体，其包含权利要求17-24中任一项所述的核酸分子。
  26. 细胞，其包含权利要求17-24中任一项所述的核酸分子，和/或权利要求25所述的载体。
  27. 制备权利要求1-16中任一项所述的S蛋白变体的方法，所述方法包括在使得权利要求1-16中任一项所述的S蛋白变体表达的条件下，培养根据权利要求26所述的细胞。
  28. 组合物，其包含(1)编码权利要求1-16中任一项所述的S蛋白变体的mRNA，和(2)递送载体。
  29. 根据权利要求28所述的组合物，其中所述mRNA在选自下组的一个或多个位置处包含修饰：5’帽、5’非翻译区、开放阅读框、3’非翻译区和poly A尾。
  30. 根据权利要求28-29中任一项所述的组合物，其中所述mRNA包含至少一种经修饰的核苷酸。
  31. 根据权利要求28-30中任一项所述的组合物，其中所述mRNA包含的经修饰的核苷酸为假尿苷(Ψ)。
  32. 根据权利要求28-31中任一项所述的组合物，其中所述mRNA是密码子优化的。
  33. 根据权利要求28-32中任一项所述的组合物，其中所述mRNA包含如SEQ ID NO:7、20、23、26、29、32、37、40、43和47中任一项所示的核苷酸序列。
  34. 根据权利要求28-32中任一项所述的组合物，其中所述S蛋白变体源自SARS CoV-2病毒。
  35. 根据权利要求28-32中任一项所述的组合物，其中所述mRNA包含如SEQ ID NO:7所示 的核苷酸序列。
  36. 根据权利要求28-35中任一项所述的组合物，其中所述递送载体包括脂质体。
  37. 根据权利要求28-36中任一项所述的组合物，其中所述递送载体包括脂质纳米颗粒(LNP)。
  38. 根据权利要求28-37中任一项所述的组合物，其中所述递送载体包括阳离子脂质。
  39. 根据权利要求38所述的组合物，在所述递送载体中，其中所述阳离子脂质的摩尔比为约45％至约55％。
  40. 根据权利要求38或39所述的组合物，其中所述阳离子脂质包括SM102和/或Dlin-MC3。
  41. 根据权利要求28-40中任一项所述的组合物，其中所述递送载体包括非阳离子脂质。
  42. 根据权利要求41所述的组合物，其中所述非阳离子脂质包括磷脂和/或脂质缀合物。
  43. 根据权利要求42所述的组合物，其中所述磷脂包括二硬脂酰基磷脂酰胆碱(DSPC)。
  44. 根据权利要求42或43所述的组合物，在所述递送载体中，其中所述磷脂的摩尔比为约35％至约40％。
  45. 根据权利要求42-44中任一项所述的组合物，其中所述脂质缀合物包括聚乙二醇修饰的脂分子。
  46. 根据权利要求42-45中任一项所述的组合物，在所述递送载体中，其中所述脂质缀合物的摩尔比为约1％至约2％。
  47. 根据权利要求45-46中任一项所述的组合物，其中所述聚乙二醇修饰的脂分子包括DMPE-PEG2000。
  48. 根据权利要求28-47中任一项所述的组合物，其中所述递送载体包括胆固醇。
  49. 根据权利要求48所述的组合物，在所述递送载体中，其中所述胆固醇的摩尔比为约8％至约12％。
  50. 根据权利要求28-49中任一项所述的组合物，其中所述递送载体包含阳离子脂质、胆固醇、磷脂和脂质缀合物，且所述阳离子脂质、胆固醇、磷脂和脂质缀合物的质量比为50:10:38.5:1.5。
  51. 根据权利要求28-50中任一项所述的组合物，其中所述递送载体包含SM102、胆固醇、DSPC和DMPE-PEG2000，且所述SM102、胆固醇、DSPC和DMPE-PEG2000的质量比为50:10:38.5:1.5。
  52. 根据权利要求28-51中任一项所述的组合物，其中所述mRNA包载在所述递送载体中。
  53. 药物组合物，其包含权利要求1-16中任一项所述的S蛋白变体、权利要求17-24中任一项所述的核酸分子、权利要求25所述的载体、权利要求26所述的细胞和/或权利要求28-52中任一项所述的组合物，以及任选地药学上可接受的载体。
  54. 疫苗，其包含权利要求1-16中任一项所述的S蛋白变体、权利要求17-24中任一项所述的核酸分子、权利要求25所述的载体、权利要求26所述的细胞、权利要求28-52中任一项所述的组合物和/或权利要求53所述的药物组合物，以及药学上可接受的佐剂。
  55. 根据权利要求54所述的疫苗，其为蛋白疫苗。
  56. 根据权利要求54所述的疫苗，其为核酸疫苗。
  57. 根据权利要求56所述的疫苗，其为DNA疫苗。
  58. 根据权利要求56所述的疫苗，其为mRNA疫苗。
  59. 试剂盒，包含权利要求1-16中任一项所述的S蛋白变体、权利要求17-24中任一项所述的核酸分子、权利要求25所述的载体、权利要求26所述的细胞、权利要求28-52中任一项所述的组合物、权利要求53所述的药物组合物和/或权利要求54-58中任一项所述的疫苗。
  60. 权利要求1-16中任一项所述的S蛋白变体、权利要求17-24中任一项所述的核酸分子、权利要求25所述的载体、权利要求26所述的细胞、权利要求28-52中任一项所述的组合物、权利要求53所述的药物组合物和/或权利要求54-58中任一项所述的疫苗在制备药物中的用途，所述药物用于缓解、预防和/或治疗冠状病毒引起的疾病。
  61. 根据权利要求60所述的用途，其中所述疾病或病症为新型冠状病毒肺炎(COVID-19)和/或重症急性呼吸综合征(SARS)。
  62. 缓解、预防和/或治疗冠状病毒引起的疾病或病症的方法，所述方法包括向有需要的受试者施用权利要求1-16中任一项所述的S蛋白变体、权利要求17-24中任一项所述的核酸分子、权利要求25所述的载体、权利要求26所述的细胞、权利要求28-52中任一项所述的组合物、权利要求53所述的药物组合物和/或权利要求54-58中任一项所述的疫苗。
  63. 根据权利要求62所述的用途，其中所述疾病或病症为新型冠状病毒肺炎(COVID-19)和/或重症急性呼吸综合征(SARS)。
  64. 产生针对冠状病毒抗体的方法，其包括施用权利要求1-16中任一项所述的S蛋白变体、权利要求17-24中任一项所述的核酸分子、权利要求25所述的载体、权利要求26所述的细胞、权利要求28-52中任一项所述的组合物、权利要求53所述的药物组合物和/或权利要求54-58中任一项所述的疫苗。
  65. 激活免疫的方法，其包括施用权利要求1-16中任一项所述的S蛋白变体、权利要求17-24中任一项所述的核酸分子、权利要求25所述的载体、权利要求26所述的细胞、权利要求28-52中任一项所述的组合物、权利要求53所述的药物组合物和/或权利要求54-58中任一项所述的疫苗。
PCT/CN2022/104158 2021-07-09 2022-07-06 一种冠状病毒s蛋白变体及其应用 Ceased WO2023280220A1 (zh)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202110780458.3 2021-07-09
CN202110780458 2021-07-09

Publications (2)

Publication Number Publication Date
WO2023280220A1 true WO2023280220A1 (zh) 2023-01-12
WO2023280220A9 WO2023280220A9 (zh) 2023-02-09

Family

ID=84801307

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/CN2022/104158 Ceased WO2023280220A1 (zh) 2021-07-09 2022-07-06 一种冠状病毒s蛋白变体及其应用
PCT/CN2022/136551 Ceased WO2023236468A1 (zh) 2021-07-09 2022-12-05 一种冠状病毒s蛋白变体及其应用

Family Applications After (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/CN2022/136551 Ceased WO2023236468A1 (zh) 2021-07-09 2022-12-05 一种冠状病毒s蛋白变体及其应用

Country Status (2)

Country Link
CN (1) CN115594742A (zh)
WO (2) WO2023280220A1 (zh)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2023236468A1 (zh) * 2021-07-09 2023-12-14 复旦大学 一种冠状病毒s蛋白变体及其应用
WO2024183687A1 (zh) * 2023-03-03 2024-09-12 上海蓝鹊生物医药有限公司 一种抗新冠病毒的蛋白或mRNA疫苗及其制备方法和应用

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111705006A (zh) * 2020-06-11 2020-09-25 天津大学 表达新型冠状病毒s蛋白的口服重组酵母及其制备与应用
CN112618707A (zh) * 2020-10-15 2021-04-09 广州达博生物制品有限公司 一种SARS-CoV-2冠状病毒疫苗及其制备方法
CN113041357A (zh) * 2021-02-18 2021-06-29 厦门大学 一种针对新型冠状病毒的核酸适体纳米颗粒及其制备方法和应用

Family Cites Families (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2023511633A (ja) * 2020-01-28 2023-03-20 モデルナティエックス インコーポレイテッド コロナウイルスｒｎａワクチン
JP2023521418A (ja) * 2020-04-10 2023-05-24 インビビド， インコーポレイテッド コロナウイルスｓタンパク質に特異的な化合物及びその使用
WO2021211688A1 (en) * 2020-04-14 2021-10-21 Duke University Sars-2 spike protein designs, compositions and methods for their use
CN111603557B (zh) * 2020-06-15 2023-11-28 睿丰康生物医药科技(浙江)有限公司 一种包膜替换型病毒载体疫苗及其构建方法
CN111893097A (zh) * 2020-06-16 2020-11-06 惠君生物医药科技(杭州)有限公司 一种冠状病毒假病毒包装系统及一步法包装方法
WO2022051859A1 (en) * 2020-09-11 2022-03-17 Manuel Caruso Pseudotyped retroviral particles for inducing immunity against coronavirus infections
CN112266411B (zh) * 2020-09-25 2022-06-24 北京诺思兰德生物技术股份有限公司 一种新型冠状病毒疫苗及其应用
WO2022071513A1 (ja) * 2020-10-02 2022-04-07 国立大学法人大阪大学 ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対する改良型ＤＮＡワクチン
CN112724209B (zh) * 2021-01-18 2022-03-08 广东华南疫苗股份有限公司 可形成纳米颗粒的冠状病毒重组蛋白及其载体和应用
CN115594742A (zh) * 2021-07-09 2023-01-13 复旦大学（Cn） 一种冠状病毒s蛋白变体及其应用
CN114560915B (zh) * 2021-12-27 2024-01-09 中国食品药品检定研究院 一种改造的高滴度SARS-CoV-2假病毒

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111705006A (zh) * 2020-06-11 2020-09-25 天津大学 表达新型冠状病毒s蛋白的口服重组酵母及其制备与应用
CN112618707A (zh) * 2020-10-15 2021-04-09 广州达博生物制品有限公司 一种SARS-CoV-2冠状病毒疫苗及其制备方法
CN113041357A (zh) * 2021-02-18 2021-06-29 厦门大学 一种针对新型冠状病毒的核酸适体纳米颗粒及其制备方法和应用

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
PROMPETCHARA EAKACHAI, KETLOY ID CHUTITORN, THARAKHET KITTIPAN, KAEWPANG PAPATSARA, BURANAPRADITKUN SUPRANEE, TECHAWIWATTANABOONID: "DNA vaccine candidate encoding SARS-CoV-2 spike proteins elicited potent humoral and Th1 cell-mediated immune responses in mice", PLOS ONE, vol. 16, no. 3, 22 March 2021 (2021-03-22), pages 1 - 16, XP055825107, DOI: 10.1371/journal.pone.0248007 *
XIONG HUA-LONG, WU YANG-TAO, CAO JIA-LI, YANG REN, LIU YING-XIA, MA JIAN, QIAO XIAO-YANG, YAO XIANG-YANG, ZHANG BAO-HUI, ZHANG YA-: "Robust neutralization assay based on SARS-CoV-2 S-protein-bearing vesicular stomatitis virus (VSV) pseudovirus and ACE2-overexpressing BHK21 cells", EMERGING MICROBES & INFECTIONS, vol. 9, no. 1, 1 January 2020 (2020-01-01), pages 2105 - 2113, XP055926484, ISSN: 2222-1751, DOI: 10.1080/22221751.2020.1815589 *
ZHANG YUFEI, HUANG KUN, WANG TING, DENG FEI, GONG WENXIAO, HUI XIANFENG, ZHAO YA, HE XINLIN, LI CHENGFEI, ZHANG QIANG, CHEN XI, LV: "SARS-CoV-2 Rapidly Adapts in Aged BALB/c Mice and Induces Typical Pneumonia", JOURNAL OF VIROLOGY, vol. 95, no. 11, 10 May 2021 (2021-05-10), US , pages 1 - 19, XP093018632, ISSN: 0022-538X, DOI: 10.1128/JVI.02477-20 *

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2023236468A1 (zh) * 2021-07-09 2023-12-14 复旦大学 一种冠状病毒s蛋白变体及其应用
WO2024183687A1 (zh) * 2023-03-03 2024-09-12 上海蓝鹊生物医药有限公司 一种抗新冠病毒的蛋白或mRNA疫苗及其制备方法和应用

Also Published As

Publication number Publication date
WO2023280220A9 (zh) 2023-02-09
CN115594742A (zh) 2023-01-13
WO2023236468A1 (zh) 2023-12-14

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP2026040566A (ja) ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ワクチン
AU2021380033A1 (en) Compositions and methods for stabilization of lipid nanoparticle mrna vaccines
JP2023524767A (ja) ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗原をコードする最適化されたヌクレオチド配列
KR20220143684A (ko) 신종 코로나바이러스 감염에 대한 mRNA 백신의 조성물 및 방법
JP2024542635A (ja) ヒトメタニューモウイルスワクチン
US20250009863A1 (en) Lyme disease rna vaccine
WO2023236468A1 (zh) 一种冠状病毒s蛋白变体及其应用
US20250161425A1 (en) Signal sequences for nucleic acid vaccines
TW202502375A (zh) 用於治療披衣菌之組合物
JP2025529906A (ja) コロナウイルスに対するワクチン
TW202527960A (zh) 經修飾ｂ型流感血球凝集素多肽及核酸及其用途
JP2025533541A (ja) 肝病期抗原の送達のための組成物及び関連方法
JP2025533527A (ja) Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ＣＳＰ抗原の送達のための組成物及び関連方法
JP2026500282A (ja) インフルエンザウイルス様粒子をコードするｍＲＮＡ
CN120158462A (zh) 编码水痘-带状疱疹病毒糖蛋白E的mRNA疫苗
CN116768988A (zh) 编码新型冠状病毒S蛋白的mRNA疫苗
US20250333452A1 (en) Vaccines and related methods
HK40084247A (zh) 一种冠状病毒s蛋白变体及其应用
CN121038807A (zh) 优化的csp变体及相关方法
HK40109231A (zh) Rna分子
TW202508620A (zh) 呼吸道mrna組合疫苗
WO2025054236A2 (en) Sars-cov-2 vaccine compositions and related methods
WO2026015882A1 (en) Hsv antigen fragments and related methods
WO2023169500A1 (zh) 编码新型冠状病毒S蛋白的mRNA疫苗
WO2024258829A1 (en) Sars-cov-2 vaccine compositions and related methods

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 22836966

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

122 Ep: pct application non-entry in european phase

Ref document number: 22836966

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

122 Ep: pct application non-entry in european phase

Ref document number: 22836966

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

32PN Ep: public notification in the ep bulletin as address of the adressee cannot be established

Free format text: NOTING OF LOSS OF RIGHTS PURSUANT TO RULE 112(1) EPC

122 Ep: pct application non-entry in european phase

Ref document number: 22836966

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1